MX2008005764A - Metodos para promover el crecimiento de neuritas y la supervivencia en neuronas dopaminergicas. - Google Patents

Metodos para promover el crecimiento de neuritas y la supervivencia en neuronas dopaminergicas.

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Abstract

La presente invención se refiere en general a los métodos para promover la regeneración, el crecimiento y la supervivencia de neuronas dopaminérgicas, que comprende poner en contacto dichas neuronas dopaminérgicas con una cantidad efectiva de una composición que comprende un antagonista de Sp35. Además, la invención está relacionada en general a los métodos para tratar diversas enfermedades, trastornos o daños asociados con la degeneración o muerte neuronal dopaminérgica por administración de un antagonista de Sp35.

Description

METODOS PARA PROMOVER EL CRECIMIENTO DE NEURITAS Y LA SUPERVIVENCIA EN NEURONAS DOPAMINERGICAS CAMPO DE LA INVENCION Esta invención se refiere a la neurología, neurobiologí a y biológica molecular. Más particularmente, esta invención se refiere a los métodos para promover la regeneración de neuritas dopaminérgicas , el crecimiento y supervivencia de las neuronas dopaminérgicas (neuronas DA) . Además, la invención se refiere a los métodos para tratar condiciones que involucran la degeneración o muerte neuronal dopaminérgica por la administración de antagonistas del receptor Sp35 (LINGO-1) .
ANTECEDENTES DE LA INVENCION Ciertos trastornos neurodegenerativos están caracterizados por degeneración de las neuronas dopaminérgicas. Por ejemplo, la enfermedad de Parkinson está asociada con la destrucción progresiva de las neuronas dopaminérgicas en la sustancia nigra del mesencéfalo. Esta destrucción da como resultado niveles reducidos del transmisor químico dopamina. Los síntomas físicos de la enfermedad de Parkinson incluyen el deterioro del movimiento voluntario y el sacudimiento rítmico incontrolable de grupos REF . : 192842 de músculos produciendo los temblores característicos. El tratamiento más ampliamente utilizado para la enfermedad de Parkinson es la administración de un precursor de dopamina, la L-dopa (L-3, 4-dihidroxifenilalanina) , la cual actúa indirectamente por el reemplazo de la dopamina faltante, después es descarboxilada principalmente por las neuronas dopaminérgicas remanentes. No obstante, las desventajas están asociadas con el uso de la L-dopa. Los pacientes a menudo sufren de los efectos colaterales, tales como discinesia, náusea, vomito, distensión abdominal y efectos psiquiátricos colaterales, y los pacientes típicamente se vuelven menos respondedores del tratamiento con L-dopa con el tiempo. Una de las razones propuestas de que el tratamiento con L-dopa se vuelva menos efectivo sobre el tiempo es que el número de neuronas dopaminérgicas sobrevivientes se llega a agotar, y de este modo no puede responder a la L-dopa administrada. Ver Isacson O., "Problems and solutions for circuits and synapses in Parkinson' s disease," ,Neuron 3: 165-168 (2004). Además, la efectividad de la L-dopa disminuye después de la pérdida continua de conexiones neuronales (terminales o sinapsis) debido a la muerte de las neuronas dopaminérgicas. Ver Id. Las formas alternativas de terapia utilizando agonistas de dopamina post-sinápticos , están también asociadas con los efectos colaterales. Además, aunque el tratamiento con L-dopa mejora la calidad de vida para los pacientes, éste no impide la progresión de la enfermedad. Otros compuestos, tales como el factor neurotrófico derivado de la linea de células gliales (GDNF) , han mostrado una promesa en el tratamiento de la enfermedad de Parkinson en pacientes humanos, cuando se distribuye mediante infusión crónica. Ver por ejemplo, Gilí et al., "Direct brain infusión of glial cell line derived neurotrophic factor in Enfermedad de Parkinson," Nature ed. 9: 589-95 (2003). No obstante, estos regímenes de tratamiento están todavía en etapas tempranas de desarrollo. Otras muchas enfermedades y trastornos pueden involucrar la degeneración de las neuronas dopaminérgicas . Estos incluyen la atrofia de sistemas múltiples, la degeneración estriatonigral, la atrofia olivopontocerebelar , el síndrome de Shy-Drager, la enfermedad de las neuronas motoras con características parkinsonianas , demencias de cuerpos de Lewy, parálisis supranuclear progresiva, degeneración ganglionar cortical-basal, demencia frontotemporal, enfermedad de Alzheimer con parkinsonismo, enfermedad de Wilson, enfermedad de Hallervorden-Spatz , enfermedad de Chediak-Hagashi, ataxia espinocerebelar de SCA-3, distonia-parkinsonismo ligado a X (DYT3) , enfermedad de Huntington (variante de Westphal) , enfermedad de los priones, enfermedad de Jacob-Creutzfeldt , parkinsonismo vascular, parálisis cerebral, trauma craneal repetido, parkinsonismo ~ post-encefalitico, esquizofrenia y neurosifilis . En consecuencia, sigue existiendo una necesidad para métodos de tratamiento adicionales para la enfermedad de Parkinson y otras condiciones caracterizadas por degeneración o muerte de las neuronas dopaminérgicas .
BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La presente invención está basada en el descubrimiento de que LINGO-1 es expresado en las neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo (DA) y regula negativamente el crecimiento de las neuritas y la supervivencia de las neuronas DA. Con base en estos descubrimientos, la invención se refiere en general a los métodos para promover la proliferación, supervivencia, reparación, crecimiento y regeneración de las neuronas dopaminérgicas, que comprende poner en contacto las neuronas dopaminérgicas con una cantidad efectiva de una composición que incluye un antagonista de Sp35. Además, la invención está relacionada a los métodos para tratar diversas enfermedades, trastornos o daños asociados con la degeneración neuronal dopaminérgica o la muerte de las mismas por administración de un antagonista de Sp35. En ciertas modalidades, la invención incluye un método para promover la regeneración, crecimiento o supervivencia de las neuronas dopaminérgicas en un mamífero, que comprende administrarle a un mamífero en necesidad del mismo, una cantidad , efectiva de una composición que comprende un antagonista de Sp35. En modalidades adicionales, el mamífero ha sido diagnosticado con una enfermedad, trastorno, daño o condición que involucra degeneración o muerte de las neuritas dopaminérgicas. En algunas modalidades, el trastorno, enfermedad, daño o condición se selecciona del grupo que consiste de enfermedad de Parkinson (PD), la atrofia de sistemas múltiples, la degeneración estriatonigral , la atrofia olivopontocerebelar, el síndrome de Shy-Drager, la enfermedad de las neuronas motoras con características parkinsonianas , demencias de cuerpos de Lewy, parálisis supranuclear progresiva, degeneración ganglionar cortical-basal, demencia frontotemporal, enfermedad de Alzheimer con parkinsonismo, enfermedad de ilson, enfermedad de Hallervorden-Spatz, enfermedad de Chediak-Hagashi , ataxia espinocerebelar de SCA-3, distonia-parkinsonismo ligado a X (DYT3), enfermedad de Huntington (variante de Westphal), enfermedad de los priones, enfermedad de Jacob-Creut zfeldt , parkinsonismo vascular, parálisis cerebral, trauma craneal repetido, parkinsonismo post-encefalítico, esquizofrenia y neurosífilis y esquizofrenia. En diversas modalidades de los métodos anteriores, el antagonista de Sp35 puede ser cualquier molécula que interfiera con la habilidad de Sp35 para regular negativamente la regeneración de las neuronas dopaminérgicas, el crecimiento o la supervivencia de las mismas. En ciertas modalidades, el antagonista de Sp35 se selecciona del grupo que consiste de un polipéptido Sp35 soluble, un anticuerpo o fragmento del mismo para Sp35, un polinucleótido antagonista de Sp35 (por ejemplo, interferencia de ARN) , un aptámero de Sp35 o una combinación de dos o más antagonistas de Sp35. En ciertas modalidades, el antagonista Sp35 es un polipéptido de Sp35 soluble. Ciertas polipéptidos de Sp35 solubles de la invención incluyen, pero no están limitados a, los polipéptidos de Sp35 solubles que comprenden o que carecen de uno o más de los siguientes dominios: (i) un dominio de la repetición rica en Leucina (LRR) de Sp35, (ii) una región C-terminal básica de Sp35 para el dominio LRR, y (iii) un dominio de inmunoglobulina (Ig) para Sp35. En algunas modalidades, el polipéptido Sp35 soluble carece de un dominio de Ig de Sp35, un dominio LRR de Sp35, y dominio transmembranal, y un dominio citoplásmico . Los polipéptidos solubles de Sp35 adicionales de la invención incluyen los polipéptidos que carecen de un dominio transmembranal y un dominio citoplásmico. En algunas modalidades, el polipéptido de Sp35 soluble comprende un dominio LRR de Sp35 y carece de un dominio de Ig de Sp35, una región básica de Sp35, un dominio transmembranal , y un dominio citoplásmico . En algunas modalidades, el polipéptido de Sp35 soluble comprende los. residuos de aminoácidos 34-532 de la SEQ ID No: 2 o 36-532 de la SEQ ID No: 2. En algunas modalidades, el antagonista de Sp35 es un polipéptido de fusión que comprende una porción no Sp35. En algunas modalidades, la porción no Sp35 se selecciona de un grupo que consiste de una porción de Ig del anticuerpo, una porción de albúmina sérica, una porción de dirección al objetivo, una porción reportera, y una porción de facuitamiento de la purificación. En algunas modalidades, la porción de Ig del anticuerpo es una porción de bisagra y Fe. En modalidades alternativas, el antagonista de Sp35 es un anticuerpo o fragmento del mismo que se enlaza a un polipéptido de Sp35 que comprende uno o más de los siguientes dominios de Sp35: (i) un dominio de repetición rica en leucina (LRR) de Sp35, (ii) una región básica de Sp35 C-terminal al dominio LRR, y (iii) un dominio de inmunoglobulina (Ig) de Sp35. Además, el anticuerpo para Sp35 o fragmento del mismo, se enlaza específicamente a un epitopo dentro de un polipéptido, que comprende un fragmento polipeptídico de Sp35 como se describe en la presente. En otras modalidades, el antagonista de Sp35 es un polinucleótido antagonista de Sp35 tal como un polinucleótido antisentido, un aptámero, una ribozima, un ARN de interferencia pequeño (ARNsi) , o un ARN de horquilla pequeña (ARNsh) . En modalidades adicionales, el antagonista de Sp35 es un aptámero de Sp35. Un aptámero de Sp35 es un polipéptido pequeño o un polinucleótido que se enlaza a sp35 e interfiere con la habilidad de Sp35 para regular negativamente la regeneración, crecimiento y supervivencia neuronal dopaminérgica . Modalidades adicionales de la invención incluyen un método para promover la regeneración, el crecimiento y la supervivencia de las neuronas dopaminérgicas o un método de tratamiento de una enfermedad, trastorno o daño que involucra la degeneración o muerte de las neuritas dopaminérgicas mediante una terapia génica in vivo, que comprende administrarle a un mamífero, en o cerca del sitio de la enfermedad, trastorno o daño, una secuencia nucleotídica que codifica para un antagonista de Sp35, de modo que el antagonista de Sp35 es expresado desde la secuencia nucleotídica en el mamífero, en una cantidad suficiente para reducir la inhibición de la regeneración neuronal dopaminérgica, el crecimiento o la supervivencia neuronal dopaminérgica en o cerca del sitio del daño. En ciertas modalidades, el vector es un vector viral que se selecciona del grupo que consiste- de un vector adenoviral, un vector alfavirus, un vector enterovirus, un vector pestivirus, un vector lentivirus, un vector báculo-viral, un vector de herpesvirus, un vector viral de Epstein Barr, un vector papovaviral, un vector poxvirus, un vector viral de la vaccinia, un parvovirus, y un vector viral del herpes simple. En algunas modalidades, el vector es administrado por una ruta seleccionada del grupo que consiste de administración tópica, administración intraocular, administración parenteral, administración intratecal, administración subdural y administración subcutánea. En algunas modalidades, la enfermedad, trastorno, daño o condición se selecciona del grupo que consiste de enfermedad de Parkinson (PD), la atrofia de sistemas múltiples, la degeneración estriatonigral , la atrofia olivopontocerebelar , el síndrome de Shy-Drager, la enfermedad de las neuronas motoras con características parkinsonianas , demencias de cuerpos de Lewy, parálisis supranuclear progresiva, degeneración ganglionar cortical-basal, demencia frontotemporal , enfermedad de Alzheimer con parkinsonismo, enfermedad de ilson, enfermedad de Hallervorden-Spatz , enfermedad de Chediak-Hagashi , ataxia espinocerebelar de SCA-3, distonia-parkinsonismo ligado a X (DYT3), enfermedad de Huntington (variante de Westphal), enfermedad de los priones, enfermedad de Jacob-Creutzfeldt , parkinsonismo vascular, parálisis cerebral, trauma craneal repetido, parkinsonismo post-encefalítico, neurosífilis y esquizofrenia . Además, la invención incluye un método para promover la regeneración, crecimiento y supervivencia de las neuronas doparminérgicas , o un método de tratamiento de una enfermedad, trastorno o daño en un mamífero que involucra la degeneración o muerte de las neuritas dopaminérgicas , que comprende: (a) introducir un polinucleótido dentro de las neuronas dopaminérgicas, el cual codifica para un antagonista de Sp35; y (b) permitir la expresión del antagonista de Sp35. Además, la invención se refiere a un método que comprende (a) administrarle al mamífero un polinucleótido que codifica para un antagonista Sp35 a través del enlace operable a una secuencia de control de expresión y (b) permitir la expresión de los antagonistas de Sp35. En algunas modalidades, la célula hospedera cultivada es derivada del mamífero que va a ser tratado. En ciertas modalidades, el polinucleótido es introducido en la célula hospedera o en la neurona dopaminérgica vía la transíección, electroporación, transducción viral o microinyección directa. En ciertas modalidades, la enfermedad, trastorno, daño o condición que van a ser tratado se selecciona del grupo que consiste de enfermedad de Parkinson (PD) , la atrofia de sistemas múltiples, la degeneración estriatonigral , la atrofia olivopontocerebelar, el síndrome de Shy-Drager, la enfermedad de las neuronas motoras con características parkinsonianas, demencias de cuerpos de Lewy, parálisis supranuclear progresiva, degeneración ganglionar cortical-basal, demencia frontotemporal , enfermedad de Alzheimer con parkinsonismo, enfermedad de ilson, enfermedad de Hallervorden-Spatz, enfermedad de Chediak-Hagashi , ataxia espinocerebelar de SCA-3, distonia-parkinsonismo ligado a X (DYT3) , enfermedad de Huntington (variante de estphal) , enfermedad de los priones, enfermedad de Jacob-Creutzfeldt , parkinsonismo vascular, parálisis cerebral, trauma craneal repetido, parkinsonismo post-encefalitico, neurosifilis y esquizofrenia. En otras modalidades, los polipéptidos , aptámeros y anticuerpos de la presente invención son conjugados a un polímero. En algunas modalidades, el polímero se selecciona del grupo que consiste de polialquilenglicol , un polímero de azúcar, y un polipéptido. En algunas modalidades, el polialquilenglicol es polietilenglicol (PEG) . En algunas modalidades, los polipéptidos y anticuerpos de la presente invención son conjugados a l, 2, 3 ó 4 polímeros. En algunas modalidades, el peso molecular total de los polímeros es de 5,000 Da hasta 100,000 Da.
BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS Figura 1: Gráfica que muestra el crecimiento neuronal dopaminérgico de cultivos neuronales de rata DA primarios , que han sido transducidos con el control vector, FL-Sp35 (FL-LINGO-1) y DN-Sp35 (DN-LINGO-1) o han sido tratados con la proteína Sp35-Fc soluble (LINGO-l-Fc) en comparación al control Fe sin la proteína Sp35 (*p < 0.003) y el lentivirus control (*p < 0.05). Figura 2: Gráfica que muestra la supervivencia de neuronas de mesencéfalo ventral (VM) de rata, cultivadas, con lentivirus que producen Sp35 de longitud completa (FL-LINGO-1), Sp35 dominante negativo (DN-LINGO-1) o un lentivirus control, y tratadas con el ion 1-metil-fenilpiridio 10 µ? (MPP+) o solo la composición vehículo utilizada para administrar el MPP+. Cuando se expone a MPP+, el número de neuronas de tirosina-hidrolasa (TH) incubadas con DN-SP35 fue significativamente más alto en comparación a FL-Sp35 y el control (*p < 0.05, Análisis de Variancia (A DEVA) de una sola vía) . Figura 3: Gráfica que muestra el número de neuronas TH de V tratado con Sp35-Fc (LINGO-l-Fc) o el anticuerpo 1A7 para el antagonista de Sp35, y Fe control o anticuerpo control. El tratamiento con Sp35-Fc o 1A7 dio como resultado un número más alto de neuronas cuando se expuso a MPP+ en comparación al Fe control o anticuerpo control (*p < 0.01, para 1A7 y *p < 0.05 para Sp35-Fc, ANDEVA de una sola vía). Figura 4: Transferencia de Western de Akt fosforilado (p-Akt) en cultivos neuronales VM primarios de rata después de la transducción de DN-LINGO-1, FL-LINGO-1 o un control. Es observado un incremento en el Akt fosforilado en las células transducidas con DN-LINGO-1 cuando se comparan a FL-LINGO-1 y el control. .' Figura 5: Gráfica que demuestra la simetría motora en ratones suprimidos en el gen Sp35, en comparación a los ratones de tipo silvestre. Fue evaluada la simetría motora 1, 2, 3 y 4 semanas después de la inyección de 6-hidroxidopamina (6-OHDA) dentro del cuerpo estriado izquierdo de ratones de tipo silvestre (WT) y suprimidos en un gen (KO) . La asimetría motora fue significativamente menor en los ratones suprimidos en un gen, en comparación a los de tipo silvestre (*p = 0.001, ANDEVA de dos vías). Figuras 6A a 6F: La Figura 6A es una gráfica que muestra el número de neuronas TH en mesencéfalos no lesionados de ratones de tipo silvestre y suprimidos en un gen, en el experimento de 6-OHDA. La Figura 6B es una gráfica que muestra el número de neuronas TH en el lado lesionado, normalizadas por el número en el lado no lesionado contralateral de los ratones suprimidos en un gen y los ratones de tipo silvestre en el experimento de 6-OHDA. El porcentaje de neuronas TH fue estadísticamente mayor en ratones KO que los ratones WT (*p = 0.001, prueba t no apareada) . La Figura 6C es una gráfica que muestra el número de neuronas TH en los mesencéfalos de ratones de tipo silvestre y suprimidos en un gen, en el experimento de 1-metil-4-fenil-l, 2, 3, 6-tetrahidropiridina (????) . El porcentaje de neuronas TH fue estadísticamente mayor en los ratones KO que en los ratones WT (*p = 0.002, prueba t no apareada) . La Figura 6D es una transferencia de Western que muestra los niveles de Akt fosforilados (P-Akt) en los ratones WT y KO después de la exposición a MPTP, en comparación a los ratones no expuestos a MPTP. La Figura 6E son transferencias de Western de Akt fosforilados (p-Akt) , Akt y beta-actina en VM de WT y de KO, tratados con solución salina y MPTP (n = 6 para cada grupo) . La Figura 6F es una gráfica que muestra que los niveles de p-Akt que fueron significativamente más altos en VMs de ratones tratados con MPTP a los 7 días en comparación a WT tratado con MPTP (*p < 0.05) y los VMs de KO tratados con solución salina (#p < 0.05, n = 6 para cada grupo) . Figura 7A a 7G: La Figura 7A es una transferencia de Western de P-Akt y de la expresión del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) de neuronas VM TH tratadas con el anticuerpo para Sp35 ( 1A7 ) o anticuerpos control. La Figura 7B es una transferencia de Western de la expresión de EGFR y P-Akt de neuronas VM TH tratadas con Sp35-Fc o controles. La Figura 7C son transferencias de Western de EGFR, p-Akt, Akt total y beta-actina de cultivos de VM tratados con Sp35-Fc o el anticuerpo para Sp35 (1A7). La Figura 7D es una co-immunoprecipitación de EGFR y Sp35 en células cultivadas, transíectadas con Sp35 y/o EGFR. + o - indican la presencia ( + ) o ausencia (-) de EGFR y Sp35. IP indica el anticuerpo utilizado para la inmunoprecipitación e IB indica el anticuerpo utilizado para la transferencia de Western. La Figura 7E es una co-inmunoprecipitación de EGFR y LINGO-1 en VM de WT y de KO. La Figura 7F es una transferencia de Western que muestra el anticuerpo para 1A7 para Sp35 que bloquea el enlace de Sp35 a EGFR en una linea celular co-transfectada . Además, otro anticuerpo 2F3 para Sp35 no bloquea el enlace de Sp35 a EGFR. La transfección del oligodendrocito-glucoproteina mielina (OMgp) se utilizó como un control. La Figura 7G es una gráfica que muestra el análisis estadístico de los niveles de p-Akt en cultivos tratados con 1A7 y con Sp35-Fc, en comparación al control y al fragmento Fe, respectivamente. Figura 8: Gráfica que muestra el número de neuronas TH en los lados no lesionados y lesionados de VM en ratones WT y KO sometidos a 6-OHDA, indujo parkinsonismo experimental Figura 9: Gráfica que muestra los cambios en los niveles de proteína Sp35 después de la lesión por 6-OHDA. Sp35 es suprarregulado en el lado lesionado (6-OHDA) en comparación al lado contralateral (control) 3 días después de la administración de 6-OHDA al cuerpo estriado en ratones de tipo silvestre (n = 3, en cada punto de tiempo, prueba t de Student, no apareada, *p < 0.05).
Figura 10: Gráfica que muestra el número de neuronas TH de sustancia nigra compacta (SNc) de ratones WT y KO tratados con solución salina (WT: n = 7, KO n = 8 ) y MPTP (n = 10 en cada grupo) . Figura 11: Gráfica que muestra los niveles de dopamina del cuerpo estrial (DA) (ng/ml) en ratones KO y WT tratados con solución salina o MPTP. Figura 12: Transferencia de Western que muestra la expresión de Sp35 y EGFR en células COS-7 2 días después de la transfección con un lentivirus que expresa FL-Sp35 a 0, 1 y 5 MOI. Figuras 13A-13B: La Figura 13A es un gel que muestra los resultados de una reacción de PCR semi-cuantitativa, que muestra la elevación significativa en los niveles de Sp35 en la sustancia nigra de pacientes con enfermedad de Parkinson (PD) comparados a los controles. La Figura 13B es una gráfica que muestra los niveles de ARNM normalizados de Sp35 en la sustancia nigra de pacientes con enfermedad de Parkinson (PD), en comparación a los controles. Figuras 14A-14B: La Figura 14A es una transferencia de Western que muestra los niveles de transporte de dopamina (DAT) en ratones KO (-/-) y WT ( +/+ ) (n = 6 en cada grupo) . La Figura 14B es una gráfica que muestra los niveles relativos de DAT en ratones WT y KO. No existe diferencia significativa en la expresión de DAT entre los ratones WT y KO (prueba T de Student no apareada, p > 0.05) . Figuras 15A-15C: La Figura 15A es una gráfica que - muestra el número de neuronas TH en el SNc de ratones inyectados con Sp-35-Fc en comparación a los controles, cuando son expuestos a MPTP (*p < 0.05, n = 9) . La Figura 15B es una gráfica que muestra los niveles de dopamina del cuerpo estriado en ratones Sp35-Fc en comparación a los controles cuando son expuestos a MPTP (*p < 0.05, n = 9) . La Figura 15C es una gráfica que muestra los niveles de MPP+ del cuerpo estriado en ratones inyectados con Sp35-Fc comparados a los controles cuando son expuestos a MPTP.
DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Definiciones A no ser que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente, tienen el mismo significado que es comúnmente entendido por una persona de experiencia ordinaria en la técnica a la cual pertenece la invención. En caso de conflicto, la presente solicitud, incluyendo las definiciones, controlará. A no ser que sea requerido de otro modo por el contexto, los términos singulares incluirán las pluralidades y los términos plurales incluirán los singulares. Todas las poblaciones, patentes y otras referencias mencionadas en la presente, son incorporadas por referencia en su totalidad, para todos los propósitos, como si cada publicación individual o solicitud de patente fuera especifica e individualmente indicada para ser incorporada por referencia. Aunque los métodos y materiales similares o equivalentes a aquellos descritos en la presente pueden ser utilizados en la práctica o prueba de la presente invención, son descritos más adelante los materiales y métodos adecuados. Los materiales, métodos y ejemplos son ilustrativos únicamente y no están destinados a ser limitantes. Otras características y ventajas de la invención serán aparentes a partir de la descripción detallada y de las reivindicaciones. Con el fin de definir adicionalmente esta invención, son proporcionados los siguientes términos y definiciones. Se debe notar que el término "un" o "una" entidad, se refiere a uno o más de esa entidad; por ejemplo, "una molécula de inmunoglobulina" , se entiende que representa una o más moléculas de inmunoglobulina. ' Como tales, los términos "un" o "uno o una" "uno o más" y "al menos uno" pueden ser utilizados intercambiablemente en la presente. A todo lo largo de esta especificación y las reivindicaciones, la palabra "comprenden" o variaciones tales como "comprende" o "que comprende" indican la inclusión de cualquier número entero indicado o grupo de números enteros, pero no la exclusión de cualquier otro número entero o grupos de números enteros. Como se utiliza en la presente una "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a una cantidad efectiva, a dosis y por periodos de tiempo necesarios, para lograr un resultado terapéutico deseado. Un resultado terapéutico puede ser, por ejemplo, la disminución de los síntomas, la supervivencia prolongada, la movilidad mejorada, y similares. Un resultado terapéutico no necesita ser una "curación". Como se utiliza en la presente, el término "tratamiento" o "trato o tratar" se refiere a la administración un agente a un animal, con el fin de mejorar o disminuir - los síntomas de una enfermedad. Además, los términos "tratamiento" o "tratar" se refieren a la administración de un agente a un animal, para prevenir la progresión de una enfermedad. Como se utiliza en la presente, una "cantidad profilácticamente efectiva" se refiere a una cantidad efectiva, a dosis y por periodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado profiláctico deseado. Típicamente, ya que es utilizada una dosis profiláctica en sujetos antes de o en una etapa más temprana de la enfermedad, la cantidad profilácticamente efectiva será menor que la cantidad terapéuticamente efectiva. Como se utiliza en la presente, un "polinucleótido" puede contener la secuencia nucleotidica de la secuencia de cADN de longitud completa, incluyendo las secuencias 5' y 3' no traducidas, las secuencias de codificación, asi como los fragmentos, epitopos, dominios y variantes de la secuencia de ácido nucleico. El pplinucleótido puede estar compuesto de cualquier polirribonucleótido o polidesoxirribonucleótido, que pueden ser ARN o ADN no modificados o ARN o ADN modificados. Por ejemplo, los polinucleótidos pueden estar compuestos de ADN de una sola hebra y de doble hebra, ADN que es una mezcla de regiones de una sola hebra y de doble hebra, ARN de una sola hebra y de doble hebra, y ARN que es una mezcla de regiones de una sola hebra y de doble hebra, moléculas híbridas que comprenden ADN y ARN que pueden ser de una sola hebra o, más típicamente, de doblé hebra, o una mezcla de regiones de una sola hebra y de doble hebra. Además, los polinucleótidos pueden estar compuestos de regiones de triple hebra que comprenden ARN o ADN o ambos, es decir ARN y ADN. Los polinucleótidos pueden también contener una o más bases modificadas o columnas vertebrales de ADN o ARN modificadas para la' estabilidad o por otras razones. Bases "modificadas" incluyen por ejemplo, las bases tritiladas y las bases no usuales tales como inosina. Una variedad de modificaciones pueden ser realizadas para el ADN y el ARN; de este modo, "polinucleótido" abarca las formas química, enzimática, o metabólicamente modificadas.
En la presente invención, un "polipéptido" puede estar compuesto de aminoácidos unidos al otro por enlaces peptidicos o enlaces peptidicos modificados, por ejemplo, isósteros peptidicos, y pueden contener aminoácidos diferentes de los 20 aminoácidos codificados por los genes (por ejemplo, aminoácidos no de origen natural) . Los polipéptidos de la presente invención pueden ser modificados mediante procesos naturales tales como el procesamiento post-traduccional, o mediante técnicas de modificación química que son bien conocidas en la materia. Tales modificaciones son bien descritas en los textos básicos y en monografías más detalladas, así como en la literatura de investigación voluminosa. Las modificaciones pueden ocurrir en cualquier sitio en el polipéptido incluyendo la columna vertebral o cadena principal peptídica, las cadenas laterales de los aminoácidos y los extremos amino o carboxilo. Se apreciará que el mismo tipo de modificación puede estar presente en el mismo o en grados variantes de varios sitios en un polipéptido dado. También, un polipéptido dado puede contener muchos tipos de modificaciones. Los polipéptidos pueden ser ramificados, por ejemplo, como resultado de la ubiquitinación, y éstos pueden ser cíclicos, con o sin ramificaciones. Los polipéptidos cíclicos, ramificados, y ramificados cíclicos pueden resultar de los procesos naturales post-traduccionales o pueden ser realizados mediante métodos sintéticos. Las modificaciones incluyen la acetilación, acilación, ADP-ribosilación, amidación, enlace covalente de la flavina, enlace covalente de una porción hemo, enlace covalente de un nucleótido o derivado de nucleótido, enlace covalente de un lipido o derivado de lipido, enlace covalente del fosfatidilinositol, reticulación ciclización, formación de enlace disulfuro, desmetilación, formación de reticulaciones covalentes, formación de cisteina, formación de piroglutamato, formilación, gamma-carboxilación, glucosilación, formación de anclas de GPI, hidroxilación, yodación, metilación, miristoilación, oxidación, pegilación, procesamiento proteolitico, fosforilación, prenilación, racemización, selenoilación, sulfatación, adición de aminoácidos mediada por ARN de transferencia a las proteínas tales como arginilación y ubiquitinación . {Ver por ejemplo, Proteins - Structure And Molecular Properties, 2a Edición, T.E. Creighton, W.H. Freeman and Company, New York (1993); Posttranslational Covalent Modification of Proteins, B.C. Johnson, Ed., Academic Press, New York, páginas 1-12 (1983); Seifter et al, Meth Enzymol 182:626-646 (1990); Rattan et al, Ann NY Acad Sd 663 :48-62 (1992).) Los términos "fragmento", "variante", "derivado" y "análogo" cuando hacen referencia a un antagonista de Sp35 de la presente invención incluyen cualesquiera moléculas antagonistas que conserven al menos cierta habilidad para inhibir la actividad de Sp35. Los antagonistas de Sp35 como se describen en la presente, pueden incluir moléculas que son fragmentos, variantes, o derivados en éstos, sin limitación, siempre y cuando el antagonista de Sp35 todavía sirva su función. Los polipéptidos de Sp35 solubles de la presente invención pueden incluir fragmentos proteolíticos de Sp35, fragmentos de supresión y en particular, fragmentos que más fácilmente llegan al sitio de acción cuando son distribuidos a un animal. Los fragmentos polipeptídicos incluyen además cualquier porción del polipéptido que comprenda un epitopo antigénico o inmunogénico del polipéptido nativo, incluyendo epitopos lineales así como tridimensionales. Los polipéptidos de Sp35 solubles de la presente invención pueden comprender regiones de Sp35 variantes, incluyendo fragmentos como se describen anteriormente y también polipéptidos con secuencias alteradas de aminoácidos debido a las sustituciones, supresiones o inserciones de aminoácidos. Las variantes pueden aparecer de manera natural, tal como una variante alélica. Por una "variante alélica" se entiende las formas alternativas de un gen que ocupa un locus dado sobre un cromosoma de un organismo. Genes II, Lewin, B., ed., John Wiley & Sons, New York (1985). Las variantes de origen no natural pueden ser producidas utilizando técnicas de mutagénesis conocidas en la materia. Los polipéptidos de Sp35 solubles pueden comprender sustituciones, supresiones o adiciones conservadoras o no conservadoras de aminoácidos. Los antagonistas de Sp35 de la presente invención pueden también incluir moléculas derivadas. Por ejemplo, los polipéptidos de Sp35 solubles de la presente invención pueden incluir regiones de Sp35 que han sido alteradas para mostrar asi características adicionales no encontradas en el polipéptido nativo. Los ejemplos incluyen proteínas de fusión y conjugados proteicos. En la presente invención, un "fragmento polipeptídico" se refiere a una secuencia corta de aminoácido de un polipéptido de Sp35. Los fragmentos proteicos pueden ser de "permanencia libre" o comprendidos dentro de un polipéptido más grande del cual el fragmento forma una parte o región. Los ejemplos representativos de los fragmentos polipeptídicos de la invención incluyen, por ejemplo, fragmentos que comprenden aproximadamente 5 aminoácidos, aproximadamente 10 aminoácidos, aproximadamente 15 aminoácidos, aproximadamente 20 aminoácidos, aproximadamente 30 aminoácidos, aproximadamente 40 aminoácidos, aproximadamente 50 aminoácidos, aproximadamente 60 aminoácidos, aproximadamente 70 aminoácidos, aproximadamente 80 aminoácidos, aproximadamente 90 aminoácidos, y aproximadamente 100 aminoácidos o más de longitud. En ciertas modalidades, los antagonistas de Sp35 para el uso en los métodos descritos en la presente son moléculas de "anticuerpo" o "inmunóglobulina" , o fragmentos inmunoespecífieos de los mismos, por ejemplo, moléculas de anticuerpo o de inmunóglobulina de origen natural con moléculas o fragmentos de anticuerpo manipulados por ingeniería genética que enlazan al antígeno de una manera similar a las moléculas de anticuerpo. Los términos "anticuerpo" e "inmunóglobulina" son utilizados aquí intercambiablemente. Además, las moléculas de inmunóglobulina utilizadas en los métodos de la invención son también descritas como moléculas "inmunoespecí ficas" o "específicas de antígeno" o "de enlace al antígeno" y son utilizados aquí intercambiablemente para referirse a las moléculas de anticuerpo o fragmentos de los mismos. Un anticuerpo o inmunóglobulina comprende al menos un dominio variable de una cadena pesada, y normalmente comprende al menos los dominios variables de una cadena pesada y una cadena ligera. Las estructuras de inmunóglobulina básicas en sistemas de vertebrados son relativamente bien comprendidas. Ver por ejemplo, Harlow et al, Antibodies,: A. Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a edición. 1988), incorporada por referencia en la presente. Como será discutido con más detalle más adelante, el término "inmunóglobulina" comprende cinco clases amplias de polipéptidos que pueden ser distinguidos bioquímicamente. Las cinco clases están claramente dentro del alcance de la presente invención, la siguiente discusión será dirigida a la clase IgG de moléculas de inmunoglobulina. Con respecto a la IgG, una molécula de inmunoglobulina estándar comprende dos polipéptidos idénticos de cadena ligera de peso molecular de aproximadamente 23,000 Daltons, y dos polipéptidos idénticos de cadena pesada de peso molecular de 53,000-70,000. Las cuatro cadenas están típicamente unidas por enlaces disulfuro en una configuración de "Y" en donde las cadenas ligeras abrazan las cadenas pesadas comenzando en la boca de la "Y" y continuando a través de la región variable. Las cadenas ligeras y pesadas son divididas en regiones de homología estructural y funcional. Los términos "constante" y "variable" son utilizados funcionalmente . A este respecto, se apreciará que los dominios variables de las porciones de cadena ligera (VL) y de cadena pesada (VH) determinan el reconocimiento y la especificidad de antígeno. De manera contraria, los dominios constantes de la cadena ligera (CL) y la cadena pesada (CH1, CH2 o CH3) confieren propiedades biológicas importantes tales como secreción, movilidad transplacentaria, enlace al receptor de Fe, enlace al complemento y similares. Por convención la numeración de los dominios de la región constante se incrementa conforme éstos se vuelven más distales del sitio de enlace al antígeno o el extremo amino del anticuerpo. La porción N-terminal es una región variable y en la porción C-terminal está una región constante; los dominios CH3 y CL efectivamente comprenden el extremo carboxilo de la cadena pesada y la cadena ligera, respectivamente. Las cadenas ligeras son clasificadas ya sea como kappa o lambda (K, ?) . Cada clase de cadena pesada puede ser enlazada ya sea con una cadena ligera kappa o lambda. En general, las cadenas ligeras y pesadas están covalentemente enlazadas una a la otra, y las porciones de "cola" de las dos cadenas pesadas están unidas una a la otra por enlaces disulfuro covalentes o enlaces no covalentes cuando las inmunoglobulinas son generadas ya sea por hibridomas, por células B o células hospederas manipuladas por ingeniería genética. En la cadena pesada, las secuencias de aminoácidos corren desde un extremo N en los extremos en forma de horquilla de la configuración en Y hacia el extremo C en el fondo de cada cadena. Aquellos expertos en la materia apreciarán que las cadenas pesadas son clasificadas como gamma, miu, alfa, delta, o epsilon, (?, µ, , d, e) con algunas subclases entre ellas (por ejemplo, ?1-?4). Es la naturaleza de esta cadena la que determina las "clases" del anticuerpo como IgG, Ig , IgA IgG, o IgE, respectivamente. Las subclases de inmunoglobulina (isotipos) , por ejemplo, IgGi, IgG2, IgG3, IgG4, IgAi, etc., están bien caracterizadas y se sabe que confieren especialización funcional. Las versiones modificadas de cada una de estas clases de isotipos son fácilmente discernibles para el experto en la técnica, en vista de la presente descripción y, en consecuencia, están dentro del alcance de la presente invención. Como se indicó anteriormente, la región variable permite que el anticuerpo reconozca selectivamente y se enlace específicamente a los epitopos sobre los antígenos. Es decir, el dominio VL y el dominio VH de un anticuerpo se combina para formar la región variable que define un sitio de enlace al antígeno, tridimensional. Esta estructura de anticuerpo cuaternario forma el sitio de enlace al antígeno presente en el extremo de cada brazo de la Y. Más específicamente, el sitio de enlace al antígeno es definido por tres regiones de determinación de la complementariedad (CDRs) sobre cada una de las cadenas VH y VL. En algunos casos, por ejemplo, ciertas moléculas de inmunoglobulina derivadas de especies de camélidos o manipuladas por ingeniería con base en inmunoglobulinas de camélido, una molécula de inmunoglobulina completa puede consistir de las cadenas pesadas únicamente, sin cadenas ligeras. Ver por ejemplo, Hamers-Casterman et al., Nature 363:446-448 (1993) . En anticuerpos de origen natural, las seis "regiones de determinación de la complementariedad" o "CDRs" presentes en cada dominio de enlace al antígeno son secuencias no contiguas, cortas de aminoácidos que están específicamente colocadas para formar el dominio de enlace al antigeno, conforme el antigeno asume su configuración tridimensional en un ambiente acuoso. El resto de los aminoácidos en los dominios de enlace al antigeno, denominadas como regiones "estructurales", muestran menos variabilidad intermolecular. Las regiones estructurales adoptan en gran medida una configuración de lámina ß y las CDRs forman bucles que conectan, y en algunos casos forman parte de, la estructura de lámina ß. De este modo, las regiones estructurales actúan para formar un andamiaje que proporciona el posicionamiento de las CDRs en la orientación correcta mediante interacciones intercatenarias, no covalentes. El dominio de enlace al antigeno formado por las CDRs posicionadas define una superficie complementaria al epitopo sobre el antigeno inmunorreactivo . Esta superficie complementaria promueve el enlace no covalente del anticuerpo a su epitopo cognado. Los aminoácidos que comprenden las CDRs y las regiones estructurales, respectivamente, pueden ser fácilmente identificados para cualquier región variable de cadena pesada o cadena ligera dada, por una persona de experiencia en la técnica, ya que éstas han sido definidas de manera precisa (ver "Sequences of Proteins of Immunological Interest," Kabat, E . , · et al, U.S. Department of Health and Human Services, (1983); y Chothia and Lesk, J. Mol Biol . , 196:901-917 (1987), las cuales son incorporadas por referencia en la presente en su totalidad) .
En especies de camélidos, no obstante, la región variable de cadena pesada, denominada como VHH, forma la CDR completa. Las principales diferencias entre las regiones variables VHH de camélido y aquellas derivadas de anticuerpos convencionales (VH) incluyen (a) más aminoácidos hidrofóbicos en la superficie de contacto de la cadena ligera de VH en comparación a la región correspondiente en VHH, (b) una CDR3 más larga en VHH, y (c) la aparición frecuente de un enlace disulfuro entre CDR1 y CDR3 en VHH. En una modalidad, una molécula de enlace al antigeno para el uso en los métodos de la invención comprende al menos una CDR de cadena pesada o ligera de una molécula de anticuerpo. En otra modalidad más, una molécula de enlace al antigeno para el uso en los métodos de la invención comprende al menos dos CDRs provenientes de una o más moléculas de anticuerpo. En otra modalidad más, una molécula de enlace al antigeno para el uso en los métodos de la invención comprende al menos tres CDRs provenientes de una o más moléculas de anticuerpo. En otra modalidad más, una molécula de enlace al antigeno para el uso en los métodos de la invención comprende al menos cuatro CDRs provenientes de una o más moléculas de anticuerpo. En otra modalidad más, una molécula de enlace al antigeno para el uso en los métodos de la invención comprende al menos cinco CDRs provenientes de una o más moléculas de anticuerpo. En otra modalidad más, una molécula de enlace al antigeno para el uso en los métodos de la invención comprende al menos seis CDRs provenientes de una o más moléculas de anticuerpo. Las moléculas de anticuerpo ejemplares que comprenden al menos una CDR que puede ser incluida en las moléculas del enlace al antigeno presentes, son conocidas en la técnica y las moléculas ejemplares son descritas aquí. Los anticuerpos o los fragmentos inmunoespecificos de los mismos para el uso en los métodos de la invención incluyen-, pero no están limitados a, anticuerpos policlonales, monoclonales, multiespecificos , humanos, humanizados, primatizados o quiméricos, anticuerpos de cadena simple, fragmentos de enlace al epitopo, por ejemplo, Fab, Fab' y F(ab')2, Fd, Fvs, Fvs de cadena simple (scFv), anticuerpos de cadena simple, Fvs enlazados por puente disulfuro (sdFv), fragmentos que comprenden un dominio VL o un dominio VH, fragmentos producidos por una biblioteca de expresión de Fab, y anticuerpos anti-idiotipicos (anti-Id) (incluyendo, por ejemplo, los anticuerpos anti-Id para las moléculas de enlace descritas en la presente) . Las moléculas de ScFv son conocidas en la técnica y son descritas por ejemplo, en la Patente de los Estados Unidos No. 5,892,019. Las moléculas de inmunoglobulina o el anticuerpo de la invención pueden ser de cualquier tipo (por ejemplo, IgG, IgE, Ig , IgD, IgA, y IgY) , clase (por ejemplo, IgGi, IgG2, IgG3, IgG4, IgAi e IgA2) o subclase de molécula de inmunoglobulina.
Los fragmentos de anticuerpo, que incluyen anticuerpos de cadena simple pueden comprender la o las regiones variables solas o en combinación con la totalidad o una porción de los siguientes: la región de bisagra, los dominios CH1, CH2, y CH3 de la cadena pesada, o CL de la cadena ligera. También incluidos en la invención están los fragmentos de enlace al antigeno que comprenden también cualquier combinación de una o varias regiones variables con una región de bisagra, el dominio CH1, CH2, CH3, o CL. Los anticuerpos o fragmentos inmunoespecificos de los mismos para el uso en los métodos descritos en la presente, pueden ser provenientes de cualquier origen natural incluyendo aves y mamíferos. Preferentemente, los anticuerpos son anticuerpos humanos, murinos, de burro, de conejo, de cabra, de cobayo, de camello, de llama, de caballo o de pollo. En otra modalidad más, la región variable puede ser de origen condrictoide (por ejemplo, de tiburones). Como se utiliza en la presente, los anticuerpos "humanos" incluyen anticuerpos que tienen la secuencia de aminoácidos de una inmunoglobulina humana, e incluyen anticuerpos aislados de las bibliotecas de inmunoglobulina humana o provenientes de animales transgénicos para una o más inmunoglobulinas humanas y que no expresan inmunoglobulinas endógenas, como se describe anteriormente y, en la Patente de los Estados Unidos No. 5,939,598 por Kucherlapati et al.
Como se utiliza en la presente, el término "porción de cadena pesada" incluye las secuencias de aminoácidos derivadas de una cadena pesada de inmunoglobulina . Un polipéptido que comprende una porción de cadena pesada comprende al menos uno de: un dominio CH1, un dominio de bisagra {por ejemplo, región de bisagra superior, intermedia y/o inferior}, un dominio CH2, un dominio CH3 o una variante o fragmento de los mismos. Por ejemplo, una porción de cadena pesada puede comprender una cadena polipeptidica que comprende un dominio CH1; un dominio polipeptitidico que comprende un dominio CH1, al menos una porción de un dominio de bisagra, y un dominio CH2; una cadena polipeptidica que comprende un dominio CH1 y un dominio CH3; una cadena peptidica que comprende un dominio CH1, al menos una porción de un dominio de bisagra, y un dominio CH3, o una cadena polipeptidica que comprende un dominio CH1, al menos una porción de un dominio de bisagra, un dominio CH2, y un dominio CH3. La porción de cadena pesada puede también incluir un polipéptido que comprende una cadena polipeptidica que incluye un dominio CH3. Además, un polipéptido de enlace para el uso en la invención puede carecer de al menos una porción de un dominio CH2 (por ejemplo, todo o parte de un dominio CH2) . Como se describió anteriormente, podrá ser comprendido por una persona de experiencia ordinaria en la técnica que estos dominios (por ejemplo, las porciones de cadena pesada) pueden ser modificadas tal que éstas pueden variar en la secuencia de aminoácidos de la molécula de inmunoglobulina de origen natural. En ciertos anticuerpos para el antagonista de Sp35 o fragmentos inmunoespecificos de los mismos, para el uso en los métodos descritos en la presente, las porciones de cadena pesada de una cadena polipeptidica de un multimero son idénticas a aquellas sobre una segunda cadena polipeptidica del multimero. Alternativamente, los monómeros que contienen la porción de cadena pesada para el uso en los métodos de la invención no son idénticos. Por ejemplo, cada monómero puede comprender un sitio de enlace a un objetivo diferente, formando, por ejemplo, un anticuerpo biespecifico . Las porciones de cadena pesada de un polipéptido de enlace para el uso en los métodos descritos en la presente pueden ser derivados de diferentes moléculas de inmunoglobulinas . Por ejemplo, una porción de cadena pesada de un polipéptido puede comprender de un dominio CH1 derivado de una molécula de IgGi y una región de bisagra derivada de una molécula de IgG3. En otro ejemplo más, una porción de cadena pesada, puede comprender una región de bisagra derivada, en parte, de una molécula de IgGi y, en parte, de una molécula de IgG3. En otro ejemplo más, una porción de cadena pesada puede comprender una bisagra quimérica derivada en parte, de una molécula de IgGi y, en parte, de una molécula de IgG4. Como se utiliza en la presente, el término "porción de cadena ligera" incluye las secuencias de aminoácidos derivadas de una cadena ligera de inmunoglobulina . Preferentemente, la porción de cadena ligera comprende al menos uno de un dominio VL o CL. Una molécula aislada de ácido nucleico que codifica para una variante no natural de un polipéptido derivado de una inmunoglobulina (por ejemplo, una porción de cadena pesada o una porción de cadena ligera de inmunoglobulina) puede ser creada mediante la introducción de una o más sustituciones, adiciones o supresiones de nucleótidos dentro de la secuencia nucleotidica de la inmunoglobulina, tal que una o más sustituciones, adiciones o supresiones de aminoácidos son introducidos dentro de la proteina codificada. Las mutaciones pueden ser introducidas mediante técnicas estándares tales como la mutagénesis dirigida al sitio y la mutagénesis mediada por PCR. Preferentemente, las sustituciones conservadoras de aminoácidos son realizadas en uno o más residuos de aminoácidos no esenciales. Los anticuerpos o fragmentos inmunoespecificos de los mismos para el uso en los métodos descritos en la presente, pueden ser también descritos o especificados en términos de su afinidad de enlace a 'un polipéptido de la invención. Las afinidades de enlace preferidas incluyen aquellas con una constante de disociación o Kd menor de 5 x 10~2 M, 10~2 M, 5 x 10"3 Mi 10"3 M, 5 x 10~4 M, 10~4 M, 5 x 10"5 M, 10"5 M, 5 x 10"6 M, 10"6 M, 5 x 10"7 M, 10"7 M, 5 x 10"8 M, 10"8 M, 5 x 10"9 M, 10"9 M, 5 x 1010 M, 10"10 M, 5 x 10"11 M, 10"11 M, 5 x 10"12 M, 10"12 M, 5 x 10~13 M, 10"13 M, 5 x 10"14 M, 10"14 M, 5 x 10"15 M, o 10"15 M. Los anticuerpos o fragmentos inmunoespecificos de los mismos para el uso en los métodos descritos en la presente, actúan como antagonistas de Sp35 como se describe en la presente. Por ejemplo, un anticuerpo para el uso en los métodos de la presente invención puede funcionar como un antagonista, bloqueando o inhibiendo la actividad supresora del polipéptido Sp35. Como se utiliza en la presente, el término "anticuerpo quimérico" será considerado para dar a entender cualquier anticuerpo en donde la región o sitio inmunorreactivo sea obtenido o derivado de una primera especie, y la región constante (la cual puede estar intacta, parcial o modificada de acuerdo con la presente invención) es obtenida de una segunda especie. En ciertas modalidades, la región de enlace al objetivo o el sitio será proveniente de una fuente no humana (por ejemplo, ratón o primate) y la región constante es humana. Como se utiliza en la presente, el término "anticuerpo manipulado por ingeniería" se refiere un anticuerpo en el cual el dominio variable en la cadena pesada y en la cadena ligera o en ambas es alterado por al menos un reemplazo parcial de una o más CDRs provenientes de un anticuerpo de especificidad conocida y, si es necesaria, por el reemplazo parcial de la región estructural y el cambio de secuencia. Aunque las CDRs pueden ser derivadas de un anticuerpo de la misma clase o incluso subclase como el anticuerpo del cual son derivadas las regiones estructurales, se considera que las CDRs serán derivadas de un anticuerpo de clase diferente, y preferentemente de un anticuerpo de especie diferente. Un anticuerpo manipulado por ingeniería en el cual una o más CDRs del "donador" provenientes de un anticuerpo no humano de especificidad conocida es injertado dentro de una región estructural de cadena pesada o ligera humana, es denominada en la presente como un "anticuerpo humanizado". Puede no ser necesario reemplazar todas las CDRs con CDRs completas provenientes de la región variable donadora para transferir la capacidad de enlace al antígeno de un dominio variable a otro. Más bien, puede ser únicamente necesario transferir aquellos residuos que son necesarios para mantener la actividad del sitio de enlace al objetivo. Dadas las explicaciones descritas por ejemplo, en las patentes de los Estados Unidos Nos. 5,585,089, 5,693,761, 5,693,762, y 6,180,370, estará dentro de la competencia de aquellos expertos en la técnica, ya sea al llevar a cabo experimentación rutinaria o mediante pruebas de ensayo y error, obtener un anticuerpo funcional manipulado por ingeniería, o humanizado. Como se utilizan en la presente, los términos "ligado", "fusionado" o "fusión" son utilizados intercambiablemente. Estos términos se refieren a la unión entre si de dos o más elementos o componentes, por cualesquiera medios incluyendo conjugación química o medios recombinantes . Una "fusión intra-estructural" se refiere a la unión de dos o más estructuras de lectura abierta (ORFs) para formar una ORP más larga continua, de una manera que mantenga la estructura de lectura correcta de las ORFs originales. De este modo, la proteína de fusión recombinante resultante es una proteína simple que contiene dos o más segmentos que corresponden a los polipéptidos codificados por las ORFs originales (cuyos segmentos no están normalmente unidos así en la naturaleza.) Aunque la estructura de lectura es hecha de este modo continua a todo lo largo de los segmentos fusionados, los segmentos pueden ser física o espacialmente separados por, por ejemplo, la secuencia ligadora intra-estructural. En el contexto de los polipéptidos, una "secuencia lineal" o una "secuencia" es un orden de aminoácidos en un polipéptido en una dirección amino a carboxilo-terminal en la cual los residuos que están vecinos al otro en las secuencias, están contiguas en la estructura primaria del polipéptido. El término "expresión" como se utiliza en la presente, se refiere a un proceso mediante el cual un gen produce un producto bioquímico, por ejemplo, un ARN o polipéptido. El proceso incluye cualquier manifestación de la presencia funcional del gen dentro de la célula incluyendo sin limitación, la supresión del gen así como la expresión transitoria y la expresión estable. Este incluye sin limitación la transcripción del gen dentro de la ARN mensajera (ARNM) , ARN de transferencia (ARNt) , ARN pequeño en forma de horquilla (ARNsh) , ARN de interferencia pequeño (ARNsi) o cualquier otro producto de ARN y la traducción de tal ARNM en uno o varios polipéptidos . Si el producto final deseado es un producto bioquímico, la expresión incluye la creación de ese producto bioquímico y cualesquiera precursores . Por "sujeto", "individuo" o "animal" o "paciente" o "mamífero", se entiende cualquier sujeto, particularmente un sujeto mamífero, para quien se desea el diagnóstico, pronóstico o terapia. Los sujetos mamíferos incluyen, pero no están limitados a humanos, animales domésticos, animales de granja, animales de zoológico, animales deportivos, animales de mascota tales como perros, gatos, cobayos, conejos, ratas, ratones, caballos, ganado, vacas; primates tales como micos, monos, orangutanes y chimpancés; Cándidos tales como perros y lobos; félidos tales como gatos, leones y tigres; équidos tales como caballos, burros y cebras; animales de alimento tales como vacas, cerdos y ovejas; ungulados tales como venados y jirafas; roedores tales como ratones, ratas, hámsteres y cobayos; y asi sucesivamente. En ciertas modalidades, el mamífero es un sujeto humano. El término "interferencia de ARN" o "ARNi" se refiere al silenciamiento o disminución de la expresión del gen por los ARNsi. Este es el proceso del gen post-transcripcional , específico de secuencia, de silenciamiento en animales y plantas, iniciado por el ARNsi que es homólogo en su región dúplex a la secuencia del gen silenciado. El gen puede ser endógeno o exógeno al organismo, integrado presente dentro de un cromosoma o presente en un vector de transfección que no está integrado en el genoma . La expresión del gen es ya sea completa o parcialmente inhibida. El ARNi puede ser también considerado como inhibidor de la función de un ARN objetivo; la función del ARN objetivo puede ser completa o parcial.
Sp35 (LINGO-1/LRRN6) La invención está basada en el descubrimiento de que los antagonistas de Sp35 promueven el crecimiento de las neuritas y la supervivencia de las neuronas DA. Sp35 humana de origen natural es una proteína específica del sistema nervioso, glucosilada que consiste de 614 aminoácidos (SEQ ID No: 2) . El polipéptido de Sp35 humano contiene un dominio LRR que consiste de 14 repeticiones ricas en leucina (incluyendo los casquetes N- y C- terminales) , un dominio de Ig, una región transmembranal , y un dominio citoplásmico . El dominio citoplásmico contiene un sitio de fosforilación de tirosina canónico. Además, la proteina Sp35 de origen natural contiene una secuencia de señal, una región básica corta entre el dominio LRRCT e Ig, una región transmembranal entre el dominio de Ig y el dominio citoplásmico. El gen Sp35 humano contiene codones de inicio de la traducción alternativos, de modo que seis aminoácidos adicionales (MQVSKR; SEQ ID No: 3) pueden o no estar presentes en el extremo N de la secuencia de señal de Sp35. La Tabla 1 lista los dominios de Sp35 y otras regiones, de acuerdo al número de residuos de aminoácidos, con base en la secuencia de la SEQ ID No: 2.
Tabla 1 Dominio o Región Residuo Inicial Residuo Final Secuencia de señal 1 33 ó 35 LRRNT 34 ó 36 64 LRR 66 89 LRR 90 113 LRR 114 137 LRR 138 161 LRR 162 185 LRR 186 209 LRR 210 233 LRR 234 257 LRR 258 281 LRR 282 305 LRR 306 329 LRR 330 353 LRRCT 363 414 ó 416 Básico 415 ó 417 424 ig 419 493 Secuencia de conexión 494 551 Transmembrana 552 576 Citoplásmico 577 614 La distribución tisular y la expresión del desarrollo de Sp35 han sido estudiadas en humanos y en ratas. La biología de Sp35 ha sido estudiada en modelo de animal experimental (rata) . La expresión de Sp35 de rata está localizada hacia las neuronas del sistema nervioso y los oligodendrocitos cerebrales, como es determinado por la transferencia de northern y la tinción immuno-histoquímica . El nivel de expresión de ARNM de Sp35 de rata, es regulado en el desarrollo, llevando a un máximo poco después del nacimiento, por ejemplo, aproximadamente un día post-natal. En un modelo de daño de transección de médula espinal de rata, Sp35 es supra-regulado en el sitio del daño, comó es determinado por RT-PCR. Además, se ha mostrado que Sp35 interactúa con el receptor Nogo66 (receptor Nogo) . Ver por ejemplo, la Solicitud de Patente Internacional No. PCT/US2004/00832, Publicación del PCT No. WO2004 /08564. Sp35 (LINGO-1) es un componente adicional del complejo del receptor de neurotrofina receptor Nogo l-p75. Ver Mi et al, Nat Neurosci. 7:221-228 (2004), que se incorpora por referencia en la presente. De manera contraria, al receptor 1 de Nogo, la expresión del gen de Sp35 es incrementada cuando las células nerviosas adultas en la médula espinal son expuestas a daños traumáticos, sugiriendo que Sp35 tiene un papel biológico importante para la función neurológica del sistema nervioso central. Id. La secuencia nucleotídica para la molécula de Sp35 de longitud completa es como sigue: GTGCTGTGCCACCGCAAGCGCTTTGTGGCAGTCCCCGAGGGCATCCCCACCGAGACGCGCCTGCTGGACCTA GGCAAGAACCGCATCAAAACGCTCAACCAGGACGAGTTCGCCAGCTTCCCGCACCTGGAGGAGCTGGAGCTC AACGAGAACATCGTGAGCGCCGTGGAGCCCGGCGCCTTCAACAACCTCTTCAACCTCCGGACGCTGGGTCTC GAGAAATGCAACCTGACCTCCATCCCCACCGAGGCGCTGTCCCACCTGCACGGCCTCATCGTCCTGAGGCTC CGGCACCTCAACATCAATGCCATCCGGGACTACTCCTTCAAGAGGCTCTACCGACTCAAGGTCTTGGAGATC TCCCACTGGCCCTACTTGGACACCATGACACCCAACTGCCTCTACGGCCTCAACCTGACGTCCCTGTCCATC GTGGGCGGGCAGCTGGCCGTGGTGGAGCCCTATGCCTTCCGCGGCCTCAACTACCTGCGCGTGCTCAATGTC TCTGGCAACCAGCTGACCACACTGGAGGAATCAGTCTTCCACTCGGTGGGCAACCTGGAGACACTCATCCTG GACTCCAACCCGGTGGCCTGCGACTGTCGGCTCCTGTGGGTGTTCCGGCGCCGCTGGCGGCTCAACTTCAAC CGGCAGCAGCCCACGTGCGCCACGCCCGAGTTTGTCCAGGGCAAGGAGTTCAAGGACTTCCCTGATGTGCTA CTGCCCAACTACTTCACCTGCCGCCGCGCCCGCATCCGGGACCGCAAGGCCCAGCAGGTGTTTGTGGACGAG GGCCACACGGTGCAGTTTGTGTGCCGGGCCGATGGCGACCCGCCGCCCGCCATCCTCTGGCTCTCACCCCGA AAGCACCTGGTCTCAGCCAAGAGCAATGGGCGGCTCACAGTCTTCCCTGATGGCACGCTGGAGGTGCGCTAC GCCCAGGTACAGGACAACGGCACGTACCTGTGCATCGCGGCCAACGCGGGCGGCAACGACTCCATGCCCGCC CACCTGCATGTGCGCAGCTACTCGCCCGACTGGCCCCATCAGCCCAACAAGACCTTCGCTTTCATCTCCAAC CAGCCGGGCGAGGGAGAGGCCAACAGCACCCGCGCCACTGTGCCTTTCCCCTTCGACATCAAGACCCTCATC ATCGCCACCACCATGGGCTTCATCTCTTTCCTGGGCGTCGTCCTCTTCTGCCTGGTGCTGCTGTTTCTCTGG AGCCGGGGCAAGGGCAACACAAAGCACAACATCGAGATCGAGTATGTGCCCCGAAAGTCGGACGCAGGCATC AGCTCCGCCGACGCGCCCCGCAAGTTCAACATGAAGATGATATGA (SEQ ID N:l). La secuencia polipeptidica para el polipéptido de Sp35 de longitud completa es como sigue: MLAGGVRSMPSPLLACWQPILLLVLGSVLSGSATGCPPRCECSAQDRAVLCHRKRFVAVPEGIPTETRLLDL GKNRIKTLNQDEFASFPHLEELELNENIVSAVEPGAFNNLFNLRTLGLRSNRLKLIPLGVFTGLSNLTKLDI SENKIVILLDYMFQDLYNLKSLEVGDNDLVYISHRAFSGLNSLEQLTLEKCNLTSIPTEALSHLHGLIVLRL RHLNINAIRDYSFKRLYRLKVLEISHWPYLDTMTPNCLYGLNLTSLSITHCNLTAVPYLAVRHLVYLRFLNL SYNPISTIEGSMLHELLRLQEIQLVGGQLAWEPYAFRGLNYLRVLNVSGNQLTTLEESVFHSVGNLETLIL DSNPLACDCRLLWVFRRRWRLNFNRQQPTCATPEFVQGKEFKDFPDVLLPNYFTCRRARIRDRKAQQVFVDE GHTVQFVCRADGDPPPAILWLSPRKHLVSAKSNGRLTVFPDGTLEVRYAQVQDNGTYLCIAANAGGNDSMPA HLHVRSYSPDWPHQPNKTFAFISNQPGEGEANSTRATVPFPFDIKTLI IATTMGFISFLGWLFCLVLLFLW SRGKGNTKHNIEIEYVPRKSDAGISSADAPRKFNMKMI (SEQ ID No : 2 ) .
Métodos que utilizan antagonistas de Sp35 Una modalidad de la presente invención proporciona los métodos para promover la regeneración, el crecimiento o la supervivencia de las neuronas dopaminérgicas (DA) que comprenden poner en contacto las neuronas DA con una cantidad efectiva de un antagonista Sp35, o una composición que comprende un antagonista de Sp35, donde el antagonista de Sp35 se selecciona del grupo que consiste de un polipéptido de Sp35 soluble, un anticuerpo de Sp35, un polinucleótido antagonista de Sp35, un aptámero de Sp35, y una combinación de dos o más de los ' antagonistas de Sp35. Diversos antagonistas y métodos ejemplares de Sp35 y los materiales para obtener estas moléculas para practicar la presente invención son descritos más adelante y/o pueden ser encontradas por ejemplo, en la Solicitud de Patente Internacional No. PCT/US2004/008323, Publicación del PCT No. WO2004 /085648 , incorporadas por referencia en la presente en su totalidad. Los antagonistas del receptor de Sp35, útiles para la invención incluyen, por ejemplo, aquellos descritos en PCT/US2005/022881, Publicación del PCT No. WO2006/002437 , incorporadas por referencia en la presente en su totalidad. Una modalidad adicional de la presente invención proporciona los métodos para tratar una enfermedad, trastorno o daño asociado con la degeneración o muerte neuronal DA neuronal (por ejemplo, enfermedad de Parkinson) en un animal (por ejemplo, un mamífero) que sufre de tal enfermedad, el método comprende, consiste esencialmente de, o consiste en administrar al animal en necesidad de la misma, una cantidad terapéuticamente efectiva de un antagonista de Sp35, o la composición que comprende un antagonista de Sp35, seleccionado del grupo que consiste de un polipéptido de Sp35 soluble, un anticuerpo de Sp35, un polinucleótido del antagonista de Sp35, un aptámero de Sp35 y una combinación de dos o más de los antagonistas de Sp35. Las modalidades adicionales de la invención incluyen un método para promover la regeneración neuronal DA, el crecimiento o supervivencia para tratar una enfermedad, trastorno o daño asociado con la muerte neuronal DA, que comprende administrarle a un mamífero, en cerca del sitio de la enfermedad, trastorno o daño, una cantidad suficiente para reducir la inhibición de la regeneración, crecimiento o supervivencia de las neuronas DA. En los métodos de la presente invención, un antagonista de Sp35 puede ser administrado vía la administración directa de un polipéptido de Sp35 soluble, el anticuerpo de Sp35, el polinucleótido del antagonista de Sp35, el aptámero de Sp35 o combinaciones de los mismos al paciente. Alternativamente, el antagonista de Sp35 puede ser administrado vía un vector de expresión que produce el antagonista de Sp35 específico. En ciertas modalidades de la invención, un antagonista de Sp35 es administrado en un método de tratamiento que incluye: (1) transformar o transfectar una célula hospedera implantable con un ácido nucleico, por. ejemplo, que expresa un antagonista de Sp35; y (2) implantar la célula hospedera transformada dentro un mamífero, en el sitio de una enfermedad, trastorno o daño. Por ejemplo, la célula hospedera transformada puede ser implantada en ciertos sitios afectados -de la fuente de las neuronas tales como el . mesencéfalo, o sus objetivos de conexiones tales como el putamen, caudal, corteza, globus pallidus o núcleo subtalámico. En algunas modalidades de la invención, la célula hospedera implantable es removida de un mamífero, temporalmente cultivado, transformado o transfectado con un ácido nucleico aislado que codifica para un antagonista de Sp35, e implantado nuevamente dentro del mismo mamífero del cual fue recuperada. La célula puede ser, pero no se requiere que sea, retirada del mismo sitio en el cual es implantada. Tales modalidades, algunas veces conocidas como terapia génica ex vivo pueden proporcionar un suministro continuo del antagonista de Sp35, localizado en el sitio de acción, por un periodo de tiempo limitado. Las enfermedades o trastornos que pueden ser tratados o mejorados por los métodos de la presente invención incluyen enfermedades, trastornos o daños que se refieren a la muerte, degeneración o falta de regeneración o diferenciación de las neuronas DA. Tales enfermedades incluyen, pero no están limitadas a, enfermedad de Parkinson (PD), atrofia del sistema múltiple., degeneraciones estriatonigral, atrofia olivopontocerebelar , síndrome de Shy-Drager, enfermedades de las neuronas motoras con características parkinsonianas, demencia por cuerpos de Lewy, parálisis supranuclear progresiva, degeneración ganglionar cortical-basal, demencia frontotemporal, enfermedad de Alzheimer con parkinsonismo, enfermedad de Wilson, enfermedad de Hallervordern-Spatz, enfermedad de Chediak-Hagashi , ataxia espinocerebral SCA-3, distonia-parkinsonismo ligado a X (DYT3), enfermedad de Huntington (variante de Westphal) , enfermedad de* los priones, enfermedad de Jacob-Creutzfeldt (CJD) , parkinsonismo vascular, parálisis cerebral, trauma craneal repetido, parkinsonismo post-encefalítico, neurosífilos y esquizofrenia. Un antagonista de Sp35, por ejemplo, un polipéptido de Sp35 soluble, un anticuerpo de Sp35, un polinucleótido del antagonista de Sp35, o un aptámero de" Sp35, que van a ser utilizados en los métodos descritos en la presente, pueden ser preparados o utilizados como un agente terapéutico que detiene, reduce, previene o inhibe la habilidad de Sp35 para regular de manera negativa el crecimiento de las neuritas DA, la supervivencia o la regeneración de las mismas.
Polipéptidos de Sp35 solubles Los antagonistas de Sp35 que van a ser utilizados en los métodos de la presente invención incluyen aquellos polipéptidos que bloquean, inhiben o interfieren con la función biológica del Sp35 de origen natural. Específicamente, los polipéptidos de Sp35 solubles de la presente invención incluyen fragmentos, variantes o derivados de los mismos de un polipéptido de Sp35 soluble. La Tabla 1 anterior describe los diversos dominios del polipéptido de Sp35. Los polipéptidos de Sp35 solubles carecen del dominio transmembranal y químicamente carecen del dominio intracelular del polipéptido de Sp35. Por ejemplo, ciertos polipéptidos de Sp35 solubles carecen de los aminoácidos 552-576 que comprenden el dominio transmembranal de Sp35 y/o los aminoácidos 577-614 que comprenden el domino intracelular de Sp35. Además, ciertos polipéptidos de Sp35 solubles, comprenden los dominios LRR, el dominio de Ig, la región básica y/o el dominio extracelular completo (correspondiente a los aminoácidos 34 al 532 de la SEQ ID No: 2) del polipéptido de Sp35. Como una persona experta en la técnica podría apreciar, el dominio extracelular completo de Sp35 puede comprender aminoácidos adicionales o menos sobre el extremo C-terminal o N-terminal del polipéptido del dominio extracelular. Como tales, los polipéptido de Sp35 solubles para el uso en los métodos de la presente invención incluyen, pero no están limitados a, un polipéptido de Sp35 que comprende, que consiste esencialmente de, o que consiste de los aminoácidos 41 al 525 de la SEQ ID No: 2; 40 al 526 de la SEQ ID No: 2; 39 al 527 de la SEQ ID No: 2; 38 al 528 de la SEQ ID No: 2; 37 al 529 de la SEQ ID No: 2; 36 al 530 dé la SEQ ID No: 2; 35 al 531 de la SEQ ID No: 2; 34 al 531 de la SEQ ID No: 2; 46 al 520 de la SEQ ID No: 2; 45 al 521 de la SEQ ID No: 2; 44 al 522 de la SEQ ID No: 2; 43 al 523 de la SEQ ID No: 2; y 42 al 524 de la SEQ ID No: 2 o fragmentos, variantes, o derivativos de tales polipéptido. Los antagonistas del polipéptido Sp35 pueden incluir cualquier combinación de dominios como se describe en la Tabla 1. Los polipéptidos de Sp35 solubles adicionales, para el uso en los métodos de la presente invención, incluyen pero no están limitados a, un polipéptido de Sp35 que comprende, que consiste- esencialmente de o que consiste de los aminoácidos 1 al 33 de la SEQ ID No.: 2; 1 al 35 de la SEQ ID No.: 2; 34 al 64 de la SEQ ID No.: 2; 36 al 64 de la SEQ ID No.: 2; 66 al 89 de la SEQ ID No.: 2; 90 al 113 de la SEQ ID No.: 2; 114 al 137 de la SEQ ID No.: 2; 138 al 161 de la SEQ ID No.: 2; 162 al 185 de la SEQ ID No.: 2; 186 al 209 de la SEQ ID. NO: 2; 210 al 233 de la SEQ ID No.: 2; 234 al 257 de la SEQ ID No.: 2; 258 al 281 de la SEQ ID No.: 2; 282 al 305 de la SEQ ID No.: 2; 306 al 329 de la SEQ ID No.: 2; 330 al 353 de la SEQ ID No.: 2; 363 al 416 de la SEQ. ID NO: 2; 417 al 424 de la SEQ ID No.: 2; 419 al 493 de la SEQ ID No.: 2; y 494 al 551 de la SEQ ID No.: 2 o fragmentos, variantes o derivados de tales polipéptidos. Los polipéptidos de Sp35 solubles, adicionales en los métodos de la presente invención incluyen, pero no están limitados a, un polipéptido de Sp35 que comprende, que consiste esencialmente de, o que consiste de los aminoácidos 1 al 33 de la SEQ ID No.: 2; 1 al 35 de la SEQ ID No.: 2; 1 al 64 de la SEQ ID No.: 2; 1 al 89 de la SEQ ID No.: 2; 1 al 113 de la SEQ ID No.: 2; 1 al 137 de la SEQ ID No.: 2; 1 al 161 de la SEQ ID No.: 2; 1 al 185 de la SEQ ID No.: 2; 1 al 209 de la SEQ ID No.: 2; 1 al 233 de la SEQ ID No.: 2; 1 al 257 de la SEQ ID No.: 2; 1 al 281 de la SEQ ID No.: 2; 1 al 305 de la SEQ ID No.: 2; 1 al 329 de la SEQ ID No.: 2; 1 al 353 de la SEQ ID "No.: 2; 1 al 416 de la SEQ ID No.: 2; 1 al 424 de la SEQ ID NO.: 2; 1 al 493 de la SEQ ID No.: 2; 1 al 551 de la SEQ ID No.: 2; 1 al 531 de la SEQ ID No.: 2 y 1 al 532 de la SEQ ID No.: 2 o fragmentos, variantes o derivados de tales polipéptidos . Los polipéptidos de Sp35 solubles adicionales para el uso en los métodos de la presente invención incluyen, pero no están limitados a, un polipéptido de Sp35 que comprende, que consiste esencialmente de, o que consiste de los aminoácidos 34 al 64 de la SEQ ID No.: 2; 34 al 89 de la SEQ ID NO.: 2; 34 al 113 de la SEQ ID No.: 2; 34 al 137 de la SEQ ID No.: 2; 34 al 161 de la SEQ ID No.: 2; 34 al 185 de la SEQ ID No.: 2; 34 al 209 de la SEQ ED NO: 2; 34 al 233 de la SEQ ID No.: 2; 34 al 257 de la SEQ ID No.: 2; 34 al 281 de la SEQ ID No.: 2; 34 al 305 de la SEQ ID No.: 2; 34 al 329 de la SEQ ID No.: 2; 34 al 353 de la SEQ ED NO: 2; 34 al 416 de la SEQ ID No.: 2; 34 al 424 de la SEQ ID No.: 2; 34 al 493 de la SEQ ID No.: 2; y 34 al 551 de la SEQ ID NO: 2 o fragmentos, variantes o derivados de tales polipéptidos . Los polipéptidos de Sp35 solubles, adicionales para el uso' en los métodos de la presente invención incluyen, pero no están limitados a, un polipéptido de Sp35 que comprende que consiste esencialmente de, o que consiste de los aminoácidos 34 al 530 de la SEQ ID No.: 2; 34 al 531 de la SEQ ID No.: 2; 34 al 532 de la SEQ ID No.: 2; 34 al 533 de la SEQ ID No.: 2; 34 al 534 de la SEQ ID No.: 2; 34 al 535 de la SEQ ID No.: 2; 34 al 536 de la SEQ ID No.: 2; 34 al 537 de la SEQ ID No.: 2; 34 al 538 de la SEQ ID No.: 2; 34 al 539 de la SEQ ID No.: 2; 30 al 532 de la SEQ ID No.: 2; 31 al 532 de la SEQ ID No.: 2; 32 al 532 de la SEQ ID No.: 2; 33 al 532 de la SEQ ID No.: 2; 34 al 532 de la SEQ ID No.: 2; 35 al 532 de la SEQ ID NO.2; 36 al 532 de la SEQ ID No.: 2; 30 al 531 de la SEQ ID No.: 2; 31 al 531 de la SEQ ID No.: 2; 32 al 531 de la SEQ ID No.: 2; 33 al 531 de la SEQ ID No.: 2; 34 al 531 de la SEQ ID No.: 2; 35 al 531 de la SEQ ID No.: 2; y 36 al 531 de la SEQ ID NO.2 o fragmentos, variantes o derivados de tales polipéptidos . Los polipéptidos Sp35 solubles, adicionales para el uso en los métodos de la presente invención incluyen, pero no están limitados a, un polipéptido de Sp35 que comprende que consiste esencialmente de, o que consiste de los aminoácidos 36 al 64 de la SEQ ID No.: 2; 36 al 89 de la SEQ ID No.: 2; 36 al 113 de la SEQ ID No.: 2; 36 al 137 de la SEQ ID No.: 2 ; 36 al 161 de la SEQ ID No.: 2; 36 al 185 de la SEQ ID No.: 2; 36 al 209 de la SEQ ID No.: 2; 36 al 233 de la SEQ ID No.: 2 ; 36 al 257 de la SEQ ID No.: 2; 36 al 281 de la SEQ ID No: 2 ; 36 al 305 de la SEQ ID No.: 2; 36 al 329 de la SEQ ID No.: 2; 36 al 353 de la SEQ ID No.: 2; 36 al 416 de la SEQ ID No.:. 2; 36 al 424 de la SEQ BD NO:2; 36 al 493 de la SEQ ID No.: 2; y 36 al 551 de la SEQ ID NO.2 o fragmentos, variantes o derivados de tales polipéptidos . Los polipéptidos de Sp35 solubles, adicionales para el uso en los métodos de la presente invención incluyen, pero no están limitados a, un polipéptido de Sp35 que comprende que consiste esencialmente de, o que consiste de los aminoácidos 36 al 530 de la SEQ ID No.: 2; 36 al 531 de la SEQ ID No.: 2; 36 al 532 de la SEQ ID No.: 2; 36 al 533 de la SEQ ID No.: 2; 36 al 534 de la SEQ ID No.: 2; 36 al 535 de la SEQ ID No: 2; 36 al 536 de la SEQ ID No.: 2; 36 al 537 de la SEQ ID No: 2; 36 al 538 de la SEQ ID No.: 2; y 36 al 539 de la SEQ ID No.: 2; o fragmentos, variantes o derivados de tales polipéptidos. Los polipéptidos de Sp35 solubles, adicionales, fragmentos, variantes o derivados de los mismos incluyen los polipéptidos que comprenden el dominio de Ig de Sp35. Por ejemplo, un polipéptido de Sp35 que comprende que consiste esencialmente de, o que consiste de los aminoácidos 417 al 493 de la SEQ ID No: 2; 417 al 494 de la SEQ ID No.: 2; 417 al 495 de la SEQ ID No.: 2; 417 al 496 de la SEQ ID No.:2; 417 al 497 de la SEQ ID No.: 2; 417 al 498 de la SEQ ID No: 2; 417 al 499 de la SEQ ID No.: 2; 417 al 500 de la SEQ ID No.: 2; 417 al 492 de la SEQ ID No.: 2; 417 al 491 de la SEQ ID No.: 2; 412 al 493 de la SEQ ID No.: 2; 413 al 493 de la SEQ ID No.: 2; 414 al 493 de la SEQ ID No.: 2; 415 al 493 de la SEQ ID No.: 2; 416 al 493 de la SEQ ID No.: 2; 411 al 493 de la SEQ ID No.: 2; 410 al 493 de la SEQ ID No.: 2; 410 al 494 de la SEQ ID No.: 2; 411 al 494 de la SEQ ID No.: 2; 412 al 494 de la SEQ ID No:2; 413 al 494 de la SEQ ID No.: 2; 414 al 494 de la SEQ ID No.: 2; 415 al 494 de la SEQ ID No.: 2; 416 al 494 de la SEQ ID No.: 2; 417 al 494 de la SEQ ID No.: 2; y 418 al 494 de la SEQ ID No.: 2 o fragmentos, variantes o derivados de tales polipéptidos . Diversos polipéptidos de Sp35 solubles, ejemplares, y los métodos y materiales para obtener estas moléculas para practicar la presente invención son descritos más adelante y/o pueden ser encontrados, en una Solicitud de Patente Internacional No. PCT/US2004/008323, Publicación del PCT No. WO2004/085648 , incorporadas por referencia en la presente, en su totalidad. Los polipéptidos de Sp35 solubles para el uso en los métodos de la presente invención descrita en la presente pueden ser cíclicos. La ciclización de los polipéptidos de Sp35 solubles reduce la libertad conformacional de los péptidos lineales y da como resultado una molécula más · estructuralmente constreñida. Muchos métodos de ciclización de péptidos son conocidos en la técnica, por ejemplo, la ciclización de "cadena principal a cadena principal" o "columna vertebral a columna vertebral" mediante la formación de un enlace amida entre los residuos de aminoácidos N- terminal y C-terminal del péptido. El método de ciclización "cadena principal a cadena principal" incluye la formación de puentes disulfuro entre los dos residuos de ?-tio aminoácido (por ejemplo, cisteína, homocisteína ) . Ciertos péptidos de Sp35 solubles de la presente invención incluyen la modificación sobre el extremo N- y C- del péptido, para formar un polipéptido de Sp35 cíclico. Tales modificaciones incluyen, pero no están limitados a, residuos de cisteína, residuos de cisteína acetilados, residuos de cisteína con una porción NH2 y biotina. Otros métodos de ciclización del péptido son descritos en Li & Roller. Curr. Top. Med. Chem. 3:325-341 (2002), que se incorpora por referencia en la presente en su totalidad. Los polipéptidos de Sp35 solubles descritos en la presente pueden tener diversas alteraciones tales como sustituciones, inserciones o supresiones. Por ejemplo, las sustituciones incluyen, pero no están limitadas a las siguientes sustituciones: valina en la posición 6 del polipéptido de Sp35 de la SEQ ID No.: 2 a metionina; serina en la posición 294 del polipéptido de Sp35 de la SEQ ID No. : 2 a glicina; valina en la posición 348 del polipéptido de Sp35 de la SEQ ED No.: 2 a alanina; arginina en la posición 419 del polipéptido de Sp35 a histidina; arginina en la posición 456.a ácido glutámico; e histidina en la posición 458 de la SEQ ID No.: 2 a valina. Los fragmentos correspondientes de los polipéptidos de Sp35 solubles al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, ó 95% idénticos a los polipéptidos de la SEQ ID No. : 2 descritos en la presente, son también contemplados. Como es conocido en la técnica, "identidad de secuencia" o "identidad secuencial" entre dos polipéptidos es determinada por la comparación de las secuencias de aminoácidos de un polipéptido a la secuencia de un segundo polipéptido. Cuando se discuten en la presente, ya sea cualquier polipéptido particular es al menos aproximadamente 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ó 95% idéntico a otro polipéptido, esto puede ser utilizado determinando métodos y programas/software de computadora conocidos en la materia, tales como, pero no limitados a, el programa BESTFIT (paquete de análisis de secuencias Wisconsin, versión 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711) . BESTFIT utiliza el algoritmo de homología de Smith y aterman, Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981), para encontrar el mejor segmento de homología entre dos secuencias. Cuando se utiliza BESTFIT · o cualquier otro programa de alineación secuencial para determinar si una secuencia particular es, por ejemplo, 95% idéntica a una secuencia de referencia de acuerdo a la presente invención, los parámetros son establecidos, por supuesto, tal que el porcentaje de identidad es calculado sobre la longitud completa de la secuencia polipeptídica de referencia y que son permitidos espacios vacíos en la homología de hasta 5% del número total de aminoácidos en la secuencia de referencia. Los polipéptido de Sp35 solubles para el uso en los métodos de la presente invención pueden incluir cualquier combinación de dos o más polipéptidos de Sp35 solubles.
Anticuerpos o Fragmentos de Enlace al Antígeno de los Mismos En una modalidad, un agonista de Sp35 para el uso en los métodos de la invención es una molécula de anticuerpo, o un fragmento monoespecífico del mismo. A no ser que se anote específicamente de otro modo, como se utiliza en la presente, un "fragmento del mismo" en referencia a un anticuerpo, se refiere a un fragmento inmunoespecífico, por ejemplo, un fragmento específico del antígeno. En una modalidad, un anticuerpo para el uso en los métodos de la invención es una molécula de enlace biespecifica, el polipéptido de enlace, o el anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo biespecifico, minicuerpo, anticuerpo suprimido del dominio, o proteina de fusión que tiene especificidad de enlace para más de un epitopo, por ejemplo, más de un antigeno y más de un epitopo sobre el mismo antigeno. En una modalidad, un anticuerpo biespecifico tiene al menos un dominio de enlace especifico para al menos un epitopo sobre Sp35. Un anticuerpo biespecifico puede ser un anticuerpo tetravalente que tiene dos dominios de enlace objetivo específicos para un epitopo de Sp35 y dos dominios de enlace al objetivo para un. segundo objetivo. De este modo, un anticuerpo tetravalente puede ser bivalente para- cada especificidad. Los antagonistas de Sp35 para el uso en los métodos de la presente invención incluyen también los anticuerpos específicos para Sp35 o los fragmentos de enlace al antígeno, variantes o derivados que son antagonistas de la actividad de Sp35. Por ejemplo, el enlace de ciertos anticuerpos de Sp35 a Sp35, como se expresa en las neuronas DA, bloquea la inhibición del crecimiento de las neuritas DA, la diferenciación y la supervivencia de las mismas. Ciertos anticuerpos antagonistas para el uso en los métodos descritos en la presente específica o preferentemente se enlazan a un fragmento polipeptídico de Sp35 particular o un dominio del mismo. Tales fragmentos polipeptidicos de Sp35 incluyen, pero no están limitados a, un polipéptido de Sp35 que comprende, que consiste esencialmente de, o que consiste de los aminoácidos 34 al 532; 34 al 417, 34 al 425, 34 al 493, 66 al 532, 66 al 417 (dominio LRR) , 66 al 426, 66 al 493, 66 al 532, 417 al 532, 417 al 425 (la región básica de Sp35), 417 al 424 (la región básica de Sp35) , 417 al 493, 417 al 532, 419 al 493 (la región de Ig de Sp35), ó 425 al 532 de la SEQ ID No.: 2, o un polipéptido variante de Sp35 al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, ó 95% idéntico a los aminoácidos 34 al 532; 34 al 417, 34 al 425, 34 al 493, 66 al 532, 66 al 417, 66 al 426, 66 al 493, 66 al 532, 417 al 532, 417 al 425 (la región básica de Sp35), 417 al 493, 417 al 532, 419 al 493 (la región de Ig de Sp35), ó 425 al 532 de la SEQ ID No. : 2. Los fragmentos peptidicos de Sp35, adicionales, a los cuales se enlazan ciertos anticuerpos específicos de Sp35, o los fragmentos de enlace al antígeno, variantes- o derivados de los mismos para el uso en los métodos de la presente invención incluyen, pero no están limitados a, aquellos fragmentos que comprenden, que consisten esencialmente de, o que consisten de. una o más repeticiones ricas en leucina (LRR) de Sp35. Tales fragmentos incluyen, por ejemplo, fragmentos que comprenden que consisten esencialmente de, o que consisten de los aminoácidos 66 al 89, 66 al 113, 66 al 137, 90 al 113, 114 al 137, 138 al 161, 162 al 185, 186 al 209, 210 al 233, 234 al 257, 258 al 281, 282 al 305, 306 al 329, ó 330 al 353 de la SEQ ID No.: 2. Los fragmentos correspondientes de un polipéptido de Sp35 variantes, al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, ó 95% idéntico a los aminoácidos 66 al 89, 66 al 113, 90 al 113, 114' al 137, 138 al 161, 162 al 185, 186"al 209, 210 al 233, 234 al 257, 258 al 281, 282 al 305, 306 al 329, ó 330 al 353 de la SEQ ID No.: 2 son también contemplados. Los fragmentos peptidicos de Sp35 adicionales a los cuales se enlazan ciertos anticuerpos, o fragmentos de enlace al antigeno, variantes, o derivativos de los mismos de la presente invención incluyen, pero no están limitados a, aquellos fragmentos que comprenden, que consisten esencialmente de, o que consisten de una o más regiones ricas en cisteina que flanquean la región LRR de Sp35. Tales fragmentos incluyen, por ejemplo, un fragmento que comprende, que consiste esencialmente de, o que consiste de los aminoácidos 34 al 64 de la SEQ ID No.: 2 (la región flanqueante LRR N-terminal (LRRNT) ) , o un fragmento que comprende, que consiste esencialmente de, o que consiste de los aminoácidos 363 al 416 de la SEQ ID No.: 2 (la región flanqueante LRR C-terminal (LRRCT) ) . Los fragmentos correspondientes de un polipéptido de Sp35 variante, al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, ó 95% idéntico a los aminoácidos 34 al 64 y 363 al 416 de la SEQ ID No.: 2 son también contemplados . En otras modalidades, los antagonistas Sp35 que van a ser utilizados en los métodos descritos en la presente, incluyen un anticuerpo, o fragmento de enlace al antigeno, variante, o derivativo del mismo que se enlaza especifica o preferentemente al menos a un epitopo de Sp35, donde el epitopo comprende, consiste esencialmente de, o consiste de al menos aproximadamente cuatro a cinco aminoácidos de la SEQ ID No.: 2, al menos siete, al menos nueve, o entre al menos aproximadamente 15 al aproximadamente 30 aminoácidos de la SEQ ID No.: 2. Los aminoácidos de un epitopo de la SEQ ID No.: 2 como se describe pueden ser, pero no necesariamente contiguos o lineales. En ciertas modalidades, al menos un epitopo de Sp35 comprende, consiste esencialmente de o consiste de un epitopo no lineal formado por el dominio no extracelular de Sp35 como es expresado sobre la superficie de una célula o como un fragmento soluble, por ejemplo, fusionado a una región Fe de IgG. De este modo, en ciertas modalidades, al menos un epitopo de Sp35 comprende, consiste esencialmente de, o consiste de al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 15, al menos 20, al menos 25, entre aproximadamente 15 al aproximadamente 30, ó al menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, • 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, ó 100 aminoácidos contiguos o no contiguos de la SEQ ID No. : 2, donde los aminoácidos no contiguos forman un epitopo a través del plegamiento de la proteina. En otras modalidades, los antagonistas de Sp35 que van a ser utilizados en los métodos de la presente invención incluyen los anticuerpos de Sp35, los fragmentos de enlace al antígeno, variantes, o derivados de los mismos que especifica o preferentemente se enlazan al menos a un epitopo de Sp35, donde el epitopo comprende o consiste esencialmente de, o consiste de, además de uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis o más aminoácidos contiguos o no contiguos de la SEQ ID No.: 2 como se describe anteriormente, y una porción adicional que modifica la proteina, por ejemplo, una porción carbohidrato puede ser incluida tal que el anticuerpo para Sp35 se enlaza con más alta afinidad a la proteina objetivo modificada que como lo hace a una versión no modificada de la proteina. Alternativamente, el anticuerpo para Sp35 no se enlaza a la versión no modificada de la proteina objetivo del todo. En ciertas modalidades, los antagonistas de Sp35 que van a ser utilizados en los métodos de la presente invención incluyen, un anticuerpo o fragmento de enlace al antigeno, variante o derivado del mismo de la invención, se enlaza específicamente al menos a un epitopo de Sp35 o fragmento o variante descrito anteriormente, por ejemplo, se enlaza a tal epitopo más fácilmente que lo que se enlazaría a un epitopo no relacionado o aleatorio; se enlaza preferentemente al menos a un epitopo de Sp35 o fragmento o variante descrita anteriormente, por ejemplo, se enlaza a tal epitopo más fácilmente que lo que se enlazaría a un epitopo relacionado, similar, homólogo o análogo; inhibe competitivamente el enlace de un anticuerpo de referencia que por si mismo se enlaza específica o preferentemente a un cierto epitopo de Sp35 o fragmento o variante descrito anteriormente, por ejemplo, o se enlaza al menos a un epitopo de Sp35 o fragmento o variante descrito anteriormente con una afinidad caracterizada por una constante de disociación KD de menos de aproximadamente 5 x 10"2 M, aproximadamente 10"2 M, aproximadamente 5 X 10 -3 M, aproximadamente 10 -3 M, aproximadamente 5 X 10 -4 M, aproximadamente 10 -4 M, aproximadamente 5 X 10 -5 M, aproximadamente 10 -5 M, aproximadamente 5 X 10 -6 M, aproximadamente 10 -6 M, aproximadamente 5 X 10 -7 M, aproximadamente 10 -7 M, aproximadamente 5 X 10 -8 M, aproximadamente 10 -8 M, aproximadamente 5 X 10 -9 M, aproximadamente 10 -9 M, aproximadamente 5 X 10" 10 M, aproximadamente 10" 10 M, aproximadamente 5 X 10" 11 M, aproximadamente 10" 11 • M, aproximadamente 5 X 10" 12 M, aproximadamente 10" 12 M, aproximadamente 5 X 10" 13 M, aproximadamente 10" 13 M, aproximadamente 5 X 10" 14 M, aproximadamente 10" 14 M, aproximadamente 5 x 10" M, ó aproximadamente 10" M. En un aspecto particular, el anticuerpo o fragmento del mismo se enlaza preferentemente a un polipéptido de Sp35 humano, o fragmento del mismo, con relación al polipéptido de Sp35 murino, o el fragmento del mismo. Como se utiliza en el contexto de las constantes de disociación de enlace al anticuerpo, el término "aproximadamente" permite el grado de variación inherente en los métodos utilizados para medir la afinidad del anticuerpo. Por ejemplo, dependiendo del nivel de precisión de la instrumentación utilizada, el error estándar basado en el número de muestras . medidas, y el error de redondeo, el término "aproximadamente 10~2 M" puede incluir, por ejemplo, de 0.05 M a 0.005 M. En modalidades especificas, los antagonistas de Sp35 para el uso en los métodos de la presente invención incluyen un anticuerpo, un fragmento de enlace al antigeno, variante o derivado del mismo de la invención, se enlaza a los polipéptidos de Sp35 o fragmentos o variantes de los mismos con una velocidad de apagado (k(off)) menos que o igual a 5 X 10~2 seg"1, 10"2 seg"1, 5 X 10~3 seg"1 ó 10"3 seg-1. Alternativamente, un anticuerpo, o el fragmento de enlace al antigeno, variante o derivado del mismo de la invención se enlaza a los polipéptidos de Sp35 o fragmentos o variantes de los mismos con una velocidad de apagado (k(off)) menor que o igual a 5 X 10"4 seg"1, 10"4 seg"1, 5 X 10"5 seg"1, ó 10"5 seg-1 5 X 10"6 seg"1, 10"6 seg"1, 5 X 10"7 seg"1 o 10"7 seg"1. En otras modalidades, los antagonistas de Sp35 para el uso en los métodos de la presente invención incluyen un anticuerpo, un fragmento de enlace al antigeno, una variante o derivado del mismo de la invención, se enlaza a los polipéptidos de Sp35 o fragmentos o variantes de los mismos, con una velocidad del encendido (k(on)) mayor que o igual a 103 M"1 seg"1, 5 X 103 M4 seg"1, 104 M'1 seg"1 o 5 X 104 M"1 seg11. Alternativamente, un anticuerpo, o fragmento de enlace al antigeno, variante o derivado del mismo de la invención se enlaza a los polipéptidos de Sp35 o fragmentos o variantes de los mismos con una velocidad de encendido mayor que o igual a 105 M"1 seg"1, 5 X 105 M"1 seg"1, 106 M"1 seg"1, ó 5 X 106 M"1 seg"1 ó 107 M"1 seg"1. Ciertos métodos de la presente invención comprenden la administración de un anticuerpo del antagonista de Sp35, o el fragmento inmunoespecifico del mismo, en el cual al menos una fracción de uno o más dominios de la región constante, ha sido suprimida o de otro modo alterada para proporcionar características bioquímicas deseadas tales como funciones efectoras reducidas, · la habilidad para dimerizarse no covalentemente, la habilidad no incrementada para localizarse en el sitio de un tumor, vida media en suero reducida, o vida media en suero incrementada, cuando se compara con un anticuerpo no alterado, entero, de aproximadamente la misma inmunogenicidad. Por ejemplo, ciertos anticuerpos para el uso en los métodos descritos en la presente son anticuerpos suprimidos en el dominio que comprende una cadena polipeptidica similar a una cadena pesada de inmunoglobulina, pero que carecen de al menos una porción de uno o más dominios de cadena pesada. Por ejemplo, en ciertas modalidades, un dominio entero de la región constante del anticuerpo modificado será suprimido, por ejemplo, todo o parte del dominio CH2 serán suprimidos. En ciertos anticuerpos del antagonista de Sp35 o los fragmentos inmunoespecificos de los mismos, para el uso en los métodos, descritos aqui, la porción Fe puede ser mutada para disminuir la función efectora utilizando técnicas bien conocidas en la materia. Por ejemplo, la supresión o inactivación (a través de mutaciones puntuales u otros medios) de un dominio de región constante pueden reducir el enlace al receptor de Fe del anticuerpo modificado circulante, con lo cual se 1 incrementa la localización tumoral. En otros casos, puede suceder que las modificaciones' en la región constante consistentes con la presente invención moderen el enlace al complemento y de este modo reduzcan la vida media en suero y la asociación no especifica de una citotoxina conjugada. Otras modificaciones más de la región constante pueden ser utilizadas para modificar los enlaces disulfuro o las porciones oligosacáridas que permiten localización mejorada debido a la especificidad incrementada del antigeno o a la mayor flexibilidad de anticuerpo. El perfil fisiológico resultante, la biodisponibilidad y otros efectos bioquímicos de las modificaciones, tales como la localización tumoral, la biodisponibilidad y la vida media en suero, pueden ser medidas ' fácilmente y cuantificadas utilizando técnicas inmunológicas bien conocidas sin experimentación indebida. Las formas modificadas de los anticuerpos o fragmentos inmunoespecífieos de los mismos para el uso en los métodos descritos en la presente, pueden ser realizados a partir del precursor completo o de anticuerpos progenitores utilizando técnicas conocidas en la materia.' Las técnicas ejemplares son discutidas con más detalle en la presente. En ciertas modalidades, las regiones variable y constante de los anticuerpos del antagonista de Sp35 o los fragmentos inmunoespecífieos de los mismos para el uso en los métodos descritos en la presente, son completamente humanos.
Los anticuerpos completamente humanos pueden ser realizados utilizando técnicas que son conocidas en la materia y como se describen en la presente. Por ejemplo, los anticuerpos completamente humanos contra un antígeno específico pueden ser preparados mediante la administración del antígeno a un animal transgénico que ha sido modificado para producir tales anticuerpos, en respuesta al reto antigénico, pero cuyos locus endógenos han sido deshabilitados. Las técnicas ejemplares que pueden ser utilizadas para elaborar tales anticuerpos se describen en las Patentes de los Estados Unidos Nos.: 6,150,584; 6,458,592; 6,420,140. Otras técnicas son conocidas en la materia. Los anticuerpos completamente humanos pueden ser de igual modo producidos mediante diversas tecnologías de visualización, por ejemplo, visualización de fago u otros sistemas de visualización viral, como se describe con más detalle en otro sitio en la presente. Los anticuerpos del antagonista de Sp35 o los fragmentos inmunoespecífieos de los. mismos para el uso en los métodos descritos aquí pueden ser elaborados o fabricados utilizando técnicas que son conocidas en la materia. En ciertas modalidades, las moléculas de anticuerpo o los fragmentos de los mismos son "recorabinantemente producidos" por ejemplo, son producidos utilizando tecnología de ADN recombinante . Las técnicas ejemplares para elaborar moléculas de anticuerpo o fragmento de los mismos se discuten con más detalle en otro sitio en la presente. Los anticuerpos del antagonista de Sp35 o los fragmentos inmunoespecífieos de los mismos para el uso en los métodos descritos en la presente, incluyen derivados que son modificados, por ejemplo, mediante el enlace covalente de cualquier tipo de molécula al anticuerpo, tal que el enlace covalente no previene que el anticuerpo se enlace específicamente a su epitopo cognado. Por ejemplo, pero no a manera de limitación, los derivados del anticuerpo incluyen anticuerpos que han sido modificados por ejemplo, mediante glucosilación, acetilación, pegilación, fosforilación, amidación, derivatización por grupos protectores/bloqueadores conocidos, escisión proteolítica, enlace a un ligando celular o a otra proteína, etc. Cualquiera de las numerosas ¦ modificaciones químicas pueden ser llevadas a cabo por técnicas conocidas, incluyendo, pero no limitadas a, la escisión química específica, acetilación, formilación, síntesis metabólica de tunicamicina, etc. Además, el derivado puede contener uno o más aminoácidos no clásicos. En modalidades preferidas, un anticuerpo para el antagonista de Sp35 o el fragmento inmunoespecí fico del mismo, para el uso en los métodos descritos en la presente, no promoverá una respuesta inmune dañina en el animal que va a ser tratado, por ejemplo, en un humano. En una modalidad, los anticuerpos para el antagonista de Sp35 o los fragmentos inmunoespecífieos de los mismos, para el uso en los métodos descritos aquí, pueden ser modificados para reducir su inmunogenicidad utilizando técnicas reconocidas en la materia. Por ejemplo, los anticuerpos pueden ser humanizados, primatizados, desinmunizados, o anticuerpos quiméricos pueden ser también elaborados. Estos tipos de anticuerpos son derivados de un anticuerpo no humano, típicamente un anticuerpo murino o de primate, que conservan o sustancialmente conserva las propiedades de enlace al antigeno del anticuerpo progenitor, pero que es menos inmunogénico en humanos. Esto puede ser logrado mediante diversos métodos, incluyendo (a) el injerto de los dominios variables no humanos completos sobre regiones constantes humanas para generar anticuerpos quiméricos; (b) el injerto de al menos una parte de una o más regiones no humanas de determinación de la complementariedad (CDRs) dentro de una estructura humana y las regiones constantes con o sin retención de los residuos estructurales críticos; o (c) el transplante de los dominios variables no humanos completos, pero "escondiéndolos" con una sección similar a la humana pero el reemplazo de los residuos superficiales. Tales métodos son descritos en Morrison et al., Proc . Nati. Acad. Sci. 57:6851-6855 (1984); Morrison et al, Adv. Immunol. 44:65-92 (1988); Verhoeyen et al, Science 232:1534-1536 (1988); Padlan, Molec. Immun. 25:489-498 (1991); Padlan, Molec. Immun. 31:169-217 (1994), y Patentes de los Estados Unidos. Nos. 5,585,089, 5,693,761, 5,693,762, y 6,190,370, todas los cuales se incorporan por referencia en la presente en su totalidad. La desinmunización puede ser también utilizada para disminuir la inmunogenicidad de un anticuerpo. Como se utiliza en la presente, el término "desinmunización" incluya la alteración de un anticuerpo para modificar los epitopos de células T (ver por ejemplo, W09852976A1, O0034317A2 ) . Por ejemplo, las secuencias VH y VL provenientes del anticuerpo inicial son analizadas y se "mapea" un epitopo de célula T humana a partir de cada región V que muestre la localización de los epitopos en relación a las regiones de determinación de la complementariedad (CDRs) y otros residuos clave dentro de la secuencia. Los epitopos de células T individuales provenientes del mapa del epitopo de célula T son analizados con el fin de identificar situaciones alternativas de aminoácidos con un bajo riesgo de alterar la actividad del anticuerpo final. Una gama de secuencias VH y VL alternativas son diseñadas, comprendiendo combinaciones de sustituciones de aminoácidos y éstas secuencias son . subsecuentemente incorporadas dentro de una gama de polipéptidos de enlace, por ejemplo, anticuerpos para el antagonista de Sp35 o fragmentos inmunoespecificos de los mismos, para el uso en los métodos descritos en la presente, que son luego probados para la función. Típicamente, entre 12 y 24 anticuerpos variantes son generados y probados. Los genes de cadena pesada y ligera completos que comprenden las regiones V modificada y C humana son luego clonados dentro de los vectores de expresión y los plásmidos subsiguientes introducido dentro de las líneas celulares para la producción del anticuerpo completo. Los anticuerpos son luego comparados en ensayos ' biológicos y bioquímicos apropiados, y es identificada la variante óptima. Los anticuerpos para el antagonista de Sp35 o los fragmentos de los mismos para el uso en los métodos de la presente invención pueden ser generados mediante cualquier método adecuado conocido en la técnica. Los anticuerpos policlonales pueden ser producidos mediante procedimientos diversos bien conocidos en la materia. Por ejemplo, un fragmento inmunoespecífico de Sp35 puede ser administrado a diversos animales hospederos incluyendo, pero no limitados a, conejos, ratones, ratas, etc., para inducir la reducción de sueros que contienen anticuerpos policlonales específicos para el antígeno. Pueden ser utilizados diversos adyuvantes para incrementar la respuesta inmunológica, dependiendo de la especie hospedera, e incluyen pero no están limitados a, adyuvante de Freund (completo e incompleto,) geles minerales, tales como hidróxido de aluminio, sustancias activas de superficie tales como lisolecitina, polioles pluronic, polianiones, péptidos, emulsiones aceitosas, emocianinas de lapa en forma de cerradura, dinitrofenol , y adyuvantes humanos potencialmente útiles tales como BCG (bacilo de Calmette-Guerin) y Corynebacterium parvum. Tales adyuvantes son también bien conocidos en la técnica. Los anticuerpos monoclonales pueden ser preparados utilizando una amplia variedad de técnicas conocidas en la materia, incluyendo el uso de las tecnologías de hibridoma, recombinante y de visualización de fago, o una combinación de las mismas. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales pueden ser producidos utilizando técnicas de hibridoma que incluyen aquellas conocidas en la materia y mostradas por ejemplo, en Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a edición. (1988); Hammerling et al., en: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas Elsevier, N.Y., 563-681 (1981) (dichas referencias son incorporadas por referencia en su totalidad) . El término "anticuerpo monoclonal" como se utiliza en la presente, no está limitado a los anticuerpos producidos a través de tecnología de hibridomas. El término "anticuerpo monoclonal" se refiere a un anticuerpo que es derivado de un clon simple, incluyendo cualquier .clon eucariótico, procariótico o fago, y no el método mediante el cual éste es producido. De este modo, el término "anticuerpo monoclonal" no está limitado a los anticuerpos producidos a través de la tecnología de hibridoma. Los anticuerpos monoclonales pueden ser preparados utilizando una amplia variedad de técnicas conocidas en la materia, incluyendo el uso de la tecnología de hibridomas y recombinante y de visualización de fagos. Utilizando los protocolos reconocidos en la técnica, en un ejemplo, los anticuerpos son producidos en mamíferos mediante múltiples inyecciones subcutáneas o intraperitoneales del antígeno relevante (por ejemplo, antígenos de Sp35 purificados o las células o extractos celulares que comprenden tales antigenos) y un adyuvante. Esta inmunización únicamente promueve una respuesta inmune que comprende la producción de anticuerpos reactivos con el antigeno a partir de esplenocitos o linfocitos activados. Mientras que los anticuerpos resultantes pueden ser cosechados del suero del animal para proporcionar preparaciones policlonales , es a menudo deseable aislar los linfocitos individuales provenientes del bazo, los nodulos linfáticos o la sangre periférica para proporcionar preparaciones homogéneas de anticuerpos monoclonales (mAbs) . Preferentemente, los linfocitos son obtenidos a partir del bazo . En este proceso bien conocido (Kohler et al, Nature 256:495 (1975)) los linfocitos de vida relativamente corta o mortales, provenientes de un mamífero que ha sido inyectado con el antígeno, son fusionados con una línea celular tumoral inmortal (por ejemplo, una línea celular de mieloma) produciendo de este modo células híbridas o "hibridomas" que son inmortales y son capaces de producir el anticuerpo genéticamente codificado de la célula B. Los híbridos resultantes son segregados dentro de las cepas genéticas simples mediante selección, dilución y re-crecimiento con cada cepa individual que comprende los genes específicos para la formación de un anticuerpo simple. Estos producen anticuerpos que son homogéneos contra un antigeno deseado y en referencia a su parentesco genético puro, son denominados "monoclonales" . Las células hibridomas preparadas de este modo son sembradas y desarrolladas en un medio de cultivo adecuado que contiene preferentemente una o más sustancias que inhiben el crecimiento o la supervivencia de las células de mieloma progenitoras , no fusionadas. Aquellos expertos en la materia apreciarán que los reactivos, las lineas celulares y los medios para la formación, selección y crecimiento de los hibridomas son comercialmente disponibles de un número de fuentes y los protocolos estandarizados están bien establecidos. En general, el medio de cultivo en el cual se están desarrollando las células hibridomas, es evaluado para la producción de anticuerpos monoclonales contra el antigeno deseado. Preferentemente, la especificidad de enlace de los anticuerpos monoclonales producidos por las células hibridomas, es determinado mediante ensayos in vitro tales como inmunoprecipitación, radioinmunoensayo (RIA) o ensayo inmunosorbente ligado a enzimas (ELISA) . Después de que son identificadas las células hibridomas que producen los anticuerpos de la especificidad, afinidad y/o actividad deseadas, los clones pueden ser subclonados mediante procedimientos de dilución limitante y desarrollados mediante métodos estándares (Goding, Monoclonal Antibodies : Principies and Practice, Academic Press, pp 59-103 (1986)). Se apreciará además que los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones pueden ser separados del medio del cultivo, el fluido de ascitis o el suero mediante procedimientos de purificación convencionales, tales como por ejemplo, cromatografía de proteína A, cromatografía de hidroxiapatita, electroforesis en gel, diálisis o cromatografía de afinidad. Los fragmentos de anticuerpo que reconocen los epitopos específicos pueden ser generados mediante técnicas conocidas. Por ejemplo, los fragmentos Fab y F(ab')2 pueden ser producidos mediante escisión proteolítica de las moléculas de inmunoglobulina , utilizando enzimas tales como papaína (para producir fragmentos Fab) o pepsina (para producir fragmentos F(ab')2). Los fragmentos F(ab')2 contienen la región variable, la región constante de cadena ligera, y el dominio CH1 de la cadena pesada. Aquellos expertos en la materia, apreciarán que el ADN que codifica para los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo (por ejemplo, los sitios de enlace al antígeno) pueden ser también derivados de bibliotecas de fagos de anticuerpo) . En una modalidad particular, tal 'fago puede ser utilizado para visualizar los dominios de enlace al antígeno, expresados a partir de un repertorio o biblioteca combinatoria de anticuerpos (por ejemplo, humano o muriria) .
El fago que expresa un dominio de enlace al antigeno que se enlaza al antigeno de interés puede ser seleccionado o identificado con el antigeno, por ejemplo, utilizando el antigeno marcado o el antigeno enlazado o capturado a una superficie o esfera sólida. El fago utilizado en estos métodos es típicamente un fago filamentoso que incluye los dominios de enlace' fd y I3 expresadas a partir del fago con Fab, Fv o los dominios del anticuerpo Fv estabilizados con fuente disulfuro recombinantemente fusionados al gen del fago III o la proteína del gen VIII. Los métodos ejemplares son descritos por ejemplo, en la Patente Europea 368 684 Bl; la Patente de los Estados Unidos No. 5,969,108, Hoogenboom, H.R. y Chames, Immunol. Today 21:371 (2000); Nagy et al Nat. Med. 5:801 (2002); Huie et al, Proc. Nati Acad. Sci. USA 98:2682 (2001); Luí et al, J. Mol Biol. 315:1063 (2002), cada una de las cuales se incorpora por referencia en la presente. Varias publicaciones (por ejemplo, Marks et al, Bio/Technology 10:779-783 (1992)) han descrito la producción de anticuerpos humanos de alta afinidad mediante entremezclado de cadenas, así como la infección combinatoria y la recombinación in vivo como una estrategia para construir bibliotecas grandes de fago. .En otra modalidad más, la visualización ribosomal puede ser utilizada para reemplazar el bacteriófago como la plataforma de visualización (ver por ejemplo, Hanes et al, Nat. Biotechnol. 18:1287 (2000); Wilson et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 95:3750 (2001); o Irving et al, J. Immunol. Methods 248:31 (2001)). En otra modalidad más, las bibliotecas de la superficie celular pueden ser seleccionadas para los anticuerpos (Boder et al, Proc. Nati Acad. Sci. USA 97:10701 (2000); Daugherry et al, J. Immunol. Methods 243:211 (2000)). Tales procedimientos proporcionan alternativas a las técnicas tradicionales de hibridoma para el aislamiento y la clonación subsiguiente de los anticuerpos monoclonales . En los métodos de visualización de fago, los dominios de anticuerpo funcional son visualizados sobre la superficie de las partículas de fago que llevan las secuencias polinucleotídicas que las codifican. En particular, las secuencias de ADN que codifican para las regiones VH y VL son amplificadas a partir de bibliotecas de cADN animales (por ejemplo, bibliotecas de cADN humanas o murinas de tejidos linfoides) o bibliotecas de cADN sintéticas En ciertas modalidades, el ADN que codifica para las regiones VH y VL es unido entre sí por un ligador scFv mediante PCR y clonados dentro de un vector fagémido (por ejemplo, p CANTAB 6 o pComb 3 HSS) . El vector es sometido a electroporesis en E. coli y el E. coli es infectado con el fago cooperador. El fago utilizado en estos métodos es típicamente un fago filamentoso que incluye fd y M13 y las regiones VH ó VL son usualmente recombinantemente fusionadas al gen III o al gen VIII del fago. El fago que expresa un dominio de enlace al antigeno que se enlaza a un antigeno de interés (por ejemplo, un polipéptido de Sp35 o un fragmento del mismo) puede ser seleccionado e identificado con el antigeno, por ejemplo, utilizando el antigeno marcado o el antigeno enlazado o capturado a una superficie sólida o una esfera . Los ejemplos adicionales de métodos de visualización de fagos . que pueden ser utilizados para elaborar los anticuerpos, incluyen aquellos descritos en Brinkman et al, J. Immunol. Methods 752:41-50 (1995); -Ames et al, J. Immunol. Methods 184:177-186 (1995); Kettleborough et al., Eur. J. Immunol. 24:952-958 (1994); Persic et al, Gene 187:9-18 (1997); Burton et al.; Advances in Immunology 57:191-280 (1994); Solicitud del PCT No. PCT/GB91/01134 ; PCT publicaciones WO '90/02809; WO 91/10737; O 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; y Patente de los Estados Unidos. Nos. 5,698,426; 5,223,409; 5,403,484; 5,580,717; 5,427,908; 5,750,753; 5,821,047; 5,571,698; 5,427,908; 5,516,637; 5,780,225; 5,658,727; 5,733,743 y 5,969,108; cada uno de las cuales se incorpora por referencia en la presente en su totalidad. Como se describe en las referencias anteriores, después de la selección de los fagos, las regiones que codifican para los anticuerpos provenientes del fago, pueden ser aisladas y utilizadas para generar anticuerpos enteros, incluyendo anticuerpos humanos, o cualquier otro fragmento deseado de enlace al antígeno, y expresados en cualquier hospedero deseado, incluyendo células de mamífero, células de insecto, células vegetales, levaduras y bacterias. Por ejemplos, las técnicas para producir recombinantemente los fragmentos Fab, Fab ' y F(ab')2 pueden ser también empleados utilizando métodos conocidos en la materia, tales como aquellos descritos en la publicación del PCT WO 92/22324; Mullinax et al., BioTechniques 12 ( 6 ): 864-869 (1992); y Sawai et al, AJRI '34:26-34 (1995); y Better et al, Science 240:1041-1043 (1988) (dichas referencias son incorporadas por referencia en la presente en su totalidad) . Los ejemplos de técnicas que pueden ser utilizados para producir Fvs de cadena simple y anticuerpos, incluyen aquellos descritos en las Patentes de los Estados Unidos. Nos 4,946,778 y 5,258,498; Huston et al, Methods in Enzymology 203:46-88 (1991); Shu et al, PNAS 90:7995-7999 (1993); y Skerra et al, Science 240:1038-1040 (1988). Para algunos usos, incluyendo el uso in vivo de los anticuerpos en humanos y los ensayos de detección in vitro, puede ser preferible utilizar anticuerpos quiméricos, humanizados o humanos. Un anticuerpo quimérico es una molécula en la cual diferentes porciones del anticuerpo son derivadas de diferentes especies animales, tales como anticuerpos que tienen una región variable derivada de un anticuerpo monoclonal murino y una región constante de inmunoglobulina humana. Los métodos para producir anticuerpos quiméricos son conocidos en la materia. Ver por ejemplo, orrison, Science 229:1202 (1985); Oi et al, BioTechniques 4:214 (1986); Gillies et al, J. Immunol . Methods 125:191-202 (1989); Patentes de los Estados Unidos. Nos. 5,807,715; 4,816,567; y 4,816397, que se incorporan por referencia en la presente en su totalidad. Los anticuerpos humanizados son moléculas de anticuerpo provenientes de especies no humanas, anticuerpos que se enlazan al antigeno deseado que tiene una o más regiones de determinación de la complementariedad (CDRs) provenientes de especies no humanas, y regiones estructurales provenientes de una molécula de inmunoglobulina humana. A menudo, los residuos estructurales en las regiones estructurales humanas serán sustituidos con el residuo correspondiente proveniente del anticuerpo donador de CDR para alterar y preferentemente para mejorar el enlace al antigeno. Estas sustituciones estructurales son identificadas mediante métodos bien conocidos en la materia, por ejemplo, mediante modelación de las interacciones de la CDR y residuos estructurales para identificar los residuos estructurales importantes para el enlace al antigeno y la comparación secuencial para identificar residuos estructurales inusuales en posiciones particulares. (Ver por ejemplo, Queen et al, Patente de los Estados Unidos. No. ,585,089; Riechmann et al, Nature 332:323 (1988), que se incorpora por referencia en la presente en su totalidad) . Los anticuerpos pueden ser humanizados utilizando una variedad de técnicas conocidas en la materia incluyendo, por ejemplo, injerto de CDR (Patente Europea 239,400; publicación del PCT WO 91/09967; Patentes de los Estados Unidos. Nos. 5,225,539; 5,530,101; y 5,585,089), disfrazamiento o reconformación superficial (Patentes Europeas Nos. 592,106; 519,596; Padlan, Molecular Immunology 28 (4/5) :A89-A98 (1991); Studnicka et al., Protein Engineering 7(6): 805-814 (1994); Roguska. et al, PNAS 91:969-973 (1994)), y entremezclado de cadenas (Patente de los Estados Unidos. No. 5,565,332). Los anticuerpos completamente humanos son particularmente deseables para el tratamiento terapéutico de pacientes humanos. Los anticuerpos humanos pueden ser elaborados mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica, incluyendo métodos de visualización de fago descritos anteriormente utilizando bibliotecas de anticuerpos derivadas de secuencias de inmunoglobulina humana. Ver también, Patentes de los Estados Unidos. Nos. 4,444,887 y 4,716,111; y publicaciones del PCT WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735, y WO 91/10741; cada uno de las cuales se incorpora por referencia en la presente en su totalidad. ¦ Los anticuerpos humanos pueden ser también producidos utilizando ratones transgénicos que son .incapaces de expresar inmunoglobulinas endógenas funcionales, pero que pueden expresar genes de inmunoglobulina humana. Por ejemplo, los complejos de genes de inmunoglobulina de cadena pesada y cadena ligera humanas, pueden ser introducidas aleatoriamente o mediante recombinación homologa dentro de células madre embrionarias de ratón. Alternativamente, la región variable humana, la región constante y la región de diversidad pueden ser introducidas dentro de células madre embrionarias de ratón además de los genes de cadena pesada y ligera humanos. Los genes de inmunoglobulina de cadena pesada y cadena ligera de ratón pueden ser hechos no funcionales separada o simultáneamente con la introducción de los locus de inmunoglobulina humana mediante recombinación homologa. En particular, la supresión homocigótica de la región JH previene la producción de anticuerpo endógeno. Las células madre embrionarias modificadas son expandidas y microinyectadas dentro de blastocitos para producir ratones quiméricos. Los ratones quiméricos son luego criados para producir progenie homocigoto que expresa anticuerpos humanos. Los ratones transgénicos son inmunizados de la manera normal con un antigeno seleccionado, por ejemplo, toda o una porción de un polipéptido objetivo deseado. Los anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antigeno pueden ser obtenidos a partir de ratones transgénicos inmunizados utilizando tecnología de hibridoma convencional. Los transgenes de inmunoglobulina humana albergados por los ratones transgénicos se reacomodan durante la diferenciación de las células B, y subsecuentemente sufren cambio de clase y mutación somática. De este modo, utilizando tal técnica, es posible producir anticuerpos IgG, IgA, IgM e IgE terapéuticamente útiles. Para una revisión de esta tecnología para producir anticuerpos humanos, ver Lonberg y Huszar Int. Rev. Inmuno1. 13:65-93 (1995). Para una discusión detallada para esta tecnología para producir anticuerpos humanos y anticuerpos monoclonales humanos, y los protocolos para producir tales anticuerpos, ver por ejemplo, las publicaciones del PCT Nos. WO 98/24893; WO 96/34096; WO 96/33735; Patente de los Estados Unidos. Nos. 5,413,923; 5,625,126; 5,633,425; 5,569,825; 5,661,016; 5,545,806; 5,814,318; y 5,939,598, las cuales se incorporan por referencia en la presente en su totalidad. Además, compañías tales como Abgenix, Inc. (Freemont, Calif.) y GenPharm (San José, California) pueden ser comprometidas para proporcionar anticuerpos humanos dirigidos contra un antígeno seleccionado, utilizando tecnología similar a aquella descrita anteriormente . Los anticuerpos completamente humanos que reconocen un epitopo seleccionado pueden ser generados utilizando una técnica denominada como "selección guiada". En este procedimiento, un anticuerpo monoclonal no humano seleccionado, por ejemplo, un anticuerpo de ratón, es utilizado para guiar la selección de un anticuerpo completamente humano que reconoce el mismo epitopo. (Jespers et al., Bio/'Technology 72:899-903 (1988)). Ver también, Patente de los Estados Unidos No. 5,565,332. En otra modalidad más, el ADN que codifica para los anticuerpos monoclonales deseados para el uso en los métodos de la presente invención, puede ser fácilmente aislado y secuenciado utilizando procedimientos convencionales (por ejemplo, mediante el uso de sondas oligonucleotidicas que son capaces de enlazarse específicamente a los genes que codifican para las cadenas pesadas y ligeras de los anticuerpos murinos). Las células hibridomas aisladas y subclonadas sirven como una fuente preferida de tal ADN. Una vez aislado, el ADN puede ser colocado dentro de vectores de expresión, que son luego transíectados dentro de células hospederas procarióticas o eucarióticas tales como células de E. coli, células COS de simio, células de ovario de hámster Chino (CHO) o células de mieloma que de otro modo no producen inmunoglobulinas . Más particularmente, el ADN aislado (el cual puede ser sintético como se describe en la presente) puede ser utilizado para clonar secuencias de las regiones constantes y variables, para la fabricación de anticuerpos como se describe en Newman et al, Patente de los Estados Unidos. No. 5,658,570, presentada el 25 de Enero de 1995, la cual se incorpora por referencia en la presente. Esencialmente, esto involucra la extracción del ARN a partir de las células seleccionadas, la conversión a cADN, y la amplificación mediante PCR utilizando cebadores específicos de inmunoglobulina . Los cebadores adecuados para este propósito son también descritos en la Patente de los Estados Unidos No. 5,658,570. Como se discutirá con más detalle más adelante, las células transformadas que expresan el anticuerpo deseado pueden ser desarrolladas en cantidades relativamente grandes para proporcionar suministros clínicos y comerciales de la inmunoglobulina. En una modalidad específica, la secuencia de aminoácido de los dominios variables de cadena pesada y/o ligera, pueden ser inspeccionados para identificar las secuencias de las regiones de determinación de la complementariedad (CDRs) mediante métodos que son bien conocidos en la materia, por ejemplo, mediante comparación a secuencias de aminoácidos conocidas de otras regiones variables de cadena pesada y ligera, para determinar las regiones de hipervariabilidad secuencial. Utilizando técnicas de ARN recombinantes rutinarias, una o más de las CDRs pueden ser insertadas dentro de las regiones estructurales, por ejemplo, dentro de las regiones estructurales humanas para humanizar un anticuerpo no humano.
Las regiones estructurales pueden ser de origen natural o regiones estructurales de consenso, y preferentemente regiones estructurales humanas (ver por ejemplo, Chothia et al., J. Mol. Biol. 275:457-479 (1998) para un listado de las regiones estructurales humanas). Preferentemente, el polinucleótido generado por la combinación de las regiones estructurales y las CDRs, codifica para un anticuerpo que se enlaza específicamente al menos a un epitopo de un polipéptido deseado, por ejemplo, Sp35. Preferentemente, una o más sustituciones de aminoácidos pueden ser realizadas dentro de las regiones estructurales, y preferentemente las sustituciones de aminoácidos mejoran el enlace del anticuerpo a su antígeno. Adicionalmente, tales métodos pueden ser utilizados para realizar sustituciones o supresiones de aminoácidos de uno o más residuos de cisteína de la región variable, que participan en un enlace disulfuro intracatenario para generar moléculas de anticuerpo que carecen de uno o más enlaces disulfuro intracatenarios . Otras alteraciones al polinucleótido son abarcadas por la presente invención y dentro de la experiencia de la técnica. Además, las técnicas desarrolladas para la producción de "anticuerpos quiméricos" (Morrison et al, Proc. Nati. Acad. Sci 57:851-855 (1984); Neuberger et al, Nature 372:604-608 ( 1984 ) ; Takeda et al., Nature 314:452-454 (1985)) mediante empalme de genes provenientes de una molécula de anticuerpo de ratón de especificidad antigénica apropiada junto con los genes provenientes de una molécula de anticuerpo humano de actividad biológica apropiada, pueden ser utilizados. Como se utiliza en la presente, un anticuerpo quimérico es una molécula en la cual diferentes porciones son derivadas de diferentes especies animales, tales como aquellas que tienen una región variable derivada de un anticuerpo monoclonal murino y una región constante de inmunoglpbulina humana, por ejemplo, anticuerpos humanizados. Alternativamente, las técnicas descritas para la producción de anticuerpos de cadena simple (Patente de los Estados Unidos. No. 4,694,778; Bird, Science 242:423-442 (1988); Huston et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 (1988); y Ward et al, Nature 334:544-554 (1989)) pueden ser adaptadas para producir anticuerpos de cadena simple. Los anticuerpos de cadena simple son formados mediante el enlace de fragmentos de la cadena pesada y ligera de la región Fv vía un puente de aminoácido, dando como resultado un anticuerpo de cadena simple. Las técnicas para el ensamblaje de los fragmentos Fv funcionales en E coli, pueden ser también utilizados (Skerra et al., Science 242:1038-1041 (1988) ) : Los anticuerpos para el antagonista de Sp35 pueden ser también anticuerpos humanos o sustancialmente humanos generados en animales transgénicos (por ejemplo, ratones) que son incapaces de realizar la producción de inmunoglobulina endógena (ver por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos. Nos. 6,075,181, 5,939,598, 5,591,669 y 5,589,369, cada una de las cuales se incorpora por referencia en la presente) . Por ejemplo, se ha descrito que la supresión homocigota de la región de unión de la cadena pesada del anticuerpo, en ratones mutantes quiméricos y de linea germinal, da como resultado la inhibición completa de la producción de anticuerpo endógeno. La transferencia de un arreglo de genes de inmunoglobulina humana a tales ratones mutantes de linea germinal, dará como resultado la producción de anticuerpos humanos después del reto con el antigeno. Otro medio preferido para generar anticuerpos humanos utilizando ratones SCID es descrito en la Patente de los Estados Unidos. No. 5,811,524, la cual es incorporada por referencia en la presente. Se apreciará que el material genético asociado con estos anticuerpos humanos puede ser también aislado y manipulado como se describe en la presente. Otro medio altamente eficiente para generar anticuerpos recombinantes es descrito por Newman, Biotechnology 10: 1455-1460 (1992). Específicamente, esta técnica da como resultado la generación de anticuerpos primatizados que contienen dominios variables de mono y secuencias constantes humanas. Esta referencia es incorporada por referencia en su totalidad aquí. Además, esta técnica es también descrita en las Patentes de los Estados Unidos. Nos. ' 5,658,570, 5,693,780 y 5,756,096 comúnmente cedidas, cada una de las cuales se incorpora por referencia en la presente. En otra modalidad más, los linfocitos pueden ser seleccionados por micromanipulación y los genes variables son aislados. Por ejemplo, células mononucleares de sangre periférica pueden ser aisladas de un mamífero humanizado y cultivadas por aproximadamente 7 días in vitro. Los cultivos pueden ser seleccionados para las IgGs específicas que cumplan los criterios de selección. Pueden ser aisladas las células provenientes de los pozos positivos. Las células B productoras de Ig, individuales, pueden ser aisladas mediante FACS o al identificarlas en un ensayo de placa hemolítica, mediado por el complemento. Las células B producidas de Ig pueden ser micromanipuladas en un tubo y los genes de VH y VL pueden ser amplificados utilizando, por ejemplo, RT-PCR. Los genes de VH y VL pueden ser clonados dentro de un vector de expresión de anticuerpo y transfectados dentro de las células (por ejemplo, células eucarióticas y procarióticas ) para la expresión . Alternativamente, las líneas celulares productoras de anticuerpo pueden ser seleccionadas y cultivadas utilizando técnicas bien conocidas por el experto en la materia. Tales técnicas son descritas en una variedad de manuales de laboratorio y publicaciones primarias. A este respecto, las técnicas adecuadas para el uso en la invención se describen más adelante como se describe en Current Protocols in Immunology, Coligan et al, Eds . , Green Publishing Associates and Wiley-Interscience, John iley and Sons, New York (1991) la cual es incorporada aqui por referencia en su totalidad, incluyendo los suplementos. Los anticuerpos para el uso en los métodos descritos en la presente pueden ser producidos mediante cualquier método conocido en la materia para la síntesis de anticuerpos, en particular, mediante síntesis química o preferentemente, mediante técnicas de expresión recombinante como se describe en la presente. Se apreciará además que el alcance de esta invención abarca también todos los alelos, variantes y mutaciones de las secuencias de ADN que se enlazan al antígeno . Como es bien conocido, el ARN puede ser aislado de células hibridomas originales o a partir de otras células transformadas, mediante técnicas estándares, tales como la extracción con isotiocianato de guanidinio y precipitación seguida por centrifugación o cromatografía. Donde es deseable, el ARNM puede ser aislado del ARN total mediante técnicas estándares tales como cromatografía sobre oligo dT celulosa. Las técnicas adecuadas son familiares en la materia . En una modalidad, los cDNAs que codifican para las cadenas ligeras y pesadas del anticuerpo, para el uso en los métodos de la presente invención pueden ser elaborados, ya sea simultáneamente o de manera separada, utilizando la transcriptasa inversa y la ADN-polimerasa de acuerdo con los métodos bien conocidos. A la PCR puede ser iniciada por cebadores de región constante de consenso o por cebadores más específicos con base en el ADN publicado de cadena pesada y ligera y en las secuencias de aminoácidos. Como se discutió anteriormente, la PCR puede ser también utilizada para aislar los clones de ADN que codifican para las cadenas ligera y pesada del anticuerpo. En este caso, las bibliotecas pueden ser seleccionadas por cebadores de consenso o sondas homologas más grandes, tales como las sondas de región constante de ratón. El ADN, típicamente ADN plasmídico, puede ser aislado de las células utilizando técnicas conocidas en la materia, mapeado por restricción y secuenciado de acuerdo con las técnicas estándares bien conocidas descritas con detalle, por ejemplo, en las referencias anteriores con relación a las técnicas de ADN recombinante . Por supuesto, el ADN puede ser sintetizado de acuerdo a la presente invención en cualquier punto durante el proceso de aislamiento o el análisis subsiguiente.
La expresión recombinante de un anticuerpo, o fragmento o derivado o análogo del mismo, por ejemplo, una cadena pesada o ligera de un anticuerpo que es un antagonista de Sp35, requiere la construcción de un vector de expresión que contiene un polinucleótido que codifica para el anticuerpo. Una vez que un polinucleótido que codifica para una molécula de anticuerpo o una cadena pesada o ligera de un anticuerpo, o porción de la misma (que contiene preferentemente el dominio variable de cadena pesada o ligera) de la invención, ha sido obtenido, el vector para la producción de la molécula de anticuerpo puede ser producido mediante la tecnología de ADN recombinante, utilizando técnicas bien conocidas en la materia. De este modo, los métodos para preparar una proteína por la expresión de un polinucleótido que contiene una secuencia nucleotídica que codifica para un anticuerpo, se describen en la presente. Los métodos que son bien conocidos para aquellos expertos en la materia pueden ser utilizados para construir vectores de expresión que contienen secuencias que codifican para el anticuerpo, y señales de control de la transcripción y de la traducción apropiadas. Estos métodos incluyen, por ejemplo, técnicas de ADN recombinantes in vitro, técnicas sintéticas, y recombinación genética in vivo. La invención proporciona de este modo los vectores replicables que contienen una secuencia nucleotídica que codifica para una molécula de anticuerpo de la invención, o una cadena pesada o ligera del mismo, o un dominio variable de cadena pesada o ligera, operablemente enlazado a un promotor. Tales vectores pueden incluir la secuencia nucleotidica que codifica para la región constante de la molécula de anticuerpo (ver por ejemplo, Publicación del PCT WO 86/05807; Publicación del PCT O 89/01036; y Patente de los Estados Unidos. No. 5,122,464) y el dominio variable del anticuerpo puede ser clonado dentro de tal vector para la expresión de la cadena pesada o ligera completa. El vector de expresión es transferido a una célula hospedera mediante técnicas convencionales y las células transíectadas son luego cultivadas mediante técnicas convencionales para producir un anticuerpo para el uso en los métodos descritos en la presente. De este modo, la invención incluye las células hospederas que contienen un polinucleótido que codifica para un anticuerpo de la invención, o una cadena pesada o ligera del mismo, operablemente enlazado a un promotor heterólogo. En modalidades preferidas, para la expresión de anticuerpos de cadena doble, los vectores que codifican para las cadenas pesadas y ligeras pueden ser co-expresados en la célula hospedera para la expresión de la molécula de inmunoglobulina completa, como se describe con detalle más adelante. Una variedad de sistemas vectores de expresión de hospedero pueden ser utilizados para expresar moléculas de anticuerpo para el uso en los métodos descritos en la presente. Tales sistemas de expresión de hospedero representan vehículos mediante los cuales las secuencias de codificación de interés pueden ser producidas y subsecuentemente purificadas, pero también representan células que pueden, cuando son transformadas o transferidas con las secuencias de codificación nucleotídicas, apropiadas, expresan una molécula de anticuerpo de la invención in situ. Estos incluyen pero no están limitados a microorganismos tales como bacterias (por ejemplo, E. coli, B. subtilis) transformados con vectores de expresión de ADN bacteriófago recombinante , ADN plásmido o ADN cósmido, que contienen las secuencias que codifican para el anticuerpo; levaduras (por ejemplo, Saccharomyces , Pichia) transformadas con vectores de expresión de levaduras recombinantes que contienen secuencias que codifican para el anticuerpo; sistemas de células de insecto infectadas con vectores de expresión de virus recombinantes (por ejemplo, baculovirus) que contienen las secuencias que codifican para el anticuerpo; sistemas de células vegetales infectados con vectores de expresión virales recombinantes (por ejemplo, el virus mosaico de la coliflor, CaMV; virus mosaico del tabaco,. TMV) o transformados con los vectores de expresión plásmidos recombinantes (por ejemplo, el plásmido Ti), que contienen las secuencias que codifican para el anticuerpo; o sistemas celulares de mamífero (por ejemplo, las células COS, CHO, BLK, 293, 3T3) que albergan construcciones de expresión recombinantes que contienen promotores derivados del genoma de las células de mamífero (por ejemplo, el promotor de metalotioneina ) o provenientes de virus de mamíferos (por ejemplo, el promotor tardío del adenovirus; el promotor de 7.5K del virus de la vaccinia) . Preferentemente, las células bacterianas tales como Escherichia coli, y más preferentemente las células eucarióticas, especialmente para la expresión de la molécula de anticuerpo recombinante completa, se utilizan para la expresión de una molécula de anticuerpo recombinante. Por ejemplo, las células de mamífero, tales como las células de hámster Chino (CHO) , en conjunto con un vector tal como el elemento promotor del gen temprano intermediario mayor proveniente del citomegalovirus humano es un sistema de expresión efectivo para anticuerpos (Foecking et al, Gene 45:101 (1986); Cockett et al, Bío/Technology 8:2 (1990)). En sistemas bacterianos, un número de vectores de expresión pueden ser ventajosamente seleccionados dependiendo del uso pretendido para la molécula de anticuerpo que es expresada. Por ejemplo, cuando una gran cantidad de tal proteína va a ser producida, para la generación de composiciones farmacéuticas de una . molécula de anticuerpo, los vectores que dirigen la expresión de altos niveles de los productos de proteina de fusión que son fácilmente purificados pueden ser deseables. Tales vectores incluyen, pero no están limitados a, el vector de expresión en E. colí pUR278 (Ruther et al., EMBO J. 2:1791 (1983)), en el cual la secuencia que codifica para el anticuerpo puede ser ligada individualmente dentro del vector intraestructuralmente con la región de codificación lacZ, de modo que es producida una proteina de fusión; vectores pIN (Inouye & Inouye, Nucleic Acids Res. 73:3101-3109 (1985); Van Heeke & Schuster, J. Biol. Chem. 24:5503-5509 (1989)); y similares. Los vectores pGÉX pueden ser también utilizados para expresar los polipéptidos extraños como proteínas de fusión con la glutation-S-transferasa (GST) . En general, tales proteínas de fusión son solubles y pueden ser fácilmente purificadas a partir de células lisadas mediante adsorción y enlace a esferas de matriz de glutation-agarosa, seguido por elusión en presencia de glutation libre. Los vectores pGEX están diseñados para incluir trombina o sitios de escisión de la proteasa del factor Xa de modo que el producto génico objetivo clonado puede ser liberado desde la porción GST. En un sistema de insecto, el virus de la polihedrosis nuclear de Autographa californica (AcNPV) es típicamente utilizado como un vector para expresar genes extraños. El virus se desarrolla en células Spodoptera 'frugiperda . La secuencia que codifica para el anticuerpo puede ser clonada individualmente dentro de las regiones no esenciales (por ejemplo, el gen de la polihedrina) del virus, y colocada bajo el control de un promotor AcNPV (por ejemplo, el promotor de polihedrina) . En células hospederas de mamífero, puede ser utilizado un número de sistemas de expresión basados en virus En casos donde un adenovirus es utilizado como un vector de expresión, la secuencia que codifica por el anticuerpo, de interés, puede ser ligada a un complejo adenoviral de control de la transcripción/traducción, por ejemplo, el promotor tardío y la secuencia guía tripartita. Este gen quimérico puede ser luego insertado en el' genoma del adenovirus mediante recombinación in vitro o in vivo. La inserción en una región no esencial del genoma viral (por ejemplo, la región El ó E3) dará como resultado un virus recombinante que es viable y capaz de expresar la molécula de anticuerpo en hospederos infectados (ver por ejemplo, Logan & Shenk, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 57:355-359 (1984)). Las señales de iniciación específicas pueden ser también requeridas para la traducción eficiente de las secuencias insertadas que codifican para el anticuerpo. Estas señales incluyen el codón de inicio ATG y secuencias adyacentes. Además, el codón de inicio debe estar en fase con la estructura de lectura de la secuencia de codificación deseada para asegurar la traducción del inserto completo. Estas señales de control de la traducción' endógenas, y los codones de inicio pueden ser de una variedad de orígenes naturales y sintéticos. La eficacia de expresión puede ser aumentada por la inclusión de elementos aumentadores de la transcripción, apropiados, terminadores de la transcripción, etc. (ver Bittner et al., Methods in Enzymol. 753:51-544 (1987).). Además, una cepa de célula hospedera puede ser elegida, la cual modula la expresión de las secuencias insertadas, o modifica y procesa el producto génico de la manera específica deseada. Tales modificaciones (por ejemplo, glucosilación) y el procesamiento (por ejemplo, escisión) de los productos proteicos, pueden ser importantes para la función de la proteína. Diferentes células hospederas tienen mecanismos característicos específicos para el procesamiento y modificación post-traduccionales de las proteínas y los productos génicos. Las líneas celulares apropiadas de los sistemas hospederos pueden ser elegidos para asegurar la modificación correcta y el procesamiento de la proteína extraña expresada. Para este fin, las células hospederas eucarióticas que poseen la maquinaria celular para el procesamiento adecuado del transcrito primario, la glucosilación y la fosforilación del producto génico, pueden ser utilizadas. Tales células hospederas de mamífero incluyen pero no están limitadas a, CHO, VERY, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293, 3T3, W138, y en particular, las lineas celulares de cánceres de mama tales como, por ejemplo, BT483, Hs578T, HTB2, BT20 y T47D, y la linea celular de glándula mamaria normal tal como, por ejemplo, CRL7030 y Hs578Bst. Para la producción de alto rendimiento, a largo plazo de las proteínas recombinantes, la expresión estable puede ser utilizada. Por ejemplo, las líneas celulares que expresan establemente la molécula de anticuerpo pueden ser manipuladas por ingeniería genética. En vez de utilizar vectores de expresión que contengan origines virales de replicación, las células hospederas pueden ser transformadas con ADN controlado por elementos de control de expresión apropiados (por ejemplo, promotor, aumentador, secuencias, terminadores de la transcripción, sitios de poliadenilación, etc.), y un marcador seleccionable . Después de la introducción del ADN extraño, las células manipuladas por ingeniería genética pueden dejarse desarrollar por 1-2 días en un medio enriquecido, y luego son cambiadas a un medio selectivo. El marcador seleccionable en el plásmido recombinante confiere resistencia a la selección y permite que las células integren establemente el plásmido dentro de sus cromosomas y se desarrollen para formar focos los cuales a su vez pueden ser clonados y expandidos dentro de líneas celulares. Este método puede ser ventajosamente utilizado para manipular por ingeniería las líneas celulares que expresan establemente la molécula de anticuerpo. Puede ser utilizado un número de sistemas de selección incluyendo pero no limitados a los genes de timidina-cinasa del virus del herpes simple ( igler et al., Cell 11:223 (1977)), la hipoxantina-guanina-fosforribosiltransferasa (Szybalska & Szybalski, Proc. Nati Acad. Sci USA 48:202 (1992)), y la adenina-fosforribosiltransferasa (Lowy et al., Cell 22:817 1980), pueden ser empleados en las células tk-, hgprt- o aprt-, respectivamente. También, la resistencia antimetabolitos puede ser utilizada como la base de la selección para los siguientes genes: dhfr, que confiere resistencia al metotrexato (Wigler et al., Nati. Acad. Sci. USA 77:357 (1980); O'Hare et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 75:1527 (1981)); gpt, que confiere resistencia al ácido micofenólico (Mulligan & Berg, Proc. Nati Acad. Sci. USA 78:2072 (1981)); neo, que confiere resistencia al aminoglucósido G-418 Clinical Pharmacy 72:488-505; Wu y Wu, Biotherapy 3:87-95 (1991); Tolstoshev, Ann . Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596 (1993); Mulligan, Science 260:926-932 (1993); y Morgan and Anderson, Ann. Rev. Biochem. 62:191-211 (1993); TIB TECH 11 ( 5 ): 155-215 (Mayo, 1993); e higro, que confiere resistencia a la higromicina (Santerre et al., Gene 30:147 (1984). Los métodos comúnmente conocidos en la técnica de la tecnología de ADN recombinante que pueden ser utilizados, son descritos en Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); Kriegler, Gene Transfer and Expressíon, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990); y en los , capítulos 12 y 13, Dracopoli et al. (eds), Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY (1994); Colberre-Garapin et al, J. Mol. Biol. 150:1 (1981), los cuales se incorporan por referencia en la presente en su totalidad. Los niveles de expresión de una molécula de anticuerpo pueden ser incrementados mediante amplificación del vector (para una revisión ver Bebbington y Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Academic Press, New York, Vol . 3. (1987)). Cuando un marcador en el sistema vector que expresa el anticuerpo es amplificable , el incremento en el nivel del inhibidor presente en el cultivo de la célula hospedera incrementará el número de copias del gen marcador. Ya que la región amplificada está asociada con el gen del anticuerpo, la producción del anticuerpo se incrementará también (Crouse et al., Mol. Cell. Biol. 3:257 (1983) ) . La célula hospedera puede ser co-transfectada con dos vectores de expresión de la invención, el primer vector que codifica para un polipéptido derivado de la cadena pesada y el segundo vector que codifica para un polipéptido derivado de la cadena ligera. Los dos vectores pueden contener marcadores seleccionables idénticos los cuales hacen posible la expresión igual de los polipéptidos de cadena pesada y ligera. Alternativamente, un vector simple puede ser utilizado, el cual codifica los polipéptidos de cadena pesada y ligera. En tales situaciones, la cadena ligera es ventajosamente colocada antes de la cadena pesada, para evitar un exceso de la cadena pesada libre de tóxicos (Proudfoot, Nature 322:52 (1986); Kohler, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 77:2197 (1980)). Las secuencias de codificación para las cadenas pesadas y ligeras comprenden cADN o ADN genómico. Una vez que una molécula de anticuerpo de la invención ha sido recombinantemente expresada, ésta puede ser purificada mediante cualquier método conocido en la técnica para la purificación de una molécula de inmunoglobulina, por ejemplo, mediante cromatografía (por ejemplo, cromatografía de intercambio iónico, de afinidad, particularmente mediante afinidad para el antígeno específico después de la proteína A, y cromatografía de columna de separación por tamaño) , centrifugación, solubilidad diferencial, o mediante otra técnica estándar para la purificación de proteínas. Alternativamente, un método preferido para incrementar la afinidad de los anticuerpos de la invención es descrito en la Patente de los Estados Unidos No. 2002 0123057 Al.
En una modalidad, una molécula de enlace o la molécula de enlace al antígeno para el uso en los métodos de la invención comprende una región constante sintética en donde uno o más dominios son parcial o completamente suprimidos ("anticuerpos suprimidos en el dominio") . En ciertas modalidades, anticuerpos modificados compatibles comprenderán construcciones suprimidas en el dominio, o variantes en donde el dominio CH2 completo haya sido removido (construcciones de DCH2) . Para otras modalidades, un péptido de conexión corto puede ser sustituido por el dominio suprimido, para proporcionar flexibilidad y libertad de movimiento para la región variable. Aquellos expertos en la materia apreciarán que tales construcciones son particularmente preferidas debido a las propiedades regulatorias del dominio CH2 sobre la velocidad catabólica del anticuerpo. En ciertas modalidades, los anticuerpos modificados para el uso en los métodos descritos en la presente son minicuerpos. Los minicuerpos pueden ser elaborados utilizando métodos descritos en la materia (ver por ejemplo, Patente de los Estados Unidos No. 5,837,821 ó WO 94/09817A1) . En otra modalidad más, los anticuerpos modificados para el uso en los métodos descritos en la presente son anticuerpos suprimidos en el dominio CH2 que son conocidos en la técnica. Las construcciones reprimidas en el dominio pueden ser derivadas utilizando un vector (por ejemplo, de Biogen IDEC Incorporated) que codifica para un dominio constante humano de IgGi (ver por ejemplo, WO 02/060955A2 y WO02/096948A2).. Este vector ejemplar fue manipulado por ingeniería para suprimir el dominio CH2 y proporcionar un vector sintético que expresa una región constante de IgGi suprimido en el dominio. En una modalidad, un anticuerpo para el antagonista de Sp35 o fragmento del mismo para el uso en los métodos descritos en la presente, comprende una cadena pesada de inmunoglobulina que tiene supresión o sustitución de unos pocos o incluso de un solo aminoácido, siempre y cuando esto permita la asociación entre las subunidades monoméricas. Por ejemplo, la mutación de un aminoácido simple en áreas seleccionadas de un CH2 puede ser suficiente para reducir sustancialmente el enlace de Fe y con esto incrementar la localización del tumor. Similarmente, puede ser deseable suprimir simplemente aquella parte de uno o más dominios de la región constante que controlan la función efectora (por ejemplo, el enlace al complemento) que va a ser modulada. Tales supresiones parciales de las regiones constantes pueden mejorar las características seleccionadas del anticuerpo (vida media en suero) mientras que al mismo tiempo otras funciones deseables asociadas con el dominio de la región constante sujeto, quedan intactas. Además, como se alude anteriormente, las regiones constantes de los anticuerpos descritos pueden ser sintéticas a través de la mutación o sustitución de uno o más aminoácidos, lo cual aumenta el perfil de la construcción resultante. A este respecto, puede ser posible perturbar la actividad proporcionada por un sitio de enlace conservado (por ejemplo, enlace a Fe) mientras que sustancialmente mantiene la configuración del perfil inmunogénico del anticuerpo modificado. Otras modalidades más comprenden la ' adición de uno o más aminoácidos a la región constante para mejorar las características deseables tales como la función efectora o proporcionar más enlace a citotoxinas o a carbohidratos. En tales modalidades, puede ser deseable insertar o replicar secuencias específicas derivadas de los dominios seleccionados de la región constante. La presente invención también proporciona el uso de anticuerpos que comprenden, consisten esencialmente de, o consisten de variantes (incluyendo derivados) de moléculas de anticuerpo (por ejemplo, las regiones VH y/o las regiones VL) descritas en la presente, cuyos anticuerpos o fragmentos de los mismos se enlazan inmunoespecíficamente a un polipéptido de Sp35. Las técnicas estándares conocidas por aquellos expertos en la materia pueden ser utilizados para introducir mutaciones en la secuencia nucleotídica que codifica para una molécula de enlace, incluyendo, pero no limitada a, mutagénesis dirigida al sitio y mutagénesis mediada por PCR, que dan como resultado sustituciones de aminoácidos. Preferentemente, las variantes (incluyendo derivados) codifican menos de 50 sustituciones de aminoácidos, menos de 40 sustituciones de aminoácidos, menos de .30 sustituciones de aminoácidos, menos de 25 sustituciones de aminoácidos, menos de 20 sustituciones de aminoácidos, menos de 15 sustituciones de aminoácidos, menos de 10 sustituciones de aminoácidos, menos de 5 sustituciones de aminoácidos, menos de 4 sustituciones de aminoácidos, menos de 3 sustituciones de aminoácidos, ó menos de 2 sustituciones de aminoácidos con relación a la región VH de referencia, VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3, región VL, VLCDR1, VLCDR2, o VLCDR3. Una "sustitución conservadora de aminoácidos" es una en la cual el residuo de aminoácidos es reemplazado con un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral con una carga similar. Las familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales con cargas similares, han sido definidas en la técnica. Estas familias incluyen los aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina) , cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico) , cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteina) , cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano) , cadenas laterales beta-ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina) . Alternativamente, pueden ser introducidas mutaciones aleatoriamente a lo largo de toda o parte de la secuencia de codificación, tal como mediante mutagénesis de saturación, y los mutantes resultantes pueden ser seleccionados para la actividad biológica para identificar los mutantes que conservan la actividad. Por ejemplo, es posible introducir mutaciones únicamente en regiones estructurales o únicamente en las regiones CDR de una molécula de anticuerpo. Las mutaciones introducidas pueden ser ya sea mutaciones silenciosas o neutras en mal sentido, por ejemplo, no tienen o tienen poco efecto sobre la habilidad de un anticuerpo para enlazarse al antigeno. Estos tipos de mutaciones pueden ser útiles para optimizar el uso de codones, o mejorar la producción de anticuerpos de un hibridoma. Alternativamente, las mutaciones en mal sentido, no neutras pueden alterar la habilidad de un anticuerpo para enlazarse al antigeno. La localización de la mayoría de las mutaciones silenciosas y neutras en mal sentido t es probablemente en las regiones estructurales, mientras que la localización de la mayoría de las mutaciones en mal sentido no neutras es probable que sea en la CDR, aunque éste no es un requerimiento absoluto. Una persona experta en la técnica seria capaz de diseñar y probar moléculas mutantes con propiedades deseadas tales como la no alteración en la actividad de enlace al antigeno o la alteración en la actividad de enlace (por ejemplo, mejoramientos en la actividad de enlace al antigeno o cambio en la especificidad de anticuerpos) . Después de la ¦ mutagénesis, la proteina codificada puede ser expresada rutinariamente y la actividad funcional y/o biológica de la proteina codificada puede ser determinada utilizando técnicas descritas en la presente o mediante técnicas de modificación rutinaria conocidas en la materia. Los anticuerpos ejemplares o los fragmentos de los mismos para el uso en los métodos de la presente invención incluyen, pero no están limitados a, anticuerpos aislados o fragmentos de enlace al antigeno de los mismos los cuales se enlazan específicamente al mismo epitopo de Sp35 como un anticuerpo monoclonal de referencia seleccionado del grupo que consiste de 201', 3A3, 3A6, 1A7, 1G7, 2B10, 2C11, 2F3, 3P1D10.2C3, 3P1E11.3B7, 3P2C6.3G10.2H7 , 3P2C9.2G4, 3P4A6.1D9, 3P4A1.2B9, 3P4C2.2D2, 3P4C5.1D8, 3P4C8.2G9, 30- C12 (LiOl), 38-D01 (Li02), 35-E04 (Li03) , 36-C09 (Li04), 30-A11 (Li05) , 34-F02 (Li06), 29-E07 (Li07), 34-G04 (Li08), 36-A12 (Li09) , 28-D02 (LilO), 30-B01 (Lili), 34-B03 (Lil2), 3383 (Lla.l), 3495 (Lia.2), 3563 (Lia.3), 3564 (Lia.4), 3565 (Lia.5), 3566 (Lia.6), 3567 (Lia.7), 3568 (Lia.8), 3569 (Lia.9), 3570 (Lia.10), 3571 (Lia.11), 3582 (Lia.12), y 1968 (Lia.13), todos como se describen en las Solicitudes de Patente Provisionales de los Estados Unidos Nos. 60/697,336, 60/771,990 y 60/814,522, las cuales son todas incorporadas por referencia en la presente en su totalidad.
Proteínas de Fusión y Polipéptidós y Anticuerpos Conjugados Los polipéptidós antagonistas Sp35, los aptámeros y anticuerpos para los antagonistas para el uso en los métodos descritos en la presente, pueden ser además recombinantemente fusionados a un polipéptido heterologo en el extremo N o C o químicamente conjugados (incluyendo conjugaciones covalentes y no covalentes) a los polipéptidós u otras composiciones. Por ejemplo, los polipéptidós antagonistas de Sp35, los aptámeros y los anticuerpos pueden ser recombinantemente fusionados o conjugados a moléculas útiles como marcadores en los ensayos de detección y las moléculas efectoras tales como los polipéptidós heterólogos, fármacos, radionúclidos o toxinas. Ver, por ejemplo, las publicaciones del PCT WO 92/08495; WO 91/14438; WO 89/12624; Patente de los Estados Unidos No. 5,314,995; EP 396,387. Los polipéptidós antagonistas de Sp35, aptámeros y anticuerpos para el uso en los métodos descritos en la presente, incluyen derivados que son modificados, por ejemplo, mediante el enlace covalente de cualquier tipo de moléculas tal que el enlace covalente no previene que el polipéptido antagonista de Sp35, el aptámero o el anticuerpo inhiban la función biológica de Sp35. Por ejemplo, pero no a manera de limitación, los polipéptidos antagonistas de Sp35, aptámeros y anticuerpos de la presente invención pueden ser modificados por ejemplo, mediante glucosilación, acetilación, pegilación, fosfilación, fosforilación, amidación, derivatización por grupos protectores/bloqueadores conocidos, escisión proteolitica, enlace a un ligando celular u otra proteina, etc. Cualquiera de las modificaciones químicas novedosas pueden ser llevadas a cabo mediante técnicas conocidas, incluyendo pero no limitadas a la escisión química específica, acetilación, formulación, síntesis metabólica de la tunicamicina , etc. Además, el derivado puede contener uno o más aminoácidos no clásicos. Los polipéptidos antagonistas de Sp35, los aptámeros y' anticuerpos para el uso en los métodos descritos en la presente, pueden estar compuestos de aminoácidos unidos uno al otro por enlaces peptídicos o enlaces peptídicos modificados, por ejemplo, isósteros peptídicos, y pueden contener aminoácidos diferentes de los 20 aminoácidos codificados por los genes. Los polipéptidos antagonistas de Sp35, los aptámeros y anticuerpos pueden ser modificados mediante procesos naturales, tales como el procesamiento post-traduccional , o mediante técnicas de modificación químicas que son bien conocidas en la materia. Tales modificaciones son bien descritas en los textos básicos y en monografías más detalladas, así como en la literatura de investigación voluminosa. Las modificaciones pueden ocurrir en cualquier sitio en el polipéptido antagonista de Sp35 o en el anticuerpo, incluyendo la cadena principal peptídica, las cadenas laterales de aminoácidos y los extremos amino o carboxilo, o sobre porciones tales como carbohidratos. Se apreciará que el mismo tipo de modificación puede estar presente en el mismo o en grados variantes en diversos sitios en un polipéptido antagonista de Sp35 dado, aptámero o anticuerpo. También, un polipéptido antagonista de Sp35 dado, un aptámero o anticuerpo puede contener muchos tipos de modificaciones. Los polipéptidos antagonistas de Sp35, aptámeros o anticuerpos pueden ser ramificados, por ejemplo, como resultado de la ubiquitinación, y éstos pueden ser cíclicos, con o sin ramificaciones. Los polipéptidos antagonistas de Sp35 cíclicos, ramificados y cíclicos-ramificados, los aptámeros y anticuerpos pueden resultar de los procesos naturales post-traduccionales o pueden ser realizados mediante métodos sintéticos. Las modificaciones incluyen la acetilación, acilación, ADP-ribosilación, amidación, enlace covalente de flavina, enlace covalente de una porción hemo, enlace covalente de un nucleótido o derivado de nucleótido, enlace covalente de un lipido o derivado lipidico, enlace covalente de fosfatidilinositol , reticulación, ciclización, formación de enlaces disulfuro, desmetilación, formación de reticulaciones covalentes, formación de cisteina, formación de piroglutamato, formilación, gamma-carboxilación, glucosilación, formación de ancla de GPI, hidroxilación, yodación, metilación, miristoilación, oxidación, pegilación, procesamiento proteolitico, fosforilación, prenilación, racemización, selenoilación, sulfatación, adición de aminoácidos a las proteinas, mediada por ARN de transferencia, tal como arginilación y ubiquitinación . (Ver, por ejemplo, Proteins -Structure And Molecular Properties, T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, New York 2a Ed., (1993); Posttranslational Covalent Modification Of Proteins, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, New York, pgs . 1-12 (1983); Seifter et al.., Meth Enzymol 182: 626-646 (1990) ; Rattan et al, Ann NY Acad Sci 663: 48-62 (1992)) . La presente invención también proporciona proteinas de fusión que comprenden, que consisten esencialmente de, o que consisten de un polipéptido antagonista de Sp35, aptámero o anticuerpo de fusión, que inhibe la función de Sp35. Preferentemente, el polipéptido heterólogo al cual está fusionado el polipéptido antagonista de Sp35, el aptámero o el anticuerpo, es útil para la función o es útil para dirigirse al polipéptido del antagonista de Sp35 o al anticuerpo. En ciertas modalidades de la invención, un polipéptido antagonista de Sp35 soluble, por ejemplo un polipéptido de Sp35 que comprende los dominios LRR, el dominio de Ig, o el dominio extracelular completo (correspondiente a los aminoácidos 34 al 532 de la SEQ ID NO: 2) es fusionado a una porción polipeptidica hete'róloga para formar un polipéptido de fusión antagonista de Sp35. Las proteínas de fusión antagonistas de Sp35, los aptámeros y los anticuerpos pueden ser logrados para formar diversos objetivos, por ejemplo, vida media incrementada en suero, biodisponibilidad mejorada, dirección al objetivo in vivo hacia un órgano específico o tipo de tejido específico, eficiencia de expresión recombinante mejorada, secreción mejorada de células hospederas, facilidad de purificación, y más alta avidez. Dependiendo del o de los objetivos que van a ser logrados, la porción heteróloga puede ser inerte o biológicamente activa. También, ésta puede ser elegida para ser establemente fusionada al polipéptido antagonista de Sp35, al aptámero o al- anticuerpo, o para ser escindible, in vivo o in vitro. Las porciones heterologas para lograr estos otros objetivos son conocidas en la materia. Como una alternativa a la expresión de un polipéptido de fusión antagonista de Sp35, aptámero o anticuerpo, una porción heteróloga elegida puede ser preformada y químicamente conjugada al polipéptido antagonista de Sp35, aptámero o anticuerpo. En la mayoría de los casos, una porción heteróloga elegida funcionará similarmente, ya sea fusionada o conjugada al polipéptido antagonista de Sp35, al aptámero o al anticuerpo. Por lo tanto, en la siguiente discusión de la secuencia de aminoácidos heterólogas, a no ser que se indique de otro modo, se debe entender que la secuencia heteróloga puede ser unida al polipéptido antagonista de Sp35, aptámero o anticuerpo en la forma de una proteína de fusión o como un conjugado químico. Los polipéptidos farmacológicamente activos tales como los polipéptidos antagonistas de Sp35, aptámeros o anticuerpos a menudo muestran despejo in vivo rápido, necesitando grandes dosis para lograr concentraciones terapéuticamente efectivas en el cuerpo. Además, los polipéptidos más pequeños de aproximadamente 60 kDa sufren potencialmente filtración glomerular, lo cual algunas veces conduce a la - nefrotoxicidad. La fusión o conjugación de polipéptidos relativamente pequeños .tales como polipéptidos antagonistas de Sp35, aptámeros o anticuerpos pueden ser empleados para reducir o evitar el riesgo de tal nefrotoxicidad. Diversas secuencias heterólogas de aminoácidos, por ejemplo, porciones polipeptídicas o "portadores", para incrementar la estabilidad in vivo, por ejemplo, la vida media en suero, o los polipéptidos terapéuticos,, son conocidos. Debido a su vida media prolongada, amplia distribución in vivo, y falta de función enzimática o inmunológica, la albúmina sérica humana esencialmente de longitud completa (HSA) , o un fragmento de HSA, es comúnmente utilizada como una porción heteróloga. A través de la aplicación de métodos y materiales tales como aquellos enseñados en Yeh et al, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89: 1904-08 (1992) y Syed et al, Blood 89: 3243-52 (1997), se puede utilizar HSA para formar un polipéptido de fusión antagonista de Sp35, el aptámero o el anticuerpo o el conjugado polipéptido/anticuerpo que muestra actividad farmacológica en virtud de la porción Sp35, al tiempo que muestra estabilidad in vivo significativamente incrementada, por ejemplo, 10 veces a 100 veces más alta. El extremo C de la HSA puede ser fusionado al extremo N de la porción Sp35 soluble. Ya que HSA es una proteina naturalmente secretada, la secuencia de señal HSA puede ser explotada para obtener la secreción de la proteina de fusión Sp35 soluble dentro del medio de cultivo celular, cuando la proteina de fusión es producida en un sistema de expresión eucariótico, por ejemplo de mamífero. En ciertas modalidades, los polipéptidos antagonistas de Sp35, aptámeros, anticuerpos y fragmentos de anticuerpo de los mismos para el uso en los métodos de la presente invención comprenden además una porción de dirección al objetivo. Las porciones de dirección al objetivo incluyen una proteina o un péptido que dirige la localización hacia una cierta parte del cuerpo, por ejemplo, hacia el cerebro o compartimientos en éste. En ciertas modalidades, los polipéptidos antagonistas de Sp35, aptámeros, anticuerpos o fragmentos de anticuerpos de los mismos para el uso en los métodos de la. presente invención, son enlazados o fusionados a una porción de dirección al cerebro. Las porciones de dirección al cerebro son covalentemente enlazadas (por ejemplo, mediante enlace directo, fusión traduccional , o por enlace químico ya sea directamente o a través de una molécula espaciadora, la cual puede ser opcionalmente escindible) o no covalentemente enlazada (por ejemplo, a través de interacciones reversibles tales como avidina, biotina, proteína A, IgG, etc.). En otras modalidades, los polipéptidos antagonistas de Sp35, aptámeros, anticuerpos o fragmentos anticuerpo de los mismos para el uso en los métodos de la presente invención son enlazados a una o más porciones de dirección al cerebro. En modalidades adicionales, la porción de dirección al cerebro es enlazada a una pluralidad de polipéptidos antagonistas de Sp35, aptámeros, anticuerpos o fragmentos de anticuerpos de los mismos para el uso en los métodos de la presente invención. Una porción de dirección al cerebro asociada con un polipéptido antagonista de Sp35, aptámero, anticuerpo o fragmento de anticuerpo del mismo, mejora la distribución cerebral de tal polipéptido antagonista de Sp35, aptámero, anticuerpo o fragmento de anticuerpo del mismo. Un número de polipéptidos han sido descritos, los cuales, cuando son fusionados a una proteina o agente terapéutico, distribuye la proteina o el agente terapéutico a través de la barrera sangre-cerebro (BBB por sus siglas en inglés) . Los ejemplos no limitantes incluyen el anticuerpo de dominio simple FC5 (Abulrob et al. (2005) J. Neurochem. .95, 1201-1214); el mAB 83-14, un anticuerpo monoclonal para el receptor de insulina humana (Pardridge et al. (1995) Pharmacol. Res. 12, 807-816); los péptidos B2, B6 y B8 que se enlazan al receptor de transferrina humano (hTfR) (Xia et al. (2000) J. Virol. 14, 11359-11366) ; el anticuerpo monoclonal 0X26 para el receptor de transferrina (Pardridge et al. (1991) J. Pharmacol. Exp. Ther. 259, 66-70); y las SEQ ID NOs : 1-18 de la Patente de los Estados Unidos No. 6,306,365. Los contenidos de las referencias anteriores son incorporados por referencia en su totalidad en la presente. La distribución cerebral mejorada de una composición de Sp35, es determinada por un número de medios bien establecidos en la técnica. Por ejemplo, la administración a un animal de un polipéptido antagonista de Sp35, radioactivamente marcado, el aptámero, el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo del mismo, enlazado a una porción de dirección al cerebro; la determinación de la localización cerebral; y la comparación de la localización con un polipéptido antagonista de Sp35, radioactivamente marcado, equivalente, aptámero, anticuerpo o fragmento de anticuerpo del mismo, que no está asociado con una porción de dirección al cerebro. Otros medios para determinar la dirección mejorada son descritos en las referencias anteriores. La secuencia de señal es un polinucleótido que codifica para una secuencia de aminoácidos que inicia el transporte de una proteina a través de la membrana del retículo endoplásmico . Las secuencias de señal útiles para la construcción de una inmunofusina incluyen las secuencias de señal de la cadena ligera del anticuerpo, por ejemplo el anticuerpo 14.18 (Gillies et al., J. Immunol . Meth. 125: 191-202 (1989)), las secuencias de señal de la cadena pesada del anticuerpo, por ejemplo las secuencias de señal de la cadena pesada del anticuerpo MOPC141 (Sakano et al., Nature 286: 5174 (1980)). Alternativamente, pueden ser utilizadas otras secuencias de señal. Ver, por ejemplo, atson, Nucí. Acids Res. 72: 5145 (1984). El péptido de señal es usualmente escindido en el lumen del retículo endoplásmico por peptidasas de señal. Esto da como resultado la secreción de una proteína inmunofusina que contiene la región Fe y la porción Sp35 soluble.
En algunas modalidades, la secuencia de ADN puede codificar para un sitio de escisión proteolitica entre el cásete de secreción y la porción Sp35 soluble. Tal sitio de escisión puede proporcionar, por ejemplo, la escisión proteolitica de la proteina de fusión codificada, separando de este modo el dominio Fe de la proteina objetivo. Los sitios de escisión proteolitica útiles incluyen secuencias de aminoácidos reconocidas por las enzimas proteoliticas tales como tripsina, plasmina, trombina, factor Xa, o enterocinasa K. El cásete de secreción puede ser incorporado dentro de un vector de expresión replicable. Los vectores útiles incluyen ácidos nucleicos lineales, plásmidos, fagémidos, cósmicos y similares. Un vector de expresión ejemplar es pdC, en el cual la transcripción del ADN de la inmunofusina es colocado bajo el control del aumentador y el promotor del citomegalovirus humano. Ver, por ejemplo, Lo et al., Biochim. Biophys. Acta 1088:112 (1991); y Lo et al, Protein Engineering 77:495-500 (1998) . Una célula hospedera apropiada puede ser transformada o transfectada con un ADN que codifica para un polipéptido Sp35 soluble, y utilizado para la expresión y secreción del polipéptido Sp35 soluble. Las células hospederas que son típicamente utilizadas incluyen células hibridomas inmortales, células de mieloma, células 293, células de ovario de hámster Chino (CHO) , células HeLa y células COS. En una modalidad, un polipéptido Sp35 soluble es fusionado a una región de bisagra y Fe, por ejemplo, la porción C-terminal de una región constante de la cadena pesada de inmunoglobulina . Las ventajas potenciales de una fusión Sp35-Fc incluyen la solubilidad, la estabilidad in vivo y la multivalencia, por ejemplo la dimerización . La región Fe utilizada puede ser una región Fe de IgA, IgD o IgG (bisagra- cH2- CH3-) . Alternativamente, ésta puede ser una región Fe de IgE o de IgM (bisagra- CH2- CH3-CH4). Una región Fe de IgG es en general utilizada, por ejemplo, una región Fe - de IgGi o una región Fe de IgG4. En una modalidad, una secuencia que comienza en la región de bisagra justo corriente arriba del sitio de escisión de papaina que define la Fe de IgG químicamente (por ejemplo el residuo 216, tomando el primer residuo de la región constante de la cadena pesada que es 114 de acuerdo al sistema de Kabat) , o los sitios análogos de otras inmunoglobulinas , es utilizado en la fusión. El sitio preciso en el cual es realizada la fusión no es crítico; los sitios particulares son bien conocidos y pueden ser seleccionados con el fin de optimizar la actividad biológica, la secreción o las características de enlace de la molécula. Los materiales y métodos para construir y expresar el ADN que codifica para las fusiones de Fe, son conocidos en la técnica y pueden ser aplicados para obtener fusiones de Sp35 solubles sin experimentación indebida. Algunas modalidades de la invención emplean una proteina de fusión Sp35 tales como aquellas descritas en Capón et al., Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,428,130 y 5,565,335. Las regiones Fe de tipo silvestre, completamente intactas, muestran funciones efectoras que normalmente no son necesarias y no deseadas en una proteina de fusión Fe utilizada en los métodos de la presente invención. Por lo tanto, ciertos sitios de enlace son típicamente suprimidos de la región Fe durante la construcción del cásete de secreción. Por ejemplo, ya que la coexpresión con la cadena ligera es innecesaria, el sitio de enlace para la proteína de enlace a la cadena pesada, Bip (Hendershot et al, Immunol . Today 8: 111-14 (1987)), es suprimida del dominio CH2 de la región Fe de IgE, tal que este sitio no interfiere con la secreción eficiente de la inmunofusina . Las secuencias del dominio transmembranal, tales como aquellas presentes en la IgM, son también en general suprimidas. La región Fe IgGi es la más frecuentemente utilizada. Alternativamente, la región Fe de las otras subclases de inmunoglobulina gamma (gamma-2, gamma-3 y gamma-4) puede ser utilizada en el cásete de secreción. La región Fe de la IgGi de inmunoglobulina gamma-1, es en general utilizada en el cásete de secreción e incluye al menos parte de la región de bisagra, la región CH2 y la región CH3. En algunas modalidades, la región Fe de la inmunoglobulina gamma-1 es una Fe suprimida en CH2, que incluye parte de la región de bisagra y la región CH3, pero no la región CH2. La Fe suprimida en CH2 ha sido descrita por Gillies et al. (1990) Huía. Antibod. Hybridomas 1: 47. En algunas modalidades, es utilizada la región Fe de una de la IgA, IgD, IgE, o IgM. Las proteínas de fusión Sp35-Fc pueden ser construidas en varias configuraciones diferentes. En una configuración el extremo C de la porción Sp35 soluble es fusionada directamente al extremo N de la porción de bisagra Fe. En una configuración ligeramente diferente, un polipéptido corto, por ejemplo de 2 a 10 aminoácidos, es incorporado dentro de la fusión entre el extremo N de la porción Sp35 soluble y el extremo C de la porción Fe. Tal ligador proporciona la flexibilidad conformacional , que puede mejorar la actividad biológica en algunas circunstancias. Si una porción suficiente de la región de bisagra es conservada en la porción Fe, la fusión Sp35-Fc se dimerizará, formando de este modo una molécula divalente. Una población homogénea de fusiones Fe monoméricas producirá dímeros bivalentes, monoespecífieos . Una mezcla de dos fusiones Fe monoméricas que tienen cada una especificidad diferente, producirán dímeros bivalentes, biespecífieos . Cualquiera de un número de reticuladores que contengan un grupo amino-reactivo correspondiente y un grupo tiol-reactivo pueden ser utilizados para enlazar los polipéptidos antagonistas de Sp35 a la albúmina sérica. Los ejemplos de ligadores adecuados incluyen reticuladores amino-reactivos que insertan una maleimida tiol-reactiva , por ejemplo, SMCC, AMAS, BMPS, MBS, EMCS, SMPB, SMPH, KMUS, y GMBS. Otros ligadores adecuados insertan un grupo haloacetato tio-reactivo, por ejemplo SBAP, SIA, SIAB. Los ligadores que proporcionan un tiol protegido o no. protegido para la reacción con los grupos sulfhidrilo para producir un enlace reducible incluyen SPDP, SMPT, SATA y SATP. Tales reactivos son comercialmente disponibles (por ejemplo, Pierce Chemicals) . La conjugación no tiene que involucrar el extremo N de un polipéptido Sp35 soluble o la porción tiol sobre la albúmina sérica. Por ejemplo, las fusiones de Sp35-albúmina solubles pueden ser obtenidas utilizando técnicas de ingeniería genética, en donde la porción Sp35 soluble es fusionada al gen de la albúmina sérica en su extremo N, en su extremo C o en ambos . Los polipéptidos Sp35 solubles pueden ser fusionados a péptidos heterólogos para facilitar la purificación o la identificación de la porción Sp35 soluble. Por ejemplo, un marcador de histidina puede ser fusionado a un polipéptido Sp35 soluble para facilitar la purificación utilizando medios de cromatografía comercialmente disponibles . En algunas modalidades de la invención, una construcción de fusión de Sp35 soluble es utilizada para aumentar la producción de una porción Sp35 soluble en bacterias. En tales construcciones una proteína bacteriana normalmente expresada y/o secretada a un alto nivel, es empleada como el socio de fusión N-terminal de un polipéptido Sp35 soluble. Ver, por ejemplo, Smith et al, Gene 67: 31 (1988); Hopp et al, Biotechnology 6: 1204 (1988); La Vallie et al, Biotechnology 77: 187 (1993). Mediante la fusión de una porción Sp35 soluble en los extremos amino y carboxilo de un socio de fusión adecuado, pueden ser obtenidas formas bivalentes o tetravalentes de un polipéptido Sp35 soluble. Por ejemplo, una porción SP35 soluble puede ser fusionada a los extremos amino y carboxilo de una porción de Ig para producir un polipéptido monomérico bivalente que contiene dos porciones Sp35 solubles. Después de la dimerización de dos de estos monómeros, en virtud de la porción Ig, es obtenida una forma tetravalente de una proteína Sp35 soluble. Tales formas multivalentes pueden ser utilizadas para lograr la afinidad de enlace incrementada para el objetivo. Las formas multivalentes de Sp35 soluble pueden ser también obtenidas mediante la colocación de porciones Sp35 solubles en tándem para formar concatámeros, que pueden ser empleados solos o fusionados a un socio de fusión tal como Ig o HSA.
Polímeros Conjugados (diferentes de los polipéptidos ) Algunas modalidades de la invención involucran un polipéptido de Sp35 soluble, aptámero de Sp35, o anticuerpo de Sp35, en donde uno o más polímeros son conjugados (covalentemente enlazados) al polipéptido de Sp35, al aptámero o al anticuerpo para el uso en los métodos de la presente invención. Los ejemplos de polímeros adecuados para tal conjugación incluyen polipéptidos (discutidos anteriormente) , aptámeros, polímeros de azúcar y cadenas de polialquilen'glicol . Típicamente, pero no necesariamente, un polímero es conjugado al polipéptido Sp35 soluble, al aptámero o al anticuerpo de Sp35 para el propósito de mejorar uno o más de los siguientes: solubilidad, estabilidad o biodisponibilidad . La clase de polímero utilizado en general para la conjugación de un polipéptido antagonista de Sp35, el aptámero o el anticuerpo es un polialquilenglicol . El polietilenglicol (PEG) es más frecuentemente utilizado, las porciones PEG, por ejemplo 1, 2, 3, 4 ó 5 polímeros de PEG, pueden ser conjugadas a cada polipéptido antagonista de Sp35, aptámero o anticuerpo, para incrementar la vida media en suero, en comparación al polipéptido antagonista de Sp35, al aptámero o al anticuerpo solo. Las porciones PEG son no antigénicas y esencialmente biológicamente inertes. Las porciones PEG utilizadas en la práctica de la invención pueden ser ramificadas o no ramificadas. El número de porciones PEG enlazadas al polipéptido antagonist de Sp35, al aptámero o al anticuerpo, y el peso molecular de las cadenas PEG individuales, pueden variar. En general, entre más alto sea el peso molecular del polímero, menos cadenas poliméricas se acoplan al polipéptido. Usualmente, la masa total del polímero enlazado al polipéptido antagonista de Sp35, el aptámero o el anticuerpo es de 20 kDa a 40 kDa. De este modo, si una cadena polimérica es enlazada, el peso molecular de la cadena es en general 20 a 40 kDa. Si son enlazadas dos cadenas, el peso molecular de cada cadena es en general de 10 a 20 kDa. Si son enlazadas tres cadenas, el peso molecular es en general de 7 a 14 kDa. El polímero, por ejemplo, PEG puede ser enlazado al polipéptido antagonista de Sp35, al aptámero o al anticuerpo a través de cualquier grupo reactivo expuesto, adecuado, sobre el polipéptido. El o los grupos .reactivos expuestos pueden ser, por ejemplo, un grupo amino N-terminal o el grupo epsilon-amino de un residuo de lisina interno o ambos. Un polímero activado puede reaccionar y enlazarse covalent.emente en cualquier grupo amino libre sobre el polipéptido antagonista de Sp35, el aptámero o el anticuerpo. Los grupos carboxilicos libres, los grupos carbonilo adecuadamente activados, las porciones hidroxilo, guanidilo, imidazol, carbohidrato oxidado y los grupos mercapto del polipéptido antagonista de Sp35, aptámero o anticuerpo (si están disponibles) pueden ser también utilizados como grupos reactivos para el enlace polimérico. En una reacción de conjugación, de aproximadamente 1.0 hasta aproximadamente 10 moles del polímero activado por mol del polipéptido, dependiendo de la concentración del polipéptido, es típicamente empleado. Usualmente, la proporción elegida representa un balance entre la maximización de la reacción, al tiempo que se reducen al mínimo las reacciones colaterales (a menudo no específicas) que pueden deteriorar la actividad farmacológica deseada del polipéptido antagonista de Sp35, o el · anticuerpo. Preferentemente, al menos 50% de la actividad biológica (como es demostrada, por ejemplo, en cualquiera de los ensayos descritos en la presente o conocidos en la técnica) del polipéptido antagonista de Sp35, el aptámero o el anticuerpo, es conservada, y más preferentemente casi 100% es conservada. El polímero puede ser conjugado al polipéptido antagonista de Sp35, el aptámero o el anticuerpo, utilizando química convencional. Por ejemplo, una porción polialquilenglicol puede ser acoplada a un grupo epsilon-amino de la lisina, del polipéptido antagonista de Sp35, el aptámero o el anticuerpo. El enlace a la cadena lateral de lisina puede ser realizado con un éster activo de N-hidroxisuccinimida (NHS) tal como el succinato .de PEG-succinimidilo (SS-PEG) y el propionato de succinimidilo (SPA-PEG) . Las porciones polialquilenglicol adecuadas incluyen, por ejemplo, carboximetil-NHS y norleucina-NHS, SC. Estos reactivos son comercialmente disponibles. Los enlazadores de PEG amino-reactivos adicionales pueden ser sustituidos por la porción succinimidilo. Éstos incluyen, por ejemplo, isotiocianatos , nitrofenilcarbonatos (PNP), epóxidos, carbonatos de benzotriazol, SC-PEG, tresilato, aldehido, epóxido, carbonilimidazol y carbonato de PNP. Las condiciones son usualmente optimizadas para elevar al máximo la selectividad y el grado de la reacción. Tal optimización de las condiciones de reacción está dentro de la experiencia ordinaria en la técnica. La PEGilación puede ser llevada a cabo mediante cualquiera de las reacciones de PEGilación conocidas en la técnica. Ver, por ejemplo, Focus on Growth Factors 3:4-10 (1992), y Solicitudes de Patente Europeas EP 0 154 316 y EP 0 401 384. La PEGilación puede ser llevada a cabo utilizando una reacción de acilación o una reacción de alquilación con una molécula de polietilenglicol reactiva (o un polímero soluble en agua reactivo, análogo) .
La PEGilación mediante acilación involucra en general la reacción de un derivado de éster activo de polietilenglicol. Cualquier molécula de PEG reactiva . puede ser empleada en la PEGilación. El PEG esterificado a la N-hidroxisuccinimida (NHS) es un éster de PEG activado, frecuentemente utilizado. Como se utiliza en la presente, "acilación" incluye sin limitación los siguientes tipos de enlaces entre la proteina terapéutica y un polímero soluble en agua tal como PEG: amida, carbamato, uretano y similares. Ver, por ejemplo, Bioconjugate Chem. 5: 133-140, 1994. Los parámetros de la reacción son en general seleccionados para evitar las condiciones de temperatura, de solvente y de pH que pudieran dañar o inactivar el polipéptido Sp35 soluble, el aptámero o el anticuerpo. En general, el enlace de conexión es una amida y típicamente al menos 95% del producto resultante está mono-, di- o tri-PEGilado . No obstante, algunas especies con más altos grados de PEGilación pueden ser formados en cantidades que dependen de las condiciones de reacción específicas, utilizadas. Opcionalmente, las especies PEGiladas purificadas son separadas de la mezcla, particularmente las especies sin reaccionar, mediante métodos convencionales de purificación, incluyendo, por ejemplo, diálisis, precipitación salina, ultrafiltración, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de filtración en gel, cromatografía de intercambio hidrofóbico y electroforesis . La PEGilación mediante alquilación involucra en general la reacción de un derivado aldehido terminal de PEG con el polipéptido antagonista de Sp35, el aptámero o el anticuerpo, en presencia de un agente reductor. Además, se pueden manipular las condiciones de reacción para favorecer la PEGilación sustancialmente solo en el grupo amino N-terminal del polipéptido antagonista de Sp35, el aptámero o el anticuerpo, por ejemplo la proteina mono-PEGilada . En cualquier caso de la mono-PEGilación o la poli-PEGilación, los grupos PEG son típicamente enlazados a la proteína vía un grupo -CH2-NH- . Con referencia particular al grupo -CH2-, este tipo de enlace es conocido como un enlace "alquilo". La derivatización vía la alquilación reductiva para producir un producto mono-PEGilado N-terminalmente dirigido, explota la reactividad diferencial de diferentes tipos de grupos amino primarios (lisina versus el N-terminal) disponible para la derivatización. La reacción es realizada a un pH que permite tomar ventaja de las diferencias de pKa entre los grupos epsilon-amino de los residuos de lisina y aquel del grupo N-terminal de la proteína. Mediante tal derivatización selectiva, el enlace de un polímero soluble en agua que contiene un grupo reactivo, tal como un aldehido, a una proteína, es controlado: la conjugación con el polímero tiene lugar predominantemente en el extremo N de la proteína y no ocurre ninguna modificación significativa de otros grupos reactivos, tales como los grupos, amino de cadena lateral de lisina. Las moléculas poliméricas utilizadas en los procedimientos de acilación y alquilación son seleccionados de entre los polímeros solubles en agua. El polímero seleccionado es típicamente modificado para tener un grupo reactivo simple, tal como un éster activo para la acilación de un aldehido para la alquilación, de modo que el grado de polimerización puede ser controlado como es proporcionado en los presentes métodos. Un aldehido de PEG reactivo, ejemplar es el polietilenglicol-propionaldehído, el cual es estable en agua, o los derivados de mono alcoxi de 1 a 10 átomos de carbono o de ariloxi de los mismos (ver, por ejemplo Harris et al., Patente de los Estados Unidos No. 5,252, 714). El polímero puede ser ramificado o no ramificado. Para las reacciones de acilación, el o los polímeros seleccionados tienen típicamente un grupo éster reactivo simple. Para la alquilación reductiva, el o los polímeros seleccionados tienen típicamente un grupo aldehido reactivo simple. En general, el polímero soluble en agua no será seleccionado de los residuos glucosilo de origen natural, debido a que éstos son usualmente hechos más convenientemente mediante sistemas de expresión recombinante en mamífero. Los métodos para preparar un polipéptido antagonista de Sp35, soluble PEGilado, el aptámero o el anticuerpo incluyen en general los pasos de (a) hacer reaccionar un polipéptido antagonista de Sp35, el aptámero o el anticuerpo con polietilenglicol (tal como un éster reactivo o el derivado aldehido de PEG) bajo condiciones mediante las cuales la molécula se llega enlazar a uno o más grupos PEG, y (b) la obtención del o de los productos de reacción. En general, las condiciones de reacción óptimas para las reacciones de acilación serán determinadas caso por caso con base en los parámetros conocidos y el resultado deseado. Por ejemplo, una proporción mayor de PEG a proteina conduce en general a un mayor porcentaje del producto poli-PEGilado. La alquilación reductiva para producir una población sustancialmente homogénea del mono-polimero/polipéptido Sp35 soluble, aptámero de Sp35 o anticuerpo de Sp35, incluye en general los pasos de: (a) hacer reaccionar una proteina Sp35 soluble o el polipéptido de Sp35 con una molécula PEG reactiva bajo condiciones de alquilación reductiva, a un pH adecuado para permitir la modificación selectiva del grupo amino N-terminal del polipéptido o del anticuerpo; y (b) la obtención del o de los productos de reacción. Para una población sustancialmente homogénea del mono-polimero/polipéptido Sp35 soluble, el aptámero de Sp35 o el anticuerpo de Sp35, las condiciones de reacción de alquilación reductiva son aquellas que permiten el enlace selectivo de la porción polimérica soluble en agua al extremo N del polipéptido o' del anticuerpo. Tales condiciones de reacción proporcionan en general diferencias de pKa entre los grupos amino de cadena lateral de lisina y el grupo amino N-terminal. Para los propósitos de la presente invención, el pH está en general en el intervalo de 3 a 9, típicamente de 3 a 6. Los polipéptidos antagonistas de Sp35, aptámeros o anticuerpos pueden incluir un marcador, por ejemplo, una porción que puede ser sustancialmente liberada mediante proteólisis. De este modo, la porción lisina puede ser selectivamente modificada primeramente al hacer reaccionar un marcador de His modificado con un ligador de bajo peso molecular tal como el reactivo de Traut (Pierce) que reaccionará con la lisina y el extremo N, y luego liberará el marcador de His. El polipéptido contendrá entonces un grupo SH libre que puede ser selectivamente modificado con un PEG que contiene un grupo de cabeza tiol-reactivo tal como un grupo maleimida, un grupo vinilsulfona, un grupo haloacetato, o un SH libre o protegido. El reactivo de Traut puede ser reemplazado con cualquier ligador que establecerá un sitio específico para el enlace de PEG. Por ejemplo, el reactivo de Traut puede ser reemplazado con SPDP, S PT, SATA, o SATP (Pierce) . Se podría hacer reaccionar la proteína con un ligador amino-reactivo que inserta una maleimida (por ejemplo SMCC, AMAS, BMPS, MBS, EMCS, SMPB, SMPH, KMUS, o GMBS), un grupo haloacetato (SBAP, SIA, SIAB) , o un grupo vinilsulfona y hacer reaccionar el producto resultante con un PEG que contiene un SH libre. En algunas modalidades, la porción polietilenglicol es acoplada a un grupo cisteína del polipéptido antagonista de Sp35, el aptámero o el anticuerpo para el uso en los métodos de la presente invención. El acoplamiento puede ser efectuado utilizando, por ejemplo, un grupo maleimida, un grupo vinilsulfona, un grupo haloacetato o un grupo tiol. Opcionalmente, el polipéptido antagonista de Sp35, el aptámero o el anticuerpo soluble, es conjugado a la porción polietilenglicol a través de un enlace lábil. El enlace lábil puede ser escindido en, por ejemplo, hidrólisis bioquímica, proteólisis o enlace sulfhidrilo. Por ejemplo, el enlace puede ser escindido bajo condiciones in vivo ( fisiológicas ) . Las reacciones pueden tener lugar mediante cualquier método adecuado utilizado para hacer reaccionar los materiales biológicamente activos con polímeros inertes, en general aproximadamente a pH 5-8, pH 5, 6, 7 u 8, si los grupos reactivos están sobre el grupo alfa-amino en el extremo N. En general, el proceso involucra la preparación de un polímero activado y después de esto la reacción de la proteína con el polímero activado para producir la proteína soluble, adecuada para la formulación.
Antagonistas del Polinucleótido Sp35 Los antagonistas de Sp35 en los métodos de la presente invención incluyen un antagonista del polinucleótido de Sp35, que comprende una molécula de ácido nucleico que se enlaza específicamente a un polinucleótido que codifica para Sp35. El antagonista del polinucleótido de Sp35 previene la expresión de Sp35 (supresión) . Los antagonistas del polinucleótido de Sp35 incluyen, pero no están limitados a las moléculas antisentido, ribozimas, ARNsi, ARNsh, ARNi. Típicamente, tales moléculas de enlace son separadamente administradas al animal (ver, por ejemplo O'Connor, J. Neurochem. 56: 560 (1991), pero tales moléculas de enlace pueden también ser expresadas in vivo a partir de los polinucleótidos recogidos por una célula hospedera y expresados in vivo. Ver también Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Ratón, FL (1988) . El ARNi se refiere a la expresión de un ARN que interfiere con la expresión del ARNM dirigido. Específicamente, el ARNi silencia un gen objetivo por medio de la interacción con el ARNM específico (por ejemplo Sp35) a través de un ARNsi (ARN de interferencia corto) . El complejo ds-ARN es luego dirigido al objetivo para la degradación por la célula. Las moléculas de ARNi adicionales incluyen el ARN de horquilla corto (ARNsh) ; también la horquilla de interferencia corta. La molécula de ARNsh contiene las secuencias en sentido y antisentido provenientes de un gen objetivo, conectadas por un bucle. El ARNsh es transportado desde el núcleo hacia el citoplasma, éste es degradado junto con el ARNM, los promotores Pol III o U6 pueden ser utilizados para expresar los ARNs para el ARNi. En algunas modalidades de la invención, el ARNsh es expresado a partir de un vector lentiviral (por ejemplo pLL3.7). El ARNi es mediado por las moléculas de ARN de doble hebra (ARNds) que tienen homología específica de secuencia a sus ARNMs "objetivo" (Caplen et al, Proc Nati Acad Sci USA P5: 9742-9747, 2001). Los estudios bioquímicos en lisados libres de células de Drosofila indican que los mediadores del silenciamiento del gen dependiente del ARN son dúplex de ARN "de interferencia pequeña" de 21 a 25 nucleótidos (siANR) . En consecuencia, las moléculas de ARNsi son ventajosamente utilizadas en los métodos de la presente invención. Las ARNsi son derivadas del procesamiento de ARNds con una ARNasa conocida como DICER (Bernstein et al., Nature 409: 363-366, 2001) . Parece que los productos dúplex de ARNsi son reclutados en un complejo de ARNsi multiproteico denominado RISC (complejo de silenciamiento inducido por ARN) . Sin desear estar comprometidos por alguna teoría particular, se cree que un RISC es guiado a un ARNM objetivo, donde el dúplex de ARNsi interactúa específicamente por secuencia para mediar la escisión de una manera catalítica (Bernstein et al, Nature 409: 363-366, 2001; Boutla et al, Curr Biol 71: 1776-1780, 2001). El ARNi ha sido utilizado para analizar la función génica y para identificar los genes esenciales en las células de mamífero (Elbashir et al, Methods 26: 199-213, 2002; Harborth et al, J Cell Sci 114: 4557-4565, 2001), incluyendo a manera de ejemplo no limitante las neuronas (Krichevsky et al, Proc Nati Acad Sci USA 29: 11926-11929, 2002). El ARNi está siendo también evaluado para modalidades terapéuticas, tales como la inhibición o el bloqueo de la infección, la replicación y/o el crecimiento de los virus, incluyendo sin limitación poliovirus (Gitlin et al, Nature 418: 379-380, 2002) HIV (Capodici et al, J Immunol 169: 5196-5201, 2002), y la reducción de la expresión de los oncogenes (por ejemplo, el gen bcr-abl; Scherr et al, Blood 101(4): 1566-9, 2002). El ARNi ha sido utilizado para modular la expresión del gen en embriones de mamífero (ratón) y anfibio {Xenopus) (respectivamente, Calegari et al, Proc Nati Acad Sci USA 99: 14236-14240, 2002; y Zhou, et al, Nucleic Acids Res 30: 1664-1669, 2002), y en ratones postnatales (Lewis et al, Nat Genet 32: 107-108, 2002), y para reducir la expresión del transgen en ratones transgénicos adultos (McCaffrey et al, Nature 418:38-39, 2002). Han sido descritos los métodos para determinar la eficacia y la especificidad de ARNsi en cultivo celular e in vivo (ver, por ejemplo, Bertrand et al., Biochem Biophys Res Commun 296: 1000-1004, 2002; Lassus et al., Sci STKE 2002 (147): PL13, 2002; y Leirdal et al., Biochem Biophys Res Commun 295: 744-748, 2002). Las moléculas que son mediadoras del ARNi, incluyendo sin limitación ARNsi, pueden ser producidas in vitro mediante síntesis química (Hohjoh, FEBS Lett 521: 195-199, 2002), la hidrólisis del ARNds (Yang et al., Proc Nati Acad Sci USA 99: 9942-9947, 2002), mediante transcripción in vitro con la ARN-polimerasa T7 (Donzeet et al., Nucleic Acids Res 30:e46, 2002; Yu et al., Proc Nati Acad Sci USA 99:6047-6052, 2002), y mediante hidrólisis del ARN de doble hebra utilizando una nucleasa tal como la ARNasa II de E. coli (Yang et al., Proc Nati Acad Sci USA 99: 9942-9947, 2002). Las moléculas de ARNsi pueden ser también formadas mediante recocido de dos oligonucleótidos uno al otro, típicamente tienen la siguiente estructura general, que incluye las porciones de una sola hebra y de doble hebra: I—fn—I (porciones sobresalientes) I x j . ("Núcleo") 5'-XXXXXXXXXXXX N]N N-3' (SEQ ID NO:4) 3'-????1??????????????-5' (SEQ ID NO:5) I—H—I (porciones sobresalientes) En donde N, X e Y son nucleótidos ; X enlaza por hidrógeno a Y; ":" significa un enlace de hidrógeno entre dos bases; x es un número entero natural que tiene un valor entre 1 y aproximadamente 100; y m y n son números enteros que tienen, independientemente, valores entre 0 y aproximadamente 100. En algunas modalidades, N, X e Y son independientemente A, G, C y T o U. Las bases de origen no natural y los nucleótidos pueden estar presentes, particularmente en el caso de ARNsi sintético (por ejemplo, el producto de recocido de dos oligonucleótidos ) . La sección central de doble hebra es llamada el "núcleo" y tiene pares de bases (pb) como unidades de medición; las porciones de una sola hebra son sobresalientes, teniendo nucleótidos (nt) como unidades de medición. Las porciones sobresalientes mostradas son porciones sobresalientes 3', pero las moléculas con porciones sobresalientes 5' están también dentro del alcance de la invención. También dentro del alcance de la invención están las moléculas de ARNsi sin porciones sobresalientes (por ejemplo, m = 0 y n = 0), y aquellas que tienen una porción sobresaliente sobre un lado del núcleo pero no sobre el otro (por ejemplo, m = 0 y r¡ > 1, o viceversa) .
Inicialmente, la tecnología de ARNi no pareció ser fácilmente aplicable a sistemas de mamífero. Esto es debido a que, en mamíferos, ARNds activa la cinasa proteica activada por ARNds (PKR) , dando como resultado una cascada apoptótica y muerte celular (Der et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 94: 3279-3283, 1997). Además, se ha sabido por mucho tiempo que ARNds activa la cascada del interferón en células de mamífero, lo cual puede conducir a fisiología celular alterada (Colby et al., Annu. Rev. Microbiol. 25: 333, 1971; Kleinschmidt et al., Annu. Rev. Biochem. 41: 517, 1972; Lampson et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 58L782, 1967; Lomniczi et al., J. Gen. Virol. 8: 55, 1970; y Younger et al., J. Bacteriol. 92: 862, 1966). No obstante, la activación mediada por ARNds de la PKR y las cascadas del interferón, requieren ARNds mayor de aproximadamente 30 pares de bases. En contraste, ARNds menor de 30 pares de bases de longitud ha demostrado que provoca ARNi en células de mamífero (Caplen et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 98: 9742-9747, 2001). De este modo, se espera que los efectos no específicos indeseables, asociados con moléculas de ARNds más largas, puedan ser evitados por la preparación de ARN corto que está sustancialmente libre de ARNdss más largos. Referencias respecto a ARNsi: Bernstein et al., Nature 409: 363-366, 2001» Boutla et al., Curr Biol 11: 1776-1780, 2001; Cullen, Nat Immunol. 3: 597-599, 2002; Caplen et al., Proc Nati Acad Sci USA 98: 9742-9747, 2001; Hamilton et al., Science 286: 950-952, 1999; Nagase et al., DNA Res. 6: 63-70, 1999; Napoli et al., Plant Cell 2: 279-289, 1990; Nicholson et al., Mamm. Genome 13: 67-73, 2002; Parrish et al., Mol Cell 6: 1077-1087, 2000; Romano et al., Mol Microbiol 6: 3343-3353, 1992; Tabara et al., Cell 99: 123-132, 1999; y Tuschl, Chembiochem. 2: 239-245, 2001. Paddison et al. (Genes & Dev. 16: 948-958, 2002) han utilizado moléculas de ARN pequeñas plegadas en horquillas como un medio para efectuar el ARNi . En consecuencia, tales moléculas cortas de ARN de horquilla (ARNsh) son también ventajosamente utilizadas en los métodos de la invención. La longitud del tallo y del bucle de los ARNshs funcionales, varia; las longitudes del tallo pueden estar en el intervalo en cualquier sitio desde aproximadamente 25 hasta aproximadamente 30 nucleótidos, y el tamaño del bucle puede estar en el intervalo de 4 a aproximadamente 24 nucleótidos sin afectar la actividad de silenciamiento . Mientras que no se desea estar comprometido por alguna teoría en particular, se cree que estos ARNshs se asemejan a los productos de ARNds de la ARNasa DICER y, en cualquier caso, tienen la misma capacidad para inhibir la expresión de un gen específico. La tecnología antisentido puede ser utilizada para controlar la expresión del gen a través del ADN o del ARN antisentido, o a través de la formación de triple hélice. Las técnicas antisentido son discutidas, por ejemplo, en Okano, J. Neurochem. 56: 560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Ratón,' FL (1988). La formación de la triple hélice es difundida por ejemplo en Lee et al.. Nucleic Acids Research 6: 3073 (1979); Cooney et al., Science 241:456 (1988); y Dervan et al., Science 251: 1300 (1991). Los métodos están basados en el enlace de un polinucleótido a un ADN o ARN complementario. Por ejemplo, la porción de codificación 5' de un polinucleótido que codifica para Sp35, puede ser utilizada para diseñar un oligonucleótido de ARN antisentido de aproximadamente 10 a 40 pares de bases de longitud. Un oligonucleótido de ARN es diseñado para ser complementario a una región del gen involucrado en la transcripción, con lo cual se previene la transcripción y la producción de la proteina objetivo. El oligonucleótido de ARN antisentido se híbrida al ARNM in vivo, y bloquea la traducción de la molécula de ARNM en el polipéptido objetivo. En una modalidad, los ácidos nucleicos antisentido, específicos para el gen de Sp35, son producidos intracelularmente mediante transcripción a partir de una secuencia exógena. Por ejemplo, un vector o una porción del mismo es transcrito, produciendo un ácido nucleico antisentido (ARN) . Tal vector puede permanecer episomal o volverse cromosómicamente integrado, siempre y cuando éste pueda ser transcrito para producir el ARN antisentido deseado. Tales vectores pueden ser construidos mediante métodos de tecnología de ADN recombinante, estándares en la técnica. Los vectores pueden ser plásmidos, virales u otros conocidos en la técnica, utilizados para la replicación y expresión en células de vertebrados. La expresión de la molécula antisentido puede ser mediante cualquier promotor conocido en la técnica para actuar en vertebrados, preferentemente en células de humano, tales como aquellos descritos en otro sitio en la presente. La complementariedad absoluta de una molécula antisentido, aunque es preferida, no es requerida. Una secuencia complementaria a al menos una porción de un ARN que codifica para Sp35, significa una secuencia que tiene suficiente complementariedad para ser capaz de hibridarse con el ARN, formando un dúplex estable; o la formación de un triples puede ser evaluada. La habilidad para hibridarse dependerá del grado de complementariedad y de la longitud del ácido nucleico antisentido. En general, entre más grande sea el ácido nucleico de hibridación, más malos acoplamientos de bases puede contener y todavía formar un dúplex estable (o triples como pueda ser el caso) . Una persona experta en la técnica puede averiguar un grado tolerable de mal acoplamiento mediante el uso de procedimientos estándares para determinar el punto de fusión del complejo hibridado. Los oligonucleótidos que son complementarios al extremo 5' de un ARN mensajero, por ejemplo la secuencia 5' no traducida hasta e incluyendo el codón de inicio AUG, debe funcionar más eficientemente para inhibir la traducción. No obstante, las secuencias complementarias a las secuencias 3' no traducidas de los ARNMs han mostrado que son efectivas para inhibir la traducción de los ARNMs también. Ver, en general, Wagner, R., Nature 372: 333-335 (1994) . De este modo, los oligonucleótidos complementarios a las regiones de no codificación 5' o 3' no traducidas, podrían ser utilizados en un procedimiento antisentido para inhibir la traducción de Sp35. Los oligonucleótidos complementarios a la región 5' no traducida del ARNM, deben incluir él complemento del codón de inicio AUG. Los oligonucleótidos antisentido complementarios para el ARNM que codifica para las regiones, son inhibidores menos eficientes de la traducción, pero podrían ser utilizados de acuerdo con la invención. Los ácidos nucleicos antisentido deben ser al menos de seis nucleótidos de longitud, y son preferentemente los oligonucleótidos en el intervalo de 6 a aproximadamente 50 nucleótidos de longitud. En aspectos específicos, el oligonucleótido es de al menos 10 nucleótidos, al menos 17 nucleótidos, al menos 25 nucleótidos o al menos 50 nucleótidos.
En otra modalidad más, un oligonucleótido antisentido para el uso en los métodos descritos en la presente, es un oligonucleótido -anomérico. Un oligonucleótido a-anomérico forma híbridos de doble hebra específicos con ARN complementario en los cuales, de manera contraria a la situación usual, las hebras corren paralelas una a la otra (Gautier et al., Nucí. Acids Res. 15: 6625-6641 (1987)). El oligonucleótido es un 2 ' -O-metilribonucleótido (Inoue et al., Nucí. Acids Res. 15: 6131-6148(1987)), o un análogo de ARN-ADN quimérico (Inoue et al., FEBS Lett. 215: 327-330(1987)). Las composiciones polinucleotídicas para el uso en los métodos descritos en la presente incluyen además el ARN catalítico, o una ribozima (ver, por ejemplo, Publicación Internacional del PCT WO 90/11364, publicada el 4 de octubre de 1990; Sarver et al., Science 247: 1222-1225 (1990). El uso de las ribozimas en forma de cabeza de martillo es preferido. Las ribozimas en forma de cabeza de martillo rompen los ARNMs en sitios dictados por las regiones flanqueantes que forman pares de bases complementarias con el ARNM objetivo. El único requerimiento es que el ARNM objetivo tenga la siguiente secuencia de dos bases: 5'-UG-3'. La construcción y la producción de las ribozimas en forma de cabeza de martillo es bien conocida en la técnica y es descrita más completamente en Haseloff y Gerlach, Nature 334: 585-591 (1988). Preferentemente, la ribozima es manipulada por ingeniería genética de modo que el sitio de reconocimiento de escisión está localizado cerca del extremo 5' del ARN objetivo; por ejemplo, para incrementar la eficiencia y reducir al mínimo la acumulación intracelular de transcritos ARNM no funcionales. Como en el procedimiento antisentido, las ribozimas para el uso en los métodos descritos en la présente pueden estar compuestas de oligonucleotidos modificados (por ejemplo para la estabilidad mejorada, la dirección al objetivo, etc.) y pueden ser distribuidos a las células que expresan Sp35 in vivo. Las construcciones de ADN que codifican para la ribozima pueden ser introducidas dentro de la célula de la misma manera que se describió anteriormente para la introducción del ADN de codificación antisentido. Un método preferido de distribución involucra el uso de una construcción de ADN que "codifica" para la ribozima bajo el control de un promotor constitutivo fuerte, tal como, por ejemplo, el promotor pol III o pol II, de modo que las células transfectadas producirán cantidades suficientes de la ribozima para destruir los mensajes de Sp35 endógenos e inhibir la traducción. Ya que las ribozimas, de manera contraria a las moléculas antisentido, son catalíticas, es requerida una menor concentración intracelular para la eficiencia.
Los polinucleótidos para el uso en los métodos descritos en la presente, incluyendo los aptámeros descritos más adelante, pueden ser ADN o ARN o mezclas quiméricas o derivados o versiones modificadas de los mismos, de una sola hebra o de doble hebra. El polinucleótido puede ser modificado en la porción base, la porción azúcar o en la cadena principal de fosfato, por ejemplo, para mejorar la estabilidad de la molécula, la hibridación, etc. El polinucleótido puede incluir otros grupos anexos tales como péptidos (por ejemplo, para dirigirse a los receptores de la célula hospedera in vivo) , o agentes que faciliten el transporte a través de la membrana celular (ver, por ejemplo, Letsinger et al., Proc. Nati Acad. Sci. U.S. A. 86: 6553-6556 (1989); Lemaitre et al., Proc. Nati. Acad. Sci. 84: 648-652 (1987)); Publicación del PCT No. WO88/09810, publicada el 15 de diciembre de 1988) o la barrera sangre-cerebro (ver, por ejemplo, Publicación del PCT No. WO89/10134, publicada el 25 de abril de 1988), agentes de escisión disparados por la hibridación. (Ver, por ejemplo, Krol et al., BioTechniques 6: 958-976 (1988)) o agentes de intercalamiento . (Ver, por ejemplo, Zon, Pharm. Res. 5: 539-549 (1988)) . Para este fin, el polinucleótido puede ser conjugado a otra molécula, por ejemplo, un péptido, agente de reticulación disparada por hibridación, agente de transporte, agente de escisión disparada por hibridación, etc.
Los polinucleótidos , incluyendo los aptámeros, para el uso en los métodos descritos en la presente pueden comprender al menos una porción de base modificada que se selecciona del grupo que incluye, pero no está limitado a, 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-clorouracilo, 5-yodouracilo, hipoxantina, xantina, 4-acetilcitosina, 5- (carboxihidroximetil) uracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5-carboximetilaminometiluracilo, dihidrouracilo, beta-D-galactosilqueosina, inosina, ?-6-isopenteniladenina, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2 , 2-dimetilguanina , 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina , 5-metilcitosina, ?-6-adenina, ' 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, beta-D-manosilqueosina , 5 ' metoxicarboximetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metiltio-N-6-isopenteniladenina, ácido uracil-5-oxiacético (v) , wybutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina , 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, éster metílico . del ácido uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético (v) , 5-metil-2-tiouracilo, 3 ( 3-amino-3-N2-carboxipropil ) uracilo, (acp3)w, y 2 , 6-diaminopurina . Los polinucleótidos, incluyendo los aptámeros, para el uso en los métodos descritos en la presente pueden también comprender al menos una porción de azúcar modificada seleccionada del grupo que incluye, pero no está limitada a, arabinosa, 2-fluoroarabinosa, xilulosa, y hexosa. En otra modalidad más, un polinucleótido, incluyendo un aptámero, para el uso en los métodos descritos en la presente comprende al menos una cadena principal de fosfato modificada seleccionada del grupo que incluye, pero no está limitada a, un fosfotioato, un fosforoditioato, un fosforamidotioato, un fosforamidato, un fosfordiamidato, un metilfosfonato, un fosfotriéster de alquilo, y un formacetal o análogo del mismo. Los polinucleótidos , incluyendo los aptámeros, para el uso en los métodos de la invención pueden ser sintetizados mediante métodos estándares conocidos en la técnica, por ejemplo mediante el uso de un sintetizador automatizado de ADN (tal como los que son comercialmente disponibles de Biosearch, Applied Biosystems, etc.). Como ejemplos, los oligonucleótidos de fosforotioato pueden ser sintetizados mediante el método de Stein et al., Nucí. Acids Res. 16: 3209 (1988), los oligonucleótidos de metilfosfonato pueden ser preparados mediante el uso de soportes poliméricos de vidrio poroso controlado (Sarin et at., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A. 55: 7448-7451 (1988)), etc.
Aptámeros En otra modalidad, el antagonista de Sp35 para el uso en los métodos de la presente invención es un aptámero.
Un aptámero puede ser un nucleótido o un polipéptido que tiene una secuencia única, tiene la propiedad de enlazarse específicamente a un objetivo deseado (por ejemplo, un polipéptido) , y es un ligando específico de un objetivo dado. Los aptámeros nucleotídicos de la invención incluyen ADN de doble hebra y moléculas de ADN de una sola hebra que se enlazan a Sp35. Los ¦ aptámeros de ácido nucleico son seleccionados utilizando métodos conocidos en la materia, por ejemplo, vía la Evolución Sistemática de los Ligandos mediante el proceso de Enriquecimiento Exponencial (SELEX) . SELEX es un método para la evolución in vitro de las moléculas de ácido nucleico con enlace altamente específico a las moléculas objetivo como se describen en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,475,096, 5,580,737, 5,567,588, 5,707,796, 5,763,177, 6,011,577, y 6,699,843, incorporadas por referencia en la presente en su totalidad. Otro método de selección para identificar los aptámeros es descrito en la Patente de los Estados Unidos No. 5,270,163 (también incorporada por referencia en la presente) . El proceso SELEX está basado en la capacidad de los ácidos nucleicos para formar una variedad de estructuras bidimensionales y tridimensionales, así como la versatilidad química disponible dentro de los monómeros nucleotídicos para actuar como ligandos (forman pares de enlace específicos) virtualmente con cualquier compuesto químico, ya sea monomérico o polimérico, incluyendo otras moléculas de ácido nucleico y polipéptidos. Las moléculas de cualquier tamaño o composición pueden servir como objetivos. El método SELEX involucra la selección de una mezcla de oligonucleótidos candidatos e iteraciones graduales de enlace, división y amplificación, utilizando el mismo esquema general de selección, para lograr la afinidad de enlace y la selectividad deseada. Comenzando a partir de una mezcla de ácidos nucleicos, que comprende preferentemente un segmento de la secuencia aleatorizada, el método SELEX incluye los pasos de poner en contacto la mezcla con el objetivo bajo condiciones favorables para el enlace; la división de los ácidos nucleicos no enlazados a partir de aquellos ácidos nucleicos que se han enlazado específicamente a las moléculas objetivo; la disociación de los complejos ácido nucleico-obj etivo; la amplificación de los ácidos nucleicos disociados de los complejos de ácido nucleico-objetivo, para producir una mezcla enriquecida en el ligando, de los ácidos nucleicos. Los pasos de enlace, división, disociación y amplificación son repetidos a través de tantos ciclos como se desee para producir ligandos de ácido nucleico de alta afinidad, altamente específicos, para la molécula obj etivo . Pueden ser utilizados aptámeros nucleotídicos , por ejemplo, como herramientas de diagnóstico o como inhibidores específicos para disectar las vías de señalización y de transporte intracelulares (James (2001) Curr. Opin. Pharmacol. 1: 540-546). La alta afinidad y especificidad de los aptámeros nucleotídicos los hacen buenos candidatos para el descubrimiento de fármacos. , Por ejemplo, los antagonistas de aptámero para la toxina ricina han sido aislados y tienen valores IC50 en el intervalo nanomolár (Hesselberth JR et al. (2000) J Biol Chem 275: 4937-4942). Los aptámeros nucleotídicos pueden ser también utilizados para la enfermedad infecciosa, malignidad y proteínas de la superficie viral para reducir la infectividad celular. Los aptámeros nucleotídicos para el uso en los métodos de la presente invención pueden ser modificados (por ejemplo, mediante modificación de la cadena principal o bases o conjugados a péptidos) como se describe en la presente para otros polinucleótidos . Utilizando la estructura proteica de Sp35, la selección para los aptámeros que actúan sobre Sp35 utilizando el proceso SELEX podría permitir la identificación de los aptámeros que inhiben los procesos mediados por Sp35 (por ejemplo, la inhibición de la regeneración axonal mediada por Sp35) . Los aptámeros polipeptídicos para el uso en los métodos de la presente invención son péptidos aleatorios seleccionados por su habilidad para enlazarse a y con esto bloquear la acción de Sp35. Los aptámeros polipeptídicos pueden incluir un dominio peptidico variable corto enlazado en ambos extremos a un andamiaje proteico. Este doble constreñimiento estructural incrementa en gran medida la afinidad de enlace de aptámero peptidico, a niveles comparables a los de un anticuerpo (intervalo nanomolar) . Ver, por ejemplo, Hoppe-Seyler F et al. (2000) J Mol Med 78 (8)·: 426-430. La longitud del péptido variable corto es típicamente de aproximadamente 10 a 20 aminoácidos, y el andamiaje puede ser cualquier proteína que tenga buena solubilidad y propiedades de compactación . Un ejemplo no limitante de una proteína de andamiaje es la proteína bacteriana tiorredoxina-A . Ver, por ejemplo, Cohén BA et al. (1998) PNAS 95 (24): 14272-14277. Un ejemplo no limitante adicional de un ptámero polipeptídico para el uso en los métodos de la presente invención es un Aptámero Peptidico Regulado por Ligando (LiRPA) . El andamiaje de LiRPA puede estar compuesto de tres dominios proteicos: la proteína de enlace a FK506 (FKBP) , el dominio de enlace FRBP-Rapamicina (FRB9 y glutatione-S-transferasa (GST) . Ver, por ejemplo, Binkowski BF et al., (2005) Chem & Biol 12 (7): 847-855, incorporada por referencia en la presente. Los aptámeros polipeptídicos son péptidos o polipéptidos pequeños que actúan como inhibidores dominantes de la función proteica. Los aptámeros peptídicos se enlazan específicamente a las proteínas objetivo, bloqueando su habilidad funcional (Kolonin et al. (1998) Proc. Nati. Acad. Sci. 95: 14,266-14,271). Los aptámeros peptídicos que se enlazan con alta afinidad y especificidad a ' una proteína objetivo pueden ser aislados sobre una variedad de técnicas conocidas en la materia. Los aptámeros peptídicos pueden ser aislados de bibliotecas peptídicas aleatorias mediante selecciones de dos híbridos en levadura (Xu, C.W., et al. (1997) Proc. Nati. Acad. Sci. 94: 12, 473-12,478) o mediante visualización de ribozomas (Hanes et al. (1997) Proc. Nati. Acad. Sci. 94: 4937-4942). Éstos pueden ser también aislados de bibliotecas de fago (Hoogenboom, H.R., et al. (1998) Immunotechnology 4: 1-20) o bibliotecas de péptidos generadas químicamente. Aunque los medios difíciles mediante los cuales son sintetizados los aptámeros peptídicos hace su uso más complejo que los aptámeros polinucleotídicos , éstos tienen diversidad química ilimitada. Los aptámeros peptídicos para el uso en los métodos de la presente invención pueden ser modificados (por ejemplo, conjugados a polímeros o fusionados a proteína) como se describe para los otros polipéptidos en otro sitio en la presente.
Vectores Los vectores que comprenden los ácidos nucleicos que codifican para los antagonistas de Sp35 pueden ser también utilizados para producir antagonistas para el uso en los métodos de la invención. La elección del vector y las secuencias de control de la expresión a las cuales son operablemente enlazados tales ácidos nucleicos, depende de las propiedades funcionales deseadas, por ejemplo, la expresión de la proteina, y la célula hospedera que va a ser transformada . Los elementos de control de expresión útiles para la regulación de la expresión de una secuencia de codificación operablemente enlazada, son conocidos en la técnica. Los ejemplos incluyen, pero no están limitados a, promotores inducibles, promotores constitutivos, señales de secreción, y otros elementos reguladores. Cuando se utiliza un promotor inducible, éste puede ser controlado, por ejemplo, mediante un cambio en el estado de los nutrientes, o un cambio en la temperatura, en el medio celular del hospedero . El vector puede incluir un replicón procariótico, por ejemplo, una secuencia de ADN que tiene la habilidad para dirigir la replicación autónoma y el mantenimiento de la molécula de ADN recombinante extra-cromosómica en una célula hospedera bacteriana. Tales replicones son bien conocidos en la técnica. Además, los vectores que incluyen un replicón procariótico, pueden también incluir un gen cuya expresión confiere un marcador detectable tal como una resistencia a fármacos. Los ejemplos de genes bacterianos de resistencia a fármacos son aquellos que confieren resistencia a la ampicilina y a la tetracicliná. Los vectores que incluyen un replicón procariótico pueden también incluir un promotor procariótico · o bacteriófago para dirigir la expresión de las secuencias génicas de codificación en una célula hospedera bacteriana. Las secuencias promotoras compatibles con los hospederos bacterianos son típicamente proporcionadas en vectores plásmidos que contienen sitios de restricción convenientes para la inserción de un segmento de ADN que va a ser expresado. Los ejemplos de tales vectores plásmidos son pUC8, pUC9, pBR322 y pBR329 (BioRad) , pPL y pKK223 (Pharmacia) . Cualquier hospedero procariótico adecuado puede ser utilizado para expresar una molécula de ADN recombinante que codifica para una proteína utilizada en los métodos de la invención . Para los propósitos de esta invención, pueden ser empleados numerosos sistemas vectores de expresión. Por ejemplo, una clase de vector utiliza elementos de ADN que son derivados de virus animales tales como el virus del papiloma bovino, virus del polioma, adenovirus, virus de la vaccinia, baculovirus, retrovirus (RSV, MMTV o MOMLV) o el virus SV40. Otros involucran el uso de sistemas policistrónicos con sitios internos de enlace al ribosoma. Además, las células que han integrado el ADN dentro de sus cromosomas pueden ser seleccionadas mediante la introducción de uno o más marcadores que permiten la selección de las células hospederas transíectadas . El marcador puede proporcionar la prototrofia a un hospedero autotrófico, resistencia a biocidas (por ejemplo, antibióticos) o resistencia a metales pesados tales como cobre. Un gen marcador seleccionable puede ser ya sea directamente enlazado a las secuencias de ADN que van a ser expresadas, o introducido dentro de la misma célula mediante cotransformación . El gen de la neomicina-fosfotransferasa (neo) es ejemplo de un gen marcador seleccionable (Southern et at, J. Mol. Anal. Genet. 1: 327-341 (1982)). Los elementos adicionales pueden ser también necesarios para la síntesis óptima del ARNM. Estos elementos pueden incluir secuencias de señal o señales de empalme, así como promotores transcripcionales , aumentadores y señales de terminación. En una modalidad, un vector de expresión de propietario de Biogen IDEC, Inc., denominado como NEOSPLA (Patente de los Estados Unidos No. 6,159,730) puede ser utilizado. Este vector contiene el promotor/aumentador del citomegalovirus , el promotor mayor de la beta-globina de ratón, el origen SV40 de replicación, la secuencia de poliadenilación de la hormona bovina del crecimiento, el exon 1 y el exon 2 de la neomicina-fosfotransferasa, el gen de la dihidrofolato-reductasa y la secuencia guia. Se ha encontrado que este vector da como resultado expresión de muy alto nivel después de la transfeccion dentro de células CHO, seguido por la selección en el medio que contiene G418 y la amplificación con metotrexato. Por supuesto, cualquier vector de expresión que sea capaz de promover la expresión en células eucarióticas puede ser utilizado en la presente invención. Los ejemplos de vectores adecuados incluyen, pero no están limitados a, los plásmidos pcDNA3, pHCMV/Zeo, pCR3.1, pEFl/His, pIND/GS, pRc/HCMV2; pSV40/Zeo2, pTRACER-HCMV, pUB6/V5-His, pVAXl, y pZeoSV2 (disponible de Invitrogen, San Diego, CA) , y el plásmido pCI (disponible de Promega, Madison, . WI) . Los vectores de expresión celular eucarióticos , adicionales son conocidos en la técnica y son comercialmente disponibles. Típicamente, tales vectores contienen los sitios de restricción convenientes para la inserción del segmento de ADN deseado. Los vectores ejemplares incluyen pSVL y pKSV-10 (Pharmacia) , pBPV-1, pml2d pBPV-1, pml2d (International Biotechnologies ) , pTDTl (ATCC 31255), el vector de expresión retroviral pMIG. y pLL3.7, el vector lanzadera del adenovirus pDC315, y los vectores AAV. Otros sistemas vectores ejemplares son descritos por ejemplo en la Patente de los Estados Unidos No. 6,413,777. En general, grandes números de selección de células transformadas para aquellos que expresan niveles adecuadamente altos del antagonista, es experimentación rutinaria que puede ser llevada a cabo, por ejemplo, por sistemas robóticos. Las secuencias reguladoras frecuentemente utilizadas para la expresión en células hospederas de mamífero incluyen elementos virales que dirigen los altos niveles de la expresión de proteína en células de mamífero, tales como los promotores y aumentadores derivados de los LTRs retrovirales, citomegalovirus (CMV) (tales como el promotor/aumentador de CMV), el virus 40 de simio (SV40) (tal como el promotor/aumentador del SV40), adenovirus (por ejemplo, el promotor tardío mayor del adenovirus (AdmIP) ) , promotores de polioma y mamíferos fuertes tales como los promotores de inmunoglobulina y actina nativos. Para la descripción adicional de los elementos reguladores virales, y las secuencias de los mismos, ver, por ejemplo, Stinski, Patente de los Estados Unidos No. 5,168,062; Bell, Patente de los. Estados Unidos No. 4,510,245; y Schaffher, Patente de los Estados Unidos No. 4,968,615. Los vectores de expresión recombinantes pueden llevar secuencias que regulan la replicación del vector en las células hospederas (por ejemplo, los orígenes de replicación) y los genes marcadores seleccionables . El gen marcador seleccionable facilita la selección de las células hospederas dentro de las cuales ha sido introducido el vector (ver, por ejemplo, Axel, U.S. Pat. Nos. 4,399,216; 4,634,665 y. 5,179,017). Por ejemplo, típicamente el gen marcador selecciónatele confiere resistencia a un fármaco, tal como G418, higromicina o metotrexato, en una célula hospedera dentro de la cual ha sido introducido el vector. Los genes marcadores seleccionables frecuentemente utilizados, incluyen el gen de la dihidrofolato-reductasa (DHFR) (para el uso en las células hospederas dhfr con selección/amplificación con metotrexato) y el gen neo (para la selección del G418). Los vectores que codifican para los antagonistas de Sp35 pueden ser utilizados para la transformación de una célula hospedera adecuada. La transformación puede ser mediante cualquier método adecuado. Los métodos para la introducción del ADN exógeno dentro de las células de mamífero son bien conocidos en la técnica e incluyen la transfección mediada por dextrano, precipitación con fosfato de calcio, transfección mediada con polibreno, fusión de protoplastos, electroporación, transfección vía el encapsulamiento del o de los polinucleótidos en liposomas, y la microinyección directa del ADN dentro de los núcleos. Además, las moléculas de ácido nucleico pueden ser introducidas dentro de las células de mamífero por vectores virales. Las células de mamífero pueden ser también transducidas por virus recombinantes que contienen el ADN exógeno el cual va a ser introducido dentro de las células de mamífero . La transformación de las células hospederas puede ser lograda por métodos convencionales, adecuados para el vector y la célula hospedera empleada. Para la transformación de las células hospederas procarióticas, pueden ser empleados métodos de electroporación y de tratamiento con sal (Cohén et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 69: 2110-14 (1972)). Para la transformación de las células de vertebrados, pueden ser empleados los métodos de electroporación, o de tratamiento con lípidos o sales catiónicas. Ver, por ejemplo, Graham et al., Virology 52: 456-467 (1973); Wigler et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 76: 1373-76 (1979). La línea celular hospedera utilizada para la expresión de las proteínas es más preferentemente de origen mamífero; aquellos expertos en la materia están acreditados con la habilidad para determinar preferentemente las líneas celulares hospederas particulares que son las mejores adecuadas para el producto génico deseado que va a ser expresado en éstas. Las líneas celulares hospederas esenciales incluyen, pero no están limitadas a, las células NSO, SP2, células de riñon de hámster bebe (BHK) , células de riñon de mono (COS), células de carcinoma hepatocelular humano (por ejemplo, Hep G2), células A549, DG44 y DUXB11 (lineas de Ovario de Hámster Chino, DHFR menos), células HELA (carcinoma cervical humano) , células CVI (linea de riñon de mono) , células COS (un derivado de CVI con el antigeno T del SV40), R1610 (fibroblasto de hámster Chino), BALBC/3T3 (fibroblasto de ratón), HAK (linea de riñon de hámster), SP2/0 (mieloma de ratón, P3x63-Ag3.653 (mieloma de ratón), BFA-lcBPT (células endoteliales bovinas) , RAJI (linfocitos humanos) y 293 (riñon humano) . Las lineas celulares hospederas son típicamente disponibles de servicios comerciales, de la American Tissue Culture Collection o de la literatura publicada. La expresión de los polipéptidos a partir de líneas celulares de producción, puede ser mejorada utilizando técnicas conocidas. Por ejemplo, el sistema de glutamina-sintetasa (GS) es comúnmente utilizado para mejorar la expresión bajo ciertas condiciones. Ver, por ejemplo, las Patentes Europeas Nos. 0,216,846, 0,256,055, y 0,323,997 y la Solicitud de Patente Europea No. 89303964.4.
Células Hospederas Las células hospederas para la expresión de un antagonista de Sp35 para el uso en un método de la invención, pueden ser procarióticas o eucarióticas . Las células hospederas eucarióticas ejemplares incluyen, pero no están limitadas a, células de levadura y de mamífero, por ejemplo, las células de ovario de hámster Chino (CHO) (ATCC No. de Acceso CCL61) , las células embrionarias de ratón Suizo NIH, NIH-3T3 (ATCC No. de Acceso CRL1658), y células de riñon de hámster bebe (BHK) . Otras células hospederas eucarióticas útiles incluyen células de insecto y células vegetales. Las células hospederas procarióticas ejemplares son E. coli y Streptomyces .
Terapia Génica Un antagonista de Sp35 puede ser producido in vivo en un mamífero, por ejemplo, un paciente humano, utilizando un procedimiento de terapia génica para el tratamiento de una enfermedad, trastorno o daño asociado con la degeneración, muerte o falta de regeneración de las neuronas DA. Éste involucra la administración de un ácido nucleico que codifica para el antagonista de Sp35, adecuado, operablemente enlazado a las secuencias adecuadas del control de expresión. En general, estas secuencias son incorporadas dentro de un vector viral. Los vectores virales adecuados para tal terapia génica incluyen un vector adenoviral, un vector de alfavirus, un vector de enterovirus, un vector de pestivirus, un vector lentiviral, un vector baculoviral, un vector de herpesvirus, un vector viral de Epstein Barr, un vector papovaviral, un vector de poxvirus, un vector viral de la vaccina, un vector viral adeno-asociado y un vector viral del herpes simple. El vector viral puede ser un vector viral defectuoso en replicación. Los vectores adenovirales que tienen una supresión en su gen El o los genes E3, son típicamente utilizados. Cuando un vector adenoviral es utilizado, el vector usualmente no tiene un gen marcador seleccionable .
Composiciones Farmacéuticas Los antagonistas de Sp35 utilizados en los métodos de la invención pueden ser formulados en composiciones farmacéuticas para la administración a mamíferos, incluyendo humanos. Las composiciones farmacéuticas utilizadas en los métodos de esta invención comprenden portadores farmacéuticamente aceptables, incluyendo, por ejemplo, intercambiadores de iones, alúmina, estearato de aluminio, lecitina, proteínas séricas, tales como albúmina sérica humana, sustancias amortiguadoras tales como fosfatos, glicina, ácido sórbico, sorbato de potasio, mezclas de glicéridos parciales de ácidos grasos vegetales saturados, agua, sales o electrolitos, tales como sulfato de protamina, fosfato ácido disódico, fosfato ácido de potasio, cloruro de sodio, sales de zinc, sílice coloidal, trisilicato de magnesio, polivinilpirrolidona, sustancias basadas en celulosa, polietilenglicol , carboximetilcelulosa de sodio, , poliacrilatos , ceras, polímeros en bloque de polietileno-polioxipropileno, polietilenglicol y grasa de lana. Las composiciones utilizadas en los métodos de la presente invención pueden ser administradas mediante cualquier método adecuado, por ejemplo, parenteralmente, intraventricularmente, oralmente, mediante roció de inhalación, tópicamente, rectalmente, nasalmente, bucalmente, vaginalmente o por medio de un depósito implantado. El término "parenteral" como se utiliza en la presente incluye las técnicas de inyección o infusión subcutánea, intravenosa, intramuscular, intra-articular , intra-sinovial , intrasternal , intratecal, intrahepática , intralesional e intracraneal. Como se describió previamente, los antagonistas de Sp35 utilizados en los métodos de la invención actúan en el sistema nervioso para promover la supervivencia, la regeneración y la diferenciación de los oligodendrocitos y la mielinización de las neuronas. En consecuencia, en los métodos de la invención, los antagonistas de Sp35 son administrados de una manera tal que éstos cruzan la barrera sangre-cerebro. Este cruce puede resultar de las propiedades fisico-quimicas inherentes en la molécula antagonista de Sp35 misma, a partir de otros componentes en una formulación farmacéutica, o a partir del uso de un dispositivo mecánico tal como una aguja, cánula o tratamientos quirúrgicos para romper la barrera sangre-cerebro. Donde el antagonista de Sp35 es una molécula que no cruza inherentemente la barrera sangre-cerebro, por ejemplo, una fusión a una porción que facilita el cruce, las rutas adecuadas de administración son, por ejemplo, intratecal o intracraneal, por ejemplo, directamente dentro de una lesión crónica de S . Donde el antagonista de Sp35 es una molécula que cruza inherentemente la barrera sangre-cerebro, la ruta de administración puede ser cualquiera de una o más de las diversas rutas descritas más adelante. Las formas inyectables estériles de las composiciones utilizadas en los métodos de esta invención pueden ser suspensión acuosa u oleaginosa. Estas suspensiones pueden ser formuladas de acuerdo a técnicas conocidas en la materia, utilizando agentes dispersantes o humectantes adecuados y agentes suspensores. La preparación estéril inyectable puede ser también una solución o suspensión estéril inyectable, en un diluyente o solvente no tóxico, parenteralmente aceptable, por ejemplo como una suspensión en 1 , 3-butanodiol . Entre los vehículos aceptables y los solventes que pueden ser empleados están el agua, la solución de Ringer y la solución isotónica de cloruro de sodio. Además, los aceites fijos estériles son convencionalmente empleados como un solvente o medio suspensor. Para este propósito, cualquier aceite fijo blando puede ser empleado, incluyendo mono- y di-glicéridos sintéticos. Los ácidos grasos, tales como ácido oleico y sus derivados glicéridos son útiles en la preparación de inyectables, como lo son los aceites farmacéuticamente aceptables naturales, tales como el aceite de oliva, o aceite de ricino, especialmente en sus versiones polioxietiladas . Estas soluciones o suspensiones aceitosas pueden también contener un diluyente o dispersante de alcohol de cadena larga, tal como carboximetilcelulosa o agentes dispersantes similares que son comúnmente utilizados en la formulación de formas de dosis farmacéuticamente aceptables incluyendo emulsiones y suspensiones. Otros surfactantes comúnmente utilizados, tales como los Tweens, Spans y otros agentes emulsificantes o aumentadores de la biodisponibilidad, que son comúnmente utilizados en la fabricación del sólido, liquido u otras formas de dosis farmacéuticamente aceptables, pueden ser también utilizados para los fines de formulación. Las formulaciones parenterales pueden ser las dosis de bolo simple, una infusión o una dosis de bolo de carga seguida por una dosis de mantenimiento. Estas composiciones pueden ser administradas a intervalos fijos o variables específicos, por ejemplo, una vez al día, o en una base "como sea necesario". Ciertas composiciones farmacéuticas utilizadas en los métodos de esta invención pueden ser administradas oralmente en una forma de dosis aceptable incluyendo, por ejemplo, cápsulas, tabletas, suspensiones o soluciones acuosas. Ciertas composiciones farmacéuticas también pueden ser administradas mediante inhalación o aerosol nasal. Tales composiciones pueden ser preparadas en soluciones salinas, empleando alcohol bencílico u otros conservadores adecuados, promotores de la absorción para aumentar la biodisponibilidad, y/o otros agentes solublizantes o dispersantes convencionales. La cantidad de un antagonista de Sp35 que puede ser combinado con los materiales portadores para producir una forma de dosis simple, variará dependiendo del hospedero tratado, del tipo de antagonista utilizado y del modo particular de administración. La composición puede ser administrada como una dosis simple, dosis múltiples o en un periodo de tiempo establecido en una infusión. Los regímenes de dosificación pueden ser también ajustados para proporcionar la respuesta óptima deseada (por ejemplo, una respuesta terapéutica o profiláctica) . Los métodos de la invención utilizan una "cantidad terapéuticamente efectiva" o una "cantidad profilácticamente efectiva", de un antagonista de Sp35. Tal cantidad terapéutica o profilácticamente efectiva puede variar de acuerdo a los factores tales como el estado de enfermedad, la edad, el sexo y el peso del individuo. Una cantidad terapéuticamente o profilácticamente efectiva es también una en la que cualesquier efectos tóxicos o dañinos son superados 17 por los efectos terapéuticamente benéficos. Un régimen de dosificación y tratamiento especifico para cualquier paciente particular dependerá de una variedad de factores, incluyendo el antagonista de Sp35 particular utilizado, la edad del paciente, el peso corporal, la salud general, el sexo y la dieta, y el tiempo de administración, la velocidad de expresión, la combinación del fármaco y la severidad de la enfermedad particular que se trate. El juicio de tales factores por los administradores de cuidados médicos está dentro de la experiencia ordinaria en la técnica. La cantidad dependerá también del paciente individual que va a ser tratado, de la ruta de administración, el tipo de formulación, las características del compuesto utilizado, la severidad de la enfermedad, y el efecto deseado. La cantidad utilizada puede ser determinada por principios farmacológicos y farmacocinéticos bien conocidos en la materia. En los métodos de la invención, los antagonistas de Sp35 son en general administrados directamente al sistema nervioso, intracerebroventricularmente, o intratecalmente , por ejemplo en una lesión crónica de MS . Las composiciones para la administración de acuerdo a los métodos de la invención pueden ser formuladas de modo que una dosis de 0.001-10 mg/kg de peso corporal por día del polipéptido antagonista de Sp35, pueden ser administradas. En algunas modalidades de la invención, la dosis es 0-01-1.0 mg/kg de peso corporal por día. En algunas modalidades, la dosis es 0.001-0.5 mg/kg de peso corporal por día. Para el tratamiento con un anticuerpo para el antagonista de Sp35, la dosis puede estar en el intervalo, de aproximadamente 0.0001 a 100 mg/kg, y más usualmente de 0.01 a 5 mg/kg (por ejemplo, 0.02 mg/kg, 0.25 mg/kg, 0.5, mg/kg, 0.75 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, etc.), del peso corporal del hospedero. Por ejemplo, las dosis pueden ser de 1 mg/kg de peso corporal o de 10 mg/kg de peso corporal o dentro del intervalo de 1 a 10 mg/kg, preferentemente de al menos 1 mg/kg. Dosis intermedias en los intervalos anteriores están también destinadas a estar dentro del alcance de la invención. Los sujetos ¦ pueden ser administrados con tales dosis diariamente, en días alternados, semanalmente o de acuerdo a cualquier otro esquema determinado por análisis empírico. Un tratamiento ejemplar involucra la administración en dosis múltiples en un periodo prolongado, por ejemplo de al menos seis meses'. Los regímenes de tratamiento ejemplares adicionales involucran la administración una vez cada dos semanas o una vez al mes, o una vez cada 3 a 6 meses. Los esquemas de dosificación ejemplares incluyen 1 a 10 mg/kg o 15 mg/kg en días consecutivos, 30 mg/kg en días alternados o 60 mg/kg semanalmente. En algunos métodos, dos o más anticuerpos monoclonales con diferentes especificidades de enlace son administrados simultáneamente, en cuyo caso la dosis de cada anticuerpo administrado cae dentro de los intervalos indicados . En ciertas modalidades, un sujeto puede ser tratado con una molécula de ácido nucleico que codifica para un polinucleótido del antagonista de Sp35. Las dosis para los ácidos nucleicos están en el intervalo de aproximadamente 10 ng hasta 1 g, 100 ng hasta 100 mg, 1 µg hasta 10 mg, 30 a 300 iq de ADN por paciente. Las dosis para los vectores virales infecciosos varían de 10 a 100, o más, viriones por dosis. Los compuestos activos suplementarios pueden ser también incorporados en las composiciones utilizadas en los métodos de la invención. Por ejemplo, un polipéptido de Sp35 soluble o una proteína de fusión puede ser coformulado con y/o administrado con uno o más agentes terapéuticos adicionales . La invención abarca cualquier método de distribución adecuado para un antagonista de Sp35 a un tejido objetivo seleccionado, incluyendo inyección de bolo de una solución acuosa o implante de un sistema de liberación controlada. El uso de un implante de liberación controlada reduce la necesidad para inyecciones repetidas. Los antagonistas de Sp35 utilizados en los métodos de la invención pueden ser directamente infundidos dentro del cerebro. Diversos implantes para la infusión cerebral directa de los compuestos son conocidos y son efectivos en la distribución de los compuestos terapéuticos a pacientes humanos que sufren de trastornos neurológicos . Éstos incluyen la infusión crónica dentro del cerebro utilizando una bomba, catéteres intersticiales temporales, estereotácticamente implantados, implantes de catéter intracraneal permanentes, e implantes biodegradables quirúrgicamente implantados. Ver por ejemplo, Gilí et al., supra; Scharfen et al., "High Activity Iodine-125 Interstitial Implant For Gliomas," Int. J. Radiation Oncology Biol. Phis. 24(4) : 583-591 (1992); Gaspar et al., "Permanent 1251 Implants for Recurrent Malignant Gliomas," Int. J. Radiation Oncology Biol. Phis. 45(5) : 977-982 (1999); Capitulo 66, páginas 577-580, Bellezza et al., "Stereotactic Interstitial Brachitherapy, " in Gilderiberg et al., Textbook of Stereotactic and Functional Neurosurgery, McGraw-Hill (1998); y Brem et al., "The Safety of Interstitial Chemotherapy ith BCNU-Loaded Polymer Followed by Radiation Therapy in the Treatment of Newly Diagnosed Malignant Gliomas: Phase I Trial," J, Neuro-Oncology 26: 111-23 (1995) . Las composiciones pueden también comprender un antagonista de Sp35 disperso en un material portador biocompatible que funciona como un sistema de distribución o de soporte adecuado para los compuestos. Los ejemplos adecuados de portadores de liberación sostenida incluyen matrices poliméricas semipermeables en la forma de artículos conformados tales como supositorios o cápsulas. Las matrices de liberación sostenida implantables o microcapsulares incluyen poliláctidos (Patente de los Estados Unidos No. 3,773,319; EP 58,481), copolímeros de ácido L-glutámico y gamma-etil-L-glutamato (Sidman et al., Biopolymers 22: 547-56 (1985)); poly ( 2-hidroxietil-methacrylate ) , acetato de etilenvinilo (Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 75: 167-277 (1981); Langer, Chem. Tech. 12: 98-105 (1982)) o ácido poli-D- (-) -3-hidroxibutírico (Patente Europea EP-133,988). En algunas modalidades de la invención, un antagonista de Sp35 es administrado a un paciente mediante infusión directa dentro de una región apropiada del cerebro. Ver por ejemplo, Gilí et al., "Direct brain infusión of glial cell line-derived neurotrophic factor in Parkinson disease," Nature ed. 9: 589-95 (2003). Las técnicas alternativas son disponibles y pueden ser aplicadas para administrar un antagonista de Sp35 de acuerdo a la invención. Por ejemplo, la colocación estereotáctica de un catéter o implante puede ser lograda utilizando la unidad de Riechert-Mundinger y la unidad de localización para propósitos múltiples ZD (Zamorano-Dujovny) . Una tomografía computarizada mejorada en contraste (CT) , inyectando 120 mi de omnipaque, 350 mg de yodo/ml, con rebanadas de espesor de 2 mm pueden permitir la planeación del tratamiento multiplanar tridimensional STP, Fischer, Freiburg, Alemania) . Este kit permite la planeación con base en los estudios de formación de imagen de resonancia magnética, la fusión de la información objetivo de CT y MRI para la confirmación objetivo clara. El sistema estereotáctico Leksell (Downs Surgical, Inc., Decatur, GA) modificado para el uso con un explorador de GE CT (General Electric Company, ilwaukee, WT) asi como el sistema estereotáctico Brown-Roberts-Wells (BRW) (Radionics, Burlington, MA) pueden ser utilizados para este propósito. De este modo, en la mañana del implante, el anillo de base anular de la estructura estereotáctica BRW puede ser acoplada al cráneo del paciente. Pueden ser obtenidas secciones de CT en Serie a intervalo de 3 mm a través de la región (tejido objetivo) con una estructura localizadora de varilla de grafito sujetada a la placa base. Un programa de planeación de tratamiento computarizado puede ser corrido sobre una computadora VAX 11/780 (Digital Equipment Corporation, Maynard, Mass.) utilizando las coordenadas de CT de imágenes de la varilla de grafito para mapear entre el espacio CT y el espacio BRW. Los métodos de tratamiento de los trastornos como se describen en la presente son típicamente probados in vitro, y luego in vivo en un modelo animal aceptable, para la actividad terapéutica o profiláctica deseada, antes del uso en 'humanos. Los modelos animales adecuados, incluyendo animales transgénicos , serán conocidos por aquellos de experiencia ordinaria en la técnica. Por ejemplo, los ensayos in vitro para demostrar la diferenciación y el efecto de supervivencia de los antagonistas de Sp35, se describen en la presente. El efecto de los antagonistas de Sp35 sobre la mielinización de los axones puede ser probado in vitro como se describe en los Ejemplos. Finalmente, las pruebas in vivo pueden ser realizadas mediante la creación de ratones transgénicos que expresan el antagonista de Sp35, o mediante la administración del antagonista de Sp35 a ratones o ratas en modelos como se describe en la presente. La práctica de la presente invención empleará, a no ser que se indique de otro modo, técnicas convencionales de biología celular, cultivo de células, biología molecular, biología transgénica, microbiología, ADN recombinante , e inmunología, que están dentro de la experiencia de la técnica. Tales técnicas son explicadas completamente en la literatura. Ver, por ejemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3-Volume Set) , J. Sambrook, D. W. Russell, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001); Genes VIII, B. Lewin, Prentice Hall (2003); PCR Primer, CW. Dieffenbach y G.S. Dveksler, CSHL Press (2003); DNA Cloning, D. N. Glover ed., Volúmenes I y II (1985); Oligonucleotide Synthesis: Methods and Applications (Methods in Molecular Biology) , P.
Herde ijn (Ed.), Humana Press (2004); Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 4a edición, R. I. Freshney, Wiley-Liss (2000) ; Oligonucleotide Synthesis, M. J. Gait (Ed.), (1984); Mullís et al. Patente de los Estados Unidos No. 4,683,195; Nucleic Acid Hibridization, B. D. Hames & S. J. Higgins eds . (1984); Nucleic Acid Hibridization, M. L. M. Anderson, Springer (1999); Animal Cell Culture and Technology, 2a edición, M. Butler, BIOS Scientific Publishers (2004); Immobilized Cells and Enzymes: A Practical Approach (Practical Approach Series), J. Woodward, M Pr (1992); Transcription And Translation, B. D. Hames & S. J. Higgins (Eds.) (1984); Culture Of Animal Cells, R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., (1987); Immobilized, Cells And Enzymes, IRL Press, (1986) ; A Practical Guide To Molecular Cloning, 3a edición, B. Perbal, John Wiley & Sons Inc. (1988); the treatise, Methods Li Enzymology, Academic Press, Inc., N.Y.; Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells, J. H. Miller y M. P. Calos eds., Cold Spring Harbor Laboratory (1987); Methods In Enzymology, Vols. 154 y 155, Wu et al. (Eds.); Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology, Mayer y Walker, (Eds.), Academic Press, London (1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volúmenes I-IV, D. M. Weir y C. C. Blackwell (Eds.), (1986); Immunology Methods Manual: The Comprehensive Sourcebook of Techniques (4 Volume Set) , la edición, I. Lefkovits, Academic Press (1997); Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, 3a edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2002); y en Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989) . Los principios generales de manipulación por ingeniería de los anticuerpos se describen en Antibody Engineering: Methods and Protocols (Métodos en Biología Molecular), B.L. Lo (Ed.), Humana Press (2003); Antibody engineering, R. Kontermann y S. Dubel (Eds.), Springer Verlag (2001); Antibody Engineering, 2a edición, C.A.K. Borrebaeck (Ed. ) , Oxford Univ. Press (1995). Los principios generales de manipulación por ingeniería de las proteínas se describen en Protein Engineering, A Practical Approach, Rickwood, D. , et al. (Eds.), IRL Press at Oxford Univ. Press, Oxford, Eng. (1995). Los principios generales de los anticuerpos y el enlace del anticuerpo-hapteno se describen en: Antibodies: A Laboratory Manual, E. Harlow y D. Lañe, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988); Nisonoff, A., Molecular Immunology, 2a edición, Sinauer Associates, Sunderland, MA (1984); y Steward, M.W., Antibodies, Their Structure and Function, Chapman and Hall, New York, NY (1984). Además, los métodos estándares en inmunología conocidos en la técnica y no específicamente descritos son en general seguidos como en Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, New York; Stites et al. (Eds.), Immunochemical Protocols (Methods in Molecular Biology) , 2a edición, J. D. Pound (Ed.), Humana Press (1998), Weir's Handbook of Experimental Immunology, 5a edición, D. M . Weir (Ed. ) , Blackwell Publishers (1996), Methods in Cellular Immunology, 2a edición, R. Fernandez-Botran, CRC Press (2001); Basic y Clinical Immunology, 8a edición, Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994) y Mishell y Shiigi (Eds.), Selected Methods in Cellular Immunology, W.H. Freeman and Co., New York (1980). Los trabajos de referencia estándares que describen los principios generales de inmunología incluyen Current Protocols in Immunology, John iley & Sons, New York; Klein, J. ; Kuby Immunology, 4a edición, R. A. Goldsby, et al., H. Freeman & Co . (2000); Basic and Clinical Immunology, M. Peakman, et al., Churchill Livingstone (1997); Immunology, 6a edición, I. Roitt, et al., Mosby, London (2001); Cellular and Molecular Immunology, 5a edición; A.K. Abbas, A.H. Lichtman, Elsevier-Health Sciences División (2005) ; Immunology Methods Manual: The Comprehensive Sourcebook of Techniques (4 Volume Set) , la edición, I. Lefkovits, Academic Press (1997) Immunology, 5a edición, R.A. Goldsby, et al., W. H. Freeman (2002) ; Monoclonal Antibodies : Principies and Practice, 3a edición, J.W. Goding, Academic Press (1996); Immunology: The Science of Self-Nonself Discrimination, John Wiley & Sons, New York (1982); Kennett, R. , et al. (Eds.), Monoclonal Antibodies, Hibridoma: A New Dimensión in Biological Analyses, Plenum Press, New York (1980); Campbell, A., "Monoclonal Antibody Technology" en Burden, R., et al. (Eds.), Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 13, Elsevere, Amsterdam (1984). Todas las referencias citadas anteriormente, asi como todas las referencias citadas aquí, son incorporadas por referencia en la presente en su totalidad.
Ejemplos Ejemplo 1 Sp35 (LINGO-1) es expresado en Neuronas Dopaminérgicas de Mesencefalo de rata (DA) La expresión de Sp35 fue evaluada en el día 7 postnatal (etapa P7) en cerebro de rata, cerebro de rata adulta y cultivos embrionarios primarios de rata (E15) mediante inmunohistoquimica y/o hibridación in situ. Las secciones cerebrales de rata congeladas fueron preparadas a partir de las ratas en las etapas P7 y adulto del desarrollo mencionadas anteriormente. Secciones cerebrales fueron preparadas para la hibridación in situ utilizando el siguiente protocolo y como se describe en Mi et al. Neurosci. 7: 221-228 (2004). Los animales fueron sacrificados con C02. Los cerebros fueron rápidamente retirados y fijados con 10% de formalina amortiguada neutra por 48 horas. Los cerebros fueron equilibrados en sucrosa al 30% en PBS para la crioprotección y seccionados en serie. La hibridación in situ fue realizada sobre series de secciones aleatoriamente seleccionadas que contienen cada 6o del mesencéfalo ventral total. Las secciones cerebrales fueron sondeadas con el ARN antisentido y en sentido de Sp35, marcado con digoxigenina . Las secciones fueron teñidas utilizando la fluorescencia de TSA plus y el kit de anticuerpos conjugado anti-digoxigenina (Perkin Elmer) siguiendo las instrucciones del fabricante. Las secciones fueron luego teñidas con DAPI (Sigma) y los anticuerpos anti-tirosina-hidroxilasa (TH) (Chemicon) . En la etapa P7, el ARNM de Sp35 fue moderadamente expresado en las neuronas DA positivas a la tirosina-hidroxilasa (TH) del mesencéfalo. Existió también una fuerte expresión del ARNM de Sp35 en el cerebelo, y una expresión débil en el. cuerpo estriado como se reportó previamente. Ver Mi et al. Nat. Neurosci. 7: 221-228 (2004). En el mesencéfalo de adultos, no obstante, existió menos expresión de ARNM de Sp35 en neuronas DA positivas a TH. Los cultivos de mesencéfalo ventral embrionario primario (VM) fueron aislados de ratas Sprague Dawley E15 (Charles River, MA) como se describe en Lin, L. et al. Mol. Cell Neurosci. 28: 547-555 (2005). En resumen, el tejido cerebral fue mecánicamente disociado con pipetas Pasteur pulidas en un medio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM; Gibco, NY) que contenia suero de caballo inactivado por calor (10%), glucosa (6.0 mg/ml) , penicilina (10,000 U/ml) , estreptomicina (10 mg/ml; Sigma) , y glutamina (2 mM; Gibco). 2xl05 células fueron resuspendidas en el medio, y sembradas sobre un cubreobjetos pre-recubierto con 15 mg/ml de poli-L-ornitina (Sigma) y 1 mg/ml de fibronectina (Sigma) de cada pozo de una charola de 24 pozos (Falcon) . La inmunohistoquimica fluorescente fue realizada sobre las secciones cerebrales y los cultivos primarios de VM como se describe en Lin, L., et al., Mol. Cell. Neurosci. 28: 547-555 (2005). En resumen, los cubreobjetos que contenían aproximadamente 2xl05 células fueron tratados con suero de cabra normal al 10% (Jackson Laboratories, Maine) y Tritón X-100 al 0.1% en solución salina amortiguada con fosfato 0.1 (PBS) por 30 minutos · a temperatura ambiente. Subsecuentemente, los cubreobjetos fueron incubados con anticuerpos primarios a 4°C toda la noche y luego con anticuerpos secundarios apropiados conjugados con fluorescencia distinta a temperatura ambiente por 1 hora. Los anticuerpos contra la tirosina-hidroxilasa (TH) , un marcador para las neuronas DA (Chemicon) a una dilución 1:300, fueron utilizados. Fueron utilizados anticuerpos secundarios conjugados con Alexa 488 (Molecular Probes) a una concentración de 1:500. La omisión de los anticuerpos primarios o de los anticuerpos pre-incubados con antígenos en exceso fueron utilizados como controles. La señal fluorescente fue examinada mediante un sistema de formación de imagen confocal (LSM510 META, Cari Zeiss, NY) '. En cultivos de VM primarios, Sp35 fue observado en neuronas DA donde Sp35 y la tinción con TH fueron colocalizadas. No se detectó ninguna tinción cuando un anticuerpo especifico de Sp35 fue pre-incubado con la proteina Sp35 en exceso. Sp35 es también expresado en las neuronas no TH en la sustancia nigra humana y el mesencéfalo de roedor. Estos experimentos indican que Sp35 es expresado en mesencéfalo embrionario E15 y neuronas DA P7, y a un grado menor en VM de adulto. Los estudios inmunohistoquimicos también muestran que la proteina Sp35 es expresada no solamente en las neuritas, sino también en la membrana plasmática de las neuronas DA en el cultivo primario de mesencéfalo .
Ejemplo 2 Los Antagonistas de Sp35 (LINGO-1) Promueven el Crecimiento y la Supervivencia de Neuritas DA in vitro El dominio citoplásmico de Sp35 contiene un sitio de fosforilación de tirosina similar a EGFr canónico, y de este modo tiene el potencial para el involucramiento directo o indirecto en la señalización. Para evaluar la importancia del dominio citoplásmico, una forma truncada de Sp35 (DN-Sp35) que carecía del dominio citoplásmico fue creada (aminoácidos 34-581 ó 34-548 de la SEQ ID NO: 2) . Se ha mostrado que una forma truncada de Sp35, con una supresión del dominio citoplásmico, funciona como una molécula negativa dominante (DN) mediante la formación de un complejo con el receptor 1 de Nogo (NgRl ) y p75NTR y/u otro receptor tal como TAJ/TROY, con lo cual se previene la señalización. Ver Shao et al. Neuron 45: 353-359 (2005) y Park et al. Neuron 45: 345-351 (2005) . Fueron creados lentivirus que expresan (FL)-Sp35 de longitud completa (aminoácidos 34-614 de la SEQ ID NO: 2) o un (DN)-Sp35 negativo dominante utilizando los siguientes métodos y como se describe en Mi et al. Neurosci . 7: 221-228 (2004) . Las secuencias de cADN de Sp35 humano de longitud completa y truncado (DN-Sp35) fueron subclonados dentro de pSECTAG-A (Invitrogen) para expresar las proteínas de fusión marcadas con HA y luego fueron ligados al vector HRST-IRESeGFP. Las construcciones lentivirales fueron cotransfectadas con la glucoproteína del virus de la estomatitis vesiculax (VSV-G) y el vector de empaquetamiento delta 8.9 de HIV-1 dentro de células 293T para generar los lentivirus recombinantes como se describe en Wang et al. Nature 417: 941-944 (2002) . Los cultivos de neuronas VM primarias de rata fueron transducidos con lentivirus que producen FI-Sp35, DN- Sp35 dominante o con un control vector. Cada grupo de virus fueron agregados a los cultivos de neuronas V a una multiplicidad de infección ( OI) de 1 ó 5. Las células fueron cultivadas por 24 horas y luego fijadas con 4% de paraformaldehido en PB (pH 7.4) por 30 minutos a temperatura ambiente. El crecimiento de las neuritas fue examinado en estas neuronas infectadas. Para el examen de la extensión de neuritas o los números de células, varios campos provenientes ' de cada pozo fueron capturados utilizando un microscopio integrado Axioskop 2 (Cari Zeiss, NY) y el kit de captura de imágenes Steroinvestigator y el software (MicroBrightField, VT) . El crecimiento de las neuritas fue promovido en neuronas positivas a TH infectadas con DN-Sp35. En contraste, las neuronas positivas a pH no mostraron diferencia en la longitud de las neuritas cuando fueron transducidas con FL-Sp35. Estas observaciones indican que DN-Sp35 perturba la función de Sp35 endógeno, con lo cual se promueve el crecimiento de las neuritas DA. Ver Figura 1. La proteina Sp35-Fc (aminoácidos 1-532 de la SEQ ID NO: 2 fusionados a un dominio Fe) fue utilizada para determinar si podría funcional como un antagonista de la función FL-Sp35, en neuronas DA, por la promoción del crecimiento de las neuritas DA. El control-Fc y Sp35-Fc fueron preparados como se describe en Mi et al. Nat. Neurosci. 7: 221-228 (2004). En resumen, los aminoácidos 1-532 de Sp35 humano fueron fusionados a la región de bisagra y a la región Fe de la IgGl humana. El polipéptido Sp35-Fc fue expresado en células CHO y purificado sobre · Proteina A-Sepharose (Pharmacia) . La proteina purificada (>95% puro) tuvo un peso molecular de 90 kDa como se midió mediante electroforesis en gel sobre un gel de SDS-PAGE bajo condiciones reductoras y comparado a un estándar de proteina conocida. La proteina tiene un peso molecular de 180 kDa cuando se corre sobre un gel de SDS-PAGE bajo condiciones no reductoras y comparado a un estándar conocido. El polipéptido Sp35-Fc purificado fue proporcionado exógenamente a cultivos de neuronas VM. El crecimiento de las neuritas fue promovido por la adición de Sp35-Fc en exceso. Ver figura 1. El polipéptido de IgG control suministrado exógenamente no promovió el crecimiento de las neuritas DA. Además, la longitud de las neuritas TH de los cultivos tratados con lentivirus que expresan DN-Sp35, fueron examinadas. Los cultivos tratados con DN-Sp35 y Sp35-Fc fueron significativamente más largos en comparación al tratamiento con lentivirus control (p<0.05, Análisis de Varianza (A DEVA) de una sola via) y el Fe control (p<0.003). El efecto de DN-Sp35 fue también probado sobre cultivos VM primarios que fueron tratados con el ion 1-metil-fenilpiridio (MPP+) . MPP+ induce la muerte celular de células neurales DA primarias normalmente, y es un sistema modelo bien establecido para el estudio de PD. Ver Gille et al., Ann NY Acad Sci 1018: 533-540 (2004). Las neuronas VM fueron infectadas con lentivirus como se describió anteriormente. Las células cultivadas fueron expuestas a MPP+ 10 µ? en el día 4 por 48 horas, seguido por fijación (dia 6) . Las neuronas positivas a TH protegidas con DN-Sp35 expuestas a MPP+ 10 µ? en cultivos primarios de mesencéfalo de rata. Ver Figura 2. El número de neuronas TH cuando fueron expuestas a MPP+ fue significativamente más alto en las células transducidas con DN-Sp35, en comparación a las neuronas transducidas con FL-Sp35 y el control (p<0.005, ADEVA de una vía) . Además, los cultivos de VM primarios expuestos a MPP+ fueron protegidos de la muerte celular mediante exposición a Sp35-Fc y un anticuerpo 1A7 para el antagonista de Sp35, descrito en la Solicitud de Patente Provisional No. 60/697,336, la cual se incorpora por referencia en la presente en su totalidad. Las células tratadas con Sp35-Fc y el anticuerpo 1A7 mostraron un efecto protector significativo contra la toxicidad por MPP+ sobre neuronas positivas a TH en comparación a los cultivos tratados con Fe control o IgG control (p<0.01, para 1A7 y p<0.05 para Sp35-Fc, ANDEVA de una sola via) . Ver Figura 3. Estos resultados indican que la inhibición de Sp35 endógeno protege las neuronas DA contra la exposición a la neurotoxina en MPP+.
Ejemplo 3 El Bloqueo de la Actividad de Sp35 Induce la Fosforilación de Akt Akt es un efector con dirección 3' de la vía de supervivencia de la cinasa PI3. Williams y Doherty Mol. Cell. Neurosci. 13: 272-280 (1999). Los niveles de la fosforilación de Akt normales en cultivos VM primarios de rata fueron evaluados mediante análisis de transferencia de Western. Neuronas VM primarias de rata fueron transducidas con los lentivirus que expresan FL-Sp35 o DN-Sp35 (marcado con HA) como se describe en el Ejemplo 2. Las neuronas VM primarias de rata, transducidas, fueron cosechadas después de 48 horas y Usadas en 500 µ? de amortiguador de lisis (HEPES 50 mM (pH 7.5); NaCl 150 mM; MgCl2 1.5 mM; EDTA 1 mM; Tritón X-100 al 1% y 10% de glicerol) por 30 minutos a 4°C. Los sobrenadantes fueron, sometidos a electroforesis sobre un gel de SDS-PAGE al 4-20% (Bio-Rad, CA) , transferidos a una membrana de inmunotransferencia y sondeados ya sea con la matriz de afinidad anti-HA (Roche, Suiza) o el anticuerpo anti-fosfo-Akt (Cell Signaling, MA) , o el anticuerpo anti-Akt total (Cell Signaling, MA) . La fosforilación de Akt fue significativamente incrementada después de la transducción de neuronas VM primarias de rata con lentivirus que expresan DN-Sp35, en comparación a la transducción con un lentivirus que expresa FL-Sp35 o un vector control. Ver Figura 4. Estos resultados sugieren que DN-Sp35 influye en la supervivencia de las neuronas positivas a TH, en parte, por el involucramiento de la vía de señalización de PI3/Akt.
Ejemplo 4 Generación de Ratones Con genes Sp35 inactivados Los Ratones Con genes Sp35 inactivados fueron generados con un vector de reemplazo GFP/Neo (proteina fluorescente verde/neomicina ) que se dirigió a la secuencia de codificación del exon simple, completa de Sp35 como se describe por Schiemann et al. (Science 293: 2111-2114 (2001) . El ADN genómico de ratón 129/SvJ fue aislado de una biblioteca genómica lambda (Stratagene #946313) . Un fragmento EcoRV de 14.6 kb fue subclonado dentro de pBSK+ y luego fue dirigido por la recombinación homologa en bacterias para insertar el gen reportero Q40 de eGFP en el ATG de inicio. La construcción final suprimió los 1-1,841 nucleótidos completos de la secuencia de Sp35 que codifica para el exon simple. Esta construcción fue utilizada para dirigirse al locus de Sp35 en células madre embrionarias D3 (129/Sv) . Las células correctamente dirigidas fueron identificadas mediante, transferencia de Southern del ADN de las células madre embrionarias digerido con EcoRI, y fueron inyectadas dentro de blastocitos C57B1/6 para generar ratones quiméricos. Las quimeras fueron cruzadas a ratones C57B1/6 para generar ratones fundadores heterocigotos . Los genotipos fueron determinados mediante PCR de tres cebadores del ADN de cola. El cebador delantero, 5 ' -CTATCCAAGCACTGCCTGCTC-3 ' (SEQ ID NO: 6), y los dos cebadores inversos, 5'-GAGTTCTAGCTCCTCCAGGTGTG-31 (SEQ ID NO: 7) y 5'-GATGCCCTTCAGCTCGATGCG-3 ' (SEQ ID NO: 8), produjeron productos alélicos de 275 pares de bases de tipo silvestre y 356 pares de bases mutante, respectivamente, en una reacción de 35 ciclos (94°C por 20 segundos, 65°C por 30 segundos, 72°C por 30 segundos). Ver Mi, S. et al., Nat . Neurosci. 7: 221-228 (2004). La validación de la supresión del gen de Sp35 fue lograda mediante transferencia de Southern, RT-PCR y análisis de transferencia de Northern. Las bandas prominentes fueron detectadas en la transferencia de Northern y RT-PCR en ratones de tipo silvestre, pero una ausencia completa de bandas fue encontrada en ratones suprimidos en el gen. Las transferencias de Southern de heterocigotos mostraron el alelo de Sp35 de tipo silvestre y modificado. Los Ratones Con genes Sp35 inactivados parecieron normales, sin anormalidades físicas no obvias o alteraciones en el comportamiento, locomoción o fecundidad. Las carnadas de la progenie Fl heterocigotas variaron en tamaño. La generación de un ratón suprimido en el gen de Sp35 es descrita en Mi et al. Nat. Neuroscience 7: 221-228 (2004), que es incorporada por referencia en la presente.
Ejemplo 5 Ensayo de 6-OHDA In Vivo para la Supervivencia y Regeneración de las Neuronas DA en Ratones Con genes Sp35 inactivados Ratones Con genes Sp35 inactivados fueron examinados para determinar si los ratones sin Sp35 mostraban supervivencia neurona^ incrementada y recuperación mejorada de la función en las vías dopaminérgicas en el cerebro después del daño. Trece Ratones Con genes Sp35 inactivados y trece ratones control de una carnada de tipo silvestre, fueron anestesiados con cetamina y xilazina (100 y 10 mg/kg ip, respectivamente) y colocados sobre una estructura estereotáxica para recibir la inyección intraestriatal unilateral de clorhidrato de 6-hidroxidopamina (6-OHDA) . El sitio quirúrgico fue limpiado con betadina y alcohol y se realizó una incisión sagital de línea media de 0.5 cm para exponer el bregma. Un orificio burdo pequeño fue realizado en el cráneo por arriba del sitio de inyección y se inyectaron 10 µg de 6-OHDA disuelto en 0.02% de ascorbato/salina (Sigma) dentro del cuerpo estriado izquierdo en las coordenadas AP+04, Lateral 1.5 mm, lateral a la línea media, DV-2.5 mm ventral a la superficie del cráneo. El 6-OHDA es infundido en 2 minutos a una velocidad de 0.5 µ?/minuto utilizando una jeringa Hamilton de 10 µ? de calibre 26. Después de la infusión de 6-OHDA, la cánula fue dejada en el sitio por 2 minutos adicionales y luego retirada lentamente. La incisión fue cerrada utilizando una abrazadera automática y los ' ratones fueron colocados sobre una almohadilla de calentamiento hasta la recuperación de la anestesia. La inyección de 6-OHDA en el cuerpo estriado de ratones produce una pérdida progresiva de los axones DA y las neuronas, y es un sistema modelo bien establecido para el estudio de PD. Ver, Brundin et al. Brain Res. 366: 346-349 (1986) . La prueba rotacional fue conducida 1, 2, 3 y 4· semanas después de la infusión de 6-OHDA. Para la prueba rotacional, los ratones fueron inyectados con apomorfina en 0.02% de ascorbato subcutáneamente a una dosis de 0.4 mg/kg. Las rotaciones contralaterales al lado de la lesión fueron contadas en un periodo de 30 minutos. "Comportamiento rotacional" es el comportamiento mostrado cuando un animal con daño unilateral a la vía de dopamina nigrostriatal es administrado con un agonista de dopamina tal como apormorfina o un agente de liberación de dopamina tal como anfetamina. El animal gira repetidamente en círculos lejos del lado del cerebro que experimenta mayor estimulación del receptor de dopamina estriatal. La magnitud de la respuesta rotacional (por ejemplo, el número de rotaciones realizadas) es directamente proporcional al grado de daño a la vía de la dopamina nigroestriatal. Ver, por ejemplo, Fuxe et al. Pharmacol. Ther. 2: 41-47 (1976). Al menos 24 horas después de la medición del comportamiento rotacional, los ratones fueron sacrificados mediante asfixia con C02. Los cerebros fueron rápidamente retirados y fijados con 10% de formalina amortiguada neutra por 48 horas. Los cerebros fueron equilibrados en sucrosa al 30% en PBS para la crioproteccion y seccionados en serie. La inmunohistoquímica ABC rutinaria fue realizada sobre series aleatoriamente seleccionadas de secciones que contenían cada sexto del mesencéfalo ventral total. Las secciones fueron incubadas con anti-tirosina-hidroxilasa (TH) (1:300, Peí Freez, AK) toda la noche a 4°C y seguido por la incubación con el anticuerpo secundario de cabra anti-oveja, biotinilado (1:300, Vector Laboratories, CA) y con el complejo de estreptavidina-biotina por una hora a temperatura ambiente, respectivamente. La tinción fue visualizada mediante incubación con la solución de 3, 3 ' -diaminobencidina con mejoramiento con níquel (Vector Laboratories, CA) . La omisión del anticuerpo primario sirvió como un control. La estereología fue realizada sobre las secciones teñidas 1 4 utilizando un microscopio Axioskop 2 integrado (Cari Zeiss, NY) y el kit de captura de imágenes Stereo Investigador y el software (MicroBrightField, VT) . Las células positivas a TH fueron contadas utilizando una sonda de fracción óptica. El número total estimado de células fue obtenido utilizando el software MicroBrightField. El análisis estereológico fue realizado por investigadores ciegos a los tratamientos grupales . La asimetría motora fue significativamente menor en ratones suprimidos en un gen, en comparación a los controles de carnada tipo silvestre a todos los puntos de tiempo examinados (p<0.001 ANDEVA de dos vías). Ver Figura 5. El análisis post-mortem a los 32 días después de las inyecciones de 6-OHDA reveló una reducción marcada en el número de neuronas TH en el mesencéfalo lesionado. El análisis estereológico reveló que el número de neuronas TH en el mesencéfalo no difirió en los ratones de tipo silvestre y suprimidos en un gen (p>0.005, prueba t no apareada). Ver Figura 6A. Para corregir las diferencias generadas por el genotipo, el número de neuronas TH en el mesencéfalo lesionado fue representado como un porcentaje del número en el lado no lesionado de cada animal. - El análisis estadístico reveló un mayor porcentaje de neuronas TH en los ratones suprimidos en un gen que en los ratones de tipo silvestre (p=0.002, prueba t no apareada) demostrando que los ratones suprimidos en un gen fueron protegidos en el modelo de 6-OHDA en comparación a los controles de carnada de tipo silvestre. Ver Figura 6B. El número de neuronas TH fue estereológicamente contado en el área tegmental ventral (VTA, área A10) y en las regiones compactas de la sustancia nigra (SNc, área A9) utilizando un método fraccionador óptico no desviado como se describe en Blum, M . , Nat . Neurosci. 1: 374-377 (1998). No existió diferencia en el número de neuronas TH entre los ratones KO y WT (Fi>48 = 1.321, p>0.05). No obstante, el número de células TH fue significativamente diferente entre el lado de la lesión y no de lesiones (Fi,48 = 27.53, p<0.0001), y la diferencia de los números de células TH entre el lado de la lesión y sin lesión fue significativamente afectado por el genotipo (interacción entre el genotipo y el lado del cerebro) (F1 ( 48 = 4.34 , p>0.05). Ver Figura 8. El número de neuronas sobre el lado de la lesión fue normalizado al lado sin lesión en cada animal, para prevenir cualquier influencia del genotipo. El análisis estadístico mostró un número mayor de neuronas TH en los ratones KO (media ± s.e.m.: 79% ± 4.5%) que en ratones WT (56% ± 5.5%) (prueba t de Student no apareada, t (24) =3.34; p=0.003), demostrando un efecto neuroprotector de la supresión del gen en estos ratones . En ratones de tipo silvestre sometidos al modelo de parkinsonismo experimental inducido por 6-OHDA, la proteina Sp35 fue incrementada en el cuerpo estriado 3 días después del daño. Ver Figura 9. Sp35 es suprarregulado en el lado de la lesión (6-OHDA) en comparación al lado contralateral (control) 3 días después de la administración de 6-OHDA en el cuerpo estriado, en ratones de tipo silvestre. Tres ratones fueron examinados en cada punto de tiempo (días 0, 3, 7 y 15) (prueba t de Student no apareada, p<0.05) .
Ejemplo 6 Ensayo de MPTP In Vivo para la Supervivencia y Regeneración de Neuronas DA en Ratones Con genes Sp35 inactivados Para confirmar adicionalmente que los ratones sin Sp35 mostraban supervivencia neuronal incrementada y recuperación mejorada de la función en las vías dopaminérgicas en el cerebro después del daño, los ratones fueron también evaluados en un modelo MPTP de PD. Trece ratones WT y catorce Ratones Con genes Sp35 inactivados fueron inyectados intraperitonealmente con 25 mg/kg de clorhidrato de MPTP (Sigma) cuatro veces, con dos horas entre cada inyección. Ver, por ejemplo, Battaglia G- et al., Neuropharmacology 45: 155-166 (2003). Todos los animales fueron sacrificados 7 días después de la inyección. Los ratones fueron sacrificados mediante asfixia con CO2. Los cerebros fueron rápidamente removidos y fijados con formalina amortiguada neutra al 10% por 48 horas. Los cerebros fueron equilibrados en sucrosa al 30% en PBS para la crioprotección y seccionados en serie. La estereologia fue realizada sobre las secciones teñidas utilizando un microscopio integrado Axioskop 2 (Cari Zeiss, NY) y el kit de captura de imágenes Stereo Investigador y el software (MicroBrightField, VT) . Las células positivas a TH fueron contadas utilizando una sonda de fracción óptica. El número total estimado de células fue obtenido utilizando el software MicroBrightField. El análisis estereológico fue realizado por investigadores ciegos a los tratamientos grupales. El análisis estereológico post-mortem a los 7 días después del tratamiento con MPTP reveló un más alto número de neuronas TH en el mesencéfalo en los ratones KO en comparación a los ratones WT . Ver Figura 6C . En otro experimento más, 10 ratones KO y 10 carnadas WT fueron evaluadas en un modelo de MPTP de PD. Los ratones WT (n=7) y KO (n=8) inyectados con solución salina, sirvieron como controles. El análisis estereológico post-morem 7 días después del tratamiento con MPTP reveló que los números de células TH en la sustancia nigra compacta (SNc, área A9) no difirieron entre los ratones WT y KO controles. No obstante, el número de neuronas TH fue reducido en el SNc de los ratones WT tratados con MPTP en comparación con los ratones WT y KO tratados con vehículo (prueba de Kruskal-Wallis , p<0.001, respectivamente). Ver Figura 10. El número de neuronas TH no fue estadísticamente diferente entre los ratones control y los ratones KO tratados con MPTP. Los niveles de dopamina estriatales del control y de los ratones KO y WT tratados con MPTP fueron también examinados. Los cuerpos estriados disectados fueron sonicados y centrifugados en ácido perclórico 0.1 M frío (PCA, aproximadamente 100 µ?/mg de tejido). Los sobrenadantes fueron tomados para las mediciones de la dopamina como se describe en Yang, L. et al., Exp. Neurol . 191: 86-93 (2005). En resumen, 15 µ? del sobrenadante fueron isocráticamente eluidos a través de una columna C18 de 80 x 4.6 mm (ESA, Inc., Chelmsford, MA) con una fase móvil que contiene LiH2P04 0.1 M, ácido 1-octansulfónico 0.85 mM y metanol al 10% (v/v) y detectado por un detector electroquímico Coulochem II de 2 canales (ESA, Inc., Chelmsford, MA) . Las concentraciones de dopamina fueron expresadas como nanogramo por miligramo de proteína. La concentración de proteína de los homogeneizados tisulares fue determinada utilizando el método de Bradford (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) y el Lector de Ensayo Perkin Elmer Bio (Norwalk, CT) . Los niveles de dopamina estriatales fueron menores en los ratones WT tratados con MPTP en comparación a los ratones WT control (prueba de Kruskal-Wallis, p<0.01) y los ratones KO control (p<0.05). Ver Figura 11. Los niveles de- dopamina no fueron estadísticamente diferentes entre los ratones KO control tratados con MPTP, lo cual es consistente con la neuroprotección también observada en el paradigma de 6-OHDA. Para determinar si la ablación genética de Sp35 altera la captación de la toxina MPTP y el metabolismo de la misma, los niveles de MPP+ del cuerpo estriado en ratones KO de Sp35 y WT (n=6 para cada grupo) fueron medidos 90 minutos después del tratamiento con MPTP. Para la medición de MPP+, los tejidos del cuerpo estriado fueron sonicados y centrifugados en PCA 0.1 M y se inyectó una alícuota del sobrenadante sobre una columna C18 META 250 x 4.6 (ESA, Inc., Chelmsford, MA) . Las muestras fueron eluidas isocráticamente con amortiguador de ácido bórico-borato de sodio 20 mM pH 7.75) que contiene el sulfato ácido de tetrabutilamonio 3 mM, ácido 1-heptansulfónico 0.25 mM y 10% de isopropanol. MPP+ fue también detectado con un kit detector de fluorescencia mediante excitación a 295 nm y emisión a 375 nm. Los niveles de MPP+ en los ratones KO y WT después del tratamiento con MPTP, no fueron significativamente diferentes (prueba t de Student no apareada; t(10)=1.69; p>0.05, media ± s.e.m., 39.68 ± 3.92 para WT y 62.06 ± 12.67 para KO) . El análisis de transferencia de Western · también mostró que los niveles de transporte de dopamina (DAT) no fueron alterados en los ratones KO de Sp35. Ver Figura 14.
Adicionalmente, las transferencias de Western fueron realizadas sobre los listados de tejido VM a partir de ratones KO y WT expuestos a MPTP asi como los controles. Los tejidos de ratones fueron Usados en 500 µ? de amortiguador de lisis [HEPES 50 mM, pH 7.5, NaCl 150 mM, MgCl2 1.5 mM, EDTA 1 mM, Tritón X-100 al 1%, 10% de glicerol que contenia Inhibidores de Proteasa Completos (Roche, Basilea, Suiza) , e Inhibidores de Fosfatasa (Sigma) ] . Los sobrenadantes fueron sometidos a electroforesis ya sea sobre gel de SDS-PAGE al 4-20% o al 10% (Bio-Rad, Hercules, CA) y sometidos a inmunotransferencia con los anticuerpos anti-fosfo-Akt , anti-Akt y anti-FGFR (Cell Signaling, Beverly, MA) . Un incremento del Akt fosforilado en el mesencéfalo ventral de ratones KO expuestos a MPTP fue también encontrado en comparación a aquellos de los controles de carnada de tipo silvestre (WT) expuestos a MPTP. Ver Figuras 6D-6F. Adicionalmente, la proteina Sp35-Fc (6.5 yg/µ?, total 2 µ?), que es la forma truncada de Sp35 que funciona como una molécula dominante-negativa, fue unilateralmente inyectada en el cuerpo estriado de ratones C57BL/6 (n=9). Estos ratones recibieron MPTP 6 días después de la cirugía y se dejaron luego sobrevivir otros 7 días. El análisis post-mortem de los números de neuronas TH en estos animales mostró un número mayor en el SNc ipsilateral que en el SNc contralateral (prueba t de Student no apareada; t (16) =2.11 ; p<0.05. Ver Figura 15A. Los niveles de dopamina en el cuerpo estriado fueron mayores en el cerebro inyectado por Sp35-Fc. (prueba de Mann-Whitney, p<0.05), indicando de este modo un efecto neuroprotector . Ver Figura 15B. Además, los niveles de MPP+ en el cuerpo estriado examinó los 90 minutos después de la inyección de MPTP no fueron diferentes entre el lado inyectado con Sp35-Fc y el lado contralateral del cerebro. Ver Figura 15C.
Ejemplo 7 Generación de Lentivirus suprimidos en el gen del ARNi El ARNi especifico de Sp35 es utilizado para someter a ablación la expresión de Sp35 en neuronas DA, para examinar cómo contribuye Sp35 a la supervivencia de las neuritas DA, a la regeneración y a la diferenciación de las mismas. Los cultivos neuronales DA son infectados con el léntivirs que posee la secuencia de ARNi especifica de Sp35 o el ARNi control preparada como sigue. Secuencias de ADN Sp35 murinas y de rata fueron comparadas para encontrar regiones homologas para utilizarse para los ARNs de horquilla pequeña candidato (ARNsh) . CH324, para la expresión del lentivirus de ARNi de Sp35, fue construido mediante el recocido de los oligonucleótidos LV1-035 y LV1-036 y ligando a pLL3.7 digerido con fípal y Xhol . El vector pLL3.7, la metodología adicional y la producción de virus fueron como se describe en Rubinson et al., Nat. Genet. 33, 401-06 (2003) . Los oligonucleótidos de ARNi de Sp35 fueron adquiridos de MWG y tienen las siguientes secuencias:} LV1-035 (oligo en sentido) -5 ' -TGATCGTCATCCTGCTAGACTTCAAGAGAGTCTAGCAGGATGACGATCTTTTTTC-3 ' (SEQ ID NO:9) y LV1-036 (oligo antisentido) 5'- TCGAGAAAAAAGATCGTCATCCTGCTAGACTCTCTTGAAGTCTAGCAGGATGACGATCA-3 ' . (SEQ ID NO: 10) . El ARNi control fue diseñado con las mismas secuencias oligonucleotidicas, excepto por los cambios de nucleótidos indicados en letras minúsculas: 5'-TGATCcTCATcCttCTAtACTTCAAGAGAGTgTAGCAGGATGAcGATCTITTTCTCGA-3 ' (SEQ ID NO: 11) y 5 ' -TCGAGAAAAAAGATCGTCATCCTGCTAGACTCTCTTGAAGTaTAGaAGGATGACGA TCA-3 ' . (SEQ ID NO: 12) . Antes de la producción del lentivurs, el ADN proveniente de pLL3.7 o el ARNsh candidato en pLL3.7, fueron co'transfectados con el plásmido marcado con Sp35-HA murino a una proporción de 5 a 1 dentro de células CH en el formato de 6 pozos. La supresión del gen fue analizada mediante detección de transferencia de Western del marcador de Sp35-HA a partir de los lisados de células CHO transfectadas , asi como mediante transferencia de Northern del ARN total preparado a partir de los pozos duplicados. La transferencia fue sondeada con un fragmento de ADNc de Sp35. Los ensayos fueron realizados 48 horas después de la transfección . Como se esperaba, existió una reducción de 10 veces del ARNM de Sp35 en las células CHO tratadas con el ARNi de CH324, con relación a las células tratadas con el control.
Ejemplo 8 La supresión del ARNi especifico de Sp35 de la expresión de Sp35 , promueve la supervivencia y diferenciación de las neuronas DA Para examinar los efectos de la falta de expresión de Sp35 en neuronas DA, los lentivirus que expresan moléculas de ARNi que erosionan la expresión de Sp35, como se describe en el Ejemplo 7, se utilizan para infectar neuronas VM primarios de rata. Los lentivirus que llevan la proteina fluorescente verde (GFP) son generados como se describe en Rubinson et al. y en el Ejemplo 7. Los cultivos neuronales VM primarios de rata son infectados a una multiplicidad de infección (MOI) de 1-5 ya sea con el control o el ARNi de Sp35. Las células positivas a GFP indican neuronas DA infectadas con el lentivirus. El efecto de la supresión de Sp35 es determinado por la extensión y supervivencia de las neuronas DA.
Ejemplo 9 El anticuerpo 1A7 Sp35-Fc y Sp35 incrementa la expresión de EGFr y la fosforilación de Akt en cultivos de VM tratados con MPP+ Para examinar la fosforilación de Akt y la interacción entre Sp35 y EGFr en cultivos VM tratados con MPP+, y en cultivos primarios de neuronas DA fueron obtenidos a partir del mesencéfalo ventral de ratas Sprague Dawley E15 o E16 (Charles River, MA) . Ver Shah et al., J Cell Physiol en prensa. En resumen, los tejidos fueron mecánicamente disociados con pipetas Pasteur unidas en un medio Eagle Modificado de Dulbecco frío (DMEM; Gibco, NY) que contenia suero de caballo inactivado por calor (al 10%), glucosa (6.0 mg/ml), penicilina (10,000 U/ml), estreptomicina (10 mg/ml; Sigma) , y glutamina (2 mM; Gibco) . 2 x 105 células fueron resuspendidas en el medio y sembradas sobre un cubreobjetos pre-recubierto con 15 mg/ml de poli-L-ornitina (Sigma) y 1 mg/ml de fibronectina (Sigma) en cada pozo de una charola de 24 pozos (Falcon). Las células no acopladas fueron aspiradas en el dia 4, y 1 mi de medio fresco que contenia LINGO-1-Fc, 1A7, IgG control o Fe control fue agregado a una concentración de 10 yg/ml. 8 horas más tarde, las células cultivadas fueron expuestas a MPP+ 10 µ? por 48 horas. Las células VM cultivadas fueron lisadas con 500 µ? de amortigua'dor de lisis [HEPES 50 mM, pH 7.5, NaCl 150 mM, gCl2 1.5 mM, EDTA 1 mM, Tritón X-100 al 1%, 10% de glicerol que contenia Inhibidores de Proteasa Completos (Roche, Basilea, Suiza) e Inhibidores de Fosfatasa (Sigma) ] . Los sobrenadantes fueron sometidos a electroforesis ya sea sobre gel de SDS-PAGE al 4-20% o al 10% (Bio-Rad, Hercules, CA) y sometidos a inmunotransferencia con los anticuerpos anti-fosfo Akt, anti-EGFR (Cell Signaling, Beverly, MA) o anticuerpos anti-actina. EGFR y la fosforilación de Akt fue incrementado en los cultivos de neuronas VM tratadas con MPP+ incubadas con un anticuerpo 1A7 y la proteína Sp35-Fc en comparación a la IgG control de la proteína control Fe, respectivamente 23.645; p<0.001 para 1A7 ; F3(i2 = 18.89, p<0.001 para Sp-Fc) . Ver Figuras 7A-7C y 7G. Adicionalmente , Sp35 de longitud completa disminuye la expresión de EGFR. Las células COS7 fueron transfectadas con el lentivirus FL-Sp35, descrito en el Ejemplo 2, a 0, 1 y 2 MOI por 2 días. La expresión de la proteína EGFR en las células transfectadas fue medida a cada MOI. Como se puede observar en la Figura 12, el nivel de expresión de EGFR disminuyó de una manera dependiente de la dosis. La interacción directa entre Sp35 y EGFR en células cultivadas y en tejidos cerebrales VM provenientes de ratones WT y KO fue demostrada mediante inmunoprecipitación utilizando los anticuerpos anti-Sp35 ( 1A7 o 2F3) o anti-EGFR (ver Figuras 7D-7F) . Las células COS-7 o HEK 293 (cajas de 100 mm) fueron transíectadas con Sp35, EGFR y Sp35/EGFR. Las células fueron cosechadas después de 48 horas y lisadas en 1 mi de amortiguador de lisis (HEPES 50 mM, pH 7.5, NaCl 150 mM, MgCl2 1.5 mM, EDTA 1 mM, Tritón X-100 al 1%, 10% de glicerol) o amortiguador RIPA (TRIS 50 mM, pH 7.2, Tritón X.100 al 1%, 0.5% de desoxicolato de sodio, 0.1% de SDS, NaCl 150 mM, MgCl2 10 mM, 5% de glicerol) por 30 minutos a 4°C. Después de la centrifugación a 14,000xg por 15 minutos, los sobrenadantes fueron incubados con esferas de Proteina A/G-Sepharose (Santa Cruz Biotechnology) a 4°C por 1 hora, y luego se incubaron 200 µ? de los lisados preaclarados ya sea con anti-EGFR (Santa Cruz Biotechnology) a 4°C por 1 hora, el anticuerpo anti-Sp35 (Biogen Idee, descrito en la Solicitud de Patente Provisional No. 60/697,336, la cual es incorporada por referencia en la presente en su totalidad) seguido por tratamiento con esferas de Proteina A/G-Sepharose . Las esferas fueron lavadas 3 veces con amortiguador de ' lisis, sometidas a ebullición en amortiguador de muestra Laemmeli, sometidas a SDS-PAGE al 4-20%, y analizadas mediante transferencia de Western con el anticuerpo anti-EGFR o el anticuerpo anti-Sp35. Los anticuerpos para EGFR y Sp35 fueron visualizados utilizando IgG-conejo conjugada a peroxidasa de rábano (HRP) . Los VM de KO o WT de Sp35 fueron lisados en amortiguador RIPA y pre-aclarados mediante esferas de Proteina A/G plus-Sepharose como se describe anteriormente. 1 mg de los extractos de mesencéfalo ventral fue luego sometido a inmunoprecipitaciones con un anti-Sp35 a 4°C toda la noche, seguido por 1 hora de incubación con las esferas de Proteina A/G plus-Sepharose. La interacción directa entre Sp35 y EGFR fue también observada en cultivos de mesencéfalo ventral. Ver Figura 7E. Además, en los experimentos IP con las lineas celulares co-transfectadas con Sp35 y EGFR, el anticuerpo anti-Sp35 1A7 bloqueó el enlace de Sp35 a EGFR mientras que el anticuerpo 2F3 anti-Sp35 no bloquea el enlace. Ver Figura 7F. En este experimento OMgp fue utilizado como un control para el enlace del anticuerpo.
Ejemplo 10 La expresión de Sp35 en neuronas dopaminérgicas sobrevivientes provenientes de la sustancia nigra (SN) de pacientes con enfermedad de Parkinson post-mortem (PD) fue examinada. El tejido post-mortem fue obtenido con el consentimiento del Centro de Recursos de Tejido Cerebral de Harvard. La Tabla 2 siguiente contiene la información respecto a los pacientes con PD y sus controles equiparados en edad utilizados en los experimentos descritos en este ej emplo .
TABLA 2 Información respecto a los pacientes con PD y controles equiparados en edad La expresión de Sp35 fue examinada en neuronas dopaminérgicas sobrevivientes, provenientes de los pacientes anteriormente descritos, mediante hibridación in situ. El tejido SN fue incrustado en el compuesto Optimum Cutting Temperature (OCT) . Las secciones congeladas fueron preparadas, procesadas y sondeadas con el ARN antisentido y en sentido de Sp35, marcado con digoxigenina, como se describe en Mi et al. Nat. Neurosci. 7: 221-228 (2004) . Las secciones fueron teñidas utilizando la fluorescencia TSA plus y el kit de anticuerpos conjugados anti-digoxigenina (Perkin Elmer, Wellesley, MA) siguiendo las instrucciones del fabricante. Las secciones fueron luego teñidas con anti-TH (Chemicon, Temecula, CA) y DAPI (Sigma) . Sp35 en las neuronas dopaminéricas supervivientes en el SN del tejido post-mortem de PD (n=6) fue suprarregulado en comparación a los controles de igual edad (n=6) . La PCR semi-cuantitativa fue también utilizada para examinar la expresión de Sp35 en los pacientes descritos en la Tabla 2. El ARNM fue extraído del tejido SN humano utilizando el kit miniprep ARN absolutamente (Stratagene) siguiendo las instrucciones del fabricante. El ARNM de Sp35 fue amplificado utilizando el cebador delantero de sp35 -5'-AGAGACATGCGATTGGTGA-3 ' (SEQ ID NO: 14) y el cebador inverso 5 ' -AGAGATGTAGACGAGGTCATT-3 ' (SEQ ID NO: 15) . Como se observa en la Figura 13A, Sp35 fue suprarregulado en las neuronas dopaminérgicas sobrevivientes en el SN del tejido post-mortem de PD en comparación a controles de igual edad. Los niveles de ARNM de Sp35 fueron estéticamente más altos en el SN de PD de los controles (prueba T de Student no apareada; t (10) =2.280; p<0.05) . Ver Figura 13B. La presente invención no debe estar limitada en alcance por las modalidades especificas descritas, las cuales están destinadas a ser ilustraciones simples de los aspectos inhibidores de la invención, y cualesquiera composiciones o métodos que sean funcionalmente equivalentes están dentro del alcance de esta invención. Por supuesto, diversas modificaciones de la invención además de aquellas mostradas y descritas aquí, se volverán aparentes para aquellos expertos en la materia a partir de la siguiente descripción y las figuras anexas. Se pretende que tales modificaciones caigan dentro del alcance de las reivindicaciones anexas. Todas las publicaciones y solicitudes de patente mencionadas en esta especificación son incorporadas aquí por referencia al mismo grado como si cada publicación individual o solicitud de patente fuera especifica e individualmente indicada para ser incorporada por referencia. Se hace constar que con relación a esta fecha el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (56)

  1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Un método para promover la regeneración, el crecimiento o la supervivencia de neuronas dopaminérgicas , caracterizado porque comprende poner en contacto las neuronas dopaminérgicas con una cantidad efectiva de una composición que comprende un antagonista de Sp35 seleccionado del grupo que consiste de: (i) un polipéptido de Sp35 soluble; (ii) un anticuerpo de Sp35 o el fragmento inmunospecifico del mismo ; (iii) un polinucleotido del antagonista de Sp35, (iv) un aptámero de Sp35; y (v) una combinación de dos o más de los antagonistas de Sp35.
  2. 2. El método para promover la regeneración, el crecimiento o la supervivencia de neuronas dopaminérgicas en un mamífero, caracterizado porque comprende administrarle a un mamífero en necesidad del mismo una cantidad efectiva de una composición que comprende un antagonista de Sp35 seleccionado del grupo que consiste de: (i) un polipéptido de Sp35 soluble; (ii) un anticuerpo de Sp35 o el fragmento del mismo; (iii) un polinucleótido del antagonista de Sp35, y (iv) un aptámero de Sp35; y (v) una combinación de dos o más de los antagonistas de Sp35.
  3. 3. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el mamífero está sufriendo de una enfermedad, trastorno, o daño asociado con la degeneración de las neuronas dopaminérgicas .
  4. 4. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque la enfermedad, trastorno o daño se selecciona del grupo que consiste de enfermedad de Parkinson (PD) , la atrofia de sistemas múltiples, la degeneración estriatonigral, la atrofia olivopontocerebelar , el síndrome de Shy-Drager, la enfermedad de las neuronas motoras con características parkinsonianas , demencias de cuerpos de Lewy, parálisis supranuclear progresiva, degeneración ganglionar cortical-basal, demencia frontotemporal, · enfermedad de Alzheimer con parkinsonismo, enfermedad de Wilson, enfermedad de Hallervorden-Spatz, enfermedad de Chediak-Hagashi , ataxia espinocerebelar de SCA-3, distonia-parkinsonismo ligado a X (DYT3), enfermedad de Huntington (variante de Westphal), enfermedad de los priones, enfermedad de Jacob-Creutzfeldt , parkinsonismo vascular, parálisis cerebral, trauma craneal repetido, parkinsonismo post-encefalítico, esquizofrenia y neurosífilis y esquizofrenia.
  5. 5. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque la enfermedad, trastorno o daño es enfermedad de Parkinson (PD) . 6. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque el antagonista de Sp35 comprende un polipéptido de Sp35 soluble. 7. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el polipéptido de Sp35 soluble comprende una región de Sp35 seleccionada del grupo que consiste de: (i) un dominio de Ig de Sp35 o un fragmento, variante, o derivado del mismo, (ii) un dominio LRR de Sp35 o un fragmento, variante, o derivado del mismo, (iii) un dominio citoplásmico de Sp35 o un fragmento, variante, o derivado del mismo, (iv) un dominio transmembranal de Sp35 o un fragmento, variante, o derivado del mismo, (v) una región básica de Sp35 C-terminal al dominio LRR o un fragmento, variante, o derivado del mismo, y (vi) una combinación de al menos dos de los dominios de Sp35 o fragmentos, variantes, o derivados de los mismos de (i) a (v). 8. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el polipéptido de Sp35 soluble carece de una región de Sp35 seleccionada del grupo que consiste de: (i) un dominio de Ig de Sp35, (ii) un dominio de LRR de Sp35, (iii) un dominio citoplásmico de Sp35, (iv) un dominio transmembranal de Sp35, (v) una región básica de Sp35 C-terminal al dominio de LRR y (vi) una combinación de al menos dos de los dominios de Sp35 de (i) a (v) . 9. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el polipéptido de Sp35 soluble carece de un dominio transmembranal de Sp35 y un dominio citoplásmico de Sp35. 10. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, caracterizado porque el polipéptido de Sp35 soluble comprende (i) un dominio de LRR de Sp35 o un fragmento, variante, o derivado del mismo, (ii) una región básica de Sp35 C-terminal al dominio de LRR o un fragmento, variante, o derivado del mismo, y (iii) un dominio de inmunoglobulina de Sp35 (Ig) o un fragmento, variante, o derivado del mismo. 11. El método de conformidad con la reivindicación 8 ó 9, caracterizado porque el polipéptido de Sp35 soluble comprende al menos una porción del dominio de LRR de Sp35, pero carece de un dominio de Ig de Sp35, la región básica de Sp35, un dominio transmembranal de Sp35, y un dominio citoplásmico de Sp35. 12. El método 'de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque el polipéptido de Sp35 soluble comprende un fragmento polipeptidico seleccionado del grupo que consiste de: (i) los aminoácidos 1 al 33 de la SEQ ID NO: 2; (ii) los aminoácidos 1 al 35 de la SEQ ID NO: 2 ; (iii) los aminoácidos 34 al 64 de la SEQ ID NO: 2; (iv) los aminoácidos 36 al 64 de la SEQ ID NO: 2; (V) los aminoácidos 66 al 89 de la SEQ ID NO: 2; (Vi) los aminoácidos 90 al 113 de la SEQ ID NO: 2; (vii) los aminoácidos 114 al 137 de la SEQ ID NO: 2 ; (viii) los aminoácidos 138 al 161 de la SEQ ID NO: 2; (ix) los aminoácidos 162 al 185 de la SEQ ID NO: 2 ; (X) los aminoácidos 186 al 209 de la SEQ ID NO: 2; (Xi) los aminoácidos 210 al 233 de la SEQ ID NO: 2; (xii) los aminoácidos 234 al 257 de la SEQ ID NO.2; (xiii) los aminoácidos 258 al 281 de la SEQ ID NO: 2 ; (xiv) los aminoácidos 282 al 305 de la SEQ ID NO: 2 ; (XV) los aminoácidos 306 al 329 de la SEQ ID NO: 2; (xvi) los aminoácidos 330 al 353 de la SEQ ID NO: 2; (xvii) los aminoácidos 363 al 416 de la SEQ ID NO: 2; (xviii) los aminoácidos 417 al 424 de la SEQ ID NO: 2: (xix) los aminoácidos 419 al 493 de la SEQ ID NO: 2;
  6. (XX) los aminoácidos 494 al 551 de la SEQ ID NO 2, (xxi ) los aminoácidos 1 al 64 de la 3EQ ID NO: 2; (xxii ) los aminoácidos 1 al 89 de la 3EQ ID NO : 2; (xxiii) los aminoácidos 1 al 113 de la SEQ ID NO. 2; (xxiv) los aminoácidos 1 al 137 de la SEQ ID NO: 2; (xxv) los aminoácidos 1 al 161 de la SEQ ID NO: 2; (xxvi) los aminoácidos 1 al 185 de la SEQ ID NO: 2; (xxvii ) los aminoácidos 1 al 209 de la SEQ ID NO: 2; (xxviii) los aminoácidos 1 al 233 de la SEQ ID NO: 2; (xxix) los aminoácidos 1 al 257 de la SEQ ID NO: 2; (xxxx) los aminoácidos 1 al 281 de la SEQ ID NO: 2; (xxxxi) los aminoácidos 1 al 305 de la SEQ ID NO: 2; (xxxxii ) los aminoácidos 1 al 329 de la SEQ ID NO. 2; (xxxxiii ) los aminoácidos 1 al 353 de la SEQ ID NO. 2; (xxxxiv) los aminoácidos 1 al 416 de la SEQ ID N02; (xxxxv) los aminoácidos 1 al 424 de la SEQ ID NO: 2; (xxxxvi) .los aminoácidos 1 al 493 de la SEQ ID NO: 2; (xxxxvii ) los aminoácidos 1 al 551 de la SEQ ID NO: 2; xxxxviii) los aminoácidos 1 al 531 de la SEQ ID iL) los aminoácidos 1 al 532 de la SEQ ID NO: 2; Li) los aminoácidos 34 al 89 de la SEQ ID NO: 2; Lii) los aminoácidos 34toll3ofSEQ1DNO : 2; Liii) los aminoácidos 34tol37 de la SEQ ID NO: 2
  7. Liv) los aminoácidos 34tol61 de la SEQ ID NO: 2
  8. Lv) los aminoácidos 34 al 185 de la SEQ ID NO: 2;
  9. (Lvi) los aminoácidos 34 al 209 de la SEQ ID NO.2;
  10. (Lvii) los aminoácidos 34 al 233 de la SEQ ID NO : 2;
  11. (Lviii ) los aminoácidos 34 al 257 de la SEQ ID NO: 2;
  12. (Lix) los aminoácidos 34 al 281 de la SEQ ID NO: 2;
  13. (Lx) los aminoácidos 34 a] 305 de la SEQ ID NO: 2 ; (Lxi) los aminoácidos 34 al 329 de la SEQ ID NO: 2;
  14. (Lxii) los aminoácidos 34 al 353 de la SEQ ID NO: 2;
  15. (Lxiii) los aminoácidos 34 al 416 de la SEQ ID NO: 2;
  16. (Lxiv) los aminoácidos 34 al 424 de la SEQ ID NO. 2;
  17. (Lxv) los aminoácidos 34 al 493 de la SEQ ID NO: 2;
  18. (Lxvi) los aminoácidos 34 al 551 de la SEQ ID NO: 2
  19. (Lxxi ) los aminoácidos 34 al 530 de la SEQ ID NO: 2;
  20. (Lxxii) los aminoácidos 34 al 531 de la SEQ ID NO: 2;
  21. (Lxxiii ) los aminoácidos 34 al 532 de la SEQ ID NO: 2;
  22. (Lxxiv) los aminoácidos 34 al 533 de la SEQ ID NO: 2;
  23. (Lxxv) los aminoácidos 34 al 534 de la SEQ ID NO: 2;
  24. (Lxxvi ) los aminoácidos 34 al 535 de la SEQ ID NO: 2;
  25. (Lxxvii) los aminoácidos 34 al 536 de la SEQ ID NO: 2;
  26. (Lxxviii ) los aminoácidos 34 al 537 de la SEQ ID NO: 2;
  27. (Lxxix) los aminoácidos 34 al 538 de la SEQ ID NO. 2;
  28. (Lxxx) los aminoácidos 34 al 539 de la SEQ ID NO. 2;
  29. (Lxxxi ) los aminoácidos 30 al 532 de la SEQ DD NO. 2;
  30. (Lxxxii) los aminoácidos 3 1 al 532 de la SEQ ID NO: 2
  31. (Lxxxiii ) los aminoácidos 32 al 532 de la SEQ ID NO: 2;
  32. (Lxxxiv) los aminoácidos 33 al 532 de la SEQ ID NO: 2;
  33. (Lxxxv) los aminoácidos 34 al 532 de la SEQ ID NO: 2; (Lxxxvi) los aminoácidos 35 al 532 de la SEQ ID NO: 2 ; (Lxxxvii) los aminoácidos 36to.532 de la SEQ ID NO: 2 ; (Lxxxviii) los aminoácidos 30 al 531 de la SEQ ID NO: 2 ; (Lxxxix) los aminoácidos 31 al 531 de la SEQ ID NO: 2; (Lxxxx) los aminoácidos 32 al 531 de la SEQ ID NO: 2 ; (Lxxxxi) los aminoácidos 33 al 531 de la SEQ ID NO: 2; (Lxxxxii) los aminoácidos 34 al 531 de la SEQ ID NO: 2; (Lxxxxiii) los aminoácidos 35 al 531 de la SEQ ID NO: 2; (Lxxxxiv) los aminoácidos 36 al 531 de la SEQ ID NO: 2 (Lxxxxv) los aminoácidos 36 al 89 de la SEQ ID NO: 2; (Lxxxxvi) los aminoácidos 36,. al 113 de la SEQ ID NO: 2 ; (Lxxxxvii) los aminoácidos 36 al 137 de la SEQ ID NO: 2 ;
  34. (Lxxxxviii) los aminoácidos 36tol61 de la SEQ ID NO: 2 ; (Lxxxxvc) los aminoácidos 36tol85 de la SEQ ID NO: 2; (c) los aminoácidos 36 al 209 de la SEQ ID NO: 2; (ci) los aminoácidos 36 al 233 de la SEQ ID NO.2; (cii) los aminoácidos 36 al 257 de la SEQ ID NO: 2; (ciii) los aminoácidos 36 al 281 de la SEQ ID NO: 2; (civ) los aminoácidos 36 al 305 de la SEQ ID NO: 2; (CV) los aminoácidos 36 al 329 de la SEQ E) NO: 2 ; (cvi) los aminoácidos 36 al 353 de la SEQ ID N02; (cvii) los aminoácidos 36 al 416 de la SEQ ID NO: 2; (cviii) los aminoácidos 36 al 424 de la SEQ ID NO: 2; (cix) los aminoácidos 36 al 493 de la SEQ ID NO: 2; ex) los aminoácidos 36 al 551 de la SEQ ID NO: 2 exi ) los aminoácidos 36 al 530 de la SEQ ID NO: 2; exii ) los aminoácidos 36 al 531 de la SEQ ID NO: 2; cxiii ) los aminoácidos 36 al 532 de la SEQ ID N02; exiv) los aminoácidos 36 al 533 de la SEQ ID NO. 2; exv) los aminoácidos 36 al 534 de la SEQ ID NO: 2; exvi) los aminoácidos 36 al 535 de la SEQ ID NO: 2; exvii ) los aminoácidos 36 al 536 de la SEQ ID NO: 2; cxviii ) los aminoácidos 36 al 537 de la SEQ ID NO: 2; exix) los aminoácidos 36 al 538 de la SEQ ID NO: 2; cxx) los aminoácidos 36 al 539 de la SEQ ID NO: 2; cxxi ) variantes o derivados de cualquiera de fragmentos polipeptidicos anteriores, y (cxxii) una combinación de al menos dos de cualquiera de los fragmentos polipeptidicos o variantes o derivados de los mismos . 13. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el polipéptido de Sp35 soluble comprende los residuos de aminoácidos 34-532 de la SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos 36-532 de la SEQ ID NO: 2. 14. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6-13, caracterizado porque el polipéptido de Sp35 soluble comprende un dominio de Ig de Sp35 o fragmento, variante o derivado del mismo. 15. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el polipéptido de Sp35 soluble comprende los aminoácidos 417-493 de la SEQ ID NO: 2. 16. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 15, caracterizado porque el polipéptido de Sp35 soluble comprende además una porción no-Sp35. 17. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque la porción no-Sp35 es un polipéptido fusionado al polipéptido de Sp35 soluble. 18. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque la porción no-Sp35 se selecciona del grupo que consiste de una porción de anticuerpo Ig, una porción de albúmina sérica, una porción de dirección al objetivo, una porción reportera, y una porción de facilitamiento de la purificación. 19. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque la porción no-Sp35 es una porción de anticuerpo Ig. 20. El método de conformidad con la reivindicación 19, . caracterizado porque la porción de anticuerpo Ig es una porción de bisagra y Fe. 21. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el polipéptido de Sp35 soluble es conjugado a un polímero. 22. El método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque el polímero se selecciona del grupo que consiste de un polialquilenglicol , un polímero de azúcar, y Un polipéptido. 23. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el polímero es un polialquilenglicol. 24. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque el polialquilenglicol es polietilenglicol (PEG) . 25. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque el polipéptido de Sp35 soluble es conjugado a 1, 2, 3 ó 4 polímeros. 26. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el peso molecular total de los polímeros es de 5,000 Da a 100,000 Da. 27. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque el antagonista de Sp35 comprende un anticuerpo para Sp35, o el fragmento del mismo. 28. El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque el anticuerpo para Sp35 o fragmento del mismo se enlaza específicamente a un epitopo que consiste esencialmente de un fragmento polipeptídico seleccionado del grupo que consiste de (i) los aminoácidos 66 al 89 de la SEQ ID NO: 2; (ii) los aminoácidos 66 al 113 de la SEQ ID NO: 2; (iii) los aminoácidos 66 al 137 de la SEQ ID NO: 2; (iv) los aminoácidos 90 al 113 de la SEQ ID NO: 2; (v) los aminoácidos 114 al 137 de la SEQ ID NO.2; (Vi) los aminoácidos 138 al 161 de la SEQ ID NO: 2 ; (vii) los aminoácidos 162 al 185 de la SEQ ID NO: 2; (viii) los aminoácidos 186 al 209 de la SEQ ID NO: 2 ; (ix) los aminoácidos 210 al 233 de la SEQ ID NO: 2; (x) los aminoácidos 234 al 257 de la SEQ ID NO: 2 ; (xi) los aminoácidos 258 al 281 de la SEQ ID NO: 2 ; (xii) los aminoácidos 282 al 305 de la SEQ ID NO: 2 ; (xiii) los aminoácidos 306 al 329 de la SEQ ID NO: 2 ; (xiv) los aminoácidos 330 al 353 de la SEQ ID NO: 2; (xv) los aminoácidos 34 al 64 de la SEQ ID NO.2; (xvi) los aminoácidos 363 al 416 de la SEQ ID NO: 2 ; (xvii) variantes o derivados de cualquiera de los fragmentos polipeptidicos, y (xvii) una combinación de dos o más de cualquiera de los fragmentos polipeptidicos o variantes o derivados de los mismos . 29. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 al 5, caracterizado porque el antagonista de Sp35 comprende un polinucleótido antagonista de Sp35. 30. El método de - conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque el polinucleótido antagonista de Sp35 se selecciona del grupo que consiste de: (i) un polinucleótido antisentido; (ii) una ribozima; (iii) un ARN de interferencia pequeño (ARNsi) ; y (iv) un ARN de horquilla pequeño (ARNsh) . 31. El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque el polinucleótido antagonista de Sp35 es un polinucleótido antisentido que comprende al menos 10 bases complementarias a la porción de codificación del ARNM de Sp35. 32. El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque el polinucleótido antagonista de Sp35 es una ribozima. 33. El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque el polinucleótido antagonista de Sp35 es un ARNsi. 34. El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque el polinucleótido antagonista de Sp35 es un ARNsh.
  35. 35. El método de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque el ARNsh comprende la secuencia nucleotidica : UGAUCGUCAU CCUGCUAGAC UUCAAGAGAG UCUAGCAGGA UGACGAUCUU UUUUC (SEQ ID NO: 13) .
  36. 36. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 35, caracterizado porque el antagonista de Sp35 es administrado mediante inyección de bolo o infusión crónica .
  37. 37. El método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque el antagonista de Sp35 es administrado directamente al sistema nervioso central.
  38. 38. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 37, caracterizado porque comprende (a) introducir dentro de las neuronas dopaminérgicas un polinucleótido que codifica para el antagonista de Sp35, a través de enlace operable a una secuencia de control de expresión, y (b) permitir la expresión del antagonista de Sp35.
  39. 39. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 37 ó 38, caracterizado porque el polinucleótido es introducido dentro de las neuronas dopaminérgicas mediante un método seleccionado del grupo que consiste de: (a) transíección; (b) electroporación; (c) transducción; y (d) microinyección directa.
  40. 40. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 37, caracterizado porque comprende (a) administrarle al mamífero un polinucleótido que codifica para el antagonista de Sp35 a través de enlace operable a una secuencia de control de expresión, y (b) permitir la expresión del antagonista de Sp35.
  41. 41. El método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque el polinucleótido es administrado en una célula hospedera cultivada capaz de expresar el polinucleótido .
  42. 42. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 38 a 41, caracterizado porque el polinucleótido es administrado como un vector de expresión.
  43. 43. El método de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado porque el vector de expresión es un vector viral .
  44. 44. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 38 a 41, caracterizado porque el polinucleótido es introducido dentro del mamífero en o cerca del sitio de la enfermedad, trastorno, o daño del sistema nervioso .
  45. 45. El método de conformidad con la reivindicación 41, caracterizado porque la célula hospedera cultivada es ' elaborada mediante un método que comprende (a) la transformación o la transfección de una célula hospedera recipiente con el polinucleótido de conformidad con la reivindicación 40 o el vector de conformidad con la reivindicación 42 o 43, y (b) el cultivo de la célula hospedera transformada o transfectada.
  46. 46. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 41 a 45, caracterizado porque la célula hospedera es derivada del mamífero que va a ser tratado.
  47. 47. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 46, caracterizado porque el antagonista de Sp35 es expresado en una cantidad suficiente para reducir la inhibición de la regeneración, crecimiento o supervivencia de las neuronas dopaminérgicas en o cerca del sitio de la enfermedad, trastorno o daño al sistema nervioso.
  48. 48. El método de conformidad con la reivindicación 43,· caracterizado porque el vector viral se selecciona del grupo que consiste de un vector adenov<¿ral, un vector alfavirus, un vector de enterovirus, un vector de pestivirus, un vector de lentivirus, un vector de baculovirus, un vector de herpesvirus, un vector de papovavirus, un vector de parvovirus y un vector de poxvirus.
  49. 49. El método de conformidad con la reivindicación 48, caracterizado porque el vector de herpesvirus se selecciona del grupo que consiste de un vector del virus del herpes simple y un vector del virus de Epstein Barr.
  50. 50. El método de conformidad con la reivindicación 48, caracterizado porque el vector de poxvirus es un vector de virus de la vaccinia.
  51. 51. El método de conformidad con la reivindicación 48, caracterizado porque el vector de lentivirus es pLL3.7.
  52. 52. El método de conformidad con la reivindicación 48, caracterizado porque el parvovirus es un virus adeno-asociado (AAV) .
  53. 53. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 43, o 48 a 52, caracterizado porque el vector es administrado mediante una ruta seleccionada del grupo que consiste de administración tópica, administración intraocular, administración parenteral, administración intratecal, administración subdural y administración subcutánea.
  54. 54. Un método para inhibir la interacción de EGFR y Sp35 en neuronas dopaminérgicas , caracterizado porque comprende poner en contacto las neuronas dopaminérgicas con una cantidad efectiva de una composición que comprende un antagonista de Sp35 seleccionada del grupo que consiste de: (i) un polipéptido de Sp35 soluble Sp35; (ii) un anticuerpo para Sp35 o el fragmento del mismo; (iii) un polinucleotido del antagonista de Sp35; (iv) un aptámero del antagonista de Sp35; y (v) una combinación de dos o más de los antagonistas de Sp35.
  55. 55. Un método para incrementar la fosforilación de Akt en neuronas dopaminérgicas, caracterizado porque comprende poner en contacto las neuronas dopaminérgicas con una cantidad efectiva de una composición que comprende un antagonista de Sp35 seleccionada del grupo que consiste de: (i) un polipéptido de Sp35 soluble Sp35; (ii) un anticuerpo para Sp35 o el fragmento del mismo; (iii) un polinucleótido del antagonista de Sp35; (iv) un aptámero del antagonista de Sp35; y (v) una combinación de dos o más de los antagonistas de Sp35.
  56. 56. Un método para incrementar la expresión de EGFR en una neurona dopaminérgica , caracterizado porque comprende poner en contacto las neuronas dopaminérgicas con una cantidad efectiva de una composición que comprende un antagonista de Sp35 seleccionada del grupo que consiste de: (i) un polipéptido de Sp35 soluble Sp35; (ii) un anticuerpo para Sp35 o el fragmento del mismo; (iii) un polinucleótido del antagonista de Sp35; (iv) un aptámero del antagonista de Sp35; y (v) una combinación de dos o más de los antagonistas de Sp35.
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