LU92807B1

LU92807B1 - Illumination arrangement for a light-sheet microscope

Info

Publication number: LU92807B1
Application number: LU92807A
Authority: LU
Inventors: Joachim Bradl; Florian Fahrbach; Werner Knebel
Original assignee: Leica Microsystems
Priority date: 2015-08-27
Filing date: 2015-08-27
Publication date: 2017-03-01

Abstract

Die Erfindung betrifft eine Beleuchtungsanordnung für ein Lichtblatt-Mikroskop, bei dem eine Probe mit einem Beleuchtungslichtbündel (8) beleuchtet wird, das im Bereich der Probe als Lichtblatt (11) ausgebildet ist, mit einem Beleuchtungsobjektiv (4), einer Tubuslinse (3) und einer astigmatischen Optik (7). Die Beleuchtungsanordnung zeichnet sich dadurch aus, dass die astigmatische Optik (7) zwischen der Tubuslinse (3) und dem Beleuchtungsobjektiv (4) angeordnet ist und/oder keine weiteren fokussierenden oder defokussierenden Elemente zwischen der astigmatischen Optik (7) und dem Beleuchtungsobjektiv (4) angeordnet sind. Alternativ kann auch vorgesehen sein, dass die astigmatische Optik Teil des Beleuchtungsobjektivs (4) ist. Darüber hinaus betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Beleuchten einer Probe mittels einer solchen Beleuchtungsanordnung, sowie ein Mikroskop, das eine solche Beleuchtungsanordnung beinhaltet. (Fig. 1)The invention relates to a lighting arrangement for a light-sheet microscope, in which a sample is illuminated with an illumination light beam (8), which is formed in the region of the sample as a light sheet (11) with an illumination objective (4), a tube lens (3) and an astigmatic optic (7). The illumination arrangement is characterized in that the astigmatic optic (7) is arranged between the tube lens (3) and the illumination objective (4) and / or no further focusing or defocusing elements between the astigmatic optic (7) and the illumination objective (4). are arranged. Alternatively, it can also be provided that the astigmatic optics is part of the illumination objective (4). Moreover, the invention relates to a method for illuminating a sample by means of such a lighting arrangement, as well as a microscope, which includes such a lighting arrangement. (Fig. 1)

Description

Beschreibungdescription

Titel: Beleuchtungsanordnung für ein Lichtblatt-MikroskopTitle: Lighting arrangement for a light-sheet microscope

Die Erfindung betrifft eine Beleuchtungsanordnung für ein Lichtblatt-Mikroskop, bei dem eine Probe mit einem Beleuchtungslichtbündel beleuchtet wird, das im Bereich der Probe als Lichtblatt ausgebildet ist, mit einem Beleuchtungsobjektiv, einer Tubuslinse und einer astigmatischen Optik.The invention relates to a lighting arrangement for a light-sheet microscope, in which a sample is illuminated with an illumination light beam, which is formed in the region of the sample as a light sheet, with an illumination objective, a tube lens and an astigmatic optics.

Die Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zum Beleuchten einer Probe, insbesondere unter Verwendung einer solchen Beleuchtungsanordnung.The invention also relates to a method for illuminating a sample, in particular using such a lighting arrangement.

Die Erfindung betrifft darüber hinaus ein Mikroskop, das eine solche Beleuchtungsanordnung beinhaltet und ein Verfahren zum Untersuchen einer Probe mittels eines solchen Mikroskops.The invention further relates to a microscope incorporating such a lighting arrangement and to a method of inspecting a sample by means of such a microscope.

Die SPIM-Technik (Single Plane Illumination Microscopy), bei der eine schichtweise Beleuchtung der Probe erfolgt, erlaubt eine schnellere und probenschonendere Erfassung von Bilddaten, als beispielsweise bei einer punktweisen Abtastung einer Probe. Ein bekanntes Einsatzgebiet der SPIM-Technologie ist der Bereich der Fluoreszenz-Mikroskopie, wobei Fluorophore in der Probe mit Laserlicht angeregt werden. Bei der SPIM-Technologie findet hierbei eine Anregung nur in einer von einem Beleuchtungslichtblatt (auch „Lichtstreifen“ genannt) beleuchteten Objektregion statt. Eine Schädigung der Probe durch Beleuchtungslicht in anderen Ebenen ist hierdurch vermieden. Üblicherweise werden in einer Richtung senkrecht dazu ein oder mehrere zweidimensionale Bilder aufgenommen.The Single Plane Illumination Microscopy (SPIM) technique, which provides layer-by-layer illumination of the sample, allows for faster and more accurate acquisition of image data than, for example, point sampling of a sample. A well-known field of application of the SPIM technology is the field of fluorescence microscopy, wherein fluorophores are excited in the sample with laser light. In the case of SPIM technology, excitation only takes place in an object region illuminated by an illumination light sheet (also called "light strip"). Damage to the sample by illumination light in other planes is thereby avoided. Usually one or more two-dimensional images are taken in a direction perpendicular thereto.

Eine nach dem SPIM-Verfahren arbeitende optische Vorrichtung ist in DE 102 57 423 Al beschrieben. Bei diesem Mikroskop wird eine Probe mit einem dünnen Lichtblatt beleuchtet, während die Beobachtung aus einer zu der Ebene des beleuchtenden Lichtblattes senkrechten Richtung erfolgt. Hierbei erfolgen die Beleuchtung und die Detektion über zwei separate optische Strahlengänge mit jeweils separater Optik. Das Lichtblatt wird von einer Zylinderlinse erzeugt. Für die Bildaufnahme wird die Probe durch das bezüglich des Detektors feststehende Lichtblatt bewegt, um schichtweise Fluoreszenz- und/oder Streulicht mit einem flächigen Detektor aufzunehmen. Die so gewonnenen Schichtbilddaten lassen sich anschließend zu einem aus einer dreidimensionalen Abbildung der Probe entsprechenden Datensatz zusammensetzen.An optical device operating according to the SPIM method is described in DE 102 57 423 A1. In this microscope, a sample is illuminated with a thin light sheet, while the observation is made from a direction perpendicular to the plane of the illuminating light sheet direction. Here, the illumination and the detection via two separate optical beam paths, each with a separate optics. The light sheet is generated by a cylindrical lens. For image acquisition, the sample is moved through the fixed relative to the detector light sheet to record in layers fluorescence and / or scattered light with a flat detector. The slice image data thus obtained can then be combined to form a data record which corresponds to a three-dimensional image of the sample.

Die Erzeugung eines Lichtblattes ausschließlich mit einer Zylinderlinse hat den Nachteil, dass die optische Qualität des Lichtblattes mit üblicherweise erhältlichen Linsen nicht ausreichend hoch ist, um über einen breiten räumlichen und spektralen Bereich ein beugungsbegrenztes Lichtblatt zu erzeugen. Selbst mit achromatischen Zylinderlinsen ist es nicht möglich, ein beugungsbegrenztes Lichtblatt mit einer Dicke von wenigen pm zu erzeugen.The creation of a light sheet exclusively with a cylindrical lens has the disadvantage that the optical quality of the light sheet with commonly available lenses is not sufficiently high to produce a diffraction-limited light sheet over a wide spatial and spectral range. Even with achromatic cylindrical lenses, it is not possible to produce a diffraction-limited light sheet with a thickness of a few pm.

Aus DE 10 2007 015 063 Al ist eine optische Anordnung mit einer Lichtquelle zum Abstrahlen eines Lichtbündels und mit optischen Elementen zur Umwandlung dieses Lichtbündels in die Form eines Lichtblattes bekannt. Die optische Anordnung ist insbesondere geeignet zur Beleuchtung einzelner Ebenen einer dreidimensionalen Probe bei der Selective Plane Illumination Microscopy (SPIM). Es sind Mittel zur Variation des Querschnittes des Lichtblattes, zur Variation der Länge des Lichtblattes und/oder zur Beeinflussung der Richtung, der innerhalb des Lichtblattes verlaufenden Strahlungsanteile vorhanden, um die Geometrie des Lichtblattes an die Beleuchtungserfordernisse bei der Beobachtung ein und derselben Probenebene mit mehreren verschiedenartigen Objektiven zu ermöglichen.From DE 10 2007 015 063 Al an optical arrangement with a light source for emitting a light beam and with optical elements for converting this light beam into the shape of a light sheet is known. The optical arrangement is particularly suitable for illuminating individual planes of a three-dimensional sample in the case of selective plane illumination microscopy (SPIM). Means are provided for varying the cross section of the light sheet, varying the length of the light sheet, and / or affecting the direction of radiation spreads within the light sheet to match the geometry of the light sheet to the lighting requirements in observing one and the same sample plane with a plurality of different ones To enable lenses.

Aus der Dissertation von W. Krieger, „Mapping Diffusion Properties in Living Cells“, Heidelberg, 2014, ist eine andere Anordnung zur Erzeugung eines Lichtblattes bekannt. Bei dieser Anordnung ist eine Zylinderlinse genau im Abstand ihrer Brennweite vor der Pupille des Beleuchtungsobjektivs angeordnet. In nachteiliger Weise ist die Breite des Lichtblatts wegen der Abhängigkeit der Breite des Lichtblatts von der Brennweite der an der fest vorgegebenen Position montierten Zylinderlinse kein freier Parameter mehr. Wird die Brennweite der Zylinderlinse so gewählt, dass sie dem Abstand der Position der Zylinderlinse zur Pupille des Beleuchtungsobjektivs entspricht, so ist die Breite des Lichtblatts wls schon festgelegt durch wls = M-wcl, wobei wcl die Breite des kollimierten Beleuchtungslichtbündels an der Position der CL ist und M=fßo/fcL der Quotient der Brennweiten von Zylinderlinse und Beleuchtungsobjektiv ist. Da üblicherweise wcl, feo/fcL vorgegeben sind, hat man also keinen freien Parameter mehr zur Variation der Breite des Lichtblatts wls.From the dissertation by W. Krieger, "Mapping Diffusion Properties in Living Cells", Heidelberg, 2014, another arrangement for generating a light sheet is known. In this arrangement, a cylindrical lens is arranged exactly at the distance of its focal length in front of the pupil of the illumination objective. Disadvantageously, the width of the sheet of light is no longer a free parameter because of the dependence of the width of the sheet of light on the focal length of the cylindrical lens mounted at the fixed position. If the focal length of the cylindrical lens is chosen to correspond to the distance of the position of the cylindrical lens to the pupil of the illumination objective, the width of the light sheet wls is already defined by wls = M-wcl, where wcl is the width of the collimated illumination light beam at the position of CL and M = fβo / fcL is the quotient of the focal lengths of the cylindrical lens and the illumination objective. Since wcl, feo / fcL are usually given, one no longer has a free parameter for varying the width of the sheet of light wls.

Es ist daher die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine kompakt ausbildbareIt is therefore the object of the present invention to provide a compact formable

Beleuchtungsanordnung anzugeben, die die flexible Erzeugung eines beugungsbegrenzten Lichtblattes ermöglicht.Specify lighting arrangement that allows the flexible generation of a diffraction-limited light sheet.

Die Aufgabe wird durch eine Beleuchtungsanordnung der eingangs genannten Art gelöst, die dadurch gekennzeichnet ist, dass die astigmatische Optik derart ausgebildet und derart zwischen der Tubuslinse und dem Beleuchtungsobjektiv angeordnet ist, dass das aus dem Beleuchtungsobjektiv austretende Beleuchtungslichtbündel sowohl in einer Sagittalebene, als auch in einer Meridionalebene fokussiert ist.The object is achieved by a lighting arrangement of the type mentioned above, which is characterized in that the astigmatic optics formed in such a way and between the tube lens and the illumination objective that the light emerging from the illumination objective illuminating light beam both in a sagittal plane, as well as in a Meridionalebene is focused.

Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ein flexibel an die jeweiligen Erfordernisse anpassbares Verfahren zum Beleuchten einer mikroskopischen Probe mit einem Lichtblatt anzugeben.It is another object of the present invention to provide a method adaptable to the particular requirements for illuminating a microscopic sample with a light sheet.

Die weitere Aufgabe wird durch ein Verfahren gelöst, das dadurch gekennzeichnet ist, dass eine astigmatische Optik an einer beliebigen Stelle zwischen einer Tubuslinse und einem Beleuchtungsobjektiv derart angeordnet wird, dass das von dem Beleuchtungsobjektiv fokussierte Beleuchtungslichtbündel einen sagittalen und einen meridionalen Fokus aufweist, die von dem Beleuchtungsobjektiv einen unterschiedlichen Axialabstand aufweisen.The further object is achieved by a method, which is characterized in that an astigmatic optics is arranged at any point between a tube lens and an illumination objective such that the illuminating light bundle focused by the illumination objective has a sagittal and a meridional focus, which differs from that of FIG Illumination lens have a different axial distance.

Die erfindungsgemäße Beleuchtungsanordnung hat, was weiter unten noch im Detail erläutert wird, den Vorteil eines äußerst kompakten Aufbaus, der es ermöglicht, bei der Realisierung eines Mikroskops Standard-Mikroskopstative verwenden zu können. Darüber hinaus besteht nach einem eigenständigen Erfindungsgedanken der ganz besondere Vorteil, dass Beleuchtungsobjektive so angefertigt werden können, dass sie in rechtwinkliger Anordnung auch zusammen mit Detektionsobjektiven hohe numerische Apertur verwendbar sind.The lighting arrangement according to the invention has, as will be explained in more detail below, the advantage of an extremely compact construction, which makes it possible to use in the realization of a microscope standard microscope stands. In addition, according to an independent idea of the invention has the very special advantage that illumination lenses can be made so that they can be used in a right angle arrangement together with detection lenses high numerical aperture.

In erfindungsgemäßer Weise wurde insbesondere erkannt, dass die bisherigen Ansätze ein Lichtblatt zu erzeugen unter anderem deshalb wenig flexibel sind, weil stets ein Lichtblatt erzeugt wird, dass in einer Ebene entlang der Ausbreitungsrichtung fokussiert ist und dass in der dazu senkrechten Ebene kollimiert ist, also keinen Fokus aufweist. Betrachtet man diese Tatsache auf der Basis der geometrischen Optik, so bedeutet dies, dass in einer Ebene ein Fokus vorliegt, während in der senkrechten Ebene kein Fokus vorhanden ist, was die Figuren 12 bis 15 illustrieren. Natürlich gibt es ein ideal kollimiertes Lichtbündel nur in der geometrischen Optik und nicht in der Realität. Tatsächlich ist die Abweichung zwischen geometrischer Optik und Gaussoptik in Relation zur Größe des Lichtblattes für die vorliegende Betrachtung nicht von Relevanz. Im Sinne dieses Dokuments ist unter einem Lichtblatt insbesondere der Teil einer Lichtverteilung zu verstehen, welcher durch das Beleuchtungslichtbündel auf der Seite der Objektebene des Beleuchtungsobjektivs in einem Abschnitt entlang der B eleuchtungsachse gebildet ist und welcher eine Ausdehnung der Lichtverteilung bzw. des Lichtbündels senkrecht zur optischen Achse des Beleuchtungsobjektivs aufweist, die kleiner als ein vorgebbarer Faktor bezogen auf die dünnste Stelle der Lichtverteilung ist, wobei der vorgebbare Faktor typischerweise Wurzel 2 beträgt. Das Lichtblatt kann im Wesentlichen rechteckförmig - wie dies beispielsweise in Figur 14 angedeutet ist - oder aber bevorzugt trapezförmig ausgebildet sein, wie dies beispielsweise in den Figuren 1,3, 5, 7 oder 8 angedeutet ist.In accordance with the invention, it has been recognized, in particular, that the previous approaches of producing a light sheet are, among other things, less flexible because a light sheet is always produced that is focused in one plane along the direction of propagation and that is collimated in the plane perpendicular thereto, ie, none Focus has. Considering this fact on the basis of geometric optics, this means that there is a focus in one plane, while in the vertical plane there is no focus, as illustrated in FIGS. 12 to 15. Of course, there is an ideal collimated light beam only in the geometric optics and not in reality. In fact, the deviation between geometric optics and Gaussian optics in relation to the size of the light sheet is not relevant for the present consideration. For the purposes of this document, a light sheet is to be understood in particular as the part of a light distribution which is formed by the illumination light beam on the side of the object plane of the illumination objective in a section along the illumination axis and which extends the light distribution or the light bundle perpendicular to the optical axis of the illumination objective, which is smaller than a predeterminable factor with respect to the thinnest point of the light distribution, wherein the predeterminable factor is typically root 2. The light sheet may be substantially rectangular in shape - as indicated for example in Figure 14 - or preferably be formed trapezoidal, as is indicated for example in Figures 1,3, 5, 7 or 8.

Bei einer besonders vorteilhaften Ausführung wird der Abstand der astigmatischen Optik und deren Brennweite so gewählt, dass der Fokus des von der astigmatischen Optik fokussierten Beleuchtungslichtbündels nicht innerhalb des Beleuchtungsobjektivs liegt, da dies bei hohen Intensitäten zur Zerstörung des Beleuchtungsobjektivs führen könnte, insbesondere wenn der Fokus an Grenzflächen innerhalb des Objektivs liegt. Außerdem ist die optische Qualität für eine solche Abbildung sehr schlecht und es können diverse Fehler auftreten, wie z.B. Farbfehler.In a particularly advantageous embodiment, the distance of the astigmatic optics and their focal length is chosen such that the focus of the focused by the astigmatic optic illumination light beam is not within the illumination lens, as this could lead to destruction of the illumination lens at high intensities, especially if the focus Interfaces lies within the lens. In addition, the optical quality for such a picture is very poor and various errors can occur such as e.g. Chromatic aberrations.

Außerdem wird der Abstand der astigmatischen Optik und deren Brennweite vorzugsweise so gewählt, dass der Fokus nicht weit vor dem Beleuchtungsobjektiv liegt, weil sonst das divergente Strahlbündel in das Objektiv eintritt, was zu störenden Reflexen an inneren Aperturen im Beleuchtungsobjektivs und/oder zu Vignettierungseffekten führen kann.In addition, the distance of the astigmatic optics and their focal length is preferably chosen so that the focus is not far in front of the illumination lens, otherwise the divergent beam enters the lens, which can lead to disturbing reflections on internal apertures in the illumination lens and / or vignetting effects ,

Besonders flexibel einsetzbar ist eine Ausführung, bei der die Brennweite der astigmatischen Optik vom Abstand der astigmatischen Optik zu der Pupille des Beleuchtungsobjektivs verschieden ist.Particularly flexible is an embodiment in which the focal length of the astigmatic optics is different from the distance of the astigmatic optics to the pupil of the illumination objective.

Bei einer besonders einfach aufgebauten und dennoch sehr flexiblen Ausführung sind keine weiteren fokussierenden oder defokussierenden Elemente zwischen der astigmatischen Optik und dem Beleuchtungsobjektiv angeordnet. Alternativ oder zusätzlich könnte die astigmatische Optik um eine Achse - zumindest um einen vorgebbaren Winkelbereich - verdrehbar angeordnet sein, und zwar insbesondere manuell oder motorisch bewegt. Die Drehachse könnte hierbei die optische Achse des optischen Strahlengangs der Beleuchtungsvorrichtung oder parallel versetzt dazu sein. Hierdurch kann die Ausrichtung des Lichtblatts beeinflusst werden, wobei beispielsweise ein beleuchteter Probenbereich relativ zur Objektebene des Detektionsobjektivs ausgerichtet bzw. überlagert werden kann.In a particularly simply constructed, yet very flexible design, no further focusing or defocusing elements are arranged between the astigmatic optics and the illumination objective. Alternatively or additionally, the astigmatic optics could be arranged to be rotatable about an axis-at least by a predefinable angular range-and, in particular, moved manually or by motor means. The axis of rotation could in this case be the optical axis of the optical beam path of the illumination device or offset parallel thereto. As a result, the orientation of the light sheet can be influenced, wherein, for example, an illuminated sample area can be aligned or superimposed relative to the object plane of the detection lens.

Bei einer ganz besonders kompakten und robusten Ausführung ist die astigmatische Optik Teil des Beleuchtungsobjektivs, was weiter unten in weiteren Details erläutert ist.In a particularly compact and robust design, the astigmatic optics is part of the illumination objective, which is explained in more detail below.

In erfindungsgemäßer Weise wurde auch erkannt, dass die Verwendung eines geläufigen Mikroskopobjektivs in Kombination mit einer Zylinderlinse bei den aus dem Stand der Technik bekannten Beleuchtungsanordnungen wegen der üblicherweise verwendeten 4f-Anordnung den Nachteil eines insgesamt relativ langen optischen Wegs hat. Bei diesen Beleuchtungsanordnungen ist die 4f-Anordnung nötig, um die Dimensionen des Lichtblattes an die Größe des Bildfeldes anzupassen, was in den Figuren 12 und 13 dargestellt ist. Dies abgesehen davon, dass bei den dem Stand der Technik bekannten Beleuchtungsanordnungen lediglich in einer Ebene ein Fokus vorliegt, während in der dazu senkrechten Ebene der Fokus im Unendlichen liegt.In accordance with the invention it has also been recognized that the use of a common microscope objective in combination with a cylindrical lens in the illumination arrangements known from the prior art has the disadvantage of a relatively long optical path overall because of the commonly used 4f arrangement. In these lighting arrangements, the 4f arrangement is necessary in order to adapt the dimensions of the light sheet to the size of the image field, which is shown in FIGS. 12 and 13. Apart from the fact that in the known prior art lighting arrangements only in one plane, there is a focus, while in the plane perpendicular thereto, the focus is at infinity.

Konkret zeigen die Figuren 12 und 13 schematisch einen Aufbau, wie er beispielsweise aus Huisken, J„ Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J. & Stelzer, E. Η. K., „Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy“, Science 305, 1007 (2004), bekannt ist; in Figur 12 in einer Ansicht senkrecht auf die Lichtblattebene und in Figur 13 in einer Ansicht parallel zur Lichtblattebene. Ein solcher Aufbau beinhaltet eine Zylinderlinse 1, eine Relaylinse 2, eine Tubuslinse 3 sowie ein Beleuchtungsobjektiv 4, wobei ein aufgeweitetes, im Querschnitt rundes Lichtbündel 6 über eine 4f-Abbildung durch die Zylinderlinse 1 in eine konjugierte Ebene 5 der Eintrittspupille des Beleuchtungsobjektivs 4 fokussiert wird. Hierbei sind sehr kurze Brennweiten nötig, um große Bildfelder auszuleuchten, also beispielsweise um ein Lichtblatt 11 zu erzeugen, das 1 mm breit ist und eine Fokuslänge von 1 mm aufweist. Innerhalb des Lichtblattes 11 liegt vorzugsweise das Sichtfeld 23 der (hier nicht dargestellten) Detektionsoptik.Concretely, Figs. 12 and 13 schematically show a construction as described, for example, in Huisken, J "Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J. & Stelzer, E. Η. K., "Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy", Science 305, 1007 (2004); in a view perpendicular to the plane of the plane of the light and in FIG. 13 in a view parallel to the plane of the plane of the light. Such a structure includes a cylindrical lens 1, a relay lens 2, a tube lens 3 and an illumination objective 4, wherein a flared, circular in cross-section light beam 6 is focused via a 4f imaging through the cylindrical lens 1 in a conjugate plane 5 of the entrance pupil of the illumination lens 4 , In this case, very short focal lengths are necessary to illuminate large image fields, that is, for example, to produce a light sheet 11 which is 1 mm wide and has a focal length of 1 mm. Within the light sheet 11 is preferably the field of view 23 of the (not shown here) detection optics.

Dies liegt daran, dass sich die Breite wx des Lichtblattes aus dem Durchmesser wo des von der Lichtquelle emittierten Lichtbündels über die Formel wx = (fobj/ftub) (freiay/fcyi) wo ableiten lässt. Um eine gute Ausleuchtung wbfp = (ftub/freiay) wo der Eintrittspupille des Beleuchtungsobjektivs zu gewährleisten, muss ftub » freiay sein. Daraus folgt die Forderung fob] > fcyi um eine ausreichend Breite wx des Lichtblatts zu erreichen. Weiterhin kann es Fälle geben, in denen die Breite wx sehr viel größer sein soll als die Fokuslänge, beispielsweise wenn das Lichtblatt entlang der Beleuchtungsachse geschoben wird um eine große Probenebene sukzessive abzutasten. Auch in diesem Fall sind kurze Brennweiten der Zylinderlinse nötig.This is because the width wx of the light sheet can be derived from the diameter where of the light beam emitted from the light source via the formula wx = (fobj / ftub) (free / fcyi) where. In order to ensure a good illumination wbfp = (ftub / freiay) where the entrance pupil of the illumination objective, ftub »must be free. From this follows the requirement fob]> fcyi to achieve a sufficient width wx of the light sheet. Furthermore, there may be cases in which the width wx should be much larger than the focal length, for example, when the light sheet is pushed along the illumination axis in order to successively scan a large sample plane. Also in this case, short focal lengths of the cylindrical lens are necessary.

Analog weist auch die aus W. Krieger, „Mapping Diffusion Properties in Living Cells", Heidelberg, 2014, bekannte Anordnung diese Nachteile auf, wie die Figuren 14 und 15 illustrieren.Analogously, the arrangement known from W. Krieger, "Mapping Diffusion Properties in Living Cells", Heidelberg, 2014, has these disadvantages, as FIGS. 14 and 15 illustrate.

Eine weitere Einschränkung der aus dem Stand der Technik bekannten Anordnungen betrifft die Größe und polare Symmetrie der üblicherweise verwendeten Objektive. Diese Symmetrie steht im Gegensatz zu den sehr asymmetrischen Abmessungen des Lichtblatts, das im Querschnitt sehr elliptisch ausgebildet ist. Legt man für eine grobe Abschätzung in paraxialer Näherung die Propagationseigenschaften Gauss'scher Strahlen zu Grunde, erreicht ein Lichtblatt mit einer Breite von 300μηη und einer Dicke von 5μΐτι (Fokuslänge ca. 300μΐτι) erst in einer Entfernung von 9.5 mm vom Fokus ein rundes Profil (in größerer Entfernung ist dann das Seitenverhältnis des Strahls umgekehrt gegenüber der Orientierung des Lichtblatts). Dies bedeutet, dass für Objektive mit kürzerem Arbeitsabstand eine runde Ausführung der Frontlinse unvorteilhaft ist, da ein bedeutsamer Teil der Linse nicht genutzt wird. Dieser Aspekt wird insbesondere bedeutsam, wenn das Beleuchtungsobjektiv für eine SPIM-Untersuchung im rechten Winkel zur Detektionsoptik montiert wird. Da das Detektionsobjektiv idealerweise eine hohe numerische Apertur aufweist, kommt es zur „sterischen Hinderung" der beiden Objektive, wenn der Arbeitsabstand des Beleuchtungsobjektivs nicht größer ist als der Radius des Detektionsobjektivs. Die beiden Objektive nehmen dann zusammen einen zu großen Raumwinkel ein, als dass sie in einem Winkel von 90 Grad zueinander so montiert werden können, dass ihre optischen Achsen sich in den Fokusebenen schneiden. Beleuchtungsobjektive mit großem Arbeitsabstand möchte man jedoch gerne vermeiden, da mit dem Arbeitsabstand für eine vorgegebene numerische Apertur naturgemäß der notwendige Durchmesser der Linsen steigt und größere Linsen komplizierter herzustellen, schwerer und teurer sind.A further limitation of prior art arrangements relates to the size and polar symmetry of commonly used lenses. This symmetry is in contrast to the very asymmetric dimensions of the leaflet, which is very elliptical in cross-section. If the propagation properties of Gaussian rays are used as a rough estimate in paraxial approximation, a light sheet with a width of 300 μm and a thickness of 5 μm (focal length about 300 μm) reaches a round profile only at a distance of 9.5 mm from the focus (FIG. at a greater distance then the aspect ratio of the beam is opposite to the orientation of the light sheet). This means that for lenses with a shorter working distance a round design of the front lens is unfavorable because a significant part of the lens is not used. This aspect becomes particularly significant when the illumination objective is mounted for a SPIM examination at right angles to the detection optics. Since the detection objective ideally has a high numerical aperture, the two lenses are "sterically hindered" if the working distance of the illumination objective is not greater than the radius of the detection objective However, one would like to avoid illuminating lenses with a long working distance, since with the working distance for a given numerical aperture naturally the necessary diameter of the lenses increases and larger ones Making lenses more complicated, heavier and more expensive.

Die besondere Anordnung der astigmatischen Optik in der Nähe der Eintrittspupille des Beleuchtungsobjektivs derart, dass die astigmatische Optik zwischen der Tubuslinse und dem Beleuchtungsobjektiv positioniert ist und/oder keine weiteren fokussierenden oder defokussierenden Elemente zwischen der astigmatischen Optik und dem Beleuchtungsobjektiv vorhanden sind, erlaubt das Erzeugen eines entlang der Ausbreitungsrichtung in der Ebene des Lichtblattes divergenten oder konvergenten Lichtblattes, was letztlich die Dimensionierung des Lichtblattes, also die Anpassung der Breite des Lichtblattes für einen gegebenen Durchmesser des Beleuchtungslichtbündels an der Stelle der astigmatischen Optik erlaubt.The particular arrangement of the astigmatic optics in the vicinity of the entrance pupil of the illumination objective such that the astigmatic optics is positioned between the tube lens and the illumination objective and / or there are no further focusing or defocusing elements between the astigmatic optics and the illumination objective permits the generation of a along the propagation direction in the plane of the light sheet divergent or convergent light sheet, which ultimately allows the dimensioning of the light sheet, so adjusting the width of the light sheet for a given diameter of the illumination light beam at the location of the astigmatic optics.

Eine derart angeordnete astigmatische Optik hat Auswirkungen auf bzw. verändert die Brechkraft des Beleuchtungsobjektivs entlang der Achse in der das Lichtblatt erzeugt werden soll näherungsweise gemäß der Formel l/fges=l/fi+l/f2-d/(fi*f2), entlang der senkrechten Achse bleibt die Brennweite und optische Abbildungsqualität des Beleuchtungsobjektivs unverändert. Auf diese Weise wird ein Astigmatismus erzeugt, wobei das von dem Beleuchtungsobjektiv fokussierte Beleuchtungslichtbündel einen sagittalen und einen meridionalen Fokus aufweist, die von dem Beleuchtungsobjektiv einen unterschiedlichen Abstand haben. Im Bildfeld ist der Strahlquerschnitt des astigmatischen Beleuchtungslichtbündels daher elliptisch. Die lange Achse des elliptischen Strahlprofils wird bei einer SPIM-Untersuchung einer Probe vorzugsweise derart angeordnet, dass sie in der Fokusebene des Detektionsobjektivs liegt. Entlang der Beleuchtungsachse weist die kürzere Halbachse ein Minimum in der Fokusebene der Beleuchtungsoptik auf, die längere Halbachse ist im Bereich des Bildfeldes monoton ansteigend (positive Brechkraft der astigmatischen Optik bzw. einer Zylinderlinse) oder abnehmend (negative Brechkraft der astigmatischen Optik bzw. einer Zylinderlinse).An astigmatic optic arranged in this way has an effect on or changes the refractive power of the illumination objective along the axis in which the light sheet is to be generated, approximately according to the formula 1 / fges = 1 / f1 + 1 / f2-d / (f1 * f2) the vertical axis, the focal length and optical imaging quality of the illumination lens remains unchanged. In this way, an astigmatism is generated, wherein the illuminating light beam focused by the illumination objective has a sagittal and a meridional focus, which have a different distance from the illumination objective. In the image field, the beam cross section of the astigmatic illumination light beam is therefore elliptical. The long axis of the elliptical beam profile is preferably arranged in a SPIM examination of a sample such that it lies in the focal plane of the detection objective. Along the illumination axis, the shorter semiaxis has a minimum in the focal plane of the illumination optics, the longer semiaxis is increasing monotonically in the area of the image field (positive refractive power of the astigmatic optics or a cylindrical lens) or decreasing (negative refractive power of the astigmatic optics or a cylindrical lens). ,

Bei einer ganz besonders vorteilhaften Ausführung weist die astigmatische Optik eine negative Brechkraft auf. Insbesondere kann die astigmatische Optik vorteilhaft eine Brechkraft im Bereich von - 1/(500 mm) bis - 1/(700 mm), insbesondere von - 1/(600 mm), aufweisen. Dies insbesondere, wenn das Beleuchtungsobjektiv eine Brennweite im Bereich von 35 mm bis 45 mm, insbesondere von 40 mm aufweist.In a particularly advantageous embodiment, the astigmatic optics has a negative refractive power. In particular, the astigmatic optics may advantageously have a refractive power in the range of -1 / (500 mm) to -1 / (700 mm), in particular of -1 / (600 mm). This in particular if the illumination objective has a focal length in the range from 35 mm to 45 mm, in particular 40 mm.

Insbesondere kann vorteilhaft vorgesehen sein, dass die astigmatische Optik eine Brechkraft aufweist, die klein in Relation zur Brechkraft des Beleuchtungsobjektivs ist - insbesondere kleiner als 1/10 der Brechkraft des Beleuchtungsobjektivs. Zum einen ist eine solche Ausführung sehr lichteffizient, da keine wesentliche Steigerung der Überleuchtung der Eintrittspupille des Beleuchtungsobjektivs verursacht wird. Darüber hinaus hat sich gezeigt, dass eine solche Ausführung den besonderen Vorteil einer guten optischen Abbildung ohne störende Aberrationen hat.In particular, it can advantageously be provided that the astigmatic optic has a refractive power which is small in relation to the refractive power of the illumination objective - in particular less than 1/10 of the refractive power of the illumination objective. On the one hand, such an embodiment is very light-efficient, since no substantial increase in the illumination of the entrance pupil of the illumination objective is caused. In addition, it has been found that such a design has the particular advantage of good optical imaging without interfering aberrations.

Die Verwendung einer astigmatischen Optik mit negativer Brechkraft hat in vorteilhafter Weise insbesondere zur Folge, dass die Brechkraft des optischen Systems bestehend aus der astigmatischen Optik und dem Beleuchtungsobjektiv für die Sagittalebene (oder die Meridionalebene) eine reduzierte Brechkraft aufweist, so dass das Beleuchtungslichtbündel, nachdem es das Beleuchtungsobjektiv durchlaufen hat, bezogen auf die Sagittalebene (beziehungsweise die Meridionalebene), weniger divergent verläuft. Dennoch ist es sehr gut möglich, ein derart erzeugtes Lichtblatt relativ zur Probe, beispielsweise unter Verwendung einer (oder mehrerer) hinsichtlich des Ablenkwinkels einstellbaren Strahlablenkeinrichtung zu bewegen, beispielsweise um größere Probenareale sukzessive abzutasten oder im aufeinanderfolgenden Wechsel unterschiedliche interessierende Bereiche (ROI, region of interest) zu beleuchten. Es ist allerdings durchaus auch möglich, dass die astigmatische Optik eine positive Brechkraft aufweist, wobei das oben bezüglich der negativen Brechkraft Gesagte entsprechend für die positive Brechkraft gilt.The use of astigmatic optics with negative refractive power advantageously has the consequence, in particular, that the refractive power of the optical system consisting of the astigmatic optics and the illumination objective for the sagittal plane (or the meridional plane) has a reduced refractive power, so that the illuminating light bundle, after it has been refracted has passed through the illumination objective, with respect to the sagittal plane (or the meridional plane), less divergent runs. Nevertheless, it is very possible to move such a generated light sheet relative to the sample, for example using one (or more) adjustable with respect to the deflection angle beam deflecting device, for example, to scan larger sample areas successively or in successive change different regions of interest (ROI, region of interest ) to illuminate. However, it is also quite possible that the astigmatic optics has a positive refractive power, with the statements made above regarding the negative refractive power correspondingly applying to the positive refractive power.

Die astigmatische Optik kann insbesondere als Zylinderlinse ausgebildet sein oder wenigstens eine Zylinderlinse aufweisen. Die erfindungsgemäße Beleuchtungsanordnung kann vorteilhaft insbesondere in der Weise ausgebildet sein, dass die astigmatische Optik genau eine einzige Zylinderlinse aufweist. Alternativ ist es auch möglich, dass die astigmatische Optik als Linsengruppe mehrerer unmittelbar hintereinander geschalteter und/oder miteinander in Kontakt stehender Linsen ausgebildet ist, von denen wenigstens eine als Zylinderlinse ausgebildet ist.The astigmatic optics can be designed in particular as a cylindrical lens or have at least one cylindrical lens. The illumination arrangement according to the invention can advantageously be designed in particular in such a way that the astigmatic optics has exactly one single cylindrical lens. Alternatively, it is also possible for the astigmatic optics to be formed as a lens group of a plurality of lenses connected directly behind one another and / or in contact with one another, of which at least one is designed as a cylindrical lens.

Insbesondere kann die astigmatische Optik als Zylinderlinse mit wenigstens einer konkav gewölbten Oberfläche ausgebildet sein oder wenigstens eine solche Zylinderlinse aufweisen. Dies insbesondere, wenn gewünscht ist, dass die astigmatische Optik eine negative Brechkraft aufweist.In particular, the astigmatic optics can be designed as a cylindrical lens with at least one concavely curved surface or have at least one such cylindrical lens. This in particular if it is desired that the astigmatic optics have a negative refractive power.

Insbesondere in dem Fall, dass die astigmatische Optik eine positive Brechkraft aufweist, kann die astigmatische Optik als Zylinderlinse mit wenigstens einer konvex gewölbten Oberfläche ausgebildet sein oder wenigsten eine solche Zylinderlinse aufweisen.In particular, in the case that the astigmatic optics has a positive refractive power, the astigmatic optics may be formed as a cylindrical lens with at least one convexly curved surface or at least have such a cylindrical lens.

Insbesondere bei einer Ausführung der Beleuchtungsanordnung, die eine astigmatische Optik mit positiver Brechkraft aufweist, kann vorteilhaft vorgesehen sein, dass das von dem Beleuchtungsobjektiv fokussierte Beleuchtungslichtbündel einen sagittalen und einen meridionalen Fokus aufweist, die von dem Beleuchtungsobjektiv einen unterschiedlichen Axialabstand aufweisen, wobei die Probe im Bereich des Fokus mit dem größeren Axialabstand zu dem Beleuchtungsobjektiv positioniert wird. Hierbei wird vorteilhaft ausgenutzt, dass das Beleuchtungslichtbündel bezogen auf die Ebene, in der das Bildfeld liegt, weniger divergent verläuft. Mit anderen Worten: durch die astigmatische Optik wird die Brechkraft des Beleuchtungsobjektivs in einer Ebene nicht verändert. Es ist günstig dort die Probe zu positionieren, weil dort die Qualität des Beleuchtungslichtbündels besonders hoch ist, während der Fokus in der anderen, zur ersten Ebene senkrechten Ebene näher an das Beleuchtungsobjektiv heranrückt.In particular, in an embodiment of the illumination arrangement which has astigmatic optics with positive refractive power, it can be advantageously provided that the illuminating light bundle focused by the illumination objective has a sagittal and a meridional focus which have a different axial distance from the illumination objective, the specimen being in the range the focus is positioned with the greater axial distance to the illumination lens. In this case, advantage is taken of the fact that the illuminating light bundle is less divergent relative to the plane in which the image field lies. In other words: the astigmatic optics do not change the refractive power of the illumination objective in one plane. It is convenient to position the sample there, because there the quality of the illumination light beam is particularly high, while the focus in the other, perpendicular to the first plane level moves closer to the illumination lens.

Allerdings ist es nicht ausgeschlossen, eine astigmatische Optik mit negativer Brechkraft zu verwenden, wobei hierbei vorzugsweise die Probe im Bereich des Fokus mit dem geringeren Axialabstand zu dem Beleuchtungsobjektiv positioniert wird. Dies deshalb, weil Qualität des Beleuchtungslichtbündels in dem Fokalbereich, der ausschließlich auf das Beleuchtungsobjektiv zurückgeht, höher ist, als in dem Fokalbereich, der durch die astigmatische Optik und das Beleuchtungsobjektiv gemeinsam erzeugt ist.However, it is not excluded to use an astigmatic optic with negative refractive power, in which case the sample is preferably positioned in the region of the focus with the smaller axial distance to the illumination objective. This is because quality of the illuminating light beam is higher in the focal area exclusively due to the illuminating lens than in the focal area co-generated by the astigmatic optic and the illuminating lens.

Wie bereits erwähnt kann die astigmatische Optik vorteilhaft in der Pupillenebene des Beleuchtungsobjektivs oder einer dazu konjugierten Ebene angeordnet sein.As already mentioned, the astigmatic optics can advantageously be arranged in the pupil plane of the illumination objective or a plane conjugate thereto.

Bei einer ganz besonders vorteilhaften Ausführung ist die astigmatische Optik in einem Unendlichstrahlengang zwischen der Tubuslinse und dem Beleuchtungsobjektiv angeordnet. Eine solche Ausführung hat den ganz besonderen Vorteil, dass bei Standard-Mikroskopstativen und üblichen Mikroskopen an dieser Stelle ohnehin bereits eine Wechselvorrichtung vorhanden ist, um optische Elemente, wie Filter, Strahlteiler oder DIC-Prismen (Differenzinterferenzkontrast-Prismen) einbringen zu können, die genutzt werden kann. Die Wechselvorrichtung kann beispielsweise als Filterrad oder als Filtereinschubvorrichtung oder als Polfiltereinschub oder als Revolver oder als DIC-Revolver ausgebildet sein.In a particularly advantageous embodiment, the astigmatic optics is arranged in an infinite beam path between the tube lens and the illumination objective. Such a design has the very special advantage that in standard microscope stands and conventional microscopes at this point already a changing device is already present in order to bring in optical elements such as filters, beam splitters or DIC prisms (differential interference contrast prisms) that used can be. The changing device can be designed, for example, as a filter wheel or as a filter insertion device or as a pole filter insert or as a revolver or as a DIC revolver.

Unabhängig davon, ob die astigmatische Optik unter Verwendung einer Wechselvorrichtung oder auf andere Weise im Beleuchtungsstrahlengang positioniert wird, ist es von Vorteil, wenn eine Vorrichtung zum Bestimmen der Position und Ausrichtung der optischen Achse der astigmatischen Optik vorhanden ist, um die astigmatische Optik, insbesondere mit einer Justiervorrichtung zum Justieren der Position und/oder Ausrichtung der astigmatischen Optik korrekt justieren zu können. Die Vorrichtung zum Bestimmen der Position und die Justiervorrichtung können insbesondere vorteilhaft dazu verwendet werden, die Verkippung des Lichtblatts relativ zu der Fokusebene des Detektionsobjektivs einstellen zu können.Regardless of whether the astigmatic optics is positioned in the illumination beam path using a changing device or otherwise, it is advantageous if a device for determining the position and orientation of the optical axis of the astigmatic optics is present in order to provide the astigmatic optics, in particular an adjustment device for adjusting the position and / or orientation of the astigmatic optics can be adjusted correctly. The device for determining the position and the adjusting device can in particular be advantageously used to be able to set the tilting of the light sheet relative to the focal plane of the detection objective.

Wie bereits erwähnt, kann die astigmatische Optik, alternativ zu einer Anordnung zwischen der Tubuslinse und dem Beleuchtungsobjektiv, auch Teil des Beleuchtungsobjektivs sein. Dies kann beispielsweise in der Weise realisiert sein, dass die astigmatische Optik als Aufsatz zum Befestigen an dem Beleuchtungsobjektiv, insbesondere an einem Beleuchtungsobjektivgehäuse, ausgebildet ist. Der Aufsatz kann beispielsweise ein Gewinde aufweisen, so dass er auf ein Gegengewinde des Beleuchtungsobjektivgehäuses aufgeschraubt werden kann, wobei die astigmatische Optik vorzugsweise auf der Lichteintrittsseite des Beleuchtungsobjektivs angeordnet ist. Eine solche Ausführung hat den besonderen Vorteil, dass ein Objektiv, das nicht speziell für eine SPIM-Beleuchtung hergestellt wurde, nachträglich umgerüstet werden kann.As already mentioned, the astigmatic optics, as an alternative to an arrangement between the tube lens and the illumination objective, can also be part of the illumination objective. This can be realized, for example, in such a way that the astigmatic optics is designed as an attachment for attachment to the illumination objective, in particular to an illumination objective housing. The attachment may for example have a thread, so that it can be screwed onto a mating thread of the illumination objective housing, wherein the astigmatic optic is preferably arranged on the light entry side of the illumination objective. Such a design has the particular advantage that a lens that was not specially manufactured for SPIM lighting, can be retrofitted.

Es ist auch möglich, die astigmatische Optik in dem Beleuchtungsobjektiv fest zu montieren, insbesondere ohne dass diese zerstörungsfrei von den übrigen Komponenten des Beleuchtungsobjektivs gelöst werden kann. Insbesondere kann ein solches Beleuchtungsobjektiv speziell ausschließlich als SPIM-Beleuchtungsobjektiv hergestellt sein; dies insbesondere vorteilhaft auch derart, dass es sich von einer im Querschnitt senkrecht zur optischen Achse kreisförmigen Eintrittsapertur zu einer im Querschnitt senkrecht zur optischen Achse elliptischen Frontlinse hin verjüngt, um einen möglichst großen Raum zur Positionierung eines Detektionsobjektivs senkrecht zum Beleuchtungsobjektiv zu lassen.It is also possible to firmly mount the astigmatic optics in the illumination objective, in particular without being able to be detached from the other components of the illumination objective in a non-destructive manner. In particular, such an illumination objective can be produced exclusively exclusively as a SPIM illumination objective; This is particularly advantageous in such a way that it tapers from an entrance aperture which is circular in cross-section perpendicular to the optical axis to a front lens which is elliptical in cross-section perpendicular to the optical axis, in order to leave the largest possible space for positioning a detection objective perpendicular to the illumination objective.

Bevorzugt ist ein Teil des Beleuchtungsobjektivs - zumindest um einen vorgebbaren Winkelbereich - gegenüber dem Rest des Beleuchtungsobjektivs verdrehbar ausgestaltet, wobei der verdrehbar ausgestaltete Teil des Beleuchtungsobjektivs die elliptische Frontlinse umfasst. Dies könnte mit einer Mechanik realisiert werden, welche ähnlich zu der ausgebildet ist, die bei Korrekturringen von Mikroskopobjektiven zum Einstellen von Dickenvariationen von Deckgläsern vorgesehen ist.Preferably, a part of the illumination objective is designed to be rotatable relative to the rest of the illumination objective, at least by a predefinable angular range, wherein the rotatably configured part of the illumination objective comprises the elliptical front lens. This could be realized with a mechanism similar to that provided in correction rings of microscope objectives for adjusting thickness variations of coverslips.

Wie bereits erwähnt, hat die erfindungsgemäße Beleuchtungsanordnung den ganz besonderen Vorteil eines kompakten Aufbaus, was eine SPIM-Untersuchung einer Probe unter Verwendung von Standard-Mikroskopstativen und/oder erfindungsgemäß umgerüsteter Mikroskope erlaubt. Insbesondere ermöglicht es die Erfindung, ein Mikroskop, das die erfindungsgemäße Beleuchtungsanordnung beinhaltet, auf der Basis eines bestehenden Rastermikroskops herzustellen. Insbesondere kann ein solches Rastermikroskops auch als konfokales Rastermikroskop ausgebildet sein. Hierbei kann insbesondere vorgesehen sein, dass ein existierendes Rastermikroskop mit der beschriebenen Beleuchtungsanordnung nachgerüstet wird, um das Rastermikroskop als SPIM-Mikroskop verwenden zu können. Die Erfindung hat hierbei den ganz besonderen Vorteil, dass kein zusätzlicher Bauraum benötigt wird, sondern dass vielmehr der ohnehin bei einem solchen Rastermikroskop vorhandene Bauraum ausreicht, um die oben beschriebene Beleuchtungsanordnung zu implementieren. Dies gilt nicht ausschließlich für Rastermikroskope, sondern insbesondere auch für aufrechte oder inverse Auflichtmikroskope.As already mentioned, the lighting arrangement according to the invention has the very particular advantage of a compact construction, which allows a SPIM examination of a sample using standard microscope stands and / or microscopes retrofitted according to the invention. In particular, the invention makes it possible to produce a microscope incorporating the lighting arrangement according to the invention on the basis of an existing scanning microscope. In particular, such a scanning microscope can also be designed as a confocal scanning microscope. In this case, provision may be made, in particular, for an existing scanning microscope to be retrofitted with the described illumination arrangement in order to be able to use the scanning microscope as a SPIM microscope. The invention has the particular advantage that no additional space is needed, but rather that the space available anyway in such a scanning microscope is sufficient to implement the illumination arrangement described above. This does not apply exclusively to scanning microscopes, but especially for upright or inverse incident light microscopes.

Bei der Verwendung eines konventionellen Fluoreszenz-Weitfeldmikroskops als Basis kann die astigmatische Optik vorteilhaft an der Stelle positioniert werden, an der bei dem Fluoreszenz-Weitfeldmikroskop ansonsten der Hauptstrahlteiler angeordnet ist. Der Hauptstrahlteiler ist bei einem Fluoreszenz-Weitfeldmikroskop das Bauteil, das das von einer Lichtquelle kommende Beleuchtungslicht in einen Abschnitt lenkt, wo der Beleuchtungsstrahlengang und der Detektionsstrahlengang koaxial zueinander verlaufen und das von der Probe kommende Detektionslicht zu einer Detektoranordnung passieren lässtWhen using a conventional fluorescence far-field microscope as a basis, the astigmatic optics can advantageously be positioned at the location at which the main beam splitter is otherwise arranged in the fluorescence field-of-view microscope. The main beam splitter in a fluorescence far field microscope is the component which directs the illumination light coming from a light source into a section where the illumination beam path and the detection beam path are coaxial with one another and the detection light coming from the sample passes to a detector arrangement

Wie bereits erwähnt, kann das Beleuchtungsobjektiv nach einem unabhängigen Erfindungsgedanken vorteilhaft in der Weise ausgebildet sein, dass es sich von einer im Querschnitt senkrecht zur optischen Achse kreisförmigen Eintrittsapertur zu einer im Querschnitt senkrecht zur optischen Achse elliptischen Frontlinse hin verjüngt, wobei das Beleuchtungsobjektiv vorzugsweise derart orientiert wird, dass die Hochachse der elliptischen Frontlinse in der Ebene des Lichtblattes angeordnet ist. Die spezielle Form des Beleuchtungsobjektivs erlaubt es, das Beleuchtungsobjektiv in Kombination mit Detektionsoptiken mit hoher Numerischer Apertur selbst dann zu verwenden, wenn das Beleuchtungsobjektiv eine kurzen Arbeitsabstand aufweist; insbesondere einen Arbeitsabstand der kleiner ist als der Radius des Detektionsobjektivs. Ein Objektiv mit kurzem Arbeitsabstand kann vorteilhaft, gemessen an der Größe des Bildfeldes und der Numerischen Apertur, mit vergleichsweise kleinen Linsen gebaut werden.As already mentioned, according to an independent idea of the invention, the illumination objective can advantageously be designed in such a way that it tapers from an entrance aperture which is circular in cross-section perpendicular to the optical axis to an elliptical front lens which is elliptical in cross-section perpendicular to the optical axis, the illumination objective preferably being oriented in this way is that the vertical axis of the elliptical front lens is arranged in the plane of the light sheet. The special shape of the illumination objective makes it possible to use the illumination objective in combination with high numerical aperture detection optics even when the illumination objective has a short working distance; in particular a working distance which is smaller than the radius of the detection objective. A short working distance lens can advantageously be constructed with comparatively small lenses, measured by the size of the image field and the numerical aperture.

Ganz allgemein hat ein solches Beleuchtungsobjektiv den ganz besonderen Vorteil, dass es insbesondere zusammen mit hochaperturigen Detektionsobjektiven eingesetzt werden kann, ohne dass es zu einer räumlichen Kollision der Objektive kommt. Vielmehr lässt ein solches Beleuchtungsobjektiv genügend Bauraum zur Anordnung auch hochaperturiger Detektionsobjektive, die einen geringen Arbeitsabstand aufweisen und daher relativ dicht am Lichtblatt angeordnet werden müssen.In general, such an illumination objective has the very special advantage that it can be used in particular together with high-aperture detection objectives without there being any spatial collision of the objectives. Rather, such an illumination objective leaves sufficient space for the arrangement of high-aperture detection lenses, which have a small working distance and therefore must be arranged relatively close to the light sheet.

Zur Klarstellung sei angemerkt, dass im Sinne dieser Anmeldung unter dem Begriff Objektiv, insbesondere Beleuchtungsobjektiv oder Detektionsobjektiv, insbesondere eine abbildende optische Einheit verstanden wird, die wenigstens drei Linsen beinhaltet und die achromatisch oder apochromatisch oder hinsichtlich eines planen Bildfeldes oder hinsichtlich eines Farbvergrößerungsfehlers korrigiert ist.For clarification, it should be noted that for the purposes of this application the term objective, in particular illumination objective or detection objective, is understood to mean in particular an imaging optical unit which contains at least three lenses and which is corrected achromatically or apochromatically or with respect to a plane image field or with respect to a color magnification error.

In der Zeichnung ist der Erfindungsgegenstand beispielhaft und schematisch dargestellt und wird anhand der Figuren nachfolgend beschrieben, wobei gleiche oder gleich wirkende Elemente zumeist mit denselben Bezugszeichen versehen sind. Dabei zeigen:In the drawing, the subject invention is exemplified and shown schematically and will be described with reference to the figures below, wherein the same or equivalent elements are usually provided with the same reference numerals. Showing:

Fig. 1 ein erstes Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Beleuchtungsanordnung in einer Ansicht senkrecht auf die Lichtblattebene,1 shows a first embodiment of a lighting arrangement according to the invention in a view perpendicular to the plane of the light sheet,

Fig. 2 das erste Ausführungsbeispiel in einer Ansicht parallel zur Lichtblattebene,2 shows the first embodiment in a view parallel to the plane of the light sheet,

Fig. 3 ein zweites Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Beleuchtungsanordnung in einer Ansicht senkrecht auf die Lichtblattebene,3 shows a second embodiment of a lighting arrangement according to the invention in a view perpendicular to the plane of the light sheet,

Fig. 4 das zweite Ausführungsbeispiel in einer Ansicht parallel zur Lichtblattebene,4 shows the second embodiment in a view parallel to the plane of the light sheet,

Fig. 5 ein drittes Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Beleuchtungsanordnung in einer Ansicht senkrecht auf die Lichtblattebene,5 shows a third embodiment of a lighting arrangement according to the invention in a view perpendicular to the plane of the light sheet,

Fig. 6 das dritte Ausführungsbeispiel in einer Ansicht parallel zur Lichtblattebene,6 shows the third embodiment in a view parallel to the plane of the light sheet,

Fig. 7 ein viertes Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßenFig. 7 shows a fourth embodiment of an inventive

Beleuchtungsanordnung in einer Ansicht senkrecht auf die Lichtblattebene,Illumination arrangement in a view perpendicular to the plane of the light,

Fig. 8 ein fünftes Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßenFig. 8 shows a fifth embodiment of an inventive

Fig. 9 ein Ausführungsbeispiel eines erfindungsgemäßen Beleuchtungsobjektivs im Vergleich zu einem herkömmlichen Beleuchtungsobjektiv in einer Seitenansicht,9 shows an exemplary embodiment of an illumination objective according to the invention in comparison with a conventional illumination objective in a side view,

Fig. 10 das Ausführungsbeispiel eines erfindungsgemäßen Beleuchtungsobjektivs im Vergleich zu einem herkömmlichen Beleuchtungsobjektiv in einer Frontalansicht in Richtung der optischen Achse des Beleuchtungsobjektivs,10 shows the embodiment of an illumination objective according to the invention in a frontal view in the direction of the optical axis of the illumination objective compared to a conventional illumination objective,

Fig. 11 das Ausführungsbeispiel eines erfindungsgemäßen Beleuchtungsobjektivs im Vergleich zu einem herkömmlichen Beleuchtungsobjektiv in einer Ansicht senkrecht auf das Bildfeld,11 shows the embodiment of an illumination objective according to the invention compared to a conventional illumination objective in a view perpendicular to the image field,

Fig. 12 eine Ausführung nach dem Stand der Technik in einer Ansicht senkrecht auf die Lichtblattebene,12 shows a prior art embodiment in a view perpendicular to the plane of the light sheet,

Fig. 13 die Ausführung nach dem Stand der Technik in einer Ansicht parallel zur Lichtblattebene,13 shows the embodiment according to the prior art in a view parallel to the plane of the light sheet,

Fig. 14 eine andere Ausführung nach dem Stand der Technik in einer Ansicht senkrecht auf die Lichtblattebene, undFig. 14 shows another embodiment according to the prior art in a view perpendicular to the plane of the light sheet, and

Fig. 15 die andere Ausführung nach dem Stand der Technik in einer Ansicht parallel zur Lichtblattebene.Fig. 15, the other embodiment according to the prior art in a view parallel to the plane of the light.

Figur 1 zeigt ein erstes Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Beleuchtungsanordnung in einer Ansicht senkrecht auf die Lichtblattebene (Lichtblattebene = Zeichenebene). Die Beleuchtungsanordnung weist ein Beleuchtungsobjektiv 4, eine Tubuslinse 3, sowie eine astigmatische Optik 7 auf, die eine Zylinderlinse 1 beinhaltet. Die astigmatische Optik 7 ist zwischen der Tubuslinse 3 und dem Beleuchtungslicht 4 angeordnet, wobei sich keine weiteren fokussierenden oder defokussierenden Elemente zwischen der astigmatischen Optik 7 und dem Beleuchtungsobjektiv 4 befinden und die Position der astigmatischen Optik 7 entlang der optischen Achse beliebig sein kann. Vorzugsweise wird die astigmatischen Optik 7 so nah wie möglich am Objektiv 4 angeordnet. Die Zylinderlinse weist eine konkav gewölbte Oberfläche 12 und eine plane Oberfläche 13 auf.FIG. 1 shows a first exemplary embodiment of a lighting arrangement according to the invention in a view perpendicular to the plane of the light sheet (light sheet plane = drawing plane). The illumination arrangement has an illumination objective 4, a tube lens 3, and an astigmatic optic 7, which includes a cylindrical lens 1. The astigmatic optic 7 is arranged between the tube lens 3 and the illumination light 4, there being no further focusing or defocusing elements between the astigmatic optic 7 and the illumination objective 4 and the position of the astigmatic optic 7 along the optical axis being arbitrary. Preferably, the astigmatic optic 7 is arranged as close as possible to the objective 4. The cylindrical lens has a concavely curved surface 12 and a planar surface 13.

Die astigmatische Optik 7 weist eine negative Brechkraft auf. Hierbei kann insbesondere vorgesehen sein, dass die negative Brechkraft - 1/(600 mm) beträgt, während die Brennweite des Beleuchtungsobjektivs 4 40 mm beträgt.The astigmatic optic 7 has a negative refractive power. In this case, provision may in particular be made for the negative refractive power to be 1 / (600 mm), while the focal length of the illumination objective 4 is 40 mm.

Bezogen auf die Lichtblattebene weist das optische System, das aus der astigmatischen Optik 7 und dem Beleuchtungsobjektiv 4 gebildet ist, eine geringere Brechkraft auf als das Beleuchtungsobjektiv 4 alleine, so dass das Beleuchtungslichtbündel 8, nachdem es das Beleuchtungsobjektiv 4 durchlaufen hat bezogen auf die Lichtblattebene (insbesondere zu erkennen Figur 1) weniger divergent verläuft als in der Ebene senkrecht zur Lichtblattebene (insbesondere zu erkennen in Figur 2) dargestellt ist.With respect to the plane of the light sheet, the optical system formed of the astigmatic optic 7 and the illumination objective 4 has a lower refractive power than the illumination objective 4 alone, so that the illumination light bundle 8, after passing through the illumination objective 4, is oriented relative to the plane of the light sheet (FIG. 1) is less divergent than in the plane perpendicular to the plane of the light sheet (in particular to be seen in FIG. 2).

Das Beleuchtungslichtbündel 8 ist nach Durchlaufen des Beleuchtungsobjektivs 4 astigmatisch und weist daher in der Ebene senkrecht zur Lichtblattebene einen ersten Fokus 9 und in der Lichtblattebene einen zweiten Fokus 10 auf, die zum Beleuchtungsobjektiv 4 einen unterschiedlichen Axialabstand aufweisen. Vorzugsweise wird bei negativer Brechkraft der Zylinderlinse 1 der erste Fokus 9 als Lichtblatt 11 verwendet, um eine Probe bei einer SPIM-Untersuchung schichtweise zu beleuchten. Innerhalb des Lichtblattes 11 liegt vorzugsweise das Sichtfeld 23 einer (hier nicht dargestellten) Detektionsoptik. Die in Fig. 2 eingezeichneten beiden gestrichelten Linien links und rechts neben der Fokalebene 26 des Beleuchtungsobjektivs 4 deuten den Schärfentiefenbereich des Lichtblatts an.After passing through the illumination objective 4, the illumination light bundle 8 is astigmatic and therefore has a first focus 9 in the plane perpendicular to the plane of the light plane and a second focus 10 in the plane of the light plane which have a different axial distance to the illumination objective 4. Preferably, with a negative refractive power of the cylindrical lens 1, the first focus 9 is used as a light sheet 11 in order to illuminate a sample in layers in an SPIM examination. Within the light sheet 11 is preferably the field of view 23 (not shown here) detection optics. The two dashed lines drawn in FIG. 2 to the left and to the right of the focal plane 26 of the illumination objective 4 indicate the depth of field of the light sheet.

Figur 3 zeigt ein zweites Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Beleuchtungsanordnung für ein Lichtblatt-Mikroskop in einer Ansicht senkrecht auf die Lichtblattebene, während Figur 4 dieses Ausführungsbeispiel in einer Ansicht parallel zur Lichtblattebene zeigt.FIG. 3 shows a second exemplary embodiment of a lighting arrangement according to the invention for a light-sheet microscope in a view perpendicular to the plane of the light sheet, while FIG. 4 shows this embodiment in a view parallel to the light-sheet plane.

Auch bei diesem Ausführungsbeispiel ist eine astigmatische Optik 7 zwischen einer Tubuslinse 3 und einem Beleuchtungsobjektiv 4 angeordnet, wobei sich keine weiteren fokussierenden oder desfokussierenden Elemente zwischen der astigmatischen Optik 7 und dem Beleuchtungsobjektiv 4 befinden. Allerdings unterscheidet sich die in den Figuren 3 und 4 dargestellte Ausführung von der in den Figuren 1 und 2 dargestellten Ausführung dadurch, dass die astigmatische Optik 7 eine positive Brechkraft aufweist. Die astigmatische Optik 7 beinhaltet eine Zylinderlinse 1 mit einer konvex gewölbten Oberfläche 14 und einer planen Oberfläche 13.In this exemplary embodiment too, an astigmatic optic 7 is arranged between a tube lens 3 and an illumination objective 4, there being no further focusing or desfocussing elements between the astigmatic optic 7 and the illumination objective 4. However, the embodiment shown in FIGS. 3 and 4 differs from the embodiment shown in FIGS. 1 and 2 in that the astigmatic optic 7 has a positive refractive power. The astigmatic optic 7 includes a cylindrical lens 1 with a convexly curved surface 14 and a planar surface 13.

Das optische System, das aus der astigmatischen Optik 7 und dem Beleuchtungsobjektiv 4 gebildet ist, weist in Bezug auf die Lichtblattebene (Figur 3) eine größere Brechkraft auf, als das Beleuchtungsobjektiv 4 alleine. Das nach dem Durchlaufen des Beleuchtungsobjektivs 4 astigmatische Beleuchtungslichtbündel 8 weist daher bezogen auf die Lichtblattebene (Figur 3) einen ersten Fokus 9 und bezogen auf die Ebene senkrecht zur Lichtblattebene einen zweiten Fokus 10 auf, wobei der erste Fokus 9 dem Beleuchtungsobjektiv 4 axial näher liegt, als der zweite Fokus 10. Vorzugsweise wird der zweite Fokus 10 als Lichtblatt 11 verwendet, um eine Probe bei einer SPIM-Untersuchung schichtweise zu beleuchten. Hierbei wird vorteilhaft ausgenutzt, dass der zweite Fokus 10 ausschließlich durch die Brechkraft des Beleuchtungsobjektivs 4 erzeugt wurde und daher sämtliche optischen Korrekturen des Beleuchtungsobjektivs 4 voll wirksam sind, während der erste Fokus 9 durch die gemeinsame Wirkung von astigmatischer Optik 7 und Beleuchtungsobjektiv 4 entsteht, so dass für den ersten Fokus 9 die Korrektur von Abbildungsfehlern schlechter ist. Außerdem hat diese Ausführung den besonderen Vorteil, dass durch die Verwendung des zweiten Fokus 10 mehr Raum für ein senkrecht zu dem Beleuchtungsobjektiv 4 anzuordnendes Detektionsobjektiv zur Verfügung gestellt ist. Innerhalb des Lichtblattes 11 liegt vorzugsweise das Sichtfeld 23 einer (hier nicht dargestellten) Detektionsoptik.The optical system, which is formed from the astigmatic optics 7 and the illumination objective 4, has a greater refractive power with respect to the plane of the light plane (FIG. 3) than the illumination objective 4 alone. The illuminating light bundle 8 that is astigmatic after passing through the illumination objective 4 therefore has a first focus 9 relative to the plane of the light plane (FIG. 3) and a second focus 10 relative to the plane perpendicular to the plane of the light plane. The first focus 9 is axially closer to the illumination objective 4. Preferably, the second focus 10 is used as a light sheet 11 to illuminate a sample in a SPIM examination in layers. In this case, advantage is taken of the fact that the second focus 10 was generated exclusively by the refractive power of the illumination objective 4 and therefore all optical corrections of the illumination objective 4 are fully effective, while the first focus 9 is produced by the joint effect of astigmatic optics 7 and illumination objective 4 that for the first focus 9, the correction of aberrations is worse. In addition, this embodiment has the particular advantage that 10 more space is provided for a perpendicular to the illumination objective 4 to be arranged detection objective by the use of the second focus. Within the light sheet 11 is preferably the field of view 23 (not shown here) detection optics.

Die Figuren 5 und 6 zeigen ein drittes Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßenFigures 5 and 6 show a third embodiment of an inventive

Beleuchtungsanordnung für ein SPIM-Mikroskop, wobei Figur 5 eine Ansicht senkrecht auf die Lichtblattebene (=Zeichenebene) zeigt, während Figur 6 eine Ansicht aus einer Richtung parallel zur Lichtblattebene (die Lichtblattebene steht senkrecht zur Zeichenebene) darstellt.Illumination arrangement for a SPIM microscope, wherein Figure 5 shows a view perpendicular to the Lichtblattebene (= plane), while Figure 6 is a view from a direction parallel to the plane of the light (the Lichtblattebene is perpendicular to the plane).

Die Beleuchtungsanordnung beinhaltet ein Beleuchtungsobjektiv 4 und eine Tubuslinse 3, sowie eine astigmatische Optik 7, die bei diesem Ausführungsbeispiel als Zylinderlinse 1 mit negativer ist. Dies kann beispielsweise dadurch realisiert sein, dass die astigmatische Optik 7 als schraubbarer Aufsatz zum Befestigen an dem Beleuchtungsobjektiv 4, insbesondere an einem Beleuchtungsobjektivgehäuse 15 des Beleuchtungsobjektivs 4, ausgebildet ist. Die astigmatische Optik 7 kann jedoch auch in das Beleuchtungsobjektivgehäuse bzw. fest an einer vorgebbaren Stelle des Beleuchtungsobjektivgehäuses 15 oder an einer beliebigen Position innerhalb des Beleuchtungsobjektivgehäuses 15 moniert sein.The illumination arrangement includes an illumination objective 4 and a tube lens 3, as well as an astigmatic optic 7, which is negative in this embodiment as a cylindrical lens 1. This can be realized, for example, in that the astigmatic optic 7 is designed as a screwable attachment for fastening to the illumination objective 4, in particular to an illumination objective housing 15 of the illumination objective 4. However, the astigmatic optic 7 can also be mounted in the illumination objective housing or fixed at a predeterminable location of the illumination objective housing 15 or at any desired position within the illumination objective housing 15.

Das Beleuchtungslichtbündel 8 wird bei diesem Ausführungsbeispiel im Wesentlichen ähnlich fokussiert, wie bei dem Ausführungsbeispiel, das in den Figuren 1 und 2 gezeigt ist. Innerhalb des Lichtblattes 11 liegt vorzugsweise das Sichtfeld 23 einer (hier nicht dargestellten) Detektionsoptik.The illumination light beam 8 is focused substantially similarly in this embodiment as in the embodiment shown in FIGS. 1 and 2. Within the light sheet 11 is preferably the field of view 23 (not shown here) detection optics.

Das Beleuchtungslichtbündel 8 weist in einer konjugierte Ebene 24 zur Fokalebene 26 des Beleuchtungsobjektivs 4 einen Fokus auf und wird anschließend von einer Tubuslinse 3 kollimiert, so dass es als kollimiertes Beleuchtungslichtbündel die Pupillenebene des Beleuchtungsobjektivs 4 durchläuft.The illumination light bundle 8 has a focus in a conjugate plane 24 to the focal plane 26 of the illumination objective 4 and is subsequently collimated by a tube lens 3, so that it passes through the pupil plane of the illumination objective 4 as a collimated illumination light bundle.

In Bezug auf die Ebene, die in Fig. 5 gezeigt ist, ändert die astigmatische Optik 7 die Brechkraft des Beleuchtungsobjektivs 4 nicht. Der zweite Fokus 10 befindet sich daher in der Fokalebene 26 des Beleuchtungsobjektivs 4. In Bezug auf die Ebene, die in Fig. 6 gezeigt ist wirkt die negative Brechkraft der astigmatischen Optik 7 zusätzlich zur die Brechkraft des Beleuchtungsobjektivs 4, so dass die insgesamt geringere Brechkraft bewirkt, dass der zweite Fokus 10 weiter vom Beleuchtungsobjektiv 4 entfernt liegt, als der erste Fokus 9. Hierbei wird vorteilhaft ausgenutzt, dass der erste Fokus 9 ausschließlich durch die Brechkraft des Beleuchtungsobjektivs 4 erzeugt wurde und daher sämtliche optischen Korrekturen des Beleuchtungsobjektivs voll wirksam sind, während der zweite Fokus 10 durch die gemeinsame Wirkung von astigmatischer Optik 7 und Beleuchtungsobjektiv 4 entsteht, so dass für den zweiten Fokus 10 dieWith respect to the plane shown in FIG. 5, the astigmatic optic 7 does not change the refractive power of the illumination objective 4. The second focus 10 is therefore located in the focal plane 26 of the illumination objective 4. With respect to the plane shown in FIG. 6, the negative refractive power of the astigmatic optic 7 acts in addition to the refractive power of the illumination objective 4, so that the overall lower refractive power causes the second focus 10 to be farther from the illumination objective 4 than the first focus 9. Here, it is advantageously utilized that the first focus 9 was generated exclusively by the refractive power of the illumination objective 4 and therefore all optical corrections of the illumination objective are fully effective. while the second focus 10 is formed by the joint effect of astigmatic optics 7 and illumination objective 4, so that for the second focus 10 the

Korrektur von Abbildungsfehlern schlechter ist.Correction of aberrations is worse.

Fig. 7 zeigt ein viertes Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Beleuchtungsanordnung in einer Ansicht senkrecht auf die Lichtblattebene (Lichtblattebene= Zeichenebene), das eine (nur sehr schematisch dargestellte) hinsichtlich des Ablenkwinkels einstellbare Strahlablenkeinrichtung 16, nämlich einen um eine Drehachse 17 drehbaren Spiegel 18 aufweist. Die Drehachse 17 ist senkrecht zur Lichtblattebene ausgerichtet.7 shows a fourth exemplary embodiment of a lighting arrangement according to the invention in a view perpendicular to the plane of the light sheet (plane of light plane = plane of drawing), which has a beam deflection device 16 (which is only shown very schematically) with respect to the deflection angle, namely a mirror 18 rotatable about a rotation axis 17. The axis of rotation 17 is aligned perpendicular to the plane of the light.

Dem Spiegel 18 ist eine Scanlinse 19 nachgeschaltet. Außerdem weist die Beleuchtungsanordnung ein Beleuchtungsobjektiv 4, eine Tubuslinse 3, sowie eine astigmatische Optik 7 auf, die eine Zylinderlinse 1 beinhaltet. Die astigmatische Optik 7 ist zwischen der Tubuslinse 3 und dem Beleuchtungsobjektiv 4 angeordnet, wobei sich keine weiteren fokussierenden oder defokussierenden Elemente zwischen der astigmatischen Optik 7 und dem Beleuchtungsobjektiv 4 befinden. Die Zylinderlinse weist eine konkav gewölbte Oberfläche 12 und eine plane Oberfläche 13 auf. Das Beleuchtungslichtbündel 8 wird bei diesem Ausführungsbeispiel vomThe mirror 18 is followed by a scanning lens 19. In addition, the illumination arrangement has an illumination objective 4, a tube lens 3, and an astigmatic optic 7, which includes a cylindrical lens 1. The astigmatic optic 7 is arranged between the tube lens 3 and the illumination objective 4, there being no further focusing or defocusing elements between the astigmatic optic 7 and the illumination objective 4. The cylindrical lens has a concavely curved surface 12 and a planar surface 13. The illumination light beam 8 is in this embodiment of

Beleuchtungsobjektiv 4 im Wesentlichen ähnlich fokussiert, wie bei demIlluminating lens 4 focused substantially similar to that in the

Ausführungsbeispiel, das in den Figuren 1 und 2 gezeigt ist.Embodiment, which is shown in Figures 1 and 2.

Durch Drehen des Spiegels 18 um die Drehachse 17 kann der von der Scanlinse 19 erzeugte Fokus in der zur Fokalebene 26 des Beleuchtungsobjektivs 4 konjugierten Ebene 24 quer zur optischen Achse bewegt werden (siehe Doppelpfeil), wodurch das Lichtblatt senkrecht zur optischen Achse des Beleuchtungsobjektivs 4 verschoben werden kann, beispielsweise um einen Probenbereich 27 über die Breite des Bildfeldes sukzessive mit dem Lichtblatt 11 zu beleuchten. Hierdurch kann zeitsequentiell ein - ggf. sogar noch größer als in Fig. 7 bzw. 8 eingezeichneter -Probenbereich 27 scannend beleuchtet werden. Es ist auch möglich, das Lichtblatt in Lichtausbreitungsrichtung zu verschieben, wenn eine Probenschicht in zwei Dimensionen sukzessive mit dem Lichtblatt 11 beleuchtet werden soll.By rotating the mirror 18 about the axis of rotation 17, the focus generated by the scan lens 19 in the focal plane 26 of the illumination lens 4 conjugate plane 24 can be moved transversely to the optical axis (see double arrow), whereby the light sheet is displaced perpendicular to the optical axis of the illumination lens 4 can be, for example, to illuminate a sample area 27 over the width of the image field successively with the light sheet 11. As a result, a sample area 27, which may be even larger than in FIG. 7 or 8, may be illuminated in a time-sequential manner. It is also possible to move the light sheet in the light propagation direction if a sample layer in two dimensions is to be successively illuminated with the light sheet 11.

Fig. 8 zeigt ein fünftes Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Beleuchtungsanordnung in einer Ansicht senkrecht auf die Lichtblattebene (Lichtblattebene = Zeichenebene). Die Beleuchtungsanordnung beinhaltet ein Beleuchtungsobjektiv 4 und eine Tubuslinse 3, sowie eine astigmatische Optik 7, die als Zylinderlinse 1 mit negativer Brechkraft Teil des Beleuchtungsobjektivs 4 ist.FIG. 8 shows a fifth exemplary embodiment of a lighting arrangement according to the invention in a view perpendicular to the plane of the light sheet (light sheet plane = drawing plane). The illumination arrangement includes an illumination objective 4 and a tube lens 3, as well as an astigmatic optic 7, which is part of the illumination objective 4 as a cylindrical lens 1 with a negative refractive power.

Die Beleuchtungsanordnung beinhaltet außerdem zwischen der Tubuslinse 3 und dem Beleuchtungsobjektiv 4 eine schematisch angedeutete, hinsichtlich des Ablenkwinkels einstellbare Strahlablenkeinrichtung 16, die es erlaubt, das Lichtblatt 11, das einen Probenbereich 27 beleuchtet, senkrecht zur optischen Achse des Beleuchtungsobjektivs 4 zu verschieben.The illumination arrangement further includes between the tube lens 3 and the illumination objective 4 a schematically indicated, with respect to the deflection angle adjustable beam deflecting device 16, which allows the light sheet 11, which illuminates a sample area 27, to move perpendicular to the optical axis of the illumination objective 4.

Die Fig. 9 bis 11 zeigen ein Ausführungsbeispiel eines erfindungsgemäßen Beleuchtungsobjektivs 4 und dessen Anordnung relativ zu einem Detektionsobjektiv 20 im Vergleich einer Anordnung mit herkömmlichem Beleuchtungsobjektiv 4, wobei in der jeweils linken Abbildung die Anordnung nach dem Stand der Technik und in der jeweils rechten Abbildung die Anordnung mit dem erfindungsgemäßen Beleuchtungsobjektiv 4 gezeigt ist. Der freie Arbeitsabstand X, also der Abstand zwischen Fokusebene 26 und Frontlinse des Beleuchtungsobjektivs 4 kann erfindungsgemäß deutlich gegenüber dem freien Arbeitsabstand der aus dem Stand der Technik bekannten Anordnungen reduziert werden.FIGS. 9 to 11 show an exemplary embodiment of an illumination objective 4 according to the invention and its arrangement relative to a detection objective 20 in comparison with an arrangement with conventional illumination objective 4, wherein in the respective left-hand illustration the arrangement according to the prior art and in the respective right-hand illustration Arrangement with the illumination objective 4 according to the invention is shown. The free working distance X, ie the distance between the focal plane 26 and the front lens of the illumination objective 4, can be significantly reduced according to the invention compared with the free working distance of the arrangements known from the prior art.

Das erfindungsgemäßen Beleuchtungsobjektivs 4 verjüngt sich von einer im Querschnitt senkrecht zur optischen Achse kreisförmigen Eintrittsapertur 28 zu einer im Querschnitt senkrecht zur optischen Achse elliptischen Frontlinse 21 hin, wobei das Beleuchtungsobjektiv 4 vorzugsweise derart orientiert wird, dass die Hochachse der elliptischen Frontlinse 21 in der Ebene des Lichtblattes 11 angeordnet ist. Die spezielle Form des Beleuchtungsobjektivs 4 erlaubt es, das Beleuchtungsobjektiv 4 in Kombination mit einem Detektionsobjektiv 20, das eine Frontlinse 22 aufweist, mit hoher Numerischer Apertur selbst dann zu verwenden, wenn das Beleuchtungsobjektiv 4 eine kurzen Arbeitsabstand aufweist; insbesondere einen Arbeitsabstand der kleiner ist als der Radius des Detektionsobjektivs 21, insbesondere einen Arbeitsabstand der nur etwas größer ist, als das Bildfeld des Detektionsobjektivs 21.The illumination objective 4 according to the invention tapers from an inlet aperture 28 which is circular in cross-section perpendicular to the optical axis to an elliptical front lens 21 which is elliptical in cross-section perpendicular to the optical axis, the illumination objective 4 preferably being oriented in such a way that the vertical axis of the elliptical front lens 21 in the plane of the elliptical front lens 21 Light sheet 11 is arranged. The special shape of the illumination objective 4 makes it possible to use the illumination objective 4 in combination with a detection objective 20 having a front lens 22 with a high numerical aperture even when the illumination objective 4 has a short working distance; in particular a working distance which is smaller than the radius of the detection objective 21, in particular a working distance which is only slightly larger than the image field of the detection objective 21.

Bezugszeichenliste: 1 Zylinderlinse 2 Relaylinse 3 Tubuslinse 4 Beleuchtungsobjektiv 5 zur Pupille des Beleuchtungsobjektivs konjugierte Ebene 6 Lichtbündel 7 astigmatische Optik 8 Beleuchtungslichtbündel 9 erster Fokus 10 zweiter Fokus 11 Lichtblatt 12 Konkav gewölbte Oberfläche 13 plane Oberfläche 14 konvex gewölbten Oberfläche 15 Beleuchtungsobjektivgehäuse 16 Strahlablenkeinrichtung 17 Drehachse 18 Spiegel 19 Scanlinse 20 Detektionsobjektiv 21 elliptische Frontlinse von (4) 22 Frontlinse des Detektionsobjektivs 23 Sichtfeld Detektionsoptik 24 konjugierte Ebene zu (26) von (4) 25 Pupillenebene von (4) 26 Fokalebene von (4) 27 Probenbereich /28 Eintrittsapertur von (4) X freier Arbeitsabstand von (4)List of Reference Numerals: 1 cylindrical lens 2 relay lens 3 tube lens 4 illumination objective 5 plane conjugate to the pupil of the illumination objective 6 light bundle 7 astigmatic optics 8 illumination light beam 9 first focus 10 second focus 11 light sheet 12 concave curved surface 13 plane surface 14 convexly curved surface 15 illumination objective housing 16 beam deflection device 17 rotation axis 18 Mirror 19 Scan Lens 20 Detection Lens 21 Elliptical Front Lens of (4) 22 Front Lens of Detection Lens 23 Field of View Detection Optics 24 Conjugate Plane to (26) of (4) 25 Pupil Plane of (4) 26 Focal Plane of (4) 27 Sample Area / 28 Entry Aperture of (4 ) X free working distance of (4)

Claims

A lighting arrangement for a light-sheet microscope, in which a sample is illuminated with an illumination light beam (8), which is formed in the region of the sample as a light sheet (11), with an illumination objective (4), a tube lens (3) and an astigmatic Optics (7), characterized in that the astigmatic optics (7) is formed and arranged between the tube lens and the illumination objective (4) such that the illuminating light bundle (8) emerging from the illumination objective (4) both in a sagittal plane is also focused in a meridional plane.

2. Lighting arrangement according to claim 1, characterized in that the focal length of the astigmatic optics from the distance of the astigmatic optics to the pupil of the illumination objective (4) is different.

3. Lighting arrangement according to claim 1 or 2, characterized in that no further focusing or defocusing elements between the astigmatic optics (7) and the illumination objective (4) are arranged and / or that the astigmatic optics (7) - at least by a predeterminable angular range - Is arranged rotatable about an axis.

4. Lighting arrangement according to one of claims 1 to 3, characterized in that the astigmatic optics (7) is part of the illumination objective (4).

5. Lighting arrangement according to one of claims 1 to 4, characterized in that a. the astigmatic optic (7) has a negative refractive power, and / or that b. the astigmatic optic (7) has a refractive power in the range of -1 / (500 mm) to -1 / (700 mm), in particular of -1 / (600 mm), and / or that c. the astigmatic optic (7) has a refractive power which is less than 1/10 of the refractive power of the illumination objective, and / or that d. the astigmatic optic (7) has a negative refractive power at least with respect to the sagittal plane, and / or that e. the astigmatic optic (7) has a negative refractive power at least with respect to the meridional plane.

6. Lighting arrangement according to one of claims 1 to 4, characterized in that a. the astigmatic optic (7) has a positive refractive power, and / or that b. the astigmatic optic (7) has a positive refractive power at least with respect to the sagittal plane, and / or that c. the astigmatic optic (7) has a positive refractive power at least with reference to the meridional plane.

7. Lighting arrangement according to one of claims 1 to 6, characterized in that a. the astigmatic optic (7) is designed as a cylindrical lens (1) or has a cylindrical lens (1) or that b. the astigmatic optic (7) is designed as a cylindrical lens (1) with at least one concavely curved surface (12) or has a cylindrical lens (1) with at least one concavely curved surface (12) or c. the astigmatic optic (7) is designed as a cylindrical lens (1) with at least one convexly curved surface (14) or has a cylindrical lens (1) with at least one convexly curved surface (14).

8. Lighting arrangement according to one of claims 1 to 7, characterized in that a. the astigmatic optic (7) is arranged in the pupil (5) of the illumination objective (4), and / or that b. the astigmatic optic (7) is arranged in an infinite beam path between the tube lens (3) and the illumination objective (4).

9. Lighting arrangement according to one of claims 1 to 8, characterized in that a. the illumination objective (4) tapers from an entrance aperture which is circular in cross section perpendicular to the optical axis to a front lens (21) which is elliptical in cross section perpendicular to the optical axis, and / or that b. the illumination objective (4) tapers from an entry aperture which is circular in cross-section perpendicular to the optical axis to an elliptical front lens (21) which is elliptical in cross-section perpendicular to the optical axis, the vertical axis of the front lens (21) being arranged in the plane of the light sheet.

10. Lighting arrangement according to claim 9, characterized in that a part of the illumination objective (4) - at least by a predeterminable angular range - with respect to the rest of the illumination objective (4) rotatable configured, wherein the rotatably configured part of the illumination objective (4), the elliptical front lens (21).

11. Lighting arrangement according to one of claims 1 to 10, characterized by a. an adjusting device for adjusting the position and / or the orientation of the astigmatic optics (7), and / or by b. a device for determining the position and orientation optical axis of the astigmatic optics (7), and / or by c. a device for adjusting the position and orientation of the optical axis of the astigmatic optics (7).

12. Lighting arrangement according to one of claims 1 to 11, characterized by a. a focus slide device for changing the position of the light sheet (11) along the light propagation direction, and / or by b. a focus shifter for changing the position of the light sheet (11) perpendicular to the optical axis of the illumination lens (4).

13. Lighting arrangement according to one of claims 1 to 12, characterized in that the astigmatic optics (7) is designed as an attachment for attachment to the illumination objective (4) or an illumination objective housing (15).

14. A microscope comprising a lighting arrangement according to one of claims 1 to 13.

15. A microscope according to claim 14, characterized in that the astigmatic optics (7) by means of a changing device for introducing optical components in the beam path of the illumination light beam (8) selectively inserted into the beam path of the illumination light beam (8) or removed from the beam path of the illumination light beam can be.

16. A microscope according to claim 14 or 15, characterized in that the changing device is designed as a filter wheel or as a filter insertion device or as Polfiltereinschub or as a revolver or as a DIC revolver.

17. A microscope according to any one of claims 14 to 16, characterized in that the microscope is designed as a scanning microscope, in particular as a confocal scanning microscope, or that the microscope is made of a scanning microscope, in particular a confocal scanning microscope.

18. A microscope according to claim 17, characterized in that the astigmatic optics (7) is positioned at the position or is positionable, on which the main beam splitter is otherwise arranged in the scanning microscope.

19. Luminaire objective (4), in particular for a lighting arrangement according to one of claims 1 to 13 and / or for a microscope according to one of claims 14 to 18, which has astigmatic optics (7) for generating a light sheet (11) for the SPIM. Examination of a sample includes and / or that tapers from a circular in the cross section perpendicular to the optical axis entry aperture to an elliptical in cross-section perpendicular to the optical axis front lens (21).

20. Method for illuminating a microscopic specimen with a light sheet, characterized in that an astigmatic optic (7) is arranged between a tube lens (3) and an illumination objective (4) such that the illumination light bundle (8) focused by the illumination objective (4) ) has a sagittal and a meridional focus (9, 10), which have a different axial distance from the illumination objective (4).

21. The method according to claim 20, characterized in that, a. the sample is positioned in the region of the focus with the smaller axial distance to the illumination objective (4) if the astigmatic optic has a negative refractive power and / or that b. the sample is positioned in the region of the focus with the greater axial distance to the illumination objective (4) if the astigmatic optic has a positive refractive power.

22. A method for illuminating a sample by means of a lighting arrangement according to one of claims 1 to 13 and / or for illuminating a sample by means of an illumination objective (4) according to claim 19 and / or for examining a sample by means of a microscope according to one of claims 14 to 18 , characterized in that the illumination light beam (8) focused by the illumination objective (4) has a sagittal and a meridional focus (9, 10) which have a different axial distance from the illumination objective (4), wherein a. the sample is positioned in the region of the focus with the smaller axial distance to the illumination objective (4) if the astigmatic optic has a negative refractive power and / or that b. the sample is positioned in the region of the focus with the greater axial distance to the illumination objective (4) if the astigmatic optic has a positive refractive power.