KR20240049139A - Superabsorbent polymer-based surface fixation technology for extracellular vesicles - Google Patents
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Abstract
본 발명은 세포밖 소포체 또는 세포의 고흡수성 수지 기반 표면 고정 기술에 관한 것으로, 더 상세하게는 고흡수성 수지에 세포밖 소포체 또는 세포를 포함하는 용액을 첨가하고 인큐베이션하여 세포밖 소포체 또는 세포를 고흡수성 수지 표면에 고정하는 기술과 그 응용에 관한 것이다. 본 발명은 세포밖 소포체 또는 세포를 고흡수성 수지 표면에 고정함으로써, 세포밖 소포체 또는 세포를 고흡수성 수지 표면에 고정한 상태로 간편하고 신속하게 세포밖 소포체 또는 세포 내에 존재하는 다양한 바이오마커 검출이 가능하고, 세포밖 소포체 또는 세포의 활용 목적에 따라 세포밖 소포체 또는 세포를 용해시키는 용매를 간편하게 교체할 수 있어, 세포밖 소포체 또는 세포를 이용한 다양한 연구와 의약품, 화장품, 식품 소재 개발에 활용할 수 있는 장점이 있다.The present invention relates to a superabsorbent resin-based surface immobilization technology for extracellular vesicles or cells. More specifically, a solution containing extracellular vesicles or cells is added to a superabsorbent resin and incubated, thereby attaching extracellular vesicles or cells to a superabsorbent polymer. It is about fixing technology to the resin surface and its application. In the present invention, by fixing extracellular vesicles or cells to the surface of a superabsorbent resin, it is possible to easily and quickly detect various biomarkers present in extracellular vesicles or cells while fixing the extracellular vesicles or cells to the surface of the superabsorbent resin. , the solvent that dissolves extracellular vesicles or cells can be easily replaced depending on the purpose of using the extracellular vesicles or cells, which has the advantage of being used for various research using extracellular vesicles or cells and for the development of pharmaceuticals, cosmetics, and food materials. there is.
Description
본 발명은 세포밖 소포체 또는 세포의 고흡수성 수지를 기반으로 하는 표면 고정 기술에 관한 것으로, 더 상세하게는 고흡수성 수지에 세포밖 소포체 또는 세포를 포함하는 용액을 첨가하고 인큐베이션하여 세포밖 소포체 또는 세포를 고흡수성 수지 표면에 고정하는 기술과 그 응용에 관한 것이다. The present invention relates to a surface immobilization technology based on a superabsorbent resin of extracellular vesicles or cells. More specifically, the present invention relates to a surface fixation technology based on a superabsorbent resin of extracellular vesicles or cells, and more specifically, by adding a solution containing extracellular vesicles or cells to the superabsorbent resin and incubating it. It relates to the technology of fixing to the surface of a superabsorbent polymer and its application.
세포밖 소포체는 나노 크기의 입자로 부모 세포의 단백질, 지질, 핵산 등 바이오 분자들을 포함하고 있다. 따라서 세포밖 소포체를 이용한 다양한 질병 진단법이 개발되고 있을 뿐만 아니라, 세포밖 소포체는 의약품, 화장품, 식품 소재로도 개발되고 있다.Extracellular vesicles are nano-sized particles that contain biomolecules such as proteins, lipids, and nucleic acids from parent cells. Therefore, not only are various disease diagnosis methods using extracellular vesicles being developed, but extracellular vesicles are also being developed into pharmaceuticals, cosmetics, and food materials.
그러나, 체액 또는 배양액과 같은 용액 중에 포함된 세포밖 소포체는 그 농도가 낮아, 이를 이용하기 위해서는 세포밖 소포체를 농축하거나 용액으로부터 분리해내는 기술이 필요하다. However, the concentration of extracellular vesicles contained in solutions such as body fluids or culture fluids is low, and in order to use them, a technique for concentrating or separating extracellular vesicles from the solution is required.
세포밖 소포체를 정제하기 위한 방법으로는 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography)가 널리 사용되고 있는데, 이는 용출 과정에서 정제된 세포밖 소포체가 용출액에 오히려 희석되기 때문에 여전히 추가적인 분리 기술이 필요하다. 한편, 폴리에틸렌 글리콜(Polyethylene glycol, PEG)을 이용한 침전 방법은 PEG라는 불순물이 첨가되고 세포밖 소포체의 성상에 인위적인 변화가 동반될 수 있기 때문에 이를 사용하는데 한계가 있다. 또한, 초고속 원심분리기를 이용하여 세포밖 소포체를 용액으로부터 분리하는 방법이 이용되기도 하지만, 이러한 방법으로는 세포밖 소포체의 수율이 매우 낮으며, 강력한 원심력이 작용하여 세포밖 소포체가 파괴될 수 있고, 고가 장비가 필요하면서도 분리에 많은 시간이 소요되는 단점이 있다. Size exclusion chromatography is widely used as a method to purify extracellular vesicles, but additional separation technology is still required because the purified extracellular vesicles are rather diluted in the eluate during the elution process. Meanwhile, the precipitation method using polyethylene glycol (PEG) has limitations because an impurity called PEG is added and artificial changes may occur in the properties of extracellular vesicles. In addition, a method of separating extracellular vesicles from a solution using an ultra-high-speed centrifuge is sometimes used, but the yield of extracellular vesicles is very low with this method, and the strong centrifugal force may cause extracellular vesicles to be destroyed. It has the disadvantage of requiring expensive equipment and taking a lot of time to separate.
이에, 본 발명자는 고흡수성 수지(Super absorbent polymer bead, SAP bead)를 이용한 세포밖 소포체의 농축방법을 개발하여, 세포 배양액이나 임상 시료에서 세포밖 소포체를 짧은 시간 안에, 단일 과정으로 간단하게 농축시킬 수 있는 방법을 개발한 바 있다 (대한민국 등록특허 제10-2118509호). Accordingly, the present inventor has developed a method for concentrating extracellular vesicles using super absorbent polymer beads (SAP beads), which can easily concentrate extracellular vesicles from cell culture media or clinical samples in a short period of time and in a single process. A method has been developed (Korean Patent Registration No. 10-2118509).
이처럼 종래에는 용액 내 세포밖 소포체를 농축하는 기술이 주를 이루었으나, 세포밖 소포체를 단순히 농축하는 것이 아닌 용액으로부터 완전히 분리하는 기술을 개발한다면 질병의 진단이나 치료제 개발에 더 유용하게 활용이 가능할 것이다.In this way, in the past, technology was mainly used to concentrate extracellular vesicles in solution, but if a technology was developed to completely separate extracellular vesicles from the solution rather than simply concentrating them, it would be more useful for diagnosing diseases or developing treatments. .
본 발명의 목적은 고흡수성 수지를 기반으로 하여 세포밖 소포체 또는 세포를 고흡수성 수지의 표면에 고정하는 방법과 이를 활용하는 방법을 제공하는 것이다.The purpose of the present invention is to provide a method of fixing extracellular vesicles or cells to the surface of a superabsorbent polymer and a method of utilizing the same based on the superabsorbent polymer.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 고흡수성 수지 표면에 세포밖 소포체 또는 세포를 고정하는 방법을 제공한다:In order to achieve the above object, the present invention provides a method for fixing extracellular vesicles or cells on the surface of a superabsorbent polymer comprising the following steps:
(a) 세포밖 소포체 또는 세포를 포함하는 용액을 고흡수성 수지와 혼합하는 단계; 및(a) mixing a solution containing extracellular vesicles or cells with a superabsorbent polymer; and
(b) 상기 혼합 단계 후, 1 시간 내지 10 시간 인큐베이션 하는 단계.(b) After the mixing step, incubation for 1 hour to 10 hours.
본 발명에 있어서, 상기 고흡수성 수지는 전분(starch)에 아크릴로니트릴(acrylonitrile), 아크릴산(acrylic acid), 아크릴아미드(acrylamide) 또는 메타크릴레이트(methacrylate)의 모노머를 공중합시킨 전분계 고분자; 카르복시메틸 셀룰로오스(CMC)에 상기의 모노머를 공중합시킨 셀룰로오스계 고분자; 및 폴리비닐알코올(polyvinyl alcohol)-메타아크릴산(methacrylic acid) 블록공중합체, 스티렌(stryene)-무수말레인산(maleic anhydride) 공중합체, 폴리아크릴아미드계(polyacryl amide) 또는 폴리옥시에틸렌계(polyoxyethylene)를 포함하는 합성수지계 고분자;로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 고흡수성 폴리머(SAP)로 제조되는 것을 특징으로 할 수 있다. In the present invention, the superabsorbent polymer is a starch-based polymer obtained by copolymerizing starch with monomers of acrylonitrile, acrylic acid, acrylamide, or methacrylate; Cellulose-based polymer obtained by copolymerizing the above monomer with carboxymethyl cellulose (CMC); and polyvinyl alcohol-methacrylic acid block copolymer, styrene-maleic anhydride copolymer, polyacryl amide or polyoxyethylene. It may be characterized as being manufactured from one or more superabsorbent polymers (SAPs) selected from the group consisting of synthetic resin-based polymers including:
본 발명에 있어서, 상기 고흡수성 수지는 폴리(아크릴아미드-코-아크릴산)((Poly(acrylamide-co-acrylic acid))) 고흡수성 수지인 것을 특징으로 할 수 있다. In the present invention, the superabsorbent resin may be a poly(acrylamide-co-acrylic acid)) superabsorbent resin.
본 발명에 있어서, 상기 용액은 세포밖 소포체를 1 × 106 내지 1 × 1013 입자수 또는 1 × 104 내지 × 108 세포수로 포함할 수 있다. In the present invention, the solution may include extracellular vesicles in the number of 1 × 10 6 to 1 × 10 13 particles or 1 × 10 4 to × 10 8 cells.
본 발명에 있어서, 상기 고흡수성 수지는 1 내지 10mm의 직경을 가지는 고흡수성 수지 비드인 것을 특징으로 할 수 있다. In the present invention, the superabsorbent polymer may be a superabsorbent resin bead having a diameter of 1 to 10 mm.
본 발명은 또한, 상기 방법에 따라 제조된 세포밖 소포체 또는 세포가 표면 고정된 고흡수성 수지를 제공한다.The present invention also provides a superabsorbent resin on which extracellular vesicles or cells prepared according to the above method are immobilized on the surface.
본 발명은 또한, 세포밖 소포체 또는 세포가 표면 고정된 고흡수성 수지를 포함하는 질환 진단용 조성물을 제공한다.The present invention also provides a composition for diagnosing diseases comprising a superabsorbent resin on which extracellular vesicles or cells are fixed to the surface.
본 발명은 또한, 세포밖 소포체 또는 세포가 표면 고정된 고흡수성 수지를 포함하는 질환 진단용 키트를 제공한다.The present invention also provides a kit for diagnosing diseases comprising a superabsorbent resin on which extracellular vesicles or cells are immobilized on the surface.
본 발명에 있어서, 상기 질환은 암일 수 있다. In the present invention, the disease may be cancer.
본 발명에 있어서, 상기 암은 유방암, 난소암, 대장암, 위암, 간암, 췌장암, 자궁경부암, 갑상선암, 부갑상선암, 폐암, 비소세포성폐암, 전립선암, 담낭암, 담도암, 비호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 혈액암, 방광암, 신장암, 흑색종, 결장암, 골암, 피부암, 두부암, 자궁암, 직장암, 뇌종양, 항문부근암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 질암, 음문암종, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계(CNS central nervous system) 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 및 뇌하수체 선종으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다. In the present invention, the cancer includes breast cancer, ovarian cancer, colon cancer, stomach cancer, liver cancer, pancreatic cancer, cervical cancer, thyroid cancer, parathyroid cancer, lung cancer, non-small cell lung cancer, prostate cancer, gallbladder cancer, biliary tract cancer, non-Hodgkin's lymphoma, Hodgkin's lymphoma, blood cancer, bladder cancer, kidney cancer, melanoma, colon cancer, bone cancer, skin cancer, head cancer, uterine cancer, rectal cancer, brain tumor, anal cancer, fallopian tube carcinoma, endometrial carcinoma, vaginal cancer, vulvar carcinoma, esophageal cancer, small intestine cancer, Endocrine cancer, adrenal cancer, soft tissue sarcoma, urethral cancer, penile cancer, ureteral cancer, renal cell carcinoma, renal pelvic carcinoma, CNS central nervous system tumor, primary CNS lymphoma, spinal cord tumor, brainstem glioma, and pituitary adenoma. It may be characterized as being selected from the group consisting of.
본 발명은 또한, 다음 단계를 포함하는 세포밖 소포체 또는 세포를 포함하는 용액의 용매 교체방법을 제공한다:The present invention also provides a method for solvent replacement of a solution containing extracellular vesicles or cells comprising the following steps:
(a) 상기 방법에 따라 고흡수성 수지 표면에 세포밖 소포체 또는 세포를 고정시키는 단계; 및(a) fixing extracellular vesicles or cells on the surface of superabsorbent polymer according to the above method; and
(b) 상기 세포밖 소포체 또는 세포가 표면 고정된 고흡수성 수지를 교체용 용매에 재현탁시키는 단계. (b) resuspending the superabsorbent resin on which the extracellular vesicles or cells are immobilized on the surface in a replacement solvent.
본 발명에 있어서, 상기 교체용 용매는 PBS, 증류수 또는 배양배지인 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, the replacement solvent may be PBS, distilled water, or culture medium.
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계는 피펫팅(pipetting) 또는 보텍싱(vortexing)으로 재현탁시키는 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, step (b) may be characterized by resuspension by pipetting or vortexing.
본 발명은 또한, 다음 단계를 포함하는 세포밖 소포체 또는 세포를 포함하는 용액의 제조방법을 제공한다:The present invention also provides a method for preparing a solution containing extracellular vesicles or cells comprising the following steps:
(a) 상기 방법에 따라 고흡수성 수지 표면에 세포밖 소포체 또는 세포를 고정시키는 단계; (a) fixing extracellular vesicles or cells on the surface of superabsorbent polymer according to the above method;
(b) 상기 세포밖 소포체 또는 세포가 표면 고정된 고흡수성 수지를 교체용 용매에 재현탁시키는 단계; 및(b) resuspending the superabsorbent resin on which the extracellular vesicles or cells are fixed to the surface in a replacement solvent; and
(c) 교체용 용매에 재현탄된 세포밖 소포체 또는 세포를 포함하는 용액을 회수하는 단계.(c) recovering a solution containing extracellular vesicles or cells resuspended in a replacement solvent.
본 발명은 세포밖 소포체 또는 세포를 고흡수성 수지 표면에 고정함으로써, 세포밖 소포체 또는 세포를 고흡수성 수지 표면에 고정한 상태로 간편하고 신속하게 세포밖 소포체 또는 세포 내에 존재하는 다양한 바이오마커 검출이 가능하고, 세포밖 소포체 또는 세포의 활용 목적에 따라 세포밖 소포체 또는 세포를 용해시키는 용매를 교체 전 용매의 오염(contamination) 없이 간편하게 교체할 수 있어, 세포밖 소포체 또는 세포를 이용한 다양한 연구와 의약품, 화장품, 식품 소재 개발에 활용할 수 있는 장점이 있다. In the present invention, by fixing extracellular vesicles or cells to the surface of a superabsorbent resin, it is possible to easily and quickly detect various biomarkers present in extracellular vesicles or cells while fixing the extracellular vesicles or cells to the surface of the superabsorbent resin. , Depending on the purpose of using extracellular vesicles or cells, the solvent that dissolves extracellular vesicles or cells can be easily replaced without contamination of the solvent before replacement, allowing for various research using extracellular vesicles or cells, pharmaceuticals, cosmetics, etc. There are advantages that can be used in the development of food materials.
도 1은 PBS 용액, free dye 용액, 세포밖 소포체 용액, 세포 용액을 각각 고흡수성 수지 비드에 첨가하고 인큐베이션 시킨 후, 세포밖 소포체 또는 세포가 고흡수성 수지 표면에 고정될 수 있음을 확인한 결과이다.
도 2는 비드 표면에 고정된 세포밖 소포체를 회수하기 위한 온도를 비교한 결과이다.
도 3은 세포밖 소포체 표면 바이오 마커의 신호를 롤링 써클 증폭 후 (A) 비드 표면에 고정 또는 (B) 비드 표면에 고정하지 않은 상태에서 형광 마커 발현을 관찰하여, 비드 표면에 고정된 상태에서 바이오마커 진단의 효과가 현저히 우수함을 확인한 결과이다.Figure 1 shows the results confirming that extracellular vesicles or cells can be immobilized on the surface of the superabsorbent resin after adding and incubating the PBS solution, free dye solution, extracellular vesicle solution, and cell solution to the superabsorbent polymer beads.
Figure 2 shows the results of comparing temperatures for recovering extracellular vesicles immobilized on the bead surface.
Figure 3 shows the expression of the fluorescent marker observed with (A) fixed on the bead surface or (B) without fixed on the bead surface after rolling circle amplification of the signal of the extracellular endoplasmic reticulum surface biomarker, and the bio-signal in the state fixed on the bead surface. This result confirmed that the effect of marker diagnosis was significantly superior.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.Unless otherwise defined, all technical and scientific terms used in this specification have the same meaning as commonly understood by a person skilled in the art to which the present invention pertains. In general, the nomenclature used herein is well known and commonly used in the art.
본 명세서에 기재된 농도 범위에 있어서, “내지”는 양 임계 범위를 포함(이상 및 이하)하는 의미로 사용되었으며, 양 임계 범위를 포함하지 않는 경우 “초과” 및 “미만”으로 농도 범위를 기재하였다. 본 명세서에서 수치에 사용된 “약”은 통상의 기술자에 의해 기재된 수치와 실질적으로 동등한 효과를 나타낼 수 있을 것으로 기대되는 범위를 포함하는 의미로 사용되며, 예를 들어, 기재된 수치 값의 ±20%, ±10%, ±5% 등일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.In the concentration range described in this specification, “to” is used to mean including (above and below) both critical ranges, and when both critical ranges are not included, the concentration range is described as “above” and “less than.” . In this specification, “about” used in numerical values is used to include a range expected to produce substantially equivalent effects to the numerical values described by a person skilled in the art, for example, ±20% of the numerical value described. , ±10%, ±5%, etc., but is not limited thereto.
세포밖 소포체는 대부분의 세포에 존재하는 30~1000 ㎚ 크기를 갖는 작은 소포체(membrane vesicle)이다. 이는 혈액, 소변 등 체액에 존재하며 특히, 엑소좀 내부에는 그 세포에서 유래된 다양한 종류의 단백질, 유전물질(DNA, mRNA, miRNA), 지질 등을 포함한다. 세포밖 소포체는 약한 음성의 표면 전하를 띄고 있다. 세포밖 소포체는 다양한 연구를 통해 여러 질병의 진단과 치료제로써의 활용가능성이 밝혀지고 있어, 해당 분야에서 점차 중요성이 높아지고 있는 실정이다.Extracellular vesicles are small endoplasmic reticulum (membrane vesicles) with a size of 30 to 1000 nm that exist in most cells. It exists in body fluids such as blood and urine, and in particular, exosomes contain various types of proteins, genetic materials (DNA, mRNA, miRNA), and lipids derived from the cell. Extracellular vesicles have a weakly negative surface charge. Extracellular vesicles are increasingly becoming more important in this field as their potential for use in the diagnosis and treatment of various diseases has been revealed through various studies.
본 발명에서는, 세포밖 소포체를 포함하는 용액을 고흡수성 수지 비드와 인큐베이션 하면, 고흡수성 수지 비드 표면에 세포밖 소포체가 고정될 수 있음을 확인하였다. In the present invention, it was confirmed that when a solution containing extracellular vesicles was incubated with superabsorbent resin beads, extracellular vesicles could be fixed to the surface of the superabsorbent resin beads.
이와 같이, 세포밖 소포체가 고흡수성 수지의 표면에 고정될 수 있으면, 소변, 객담, 혈액, 침, 눈물, 땀과 같은 생물학적 임상 시료 내에 존재하는 세포밖 소포체를 별도의 분리 및 정제 과정 없이 간단한 희석 또는 분리 과정 후 고흡수성 수지와 인큐베이션 시킴으로써 고흡수성 수지의 표면에 세포밖 소포체가 고정되게 하여 그 고정된 상태에서 세포밖 소포체에 존재하는 종래 알려진 또는 앞으로 발견될 수 있는 다양한 바이오마커를 용이하게 검출하여 분자 진단의 편의성과 신속성을 개선할 수 있다. In this way, if extracellular vesicles can be fixed to the surface of the superabsorbent polymer, extracellular vesicles present in biological clinical samples such as urine, sputum, blood, saliva, tears, and sweat can be easily diluted without separate separation and purification processes. Alternatively, by incubating with the superabsorbent resin after the separation process, extracellular vesicles are fixed on the surface of the superabsorbent resin, and in that fixed state, various biomarkers that are known or may be discovered in the extracellular vesicles can be easily detected. The convenience and speed of molecular diagnosis can be improved.
또한, 세포밖 소포체가 고흡수성 수지의 표면에 고정될 수 있으면, 목적에 따라 원하는 용액에 재현탁시킴으로써 세포밖 소포체를 포함하는 용액을 용이하게 교체하여 회수할 수 있다. Additionally, if extracellular vesicles can be immobilized on the surface of the superabsorbent polymer, the solution containing the extracellular vesicles can be easily replaced and recovered by resuspending them in a desired solution depending on the purpose.
같은 맥락에서, 세포 또한 고흡수성 수지의 표면에 고정될 수 있고, 목적에 따라 원하는 용액에 재현탁시킴으로써 세포를 포함하는 용액을 용이하게 교체하여 회수할 수 있다. In the same context, cells can also be immobilized on the surface of a superabsorbent polymer, and the solution containing the cells can be easily replaced and recovered by resuspending them in a desired solution depending on the purpose.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, 다음 단계를 포함하는 고흡수성 수지 표면에 세포밖 소포체 및/또는 세포를 고정하는 방법에 관한 것이다:Accordingly, in one aspect, the present invention relates to a method for immobilizing extracellular vesicles and/or cells on a superabsorbent polymer surface comprising the following steps:
(a) 세포밖 소포체 및/또는 세포를 포함하는 용액을 고흡수성 수지와 혼합하는 단계; 및(a) mixing a solution containing extracellular vesicles and/or cells with a superabsorbent polymer; and
(b) 상기 혼합 단계 후, 1 시간 내지 10 시간 인큐베이션 하는 단계.(b) After the mixing step, incubation for 1 hour to 10 hours.
본 발명에서, 상기 인큐베이션 하는 단계는, 약 1 시간 내지 약 10 시간, 예컨대, 약 1 시간 내지 약 5 시간, 예컨대, 약 1 시간 내지 약 3 시간 동안 인큐베이션 하는 것일 수 있다. In the present invention, the incubation step may be incubation for about 1 hour to about 10 hours, for example, for about 1 hour to about 5 hours, for example, for about 1 hour to about 3 hours.
본 발명에서, 상기 고흡수성 수지와 세포밖 소포체 및/또는 세포를 포함하는 용액을 1시간 미만으로 인큐베이션 하는 경우, 세포밖 소포체 및/또는 세포가 농축될 수는 있지만, 고흡수성 수지 표면에 고정되는 특징은 발휘하지 못하며 (대한민국 공개특허 10-2022-0074738, 대한민국 등록특허 10-2329816, 대한민국 등록특허 10-2118509 참조), 본 발명에서와 같이 1시간 이상 인큐베이션하는 경우, 고흡수성 수지 표면에 세포밖 소포체 및/또는 세포가 효과적으로 고정되어 유지될 수 있는 특징이 발휘된다. In the present invention, when the solution containing the superabsorbent polymer and extracellular vesicles and/or cells is incubated for less than 1 hour, the extracellular vesicles and/or cells may be concentrated, but are not fixed to the surface of the superabsorbent polymer. characteristics are not exhibited (see Republic of Korea Patent Publication No. 10-2022-0074738, Republic of Korea Patent No. 10-2329816, and Republic of Korea Patent No. 10-2118509), and when incubating for more than 1 hour as in the present invention, extracellular deposits appear on the surface of the superabsorbent resin. The characteristic of allowing endoplasmic reticulum and/or cells to be effectively fixed and maintained is exhibited.
한편, 본 발명에서, 상기 인큐베이션하는 단계가 10시간 초과인 경우 세포밖 소포체 및/또는 세포가 고정되는 효율이 크게 향상되지는 않는바, 10시간 이상의 인큐베이션 시간은 효율성 면에서 바람직하지 못하다. Meanwhile, in the present invention, when the incubation step is longer than 10 hours, the efficiency of fixing extracellular vesicles and/or cells is not significantly improved, so an incubation time of more than 10 hours is not desirable in terms of efficiency.
본 발명에 있어서, 상기 고흡수성 수지는 전분(starch)에 아크릴로니트릴(acrylonitrile), 아크릴산(acrylic acid), 아크릴아미드(acrylamide) 또는 메타크릴레이트(methacrylate)의 모노머를 공중합시킨 전분계 고분자; 카르복시메틸 셀룰로오스(CMC)에 상기의 모노머를 공중합시킨 셀룰로오스계 고분자; 및 폴리비닐알코올(polyvinyl alcohol)-메타아크릴산(methacrylic acid) 블록공중합체, 스티렌(stryene)-무수말레인산(maleic anhydride) 공중합체, 폴리아크릴아미드계(polyacryl amide) 또는 폴리옥시에틸렌계(polyoxyethylene)를 포함하는 합성수지계 고분자;로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 고흡수성 폴리머(SAP : super absorbed polymer)로 제조되는 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 폴리(아크릴아미드-코-아크릴산)((Poly(acrylamide-co-acrylic acid))) 고흡수성 수지인 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, the superabsorbent polymer is a starch-based polymer obtained by copolymerizing starch with monomers of acrylonitrile, acrylic acid, acrylamide, or methacrylate; Cellulose-based polymer obtained by copolymerizing the above monomer with carboxymethyl cellulose (CMC); and polyvinyl alcohol-methacrylic acid block copolymer, styrene-maleic anhydride copolymer, polyacryl amide or polyoxyethylene. It may be characterized as being manufactured from one or more superabsorbent polymers (SAP: super absorbed polymer) selected from the group consisting of synthetic resin-based polymers, preferably poly(acrylamide-co-acrylic acid) ((Poly (acrylamide-co-acrylic acid)))) It can be characterized as a highly absorbent resin.
본 발명에 있어서, 상기 세포밖 소포체 또는 세포를 포함하는 용액은 세포밖 소포체를 1 × 106 내지 1 × 1013 입자수 또는 1 × 104 내지 × 108 세포수로 포함할 수 있다. In the present invention, the solution containing the extracellular vesicles or cells may include extracellular vesicles in the number of 1 × 10 6 to 1 × 10 13 particles or 1 × 10 4 to × 10 8 cells.
상기 세포밖 소포체 또는 상기 세포는 100 μL 내지 10 mL의 용액에 포함될 수 있다. 일 양태로서, 상기 세포밖 소포체 또는 상기 세포는 100 μL 내지 5 mL의 용액에 포함될 수 있고, 다른 양태로서, 상기 세포밖 소포체 또는 상기 세포는 100 μL 내지 3 mL의 용액에 포함될 수 있으며, 또 다른 양태로서, 상기 세포밖 소포체는 100 μL 내지 2 mL 용액에 포함될 수 있다. The extracellular vesicles or the cells may be included in a solution of 100 μL to 10 mL. In one embodiment, the extracellular vesicles or the cells may be contained in a solution of 100 μL to 5 mL, and in another embodiment, the extracellular vesicles or the cells may be contained in a solution of 100 μL to 3 mL, and in another embodiment, the extracellular vesicles or the cells may be contained in a solution of 100 μL to 3 mL. In one embodiment, the extracellular vesicles may be contained in a 100 μL to 2 mL solution.
고흡수성 수지 표면에 세포밖 소포체 및/또는 세포를 고정하는 바람직한 양태로서, 상기 1 × 106 내지 1 × 1013 입자수 또는 1 × 104 내지 × 108 세포수로 포함하는 100 내지 2000 μL 부피의 용액으로 제조되는 것을 특징으로 할 수 있다. In a preferred embodiment of fixing extracellular vesicles and/or cells on the surface of the superabsorbent polymer, a volume of 100 to 2000 μL containing the number of particles of 1 × 10 6 to 1 × 10 13 or the number of cells of 1 × 10 4 to × 10 8 It may be characterized as being manufactured from a solution of.
다른 양태로서, 상기 세포밖 소포체를 포함하는 용액은 세포밖 소포체를 약 1 × 106 내지 약 1 × 1013 입자수로 포함하는 100 내지 2000 μL 부피, 예컨대, 약 100 내지 약 500 μL 부피의 용액으로 제조되는 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 약 5 × 109 내지 약 5 × 1011 입자수로 포함하는 약 100 내지 약 500 μL 부피의 용액으로 제조되는 것을 특징으로 할 수 있으며, 예컨대, 약 1 × 1010 입자수로 포함하는 약 200 μL 부피의 용액으로 제조되는 것을 특징으로 할 수 있다. In another embodiment, the solution containing the extracellular vesicles is a solution containing about 1 × 10 6 to about 1 × 10 13 extracellular vesicles in a volume of 100 to 2000 μL, for example, a volume of about 100 to about 500 μL. It may be characterized in that it is prepared as a solution, preferably in a volume of about 100 to about 500 μL containing about 5 × 10 9 to about 5 × 10 11 particles, for example, It may be characterized as being prepared as a solution with a volume of about 200 μL containing about 1 × 10 10 particles.
일 양태로서, 상기 세포밖 소포체를 포함하는 용액은 세포밖 소포체를 1 × 106 내지 1 × 1013 입자수로 포함하는 100 내지 2000 μL 부피의 용액으로 제조되는 것을 특징으로 할 수 있다. In one embodiment, the solution containing the extracellular vesicles may be prepared as a solution containing 1 × 10 6 to 1 × 10 13 extracellular vesicles with a volume of 100 to 2000 μL.
상기 세포를 포함하는 용액은 세포를 약 1 × 104 내지 1 × 108 세포수로 포함하는 100 내지 2000 μL 부피, 예컨대, 약 100 내지 약 500 μL 부피의 용액으로 제조되는 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 약 5 × 104 내지 약 5 × 107 세포수로 포함하는 약 100 내지 약 500 μL 부피의 용액으로 제조되는 것을 특징으로 할 수 있으며, 예컨대, 약 6 × 105 세포수로 포함하는 약 200 μL 부피의 용액으로 제조되는 것을 특징으로 할 수 있다. The solution containing the cells may be prepared as a solution containing about 1 × 10 4 to 1 × 10 8 cells in a volume of 100 to 2000 μL, for example, a volume of about 100 to about 500 μL. , Preferably, it may be prepared as a solution with a volume of about 100 to about 500 μL containing about 5 × 10 4 to about 5 × 10 7 cells, for example, about 6 × 10 5 cells. It may be characterized as being prepared as a solution with a volume of about 200 μL.
일 양태로서, 상기 세포를 포함하는 용액은 1 × 104 내지 × 108 세포수로 포함하는 100 내지 2000 μL 부피의 용액으로 제조되는 것을 특징으로 할 수 있다. In one embodiment, the solution containing the cells may be prepared as a solution containing 1 × 10 4 to × 10 8 cells with a volume of 100 to 2000 μL.
본 발명에 있어서, 상기 세포밖 소포체를 포함하는 용액은 생물학적 시료로부터 세포밖 소포체 분리용 키트를 사용하여 얻어진 저농도의 세포밖 소포체를 포함하는 용액일 수 있다.In the present invention, the solution containing extracellular vesicles may be a solution containing low concentration of extracellular vesicles obtained using a kit for isolating extracellular vesicles from biological samples.
상기 세포밖 소포체 분리용 키트로는 세포 배양액으로부터 세포밖 소포체를 분리하는데 중점이 맞춰진 제품이면 특별히 제한되지 않으며, 일 예로 Exoquick, Exo-spin 등 세포밖 소포체 분리용 키트들일 수 있다.The kit for isolating extracellular vesicles is not particularly limited as long as it is a product focused on isolating extracellular vesicles from cell culture medium, and examples may include kits for isolating extracellular vesicles such as Exoquick and Exo-spin.
상기 생물학적 시료는 액체 중에 세포밖 소포체를 함유하거나 함유할 가능성이 있는 것이라면 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게는 원핵세포, 진핵세포, 박테리아, 진균, 효모, 줄기세포 및 식물, 동물로부터 분리된 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 배양한 배양액이거나, 혈액, 타액, 소변, 유즙, 양수, 복수 등의 체액 또는 이를 배양한 배양액일 수 있다.The biological sample is not particularly limited as long as it contains or is likely to contain extracellular vesicles in the liquid, but is preferably composed of prokaryotic cells, eukaryotic cells, bacteria, fungi, yeast, stem cells, and cells isolated from plants and animals. It may be a culture medium obtained by culturing one or more selected from the group, or it may be a body fluid such as blood, saliva, urine, milk, amniotic fluid, or ascites, or a culture medium obtained by culturing the same.
상기 세포밖 소포체는 고세균(Archaea), 원핵생물(Prokarya) 또는 진핵생물(Eukarya)의 세포로부터 유래한 생체 나노입자를 통칭하며, 엑소좀(exosome), 아그로좀(argosomes), 덱소좀(dexosomes), 엑토좀(ectosomes), 엑소베지클(exovesicle), 온코좀(oncosome), 프로미노좀(prominosome), 프로스타좀(prostasome), 톨레로좀(tolerosome), 미세입자(microparticle), 미세소포(microvesicle), 나노소포(nanovesicle), 수포성 소포(blebbing vesicle), 출아성 소포(budding vesicle), 세포밖 소포체-유사 소포(exosome-like vesicle), 매트릭스 소포(matrix vesicle), 막 소포(membrane vesicle), 탈피성 소포(shedding vesicle), 막 입자(membrane particle), 탈피성 미세소포(shedding microvesicle), 막 수포(membrane bleb), 에피디디모좀(epididimosome), 프로미니노좀(promininosome), 텍소좀(texosome) 또는 아키오좀(archeosome)을 포함할 수 있고, 바람직하게는 엑소좀(exosome), 미세소포(microvesicle) 및 미세입자(microparticle)일 수 있고, 가장 바람직하게는 엑소좀 (exosome)일 수 있다.The extracellular vesicles collectively refer to biological nanoparticles derived from cells of Archaea, Prokarya, or Eukarya, and include exosomes, argosomes, and dexosomes. , ectosomes, exovesicle, oncosome, prominosome, prostasome, tolerosome, microparticle, microvesicle ( microvesicle, nanovesicle, blebbing vesicle, budding vesicle, exosome-like vesicle, matrix vesicle, membrane vesicle ), shedding vesicle, membrane particle, shedding microvesicle, membrane bleb, epididimosome, promininosome, texosome ( It may include a texosome) or an archeosome, preferably an exosome, a microvesicle, and a microparticle, and most preferably an exosome. .
상기 세포는 고세균(Archaea), 원핵생물(Prokarya) 또는 진핵생물(Eukarya)의 세포일 수 있다. The cells may be cells of Archaea, Prokarya, or Eukarya.
상기 고흡수성 폴리머로 제조된 수지는 자기 무게보다 수십 배에서 수백 배(최대 300배)까지의 용매를 흡수할 수 있고, 재료 자체가 용매를 빨아들이므로 탈지면이나 무명천 같은 것보다 흡수량이 많으며 웬만한 압력에는 용매를 방출하지 않아, 유아용, 성인용 및 동물용 기저귀에 가장 많이 사용되고 있다.Resins made from the above-mentioned high-absorbency polymer can absorb solvents tens to hundreds of times their weight (up to 300 times), and since the material itself absorbs solvents, the absorption amount is greater than that of cotton wool or cheesecloth, and it can absorb solvents at a level of up to 300 times its own weight. Since it does not emit solvents, it is most often used in diapers for infants, adults, and animals.
상기 고흡수성 폴리머는 통상 백색의 분말로, 이를 일정한 부피를 가지도록, 예컨대 구형의 비드 형태로 제작하면, 용매를 흡수하고 팽윤되어 겔화되는 성질을 가지고 있는데, 본 발명에서는 상기 팽윤된 비드의 표면에 세포밖 소포체 또는 세포가 고정된 상태로 존재할 수 있음을 최초로 발명한 점에 그 주요 특징 중 하나이다. The superabsorbent polymer is usually a white powder, and when manufactured to have a certain volume, for example, in the form of a spherical bead, it has the property of absorbing a solvent, swelling, and gelling. In the present invention, it is added to the surface of the swollen bead. One of its main characteristics is that it was the first to discover that extracellular vesicles or cells can exist in a fixed state.
본 발명에 있어서, 상기 고흡수성 수지는 0.5 내지 10mm의 직경을 가지는 것을 고흡수성 수지 비드인 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 약 1mm 내지 약 3mm 일 수 있다. In the present invention, the superabsorbent polymer may be characterized as a superabsorbent polymer bead having a diameter of 0.5 to 10 mm, preferably about 1 mm to about 3 mm.
본 발명은 다른 관점에서, 상기 방법에 따라 제조된 세포밖 소포체 및/또는 세포가 표면 고정된 고흡수성 수지에 관한 것이다.From another aspect, the present invention relates to a superabsorbent resin on which extracellular vesicles and/or cells prepared according to the above method are immobilized on the surface.
상기 세포밖 소포체 및/또는 세포가 표면 고정된 고흡수성 수지는 질환 진단 용도로 활용될 수 있다. The superabsorbent resin on which extracellular vesicles and/or cells are immobilized on the surface can be used for disease diagnosis.
따라서, 본 발명은 일 양태로서, 세포밖 소포체 및/또는 세포가 표면 고정된 질환 진단용 고흡수성 수지를 제공할 수 있다. Accordingly, in one aspect, the present invention can provide a superabsorbent resin for diagnosing diseases in which extracellular vesicles and/or cells are fixed to the surface.
본 발명은 다른 양태로서, 세포밖 소포체 및/또는 세포가 표면 고정된 고흡수성 수지를 포함하는 질환 진단용 조성물을 제공할 수 있다. In another aspect, the present invention can provide a composition for diagnosing diseases comprising a superabsorbent resin on which extracellular vesicles and/or cells are fixed to the surface.
본 발명은 또 다른 양태로서, 세포밖 소포체 및/또는 세포가 표면 고정된 고흡수성 수지를 포함하는 질환 진단용 키트를 제공할 수 있다. In another aspect, the present invention can provide a kit for diagnosing diseases comprising a superabsorbent resin on which extracellular vesicles and/or cells are immobilized on the surface.
상기 키트는, 시료로부터 세포밖 소포체 및/또는 세포를 분리하는 시약과 함께 고흡수성 수지를 포함하고, 추가적으로 시료로부터 세포밖 소포체 및/또는 세포를 분리하는 방법 및/또는 분리된 세포밖 소포체 및/또는 세포를 고흡수성 수지에 고정하는 방법을 지시하는 매뉴얼을 추가로 포함할 수 있다. The kit includes a superabsorbent resin together with a reagent for separating extracellular vesicles and/or cells from a sample, and additionally includes a method for isolating extracellular vesicles and/or cells from a sample and/or isolated extracellular vesicles and/or Alternatively, a manual instructing how to fix cells on superabsorbent resin may be additionally included.
본 발명에 있어서, 상기 질환은 암일 수 있다. In the present invention, the disease may be cancer.
본 발명에서 진단의 대상이 되는 질환으로 상기 "암"은 포유류에서 전형적으로 조절되지 않는 세포 성장으로 특징 지어진 생리적 상태를 나타내거나 가리킨다. 본 발명에서 진단의 대상이 되는 암은 유방암, 난소암, 대장암, 위암, 간암, 췌장암, 자궁경부암, 갑상선암, 부갑상선암, 폐암, 비소세포성폐암, 전립선암, 담낭암, 담도암, 비호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 혈액암, 방광암, 신장암, 흑색종, 결장암, 골암, 피부암, 두부암, 자궁암, 직장암, 뇌종양, 항문부근암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 질암, 음문암종, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계(CNS central nervous system) 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 및 뇌하수체 선종으로 구성된 군에서 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정되지는 않으며, 세포밖 소포체 또는 세포에 포함된 바이오마커로 진단 가능한 암은 제한없이 본 발명에 따른 조성물 또는 키트로 진단이 가능하다. As a disease to be diagnosed in the present invention, “cancer” refers to or refers to a physiological condition typically characterized by uncontrolled cell growth in mammals. Cancers subject to diagnosis in the present invention include breast cancer, ovarian cancer, colon cancer, stomach cancer, liver cancer, pancreatic cancer, cervical cancer, thyroid cancer, parathyroid cancer, lung cancer, non-small cell lung cancer, prostate cancer, gallbladder cancer, biliary tract cancer, and non-Hodgkin lymphoma. , Hodgkin's lymphoma, blood cancer, bladder cancer, kidney cancer, melanoma, colon cancer, bone cancer, skin cancer, head cancer, uterine cancer, rectal cancer, brain tumor, perianal cancer, fallopian tube carcinoma, endometrial carcinoma, vaginal cancer, vulvar carcinoma, esophageal cancer, small intestine. Cancer, endocrine cancer, adrenal cancer, soft tissue sarcoma, urethral cancer, penile cancer, ureteral cancer, renal cell carcinoma, renal pelvic carcinoma, CNS central nervous system tumor, primary CNS lymphoma, spinal cord tumor, brainstem glioma, and It may be selected from the group consisting of pituitary adenoma, but is not limited thereto, and cancers that can be diagnosed using extracellular vesicles or biomarkers contained in cells can be diagnosed using the composition or kit according to the present invention without limitation.
하지만, 본 발명은 세포밖 소포체 및/또는 세포에 포함된 바이오마커로 진단 가능한 모든 질병 또는 질환에 적용될 수 있을 것이다.However, the present invention may be applied to any disease or condition that can be diagnosed using biomarkers contained in extracellular vesicles and/or cells.
본 발명에서 상기 "진단"은 특정 질병 또는 질환에 대한 대상(subject)의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 대상이 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 대상의 예후(prognosis)(예컨대, 전-전이성 또는 전이성 암 상태의 동정, 암의 단계 결정 또는 치료에 대한 암의 반응성 결정)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링하는 것)을 포함한다. 본 발명의 목적상, 상기 진단은 상기한 암의 발병 여부 또는 발병 가능성(위험성)을 확인하는 것이다.In the present invention, the "diagnosis" refers to determining the subject's susceptibility to a specific disease or condition, determining whether the subject currently has a specific disease or condition, and determining whether the subject currently has a specific disease or condition. Determining a subject's prognosis (e.g., identifying a pre-metastatic or metastatic cancer state, determining the stage of the cancer, or determining the responsiveness of the cancer to treatment), or therametrics (e.g., determining the efficacy of a treatment) Includes monitoring the state of an object to provide information. For the purpose of the present invention, the diagnosis is to confirm whether or not the cancer has developed or the possibility (risk) of developing it.
본 발명에서, 상기 진단은 고흡수성 수지 표면에 고정된 세포밖 소포체 및/또는 세포는 핵산 분자 증폭 반응을 이용한 바이오마커 진단에 사용될 수 있으며, 예컨대, 상기 단일 핵산 분자 증폭 반응은 지수함수적 증폭 반응(EXPAR), 롤링 써클 증폭(RCA), 또는 앱타머 저지제-DNA-효소(IDE), 또는 앱타머-IDE 시스템일 수 있다. In the present invention, extracellular vesicles and/or cells immobilized on the surface of a superabsorbent polymer can be used for biomarker diagnosis using a nucleic acid molecule amplification reaction. For example, the single nucleic acid molecule amplification reaction is an exponential amplification reaction. (EXPAR), rolling circle amplification (RCA), or aptamer inhibitor-DNA-enzyme (IDE), or aptamer-IDE system.
일 양태로서, 고흡수성 수지 표면에 고정된 세포밖 소포체 또는 세포에 존재하는 핵산 표적이 롤링 써클 증폭(RCA) 또는 EXPAR를 이용하여 증폭되어 진단에 사용될 수 있다. In one embodiment, nucleic acid targets present in extracellular vesicles or cells immobilized on the surface of a superabsorbent polymer can be amplified using rolling circle amplification (RCA) or EXPAR and used for diagnosis.
상기 고흡수성 수지 표면에 고정된 세포밖 소포체의 함유량은 1 × 103 내지 1 × 1013 입자수, 바람직하게는 1 × 106 내지 1 × 1013 입자수인 것이 진단의 민감도 면에서 바람직하다. The content of extracellular vesicles fixed to the surface of the superabsorbent polymer is preferably 1 × 10 3 to 1 × 10 13 particles, preferably 1 × 10 6 to 1 × 10 13 particles in terms of diagnostic sensitivity.
본 발명은 또 다른 관점에서, 다음 단계를 포함하는 세포밖 소포체 및/또는 세포를 포함하는 용액의 용매 교체방법에 관한 것이다:In another aspect, the present invention relates to a method for solvent replacement of a solution containing extracellular vesicles and/or cells comprising the following steps:
(a) 상기 방법에 따라 고흡수성 수지 표면에 세포밖 소포체 및/또는 세포를 고정시키는 단계; 및(a) fixing extracellular vesicles and/or cells on the surface of superabsorbent polymer according to the above method; and
(b) 상기 세포밖 소포체 및/또는 세포가 표면 고정된 고흡수성 수지를 교체용 용매에 재현탁시키는 단계. (b) resuspending the superabsorbent polymer on which the extracellular vesicles and/or cells are immobilized on the surface in a replacement solvent.
본 발명에 있어서, 상기 교체용 용매는 상기 세포밖 소포체 및/또는 세포를 용해시키거나, 이후의 실험이나 진단 단계에 활용하기에 적합한 용매일 수 있으며, 예컨대 PBS, 증류수 또는 배양배지일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.In the present invention, the replacement solvent may be a solvent suitable for dissolving the extracellular vesicles and/or cells or for use in subsequent experiments or diagnostic steps, such as PBS, distilled water, or culture medium. It is not limited to this.
다른 양태로서, 상기 용매는 완충 용액이나 실험용 시약일 수 있다. In another aspect, the solvent may be a buffer solution or an experimental reagent.
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계는 물리적인 방법, 예컨대, 피펫팅(pipetting) 또는 보텍싱(vortexing)으로 재현탁시키는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.In the present invention, step (b) may be characterized by resuspending by a physical method, such as pipetting or vortexing, but is not limited thereto.
본 발명은 또한 다음 단계를 포함하는 세포밖 소포체 및/또는 세포를 포함하는 용액의 제조방법을 제공한다:The present invention also provides a method for preparing a solution containing extracellular vesicles and/or cells comprising the following steps:
(a) 상기 방법에 따라 고흡수성 수지 표면에 세포밖 소포체 및/또는 세포를 고정시키는 단계; (a) fixing extracellular vesicles and/or cells on the surface of superabsorbent polymer according to the above method;
(b) 상기 세포밖 소포체 및/또는 세포가 표면 고정된 고흡수성 수지를 교체용 용매에 재현탁시키는 단계; 및(b) resuspending the superabsorbent polymer on which the extracellular vesicles and/or cells are immobilized on the surface in a replacement solvent; and
(c) 교체용 용매에 재현탄된 세포밖 소포체 및/또는 세포를 포함하는 용액을 회수하는 단계.(c) recovering the solution containing extracellular vesicles and/or cells resuspended in the replacement solvent.
실시예Example
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. These examples are only for illustrating the present invention in more detail, and it will be apparent to those skilled in the art that the scope of the present invention is not limited by these examples according to the gist of the present invention. .
실시예 1. HEK293T cell 유래 세포밖 소포체 분리Example 1. Isolation of extracellular vesicles derived from HEK293T cells
HEK293T cell(ATCC)을 100 mm cell culture dish (SPL Life Sciences, Korea)에서 10% Exosome-Depleted Fetal bovine serum (Gibco, USA), 1% 페니실린/스트렙토마이신(Gibco)을 포함한 DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium, Cellgro, USA)으로 37℃ 및 5% CO2 조건으로 유지하며 2~3일간 배양하였다. 50 mL conical tube (SPL Life Sciences)에 세포배양배지를 회수하여 3,000 x g에서 15분간 원심분리하여 cell debris를 제거하였다. 0.22-μm cellulose acetate syringe-filter (GVS, Italy)로 필터링 하였다. ExoQuick™ Exosome Precipitation Solution(System Bioscience, USA)을 15 ml conical tube (SPL Life Sciences)에서 위 세포배양배지와 1:5 부피 비율로 혼합한 후 4℃에서 16시간 동안 인큐베이션 하였다. 위 용액을 30분 동안 1,500 x g에서 원심분리한 후 상층액을 제거한 후 생기는 pellet에 1X N.F PBS를 첨가하여 피펫팅 하여 용해시켜 세포밖 소포체 용액을 수득하였다. HEK293T cells (ATCC) were grown in DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) containing 10% Exosome-Depleted Fetal bovine serum (Gibco, USA) and 1% penicillin/streptomycin (Gibco) in a 100 mm cell culture dish (SPL Life Sciences, Korea). , Cellgro, USA) and cultured for 2 to 3 days, maintained at 37°C and 5% CO 2 conditions. Cell culture medium was collected in a 50 mL conical tube (SPL Life Sciences) and centrifuged at 3,000 xg for 15 minutes to remove cell debris. Filtered with a 0.22-μm cellulose acetate syringe-filter (GVS, Italy). ExoQuick™ Exosome Precipitation Solution (System Bioscience, USA) was mixed with the above cell culture medium in a 1:5 volume ratio in a 15 ml conical tube (SPL Life Sciences) and incubated at 4°C for 16 hours. The above solution was centrifuged at 1,500
실시예 2. 세포밖 소포체 형광 염색Example 2. Extracellular vesicle fluorescence staining
세포밖 소포체 용액 297 μL에 BODIPY™FL C5-Ceramide (Invitrogen) 3 μL (100:1 부피비)를 첨가하여 혼합하고, 37℃에서 20분간 인큐베이션 하였다. Pierce™ Protein Concentrators PES, 100K MWCO, 0.5 mL (Thermo scientific)에 로딩 후 15,000 × g에서 10분간 원심분리하였다. 필터 위에 남아있는 용액을 회수하였다.3 μL (100:1 volume ratio) of BODIPY™FL C5-Ceramide (Invitrogen) was added to 297 μL of extracellular vesicle solution, mixed, and incubated at 37°C for 20 minutes. It was loaded into Pierce™ Protein Concentrators PES, 100K MWCO, 0.5 mL (Thermo scientific) and centrifuged at 15,000 × g for 10 minutes. The solution remaining on the filter was recovered.
실시예 3. 비드 표면에 세포밖 소포체 고정 Example 3. Fixation of extracellular vesicles on the bead surface
PBS를 이용하여 5 × 1010 particles/200 μL 농도의 형광 염색된 세포밖 소포체 용액을 제조하였다. 대조군으로는 PBS 198 μL에 BODIPY™FL C5-Ceramide 2 μL를 혼합한 용액(free dye 용액)과 PBS를 사용하였다. 고흡수성 수지 비드(Poly(acrylamide-co-acrylic acid) sap beads, CAS no. 9003-06-9) 16 mg (1개)를 상기 용액 200 μL에 첨가하고 2시간 동안 인큐베이션 하였다. 칼을 이용하여 위 고흡수성 수지 비드를 2 mm 두께로 자른 후 24 well plate (SPL Life Sciences) 위에 올려 형광현미경으로 분석하였다. A fluorescently stained extracellular vesicle solution with a concentration of 5 × 10 10 particles/200 μL was prepared using PBS. As a control, 198 μL of PBS mixed with 2 μL of BODIPY™FL C5-Ceramide (free dye solution) and PBS were used. Add 16 mg (1 piece) of superabsorbent resin beads (Poly(acrylamide-co-acrylic acid) sap beads, CAS no. 9003-06-9) to 200 μL of the above solution. Incubation was performed for 2 hours. The above superabsorbent polymer beads were cut into 2 mm thick pieces using a knife, placed on a 24 well plate (SPL Life Sciences), and analyzed under a fluorescence microscope.
그 결과, 도 1에서와 같이 대조군인 free dye는 고흡수성 수지 비드 내부로 침투하여 비드 전체가 형광을 나타내었으나, 본 발명에 따른 세포밖 소포체는 비드 표면에 고정되어 있었으며, 따라서 비드 표면에서만 강한 형광이 관찰되었다. As a result, as shown in Figure 1, the control free dye penetrated into the inside of the superabsorbent resin bead and the entire bead showed fluorescence, but the extracellular vesicles according to the present invention were fixed to the bead surface and therefore showed strong fluorescence only on the bead surface. This was observed.
실시예 4. 비드 표면에 세포 고정Example 4. Cell fixation on bead surface
PBS를 이용하여 HEK293T cell을 3 × 103 cells/μL 농도가 되도록 형광 염색된 세포 용액을 제조하였다. 고흡수성 수지 비드(Poly(acrylamide-co-acrylic acid) sap beads, CAS no. 9003-06-9) 16 mg (1개)를 상기 용액 200 μL에 첨가하고 2시간 동안 인큐베이션 하였다. 칼을 이용하여 위 고흡수성 수지 비드를 2 mm 두께로 자른 후 24 well plate (SPL Life Sciences) 위에 올려 형광현미경으로 분석하였다. A fluorescently stained cell solution was prepared using PBS to provide HEK293T cells at a concentration of 3 × 10 3 cells/μL. 16 mg (1 piece) of superabsorbent resin beads (Poly(acrylamide-co-acrylic acid) sap beads, CAS no. 9003-06-9) was added to 200 μL of the solution and incubated for 2 hours. The above superabsorbent polymer beads were cut into 2 mm thick pieces using a knife, placed on a 24 well plate (SPL Life Sciences), and analyzed under a fluorescence microscope.
그 결과, 도 1에서와 같이 대조군인 free dye는 고흡수성 수지 비드 내부로 침투하여 비드 전체가 형광을 나타내었으나, 본 발명에 따른 세포 역시 비드 표면에 고정되어 있었으며, 따라서 비드 표면에서만 강한 형광이 관찰되었다. As a result, as shown in Figure 1, the control free dye penetrated into the inside of the superabsorbent resin bead and the entire bead showed fluorescence, but the cells according to the present invention were also fixed to the bead surface, and therefore strong fluorescence was observed only on the bead surface. It has been done.
실시예 5. 비드 표면에 고정된 세포밖 소포체의 회수 온도 비교Example 5. Comparison of recovery temperatures of extracellular vesicles immobilized on the bead surface
실시예 3에서 기술된 바와 같이 비드 표면에 세포밖 소포체를 고정하였다. 이 때, 온도의 영향을 확인하기 위하여 세포밖 소포체 고정 온도를 각각 4℃와 25℃로 설정하였다. 이후, 세포밖 소포체가 고정된 비드에 PBS 용액 1 mL을 첨가한 후 pipetting을 통해 고정된 세포밖 소포체를 회수하였다. 회수된 용액 내 세포밖 소포체의 개수는 nanoparticle tracking analysis를 이용하여 분석하였다. 고정에 사용된 세포밖 소포체(Input)의 개수를 100%으로 하여 회수된 세포밖 소포체(Output)의 개수를 백분율로 환산하였다. Extracellular vesicles were immobilized on the bead surface as described in Example 3. At this time, in order to check the effect of temperature, the extracellular vesicle fixation temperatures were set to 4°C and 25°C, respectively. Afterwards, 1 mL of PBS solution was added to the beads on which the extracellular vesicles were immobilized, and the immobilized extracellular vesicles were recovered through pipetting. The number of extracellular vesicles in the recovered solution was analyzed using nanoparticle tracking analysis. The number of extracellular vesicles (Input) used for fixation was set as 100%, and the number of recovered extracellular vesicles (Output) was converted to a percentage.
도 2에서와 같이, 고정 및 회수 온도와는 무관하게 대부분의 고정된 세포밖 소포체가 회수될 수 있음을 알 수 있다.As shown in Figure 2, it can be seen that most of the fixed extracellular vesicles can be recovered regardless of the fixation and recovery temperature.
실시예 6. 세포밖 소포체 표면 바이오 마커 신호 증폭 후 비드 표면에 고정을 통한 진단 Example 6. Diagnosis through amplification of extracellular vesicle surface biomarker signal and immobilization on bead surface
비드 표면에 세포밖 소포체를 고정하는 상기 방법을 이용한 세포밖 소포체 기반 질병 진단 효율을 확인해 보고자, 세포밖 소포체의 표면 단백질 바이오 마커(CD63)를 롤링 써클 증폭 (RCA)을 이용하여 형광 검출하였다. 각각 1 × 109, 5 × 109 또는 1 × 1010 입자수의 세포밖 소포체를 대표적인 표면 단백질인 CD63에 특이적으로 결합하는 DNA 압타머(CAC CCC ACC TCG CTC CCG TGA CAC TAA TGC TAT TTT TCG TAT CTG TGC TCA GTA AGA, 바이오니아) 100 nM 로 타겟팅 하였다. DNA 압타머는 상보적으로 설계된 동일 농도의 패드락 프로브(Phosphate-CAC AGA TAC GTT ATA CCC GGT CGC TTT AGC CTT CTT ACT GAG, 바이오니아)에 혼성화되고, T4 DNA 리가제(Thermo Scientific)에 의해 패드락 프로브가 연결되어 반응 주형으로 작용하는 단일가닥 환형 DNA가 형성되도록 하였다.To confirm the efficiency of extracellular vesicle-based disease diagnosis using the above method of fixing extracellular vesicles on the bead surface, fluorescence detection of the surface protein biomarker (CD63) of extracellular vesicles was performed using rolling circle amplification (RCA). DNA aptamers (CAC CCC ACC TCG CTC CCG TGA CAC TAA TGC TAT TTT TCG) that specifically bind to CD63, a representative surface protein, were applied to extracellular vesicles of 1 × 10 9 , 5 × 10 9 or 1 × 10 10 particles, respectively. TAT CTG TGC TCA GTA AGA, Bioneer) was targeted at 100 nM. The DNA aptamer is hybridized to the same concentration of complementary designed Padlock probe (Phosphate-CAC AGA TAC GTT ATA CCC GGT CGC TTT AGC CTT CTT ACT GAG, Bioneer), and the Padlock probe is lysed by T4 DNA ligase (Thermo Scientific). were linked to form single-stranded circular DNA that served as a reaction template.
상기 단일가닥 환형 DNA에 10U phi29 polymerase (Thermo Scientific), 10X reaction buffer (Thermo Scientific), 10mM dNTP mix (New England Biolabs)를 첨가하여 롤링 써클 증폭 용액 180μL을 제조하였다. 이어 30℃에서 4시간을 인큐베이션하여 증폭을 하였으며, 검출을 위해 상기 용액에 형광 dye (SYBRTM Green II RNA Gel Stain, Thermo Scientific) 20μL를 첨가하여 실험군을 제조하였다. 10U phi29 polymerase (Thermo Scientific), 10X reaction buffer (Thermo Scientific), and 10mM dNTP mix (New England Biolabs) were added to the single-stranded circular DNA to prepare 180 μL of rolling circle amplification solution. Next, amplification was performed by incubation at 30°C for 4 hours, and an experimental group was prepared by adding 20 μL of fluorescent dye (SYBR TM Green II RNA Gel Stain, Thermo Scientific) to the solution for detection.
시료 대조군으로는 PBS 180 μL에 10 × SYBRTM Green II RNA Gel Stain 20 μL를 혼합한 용액(free dye 용액), 세포밖 소포체를 포함하지 않는 동일 부피의 롤링 써클 증폭 용액에 SYBRTM Green II RNA Gel Stain이 혼합된 용액을 사용하였다. As a sample control, 20 μL of 10 A solution mixed with stain was used.
15 mg (1개) 고흡수성 수지 비드 (Poly(acrylamide-co-acrylic acid) sap beads, CAS no. 9003-06-9)를 상기 증폭반응에 따른 각 용액(실험군 또는 시료 대조군)에 첨가하고 용액을 완전 흡수한 뒤 칼을 이용하여 위 고흡수성 수지 비드를 반으로 자른 후 형광현미경으로 분석하였다. 15 mg (1 piece) of superabsorbent resin beads (Poly(acrylamide-co-acrylic acid) sap beads, CAS no. 9003-06-9) was added to each solution (experimental group or sample control group) according to the amplification reaction above and the solution After complete absorption, the superabsorbent polymer beads were cut in half using a knife and analyzed under a fluorescence microscope.
한편, 또 다른 대조군으로는 상기 실험군을 고흡수성 수지 비드와 반응시키지 않고 형광현미경으로 분석하였다. Meanwhile, as another control group, the experimental group was analyzed using a fluorescence microscope without reacting with superabsorbent resin beads.
그 결과, 도 3A에서와 같이 대조군인 free dye 용액과 세포밖 소포체를 포함하지 않고 롤링 써클 증폭한 경우에는 고흡수성 수지 비드로 고정하여도 세포밖 소포체의 형광 신호가 확인되지 않은 반면, 본 발명에서와 같이 각각 1 × 109, 5 × 109 또는 1 × 1010 입자수로 세포밖 소포체를 포함하여 롤링 서클 증폭하고 고흡수성 수지 비드로 고정한 경우, 세포밖 소포체 농도 의존적인 형광 신호의 증가가 관찰되었다. As a result, as shown in Figure 3A, in the case of rolling circle amplification without the control free dye solution and extracellular vesicles, the fluorescence signal of extracellular vesicles was not confirmed even when fixed with superabsorbent resin beads, whereas in the present invention, When rolling circles containing extracellular vesicles were amplified with particle numbers of 1 × 10 9 , 5 × 10 9 or 1 × 10 10 and fixed with superabsorbent resin beads, a concentration-dependent increase in the fluorescent signal of extracellular vesicles was observed. It has been done.
한편, 도 3B에서와 같이 각각 1 × 109, 5 × 109 또는 1 × 1010 입자수로 포함하여 롤링 서클 증폭한 경우에도 고흡수성 수지 비드로 고정하지 않은 경우에는 형광 신호가 관찰되지 않았다.On the other hand, as shown in Figure 3B, even when rolling circle amplification was performed including 1 × 10 9 , 5 × 10 9 or 1 × 10 10 particles, no fluorescence signal was observed when not fixed with superabsorbent resin beads.
상기와 같은 결과로부터, 본 발명에서와 같이 세포밖 소포체를 비드에 고정된 상태로 바이오마커 진단시 진단 성능이 현저히 개선됨을 확인할 수 있었다. From the above results, it was confirmed that diagnostic performance was significantly improved when diagnosing biomarkers with extracellular vesicles fixed to beads as in the present invention.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.As the specific parts of the present invention have been described in detail above, it is clear to those skilled in the art that these specific techniques are merely preferred embodiments and do not limit the scope of the present invention. something to do. Accordingly, the actual scope of the present invention will be defined by the appended claims and their equivalents.
Claims (16)
(a) 세포밖 소포체 또는 세포를 포함하는 용액을 고흡수성 수지와 혼합하는 단계; 및
(b) 상기 혼합 단계 후, 1 시간 내지 10 시간 인큐베이션 하는 단계.
A method for immobilizing extracellular vesicles or cells on a superabsorbent polymer surface comprising the following steps:
(a) mixing a solution containing extracellular vesicles or cells with a superabsorbent polymer; and
(b) After the mixing step, incubation for 1 hour to 10 hours.
상기 고흡수성 수지는 전분(starch)에 아크릴로니트릴(acrylonitrile), 아크릴산(acrylic acid), 아크릴아미드(acrylamide) 또는 메타크릴레이트(methacrylate)의 모노머를 공중합시킨 전분계 고분자; 카르복시메틸 셀룰로오스(CMC)에 상기의 모노머를 공중합시킨 셀룰로오스계 고분자; 및 폴리비닐알코올(polyvinyl alcohol)-메타아크릴산(methacrylic acid) 블록공중합체, 스티렌(stryene)-무수말레인산(maleic anhydride) 공중합체, 폴리아크릴아미드계(polyacryl amide) 또는 폴리옥시에틸렌계(polyoxyethylene)를 포함하는 합성수지계 고분자;로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 고흡수성 폴리머(SAP)로 제조되는 것을 특징으로 하는, 고흡수성 수지 표면에 세포밖 소포체 또는 세포를 고정하는 방법.
According to paragraph 1,
The superabsorbent resin is a starch-based polymer obtained by copolymerizing starch with monomers of acrylonitrile, acrylic acid, acrylamide, or methacrylate; Cellulose-based polymer obtained by copolymerizing the above monomer with carboxymethyl cellulose (CMC); and polyvinyl alcohol-methacrylic acid block copolymer, styrene-maleic anhydride copolymer, polyacryl amide or polyoxyethylene. A method of fixing extracellular vesicles or cells to the surface of a superabsorbent resin, characterized in that it is manufactured from at least one superabsorbent polymer (SAP) selected from the group consisting of a synthetic resin-based polymer comprising:
상기 고흡수성 수지는 폴리(아크릴아미드-코-아크릴산)((Poly(acrylamide-co-acrylic acid))) 고흡수성 수지인 것을 특징으로 하는, 고흡수성 수지 표면에 세포밖 소포체 또는 세포를 고정하는 방법.
According to paragraph 1,
A method of fixing extracellular vesicles or cells to the surface of a superabsorbent polymer, wherein the superabsorbent resin is a poly(acrylamide-co-acrylic acid)) superabsorbent resin. .
상기 세포밖 소포체 또는 세포를 포함하는 용액은 세포밖 소포체를 1 × 106 내지 1 × 1013 입자수 또는 1 × 104 내지 × 108 세포수로 포함하는 것을 특징으로 하는, 고흡수성 수지 표면에 세포밖 소포체 또는 세포를 고정하는 방법.
According to paragraph 1,
The solution containing the extracellular vesicles or cells is characterized in that it contains extracellular vesicles in the number of 1 × 10 6 to 1 × 10 13 particles or 1 × 10 4 to × 10 8 cells on the surface of the superabsorbent resin. A method of fixing extracellular vesicles or cells.
The method of claim 1, wherein the superabsorbent polymer is a superabsorbent polymer bead having a diameter of 1 to 10 mm.
A superabsorbent resin having extracellular vesicles or cells immobilized on its surface prepared according to the method of any one of claims 1 to 5.
A composition for diagnosing a disease comprising the superabsorbent resin on which the extracellular vesicles or cells of claim 6 are fixed to the surface.
The composition for diagnosing a disease according to claim 7, wherein the disease is cancer.
상기 암은 유방암, 난소암, 대장암, 위암, 간암, 췌장암, 자궁경부암, 갑상선암, 부갑상선암, 폐암, 비소세포성폐암, 전립선암, 담낭암, 담도암, 비호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 혈액암, 방광암, 신장암, 흑색종, 결장암, 골암, 피부암, 두부암, 자궁암, 직장암, 뇌종양, 항문부근암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 질암, 음문암종, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계(CNS central nervous system) 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 및 뇌하수체 선종으로 구성된 군에서 선택되는, 질환 진단용 조성물.
According to clause 8,
The above cancers include breast cancer, ovarian cancer, colon cancer, stomach cancer, liver cancer, pancreatic cancer, cervical cancer, thyroid cancer, parathyroid cancer, lung cancer, non-small cell lung cancer, prostate cancer, gallbladder cancer, biliary tract cancer, non-Hodgkin lymphoma, Hodgkin lymphoma, and blood cancer. , bladder cancer, kidney cancer, melanoma, colon cancer, bone cancer, skin cancer, head cancer, uterine cancer, rectal cancer, brain tumor, perianal cancer, fallopian tube carcinoma, endometrial carcinoma, vaginal cancer, vulvar carcinoma, esophageal cancer, small intestine cancer, endocrine cancer, adrenal cancer. , selected from the group consisting of soft tissue sarcoma, urethral cancer, penile cancer, ureteral cancer, renal cell carcinoma, renal pelvic carcinoma, CNS central nervous system tumor, primary CNS lymphoma, spinal cord tumor, brainstem glioma, and pituitary adenoma. A composition for diagnosing a disease.
A kit for diagnosing a disease comprising the superabsorbent resin on which the extracellular vesicles or cells of claim 6 are fixed to the surface.
The kit for diagnosing a disease according to claim 10, wherein the disease is cancer.
상기 암은 유방암, 난소암, 대장암, 위암, 간암, 췌장암, 자궁경부암, 갑상선암, 부갑상선암, 폐암, 비소세포성폐암, 전립선암, 담낭암, 담도암, 비호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 혈액암, 방광암, 신장암, 흑색종, 결장암, 골암, 피부암, 두부암, 자궁암, 직장암, 뇌종양, 항문부근암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 질암, 음문암종, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계(CNS central nervous system) 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 및 뇌하수체 선종으로 구성된 군에서 선택되는, 질환 진단용 키트.
According to clause 11,
The above cancers include breast cancer, ovarian cancer, colon cancer, stomach cancer, liver cancer, pancreatic cancer, cervical cancer, thyroid cancer, parathyroid cancer, lung cancer, non-small cell lung cancer, prostate cancer, gallbladder cancer, biliary tract cancer, non-Hodgkin lymphoma, Hodgkin lymphoma, and blood cancer. , bladder cancer, kidney cancer, melanoma, colon cancer, bone cancer, skin cancer, head cancer, uterine cancer, rectal cancer, brain tumor, perianal cancer, fallopian tube carcinoma, endometrial carcinoma, vaginal cancer, vulvar carcinoma, esophageal cancer, small intestine cancer, endocrine cancer, adrenal cancer. , selected from the group consisting of soft tissue sarcoma, urethral cancer, penile cancer, ureteral cancer, renal cell carcinoma, renal pelvic carcinoma, CNS central nervous system tumor, primary CNS lymphoma, spinal cord tumor, brainstem glioma, and pituitary adenoma. A kit for diagnosing diseases.
(a) 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 방법에 따라 고흡수성 수지 표면에 세포밖 소포체 또는 세포를 고정시키는 단계; 및
(b) 상기 세포밖 소포체 또는 세포가 표면 고정된 고흡수성 수지를 교체용 용매에 재현탁시키는 단계.
A solvent replacement method for a solution containing extracellular vesicles or cells comprising the following steps:
(a) fixing extracellular vesicles or cells on the surface of a superabsorbent polymer according to the method of any one of claims 1 to 5; and
(b) resuspending the superabsorbent resin on which the extracellular vesicles or cells are immobilized on the surface in a replacement solvent.
The solvent replacement method according to claim 13, wherein the replacement solvent is PBS, distilled water, or a culture medium.
The method of claim 13, wherein step (b) is performed by resuspending the solvent by pipetting or vortexing.
(a) 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 방법에 따라 고흡수성 수지 표면에 세포밖 소포체 또는 세포를 고정시키는 단계;
(b) 상기 세포밖 소포체 또는 세포가 표면 고정된 고흡수성 수지를 교체용 용매에 재현탁시키는 단계; 및
(c) 교체용 용매에 재현탁된 세포밖 소포체 또는 세포를 포함하는 용액을 회수하는 단계.Method for preparing a solution containing extracellular vesicles or cells comprising the following steps:
(a) fixing extracellular vesicles or cells on the surface of a superabsorbent polymer according to the method of any one of claims 1 to 5;
(b) resuspending the superabsorbent resin on which the extracellular vesicles or cells are fixed to the surface in a replacement solvent; and
(c) recovering the solution containing extracellular vesicles or cells resuspended in the replacement solvent.
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| KR102118509B1 (en) | 2018-11-22 | 2020-06-03 | 인천대학교 산학협력단 | method for the concentration of extracellular vesicles using super absorbent polymer |
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2023
- 2023-05-18 KR KR1020230064666A patent/KR20240049139A/en unknown
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102118509B1 (en) | 2018-11-22 | 2020-06-03 | 인천대학교 산학협력단 | method for the concentration of extracellular vesicles using super absorbent polymer |
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