KR20230016176A - Pcsk9의 염기 편집 및 질환 치료를 위한 이의 사용 방법 - Google Patents

Pcsk9의 염기 편집 및 질환 치료를 위한 이의 사용 방법 Download PDF

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알렉산드라 차드윅
칼란토타틸 지 라지브
엘렌 로드
크리스토퍼 쳉
캐롤린 라이스
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버브 테라퓨틱스, 인크.
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Abstract

유전자 변형 또는 편집을 위한 조성물 및 특정 병태를 치료 또는 예방하기 위해 이를 사용하는 방법이 본원에 제공된다. LDL-C를 지속적으로 낮추기 위해 간에서 발현되는 유전자 표적을 안전하고 효과적으로 편집하여 심혈관 질환의 주요 원인을 치료할 수 있는 특정 조성물 및 방법이 개시된다.

Description

PCSK9의 염기 편집 및 질환 치료를 위한 이의 사용 방법
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 35 U.S.C. §119 하에 2020년 4월 9일자로 출원된 가출원 일련 번호 63/007,803; 2020년 4월 9일자로 출원된 가출원 일련 번호 63/007,797; 2021년 1월 11일자로 출원된 가출원 일련 번호 63/136,087; 2020년 6월 26일자로 출원된 가출원 일련 번호 63/045,032; 2020년 6월 26일자로 출원된 가출원 일련 번호 63/045,033의 이익을 주장하며, 그 개시 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
서열 목록
본 출원에는 ASCII 형식으로 전자 제출된 서열 목록이 포함되어 있으며 이에 의해 그 전체가 참고로 포함된다. 2021년 4월 8일자로 생성된 상기 ASCII 사본의 명칭은 53989_707_601_SL.txt이며 크기는 1,105,762바이트이다.
발명의 분야
본원에서는 심혈관 질환 및 병태 또는 이와 관련된 질환, 예컨대 당뇨병과 같은 특정 병태를 치료 또는 예방할 수 있는 유전자 변형 또는 편집용 조성물, 및 이를 사용하는 방법을 제공한다.
본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 각각의 개별 간행물, 특허 또는 특허 출원이 참고로 포함되는 것으로 구체적이고 개별적으로 표시된 것과 동일한 정도로 본원에 참고로 포함된다. 본원에 구체적으로 또는 암시적으로 참조된 어떠한 간행물이나 정보가 선행 기술이거나 청구된 주제와 반드시 관련이 있다고 인정하는 것은 아니다. 참고로 포함된 간행물, 특허 또는 특허 출원이 명세서에 포함된 개시 내용과 모순되거나 일치하지 않을 경우, 그러한 인용 또는 포함된 참고 문헌은 명세서가 양립할 수 없는 불일치 또는 모순되는 자료를 대체하고/거나 그에 우선하도록 의도된 것이라는 이해하면서 본 개시 내용을 보충하는 것으로 간주되어야 한다.
요약
본 출원에 개시된 본 발명의 주제는 폴리뉴클레오티드 또는 표적 유전자를 편집할 수 있는 조성물 및 이러한 조성물의 사용 방법에 관한 것이다. 조성물 및 이의 구성성분은 개별적으로 및 조합하여 본 발명의 주제의 별개의 측면으로 간주되며, 이는 제한 없이 임의의 조합으로 본원에 기재된 각각의 물리적 및/또는 기능적 속성에 의해 정의 및 청구될 수 있다. 본 발명의 주제의 폭, 특이성 및 변형은 여기에 요약된 특정 측면에 의해 추가로 예시된다.
본원에 기재된 본 발명의 주제의 한 가지 중요한 측면은 세계 보건 기구에 따르면 3건의 사망 중 거의 1건의 원인이 되는 전 세계 주요 사망 원인인 심혈관 질환(CVD: cardiovascular disease)의 치료에 관한 것이다. CVD는 또한 기대 수명 감소의 주요 원인이며 관리하기에 비용이 가장 큰 건강 상태 중 하나이다. 질환 통제 예방 센터(CDC: Centers for Disease Control and Prevention)에 따르면 CVD는 상당한 경제적 부담으로 미국 의료 시스템에 연간 3,200억 달러 이상의 비용과 생산성 손실을 초래한다. CVD는 특히 죽상동맥경화성 심혈관 질환(ASCVD: atherosclerotic cardiovascular disease) 또는 심근병증 등으로 진단되는 심장 및 혈관 질환을 총칭한다. ASCVD는 콜레스테롤이 동맥 경화를 초래하는 혈관벽의 콜레스테롤, 세포 및 세포 파편의 혼합물인 죽상동맥경화반의 발생을 유도하는 CVD의 큰 하위 집합이다. ASCVD 치료 및 예방의 현재 초석은 혈중 지질에 대한 누적 노출을 낮추어 저밀도 지단백 콜레스테롤(LDL-C, 일반적으로 "나쁜" 콜레스테롤로 알려짐) 및/또는 트리글리세리드를 가능한 한 낮게 가능한 한 오랫동안 유지하는 것이다. 예를 들어, 충분히 장기간에 걸쳐 LDL-C를 충분히 낮은 수준으로 유지하는 개인은 ASCVD가 발생할 가능성이 상당히 낮다는 것을 보여주는 중요한 증거가 있다. LDL-C의 저하와 ASCVD의 감소 사이의 관계는 의학의 모든 관계 중에서 가장 잘 알려져 있다. ASCVD가 확립된 환자에서 5년 동안 LDL-C를 39 mg/dL 낮추면 ASCVD 위험이 21% 감소하는 한편 평생 동안 LDL-C를 동일한 39 mg/dL 수준으로 감소하면 첫 번째 ASCVD 이벤트의 위험이 88% 감소하는 것으로 나타났다. 현재의 치료 표준은 일반적으로 매일 수많은 알약 및/또는 간헐적 주사를 필요로 하고 종종 LDL-C에 대한 누적 노출을 불충분하게 제어하는 만성 치료 모델이다. 이러한 만성 치료 요법의 이용 가능성에도 불구하고, 많은 ASCVD 환자에서 LDL-C에 대한 누적 노출이 종종 불충분하게 조절되고, ASCVD가 확립된 개인의 상당수가 권장 목표보다 높은 LDL-C 수준을 나타낸다. 더 높은 누적 LDL-C 노출은 심장 또는 경부 동맥에 콜레스테롤 플라크 축적을 가속화하고 파열로 인해 심장 마비, 심장 사망, 뇌졸중 및 관상동맥 스텐트 삽입 및 관상동맥 우회로술과 같은 침습적 의료 절차의 요구를 초래할 수 있다.
본원에 개시된 한 측면은 LDL-C 및/또는 트리글리세리드를 지속적으로 낮추기 위해 간에서 발현된 유전자 표적을 안전하고 효과적으로 편집하여 ASCVD와 같은 CVD를 치료할 수 있는 조성물 및 방법이다.
본원에 개시된 또 다른 측면은 단일 코스 또는 용량(일회성) 요법으로서 반복 또는 연속 용량 및 조합 유전자 편집 요법 용량으로 투여되는 경우 본원에 기재된 유전자 편집 조성물의 효능 및 안전성이다. 본원에 기재된 조성물의 효능 및 안전성은 마우스 및 비인간 영장류 실험을 비롯한 다양한 세포 및 동물 실험을 포함하는 본원에 기재된 시험관 내 및 생체 내 연구, 및 각각이 본 발명의 측면을 구성하는 이들 연구에서 제시된 본원에 개시된 조성물의 결과 또는 성과로 보여준다.
본원에 개시된 조성물 및 방법의 또 다른 측면은 예를 들어 스플라이스 부위에서 유전자를 편집하도록 지시된 조성물 및 방법을 포함하는 유전자의 편집이 이루어지는 위치에 관한 것이다.
본원에 개시된 조성물 및 방법의 또 다른 측면은 표적 유전자에 이중 가닥 파손을 부여하지 않고 단일 염기쌍에서 유전자를 정확하게 편집할 수 있는 조성물을 포함하는, 구성성분이 되는 가이드 RNA(gRNA) 및 염기 에디터이다. 염기 에디터를 발현하고 코딩하는 뉴클레오티드 또는 mRNA 서열을 포함하는 이러한 gRNA 및 염기 에디터의 사용 방법 및 조성물은 또 다른 측면을 구성한다.
본원에 개시된 또 다른 측면은 gRNA 및 염기 에디터 원료 의약품을 캡슐화하는 지질 나노입자(LNP: lipid nanoparticle) 제제, LNP의 선택, 및 단독으로 및 LNP의 일부로서 원료 의약품 조성물의 다양한 성분 사이의 상대 비율이다.
본원에 개시된 또 다른 측면은 본원에 기재된 것과 같은 유전자 편집 조성물의 투여, 및 효능 및 안전성 프로파일 지표에 대한 투여 및 반복 투여의 영향에 관한 것이다.
본원에 개시된 또 다른 측면은 조성물 및 사용 방법이 PCSK9, ANGPTL3, APOC3 및/또는 Lp(a)와 같은 특정 유전자를 표적화 또는 편집하고/거나 해당 유전자에 의해 발현되는 단백질 수준에 영향을 주도록 설계된 구현을 포함한다는 것이다.
한 측면에서, (i) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 mRNA, (ii) 염기 에디터 융합 단백질에 대한 결합 스캐폴드로서 역할을 하는 tracr 서열, 및 PCSK9 유전자 상의 프로토스페이서에 상응하는 스페이서 서열을 포함하는 가이드 RNA를 포함하는 유전자 표적을 편집하기 위한 조성물이 본원에 제공되며, 여기서 가이드 RNA는 포유동물 대상체에게 투여될 때 염기 에디터 융합 단백질이 생체 내에서 PCSK9 유전자 내 핵염기 변경을 수행하도록 지시하며, 가이드 RNA 및 mRNA가 적어도 0.05 mg/kg의 총량으로 투여될 때, 차세대 시퀀싱 또는 생어(Sanger) 시퀀싱에 의해 측정되는 경우 포유동물 대상체에서 전체 간 세포의 적어도 35%에서 염기 변경이 발생한다. 일부 실시양태에서, 포유동물 대상체는 시노몰구스 원숭이이며, 여기서 가이드 RNA 및 mRNA가 적어도 0.5 mg/kg의 총량으로 투여될 때, 차세대 시퀀싱 또는 생어 시퀀싱에 의해 측정되는 경우 시노몰구스 원숭이에서 전체 간 세포의 적어도 40%에서 염기 변경이 발생한다. 일부 실시양태에서, 포유동물 대상체는 시노몰구스 원숭이이며, 여기서 가이드 RNA 및 mRNA가 적어도 1 mg/kg의 총량으로 투여될 때, 차세대 시퀀싱 또는 생어 시퀀싱에 의해 측정되는 경우 시노몰구스 원숭이에서 전체 간 세포의 적어도 45%에서 염기 변경이 발생한다. 일부 실시양태에서, 포유동물 대상체는 시노몰구스 원숭이이며, 여기서 가이드 RNA 및 mRNA가 적어도 1.5 mg/kg의 총량으로 투여될 때, 차세대 시퀀싱 또는 생어 시퀀싱에 의해 측정되는 경우 시노몰구스 원숭이에서 전체 간 세포의 적어도 50%에서 염기 변경이 발생한다. 일부 실시양태에서, 포유동물 대상체는 시노몰구스 원숭이이며, 여기서 가이드 RNA 및 mRNA가 적어도 3 mg/kg의 총량으로 투여될 때, 차세대 시퀀싱 또는 생어 시퀀싱에 의해 측정되는 경우 시노몰구스 원숭이에서 전체 간 세포의 적어도 55%에서 염기 변경이 발생한다. 일부 실시양태에서, 포유동물 대상체는 마우스이며, 여기서 가이드 RNA 및 mRNA가 적어도 0.125 mg/kg의 총량으로 투여될 때, 차세대 시퀀싱 또는 생어 시퀀싱에 의해 측정되는 경우 마우스에서 전체 간 세포의 적어도 40%에서 염기 변경이 발생한다. 일부 실시양태에서, 포유동물 대상체는 마우스이며, 여기서 가이드 RNA 및 mRNA가 적어도 0.5 mg/kg의 총량으로 투여될 때, 차세대 시퀀싱 또는 생어 시퀀싱에 의해 측정되는 경우 마우스에서 전체 간 세포의 적어도 45%에서 염기 변경이 발생한다. 일부 실시양태에서, 포유동물 대상체는 마우스이며, 여기서 가이드 RNA 및 mRNA가 적어도 2 mg/kg의 총량으로 투여될 때, 차세대 시퀀싱 또는 생어 시퀀싱에 의해 측정되는 경우 마우스에서 전체 간 세포의 적어도 50%에서 염기 변경이 발생한다. 일부 실시양태에서, 핵염기 변경은 투여 전과 비교하여 대상체의 혈중 저밀도 지단백질 콜레스테롤(LDL-C) 수준에서 적어도 50%의 감소를 초래한다. 일부 실시양태에서, 프로토스페이서는 스플라이스 부위에 위치한다. 일부 실시양태에서, 프로토스페이서 상보적 서열은 PCSK9 유전자의 안티센스 가닥에 있다. 일부 실시양태에서, 프로토스페이서 상보적 서열은 PCSK9 유전자의 센스 가닥에 있다. 일부 실시양태에서, 염기 변경은 PCSK9 유전자 상의 프로토스페이서 외부(오프 타겟 부위)에서 일어나며, 여기서 표 11에 제시된 오프 타겟 부위의 편집 백분율은 각각 표 11에 제시된 편집 백분율 이하이다. 일부 실시양태에서, 데아미나아제는 아데닌 데아미나아제이며 여기서 핵염기 변경은 A·T에서 G·C로의 변경이다. 일부 실시양태에서, 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인은 뉴클레아제 불활성 Cas9 또는 Cas9 닉카아제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵염기 변경은 PCSK9 유전자의 스플라이스 부위에 있다. 일부 실시양태에서, 핵염기 변경은 PCSK9 유전자의 스플라이스 도너 부위에 있다. 일부 실시양태에서, 스플라이스 도너 부위는 서열 번호 5에 참조된 바와 같이 PCSK9 인트론 1의 5' 말단에 있다. 일부 실시양태에서, 핵염기 변경은 PCSK9 유전자의 스플라이스 억셉터 부위에 있다. 일부 실시양태에서, 핵염기 변경은 PCSK9 유전자에 의해 코딩되는 전사물에서 프레임 이동, 조기 정지 코돈, 삽입 또는 결실을 초래한다. 일부 실시양태에서, 핵염기 변경은 PCSK9 유전자에 의해 코딩되는 비정상 전사물을 생성한다. 일부 실시양태에서, 가이드 RNA는 화학적으로 변형된다. 일부 실시양태에서, 가이드 RNA의 tracr 서열은 [도 7]에 도시된 도식에 따라 화학적으로 변형된다. 일부 실시양태에서, 스페이서 서열은 표 1에 제시된 PCSK9 ABE 가이드 RNA 스페이서 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 가이드 RNA는 표 1에 제시된 GA096, GA097, GA343, GA346, GA375-377, GA380-389, GA391, GA439 또는 GA440의 PCSK9 ABE 가이드 RNA 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로토스페이서 서열은 표 1에 제시된 PCSK9 ABE 프로토스페이서 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로토스페이서는 서열 5'-CCCGCACCTTGGCGCAGCGG-3'(서열 번호 13) 또는 5'-CCGCACCTTGGCGCAGCGG-3'(서열 번호 247)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 염기 에디터 융합 단백질은 서열 번호 2137의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, mRNA 서열의 GC% 함량은 50% 초과이다. 일부 실시양태에서, mRNA 서열의 GC% 함량은 56% 초과이다. 일부 실시양태에서, mRNA 서열의 GC% 함량은 63% 이상이다. 일부 실시양태에서, mRNA는 아데닌 tTNA 데아미나아제(TadA) 영역, Cas9 영역 및 핵 국소화 서열(NLS) 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, mRNA는 TadA 영역과 Cas9 영역을 연결하는 제1 링커 영역, 및 Cas9 영역과 NLS 영역을 연결하는 제2 링커 영역을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, TadA 영역의 GC% 함량은 60% 초과이다. 일부 실시양태에서, TadA 영역의 GC% 함량은 70% 이상이다. 일부 실시양태에서, Cas9 영역의 GC% 함량은 56% 초과이다. 일부 실시양태에서, Cas9 영역의 GC% 함량은 62% 이상이다. 일부 실시양태에서, NLS 영역의 GC% 함량은 54% 초과이다. 일부 실시양태에서, NLS 영역의 GC% 함량은 63% 이상이다. 일부 실시양태에서, 제1 링커 영역의 GC% 함량은 65% 초과이다. 일부 실시양태에서, 제1 링커 영역의 GC% 함량은 79% 이상이다. 일부 실시양태에서, 제2 링커 영역의 GC% 함량은 67% 초과이다. 일부 실시양태에서, 제2 링커 영역의 GC% 함량은 83% 이상이다. 일부 실시양태에서, TadA 영역의 GC% 함량은 60% 초과이며, Cas9 영역의 GC% 함량은 56% 초과이며, NLS 영역의 GC% 함량은 54% 초과이며, 제1 링커 영역의 GC% 함량은 65% 초과이며, 제2 링커 영역의 GC% 함량은 67% 초과이다. 일부 실시양태에서, mRNA는 표 23으로부터 선택된 mRNA 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, mRNA는 서열 번호 2136의 mRNA 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, mRNA는 폴리 A 꼬리를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 (i)를 둘러싸는 지질 나노입자(LNP)를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, LNP는 (ii)를 추가로 둘러싼다. 일부 실시양태에서, 조성물은 (ii)를 둘러싸는 제2 LNP를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 가이드 RNA와 염기 에디터 융합 단백질을 코딩하는 mRNA의 비는 중량 기준으로 약 1:10 내지 약 10:1이다. 일부 실시양태에서, 가이드 RNA와 염기 에디터 융합 단백질을 코딩하는 mRNA의 비는 중량 기준으로 약 1:1, 1.5:1, 2:1, 3:1, 4:1, 1:1.5, 1:2, 1:3, 또는 1:4이다. 일부 실시양태에서, 가이드 RNA와 염기 에디터 융합 단백질을 코딩하는 mRNA의 비는 중량 기준으로 약 1:1이다.
또 다른 측면에서, 본원에 제공된 바와 같은 조성물 및 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 약학 조성물이 본원에 제공한다.
또 다른 측면에서, 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법이 본원에 제공되며, 방법은 본원에 제공된 바와 같은 조성물의 치료 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 투여는 정맥 내 주입을 통해 이루어진다. 일부 실시양태에서, 방법은 (i)를 둘러싸는 LNP 및 (ii)를 둘러싸는 LNP의 순차적 투여를 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 (i)를 둘러싸는 LNP 및 (ii)를 둘러싸는 LNP의 동시 투여를 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 (ii)를 둘러싸는 LNP의 단일 용량의 투여 이후에, 1일의 간격으로 (i)를 둘러싸는 LNP의 시간차 용량을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 (ii)를 둘러싸는 LNP의 단일 용량의 투여 이후에, 2일의 간격으로 (i)를 둘러싸는 LNP의 시간차 용량을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 (ii)를 둘러싸는 LNP의 단일 용량의 투여 이후에, 3일의 간격으로 (i)를 둘러싸는 LNP의 시간차 용량을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 (ii)를 둘러싸는 LNP의 단일 용량의 투여 이후에, 4일의 간격으로 (i)를 둘러싸는 LNP의 시간차 용량을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 (ii)를 둘러싸는 LNP의 단일 용량의 투여 이후에, 5일의 간격으로 (i)를 둘러싸는 LNP의 시간차 용량을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 (ii)를 둘러싸는 LNP의 단일 용량의 투여 이후에, 6일의 간격으로 (i)를 둘러싸는 LNP의 시간차 용량을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 (ii)를 둘러싸는 LNP의 단일 용량의 투여 이후에, 7일의 간격으로 (i)를 둘러싸는 LNP의 시간차 용량을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 (i) 및 (ii)를 둘러싸는 LNP의 단일 용량을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, LNP의 단일 용량은 약 0.3 내지 약 3mg/kg이다. 일부 실시양태에서, 방법은 대상체에게 하나 이상의 치료의 치료 과정을 시행하는 단계를 포함하고, 여기서 하나 이상의 치료 각각은 LNP의 단일 용량의 하나 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 2 내지 10회 치료의 치료 과정을 시행하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 2 내지 5회 치료의 치료 과정을 시행하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 2회 치료의 치료 과정을 시행하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 3회 치료의 치료 과정을 시행하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 4회 치료의 치료 과정을 시행하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 5회 치료의 치료 과정을 시행하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 병태는 죽상동맥경화성 심혈관 질환이다. 일부 실시양태에서, 병태는 죽상동맥경화성 혈관 질환이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 인간이다.
또 다른 측면에서, (i) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 mRNA, (ii) 염기 에디터 융합 단백질에 대한 결합 스캐폴드로서 역할을 하는 tracr 서열, 및 PCSK9 유전자 상의 프로토스페이서에 상응하는 스페이서 서열을 포함하는 가이드 RNA를 포함하는 유전자 표적을 편집하기 위한 조성물이 본원에 제공되며, 여기서 가이드 RNA는 포유동물 대상체에게 투여될 때 염기 에디터 융합 단백질이 생체 내에서 PCSK9 유전자 내 핵염기 변경을 수행하도록 지시하며, 가이드 RNA는 표 1에 제시된 바와 같은 PCSK9 ABE 가이드 RNA 서열을 포함한다. 또 다른 측면에서, (i) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 mRNA, (ii) 염기 에디터 융합 단백질에 대한 결합 스캐폴드로서 역할을 하는 tracr 서열, 및 PCSK9 유전자 상의 프로토스페이서에 상응하는 스페이서 서열을 포함하는 가이드 RNA를 포함하는 유전자 표적을 편집하기 위한 조성물이 본원에 제공되며, 여기서 가이드 RNA는 포유동물 대상체에게 투여될 때 염기 에디터 융합 단백질이 생체 내에서 PCSK9 유전자 내 핵염기 변경을 수행하도록 지시하며, mRNA는 표 23으로부터 선택된 서열을 포함한다.
또 다른 측면에서, 죽상동맥경화성 심혈관 질환의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법이 본원에 제공되며, 방법은 (i) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 mRNA, (ii) 염기 에디터 융합 단백질에 대한 결합 스캐폴드로서 역할을 하는 tracr 서열, 및 PCSK9 유전자 상의 프로토스페이서에 상응하는 스페이서 서열을 포함하는 가이드 RNA를 포함하는 제1 조성물로서, 가이드 RNA는 포유동물 대상체에게 투여될 때 염기 에디터 융합 단백질이 생체 내에서 PCSK9 유전자 내 핵염기 변경을 수행하도록 지시하며, 가이드 RNA 및 mRNA가 적어도 0.05 mg/kg의 총량으로 투여될 때, 차세대 시퀀싱 또는 생어 시퀀싱에 의해 측정되는 경우 포유동물 대상체에서 전체 간 세포의 적어도 35%에서 염기 변경이 발생하는 것인 제1 조성물; 및 (i) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 mRNA, (ii) 염기 에디터 융합 단백질에 대한 결합 스캐폴드로서 역할을 하는 tracr 서열, 및 ANGPTL3 유전자 상의 프로토스페이서에 상응하는 스페이서 서열을 포함하는 가이드 RNA를 포함하는 제2 조성물로서, 가이드 RNA는 포유동물 대상체에게 투여될 때 염기 에디터 융합 단백질이 생체 내에서 ANGPTL3 유전자 내 핵염기 변경을 수행하도록 지시하며, 가이드 RNA 및 mRNA가 적어도 0.5 mg/kg의 총량으로 투여될 때, 차세대 시퀀싱 또는 생어 시퀀싱에 의해 측정되는 경우 포유동물 대상체에서 전체 간 세포의 적어도 35%에서 염기 변경이 발생하는 것인 제2 조성물의 치료 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 제1 조성물 및 제2 조성물의 순차적 투여를 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 1회 이상의 용량의 제1 조성물을 투여한 후 1회 이상의 용량의 제2 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 1회 이상의 용량의 제2 조성물을 투여한 후 1회 이상의 용량의 제1 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 제1 조성물 및 제2 조성물의 동시 투여를 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 제1 조성물 및 제2 조성물의 1회 이상의 용량을 포함한다.
또 다른 측면에서, (i) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 mRNA, (ii) 염기 에디터 융합 단백질에 대한 결합 스캐폴드로서 역할을 하는 tracr 서열, 및 APOC3 유전자 상의 프로토스페이서에 상응하는 스페이서 서열을 포함하는 가이드 RNA를 포함하는 유전자 표적을 편집하기 위한 조성물이 본원에 제공되며, 여기서 가이드 RNA는 표 24에 제시된 바와 같은 GA300-303의 APOC3 ABE 가이드 RNA 서열을 포함한다. 또 다른 측면에서, (i) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 mRNA, (ii) 염기 에디터 융합 단백질에 대한 결합 스캐폴드로서 역할을 하는 tracr 서열, 및 PCSK9 유전자 상의 프로토스페이서에 상응하는 스페이서 서열을 포함하는 가이드 RNA를 포함하는 유전자 표적을 편집하기 위한 조성물이 본원에 제공되며, 여기서 가이드 RNA는 염기 에디터 융합 단백질이 시험관 내에서 PCSK9 유전자 내 핵염기 변경을 수행하도록 지시하며, 가이드 RNA 및 mRNA가 적어도 2.5 mg/kg의 총량으로 투여될 때, 차세대 시퀀싱 또는 생어 시퀀싱에 의해 측정되는 경우 포유동물 대상체에서 전체 간 세포의 적어도 35%에서 염기 변경이 발생한다. 또 다른 측면에서, (a) 편집 창을 갖는 아데닌 염기 에디터 단백질을 코딩하는 mRNA, 및 (b) 염기 에디터 단백질에 대한 결합 스캐폴드 역할을 하는 tracr 서열 및 염기 에디터 단백질을 PCSK9 유전자 상의 프로토스페이서 서열로 안내하는 역할을 하는 스페이서 서열을 포함하는 가이드 RNA를 포함하는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물이 본원에 제공되며, 여기서 스페이서 서열은 PCSK9 유전자의 스플라이스 부위 또는 엑손 영역에 적어도 부분적으로 상보적이다. 일부 실시양태에서, 염기 에디터 단백질이 가이드 RNA에 작동적으로 결합되고 가이드 RNA가 PCSK9 유전자 상의 프로토스페이서 서열에 상보적인 가닥과 혼성화되는 경우, 편집 창은 PCSK9 유전자의 스플라이스 부위를 포함한다. 일부 실시양태에서, 염기 에디터 단백질이 가이드 RNA에 작동적으로 결합되고 가이드 RNA가 PCSK9 유전자 상의 프로토스페이서 서열에 상보적인 가닥과 혼성화되는 경우, 편집 창은 PCSK9 유전자의 인트론의 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 염기 에디터 단백질이 가이드 RNA에 작동적으로 결합되고 가이드 RNA가 PCSK9 유전자 상의 프로토스페이서 서열에 상보적인 가닥과 혼성화되는 경우, 편집 창은 PCSK9 유전자의 인트론 1, 인트론 3 또는 인트론 4의 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 염기 에디터 단백질이 가이드 RNA에 작동적으로 결합되고 가이드 RNA가 PCSK9 유전자 상의 프로토스페이서 서열에 상보적인 가닥과 혼성화되는 경우, 편집 창은 PCSK9 유전자의 인트론 1의 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 스페이서 서열은 GA066, GA073 및 GA074로 식별된 가이드 RNA 서열의 군으로부터 선택된 스페이서 서열에 대해 80-100% 뉴클레오티드 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시양태에서, tracr 서열은 GA066, GA095, GA096, GA097, GA343, GA346, GA375, GA376, GA377, GA380, GA381, GA382, GA383, GA384, GA385, GA386, GA387, GA388, GA389, GA439, 및 GA440으로 식별된 가이드 RNA 서열의 군으로부터 선택된 tracr 서열에 대해 80-100% 뉴클레오티드 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시양태에서, mRNA는 MA002, MA004, MA040, MA0041, 또는 MA045로 식별된 mRNA 서열에 대해 80-100% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시양태에서, mRNA는 하기 표에 제시된 GC 뉴클레오티드 영역 백분율 중 하나 이상을 갖는다:
Figure pct00001
일부 실시양태에서, mRNA는 하기 표에 제시된 GC 뉴클레오티드 영역 백분율 중 하나 이상을 갖는다:
Figure pct00002
일부 실시양태에서, mRNA 및 gRNA는 지질 나노입자 내에 캡슐화된다. 일부 실시양태에서, mRNA 및 gRNA는 하기를 갖는 지질 나노입자 내에 캡슐화된다:
LNP 조성(몰%):
40-65% iLipid
2-20% DSPC
1-5% PEG
나머지 몰%는 콜레스테롤;
LNP 입자 크기: 55-120 nm Z 평균 유체역학적 직경; 및
동적 광산란에 의해 결정된 <0.2의 다분산 지수.
일부 실시양태에서, mRNA 및 gRNA는 50-70 nm Z 평균 유체역학적 직경의 LNP 입자 크기를 갖는 지질 나노입자 내에 캡슐화된다. 일부 실시양태에서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 0.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 40% 초과의 평균 편집 백분율로 시노몰구스 원숭이의 간의 PCSK9 표적 스플라이스 부위에서 아데닌 염기 편집을 유도할 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 0.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 50% 초과의 평균 편집 백분율로 시노몰구스 원숭이의 간의 PCSK9 표적 스플라이스 부위에서 아데닌 염기 편집을 유도할 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 0.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 30% 초과의 평균 편집 백분율로 시노몰구스 원숭이의 간의 PCSK9 표적 스플라이스 부위에서 아데닌 염기 편집을 유도할 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 40% 초과의 평균 편집 백분율로 시노몰구스 원숭이의 간의 PCSK9 표적 스플라이스 부위에서 아데닌 염기 편집을 유도할 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 50% 초과의 평균 편집 백분율로 시노몰구스 원숭이의 간의 PCSK9 표적 스플라이스 부위에서 아데닌 염기 편집을 유도할 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 60% 초과의 평균 편집 백분율로 시노몰구스 원숭이의 간의 PCSK9 표적 스플라이스 부위에서 아데닌 염기 편집을 유도할 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 70% 초과의 평균 편집 백분율로 시노몰구스 원숭이의 간의 PCSK9 표적 스플라이스 부위에서 아데닌 염기 편집을 유도할 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 40% 초과의 평균 편집 백분율로 시노몰구스 원숭이의 간의 PCSK9 표적 스플라이스 부위에서 아데닌 염기 편집을 유도할 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 50% 초과의 평균 편집 백분율로 시노몰구스 원숭이의 간의 PCSK9 표적 스플라이스 부위에서 아데닌 염기 편집을 유도할 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 60% 초과의 평균 편집 백분율로 시노몰구스 원숭이의 간의 PCSK9 표적 스플라이스 부위에서 아데닌 염기 편집을 유도할 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 70% 초과의 평균 편집 백분율로 시노몰구스 원숭이의 간의 PCSK9 표적 스플라이스 부위에서 아데닌 염기 편집을 유도할 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 80% 초과의 평균 편집 백분율로 시노몰구스 원숭이의 간의 PCSK9 표적 스플라이스 부위에서 아데닌 염기 편집을 유도할 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 3 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 40% 초과의 평균 편집 백분율로 시노몰구스 원숭이의 간의 PCSK9 표적 스플라이스 부위에서 아데닌 염기 편집을 유도할 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 3 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 50% 초과의 평균 편집 백분율로 시노몰구스 원숭이의 간의 PCSK9 표적 스플라이스 부위에서 아데닌 염기 편집을 유도할 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 3 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 60% 초과의 평균 편집 백분율로 시노몰구스 원숭이의 간의 PCSK9 표적 스플라이스 부위에서 아데닌 염기 편집을 유도할 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 3 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 70% 초과의 평균 편집 백분율로 시노몰구스 원숭이의 간의 PCSK9 표적 스플라이스 부위에서 아데닌 염기 편집을 유도할 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 3 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 80% 초과의 평균 편집 백분율로 시노몰구스 원숭이의 간의 PCSK9 표적 스플라이스 부위에서 아데닌 염기 편집을 유도할 수 있다. 일부 실시양태에서, 퍼센트 편집율은 원숭이의 간 생검 또는 부검을 통해 투여된 시노몰구스 원숭이 간의 분석을 통해 투여 후 15일에 결정된다. 일부 실시양태에서, 퍼센트 편집율은 투여 후 적어도 168일의 범위에 걸쳐 투여된 시노몰구스 원숭이의 주기적인 간 생검 테스트에 의해 지속적으로 유지되는 것으로 결정된다. 일부 실시양태에서, 퍼센트 편집율은 투여 후 적어도 300일의 범위에 걸쳐 투여된 시노몰구스 원숭이의 주기적인 간 생검 테스트에 의해 지속적으로 유지되는 것으로 결정된다. 일부 실시양태에서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 0.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 PCSK9 단백질을 기준선과 비교하여 평균 35% 이상 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 0.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 PCSK9 단백질을 기준선과 비교하여 평균 40% 이상 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 원숭이 체중 1 kg당 대략 0.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 PCSK9 단백질을 기준선과 비교하여 평균 50% 이상 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 0.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 원숭이의 혈장에서 PCSK9 단백질을 기준선과 비교하여 평균 60% 이상 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 0.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 PCSK9 단백질을 기준선과 비교하여 평균 70% 이상 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 0.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 PCSK9 단백질을 기준선과 비교하여 평균 80% 이상 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 PCSK9 단백질을 기준선과 비교하여 평균 35% 이상 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 PCSK9 단백질을 기준선과 비교하여 평균 40% 이상 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 원숭이 체중 1 kg당 대략 1 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 PCSK9 단백질을 기준선과 비교하여 평균 50% 이상 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 PCSK9 단백질을 기준선과 비교하여 평균 60% 이상 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 PCSK9 단백질을 기준선과 비교하여 평균 70% 이상 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 PCSK9 단백질을 기준선과 비교하여 평균 80% 이상 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 PCSK9 단백질을 기준선과 비교하여 평균 35% 이상 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 PCSK9 단백질을 기준선과 비교하여 평균 40% 이상 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 PCSK9 단백질을 기준선과 비교하여 평균 50% 이상 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 PCSK9 단백질을 기준선과 비교하여 평균 60% 이상 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 PCSK9 단백질을 기준선과 비교하여 평균 70% 이상 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 PCSK9 단백질을 기준선과 비교하여 평균 80% 이상 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 3 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 PCSK9 단백질을 기준선과 비교하여 평균 35% 이상 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 3 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 PCSK9 단백질을 기준선과 비교하여 평균 40% 이상 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 3 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 PCSK9 단백질을 기준선과 비교하여 평균 50% 이상 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 3 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 PCSK9 단백질을 기준선과 비교하여 평균 60% 이상 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 3 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 PCSK9 단백질을 기준선과 비교하여 평균 70% 이상 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 3 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 PCSK9 단백질을 기준선과 비교하여 평균 80% 이상 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 혈장 단백질의 감소는 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈액 샘플링 및 분석을 통해 투여 후 15일에 결정된다. 일부 실시양태에서, 조성물은 원숭이 체중 1 kg당 대략 0.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 원숭이의 혈장에서 LDL-C를 기준선과 비교하여 평균 20% 이상 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 0.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 LDL-C를 기준선과 비교하여 평균 25% 이상 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 0.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 LDL-C를 기준선과 비교하여 평균 30% 이상 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 0.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 LDL-C를 기준선과 비교하여 평균 35% 이상 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 0.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 LDL-C를 기준선과 비교하여 평균 40% 이상 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 0.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 LDL-C를 기준선과 비교하여 평균 45% 이상 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 LDL-C를 기준선과 비교하여 평균 20% 이상 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 LDL-C를 기준선과 비교하여 평균 25% 이상 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 LDL-C를 기준선과 비교하여 평균 30% 이상 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 LDL-C를 기준선과 비교하여 평균 35% 이상 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 LDL-C를 기준선과 비교하여 평균 40% 이상 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 LDL-C를 기준선과 비교하여 평균 45% 이상 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 LDL-C를 기준선과 비교하여 평균 50% 이상 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 LDL-C를 기준선과 비교하여 평균 55% 이상 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 LDL-C를 기준선과 비교하여 평균 60% 이상 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 LDL-C를 기준선과 비교하여 평균 20% 이상 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 LDL-C를 기준선과 비교하여 평균 25% 이상 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 LDL-C를 기준선과 비교하여 평균 30% 이상 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 LDL-C를 기준선과 비교하여 평균 35% 이상 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 LDL-C를 기준선과 비교하여 평균 40% 이상 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 LDL-C를 기준선과 비교하여 평균 45% 이상 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 LDL-C를 기준선과 비교하여 평균 50% 이상 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 LDL-C를 기준선과 비교하여 평균 55% 이상 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 LDL-C를 기준선과 비교하여 평균 60% 이상 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 LDL-C를 기준선과 비교하여 평균 65% 이상 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 3 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 LDL-C를 기준선과 비교하여 평균 20% 이상 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 3 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 LDL-C를 기준선과 비교하여 평균 25% 이상 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 3 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 LDL-C를 기준선과 비교하여 평균 30% 이상 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 3 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 LDL-C를 기준선과 비교하여 평균 35% 이상 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 3 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 LDL-C를 기준선과 비교하여 평균 40% 이상 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 3 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 LDL-C를 기준선과 비교하여 평균 45% 이상 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 3 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 LDL-C를 기준선과 비교하여 평균 50% 이상 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 3 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 LDL-C를 기준선과 비교하여 평균 55% 이상 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 3 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 LDL-C를 기준선과 비교하여 평균 60% 이상 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 3 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 LDL-C를 기준선과 비교하여 평균 65% 이상 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, LDL-C의 감소는 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈액 샘플링 및 분석을 통해 투여 후 15일에 결정된다. 일부 실시양태에서, LDL-C의 감소는 투여된 시노몰구스 원숭이의 주기적 혈액 샘플링 및 분석에 의해 적어도 168일의 범위에 걸쳐 지속적으로 유지되는 것으로 결정된다. 일부 실시양태에서, LDL-C의 감소는 투여된 시노몰구스 원숭이의 주기적 혈액 샘플링 및 분석에 의해 적어도 300일의 범위에 걸쳐 지속적으로 유지되는 것으로 결정된다. 일부 실시양태에서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 3 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 지단백질(a)를 기준선과 비교하여 평균 10% 이상 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 3 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 지단백질(a) 수준을 기준선과 비교하여 평균 15% 이상 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 3 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 지단백질(a) 수준을 기준선과 비교하여 평균 20% 이상 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 3 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 지단백질(a) 수준을 기준선과 비교하여 평균 25% 이상 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 3 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 지단백질(a) 수준을 기준선과 비교하여 평균 30% 이상 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 3 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 지단백질(a) 수준을 기준선과 비교하여 평균 대략 35% 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 지단백질(a)의 감소는 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈액 샘플링 및 분석을 통해 투여 후 15일에 결정된다. 일부 실시양태에서, 지단백질(a)의 감소는 투여된 시노몰구스 원숭이의 주기적 혈액 샘플링 및 분석에 의해 적어도 224일의 범위에 걸쳐 지속적으로 유지되는 것으로 결정된다. 일부 실시양태에서, 지단백질(a)의 감소는 투여된 시노몰구스 원숭이의 주기적 혈액 샘플링 및 분석에 의해 적어도 300일의 범위에 걸쳐 지속적으로 유지되는 것으로 결정된다. 일부 실시양태에서, 시노몰구스 원숭이의 투여가 AST, ALT, 또는 사이토카인의 상승을 초래하는 정도로, 조성물의 투여로 인한 상승은 일시적이고 투여 후 3-15일 이내에 대략 기준선 수준으로 다시 해소된다. 일부 실시양태에서, PCSK9의 퍼센트 편집율은 [도 27]에 예시된 바와 같이 간, 비장 및 부신 조직 외부에서 무시할 수 있다. 일부 실시양태에서, 반복 투여 결과는 PCSK9 편집 백분율의 편집 백분율과 관련하여 부가적이다. 일부 실시양태에서, 반복 투여는 사이토카인 활성화도 면역 반응도 유발하지 않는다. 일부 실시양태에서, 스페이서 서열은 PCSK9 유전자 상의 표적화된 프로토스페이서의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%의 뉴클레오티드 상관관계를 가지며, 여기서 스페이서 서열 상의 RNA 뉴클레오티드는 DNA 뉴클레오티드와 동일한 뉴클레오티드를 동일한 순서로 가질 경우 프로토스페이서의 DNA 뉴클레오티드와 상관관계에 있고 우라실 및 티민 염기는 상관관계를 결정하기 위해 동일한 뉴클레오티드로 간주된다. 일부 실시양태에서, 스페이서 서열은 PCSK9 유전자 상의 표적화된 프로토스페이서의 뉴클레오티드 서열과 적어도 85%의 뉴클레오티드 상관관계를 갖는다.일부 실시양태에서, 스페이서 서열은 PCSK9 유전자 상의 표적화된 프로토스페이서의 뉴클레오티드 서열과 적어도 90%의 뉴클레오티드 상관관계를 갖는다. 일부 실시양태에서, 스페이서 서열은 PCSK9 유전자 상의 표적화된 프로토스페이서의 뉴클레오티드 서열과 적어도 95%의 뉴클레오티드 상관관계를 갖는다. 일부 실시양태에서, 스페이서 서열은 PCSK9 유전자 상의 표적화된 프로토스페이서의 뉴클레오티드 서열과 적어도 99%의 뉴클레오티드 상관관계를 갖는다. 일부 실시양태에서, 스페이서 서열은 PCSK9 유전자 상의 표적화된 프로토스페이서의 뉴클레오티드 서열과 적어도 100%의 뉴클레오티드 상관관계를 갖는다.
또 다른 측면에서, 죽상동맥경화성 심혈관 질환의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법이 본원에 제공되며, 방법은 (a) 편집 창을 갖는 아데닌 염기 에디터 단백질을 코딩하는 mRNA, (b) 염기 에디터 단백질에 대한 결합 스캐폴드 역할을 하는 tracr 서열 및 염기 에디터 단백질을 PCSK9 유전자 상의 프로토스페이서 서열로 안내하는 역할을 하는 스페이서 서열을 포함하는 제1 가이드 RNA로서, 스페이서 서열은 PCSK9 유전자의 스플라이스 부위 또는 엑손 영역에 적어도 부분적으로 상보적인 것인 제1 가이드 RNA; 및 (c) 염기 에디터 단백질에 대한 결합 스캐폴드 역할을 하는 tracr 서열 및 염기 에디터 단백질을 ANGPTL3 유전자 상의 프로토스페이서 서열로 안내하는 역할을 하는 스페이서 서열을 포함하는 제2 가이드 RNA로서, 스페이서 서열은 ANGPTL3 유전자의 스플라이스 부위 또는 엑손 영역에 적어도 부분적으로 상보적인 것인 제2 가이드 RNA의 치료 유효량을 대상체에 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 (a)를 둘러싸는 제1 LNP를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 LNP는 (b) 및 (c)를 둘러싼다. 일부 실시양태에서, 제1 LNP는 반복적으로 투여되었다. 일부 실시양태에서, 제1 LNP는 1 내지 60일의 간격으로 반복적으로 투여되었다. 일부 실시양태에서, 제1 LNP는 7일의 간격으로 반복적으로 투여되었다. 일부 실시양태에서, 제1 LNP는 (b)를 추가로 둘러싼다. 일부 실시양태에서, 방법은 (a) 및 (c)를 둘러싸는 제2 LNP를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 LNP 및 제2 LNP는 순차적으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 제1 LNP 및 제2 LNP는 1일 내지 12개월의 간격으로 순차적으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 간격은 1일이다. 일부 실시양태에서, 간격은 5일이다. 일부 실시양태에서, 간격은 10일이다. 일부 실시양태에서, 간격은 15일이다. 일부 실시양태에서, 간격은 20일이다. 일부 실시양태에서, 간격은 25일이다. 일부 실시양태에서, 간격은 1개월이다. 일부 실시양태에서, 간격은 2개월이다. 일부 실시양태에서, 간격은 3개월이다. 일부 실시양태에서, 간격은 5개월이다. 일부 실시양태에서, 간격은 8개월이다. 일부 실시양태에서, 간격은 10개월이다. 일부 실시양태에서, 간격은 12개월이다.
본 출원의 주제의 특징, 원리, 이점, 및 예시적인 실시양태, 구현, 분석 및 예는 다음의 첨부된 도면에 예시된 측면과 함께 첨부된 청구범위를 포함하여 본원에 제시된다.
[도 1a-1c]는 "프로토스페이서", "PAM", "스페이서"(Mali, P. et al 2013 Nat Methods 10, 957-963; Anzalone, AV. 2020 Nat Biotechnol 38, 824-844)를 포함하는 본 출원에 사용된 해당 용어와 함께 Cas9, 시티딘 염기 에디터(CBE), 및 아데닌 염기 에디터(ABE) 각각의 작동 방식을 예시한다. [도 1d]는 본원에 개시된 mcPCSK9 가이드 RNA(gRNA)-Tracr이 어떻게 설계되었는지를 도식적으로 나타낸 것이다. 줄기-루프 가이드 분자 내 상호작용(줄기에서 W-C 염기쌍)과 리보핵단백질(RNP)-단일 가이드 RNA(sgRNA) 정렬을 보여준다. gRNA의 tracrRNA 서열은 cas 단백질에 대한 결합 스캐폴드 역할을 한다. gRNA를 설계할 때, 루프 뉴클레오티드는 단백질과 정렬될 수 있고, 염기의 상호작용(H-결합), 당 모이어티의 2'-히드록실(2'-OH), 4'-산소(고리-산소), 단백질의 아미노산 측쇄에 대한 각 뉴클레오티드의 포스페이트 결합이 gRNA-Tracr의 설계에서 고려될 수 있다. RNP-입체 상호작용 내에서 뉴클레오티드의 공간적 배열, 2'-O-메틸(2'-OMe) 및 포스포로티오에이트(PS)와 같은 부피가 큰 치환을 수용할 수 있는 공간도 고려될 수 있다. [도 1d]는 출현 순서대로 각각 서열 번호 70-71을 개시한다.
[도 2]는 구조를 기반으로 본원에 개시된 gRNA를 설계하는 것과 관련하여 SpCas9 결정 구조가 어떻게 선택되었는지를 설명하는 2개의 표이다. 상단 패널은 단백질 데이터 뱅크(PDB: Protein Data Bank) ID 및 상태와 함께 CRISPR/Cas 시스템의 다양한 구성요소를 요약한 표이다. 하단 패널은 각 구조의 단백질 사슬 사이의 정렬 후 평균 제곱근 편차(RMSD: root mean square deviation) 값을 보여준다. RNP 상태(4ZT0)와 촉매전 삼원 복합체(pre-catalytic ternary complex)(5F9R)가 RNP 형성과 관련된 접촉 및 촉매작용과 관련된 접촉을 결정하는 데 가장 관련이 있다. 이 두 상태 사이에서 단백질의 일부 재배열이 발생한다. apo 상태와 RNP 사이의 단백질에서 대규모 재배열이 발생할 수 있다.
[도 3]은 4ZT0 및 5F9R 결정 구조에 기반한 sgRNA의 gRNA 2차 구조를 도시하며, 여기서 sgRNA는 RNP 단독으로 또는 DNA와의 삼원 복합체의 일부로서 SpCas9에 결합된다. 2차 구조 관계는 Leontis 및 Westhof 명명법(RNA, 2001, 7, 499-512)(서열 번호 72)에 나와 있다.
[도 4]는 RNP PDB 4ZT0(sgRNA + SpCas9 RNP)에 기초하여 예측된 접촉을 보여주는 PCSK9 스페이서를 갖는 gRNA 2차 구조를 도시한다. 위치 1-10 및 위치 83-100은 명확한 전자 밀도(서열 번호 73)의 부족으로 인해 이 결정 구조에서 모델링되지 않았다. 흰색 문자 표시가 있는 검은색 원: 단백질 접촉, 검은색 문자가 있는 밝은 회색: 2'-O-Me가 혼입되거나 원거리 접촉일 경우 입체 클래쉬(clash), 검은색 문자가 있는 짙은 회색: RNA 접촉. 당업자가 이해하는 바와 같이, 본원에 사용되는 용어 "클래쉬"는 구조에서 물리적으로 가능성이 없는 중첩 원자 부피를 지칭한다. 이러한 상황에서 2'O-Me 변형이 혼입되면 잠재적으로 RNP 기능에 해로울 수 있는 구조적 재배열(들)이 발생할 수 있다. 당업자가 이해하는 바와 같이, 본원에 사용되는 용어 "접촉"은 2개의 작용기 사이의 안정한 비공유 상호작용, 예를 들어, 수소 결합을 의미한다.
[도 5]는 PDB 5F9R(촉매전 삼원 복합체)(서열 번호 74)에 기초하여 예측된 접촉을 나타내는 PCSK9 스페이서를 갖는 gRNA 2차 구조를 도시한다. 흰색 문자 표시가 있는 검은색 원: 단백질 접촉, 검은색 문자가 있는 밝은 회색: 2'-O-Me가 혼입되거나 근거리 접촉인 경우 입체 클래쉬, 검은색 문자가 있는 짙은 회색: RNA 접촉.
[도 6]은 구조 기반 설계(서열 번호 73)에 의해 결정된 2'-OMe 치환의 타당한 위치를 도시한다. 흰색 문자 표시가 있는 검은색 원: 2'-OMe 및 포스포로티오에이트 치환, 검은색 문자 표시가 있는 밝은 회색 원: 2'-OMe 치환만, 검은색 문자 표시가 있는 흰색 원: 비변형된 뉴클레오티드.
[도 7a]는 생체 내에서 강력한 편집을 생성하는 2'-O-메틸리보당 변형의 구조 가이드된 혼입으로부터 단일 가이드 RNA의 tracr 영역에서 식별된 2'-OMe 위치의 3가지 패턴을 도시한다: (1) 마우스: [도 16], GA054(tracr1) 및 GA055(tracr2) 및 (2) NHP: [도 28], GA096(tracr1), GA097(tracr2) 및 GA346(tracr3). 흰색 문자 표시가 있는 검은색 원: 2'-OMe 및 포스포로티오에이트 치환, 검은색 문자 표시가 있는 밝은 회색 원: 2'-OMe 치환만, 검은색 문자 표시가 있는 흰색 원: 비변형된 뉴클레오티드. (서열 번호 73) [도 7b]는 비변형된 서열 번호 61, 참조 tracrRNA 서열("Lit Tracr"), tracr1, tracr2, 및 tracr3의 서열 정렬을 도시한다. (서열 번호 73)
[도 8]은 1차 인간 간세포에서 PCSK9를 변형할 때 아데노신 염기 에디터 시스템에 의한 표적 스플라이스 부위의 염기 편집율을 나타낸다. 진한 선은 GA066으로 식별된 gRNA를 사용하여 얻은 스플라이스 부위 편집율 퍼센트를 나타낸다.
[도 9]는 PCSK9 엑손 1(2500-ng/mL 용량으로 형질감염된 세포의 게놈 DNA로부터 PCR 증폭)의 말단에서 스플라이스 도너의 안티센스 가닥에서 아데닌 염기의 편집율을 나타내는 생어 시퀀싱 크로마토그램을 도시하며, 스플라이스 부위 파괴가 어떻게 프레임 내 정지 코돈을 생성하는지를 보여준다. 편집 부위 하류에서 자연 발생 단일 염기 다형성(SNP: single nucleotide polymorphism)에 대한 이형접합이 명백하다. 이 계획은 1차 인간 간세포에서 PCSK9를 녹아웃시키기 위한 아데노신 염기 에디터 시스템에 의한 A에서 G로의 염기 편집율을 보여준다. [도 9]는 서열 번호 75를 개시한다.
[도 10]은 ANGPTL3 엑손 6(2500-ng/mL 용량으로 형질감염된 세포의 게놈 DNA로부터 PCR 증폭)의 말단에서 스플라이스 도너의 안티센스 가닥에서 아데닌 염기의 편집을 입증하는 생어 시퀀싱 크로마토그램을 도시하며, 스플라이스 부위 파괴가 어떻게 프레임 내 정지 코돈을 생성하는지 보여준다. A에서 G로의 염기 편집은 1차 인간 간세포에서 ANGPTL3을 변형할 때 아데노신 염기 에디터 시스템에 의해 수행된다. [도 10]은 서열 번호 76을 개시한다.
[도 11]은 1) 미처리된 1차 간세포(상부 패널); 2) SpCas9 mRNA/PCSK9 gRNA GA097 처리된 1차 간세포(중간 패널); 3) ABE8.8 mRNA/PCSK9 gRNA 처리된 1차 간세포(하부 패널)로부터 단리된 PCR 증폭된 게놈 DNA로부터의 3개의 생어 시퀀싱 크로마토그램을 나타낸다. PCSK9-gRNA GA097 프로토스페이서 서열은 회색으로 강조 표시되어 있다. 화살표는 ABE8.8 에디터에 의해 A에서G로의 염기 편집을 위해 표적화되는 프로토스페이서의 위치 6을 가리킨다. 가위는 이 표적 부위에서 SpCas9 뉴클레아제에 의해 절단될 때 발생하는 이중 가닥 파손의 일반적인 부위를 도시한다. 세포에서 SpCas9 mRNA 및 GA097 전달은 이중 가닥 파손 부위에서 상당한 유전자 편집을 초래했지만(가위로 표시됨) 이것은 세포에서 ABE8.8 및 GA097 전달에서 보이지 않았다. 대신, ABE8.8 mRNA와 조합된 동일한 gRNA GA097은 강력한 A에서G로의 염기 편집을 초래하였다. [도 11]은 출현 순서대로 각각 서열 번호 77-79를 개시한다.
[도 12]는 스플라이스 도너 또는 스플라이스 억셉터 서열의 파괴로 인한 잠재적인 스플라이싱 결과를 보여주는 개략도를 도시한다. 스플라이싱 생성물에 인트론 1의 일부를 포함하는 것과 같은 다른 결과도 가능하다. 스플라이스 도너 또는 스플라이스 억셉터 부위의 변경을 나타낸다(상단 패널). 1차 인간 간세포에서 PCSK9 엑손 1 스플라이스 도너 아데닌 염기의 편집으로 인한 PCSK9 인트론 1 내의 대체 스플라이스 도너 부위를 하단 패널에 보여준다. * 대조군/처리된 샘플의 RT-PCR에 4개의 상이한 프라이머 쌍(표 9)을 사용하였다.
[도 13]은 1차 인간 간세포에서 가이드 RNA 의존적 DNA 오프 타겟 편집의 결여를 보여준다. 인간 1차 간세포를 실시예 4에 기재된 바와 같이 gRNA(GA097 또는 GA346) 및 ABE8.8 mRNA와 함께 인큐베이션하였다. 오프 타겟 판독은 4명의 개별 기증자로부터의 1차 인간 간세포에서 온 타겟 PCSK9 부위에서 순 아데닌 편집율(미처리 세포에 비해 LNP 처리된 세포에서 하나 이상의 아데닌 염기의 변경을 갖는 시퀀싱 리드(read)의 비율) 및 50개 초과의 후보 오프 타겟 PCSK9 부위로서 계산하였다.
[도 14]는 2일 후(n = 4개의 생물학적 복제물) SpCas9 처리 또는 ABE8.8 처리 간세포에서 평가된 가이드 RNA 비의존적 RNA 편집율을 도시한다. 각 복제물을 4개의 미처리된 간세포 샘플 각각에 대해 비교하여 두 조건에 공통적인 편집이 있는 모든 위치를 제거하였다. jitter 플롯은 처리된 샘플에서 편집이 있는 트랜스크립톰 유전자좌를 나타낸다(숫자는 처리된 샘플에서 식별된 총 편집된 유전자좌를 나타내고, 상자 플롯은 샘플의 편집된 모든 유전자좌에서 편집된 리드의 비율의 중앙값 ± 사분위수 범위를 나타냄). 이 연구에서 gRNA GA097, SpCas9 mRNA MS010 및 ABE8.8 mRNA MA004를 실시예 4에 기재된 바와 같이 사용하였다.
[도 15]는 1차 인간 간세포 및 1차 비인간 영장류(NHP: non-human primate) 간세포에서 염기 에디터 시스템, ABE mRNA 및 가이드 RNA의 한 실시양태로 제제화된 지질 나노입자(LNP)를 사용한 PCSK9 및 ANGPTL3 염기 편집율을 나타낸다. 인간 특이적 ANGPTL3 가이드 RNA는 평가된 농도 내에서 NHP 간세포에서 낮은 편집 효율을 보인 반면, 인간 및 NHP 둘 다에 교차 반응성인 PCSK9 가이드 RNA는 두 세포주 모두에서 높은 편집 효율을 나타냈다.
[도 16]은 1:1 중량비로 SpCas9 mRNA MS002(TriLink Biotechnologies) 및 상이한 tracr 설계(GA052, GA053, GA054, 및 GA055)를 이용한 마우스 Pcsk9-표적화 gRNA를 함유하는 LNP를 통한 마우스(n=2-5마리 마우스)에서 Pcsk9의 유전자 편집율을 보여준다. 야생형 C57BL/6 마우스에 2 mg/kg의 LNP 테스트 물품을 투여하였다. mg/kg 용량은 총 RNA를 기준으로 계산하였으며 총 RNA는 제제화 후 LNP에 존재하는 mRNA와 gRNA의 정량화된 합계이다. 투여 7일 후, 마우스를 안락사시키고 마우스 간에서 게놈 DNA를 수거한 다음, 차세대 시퀀싱으로 표적 부위의 염기 편집을 평가하였다. 평가된 4개의 가이드 RNA는 모두 5'-말단으로부터의 처음 20개 뉴클레오티드 내에서 동일한 스페이서 및 동일한 화학적 변형 패턴을 가지고 있지만, 4개 모두 100-mer 가이드 RNA의 위치 21과 위치 100의 뉴클레오티드 사이의 tracr 내 화학적 변형 패턴이 상이하다.
[도 17]은 염기 에디터 시스템, ABE mRNA MA004 및 PCSK9 가이드 RNA GA256(마우스 인트론 1 스플라이스 도너를 표적화함)의 실시양태를 포함한 LNP를 통한 마우스(n=5)에서 PCSK9의 염기 편집율을 나타낸다. 야생형 C57BL/6 마우스에 LNP 테스트 물품의 총 RNA 2 mg/kg을 투여하였다. 투여 7일 후, 마우스를 안락사시키고 마우스 간에서 게놈 DNA를 수거한 다음 차세대 시퀀싱으로 표적 부위의 염기 편집에 대해 평가하였다.
[도 18]은 ABE8.8 mRNA MA004 및 Pcsk9 gRNA GA256(투여군당 n = 4 내지 5마리 마우스, 막대는 군의 평균 편집율을 나타냄)를 포함한 동일한 LNP 제제의 다양한 용량으로 투여 1주일 후에 평가한 야생형 마우스 간에서 Pcsk9 엑손 1 스플라이스 도너 아데닌 염기의 편집율을 도시한다.
[도 19]는 상이한 비율의 gRNA GA256 및 mRNA MA002를 함유하는 0.05mg/kg 총 RNA 용량의 LNP를 투여한 후, 야생형 마우스 간에서 Pcsk9 엑손 1 스플라이스 도너 아데닌 염기의 편집율을 도시한다. 상이한 화학적 변형을 가진 추가 가이드 GA255 및 GA257도 mRNA 대 gRNA 1:1 중량비에서 염기 편집 효율성에 대해 평가하였다.
[도 20]은 ABE8.8 mRNA 및 마우스 Angptl3-표적화 gRNA(GA258, GA259, GA260, GA349, GA353)를 1:1 중량비로 함유하는 LNP를 0.05 mg/kg 총 RNA 용량으로 마우스에 투여한 결과를 나타낸다. GA258, GA259 및 GA260은 세 가지 상이한 구조 가이드된 tracr 설계를 포함한다. GA349 및 GA353 tracr 설계는 공개된 문헌(Cell Reports, 2018 22, 2227-2235)에서 유래하였다. 나중에 마우스를 안락사시키고 마우스 간으로부터 게놈 DNA를 수거한 다음 차세대 시퀀싱으로 표적 스플라이스 부위의 염기 편집에 대해 평가하였다.
[도 21]은 염기 에디터 시스템, ABE mRNA 및 가이드 RNA의 실시양태로 제제화된 LNP를 통해 NHP에서 표적 유전자의 아데닌 염기 편집을 도입하기 위한 일반적인 투여 전략 및 2주 후 후속 분석을 나타내는 개략도이다.
[도 22]는 염기 에디터 시스템, ABE mRNA MA002 및 PCSK9 가이드 RNA GA066의 실시양태로 제제화된 LNP를 1mg/kg 및 3mg/kg 총 RNA 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이에게 투여하여 시노몰구스 원숭이의 간의 PCSK9 표적 스플라이스 부위에서 아데닌 염기 편집을 유도하였음을 보여준다.
[도 23]은 염기 에디터 시스템, ABE mRNA MA004 및 PCSK9 가이드 RNA GA066의 실시양태로 제제화된 LNP를 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이에게 투여한 결과 투여 후 2주에 투여 전 수준과 비교하여 혈중 PCSK9 단백질 수준이 감소되었음을 보여준다.
[도 24]는 염기 에디터 시스템, ABE mRNA MA002 및 PCSK9 가이드 RNA GA066의 실시양태로 제제화된 3mg/kg의 LNP를 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이에게 투여한 결과 투여 후 1주 및 2주에 투여 전 수준과 비교하여 혈중 저밀도 지단백 콜레스테롤(LDL-C) 수준이 감소되었음을 보여준다.
[도 25a-25c]는 비인간 영장류에서 PCSK9의 단기 아데닌 염기 편집율을 보여준다. [도 25a]는 ABE8.8 mRNA MA004 및 PCSK9 gRNA GA097을 포함한 1 mg/kg 용량의 LNP 제제를 정맥 내 주입하고 처리 후 2주(3마리 동물) 또는 24시간(2마리 동물)에 부검한 시노몰구스 원숭이의 간에서 PCSK9 엑손 1 스플라이스 도너 아데닌 염기의 편집율을 도시한다. 각 동물에 대해 간 전체에 분포된 부위로부터 수집한 샘플에서 편집율을 평가하였다(n = 8 샘플, 막대는 동물의 평균 편집율을 나타냄). 기준선 처리 전 수준(동물당 n = 1 혈액 샘플)에 대해 2주에서의 수준을 비교하여 처리 후 2주에 부검한 3마리의 동물에서 혈중 PCSK9 단백질 수준(도 25b) 또는 혈액 LDL-C 수준(도 25c)의 감소가 나타난다.
[도 26a-26c]는 비인간 영장류에서 PCSK9의 아데닌 염기 편집율을 보여준다. [도 26a]는 ABE8.8 mRNA MA004 및 PCSK9 gRNA GA346을 포함한 0.5, 1.0, 또는 1.5 mg/kg 용량의 LNP 제제를 정맥 내 주입한 시노몰구스 원숭이의 간에서 PCSK9 엑손 1 스플라이스 도너 아데닌 염기의 편집율을 도시한다. 동물에 대한 혈중 PCSK9 단백질 수준(도 26b) 또는 혈액 LDL-C 수준(도 26c)의 감소가 나타난다.
[도 27]은 처리 후 2주에 부검한 3마리의 동물에서 PCSK9 엑손 1 스플라이스 도너 아데닌 염기 편집율의 조직 분포를 도시한다(간을 제외한 각각의 표시된 기관에 대해 동물당 n = 1 샘플; 간 데이터는 각각 8개의 간 샘플로부터 계산하여 평균으로 나타냄). 본 연구에서는 ABE mRNA MA004 및 가이드 RNA GA346으로 구성된 LNP를 사용하였으며, 투여된 양은 0.5 mg/kg이었다.
[도 28]은 ABE mRNA MA004 및 동일한 스페이서를 갖지만 상이한 tracer 변형을 갖는 상이한 가이드 RNA로 구성된 개별 지질 나노입자(LNP)의 정맥 내 주입 후 시노몰구스 원숭이의 간에서 PCSK9 엑손 1 스플라이스 도너 아데닌 염기 편집의 편집율을 예시한다. 이 연구에 사용된 가이드 RNA는 GA066, GA096, GA097 및 GA346이었다. 두 가지 상이한 공급원으로부터의 gRNA GA097을 동일한 연구에 사용하였으며 공급원은 (1) 및 (2)로 식별한다. tracr 비교 연구를 위해 LNP는 가이드 RNA와 mRNA가 1:1 중량비로 혼합된 1 mg/kg 총 RNA 용량으로 투여하였다. tracr 설계가 공개된 GA066(Cell Reports, 2018 22, 2227-2235)은 동일한 실험 조건에서 다른 모든 tracr 설계(도 7)(GA095, GA097 및 GA346)에 비해 원숭이에서 더 낮은 염기 편집율을 생성하였다.
[도 29]는 비인간 영장류에서 SpCas9 뉴클레아제 대 PCSK9의 아데닌 염기 편집율을 보여준다. SpCas9 mRNA 및 PCSK9 gRNA(MS010/GA097) 또는 ABE8.8 mRNA 및 PCSK9 gRNA(MA004/GA097)를 포함하는 LNP를 시노몰구스 원숭이에게 정맥 내 주입하였다. MS010/GA097 LNP는 0.75 및 1.5 mg/kg으로 투여하였고 MA004/GA097 LNP는 1 mg/kg 총 RNA 투여량으로 투여하였다. 1.5 mg/kg의 MS010/GA097 LNP 테스트 물품은 NHP에서 낮은 한 자리 수 유전자 편집율을 생성한 반면 ABE/GA097 테스트 물품은 1 mg/kg에서 약 40% 아데닌 염기 편집율을 생성하여 SpCas9 시스템에 대한 ABE 염기 에디터의 견고성을 보여준다. 이 연구에 사용된 모든 LNP는 동일한 부형제 및 조성을 사용하여 제조하였다.
[도 30]은 비인간 영장류에서 PCSK9의 아데닌 염기 편집율을 보여준다. 이 그래프는 0.5, 1.0, 1.5, 또는 3 mg/kg LNP#1의 총 RNA 용량을 정맥 내 주입한 시노몰구스 원숭이(각 막대는 개별 동물이며 편집율은 여러 샘플링 영역에 대해 기록됨)의 간에서 PCSK9 엑손 1 스플라이스 도너 아데닌 염기의 편집율을 나타낸다. 3mg/kg 총 RNA의 LNP#2는 이전 연구의 벤치마크로 투여하였다. 두 LNP 제제 모두 ABE8.8 mRNA MA004 및 PCSK9 gRNA GA346을 포함한다.
[도 31]은 [도 30]에 기재된 동일한 실험으로부터 제15일에 기저로부터 PCSK9 단백질 수준의 감소를 나타낸다.
[도 32]는 ABE8.8 mRNA MA004 및 PCSK9 gRNA GA066을 포함한 LNP 제제의 3 mg/kg 총 RNA 용량을 정맥 내 주입한 4마리의 시노몰구스 원숭이의 간에서 PCSK9 엑손 1 스플라이스 도너 아데닌 염기의 편집율을 도시한다. 각 동물에 대해 처리 후 2주에 간 생검 샘플에서 편집율을 평가하였다(동물당 샘플 n = 1).
[도 33]은 [도 32]의 4마리 동물(ABE8.8 mRNA MA004 및 PCSK9 gRNA GA066을 포함하는 3mg/kg 총 RNA 용량의 LNP 제제를 받은 동물) 및 포스페이트 완충 식염수를 받은 2마리의 동시 대조군 동물에서 처리 후 다양한 시점에서의 수준 대 기준선 처리 전 수준(각 군에 대한 평균 ± 표준 편차, 각 시점에서 n = 4 또는 n = 2)을 비교하여 혈중 PCSK9 단백질 수준의 감소를 도시한다. 점선은 각각 기준선 수준의 100% 및 10%를 나타낸다.
[도 34]는 [도 32]의 4마리 동물(ABE8.8 mRNA MA004 및 PCSK9 gRNA GA066을 포함하는 3mg/kg 총 RNA 용량의 LNP 제제를 받은 동물) 및 포스페이트 완충 식염수를 받은 2마리의 동시 대조군 동물에서 처리 후 다양한 시점에서의 수준 대 기준선 처리 전 수준(각 군에 대한 평균 ± 표준 편차, 각 시점에서 n = 4 또는 n = 2)을 비교하여 혈중 LDL-C 수준의 감소를 도시한다. 점선은 각각 기준선 수준의 100% 및 40%를 나타낸다(상단 패널). 개별 동물의 절대값이 하단 패널에 표시되어 있다.
[도 35]는 [도 32]의 4마리 동물 및 포스페이트 완충 식염수를 받은 2마리의 동시 대조군 동물에서 처리 후 다양한 시점에서의 수준 대 기준선 처리 전 수준(각 군에 대한 평균 ± 표준 편차, 각 시점에서 n = 4 또는 n = 2)을 비교하여 지단백질(a)의 감소를 도시한다
[도 36]은 비인간 영장류에서 간 PCSK9 염기 편집의 장기 표현형 효과를 보여준다. 처리 후 다양한 시점에서 [도 32]에 도시된 개별 동물(ABE8.8 mRNA 및 PCSK9-gRNA가 포함된 3 mg/kg 용량의 LNP 제제로 처리한 동물 n =4, 및 포스페이트 완충 식염수로 처리된 동물 n = 2)에서 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제(AST)(상부 패널) 및 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT)(하부 패널)의 절대값.
[도 37a-37g]는 개별 동물의 간 기능 마커를 보여준다. ABE8.8 mRNA 및 PCSK9 gRNA를 포함하는 0.5, 1.0, 또는 1.5 mg/kg 용량의 LNP 제제를 정맥 내 주입한 시노몰구스 원숭이로부터의 투여 후 15일 까지의 AST(도 37a, 도 37b), ALT(도 37a, 도 37c), 알칼리 포스페이트(도 37a, 도 37d), 감마-글루타밀트랜스퍼라제(도 37a, 도 37e), 총 빌리루빈(도 37a, 도 37e), 및 알부민(도 37a, 도 37g).
[도 38]은 시노몰구스 게놈에 대해 설계된 특정 라이브러리를 사용한 대표적인 후보 ONE-seq 부위의 개략도이다. PCSK9 프로토스페이서는 1.00의 ONE-seq 점수로 상단에 표시되어 있다. 나열된 모든 부위는 감소하는 ONE-seq 점수에 의해 순위가 매겨져 있으며, 프로토스페이서 서열에 대한 미스매치가 식별되어 있다. [도 38]은 출현 순서대로 각각 서열 번호 80, 2193-2196, 566, 2197-2205, 675, 2206-2220, 564, 2221-224, 638, 644, 506, 621, 2225-2226, 681, 및 2227-2230를 개시한다.
[도 39]는 [도 38]에서 식별된 부위의 gRNA 의존적, DNA 오프 타겟 분석을 보여준다. 시노몰구스 1차 간세포(상단 패널) 또는 시노몰구스 원숭이 간(하단 패널)의 샘플을 순 A>G 염기 편집율에 대해 평가하였다(처리된 샘플 n=3, 미처리된 샘플 n=3).
[도 40]은 0.5, 1.0, 또는 1.5 mg/kg LNP를 받은 NHP의 간으로부터의 [도 39]에서 식별된 하나의 오프 타겟 부위(C5)에서의 순 A>G% 염기 편집율을 나타낸다.
[도 41]은 염기 에디터 시스템, ABE mRNA MA004 및 ANGPTL3 가이드 RNA GA067의 실시양태로 제제화된 LNP를 통한 NHP에서 ANGPTL3의 염기 편집율을 보여준다. 3개의 NHP에 대해 간 편집율(왼쪽 패널), ANGPTL3 단백질 수준(중간 패널), 및 트리글리세리드 수준(오른쪽 패널)을 보여준다.
[도 42]는 인간 1차 간세포에서 염기 에디터 시스템, ABE mRNA MA002 및 이중 가이드 RNA GA095(hcPCSK9) 및 GA098(hANGPTL3)의 실시양태로 제제화된 지질 나노입자(LNP)를 0-2500 ng/테스트 물품/mL 범위의 농도에서 사용한 동시 ANGPTL3 및 PCSK9 염기 편집율을 나타낸다.
[도 43]은 제15일 및 제44일 간 생검 아데노신 염기 편집율 결과를 나타낸다. NHP에 ABE8.8 mRNA MA004 및 PCSK9(GA346)를 표적화하는 gRNA 또는 ANGPTL3(GA347)을 표적화하는 gRNA로 제제화된 LNP를 0.5-2mg/kg 범위의 총 RNA 용량으로 정맥 내 주입을 통해 투여하였다. 테스트 물품 투여 후 2주에, 염기 편집율을 평가하기 위해 생검을 수행하였다. 연구 개시로부터 30일 후, 반대의 LNP를 투여하였다. 추가 2주 후 두 번째 생검 후 gDNA를 추출하고 차세대 시퀀싱을 사용하여 염기 편집율을 평가하였다. PCSK9 염기 편집율(상단 패널) 및 ANGPTL3 염기 편집율(하단 패널)에 대한 결과를 나타낸다. ABE8.8 mRNA, PCSK9 gRNA GA346 및 ANGPTL3 gRNA GA347을 1:0.5:0.5 중량비로 캡슐화하는 LNP의 2 mg/kg 총 RNA 용량은 강력한 동기화된 PCSK9 및 ANGPTL3 유전자 편집율을 생성하였다(실시예 10).
[도 44]는 [도 43]에 도시된 NHP로부터의 PCSK9(상부 패널) 및 ANGPTL3(하부 패널) 단백질 수준의 상응하는 변화율%를 예시한다.
[도 45]는 NHP에서 반복적인 LNP 투여가 제14일, 제46일, 및 제75일 간 생검 후 간에서 부가적인 아데노신 염기 편집을 유발한다는 것을 예시한다. NHP에 ABE8.8 mRNA MA004 및 PCSK9(GA097)를 표적화하는 gRNA로 제제화된 LNP#1 또는 LNP#2를 0.5mg/kg의 총 RNA 용량으로 정맥 내 주입을 통해 투여하였다(투여 간격에 대한 자세한 내용 및 관련 세부 사항은 실시예 10를 참조).
[도 46]은 NHP에서 반복적인 LNP 투여가 간에서 부가적인 염기 편집을 유발하고 90일에 걸쳐 혈장 PCSK9 단백질 수준의 용량 의존적 부가적 감소로 해석된다는 것을 예시한다. [도 45]에 도시된 바와 같이, NHP에 ABE8.8 mRNA MA004 및 PCSK9(GA097)를 표적화하는 gRNA로 제제화된 LNP로 반복 투여하였다. NHP에 제0일, 제30일 및 제60일에 0.5mg/kg의 총 RNA 용량으로 정맥 내 주입을 통해 투여하였다(화살표를 그래프에 표시하여 투여를 나타냄). PCSK9 단백질 수준 분석에 대한 설명은 자세한 방법 섹션을 참조한다.
[도 47]은 NHP에서 반복적인 LNP 투여가 간에서 단지 일시적인 간 마커 증가와 함께 부가적인 염기 편집을 유발하고, 일시적인 간 마커의 증가가 각 용량이 투여된 날과 매우 상관된다는 것을 예시한다. 데이터는 제1 용량 후 ALT, AST, 총 빌리루빈 및 크레아틴 키나아제의 간 마커 수준의 71일을 보여준다(상세한 내용은 실시예 10, [도 45] 참조).
[도 48]은 NHP에서 반복적인 LNP 투여가 간에서 부가적인 염기 편집을 유발하고, NHP에서 LDH, GLDH, GGT 및 ALP의 간 효소 수준의 투여 후 71일까지 일시적인 간 마커 증가만 나타냄을 예시한다(자세한 내용은 실시예 10, [도 45] 참조).
[도 49a 및 49b]는 ANGPTL3의 염기 편집이 ABE8.8 mRNA MA004 및 ANGPTL3 gRNA GA067로 구성된 LNP의 단일 용량 후 장기간 감소된 ANGPTL3 단백질 및 트리글리세리드 수준을 초래한다는 것을 예시한다. 결과는 6개월에 걸쳐 비인간 영장류에서 ANGPTL3 단백질(도 49a) 및 트리글리세리드(도 49b)에 대한 ANGPTL3의 장기간 아데닌 염기 편집 효과를 예시한다. ANGPTL3 단백질(96% 감소) 및 트리글리세리드 수준은 LNP의 단일 용량 투여 시 실질적으로 감소되었으며, 170일 이상 동안 안정적으로 감소된 상태를 유지하였다(자세한 내용은 실시예 10 참조).
[도 50a-50e]는 사이토카인 활성화 및 면역 반응에 대한 NHP에서 LNP 투여의 효과를 예시한다. 시노몰구스 원숭이에 ABE8.8 mRNA MA004 및 PCSK9 gRNA GA346을 포함한 0.5 mg/kg 용량의 LNP 제제를 지정된 시점(도 50a 및 도 50b)에서 정맥 내 주입하였다. 그래프에 지정된 시점에 채혈하여, IP-10 및 MCP-1을 분석하였다. 추가 연구에서, IL-6, MCP-1, 및 SC5b-9(각각 도 50c, 도 50d 및 도 50e)는 MA004 및 PCSK9 gRNA GA346으로 제제화된 LNP의 1.0 mg/kg의 총 RNA 용량을 정맥 내 주입한 NHP로부터 수집된 혈액으로부터 상이한 시점에서 분석하였다.
[도 51]은 SpCas9 mRNA/gRNA를 함유하는 LNP로 처리한 후 15일에 NHP에서 간 편집율을 예시한다. [도 51]은 비인간 영장류에서 ANGPTL3 또는 PCSK9의 유전자 편집 결과를 보여준다. 시노몰구스 원숭이에 SpCas9 mRNA MS004 및 ANGPTL3(GA261-GA263) 또는 PCSK9(GA266-GA271)를 표적화하는 하나의 gRNA를 포함하는 1.5 mg/kg 용량의 LNP 제제를 정맥 내 주입하였다. 2주 후 부검 시 각 간엽에서 2조각(총 8조각)를 단리하고 gDNA를 추출하였다. 샘플은 자세한 방법 섹션에 설명된 대로 처리하였다. 각 개별 조각에 대해 삽입-결실(indel)%를 분석하였으며 개별 포인트로 그래프로 표시한다. 대부분의 NHP 간에서 높은 편집 효율이 관찰되었다.
[도 52]는 SpCas9/gRNA로 처리한 후 15일에 NHP에서 LDL-C 수준을 예시한다. [도 52]는 비인간 영장류에서 ANGPTL3 또는 PCSK9의 유전자 편집율로부터 LDL-C의 감소를 보여준다. 시노몰구스 원숭이에 SpCas9 mRNA MS004 및 ANGPTL3(GA261-GA263) 또는 PCSK9(GA266-GA271)를 표적화하는 하나의 gRNA를 포함한 1.5mg/kg 용량의 LNP 제제를 정맥 내 주입하였다. 샘플은 상세한 방법 섹션에 설명된 대로 처리하였다. SpCas9 mRNA/PCSK9 gRNA를 포함한 LNP를 받은 모든 NHP는 순환 LDL-C 수준이 35% 이상 감소하였다. 더 크지 않긴 하지만, SpCas9 mRNA/ANGPTL3 gRNA를 포함한 LNP는 순환 LDL-C 수준이 10-25% 감소하였다.
[도 53]은 SpCas9/gRNA로 처리한 후 15일에 NHP에서 트리글리세리드 수준을 예시한다. [도 53]은 비인간 영장류에서 ANGPTL3 또는 PCSK9의 유전자 편집으로부터의 트리글리세리드 수준을 보여준다. 시노몰구스 원숭이에 SpCas9 mRNA MS004 및 ANGPTL3(GA261-GA263) 또는 PCSK9(GA266-GA271)를 표적화하는 하나의 gRNA를 포함한 1.5 mg/kg 용량의 LNP 제제를 정맥 내 주입하였다. 샘플은 상세한 방법 섹션에 설명된 대로 처리하였다. SpCas9 mRNA/ANGPTL3 gRNA를 포함한 LNP를 받은 NHP는 트리글리세리드 수준이 약 10-50% 감소하였다. SpCas9 mRNA/PCSK9 gRNA를 포함한 LNP를 받은 NHP는 트리글리세리드 수준에서 유의한 감소를 나타내지 않았다.
[도 54a 및 54b]는 gRNA에 대한 PACE-변형이 오프 타겟 편집 효율을 감소시킨다는 것을 예시한다. 인간 1차 간세포를 2500, 1250, 500 및 250 ng/테스트 물품/mL에서 SpCas9 mRNA(Trilink에서 상업적으로 구입) 및 tracr에 대한 변형이 있는 PCSK9를 표적화하는 gRNA로 형질감염시켰다. 게놈 DNA는 상세한 방법 섹션에 설명된 대로 처리, 시퀀싱 및 분석하였다. GA156을 형질감염시켜 양성 대조군으로 사용하였다. GA248 및 GA249에는 이전에 오프 타겟 편집 효율성을 감소시키는 것으로 입증된 gRNA에 대한 PACE 변형이 포함되어 있다. 실제로, GA248 및 GA249가 비변형된 gRNA에 비해 더 낮은 온 타겟 편집을 보였음에도 불구하고, GA156(도 54a), GA248 및 GA249는 식별된 오프 타겟 부위에서 감소된 오프 타겟 편집율을 나타냈다(도 54b).
[도 55a]는 ABE 코딩 뉴클레오티드, MA004, MA019, MA020, MA021, 및 ABE8.8m(표 23)의 GC 비교 뿐만 아니라 MA004(도 55a, 하단 패널)에 대한 보다 상세한 보기를 예시한다. [도 55b]는 ABE 코딩 뉴클레오티드, MA004, MA019, MA020, 및 MA021을 사용하여 얻은 편집율%을 예시한다(표 23).
다양한 실시양태의 완전한 이해를 제공하기 위해 이 설명의 특정의 구체적인 세부사항이 설명된다. 그러나, 당업자는 본 개시 내용이 이러한 세부사항 없이 실시될 수 있음을 이해할 것이다. 다른 경우에, 잘 알려진 구조는 실시양태의 설명을 불필요하게 모호하게 하는 것을 피하기 위해 상세히 도시되거나 설명되지 않았다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 개시 내용이 속하는 기술 분야에서 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 등가인 방법 및 재료가 본 개시 내용의 실시 또는 테스트에 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 재료가 하기에 기재되어 있다. 또한, 본원에 제공된 제목은 단지 편의를 위한 것이며 청구된 개시 내용의 범위 또는 의미를 해석하지 않는다. 본 명세서에서 논의된 임의의 실시양태는 본 개시 내용의 임의의 방법 또는 조성물과 관련하여 구현될 수 있고, 그 반대도 마찬가지인 것으로 고려된다. 또한, 본 개시 내용의 조성물은 본 개시 내용의 방법을 달성하기 위해 사용될 수 있다.
정의
본 개시 내용의 이해를 용이하게 하기 위해, 다수의 용어 및 문구가 하기에 정의된다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에 사용되는 바와 같이, 단수형 "a", "an" 및 "the"는 내용이 달리 명시하지 않는 한 복수의 지시 대상을 포함한다.
또한 "또는"이라는 용어는 내용이 달리 명백하게 지시하지 않는 한 "및/또는"을 포함하는 의미로 일반적으로 사용된다는 점에 유의해야 한다. 용어 본원에 사용되는 바와 같이 "및/또는" 및 "이들의 임의의 조합" 및 이들의 문법적 동의어는 상호교환적으로 사용될 수 있다. 이러한 용어는 임의의 조합이 구체적으로 고려됨을 전달할 수 있다. 단지 예시 목적으로, 다음 문구 "A, B, 및/또는 C" 또는 "A, B, C, 또는 이들의 임의의 조합"은 "A 개별적으로; B 개별적으로; C 개별적으로; A 및 B; B 및 C; A 및 C; 그리고 A, B, 및 C"를 의미할 수 있다. "또는"이라는 용어는 문맥이 구체적으로 분리 사용을 언급하지 않는 한 결합적으로 또는 분리적으로 사용될 수 있다.
용어 "약" 또는 "대략"은 당업자에 의해 결정된 특정 값에 대해 허용 가능한 오차 범위 내를 의미할 수 있으며, 이는 값이 어떻게 측정 또는 결정되는지, 즉 측정 시스템의 한계에 따라 결정될 것이다. 예를 들어, "약"은 당업계의 관행에 따라 1 또는 1 이상의 표준 편차 이내를 의미할 수 있다. 대안적으로, "약"은 주어진 값의 최대 20%, 최대 10%, 최대 5%, 또는 최대 1%의 범위를 의미할 수 있다. 대안적으로, 특히 생물학적 시스템 또는 과정과 관련하여, 상기 용어는 값의 10배 이내, 5배 이내, 보다 바람직하게는 2배 이내를 의미할 수 있다. 특정 값이 출원 및 청구범위에 기재된 경우, 달리 언급되지 않는 한 "약"이라는 용어는 특정 값에 대해 허용 가능한 오차 범위 내를 의미하는 것으로 가정해야 한다.
본 명세서 및 청구항(들)에서 사용되는 바와 같이, 단어 "포함하는(comprising)"(및 "포함하다" 및 "포함한다"와 같은 "포함하는"의 모든 형태), "가지는"(및 "가지다"와 "갖다"같은 "갖는"의 모든 형태), "포함하는(including)"(및 "포함하다" 및 "포함한다"와 같은 "포함하는"의 모든 형태) 또는 "함유하는(containing)"(및 "함유하다" 및 "함유한다"와 같은 "함유하는"의 모든 형태)은 포괄적이거나 개방적이며 추가의 나열되지 요소 또는 방법 단계를 배제하지 않는다.
본원에 사용되는 바와 같이, "일부 실시양태", "실시양태", "일 실시양태", "실시양태(들)" 또는 "다른 실시양태"는 실시양태와 관련하여 기재된 특정 특징, 구조, 또는 특성이 적어도 일부 실시양태에 포함됨을 의미하지만, 본 개시 내용의 모든 실시양태가 반드시 그런 것은 아니다.
본원에 사용되는 바와 같이 용어 "핵산"은 단일 가닥 또는 이중 가닥 형태로 2개 이상의 뉴클레오티드(즉, 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드)를 함유하는 중합체를 지칭하며 DNA 및 RNA를 포함한다. "뉴클레오티드"는 당 데옥시리보스(DNA) 또는 리보스(RNA), 염기 및 포스페이트 기를 포함한다. 뉴클레오티드는 포스페이트 기를 통해 함께 연결된다. "염기"는 퓨린 및 피리미딘을 포함하며, 이는 천연 화합물인 아데닌, 티민, 구아닌, 시토신, 우라실, 이노신, 및 천연 유사체, 및 아민, 알코올, 티올, 카르복실레이트 및 알킬할라이드와 같은 그러나 이에 제한되지 않는 새로운 반응기를 배치하는 변형을 포함하는, 그러나 이에 제한되지 않는 퓨린 및 피리미딘의 합성 유도체를 추가로 포함한다. 핵산은 임의의 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 60개 이하의 뉴클레오티드를 포함하는 단편을 일반적으로 올리고뉴클레오티드라고 하고, 더 긴 단편을 폴리뉴클레오티드라고 한다. 데옥시리보올리고뉴클레오티드는 데옥시리보스라고 하는 5탄당으로 이루어지는데, 이는 이 당의 5' 및 3' 탄소에서 포스페이트에 공유 결합되어 교대로 분지되지 않은 중합체를 형성한다. DNA는 예를 들어 안티센스 분자, 플라스미드 DNA, 사전 축합된 DNA, PCR 생성물, 벡터, 발현 카세트, 키메라 서열, 염색체 DNA, 또는 이들 군의 유도체 및 조합의 형태일 수 있다. 리보올리고뉴클레오티드는 5탄당이 리보스인 유사한 반복 구조로 이루어진다. 따라서, 용어 "폴리뉴클레오티드" 및 "올리고뉴클레오티드"는 자연 발생 염기, 당 및 당간(백본) 결합으로 이루어진 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드 단량체의 중합체 또는 올리고머를 지칭할 수 있다. 추가로, 핵산은 합성, 비표준 및/또는 비-자연 발생이고 참조 핵산과 유사한 결합 특성을 갖는 알려진 뉴클레오티드 유사체 또는 변형된 백본 잔기 또는 결합을 함유하는 핵산을 포함한다. 핵산은 염기 모이어티(예를 들어, 상보적 뉴클레오티드와 수소 결합을 형성하기 위해 전형적으로 이용 가능한 하나 이상의 원자 및/또는 상보적 뉴클레오티드와 전형적으로 수소 결합을 형성할 수 없는 하나 이상의 원자에서), 당 모이어티, 또는 포스페이트 백본에서 변형될 수 있다. 백본 변형은 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포로셀레노에이트, 포스포로디셀레노에이트, 포스포로아닐로티오에이트, 포스포라닐라데이트, 포스포라미데이트, 및 포스포로디아미데이트 결합을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 포스포로티오에이트 결합은 포스페이트 백본에서 비-가교 산소를 황 원자로 대체하고 올리고뉴클레오티드의 뉴클레아제 분해를 지연시킨다. 포스포로디아미데이트 결합(N3'→P5')은 뉴클레아제 인식 및 분해를 방지할 수 있다. 백본 변형은 백본 구조에서 인 대신에 펩티드 결합을 갖는 것(예를 들어, 펩티드 핵산에서 펩티드 결합에 의해 연결된 N-(2-아미노에틸)-글리신 단위), 또는 카르바메이트, 아미드 및 선형 및 고리형 탄화수소기를 포함하는 연결기를 갖는 것을 포함한다. 변형된 백본을 가진 올리고뉴클레오티드는 문헌[Micklefield, Backbone modification of nucleic acids: synthesis, structure and therapeutic applications, Curr. Med. Chem., 8 (10): 1157-79, 2001 및 Lyer et al., Modified oligonucleotides-synthesis, properties and applications, Curr. Opin. Mol. Ther., 1 (3): 344-358, 1999]에서 검토되어 있다. 본원에 기재된 핵산 분자는 자연 발생 뉴클레오티드에 존재하는 리보스 또는 데옥시리보스를 포함하는 당 모이어티, 또는 변형된 당 모이어티 또는 당 유사체를 함유할 수 있다. 변형된 당 모이어티의 예는 2'-O-메틸, 2'-O-메톡시에틸, 2'-O-아미노에틸, 2'-플루오로, N3'→P5' 포스포라미데이트, 2' 디메틸아미노옥시에톡시, 2' 2'디메틸아미노에톡시에톡시, 2'-구아니디니듐, 2'-O-구아니디늄 에틸, 카바메이트 변형 당, 및 이환 변형 당을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 2'-O-메틸 또는 2'-O-메톡시에틸 변형은 올리고뉴클레오티드에서 A-형태 또는 RNA-유사 형태를 촉진하고, RNA에 대한 결합 친화성을 증가시키며, 향상된 뉴클레아제 내성을 갖는다. 변형된 당 모이어티는 또한 여분의 가교 결합(예를 들어, 잠긴 핵산에서 리보스의 2'-O 및 4'-C 원자를 연결하는 메틸렌 가교) 또는 모르폴린 고리와 같은 당 유사체(예를 들어, 포스포로디아미데이트 모르폴리노에서와 같이)를 갖는 것을 포함한다. 이러한 유사체 및/또는 변형된 잔기의 예는 디아미노퓨린, 5-플루오로우라실, 5-브로모우라실, 5-클로로우라실, 5-요오도우라실, 하이포잔틴, 잔틴, 4-아세틸시토신, 5-(카르복시히드록실메틸)우라실, 5-카르복시메틸아미노메틸-2-티오우리딘, 5-카르복시메틸아미노메틸우라실, 디히드로우라실, 베타-D-갈락토실퀘오신, 이노신, N6-이소펜테닐아데닌, 1-메틸구아닌, 1-메틸이노신, 2,2-디메틸구아닌, 2-메틸아데닌, 2- 메틸구아닌, 3-메틸시토신, 5-메틸시토신, N6-아데닌, 7-메틸구아닌, 5-메틸아미노메틸우라실, 5-메톡시아미노메틸-2-티오우라실, 베타-D-만노실퀘오신, 5'-메톡시카르복시메틸우라실, 5-메톡시우라실, 2-메틸티오-N6-이소펜테닐아데닌, 우라실-5-옥시아세트산(v), 와이부톡소신, 슈도우라실, 퀘오신, 2-티오시토신, 5-메틸-2-티오우라실, 2-티오우라실, 4-티오우라실, 5-메틸우라실, 우라실-5-옥시아세트산 메틸에스테르, 5-메틸-2-티오우라실, 3-(3-아미노-3-N-2-카르복시프로필) 우라실, (acp3)w, 2,6-디아미노퓨린, 메틸 포스포네이트, 키랄-메틸 포스포네이트, 2'-O-메틸 리보뉴클레오티드, 펩티드-핵산(PNA) 등을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 일부 경우에, 뉴클레오티드는 트리포스페이트 모이어티에 대한 변형을 포함하여 포스페이트 모이어티에서 변형을 포함할 수 있다. 이러한 변형의 비제한적 예에는 더 긴 길이의 포스페이트 사슬(예를 들어, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 포스페이트 모이어티를 갖는 포스페이트 사슬) 및 티올 모이어티를 사용한 변형(예를 들어, 알파-티오트리포스페이트 및 베타-티오트리포스페이트)이 포함된다. 이러한 변형 또는 치환된 올리고뉴클레오티드는 예를 들어, 향상된 세포 흡수, 감소된 면역원성 및 뉴클레아제의 존재 하에 증가된 안정성과 같은 특성 때문에 종종 천연 형태보다 선호된다. 따라서, 용어 "폴리뉴클레오티드" 및 "올리고뉴클레오티드"는 유사하게 기능을 하는 비-자연 발생 단량체, 또는 이의 부분을 포함하는 중합체 또는 올리고머를 또한 포함할 수 있다.
달리 표시되지 않는 한, 특정 핵산 서열은 또한 그의 보존적으로 변형된 변이체(예를 들어, 축퇴 코돈 치환), 대립유전자, 오솔로그, SNP, 및 상보적 서열 뿐만 아니라 명시적으로 표시된 서열을 암시적으로 포함한다. 구체적으로, 축퇴 코돈 치환은 하나 이상의 선택된(또는 모든) 코돈의 세 번째 위치가 혼합 염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환된 서열을 생성함으로써 달성될 수 있다(Batzer et al., Nucleic Acid Res., 19: 5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem., 260:2605-2608 (1985); Rossolini et al., Mol. Cell. Probes, 8:91-98 (1994)).
본 개시 내용은 단리되거나 실질적으로 정제된 핵산 분자 및 이러한 분자를 함유하는 조성물을 포함한다. 본원에 사용되는 바와 같이, "단리된" 또는 "정제된" DNA 분자 또는 RNA 분자는 그의 천연 환경과 별도로 존재하는 DNA 분자 또는 RNA 분자이다. 단리된 DNA 분자 또는 RNA 분자는 정제된 형태로 존재할 수 있거나, 예를 들어 트랜스제닉 숙주 세포와 같은 비-천연 환경에 존재할 수 있다. 예를 들어, "단리된" 또는 "정제된" 핵산 분자 또는 이의 생물학적 활성 부분은 재조합 기술에 의해 생산될 때 다른 세포 물질 또는 배양 배지가 실질적으로 없거나, 화학적으로 합성될 때 화학적 전구체 또는 기타 화학물질이 실질적으로 없다. 한 실시양태에서, "단리된" 핵산에는 핵산이 유래된 유기체의 게놈 DNA에서 핵산에 자연적으로 측면에 위치하는 서열(즉, 핵산의 5' 및 3' 말단에 위치하는 서열)이 없다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 단리된 핵산 분자는 핵산이 유래된 세포의 게놈 DNA에서 핵산 분자의 측면에 자연적으로 위치하는 약 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0.5 kb, 또는 0.1 kb 미만의 뉴클레오티드 서열을 함유할 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "벡터"는 연결된 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 일부 예에서, 벡터는 작동적으로 연결된 핵산의 발현을 지시할 수 있는 발현 벡터이다. 본원에 사용되는 바와 같이 용어 "작동 가능하게 연결된"은 관심 뉴클레오티드 서열이 뉴클레오티드 서열의 발현을 허용하는 방식으로 조절 서열(들)에 연결됨을 의미한다. 본원에 사용되는 바와 같이 용어 "조절 서열"은 프로모터, 인핸서 및 기타 발현 제어 요소를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 이러한 조절 서열은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 문헌[Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)]에 설명되어 있다. 발현 벡터의 예는 플라스미드 벡터, 백시니아 바이러스, 폴리오바이러스, 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스, SV40, 단순 포진 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스, 레트로바이러스(예를 들어, 뮤린 백혈병 바이러스, 비장 괴사 바이러스, 및 Rous 육종 바이러스, Harvey 육종 바이러스, 조류 백혈병 바이러스, 렌티바이러스, 인간 면역결핍 바이러스, 골수증식성 육종 바이러스 및 유선 종양 바이러스와 같은 레트로바이러스로부터 유래된 벡터)에 기반한 바이러스 벡터 및 기타 재조합 벡터를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "단백질", "폴리펩티드" 및 "펩티드"는 상호교환적으로 사용되며 펩티드 결합을 통해 연결되고 2개 이상의 폴리펩티드 사슬로 구성될 수 있는 아미노산 잔기의 중합체를 지칭한다. 용어 "폴리펩티드", "단백질" 및 "펩티드"는 아미드 결합을 통해 함께 연결된 2개 이상의 아미노산 단량체의 중합체를 지칭한다. 아미노산은 L-광학 이성질체 또는 D-광학 이성질체일 수 있다. 보다 구체적으로, 용어 "폴리펩티드", "단백질" 및 "펩티드"는 특정 순서로 2개 이상의 아미노산으로 구성된 분자를 지칭하며, 예를 들어, 순서는 단백질을 코딩하는 유전자 또는 RNA의 뉴클레오티드 염기서열에 의해 결정된다. 단백질은 신체의 세포, 조직 및 기관의 구조, 기능 및 조절에 필수적이며 각 단백질은 고유한 기능을 가지고 있다. 예는 호르몬, 효소, 항체 및 이들의 임의의 단편이다. 일부 경우에, 단백질은 단백질의 일부, 예를 들어 단백질의 도메인, 서브도메인, 또는 모티프일 수 있다. 일부 경우에, 단백질은 단백질의 변이체(또는 돌연변이)일 수 있으며, 여기서 하나 이상의 아미노산 잔기는 단백질의 자연 발생(또는 적어도 알려진) 아미노산 서열 내에 삽입되고/거나, 그로부터 결실되고/거나 그에 치환된다. 단백질 또는 이의 변이체는 자연 발생 또는 재조합일 수 있다. 생물학적 물질에서 폴리펩티드의 검출 및/또는 측정 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며 웨스턴 블롯팅, 유세포 분석, ELISA, RIA, 및 다양한 단백질체학 기술을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 폴리펩티드를 측정하거나 검출하는 예시적인 방법은 ELISA와 같은 면역분석이다. 이러한 유형의 단백질 정량은 특정 항원을 포획할 수 있는 항체 및 포획된 항원을 검출할 수 있는 2차 항체를 기반으로 할 수 있다. 폴리펩티드의 검출 및/또는 측정을 위한 예시적인 분석은 문헌[Harlow, E. and Lane, D. Antibodies: A Laboratory Manual, (1988), Cold Spring Harbor Laboratory Press]에 설명되어 있다.
본원에 사용되는 바와 같이 용어 "서열 동일성"은 2개의 상이한 서열 사이에 정확히 일치하는 뉴클레오티드의 양을 지칭한다. RNA와 DNA 서열을 비교할 때 우라실과 티민 염기는 동일한 염기로 간주된다. 갭은 계산되지 않으며 측정은 일반적으로 두 서열 중 더 짧은 서열과 관련하여 이루어진다.
예를 들어:
A: AAGGCTT
B: AAGGC
C: AAGGCAT
여기서 동일성 (A,B)=100% (5개의 동일한 뉴클레오티드/min(길이(A),길이(B))).
동일성(B,C)=100%, 그러나 동일성(A,C)=85% ((6개의 동일한 뉴클레오티드 / 7). 따라서 100% 동일성이 두 개의 서열이 동일하다는 것을 의미하지는 않는다.
본원에 사용되는 바와 같이 "서열 유사성"이라는 용어는 한 서열을 정렬되는 다른 서열(편집 거리)의 정확한 사본으로 변환하기 위해 최소 횟수의 편집 작업(삽입, 결실 및 치환)을 찾는 최적의 일치 문제로 설명될 수 있다. 이를 사용하여 위 예의 백분율 서열 유사성은 sim(A,B)=60%, sim(B,C)=60%, sim(A,C)=86%(세미 글로벌, sim=1-(편집 거리/짧은 서열의 정렬되지 않은 길이)).
이를 필요로 하는 "대상체"는 질환, 질환의 증상, 또는 질환에 대한 소인을 치유, 힐링, 완화, 경감, 변경, 치료, 개선, 향상하거나, 이들에 영향을 미칠 목적을 가진 질환, 질환의 증상 또는 질환에 대한 소인이 있는 개인을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 대상체는 고콜레스테롤혈증이 갖는다. 일부 실시양태에서, 대상체는 죽상동맥경화성 혈관 질환을 갖는다. 일부 실시양태에서, 대상체는 고트리글리세리드혈증을 갖는다. 일부 실시양태에서, 대상체는 당뇨병을 갖는다. 용어 "대상체" 또는 "환자"는 포유동물을 포함한다. 포유동물의 예는 포유동물 부류의 임의의 일원: 인간, 침팬지와 같은 비인간 영장류, 및 기타 유인원 및 원숭이 종; 소, 말, 양, 염소, 돼지와 같은 농장 동물; 토끼, 개 및 고양이와 같은 가축; 래트, 마우스, 및 기니피그와 같은 설치류를 포함하는 실험 동물 등을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용되는 바와 같이 용어 "병태"는 질환, 장애 및 감수성을 포함한다. 일부 실시양태에서, 병태는 죽상동맥경화성 혈관 질환이다. 일부 실시양태에서, 병태는 고트리글리세리드혈증이다. 일부 실시양태에서, 병태는 당뇨병이다.
본원에 사용되는 바와 같이 "죽상동맥경화증" 또는 "죽상동맥경화성 혈관 질환"은 플라크(plaque)의 축적으로 인해 동맥 내부가 좁아지는 질환을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 이는 관상 동맥 질환, 뇌졸중, 말초 동맥 질환, 또는 신장 문제를 유발할 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이 용어 "고트리글리세리드혈증"은 대부분의 유기체에서 가장 풍부한 지방 분자인 트리글리세리드의 높은(고-) 혈액 수준(-혈증)을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 트리글리세리드의 상승된 수준은 심지어 고콜레스테롤혈증(높은 콜레스테롤 수준)이 없는 경우에도 죽상동맥경화증과 연관되고 심혈관 질환의 소인이 된다. 일부 실시양태에서, 매우 높은 트리글리세리드 수준은 급성 췌장염의 위험을 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 고트리글리세리드혈증은 과식, 비만, 진성 당뇨병 및 인슐린 저항성, 과도한 알코올 소비, 신부전, 신증후군, 유전적 소인(예를 들어, 가족성 복합 고지혈증, 즉, II형 고지혈증), 지단백질 리파아제 결핍, 리소좀 산 리파아제 결핍, 콜레스테릴 에스테르 축적 질환, 특정 약물(예를 들어, 이소트레티노인, 히드로클로로티아지드 이뇨제, 베타 차단제, 프로테아제 억제제), 갑상선 기능 저하증(갑상선 저하증), 전신 홍반성 루푸스 및 관련 자가 면역 반응, 글리코겐 축적 질환 유형 1, 프로포폴, 또는 HIV 약물과 관련된다.
본원에 사용되는 바와 같이 용어 "당뇨병"은 장기간에 걸친 고혈당 수준을 특징으로 하는 대사 장애 군을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 당뇨병은 베타 세포의 손실로 인해 췌장이 충분한 인슐린을 생성하지 못함으로써 발생하는 제1형 당뇨병이다. 일부 실시양태에서, 당뇨병은 세포가 인슐린에 적절하게 반응하지 못하는 상태인 인슐린 저항성을 특징으로 하는 제2형 당뇨병이다. 일부 실시양태에서, 당뇨병은 당뇨병의 이전 병력이 없는 임산부가 고혈당 수준을 나타낼 때 발생하는 임신성 당뇨병이다.
본원에 사용되는 바와 같이 용어 "저밀도 지단백질(LDL)"은 지단백질의 바깥쪽 테두리와 콜레스테롤 중심으로 구성된 미세한 덩어리를 지칭한다. 일부 실시양태에서, LDL은 리놀레에이트로 알려진 다중불포화 지방산 및 수백 내지 수천 개의 에스테르화 및 비에스테르화 콜레스테롤 분자로 구성된 고도로 소수성인 코어를 갖는다. 일부 실시양태에서, LDL의 코어는 또한 트리글리세리드 및 기타 지방을 운반하고 인지질 및 에스테르화되지 않은 콜레스테롤의 껍질로 둘러싸여 있다.
본원에 사용되는 바와 같이 용어 "고밀도 지단백질(HDL)"은 가장 작은 지단백질 입자를 지칭한다. 실시양태에서, 혈장 효소 레시틴-콜레스테롤 아실트랜스퍼라제(LCAT)는 유리 콜레스테롤을 콜레스테릴로 전환하고, 콜레스테릴은 그 후 지단백질 입자의 코어 내로 격리되어 결국 새로 합성된 HDL이 구형을 취하도록 한다. 실시양태에서, HDL 입자는 혈류를 통해 순환하고 세포 및 기타 지단백질로부터 더 많은 콜레스테롤 및 인지질 분자를 통합함에 따라 크기가 증가한다.
본원에 사용되는 바와 같이 용어 "콜레스테롤"은 부피가 큰 스테로이드 구조를 형성하는 4개의 연결된 탄화수소 고리로 구성된 독특한 구조를 갖는 지질을 지칭한다. 본원에 사용되는 바와 같이 용어 "트리글리세리드"는 3개의 지방산 분자에 결합된 글리세롤로 구성된 트리-에스테르를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 지방산은 포화 또는 불포화 지방산이다.
본원에 사용되는 바와 같이 용어 "치료하다", "치료하는" 또는 "치료" 및 그의 문법적 동의어는 질환 또는 병태의 적어도 하나의 증상을 완화, 약화 또는 개선하거나, 추가 증상을 예방하거나, 질환 또는 병태를 억제하거나, 예를 들어 질환 또는 병태의 발달 또는 진행을 지연, 감소, 억제, 약화, 감소, 저지 또는 안정화하거나, 질환 또는 병태를 완화하거나, 질환 또는 병태의 퇴행을 유발하거나, 질환 또는 병태에 의해 유발된 상태를 완화하거나, 질환 중증도를 감소시키거나, 질환 또는 병태의 증상을 예방적으로 및/또는 치료적으로 중단시키는 것을 포함할 수 있다. "치료"는 또한 질환 또는 병태와 관련된 임의의 증상 또는 다른 유해 효과 및/또는 질환 또는 병태와 관련된 부작용의 발생 또는 재발의 빈도, 또는 중증도를 줄이는 것을 포함한다. "치료"는 반드시 치료 결과를 요구하는 것은 아니다. 배제되지는 않지만, 장애 또는 병태를 치료하는 것이 또한 장애, 병태 또는 이와 관련된 증상이 완전히 제거되는 것을 요구하지 않는 것으로 이해된다. 용어 "치료"는 환자의 특정 질환 또는 장애의 중증도를 감소시키거나 재발을 지연시키는 것, 예를 들어 질환을 앓았던 환자의 관해 기간을 연장하는 것을 지칭하는 "관리"의 개념을 포함한다. "치료"는 질환 또는 병태의 발병 또는 발병 의심 후 대상체에 대한 조성물의 적용 또는 투여를 지칭할 수 있다.
"치료"라는 용어는 "예방하다", "예방하는" 및 "예방"의 개념을 추가로 포함한다. 본원에 사용되는 바와 같이 용어 "예방하다", "예방하는" 및 "예방"은 질환 또는 병태는 없지만 발병할 위험이 있거나 발병하기 쉬운 대상체에서 병태의 병리 발생의 감소를 지칭한다. 예방은 완전할 수 있으며, 예를 들어 대상체의 병태의 병리의 완전한 부재일 수 있다. 예방은 또한 대상체에서 병태의 병리 발생이 본 개시 내용 없이 발생했을 것보다 적은 것과 같이 부분적일 수 있다.
예를 들어, 동등한 치료되지 않은 대조군과 비교하여 "병태를 치료하거나 예방"함으로써, 장애의 증상 완화는 임의의 표준 기술로 측정되는 경우 적어도 3%, 5%, 10%, 20%, 40%, 50%, 60%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9%, 또는 100%의 감소 또는 예방 정도를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 장애의 증상 완화는 동등한 치료되지 않은 대조군과 비교하여 적어도 2, 3, 4, 5, 10, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 또는 10000배의 감소 또는 예방 정도를 포함할 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, 질환 발달의 "지연"은 질환 진행의 연기, 저해, 지연, 늦춤, 안정화, 및/또는 미룸을 의미한다. 이 지연은 질환의 병력 및/또는 치료를 받는 개인에 따라 다양한 시간 길이가 될 수 있다. 질환 발달의 "지연" 또는 완화 또는 질환 발병의 지연 방법은 방법을 사용하지 않는 것과 비교할 때 주어진 기간에 질환의 하나 이상의 증상이 발달할 확률을 감소시키고/거나 주어진 기간에 증상의 정도를 줄이는 방법이다. 이러한 비교는 일반적으로 통계적으로 유의한 결과를 제공하기에 충분한 수의 대상체를 사용한 임상 연구를 기반으로 한다.
질환의 "발달" 또는 "진행"은 질환의 초기 징후 및/또는 뒤이은 진행을 의미한다. 질환의 발병은 당업계에 잘 알려진 표준 임상 기술을 사용하여 탐지 가능하고 평가할 수 있다. 그러나 발달은 감지할 수 없는 진행을 지칭하기도 한다. 본 개시 내용의 목적을 위해, 발병 또는 진행은 증상의 생물학적 과정을 지칭한다. "발달"에는 발생, 재발, 및 발병이 포함된다.
본원에 사용되는 바와 같이, 질환의 "발병" 또는 "발생"은 초기 발병 및/또는 재발을 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같이 "투여" 및 그의 문법적 동의어는 본원에 기재된 약학 조성물을 대상체 또는 환자에게 제공하는 것을 지칭할 수 있다. 치료할 질환의 유형 또는 질환의 부위에 따라, 의약 분야의 통상의 기술자에게 공지된 통상적인 방법을 사용하여 대상체에게 조성물을 투여할 수 있다. 예를 들어, 조성물은 예를 들어, 경구, 비경구, 흡입 스프레이에 의해, 국소적으로, 직장으로, 비강으로, 협측으로, 질로, 이식된 저장소를 통해, 또는 주입을 통해 투여될 수 있다. 하나 이상의 이러한 경로가 사용될 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이 용어 "비경구"는 피하, 피 내, 정맥 내, 근육 내, 복강 내, 피부 내, 동맥 내, 활막 내, 흉골 내, 척추강 내, 혈관 내, 병변 내, 및 두개 내 주사 또는 주입 기술을 포함한다. 또한, 1, 3 또는 6개월 데포 주사 가능한 또는 생분해성 물질 및 방법을 사용하는 것과 같은 주사 가능한 데포 투여 경로를 통해 대상체에게 투여될 수 있다.
"공동 투여"는 하나 이상의 추가의 치료 요법 또는 작용제 또는 치료 및 본 개시 내용의 조성물을 하나 이상의 추가 치료제의 효과를 향상시키기에 시간상 충분히 근접하여 투여하거나 그 반대의 경우를 의미한다. 이와 관련하여, 본원에 기재된 개시 내용의 조성물은 하나 이상의 추가의 치료 요법 또는 작용제 또는 치료와 상이한 시간에 또는 완전히 상이한 치료 일정으로 동시에 투여될 수 있다(예를 들어, 제1 치료는 매일일 수 있는 반면, 추가 치료는 매주임). 예를 들어, 실시양태에서, 제2 치료 요법 또는 작용제 또는 치료는 본 개시 내용의 조성물 이전에 또는 이후에 동시 투여된다.
본원에 사용되는 바와 같이 용어 "약학 조성물" 및 그의 문법적 동의어는 대상체, 예를 들어 이를 필요로 하는 인간에게 투여될 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 부형제, 담체 및/또는 치료제와 함께 치료 유효량의 활성 약학 성분을 포함하는 혼합물 또는 용액을 지칭할 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이 용어 "약학적으로 허용 가능한" 및 그의 문법적 동의어는 일반적으로 안전하고 비독성이며 생물학적으로나 달리 바람직하지 않지 않으며 수의학적으로 뿐만 아니라 인간 약학 용도에 허용 가능한 약학 조성물을 제조하는 데 유용한 물질의 속성을 지칭할 수 있다. "약학적으로 허용 가능한"은 화합물의 생물학적 활성 또는 특성을 없애지 않고 상대적으로 독성이 없는 담체 또는 희석제와 같은 물질을 나타낼 수 있다. 즉, 물질이 바람직하지 않은 생물학적 효과를 일으키거나 함유된 약학적 조성물의 어떠한 성분과도 유해한 방식으로 상호작용하지 않으면서 대상체에게 투여될 수 있다.
"약학적으로 허용 가능한 부형제, 담체 또는 희석제"는 작용제와 함께 대상체에게 투여될 수 있고 치료량의 작용제를 전달하기 위해 충분한 용량으로 투여될 때 그의 약리학적 활성을 파괴하지 않고 무독성인 부형제, 담체, 또는 희석제를 지칭한다.
"약학적으로 허용 가능한 염"은 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응, 또는 기타 문제 또는 합병증 없이 인간 또는 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합하다고 당업계에서 일반적으로 고려되는 산 또는 염기 염일 수 있다. 이러한 염은 아민과 같은 염기성 잔기의 무기산염 및 유기산염뿐만 아니라 카르복실산과 같은 산성 잔기의 알칼리 또는 유기 염을 포함한다. 구체적인 약학적 염은 염산, 인산, 브롬화수소산, 말산, 글리콜산, 푸마르산, 황산, 설팜산, 설파닐산, 포름산, 톨루엔설폰산, 메탄설폰산, 벤젠 설폰산, 에탄 디설폰산, 2-히드록시에틸 설폰산, 질산, 벤조산, 2-아세톡시벤조산, 시트르산, 타르타르산, 락트산, 스테아르산, 살리실산, 글루탐산, 아스코르브산, 파모산, 숙신산, 푸마르산, 말레산, 프로피온산, 히드록시말레산, 요오드화수소산, 페닐아세트산, 알칸산, 예컨대 아세트산, HOOC-(CH2)n-COOH (여기서 n은 0-4) 등과 같은 산의 염을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 유사하게, 약학적으로 허용 가능한 양이온은 나트륨, 칼륨, 칼슘, 알루미늄, 리튬 및 암모늄을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 당업자는 본 개시 내용 및 당해 분야의 지식으로부터 추가의 약학적으로 허용 가능한 염이 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, p. 1418(1985)]에 열거된 것들을 포함함을 인식할 것이다. 일반적으로, 약학적으로 허용 가능한 산 또는 염기 염은 염기성 또는 산성 모이어티를 함유하는 모 화합물로부터 임의의 통상적인 화학적 방법에 의해 합성될 수 있다. 간략하게, 이러한 염은 이들 화합물의 유리 산 또는 염기 형태를 적절한 용매 중에서 화학량론적 양의 적절한 염기 또는 산과 반응시켜 제조할 수 있다.
용어 "치료제"는 대상체에게 투여될 때 치료, 진단, 및/또는 예방 효과를 갖고/거나 원하는 생물학적 및/또는 약리학적 효과를 유발하는 임의의 작용제를 지칭할 수 있다. 치료제는 또한 "활성물질" 또는 "활성제"로 지칭될 수 있다. 이러한 작용제에는 세포독소, 방사성 이온, 화학요법제, 소분자 약물, 단백질 및 핵산이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용되는 바와 같이 "치료 유효량"은 단독으로 또는 하나 이상의 다른 치료제와 조합하여 대상체에 치료 효과를 부여하는 데 필요한 본 개시 내용의 각 조성물의 양을 지칭한다. 따라서, 본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "치료 유효량"은 질환, 장애, 및/또는 병태에 걸렸거나 걸리기 쉬운 대상체에게 투여될 때 질환, 장애 및/또는 병태의 치료, 증상 개선, 진단, 예방 및/또는 발병 지연에 충분한 전달될 작용제(예를 들어, 핵산, 조성물, 치료제, 예방제 등)의 양을 의미한다. 치료의 관점에서, "치료 유효량"은 질환 또는 병태, 예를 들어 죽상동맥경화성 혈관 질환, 고트리글리세리드혈증, 또는 당뇨병의 진행을 완화, 개선, 안정화, 역전 또는 지연하기에 충분한 양이다. "치료 유효량"은 당업자에게 인식되는 바와 같이 치료되는 특정 병태, 병태의 중증도, 나이, 신체 상태, 크기, 성별 및 체중을 포함한 개별 대상체 매개변수, 치료 기간, 동시 요법(있는 경우)의 특성, 특정 투여 경로 및 의료 종사자의 지식 및 전문 지식 내에서 유사한 요인에 따라 달라진다. 이러한 요인은 당업자에게 잘 알려져 있으며 단지 일상적인 실험으로 해결될 수 있다. 일반적으로 개별 성분 또는 이들의 조합의 최대 용량은 즉 건전한 의학적 판단에 따른 가장 안전한 용량을 사용하는 것이 바람직하다. 그러나, 당업자는 대상체가 의학적 이유, 심리적 이유 또는 거의 모든 다른 이유로 더 낮은 용량 또는 허용 가능한 용량을 주장할 수 있음을 이해할 것이다. 추가로, 환자가 받고 있을 수 있는 다른 약물은 투여할 치료제의 치료 유효량의 결정에 영향을 미칠 것이다. 반감기와 같은 경험적 고려 사항은 일반적으로 투여량을 결정하는 데 기여할 것이다. "치료 유효량"은 단독으로 또는 병태를 치료하는 데 사용되는 하나 이상의 작용제와 함께 사용되는 본 개시 내용의 임의의 조성물의 것일 수 있다. 치료 유효량은 1회 이상의 투여로 투여될 수 있다.
"치료 유효량"을 결정하기 위한 효과적인 초기 방법은 세포 배양 분석(예를 들어 신경 세포 사용)을 수행하거나 동물 모델(예를 들어, 마우스, 래트, 토끼, 개 또는 돼지)을 사용하는 것에 의할 수 있다. 세포 배양에서 결정되는 바와 같은 IC50(즉, 증상의 최대 억제의 절반을 달성하는 조성물의 농도)을 포함하는 농도 범위를 달성하기 위한 용량은 동물 모델에서 공식화될 수 있다. 이러한 정보를 사용하여 인간에서 유용한 용량을 보다 정확하게 결정할 수 있다. 치료적으로 유효하도록 개시 내용의 조성물에 대한 적절한 농도 범위를 결정하는 것 외에도, 동물 모델은 또한 최대 효과를 제공할 바람직한 투여 경로와 같은 기타 관련 정보를 산출할 수 있다. 상기에 기재된 방법 및 기타 방법을 기반으로 인간에서 최대 효능을 달성하기 위한 용량을 조정하는 것은 숙련된 기술자의 능력 범위 내에 있다.
본원에 제공된 범위는 범위 내의 모든 값에 대한 약기로 이해된다. 예를 들어, 1 내지 50의 범위는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50으로 이루어진 군으로부터의 임의의 수, 수의 조합, 또는 하위 범위뿐만 아니라 예를 들어 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 및 1.9와 같은 전술한 정수 사이의 모든 중간 소수점 값을 포함하는 것으로 이해된다. 하위 범위와 관련하여, 범위의 어느 한 끝점에서 확장되는 "중첩된 하위 범위"가 구체적으로 고려된다. 예를 들어, 1에서 50까지의 예시적인 범위의 중첩된 하위 범위는 한 방향으로 1에서 10, 1에서 20, 1에서 30, 1에서 40, 또는 다른 방향으로 50에서 40, 50에서 30, 50에서 20 및 50에서 10을 포함할 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이 용어 "프로토스페이서" 또는 "표적 서열" 및 이들의 문법적 동의어는 표적 유전자의 DNA 서열을 지칭할 수 있다. 천연 상태에서 프로토스페이서는 PAM(프로토스페이서 인접 모티프)에 인접한다. 용어 "스페이서"는 프로토스페이서의 상보적 가닥에 결합하는 프로토스페이서의 RNA 버전일 수 있다. 스페이서는 가이드 RNA(gRNA) 내에 있을 수 있다. RNA 가이드 뉴클레아제에 의한 절단 부위는 프로토스페이서 서열 내에 있다. 예시를 위한 [도1a]를 참조한다.
본원에 사용되는 바와 같이 용어 "염기 편집", "유전자 편집" 또는 "유전자 변형" 및 그의 문법적 동의어는 게놈으로부터 하나 이상의 뉴클레오티드가 삽입, 대체 또는 제거되는 유전 공학을 지칭할 수 있다. 유전자 편집은 뉴클레아제(예를 들어, 자연 존재 뉴클레아제 또는 인공적으로 조작된 뉴클레아제)를 사용하여 수행될 수 있다. 유전자 변형은 이중 가닥 파손, 넌센스 돌연변이, 프레임 이동 돌연변이, 스플라이스 부위 변경, 또는 폴리뉴클레오티드 서열, 예를 들어, 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 역위를 도입하는 것을 포함할 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이 용어 "염기 에디터(BE: base editor)" 또는 "핵염기 에디터(NBE: nucleobase editor)"는 폴리뉴클레오티드에 결합하고 핵염기 변형 활성을 갖는 작용제를 지칭할 수 있다. 다양한 실시양태에서, 염기 에디터는 핵염기 변형 폴리펩티드(예를 들어, 데아미나아제) 및 가이드 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 가이드 RNA)와 결합된 핵산 프로그램 가능한 뉴클레오티드 결합 도메인, 또는 프로그램 가능한 뉴클레오티드 결합 도메인 및 데아미나아제를 코딩하는 핵산을 포함한다. 다양한 실시양태에서, 작용제는 염기 편집 활성을 갖는 단백질 도메인, 즉 핵산 분자(예를 들어, DNA) 내의 염기(예를 들어, A, T, C, G, 또는 U)를 변형할 수 있는 도메인, 또는 이를 코딩하는 핵산을 포함하는 생물분자 복합체이다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 프로그램 가능 DNA 결합 도메인은 데아미나아제 도메인에 융합되거나 연결되어 염기 에디터 융합 단백질을 생성한다. 일부 실시양태에서, 염기 에디터는 염기 에디터 융합 단백질을 코딩하는 핵산, 예를 들어 염기 에디터 융합 단백질을 코딩하는 mRNA를 포함한다. 염기 에디터 융합 단백질은 하나 이상의 링커, 예를 들어 펩티드 링커를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 작용제는 염기 편집 활성을 갖는 도메인을 포함하는 융합 단백질이다. 또 다른 실시양태에서, 염기 편집 활성을 갖는 단백질 도메인은 (예를 들어, 가이드 RNA 상의 RNA 결합 모티프 및 데아미나아제에 융합된 RNA 결합 도메인을 통해) 가이드 RNA에 연결된다. 일부 실시양태에서, 염기 편집 활성을 갖는 도메인은 핵산 분자 내의 염기를 탈아미노화할 수 있다. 일부 실시양태에서, 염기 에디터는 DNA 분자 내의 하나 이상의 염기를 탈아미노화할 수 있다. 일부 실시양태에서, 염기 에디터는 DNA 내의 아데노신(A)을 탈아미노화할 수 있다. 일부 실시양태에서, 염기 에디터는 아데노신 염기 에디터(ABE)이다. 일부 실시양태에서, 염기 에디터는 DNA 내의 시토신(C)을 탈아미노화할 수 있다. 일부 실시양태에서, 염기 에디터는 시토신 염기 에디터(CBE)이다.
"염기 에디터 시스템"이라는 용어는 표적 뉴클레오티드 서열의 핵염기를 편집하기 위한 시스템을 지칭한다. 다양한 실시양태에서, 염기 에디터 시스템은 (1) 폴리뉴클레오티드 프로그램 가능한 뉴클레오티드 결합 도메인(예를 들어, Cas9); (2) 상기 핵염기를 탈아미노화하기 위한 데아미나아제 도메인(예를 들어, 아데노신 데아미나아제 또는 시티딘 데아미나아제); 및 (3) 하나 이상의 가이드 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 가이드 RNA)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 염기 에디터 시스템은 (1) 및 (2)를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 프로그램 가능한 뉴클레오티드 결합 도메인은 폴리뉴클레오티드 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인이다. 일부 실시양태에서, 염기 에디터는 아데닌 또는 아데노신 염기 에디터(ABE)이다. 일부 실시양태에서, 염기 에디터는 시토신 염기 에디터(CBE)이다.
핵염기 에디터 시스템
일부 측면에서, 핵염기 변형이 가능한 염기 에디터 시스템이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 염기 에디터 시스템은 (i) 가이드 폴리뉴클레오티드 또는 이를 코딩하는 핵산, 및 (ii) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 염기 에디터 시스템은 가이드 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 염기 에디터 시스템은 가이드 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 염기 에디터 시스템은 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질을 포함한다.일부 실시양태에서, 염기 에디터 시스템은 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질을 코딩하는 핵산을 포함한다.
일부 실시양태에서, 가이드 폴리뉴클레오티드는 대상체에게 투여될 때 염기 에디터 시스템이 생체 내에서 PCSK9 또는 ANGPTL3 유전자 내 핵염기 변경을 수행하도록 지시한다.
일부 실시양태에서, 염기 변경은 차세대 시퀀싱 또는 생어 시퀀싱에 의해 측정된 바와 같이 대상체의 전체 간 세포의 적어도 35%에서 발생한다.
일부 실시양태에서, 염기 변경은 차세대 시퀀싱 또는 생어 시퀀싱에 의해 측정되는 경우 대상체에서 전체 간 세포의 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99.3%, 99.5%, 99.7%, 99.8%, 또는 99.9%에서 발생한다. 일부 실시양태에서, 염기 변경은 차세대 시퀀싱 또는 생어 시퀀싱에 의해 측정되는 경우 대상체에서 전체 간 세포의 최대 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99.3%, 99.5%, 99.7%, 99.8%, 또는 99.9%에서 발생한다. 일부 실시양태에서, 염기 변경은 차세대 시퀀싱 또는 생어 시퀀싱에 의해 측정되는 경우 대상체에서 전체 간 세포의 1%-99.9%, 2%-99.9%, 3%-99.9%, 4%-99.9%, 5%-99.9%, 6%-99.9%, 7%-99.9%, 8%-99.9%, 9%-99.9%, 10%-99.9%, 15%-99.9%, 20%-99.9%, 25%-99.9%, 30%-99.9%, 35%-99.9%, 40%-99.9%, 45%-99.9%, 50%-99.9%, 55%-99.9%, 60%-99.9%, 65%-99.9%, 70%-99.9%, 75%-99.9%, 80%-99.9%, 85%-99.9%, 90%-99.9%, 또는 95-99.9%에서 발생한다. 일부 실시양태에서, 염기 변경은 차세대 시퀀싱 또는 생어 시퀀싱에 의해 측정되는 경우 대상체에서 전체 간 세포의 1%-99.5%, 1%-99%, 1%-98%, 1%-97%, 1%-96%, 1%-95%, 1%-90%, 1%-85%, 1%-80%, 1%-75%, 1%-70%, 1%-65%, 1%-60%, 1%-55%, 1%-50%, 1%-45%, 1%-40%, 1%-35%, 1%-30%, 1%-25%, 1%-20%, 1%-15%, 1%-10%, 1%-9%, 1%-8%, 1%-7%, 1%-6%, 1%-5%, 1%-4%, 1%-3%, 또는 1%-2%에서 발생한다. 일부 실시양태에서, 염기 변경은 차세대 시퀀싱 또는 생어 시퀀싱에 의해 측정되는 경우 대상체에서 전체 간 세포의 1%-90%, 5%-85%, 10%-80%, 15%-75%, 20%-70%, 25%-65%, 30%-60%, 35%-55%, 또는 40%-50%에서 발생한다. 일부 실시양태에서, 염기 변경은 차세대 시퀀싱 또는 생어 시퀀싱에 의해 측정되는 경우 대상체에서 전체 간 세포의 100%에서 발생한다.
일부 실시양태에서, 염기 변경은 대상체의 간세포에서 발생한다. 일부 실시양태에서, 염기 변경은 차세대 시퀀싱 또는 생어 시퀀싱에 의해 측정되는 경우 대상체에서 간세포의 적어도 30%에서 발생한다. 일부 실시양태에서, 염기 변경은 대상체의 간세포 간세포에서 발생한다. 일부 실시양태에서, 염기 변경은 차세대 시퀀싱 또는 생어 시퀀싱에 의해 측정되는 경우 대상체에서 간세포의 적어도 %에서 발생한다. 일부 실시양태에서, 염기 변경은 차세대 시퀀싱 또는 생어 시퀀싱에 의해 측정되는 경우 대상체에서 간세포의 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99.3%, 99.5%, 99.7%, 99.8%, 또는 99.9%에서 발생한다. 일부 실시양태에서, 염기 변경은 차세대 시퀀싱 또는 생어 시퀀싱에 의해 측정되는 경우 대상체에서 간세포의 최대 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99.3%, 99.5%, 99.7%, 99.8%, 또는 99.9%에서 발생한다. 일부 실시양태에서, 염기 변경은 차세대 시퀀싱 또는 생어 시퀀싱에 의해 측정되는 경우 대상체에서 간세포의 1%-99.9%, 2%-99.9%, 3%-99.9%, 4%-99.9%, 5%-99.9%, 6%-99.9%, 7%-99.9%, 8%-99.9%, 9%-99.9%, 10%-99.9%, 15%-99.9%, 20%-99.9%, 25%-99.9%, 30%-99.9%, 35%-99.9%, 40%-99.9%, 45%-99.9%, 50%-99.9%, 55%-99.9%, 60%-99.9%, 65%-99.9%, 70%-99.9%, 75%-99.9%, 80%-99.9%, 85%-99.9%, 90%-99.9%, 또는 95-99.9%에서 발생한다. 일부 실시양태에서, 염기 변경은 차세대 시퀀싱 또는 생어 시퀀싱에 의해 측정되는 경우 대상체에서 간세포의 1%-99.5%, 1%-99%, 1%-98%, 1%-97%, 1%-96%, 1%-95%, 1%-90%, 1%-85%, 1%-80%, 1%-75%, 1%-70%, 1%-65%, 1%-60%, 1%-55%, 1%-50%, 1%-45%, 1%-40%, 1%-35%, 1%-30%, 1%-25%, 1%-20%, 1%-15%, 1%-10%, 1%-9%, 1%-8%, 1%-7%, 1%-6%, 1%-5%, 1%-4%, 1%-3%, 또는 1%-2%에서 발생한다. 일부 실시양태에서, 염기 변경은 차세대 시퀀싱 또는 생어 시퀀싱에 의해 측정되는 경우 대상체에서 간세포의 1%-90%, 5%-85%, 10%-80%, 15%-75%, 20%-70%, 25%-65%, 30%-60%, 35%-55%, 또는 40%-50%에서 발생한다. 일부 실시양태에서, 염기 변경은 차세대 시퀀싱 또는 생어 시퀀싱에 의해 측정되는 경우 대상체에서 간세포의 100%에서 발생한다.
일부 실시양태에서, 대상체의 전체 간 세포에서 발생되는 염기 변경은 차세대 시퀀싱에 의해 측정된다. 일부 실시양태에서, 대상체의 전체 간 세포에서 발생되는 염기 변경은 생어 시퀀싱에 의해 측정된다. 일부 실시양태에서, 대상체의 간세포에서 발생되는 염기 변경은 차세대 시퀀싱에 의해 측정된다. 일부 실시양태에서, 대상체의 간세포에서 발생되는 염기 변경은 생어 시퀀싱에 의해 측정된다.
일부 실시양태에서, 핵염기 변경은 ELISA, 웨스턴 블롯, 또는 LC-MS/MS에 의해 측정되는 경우 투여 전과 비교하여 대상체의 혈중 PCSK9 단백질 수준에서 적어도 35% 감소를 초래한다. 일부 실시양태에서, 핵염기 변경은 ELISA, 웨스턴 블롯, 또는 LC-MS/MS에 의해 측정되는 경우 투여 전과 비교하여 대상체의 혈중 ANGPTL3 단백질 수준에서 적어도 35% 감소를 초래한다.
일부 실시양태에서, 핵염기 변경은 ELISA, 웨스턴 블롯, 또는 LC-MS/MS에 의해 측정되는 경우 투여 전과 비교하여 대상체의 혈중 PCSK9 단백질 수준에서 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 또는 99%의 감소를 초래한다. 일부 실시양태에서, 핵염기 변경은 ELISA, 웨스턴 블롯, 또는 LC-MS/MS에 의해 측정되는 경우 투여 전과 비교하여 대상체의 혈중 PCSK9 단백질 수준에서 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99.3%, 99.5%, 99.7%, 99.8%, 또는 99.9%의 감소를 초래한다. 일부 실시양태에서, 핵염기 변경은 ELISA, 웨스턴 블롯, 또는 LC-MS/MS에 의해 측정되는 경우 투여 전과 비교하여 대상체의 혈중 PCSK9 단백질 수준에서 최대 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99.3%, 99.5%, 99.7%, 99.8%, 또는 99.9%의 감소를 초래한다. 일부 실시양태에서, 핵염기 변경은 ELISA, 웨스턴 블롯, 또는 LC-MS/MS에 의해 측정되는 경우 투여 전과 비교하여 대상체의 혈중 PCSK9 단백질 수준에서 1%-99.9%, 2%-99.9%, 3%-99.9%, 4%-99.9%, 5%-99.9%, 6%-99.9%, 7%-99.9%, 8%-99.9%, 9%-99.9%, 10%-99.9%, 15%-99.9%, 20%-99.9%, 25%-99.9%, 30%-99.9%, 31%-99.9%, 32%-99.9%, 33%-99.9%, 34%-99.9%, 35%-99.9%, 36%-99.9%, 37%-99.9%, 38%-99.9%, 39%-99.9%, 40%-99.9%, 45%-99.9%, 50%-99.9%, 55%-99.9%, 60%-99.9%, 65%-99.9%, 70%-99.9%, 75%-99.9%, 80%-99.9%, 85%-99.9%, 90%-99.9%, 또는 95-99.9%의 감소를 초래한다. 일부 실시양태에서, 핵염기 변경은 ELISA, 웨스턴 블롯, 또는 LC-MS/MS에 의해 측정되는 경우 투여 전과 비교하여 대상체의 혈중 PCSK9 단백질 수준에서 1%-99.5%, 1%-99%, 1%-98%, 1%-97%, 1%-96%, 1%-95%, 1%-90%, 1%-85%, 1%-80%, 1%-79%, 1%-78%, 1%-77%, 1%-76%, 1%-75%, 1%-74%, 1%-73%, 1%-72%, 1%-71%, 1%-70%, 1%-65%, 1%-60%, 1%-55%, 1%-50%, 1%-45%, 1%-40%, 1%-39%, 1%-38%, 1%-37%, 1%-36%, 1%-35%, 1%-34%, 1%-33%, 1%-32%, 1%-31%, 1%-30%, 1%-25%, 1%-20%, 1%-15%, 1%-10%, 1%-9%, 1%-8%, 1%-7%, 1%-6%, 1%-5%, 1%-4%, 1%-3%, 또는 1%-2%의 감소를 초래한다. 일부 실시양태에서, 핵염기 변경은 ELISA, 웨스턴 블롯, 또는 LC-MS/MS에 의해 측정되는 경우 투여 전과 비교하여 대상체의 혈중 PCSK9 단백질 수준에서 1%-99.9%, 5%-99.5%, 10%-99%, 15%-97%, 20%-95%, 25%-90%, 30%-85%, 31%-80%, 32%-79%, 33%-78%, 34%-77%, 35%-76%, 36%-76%, 37%-75%, 38%-74%, 39%-73%, 40%-72%, 45%-71%, 50%-70%, 또는 55%-65%의 감소를 초래한다. 일부 실시양태에서, 핵염기 변경은 ELISA, 웨스턴 블롯, 또는 LC-MS/MS에 의해 측정되는 경우 투여 전과 비교하여 대상체의 혈중 PCSK9 단백질 수준에서 100%의 감소를 초래한다.
일부 실시양태에서, 핵염기 변경은 ELISA, 웨스턴 블롯, 또는 LC-MS/MS에 의해 측정되는 경우 투여 전과 비교하여 대상체에서 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 75%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 210%, 220%, 230%, 240%, 250%, 260%, 270%, 280%, 290%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900%, 1000% 적은 혈중 PCSK9 단백질 수준을 초래한다. 일부 실시양태에서, 핵염기 변경은 ELISA, 웨스턴 블롯, 또는 LC-MS/MS에 의해 측정되는 경우 투여 전과 비교하여 대상체에서 적어도 1.1배, 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 1.6배, 1.7배, 1.8배, 1.9배, 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 또는 10배 이상 적은 혈중 PCSK9 단백질 수준을 초래한다.
일부 실시양태에서, 투여 전과 비교하여 대상체에서 혈중 PCSK9 단백질 수준의 감소 또는 혈중 PCSK9 단백질 수준은 ELISA(효소 결합 면역흡착 분석)에 의해 측정된다. 일부 실시양태에서, 투여 전과 비교하여 대상체에서 혈중 PCSK9 단백질 수준의 감소 또는 혈중 PCSK9 단백질 수준은 웨스턴 블롯 분석에 의해 측정된다. 일부 실시양태에서, 투여 전과 비교하여 대상체에서 혈중 PCSK9 단백질 수준의 감소 또는 혈중 PCSK9 단백질 수준은 LC-MS/MS(액체 크로마토그래피-직렬 질량 분석법)에 의해 측정된다.
일부 실시양태에서, 핵염기 변경은 ELISA, 웨스턴 블롯, 또는 LC-MS/MS에 의해 측정되는 경우 투여 전과 비교하여 대상체의 혈중 ANGPTL3 단백질 수준에서 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 또는 99%의 감소를 초래한다. 일부 실시양태에서, 핵염기 변경은 ELISA, 웨스턴 블롯, 또는 LC-MS/MS에 의해 측정되는 경우 투여 전과 비교하여 대상체의 혈중 ANGPTL3 단백질 수준에서 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99.3%, 99.5%, 99.7%, 99.8%, 또는 99.9%의 감소를 초래한다. 일부 실시양태에서, 핵염기 변경은 ELISA, 웨스턴 블롯, 또는 LC-MS/MS에 의해 측정되는 경우 투여 전과 비교하여 대상체의 혈중 ANGPTL3 단백질 수준에서 최대 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99.3%, 99.5%, 99.7%, 99.8%, 또는 99.9%의 감소를 초래한다. 일부 실시양태에서, 핵염기 변경은 ELISA, 웨스턴 블롯, 또는 LC-MS/MS에 의해 측정되는 경우 투여 전과 비교하여 대상체의 혈중 ANGPTL3 단백질 수준에서 1%-99.9%, 2%-99.9%, 3%-99.9%, 4%-99.9%, 5%-99.9%, 6%-99.9%, 7%-99.9%, 8%-99.9%, 9%-99.9%, 10%-99.9%, 15%-99.9%, 20%-99.9%, 25%-99.9%, 30%-99.9%, 31%-99.9%, 32%-99.9%, 33%-99.9%, 34%-99.9%, 35%-99.9%, 36%-99.9%, 37%-99.9%, 38%-99.9%, 39%-99.9%, 40%-99.9%, 45%-99.9%, 50%-99.9%, 55%-99.9%, 60%-99.9%, 65%-99.9%, 70%-99.9%, 75%-99.9%, 80%-99.9%, 85%-99.9%, 90%-99.9%, 또는 95-99.9%의 감소를 초래한다. 일부 실시양태에서, 핵염기 변경은 ELISA, 웨스턴 블롯, 또는 LC-MS/MS에 의해 측정되는 경우 투여 전과 비교하여 대상체의 혈중 ANGPTL3 단백질 수준에서 1%-99.5%, 1%-99%, 1%-98%, 1%-97%, 1%-96%, 1%-95%, 1%-90%, 1%-85%, 1%-80%, 1%-79%, 1%-78%, 1%-77%, 1%-76%, 1%-75%, 1%-74%, 1%-73%, 1%-72%, 1%-71%, 1%-70%, 1%-65%, 1%-60%, 1%-55%, 1%-50%, 1%-45%, 1%-40%, 1%-39%, 1%-38%, 1%-37%, 1%-36%, 1%-35%, 1%-34%, 1%-33%, 1%-32%, 1%-31%, 1%-30%, 1%-25%, 1%-20%, 1%-15%, 1%-10%, 1%-9%, 1%-8%, 1%-7%, 1%-6%, 1%-5%, 1%-4%, 1%-3%, 또는 1%-2%의 감소를 초래한다. 일부 실시양태에서, 핵염기 변경은 ELISA, 웨스턴 블롯, 또는 LC-MS/MS에 의해 측정되는 경우 투여 전과 비교하여 대상체의 혈중 ANGPTL3 단백질 수준에서 1%-99.9%, 5%-99.5%, 10%-99%, 15%-97%, 20%-95%, 25%-90%, 30%-85%, 31%-80%, 32%-79%, 33%-78%, 34%-77%, 35%-76%, 36%-76%, 37%-75%, 38%-74%, 39%-73%, 40%-72%, 45%-71%, 50%-70%, 또는 55%-65%의 감소를 초래한다. 일부 실시양태에서, 핵염기 변경은 ELISA, 웨스턴 블롯, 또는 LC-MS/MS에 의해 측정되는 경우 투여 전과 비교하여 대상체의 혈중 ANGPTL3 단백질 수준에서 100%의 감소를 초래한다.
일부 실시양태에서, 핵염기 변경은 ELISA, 웨스턴 블롯, 또는 LC-MS/MS에 의해 측정되는 경우 투여 전과 비교하여 대상체에서 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 75%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 210%, 220%, 230%, 240%, 250%, 260%, 270%, 280%, 290%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900%, 1000% 적은 혈중 ANGPTL3 단백질 수준을 초래한다. 일부 실시양태에서, 핵염기 변경은 ELISA, 웨스턴 블롯, 또는 LC-MS/MS에 의해 측정되는 경우 투여 전과 비교하여 대상체에서 적어도 1.1배, 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 1.6배, 1.7배, 1.8배, 1.9배, 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 또는 10배 이상 적은 혈중 ANGPTL3 단백질 수준을 초래한다.
일부 실시양태에서, 투여 전과 비교하여 대상체에서 혈중 ANGPTL3 단백질 수준의 감소 또는 혈중 ANGPTL3 단백질 수준은 ELISA(효소 결합 면역흡착 분석)에 의해 측정된다. 일부 실시양태에서, 투여 전과 비교하여 대상체에서 혈중 ANGPTL3 단백질 수준의 감소 또는 혈중 ANGPTL3 단백질 수준은 웨스턴 블롯 분석에 의해 측정된다. 일부 실시양태에서, 투여 전과 비교하여 대상체에서 혈중 ANGPTL3 단백질 수준의 감소 또는 혈중 ANGPTL3 단백질 수준은 LC-MS/MS(액체 크로마토그래피-직렬 질량 분석법)에 의해 측정된다.
일부 실시양태에서, 핵염기 변경은 투여 전과 비교하여 대상체의 혈중 저밀도 지단백질 콜레스테롤(LDL-C) 수준에서 적어도 35%의 감소를 초래한다. 일부 실시양태에서, 핵염기 변경은 투여 전과 비교하여 대상체의 혈중 저밀도 지단백질 콜레스테롤(LDL-C) 수준에서 적어도 35%, 40%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 또는 99%의 감소를 초래한다. 일부 실시양태에서, 핵염기 변경은 투여 전과 비교하여 대상체의 혈중 저밀도 지단백질 콜레스테롤(LDL-C) 수준에서 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99.3%, 99.5%, 99.7%, 99.8%, 또는 99.9%의 감소를 초래한다. 일부 실시양태에서, 핵염기 변경은 투여 전과 비교하여 대상체의 혈중 저밀도 지단백질 콜레스테롤(LDL-C) 수준에서 최대 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99.3%, 99.5%, 99.7%, 99.8%, 또는 99.9%의 감소를 초래한다. 일부 실시양태에서, 핵염기 변경은 투여 전과 비교하여 대상체의 혈중 저밀도 지단백질 콜레스테롤(LDL-C) 수준에서 1%-99.9%, 2%-99.9%, 3%-99.9%, 4%-99.9%, 5%-99.9%, 6%-99.9%, 7%-99.9%, 8%-99.9%, 9%-99.9%, 10%-99.9%, 15%-99.9%, 20%-99.9%, 25%-99.9%, 30%-99.9%, 35%-99.9%, 40%-99.9%, 45%-99.9%, 50%-99.9%, 55%-99.9%, 60%-99.9%, 65%-99.9%, 70%-99.9%, 75%-99.9%, 80%-99.9%, 85%-99.9%, 90%-99.9%, 또는 95-99.9%의 감소를 초래한다. 일부 실시양태에서, 핵염기 변경은 투여 전과 비교하여 대상체의 혈중 저밀도 지단백질 콜레스테롤(LDL-C) 수준에서 1%-99.5%, 1%-99%, 1%-98%, 1%-97%, 1%-96%, 1%-95%, 1%-90%, 1%-85%, 1%-80%, 1%-75%, 1%-70%, 1%-65%, 1%-60%, 1%-55%, 1%-50%, 1%-45%, 1%-40%, 1%-35%, 1%-30%, 1%-25%, 1%-20%, 1%-15%, 1%-10%, 1%-9%, 1%-8%, 1%-7%, 1%-6%, 1%-5%, 1%-4%, 1%-3%, 또는 1%-2%의 감소를 초래한다. 일부 실시양태에서, 핵염기 변경은 투여 전과 비교하여 대상체의 혈중 저밀도 지단백질 콜레스테롤(LDL-C) 수준에서 1%-99.9%, 5%-99.5%, 10%-99%, 15%-97%, 20%-95%, 25%-90%, 30%-85%, 35%-80%, 40%-75%, 45%-70%, 50%-65%, 또는 55%-60%의 감소를 초래한다. 일부 실시양태에서, 핵염기 변경은 투여 전과 비교하여 대상체의 혈중 저밀도 지단백질 콜레스테롤(LDL-C) 수준에서 100%의 감소를 초래한다. 일부 실시양태에서, 핵염기 변경은 투여 전과 비교하여 대상체에서 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 75%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 210%, 220%, 230%, 240%, 250%, 260%, 270%, 280%, 290%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900%, 1000% 적은 혈중 저밀도 지단백질 콜레스테롤(LDL-C) 수준을 초래한다. 일부 실시양태에서, 핵염기 변경은 투여 전과 비교하여 대상체에서 적어도 1.1배, 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 1.6배, 1.7배, 1.8배, 1.9배, 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 또는 10배 이상 적은 혈중 저밀도 지단백질 콜레스테롤(LDL-C) 수준을 초래한다.
일부 실시양태에서, 핵염기 변경은 투여 전과 비교하여 대상체의 혈중 트리글리세리드 수준에서 적어도 35%의 감소를 초래한다. 일부 실시양태에서, 핵염기 변경은 투여 전과 비교하여 대상체의 혈중 트리글리세리드 수준에서 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 또는 99%의 감소를 초래한다. 일부 실시양태에서, 핵염기 변경은 투여 전과 비교하여 대상체의 혈중 트리글리세리드 수준에서 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99.3%, 99.5%, 99.7%, 99.8%, 또는 99.9%의 감소를 초래한다. 일부 실시양태에서, 핵염기 변경은 투여 전과 비교하여 대상체의 혈중 트리글리세리드 수준에서 최대 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99.3%, 99.5%, 99.7%, 99.8%, 또는 99.9%의 감소를 초래한다. 일부 실시양태에서, 핵염기 변경은 투여 전과 비교하여 대상체의 혈중 트리글리세리드 수준에서 1%-99.9%, 2%-99.9%, 3%-99.9%, 4%-99.9%, 5%-99.9%, 6%-99.9%, 7%-99.9%, 8%-99.9%, 9%-99.9%, 10%-99.9%, 15%-99.9%, 20%-99.9%, 25%-99.9%, 30%-99.9%, 35%-99.9%, 40%-99.9%, 45%-99.9%, 50%-99.9%, 55%-99.9%, 60%-99.9%, 65%-99.9%, 70%-99.9%, 75%-99.9%, 80%-99.9%, 85%-99.9%, 90%-99.9%, 또는 95-99.9%의 감소를 초래한다. 일부 실시양태에서, 핵염기 변경은 투여 전과 비교하여 대상체의 혈중 트리글리세리드 수준에서 1%-99.5%, 1%-99%, 1%-98%, 1%-97%, 1%-96%, 1%-95%, 1%-90%, 1%-85%, 1%-80%, 1%-75%, 1%-70%, 1%-65%, 1%-60%, 1%-55%, 1%-50%, 1%-45%, 1%-40%, 1%-35%, 1%-30%, 1%-25%, 1%-20%, 1%-15%, 1%-10%, 1%-9%, 1%-8%, 1%-7%, 1%-6%, 1%-5%, 1%-4%, 1%-3%, 또는 1%-2%의 감소를 초래한다. 일부 실시양태에서, 핵염기 변경은 투여 전과 비교하여 대상체의 혈중 트리글리세리드 수준에서 1%-99.9%, 5%-99.5%, 10%-99%, 15%-97%, 20%-95%, 25%-90%, 30%-85%, 35%-80%, 40%-75%, 45%-70%, 50%-65%, 또는 55%-60%의 감소를 초래한다. 일부 실시양태에서, 핵염기 변경은 투여 전과 비교하여 대상체의 혈중 트리글리세리드 수준에서 100%의 감소를 초래한다. 일부 실시양태에서, 핵염기 변경은 투여 전과 비교하여 대상체에서 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 75%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 210%, 220%, 230%, 240%, 250%, 260%, 270%, 280%, 290%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900%, 1000% 적은 혈중 트리글리세리드 수준을 초래한다. 일부 실시양태에서, 핵염기 변경은 투여 전과 비교하여 대상체에서 적어도 1.1배, 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 1.6배, 1.7배, 1.8배, 1.9배, 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 또는 10배 이상 적은 혈중 트리글리세리드 수준을 초래한다.
일부 실시양태에서, 투여 전과 비교하여 대상체에서 혈중 트리글리세리드 수준 또는 혈중 트리글리세리드 수준의 감소는 임의의 표준 기술에 의해 측정된다. 일부 실시양태에서, 투여 전과 비교하여 대상체에서 혈중 저밀도 지단백 콜레스테롤(LDL-C) 수준 또는 혈액 저밀도 지단백 콜레스테롤(LDL-C) 수준의 감소는 임의의 표준 기술에 의해 측정된다. 예를 들어, 임상 분석 기기를 사용하여 콜레스테롤(총 C), 트리글리세리드(TG) 및 고밀도 지단백 콜레스테롤(HDL-C)을 효소적으로 직접 측정하는 혈청 샘플의 '지질 패널'을 측정할 수 있다. 각 분석물에 특정한 시약 키트에는 완충액, 캘리브레이터, 블랭크 및 대조군이 포함되어 있다. 본 개시 내용에 사용되는 바와 같이, 콜레스테롤, 트리글리세리드 및 HDL-C는 특정 효소 반응 생성물의 흡광도 측정을 사용하여 정량화될 수 있다. LDL-C는 간접적으로 측정될 수 있다. 일부 경우에, 순환 콜레스테롤의 대부분이 세 가지 주요 지단백질 분획인 초저밀도 지단백질(VLDL), LDL 및 HDL에서 발견될 수 있다. 일부 실시양태에서, 총 순환 콜레스테롤은 [총 C] = [VLDL-C] + [LDL-C] + [HDL-C] 공식으로 추정될 수 있다. 따라서 LDL-C는 [LDL-C] = [총 C] - [HDL-C] - [TG]/5(여기서 [TG]/5는 VLDL-콜레스테롤의 추정치임)의 관계에 따라 총 콜레스테롤, 트리글리세리드 및 HDL-C의 측정값으로부터 계산될 수 있다. 완충제, 캘리브레이터, 블랭크 및 대조군을 포함하는 트리글리세리드에 특정한 시약 키트가 사용될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 연구로부터의 혈청 샘플을 분석할 수 있고 트리글리세리드를 일련의 결합된 효소 반응을 사용하여 측정할 수 있다. 일부 실시양태에서, H2O2를 사용하여 마지막 생성물의 최종 생성물 및 500nm에서의 그의 흡광도로서 분석물을 정량화할 수 있으며, 색상 강도는 트리글리세리드 농도에 비례한다.
일부 실시양태에서, 가이드 폴리뉴클레오티드는 가이드 RNA이며, 여기서 가이드 RNA는 0, 1 또는 2개의 미스매치를 가지며 PCSK9 유전자의 프로토스페이서 서열의 상보적 가닥에 결합하는 스페이서 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 가이드 RNA는 미스매치 없이 PCSK9 유전자의 프로토스페이서 서열의 상보적 가닥에 결합하는 스페이서 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 가이드 RNA는 1개의 미스매치를 가지며 PCSK9 유전자의 프로토스페이서 서열의 상보적 가닥에 결합하는 스페이서 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 가이드 RNA는 2개의 미스매치를 가지며 PCSK9 유전자의 프로토스페이서 서열의 상보적 가닥에 결합하는 스페이서 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 가이드 RNA는 3개의 미스매치를 가지며 PCSK9 유전자의 프로토스페이서 서열의 상보적 가닥에 결합하는 스페이서 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 가이드 RNA는 4개의 미스매치를 가지며 PCSK9 유전자의 프로토스페이서 서열의 상보적 가닥에 결합하는 스페이서 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 가이드 RNA는 5개의 미스매치를 가지며 PCSK9 유전자의 프로토스페이서 서열의 상보적 가닥에 결합하는 스페이서 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 가이드 폴리뉴클레오티드는 가이드 RNA이며, 여기서 가이드 RNA는 0, 1 또는 2개의 미스매치를 가지며 ANGPTL3 유전자의 프로토스페이서 서열의 상보적 가닥에 결합하는 스페이서 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 가이드 RNA는 미스매치 없이 ANGPTL3 유전자의 프로토스페이서 서열의 상보적 가닥에 결합하는 스페이서 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 가이드 RNA는 1개의 미스매치를 가지며 ANGPTL3 유전자의 프로토스페이서 서열의 상보적 가닥에 결합하는 스페이서 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 가이드 RNA는 2개의 미스매치를 가지며 ANGPTL3 유전자의 프로토스페이서 서열의 상보적 가닥에 결합하는 스페이서 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 가이드 RNA는 3개의 미스매치를 가지며 ANGPTL3 유전자의 프로토스페이서 서열의 상보적 가닥에 결합하는 스페이서 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 가이드 RNA는 4개의 미스매치를 가지며 ANGPTL3 유전자의 프로토스페이서 서열의 상보적 가닥에 결합하는 스페이서 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 가이드 RNA는 5개의 미스매치를 가지며 ANGPTL3 유전자의 프로토스페이서 서열의 상보적 가닥에 결합하는 스페이서 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 핵염기 변경은 순 핵염기 편집에 의해 측정되는 경우 대상체의 전체 간 세포의 1% 미만에서 프로토스페이서 서열 외부에 있다. 일부 실시양태에서, 핵염기 변경은 순 핵염기 편집에 의해 측정되는 경우 대상체의 간세포의 1% 미만에서 프로토스페이서 서열 외부에 있다. 일부 실시양태에서, 핵염기 변경은 순 핵염기 편집에 의해 측정되는 경우 프로토스페이서 서열 내에만 있다.
일부 실시양태에서, 핵염기 변경은 순 핵염기 편집에 의해 측정되는 경우 대상체의 전체 간 세포의 0.01%. 0.02%, 0.03% 0.04%, 0.05%, 0.06%, 0.07%, 0.08%, 0.09%, 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9%, 1.0%, 2.0%, 3.0% 4.0%, 5.0%, 6.0%, 7.0%, 8.0%, 9.0%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 65%, 80%, 85%, 90% 미만에서 프로토스페이서 서열 외부에 있다. 일부 실시양태에서, 핵염기 변경은 순 핵염기 편집에 의해 측정되는 경우 대상체의 간세포의 0.01%. 0.02%, 0.03% 0.04%, 0.05%, 0.06%, 0.07%, 0.08%, 0.09%, 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9%, 1.0%, 2.0%, 3.0% 4.0%, 5.0%, 6.0%, 7.0%, 8.0%, 9.0%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 65%, 80%, 85%, 90% 미만에서 프로토스페이서 서열 외부에 있다. 일부 실시양태에서, 핵염기 변경은 순 핵염기 편집에 의해 측정되는 경우 대상체의 세포의 0.01%. 0.02%, 0.03% 0.04%, 0.05%, 0.06%, 0.07%, 0.08%, 0.09%, 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9%, 1.0%, 2.0%, 3.0% 4.0%, 5.0%, 6.0%, 7.0%, 8.0%, 9.0%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 65%, 80%, 85%, 90% 미만에서 프로토스페이서 서열 외부에 있다.
일부 실시양태에서, 데아미나아제는 아데닌 데아미나아제이다. 일부 실시양태에서, 핵염기 변경은 A·T에서 G·C로의 변경이다. 일부 실시양태에서, 데아미나아제는 아데닌 데아미나아제이고 핵염기 변경은 A·T에서 G·C로의 변경이다. 일부 실시양태에서, 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인은 뉴클레아제 불활성 Cas9 또는 Cas9 닉카아제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인은 Cas9를 포함한다.
일부 실시양태에서, 핵염기 변경은 PCSK9 유전자의 스플라이스 부위에 있다. 일부 실시양태에서, 핵염기 변경은 PCSK9 유전자의 스플라이스 도너 부위에 있다. 일부 실시양태에서, 스플라이스 도너 부위는 서열 번호 5에 참조된 바와 같이 PCSK9 인트론 1의 5' 말단에 있다. 일부 실시양태에서, 핵염기 변경은 PCSK9 유전자의 스플라이스 억셉터 부위에 있다. 일부 실시양태에서, 핵염기 변경은 PCSK9 유전자에 의해 코딩되는 전사물에서 프레임 이동, 조기 정지 코돈, 삽입 또는 결실을 초래한다. 일부 실시양태에서, 핵염기 변경은 PCSK9 유전자에 의해 코딩되는 비정상 전사물을 생성한다. 일부 실시양태에서, 가이드 폴리뉴클레오티드는 가이드 RNA이다. 일부 실시양태에서, 가이드 RNA는 화학적으로 변형된다. 일부 실시양태에서, 가이드 RNA는 tracrRNA 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 가이드 RNA는 표 1 또는 표 24에 제시된 바와 같이 화학적 변형을 포함한다.
일부 실시양태에서, 핵염기 변경은 ANGPTL3 유전자의 스플라이스 부위에 있다. 일부 실시양태에서, 핵염기 변경은 ANGPTL3 유전자의 스플라이스 도너 부위에 있다. 일부 실시양태에서, 스플라이스 도너 부위는 서열 7에 참조된 바와 같이 ANGPTL3 인트론 6의 5' 말단에 있다. 일부 실시양태에서, 핵염기 변경은 ANGPTL3 유전자의 스플라이스 억셉터 부위에 있다. 일부 실시양태에서, 핵염기 변경은 ANGPTL3 유전자에 의해 코딩되는 전사물에서 프레임 이동, 조기 정지 코돈, 삽입 또는 결실을 초래한다. 일부 실시양태에서, 핵염기 변경은 ANGPTL3 유전자에 의해 코딩되는 비정상 전사물을 생성한다. 일부 실시양태에서, 가이드 폴리뉴클레오티드는 가이드 RNA이다. 일부 실시양태에서, 가이드 RNA는 화학적으로 변형된다. 일부 실시양태에서, 가이드 RNA는 tracrRNA 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 가이드 RNA는 표 1 또는 표 24에 제시된 바와 같이 화학적 변형을 포함한다.
일부 실시양태에서, 가이드 RNA는 표 1 또는 표 24에 제시된 가이드 RNA 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 가이드 RNA는 서열 5'-5'-cscscsGCACCUUGGCGCAGCGGgUUUUAGagcuaGaaauagcaaGUUaAaAuAaggCUaGUCcG UUAucAAcuuGaaaaaguGgcaccgAgUCggugcusususu-3' (서열 번호 9), 5'-cscscsGCACCUUGGCGCAGCGGgUUUUAGagcuagaaauagcaaGUUaAaAuAaggcuaGUccGU UAucAAcuugaaaaagugGcaccgagucggugcusususu-3' (서열 번호 9), 5'-cscscsGCACCUUGGCGCAGCGGgUUUUAGagcuaGaaauagcaaGUUaAaAuAaggcuaGUccGUUAucAAcuuGaaaaagugGcaccgagucggugcusususu-3' (서열 번호 9) (GA346), 5'- cscscsGCACCUUGGCGCAGCGGgUUUUAGagcuagaaauagcaaGUUaAaAuAaggcuaGUccGUUAacAAcuugaaaaagugGcaccgagucggugcusususu-3' (서열 번호 10) (GA374), 5'-cscscsGCACCUUGGCGCAGCGGgUUUUAGagcuagaaauagcaaGUUaAaAuAaggcuaGUccGUUAucAAcuugaaaaagugGcaccgagucggugcusususuuuu-3' (서열 번호 11) (GA385), 5'- cscscsGCACCUUGGCGCAGCGGgUUUUAGagcuagaaauagcaaGUUaAaAuAaggcuaGUccGUUAucAAcuugaaaaagugGcaccgagucggugcusususuuUu-3' (서열 번호 11) (GA386) 또는 5'- cscscsGCACCUUGGCGCAGCGgUUUUAGagcuaGaaauagcaaGUUaAaAuAaggcuaGUccGUUAucAAcuuGaaaaagugGcaccgagucggugcuususuuuu-3' (서열 번호 12) (GA387)을 포함한다.
일부 실시양태에서, 프로토스페이서 서열은 표 1 또는 표 24에 제시된 프로토스페이서 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로토스페이서는 서열 5'-CCCGCACCTTGGCGCAGCGG-3' (서열 번호 13), AAGATACCTGAATAACTCTC-3' (서열 번호 14), 및 5'-AAGATACCTGAATAACCCTC-3' (서열 번호 15)을 포함한다.
일부 실시양태에서, 염기 에디터 융합 단백질은 서열 번호 3의 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나아제는 서열 번호 3에 제시된 아미노산 서열 또는 본원에 제공된 임의의 아데노신 데아미나아제에 대해 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 본원에서 제공된 아데노신 데아미나아제는 하나 이상의 돌연변이(예를 들어, 본원에서 제공된 임의의 돌연변이)를 포함할 수 있음을 이해해야 한다. 본 개시 내용은 특정 퍼센트 동일성을 갖는 임의의 데아미나아제 도메인 및 본원에 기재된 이들의 임의의 돌연변이 또는 조합을 제공한다. 일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나아제는 서열 번호 3에 제시된 아미노산 서열 또는 본원에 제공된 임의의 아데노신 데아미나아제와 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 21, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50개 이상의 돌연변이를 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나아제는 서열 번호 3에 제시된 아미노산 서열 중 어느 하나 또는 본원에 제공된 임의의 아데노신 데아미나아제와 비교하여 적어도 5, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 110, 적어도 120, 적어도 130, 적어도 140, 적어도 150, 적어도 160, 또는 적어도 170개의 동일한 연속 아미노산 잔기를 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 염기 에디터 융합 단백질을 코딩하는 핵산은 mRNA이다. mRNA는 변형, 예를 들어 mRNA의 3' 또는 5' 말단에서의 변형을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, mRNA는 cap 유사체를 포함한다.
일부 실시양태에서, mRNA는 2'-히드록실 기, 2'-O-메틸 기, 또는 추가의 2’ 화학적 변형 또는 이들의 조합을 포함하는 5' 말단에 적어도 1, 2 또는 3개의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, mRNA는 2'-히드록실 기, 2'-O-메틸 기, 또는 추가의 2’ 화학적 변형 또는 이들의 조합을 포함하는 5' 말단에 적어도 1, 2 또는 3개의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, mRNA는 2'-히드록실 기, 2'-O-메틸 기, 또는 추가의 2’ 화학적 변형 또는 이들의 조합을 포함하는 5' 말단에 적어도 1개의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, mRNA는 2'-히드록실 기, 2'-O-메틸 기, 또는 추가의 2’ 화학적 변형 또는 이들의 조합을 포함하는 5' 말단에 적어도 2개의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, mRNA는 2'-히드록실 기, 2'-O-메틸 기, 또는 추가의 2’ 화학적 변형 또는 이들의 조합을 포함하는 5' 말단에 적어도 3개의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, mRNA는 2'-히드록실 기, 2'-O-메틸 기, 또는 추가의 2’ 화학적 변형 또는 이들의 조합을 포함하는 5' 말단에 적어도 4개의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, mRNA는 2'-히드록실 기, 2'-O-메틸 기, 또는 추가의 2’ 화학적 변형 또는 이들의 조합을 포함하는 5' 말단에 적어도 5개의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, mRNA는 2'-히드록실 기, 2'-O-메틸 기, 또는 추가의 2’ 화학적 변형 또는 이들의 조합을 포함하는 5' 말단에 적어도 6개의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, mRNA는 2'-히드록실 기, 2'-O-메틸 기, 또는 추가의 2’ 화학적 변형 또는 이들의 조합을 포함하는 5' 말단에 적어도 7개의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, mRNA는 2'-히드록실 기, 2'-O-메틸 기, 또는 추가의 2’ 화학적 변형 또는 이들의 조합을 포함하는 5' 말단에 적어도 8개의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, mRNA는 2'-히드록실 기, 2'-O-메틸 기, 또는 추가의 2’ 화학적 변형 또는 이들의 조합을 포함하는 5' 말단에 적어도 9개의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, mRNA는 2'-히드록실 기, 2'-O-메틸 기, 또는 추가의 2’ 화학적 변형 또는 이들의 조합을 포함하는 5' 말단에 적어도 10개의 뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시양태에서, mRNA는 폴리 A 꼬리를 포함한다. 폴리 A mRNA의 3' 말단에 있을 수 있다.
일부 실시양태에서, mRNA 서열의 GC% 함량은 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% 또는 90% 이상이다. 일부 실시양태에서, mRNA 서열의 GC% 함량은 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75% 또는 80% 이상이다.
일부 실시양태에서, mRNA 서열은 아데닌 tTNA 데아미나아제(TadA) 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, TadA 영역의 GC% 함량은 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% 또는 90% 이상이다. 일부 실시양태에서, TadA 영역의 GC% 함량은 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75% 또는 80% 이상이다.
일부 실시양태에서, mRNA 서열은 Cas9 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, Cas9 영역의 GC% 함량은 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% 또는 90% 이상이다. 일부 실시양태에서, Cas9 영역의 GC% 함량은 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75% 또는 80% 이상이다.
일부 실시양태에서, mRNA 서열은 NLS 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, NLS 영역의 GC% 함량은 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% 또는 90% 이상이다. 일부 실시양태에서, NLS 영역의 GC% 함량은 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75% 또는 80% 이상이다.
일부 실시양태에서, mRNA 서열은 TadA 영역과 Cas9 영역을 연결하는 제1 링커 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 링커 영역의 GC%는 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% 또는 90% 이상이다. 일부 실시양태에서, 제1 링커 영역의 GC% 함량은 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75% 또는 80% 이상이다.
일부 실시양태에서, mRNA 서열은 Cas9 영역과 NLS 영역을 연결하는 제2 링커를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 링커 영역의 GC% 함량은 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% 또는 90% 이상이다. 일부 실시양태에서, 제2 링커 영역의 GC% 함량은 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75% 또는 80% 이상이다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 바와 같은 염기 에디터 시스템은 가이드 폴리뉴클레오티드 또는 가이드 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 핵산 (i)을 둘러싸는 지질 나노입자(LNP)를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, LNP는 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 핵산 (ii)을 추가로 둘러싼다. 일부 실시양태에서, 염기 에디터 시스템은 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 핵산 (ii)을 둘러싸는 제2 LNP를 추가로 포함한다.
본원에 제공되는 바와 같은 염기 에디터 시스템은 하나 이상의 LNP를 포함할 수 있다. 예를 들어, 염기 에디터 시스템은 가이드 폴리뉴클레오티드 및 염기 에디터 융합 단백질을 코딩하는 핵산, 예를 들어, 염기 에디터 융합 단백질을 코딩하는 mRNA 둘 다를 둘러싸는 LNP를 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, 염기 에디터 시스템은 가이드 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 가이드 RNA를 둘러싸는 LNP, 및 염기 에디터 융합 단백질을 코딩하는 핵산, 예를 들어 mRNA를 둘러싸는 LNP를 포함할 수 있다. 가이드 폴리뉴클레오티드 및 염기 에디터 융합 단백질 또는 염기 에디터 융합 단백질을 코딩하는 mRNA를 별도로 둘러싸는 LNP는 염기 에디터 시스템의 유연한 투약 및 투여를 허용할 수 있다. 예를 들어, 가이드 RNA를 둘러싸는LNP를 먼저 투여한 다음 염기 에디터 융합 단백질을 코딩하는 mRNA를 둘러싸는 LNP를 투여할 수 있다. 일부 실시양태에서, 가이드 RNA를 둘러싸는 LNP 및 염기 에디터 융합 단백질을 코딩하는 mRNA를 둘러싸는 제2 LNP는 대상체에게 동시에 투여된다. 일부 실시양태에서, 가이드 RNA를 둘러싸는 LNP 및 염기 에디터 단백질을 코딩하는 mRNA를 둘러싸는 LNP는 대상체에게 순차적으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 염기 에디터 융합 단백질을 코딩하는 mRNA를 둘러싸는 LNP를 대상체에게 투여하고, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 7주, 8주, 9주, 10주, 11주, 또는 12주 이상 후에 가이드 RNA를 둘러싸는 제2 LNP를 다회 투여 또는 용량이 뒤따른다. 제2 LNP의 다회 용량은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20일 이상의 간격으로 투여될 수 있다.
일부 실시양태에서, 가이드 폴리뉴클레오티드와 염기 에디터 융합 단백질을 코딩하는 핵산의 비는 중량 기준으로 약 1:10 내지 약 10:1이다. 일부 실시양태에서, 가이드 폴리뉴클레오티드와 염기 에디터 융합 단백질을 코딩하는 핵산의 비는 중량 기준으로 약 1:1, 1.5:1, 2:1, 3:1, 4:1, 1:1.5, 1:2, 1:3, 1:4, 또는 4:1 또는 1:4 사이의 임의의 비이다. 일부 실시양태에서, 가이드 폴리뉴클레오티드와 염기 에디터 융합 단백질을 코딩하는 핵산의 비는 가이드 폴리뉴클레오티드 및 염기 에디터 융합 단백질을 코딩하는 핵산의 적정에 의해 결정될 수 있다.
일부 실시양태에서, 가이드 폴리뉴클레오티드와 염기 에디터 융합 단백질을 코딩하는 핵산의 몰비는 약 500:1 내지 약 1:500이다.
일부 실시양태에서, 가이드 폴리뉴클레오티드와 염기 에디터 융합 단백질을 코딩하는 핵산의 비는 중량 기준으로 약 1000:1 내지 약 1:1000이다. 일부 실시양태에서, 가이드 폴리뉴클레오티드와 염기 에디터 융합 단백질을 코딩하는 핵산의 비는 중량 기준으로 약 1000:1, 950:1, 900:1, 850:1, 800:1, 750:1, 700:1, 650:1, 600:1, 550:1, 500:1, 450:1, 400:1, 350:1, 300:1, 250:1, 200:1, 100:1, 95:1, 90:1, 85:1, 80:1, 75:1, 70:1, 65:1, 60:1, 55:1, 50:1, 45:1, 40:1, 35:1, 30:1, 25:1, 20:1, 19:1, 18:1, 17:1, 17:1, 15:1, 14:1, 13:1, 12:1, 11:1, 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2;1, 1.9:1, 1.8:1, 1.7:1, 1.6:1, 1.5:1, 1.4:1, 1.3:1, 1.2:1, 1.1:1, 1.0:1, 0.9:1, 0.8:1, 0.7:1, 0.6:1, 0.5:1, 0.4:1, 0.3:1, 0.2:1, 또는 0.1이다. 일부 실시양태에서, 가이드 폴리뉴클레오티드와 염기 에디터 융합 단백질을 코딩하는 핵산의 비는 약 1:0.1, 1:0.2, 1:0.3, 1:0.4, 1:0.5, 1:0.6, 1:0.7, 1:0.8, 1:0.9, 1:1.0, 1:1.1, 1:1.2, 1:1.3, 1:1.4, 1:1.5, 1:1.6, 1:1.7, 1:1.8, 1:1.9, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1:19, 1:20, 1:25, 1:30, 1:35, 1:40, 1:45, 1:50, 1:55, 1:60, 1:65, 1:70, 1:75, 1:80, 1:85, 1:90, 1:95, 1:100, 1:150, 1:200, 1:250, 1:300, 1:350, 1:400, 1:450, 1:500, 1:550, 1:600, 1:650, 1:700, 1:750, 1:800, 1:850, 1:900, 1:950, 또는 1:1000이다. 일부 실시양태에서, 가이드 폴리뉴클레오티드와 염기 에디터 융합 단백질을 코딩하는 핵산의 비는 중량 기준으로 적어도 약 1000:1, 950:1, 900:1, 850:1, 800:1, 750:1, 700:1, 650:1, 600:1, 550:1, 500:1, 450:1, 400:1, 350:1, 300:1, 250:1, 200:1, 100:1, 95:1, 90:1, 85:1, 80:1, 75:1, 70:1, 65:1, 60:1, 55:1, 50:1, 45:1, 40:1, 35:1, 30:1, 25:1, 20:1, 19:1, 18:1, 17:1, 17:1, 15:1, 14:1, 13:1, 12:1, 11:1, 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2;1, 1.9:1, 1.8:1, 1.7:1, 1.6:1, 1.5:1, 1.4:1, 1.3:1, 1.2:1, 1.1:1, 1.0:1, 0.9:1, 0.8:1, 0.7:1, 0.6:1, 0.5:1, 0.4:1, 0.3:1, 0.2:1, 또는 0.1이다. 일부 실시양태에서, 가이드 폴리뉴클레오티드와 염기 에디터 융합 단백질을 코딩하는 핵산의 비는 중량 기준으로 적어도 약 1:0.1, 1:0.2, 1:0.3, 1:0.4, 1:0.5, 1:0.6, 1:0.7, 1:0.8, 1:0.9, 1:1.0, 1:1.1, 1:1.2, 1:1.3, 1:1.4, 1:1.5, 1:1.6, 1:1.7, 1:1.8, 1:1.9, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1:19, 1:20, 1:25, 1:30, 1:35, 1:40, 1:45, 1:50, 1:55, 1:60, 1:65, 1:70, 1:75, 1:80, 1:85, 1:90, 1:95, 1:100, 1:150, 1:200, 1:250, 1:300, 1:350, 1:400, 1:450, 1:500, 1:550, 1:600, 1:650, 1:700, 1:750, 1:800, 1:850, 1:900, 1:950, 또는 1:1000이다. 일부 실시양태에서, 가이드 폴리뉴클레오티드와 염기 에디터 융합 단백질을 코딩하는 핵산의 비는 중량 기준으로 최대 약 1000:1, 950:1, 900:1, 850:1, 800:1, 750:1, 700:1, 650:1, 600:1, 550:1, 500:1, 450:1, 400:1, 350:1, 300:1, 250:1, 200:1, 100:1, 95:1, 90:1, 85:1, 80:1, 75:1, 70:1, 65:1, 60:1, 55:1, 50:1, 45:1, 40:1, 35:1, 30:1, 25:1, 20:1, 19:1, 18:1, 17:1, 17:1, 15:1, 14:1, 13:1, 12:1, 11:1, 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2;1, 1.9:1, 1.8:1, 1.7:1, 1.6:1, 1.5:1, 1.4:1, 1.3:1, 1.2:1, 1.1:1, 1.0:1, 0.9:1, 0.8:1, 0.7:1, 0.6:1, 0.5:1, 0.4:1, 0.3:1, 0.2:1, 또는 0.1이다. 일부 실시양태에서, 가이드 폴리뉴클레오티드와 염기 에디터 융합 단백질을 코딩하는 핵산의 비는 중량 기준으로 최대 약 1:0.1, 1:0.2, 1:0.3, 1:0.4, 1:0.5, 1:0.6, 1:0.7, 1:0.8, 1:0.9, 1:1.0, 1:1.1, 1:1.2, 1:1.3, 1:1.4, 1:1.5, 1:1.6, 1:1.7, 1:1.8, 1:1.9, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1:19, 1:20, 1:25, 1:30, 1:35, 1:40, 1:45, 1:50, 1:55, 1:60, 1:65, 1:70, 1:75, 1:80, 1:85, 1:90, 1:95, 1:100, 1:150, 1:200, 1:250, 1:300, 1:350, 1:400, 1:450, 1:500, 1:550, 1:600, 1:650, 1:700, 1:750, 1:800, 1:850, 1:900, 1:950, 또는 1:1000이다.
일부 실시양태에서, 가이드 폴리뉴클레오티드와 염기 에디터 융합 단백질을 코딩하는 핵산의 몰비는 약 10000:1 내지 약 1:10000이다. 일부 실시양태에서, 가이드 폴리뉴클레오티드와 염기 에디터 융합 단백질을 코딩하는 핵산의 몰비는 약 10000:1, 9500:1, 9000:1, 8500:1, 8000:1, 7500:1, 7000:1, 6500:1, 6000:1, 5500:1, 5000:1, 4500:1, 4000:1, 3500:1, 3000:1, 2500:1, 2000:1, 1500:1, 1000:1, 950:1, 900:1, 850:1, 800:1, 750:1, 700:1, 650:1, 600:1, 550:1, 500:1, 450:1, 400:1, 350:1, 300:1, 250:1, 200:1, 190:1, 180:1, 170:1, 160:1, 150:1, 140:1, 130:1, 120:1, 110:1, 100:1, 95:1, 90:1, 85:1, 80:1, 75:1, 70:1, 69:1, 68:1, 67:1, 66:1, 65:1, 64:1, 63:1, 62:1, 61:1, 60:1, 59:1, 58:1, 57:1, 56:1, 55:1, 54:1, 53:1, 52:1, 51:1, 50:1, 49:1, 48:1, 47:1, 46:1, 45:1, 44:1, 43:1, 42:1, 41:1, 40:1, 39:1, 38:1, 37:1, 36:1, 35:1, 34:1, 33:1, 32:1, 31:1, 30:1, 29:1, 28:1, 27:1, 26:1, 25:1, 24:1, 23:1, 22:1, 21:1, 20:1, 19:1, 18:1, 17:1, 16:1, 15:1, 14:1, 13:1, 12:1, 11:1, 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 0.9:1, 0.8:1, 0.7:1, 0.6:1, 0.5:1, 0.4:1, 0.3:1, 0.2:1, 또는 0.1:1이다. 일부 실시양태에서, 가이드 폴리뉴클레오티드와 염기 에디터 융합 단백질을 코딩하는 핵산의 몰비는 적어도 약 1:10000, 1:9500, 1:9000, 1:8500, 1:8000, 1:7500, 1:7000, 1:6500, 1:6000, 1:5500, 1:5000, 1:4500, 1:4000, 1:3500, 1:3000, 1:2500, 1:2000, 1:1500, 1:1000, 1:950, 1:900, 1:850, 1:800, 1:750, 1:700, 1:650, 1:600, 1:550, 1:500, 1:450, 1:400, 1:350, 1:300, 1:250, 1:200, 1:190, 1:180, 1:170, 1:160, 1:150, 1:140, 1:130, 1:120, 1:110, 1:100, 1:95, 1:90, 1:85, 1:80, 1:75, 1:70, 1:69, 1:68, 1:67, 1:66, 1:65, 1:64, 1:63, 1:62, 1:61, 1:60, 1:59, 1:58, 1:57, 1:56, 1:55, 1:54, 1:53, 1:52, 1:51, 1:50, 1:49, 1:48, 1:47, 1:46, 1:45, 1:44, 1:43, 1:42, 1:41, 1:40, 1:39, 1:38, 1:37, 1:36, 1:35, 1:34, 1:33, 1:32, 1:31, 1:30, 1:29, 1:28, 1:27, 1:26, 1:25, 1:24, 1:23, 1:22, 1:21, 1:20, 1:19, 1:18, 1:17, 1:16, 1:15, 1:14, 1:13, 1:12, 1:11, 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1, 1:0.9, 1:0.8, 1:0.7, 1:0.6, 1:0.5, 1:0.4, 1:0.3, 1:0.2, 또는 1:0.1이다. 일부 실시양태에서, 가이드 폴리뉴클레오티드와 염기 에디터 융합 단백질을 코딩하는 핵산의 몰비는 적어도 약 10000:1, 9500:1, 9000:1, 8500:1, 8000:1, 7500:1, 7000:1, 6500:1, 6000:1, 5500:1, 5000:1, 4500:1, 4000:1, 3500:1, 3000:1, 2500:1, 2000:1, 1500:1, 1000:1, 950:1, 900:1, 850:1, 800:1, 750:1, 700:1, 650:1, 600:1, 550:1, 500:1, 450:1, 400:1, 350:1, 300:1, 250:1, 200:1, 190:1, 180:1, 170:1, 160:1, 150:1, 140:1, 130:1, 120:1, 110:1, 100:1, 95:1, 90:1, 85:1, 80:1, 75:1, 70:1, 69:1, 68:1, 67:1, 66:1, 65:1, 64:1, 63:1, 62:1, 61:1, 60:1, 59:1, 58:1, 57:1, 56:1, 55:1, 54:1, 53:1, 52:1, 51:1, 50:1, 49:1, 48:1, 47:1, 46:1, 45:1, 44:1, 43:1, 42:1, 41:1, 40:1, 39:1, 38:1, 37:1, 36:1, 35:1, 34:1, 33:1, 32:1, 31:1, 30:1, 29:1, 28:1, 27:1, 26:1, 25:1, 24:1, 23:1, 22:1, 21:1, 20:1, 19:1, 18:1, 17:1, 16:1, 15:1, 14:1, 13:1, 12:1, 11:1, 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 0.9:1, 0.8:1, 0.7:1, 0.6:1, 0.5:1, 0.4:1, 0.3:1, 0.2:1, 또는 0.1:1이다. 일부 실시양태에서, 가이드 폴리뉴클레오티드와 염기 에디터 융합 단백질을 코딩하는 핵산의 몰비는 적어도 약 1:10000, 1:9500, 1:9000, 1:8500, 1:8000, 1:7500, 1:7000, 1:6500, 1:6000, 1:5500, 1:5000, 1:4500, 1:4000, 1:3500, 1:3000, 1:2500, 1:2000, 1:1500, 1:1000, 1:950, 1:900, 1:850, 1:800, 1:750, 1:700, 1:650, 1:600, 1:550, 1:500, 1:450, 1:400, 1:350, 1:300, 1:250, 1:200, 1:190, 1:180, 1:170, 1:160, 1:150, 1:140, 1:130, 1:120, 1:110, 1:100, 1:95, 1:90, 1:85, 1:80, 1:75, 1:70, 1:69, 1:68, 1:67, 1:66, 1:65, 1:64, 1:63, 1:62, 1:61, 1:60, 1:59, 1:58, 1:57, 1:56, 1:55, 1:54, 1:53, 1:52, 1:51, 1:50, 1:49, 1:48, 1:47, 1:46, 1:45, 1:44, 1:43, 1:42, 1:41, 1:40, 1:39, 1:38, 1:37, 1:36, 1:35, 1:34, 1:33, 1:32, 1:31, 1:30, 1:29, 1:28, 1:27, 1:26, 1:25, 1:24, 1:23, 1:22, 1:21, 1:20, 1:19, 1:18, 1:17, 1:16, 1:15, 1:14, 1:13, 1:12, 1:11, 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1, 1:0.9, 1:0.8, 1:0.7, 1:0.6, 1:0.5, 1:0.4, 1:0.3, 1:0.2, 또는 1:0.1이다. 일부 실시양태에서, 가이드 폴리뉴클레오티드와 염기 에디터 융합 단백질을 코딩하는 핵산의 몰비는 최대 약 10000:1, 9500:1, 9000:1, 8500:1, 8000:1, 7500:1, 7000:1, 6500:1, 6000:1, 5500:1, 5000:1, 4500:1, 4000:1, 3500:1, 3000:1, 2500:1, 2000:1, 1500:1, 1000:1, 950:1, 900:1, 850:1, 800:1, 750:1, 700:1, 650:1, 600:1, 550:1, 500:1, 450:1, 400:1, 350:1, 300:1, 250:1, 200:1, 190:1, 180:1, 170:1, 160:1, 150:1, 140:1, 130:1, 120:1, 110:1, 100:1, 95:1, 90:1, 85:1, 80:1, 75:1, 70:1, 69:1, 68:1, 67:1, 66:1, 65:1, 64:1, 63:1, 62:1, 61:1, 60:1, 59:1, 58:1, 57:1, 56:1, 55:1, 54:1, 53:1, 52:1, 51:1, 50:1, 49:1, 48:1, 47:1, 46:1, 45:1, 44:1, 43:1, 42:1, 41:1, 40:1, 39:1, 38:1, 37:1, 36:1, 35:1, 34:1, 33:1, 32:1, 31:1, 30:1, 29:1, 28:1, 27:1, 26:1, 25:1, 24:1, 23:1, 22:1, 21:1, 20:1, 19:1, 18:1, 17:1, 16:1, 15:1, 14:1, 13:1, 12:1, 11:1, 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 0.9:1, 0.8:1, 0.7:1, 0.6:1, 0.5:1, 0.4:1, 0.3:1, 0.2:1, 또는 0.1:1이다. 일부 실시양태에서, 가이드 폴리뉴클레오티드와 염기 에디터 융합 단백질을 코딩하는 핵산의 몰비는 최대 약 1:10000, 1:9500, 1:9000, 1:8500, 1:8000, 1:7500, 1:7000, 1:6500, 1:6000, 1:5500, 1:5000, 1:4500, 1:4000, 1:3500, 1:3000, 1:2500, 1:2000, 1:1500, 1:1000, 1:950, 1:900, 1:850, 1:800, 1:750, 1:700, 1:650, 1:600, 1:550, 1:500, 1:450, 1:400, 1:350, 1:300, 1:250, 1:200, 1:190, 1:180, 1:170, 1:160, 1:150, 1:140, 1:130, 1:120, 1:110, 1:100, 1:95, 1:90, 1:85, 1:80, 1:75, 1:70, 1:69, 1:68, 1:67, 1:66, 1:65, 1:64, 1:63, 1:62, 1:61, 1:60, 1:59, 1:58, 1:57, 1:56, 1:55, 1:54, 1:53, 1:52, 1:51, 1:50, 1:49, 1:48, 1:47, 1:46, 1:45, 1:44, 1:43, 1:42, 1:41, 1:40, 1:39, 1:38, 1:37, 1:36, 1:35, 1:34, 1:33, 1:32, 1:31, 1:30, 1:29, 1:28, 1:27, 1:26, 1:25, 1:24, 1:23, 1:22, 1:21, 1:20, 1:19, 1:18, 1:17, 1:16, 1:15, 1:14, 1:13, 1:12, 1:11, 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1, 1:0.9, 1:0.8, 1:0.7, 1:0.6, 1:0.5, 1:0.4, 1:0.3, 1:0.2, 또는 1:0.1이다.
일부 실시양태에서, 가이드 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 핵산과 염기 에디터 융합 단백질을 코딩하는 핵산의 비는 중량 기준으로 약 10:1 내지 약 1:10이다. 일부 실시양태에서, 가이드 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 핵산과 염기 에디터 융합 단백질을 코딩하는 핵산의 비는 중량 기준으로 약 4:1, 3;1, 2:1, 1.5:1, 1:1, 1:1.5, 1:2, 1:3, 또는 1:4이다. 일부 실시양태에서, 가이드 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 핵산과 염기 에디터 융합 단백질을 코딩하는 핵산의 몰비는 중량 기준으로 약 500:1 내지 약 1:500이다.
일부 실시양태에서, 가이드 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 핵산과 염기 에디터 융합 단백질을 코딩하는 핵산의 비는 중량 기준으로 약1000:1 내지 약 1:1000이다. 일부 실시양태에서, 가이드 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 핵산과 염기 에디터 융합 단백질을 코딩하는 핵산의 비는 중량을 기준으로 약 1000:1, 950:1, 900:1, 850:1, 800:1, 750:1, 700:1, 650:1, 600:1, 550:1, 500:1, 450:1, 400:1, 350:1, 300:1, 250:1, 200:1, 100:1, 95:1, 90:1, 85:1, 80:1, 75:1, 70:1, 65:1, 60:1, 55:1, 50:1, 45:1, 40:1, 35:1, 30:1, 25:1, 20:1, 19:1, 18:1, 17:1, 17:1, 15:1, 14:1, 13:1, 12:1, 11:1, 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2;1, 1.9:1, 1.8:1, 1.7:1, 1.6:1, 1.5:1, 1.4:1, 1.3:1, 1.2:1, 1.1:1, 1.0:1, 0.9:1, 0.8:1, 0.7:1, 0.6:1, 0.5:1, 0.4:1, 0.3:1, 0.2:1, 또는 0.1이다. 일부 실시양태에서, 가이드 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 핵산과 염기 에디터 융합 단백질을 코딩하는 핵산의 비는 중량 기준으로 약 1:0.1, 1:0.2, 1:0.3, 1:0.4, 1:0.5, 1:0.6, 1:0.7, 1:0.8, 1:0.9, 1:1.0, 1:1.1, 1:1.2, 1:1.3, 1:1.4, 1:1.5, 1:1.6, 1:1.7, 1:1.8, 1:1.9, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1:19, 1:20, 1:25, 1:30, 1:35, 1:40, 1:45, 1:50, 1:55, 1:60, 1:65, 1:70, 1:75, 1:80, 1:85, 1:90, 1:95, 1:100, 1:150, 1:200, 1:250, 1:300, 1:350, 1:400, 1:450, 1:500, 1:550, 1:600, 1:650, 1:700, 1:750, 1:800, 1:850, 1:900, 1:950, 또는 1:1000이다. 일부 실시양태에서, 가이드 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 핵산과 염기 에디터 융합 단백질을 코딩하는 핵산의 비는 중량 기준으로 적어도 약 1000:1, 950:1, 900:1, 850:1, 800:1, 750:1, 700:1, 650:1, 600:1, 550:1, 500:1, 450:1, 400:1, 350:1, 300:1, 250:1, 200:1, 100:1, 95:1, 90:1, 85:1, 80:1, 75:1, 70:1, 65:1, 60:1, 55:1, 50:1, 45:1, 40:1, 35:1, 30:1, 25:1, 20:1, 19:1, 18:1, 17:1, 17:1, 15:1, 14:1, 13:1, 12:1, 11:1, 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2;1, 1.9:1, 1.8:1, 1.7:1, 1.6:1, 1.5:1, 1.4:1, 1.3:1, 1.2:1, 1.1:1, 1.0:1, 0.9:1, 0.8:1, 0.7:1, 0.6:1, 0.5:1, 0.4:1, 0.3:1, 0.2:1, 또는 0.1이다. 일부 실시양태에서, 가이드 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 핵산과 염기 에디터 융합 단백질을 코딩하는 핵산의 비는 중량 기준으로 적어도 약 1:0.1, 1:0.2, 1:0.3, 1:0.4, 1:0.5, 1:0.6, 1:0.7, 1:0.8, 1:0.9, 1:1.0, 1:1.1, 1:1.2, 1:1.3, 1:1.4, 1:1.5, 1:1.6, 1:1.7, 1:1.8, 1:1.9, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1:19, 1:20, 1:25, 1:30, 1:35, 1:40, 1:45, 1:50, 1:55, 1:60, 1:65, 1:70, 1:75, 1:80, 1:85, 1:90, 1:95, 1:100, 1:150, 1:200, 1:250, 1:300, 1:350, 1:400, 1:450, 1:500, 1:550, 1:600, 1:650, 1:700, 1:750, 1:800, 1:850, 1:900, 1:950, 또는 1:1000이다. 일부 실시양태에서, 가이드 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 핵산과 염기 에디터 융합 단백질을 코딩하는 핵산의 비는 중량 기준으로 최대 약 1000:1, 950:1, 900:1, 850:1, 800:1, 750:1, 700:1, 650:1, 600:1, 550:1, 500:1, 450:1, 400:1, 350:1, 300:1, 250:1, 200:1, 100:1, 95:1, 90:1, 85:1, 80:1, 75:1, 70:1, 65:1, 60:1, 55:1, 50:1, 45:1, 40:1, 35:1, 30:1, 25:1, 20:1, 19:1, 18:1, 17:1, 17:1, 15:1, 14:1, 13:1, 12:1, 11:1, 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2;1, 1.9:1, 1.8:1, 1.7:1, 1.6:1, 1.5:1, 1.4:1, 1.3:1, 1.2:1, 1.1:1, 1.0:1, 0.9:1, 0.8:1, 0.7:1, 0.6:1, 0.5:1, 0.4:1, 0.3:1, 0.2:1, 또는 0.1이다. 일부 실시양태에서, 가이드 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 핵산과 염기 에디터 융합 단백질을 코딩하는 핵산의 비는 최대 약 1:0.1, 1:0.2, 1:0.3, 1:0.4, 1:0.5, 1:0.6, 1:0.7, 1:0.8, 1:0.9, 1:1.0, 1:1.1, 1:1.2, 1:1.3, 1:1.4, 1:1.5, 1:1.6, 1:1.7, 1:1.8, 1:1.9, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1:19, 1:20, 1:25, 1:30, 1:35, 1:40, 1:45, 1:50, 1:55, 1:60, 1:65, 1:70, 1:75, 1:80, 1:85, 1:90, 1:95, 1:100, 1:150, 1:200, 1:250, 1:300, 1:350, 1:400, 1:450, 1:500, 1:550, 1:600, 1:650, 1:700, 1:750, 1:800, 1:850, 1:900, 1:950, 또는 1:1000이다.
일부 실시양태에서, 가이드 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 핵산과 염기 에디터 융합 단백질을 코딩하는 핵산의 몰비는 약 10000:1 내지 약 1:10000이다. 일부 실시양태에서, 가이드 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 핵산과 염기 에디터 융합 단백질을 코딩하는 핵산의 몰비는 약 10000:1, 9500:1, 9000:1, 8500:1, 8000:1, 7500:1, 7000:1, 6500:1, 6000:1, 5500:1, 5000:1, 4500:1, 4000:1, 3500:1, 3000:1, 2500:1, 2000:1, 1500:1, 1000:1, 950:1, 900:1, 850:1, 800:1, 750:1, 700:1, 650:1, 600:1, 550:1, 500:1, 450:1, 400:1, 350:1, 300:1, 250:1, 200:1, 190:1, 180:1, 170:1, 160:1, 150:1, 140:1, 130:1, 120:1, 110:1, 100:1, 95:1, 90:1, 85:1, 80:1, 75:1, 70:1, 69:1, 68:1, 67:1, 66:1, 65:1, 64:1, 63:1, 62:1, 61:1, 60:1, 59:1, 58:1, 57:1, 56:1, 55:1, 54:1, 53:1, 52:1, 51:1, 50:1, 49:1, 48:1, 47:1, 46:1, 45:1, 44:1, 43:1, 42:1, 41:1, 40:1, 39:1, 38:1, 37:1, 36:1, 35:1, 34:1, 33:1, 32:1, 31:1, 30:1, 29:1, 28:1, 27:1, 26:1, 25:1, 24:1, 23:1, 22:1, 21:1, 20:1, 19:1, 18:1, 17:1, 16:1, 15:1, 14:1, 13:1, 12:1, 11:1, 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 0.9:1, 0.8:1, 0.7:1, 0.6:1, 0.5:1, 0.4:1, 0.3:1, 0.2:1, 또는 0.1:1이다. 일부 실시양태에서, 가이드 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 핵산과 염기 에디터 융합 단백질을 코딩하는 핵산의 몰비는 적어도 약 1:10000, 1:9500, 1:9000, 1:8500, 1:8000, 1:7500, 1:7000, 1:6500, 1:6000, 1:5500, 1:5000, 1:4500, 1:4000, 1:3500, 1:3000, 1:2500, 1:2000, 1:1500, 1:1000, 1:950, 1:900, 1:850, 1:800, 1:750, 1:700, 1:650, 1:600, 1:550, 1:500, 1:450, 1:400, 1:350, 1:300, 1:250, 1:200, 1:190, 1:180, 1:170, 1:160, 1:150, 1:140, 1:130, 1:120, 1:110, 1:100, 1:95, 1:90, 1:85, 1:80, 1:75, 1:70, 1:69, 1:68, 1:67, 1:66, 1:65, 1:64, 1:63, 1:62, 1:61, 1:60, 1:59, 1:58, 1:57, 1:56, 1:55, 1:54, 1:53, 1:52, 1:51, 1:50, 1:49, 1:48, 1:47, 1:46, 1:45, 1:44, 1:43, 1:42, 1:41, 1:40, 1:39, 1:38, 1:37, 1:36, 1:35, 1:34, 1:33, 1:32, 1:31, 1:30, 1:29, 1:28, 1:27, 1:26, 1:25, 1:24, 1:23, 1:22, 1:21, 1:20, 1:19, 1:18, 1:17, 1:16, 1:15, 1:14, 1:13, 1:12, 1:11, 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1, 1:0.9, 1:0.8, 1:0.7, 1:0.6, 1:0.5, 1:0.4, 1:0.3, 1:0.2, 또는 1:0.1이다. 일부 실시양태에서, 가이드 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 핵산과 염기 에디터 융합 단백질을 코딩하는 핵산의 몰비는 적어도 약 10000:1, 9500:1, 9000:1, 8500:1, 8000:1, 7500:1, 7000:1, 6500:1, 6000:1, 5500:1, 5000:1, 4500:1, 4000:1, 3500:1, 3000:1, 2500:1, 2000:1, 1500:1, 1000:1, 950:1, 900:1, 850:1, 800:1, 750:1, 700:1, 650:1, 600:1, 550:1, 500:1, 450:1, 400:1, 350:1, 300:1, 250:1, 200:1, 190:1, 180:1, 170:1, 160:1, 150:1, 140:1, 130:1, 120:1, 110:1, 100:1, 95:1, 90:1, 85:1, 80:1, 75:1, 70:1, 69:1, 68:1, 67:1, 66:1, 65:1, 64:1, 63:1, 62:1, 61:1, 60:1, 59:1, 58:1, 57:1, 56:1, 55:1, 54:1, 53:1, 52:1, 51:1, 50:1, 49:1, 48:1, 47:1, 46:1, 45:1, 44:1, 43:1, 42:1, 41:1, 40:1, 39:1, 38:1, 37:1, 36:1, 35:1, 34:1, 33:1, 32:1, 31:1, 30:1, 29:1, 28:1, 27:1, 26:1, 25:1, 24:1, 23:1, 22:1, 21:1, 20:1, 19:1, 18:1, 17:1, 16:1, 15:1, 14:1, 13:1, 12:1, 11:1, 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 0.9:1, 0.8:1, 0.7:1, 0.6:1, 0.5:1, 0.4:1, 0.3:1, 0.2:1, 또는 0.1:1이다. 일부 실시양태에서, 가이드 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 핵산과 염기 에디터 융합 단백질을 코딩하는 핵산의 몰비는 적어도 약 1:10000, 1:9500, 1:9000, 1:8500, 1:8000, 1:7500, 1:7000, 1:6500, 1:6000, 1:5500, 1:5000, 1:4500, 1:4000, 1:3500, 1:3000, 1:2500, 1:2000, 1:1500, 1:1000, 1:950, 1:900, 1:850, 1:800, 1:750, 1:700, 1:650, 1:600, 1:550, 1:500, 1:450, 1:400, 1:350, 1:300, 1:250, 1:200, 1:190, 1:180, 1:170, 1:160, 1:150, 1:140, 1:130, 1:120, 1:110, 1:100, 1:95, 1:90, 1:85, 1:80, 1:75, 1:70, 1:69, 1:68, 1:67, 1:66, 1:65, 1:64, 1:63, 1:62, 1:61, 1:60, 1:59, 1:58, 1:57, 1:56, 1:55, 1:54, 1:53, 1:52, 1:51, 1:50, 1:49, 1:48, 1:47, 1:46, 1:45, 1:44, 1:43, 1:42, 1:41, 1:40, 1:39, 1:38, 1:37, 1:36, 1:35, 1:34, 1:33, 1:32, 1:31, 1:30, 1:29, 1:28, 1:27, 1:26, 1:25, 1:24, 1:23, 1:22, 1:21, 1:20, 1:19, 1:18, 1:17, 1:16, 1:15, 1:14, 1:13, 1:12, 1:11, 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1, 1:0.9, 1:0.8, 1:0.7, 1:0.6, 1:0.5, 1:0.4, 1:0.3, 1:0.2, 또는 1:0.1이다. 일부 실시양태에서, 가이드 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 핵산과 염기 에디터 융합 단백질을 코딩하는 핵산의 몰비는 최대 약 10000:1, 9500:1, 9000:1, 8500:1, 8000:1, 7500:1, 7000:1, 6500:1, 6000:1, 5500:1, 5000:1, 4500:1, 4000:1, 3500:1, 3000:1, 2500:1, 2000:1, 1500:1, 1000:1, 950:1, 900:1, 850:1, 800:1, 750:1, 700:1, 650:1, 600:1, 550:1, 500:1, 450:1, 400:1, 350:1, 300:1, 250:1, 200:1, 190:1, 180:1, 170:1, 160:1, 150:1, 140:1, 130:1, 120:1, 110:1, 100:1, 95:1, 90:1, 85:1, 80:1, 75:1, 70:1, 69:1, 68:1, 67:1, 66:1, 65:1, 64:1, 63:1, 62:1, 61:1, 60:1, 59:1, 58:1, 57:1, 56:1, 55:1, 54:1, 53:1, 52:1, 51:1, 50:1, 49:1, 48:1, 47:1, 46:1, 45:1, 44:1, 43:1, 42:1, 41:1, 40:1, 39:1, 38:1, 37:1, 36:1, 35:1, 34:1, 33:1, 32:1, 31:1, 30:1, 29:1, 28:1, 27:1, 26:1, 25:1, 24:1, 23:1, 22:1, 21:1, 20:1, 19:1, 18:1, 17:1, 16:1, 15:1, 14:1, 13:1, 12:1, 11:1, 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 0.9:1, 0.8:1, 0.7:1, 0.6:1, 0.5:1, 0.4:1, 0.3:1, 0.2:1, 또는 0.1:1이다. 일부 실시양태에서, 가이드 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 핵산과 염기 에디터 융합 단백질을 코딩하는 핵산의 몰비는 최대 약 1:10000, 1:9500, 1:9000, 1:8500, 1:8000, 1:7500, 1:7000, 1:6500, 1:6000, 1:5500, 1:5000, 1:4500, 1:4000, 1:3500, 1:3000, 1:2500, 1:2000, 1:1500, 1:1000, 1:950, 1:900, 1:850, 1:800, 1:750, 1:700, 1:650, 1:600, 1:550, 1:500, 1:450, 1:400, 1:350, 1:300, 1:250, 1:200, 1:190, 1:180, 1:170, 1:160, 1:150, 1:140, 1:130, 1:120, 1:110, 1:100, 1:95, 1:90, 1:85, 1:80, 1:75, 1:70, 1:69, 1:68, 1:67, 1:66, 1:65, 1:64, 1:63, 1:62, 1:61, 1:60, 1:59, 1:58, 1:57, 1:56, 1:55, 1:54, 1:53, 1:52, 1:51, 1:50, 1:49, 1:48, 1:47, 1:46, 1:45, 1:44, 1:43, 1:42, 1:41, 1:40, 1:39, 1:38, 1:37, 1:36, 1:35, 1:34, 1:33, 1:32, 1:31, 1:30, 1:29, 1:28, 1:27, 1:26, 1:25, 1:24, 1:23, 1:22, 1:21, 1:20, 1:19, 1:18, 1:17, 1:16, 1:15, 1:14, 1:13, 1:12, 1:11, 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1, 1:0.9, 1:0.8, 1:0.7, 1:0.6, 1:0.5, 1:0.4, 1:0.3, 1:0.2, 또는 1:0.1이다.
정밀 게놈 편집은 산업, 농업, 및 생물의학 응용 분야와 에서 성장하는 분야이다. 오늘날 사용 가능한 지배적인 게놈 편집 시스템 중 하나는 클러스터된 규칙적으로 간격을 두고 있는 짧은 회문 반복체(CRISPR: clustered regularly interspaced short palindromic repeat)-CRISPR 연관 9(Cas9)이다. DNA에서 서열 NGG(N은 임의의 표준 염기)를 포함하는 특정 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)에 인접한 표적 게놈의 DNA 서열(프로토스페이서로 알려짐)과 상동인 서열을 갖는 가이드 RNA(gRNA)의 사용을 통해, Cas9를 사용하여 표적화된 서열에서 이중 가닥 파손(DSB: double-strand break)을 생성할 수 있다. DSB에서 비상동 말단 연결(NHEJ: non-homologous end joining)을 사용하여 유전자좌에서 삽입-결실을 생성하고 유전자를 녹아웃시킬 수 있으며, 유사하게, 도입된 주형 DNA와 함께 상동성 유도 복구(HDR: homology-directed repair)를 사용하여 유전자를 삽입하거나 표적화된 서열을 변형할 수 있다. DNA를 메틸화하거나 더 넓은 서열 공간을 인식하거나, 단일 가닥 닉을 생성하는 도구를 포함하여 다양한 Cas9 기반 도구가 최근 몇 년 동안 개발되었다. 2016년에 Komor 연구자들은 CRISPR-Cas9를 사용하여 주형 DNA 가닥을 도입하지 않고 DSB를 필요로 하지 않고 시토신 염기를 티민 염기로 전환하는 방법을 기술하였다(Komor AC, Kim YB, Packer MS, et al. Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature, 2016, 533: 420-4, 전체 내용이 본원에 참고로 포함됨). 래트 APOBEC1의 시티딘 데아미나아제 도메인이 링커 XTEN을 사용하여 촉매적으로 죽은 Cas9(dCas9)의 N-말단에 융합된 후(염기 에디터 1 또는 BE1이라고 하는 융합 단백질 생성), DNA의 20-nt 프로토스페이서 영역 내의 위치 4와 위치 8(또는 이를 다른 방식으로 표현하자면, PAM 상류의 13~17개 뉴클레오티드) 사이에서 시토신에서 우라실로의 전환이 관찰되었다. 중요하게는, 이 "창" 내의 모든 시토신 염기는 편집이 가능하여 편집된 시토신의 수와 종류에 따라 다양한 결과가 나타났다. DNA 복제 또는 복구 후, 각 우라실은 티민으로 대체되어 C->T 염기 편집을 완료하였다.3 염기 에디터(BE2)의 다음 버전은 시티딘 데아미나아제 활성으로 인한 우라실 염기의 염기 절제 복구(그렇지 않으면 원래의 시토신 염기를 복원하는 작용을 함)를 억제하는 데 도움이 되도록 dCas9의 C-말단에 융합된 우라실 글리코실라제 억제제를 포함하였다. 이것은 C->T 염기 편집의 효율성을 향상시켰다. 최종 버전인 BE3은 dCas9 대신 Cas9 닉카아제를 사용하였으며, 닉카아제는 편집된 C->T 염기 맞은편 편집되지 않은 가닥을 절단하여 진핵생물의 미스매치 복구를 통한 맞은편 구아니딘의 제거를 자극하였다. BE2 및 BE3 염기 편집은 인간 및 뮤린 세포주 모두에서 관찰되었다. 염기 편집의 특이성은 Cas9 닉카아제에 돌연변이를 추가하여 더욱 향상되었다. 유사한 방식으로, Cas9는 편집 창의 너비를 약 5개 뉴클레오티드에서 1-2개 뉴클레오티드로 좁히도록 돌연변이되었다(Rees HA, Komor AC, Yeh WH, et al. Improving the DNA specificity and applicability of base editing through protein engineering and protein delivery. Nat Commun, 2017, 8: 15790, Kim YB, Komor AC, Levy JM, et al. Increasing the genome-targeting scope and precision of base editing with engineered Cas9-cytidine deaminase fusions. Nat Biotechnol, 2017, 35: 371-6, 이들 각각은 그 전체가 본원에 참고로 포함됨).
대안적인 시토신 염기 편집 플랫폼은 활성화 유도 시토신 데아미나아제 도메인 PmCDA1을 dCas9(Target-AID)에 연결함으로써 효모에서 표적화된 C->T 염기 편집을 입증할 수 있었다. 또한, 대안적인 C->T 편집 전략도 Cas9에 데아미나아제 도메인을 융합하지 않고 입증되었다. 대신 SH3(Src 3 상동성) 도메인이 dCas9의 C-말단에 추가되는 한편 SHL(SH3 상호작용 리간드)이 PmCDA1에 추가되었다.6 dCas9 대신 Cas9 닉카아제를 사용하여 효율을 최적화하였다. 또한, 포유동물 CHO 세포주에서 염기 편집을 향상시키기 위해 우라실 DNA 글리코실라제 억제제를 첨가하였다. 생성된 플랫폼은 PAM 서열의 상류 18번째 뉴클레오티드의 3 내지 5개 염기 내의 염기를 일관성 있게 편집할 수 있었다(Nishida K, Arazoe T, Yachie N, et al. Targeted nucleotide editing using hybrid prokaryotic and vertebrate adaptive immune systems. Science, 2016, 353: aaf8729, 그 전체가 본원에 참고로 포함됨).
별개의 시토신 염기 편집 플랫폼은 RNA 가이드 엔도뉴클레아제로 Cas9 대신 Cpf1(Cas12a라고도 함)을 사용하였다. 촉매적으로 불활성화된 Cpf1은 APOBEC1에 융합되어(dLbCpf1-BE0) 인간 세포주에서 C에서 T로의 전환을 유도하였다. Cas9 염기 에디터 변이체 BE3 및 Target-AID는 PAM 서열 NGG를 인식하는 반면 dLbCpf1-BE0은 T 풍부 PAM 서열 TTTV를 인식한다. dLbCpf1-BE0로 프로토스페이서 서열의 위치 8과 13 사이에서 염기 편집이 관찰되었지만, Cpf1에 추가 돌연변이를 도입하면 창을 위치 10 내지 12로 줄일 수 있었다. 그러나 염기 편집 창의 축소는 편집 효율 감소와 상관관계가 있었다(Li X, Wang Y, Liu Y, et al. Base editing with a Cpf1-cytidine deaminase fusion. Nat Biotechnol, 2018, 36: 324-7, 그 전체가 본원에 참고로 포함됨).
시토신 염기 편집은 완전히 예측할 수 없다. C에서 T로의 편집 에디터에서 관찰된 빈도보다 낮은 빈도이긴 하지만 표적 부위에서 삽입-결실이 발생할 수 있다. 또한, 시토신 염기 에디터는 때때로 예상되는 C에서 T 편집보다 C에서 A 또는 C에서 G 편집을 유발할 수 있다. Cas9 닉카아제와 래트 APOBEC1 시토신 데아미나아제 도메인 사이의 링커 길이를 16개 아미노산에서 32개 아미노산으로, Cas9 닉카아제와 우라실 글리코실라제 억제제 사이의 링커를 4개 아미노산에서 9개 아미노산으로 추가하고 두 번째 우라실 글리코실라제 억제제를 사용하여 또 다른 9개 아미노산 링커를 사용하여 새로운 시토신 염기 에디터의 C-말단에 추가하여 "BE4"라고 하는 시토신 염기 에디터를 개선하였다(Komor AC, Zhao KT, Packer MS, et al. Improved base excision repair inhibition and bacteriophage Mu Gam protein yields C:G-to-T:A base editors with higher efficiency and product purity. Sci Adv, 2017, 3: eaao4774. 전체 내용이 본원에 참고로 포함됨).
에쉐리키아 콜라이(Escherichia coli) 아데닌 tTNA 데아미나아제 TadA(ecTadA)를 dCas9에 융합하고 편집 활성을 위한 선별과 함께 ecTadA 도메인의 돌연변이유발을 통해 A106V 및 D108N 돌연변이가 ABE7.10이라고 하는 DNA에서 아데닌을 구아닌으로 편집할 수 있는 염기 에디터를 생성함을 보여주었다(Caudelli NM, Komor AC, Rees HA, et al. Programmable base editing of A•T to G•C in genomic DNA without DNA cleavage. Nature, 2017, 551: 464-71, 그 전체 내용이 본원에 참고로 포함됨). Koblanet 연구자들은 핵 국소화 신호 및 코돈 최적화의 변형을 통해 ABE7.10의 효율성을 개선하여, ABEmax라고 불리는 버전을 생성하였으며, 유사한 접근법으로 시토신 염기 에디터 BE4.의 효율을 개선하였다.10 Huang 연구자들은 대체 PAM을 사용하고 편집 창을 확장하기 위해 아데닌 및 시토신 염기 에디터의 추가 개발을 수행하여 표적화 범위를 증가시켰다(Improving cytidine and adenine base editors by expression optimization and ancestral reconstruction. Nat Biotechnol, 2018, 36: 843-6, 그 전체가 본원에 참고로 포함됨).
동일한 gRNA를 사용하는 Cas9, 시토신 염기 에디터, 및 아데닌 염기 에디터의 비교가 별개의 오프 타겟 프로파일을 보여주긴 했지만 염기 에디터에 대해 동일한 것이 적용되는 것으로 입증되었다.12-14
다양한 연구에서 (Cas9-gRNA 복합체에 의한 DNA의 관여를 필요로 하지 않으면서) 따로 작용하는 데아미나아제 도메인에 의해서 유발된 gRNA 비의존적 오프 타겟 염기 편집에 대한 우려가 제기되었다. 추가 연구에서 염기 에디터의 gRNA 비의존적 오프 타겟 효과는 DNA에만 국한되지 않는 것으로 나타났다. 시토신 염기 에디터 또는 아데닌 염기 에디터로 처리된 세포의 RNA 시퀀싱으로 RNA의 트랜스크립톰 전체 오프 타겟 편집을 밝혔고, 아데닌 염기 에디터의 데아미나아제 도메인에 아미노산 치환(예를 들어, R106W)의 도입은 온 타겟 DNA 염기 편집 효율을 실질적으로 감소시키지 않으면서RNA의 오프 타겟 편집을 감소시켰다(Zuo E, Sun Y, Wei W, et al. Cytosine base editor generates substantial off-target single-nucleotide variants in mouse embryos. Science, 2019, 364: 289-92; Jin S, Zong Y, Gao Q, et al. Cytosine, but not adenine, base editors induce genome-wide off-target mutations in rice. Science, 2019, 364: 292-5;
Figure pct00003
J, Zhou R, Garcia SP, et al. Transcriptome-wide off-target RNA editing induced by CRISPR-guided DNA base editors. Nature, 2019, 569: 433-7;
Figure pct00004
J, Zhou R, Iyer S, et al. CRISPR DNA base editors with reduced RNA off-target and self-editing activities. Nat Biotechnol, 2019, 37: 1041-8; Zhou C, Sun Y, Yan R, et al. Off-target RNA mutation induced by DNA base editing and its elimination by mutagenesis. Nature, 2019, 571: 275-8; Rees HA, Wilson C, Doman JL, et al. Analysis and minimization of cellular RNA editing by DNA adenine base editors. Sci Adv, 2019, 5: eaax5717, 이들 각각은 그 전체가 본원에 참고로 포함됨).
표준 Cas9 게놈 편집을 이용한 정밀 편집을 통한 질환 유발 돌연변이의 교정에는 주로 HDR이 필요하였다. HDR은 유사 분열의 S 또는 G2 단계의 세포에 국한되기 때문에 비-유사 분열 세포의 정밀 편집이 어렵다. 그러나 염기 에디터는 HDR에 의존하지 않는다. 마우스에서 유사분열 후 달팽이관 세포의 편집은 시토신 염기 에디터 BE3으로 가능하다. 양이온성 리포솜을 통해 사전 조립된 리보핵단백질 형태의 BE3 및 gRNA를 주입함으로써, 베타-카테닌의 세린-33이 페닐알라닌으로 편집되어(TCT 코돈이 TTT로 편집됨) 지지 세포가 유모 세포로 전환분화를 가능하게 하였다. 달팽이관 조직의 염기 편집을 시퀀싱을 통해 확인하였으며, 달팽이관 부위에 따라 0.7 내지 3.0%의 편집율을 보였다. 대조적으로, HDR을 통한 표준 Cas9 편집은 달팽이관 세포에서 무시할 만한 효능의 징후를 보여주었다. AAV(아데노 관련 바이러스) 벡터를 통해 간으로 전달된 SaBE3의 변이체는 Pah 유전자의 병원성 T에서 C로의 돌연변이를 29%의 높은 편집율로 직접 교정함으로써 성체 마우스에서 페닐케톤뇨증 질환을 치료하는 것으로 보고되었다. 아데닌 염기 편집은 또한 마우스에서 돌연변이를 생성하는 것으로 입증되었다(Yeh WH, Chiang H, Rees HA, et al. In vivo base editing of post-mitotic sensory cells. Nat Commun, 2018, 9: 2184; Villiger L, Grisch-Chan HM, Lindsay H, et al. Treatment of a metabolic liver disease by in vivo genome base editing in adult mice. Nat Med, 2018, 24: 1519-25; Ryu SM, Koo T, Kim K, et al. Adenine base editing in mouse embryos and an adult mouse model of Duchenne muscular dystrophy. Nat Biotechnol, 2018, 36: 536-9; Song CQ, Jiang T, Richter M, et al. Adenine base editing in an adult mouse model of tyrosinaemia. Nat Biomed Eng, 2020, 4: 125-30; Pisciotta L, Favari E, Magnolo L, et al. Characterization of three kindreds with familial combined hypolipidemia caused by loss-of-function mutations of ANGPTL3. Circ Cardiovasc Genet, 2012, 5: 42-50, 이들 각각은 그 전체가 본원에 참고로 포함됨).
본원에서는 표적 뉴클레오티드 서열 내에서 핵염기(예를 들어, A, T, C, G 또는 U)로 변형 또는 전환할 수 있는 핵염기 에디터 단백질, 복합체, 또는 화합물을 포함하는 핵염기 에디터 시스템의 조성물이 제공된다.
핵염기 에디터 또는 염기 에디터(BE)는 핵산 서열(예를 들어, DNA 또는 RNA) 내의 염기(예를 들어, A, T, C, G, 또는 U)에 변형을 만들 수 있는 폴리펩티드를 포함하는 작용제를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 염기 에디터는 핵산 내의 염기를 탈아미노화할 수 있다. 일부 실시양태에서, 염기 에디터는 DNA 분자 내의 염기를 탈아미노화할 수 있다. 일부 실시양태에서, 염기 에디터는 DNA에서 아데닌(A)을 탈아미노화할 수 있다.
일부 실시양태에서, 염기 에디터는 아데노신 데아미나아제에 융합된 프로그램 가능한 DNA 결합 단백질을 포함하는 융합 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 염기 에디터는 Cas9 단백질 및 아데노신 데아미나아제를 포함하는 융합 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 염기 에디터는 아데노신 데아미나아제에 융합된 Cas9 닉카아제(nCas9)이다. 일부 실시양태에서, 염기 에디터는 아데노신 데아미나아제에 융합된 뉴클레아제 불활성 Cas9(dCas9)이다. 일부 실시양태에서, 염기 에디터는 시티딘 데아미나아제에 융합된 프로그램 가능한 DNA 결합 단백질을 포함하는 융합 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 염기 에디터는 Cas9 단백질 및 시티딘 데아미나아제를 포함하는 융합 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 염기 에디터는 시티딘 데아미나아제에 융합된 Cas9 닉카아제(nCas9)이다. 일부 실시양태에서, 염기 에디터는 시티딘 데아미나아제에 융합된 뉴클레아제 불활성 Cas9(dCas9)이다. 일부 실시양태에서, 염기 에디터는 염기 절제 복구의 억제제, 예를 들어 UGI 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 융합 단백질은 데아미나아제에 융합된 Cas9 닉카아제 및 UGI 또는 dISN 도메인과 같은 염기 절제 복구의 억제제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 융합 단백질의 dCas9 도메인은 야생형 SpCas9 아미노산 서열에서 넘버링된 바와 같이 D10A 및 H840A 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, UGI는 하기 아미노산 서열을 포함한다:
>splP14739IUNGI_BPPB2 우라실-DNA 글리코실라제 억제제
MTNLSDIIEKETGKQLVIQESILMLPEEVEEVIGNKPESDILVHTAYDESTDENVMLLT S D APE YKPW ALVIQDS NGENKIKML (서열 번호 16)
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 염기 에디터 시스템은 염기 에디터 융합 단백질을 포함한다. 예를 들어, 염기 에디터 융합 단백질은 프로그램 가능한 DNA 결합 단백질 및 데아미나아제, 예를 들어 아데노신 데아미나아제를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 임의의 융합 단백질은 염기 에디터이다. 일부 실시양태에서, 프로그램 가능한 DNA 결합 단백질은 Cas9 도메인, Cpf1 도메인, CasX 도메인, CasY 도메인, Cas12b 도메인, C2c2 도메인, C2c3 도메인, 또는 Argonaute 도메인이다. 일부 실시양태에서, 프로그램 가능한 DNA 결합 단백질은 Cas9 도메인이다. Cas9 도메인은 본원에 제공된 임의의 Cas9 도메인 또는 Cas9 단백질(예를 들어, 임의의 종으로부터의 뉴클레아제 불활성 Cas9 또는 Cas9 닉카아제, 또는 Cas9 변이체)일 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 임의의 Cas9 도메인 또는 Cas9 단백질은 본원에 제공된 임의의 데아미나아제와 융합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 염기 에디터는 데아미나아제, 예를 들어, 아데노신 데아미나아제 및 프로그램 가능한 DNA 결합 단백질, 예를 들어 링커를 통해 연결된 Cas9 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 염기 에디터는 데아미나아제, 예를 들어, 아데노신 데아미나아제 및 프로그램 가능한 DNA 결합 단백질, 예를 들어 링커를 통해 연결된 Cas9 도메인을 포함하는 융합 단백질을 포함한다 일부 실시양태에서, 링커는 펩티드 링커이다. 일부 실시양태에서, 링커는 데아미나아제 도메인과 Cas9 도메인 사이에 존재한다. 일부 실시양태에서, 데아미나아제 및 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인은 본원에 제공된 임의의 펩티드 링커를 통해 융합된다. 예를 들어, 아데노신 데아미나아제 및 Cas9 도메인은 1 내지 200개의 아미노산을 포함하는 링커를 통해 융합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나아제 및 프로그램 가능한 DNA 결합 단백질은 1 내지 5, 1 내지 10, 1 내지 20, 1 내지 30, 1 내지 40, 1 내지 50, 1 내지 60, 1 내지 80, 1 내지 100, 1 내지 150, 1 내지 200, 5 내지 10, 5 내지 20, 5 내지 30, 5 내지 40, 5 내지 60, 5 내지 80, 5 내지 100, 5 내지 150, 5 내지 200, 10 내지 20, 10 내지 30, 10 내지 40, 10 내지 50, 10 내지 60, 10 내지 80, 10 내지 100, 10 내지 150, 10 내지 200, 20 내지 30, 20 내지 40, 20 내지 50, 20 내지 60, 20 내지 80, 20 내지 100, 20 내지 150, 20 내지 200, 30 내지 40, 30 내지 50, 30 내지 60, 30 내지 80, 30 내지 100, 30 내지 150, 30 내지 200, 40 내지 50, 40 내지 60, 40 내지 80, 40 내지 100, 40 내지 150, 40 내지 200, 50 내지 60 50 내지 80, 50 내지 100, 50 내지 150, 50 내지 200, 60 내지 80, 60 내지 100, 60 내지 150, 60 내지 200, 80 내지 100, 80 내지 150, 80 내지 200, 100 내지 150, 100 내지 200, or 150 내지 200개의 아미노산 길이를 포함하는 링커를 통해 융합된다. 일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나아제 및 프로그램 가능한 DNA 결합 단백질은 4, 16, 32 또는 104개의 아미노산 길이를 포함하는 링커를 통해 융합된다. 일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나아제 및 프로그램 가능한 DNA 결합 단백질은 SGSETPGTSESATPES (서열 번호 17), SGGS (서열 번호 18), SGGSSGSETPGTSESATPESSGGS (서열 번호 19), SGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGS (서열 번호 20), 또는 GGSGGSPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTE PSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGGSGGS (서열 번호 21)의 아미노산 서열을 포함하는 링커를 통해 융합된다. 일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나아제 및 프로그램 가능한 DNA 결합 단백질은 XTEN 링커로도 지칭될 수 있는 아미노산 서열 SGSETPGTSESATPES (서열 번호 17)를 포함하는 링커를 통해 융합된다. 일부 실시양태에서, 링커는 24개 아미노산 길이이다. 일부 실시양태에서, 링커는 아미노산 서열 SGGSSGGSSGSETPGTSESATPES (서열 번호 23)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 40개 아미노산 길이이다. 일부 실시양태에서, 링커는 아미노산 서열 SGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGSSGGSSGGS (서열 번호 24)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 64개 아미노산 길이이다. 일부 실시양태에서, 링커는 아미노산 서열 SGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGSSGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGS (서열 번호 25)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 92개 아미노산 길이이다. 일부 실시양태에서, 링커는 아미노산 서열 PGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAP GTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATS (서열 번호 26)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 염기 에디터 시스템은 염기 복구 억제제를 포함하는 융합 단백질을 포함하는 염기 에디터를 포함한다. 일부 실시양태에서, 염기 에디터는 시티딘 데아미나아제 및 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인, 예를 들어 Cas9 도메인을 포함하는 융합 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 염기 에디터는 아데노신 데아미나아제 및 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인, 예를 들어, Cas9 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 염기 에디터 또는 융합 단백질은 염기 복구의 억제제(IBR)를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, IBR은 이노신 염기 복구의 억제제를 포함한다. 일부 실시양태에서, IBR은 이노신 염기 절제 복구의 억제제이다. 일부 실시양태에서, 이노신 염기 절제 복구의 억제제는 촉매적으로 불활성인 이노신 특이적 뉴클레아제(dISN)이다. 일부 실시양태에서, dISN은 (예를 들어, 입체 장애에 의해) 이노신 제거 효소가 DNA로부터 이노신 잔기를 절제하는 것을 억제할 수 있다. 예를 들어, 촉매적으로 죽은 이노신 글리코실라제(예를 들어, 알킬 아데닌 글리코실라제[AAG])는 이노신에 결합하지만 무염기 부위를 생성하거나 이노신을 제거하지 않아 잠재적인 DNA 손상/복구 메커니즘으로부터 새로 형성된 이노신 모이어티를 입체적으로 차단한다. 따라서, 본 개시 내용은 dISN에 추가로 융합된 아데노신 데아미나아제 및 프로그램 가능한 DNA 결합 단백질을 포함하는 융합 단백질을 고려한다. 본 개시 내용은 임의의 Cas9 도메인, 예를 들어 Cas9 닉카아제(nCas9) 도메인, 촉매적으로 불활성인 Cas9(dCas9) 도메인, 고충실도 Cas9 도메인, 또는 PAM 배타성이 감소된 Cas9 도메인을 포함하는 융합 단백질을 고려한다. dISN의 사용은 A에서 I로의 변화를 촉매할 수 있는 아데노신 데아미나아제의 편집 효율을 증가시킬 수 있음을 이해해야 한다. 예를 들어, dISN 도메인을 포함하는 융합 단백질은 A 잔기를 탈아미노화하는데 더 효율적일 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 염기 에디터는 하나 이상의 핵 표적화 서열, 예를 들어 핵 국소화 서열(NLS)을 추가로 포함하는 융합 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 융합 단백질은 다중 NLS를 포함한다. 일부 실시양태에서, 융합 단백질은 융합 단백질의 N-말단 및 C-말단에 NLS를 포함한다. 일부 실시양태에서, NLS는 NLS를 포함하는 단백질의 세포 핵 내로의 도입을 촉진하는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, NLS는 융합 단백질의 N-말단에 융합된다. 일부 실시양태에서, NLS는 융합 단백질의 C-말단에 융합된다. 일부 실시양태에서, NLS는 프로그램 가능한 DNA 결합 단백질, 예를 들어 Cas9의 N-말단에 융합된다. 일부 실시양태에서, NLS는 프로그램 가능한 DNA 결합 단백질의 C-말단에 융합된다. 일부 실시양태에서, NLS는 아데노신 데아미나아제의 N-말단에 융합된다. 일부 실시양태에서, NLS는 아데노신 데아미나아제의 C-말단에 융합된다. 일부 실시양태에서, NLS는 하나 이상의 링커를 통해 융합 단백질에 융합된다. 일부 실시양태에서, NLS는 링커 없이 융합 단백질에 융합된다. 일부 실시양태에서, NLS는 본원에서 제공되거나 참조된 NLS 서열 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, NLS는 아미노산 서열 PKKKRKV (서열 번호 27) 또는 MDSLLMNRRKFLYQFKNVRWAKGRRETYLC (서열 번호 28)를 포함한다. 추가적인 핵 국소화 서열은 당업계에 공지되어 있으며 당업자에게 명백할 것이다. 예를 들어, NLS 서열은 Plank et al, PCT/EP2000/011690에 기술되어 있으며, 그 내용은 예시적인 핵 국소화 서열의 개시 내용에 대해 본원에 참고로 포함된다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 융합 단백질은 링커를 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 링커는 하나 이상의 도메인 또는 단백질(예를 들어, 아데노신 데아미나아제, napDNAbp, NLS, 및/또는 IBR) 사이에 존재한다. 일부 실시양태에서, 상기 일반 아키텍처에서 사용된 "-"는 선택적 링커의 존재를 나타낸다.
본 개시 내용의 일부 측면은 프로그램 가능한 DNA 결합 단백질 및 적어도 2개의 아데노신 데아미나아제 도메인을 포함하는 염기 에디터 또는 융합 단백질을 제공한다. 임의의 특정 이론에 얽매이지 않고, 아데노신 데아미나아제의 이량체화(예를 들어, 시스 또는 트랜스로)는 핵산 염기를 변형하는, 예를 들어 아데닌을 탈아미노화하는 융합 단백질의 능력(예를 들어, 효율)을 개선할 수 있다. 일부 실시양태에서, 임의의 융합 단백질은 2, 3, 4 또는 5개의 아데노신 데아미나아제 도메인을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 임의의 융합 단백질은 2개의 아데노신 데아미나아제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 임의의 융합 단백질은 2개의 아데노신 데아미나아제만을 포함한다. 일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나아제는 동일하다. 일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나아제는 본원에 제공된 임의의 아데노신 데아미나아제이다. 일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나아제는 상이하다. 일부 실시양태에서, 제1 아데노신 데아미나아제는 본원에 제공된 임의의 아데노신 데아미나아제이고, 제2 아데노신은 본원에 제공된 임의의 아데노신 데아미나아제이지만, 제1 아데노신 데아미나아제와 동일하지 않다. 일부 실시양태에서, 제1 아데노신 데아미나아제는 서열 번호 1에 넘버링된 바와 같이 본원에 제공된 돌연변이 중 어느 하나를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 아데노신 데아미나아제는 서열 번호 1에 넘버링된 바와 같이 본원에 제공된 돌연변이 중 어느 하나를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 아데노신 데아미나아제는 서열 번호 1에 넘버링된 바와 같이 본원에 제공된 돌연변이 중 어느 하나를 포함하고, 제2 아데노신 데아미나아제는 야생형 아데노신 데아미나아제 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 아데노신 데아미나아제는 서열 번호 1에 넘버링된 바와 같이 본원에 제공된 돌연변이 중 어느 하나를 포함하고, 제1 아데노신 데아미나아제는 야생형 아데노신 데아미나아제 서열을 포함한다. 하나의 예로서, 융합 단백질은 둘 다 ecTadA(서열 번호 1)로부터의 A106V, D108N, D147Y, 및 E155V 돌연변이를 포함하는 제1 아데노신 데아미나아제 및 제2 아데노신 데아미나아제를 포함할 수 있다. 다른 예로서, 융합 단백질은 ecTadA(서열 번호 1)로부터의 A106V, D108N, D147Y, 및 E155V 돌연변이를 포함하는 제1 아데노신 데아미나아제 도메인, 및 ecTadA(서열 번호 1)로부터의 L84F, A106V, D108N, H123Y, D147Y, E155V, 및 I156F 돌연변이를 포함하는 제2 아데노신 데아미나아제를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나아제는 다음 아미노산 서열을 포함한다:
Figure pct00005
일부 실시양태에서, 융합 단백질은 2개의 아데노신 데아미나아제(예를 들어, 제1 아데노신 데아미나아제 및 제2 아데노신 데아미나아제)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 아데노신 데아미나아제는 융합 단백질에서 제2 아데노신 데아미나아제의 N-말단이다. 일부 실시양태에서, 제1 아데노신 데아미나아제는 융합 단백질에서 제2 아데노신 데아미나아제의 C-말단이다. 일부 실시양태에서, 제1 아데노신 데아미나아제 및 제2 데아미나아제는 직접적으로 또는 링커를 통해 융합된다. 일부 실시양태에서, 링커는 본원에 제공된 임의의 링커, 예를 들어 "링커" 섹션에 기재된 임의의 링커이다. 일부 실시양태에서, 제1 아데노신 데아미나아제는 제2 아데노신 데아미나아제와 동일하다. 일부 실시양태에서, 제1 아데노신 데아미나아제 및 제2 아데노신 데아미나아제는 본원에 기재된 임의의 아데노신 데아미나아제이다. 일부 실시양태에서, 제1 아데노신 데아미나아제 및 제2 아데노신 데아미나아제는 상이하다. 일부 실시양태에서, 제1 아데노신 데아미나아제는 본원에 제공된 임의의 아데노신 데아미나아제이다. 일부 실시양태에서, 제2 아데노신 데아미나아제는 본원에 제공된 임의의 아데노신 데아미나아제이지만 제1 아데노신 데아미나아제와 동일하지 않다. 일부 실시양태에서, 제1 아데노신 데아미나아제는 ecTadA 아데노신 데아미나아제이다. 일부 실시양태에서, 제1 아데노신 데아미나아제는 서열 번호 1에 제시된 아미노산 서열 또는 본원에 제공된 임의의 아데노신 데아미나아제에 대해 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 아데노신 데아미나아제는 서열 번호 1에 제시된 아미노산 서열 또는 본원에 제공된 임의의 아데노신 데아미나아제에 대해 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 아데노신 데아미나아제는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 융합 단백질은 링커를 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 링커는 하나 이상의 도메인 또는 단백질(예를 들어, 제1 아데노신 데아미나아제, 제2 아데노신 데아미나아제, 프로그램 가능한 DNA 결합 단백질, 및/또는 NLS) 사이에 존재한다.
본 개시 내용의 융합 단백질은 하나 이상의 추가 특징을 포함할 수 있음을 이해해야 한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 융합 단백질은 세포질 국소화 서열, 핵 유출 서열과 같은 유출 서열, 또는 다른 국소화 서열, 뿐만 아니라 융합 단백질의 가용화, 정제 또는 검출에 유용한 서열 태그를 포함할 수 있다. 본원에서 제공되는 적합한 단백질 태그에는 비오틴 카르복실라제 운반 단백질(BCCP) 태그, myc-태그, 칼모듈린-태그, FLAG-태그, 헤마글루티닌(HA)-태그, 폴리히스티딘 태그(히스티딘 태그 또는 His-태그라고도 함), 말토스 결합 단백질(MBP)-태그, nus-태그, 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST)-태그, 녹색 형광 단백질(GFP)-태그, 티오레독신-태그, S-태그, Softag(예를 들어, Softag 1, Softag 3), strep-태그, 비오틴 리가제 태그, FlAsH 태그, V5 태그 및 SBP-태그가 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 추가의 적합한 서열은 당업자에게 명백할 것이다. 일부 실시양태에서, 융합 단백질은 하나 이상의 His 태그를 포함한다.
일부 실시양태에서, 융합 단백질은 표 23에 열거된 아미노산 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.7%, 또는 적어도 99.9% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 융합 단백질은 표 23에 열거된 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함한다. 일부 실시양태에서, 융합 단백질의 서열은 표 23에 열거된 아미노산 서열 중 어느 하나이다. 일부 실시양태에서, 융합 단백질은 서열 번호 2137, 2149, 2154, 2158, 2188, 2140, 40, 2146, 2152, 2156, 및 2160의 아미노산 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.7%, 또는 적어도 99.9% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 융합 단백질은 서열 번호 2137, 2149, 2154, 2158, 2188, 2140, 40, 2146, 2152, 2156, 및 2160의 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함한다. 일부 실시양태에서, 융합 단백질의 서열은 서열 번호 2137, 2149, 2154, 2158, 및 2188의 아미노산 서열 중 어느 하나이다
일부 실시양태에서, 융합 단백질은 표 23에 열거된 폴리뉴클레오티드 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.7%, 또는 적어도 99.9% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 융합 단백질은 표 23에 열거된 폴리뉴클레오티드 서열 중 어느 하나에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 융합 단백질은 표 23에 열거된 폴리뉴클레오티드 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.7%, 또는 적어도 99.9% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 발현된다. 일부 실시양태에서, 융합 단백질은 표 23에 열거된 폴리뉴클레오티드 서열 중 어느 하나에 의해 발현된다. 일부 실시양태에서, 융합 단백질은 서열 번호 2192, 2148, 2153, 2157, 2161, 2168, 2174, 2180, 2186, 2189, 2139, 2142, 2145, 2151, 2155, 2159, 2162, 2164, 2167, 2169, 2171, 2173, 2175, 2177, 2179, 2181, 2183, 2185, 2187, 및 2190의 폴리뉴클레오티드 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.7%, 또는 적어도 99.9% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 융합 단백질은 서열 번호 2192, 2148, 2153, 2157, 2161, 2168, 2174, 2180, 2186, 2189, 2139, 2142, 2145, 2151, 2155, 2159, 2162, 2164, 2167, 2169, 2171, 2173, 2175, 2177, 2179, 2181, 2183, 2185, 2187, 및 2190의 폴리뉴클레오티드 서열 중 어느 하나를 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 융합 단백질은 서열 번호 2192, 2148, 2153, 2157, 2161, 2168, 2174, 2180, 2186, 및 2189의 폴리뉴클레오티드 서열 중 어느 하나에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 융합 단백질은 서열 번호 2192, 2148, 2153, 2157, 2161, 2168, 2174, 2180, 2186, 2189, 2139, 2142, 2145, 2151, 2155, 2159, 2162, 2164, 2167, 2169, 2171, 2173, 2175, 2177, 2179, 2181, 2183, 2185, 2187, 2190, 2138, 2147, 2158, 또는 이들의 조합의 폴리뉴클레오티드 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.7%, 또는 적어도 99.9% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 발현된다. 일부 실시양태에서, 융합 단백질은 서열 번호 2192, 2148, 2153, 2157, 2161, 2168, 2174, 2180, 2186, 2189, 2139, 2142, 2145, 2151, 2155, 2159, 2162, 2164, 2167, 2169, 2171, 2173, 2175, 2177, 2179, 2181, 2183, 2185, 2187, 2190, 2138, 2147, 2158, 또는 이들의 조합의 폴리뉴클레오티드 서열 중 어느 하나를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 융합 단백질은 서열 번호 2192, 2148, 2153, 2157, 2161, 2168, 2174, 2180, 2186, 및 2189의 폴리뉴클레오티드 서열 중 어느 하나에 의해 발현된다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 2138, 2147, 2158, 또는 이들의 조합의 폴리뉴클레오티드 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.7%, 또는 적어도 99.9% 동일한 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 2138, 2147, 2158, 또는 이들의 조합의 폴리뉴클레오티드 서열 중 어느 하나를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 핵염기 에디터 ABE8.8은 하기 제공된 바와 같은 서열을 포함하는 융합 단백질을 포함한다:
Figure pct00006
일부 실시양태에서, 핵염기 에디터는 하기 제공된 바와 같은 폴리뉴클레오티드(본원에서 MA002로도 참조됨) 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질을 포함한다:
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
한 측면에서, 본원에서 제공된 핵염기 에디터 시스템은 가이드 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 가이드 폴리뉴클레오티드는 염기 에디터 융합 단백질에 결합하고 이와 복합체를 형성한다. 일부 실시양태에서, 가이드 폴리뉴클레오티드는 염기 에디터 융합 단백질이 표적 서열에서 변형을 수행하도록 지시한다. 가이드 폴리뉴클레오티드는 단일 핵산 서열 또는 2개의 별개의 핵산 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 가이드 폴리뉴클레오티드는 단일 가이드, 예를 들어, 단일 가이드 RNA이다. 일부 실시양태에서, 단일 가이드 RNA는 표적 서열과 혼성화할 수 있는 스페이서 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단일 가이드 RNA는 프로그램 가능한 DNA 결합 단백질, 예를 들어, 염기 에디터 융합 단백질의 Cas9 단백질에 결합하는 tracrRNA 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단일 가이드 RNA는 줄기 루프 구조, tracrRNA 서열, crRNA 서열, 동향(direct) 반복부 및/또는 안티-반복부를 포함한다. 일부 실시양태에서, 단일 가이드 RNA는 화학적 변형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 가이드 폴리뉴클레오티드는 "가이드 폴리뉴클레오티드" 섹션에 기재된 바와 같이, 본원에 제공된 가이드 폴리뉴클레오티드 중 어느 하나이다.
데아미나아제 도메인
폴리뉴클레오티드의 표적 뉴클레오티드 서열을 편집, 변형 또는 변경하기 위한 염기 에디터 시스템이 본원에 개시된다.
본원에서 제공되는 염기 에디터 시스템은 프로그램 가능한 DNA 결합 단백질 및 데아미나아제를 포함할 수 있다. 본원에 사용되는 바와 같이, 데아미나아제는 분자로부터 아민 기의 제거, 또는 예를 들어 가수분해를 통한 탈아미노화를 촉매하는 효소를 지칭할 수 있다. 일부 실시양태에서, 데아미나아제는 시티딘 데아미나아제이며, 시티딘(C)에서 우리딘(U)으로, 데옥시시티딘(dC)에서 데옥시우리딘(dU)으로, 또는 5-메틸-시티딘에서 티미딘(T, 5-메틸-U) 각각으로 탈아미노화를 촉매한다. 후속 DNA 복구 메커니즘은 문헌[Komor et al, Nature, Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage, 533, 420-424 (2016), 이는 그 전체가 본원에 참고로 포함됨]에 기술된 바와 같이 dU가 T로 대체되도록 보장한다. 일부 실시양태에서, 데아미나아제는 시토신 데아미나아제이며, 시토신에서 우라실(예를 들어, RNA에서) 또는 티민(예를 들어, DNA에서)으로의 전환을 촉매하고 촉진한다. 일부 실시양태에서, 데아미나아제는 아데노신 데아미나아제이며, 아데닌의 구아닌으로의 전환을 촉매하고 촉진한다. 일부 실시양태에서, 데아미나아제는 인간, 침팬지, 고릴라, 원숭이, 소, 개, 래트, 또는 마우스와 같은 유기체로부터의 자연 발생 데아미나아제이다. 일부 실시양태에서, 데아미나아제는 유기체로부터의 자연 발생 데아미나아제의 변이체이고, 변이체는 자연에서 발생하지 않는다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 데아미나아제 또는 데아미나아제 도메인은 유기체로부터의 자연 발생 데아미나아제에 대해 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75% 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 동일하다.
시티딘 데아미나아제(또는 시토신 데아미나아제)는 화학 반응 "시토신 + H20 -> 우라실 + NH3" 또는 "5-메틸-시토신 + H20 -> 티민 + NH3"을 촉매하는 효소를 포함한다. 유전자의 맥락에서, 이러한 뉴클레오티드 변화, 또는 돌연변이는 차례로 단백질의 아미노산 변화로 이어질 수 있으며, 이는 단백질의 기능, 예를 들어 기능 상실 또는 기능 획득에 영향을 미칠 수 있다. 후속 DNA 복구 메커니즘은 문헌[Komor et al. Nature, Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage, 533, 420-424 (2016), 이는 그 전체가 본원에 참고로 포함됨)에 기술된 바와 같이 DNA의 우라실 염기가 T로 대체되도록 보장한다.
시토신 데아미나아제의 하나의 예시적인 적합한 부류는 제어되고 유익한 방식으로 돌연변이유발을 개시하는 역할을 하는 11개의 단백질을 포함하는 시토신 데아미나아제의 아포지단백질 B mRNA 편집 복합체(APOBEC) 패밀리이다. 아포지단백질 B 편집 복합체 3(APOBEC3) 효소는 역전사된 바이러스 ssDNA에서 시토신의 탈아미노화를 통해 특정 HIV-1 균주에 대해 인간 세포를 보호한다. 이들 시토신 데아미나아제는 모두 촉매 활성을 위해 Zn-배위 모티프(His-X-Glu-X23_26-Pro-Cys-X2_4-Cys(서열 번호 29)) 및 결합된 물 분자를 필요로 한다. 글루탐산 잔기는 탈아미노화 반응에서 친핵성 공격을 위해 물 분자를 수산화아연으로 활성화시키는 역할을 한다. 각 패밀리 구성원은 hAID의 경우 WRC(W는 A 또는 T, R은 A 또는 G임) 또는 hAPOBEC3F의 경우 TTC와 같이 고유한 특정 "핫스팟"에서 우선적으로 탈아미노화한다. APOBEC3G의 촉매 도메인의 최근 결정 구조는 6개의 α-나선이 측면에 있는 5가닥 β-시트 코어를 포함하는 2차 구조를 밝혀냈으며, 이는 전체 패밀리에 걸쳐 보존되는 것으로 여겨진다. 활성 중심 루프는 ssDNA 결합과 "핫스팟" 식별을 모두 담당하는 것으로 나타났다. 이러한 효소의 과발현은 게놈 불안정성 및 암과 관련이 있어 서열 특이적 표적화의 중요성을 강조한다. 또 다른 적합한 시토신 데아미나아제는 활성화 유도 시티딘 데아미나아제(AID)이며, 이는 전사 의존적, 가닥 편향 방식으로 ssDNA의 시토신을 우라실로 전환함으로써 항체의 성숙을 담당한다.
아데노신 데아미나아제(또는 아데닌 데아미나아제)는 각각 이노신 또는 데옥시이노신으로의 아데노신 또는 데옥시 아데노신의 가수분해적 탈아미노화를 촉매하는 효소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나아제는 데옥시리보핵산(DNA)에서 아데닌 또는 아데노신의 가수분해적 탈아미노화를 촉매한다. 본원에서 제공되는 아데노신 데아미나아제(예를 들어, 조작된 아데노신 데아미나아제, 진화된 아데노신 데아미나아제)는 박테리아와 같은 임의의 유기체로부터 유래될 수 있다. 일부 실시양태에서, 데아미나아제 또는 데아미나아제 도메인은 유기체로부터의 자연 발생 데아미나아제의 변이체이다. 일부 실시양태에서, 데아미나아제 또는 데아미나아제 도메인은 자연에서 발생하지 않는다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 데아미나아제 또는 데아미나아제 도메인은 자연 발생 데아미나아제에 대해 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75% 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 동일하다. 일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나아제는 박테리아, 예컨대 이. 콜라이, 에스. 아우레우스(S. aureus), 에스. 타이피(S. typhi), 에스. 푸트레파시엔스(S. putrefaciens), 에이치. 인플루엔자(H. influenza), 또는 씨. 크레센투스(C. crescentus)로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나아제는 TadA 데아미나아제이다. 일부 실시양태에서, TadA 데아미나아제는 이. 콜라이 TadA 데아미나아제이다. 일부 실시양태에서, TadA 데아미나아제는 단축된(trundcated) 이. 콜라이 TadA 데아미나아제이다. 예를 들어, 단축된 ecTadA는 전장 ecTadA에 비해 하나 이상의 N-말단 아미노산이 누락될 수 있다. 일부 실시양태에서, 단축된 ecTadA는 전장 ecTadA에 비해 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 6, 17, 18, 19 또는 20개의 N-말단 아미노산 잔기가 누락될 수 있다. 일부 실시양태에서, 단축된 ecTadA는 전장 ecTadA에 비해 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 6, 17, 18, 19 또는 20개의 C-말단 아미노산 잔기가 누락될 수 있다. 일부 실시양태에서, ecTadA 데아미나아제는 N-말단 메티오닌을 포함하지 않는다.
일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나아제는 서열 번호 1에 제시된 아미노산 서열 또는 본원에 제공된 임의의 아데노신 데아미나아제에 대해 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 본원에서 제공되는 아데노신 데아미나아제는 하나 이상의 돌연변이(예를 들어, 본원에서 제공되는 임의의 돌연변이)를 포함할 수 있음을 이해해야 한다. 본 개시 내용은 특정 퍼센트 동일성을 가진 임의의 데아미나아제 도메인 및 본원에 기재된 이들의 임의의 돌연변이 또는 조합을 제공한다. 일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나아제는 서열 번호 1에 제시된 아미노산 서열 또는 본원에 제공된 임의의 아데노신 데아미나아제와 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 21, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50개 이상의 돌연변이를 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나아제는 서열 번호 1에 제시된 아미노산 서열 중 어느 하나 또는 본원에 제공된 임의의 아데노신 데아미나아제와 비교하여 적어도 5, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 110, 적어도 120, 적어도 130, 적어도 140, 적어도 150, 적어도 160, 또는 적어도 170개의 동일한 연속 아미노산 잔기를 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나아제는 ecTadA 서열 번호 1에서 D108X 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 돌연변이를 포함하며, 여기서 X는 야생형 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나아제는 서열 번호 1에서 D108G, D108N, D108V, D108A, 또는 D108Y 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 돌연변이를 포함한다. 그러나, 본원에 제공된 바와 같이 돌연변이될 수 있는 상동 아미노산 잔기를 확인하기 위해 추가의 데아미나아제가 유사하게 정렬될 수 있음을 이해해야 한다.
일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나아제는 ecTadA 서열 번호 1에서 A106X 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 돌연변이를 포함하며, 여기서 X는 야생형 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나아제는 서열 번호 1에서 A106V 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 돌연변이를 포함한다.
일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나아제는 서열 번호 1에서 E155X 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 돌연변이를 포함하며, 여기서 X의 존재는 야생형 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나아제는 서열 번호 1에서 E155D, E155G, 또는 E155V 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 돌연변이를 포함한다.
일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나아제는 서열 번호 1에서 D147X 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 돌연변이를 포함하며, 여기서 X의 존재는 야생형 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나아제는 서열 번호 1에서 D147Y 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 돌연변이를 포함한다.
본원에 제공된 임의의 돌연변이(예를 들어, 서열 번호 1의 ecTadA 아미노산 서열을 기반으로 함)는 에스. 아우레우스 TadA(saTadA) 또는 다른 아데노신 데아미나아제(예를 들어, 세균성 아데노신 데아미나아제)와 같은 다른 아데노신 데아미나아제 내로 도입될 수 있음을 이해해야 한다. ecTadA에서 돌연변이된 잔기와 어떻게 상동성을 갖는지는 당업자에게 명백할 것이다. 따라서, ecTadA에서 확인된 임의의 돌연변이는 상동 아미노산 잔기를 갖는 다른 아데노신 데아미나아제에서 만들어질 수 있다. 또한 본원에 제공된 임의의 돌연변이가 ecTadA 또는 다른 아데노신 데아미나아제에서 개별적으로 또는 임의의 조합으로 만들어질 수 있음을 이해해야 한다. 예를 들어, 아데노신 데아미나아제는 ecTadA 서열 번호 1에서 D108N, A106V, E155V, 및/또는 D147Y 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 돌연변이를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나아제는 ecTadA 서열 번호 1에서 하기 돌연변이 군(돌연변이 군은 ";"로 구분됨), 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 돌연변이를 포함한다: D108N 및 A106V; D108N 및 E155V; D108N 및 D147Y; A106V 및 E155V; A106V 및 D147Y; E155V 및 D147Y; D108N, A106V, 및 E55V; D108N, A106V, 및 D147Y; D108N, E55V, 및 D147Y; A106V, E55V, 및 D147Y; 및 D108N, A106V, E55V, 및 D147Y. 그러나, 본원에 제공된 상응하는 돌연변이의 임의의 조합이 아데노신 데아미나아제(예: ecTadA)에서 만들어질 수 있음을 이해해야 한다.
일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나아제는 서열 번호 1에서 H8X, T17X, L18X, W23X, L34X, W45X, R51X, A56X, E59X, E85X, M94X, I95X, V102X, F104X, A106X, R107X, D108X, K110X, M118X, N127X, A138X, F149X, M151X, R153X, Q154X, I156X, 및/또는 K157X 돌연변이 중 하나 이상은 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 하나 이상의 상응하는 돌연변이를 포함하며, 여기서 X의 존재는 야생형 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나아제는 서열 번호 1에서 H8Y, T17S, L18E, W23L, L34S, W45L, R51H, A56E, 또는 A56S, E59G, E85K, 또는 E85G, M94L, 1951, V102A, F104L, A106V, R107C, 또는 R107H, 또는 R107P, D108G, 또는 D108N, 또는 D108V, 또는 D108A, 또는 D108Y, K110l, M118K, N127S, A138V, F149Y, M151V, R153C, Q154L, I156D, 및/또는 K157R 돌연변이 중 하나 이상, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 하나 이상의 상응하는 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나아제는 서열 번호 1에 상응하는 돌연변이 중 하나 이상, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 하나 이상의 상응하는 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나아제는 서열 번호 1에 상응하는 표 23에 나타낸 임의의 구축물에서의 돌연변이 또는 돌연변이들, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 돌연변이 돌연변이들을 포함한다. 일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나아제는 서열 번호 1에서 H8X, D108X, 및/또는 N127X 돌연변이 중 하나 이상, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 하나 이상의 상응하는 돌연변이를 포함하며, 여기서 X는 임의의 아미노산의 존재를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나아제는 서열 번호 1에서 H8Y, D108N, 및/또는 N127S 돌연변이 중 하나 이상, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 하나 이상의 상응하는 돌연변이를 포함한다.
일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나아제는 서열 번호 1에서 H8X, R26X, M61X, L68X, M70X, A106X, D108X, A109X, N127X, D147X, R152X, Q154X, E155X, K161X, Q163X, 및/또는 T166X 돌연변이 중 하나 이상, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 하나 이상의 상응하는 돌연변이를 포함하며, 여기서 X는 야생형 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산의 존재를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나아제는 서열 번호 1에서 H8Y, R26W, M61I, L68Q, M70V, A106T, D108N, A109T, N127S, D147Y, R152C, Q154H 또는 Q154R, E155G 또는 E155V 또는 E155D, K161Q, Q163H, 및/또는 T166P 돌연변이 중 하나 이상, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 하나 이상의 상응하는 돌연변이를 포함한다.
일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나아제는 서열 번호 1에서 H8X, D108X, N127X, D147X, R152X, 및 Q154X로 이루어진 군으로부터 선택된 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 돌연변이 또는 돌연변이들을 포함하며, 여기서 X는 야생형 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산의 존재를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나아제는 서열 번호 1에 H8X, M61X, M70X, D108X, N127X, Q154X, E155X, 및 Q163X로 이루어진 군으로부터 선택된 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개의 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 돌연변이 또는 돌연변이들을 포함하며, 여기서 X는 야생형 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산의 존재를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나아제는 서열 번호 1에서 H8X, D108X, N127X, E155X, 및 T166X로 이루어진 군으로부터 선택된 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 돌연변이 또는 돌연변이들을 포함하며, 여기서 X는 야생형 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산의 존재를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나아제는 서열 번호 1에 H8X, A106X, D108X로 이루어진 군으로부터 선택된 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 돌연변이 또는 돌연변이들을 포함하며, 여기서 X는 야생형 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산의 존재를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나아제는 서열 번호 1에서 H8X, R126X, L68X, D108X, N127X, D147X, 및 E155X로 이루어진 군으로부터 선택된 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개의 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 돌연변이 또는 돌연변이들을 포함하며, 여기서 X는 야생형 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산의 존재를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나아제는 서열 번호 1에서 H8X, D108X, A109X, N127X, 및 E155X로 이루어진 군으로부터 선택된 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 돌연변이 또는 돌연변이들을 포함하며, 여기서 X는 야생형 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산의 존재를 나타낸다.
일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나아제는 서열 번호 1에서 H8Y, D108N, N127S, D147Y, R152C, 및 Q154H로 이루어진 군으로부터 선택된 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 돌연변이 또는 돌연변이들을 포함한다. 일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나아제는 서열 번호 1에서 H8Y, M61I, M70V, D108N, N127S, Q154R, E155G 및 Q163H로 이루어진 군으로부터 선택된 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개의 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 돌연변이 또는 돌연변이들을 포함한다. 일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나아제는 서열 번호 1에서 H8Y, D108N, N127S, E155V, 및 T166P로 이루어진 군으로부터 선택된 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 돌연변이 또는 돌연변이들을 포함한다. 일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나아제는 서열 번호 1에서 H8Y, A106T, D108N, N127S, E155D, 및 K161Q로 이루어진 군으로부터 선택된 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 돌연변이 또는 돌연변이들을 포함한다. 일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나아제는 서열 번호 1에서 H8Y, R126W, L68Q, D108N, N127S, D147Y, 및 E155V로 이루어진 군으로부터 선택된 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개의 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 돌연변이 또는 돌연변이들을 포함한다. 일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나아제는 서열 번호 1에서 H8Y, D108N, A109T, N127S, 및 E155G로 이루어진 군으로부터 선택된 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 돌연변이 또는 돌연변이들을 포함한다.
일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나아제는 서열 번호 1에 D108N, D108G, 또는 D108V 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나아제는 서열 번호 1에서 A106V 및 D108N 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나아제는 서열 번호 1에서에 R107C 및 D108N 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나아제는 서열 번호 1에서 H8Y, D108N, N127S, D147Y, 및 Q154H 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나아제는 서열 번호 1에서 H8Y, R24W, D108N, N127S, D147Y, 및 E155V 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나아제는 서열 번호 1에서 D108N, D147Y, 및 E155V 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나아제는 서열 번호 1에서 H8Y, D108N, 및 S127S 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나아제는 서열 번호 1에서 A106V, D108N, D147Y 및 E155V 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 돌연변이를 포함한다.
일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나아제는 서열 번호 1에서 S2X, H8X, I49X, L84X, H123X, N127X, I156X 및/또는 K160X 돌연변이 중 하나 이상, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 하나 이상의 상응하는 돌연변이를 포함하며, 여기서 X의 존재는 야생형 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나아제는 서열 번호 1에서 S2A, H8Y, I49F, L84F, H123Y, N127S, I156F 및/또는 K160S 돌연변이 중 하나 이상, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 하나 이상의 상응하는 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나아제는 서열 번호 1에서 하나 이상의 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 하나 이상의 상응하는 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나아제는 서열 번호 1에서 상응하는 클론 중 어느 하나의 돌연변이 또는 돌연변이들, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 돌연변이 또는 돌연변이들을 포함한다.
일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나아제는 L84X 돌연변이 아데노신 데아미나아제를 포함하며, 여기서 X는 야생형 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나아제는 서열 번호 1에서 L84F 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 돌연변이를 포함한다.
일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나아제는 ecTadA 서열 번호 1에서 H123X 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 돌연변이를 포함하며, 여기서 X는 야생형 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나아제는 서열 번호 1에서 H123Y 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 돌연변이를 포함한다.
일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나아제는 ecTadA 서열 번호 1에서 I157X 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 돌연변이를 포함하며, 여기서 X는 야생형 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나아제는 서열 번호 1에서 I157F 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 돌연변이를 포함한다.
일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나아제는 서열 번호 1에서 L84X, A106X, D108X, H123X, D147X, E155X, 및 I156X로 이루어진 군으로부터 선택된 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 돌연변이 또는 돌연변이들을 포함하며, 여기서 X는 야생형 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산의 존재를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나아제는 서열 번호 1에서 S2X, I49X, A106X, D108X, D147X, 및 E155X로 이루어진 군으로부터 선택된 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 돌연변이 또는 돌연변이들을 포함하며, 여기서 X는 야생형 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산의 존재를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나아제는 서열 번호 1에서 H8X, A106X, D108X, N127X, 및 K160X로 이루어진 군으로부터 선택된 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 돌연변이 또는 돌연변이들을 포함하며, 여기서 X는 야생형 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산의 존재를 나타낸다.
일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나아제는 서열 번호 1에서 L84F, A106V, D108N, H123Y, D147Y, E155V, 및 I156F로 이루어진 군으로부터 선택된 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 돌연변이 또는 돌연변이들을 포함한다. 일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나아제는 S2A, I49F, A106V, D108N, D147Y, 및 E155V로 이루어진 군으로부터 선택된 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나아제는 서열 번호 1에서 H8Y, A106T, D108N, N127S, 및 K160S로 이루어진 군으로부터 선택된 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 돌연변이 또는 돌연변이들을 포함한다. 일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나아제는 서열 번호 1에서 E25X, R26X, R107X, A142X, 및/또는 A143X 돌연변이 중 하나 이상, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 하나 이상의 상응하는 돌연변이를 포함하며, 여기서 X의 존재는 야생형 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나아제는 서열 번호 1에서 E25M, E25D, E25A, E25R, E25V, E25S, E25Y, R26G, R26N, R26Q, R26C, R26L, R26K, R107P, R07K, R107A, R107N, R107W, R107H, R107S, A142N, A142D, A142G, A143D, A143G, A143E, A143L, A143W, A143M, A143S, A143Q 및/또는 A143R 돌연변이 중 하나 이상, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 하나 이상의 상응하는 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나아제는 서열 번호 1에 상응하는 표 23에 제공된 돌연변이 중 하나 이상, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에 하나 이상의 상응하는 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나아제는 서열 번호 1에 상응하는 표 23에 나타낸 어느 하나의 돌연변이 또는 돌연변이들, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 돌연변이 또는 돌연변이들을 포함한다.
일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나아제는 ecTadA 서열 번호 1에서 E25X 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 돌연변이를 포함하며, 여기서 X는 야생형 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나아제는 서열 번호 1에서 E25M, E25D, E25A, E25R, E25V, E25S, 또는 E25Y 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 돌연변이를 포함한다.
일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나아제는 ecTadA 서열 번호 1에서 R26X 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 돌연변이를 포함하며, 여기서 X는 야생형 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나아제는 서열 번호 1에서 R26G, R26N, R26Q, R26C, R26L, 또는 R26K 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 돌연변이를 포함한다.
일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나아제는 ecTadA 서열 번호 1에서 R107X 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 돌연변이를 포함하며, 여기서 X는 야생형 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나아제는 서열 번호 1에서 R107P, R107K, R107A, R107N, R107W, R107H, 또는 R107S 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 돌연변이를 포함한다.
일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나아제는 ecTadA 서열 번호 1에서 A142X 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 돌연변이를 포함하며, 여기서 X는 야생형 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나아제는 서열 번호 1에서 A142N, A142D, A142G 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 돌연변이를 포함한다.
일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나아제는 ecTadA 서열 번호 1에서 A143X 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 돌연변이를 포함하며, 여기서 X는 야생형 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나아제는 서열 번호 1에서 A143D, A143G, A143E, A143L, A143W, A143M, A143S, A143Q 및/또는 A143R 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 돌연변이를 포함한다.
일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나아제는 서열 번호 1에서 H36X, N37X, P48X, I49X, R51X, M70X, N72X, D77X, E134X, S146X, Q154X, K157X, 및/또는 K161X 돌연변이 중 하나 이상, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 하나 이상의 상응하는 돌연변이를 포함하며, 여기서 X의 존재는 야생형 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나아제는 서열 번호 1에서 H36L, N37T, N37S, P48T, P48L, I49V, R51H, R51L, M70L, N72S, D77G, E134G, S146R, S146C, Q154H, K157N, 및/또는 K161T 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 하나 이상의 상응하는 돌연변이를 포함한다.
일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나아제는 ecTadA 서열 번호 1에서 H36X 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 돌연변이를 포함하며, 여기서 X는 야생형 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나아제는 서열 번호 1에서 H36L 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나아제는 ecTadA 서열 번호 1에서 N37X 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 돌연변이를 포함하며, 여기서 X는 야생형 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나아제는 서열 번호 1에서 N37T, 또는 N37S 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 돌연변이를 포함한다.
일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나아제는 ecTadA 서열 번호 1에서 P48X 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 돌연변이를 포함하며, 여기서 X는 야생형 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나아제는 서열 번호 1에서 P48T, 또는 P48L 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 돌연변이를 포함한다.
일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나아제는 ecTadA 서열 번호 1에서 R51X 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 돌연변이를 포함하며, 여기서 X는 야생형 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나아제는 서열 번호 1에서 R51H, 또는 R51L 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 돌연변이를 포함한다.
일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나아제는 ecTadA 서열 번호 1에서 S146X 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 돌연변이를 포함하며, 여기서 X는 야생형 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나아제는 서열 번호 1에서 S146R, 또는 S146C 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 돌연변이를 포함한다.
일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나아제는 ecTadA 서열 번호 1에서 K157X 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 돌연변이를 포함하며, 여기서 X는 야생형 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나아제는 서열 번호 1에서 K157N 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 돌연변이를 포함한다.
일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나아제는 ecTadA 서열 번호 1에서 P48X 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 돌연변이를 포함하며, 여기서 X는 야생형 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나아제는 서열 번호 1에서 P48S, P48T, 또는 P48A 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 돌연변이를 포함한다.
일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나아제는 ecTadA 서열 번호 1에서 A142X 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 돌연변이를 포함하며, 여기서 X는 야생형 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나아제는 서열 번호 1에서 A142N 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 돌연변이를 포함한다.
일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나아제는 ecTadA 서열 번호 1에서 W23X 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 돌연변이를 포함하며, 여기서 X는 야생형 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나아제는 서열 번호 1에서 W23R, 또는 W23L 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 돌연변이를 포함한다.
일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나아제는 ecTadA 서열 번호 1에서 R152X 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 돌연변이를 포함하며, 여기서 X는 야생형 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나아제는 서열 번호 1에서 R152P, 또는 R52H 돌연변이, 또는 또 다른 아데노신 데아미나아제에서 상응하는 돌연변이를 포함한다.
추가적인 아데노신 데아미나아제 돌연변이 및 변이체가 특허 출원 WO2018119354에 기술되어 있으며, 이는 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
본 출원에서 유용한 추가의 아데노신 데아미나아제는 당업자에게 명백할 것이며 본 개시 내용의 범위 내에 있다. 예를 들어, 아데노신 데아미나아제는 AD AT의 상동체일 수 있다. 예시적인 AD AT 상동체는 제한 없이 다음을 포함한다:
스태필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) TadA:
Figure pct00010
바실러스 섭틸러스(Bacillus subtilis) TadA:
Figure pct00011
살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium)(에스. 타이피뮤리움) TadA:
Figure pct00012
쉬와넬라 푸트레파시엔스(Shewanella putrefaciens)(에스. 푸트레파시엔스) TadA:
Figure pct00013
헤모필루스 인플루엔제 F3031 (에이치. 인플루엔제) TadA:
Figure pct00014
카울로박터 크레센투스(Caulobacter crescentus) (씨. 크레센투스) TadA:
Figure pct00015
지오박터 설퍼레두센스(Geobacter sulfurreducens)(지. 설퍼레두센스) TadA:
Figure pct00016
일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나 아제는 표 23에 열거된 아미노산 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.7%, 또는 적어도 99.9% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나아제는 표 23에 열거된 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함한다. 일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나아제의 서열은 표 23에 열거된 아미노산 서열 중 어느 하나이다. 일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나아제는 서열 번호 2137, 2149, 2154, 2158, 2188, 2140, 40, 2146, 2152, 2156, 및 2160의 아미노산 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.7%, 또는 적어도 99.9% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나아제는 서열 번호 2137, 2149, 2154, 2158, 2188, 2140, 40, 2146, 2152, 2156, 및 2160의 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함한다. 일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나아제의 서열은 서열 번호 2137, 2149, 2154, 2158, 및 2188의 아미노산 서열 중 어느 하나이다.
일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나아제는 표 23에 열거된 폴리뉴클레오티드 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.7%, 또는 적어도 99.9% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나아제는 표 23에 열거된 폴리뉴클레오티드 서열 중 어느 하나에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나아제는 표 23에 열거된 폴리뉴클레오티드 서열 중 어느 하나와 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.7%, 또는 적어도 99.9% 동일한 폴리뉴클레오티드에 의해 발현된다. 일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나아제는 표 23에 열거된 서열 중 어느 하나에 의해 발현된다. 일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나아제는 서열 번호 2192, 2148, 2153, 2157, 2161, 2168, 2174, 2180, 2186, 2189, 2139, 2142, 2145, 2151, 2155, 2159, 2162, 2164, 2167, 2169, 2171, 2173, 2175, 2177, 2179, 2181, 2183, 2185, 2187, 및 2190의 폴리뉴클레오티드 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.7%, 또는 적어도 99.9% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나아제는 서열 번호 2192, 2148, 2153, 2157, 2161, 2168, 2174, 2180, 2186, 2189, 2139, 2142, 2145, 2151, 2155, 2159, 2162, 2164, 2167, 2169, 2171, 2173, 2175, 2177, 2179, 2181, 2183, 2185, 2187, 및 2190의 폴리뉴클레오티드 서열 중 어느 하나를 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나아제는 서열 번호 2192, 2148, 2153, 2157, 2161, 2168, 2174, 2180, 2186, 및 2189의 폴리뉴클레오티드 서열 중 어느 하나에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나아제는 서열 번호 2192, 2148, 2153, 2157, 2161, 2168, 2174, 2180, 2186, 2189, 2139, 2142, 2145, 2151, 2155, 2159, 2162, 2164, 2167, 2169, 2171, 2173, 2175, 2177, 2179, 2181, 2183, 2185, 2187, 2190, 2138, 2147, 2158, 또는 이들의 조합의 폴리뉴클레오티드 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.7%, 또는 적어도 99.9% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 발현된다. 일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나아제는 서열 번호 2192, 2148, 2153, 2157, 2161, 2168, 2174, 2180, 2186, 2189, 2139, 2142, 2145, 2151, 2155, 2159, 2162, 2164, 2167, 2169, 2171, 2173, 2175, 2177, 2179, 2181, 2183, 2185, 2187, 2190, 2138, 2147, 2158, 또는 이들의 조합의 폴리뉴클레오티드 서열 중 어느 하나를 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나아제는 서열 번호 2192, 2148, 2153, 2157, 2161, 2168, 2174, 2180, 2186, 및 2189의 폴리뉴클레오티드 서열 중 어느 하나에 의해 발현된다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 2138, 2147, 2158, 또는 이들의 조합의 폴리뉴클레오티드 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.7%, 또는 적어도 99.9% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 2138, 2147, 2158, 또는 이들의 조합의 폴리뉴클레오티드 서열 중 어느 하나를 추가로 포함한다.
프로그램 가능한 DNA 결합 단백질
게놈 내의 임의의 원하는 뉴클레오티드 서열 내 DNA 서열에 결합하는 것을 목표로 하도록 프로그램될 수 있는 프로그램 가능한 DNA 결합 단백질이 본원에서 제공된다. DNA 결합 단백질이 원하는 뉴클레오티드 서열에 결합하도록 프로그래밍하기 위해, DNA 결합 단백질, 예를 들어, 징크 핑거 DNA 결합 도메인, 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN), CRISPR-Cas9 단백질, 또는 전사 활성화제 유사 이펙터 단백질(TALE)은 그의 결합 특이성을 변경하도록 변형될 수 있다. ZFN은 징크 핑거 DNA 결합 도메인을 DNA 절단 도메인에 융합하여 생성된 인공 제한 효소이다. 징크 핑거 도메인은 원하는 특정 DNA 서열을 표적화하도록 조작될 수 있으며 이를 통해 징크 핑거가 복잡한 게놈 내에서 고유한 서열에 결합할 수 있다. 전사 활성화 인자 유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN)는 DNA의 특정 서열을 절단하도록 조작될 수 있는 조작된 제한 효소이다. 이들은 TAL 이펙터 DNA 결합 도메인을 뉴클레아제 도메인(예를 들어, Fokl)에 융합하여 만들어진다. 전사 활성화 인자 유사 이펙터(TALE)는 임의의 원하는 DNA 서열에 실질적으로 결합하도록 조작될 수 있다. ZFN 및 TALE를 프로그래밍하는 방법은 당업자에게 익숙하다. 예를 들어, 이러한 방법은 문헌[Maeder, et al, Mol. Cell 31 (2): 294-301, 2008; Carroll et al, Genetics Society of America, 188 (4): 773-782, 2011; Miller et al., Nature Biotechnology 25 (7): 778-785, 2007; Christian et al, Genetics 186 (2): 757-61, 2008; Li et al, Nucleic Acids Res. 39 (1): 359-372, 2010; 및 Moscou et al, Science 326 (5959): 1501, 2009, 이들 각각은 본원에 참고로 포함됨]에 기술되어 있다.
본원에서 제공되는 염기 에디터 시스템 내 CRISPR/Cas 시스템 또는 Cas 단백질은 리보핵산 단백질 복합체를 비롯한 클래스 1 또는 클래스 2 시스템 구성요소를 포함할 수 있다. 클래스 2 Cas 뉴클레아제 단백질 패밀리는 DNA 엔도뉴클레아제 활성을 갖는 효소이며, 본원에 추가로 기재된 바와 같이 적절한 가이드 RNA를 설계함으로써 원하는 핵산 표적을 절단하도록 지시될 수 있다. 클래스 2 CRISPR/Cas 시스템 구성요소는 II형, IIA형, IIB형, IIC형, V형 또는 VI형 시스템에서 유래될 수 있다. 클래스 2 Cas 뉴클레아제에는 예를 들어 Cas9(Csn1 또는 Csx12로도 알려짐), Csn2, Cas4, Cas12a(Cpf1), Cas12b(C2c1), Cas12c(C2c3), Cas13a(C2c2), Cas13b, Cas13c, 및 Cas13d 단백질이 포함된다. 일부 실시양태에서, Cas 단백질은 II형 CRISPR/Cas 시스템으로부터 유래되며, 즉 CRISPR/Cas9 시스템으로부터의 Cas9 단백질이거나, V형 CRISPR/Cas 시스템으로부터 유래되며, 예를 들어 Cas12a 단백질이다. 일부 실시양태에서, Cas 단백질은 클래스 2 CRISPR/Cas 시스템으로부터 유래되며, 즉 단일 단백질 Cas 뉴클레아제, 예컨대 Cas9 단백질 또는 Cas12a 단백질이다.
Cas 단백질의 다른 비제한적인 예는 Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas10, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx1S, Csf1, Csf2, CsO, Csf4, Cpf1, Cas9HiFi, 이들의 상동체, 또는 이들의 변형된 버전을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, DNA에 결합할 수 있는 가이드 뉴클레오티드 서열 프로그램 가능한 DNA 결합 단백질 또는 RNA 가이드 프로그램 가능한 DNA 결합 단백질이 본원에 제공되며, 그의 표적 DNA 서열에 대한 결합은 가이드 뉴클레오티드 서열에 의해 매개된다. 따라서, 가이드 뉴클레오티드 서열 프로그램 가능한 DNA 결합 단백질은 가이드 뉴클레오티드 서열에 결합하는 것으로 이해된다. 가이드 뉴클레오티드는 표적 서열에 상보적이고 DNA 결합 단백질을 표적 서열로 안내할 수 있는 RNA 또는 DNA 분자(예를 들어, 단일 가닥 DNA 또는 ssDNA 분자)일 수 있다. 이와 같이, 가이드 뉴클레오티드 서열 프로그램 가능한 DNA 결합 단백질은 RNA 프로그램 가능한 DNA 결합 단백질(예를 들어, Cas9 단백질), 또는 ssDNA 프로그램 가능한 DNA 결합 단백질(예를 들어, Argonaute 단백질)일 수 있다. "프로그램 가능한"은 DNA 결합 단백질이 가이드 뉴클레오티드가 표적화하는 임의의 DNA 서열에 결합하도록 프로그램될 수 있음을 의미한다. 예시적인 가이드 뉴클레오티드 서열 프로그램 가능한 DNA 결합 단백질은 Cas9(예를 들어, dCas9 및 nCas9), saCas9(예를 들어, saCas9d, saCas9d, saKKH Cas9) CasX, CasY, Cpf1, C2c1, C2c2, C2c3, Argonaute, 및 본원에 기재된 임의의 다른 적합한 단백질, 또는 이들의 변이체를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 가이드 뉴클레오티드 서열은 단일 뉴클레오티드 분자로 존재하고 2개의 도메인 (1) 표적 핵산에 대한 상동성을 공유하(고, 예를 들어, 가이드 뉴클레오티드 서열 프로그램 가능한 DNA결합 단백질의 결합을 지시하)는 도메인; 및 (2) 가이드 뉴클레오티드 서열 프로그램 가능한 DNA 결합 단백질에 결합하는 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 도메인 (1)은 스페이서 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 도메인 (2)는 tracrRNA 서열로 지칭된다. 일부 실시양태에서, 도메인 (2)는 tracrRNA로 공지된 서열에 상응하고, 줄기-루프 구조를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 도메인 (2)는 문헌[Jinek et al., Science 337:816-821(2012), 이는 본원에 참고로 포함됨]에 제공된 바와 같은 tracrRNA와 동일하거나 상동성이다. gRNA(예를 들어, 도메인 2를 포함하는 것들)의 다른 예는 미국 특허 출원 공보 US20160208288 및 U.S. 특허 출원 공보 US20160200779에서 찾을 수 있으며, 이들 각각은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
부위 특이적 절단(예를 들어, 게놈을 변형하기 위해)을 위해 Cas9와 같은 가이드 뉴클레오티드 서열-프로그램 가능한 DNA 결합 단백질을 사용하는 방법은 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, Cong, L. et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science 339, 819-823 (2013); Mali, P. et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science 339, 823-826 (2013); Hwang, W.Y. et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nature biotechnology 31, 227-229 (2013); Jinek, M. et al. RNA-programmed genome editing in human cells. eLife 2, e00471 (2013); Dicarlo, J.E. et al. Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems. Nucleic acids research (2013); Jiang, W. et al. RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems. Nature biotechnology 31, 233-239 (2013)를 참조하며, 이들 각각은 본원에 참고로 포함됨).
CRISPR은 이동성 유전 요소(바이러스, 전이성 요소 및 접합 플라스미드)에 대한 보호를 제공하는 적응 면역 시스템이다. CRISPR 클러스터는 스페이서, 선행 이동 요소에 상보적인 서열, 및 표적 침입 핵산을 포함한다. CRISPR/Cas 시스템은 DNA(예를 들어, 표적 DNA 서열) 및 뉴클레아제 기능성(예를 들어, 2개의 뉴클레아제 도메인)을 갖는 Cas 단백질(예를 들어, Cas9)에 결합하는 비코딩 RNA 분자(예를 들어, 가이드 RNA)를 포함한다. 예를 들어 문헌[Sander, et al., Nature Biotechnology, 32:347-355(2014)]을 참조하며, 또한 예를 들어 문헌[Hsu, et al., Cell 157(6):1262-1278 (2014)]을 참조한다. CRISPR 시스템의 일반적인 메커니즘과 최근의 발전은 문헌[Cong, et al., Science, 339(6121): 819-823 (2013); Fu, et al., Nature Biotechnology, 31, 822-826 (2013); Chu, et al., Nature Biotechnology 33, 543-548 (2015); Shmakov, et al., Molecular Cell, 60, 1-13 (2015); Makarova, et al., Nature Reviews Microbiology, 13, 1-15 (2015)]에 논의되어 있다. CRISPR/Cas 시스템은 표적 DNA의 부위 특이적 절단을 도입하는 데 사용될 수 있다. 부위 특이적 절단을 위한 위치는 1) 가이드 RNA(gRNA)와 표적 DNA(프로토스페이서) 사이의 염기 페어링 상보성과 2) 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)라고 하는 표적 DNA 내 짧은 모티프에 의해 결정된다. CRISPR/Cas 시스템(예를 들어, II형 CRISPR/Cas 시스템)은 예를 들어 표적 유전자가 파괴되거나 돌연변이된 조작된 세포를 생성하는 데 사용될 수 있다. Cas 효소(예를 들어, Cas9)를 사용하여 DNA 절단을 촉매할 수 있다. Cas9 단백질(예를 들어, 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes) Cas9 또는 임의의 밀접하게 연관된 Cas9)은 가이드 서열(예를 들어, gRNA)의 약 20개 뉴클레오티드에 혼성화하고 표적 서열 다음에 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)를 갖는 표적 부위 서열에서 이중 가닥 파손을 생성하는 효소 작용을 유도할 수 있다.
CRISPR/Cas 시스템은 리보핵산 단백질 복합체를 포함한 클래스 1 또는 클래스 2 시스템 구성요소를 포함한다. 클래스 2 Cas 뉴클레아제 단백질 패밀리는 DNA 엔도뉴클레아제 활성을 갖는 효소이며, 본원에 추가로 기재된 바와 같이 적절한 가이드 RNA를 설계함으로써 원하는 핵산 표적을 절단하도록 지시될 수 있다. 클래스 2 CRISPR/Cas 시스템 구성요소는 II형, IIA형, IIB형, IIC형, V형 또는 VI형 시스템으로부터 유래할 수 있다. 클래스 2 Cas 뉴클레아제에는 예를 들어 Cas9(Csn1 또는 Csx12로도 알려짐), Csn2, Cas4, Cas12a(Cpf1), Cas12b(C2c1), Cas12c(C2c3), Cas13a(C2c2), Cas13b, Cas13c, 및 Cas13d 단백질이 포함된다. 일부 실시양태에서, Cas 단백질은 II형 CRISPR/Cas 시스템으로부터 유래되며, 즉 CRISPR/Cas9 시스템으로부터의 Cas9 단백질이거나, V형 CRISPR/Cas 시스템으로부터 유래되며, 예를 들어 Cas12a 단백질이다. 일부 실시양태에서, Cas 단백질은 클래스 2 CRISPR/Cas 시스템으로부터 유래되며, 즉 단일 단백질 Cas 뉴클레아제, 예컨대 Cas9 단백질 또는 Cas12a 단백질이다.
Cas 단백질의 다른 비제한적인 예는 Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas10, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx1S, Csf1, Csf2, CsO, Csf4, Cpf1, Cas9HiFi, 이들의 상동체, 또는 이들의 변형된 버전을 포함할 수 있다.
본원에서 제공되는 염기 에디터 시스템은 Cas9 또는 Cas9 뉴클레아제를 포함할 수 있다. Cas9 단백질 또는 Cas9 뉴클레아제는 Cas9 단백질, 이의 단편 또는 변이체를 포함하는 RNA 가이드 뉴클레아제를 지칭한다. Cas9 뉴클레아제는 때때로 casnl 뉴클레아제 또는 CRISPR(클러스터된 규칙적으로 간격을 두고 있는 짧은 회문 반복체) 관련 뉴클레아제라고도 한다. CRISPR은 이동성 유전 요소(바이러스, 전이 요소 및 접합 플라스미드)에 대한 보호를 제공하는 적응 면역 시스템이다. CRISPR 클러스터는 스페이서, 선행 이동 요소에 상보적인 서열, 및 표적 침입 핵산을 포함한다. CRISPR 클러스터는 전사되어 CRISPR RNA(crRNA)로 처리된다. II형 CRISPR 시스템에서 pre-crRNA의 올바른 처리에는 트랜스 코딩된 작은 RNA(tracrRNA), 내인성 리보뉴클레아제 3(rnc) 및 Cas9 단백질이 필요하다. tracrRNA는 pre-crRNA의 리보뉴클레아제 3-지원 처리를 위한 가이드로서 역할을 한다. 후속적으로, Cas9/crRNA/tracrRNA는 스페이서에 상보적인 선형 또는 원형 dsDNA 표적을 엔도뉴클레오절단 방식으로 절단한다. crRNA에 상보적이지 않은 표적 가닥은 먼저 엔도뉴클레오절단 방식으로 절단된 다음 3'-5' 엑소뉴클레오절단 방식으로 트리밍된다. 자연에서, DNA 결합 및 절단에는 일반적으로 단백질과 두 RNA 모두가 필요하다. 그러나, 단일 가이드 RNA("sgRNA", 또는 간단히 "gRNA")는 crRNA 및 tracrRNA 둘 모두의 측면을 단일 RNA 종으로 통합하도록 조작될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Jinek et al., Science 337:816-821(2012), 이는 그 전체가 본원에 참고로 포함됨]을 참조한다.
용어 "Cas9"는 Cas9 단백질, 또는 이의 단편(예를 들어, Cas9의 활성, 불활성 또는 부분 활성 DNA 절단 도메인, 및/또는 Cas9의 gRNA 결합 도메인을 포함하는 단백질)을 포함하는 RNA 가이드 뉴클레아제를 지칭한다. Cas9 뉴클레아제는 또한 Casnl 뉴클레아제 또는 CRISPR(클러스터된 규칙적으로 간격을 두고 있는 짧은 회문 반복체) 관련 뉴클레아제라고도 한다. Cas9는 야생형의 예시적인 Cas9 폴리펩티드(예를 들어, 에스. 피오게네스의 Cas9)에 대해 적어도 또는 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 서열 동일성 및/또는 서열 유사성을 갖는 폴리펩티드를 지칭할 수 있다. Cas9는 야생형의 예시적인 Cas9 폴리펩티드(예를 들어, 에스. 피오게네스의 Cas9)에 대해 최대 또는 최대 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 서열 동일성 및/또는 서열 유사성을 갖는 폴리펩티드를 지칭할 수 있다. Cas9는 결실, 삽입, 치환, 변이, 돌연변이, 융합, 키메라 또는 이들의 임의의 조합과 같은 아미노산 변화를 포함할 수 있는 야생형 또는 변형된 형태의 Cas9 단백질을 지칭할 수 있다.
Cas9 뉴클레아제 서열 및 변이체 Cas9 오솔로그의 구조는 다양한 종에서 기술되었다. Cas9 단백질 또는 기타 구성요소가 유래될 수 있는 예시적인 종은 스트렙토코커스 피오게네스, 스트렙토코커스 써모필루스(Streptococcus thermophilus), 스트렙토코커스 종, 스태필로코커스 아우레우스, 리스테리아 이노쿠아(Listeria innocua), 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri), 프란시엘라 노비시다(Francisella novicida), 울리넬라 숙시노게네스(Wolinella succinogenes), 수테렐라 와즈워텐시스(Sutterella wadsworthensis), 감마 프로테오박테리움(Gamma proteobacterium), 나이세리아 메닝기티디스(Neisseria meningitidis), 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni), 파스퇴렐라 멀토시다(Pasteurella multocida), 피브로박터 숙시노게네스(Fibrobacter succinogenes), 로도스피릴룸 루브룸(Rhodospirillum rubrum), 노카르디옵시스 다손빌레이(Nocardiopsis dassonvillei), 스트렙토마이세스 프리스티네스피랄리스(Streptomyces pristinaespiralis), 스트렙토마이세스 비리도크로모게네스(Streptomyces viridochromogenes), 스트렙토마이세스 비리도크로모게네스, 스트렙토스포란지움 로세움(Streptosporangium roseum), 알리시클로바실러스 아시도칼다리우스(Alicyclobacillus acidocaldarius), 바실러스 슈도마이코이데스(Bacillus pseudomycoides), 바실러스 셀레니티레두센스(Bacillus selenitireducens), 엑시구오박테리움 시비리쿰(Exiguobacterium sibiricum), 락토바실러스 델브루엑키이(Lactobacillus delbrueckii), 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius), 락토바실러스 부크네리(Lactobacillus buchneri), 트레포네마 덴티콜라(Treponema denticola), 마이크로실라 마리나(Microscilla marina), 부르크홀데리알레스 박테리움(Burkholderiales bacterium), 폴라로모나스 나프탈레니보란스(Polaromonas naphthalenivorans), 폴라로모나스 종, 크로코스파에라 와트소니이(Crocosphaera watsonii), 시아노테세 종(Cyanothece sp.), 마이크로시스티스 에루지노사(Microcystis aeruginosa), 시네코코커스 종(Synechococcus sp.), 아세토할로비움 아라바티쿰(Acetohalobium arabaticum), 암모니펙스 데겐시이(Ammonifex degensii), 칼디셀룰로시럽터 베시이(Caldicellulosiruptor bescii), 칸디다투스 데술포루디스(Candidatus Desulforudis), 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum), 클로스트리디움 디피실리(Clostridium difficile), 피네골디아 마그나(Finegoldia magna), 나트라나에로비우스 써모필루스(Natranaerobius thermophilus), 펠로토마쿨룸 써모프로피오니쿰(Pelotomaculum thermopropionicum), 아시디티오바실러스 칼두스(Acidithiobacillus caldus), 아시디티오바실러스 페로옥시단스(Acidithiobacillus ferrooxidans), 알로크로마티움 비노숨(Allochromatium vinosum), 마리노박터 종(Marinobacter sp.), 니트로소코커스 할로필루스(Nitrosococcus halophilus), 니트로소코커스 와트소니(Nitrosococcus watsoni), 슈도알테로모나스 할로프란크티스(Pseudoalteromonas haloplanktis), 크테도노박터 라세미페르(Ktedonobacter racemifer), 메타노할로비움 에베스티가툼(Methanohalobium evestigatum), 아나바에나 바리아빌리스(Anabaena variabilis), 노둘라리아 스푸미게나(Nodularia spumigena), 노스톡 종(Nostoc sp.), 아트로스피라 막시마(Arthrospira maxima), 아트로스피라 플라텐시스(Arthrospira platensis), 아트로스피라 종, 린그비아 종(Lyngbya sp.), 마이크로콜레우스 크토노프라스테스(Microcoleus chthonoplastes), 오실라토리아 종(Oscillatoria sp.), 페트로토가 모빌리스(Petrotoga mobilis), 써모시포 아프리카누스(Thermosipho africanus), 스트렙토코커스 파스퇴리아누스(Streptococcus pasteurianus), 나이세리아 시네레아(Neisseria cinerea), 캄필로박터 라리(Campylobacter lari), 파르비바쿨룸 라바멘티보란스(Parvibaculum lavamentivorans), 코리네 박테리움 디프테리아(Coryne bacterium diphtheria), 또는 아카리오클로리스 마리나(Acaryochloris marina)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, Cas9 단백질은 스트렙토코커스 피오게네스로부터 유래한다. 일부 실시양태에서, Cas9 단백질은 스트렙토코커스 써모필루스로부터 유래할 수 있다. 일부 실시양태에서, Cas9 단백질은 스태필로코커스 아우레우스로부터 유래할 수 있다.
추가의 적합한 Cas9 뉴클레아제 및 서열은 본 개시 내용에 기반하여 당업자에게 명백할 것이며, 이러한 Cas9 뉴클레아제 및 서열은 문헌[Chylinski et al., (2013) RNA Biology 10:5, 726-737; 이는 본원에 참고로 포함됨]에 개시된 유기체 및 유전자좌로부터의 Cas9 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 야생형 Cas9는 스태필로코커스 피오게네스로부터의 Cas9(NCBI 참조 서열: NC_002737.2 (다음과 같은 뉴클레오티드 서열); 및 Uniprot 참조 서열: Q99ZW2 (다음과 같은 아미노산 서열)에 해당한다:
Figure pct00017
Figure pct00018
Figure pct00019
일부 실시양태에서, Cas9는 코리네박테리움 울세란스(Corynebacterium ulcerans)(NCBI Ref: NC_015683.1, NC_017317.1); 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheria)(NCBI Ref. NC 016782.1, NC_016786.1); 시피로플라스마 시르피디콜라(Spiroplasma syrphidicola)(NCBI Ref: NC_021284.1); 프레보텔라 이테르메디아(Prevotella intermedia)(NCBI Ref: NC_017861.1); 시피로플라스마 타이와넨스(Spiroplasma taiwanense)(NCBI Ref: NC_021846.1); 스트렙토코커스 이니에(Streptococcus iniae)(NCBI Ref: NC_021314.1); 벨리엘라 발티카(Belliella baltica)(NCBI Ref: NC_018010.1); 사이크로플렉수스 토르키스(Psychroflexus torquis)(NCBI Ref: NC_018721.1); 리스테리아 이노쿠아(Listeria innocua)(NCBI Ref: NP_472073.1), 캄필로박터 제주니 (NCBI Ref: YP_002344900.1) 또는 나이세리아 메닝기티디스 (NCBI Ref: YP_002342100.1)의 종으로부터의 Cas9 단백질이다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 염기 에디터는 뉴클레아제 활성이 감소 또는 제거된 프로그램 가능한 DNA 결합 단백질, 예를 들어 Cas 뉴클레아제를 포함한다. 예를 들어, Ca9 단백질은 뉴클레아제 불활성일 수 있거나 Cas9 닉카아제일 수 있다. 불활성 DNA 절단 도메인을 갖는 Cas9 단백질(또는 이의 단편)을 생성하는 방법은 공지되어 있다(예를 들어, Jinek et al., Science. 337:816-821(2012); Qi et al., (2013) Cell. 28; 152(5): 1173-83을 참조하며, 이들 각각은 그 전체가 본원에 참조로 포함됨). 예를 들어, Cas9의 DNA 절단 도메인은 HNH 뉴클레아제 서브도메인 및 RuvC1 서브도메인의 2개의 서브도메인을 포함하는 것으로 알려져 있다. HNH 서브도메인은 gRNA에 상보적인 가닥을 절단하는 반면 RuvC1 서브도메인은 비-상보적 가닥을 절단한다. 이러한 서브도메인 내의 돌연변이는 Cas9의 뉴클레아제 활성을 침묵시킬 수 있다. 예를 들어 돌연변이 D10A 및 H840A는 에스. 피오게네스 Cas9의 뉴클레아제 활성을 완전히 불활성화한다(Jinek et al., Science. 337:816-821(2012); Qi et al, Cell. 28;152(5):1173-83 (2013)). 본 개시 내용에 따라 사용하기에 적합한 Cas9 닉카아제는 활성 HNH 도메인과 불활성 RuvC 도메인을 가지며 gRNA에 의해 결합된 표적 DNA의 가닥(시티딘 탈아미노화에 의해 편집된 가닥의 반대 가닥임)만 절단할 수 있다. 본 개시 내용의 Cas9 닉카아제는 RuvC 도메인을 불활성화하는 돌연변이, 예를 들어 D10A 돌연변이를 포함할 수 있다. RuvC 도메인을 불활성화하는 임의의 돌연변이, 예를 들어 RuvC 도메인에서 삽입, 결실, 또는 단일 또는 다중 아미노산 치환이 Cas9 닉카아제에 포함될 수 있음을 이해해야 한다. 본원에 기재된 Cas9 닉카아제에서, RuvC 도메인이 불활성화되는 동안, HNH 도메인은 활성화된 상태로 유지된다. 따라서, Cas9 닉카아제는 RuvC 도메인을 불활성화하는 것(예를 들어, D10A) 이외의 돌연변이를 포함할 수 있지만, 이러한 돌연변이는 HNH 도메인의 활성에 영향을 미치지 않는다. 비제한적인 Cas9 닉카아제 예에서 위치 840의 히스티딘은 변경되지 않은 상태로 유지된다.
일부 실시양태에서, 뉴클레아제 불활성 Cas9는 아래에 제공된 dCas9(D10A 및 H840A)의 아미노산 서열을 포함한다:
Figure pct00020
일부 실시양태에서, Cas9 닉카아제는 다음과 같은 예시적인 촉매적 Cas9 닉카아제(nCas9)의 아미노산 서열을 포함한다:
Figure pct00021
Cas9를 불활성화하는 추가의 적합한 돌연변이는 본 개시 내용 및 당해 분야의 지식에 기반하여 당업자에게 명백할 것이며, 본 개시 내용의 범위 내에 있다. 이러한 추가의 예시적인 적합한 뉴클레아제 불활성 Cas9 도메인에는 D839A 및/또는 N863A(예를 들어, Prashant et al, Nature Biotechnology. 2013; 31(9): 833-838 참조, 이들은 본원에 참고로 포함됨), 또는 K603R(예를 들어, Chavez et al., Nature Methods 12, 326-328, 2015 참조, 이는 본원에 참고로 포함됨)가 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. Cas9, dCas9, 또는 Cas9 변이체는 또한 임의의 유기체로부터의 Cas9, dCas9, 또는 Cas9 변이체를 포함한다. 또한, 임의의 유기체로부터의 dCas9, Cas9 닉카아제, 또는 다른 적절한 Cas9 변이체가 본 개시 내용에 따라 사용될 수 있는 것으로 이해된다.
일부 실시양태에서, Cas9는 단세포 원핵 미생물의 역 및 계를 구성하는 고세균(예를 들어, 나노알케아(nanoarchaea)로부터의 Cas9를 지칭한다.
일부 실시양태에서, 프로그램 가능한 DNA 결합 단백질은 예를 들어 문헌[Burstein et al., "New CRISPR-Cas systems from uncultivated microbes" Cell Res. 2017 Feb 21. doi: 10.1038/cr.2017.21, 이의 전체 내용은 이로써 참고로 포함됨]에 기재된 CasX 또는 CasY, 또는 이의 변이체를 포함한다. 게놈 분석 메타게노믹스를 사용하여 생명체의 고세균 역에서 처음 보고된 Cas9를 포함하여 많은 CRISPR-Cas 시스템이 확인되었다. 이 다양한 Cas9 단백질은 활성 CRISPR-Cas 시스템의 일부로서 거의 연구되지 않은 나노알케아에서 발견되었다. 박테리아에서 이전에 알려지지 않은 두 시스템인 CRISPR-CasX와 CRISPR-CasY가 발견되었는데, 이는 현재까지 발견된 가장 컴팩트한 시스템 중 하나이다.
본 개시 내용의 일부 측면은 본원에 제공된 핵염기 에디터의 고충실도 Cas9 도메인을 제공한다. 일부 실시양태에서, 고충실도 Cas9 도메인은 상응하는 야생형 Cas9 도메인과 비교하여 Cas9 도메인과 DNA의 당-포스페이트 백본 사이의 정전기적 상호작용을 감소시키는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 조작된 Cas9 도메인이다. 특정 이론에 구속되기를 바라지 않고, DNA의 당-포스페이트 백본과의 정전기적 상호작용이 감소된 고충실도 Cas9 도메인은 오프 타겟 효과가 적을 수 있다. 일부 실시양태에서, Cas9 도메인은 Cas9 도메인과 DNA의 당-포스페이트 백본 사이의 회합을 감소시키는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, Cas9 도메인은 Cas9 도메인과 DNA의 당-포스페이트 백본 사이의 회합을 적어도 1%, 적어도 2%, 적어도 3%, 적어도 4%, 적어도 5%, 적어도l0%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 또는 그 이상 감소시키는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 임의의 Cas9 융합 단백질은 야생형 Cas9 아미노산 서열에서 넘버링된 바와 같이 N497X, R661X, Q695X, 및/또는 Q926X 돌연변이 중 하나 이상 또는 또 다른 Cas9에서 상응하는 아미노산을 포함하며, 여기서 X는 임의의 아미노산이다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 임의의 Cas9 또는 Cas9 융합 단백질은 야생형 Cas9 아미노산 서열에서 넘버링된 바와 같이 야생형 Cas9 서열에서 제공된 아미노산 서열의 N497A, R661A, Q695A, 및/또는 Q926A 돌연변이, 또는 상응하는 돌연변이 중 하나 이상 또는 또 다른 Cas9에서 상응하는 아미노산을 포함한다. 충실도가 높은 Cas9 도메인은 문헌[Kleinstiver, B.P., et al. "High-fidelity CRISPR-Cas9 nucleases with no detectable genome-wide off-target effects." Nature 529, 490-495 (2016); 및 Slaymaker, I.M., et al. "Rationally engineered Cas9 nucleases with improved specificity." Science 351, 84-88 (2015); 각각의 전체 내용은 본원에 참고로 포함됨]에 기술되었다.
본원에 제공된 임의의 염기 에디터, 예를 들어 본원에 제공된 임의의 아데노신 데아미나아제 염기 에디터는 본원에 기재된 바와 같은 Cas9 도메인을 변형하여 고충실도 염기 에디터를 생성함으로써 고충실도 염기 에디터, 예를 들어 고충실도 아데노신 염기 에디터로 전환될 수 있음을 이해해야 한다. 일부 실시양태에서, 고충실도 Cas9 도메인은 뉴클레아제 불활성 Cas9 도메인이다. 일부 실시양태에서, 고충실도 Cas9 도메인은 Cas9 닉카아제 도메인이다.
일부 실시양태에서, Cas 단백질은 예를 들어 문헌[Burstein et al., "New CRISPR-Cas systems from uncultivated microbes" Cell Res. 2017 Feb 21. doi: 10.1038/cr.2017.21, 이의 전체 내용은 이로써 참고로 포함됨]에 기재된 CasX 또는 CasY, 또는 이의 변이체를 포함한다. 게놈 분석 메타게노믹스를 사용하여 생명체의 고세균 역에서 처음 보고된 Cas9를 포함하여 많은 CRISPR-Cas 시스템이 확인되었다. 이 다양한 Cas9 단백질은 활성 CRISPR-Cas 시스템의 일부로 거의 연구되지 않은 나노알케아에서 발견되었다. 박테리아에서 이전에 알려지지 않은 두 시스템인 CRISPR-CasX와 CRISPR-CasY가 발견되었는데, 이는 현재까지 발견된 가장 컴팩트한 시스템 중 하나이다.
에스. 피오게네스 Cas9에 대한 대안은 포유동물 세포에서 절단 활성을 나타내는 Cpf1 패밀리의 RNA 가이드 엔도뉴클레아제를 포함할 수 있다. Cpf1 매개 DNA 절단은 Cas9 매개 DNA 절단과 상이한 짧은 3' 돌출부가 있는 이중 가닥 파손이다. Cpf1의 엇갈린 절단 패턴은 종래의 제한 효소 클로닝과 유사한 방향성 유전자 전달의 가능성을 열 수 있으며, 이는 유전자 편집의 효율성을 높일 수 있다. 상기에 기재된 Cas9 변이체 및 오솔로그와 마찬가지로 Cpf1은 CRISPR에 의해 표적화될 수 있는 부위의 수를 SpCas9가 선호하는 NGG PAM 부위가 없는 AT-풍부 영역 또는 AT-풍부 게놈으로 확장할 수도 있다.
일부 실시양태에서, Cas9 단백질은 표 23에 열거된 아미노산 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.7%, 또는 적어도 99.9% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, Cas9 단백질은 표 23에 열거된 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함한다. 일부 실시양태에서, Cas9 단백질의 서열은 표 23에 열거된 아미노산 서열 중 어느 하나이다. 일부 실시양태에서, Cas9 단백질은 서열 번호 2137, 2149, 2154, 2158, 2188, 2140, 40, 2146, 2152, 2156, 및 2160의 아미노산 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.7%, 또는 적어도 99.9% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, Cas9 단백질은 서열 번호 2137, 2149, 2154, 2158, 2188, 2140, 40, 2146, 2152, 2156, 및 2160의 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함한다. 일부 실시양태에서, Cas9 단백질의 서열은 서열 번호 2137, 2149, 2154, 2158, 및 2188의 아미노산 서열 중 어느 하나이다.
일부 실시양태에서, Cas9 단백질은 표 23에 열거된 폴리뉴클레오티드 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.7%, 또는 적어도 99.9% 동일한 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, Cas9 단백질은 표 23에 열거된 폴리뉴클레오티드 서열 중 어느 하나에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, Cas9 단백질은 표 23에 열거된 폴리뉴클레오티드 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.7%, 또는 적어도 99.9% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 발현된다. 일부 실시양태에서, Cas9 단백질은 표 23에 열거된 폴리뉴클레오티드 서열 중 어느 하나에 의해 발현된다. 일부 실시양태에서, Cas9 단백질은 서열 번호 2192, 2148, 2153, 2157, 2161, 2168, 2174, 2180, 2186, 2189, 2139, 2142, 2145, 2151, 2155, 2159, 2162, 2164, 2167, 2169, 2171, 2173, 2175, 2177, 2179, 2181, 2183, 2185, 2187, 및 2190의 폴리뉴클레오티드 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.7%, 또는 적어도 99.9% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, Cas9 단백질은 서열 번호 2192, 2148, 2153, 2157, 2161, 2168, 2174, 2180, 2186, 2189, 2139, 2142, 2145, 2151, 2155, 2159, 2162, 2164, 2167, 2169, 2171, 2173, 2175, 2177, 2179, 2181, 2183, 2185, 2187, 및 2190의 폴리뉴클레오티드 서열 중 어느 하나를 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, Cas9 단백질은 서열 번호 2192, 2148, 2153, 2157, 2161, 2168, 2174, 2180, 2186, 및 2189의 폴리뉴클레오티드 서열 중 어느 하나에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, Cas9 단백질은 서열 번호 2192, 2148, 2153, 2157, 2161, 2168, 2174, 2180, 2186, 2189, 2139, 2142, 2145, 2151, 2155, 2159, 2162, 2164, 2167, 2169, 2171, 2173, 2175, 2177, 2179, 2181, 2183, 2185, 2187, 2190, 2138, 2147, 2158, 또는 이들의 조합의 폴리뉴클레오티드 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.7%, 또는 적어도 99.9% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 발현된다. 일부 실시양태에서, Cas9 단백질은 서열 번호 2192, 2148, 2153, 2157, 2161, 2168, 2174, 2180, 2186, 2189, 2139, 2142, 2145, 2151, 2155, 2159, 2162, 2164, 2167, 2169, 2171, 2173, 2175, 2177, 2179, 2181, 2183, 2185, 2187, 2190, 2138, 2147, 2158, 또는 이들의 조합의 폴리뉴클레오티드 서열 중 어느 하나를 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, Cas9 단백질은 서열 번호 2192, 2148, 2153, 2157, 2161, 2168, 2174, 2180, 2186, 및 2189의 폴리뉴클레오티드 서열 중 어느 하나에 의해 발현된다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 2138, 2147, 2158, 또는 이들의 조합의 폴리뉴클레오티드 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.7%, 또는 적어도 99.9% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 2138, 2147, 2158, 또는 이들의 조합의 폴리뉴클레오티드 서열 중 어느 하나를 추가로 포함한다.
링커
본원에 제공된 염기 에디터는 염기 에디터의 하나 이상의 구성요소를 연결하는 링커를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 링커를 사용하여 본원에 기재된 임의의 단백질 또는 단백질 도메인을 연결할 수 있다. 링커는 공유 결합만큼 단순하거나, 많은 원자 길이의 중합체 링커일 수 있다. 특정 실시양태에서, 링커는 폴리펩티드이거나 아미노산을 기반으로 한다. 다른 실시양태에서, 링커는 펩티드와 유사하지 않다. 일부 실시양태에서, 링커는 탄소 결합, 이황화 결합, 탄소-헤테로원자 결합 등이다. 특정 실시양태에서, 링커는 아미드 결합의 탄소-질소 결합이다. 특정 실시양태에서, 링커는 환형 또는 비환형, 치환 또는 비치환, 분지형 또는 비분지형 지방족 또는 헤테로지방족 링커이다. 특정 실시양태에서, 링커는 중합체성(예를 들어, 폴리에틸렌, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리아미드, 폴리에스테르 등)이다. 특정 실시양태에서, 링커는 아미노알칸산의 단량체, 이량체 또는 중합체를 포함한다. 특정 실시양태에서, 링커는 아미노알칸산(예를 들어, 글리신, 에탄산, 알라닌, 베타-알라닌, 3-아미노프로판산, 4-아미노부탄산, 5-펜탄산 등)을 포함한다. 특정 실시양태에서, 링커는 아미노헥산산(Ahx)의 단량체, 이량체 또는 중합체를 포함한다. 특정 실시양태에서, 링커는 카르보시클릭 모이어티(예를 들어, 시클로펜탄, 시클로헥산)를 기반으로 한다. 다른 실시양태에서, 링커는 폴리에틸렌 글리콜 모이어티(PEG)를 포함한다. 다른 실시양태에서, 링커는 아미노산을 포함한다. 특정 실시양태에서, 링커는 펩티드를 포함한다. 특정 실시양태에서, 링커는 아릴 또는 헤테로아릴 모이어티를 포함한다. 특정 실시양태에서, 링커는 페닐 고리를 기반으로 한다. 링커는 펩티드로부터의 친핵체(예를 들어, 티올, 아미노)의 링커로의 부착을 용이하게 하는 작용화된 모이어티를 포함할 수 있다. 임의의 친전자체를 링커의 일부로 사용할 수 있다. 예시적인 친전자체는 활성화된 에스테르, 활성화된 아미드, 알킬 할라이드, 아릴 할라이드, 아실 할라이드, 및 이소티오시아네이트를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
일부 실시양태에서, 링커는 아미노산 또는 복수의 아미노산(예를 들어, 펩티드 또는 단백질)이다. 일부 실시양태에서, 링커는 결합(예를 들어, 공유 결합), 유기 분자, 기, 중합체, 또는 화학적 모이어티이다. 일부 실시양태에서, 링커는 5-100개 아미노산 길이, 예를 들어 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 30-35, 35-40, 40-45, 45-50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-100, 100-110, 110- 120, 120-130, 130-140, 140-150, 또는 150-200개 아미노산 길이이다. 더 길거나 더 짧은 링커도 고려된다. 일부 실시양태에서, 링커는 XTEN 링커라고도 하는 아미노산 서열 SGSETPGTSESATPES (서열 번호 17)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 아미노산 서열 SGGS를 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 (SGGS)n (서열 번호 41), (GGGS)n (서열 번호 42), (GGGGS)n (서열 번호 43), (G)n (서열 번호 44), (EAAAK)n (서열 번호 45), (GGS)n (서열 번호 46), SGSETPGTSESATPES (서열 번호 17), 또는 (XP)n (서열 번호 47) 모티프, 이들 중 임의의 조합을 포함하며, 여기서 n은 독립적으로 1 내지 30의 정수이고, X는 임의의 아미노산이다. 일부 실시양태에서, n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15이다. 일부 실시양태에서, 링커는 SGSETPGTSESATPES (서열 번호 17), SGGSSGSETPGTSESATPESSGGS (서열 번호 19)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 SGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGS (서열 번호 20)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 GGSGGSPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTE PSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGGSGGS (서열 번호 21)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 24개 아미노산 길이이다. 일부 실시양태에서, 링커는 아미노산 서열 SGGSSGGSSGSETPGTSESATPES (서열 번호 23)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 40개 아미노산 길이이다. 일부 실시양태에서, 링커는 아미노산 서열 SGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGSSGGSSGGS (서열 번호 24)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 64개 아미노산 길이이다. 일부 실시양태에서, 링커는 아미노산 서열 ㅊ (서열 번호 25)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는92개 아미노산 길이이다. 일부 실시양태에서, 링커는 아미노산 서열 PGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAP GTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATS (서열 번호 26)를 포함한다. 본원에 제공된 임의의 링커는 제1 아데노신 데아미나아제와 제2 아데노신 데아미나아제; 데아미나아제(예를 들어, 제1 또는 제2 아데노신 데아미나아제)와 RNA 가이드 프로그램 가능한 DNA 결합 단백질; RNA 가이드 프로그램 가능한 DNA 결합 단백질과 NLS; 또는 데아미나아제(예를 들어, 제1 또는 제2 아데노신 데아미나아제)와 NLS을 연결할 수 있음을 알아야한다.
특정 적용을 위한 데아미나아제 활성을 위한 최적의 길이를 달성하기 위해 데아미나아제(예를 들어, 조작된 ecTadA)와 RNA 가이드 프로그램 가능한 DNA 결합 단백질(예를 들어, Cas9 도메인) 사이, 및/또는 제1 아데노신 데아미나아제와 제2 아데노신 데아미나아제 사이에서 다양한 링커 길이 및 가요성이 사용될 수 있다(예를 들어, (GGGGS)n(서열 번호 22), (GGGGS)n(서열 번호 22) 및 (G)n 형태의 매우 가요성인 링커에서 (EAAAAK)n(서열 번호 48), (SGGS)n (서열 번호 49), 및 (XP)n 형태의 강성이 큰 링커의 범위). 일부 실시양태에서, n은 3 내지 30 사이의 임의의 정수이다. 일부 실시양태에서, n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15이다. 일부 실시양태에서, 링커는 (GGS)n(서열 번호 51) 모티프를 포함하며, 여기서 n은 1, 3, 또는 7이다.
프로토스페이서 인접 모티프
CRISPR 클러스터는 스페이서, 선행 이동 요소에 상보적인 서열, 및 표적 침입 핵산을 포함한다. CRISPR 클러스터는 전사되어 CRISPR RNA(crRNA)로 처리된다. 예를 들어, II형 CRISPR 시스템에서 pre-crRNA의 올바른 처리에는 트랜스 코딩된 작은 RNA(tracrRNA), 내인성 리보뉴클레아제 3(rnc) 및 Cas9 단백질이 필요하다. tracrRNA는 pre-crRNA의 리보뉴클레아제 3-지원 처리를 위한 가이드로서 역할을 한다. Cas9는 CRISPR 반복 서열에서 짧은 모티프(PAM 또는 프로토스페이서 인접 모티프)를 인식한다(예를 들어, "Complete genome sequence of an Ml strain of Streptococcus pyogenes." Ferretti et ah, J.J., McShan W.M., Ajdic D.J., Savic D.J., Savic G., Lyon K., Primeaux C, Sezate S., Suvorov A.N., Kenton S., Lai H.S., Lin S.P., Qian Y., Jia H.G., Najar F.Z., Ren Q., Zhu H., Song L., Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98:4658-4663(2001); "CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III." Deltcheva E., Chylinski K., Sharma CM., Gonzales K., Chao Y., Pirzada Z.A., Eckert M.R., Vogel J., Charpentier E., Nature 471:602-607(2011); 및 "A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity." Jinek M., Chylinski K., Fonfara I., Hauer M., Doudna J.A., Charpentier E. Science 337:816-821(2012)를 참조하며, 이들 각각의 전체 내용은 본원에 참고로 포함됨). Cas9 오솔로그는 에스. 피오게네스 및 에스. 써모필루스를 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 종에서 설명되었다.
본 개시 내용의 일부 측면은 프로그램된 DNA 결합 단백질 도메인, 예를 들어 PAM 특이성이 변경된 Cas9 도메인을 제공한다. 일부 실시양태에서, 에스. 피오게네스로부터 유래된 Cas9(spCas9)는 표준 NGG PAM 서열(여기서 "NGG"의 "N"은 아데닌(A), 티민(T), 구아닌(G), 또는 시토신(C)이고, G는 구아닌임)을 인식한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 염기 편집 융합 단백질은 PAM의 상류 대략 15개 염기인 4개 염기 영역(예를 들어, "탈아미노화 창") 내의 표적 핵염기를 탈아미노화함으로써 기능을 한다. 일부 실시양태에서, 탈아미노화 창은 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개 염기이다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 임의의 융합 단백질은 표준(예를 들어, NGG) PAM 서열을 함유하지 않는 뉴클레오티드 서열에 결합할 수 있는 Cas9 도메인을 함유할 수 있다. 비표준 PAM 서열에 결합하는 Cas9 도메인은 당업계에 기술되었으며 당업자에게 명백할 것이다. 예를 들어, 비표준 PAM 서열에 결합하는 Cas9 도메인은 문헌[Kleinstiver, B. P., et al., "Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificities" Nature 523, 481-485 (2015); and Kleinstiver, B. P., et ah, "Broadening the targeting range of Staphylococcus aureus CRISPR-Cas9 by modifying PAM recognition" Nature Biotechnology 33, 1293-1298 (2015); 각각의 전체 내용은 이로써 참고로 포함됨]에 기술되었다. 일부 실시양태에서, Cas9 도메인은 스태필로코커스 아우레우스로부터의 Cas9 도메인(SaCas9)이다. 일부 실시양태에서, SaCas9 도메인은 뉴클레아제 활성 SaCas9, 뉴클레아제 불활성 SaCas9(SaCas9d), 또는 SaCas9 닉카아제(SaCas9n)이다. 야생형 SaCas9 아미노산 서열은 아래에 제공된다:
Figure pct00022
일부 실시양태에서, SaCas9는 N579X 돌연변이, 또는 야생형 SaCas9 서열에서 넘버링된 바와 같이 임의의 아미노산 서열에서 상응하는 돌연변이를 포함하며, 여기서 X는 N을 제외한 임의의 아미노산이다. 일부 실시양태에서, SaCas9는 야생형 SaCas9 서열에서 넘버링된 바와 같이N579A돌연변이 또는 또 다른 SaCas9 단백질에서 상응하는 돌연변이를 포함한다.
일부 실시양태에서, SaCas9 도메인, 뉴클레아제 불활성 SaCas9 도메인, 또는 SaCas9 닉카아제 도메인은 비표준 PAM을 갖는 핵산 서열에 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, SaCas9 도메인, SaCas9d 도메인, 또는 SaCas9n 도메인은 NNGRRT PAM 서열을 갖는 핵산 서열에 결합할 수 있으며, 여기서 N = A, T, C, 또는 G이고, R = A 또는 G이다. 실시양태에서, SaCas9 도메인은 야생형 SaCas9 서열에서 넘버링된 바와 같이 E781X, N967X, 및 R1014X 중 하나 이상 또는 또 다른 SaCas9 단백질에서 상응하는 돌연변이를 포함하며, 여기서 X는 임의의 아미노산이다. 일부 실시양태에서, SaCas9 도메인은 야생형 SaCas9 서열에서 넘버링된 바와 같이 E781K, N967K, 및 R1014H 돌연변이 중 하나 이상 또는 또 다른 SaCas9 단백질에서 상응하는 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, SaCas9 도메인은 야생형 SaCas9 서열에서 넘버링된 바와 같이 E781K, N967K, 또는 R1014H 돌연변이 또는 또 다른 SaCas9 단백질에서 상응하는 돌연변이를 포함한다.
일부 실시양태에서, Cas9 도메인은 스트렙토코커스 피오게네스로부터의 Cas9 도메인(SpCas9)이다. 일부 실시양태에서, SpCas9 도메인은 뉴클레아제 활성 SpCas9, 뉴클레아제 불활성 SpCas9(SpCas9d), 또는 SpCas9 닉카아제(SpCas9n)이다. 일부 실시양태에서, SpCas9는 야생형 SpCas9 아미노산 서열에서 넘버링된 바와 같이 D10X 돌연변이 또는 또 다른 SapCas9 단백질에서 상응하는 돌연변이를 포함하며, 여기서 X는 D를 제외한 임의의 아미노산이다. 일부 실시양태에서, SpCas9는 야생형 SpCas9 아미노산 서열에서 넘버링된 바와 같이 D10A 돌연변이 또는 또 다른 SpCas9 단백질에서 상응하는 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, SpCas9 도메인, 뉴클레아제 불활성 SpCas9 도메인, 또는 SpCas9 닉카아제 도메인은 비-NGG PAM을 갖는 핵산 서열에 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, SpCas9 도메인, SpCas9 도메인, 뉴클레아제 불활성 SpCas9 도메인, 또는 SpCas9 닉카아제 도메인은 NGG, NGA, 또는 NGCG PAM 서열을 갖는 핵산 서열에 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, SpCas9 도메인은 야생형 SpCas9 아미노산 서열에서 넘버링된 바와 같이 D1135X, R1335X, 및 T1337X 돌연변이 중 하나 이상 또는 또 다른 SpCas9 단백질에서 상응하는 돌연변이를 포함하며, 여기서 X는 임의의 아미노산이다. 일부 실시양태에서, SpCas9 도메인은 야생형 SpCas9 아미노산 서열에서 넘버링된 바와 같이 D1135E, R1335Q, 및 T1337R 돌연변이 중 하나 이상 또는 또 다른 SpCas9 단백질에서 상응하는 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, SpCas9 도메인은 야생형 Cas9 아미노산 서열에서 넘버링된 바와 같은 D1134V, R1334Q, 및 T1336R 돌연변이 중 하나 이상, 또는 이들의 상응하는 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, SpCas9 도메인은 야생형 SpCas9 아미노산 서열에서 넘버링된 바와 같이 D1135V, R1335Q, 및 T1337R 돌연변이 또는 또 다른 SpCas9 단백질에서 상응하는 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, SpCas9 도메인은 야생형 SpCas9 아미노산 서열에서 넘버링된 바와 같이 D1135X, G1218X, R1335X, 및 T1337X 돌연변이 중 하나 이상 또는 또 다른 SpCas9 단백질에서 상응하는 돌연변이를 포함하며, 여기서 X는 임의의 아미노산이다. 일부 실시양태에서, SpCas9 도메인은 야생형 SpCas9 아미노산 서열에서 넘버링된 바와 같이 D1135V, G1218R, R1335Q, 및 T1337R 돌연변이 중 하나 이상 또는 또 다른 SpCas9 단백질에서 상응하는 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, SpCas9 도메인은 야생형 SpCas9 아미노산 서열에서 넘버링된 바와 같이 D1135V, G1218R, R1335Q, 및 T1337R 돌연변이 또는 또 다른 SpCas9 단백질에서 상응하는 돌연변이를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 임의의 융합 단백질의 Cas9 도메인은 본원에 제공된 Cas9 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공되는 염기 에디터는 특정 핵산(예를 들어, DNA 또는 RNA) 서열을 표적화하고 변형하는데 사용될 수 있는 RNA 가이드 프로그램 가능한 DNA 결합 단백질을 포함한다. 핵산 프로그램 가능한 DNA 결합 단백질은 Cas9(예를 들어, 뉴클레아제 불활성 Cas9 및 Cas9 닉카아제), CasX, CasY, Cas12a(Cpf1), Cas12b, C2c1, C2c2, C2C3, 및 Argonaute를 제한 없이 포함한다. Cas9와 상이한 PAM 특이성을 갖는 핵산 프로그램 가능한 DNA 결합 단백질의 한 예는 프로보텔라 및 프란시셀라 1(Cpf1)의 클러스터된 규칙적으로 간격을 두고 있는 짧은 회문 반복체이다. Cas9와 유사하게 Cpf1도 클래스 2 CRISPR 이펙터이다. Cpf1은 Cas9와 구별되는 특징으로 강력한 DNA 간섭을 매개하는 것으로 나타났다. Cpf1은 tracrRNA가 없는 단일 RNA 가이드 엔도뉴클레아제이며 T 풍부 프로토스페이서 인접 모티프(TTN, TTTN, 또는 YTN)를 사용한다. Cpf1 단백질은 문헌[Yamano et ah, "Crystal structure of Cpf1 in complex with guide RNA and target DNA." Cell (165) 2016, p. 949-962; 그 전체 내용은 이로써 참고로 포함됨]에 기술되었다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 염기 에디터는 뉴클레아제 불활성 Cpf1 단백질 또는 이의 변이체를 포함한다. Cpf1 단백질은 Cas9의 RuvC 도메인과 유사하지만 HNH 엔도뉴클레아제 도메인이 없는 RuvC 유사 엔도뉴클레아제 도메인을 가지고 있으며, Cpf1의 N-말단에는 Cas9의 알파 나선 인식 엽이 없다. 일부 실시양태에서, Cpf1 닉카아제는 프란시셀라 노비시다 Cpf1 단백질에서 넘버링된 바와 같이 D917A, E1006A, 또는 D1255A에 상응하는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다.
야생형 프란시셀라 노비시다 Cpf1 아미노산 서열은 하기에 제공된다:
Figure pct00023
일부 실시양태에서, 염기 에디터는 Cpf1 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, Cpf1 단백질은 Cpf1 닉카아제이다. 일부 실시양태에서, Cpf1 단백질은 뉴클레아제 불활성 Cpf1이다. 일부 실시양태에서, Cpf1 단백질은 본원에 제공된 FnCpf1 서열에 대해 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, Cpf1 단백질은 본원에 제공된 야생형 FnCpf1 서열에서 넘버링된 바와 같이 D917A, E1006A, D1255A, D917A/E1006A, D917A/D1255A, E1006A/D1255A, 또는 D917A/E1006A/D1255A에 상응하는 돌연변이를 포함한다. 다른 박테리아 종으로부터의 Cpf1이 또한 본 개시 내용에 따라 사용될 수 있음을 이해해야 한다.
일부 실시양태에서, 핵산 프로그램 가능한 DNA 결합 단백질은 Cas12b(C2c1), C2c2, 또는 C2c3 단백질 또는 이들의 변이체를 포함한다. 클래스 2 CRISPR-Cas 시스템에서 Cas 단백질의 추가적인 특징은 문헌[Shmakov et al., "Discovery and Functional Characterization of Diverse Class 2 CRISPR Cas Systems", Mol. Cell, 2015 Nov 5; 60(3): 385-397, 그 전체 내용은 이로써 참고로 포함됨]에 기술되었다. 시스템 중 둘, C2c1 및 C2c3의 이펙터는 Cpf1과 관련된 RuvC 유사 엔도뉴클레아제 도메인을 포함한다. 세 번째 시스템인 C2c2는 2개의 예측된 HEPN RNase 도메인을 가진 이펙터를 포함한다. 성숙 CRISPR RNA의 생산은 C2c1에 의한 CRISPR RNA의 생산과 달리 tracrRNA 비의존적이다. C2c1은 DNA 절단을 위해 CRISPR RNA와 tracrRNA 모두에 의존한다. 키메라 단일 분자 가이드 RNA(sgRNA)와 복합체를 형성하는 알리시클로바실러스 아시도테라트리스(Alicyclobacillus acidoterratris C2c1(AacC2c1)의 결정 구조는 문헌[Liu et al., "C2c1-sgRNA Complex Structure Reveals RNA-Guided DNA Cleavage Mechanism", Mol. Cell, 2017 Jan 19;65(2):310-322; Yang et al., "PAM-dependent Target DNA Recognition and Cleavage by C2C1 CRISPR-Cas, 그 전체 내용은 이로써 참고로 포함됨]에 기술되어 있다.
예시적인 Cas12b 아미노산 서열(바실러스 히사시(Bacillus hisashii) Cas12b)은 하기에 제공된다:
BhCas12b (바실러스 히사시) NCBI 참조 서열: WP_095142515
Figure pct00024
일부 실시양태에서, 프로그램 가능한 DNA 결합 단백질은 argonaute 단백질을 포함한다. 이러한 핵산 프로그램 가능한 DNA 결합 단백질의 한 예는 나트로노박테리움 그레고리(Natronobacterium gregoryi)(NgAgo)의 Argonaute 단백질이다. NgAgo는 ssDNA 가이드 엔도뉴클레아제이다. NgAgo는 -24개 뉴클레오티드(gDNA)의 5' 인산화된 ssDNA에 결합하여 이를 표적 부위로 안내하고 gDNA 부위에서 DNA 이중 가닥 파손을 만들 것이다. Cas9와 대조적으로, NgAgo-gDNA 시스템에는 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)가 필요하지 않다. 뉴클레아제 불활성 NgAgo(dNgAgo)를 사용하면 표적화될 수 있는 염기가 크게 확장될 수 있다. NgAgo의 특성화 및 사용은 문헌[Gao et al., Nat Biotechnol., 2016 Jul;34(7):768-73. PubMed PMID: 27136078; Swarts et al., Nature. 507(7491) (2014):258-61; 및 Swarts et al., Nucleic Acids Res. 43(10) (2015):5120-9, 이들 각각은 본원에 참고로 포함됨]에 기술되었다.
일부 실시양태에서, 프로토스페이서 서열은 표 1 또는 표 24에 열거된 프로토스페이서 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.7%, 또는 적어도 99.9% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로토스페이서 서열은 표 1 또는 표 24에 열거된 프로토스페이서 서열 중 어느 하나를 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로토스페이서 서열은 표 1 또는 표 24에 열거된 프로토스페이서 서열 중 어느 하나이다. 일부 실시양태에서, 프로토스페이서 서열은 서열 번호 13-15, 50, 66-69, 81-252, 및 1594-1617의 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.7%, 또는 적어도 99.9% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로토스페이서 서열은 서열 번호 13-15, 50, 66-69, 81-252, 및 1594-1617의 서열 중 어느 하나를 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로토스페이서 서열은 서열 번호 13-15, 50, 66-69, 81-252, 및 1594-1617의 서열 중 어느 하나이다.
가이드 폴리뉴클레오티드
본 개시 내용의 일부 측면은 본원에서 제공되는 임의의 융합 단백질, 및 프로그램 가능한 DNA 결합 단백질, 예를 들어, 염기 에디터 또는 융합 단백질의 Cas9 도메인에 결합된 가이드 폴리뉴클레오티드를 포함하는 복합체를 제공한다.
일부 실시양태에서, 가이드 폴리뉴클레오티드는 가이드 폴리뉴클레오티드, 가이드 RNA(gRNA), 또는 이를 코딩하는 핵산이다.
일부 실시양태에서, 가이드 폴리뉴클레오티드는 단일 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 가이드 폴리뉴클레오티드는 2개의 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 가이드 핵산(예를 들어, 가이드 RNA)은 15-100개 뉴클레오티드 길이이고 표적 서열에 상보적인 적어도 10개의 연속 뉴클레오티드의 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 가이드 RNA는 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 가이드 RNA는 표적 서열에 상보적인 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 또는 40개의 연속 뉴클레오티드의 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 표적 서열은 DNA 서열이다. 일부 실시양태에서, 표적 서열은 포유동물의 게놈 내의 서열이다. 일부 실시양태에서, 표적 서열은 인간의 게놈 내 서열이다. 일부 실시양태에서, 표적 서열의 3' 말단은 표준 PAM 서열(NGG)에 바로 인접한다. 일부 실시양태에서, 가이드 핵산(예를 들어, 가이드 RNA)은 질환 또는 장애와 관련된 서열에 상보적이다. 일부 실시양태에서, 가이드 핵산(예를 들어, 가이드 RNA)은 PCSK9 유전자, ANGPTL3 유전자, 또는 APOC3 유전자에 돌연변이를 갖는 질환 또는 장애와 관련된 서열에 상보적이다.
본 개시 내용의 일부 측면은 본원에 제공된 가이드 핵산(예를 들어, gRNA) 및 핵염기 에디터를 포함하는 융합 단백질, 또는 복합체를 사용하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 본 개시 내용의 일부 측면은 DNA, 또는 RNA 분자를 본원에 제공된 임의의 융합 단백질, 및 적어도 하나의 가이드 핵산(예를 들어, 가이드 RNA)과 접촉시키는 단계를 포함하는 방법을 제공하며, 여기서 가이드 핵산(예를 들어, 가이드 RNA)는 약 15-100개 뉴클레오티드 길이이고 표적 서열에 상보적인 적어도 10개의 연속 뉴클레오티드의 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 표적 서열의 3' 말단은 표준 PAM 서열(NGG)에 바로 인접한다. 일부 실시양태에서, 표적 서열의 3' 말단은 표준 PAM 서열(NGG)에 바로 인접하지 않는다. 일부 실시양태에서, 표적 서열의 3' 말단은 AGC, GAG, TTT, GTG, 또는 CAA 서열에 바로 인접한다.
일부 실시양태에서, 가이드 폴리뉴클레오티드는 DNA이다. 일부 실시양태에서, 가이드 폴리뉴클레오티드는 RNA이다. 일부 실시양태에서, 가이드 폴리뉴클레오티드는 변형된 인공 폴리뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 가이드 폴리뉴클레오티드는 단일 또는 단일 분자 폴리뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 가이드 폴리뉴클레오티드는 이중 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 가이드 폴리뉴클레오티드는 링커에 의해 연결된 이중 폴리뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 가이드 폴리뉴클레오티드는 비핵산 링커에 의해 연결된 이중 폴리뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 가이드 폴리뉴클레오티드는 펩티드 링커 또는 화학적 링커에 의해 연결된 이중 폴리뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 가이드 폴리뉴클레오티드는 단일 가이드 RNA이다. 가이드 RNA(gRNA)는 프로그램 가능한 DNA 결합 단백질, 예를 들어 클래스 2 Cas 뉴클레아제, 예를 들어, Cas9를 표적 핵산 분자 상의 표적 서열에 안내할 수 있으며, 여기서 gRNA는 프로그램 가능한 DNA 결합 단백질과 혼성화하고 표적 서열을 변형시킨다. 일부 실시양태에서, gRNA 및 염기 에디터 융합 단백질은 리보핵단백질(RNP), 예를 들어 CRISPR/Cas 복합체를 형성할 수 있다. 일부 실시양태에서, CRISPR 복합체는 II형 CRISPR/Cas9 복합체일 수 있다. 일부 실시양태에서, CRISPR/Cas 복합체는 Cpf1/가이드 RNA 복합체와 같은 V형 CRISPR/Cas 복합체일 수 있다.
gRNA는 적어도 3개의 영역을 포함할 수 있다: 염색체 서열에서 표적 부위의 상보적 가닥에 결합할 수 있는 5' 말단의 제1 영역(스페이서 영역), 줄기 루프 구조를 형성할 수 있는 제2 내부 영역, 및 단일 가닥일 수 있는 제3의 3' 영역. 각각의 가이드 RNA의 제1 영역은 또한 각각의 gRNA가 단백질, 예를 들어 Cas9를 특정 표적 부위로 가이드하도록 상이할 수 있다. 또한, 각 gRNA의 제2 및 제3 영역은 모든 gRNA에서 동일할 수 있다. gRNA의 제2 영역은 이차 구조를 형성할 수 있다. 일부 실시양태에서, gRNA에 의해 형성된 2차 구조는 줄기(또는 머리핀) 및 루프를 포함할 수 있다. 루프와 줄기의 길이는 변화를 줄 수 있다. 일부 실시양태에서, 루프는 약 3 내지 약 10개 뉴클레오티드 길이의 범위일 수 있다. 일부 실시양태에서, 줄기는 약 6 내지 약 20개 뉴클레오티드 길이의 범위일 수 있다. 줄기는 1 내지 10개 뉴클레오티드 또는 약 10개 뉴클레오티드의 하나 이상의 돌출부를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 제2 영역의 전체 길이는 약 16 내지 60개 뉴클레오티드 길이의 범위일 수 있다. 일부 실시양태에서, 루프는 약 4개 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 일부 실시양태에서, 줄기는 약 12개 길이일 수 있다. 3' 말단에 있는 gRNA의 제3 영역은 본질적으로 단일 가닥일 수 있다. 일부 실시양태에서, 제3 영역은 때로는 관심 세포의 염색체 서열에 전혀 상보적이지 않고 때로는 gRNA의 나머지 부분에 상보적이지 않다. 또한 제3 영역의 길이는 변화를 줄 수 있다. 일부 실시양태에서, 제3 영역은 3개 초과 또는 4개 초과의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 예를 들어, 제3 영역의 길이는 약 5 내지 60개 뉴클레오티드 길이의 범위일 수 있다.
염기 에디터 시스템을 위한 gRNA는 CRISPR RNA(crRNA) 및 트랜스-활성화 crRNA(tracrRNA)를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, crRNA는 표적 핵산 분자 상의 표적 서열의 상보적 가닥과 혼성화하는 표적화 서열(또는 스페이서 서열)을 포함할 수 있다. crRNA는 또한 tracrRNA의 일부에 상보적이고 혼성화하는 깃대를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, crRNA는 박테리아의 CRISPR 유전자좌로부터 전사된 자연 발생 crRNA의 구조와 평행할 수 있으며, 여기서 표적화 서열은 염기 에디터 시스템에서 Cas9의 프로토스페이서로서 작용한다. gRNA는 crRNA의 표적화 서열을 통해 임의의 관심 서열을 표적화할 수 있다. 일부 실시양태에서, gRNA의 표적화 서열과 표적 핵산 분자 상의 표적 서열 사이의 상보성 정도는 적어도 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%이다. 일부 실시양태에서, gRNA의 표적화 서열 및 표적 핵산 분자 상의 표적 서열은 100% 상보적일 수 있다. 다른 실시양태에서, gRNA의 표적화 서열 및 표적 핵산 분자 상의 표적 서열은 적어도 하나의 미스매치를 포함할 수 있다. 예를 들어, gRNA의 표적화 서열 및 표적 핵산 분자 상의 표적 서열은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 미스매치를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 표적화 서열의 길이는 염기 에디터 시스템의 CRISPR/Cas 구성요소 및 사용된 구성요소에 따라 결정된다. 예를 들어, 상이한 박테리아 종의 상이한 Cas 단백질은 다양한 최적의 표적화 서열 길이를 갖는다. 따라서, 표적화 서열은 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50개, 또는 50개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적화 서열은 18-24개 뉴클레오티드 길이를 포함하였다. 일부 실시양태에서, 표적화 서열은 19-21개의 뉴클레오티드 길이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 표적화 서열은 20개의 뉴클레오티드 길이를 포함한다.
일부 실시양태에서, 가이드 RNA는 "이중 가이드 RNA" 또는 "dgRNA"이다. 일부 실시양태에서, dgRNA는 crRNA를 포함하는 제1 RNA 분자, 및 tracrRNA를 포함하는 제2 RNA 분자를 포함한다. 제1 및 제2 RNA 분자는 crRNA와 tracrRNA(예를 들어, 반복체 및 안티-반복체) 사이의 염기 페어링에 의해 RNA 이중체를 형성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 가이드 RNA는 "단일 가이드 RNA" 또는 "sgRNA"이다. 일부 실시양태에서, sgRNA는 tracrRNA에 공유적으로 연결된 crRNA를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, crRNA 및 tracrRNA는 링커를 통해 공유적으로 연결될 수 있다. 일부 실시양태에서, 단일 분자 가이드 RNA는 crRNA와 tracrRNA 사이의에서 염기 페이링에 의한 줄기-루프 구조를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, sgRNA는 Cas9 단백질을 지시할 수 있는 "Cas9 sgRNA"이다. 특정 실시양태에서, 가이드 RNA는 Cas9 단백질과 활성 복합체를 형성하고 RNA 가이드 DNA 변형을 매개하기에 충분한 crRNA 및 tracrRNA를 포함한다. 용어 "gRNA" 및 "sgRNA"는 본 출원 전반에 걸쳐 상호교환적으로 사용된다. 일부 실시양태에서, 하나 초과의 가이드 RNA가 사용될 수 있고; 각 가이드 RNA는 염기 에디터 시스템이 하나 초과의 표적 서열을 변형하도록 서로 다른 표적화 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 가이드 RNA는 염기 에디터 복합체 내의 활성 또는 안정성과 같은 동일하거나 상이한 특성을 가질 수 있다. 하나 초과의 가이드 RNA가 사용되는 경우, 각 가이드 RNA는 동일하거나 상이한 발현 카세트에 코딩될 수 있다. 하나 초과의 가이드 RNA의 발현을 유도하는 데 사용되는 프로모터는 동일하거나 상이할 수 있다.
일부 실시양태에서, gRNA 또는 Cas 단백질을 코딩하는 mRNA는 변형된다. 변형은 화학적 변경, 합성 변형, 뉴클레오티드 추가 및/또는 뉴클레오티드 빼기를 포함할 수 있고 변형된 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드는 gRNA에 존재할 수 있다. 하나 이상의 변형된 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드를 포함하는 gRNA 또는 Cas 단백질 코딩 mRNA는 표준 A, G, C 및 U 잔기 대신에 또는 그에 추가로 사용되는 하나 이상의 비천연 및/또는 자연 발생 구성요소 또는 구성의 존재를 설명하기 위해 "변형된" RNA라고 한다. 일부 실시양태에서, 변형된 RNA는 비표준 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드로 합성된다. 변형된 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드는 다음 중 하나를 포함할 수 있다: (i) 포스포디에스테르 백본 결합에서 비-연결 포스페이트 산소 및/또는 하나 이상의 연결 포스페이트 산소 중 하나 또는 둘 다의 변경, 예를 들어 대체(예시적인 백본 변형); (ii) 리보스 당의 구성성분, 예를 들어 리보스 당의 2' 히드록실의 변경, 예를 들어 대체(예시적인 당 변형); (iii) "데포스포" 링커로 포스페이트 모이어티의 대규모 대체(예시적인 백본 변형); (iv) 비표준 핵염기를 포함하는 자연 발생 핵염기의 변형 또는 대체(예시적인 염기 변형); (v) 리보스-포스페이트 백본의 대체 또는 변형(예시적인 백본 변형); (vi) 올리고뉴클레오티드의 3' 말단 또는 5' 말단의 변형, 예를 들어 말단 포스페이트 기의 제거, 첨가, 변형 또는 대체 또는 모이어티, 캡 또는 링커의 접합(이러한 3' 또는 5' 캡 변형은 당 및/또는 백본 변형을 포함할 수 있음); 및 (vii) 당의 변형 또는 대체(예시적인 당 변형). 변형은 CRISPR/Cas에 의한 게놈 편집을 향상시킬 수 있다. 변형은 gRNA의 키랄성을 변경할 수 있다. 일부 경우에, 변형 후 키랄성이 균일하거나 입체순수적일 수 있다. 가이드 RNA도 단축될 수 있다. 단축은 원하지 않는 오프 타겟 돌연변이 유발을 줄이는 데 사용될 수 있다. 단축은 임의의 개수의 뉴클레오티드 결실을 포함할 수 있다. 예를 들어, 단축은 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 사용되는 바와 같이 용어 "cap"은 하나 이상의 특별히 변경된 또는 변형된 뉴클레오티드, 예를 들어 mRNA의 5' 말단 상의 특별히 변경된 또는 변형된 뉴클레오티드를 지칭하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, cap은 변형된 구아닌(G) 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, cap은 7-메틸구아노신(N7-메틸 구아노신 또는 m7G)의 첨가에 의한 mRNA의 5' 말단 변형을 지칭한다. 일부 실시양태에서, mRNA 구조의 "캡핑"은 번역 개시, 스플라이싱, 세포내 수송, 및 전환율을 포함하는 다양한 세포 과정에서 중요한 역할을 한다. 일부 실시양태에서, 5' cap은 mRNA 안정성 및 번역 효율을 향상시킨다. 예시적인 cap 유사체는 표준 cap 유사체 m7G(5')ppp(5')G, 안티-역전 cap 유사체(ARCA) m7,3'-OGpppG(또는 3-O-Me-m7G(5') ppp(5')G), 비메틸화된 cap 유사체 G(5')ppp(5')G, A+1 부위에 대한 메틸화된 cap 유사체 m7G(5')ppp(5')A, 및 A+1 부위에 대한 비메틸화된 cap 유사체 G(5')ppp(5')A를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. mRNA cap 유사체를 얻는 추가 방법은 문헌[Kowalska et al., RNA 2008 14(6): 1119-1131]에 기술되어 있으며, 이는 그 전체가 본원에 포함된다.
일부 실시양태에서, 가이드 RNA 서열은 표 1 또는 표 24에 열거된 가이드 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.7%, 또는 적어도 99.9% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 가이드RNA 서열은 표 1 또는 표 24에 열거된 가이드 서열 중 어느 하나를 포함한다. 일부 실시양태에서, 가이드 RNA 서열은 표 1 또는 표 24에 열거된 가이드 서열 중 어느 하나이다. 일부 실시양태에서, 가이드 RNA 서열은 서열 번호 9-11, 55, 59, 253-452, 1618-1635, 1637-1800, 1802-2135, 및 2191의 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.7%, 또는 적어도 99.9% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 가이드RNA 서열은 서열 번호 9-11, 55, 59, 253-452, 1618-1635, 1637-1800, 1802-2135, 및 2191의 서열 중 어느 하나를 포함한다. 일부 실시양태에서, 가이드 RNA 서열은 서열 번호 9-11, 55, 59, 253-452, 1618-1635, 1637-1800, 1802-2135, 및 2191의 서열 중 어느 하나이다.
오프 타겟 효과
표준 CRISPR-Cas9 게놈 편집을 사용하면 gRNA에 코딩된 프로토스페이서 서열과 높은 수준의 서열 유사성을 공유하는 부위에서 오프 타겟 돌연변이 유발(즉, 의도된 표적 부위 이외의 게놈 부위에서의 편집)이 발생할 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, 오프 타겟 효과는 의도된 표적 부위 이외의 게놈 부위, 예를 들어 가이드 RNA 서열에 의해 인식되는 프로토스페이서 서열에서 삽입-결실을 포함하는 변형을 지칭하는 데 사용될 수 있다. 염기 편집의 맥락에서, 오프 타겟 편집은 의도된 표적 부위에서 멀리 떨어진 게놈 부위에서 또는 의도된 표적 부위에 매우 근접하여 발생할 수 있다. 예를 들어, 염기 편집 창에서 표적 핵염기 이외의 하나 이상의 염기가 편집될 수 있다("방관자 편집"). 특정 실시양태에서, 오프 타겟 염기 편집, 예를 들어 방관자 편집은 표적 유전자의 발현이나 기능에 영향을 미치지 않는다.
게놈의 잠재적인 오프 타겟 서열 후보는 예를 들어 MIT 특이성 점수(https://crispor.tefor.net/에 의해 계산됨, 최소 점수 50)를 사용하는 인간 게놈의 생물정보학 분석에 의해 또는 시험관 내 생화학적 분석, 예를 들어 ONE-seq 에 의해 예측할 수 있다.
오프 타겟 편집은 시퀀싱 분석에 의해 결정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 오프 타겟 편집은 게놈의 잠재적 오프 타겟 부위에서 순 핵염기 편집을 사용하여 계산된다. 예를 들어, 순 핵염기 편집 효율은 무염기 에디터 또는 무가이드 RNA를 대조군으로 사용하여 결정될 수 있으며, 여기서 순 핵염기 편집 효율은 예측된 오프 타겟 부위에서 대조군 세포에서 관찰된 편집 비율에 의해 영향을 받는 염기 에디터 mRNA 및 가이드 RNA를 둘러싸는 LNP와 접촉된 세포에서 관찰된 편집 비율에 의해 얻어진다. 오프 타겟 편집을 추정하고 줄이기 위한 추가 방법은 문헌[Rees et al., Nat. Rev. Genet. 2018 19(12): 770-788, 이는 그 전체가 본원에 참고로 포함됨]에 기재되어 있다.
gRNA 및 표적화 서열(또는 스페이서 서열)을 선택, 설계, 및 검증하는 방법은 본원에 기재되어 있고 당업자에게 공지되어 있다. 소프트웨어 도구를 사용하여 표적 핵산 서열에 상응하는 gRNA를 최적화할 수 있다. 예를 들어, 에스. 피오게네스 Cas9를 사용한 각각의 가능한 표적화 도메인 선택에 대해, 특정 수(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10) 이하의 미스매치 염기쌍을 포함하는 (선택된 PAM, 예를 들어, NAG 또는 NGG에 선행하는) 모든 오프 타겟 서열이 게놈에 걸쳐 확인될 수 있다. 표적 부위에 상보적인 gRNA의 제1 영역이 확인될 수 있고, 모든 제1 영역(예를 들어, crRNA)은 그의 총 예측된 오프 타겟 점수에 따라 순위 매겨질 수 있고; 최상위 표적화 도메인은 가장 큰 온 타겟 활성과 가장 적은 오프 타겟 활성을 가질 가능성이 있는 도메인을 나타낸다. 일부 실시양태에서, DNA 서열 검색 알고리즘을 사용하여 Cas9와 함께 사용하기 위한 gRNA의 crRNA에서 표적 서열을 확인할 수 있다. 게놈 전체의 오프 타겟 성향을 계산한 후 가이드를 채점하는 공개 도구 cas-offinder를 기반으로 하는 맞춤형 gRNA 설계 소프트웨어도 gRNA를 설계하는 데 사용될 수 있다(Bae, et al., Cas-OFFinder: A fast and versatile algorithm that searches for potential off-target sites of Cas9 RNA-guided endonucleases. Bioinformatics 30, 1473-1475 (2014)). 일부 실시양태에서, RepeatMasker 프로그램을 사용하여 입력 DNA 서열에서 반복 인자 및 복잡성이 낮은 영역을 스크리닝할 수 있다. 또한, 의도하지 않게 표적화될 수 있는 잔기의 수(예를 들어, 표적 핵산 유전자좌 내의 ssDNA에 잠재적으로 존재할 수 있는 오프 타겟 잔기)를 최소화하여 핵염기 에디터 시스템에서 데아미나아제 도메인의 잠재적 기질 난잡성의 영향을 줄일 수 있다. 후보 gRNA는 당업계에 공지된 방법 및/또는 본원에 제시된 방법을 사용하여 기능적으로 평가될 수 있다.
일부 실시양태에서, 염기 에디터 시스템에서 Cas9 단백질에 대한 표적 서열은 하나 이상의 종에서 관심 유전자의 표적 서열의 존재에 기초하여 선택될 수 있다. 예를 들어, 서열이 관심 유전자의 인간 및 시노몰구스 원숭이 오솔로그 둘 다의 표적 서열과 일치하는 경우 서열은 표적 서열로서 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, Cas9 뉴클레아제에 대한 표적 서열은 MIT 특이성 점수(https://crispor.tefor.net/에 의해 계산됨)에 의해 판단되는 바와 같이 예측된 오프 타겟 프로파일에 기초하여 선택될 수 있다. 예를 들어, 서열이 유리한 예측 오프 타겟 프로파일(예를 들어, MIT 특이성 점수에 의해 판단될 때 50의 최소 점수)을 갖는 경우 서열은 표적 서열로서 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 아데닌 염기 에디터(ABE)에 대한 표적 서열은 표적 유전자의 스플라이스 도너 부위 또는 스플라이스 억셉터 부위 내의 아데닌 염기를 편집하는 능력에 기초하여 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, ABE에 대한 표적 서열은 예를 들어 아데닌이 ABE의 편집 창 내에 있는 경우 아데닌의 위치에 기초하여 선택될 수 있다.
본원에 기재된 gRNA는 화학적으로, 효소적으로, 또는 이들의 조합으로 합성될 수 있다. 예를 들어, gRNA는 표준 포스포라미다이트 기반 고체상 합성 방법을 사용하여 합성될 수 있다. 대안적으로, gRNA는 gRNA를 코딩하는 DNA를 파지 RNA 폴리머라제에 의해 인식되는 프로모터 제어 서열에 작동 가능하게 연결함으로써 시험관 내에서 합성될 수 있다. 적합한 파지 프로모터 서열의 예는 T7, T3, SP6 프로모터 서열, 또는 이들의 변이체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, gRNA는 2개의 개별 분자(예를 들어, crRNA 및 tracrRNA)를 포함하고, 한 분자(예를 들어, crRNA)는 화학적으로 합성될 수 있고 다른 분자(예를 들어, tracrRNA)는 효소적으로 합성될 수 있다.
일부 측면에서, 본원에 기재된 단일 가이드 RNA(sgRNA) 및 염기 에디터 융합 단백질 또는 염기 에디터 융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 유전자 변형을 위한 조성물이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 조성물은 염기 에디터 융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 염기 에디터 융합 단백질은 Cas9 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, Cas9 단백질은 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9인 Cas9 단백질이다. 일부 실시양태에서, 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함한다. 약학적으로 허용 가능한 담체의 비제한적인 예는 본 출원의 "약학 조성물 및 치료 방법" 섹션에 나열되어 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물은 지질 나노입자로 제공될 수 있다.
화학적으로 변형된 가이드 RNA(gRNA)
본원에 제공된 본 개시 내용은 임의의 일반적인 CRISPR/Cas 시스템, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 염기 에디터 시스템과 관련하여 사용될 수 있는 화학적으로 변형된 CRISPR 가이드 RNA(gRNA)에 관한 것이다. gRNA(예를 들어, sgRNA, 짧은-sgRNA, crRNA, tracrRNA, 또는 dgRNA)는 다양한 뉴클레오티드 위치에서 변형을 포함할 수 있다. 일부 측면에서, (i) 뉴클레오티드에서의 화학적 변형 및 (ii) 비변형된 뉴클레오티드를 포함하는 가이드 RNA(gRNA) 또는 단일 가이드 RNA(sgRNA)가 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, gRNA 또는 sgRNA는 특정 뉴클레오티드 위치에서 변형을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, gRNA 또는 sgRNA는 하나 이상의 특정 위치에서 하나 이상의 변형을 포함할 수 있다.
한 측면에서, 본원에 제공된 화학적으로 변형된 CRISPR 가이드 RNA는 결정 구조에 기반한 변형을 포함한다. 특정 이론에 얽매이지 않고, X선 결정 구조 기반 가이드 설계를 사용하여 Cas 단백질, 예를 들어 Cas9와 복합체에서 gRNA 변형을 최적화할 수 있다. 일부 실시양태에서, 2'-OH가 Cas9-gRNA 복합체에서 Cas9 단백질과 매우 근접한 뉴클레오티드는 변형되지 않는다. 일부 실시양태에서, 2'-OH가 Cas9-gRNA 복합체에서 Cas9 단백질과 접촉하는 뉴클레오티드는 변형되지 않는다. 일부 실시양태에서, 2'-OH가 Cas9-gRNA 복합체에서 수소 결합을 갖는 Cas9 단백질과 접촉하는 뉴클레오티드는 변형되지 않는다. 일부 실시양태에서, Cas9-gRNA 복합체는 촉매전 삼원 복합체이다. 일부 실시양태에서, 2'-OH가 Cas9-gRNA 복합체에서 gRNA의 다른 부분과 매우 근접한 뉴클레오티드는 변형되지 않는다. 일부 실시양태에서, 2'-OH가 Cas9-gRNA 복합체에서 gRNA의 다른 부분과 접촉하는 뉴클레오티드는 변형되지 않는다. 일부 실시양태에서, 2'-OH가 Cas9-gRNA 복합체에서 수소 결합을 갖는 gRNA의 다른 부분과 접촉하는 뉴클레오티드는 변형되지 않는다. 일부 실시양태에서, Cas9-gRNA 복합체는 촉매전 삼원 복합체이다. 당업자가 이해하는 바와 같이, 본원에 사용되는 용어 "클래쉬"는 구조에서 물리적으로 가능성이 거의 없는 중첩 원자 부피를 지칭한다. 이러한 상황에서 2'O-Me 변형을 혼입하면 잠재적으로 RNP 기능에 해로울 수 있는 구조적 재배열(들)이 발생할 수 있다. 당업자가 이해하는 바와 같이, 본원에 사용되는 용어 "접촉"은 2개의 작용기, 사이의 안정한 비공유 상호작용, 예를 들어 수소 결합을 의미한다. 일부 실시양태에서, Cas9-gRNA 복합체에서 2'-OH가 2'-OMe로 대체되는 경우 gRNA의 다른 부분과의 클래쉬가 예측되는 뉴클레오티드는 변형되지 않는다. 일부 실시양태에서, Cas9-gRNA 복합체에서 2'-OH가 2'-OMe로 대체되는 경우 gRNA에서 또 다른 2'-OH와의 클래쉬가 예측되는 뉴클레오티드는 변형되지 않는다. 일부 실시양태에서, Cas9-gRNA 복합체는 촉매전 삼원 복합체이다. 일부 실시양태에서, Cas9-gRNA 복합체에서 용매-노출되거나 그렇지 않으면 Cas 단백질 잔기로부터 떨어져 있는 뉴클레오티드는 화학적 변형을 포함한다. 일부 실시양태에서, Cas9-gRNA 복합체에서 gRNA에서 용매-노출되거나 그렇지 않으면 다른 뉴클레오티드로부터 떨어져 있는 뉴클레오티드는 화학적 변형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학적 변형은 2'-OM 변형이다. Cas9-gRNA 결정 구조에 대한 추가 설명은 문헌[Jiang F, Taylor DW, Chen JS, Kornfeld JE, Zhou K, Thompson AJ, Nogales E, Doudna JA. Structures of a CRISPR-Cas9 R-loop complex primed for DNA cleavage. Science. 2016 Feb 19;351(6275):867-71, 그 전체가 본원에 참고로 포함됨]에 포함되어 있다.
가이드 RNA 뉴클레오티드에 대한 변형은 2'-O-메틸 변형, 2'-O-(2-메톡시에틸) 변형, 2'-플루오로 변형, 포스포로티오에이트 변형, 역전 무염기 변형, 데옥시리보뉴클레오티드, 비시클릭 리보스 유사체(예를 들어, 잠금 핵산(LNA), C-에틸렌 가교 핵산(ENA), 가교 핵산(BNA), 잠금 해제 핵산(UNA)), 염기 또는 핵염기 변형, 뉴클레오시드간 결합 변형, 리보네불라린, 2'-O-메틸네불라린, 또는 2'-데옥시네불라린을 포함할 수 있지만 이에 제한되지는 않는다. 변형의 다른 예는 5'아데닐레이트, 5' 구아노신-트리포스페이트 cap, 5'N7-메틸구아노신-트리포스페이트 cap, 5'트리포스페이트 cap, 3'포스페이트, 3'티오포스페이트, 5'포스페이트, 5'티오포스페이트, Cis-Syn 티미딘 이량체, 삼량체, C12 스페이서, C3 스페이서, C6 스페이서, dSpacer, PC 스페이서, rSpacer, Spacer 18, Spacer 9, 3'-3' 변형, 5'-5' 변형, 무염기, 아크리딘, 아조벤젠, 비오틴, 비오틴 BB, 비오틴 TEG, 콜레스테릴 TEG, 데스티오비오틴 TEG, DNP TEG, DNP-X, DOTA, dT-비오틴, 듀얼 비오틴, PC 비오틴, 소랄렌 C2, 소랄렌 C6, TINA, 3'DABCYL, 블랙홀 소광제 1, 블랙홀 소광제 2, DABCYL SE, dT-DABCYL, IRDye QC-1, QSY-21, QSY-35, QSY-7, QSY-9, 카르복실 링커, 티올 링커, 2' 데옥시리보뉴클레오시드 유사체 퓨린, 2' 데옥시리보뉴클레오시드 유사체 피리미딘, 리보뉴클레오시드 유사체, 2'-O-메틸 리보뉴클레오시드 유사체, 당 변형 유사체, 워블/보편 염기, 형광 염료 표지, 2'플루오로 RNA, 2'O-메틸 RNA, 메틸포스포네이트, 포스포디에스테르 DNA, 포스포디에스테르 RNA, 포스포티오에이트 DNA, 포스포로티오에이트 RNA, UNA, 슈도우리딘-5'-트리포스페이트, 5-메틸시티딘-5'-트리포스페이트, 2-O-메틸 3포스포로티오에이트 또는 이들의 조합을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 리보스 기(또는 당)가 변형될 수 있다. 일부 실시양태에서, 변형된 리보스 기는 상보적 가닥에 대한 올리고뉴클레오티드 결합 친화성, 이중체 형성, 또는 뉴클레아제와의 상호작용을 제어할 수 있다. 리보스 기에 대한 화학적 변형의 예에는 2'-O-메틸(2'-OMe), 2'-플루오로(2'-F), 2'-데옥시, 2'-O-(2-메톡시에틸)(2'-MOE), 2'-NH2, 2'-O-알릴, 2'-O-에틸아민, 2'-O-시아노에틸, 2'-O-아세탈에스테르, 또는 비시클릭 뉴클레오티드, 예를 들어 잠금 핵산(LNA), 2'-(5-구속 에틸(S-cEt)), 구속 MOE 또는 2'-0,4'-C-아미노메틸렌 가교 핵산(2',4'-BNANC)이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 2'-O-메틸 변형은 올리고뉴클레오티드의 결합 친화성을 증가시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 2'-O-메틸 변형은 올리고뉴클레오티드의 뉴클레아제 안정성을 향상시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 2'-플루오로 변형은 올리고뉴클레오티드 결합 친화성 및 뉴클레아제 안정성을 증가시킬 수 있다. 본 출원에서, gRNA 서열의 소문자 리보뉴클레오티드는 2'-OMe 변형을 나타낸다(예를 들어, 표 1 또는 표 24)(소문자 s는 포스포로티오에이트 결합을 나타냄).
일부 실시양태에서, 포스페이트 기는 화학적으로 변형될 수 있다. 포스페이트기에 대한 화학적 변형의 예는 포스포로티오에이트(PS), 포스포노아세테이트(PACE), 티오포스포노아세테이트(thioPACE), 아미드, 트리아졸, 포스포네이트, 또는 포스포트리에스테르 변형을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, PS 결합은 예를 들어 뉴클레오티드 사이의 포스포디에스테르 결합에서 황이 하나의 비가교 포스페이트 산소에 치환된 결합을 지칭할 수 있다. "s"는 본 출원에서 gRNA 서열에서 PS 변형을 나타내는 데 사용될 수 있다(예를 들어, 표 1 또는 표 24). 일부 실시양태에서, gRNA 또는 sgRNA는 5' 말단 또는 3' 말단에 포스포로티오에이트(PS) 결합을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, gRNA 또는 sgRNA는 5' 말단에 포스포로티오에이트(PS) 결합을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, gRNA 또는 sgRNA는 3' 말단에 포스포로티오에이트(PS) 결합을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, gRNA 또는 sgRNA는 5' 말단 및 3' 말단에 포스포로티오에이트(PS) 결합을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, gRNA 또는 sgRNA는 5' 말단 또는 3' 말단에 1, 2, 또는 3개, 또는 3개 이상의 포스포로티오에이트 결합을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, gRNA 또는 sgRNA는 5' 말단 또는 3' 말단에 3개의 포스포로티오에이트(PS) 결합을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, gRNA 또는 sgRNA는 3' 말단에 3개의 포스포로티오에이트 결합을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, gRNA 또는 sgRNA는 5' 말단 또는 3' 말단에 2개 및 2개 이하(즉, 단지 2개) 연속적인 포스포로티오에이트(PS) 결합을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, gRNA 또는 sgRNA는 5' 말단 또는 3' 말단에 3개의 연속적인 포스포로티오에이트(PS) 결합을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, gRNA 또는 sgRNA는 3' 말단 또는 5' 말단에 서열 5'-UsUsU-3'를 포함할 수 있으며, 여기서 U는 우리딘을 나타내고 s는 포스포로티오에이트(PS) 결합을 나타낸다. 일부 실시양태에서, gRNA 또는 sgRNA는 3' 말단 또는 5' 말단에 서열 5'-ususu-3'를 포함할 수 있으며, 여기서 u는 2'-O-메틸우리딘을 나타내고, s는 포스포로티오에이트(PS) 결합을 나타낸다. 일부 실시양태에서, gRNA 또는 sgRNA는 3' 말단 또는 5' 말단에 서열 5'-ususuUUU-3'를 포함할 수 있으며, 여기서 U 및 u는 각각 우리딘 및 2'-O-메틸우리딘을 나타내고, s는 포스포로티오에이트(PS) 결합을 나타낸다. 일부 실시양태에서, gRNA 또는 sgRNA는 3' 말단 또는 5' 말단에 서열 5'-ususuUuU-3'를 포함할 수 있으며, 여기서 U 및 u는 각각 우리딘 및 2'-O-메틸우리딘을 나타내고, s는 포스포로티오에이트(PS) 결합을 나타낸다. 일부 실시양태에서, gRNA 또는 sgRNA는 3' 말단에 서열 5'- usususuUuU-3'를 포함할 수 있으며, 여기서 U 및 u는 각각 우리딘 및 2'-O-메틸우리딘을 나타내고, s는 포스포로티오에이트(PS) 결합을 나타낸다. 일부 실시양태에서, gRNA 또는 sgRNA는 3' 말단에 서열 5'- ususuuuu -3'를 포함할 수 있으며, 여기서 u는 2'-O-메틸우리딘을 나타내고, s는 포스포로티오에이트(PS) 결합을 나타낸다.
일부 실시양태에서, 핵염기는 화학적으로 변형될 수 있다. 핵염기에 대한 화학적 변형의 예는 2-티오우리딘, 4-티오우리딘, N6-메틸아데노신, 슈도우리딘, 2,6-디아미노퓨린, 이노신, 티미딘, 5-메틸시토신, 5-치환된 피리미딘, 이소구아닌, 이소시토신, 또는 할로겐화 방향족 기를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서 화학적으로 변형된 gRNA는 네불라린을 포함한다. 네불라린은 베타-D-리보스에서 유도된 퓨린 리보뉴클레오시드이며 글리코시드 (N-글리코실) 결합을 통해 위치 9의 베타-D-리보푸라노실 잔기에 부착된 9H-퓨린이다. 네불라린은 외환 작용 모이어티 또는 치환이 없는 퓨린 리보뉴클레오시드다. 일부 실시양태에서, 이는 퓨린 리보뉴클레오시드이다. 일부 실시양태에서, 이는 퓨린 D-리보뉴클레오시드이다. 일부 실시양태에서, 네불라린은 화학적으로 추가로 변형된다. 본 출원에서, "X", "x" 및 "dX"는 gRNA 서열에서 각각 리보네불라린 변형, 2'-O-메틸네불라린 변형, 및 2'-데옥시네불라린 변형을 나타내는 데 사용될 수 있다(예를 들어, 표 1 또는 표 24). 일부 실시양태에서, gRNA 서열(예를 들어, 스페이서 영역 또는 tracr 영역)의 뉴클레오티드(예를 들어, A)를 네불라린으로 치환하면 gRNA 활성에 영향을 미치지 않으면서 오프 타겟 효과를 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 네불라린, 데옥시네불라린, 또는 2'-O-메틸네불라린은 비변형된 gRNA 또는 sgRNA에서 아데닌을 대체한다. 일부 실시양태에서, 네불라린, 데옥시네불라린, 또는 2'-O-메틸네불라린은 스페이서 서열에 있다. 일부 실시양태에서, 네불라린, 데옥시네불라린, 또는 2'-O-메틸네불라린은 tracrRNA 서열에 있다. 일부 실시양태에서, 네불라린, 데옥시네불라린, 또는 2'-O-메틸네불라린은 tracrRNA 서열의 tracrRNA 서열에 있다. 일부 실시양태에서, 네불라린, 데옥시네불라린, 또는 2'-O-메틸네불라린은 tracrRNA 서열의 crRNA 서열에 있다. 일부 실시양태에서, 네불라린, 데옥시네불라린, 또는 2'-O-메틸네불라린은 tracrRNA 서열의 줄기 루프 구조에 있다.
일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA는 총 50-150개 염기쌍 길이를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA는 총 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 또는 150개 염기쌍 길이를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA는 총 약 50 내지 약 140개 염기쌍 길이를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA는 총 약 50 내지 약 60, 약 50 내지 약 70, 약 50 내지 약 80, 약 50 내지 약 90, 약 50 내지 약 100, 약 50 내지 약 110, 약 50 내지 약 120, 약 50 내지 약 130, 약 50 내지 약 140, 약 60 내지 약 70, 약 60 내지 약 80, 약 60 내지 약 90, 약 60 내지 약 100, 약 60 내지 약 110, 약 60 내지 약 120, 약 60 내지 약 130, 약 60 내지 약 140, 약 70 내지 약 80, 약 70 내지 약 90, 약 70 내지 약 100, 약 70 내지 약 110, 약 70 내지 약 120, 약 70 내지 약 130, 약 70 내지 약 140, 약 80 내지 약 90, 약 80 내지 약 100, 약 80 내지 약 110, 약 80 내지 약 120, 약 80 내지 약 130, 약 80 내지 약 140, 약 90 내지 약 100, 약 90 내지 약 110, 약 90 내지 약 120, 약 90 내지 약 130, 약 90 내지 약 140, 약 100 내지 약 110, 약 100 내지 약 120, 약 100 내지 약 130, 약 100 내지 약 140, 약 110 내지 약 120, 약 110 내지 약 130, 약 110 내지 약 140, 약 120 내지 약 130, 약 120 내지 약 140, 또는 약 130 내지 약 140개 염기쌍 길이를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA는 총 약 50, 약 60, 약 70, 약 80, 약 90, 약 100, 약 110, 약 120, 약 130, 또는 약 140개 염기쌍 길이를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA는 총 적어도 약 50, 약 60, 약 70, 약 80, 약 90, 약 100, 약 110, 약 120, 또는 약 130개 염기쌍 길이를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA는 총 최대 약 60, 약 70, 약 80, 약 90, 약 100, 약 110, 약 120, 약 130, 또는 약 140개 염기쌍 길이를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA는 총 100개 염기쌍 길이를 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA는 총 103개 염기쌍 길이를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA는 1 내지 150개의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA는 총 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 또는 150개의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA는 총 약 1 내지 약 45개의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA는 총 약 1 내지 약 3, 약 1 내지 약 5, 약 1 내지 약 10, 약 1 내지 약 15, 약 1 내지 약 20, 약 1 내지 약 25, 약 1 내지 약 30, 약 1 내지 약 35, 약 1 내지 약 40, 약 1 내지 약 45, 약 3 내지 약 5, 약 3 내지 약 10, 약 3 내지 약 15, 약 3 내지 약 20, 약 3 내지 약 25, 약 3 내지 약 30, 약 3 내지 약 35, 약 3 내지 약 40, 약 3 내지 약 45, 약 5 내지 약 10, 약 5 내지 약 15, 약 5 내지 약 20, 약 5 내지 약 25, 약 5 내지 약 30, 약 5 내지 약 35, 약 5 내지 약 40, 약 5 내지 약 45, 약 10 내지 약 15, 약 10 내지 약 20, 약 10 내지 약 25, 약 10 내지 약 30, 약 10 내지 약 35, 약 10 내지 약 40, 약 10 내지 약 45, 약 15 내지 약 20, 약 15 내지 약 25, 약 15 내지 약 30, 약 15 내지 약 35, 약 15 내지 약 40, 약 15 내지 약 45, 약 20 내지 약 25, 약 20 내지 약 30, 약 20 내지 약 35, 약 20 내지 약 40, 약 20 내지 약 45, 약 25 내지 약 30, 약 25 내지 약 35, 약 25 내지 약 40, 약 25 내지 약 45, 약 30 내지 약 35, 약 30 내지 약 40, 약 30 내지 약 45, 약 35 내지 약 40, 약 35 내지 약 45, 약 40 내지 약 45, 또는 약 45 내지 약 50개의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA는 총 약 1, 약 3, 약 5, 약 10, 약 15, 약 20, 약 25, 약 30, 약 35, 약 40, 약 45, 또는 약 50개의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA는 총 적어도 약 1, 약 3, 약 5, 약 10, 약 15, 약 20, 약 25, 약 30, 약 35, 약 40, 약 45, 또는 약 50개의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA는 총 최대 약 3, 약 5, 약 10, 약 15, 약 20, 약 25, 약 30, 약 35, 약 40, 약 45, 또는 약 50개의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA는 총 약 50 내지 약 140개의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA는 총 약 50 내지 약 60, 약 50 내지 약 70, 약 50 내지 약 80, 약 50 내지 약 90, 약 50 내지 약 100, 약 50 내지 약 110, 약 50 내지 약 120, 약 50 내지 약 130, 약 50 내지 약 140, 약 60 내지 약 70, 약 60 내지 약 80, 약 60 내지 약 90, 약 60 내지 약 100, 약 60 내지 약 110, 약 60 내지 약 120, 약 60 내지 약 130, 약 60 내지 약 140, 약 70 내지 약 80, 약 70 내지 약 90, 약 70 내지 약 100, 약 70 내지 약 110, 약 70 내지 약 120, 약 70 내지 약 130, 약 70 내지 약 140, 약 80 내지 약 90, 약 80 내지 약 100, 약 80 내지 약 110, 약 80 내지 약 120, 약 80 내지 약 130, 약 80 내지 약 140, 약 90 내지 약 100, 약 90 내지 약 110, 약 90 내지 약 120, 약 90 내지 약 130, 약 90 내지 약 140, 약 100 내지 약 110, 약 100 내지 약 120, 약 100 내지 약 130, 약 100 내지 약 140, 약 110 내지 약 120, 약 110 내지 약 130, 약 110 내지 약 140, 약 120 내지 약 130, 약 120 내지 약 140, 또는 약 130 내지 약 140개의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA는 총 약 50, 약 60, 약 70, 약 80, 약 90, 약 100, 약 110, 약 120, 약 130, 또는 약 140개의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA는 총 적어도 약 50, 약 60, 약 70, 약 80, 약 90, 약 100, 약 110, 약 120, 또는 약 130개의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA는 총 최대 약 60, 약 70, 약 80, 약 90, 약 100, 약 110, 약 120, 약 130, 또는 약 140개의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA는 총 54개의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA는 총 62개의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA는 약 1% 내지 약 100% 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA는 약 1% 내지 약 10%, 약 1% 내지 약 20%, 약 1% 내지 약 30%, 약 1% 내지 약 40%, 약 1% 내지 약 50%, 약 1% 내지 약 60%, 약 1% 내지 약 70%, 약 1% 내지 약 80%, 약 1% 내지 약 90%, 약 1% 내지 약 95%, 약 1% 내지 약 100%, 약 10% 내지 약 20%, 약 10% 내지 약 30%, 약 10% 내지 약 40%, 약 10% 내지 약 50%, 약 10% 내지 약 60%, 약 10% 내지 약 70%, 약 10% 내지 약 80%, 약 10% 내지 약 90%, 약 10% 내지 약 95%, 약 10% 내지 약 100%, 약 20% 내지 약 30%, 약 20% 내지 약 40%, 약 20% 내지 약 50%, 약 20% 내지 약 60%, 약 20% 내지 약 70%, 약 20% 내지 약 80%, 약 20% 내지 약 90%, 약 20% 내지 약 95%, 약 20% 내지 약 100%, 약 30% 내지 약 40%, 약 30% 내지 약 50%, 약 30% 내지 약 60%, 약 30% 내지 약 70%, 약 30% 내지 약 80%, 약 30% 내지 약 90%, 약 30% 내지 약 95%, 약 30% 내지 약 100%, 약 40% 내지 약 50%, 약 40% 내지 약 60%, 약 40% 내지 약 70%, 약 40% 내지 약 80%, 약 40% 내지 약 90%, 약 40% 내지 약 95%, 약 40% 내지 약 100%, 약 50% 내지 약 60%, 약 50% 내지 약 70%, 약 50% 내지 약 80%, 약 50% 내지 약 90%, 약 50% 내지 약 95%, 약 50% 내지 약 100%, 약 60% 내지 약 70%, 약 60% 내지 약 80%, 약 60% 내지 약 90%, 약 60% 내지 약 95%, 약 60% 내지 약 100%, 약 70% 내지 약 80%, 약 70% 내지 약 90%, 약 70% 내지 약 95%, 약 70% 내지 약 100%, 약 80% 내지 약 90%, 약 80% 내지 약 95%, 약 80% 내지 약 100%, 약 90% 내지 약 95%, 약 90% 내지 약 100%, 또는 약 95% 내지 약 100% 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA는 약 1%, 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95%, 또는 약 100% 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA는 적어도 약 1%, 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 또는 약 95% 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA는 최대 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95%, 또는 약 100% 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA는 gRNA 서열에서 5'-3' 방향으로 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 또는 150 중 하나 이상에 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 가질 수 있다.
일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA는 gRNA 서열의 5' 말단으로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 또는 149개 염기쌍인 위치 중 하나 이상에 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 가질 수 있다
일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA는 gRNA 서열의 3' 말단으로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 또는 149개 염기쌍인 위치 중 하나 이상에 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 가질 수 있다
일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA는 sgRNA일 수 있다. 용어 "gRNA" 및 "sgRNA"는 본 출원에서 상호교환적으로 사용된다. 일부 실시양태에서, sgRNA는 하나 이상의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 sgRNA는 총 50-150개 염기쌍 길이를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 sgRNA는 총 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 또는 150개 염기쌍 길이를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 sgRNA는 총 약 50 내지 약 140개 염기쌍 길이를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 sgRNA는 총 약 50 내지 약 60, 약 50 내지 약 70, 약 50 내지 약 80, 약 50 내지 약 90, 약 50 내지 약 100, 약 50 내지 약 110, 약 50 내지 약 120, 약 50 내지 약 130, 약 50 내지 약 140, 약 60 내지 약 70, 약 60 내지 약 80, 약 60 내지 약 90, 약 60 내지 약 100, 약 60 내지 약 110, 약 60 내지 약 120, 약 60 내지 약 130, 약 60 내지 약 140, 약 70 내지 약 80, 약 70 내지 약 90, 약 70 내지 약 100, 약 70 내지 약 110, 약 70 내지 약 120, 약 70 내지 약 130, 약 70 내지 약 140, 약 80 내지 약 90, 약 80 내지 약 100, 약 80 내지 약 110, 약 80 내지 약 120, 약 80 내지 약 130, 약 80 내지 약 140, 약 90 내지 약 100, 약 90 내지 약 110, 약 90 내지 약 120, 약 90 내지 약 130, 약 90 내지 약 140, 약 100 내지 약 110, 약 100 내지 약 120, 약 100 내지 약 130, 약 100 내지 약 140, 약 110 내지 약 120, 약 110 내지 약 130, 약 110 내지 약 140, 약 120 내지 약 130, 약 120 내지 약 140, 또는 약 130 내지 약 140개 염기쌍 길이를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 sgRNA는 총 약 50, 약 60, 약 70, 약 80, 약 90, 약 100, 약 110, 약 120, 약 130, 또는 약 140개 염기쌍 길이를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 sgRNA는 총 적어도 약 50, 약 60, 약 70, 약 80, 약 90, 약 100, 약 110, 약 120, 또는 약 130개 염기쌍 길이를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 sgRNA는 총 최대 약 60, 약 70, 약 80, 약 90, 약 100, 약 110, 약 120, 약 130, 또는 약 140개 염기쌍 길이를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 화학적으로 변형된 sgRNA는 총 100개 염기쌍 길이를 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 화학적으로 변형된 sgRNA는 총 103개 염기쌍 길이를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 sgRNA는 총 1 내지 150개의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 sgRNA는 총 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 또는 150개의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 sgRNA는 총 약 1 내지 약 45개의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 sgRNA는 총 약 1 내지 약 3, 약 1 내지 약 5, 약 1 내지 약 10, 약 1 내지 약 15, 약 1 내지 약 20, 약 1 내지 약 25, 약 1 내지 약 30, 약 1 내지 약 35, 약 1 내지 약 40, 약 1 내지 약 45, 약 3 내지 약 5, 약 3 내지 약 10, 약 3 내지 약 15, 약 3 내지 약 20, 약 3 내지 약 25, 약 3 내지 약 30, 약 3 내지 약 35, 약 3 내지 약 40, 약 3 내지 약 45, 약 5 내지 약 10, 약 5 내지 약 15, 약 5 내지 약 20, 약 5 내지 약 25, 약 5 내지 약 30, 약 5 내지 약 35, 약 5 내지 약 40, 약 5 내지 약 45, 약 10 내지 약 15, 약 10 내지 약 20, 약 10 내지 약 25, 약 10 내지 약 30, 약 10 내지 약 35, 약 10 내지 약 40, 약 10 내지 약 45, 약 15 내지 약 20, 약 15 내지 약 25, 약 15 내지 약 30, 약 15 내지 약 35, 약 15 내지 약 40, 약 15 내지 약 45, 약 20 내지 약 25, 약 20 내지 약 30, 약 20 내지 약 35, 약 20 내지 약 40, 약 20 내지 약 45, 약 25 내지 약 30, 약 25 내지 약 35, 약 25 내지 약 40, 약 25 내지 약 45, 약 30 내지 약 35, 약 30 내지 약 40, 약 30 내지 약 45, 약 35 내지 약 40, 약 35 내지 약 45, 약 40 내지 약 45, 또는 약 45 내지 약 50개의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 sgRNA는 총 약 1, 약 3, 약 5, 약 10, 약 15, 약 20, 약 25, 약 30, 약 35, 약 40, 약 45, 또는 약 50개의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 sgRNA는 총 적어도 약 1, 약 3, 약 5, 약 10, 약 15, 약 20, 약 25, 약 30, 약 35, 약 40, 약 45, 또는 약 50개의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 sgRNA는 총 최대 약 3, 약 5, 약 10, 약 15, 약 20, 약 25, 약 30, 약 35, 약 40, 약 45, 또는 약 50개의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 sgRNA는 총 약 50 내지 약 140개의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 sgRNA는 총 약 50 내지 약 60, 약 50 내지 약 70, 약 50 내지 약 80, 약 50 내지 약 90, 약 50 내지 약 100, 약 50 내지 약 110, 약 50 내지 약 120, 약 50 내지 약 130, 약 50 내지 약 140, 약 60 내지 약 70, 약 60 내지 약 80, 약 60 내지 약 90, 약 60 내지 약 100, 약 60 내지 약 110, 약 60 내지 약 120, 약 60 내지 약 130, 약 60 내지 약 140, 약 70 내지 약 80, 약 70 내지 약 90, 약 70 내지 약 100, 약 70 내지 약 110, 약 70 내지 약 120, 약 70 내지 약 130, 약 70 내지 약 140, 약 80 내지 약 90, 약 80 내지 약 100, 약 80 내지 약 110, 약 80 내지 약 120, 약 80 내지 약 130, 약 80 내지 약 140, 약 90 내지 약 100, 약 90 내지 약 110, 약 90 내지 약 120, 약 90 내지 약 130, 약 90 내지 약 140, 약 100 내지 약 110, 약 100 내지 약 120, 약 100 내지 약 130, 약 100 내지 약 140, 약 110 내지 약 120, 약 110 내지 약 130, 약 110 내지 약 140, 약 120 내지 약 130, 약 120 내지 약 140, 또는 약 130 내지 약 140개의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 sgRNA는 총 약 50, 약 60, 약 70, 약 80, 약 90, 약 100, 약 110, 약 120, 약 130, 또는 약 140개의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 sgRNA는 총 적어도 약 50, 약 60, 약 70, 약 80, 약 90, 약 100, 약 110, 약 120, 또는 약 130개의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 sgRNA는 총 최대 약 60, 약 70, 약 80, 약 90, 약 100, 약 110, 약 120, 약 130, 또는 약 140개의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 화학적으로 변형된 sgRNA는 총 54개의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 화학적으로 변형된 sgRNA는 총 62개의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 sgRNA는 약 1% 내지 약 100% 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 sgRNA는 약 1% 내지 약 10%, 약 1% 내지 약 20%, 약 1% 내지 약 30%, 약 1% 내지 약 40%, 약 1% 내지 약 50%, 약 1% 내지 약 60%, 약 1% 내지 약 70%, 약 1% 내지 약 80%, 약 1% 내지 약 90%, 약 1% 내지 약 95%, 약 1% 내지 약 100%, 약 10% 내지 약 20%, 약 10% 내지 약 30%, 약 10% 내지 약 40%, 약 10% 내지 약 50%, 약 10% 내지 약 60%, 약 10% 내지 약 70%, 약 10% 내지 약 80%, 약 10% 내지 약 90%, 약 10% 내지 약 95%, 약 10% 내지 약 100%, 약 20% 내지 약 30%, 약 20% 내지 약 40%, 약 20% 내지 약 50%, 약 20% 내지 약 60%, 약 20% 내지 약 70%, 약 20% 내지 약 80%, 약 20% 내지 약 90%, 약 20% 내지 약 95%, 약 20% 내지 약 100%, 약 30% 내지 약 40%, 약 30% 내지 약 50%, 약 30% 내지 약 60%, 약 30% 내지 약 70%, 약 30% 내지 약 80%, 약 30% 내지 약 90%, 약 30% 내지 약 95%, 약 30% 내지 약 100%, 약 40% 내지 약 50%, 약 40% 내지 약 60%, 약 40% 내지 약 70%, 약 40% 내지 약 80%, 약 40% 내지 약 90%, 약 40% 내지 약 95%, 약 40% 내지 약 100%, 약 50% 내지 약 60%, 약 50% 내지 약 70%, 약 50% 내지 약 80%, 약 50% 내지 약 90%, 약 50% 내지 약 95%, 약 50% 내지 약 100%, 약 60% 내지 약 70%, 약 60% 내지 약 80%, 약 60% 내지 약 90%, 약 60% 내지 약 95%, 약 60% 내지 약 100%, 약 70% 내지 약 80%, 약 70% 내지 약 90%, 약 70% 내지 약 95%, 약 70% 내지 약 100%, 약 80% 내지 약 90%, 약 80% 내지 약 95%, 약 80% 내지 약 100%, 약 90% 내지 약 95%, 약 90% 내지 약 100%, 또는 약 95% 내지 약 100% 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 sgRNA는 약 1%, 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95%, 또는 약 100% 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 sgRNA는 적어도 약 1%, 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 또는 약 95% 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 sgRNA는 최대 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95%, 또는 약 100% 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 sgRNA는 sgRNA 서열에서 5'-3' 방향으로 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 또는 150 중 하나 이상에 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 가질 수 있다.
일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 sgRNA는 sgRNA 서열의 5' 말단으로부터 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 또는 149개 염기쌍 중 하나 이상에 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 가질 수 있다.
일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 sgRNA는 sgRNA 서열의 3' 말단으로부터 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 또는 149개 염기쌍 중 하나 이상에 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 가질 수 있다.
일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 스페이서 또는 프로토스페이서 영역, 즉 표적 서열에서 하나 이상의 화학적 변형을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 10 내지 30개 염기쌍 길이의 스페이서 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30개 염기쌍 길이의 스페이서 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 약 10 내지 약 30개 염기쌍 길이의 스페이서 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 약 10 내지 약 15, 약 10 내지 약 20, 약 10 내지 약 25, 약 10 내지 약 30, 약 15 내지 약 20, 약 15 내지 약 25, 약 15 내지 약 30, 약 20 내지 약 25, 약 20 내지 약 30, 또는 약 25 내지 약 30개 염기쌍 길이의 스페이서 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 약 10, 약 15, 약 20, 약 25, 또는 약 30개 염기쌍 길이의 스페이서 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 적어도 약 10, 약 15, 약 20, 또는 약 25개 염기쌍 길이 길이의 스페이서 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 최대 약 15, 약 20, 약 25, 또는 약 30개 염기쌍 길이의 스페이서 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 18개 염기쌍 길이의 스페이서 서열을 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 22개 염기쌍 길이의 스페이서 서열을 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 20개 염기쌍 길이의 스페이서 서열을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 스페이서 서열은 총 1 내지 30개의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 스페이서 영역은 총 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30개의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 스페이서 서열은 총 약 1 내지 약 10개의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 스페이서 서열은 총 약 1 내지 약 2, 약 1 내지 약 3, 약 1 내지 약 4, 약 1 내지 약 5, 약 1 내지 약 6, 약 1 내지 약 7, 약 1 내지 약 8, 약 1 내지 약 9, 약 1 내지 약 10, 약 2 내지 약 3, 약 2 내지 약 4, 약 2 내지 약 5, 약 2 내지 약 6, 약 2 내지 약 7, 약 2 내지 약 8, 약 2 내지 약 9, 약 2 내지 약 10, 약 3 내지 약 4, 약 3 내지 약 5, 약 3 내지 약 6, 약 3 내지 약 7, 약 3 내지 약 8, 약 3 내지 약 9, 약 3 내지 약 10, 약 4 내지 약 5, 약 4 내지 약 6, 약 4 내지 약 7, 약 4 내지 약 8, 약 4 내지 약 9, 약 4 내지 약 10, 약 5 내지 약 6, 약 5 내지 약 7, 약 5 내지 약 8, 약 5 내지 약 9, 약 5 내지 약 10, 약 6 내지 약 7, 약 6 내지 약 8, 약 6 내지 약 9, 약 6 내지 약 10, 약 7 내지 약 8, 약 7 내지 약 9, 약 7 내지 약 10, 약 8 내지 약 9, 약 8 내지 약 10, 또는 약 9 내지 약 10개의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 스페이서 서열은 총 약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 약 6, 약 7, 약 8, 약 9, 또는 약 10개의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 스페이서 서열은 총 적어도 약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 약 6, 약 7, 약 8, 또는 약 9개의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 스페이서 서열은 총 최대 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 약 6, 약 7, 약 8, 약 9, 또는 약 10개의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 스페이서 서열은 총 약 10 내지 약 30개의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 스페이서 서열은 총 약 10 내지 약 15, 약 10 내지 약 20, 약 10 내지 약 25, 약 10 내지 약 30, 약 15 내지 약 20, 약 15 내지 약 25, 약 15 내지 약 30, 약 20 내지 약 25, 약 20 내지 약 30, 또는 약 25 내지 약 30개의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 스페이서 서열은 총 약 10, 약 15, 약 20, 약 25, 또는 약 30개의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 스페이서 서열은 총 적어도 약 10, 약 15, 약 20, 또는 약 25개의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 스페이서 서열은 총 최대 약 15, 약 20, 약 25, 또는 약 30개의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 스페이서 서열은 총 3개의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 스페이서 서열은 총 5개의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 스페이서 서열은 1% 내지 100% 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 스페이서 서열은 약 1% 내지 약 100% 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 스페이서 서열은 약 1% 내지 약 10%, 약 1% 내지 약 20%, 약 1% 내지 약 30%, 약 1% 내지 약 40%, 약 1% 내지 약 50%, 약 1% 내지 약 60%, 약 1% 내지 약 70%, 약 1% 내지 약 80%, 약 1% 내지 약 90%, 약 1% 내지 약 95%, 약 1% 내지 약 100%, 약 10% 내지 약 20%, 약 10% 내지 약 30%, 약 10% 내지 약 40%, 약 10% 내지 약 50%, 약 10% 내지 약 60%, 약 10% 내지 약 70%, 약 10% 내지 약 80%, 약 10% 내지 약 90%, 약 10% 내지 약 95%, 약 10% 내지 약 100%, 약 20% 내지 약 30%, 약 20% 내지 약 40%, 약 20% 내지 약 50%, 약 20% 내지 약 60%, 약 20% 내지 약 70%, 약 20% 내지 약 80%, 약 20% 내지 약 90%, 약 20% 내지 약 95%, 약 20% 내지 약 100%, 약 30% 내지 약 40%, 약 30% 내지 약 50%, 약 30% 내지 약 60%, 약 30% 내지 약 70%, 약 30% 내지 약 80%, 약 30% 내지 약 90%, 약 30% 내지 약 95%, 약 30% 내지 약 100%, 약 40% 내지 약 50%, 약 40% 내지 약 60%, 약 40% 내지 약 70%, 약 40% 내지 약 80%, 약 40% 내지 약 90%, 약 40% 내지 약 95%, 약 40% 내지 약 100%, 약 50% 내지 약 60%, 약 50% 내지 약 70%, 약 50% 내지 약 80%, 약 50% 내지 약 90%, 약 50% 내지 약 95%, 약 50% 내지 약 100%, 약 60% 내지 약 70%, 약 60% 내지 약 80%, 약 60% 내지 약 90%, 약 60% 내지 약 95%, 약 60% 내지 약 100%, 약 70% 내지 약 80%, 약 70% 내지 약 90%, 약 70% 내지 약 95%, 약 70% 내지 약 100%, 약 80% 내지 약 90%, 약 80% 내지 약 95%, 약 80% 내지 약 100%, 약 90% 내지 약 95%, 약 90% 내지 약 100%, 또는 약 95% 내지 약 100% 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 스페이서 서열은 약 1%, 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95%, 또는 약 100% 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 스페이서 서열은 적어도 약 1%, 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 또는 약 95% 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 스페이서 서열은 최대 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95%, 또는 약 100% 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 스페이서 서열은 스페이서 서열에서 5'-3' 방향으로 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30 중 하나 이상에 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 가질 수 있다.
일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 스페이서 영역은 스페이서 서열의 5' 말단으로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 또는 29개 염기쌍인 위치 중 하나 이상에 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 가질 수 있다.
일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 스페이서 영역은 스페이서 서열의 3' 말단으로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 또는 29개 염기쌍인 위치 중 하나 이상에 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 가질 수 있다.
일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 tracrRNA 서열에서 하나 이상의 화학적 변형을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 30 내지 100개 염기쌍 길이의 tracrRNA 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 또는 130개 염기쌍 길이의 tracrRNA 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 약 30 내지 약 130개 염기쌍 길이의 tracrRNA 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 약 30 내지 약 40, 약 30 내지 약 50, 약 30 내지 약 60, 약 30 내지 약 70, 약 30 내지 약 75, 약 30 내지 약 80, 약 30 내지 약 90, 약 30 내지 약 100, 약 30 내지 약 110, 약 30 내지 약 120, 약 30 내지 약 130, 약 40 내지 약 50, 약 40 내지 약 60, 약 40 내지 약 70, 약 40 내지 약 75, 약 40 내지 약 80, 약 40 내지 약 90, 약 40 내지 약 100, 약 40 내지 약 110, 약 40 내지 약 120, 약 40 내지 약 130, 약 50 내지 약 60, 약 50 내지 약 70, 약 50 내지 약 75, 약 50 내지 약 80, 약 50 내지 약 90, 약 50 내지 약 100, 약 50 내지 약 110, 약 50 내지 약 120, 약 50 내지 약 130, 약 60 내지 약 70, 약 60 내지 약 75, 약 60 내지 약 80, 약 60 내지 약 90, 약 60 내지 약 100, 약 60 내지 약 110, 약 60 내지 약 120, 약 60 내지 약 130, 약 70 내지 약 75, 약 70 내지 약 80, 약 70 내지 약 90, 약 70 내지 약 100, 약 70 내지 약 110, 약 70 내지 약 120, 약 70 내지 약 130, 약 75 내지 약 80, 약 75 내지 약 90, 약 75 내지 약 100, 약 75 내지 약 110, 약 75 내지 약 120, 약 75 내지 약 130, 약 80 내지 약 90, 약 80 내지 약 100, 약 80 내지 약 110, 약 80 내지 약 120, 약 80 내지 약 130, 약 90 내지 약 100, 약 90 내지 약 110, 약 90 내지 약 120, 약 90 내지 약 130, 약 100 내지 약 110, 약 100 내지 약 120, 약 100 내지 약 130, 약 110 내지 약 120, 약 110 내지 약 130, 또는 약 120 내지 약 130개 염기쌍 길이의 tracrRNA 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 약 30, 약 40, 약 50, 약 60, 약 70, 약 75, 약 80, 약 90, 약 100, 약 110, 약 120, 또는 약 130개 염기쌍 길이의 tracrRNA 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 적어도 약 30, 약 40, 약 50, 약 60, 약 70, 약 75, 약 80, 약 90, 약 100, 약 110, 또는 약 120개 염기쌍 길이의 tracrRNA 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 최대 약 40, 약 50, 약 60, 약 70, 약 75, 약 80, 약 90, 약 100, 약 110, 약 120, 또는 약 130개 염기쌍 길이의 tracrRNA 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 70개 염기쌍 길이의 tracrRNA 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 73개 염기쌍 길이의 tracrRNA 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 68개 염기쌍 길이의 tracrRNA 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 71개 염기쌍 길이의 tracrRNA 서열을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, tracrRNA 서열은 총 1 내지 130개의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 또는 130개의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드의 tracrRNA 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, tracrRNA 서열은 총 약 1 내지 약 10개의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, tracrRNA 서열은 총 약 1 내지 약 2, 약 1 내지 약 3, 약 1 내지 약 4, 약 1 내지 약 5, 약 1 내지 약 6, 약 1 내지 약 7, 약 1 내지 약 8, 약 1 내지 약 9, 약 1 내지 약 10, 약 2 내지 약 3, 약 2 내지 약 4, 약 2 내지 약 5, 약 2 내지 약 6, 약 2 내지 약 7, 약 2 내지 약 8, 약 2 내지 약 9, 약 2 내지 약 10, 약 3 내지 약 4, 약 3 내지 약 5, 약 3 내지 약 6, 약 3 내지 약 7, 약 3 내지 약 8, 약 3 내지 약 9, 약 3 내지 약 10, 약 4 내지 약 5, 약 4 내지 약 6, 약 4 내지 약 7, 약 4 내지 약 8, 약 4 내지 약 9, 약 4 내지 약 10, 약 5 내지 약 6, 약 5 내지 약 7, 약 5 내지 약 8, 약 5 내지 약 9, 약 5 내지 약 10, 약 6 내지 약 7, 약 6 내지 약 8, 약 6 내지 약 9, 약 6 내지 약 10, 약 7 내지 약 8, 약 7 내지 약 9, 약 7 내지 약 10, 약 8 내지 약 9, 약 8 내지 약 10, 또는 약 9 내지 약 10개의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, tracrRNA 서열은 총 약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 약 6, 약 7, 약 8, 약 9, 또는 약 10개의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, tracrRNA 서열은 총 적어도 약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 약 6, 약 7, 약 8, 또는 약 9개의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, tracrRNA 서열은 총 최대 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 약 6, 약 7, 약 8, 약 9, 또는 약 10개의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, tracrRNA 서열은 총 약 10 내지 약 30개의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, tracrRNA 서열은 총 약 10 내지 약 15, 약 10 내지 약 20, 약 10 내지 약 25, 약 10 내지 약 30, 약 15 내지 약 20, 약 15 내지 약 25, 약 15 내지 약 30, 약 20 내지 약 25, 약 20 내지 약 30, 또는 약 25 내지 약 30개의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, tracrRNA 서열은 총 약 10, 약 15, 약 20, 약 25, 또는 약 30개의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, tracrRNA 서열은 총 적어도 약 10, 약 15, 약 20, 또는 약 25개의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 스페이서 영역은 총 최대 약 15, 약 20, 약 25, 또는 약 30개의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, tracrRNA 서열은 총 약 30 내지 약 130개의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, tracrRNA 서열은 총 약 30 내지 약 40, 약 30 내지 약 50, 약 30 내지 약 60, 약 30 내지 약 70, 약 30 내지 약 75, 약 30 내지 약 80, 약 30 내지 약 90, 약 30 내지 약 100, 약 30 내지 약 110, 약 30 내지 약 120, 약 30 내지 약 130, 약 40 내지 약 50, 약 40 내지 약 60, 약 40 내지 약 70, 약 40 내지 약 75, 약 40 내지 약 80, 약 40 내지 약 90, 약 40 내지 약 100, 약 40 내지 약 110, 약 40 내지 약 120, 약 40 내지 약 130, 약 50 내지 약 60, 약 50 내지 약 70, 약 50 내지 약 75, 약 50 내지 약 80, 약 50 내지 약 90, 약 50 내지 약 100, 약 50 내지 약 110, 약 50 내지 약 120, 약 50 내지 약 130, 약 60 내지 약 70, 약 60 내지 약 75, 약 60 내지 약 80, 약 60 내지 약 90, 약 60 내지 약 100, 약 60 내지 약 110, 약 60 내지 약 120, 약 60 내지 약 130, 약 70 내지 약 75, 약 70 내지 약 80, 약 70 내지 약 90, 약 70 내지 약 100, 약 70 내지 약 110, 약 70 내지 약 120, 약 70 내지 약 130, 약 75 내지 약 80, 약 75 내지 약 90, 약 75 내지 약 100, 약 75 내지 약 110, 약 75 내지 약 120, 약 75 내지 약 130, 약 80 내지 약 90, 약 80 내지 약 100, 약 80 내지 약 110, 약 80 내지 약 120, 약 80 내지 약 130, 약 90 내지 약 100, 약 90 내지 약 110, 약 90 내지 약 120, 약 90 내지 약 130, 약 100 내지 약 110, 약 100 내지 약 120, 약 100 내지 약 130, 약 110 내지 약 120, 약 110 내지 약 130, 또는 약 120 내지 약 130개의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, tracrRNA 서열은 약 30, 약 40, 약 50, 약 60, 약 70, 약 75, 약 80, 약 90, 약 100, 약 110, 약 120, 또는 약 130개의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, tracrRNA 서열은 총 적어도 약 30, 약 40, 약 50, 약 60, 약 70, 약 75, 약 80, 약 90, 약 100, 약 110, 또는 약 120개의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, tracrRNA 서열은 총 최대 약 40, 약 50, 약 60, 약 70, 약 75, 약 80, 약 90, 약 100, 약 110, 약 120, 또는 약 130개의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, tracrRNA 서열은 총 51개의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, tracrRNA 서열은 총 59개의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, tracrRNA 서열은 1% 내지 100% 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, tracrRNA 서열은 약 1% 내지 약 100% 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, tracrRNA 서열은 약 1% 내지 약 10%, 약 1% 내지 약 20%, 약 1% 내지 약 30%, 약 1% 내지 약 40%, 약 1% 내지 약 50%, 약 1% 내지 약 60%, 약 1% 내지 약 70%, 약 1% 내지 약 80%, 약 1% 내지 약 90%, 약 1% 내지 약 95%, 약 1% 내지 약 100%, 약 10% 내지 약 20%, 약 10% 내지 약 30%, 약 10% 내지 약 40%, 약 10% 내지 약 50%, 약 10% 내지 약 60%, 약 10% 내지 약 70%, 약 10% 내지 약 80%, 약 10% 내지 약 90%, 약 10% 내지 약 95%, 약 10% 내지 약 100%, 약 20% 내지 약 30%, 약 20% 내지 약 40%, 약 20% 내지 약 50%, 약 20% 내지 약 60%, 약 20% 내지 약 70%, 약 20% 내지 약 80%, 약 20% 내지 약 90%, 약 20% 내지 약 95%, 약 20% 내지 약 100%, 약 30% 내지 약 40%, 약 30% 내지 약 50%, 약 30% 내지 약 60%, 약 30% 내지 약 70%, 약 30% 내지 약 80%, 약 30% 내지 약 90%, 약 30% 내지 약 95%, 약 30% 내지 약 100%, 약 40% 내지 약 50%, 약 40% 내지 약 60%, 약 40% 내지 약 70%, 약 40% 내지 약 80%, 약 40% 내지 약 90%, 약 40% 내지 약 95%, 약 40% 내지 약 100%, 약 50% 내지 약 60%, 약 50% 내지 약 70%, 약 50% 내지 약 80%, 약 50% 내지 약 90%, 약 50% 내지 약 95%, 약 50% 내지 약 100%, 약 60% 내지 약 70%, 약 60% 내지 약 80%, 약 60% 내지 약 90%, 약 60% 내지 약 95%, 약 60% 내지 약 100%, 약 70% 내지 약 80%, 약 70% 내지 약 90%, 약 70% 내지 약 95%, 약 70% 내지 약 100%, 약 80% 내지 약 90%, 약 80% 내지 약 95%, 약 80% 내지 약 100%, 약 90% 내지 약 95%, 약 90% 내지 약 100%, 또는 약 95% 내지 약 100% 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, tracrRNA 서열은 약 1%, 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95%, 또는 약 100% 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, tracrRNA 서열은 적어도 약 1%, 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 또는 약 95% 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, tracrRNA 서열은 최대 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95%, 또는 약 100% 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 tracrRNA 서열은 tracrRNA 서열에서 5'-3' 방향으로 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 또는 130 중 하나 이상에 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 가질 수 있다.
일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 tracr 영역은 tracrRNA 서열의 5' 말단으로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 또는 129개 염기쌍인 위치 중 하나 이상에 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 가질 수 있다.
일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 tracr 영역은 tracrRNA 서열의 3' 말단으로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 또는 129개 염기쌍인 위치 중 하나 이상에 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 가질 수 있다.
일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA는 gRNA 서열의 5' 말단에서 하나 이상의 화학적 변형을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA는 gRNA 서열의 5' 말단에서 하나 이상의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA는 gRNA 서열의 3' 말단에서 하나 이상의 화학적 변형을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 는 gRNA 서열의 3' 말단에서 하나 이상의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA는 crRNA를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, crRNA는 하나 이상의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 crRNA는 30 내지 50개 염기쌍 길이일 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 crRNA는 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50개 염기쌍 길이일 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 crRNA는 약 30 내지 약 50개 염기쌍 길이일 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 crRNA는 약 30 내지 약 32, 약 30 내지 약 34, 약 30 내지 약 36, 약 30 내지 약 38, 약 30 내지 약 40, 약 30 내지 약 42, 약 30 내지 약 44, 약 30 내지 약 46, 약 30 내지 약 48, 약 30 내지 약 50, 약 32 내지 약 34, 약 32 내지 약 36, 약 32 내지 약 38, 약 32 내지 약 40, 약 32 내지 약 42, 약 32 내지 약 44, 약 32 내지 약 46, 약 32 내지 약 48, 약 32 내지 약 50, 약 34 내지 약 36, 약 34 내지 약 38, 약 34 내지 약 40, 약 34 내지 약 42, 약 34 내지 약 44, 약 34 내지 약 46, 약 34 내지 약 48, 약 34 내지 약 50, 약 36 내지 약 38, 약 36 내지 약 40, 약 36 내지 약 42, 약 36 내지 약 44, 약 36 내지 약 46, 약 36 내지 약 48, 약 36 내지 약 50, 약 38 내지 약 40, 약 38 내지 약 42, 약 38 내지 약 44, 약 38 내지 약 46, 약 38 내지 약 48, 약 38 내지 약 50, 약 40 내지 약 42, 약 40 내지 약 44, 약 40 내지 약 46, 약 40 내지 약 48, 약 40 내지 약 50, 약 42 내지 약 44, 약 42 내지 약 46, 약 42 내지 약 48, 약 42 내지 약 50, 약 44 내지 약 46, 약 44 내지 약 48, 약 44 내지 약 50, 약 46 내지 약 48, 약 46 내지 약 50, 또는 약 48 내지 약 50개 염기쌍 길이일 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 crRNA는 약 30, 약 32, 약 34, 약 36, 약 38, 약 40, 약 42, 약 44, 약 46, 약 48, 또는 약 50개 염기쌍 길이일 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 crRNA는 적어도 약 30, 약 32, 약 34, 약 36, 약 38, 약 40, 약 42, 약 44, 약 46, 또는 약 48개 염기쌍 길이일 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 crRNA는 최대 약 32, 약 34, 약 36, 약 38, 약 40, 약 42, 약 44, 약 46, 약 48, 또는 약 50개 염기쌍 길이일 수 있다.
일부 실시양태에서, crRNA는 총 1 내지 50개의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 crRNA는 총 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50개의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 crRNA는 총 약 1 내지 약 10개의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 crRNA는 총 약 1 내지 약 2, 약 1 내지 약 3, 약 1 내지 약 4, 약 1 내지 약 5, 약 1 내지 약 6, 약 1 내지 약 7, 약 1 내지 약 8, 약 1 내지 약 9, 약 1 내지 약 10, 약 2 내지 약 3, 약 2 내지 약 4, 약 2 내지 약 5, 약 2 내지 약 6, 약 2 내지 약 7, 약 2 내지 약 8, 약 2 내지 약 9, 약 2 내지 약 10, 약 3 내지 약 4, 약 3 내지 약 5, 약 3 내지 약 6, 약 3 내지 약 7, 약 3 내지 약 8, 약 3 내지 약 9, 약 3 내지 약 10, 약 4 내지 약 5, 약 4 내지 약 6, 약 4 내지 약 7, 약 4 내지 약 8, 약 4 내지 약 9, 약 4 내지 약 10, 약 5 내지 약 6, 약 5 내지 약 7, 약 5 내지 약 8, 약 5 내지 약 9, 약 5 내지 약 10, 약 6 내지 약 7, 약 6 내지 약 8, 약 6 내지 약 9, 약 6 내지 약 10, 약 7 내지 약 8, 약 7 내지 약 9, 약 7 내지 약 10, 약 8 내지 약 9, 약 8 내지 약 10, 또는 약 9 내지 약 10개의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 crRNA는 총 약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 약 6, 약 7, 약 8, 약 9, 또는 약 10개의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 crRNA는 총 적어도 약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 약 6, 약 7, 약 8, 또는 약 9개의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 crRNA는 총 최대 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 약 6, 약 7, 약 8, 약 9, 또는 약 10개의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 crRNA는 총 약 10 내지 약 30개의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 crRNA는 총 약 10 내지 약 15, 약 10 내지 약 20, 약 10 내지 약 25, 약 10 내지 약 30, 약 15 내지 약 20, 약 15 내지 약 25, 약 15 내지 약 30, 약 20 내지 약 25, 약 20 내지 약 30, 또는 약 25 내지 약 30 개의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 crRNA는 총 약 10, 약 15, 약 20, 약 25, 또는 약 30 개의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 crRNA는 총 적어도 약 10, 약 15, 약 20, 또는 약 25 개의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 crRNA는 총 최대 약 15, 약 20, 약 25, 또는 약 30 개의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 crRNA는 총 약 30 내지 약 50 개의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 crRNA는 총 약 30 내지 약 32, 약 30 내지 약 34, 약 30 내지 약 36, 약 30 내지 약 38, 약 30 내지 약 40, 약 30 내지 약 42, 약 30 내지 약 44, 약 30 내지 약 46, 약 30 내지 약 48, 약 30 내지 약 50, 약 32 내지 약 34, 약 32 내지 약 36, 약 32 내지 약 38, 약 32 내지 약 40, 약 32 내지 약 42, 약 32 내지 약 44, 약 32 내지 약 46, 약 32 내지 약 48, 약 32 내지 약 50, 약 34 내지 약 36, 약 34 내지 약 38, 약 34 내지 약 40, 약 34 내지 약 42, 약 34 내지 약 44, 약 34 내지 약 46, 약 34 내지 약 48, 약 34 내지 약 50, 약 36 내지 약 38, 약 36 내지 약 40, 약 36 내지 약 42, 약 36 내지 약 44, 약 36 내지 약 46, 약 36 내지 약 48, 약 36 내지 약 50, 약 38 내지 약 40, 약 38 내지 약 42, 약 38 내지 약 44, 약 38 내지 약 46, 약 38 내지 약 48, 약 38 내지 약 50, 약 40 내지 약 42, 약 40 내지 약 44, 약 40 내지 약 46, 약 40 내지 약 48, 약 40 내지 약 50, 약 42 내지 약 44, 약 42 내지 약 46, 약 42 내지 약 48, 약 42 내지 약 50, 약 44 내지 약 46, 약 44 내지 약 48, 약 44 내지 약 50, 약 46 내지 약 48, 약 46 내지 약 50, 또는 약 48 내지 약 50 개의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 crRNA는 총 약 30, 약 32, 약 34, 약 36, 약 38, 약 40, 약 42, 약 44, 약 46, 약 48, 또는 약 50 개의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 crRNA는 총 적어도 약 30, 약 32, 약 34, 약 36, 약 38, 약 40, 약 42, 약 44, 약 46, 또는 약 48 개의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 crRNA는 총 최대 약 32, 약 34, 약 36, 약 38, 약 40, 약 42, 약 44, 약 46, 약 48, 또는 약 50개의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, crRNA는 1% 내지 100% 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, crRNA는 약 1% 내지 약 100% 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, crRNA는 약 1% 내지 약 10%, 약 1% 내지 약 20%, 약 1% 내지 약 30%, 약 1% 내지 약 40%, 약 1% 내지 약 50%, 약 1% 내지 약 60%, 약 1% 내지 약 70%, 약 1% 내지 약 80%, 약 1% 내지 약 90%, 약 1% 내지 약 95%, 약 1% 내지 약 100%, 약 10% 내지 약 20%, 약 10% 내지 약 30%, 약 10% 내지 약 40%, 약 10% 내지 약 50%, 약 10% 내지 약 60%, 약 10% 내지 약 70%, 약 10% 내지 약 80%, 약 10% 내지 약 90%, 약 10% 내지 약 95%, 약 10% 내지 약 100%, 약 20% 내지 약 30%, 약 20% 내지 약 40%, 약 20% 내지 약 50%, 약 20% 내지 약 60%, 약 20% 내지 약 70%, 약 20% 내지 약 80%, 약 20% 내지 약 90%, 약 20% 내지 약 95%, 약 20% 내지 약 100%, 약 30% 내지 약 40%, 약 30% 내지 약 50%, 약 30% 내지 약 60%, 약 30% 내지 약 70%, 약 30% 내지 약 80%, 약 30% 내지 약 90%, 약 30% 내지 약 95%, 약 30% 내지 약 100%, 약 40% 내지 약 50%, 약 40% 내지 약 60%, 약 40% 내지 약 70%, 약 40% 내지 약 80%, 약 40% 내지 약 90%, 약 40% 내지 약 95%, 약 40% 내지 약 100%, 약 50% 내지 약 60%, 약 50% 내지 약 70%, 약 50% 내지 약 80%, 약 50% 내지 약 90%, 약 50% 내지 약 95%, 약 50% 내지 약 100%, 약 60% 내지 약 70%, 약 60% 내지 약 80%, 약 60% 내지 약 90%, 약 60% 내지 약 95%, 약 60% 내지 약 100%, 약 70% 내지 약 80%, 약 70% 내지 약 90%, 약 70% 내지 약 95%, 약 70% 내지 약 100%, 약 80% 내지 약 90%, 약 80% 내지 약 95%, 약 80% 내지 약 100%, 약 90% 내지 약 95%, 약 90% 내지 약 100%, 또는 약 95% 내지 약 100% 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, crRNA는 약 1%, 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95%, 또는 약 100% 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, crRNA는 적어도 약 1%, 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 또는 약 95% 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, crRNA는 최대 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95%, 또는 약 100% 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 crRNA는 crRNA 서열에서 5'-3' 방향으로 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50 중 하나 이상에 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 가질 수 있다.
일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 crRNA는crRNA 서열의 5' 말단으로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 또는 49개 염기쌍인 위치 중 하나 이상에 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 가질 수 있다.
일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 crRNA는 crRNA 서열의 3' 말단부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 또는 49개 염기쌍인 위치 중 하나 이상에 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 가질 수 있다.
일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA는 tracrRNA를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, tracrRNA는 하나 이상의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 tracrRNA는 총50 내지 130개 염기쌍 길이를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 tracrRNA는 총 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 또는 130개 염기쌍 길이를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 tracrRNA는 총 약 30 내지 약 130개 염기쌍 길이를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 tracrRNA는 총 약 30 내지 약 40, 약 30 내지 약 50, 약 30 내지 약 60, 약 30 내지 약 70, 약 30 내지 약 75, 약 30 내지 약 80, 약 30 내지 약 90, 약 30 내지 약 100, 약 30 내지 약 110, 약 30 내지 약 120, 약 30 내지 약 130, 약 40 내지 약 50, 약 40 내지 약 60, 약 40 내지 약 70, 약 40 내지 약 75, 약 40 내지 약 80, 약 40 내지 약 90, 약 40 내지 약 100, 약 40 내지 약 110, 약 40 내지 약 120, 약 40 내지 약 130, 약 50 내지 약 60, 약 50 내지 약 70, 약 50 내지 약 75, 약 50 내지 약 80, 약 50 내지 약 90, 약 50 내지 약 100, 약 50 내지 약 110, 약 50 내지 약 120, 약 50 내지 약 130, 약 60 내지 약 70, 약 60 내지 약 75, 약 60 내지 약 80, 약 60 내지 약 90, 약 60 내지 약 100, 약 60 내지 약 110, 약 60 내지 약 120, 약 60 내지 약 130, 약 70 내지 약 75, 약 70 내지 약 80, 약 70 내지 약 90, 약 70 내지 약 100, 약 70 내지 약 110, 약 70 내지 약 120, 약 70 내지 약 130, 약 75 내지 약 80, 약 75 내지 약 90, 약 75 내지 약 100, 약 75 내지 약 110, 약 75 내지 약 120, 약 75 내지 약 130, 약 80 내지 약 90, 약 80 내지 약 100, 약 80 내지 약 110, 약 80 내지 약 120, 약 80 내지 약 130, 약 90 내지 약 100, 약 90 내지 약 110, 약 90 내지 약 120, 약 90 내지 약 130, 약 100 내지 약 110, 약 100 내지 약 120, 약 100 내지 약 130, 약 110 내지 약 120, 약 110 내지 약 130, 또는 약 120 내지 약 130개 염기쌍 길이를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 tracrRNA는 총 약 30, 약 40, 약 50, 약 60, 약 70, 약 75, 약 80, 약 90, 약 100, 약 110, 약 120, 또는 약 130개 염기쌍 길이를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 tracrRNA는 총 적어도 약 30, 약 40, 약 50, 약 60, 약 70, 약 75, 약 80, 약 90, 약 100, 약 110, 또는 약 120개 염기쌍 길이를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 tracrRNA는 총 최대 약 40, 약 50, 약 60, 약 70, 약 75, 약 80, 약 90, 약 100, 약 110, 약 120, 또는 약 130개 염기쌍 길이를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 tracrRNA는 총 1 내지 130개의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 tracrRNA는 총 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 또는 130개의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 tracrRNA는 총 약 1 내지 약 10개의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 tracrRNA는 총 약 1 내지 약 2, 약 1 내지 약 3, 약 1 내지 약 4, 약 1 내지 약 5, 약 1 내지 약 6, 약 1 내지 약 7, 약 1 내지 약 8, 약 1 내지 약 9, 약 1 내지 약 10, 약 2 내지 약 3, 약 2 내지 약 4, 약 2 내지 약 5, 약 2 내지 약 6, 약 2 내지 약 7, 약 2 내지 약 8, 약 2 내지 약 9, 약 2 내지 약 10, 약 3 내지 약 4, 약 3 내지 약 5, 약 3 내지 약 6, 약 3 내지 약 7, 약 3 내지 약 8, 약 3 내지 약 9, 약 3 내지 약 10, 약 4 내지 약 5, 약 4 내지 약 6, 약 4 내지 약 7, 약 4 내지 약 8, 약 4 내지 약 9, 약 4 내지 약 10, 약 5 내지 약 6, 약 5 내지 약 7, 약 5 내지 약 8, 약 5 내지 약 9, 약 5 내지 약 10, 약 6 내지 약 7, 약 6 내지 약 8, 약 6 내지 약 9, 약 6 내지 약 10, 약 7 내지 약 8, 약 7 내지 약 9, 약 7 내지 약 10, 약 8 내지 약 9, 약 8 내지 약 10, 또는 약 9 내지 약 10개의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 tracrRNA는 총 약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 약 6, 약 7, 약 8, 약 9, 또는 약 10개의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 tracrRNA는 총 적어도 약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 약 6, 약 7, 약 8, 또는 약 9개의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 tracrRNA는 총 최대 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 약 6, 약 7, 약 8, 약 9, 또는 약 10개의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 tracrRNA는 총 약 10 내지 약 30개의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 tracrRNA는 총 약 10 내지 약 15, 약 10 내지 약 20, 약 10 내지 약 25, 약 10 내지 약 30, 약 15 내지 약 20, 약 15 내지 약 25, 약 15 내지 약 30, 약 20 내지 약 25, 약 20 내지 약 30, 또는 약 25 내지 약 30개의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 tracrRNA는 총 약 10, 약 15, 약 20, 약 25, 또는 약 30개의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 tracrRNA는 총 적어도 약 10, 약 15, 약 20, 또는 약 25개의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 스페이서 영역은 총 최대 약 15, 약 20, 약 25, 또는 약 30개의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 tracrRNA는 총 약 30 내지 약 130개의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 tracrRNA는 총 약 30 내지 약 40, 약 30 내지 약 50, 약 30 내지 약 60, 약 30 내지 약 70, 약 30 내지 약 75, 약 30 내지 약 80, 약 30 내지 약 90, 약 30 내지 약 100, 약 30 내지 약 110, 약 30 내지 약 120, 약 30 내지 약 130, 약 40 내지 약 50, 약 40 내지 약 60, 약 40 내지 약 70, 약 40 내지 약 75, 약 40 내지 약 80, 약 40 내지 약 90, 약 40 내지 약 100, 약 40 내지 약 110, 약 40 내지 약 120, 약 40 내지 약 130, 약 50 내지 약 60, 약 50 내지 약 70, 약 50 내지 약 75, 약 50 내지 약 80, 약 50 내지 약 90, 약 50 내지 약 100, 약 50 내지 약 110, 약 50 내지 약 120, 약 50 내지 약 130, 약 60 내지 약 70, 약 60 내지 약 75, 약 60 내지 약 80, 약 60 내지 약 90, 약 60 내지 약 100, 약 60 내지 약 110, 약 60 내지 약 120, 약 60 내지 약 130, 약 70 내지 약 75, 약 70 내지 약 80, 약 70 내지 약 90, 약 70 내지 약 100, 약 70 내지 약 110, 약 70 내지 약 120, 약 70 내지 약 130, 약 75 내지 약 80, 약 75 내지 약 90, 약 75 내지 약 100, 약 75 내지 약 110, 약 75 내지 약 120, 약 75 내지 약 130, 약 80 내지 약 90, 약 80 내지 약 100, 약 80 내지 약 110, 약 80 내지 약 120, 약 80 내지 약 130, 약 90 내지 약 100, 약 90 내지 약 110, 약 90 내지 약 120, 약 90 내지 약 130, 약 100 내지 약 110, 약 100 내지 약 120, 약 100 내지 약 130, 약 110 내지 약 120, 약 110 내지 약 130, 또는 약 120 내지 약 130개의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 tracrRNA는 총 약 30, 약 40, 약 50, 약 60, 약 70, 약 75, 약 80, 약 90, 약 100, 약 110, 약 120, 또는 약 130개의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 tracrRNA는 총 적어도 약 30, 약 40, 약 50, 약 60, 약 70, 약 75, 약 80, 약 90, 약 100, 약 110, 또는 약 120개의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 tracrRNA는 총 최대 약 40, 약 50, 약 60, 약 70, 약 75, 약 80, 약 90, 약 100, 약 110, 약 120, 또는 약 130개의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 tracrRNA는 약 1% 내지 약 100% 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 tracrRNA는 약 1% 내지 약 10%, 약 1% 내지 약 20%, 약 1% 내지 약 30%, 약 1% 내지 약 40%, 약 1% 내지 약 50%, 약 1% 내지 약 60%, 약 1% 내지 약 70%, 약 1% 내지 약 80%, 약 1% 내지 약 90%, 약 1% 내지 약 95%, 약 1% 내지 약 100%, 약 10% 내지 약 20%, 약 10% 내지 약 30%, 약 10% 내지 약 40%, 약 10% 내지 약 50%, 약 10% 내지 약 60%, 약 10% 내지 약 70%, 약 10% 내지 약 80%, 약 10% 내지 약 90%, 약 10% 내지 약 95%, 약 10% 내지 약 100%, 약 20% 내지 약 30%, 약 20% 내지 약 40%, 약 20% 내지 약 50%, 약 20% 내지 약 60%, 약 20% 내지 약 70%, 약 20% 내지 약 80%, 약 20% 내지 약 90%, 약 20% 내지 약 95%, 약 20% 내지 약 100%, 약 30% 내지 약 40%, 약 30% 내지 약 50%, 약 30% 내지 약 60%, 약 30% 내지 약 70%, 약 30% 내지 약 80%, 약 30% 내지 약 90%, 약 30% 내지 약 95%, 약 30% 내지 약 100%, 약 40% 내지 약 50%, 약 40% 내지 약 60%, 약 40% 내지 약 70%, 약 40% 내지 약 80%, 약 40% 내지 약 90%, 약 40% 내지 약 95%, 약 40% 내지 약 100%, 약 50% 내지 약 60%, 약 50% 내지 약 70%, 약 50% 내지 약 80%, 약 50% 내지 약 90%, 약 50% 내지 약 95%, 약 50% 내지 약 100%, 약 60% 내지 약 70%, 약 60% 내지 약 80%, 약 60% 내지 약 90%, 약 60% 내지 약 95%, 약 60% 내지 약 100%, 약 70% 내지 약 80%, 약 70% 내지 약 90%, 약 70% 내지 약 95%, 약 70% 내지 약 100%, 약 80% 내지 약 90%, 약 80% 내지 약 95%, 약 80% 내지 약 100%, 약 90% 내지 약 95%, 약 90% 내지 약 100%, 또는 약 95% 내지 약 100% 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 tracrRNA는 약 1%, 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95%, 또는 약 100% 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 tracrRNA는 적어도 약 1%, 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 또는 약 95% 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 tracrRNA는 최대 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95%, 또는 약 100% 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 tracrRNA는 tracrRNA 서열에서 5'-3' 방향으로 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 또는 130 중 하나 이상에 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 tracrRNA는 tracrRNA 서열의 5' 말단으로부터 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 또는 129개 염기쌍 중 하나 이상에 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 tracrRNA는 tracrRNA 서열의 3' 말단으로부터 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 또는 129개 염기쌍 중 하나 이상에 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 gRNA 서열의 5' 또는 3' 말단에 포스포로티오에이트(PS) 결합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 gRNA 또는 sgRNA 서열의 5' 말단에 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 PS 결합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 gRNA 또는 sgRNA 서열의 3' 말단에 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 PS 결합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 gRNA 또는 sgRNA 서열의 5' 및 3' 말단 각각에 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 PS 결합, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 gRNA 또는 sgRNA 서열의 5' 및 3' 말단 각각에 0, 1, 2 또는 3개의 PS 결합, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 gRNA 또는 sgRNA 서열의 5' 및 3' 말단 각각에 1개의 PS 결합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 gRNA 또는 sgRNA 서열의 5' 및 3' 말단 각각에 2개의 PS 결합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 gRNA 또는 sgRNA 서열의 5' 및 3' 말단 각각에 3개의 PS 결합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 gRNA 또는 sgRNA 서열의 5' 및 3' 말단 각각에 4개의 PS 결합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 gRNA 또는 sgRNA 서열의 5' 및 3' 말단 각각에 5개의 PS 결합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 gRNA 또는 sgRNA 서열의 5' 말단에 3개의 PS 결합 및 3' 말단에 0개의 PS 결합(즉, 변형 없음)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 gRNA 또는 sgRNA 서열의 5' 말단에 3개의 PS 결합 및 3' 말단에 1개의 PS 결합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 gRNA 또는 sgRNA 서열의 5' 말단에 3개의 PS 결합 및 3' 말단에 2개의 PS 결합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 gRNA 또는 sgRNA 서열의 5' 말단에 3개의 PS 결합 및 3' 말단에 4개의 PS 결합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 gRNA 또는 sgRNA 서열의 5' 말단에 3개의 PS 결합 및 3' 말단에 5개의 PS 결합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 gRNA 또는 sgRNA 서열의 5' 말단에 2개의 PS 결합 및 3' 말단에 0개의 PS 결합(즉, 변형 없음)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 gRNA 또는 sgRNA 서열의 5' 말단에 2개의 PS 결합 및 3' 말단에 1개의 PS 결합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 gRNA 또는 sgRNA 서열의 5' 말단에 2개의 PS 결합 및 3' 말단에 3개의 PS 결합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 gRNA 또는 sgRNA 서열의 5' 말단에 2개의 PS 결합 및 3' 말단에 4개의 PS 결합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 gRNA 또는 sgRNA 서열의 5' 말단에 2개의 PS 결합 및 3' 말단에 5개의 PS 결합을 포함한다.
일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 5' 말단에 2개 및 2개 이하의 연속적인 포스포로티오에이트(PS) 결합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 3' 말단에 2개 및 2개 이하의 연속적인 포스포로티오에이트(PS) 결합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 5' 말단에 3개의 연속적인 포스포로티오에이트(PS) 결합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 3' 말단에 3개의 연속적인 포스포로티오에이트(PS) 결합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 3' 말단 또는 5' 말단에 서열 5'-UsUsU-3'을 포함하고, 여기서 U는 우리딘을 나타내고 s는 포스포로티오에이트(PS) 결합을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 5' 말단에 3개의 포스포로티오에이트(PS) 결합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 3' 말단에 3개의 포스포로티오에이트(PS) 결합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 5' 말단에 2개의 포스포로티오에이트 결합을 포함하고, 여기서 2개의 포스포로티오에이트(PS) 결합은 5' 말단의 처음 2개의 뉴클레오티드 위치에서 2개의 연속적인 포스포로티오에이트(PS) 결합이다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 5' 말단에 2개의 포스포로티오에이트 결합을 포함하고, 여기서 2개의 포스포로티오에이트(PS) 결합은 5' 말단의 처음 3-10개 뉴클레오티드 내에 있다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 3' 말단에 2개의 포스포로티오에이트(PS) 결합을 포함하고, 여기서 2개의 포스포로티오에이트(PS) 결합은 3' 말단의 처음 2개의 뉴클레오티드 위치에서 2개의 연속적인 포스포로티오에이트(PS) 결합이다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 3' 말단에 2개의 포스포로티오에이트(PS) 결합을 포함하고, 여기서 2개의 포스포로티오에이트(PS) 결합은 3' 말단의 처음 3-10개 뉴클레오티드 내에 있다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 3' 말단에 서열 5'-UsUsUs-3'를 포함하며, 여기서 U는 우리딘을 나타내고 s는 포스포로티오에이트(PS) 결합을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 3' 말단에 서열 5'-UsUsU-3'을 포함하며, 여기서 U는 우리딘을 나타내고 s는 포스포로티오에이트(PS) 결합을 나타낸다.
일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 gRNA 또는 sgRNA 서열의 내부 위치에 PS 결합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 gRNA 또는 sgRNA 서열의 내부 위치에 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 PS 결합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 gRNA 또는 sgRNA 서열의 내부 위치에 1개의 PS 결합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 gRNA 또는 sgRNA 서열의 내부 위치에 2개의 PS 결합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 gRNA 또는 sgRNA 서열의 내부 위치에 3개의 PS 결합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 gRNA 또는 sgRNA 서열의 내부 위치에 4개의 PS 결합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 gRNA 또는 sgRNA 서열의 내부 위치에 5개의 PS 결합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 gRNA 또는 sgRNA 서열의 내부 위치에 6개의 PS 결합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 gRNA 또는 sgRNA 서열의 내부 위치에 7개의 PS 결합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 gRNA 또는 sgRNA 서열의 내부 위치에 8개의 PS 결합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 gRNA 또는 sgRNA 서열의 내부 위치에 9개의 PS 결합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 gRNA 또는 sgRNA 서열의 내부 위치에 10개의 PS 결합을 포함한다.
일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 gRNA 또는 sgRNA 서열의 5' 말단, 3' 말단, 또는 내부 위치, 또는 이들의 임의의 조합에 PS 결합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 gRNA 또는 sgRNA 서열의 5' 말단, 3' 말단, 또는 내부 위치, 또는 이들의 임의의 조합에 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 PS 결합을 포함한다.
일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 gRNA 또는 sgRNA 서열의 5' 말단에 2개의 PS 결합, 3' 말단에 3개의 PS 결합, 및 내부 위치에 0개의 PS 결합(즉, 변형 없음)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 gRNA 또는 sgRNA 서열의 5' 말단에 2개의 PS 결합, 3' 말단에 3개의 PS 결합, 및 내부 위치에 1개의 PS 결합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 gRNA 또는 sgRNA 서열의 5' 말단에 2개의 PS 결합, 3' 말단에 3개의 PS 결합, 및 내부 위치에 2개의 PS 결합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 gRNA 또는 sgRNA 서열의 5' 말단에 2개의 PS 결합, 3' 말단에 3개의 PS 결합, 및 내부 위치에 3개의 PS 결합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 gRNA 또는 sgRNA 서열의 5' 말단에 2개의 PS 결합, 3' 말단에 3개의 PS 결합, 및 내부 위치에 4개의 PS 결합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 gRNA 또는 sgRNA 서열의 5' 말단에 2개의 PS 결합, 3' 말단에 3개의 PS 결합, 및 내부 위치에 5개의 PS 결합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 gRNA 또는 sgRNA 서열의 5' 말단에 2개의 PS 결합, 3' 말단에 3개의 PS 결합, 및 내부 위치에 6개의 PS 결합을 포함한다.
일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 gRNA 또는 sgRNA 서열의 5' 말단에 3개의 PS 결합, 3' 말단에 2개의 PS 결합, 및 내부 위치에 0개의 PS 결합(즉, 변형 없음)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 gRNA 또는 sgRNA 서열의 5' 말단에 3개의 PS 결합, 3' 말단에 2개의 PS 결합, 및 내부 위치에 1개의 PS 결합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 gRNA 또는 sgRNA 서열의 5' 말단에 3개의 PS 결합, 3' 말단에 2개의 PS 결합, 및 내부 위치에 2개의 PS 결합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 gRNA 또는 sgRNA 서열의 5' 말단에 3개의 PS 결합, 3' 말단에 2개의 PS 결합, 및 내부 위치에 3개의 PS 결합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 gRNA 또는 sgRNA 서열의 5' 말단에 3개의 PS 결합, 3' 말단에 2개의 PS 결합, 및 내부 위치에 4개의 PS 결합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 gRNA 또는 sgRNA 서열의 5' 말단에 3개의 PS 결합, 3' 말단에 2개의 PS 결합, 및 내부 위치에 5개의 PS 결합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 gRNA 또는 sgRNA 서열의 5' 말단에 3개의 PS 결합, 3' 말단에 2개의 PS 결합, 및 내부 위치에 6개의 PS 결합을 포함한다.
일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 gRNA 또는 sgRNA 서열의 5' 말단에 2개의 PS 결합, 3' 말단에 2개의 PS 결합, 및 내부 위치에 0개의 PS 결합(즉, 변형 없음)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 gRNA 또는 sgRNA 서열의 5' 말단에 2개의 PS 결합 및 3' 말단에 2개의 PS 결합 및 내부 위치에 1개의 PS 결합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 gRNA 또는 sgRNA 서열의 5' 말단에 2개의 PS 결합 및 3' 말단에 2개의 PS 결합 및 내부 위치에 2개의 PS 결합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 gRNA 또는 sgRNA 서열의 5' 말단에 2개의 PS 결합 및 3' 말단에 2개의 PS 결합 및 내부 위치에 3개의 PS 결합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 gRNA 또는 sgRNA 서열의 5' 말단에 2개의 PS 결합 및 3' 말단에 2개의 PS 결합 및 내부 위치에 4개의 PS 결합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 gRNA 또는 sgRNA 서열의 5' 말단에 2개의 PS 결합 및 3' 말단에 2개의 PS 결합 및 내부 위치에 5개의 PS 결합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 gRNA 또는 sgRNA 서열의 5' 말단에 2개의 PS 결합 및 3' 말단에 2개의 PS 결합 및 내부 위치에 6개의 PS 결합을 포함한다.
일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 gRNA 또는 sgRNA 서열의 5' 말단에 3개의 PS 결합, 3' 말단에 3개의 PS 결합, 및 내부 위치에 0개의 PS 결합(즉, 변형 없음)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 gRNA 또는 sgRNA 서열의 5' 말단에 3개의 PS 결합 및 3' 말단에 3개의 PS 결합 및 내부 위치에 1개의 PS 결합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 gRNA 또는 sgRNA 서열의 5' 말단에 3개의 PS 결합 및 3' 말단에 3개의 PS 결합 및 내부 위치에 2개의 PS 결합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 gRNA 또는 sgRNA 서열의 5' 말단에 3개의 PS 결합 및 3' 말단에 3개의 PS 결합 및 내부 위치에 3개의 PS 결합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 gRNA 또는 sgRNA 서열의 5' 말단에 3개의 PS 결합 및 3' 말단에 3개의 PS 결합 및 내부 위치에 4개의 PS 결합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 gRNA 또는 sgRNA 서열의 5' 말단에 3개의 PS 결합 및 3' 말단에 3개의 PS 결합 및 내부 위치에 5개의 PS 결합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 gRNA 또는 sgRNA 서열의 5' 말단에 3개의 PS 결합 및 3' 말단에 3개의 PS 결합 및 내부 위치에 6개의 PS 결합을 포함한다.
일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 포스포디에스테르 결합을 갖는 추가의 변형된 또는 비변형된 뉴클레오티드(N)를 포함하며, 여기서 N은 A, C, G, U, dA(데옥시A), dC(데옥시C), dG(데옥시G), 또는 T, 및 이들의 임의의 조합이다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 포스포디에스테르 결합을 갖는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 추가 N을 포함하며, 여기서 N은 A, G, U, dA, dG, dC 또는 T, 및 이들의 임의의 조합이다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 5' 또는 3' 말단에 포스포디에스테르 결합을 갖는 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 추가 N을 포함한다. 한 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 5' 말단에 포스포디에스테르 결합을 갖는 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 추가 N을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 3' 말단에 포스포디에스테르 결합을 갖는 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 추가 N을 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 포스포디에스테르 결합을 갖는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 추가 N을 포함하며 각각의 N은 동일한 변형된 또는 비변형된 뉴클레오티드이다. 예를 들어, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 포스포디에스테르 결합을 갖는 4개의 추가 N을 포함할 수 있고 4개의 추가 N의 각각의 N은 A, C, G, U, dA, dC, dG, 또는 T이다. 예를 들어, 화학적으로 변형된 gRNA는 또는 sgRNA는 포스포디에스테르 결합을 갖는 4개의 추가 N을 포함할 수 있고 4개의 추가 N의 각각의 N은 A이다. 예를 들어, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 포스포디에스테르 결합을 갖는 3개의 추가 N을 포함할 수 있고 3개의 추가 N의 각각의 N은 A, C, G, U, dA, dC, dG, 또는 T 이다. 예를 들어, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 포스포디에스테르 결합을 갖는 3개의 추가 N을 포함할 수 있고 3개의 추가 N의 각각의 N은 A이다. 예를 들어, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 포스포디에스테르 결합을 갖는 3개의 추가 N을 포함할 수 있고 3개의 추가 N의 각각의 N은 C이다. 예를 들어, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 포스포디에스테르 결합을 갖는 3개의 추가 N을 포함할 수 있고 3개의 추가 N의 각각의 N은 G이다. 예를 들어, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 포스포디에스테르 결합을 갖는 3개의 추가 N을 포함할 수 있고 3개의 추가 N의 각각의 N은 U이다. 예를 들어, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 포스포디에스테르 결합을 갖는 3개의 추가 N을 포함할 수 있고 3개의 추가 N의 각각의 N은 dA이다. 예를 들어, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 포스포디에스테르 결합을 갖는 3개의 추가 N을 포함할 수 있고 3개의 추가 N의 각각의 N은 dC이다. 예를 들어, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 포스포디에스테르 결합을 갖는 3개의 추가 N을 포함할 수 있고 3개의 추가 N의 각각의 N은 dG이다. 예를 들어, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 포스포디에스테르 결합을 갖는 3개의 추가 N을 포함할 수 있고 3개의 추가 N의 각각의 N은 T이다.
일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 5' 또는 3' 말단에 포스포디에스테르 결합을 갖는 추가의 우라실(U)을 포함한다. 한 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 5' 말단에 포스포디에스테르 결합을 갖는 추가 U를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 3' 말단에 포스포디에스테르 결합을 갖는 추가 U를 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 5' 또는 3' 말단에 포스포디에스테르 결합을 갖는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 추가 U를 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 5' 말단에 포스포디에스테르 결합을 갖는 1개의 추가 U를 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 3' 말단에 포스포디에스테르 결합을 갖는 1개의 추가 U를 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 5' 말단에 포스포디에스테르 결합을 갖는 2개의 추가 U를 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 3' 말단에 포스포디에스테르 결합을 갖는 2개의 추가 U를 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 5' 말단에 포스포디에스테르 결합을 갖는 3개의 추가 U를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 3' 말단에 포스포디에스테르 결합을 갖는 3개의 추가 U를 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 5' 말단에 포스포디에스테르 결합을 갖는 4개의 추가 U를 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 3' 말단에 포스포디에스테르 결합을 갖는 4개의 추가 U를 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 5' 말단에 포스포디에스테르 결합을 갖는 5개의 추가 U를 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 3' 말단에 포스포디에스테르 결합을 갖는 5개의 추가 U를 포함한다.
일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 리보네불라린(본 출원에서, 예를 들어, 표 1 또는 표 24에서 "X"로 도시됨)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 리보네불라린을 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 리보네불라린을 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 1개의 리보네불라린을 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 2개의 리보네불라린을 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 3개의 리보네불라린을 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 4개의 리보네불라린을 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 5개의 리보네불라린을 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 6개의 리보네불라린을 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 7개의 리보네불라린을 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 8개의 리보네불라린을 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 9개의 리보네불라린을 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 10개의 리보네불라린을 포함한다. 일부 실시양태에서, 네불라린은 비변형된 gRNA 또는 sgRNA 또는 sgRNA 또는 sgRNA에서 아데닌을 대체한다. 일부 실시양태에서, 네불라린은 스페이서 서열에 있다. 일부 실시양태에서, 네불라린은 tracrRNA 서열에 있다. 일부 실시양태에서, 네불라린은 tracrRNA 서열의 crRNA 서열에 있다. 일부 실시양태에서, 네불라린은 tracrRNA 서열의 줄기 루프 구조에 있다.
일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 2'-O-메틸네불라린(본 출원에서, 예를 들어, 표 1 또는 표 24에서 "x"로 도시됨)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 2'-O-메틸네불라린을 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 2'-O-메틸네불라린을 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 1개의 2'-O-메틸네불라린을 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 2개의 2'-O-메틸네불라린을 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 3개의 2'-O-메틸네불라린을 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 4개의 2'-O-메틸네불라린을 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 5개의 2'-O-메틸네불라린을 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 6개의 2'-O-메틸네불라린을 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 7개의 2'-O-메틸네불라린을 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 8개의 2'-O-메틸네불라린을 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 9개의 2'-O-메틸네불라린을 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 10개의 2'-O-메틸네불라린을 포함한다. 일부 실시양태에서, 2'-O-메틸네불라린은 비변형된 gRNA 또는 sgRNA 또는 sgRNA 또는 sgRNA에서 아데닌을 대체한다. 일부 실시양태에서, 2'-O-메틸네불라린은 스페이서 서열에 있다. 일부 실시양태에서, 2'-O-메틸네불라린은 tracrRNA 서열에 있다. 일부 실시양태에서, 2'-O-메틸네불라린은 tracrRNA 서열의 crRNA 서열에 있다. 일부 실시양태에서, 2'-O-메틸네불라린은 tracrRNA 서열의 줄기 루프 구조에 있다.
일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 2'-데옥시네불라린(본 출원에서, 예를 들어, 표 1 또는 표 24에서 "dX"로 도시됨)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 2'-데옥시네불라린을 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 2'-데옥시네불라린을 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 1개의 2'-데옥시네불라린을 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 2개의 2'-데옥시네불라린을 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 3개의 2'-데옥시네불라린을 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 4개의 2'-데옥시네불라린을 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 5개의 2'-데옥시네불라린을 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 6개의 2'-데옥시네불라린을 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 7개의 2'-데옥시네불라린을 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 8개의 2'-데옥시네불라린을 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 9개의 2'-데옥시네불라린을 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 10개의 2'-데옥시네불라린을 포함한다. 일부 실시양태에서, 2'-데옥시네불라린은 비변형된 gRNA 또는 sgRNA 또는 sgRNA 또는 sgRNA에서 아데닌을 대체한다. 일부 실시양태에서, 2'-데옥시네불라린은 스페이서 서열에 있다. 일부 실시양태에서, 2'-데옥시네불라린은 tracrRNA 서열에 있다. 일부 실시양태에서, 2'-데옥시네불라린은 tracrRNA 서열의 crRNA 서열에 있다. 일부 실시양태에서, 2'-데옥시네불라린은 tracrRNA 서열의 줄기 루프 구조에 있다.
일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 2'-O-메틸리보뉴클레오티드(2'-OMe)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 약 0 내지 약 70개의 2'-OMe를 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 또는 70개의 2'-OMe를 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 약 0 내지 약 70개의 2'-OMe를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 약 0 내지 약 10, 약 0 내지 약 20, 약 0 내지 약 30, 약 0 내지 약 35, 약 0 내지 약 40, 약 0 내지 약 45, 약 0 내지 약 50, 약 0 내지 약 55, 약 0 내지 약 60, 약 0 내지 약 65, 약 0 내지 약 70, 약 10 내지 약 20, 약 10 내지 약 30, 약 10 내지 약 35, 약 10 내지 약 40, 약 10 내지 약 45, 약 10 내지 약 50, 약 10 내지 약 55, 약 10 내지 약 60, 약 10 내지 약 65, 약 10 내지 약 70, 약 20 내지 약 30, 약 20 내지 약 35, 약 20 내지 약 40, 약 20 내지 약 45, 약 20 내지 약 50, 약 20 내지 약 55, 약 20 내지 약 60, 약 20 내지 약 65, 약 20 내지 약 70, 약 30 내지 약 35, 약 30 내지 약 40, 약 30 내지 약 45, 약 30 내지 약 50, 약 30 내지 약 55, 약 30 내지 약 60, 약 30 내지 약 65, 약 30 내지 약 70, 약 35 내지 약 40, 약 35 내지 약 45, 약 35 내지 약 50, 약 35 내지 약 55, 약 35 내지 약 60, 약 35 내지 약 65, 약 35 내지 약 70, 약 40 내지 약 45, 약 40 내지 약 50, 약 40 내지 약 55, 약 40 내지 약 60, 약 40 내지 약 65, 약 40 내지 약 70, 약 45 내지 약 50, 약 45 내지 약 55, 약 45 내지 약 60, 약 45 내지 약 65, 약 45 내지 약 70, 약 50 내지 약 55, 약 50 내지 약 60, 약 50 내지 약 65, 약 50 내지 약 70, 약 55 내지 약 60, 약 55 내지 약 65, 약 55 내지 약 70, 약 60 내지 약 65, 약 60 내지 약 70, 또는 약 65 내지 약 70개의 2'-OMe를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 약 0, 약 10, 약 20, 약 30, 약 35, 약 40, 약 45, 약 50, 약 55, 약 60, 약 65, 또는 약 70개의 2'-OMe를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 적어도 약 0, 약 10, 약 20, 약 30, 약 35, 약 40, 약 45, 약 50, 약 55, 약 60, 또는 약 65개의 2'-OMe를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 최대 약 10, 약 20, 약 30, 약 35, 약 40, 약 45, 약 50, 약 55, 약 60, 약 65, 또는 약 70개의 2'-OMe를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 2'-OMe를 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 62개의 2'-OMe를 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 54개의 2'-OMe를 포함한다.
일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 gRNA 또는 sgRNA 서열의 5' 말단에 2'-OMe를 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 gRNA 또는 sgRNA 서열의 3' 말단에 2'-OMe를 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 gRNA 또는 sgRNA 서열의 내부 위치에 2'-OMe를 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 gRNA 또는 sgRNA 서열의 5' 말단, 3' 말단, 또는 내부 위치에 2'-OMe를 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 gRNA 또는 sgRNA 서열의 5' 말단, 3' 말단, 및 내부 위치에 2'-OMe를 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 gRNA 또는 sgRNA 서열에서 5'-3' 방향으로 위치 2, 3, 4, 23, 24, 25, 27, 31, 또는 42, 또는 이들의 임의의 조합에서 2'-OMe를 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 gRNA 또는 sgRNA 서열에서 5'-3' 방향으로 위치 2, 3, 4, 23, 24, 25, 27, 31, 및 42에서 2'-OMe를 포함하지 않는다.
예시적인 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA 서열은 하기에 나타낸다:
5' - csasgsGUUCCAUGGGAUGCUCUgUUUUAGagcuaGaaauagcaaGUUaAaAuAaggCUaGUCcGUUAucAAcuuGaaaaaguGgcaccgAgUCggugcusususu - 3 (서열 번호 55)
여기서 대문자 A, U, G, 또는 C는 리보뉴클레오티드 아데노신, 우리딘, 구아닌, 또는 시티딘을 나타내고, 소문자 a, u, g, 및 c는 2'-O-메틸 변형된 아데닌, 우리딘, 구아닌, 및 시티딘을 나타내고, "s"는 포스포로티오에이트(PS) 결합을 나타낸다.
예시적인 화학적으로 변형된 스페이서 서열은 하기에 나타낸다:
5' - csasgsGUUCCAUGGGAUGCUCU - 3' (서열 번호 56)
여기서 대문자 A, U, G, 또는 C는 리보뉴클레오티드 아데노신, 우리딘, 구아닌, 또는 시티딘을 나타내고, 소문자 a, u, g, 및 c는 2'-O-메틸 변형된 아데닌, 우리딘, 구아닌, 및 시티딘을 나타내고, "s"는 포스포로티오에이트(PS) 결합을 나타낸다.
예시적인 화학적으로 변형된 tracrRNA 서열은 하기에 나타낸다:
5' - gUUUUAGagcuaGaaauagcaaGUUaAaAuAaggCUaGUCcGUUAucAAcuuGaaaaaguGgcaccgAgUCggugcusususu - 3' (서열 번호 57)
여기서 대문자 A, U, G, 또는 C는 리보뉴클레오티드 아데노신, 우리딘, 구아닌, 또는 시티딘을 나타내고, 소문자 a, u, g, 및 c는 2'-O-메틸 변형된 아데닌, 우리딘, 구아닌, 및 시티딘을 나타내고, "s"는 포스포로티오에이트(PS) 결합을 나타낸다.
또 다른 예시적인 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA 서열은 하기에 나타낸다:
5' - csasgsGUUCCAUGGGAUGCUCUgUUUUAGagcuagaaauagcaaGUUaAaAuAaggcuaGUccGUUAucAAcuugaaaaagugGcaccgagucggugcusususu - 3' (서열 번호 55)
여기서 대문자 A, U, G, 또는 C는 리보뉴클레오티드 아데노신, 우리딘, 구아닌, 또는 시티딘을 나타내고, 소문자 a, u, g, 및 c는 2'-O-메틸 변형된 아데닌, 우리딘, 구아닌, 및 시티딘을 나타내고, "s"는 포스포로티오에이트(PS) 결합을 나타낸다.
또 다른 예시적인 화학적으로 변형된 tracrRNA 서열은 하기에 나타낸다:
5'-gUUUUAGagcuagaaauagcaaGUUaAaAuAaggcuaGUccGUUAucAAcuugaaaaagugGcaccgagucggugcusususu-3' (서열 번호 57)
또 다른 예시적인 화학적으로 변형된 가이드 RNA 서열은 하기에 나타낸다:
5' - cscscsGCACCTTGGCGCAGCGGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUsususu -3' (서열 번호 58), 여기서 대문자 A, U, G, 또는 C는 리보뉴클레오티드 아데노신, 우리딘, 구아닌, 또는 시티딘을 나타내고, 소문자 a, u, g, 및 c는 2'-O-메틸 변형된 아데닌, 우리딘, 구아닌, 및 시티딘을 나타내고, "s"는 포스포로티오에이트(PS) 결합을 나타낸다.
또 다른 예시적인 화학적으로 변형된 가이드 RNA 서열은 하기에 나타낸다:
5' - asasgsAUACCUGAAUAACCCUCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUsususu-3' (서열 번호 59) (GA091)
또 다른 예시적인 화학적으로 변형된 가이드 RNA 서열은 하기에 나타낸다:
5' - asasgsAUACCUGAAUAACCCUCGUUUUAGAgcuagaaauagcAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAacuugaaaaaguggcaccgagucggugcusususu 3' (서열 번호 60) (GA098)
여기서 대문자 A, U, G, 또는 C는 리보뉴클레오티드 아데노신, 우리딘, 구아닌, 또는 시티딘을 나타내고, 소문자 a, u, g, 및 c는 2'-O-메틸 변형된 아데닌, 우리딘, 구아닌, 및 시티딘을 나타내고, "s"는 포스포로티오에이트(PS) 결합을 나타낸다.
또 다른 예시적인 화학적으로 변형된 가이드 RNA 서열은 하기에 나타낸다:
5' - asasgsAUACCUGAAUAACCCUCgUUUUAGagcuaGaaauagcaaGUUaAaAuAaggCUaGUCcGUUAucAAcuuGaaaaaguGgcaccgAgUCggugcusususu-3' (서열 번호 59) (GA099)
여기서 대문자 A, U, G, 또는 C는 리보뉴클레오티드 아데노신, 우리딘, 구아닌, 또는 시티딘을 나타내고, 소문자 a, u, g, 및 c는 2'-O-메틸 변형된 아데닌, 우리딘, 구아닌, 및 시티딘을 나타내고, "s"는 포스포로티오에이트(PS) 결합을 나타낸다.
또 다른 예시적인 화학적으로 변형된 가이드 RNA 서열은 하기에 나타낸다:
5' - asasgsAUACCUGAAUAACCCUCgUUUUAGagcuagaaauagcaaGUUaAaAuAaggcuaGUccGUUAucAAcuugaaaaagugGcaccgagucggugcusususu-3' (서열 번호 59) (GA100)
여기서 대문자 A, U, G, 또는 C는 리보뉴클레오티드 아데노신, 우리딘, 구아닌, 또는 시티딘을 나타내고, 소문자 a, u, g, 및 c는 2'-O-메틸 변형된 아데닌, 우리딘, 구아닌, 및 시티딘을 나타내고, "s"는 포스포로티오에이트(PS) 결합을 나타낸다.
또 다른 예시적인 화학적으로 변형된 가이드 RNA 서열은 하기에 나타낸다:
5'- cscscsGCACCUUGGCGCAGCGGgUUUUAGagcuagaaauagcaaGUUaAaAuAaggcuaGUccGUUAucAAcuugaaaaagugGcaccgagucggugcusususuuuu-3' (서열 번호 11) (GA385)
여기서 대문자 A, U, G, 또는 C는 리보뉴클레오티드 아데노신, 우리딘, 구아닌, 또는 시티딘을 나타내고, 소문자 a, u, g, 및 c는 2'-O-메틸 변형된 아데닌, 우리딘, 구아닌, 및 시티딘을 나타내고, "s"는 포스포로티오에이트(PS) 결합을 나타낸다.
또 다른 예시적인 화학적으로 변형된 가이드 RNA 서열은 하기에 나타낸다:
5'- cscscsGCACCUUGGCGCAGCGGgUUUUAGagcuagaaauagcaaGUUaAaAuAaggcuaGUccGUUAucAAcuugaaaaagugGcaccgagucggugcusususuuUu-3' (서열 번호 11) (GA386),
여기서 대문자 A, U, G, 또는 C는 리보뉴클레오티드 아데노신, 우리딘, 구아닌, 또는 시티딘을 나타내고, 소문자 a, u, g, 및 c는 2'-O-메틸 변형된 아데닌, 우리딘, 구아닌, 및 시티딘을 나타내고, "s"는 포스포로티오에이트(PS) 결합을 나타낸다.
또 다른 예시적인 화학적으로 변형된 가이드 RNA 서열은 하기에 나타낸다:
5'- cscscsGCACCUUGGCGCAGCGgUUUUAGagcuaGaaauagcaaGUUaAaAuAaggcuaGUccGUUAucAAcuuGaaaaagugGcaccgagucggugcuususuuuu-3' (서열 번호 12), (GA387)
여기서 대문자 A, U, G, 또는 C는 리보뉴클레오티드 아데노신, 우리딘, 구아닌, 또는 시티딘을 나타내고, 소문자 a, u, g, 및 c는 2'-O-메틸 변형된 아데닌, 우리딘, 구아닌, 및 시티딘을 나타내고, "s"는 포스포로티오에이트(PS) 결합을 나타낸다.
추가로 화학적으로 변형된 가이드 RNA 서열 및 표적 유전자 정보는 표 1 또는 표 24에 제공되어 있다.
일부 실시양태에서, 화학적 변형은 포스포로티오에이트 결합(PS)을 포함한다. 일부 실시양태에서, sgRNA는 5' 말단 또는 3' 말단에 포스포로티오에이트 결합(PS)을 포함한다. 일부 실시양태에서, sgRNA는 5' 말단 또는 3' 말단에 2개 이하의 연속적인 포스포로티오에이트 결합(PS)을 포함한다. 일부 실시양태에서, sgRNA는 5' 말단 또는 3' 말단에 3개의 연속적인 포스포로티오에이트 결합(PS)을 포함한다. 일부 실시양태에서, sgRNA는 3' 말단 또는 5' 말단에 서열 5'-UsUsU-3'을 포함하고, 여기서 U는 우리딘을 나타내고 s는 포스포로티오에이트 결합(PS)을 나타낸다.
일부 측면에서, (i) 스페이서 서열 및 (ii) tracrRNA 서열을 포함하는 sgRNA가 본원에 제공되며, 여기서 스페이서 서열은 표적 폴리뉴클레오티드와 접촉될 때 PCSK9 유전자 또는 ANGPTL3 유전자 내 표적 폴리뉴클레오티드 서열과 혼성화하고. tracrRNA 서열은 염기 에디터 시스템과 접촉될 때 염기 에디터 시스템에서 Cas 단백질에 결합하고, sgRNA는 네불라린 또는 데옥시네불라린을 포함한다. 일부 실시양태에서, 네불라린 또는 데옥시네불라린은 비변형된 sgRNA에서 아데닌을 대체한다. 일부 실시양태에서, 네불라린 또는 데옥시네불라린은 스페이서 서열에 있다. 일부 실시양태에서, 네불라린 또는 데옥시네불라린은 tracrRNA 서열에 있다. 일부 실시양태에서, 네불라린 또는 데옥시네불라린은 tracrRNA 서열에 있다. 일부 실시양태에서, 네불라린 또는 데옥시네불라린은 tracrRNA 서열의 crRNA 서열에 있다. 일부 실시양태에서, 네불라린 또는 데옥시네불라린은 tracrRNA 서열의 줄기 루프 구조에 있다.
일부 측면에서, 표 1 또는 표 24로부터 선택된 서열을 포함하는 단일 가이드 RNA가 본원에 제공되며, 여기서 a, u, g, 및 c는 2'-OMe 변형된 아데닌, 우리딘, 구아닌, 및 시티딘을 나타내고, 여기서 s는 포스포로티오에이트(PS) 결합을 나타낸다.
일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 가이드 RNA는 비변형된 tracrRNA 서열
GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU (서열 번호 61)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 가이드 RNA는 tracrRNA 서열
GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU (서열 번호 61)를 포함하며, 이는 하나 이상의 변형을 포함한다.
일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 가이드 RNA는 표 1 또는 표 24에 열거된 화학적으로 변형된 가이드 RNA 중 어느 하나에 대해 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.7%, 또는 적어도 99.9% 동일한 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 가이드 RNA는 표 1 또는 표 24에 열거된 화학적으로 변형된 가이드 RNA 중 어느 하나를 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 가이드 RNA는 표 1 또는 표 24에 열거된 화학적으로 변형된 가이드 RNA 중 어느 하나이다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 가이드 RNA는 서열 번호 9-11, 55, 59, 253-452, 1618-1635, 1637-1800, 1802-2135, 및 2191에 열거된 화학적으로 변형된 가이드 RNA 중 어느 하나에 대해 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.7%, 또는 적어도 99.9% 동일한 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 가이드 RNA는 서열 번호 9-11, 55, 59, 253-452, 1618-1635, 1637-1800, 1802-2135, 및 2191의 화학적으로 변형된 가이드 RNA 중 어느 하나를 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 가이드 RNA는 서열 번호 9-11, 55, 59, 253-452, 1618-1635, 1637-1800, 1802-2135, 및 2191의 화학적으로 변형된 가이드 RNA 중 어느 하나이다.
스플라이스 부위에서 염기 편집
한 측면에서, 표적 유전자의 스플라이스 부위에서 엑손 및 인트론의 경계(스플라이스 부위)에서 발생하는 DNA 서열의 유전적 변경을 생성함으로써 표적 유전자를 변형시키기 위한 염기 에디터 시스템 및 이를 사용하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 염기 에디터 시스템은 표적 유전자의 스플라이스 억셉터 부위에서 핵염기를 변형시킨다. 일부 실시양태에서, 염기 에디터 시스템은 표적 유전자의 스플라이스 도너 부위에서 핵염기를 변형시킨다. 스플라이스 도너 또는 스플라이스 억셉터 부위에서의 변형은 대체된 전사물을 생성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 스플라이스 도너 또는 스플라이스 억셉터 부위에서의 변형은 비정상 전사물을 생성한다. 일부 실시양태에서, 스플라이스 도너 또는 스플라이스 억셉터 부위에서의 변형은 전사 시 분해의 대상이 되는 불안정한 전사물을 생성한다. 일부 실시양태에서, 스플라이스 도너 또는 스플라이스 억셉터 부위에서의 변형은 전사물에서 조기 정지 코돈을 생성한다. 특정 실시양태에서, 방법은 스플라이스 억셉터-스플라이스 도너(SA-SD) 부위 또는 조기 정지(pmSTOP) 부위를 표적화함으로써 유전자를 녹아웃 또는 녹다운시키는 단계를 포함한다. 이러한 방법의 경우, 가이드 폴리뉴클레오티드는 표적 뉴클레오티드 서열 내의 하나 이상의 스플라이스 억셉터/도너 부위를 파괴하도록 설계된다. 일부 실시양태에서, 가이드 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, 단일 가이드 RNA는 유기체의 게놈에서 표적 서열에 상보적이고 표적 염기쌍을 포함하는 적어도 10개의 연속 뉴클레오티드의 서열 또는 17-23개의 연속 뉴클레오티드의 서열을 포함한다.
SA-SD 부위의 파괴는 정지 코돈 번역초과(read thorugh) 없이 코딩 서열 및 비코딩 RNA(ncRNA)를 녹아웃시킬 수 있기 때문에 특히 유리하다. 염기 편집의 효율성은 생어 시퀀싱 트레이스의 EditR 분석 또는 차세대 시퀀싱(NGS)에 의해 게놈 수준에서, 또한 유세포 분석에 의해 단백질 수준에서 결정될 수 있다. 스플라이스 도너 영역과 스플라이스 억셉터 영역을 표적화하는 스플라이스 억셉터-스플라이스 도너 염기 편집 gRNA는 적어도 5%, 일부 경우에 적어도 80% 이상(예를 들어, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%)의 염기 전환 효율을 나타낸다. 일부 경우에, SA-SD gRNA가 조기 정지 코돈 파괴를 도입하는 gRNA보다 C에서 T로의 전환에서 훨씬 더 효율적이다.
SA-SD 부위를 표적화하기 위한 가이드 RNA는 모든 ncRNA 및 단백질 코딩 유전자 SA-SD 부위를 표적화하는 gRNA를 식별하는 R 기반 프로그램을 사용하여 설계될 수 있다. 일부 경우에, 사용자는 참조 게놈, 참조 서열의 Ensembl 전사물 ID, 프로토스페이서 인접 모티프(PAM) 부위, 엑손-인트론 경계의 상류 및 하류 서브셋까지의 거리를 제공한다. 프로그램은 엑손-인트론 경계의 상류 20개 염기쌍 + PAM 길이 및 하류 15개 염기쌍의 서열과 스플라이스 부위 모티프를 추출한다. 일부 실시양태에서, 가이드 분자는 길이가 20 내지 120개 이상의 염기일 수 있다. 특정 실시양태에서, 가이드 분자는 길이가 20 내지 60개 염기, 또는 20 내지 50개 염기, 또는 30 내지 50개 염기, 또는 39 내지 46개 염기일 수 있다.
일부 경우에, 포유동물 세포 내로 형질감염될 때 안정성이 증가된 화학적으로 변형된 gRNA를 사용하는 것이 유리하다. 예를 들어, gRNA는 각 gRNA의 적어도 하나의 5' 뉴클레오티드 및 적어도 하나의 3' 뉴클레오티드에 2'-O-메틸 포스포티오에이트 변형을 포함하도록 화학적으로 변형될 수 있다. 일부 경우에, 3개의 말단 5' 뉴클레오티드 및 3개의 말단 3' 뉴클레오티드는 2'-O-메틸 포스포티오에이트 변형을 포함하도록 화학적으로 변형된다.
한 측면에서, 염기 편집 파괴를 위해 질환을 표적화하기 위한 염기 에디터 시스템 및 방법이 본원에 제공된다. 표적 서열은 당업계에 확립된 바와 같이 임의의 질환 관련 폴리뉴클레오티드 또는 유전자일 수 있다.
특정 이론에 얽매이지 않고, 치료 목적을 위해 생체 내에서 유전자를 파괴하는 것이 목표인 경우, 시토신 염기 에디터를 사용하여 글루타민(CAG-TAG, CAA-TAA), 아르기닌(CGA-TGA), 및 트립토판(TGG-TAG/TAA/TGA, 안티센스 가닥의 시토신 편집으로)에 대한 특정 코돈을 변경함으로써 정지 코돈을 유전자의 코딩 서열에 직접 도입할 수 있다(넌센스 돌연변이). 특정 실시양태에서, 아데닌 염기 에디터를 사용하여 표적 유전자의 스플라이스 부위에서 핵염기를 변형함으로써 유전자 기능 및/또는 발현을 파괴할 수 있다. 특히 gRNA 비의존적 오프 타겟 DNA 염기 편집과 관련하여, 아데닌 염기 에디터의 더 유리한 오프 타겟 프로파일은 치료 목적으로 시토신 염기 에디터보다 아데닌 염기 에디터의 사용을 권장한다. 일부 실시양태에서, 염기 에디터, 예를 들어 본원에 기재된 아데노신 핵염기 에디터는 인트론의 5' 말단에서 스플라이스 도너 또는 인트론의 3' 말단에서 스플라이스 억셉터를 파괴하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 스플라이스 부위 파괴는 전령 RNA(mRNA)에서 인트론 서열의 포함(단백질 활성을 파괴하는 조기 정지 코돈 또는 아미노산의 삽입/결실을 초래하는 넌센스, 프레임 이동 또는 프레임 내 삽입-결실 돌연변이의 잠재적으로 도입) 또는 넌센스, 프레임 이동 또는 프레임 내 삽입-결실 돌연변이를 또한 도입할 수 있는 엑손 서열의 배제를 초래한다.
표준 스플라이스 도너는 센스 가닥의 DNA 서열 GT를 포함하는 반면, 표준 스플라이스 억셉터는 DNA 서열 AG를 포함한다. 일부 실시양태에서, 염기 에디터, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 아데노신 핵염기 에디터를 사용하여 서열의 변경이 정상적인 스플라이싱을 방해하는 서열 변경을 생성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 아데노신 염기 에디터는 안티센스 가닥의 제2 위치에서 상보적 염기를 파괴한다(GT-GC). 일부 실시양태에서, 아데노신 염기 에디터는 센스 가닥의 제1 위치를 파괴한다(AG-GG).
질환과 관련된 표적 유전자의 발현을 감소시키거나 없애는 내인성 유전자 서열의 돌연변이 또는 파괴의 유용한 적용의 예는 오프 타겟 효과, 삽입-결실빈도, 및/또는 종래의 CRISPR-Cas9 뉴클레아제 변형으로 인한 이중 가닥 파손과 관련된 기타 의도하지 않은 유전자 중단을 현저하게 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 표적 유전자는 PCSK9 유전자이다. 일부 실시양태에서, 표적 유전자는 ANGPTL3 유전자이다.
본 개시 내용의 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 염기 에디터 융합 단백질의 프로그램 가능한 DNA 결합 구성요소, 예컨대 Cas 단백질(예를 들어, Cas9 단백질, 뉴클레아제 불활성 Cas9 단백질, Cas9 닉카아제)과 가이드 RNA(예를 들어, gRNA 또는 sgRNA) 사이의 결합 친화성을 향상 또는 증가시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시 내용의 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 비변형된 gRNA 또는 sgRNA와 비교하여 Cas 단백질과 gRNA 또는 sgRNA 사이의 결합 친화성을 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 75%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 210%, 220%, 230%, 240%, 250%, 260%, 270%, 280%, 290%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900%, 또는 1000% 향상 또는 증가시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시 내용의 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 비변형된 gRNA 또는 sgRNA와 비교하여 Cas 단백질, 예를 들어 Cas9 단백질, 뉴클레아제 불활성 Cas9 단백질, Cas9 닉카아제와 gRNA 또는 sgRNA 사이의 결합 친화성을 약 20% 내지 약 300%, 약 50% 내지 약 300%, 약 100% 내지 약 300%, 약 150% 내지 약 300%, 약 20% 내지 약 50%, 약 20% 내지 약 100%, 약 20% 내지 약 150%, 약 20% 내지 약 200%, 약 20% 내지 약 250%, 약 50% 내지 약 100%, 약 50% 내지 약 150%, 약 50% 내지 약 200%, 약 50% 내지 약 250%, 약 100% 내지 약 150%, 약 100% 내지 약 200%, 약 100% 내지 약 250%, 약 150% 내지 약 200%, 약 150% 내지 약 250%, 약 200% 내지 약 250%, 적어도 약 20%, 적어도 약 50%, 적어도 약 100%, 적어도 약 150%, 적어도 약 200%, 적어도 약 250%, 또는 적어도 약 300% 향상 또는 증가시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시 내용의 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 비변형된 gRNA 또는 sgRNA와 비교하여 염기 에디터 융합체 또는 Cas 단백질과 gRNA 또는 sgRNA 사이의 결합 친화성을 약 20% 내지 약 300%, 약 50% 내지 약 300%, 약 100% 내지 약 300%, 약 150% 내지 약 300%, 약 20% 내지 약 50%, 약 20% 내지 약 100%, 약 20% 내지 약 150%, 약 20% 내지 약 200%, 약 20% 내지 약 250%, 약 50% 내지 약 100%, 약 50% 내지 약 150%, 약 50% 내지 약 200%, 약 50% 내지 약 250%, 약 100% 내지 약 150%, 약 100% 내지 약 200%, 약 100% 내지 약 250%, 약 150% 내지 약 200%, 약 150% 내지 약 250%, 약 200% 내지 약 250%, 적어도 약 20%, 적어도 약 50%, 적어도 약 100%, 적어도 약 150%, 적어도 약 200%, 적어도 약 250%, 또는 적어도 약 300% 향상 또는 증가시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시 내용의 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 비변형된 gRNA 또는 sgRNA와 비교하여 Cas 단백질 또는 염기 에디터 융합 단백질의 구성요소와 gRNA 또는 sgRNA 사이의 결합 친화성을 적어도 1.1배, 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 1.6배, 1.7배, 1.8배, 1.9배, 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 또는 10배 이상 향상 또는 증가시킬 수 있다.
본 개시 내용의 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 염기 에디터 융합 단백질, 예컨대 Cas 단백질의 프로그램 가능한 DNA 결합 구성요소 (예를 들어, Cas9 단백질, 뉴클레아제 불활성 Cas9 단백질, Cas9 닉카아제)과 가이드 RNA 서열(예를 들어, gRNA 또는 sgRNA)의 tracrRNA 서열 사이의 결합 친화성을 향상 또는 증가시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시 내용의 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 비변형된 gRNA 또는 sgRNA와 비교하여 염기 에디터 융합체 또는 Cas 단백질과 gRNA 또는 sgRNA의 tracrRNA 서열 사이의 결합 친화성을 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 75%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 210%, 220%, 230%, 240%, 250%, 260%, 270%, 280%, 290%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900%, 또는 1000% 향상 또는 증가시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시 내용의 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 비변형된 gRNA 또는 sgRNA와 비교하여 염기 에디터 융합체 또는 Cas 단백질과 gRNA 또는 sgRNA의 tracrRNA 서열 사이의 결합 친화성을 약 20% 내지 약 300%, 약 50% 내지 약 300%, 약 100% 내지 약 300%, 약 150% 내지 약 300%, 약 20% 내지 약 50%, 약 20% 내지 약 100%, 약 20% 내지 약 150%, 약 20% 내지 약 200%, 약 20% 내지 약 250%, 약 50% 내지 약 100%, 약 50% 내지 약 150%, 약 50% 내지 약 200%, 약 50% 내지 약 250%, 약 100% 내지 약 150%, 약 100% 내지 약 200%, 약 100% 내지 약 250%, 약 150% 내지 약 200%, 약 150% 내지 약 250%, 약 200% 내지 약 250%, 적어도 약 20%, 적어도 약 50%, 적어도 약 100%, 적어도 약 150%, 적어도 약 200%, 적어도 약 250%, 또는 적어도 약 300% 향상 또는 증가시킬 수 있다. 본 개시 내용의 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 비변형된 gRNA 또는 sgRNA와 비교하여 염기 에디터 융합체 또는 Cas 단백질과 gRNA 또는 sgRNA의 tracrRNA 서열 사이의 결합 친화성을 약 20% 내지 약 300%, 약 50% 내지 약 300%, 약 100% 내지 약 300%, 약 150% 내지 약 300%, 약 20% 내지 약 50%, 약 20% 내지 약 100%, 약 20% 내지 약 150%, 약 20% 내지 약 200%, 약 20% 내지 약 250%, 약 50% 내지 약 100%, 약 50% 내지 약 150%, 약 50% 내지 약 200%, 약 50% 내지 약 250%, 약 100% 내지 약 150%, 약 100% 내지 약 200%, 약 100% 내지 약 250%, 약 150% 내지 약 200%, 약 150% 내지 약 250%, 약 200% 내지 약 250%, 적어도 약 20%, 적어도 약 50%, 적어도 약 100%, 적어도 약 150%, 적어도 약 200%, 적어도 약 250%, 또는 적어도 약 300% 향상 또는 증가시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시 내용의 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 비변형된 gRNA 또는 sgRNA와 비교하여 염기 에디터 융합체 또는 Cas 단백질과 gRNA 또는 sgRNA의 tracrRNA 서열 사이의 결합 친화성을 적어도 1.1배, 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 1.6배, 1.7배, 1.8배, 1.9배, 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 또는 10배 이상 향상 또는 증가시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, gRNA 또는 sgRNA의 tracrRNA 서열은 비변형된 sgRNA의 tracrRNA 서열과 비교하여 염기 에디터 융합 단백질의 프로그램 가능한 DNA 결합 구성요소, 예컨대 Cas 단백질에 증가된 결합 친화성으로 결합할 수 있다. II형 Cas 단백질은 본원에 기재된 바와 같은 시스템 또는 염기 에디터로서 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, gRNA 또는 sgRNA의 tracrRNA 서열은 비변형된 sgRNA의 tracrRNA 서열과 비교하여 II형 Cas 단백질에 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 75%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 210%, 220%, 230%, 240%, 250%, 260%, 270%, 280%, 290%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900%, 또는 1000% 증가된 결합 친화성으로 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, gRNA 또는 sgRNA의 tracrRNA 서열은 비변형된 sgRNA의 tracrRNA 서열과 비교하여 II형 Cas 단백질을 포함하는 염기 에디터에 적어도 1.1배, 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 1.6배, 1.7배, 1.8배, 1.9배, 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 또는 10배 이상 증가된 결합 친화성으로 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, gRNA 또는 sgRNA의 tracrRNA 서열은 비변형된 sgRNA의 tracrRNA 서열과 비교하여 Cas9 단백질을 포함하는 염기 에디터 융합 단백질에 증가된 결합 친화성으로 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, gRNA 또는 sgRNA의 tracrRNA 서열은 비변형된 sgRNA의 tracrRNA 서열과 비교하여 Cas9 단백질에 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 75%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 210%, 220%, 230%, 240%, 250%, 260%, 270%, 280%, 290%, 또는 300% 증가된 결합 친화성으로 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, gRNA 또는 sgRNA의 tracrRNA 서열은 비변형된 sgRNA의 tracrRNA 서열과 비교하여 Cas9 단백질을 포함하는 염기 에디터 융합 단백질에 적어도 1.1배, 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 1.6배, 1.7배, 1.8배, 1.9배, 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 또는 10배 이상 증가된 결합 친화성으로 결합할 수 있다.
본 개시 내용의 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 표적 서열의 유전자 변형(예를 들어, 유전자 또는 게놈 편집)에서 오프 타겟 효과를 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시 내용의 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 비변형된 gRNA 또는 sgRNA와 비교하여 표적 서열의 유전자 변형에서 오프 타겟 효과를 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 75%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 210%, 220%, 230%, 240%, 250%, 260%, 270%, 280%, 290%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900%, 또는 1000% 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시 내용의 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 비변형된 gRNA 또는 sgRNA와 비교하여 표적 서열의 유전자 변형에서 오프 타겟 효과를 약 20% 내지 약 300%, 약 50% 내지 약 300%, 약 100% 내지 약 300%, 약 150% 내지 약 300%, 약 20% 내지 약 50%, 약 20% 내지 약 100%, 약 20% 내지 약 150%, 약 20% 내지 약 200%, 약 20% 내지 약 250%, 약 50% 내지 약 100%, 약 50% 내지 약 150%, 약 50% 내지 약 200%, 약 50% 내지 약 250%, 약 100% 내지 약 150%, 약 100% 내지 약 200%, 약 100% 내지 약 250%, 약 150% 내지 약 200%, 약 150% 내지 약 250%, 약 200% 내지 약 250%, 적어도 약 20%, 적어도 약 50%, 적어도 약 100%, 적어도 약 150%, 적어도 약 200%, 적어도 약 250%, 또는 적어도 약 300% 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시 내용의 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 비변형된 gRNA 또는 sgRNA와 비교하여 표적 서열의 유전자 변형에서 오프 타겟 효과를 약 20% 내지 약 300%, 약 50% 내지 약 300%, 약 100% 내지 약 300%, 약 150% 내지 약 300%, 약 20% 내지 약 50%, 약 20% 내지 약 100%, 약 20% 내지 약 150%, 약 20% 내지 약 200%, 약 20% 내지 약 250%, 약 50% 내지 약 100%, 약 50% 내지 약 150%, 약 50% 내지 약 200%, 약 50% 내지 약 250%, 약 100% 내지 약 150%, 약 100% 내지 약 200%, 약 100% 내지 약 250%, 약 150% 내지 약 200%, 약 150% 내지 약 250%, 약 200% 내지 약 250%, 적어도 약 20%, 적어도 약 50%, 적어도 약 100%, 적어도 약 150%, 적어도 약 200%, 적어도 약 250%, 또는 적어도 약 300% 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시 내용의 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 비변형된 gRNA 또는 sgRNA와 비교하여 표적 서열의 유전자 변형에서 오프 타겟 효과를 적어도 1.1배, 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 1.6배, 1.7배, 1.8배, 1.9배, 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 또는 10배 이상 감소시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 표적 폴리뉴클레오티드 서열은 게놈 내에 있으며, 여기서 gRNA 또는 sgRNA는 염기 에디터 융합 단백질의 구성요소(예, Cas9)가 표적 폴리뉴클레오티드 서열에서 변형을 수행하도록 지시할 수 있으며, 여기서 변형은 비변형된 gRNA 또는 sgRNA와 비교하여 게놈에서 더 적은 오프 타겟 효과를 초래한다. 일부 실시양태에서, gRNA 또는 sgRNA는 II형 Cas 단백질이 표적 폴리뉴클레오티드 서열에서 변형을 수행하도록 지시할 수 있다. 일부 실시양태에서, gRNA 또는 sgRNA는 II형 Cas 단백질이 표적 폴리뉴클레오티드 서열에서 변형을 수행하도록 지시할 수 있으며, 여기서 변형은 비변형된 gRNA 또는 sgRNA와 비교하여 게놈에서 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 75%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 210%, 220%, 230%, 240%, 250%, 260%, 270%, 280%, 290%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900%, 또는 1000% 적은 오프 타겟 효과를 초래한다. 일부 실시양태에서, gRNA 또는 sgRNA는 염기 에디터 융합 단백질의 II형 Cas 단백질이 표적 폴리뉴클레오티드 서열에서 변형을 수행하도록 지시할 수 있으며, 여기서 변형은 비변형된 gRNA 또는 sgRNA와 비교하여 게놈에서 적어도 1.1배, 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 1.6배, 1.7배, 1.8배, 1.9배, 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 또는 10배 이상 적은 오프 타겟 효과를 초래한다. 일부 실시양태에서, 표적 폴리뉴클레오티드 서열은 게놈 내에 있으며, 여기서 gRNA 또는 sgRNA는 Cas9 단백질이 표적 폴리뉴클레오티드 서열에서 변형을 수행하도록 지시할 수 있으며, 여기서 변형은 비변형된 gRNA 또는 sgRNA와 비교하여 게놈에서 더 적은 오프 타겟 효과를 초래한다. 일부 실시양태에서, gRNA 또는 sgRNA는 Cas9 단백질이 표적 폴리뉴클레오티드 서열에서 변형을 수행하도록 지시할 수 있으며, 여기서 변형은 비변형된 gRNA 또는 sgRNA와 비교하여 게놈에서 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 75%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 210%, 220%, 230%, 240%, 250%, 260%, 270%, 280%, 290%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900%, 또는 1000% 적은 오프 타겟 효과를 초래한다. 일부 실시양태에서, gRNA 또는 sgRNA는 Cas9를 지시할 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적 폴리뉴클레오티드 서열은 게놈 내에 있으며, 여기서 gRNA 또는 sgRNA는 염기 에디터 융합 단백질이 표적 폴리뉴클레오티드 서열에서 변형을 수행하도록 지시할 수 있으며, 여기서 변형은 비변형된 gRNA 또는 sgRNA와 비교하여 게놈에서 더 적은 오프 타겟 효과를 초래한다. 일부 실시양태에서, gRNA 또는 sgRNA는 염기 에디터 융합 단백질이 표적 폴리뉴클레오티드 서열에서 변형을 수행하도록 지시할 수 있으며, 여기서 변형은 비변형된 gRNA 또는 sgRNA와 비교하여 게놈에서 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 75%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 210%, 220%, 230%, 240%, 250%, 260%, 270%, 280%, 290%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900%, 또는 1000% 적은 오프 타겟 효과를 초래한다. 일부 실시양태에서, gRNA 또는 sgRNA는 염기 에디터 융합 단백질이 표적 폴리뉴클레오티드 서열에서 변형을 수행하도록 지시할 수 있으며, 여기서 변형은 비변형된 gRNA 또는 sgRNA와 비교하여 게놈에서 적어도 1.1배, 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 1.6배, 1.7배, 1.8배, 1.9배, 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 또는 10배 이상 적은 오프 타겟 효과를 초래한다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA를 사용한 변형은 비변형된 gRNA 또는 sgRNA와 비교하여 세포에서 더 적은 오프 타겟 효과를 초래한다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA를 사용한 변형은 비변형된 gRNA 또는 sgRNA와 비교하여 세포에서 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 75%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 210%, 220%, 230%, 240%, 250%, 260%, 270%, 280%, 290%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900%, 또는 1000% 적은 오프 타겟 효과를 초래한다.일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA를 사용한 변형은 비변형된 gRNA 또는 sgRNA와 비교하여 세포에서 적어도 1.1배, 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 1.6배, 1.7배, 1.8배, 1.9배, 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 또는 10배 이상 적은 오프 타겟 효과를 초래한다.
본 개시 내용의 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 유전자 변형(예를 들어, 유전자 또는 게놈 편집) 효율을 향상 또는 증가시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시 내용의 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 비변형된 gRNA 또는 sgRNA와 비교하여 유전자 변형(예를 들어, 유전자 또는 게놈 편집) 효율을 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 75%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 210%, 220%, 230%, 240%, 250%, 260%, 270%, 280%, 290%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900%, 또는 1000% 향상 또는 증가시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시 내용의 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 비변형된 gRNA 또는 sgRNA와 비교하여 유전자 변형(예를 들어, 유전자 또는 게놈 편집) 효율을 약 20% 내지 약 300%, 약 50% 내지 약 300%, 약 100% 내지 약 300%, 약 150% 내지 약 300%, 약 20% 내지 약 50%, 약 20% 내지 약 100%, 약 20% 내지 약 150%, 약 20% 내지 약 200%, 약 20% 내지 약 250%, 약 50% 내지 약 100%, 약 50% 내지 약 150%, 약 50% 내지 약 200%, 약 50% 내지 약 250%, 약 100% 내지 약 150%, 약 100% 내지 약 200%, 약 100% 내지 약 250%, 약 150% 내지 약 200%, 약 150% 내지 약 250%, 약 200% 내지 약 250%, 적어도 약 20%, 적어도 약 50%, 적어도 약 100%, 적어도 약 150%, 적어도 약 200%, 적어도 약 250%, 또는 적어도 약 300% 향상 또는 증가시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시 내용의 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 비변형된 gRNA 또는 sgRNA와 비교하여 유전자 변형(예를 들어, 유전자 또는 게놈 편집) 효율을 약 20% 내지 약 300%, 약 50% 내지 약 300%, 약 100% 내지 약 300%, 약 150% 내지 약 300%, 약 20% 내지 약 50%, 약 20% 내지 약 100%, 약 20% 내지 약 150%, 약 20% 내지 약 200%, 약 20% 내지 약 250%, 약 50% 내지 약 100%, 약 50% 내지 약 150%, 약 50% 내지 약 200%, 약 50% 내지 약 250%, 약 100% 내지 약 150%, 약 100% 내지 약 200%, 약 100% 내지 약 250%, 약 150% 내지 약 200%, 약 150% 내지 약 250%, 약 200% 내지 약 250%, 적어도 약 20%, 적어도 약 50%, 적어도 약 100%, 적어도 약 150%, 적어도 약 200%, 적어도 약 250%, 또는 적어도 약 300% 향상 또는 증가시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시 내용의 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 비변형된 gRNA 또는 sgRNA와 비교하여 유전자 변형(예를 들어, 유전자 또는 게놈 편집) 효율을 적어도 1.1배, 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 1.6배, 1.7배, 1.8배, 1.9배, 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 또는 10배 이상 향상 또는 증가시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시 내용의 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 염기 에디터 단백질 또는 구성요소(예를 들어, Cas9 단백질)와 가이드 RNA(예를 들어, gRNA 또는 sgRNA)의 복합체의 안정성, 예를 들어 염기 에디터 복합체의 안정성을 향상 또는 증가시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시 내용의 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 비변형된 gRNA 또는 sgRNA와 비교하여 Cas 단백질-gRNA 복합체의 안정성을 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 75%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 210%, 220%, 230%, 240%, 250%, 260%, 270%, 280%, 290%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900%, 또는 1000% 향상 또는 증가시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시 내용의 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 비변형된 gRNA 또는 sgRNA와 비교하여 염기 에디터 융합체 또는 Cas 단백질-gRNA 복합체의 안정성을 약 20% 내지 약 300%, 약 50% 내지 약 300%, 약 100% 내지 약 300%, 약 150% 내지 약 300%, 약 20% 내지 약 50%, 약 20% 내지 약 100%, 약 20% 내지 약 150%, 약 20% 내지 약 200%, 약 20% 내지 약 250%, 약 50% 내지 약 100%, 약 50% 내지 약 150%, 약 50% 내지 약 200%, 약 50% 내지 약 250%, 약 100% 내지 약 150%, 약 100% 내지 약 200%, 약 100% 내지 약 250%, 약 150% 내지 약 200%, 약 150% 내지 약 250%, 약 200% 내지 약 250%, 적어도 약 20%, 적어도 약 50%, 적어도 약 100%, 적어도 약 150%, 적어도 약 200%, 적어도 약 250%, 또는 적어도 약 300% 향상 또는 증가시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시 내용의 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 비변형된 gRNA 또는 sgRNA와 비교하여 염기 에디터 융합체 또는 Cas 단백질-gRNA 복합체의 안정성을 약 20% 내지 약 300%, 약 50% 내지 약 300%, 약 100% 내지 약 300%, 약 150% 내지 약 300%, 약 20% 내지 약 50%, 약 20% 내지 약 100%, 약 20% 내지 약 150%, 약 20% 내지 약 200%, 약 20% 내지 약 250%, 약 50% 내지 약 100%, 약 50% 내지 약 150%, 약 50% 내지 약 200%, 약 50% 내지 약 250%, 약 100% 내지 약 150%, 약 100% 내지 약 200%, 약 100% 내지 약 250%, 약 150% 내지 약 200%, 약 150% 내지 약 250%, 약 200% 내지 약 250%, 적어도 약 20%, 적어도 약 50%, 적어도 약 100%, 적어도 약 150%, 적어도 약 200%, 적어도 약 250%, 또는 적어도 약 300% 향상 또는 증가시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시 내용의 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 비변형된 gRNA 또는 sgRNA와 비교하여 염기 에디터 융합체 또는 Cas 단백질-gRNA 복합체의 안정성을 적어도 1.1배, 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 1.6배, 1.7배, 1.8배, 1.9배, 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 또는 10배 이상 향상 또는 증가시킬 수 있다
일부 실시양태에서, 본 개시 내용의 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 비변형된 gRNA 또는 sgRNA와 비교하여 염기 에디터 복합체의 안정성을 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 75%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 210%, 220%, 230%, 240%, 250%, 260%, 270%, 280%, 290%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900%, 또는 1000% 향상 또는 증가시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시 내용의 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 비변형된 gRNA 또는 sgRNA와 비교하여 염기 에디터 복합체의 안정성을 약 20% 내지 약 300%, 약 50% 내지 약 300%, 약 100% 내지 약 300%, 약 150% 내지 약 300%, 약 20% 내지 약 50%, 약 20% 내지 약 100%, 약 20% 내지 약 150%, 약 20% 내지 약 200%, 약 20% 내지 약 250%, 약 50% 내지 약 100%, 약 50% 내지 약 150%, 약 50% 내지 약 200%, 약 50% 내지 약 250%, 약 100% 내지 약 150%, 약 100% 내지 약 200%, 약 100% 내지 약 250%, 약 150% 내지 약 200%, 약 150% 내지 약 250%, 약 200% 내지 약 250%, 적어도 약 20%, 적어도 약 50%, 적어도 약 100%, 적어도 약 150%, 적어도 약 200%, 적어도 약 250%, 또는 적어도 약 300% 향상 또는 증가시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시 내용의 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 비변형된 gRNA 또는 sgRNA와 비교하여 염기 에디터 복합체의 안정성을 약 20% 내지 약 300%, 약 50% 내지 약 300%, 약 100% 내지 약 300%, 약 150% 내지 약 300%, 약 20% 내지 약 50%, 약 20% 내지 약 100%, 약 20% 내지 약 150%, 약 20% 내지 약 200%, 약 20% 내지 약 250%, 약 50% 내지 약 100%, 약 50% 내지 약 150%, 약 50% 내지 약 200%, 약 50% 내지 약 250%, 약 100% 내지 약 150%, 약 100% 내지 약 200%, 약 100% 내지 약 250%, 약 150% 내지 약 200%, 약 150% 내지 약 250%, 약 200% 내지 약 250%, 적어도 약 20%, 적어도 약 50%, 적어도 약 100%, 적어도 약 150%, 적어도 약 200%, 적어도 약 250%, 또는 적어도 약 300% 향상 또는 증가시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시 내용의 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 비변형된 gRNA 또는 sgRNA와 비교하여 염기 에디터-sgRNA 또는 Cas9-sgRNA 복합체의 안정성을 적어도 1.1배, 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 1.6배, 1.7배, 1.8배, 1.9배, 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 또는 10배 이상 향상 또는 증가시킬 수 있다.
본 개시 내용의 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 시험관 내, 생체 내, 및/또는 생체 외 가이드 RNA(예를 들어, gRNA 또는 sgRNA)의 안정성을 향상 또는 증가시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시 내용의 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 비변형된 gRNA 또는 sgRNA와 비교하여 시험관 내, 생체 내, 및/또는 생체 외 gRNA 또는 sgRNA의 안정성을 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 75%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 210%, 220%, 230%, 240%, 250%, 260%, 270%, 280%, 290%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900%, 또는 1000% 향상 또는 증가시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시 내용의 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 비변형된 gRNA 또는 sgRNA와 비교하여 시험관 내, 생체 내, 및/또는 생체 외 gRNA 또는 sgRNA의 안정성을 약 20% 내지 약 300%, 약 50% 내지 약 300%, 약 100% 내지 약 300%, 약 150% 내지 약 300%, 약 20% 내지 약 50%, 약 20% 내지 약 100%, 약 20% 내지 약 150%, 약 20% 내지 약 200%, 약 20% 내지 약 250%, 약 50% 내지 약 100%, 약 50% 내지 약 150%, 약 50% 내지 약 200%, 약 50% 내지 약 250%, 약 100% 내지 약 150%, 약 100% 내지 약 200%, 약 100% 내지 약 250%, 약 150% 내지 약 200%, 약 150% 내지 약 250%, 약 200% 내지 약 250%, 적어도 약 20%, 적어도 약 50%, 적어도 약 100%, 적어도 약 150%, 적어도 약 200%, 적어도 약 250%, 또는 적어도 약 300% 향상 또는 증가시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시 내용의 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 비변형된 gRNA 또는 sgRNA와 비교하여 시험관 내, 생체 내, 및/또는 생체 외 gRNA 또는 sgRNA의 안정성을 약 20% 내지 약 300%, 약 50% 내지 약 300%, 약 100% 내지 약 300%, 약 150% 내지 약 300%, 약 20% 내지 약 50%, 약 20% 내지 약 100%, 약 20% 내지 약 150%, 약 20% 내지 약 200%, 약 20% 내지 약 250%, 약 50% 내지 약 100%, 약 50% 내지 약 150%, 약 50% 내지 약 200%, 약 50% 내지 약 250%, 약 100% 내지 약 150%, 약 100% 내지 약 200%, 약 100% 내지 약 250%, 약 150% 내지 약 200%, 약 150% 내지 약 250%, 약 200% 내지 약 250%, 적어도 약 20%, 적어도 약 50%, 적어도 약 100%, 적어도 약 150%, 적어도 약 200%, 적어도 약 250%, 또는 적어도 약 300% 향상 또는 증가시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시 내용의 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 비변형된 gRNA 또는 sgRNA와 비교하여 시험관 내, 생체 내, 및/또는 생체 외 gRNA 또는 sgRNA의 안정성을 적어도 1.1배, 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 1.6배, 1.7배, 1.8배, 1.9배, 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 또는 10배 이상 향상 또는 증가시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 비변형된 gRNA 또는 sgRNA와 비교하여 세포에서 증가된 안정성을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 비변형된 gRNA 또는 sgRNA와 비교하여 세포에서 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 75%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 210%, 220%, 230%, 240%, 250%, 260%, 270%, 280%, 290%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900%, 또는 1000% 더 높거나 증가된 안정성을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 비변형된 gRNA 또는 sgRNA와 비교하여 세포에서 적어도 1.1배, 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 1.6배, 1.7배, 1.8배, 1.9배, 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 또는 10배 이상 더 높거나 증가된 안정성을 나타낸다.
일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA의 안정성은 세포에서 gRNA 또는 sgRNA의 반감기로 측정된다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 비변형된 gRNA 또는 sgRNA와 비교하여 세포에서 증가된 반감기를 나타낸다. 일부 실시양태에서, gRNA 또는 sgRNA는 비변형된 gRNA 또는 sgRNA와 비교하여 세포에서 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 75%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 210%, 220%, 230%, 240%, 250%, 260%, 270%, 280%, 290%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900%, 또는 1000% 증가된 반감기를 나타낸다. 일부 실시양태에서, gRNA 또는 sgRNA는 비변형된 gRNA 또는 sgRNA와 비교하여 세포에서 약 20% 내지 약 300%, 약 50% 내지 약 300%, 약 100% 내지 약 300%, 약 150% 내지 약 300%, 약 20% 내지 약 50%, 약 20% 내지 약 100%, 약 20% 내지 약 150%, 약 20% 내지 약 200%, 약 20% 내지 약 250%, 약 50% 내지 약 100%, 약 50% 내지 약 150%, 약 50% 내지 약 200%, 약 50% 내지 약 250%, 약 100% 내지 약 150%, 약 100% 내지 약 200%, 약 100% 내지 약 250%, 약 150% 내지 약 200%, 약 150% 내지 약 250%, 약 200% 내지 약 250%, 적어도 약 20%, 적어도 약 50%, 적어도 약 100%, 적어도 약 150%, 적어도 약 200%, 적어도 약 250%, 또는 적어도 약 300% 증가된 반감기를 나타낸다. 일부 실시양태에서, gRNA 또는 sgRNA는 비변형된 gRNA 또는 sgRNA와 비교하여 세포에서 적어도 1.1배, 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 1.6배, 1.7배, 1.8배, 1.9배, 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 또는 10배 이상 증가된 반감기를 나타낸다.
본 개시 내용의 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 비변형된 gRNA 또는 sgRNA와 비교하여 분해에 대한 내성이 더 클 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시 내용의 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 비변형된 gRNA 또는 sgRNA와 비교하여 분해에 대한 내성이 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 75%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 210%, 220%, 230%, 240%, 250%, 260%, 270%, 280%, 290%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900%, 또는 1000% 더 클 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시 내용의 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 비변형된 gRNA 또는 sgRNA와 비교하여 분해에 대한 내성이 약 20% 내지 약 300%, 약 50% 내지 약 300%, 약 100% 내지 약 300%, 약 150% 내지 약 300%, 약 20% 내지 약 50%, 약 20% 내지 약 100%, 약 20% 내지 약 150%, 약 20% 내지 약 200%, 약 20% 내지 약 250%, 약 50% 내지 약 100%, 약 50% 내지 약 150%, 약 50% 내지 약 200%, 약 50% 내지 약 250%, 약 100% 내지 약 150%, 약 100% 내지 약 200%, 약 100% 내지 약 250%, 약 150% 내지 약 200%, 약 150% 내지 약 250%, 약 200% 내지 약 250%, 적어도 약 20%, 적어도 약 50%, 적어도 약 100%, 적어도 약 150%, 적어도 약 200%, 적어도 약 250%, 또는 적어도 약 300% 더 클 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시 내용의 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 비변형된 gRNA 또는 sgRNA와 비교하여 분해에 대한 내성이 약 20% 내지 약 300%, 약 50% 내지 약 300%, 약 100% 내지 약 300%, 약 150% 내지 약 300%, 약 20% 내지 약 50%, 약 20% 내지 약 100%, 약 20% 내지 약 150%, 약 20% 내지 약 200%, 약 20% 내지 약 250%, 약 50% 내지 약 100%, 약 50% 내지 약 150%, 약 50% 내지 약 200%, 약 50% 내지 약 250%, 약 100% 내지 약 150%, 약 100% 내지 약 200%, 약 100% 내지 약 250%, 약 150% 내지 약 200%, 약 150% 내지 약 250%, 약 200% 내지 약 250%, 적어도 약 20%, 적어도 약 50%, 적어도 약 100%, 적어도 약 150%, 적어도 약 200%, 적어도 약 250%, 또는 적어도 약 300% 더 클 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시 내용의 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA는 비변형된 gRNA 또는 sgRNA와 비교하여 분해에 대한 내성이 적어도 1.1배, 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 1.6배, 1.7배, 1.8배, 1.9배, 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 또는 10배 이상 더 클 수 있다.
표적 유전자 변형
일부 측면에서, 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법으로서, 본원에 기재된 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA를 포함하는 조성물 또는 지질 나노입자를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법이 제공되며, 여기서 gRNA 또는 sgRNA는 염기 에디터 단백질이 대상체의 세포에서 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 변형을 수행하도록 지시함으로써, 병태를 치료하거나 예방한다. 일부 실시양태에서, 표적 폴리뉴클레오티드는 PCSK9 유전자에 있다. 일부 실시양태에서, 표적 폴리뉴클레오티드는 ANGPTL3 유전자에 있다. 일부 실시양태에서, 변형은 표적 폴리뉴클레오티드의 스플라이스 부위에 있다. 일부 실시양태에서, 변형은 표적 폴리뉴클레오티드의 스플라이스 도너 부위에 있다. 일부 실시양태에서, 변형은 표적 폴리뉴클레오티드의 스플라이스 억셉터 부위에 있다. 일부 실시양태에서, 변형은 대상체에서 PCSK9 유전자에 의해 코딩되는 기능적 PCSK9 단백질의 발현을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 변형은 대상체에서 ANGPTL3 유전자에 의해 코딩되는 기능적 ANGPTL3 단백질의 발현을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 병태는 죽상동맥경화성 혈관 질환이다. 일부 실시양태에서, 병태는 죽상동맥경화성 혈관 질환, 고트리글리세리드혈증 또는 당뇨병이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 투여 전과 비교하여 감소된 혈중 LDL 콜레스테롤 수준 및/또는 감소된 혈중 트리글리세리드 수준을 나타낸다.
일부 실시양태에서, 본 개시 내용은 아포지단백질 C3(APOC3) 단백질 및 이의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 편집하기 위한 염기 에디터 시스템, 조성물 및 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 전구단백질 전환효소 서브틸리신/켁신 9형(PCSK9) 및 이의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 편집하기 위한 게놈/염기 에디터 시스템, 조성물 및 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 안지오포이에틴 유사 3(ANGPTL3) 및 이의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 편집하기 위한 게놈/염기 에디터 시스템, 조성물 및 방법이 본원에 제공된다. 표적 유전자를 편집하기 위해, 표적 유전자 폴리뉴클레오티드는 sgRNA 및 아데노신 염기 에디터 단백질을 포함하는 본원에 개시된 조성물과 접촉할 수 있고, 여기서 sgRNA는 스페이서 서열 및 tracrRNA 서열을 포함하고, 여기서 스페이서 서열은 PCSK9 또는 ANGPTL3 유전자에서 표적 폴리뉴클레오티드 서열과 혼성화하고 tracrRNA 서열은 아데노신 염기 에디터 단백질(예를 들어, 아데노신 염기 에디터의 Cas9 구성요소)에 결합한다. 일부 실시양태에서, 따라서 sgRNA는 염기 에디터 단백질을 표적 폴리뉴클레오티드 서열로 안내하여 표적 유전자에서 G로의 변형을 초래한다. 일부 실시양태에서, 표적 유전자 또는 표적 폴리뉴클레오티드는 PCSK9, APOC3, LPA, 및 ANGPTL3을 코딩하는 유전자로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 표적 폴리뉴클레오티드 서열은 PCSK9 유전자에 있다. 일부 실시양태에서, 표적 폴리뉴클레오티드 서열은 ANGPTL3 유전자에 있다. 일부 실시양태에서, 변형은 세포에서 PCSK9 유전자에 의해 코딩되는 기능적 PCSK9 단백질의 발현을 감소 또는 제거한다. 일부 실시양태에서, 변형은 세포에서 ANGPTL3 유전자에 의해 코딩되는 기능적 ANGPTL3 단백질의 발현을 감소 또는 제거한다. 일부 실시양태에서, 도입은 조성물을 포함하는 지질 나노입자를 통해 수행된다.
예를 들어, sgRNA 및 아데노신 염기 에디터 단백질은 표적 유전자 편집이 요구되는 세포(예를 들어, 간 세포)에서 발현되어 표적 유전자와 본원에 개시된 조성물(예를 들어, sgRNA 및 아데노신 염기 에디터 단백질)의 접촉을 허용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 아데노신 염기 에디터 단백질의 표적 유전자 내 그의 표적 폴리뉴클레오티드 서열에 대한 결합은 본원에 개시된 단일 가이드 RNA, 예를 들어 (i) 스페이서 서열 및 (ii) tracrRNA를 포함하는 단일 가이드 RNA에 의해 지시되며, 여기서 스페이서 서열은 표적 유전자 내 표적 폴리뉴클레오티드 서열과 혼성화한다. 따라서, 가이드 RNA 서열을 설계함으로써, 아데노신 염기 에디터 단백질은 표적 유전자(예를 들어, PCSK9, APOC3 및 ANGPTL3을 코딩하는 표적 유전자) 내 임의의 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 편집하도록 지시될 수 있다. 일부 실시양태에서, 가이드 RNA 서열은 편집이 요구되는 세포에서 아데노신 염기 에디터 단백질과 공동 발현된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 하나 초과의 돌연변이를 포함하는 표적 유전자가 고려된다. 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 돌연변이를 포함하는 변이 단백질을 코딩하는 표적 유전자는 본원에 기재된 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 표적 유전자에서 다중 돌연변이를 만들기 위해, 복수의 가이드 RNA 서열이 사용될 수 있으며, 각각의 가이드 RNA 서열은 표적 유전자에서 하나의 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 표적화한다. 아데노신 염기 에디터 단백질 은 가이드 RNA 서열이 지시하는 모든 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 편집할 수 있다. 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 가이드 RNA 서열이 유전자 편집 반응에 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 사용된 바와 같은 가이드 RNA 서열(예를 들어, gRNA). 일부 실시양태에서, 가이드 RNA 서열을 코딩하는 DNA 분자가 또한 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 하나 초과의 표적 유전자(예를 들어, LDL-매개 콜레스테롤 제거 경로에서 하나 초과의 표적 유전자) 내로 동시 변형이 또한 본원에서 고려된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 변형은 PCSK9 및 APOC3 유전자 내로 동시에 도입될 수 있다. 일부 실시양태에서, 변형은 PCSK9 및 LDL-R 유전자 내로 동시에 도입될 수 있다. 일부 실시양태에서, 변형은 PCSK9 및 IODL 유전자 내로 동시에 도입될 수 있다. 일부 실시양태에서, 변형은 PCSK9 및 LPA 유전자 내로 동시에 도입될 수 있다. 일부 실시양태에서, 변형은 APOC3 및 IODL 유전자 내로 동시에 도입될 수 있다. 일부 실시양태에서, 변형은 LDL-R 및 APOC3 유전자 내로 동시에 도입될 수 있다. 일부 실시양태에서, 변형은 LDL-R 및 IDOL 유전자 내로 동시에 도입될 수 있다. 일부 실시양태에서, 변형은 PCSK9, APOC3, LDL-R 및 IDOL 유전자 내로 동시에 도입될 수 있다. 일부 실시양태에서, 변형은 PCSK9 및 ANGPTL3 유전자 내로 동시에 도입될 수 있다. 하나 초과의 표적 유전자 내로 변형을 동시에 도입하기 위해 다중 가이드 뉴클레오티드 서열이 사용된다.
PCSK9 또는 ANGPTL3 단백질을 코딩하는 유전자를 편집하기 위해, 유전자는 본원에 기재된 조성물과 접촉된다. 일부 실시양태에서, 표적 유전자 내 표적 폴리뉴클레오티드 서열은 본원에 개시된 단일 가이드 RNA 및 아데노신 염기 에디터 단백질 또는 아데노신 염기 에디터 단백질을 코딩하는 핵산 서열과 접촉되며, 여기서 단일 가이드 RNA는 아데노신 염기 에디터 단백질이 표적 유전자(예를 들어, PCSK9, APOC3 및 ANGPTL3을 코딩하는 표적 유전자)에서 변형을 수행하도록 지시한다. 일부 실시양태에서, 표적 폴리뉴클레오티드 서열은 세포의 게놈 DNA 내의 유전자좌다. 일부 실시양태에서, 세포는 배양된 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 생체 내에 있다. 일부 실시양태에서, 세포는 시험관 내에 있다. 일부 실시양태에서, 세포는 생체 외에 있다.
일부 실시양태에서, 세포는 포유동물로부터 유래한다. 일부 실시양태에서, 포유동물은 인간이다. 일부 실시양태에서, 포유동물은 설치류이다. 일부 실시양태에서, 설치류는 마우스이다. 일부 실시양태에서, 설치류는 래트이다. 당업자가 이해하는 바와 같이, 표적 폴리뉴클레오티드 서열은 코딩 가닥 및 상보적 가닥, 예를 들어 게놈 내의 PCSK9 또는 ANGPTL3 유전자좌를 포함하는 DNA 분자일 수 있다. 이와 같이, 표적 폴리뉴클레오티드 서열은 또한 코딩 영역(예를 들어, 엑손) 및 비-코딩 영역(예를 들어, 인트론 또는 스플라이싱 부위)을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적 폴리뉴클레오티드 서열은 표적 유전자(예를 들어, PCSK9 또는 ANGPTL3 유전자좌)의 코딩 영역(예를 들어, 엑손)에 위치한다. 이와 같이, 코딩 영역에서의 변형은 표적 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 아미노산 변화, 즉 돌연변이를 초래할 수 있다. 일부 실시양태에서, 돌연변이는 기능 상실 돌연변이이다. 일부 실시양태에서, 기능 상실 돌연변이는 자연 발생 기능 상실 돌연변이이다. 일부 실시양태에서, 표적 폴리뉴클레오티드 서열은 표적 유전자의 비-코딩 영역, 예를 들어 인트론 또는 스플라이싱 부위에 위치한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 염기 에디터 시스템은 PCSK9 유전자 또는 ANGPTL3 유전자의 스플라이스 부위에서 A·T에서 G·C로의 변경을 초래한다. 일부 실시양태에서, A·T에서 G·C로의 변경은 PCSK9 유전자의 스플라이스 억셉터 부위에 있다. 일부 실시양태에서, A·T에서 G·C로의 변경은 PCSK9 유전자에 의해 코딩되는 비정상 PCSK9 전사물을 초래한다. 일부 실시양태에서, A·T에서 G·C로의 변경은 세포에서 발현될 때 PCSK9 유전자에 의해 코딩되는 비기능적 PCSK9 폴리펩티드를 생성한다. 일부 실시양태에서, A·T에서 G·C로의 변경은 PCSK9 유전자의 인트론 1의 스플라이스 도너 부위의 5' 말단에 있다. 일부 실시양태에서, A·T에서 G·C로의 변경은 PCSK9 유전자의 인트론 4의 스플라이스 도너 부위의 5' 말단에 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 염기 에디터 시스템은 ANGPTL3 유전자의 스플라이스 부위에서 A·T에서 G·C로의 변경을 초래하거나, 두 번째 A·T에서 G·C로의 변경은 ANGPTL3 유전자의 스플라이스 도너 부위에 있다. 일부 실시양태에서, A·T에서 G·C로의 변경 또는 두 번째 A·T에서 G·C로의 변경은 ANTPTL3 유전자의 스플라이스 억셉터 부위에 있다. 일부 실시양태에서, A·T에서 G·C로의 변경 또는 두 번째 A·T에서 G·C로의 변경은 ANGPTL3 유전자에 의해 코딩되는 비정상 ANGPTL3 전사물을 생성한다. 일부 실시양태에서, A·T에서 G·C로의 변경 또는 두 번째 A·T에서 G·C로의 변경은 ANGPTL3 유전자에 의해 코딩되는 비기능적 ANGPTL3 폴리펩티드를 생성한다. 일부 실시양태에서, A·T에서 G·C로의 변경 또는 두 번째 A·T에서 G·C로의 변경은 ANGPLT3 유전자의 인트론 6의 스플라이스 도너 부위의 5' 말단에 있다.
일부 실시양태에서, 표적 폴리뉴클레오티드 서열은 스플라이싱 부위에 위치하고 이러한 서열의 편집은 표적 유전자의 mRNA의 대체 스플라이싱을 야기한다. 일부 실시양태에서, 대체 스플라이싱은 기능 상실 돌연변이를 유도한다. 일부 실시양태에서, 대체 스플라이싱은 표적 유전자에 의해 코딩되는 mRNA에 조기 정지 코돈의 도입을 유도하여 단축되고 불안정한 단백질을 생성한다. 일부 실시양태에서, 폴딩에 결함이 있는 돌연변이체가 생성된다. 본원에 개시된 조성물 및 방법을 사용하여 변형된 유전자에 의해 생성된 기능 상실 변이체는 비변형된 표적 유전자에 의해 코딩되는 야생형 단백질과 비교하여 감소된 활성을 가질 수 있다. 활성은 당해 기술분야에서 야생형 단백질의 임의의 공지된 생물학적 활성을 지칭한다.
일부 실시양태에서, 기능 상실 변이체의 활성은 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 99% 이상 감소될 수 있다 일부 실시양태에서, 기능 상실 변이체는 야생형 단백질과 비교하여 50% 이하, 40% 이하, 30% 이하, 20% 이하, 10% 이하, 5% 이하, 1% 이하의 활성을 가진다.
일부 실시양태에서, 적절하게 폴딩되고 활성인 단백질의 수준을 감소시킴으로써 표적 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 세포 활성이 감소될 수 있다. 야생형 단백질에 불안정화 돌연변이를 도입하면 단백질이 잘못 폴딩되거나 비활성화될 수 있다. 본원에 개시된 조성물 및 방법을 사용하여 표적 유전자를 변형함으로써 생성된 변이체는 비변형된 표적 유전자에 의해 코딩되는 야생형 단백질과 비교하여 감소된 활성을 가질 수 있는 하나 이상의 불안정화 돌연변이를 포함한다. 예를 들어, 하나 이상의 불안정화 돌연변이를 포함하는 변이체의 활성은 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 99% 이상 감소될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법 및 조성물은 표적 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 발현 및/또는 기능을 감소 또는 제거한다. 예를 들어, 본원에 개시된 방법 및 조성물은 대조군에 비해 표적 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 발현 및/또는 기능을 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 6배, 적어도 7배, 적어도 8배, 적어도 9배, 또는 적어도 10배 감소시킨다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법 및 조성물은 대조군에 비해 표적 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 발현 및/또는 기능을 적어도 2배 감소시키거나 제거한다. 예를 들어, 본원에 개시된 방법 및 조성물은 대조군에 비해 표적 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 발현 및/또는 기능을 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 6배, 적어도 7배, 적어도 8배, 적어도 9배, 또는 적어도 10배 감소시키거나 제거한다.
본 개시 내용의 일부 측면은 생산되는 전장의 기능적 단백질의 양을 감소시키기 위해 표적 유전자를 편집하는 전략을 제공한다. 일부 실시양태에서, 정지 코돈은 정상 정지 코돈의 상류에 있는 표적 유전자의 코딩 서열 내로 도입될 수 있다("조기 정지 코돈"으로 지칭됨). 조기 정지 코돈은 조기 번역 종결을 일으키고, 결국 단축되고 비기능적인 단백질을 초래하고 넌센스 매개 mRNA 붕괴 경로를 통해 mRNA의 빠른 분해를 유도한다. 예를 들어, 문헌[Baker et al., Current Opinion in Cell Biology 16 (3): 293-299, 2004; Chang et al, Annual Review of Biochemistry 76: 51-74, 2007; 및 Behm-Ansmant et ah, Genes & Development 20 (4): 391-398, 2006, 이들 각각은 본원에 참고로 포함됨]을 참조한다.
전구단백질 전환효소 서브틸리신-켁신 9형(PCSK9)
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 조성물 및 방법을 사용한 변형을 위한 표적 유전자는 PCSK9를 코딩하는 유전자이다. 신경 아폽토시스 제어 전환효소 1(NARC-I: neural apoptosis-controlled convertase 1)로도 알려진 전구단백질 전환효소 서브틸리신-켁신 9형(PCSK9)은 분비성 서브틸라제 패밀리의 9번째 구성원으로 확인된 프로테이나제 K 유사 서브틸라제이다. " 전구단백질 전환효소 서브틸리신-켁신 9형(PCSK9)"은 PCSK9 유전자에 의해 코딩된 효소를 지칭한다. PCSK9는 저밀도 지단백질(LDL) 입자에 대한 수용체에 결합한다. 간에서, LDL 수용체는 엔도시토시스 경로를 통해 혈액으로부터 LDL 입자를 제거한다. PCSK9가 LDL 수용체에 결합하면, 수용체는 리소좀 경로로 보내지고 단백질 분해 효소에 의해 분해되어 주어진 LDL 수용체가 혈액으로부터 LDL 입자를 흡수할 수 있는 횟수를 제한한다. 따라서, PCSK9 활성을 차단하면 더 많은 LDL 수용체가 재활용되어 간 세포 표면에 존재할 수 있으며 혈액으로부터 더 많은 LDL 콜레스테롤을 제거할 것이다.
따라서, PCSK9를 차단하면 혈중 콜레스테롤 수치를 낮출 수 있다. PCSK9 오솔로그는 많은 종에서 발견된다. PCSK9는 펩티드 사슬의 일부가 활성을 차단하기 때문에 처음 합성될 때 프리프로 효소로 비활성화된다. 전구단백질 전환효소는 효소를 활성화하기 위해 해당 부분을 제거한다. 프로-PCSK9는 N-말단 프로-도메인을 촉매 부위를 차단하는 PCSK9의 강력한 내인성 억제제로 단백질 분해 자가 처리할 수 있는 분비된 구형 세린 프로테아제이다. 콜레스테롤 항상성에서 PCSK9의 역할은 의학적으로 활용되었다. PCSK9를 차단하는 약물은 저밀도 지단백 콜레스테롤(LDL-C)의 혈중 수준을 낮출 수 있다. 최초 두 가지 PCSK9 억제제인 알리로쿠맙과 에볼로쿠맙은 2015년 미국 식품의약국(FDA)에서 스타틴 및 기타 약물로 불충분한 콜레스테롤 저하를 위해 승인되었다.
PCSK9에 대한 인간 유전자는 인간 염색체 Ip33-p34.3에 위치한다. PCSK9는 예를 들어 간세포, 신장 중간엽 세포, 장 회장, 및 결장 상피뿐만 아니라 배아 뇌 종뇌 뉴런을 비롯한 증식 및 분화가 가능한 세포에서 발현된다. 예를 들어, 문헌[Seidah et al., 2003 PNAS 100:928-933, 이는 본원에 참고로 포함됨]을 참조한다.
PCSK9의 원래 합성은 기능을 활성화하기 위해 소포체(ER)에서 자가 촉매, 분자 내 처리를 거치는 72 kDa의 비활성 효소 전구체, 또는 자이모겐 형태이다. 이 내부 처리 이벤트는 SSVFAQ jSIP 모티프에서 발생하는 것으로 보고되었으며, ER로부터 탈출 요건으로 보고되었다. "j"는 절단 부위를 나타낸다. 문헌[Benjannet et al., 2004 J. Biol. Chem. 279:48865-48875, 및 Seidah et al, 2003 PNAS 100:928-933, 이들 각각은 본원에 참고로 포함됨]을 참조한다. 그런 다음 절단된 단백질이 분비된다. 절단된 펩티드는 활성화되고 분비된 효소와 결합된 상태로 유지된다.
인간 PCSK9의 유전자 서열은 692개 아미노산 단백질을 코딩하는 12개의 엑손이 있으며 ~22 kb 길이이다. 인간 PCSK9의 단백질 서열은 예를 들어, 기탁 번호 NP_777596.2에서 찾을 수 있으며, 이 서열은 그 전체가 본원에 포함된다. 인간, 마우스 및 래트 PCSK9 핵산 서열이 기탁되었다. 예를 들어, GenBank 등록 번호 AX127530(또한 AX207686), AX207688, 및 AX207690을 각각 참조하며, 이들 서열 각각은 그 전체가 본원에 포함된다. 마카카 파시쿨라리스(Macaca fascicularis)의 유전자 서열은 예를 들어 NCBI 유전자 ID: 102142788에서 공개적으로 찾을 수 있으며, 이 서열은 그 전체가 본원에 포함된다. 마카카 파시쿨라리스 전구단백질 전환효소 서브틸리신/켁신 9형 아이소형 X2 서열은 예를 들어 NCBI 참조 서열: XP_005543317.1에서 공개적으로 찾아볼 수 있으며, 이 서열은 그 전체가 본원에 포함된다.
번역된 단백질은 NH2-말단에 신호 펩티드를 포함하고, 세포와 조직에서 약 74kDa 자이모겐(전구체) 형태의 전장 단백질은 소포체에서 발견된다. 세포에서 초기 처리 동안, 약 14 kDa 프로도메인 펩티드는 자가촉매적으로 절단되어 촉매 도메인 및 종종 시스테인-히스티딘 풍부 도메인(CHRD)으로 지칭되는 C-말단 도메인을 함유하는 성숙한 약 60 kDa 단백질을 생성한다. 이 약 60 kDa 형태의 PCSK9는 간 세포로부터 분비된다. 분비된 형태의 PCSK9는 생리학적으로 활성 종인 것으로 보이지만, 약 60 kDa 형태의 세포 내 기능적 역할이 배제되지는 않았다.
수많은 PCSK9 변이체가 다음을 포함하는, 그러나 이에 제한되지 않는 여러 특허 공보에 개시 및/또는 청구되어 있다: PCT 공개 번호 WO2001031007, WO2001057081, WO2002014358, WO2001098468, WO2002102993, WO2002102994, WO2002046383, WO2002090526, WO2001077137, 및 WO2001034768; 미국 공개 번호. US 2004/0009553 및 US 2003/0119038, 및 유럽 공개 번호 EP 1 440 981, EP 1 067 182, 및 EP 1 471 152, 이들 각각은 본원에 참고로 포함된다.
S127R, N157K, F216L, R218S, 및 D374Y를 비롯한 여러 돌연변이 형태의 PCSK9가 잘 특성화되어 있으며 S127R, F216L, 및 D374Y는 상염색체 우성 고콜레스테롤혈증(ADH)과 연관된다. 문헌[Benjannet et al. J. Biol. Chem., 279(47):48865-48875 (2004)]은 S127R 및 D374Y 돌연변이가 활성의 분비된 자이모겐을 형성하기 위해 ER에서 처리되는 프로-PCSK9 수준의 상당한 감소를 초래한다는 것을 입증하였다. 결과적으로, 야생형 PCSK9는 LDL 제거를 억제하는 LDL 수용체의 전환율을 증가시키는 한편(Maxwell et al, PNAS, 102(6):2069-2074 (2005); Benjannet et al, 및 Lalanne et al), PCSK9 상염색체 우성 돌연변이는 LDLR 수준 증가, 순환 LDL 제거 증가, 및 이에 상응하는 혈장 콜레스테롤 수준 감소를 초래한다고 여겨진다. 문헌[Rashid et al, PNAS, 102(15):5374-5379 (2005); Abifadel et al, 2003 Nature Genetics 34: 154-156; Timms et al, 2004 Hum. Genet. 114:349-353; 및 Leren, 2004 Clin. Genet. 65:419-422, 이들 각각은 본원에 참고로 포함됨]을 참조한다.
문헌[Abifadel et al]의 S127R 돌연변이에 대한 나중에 발표된 연구에 따르면 이러한 돌연변이를 보유하는 환자는 (1) 저밀도 지단백질(LDL), 초저밀도 지단백질(VLDL) 및 중간 밀도 지단백질(IDL)과 같은 apoB 100 함유 지단백질의 과잉 생산, 및 (2) 상기 지단백질의 제거 또는 전환에 있어 관련 감소로 인해 혈장에서 더 높은 총 콜레스테롤과 apoB 100을 나타냈다고 보고하였다. 동시에, 위에서 참조된 연구는 PCSK9가 LDL 생산 조절에 역할을 한다는 사실을 입증한다. PCSK9의 발현 또는 상향조절은 LDL 콜레스테롤의 증가된 혈장 수준과 연관되고, PCSK9의 발현 억제 또는 결핍은 낮은 LDL 콜레스테롤 혈장 수준과 연관된다. 중요하게는, PCSK9의 서열 변이와 관련된 낮은 수준의 LDL 콜레스테롤은 관상 동맥 심장 질환에 대한 보호를 제공하였다(Cohen et al, 2006 N. Engl. J. Med. 354: 1264-1272).
문헌[Lalanneet al.]은 PCSK9에 S127R 돌연변이를 보유한 2명의 환자에서 LDL 이화작용이 손상되고 아포지단백질 B 함유 지단백 합성이 향상되었음을 입증하였다(J. Lipid Research, 46: 1312-1319 (2005)). 문헌[Sun et al.]은 또한 PCSK9의 돌연변이 형태가 아포지단백질 B 분비를 증가시키는 효과의 결과로서 비정상적으로 심각한 우성 고콜레스테롤혈증의 원인이라는 증거도 제공하였다(Sun et al, Hum. Mol. Genet, 14(9): 1161-1169 (2005)). 이러한 결과는 PCSK9의 돌연변이 형태가 LDL 수용체의 수준도 감소시킨다는 것을 입증한 결과(Park et al., J. Biol. Chem., 279:50630-50638 (2004))에 더하여, 마우스에서 PCSK9의 아데노바이러스 매개 과발현이 LDL 수용체 양의 급격한 감소로 인해 심각한 고콜레스테롤혈증을 초래한다는 것을 입증한 초기 결과 (Dubuc et al., Thromb. Vase. Biol., 24: 1454-1459 (2004)) 와 일치하였다. 간 유래 세포를 포함한 세포주 및 생체 내 마우스 간에서 PCSK9의 과발현은 LDLR mRNA 수준에서 변화 없이 LDLR 단백질 수준 및 LDLR 기능 활성의 현저한 감소를 초래한다(Maxwell et al., Proc. Nat. Amer. Set, 101:7100-7105 (2004); Benjannet S. et al, J. Bio. Chem. 279: 48865-48875 (2004)).
유전자 침묵제, 예를 들어 RNAi에 의한 PSCK9 합성의 억제; 단클론 항체, 작은 펩티드 또는 애드넥틴에 의한 LDLR에 대한 PCSK9 결합의 억제; 및 소분자 억제제에 의한 PCSK9 자가촉매 처리의 억제를 비롯한PSCK9의 억제에 대한 다양한 치료적 접근이 제안되었다. 이들 전략은 문헌[Hedrick et al., Curr Opin Investig Drugs 2009;10:938-46; Hooper et al, Expert Opin Biol Ther, 2013;13:429-35; Rhainds et al, Clin Lipid, 2012;7:621-40; Seidah et al;, Expert Opin Ther Targets 2009;13:19-28; 및 Seidah et al, Nat Rev Drug Discov 2012; 11:367-83, 이들 각각은 본원에 참고로 포함됨]에 기술되었다.
일부 실시양태에서, 기능 상실 돌연변이는 PCSK9, 예를 들어 G106R, L253F, A443T, R93C 등에서 유도되었다. 일부 실시양태에서, 기능 상실 돌연변이, 예를 들어 G24D, S47F, R46H, S153N, H193Y가 조작된다(즉, 자연 발생이 아님).
본 개시 내용에서 유용할 수 있는 PCSK9 변이체는 단독으로 또는 경로에 관여하는 다른 유전자, 예를 들어, APOC3, LDL-R, 또는 Idol과 함께 LDL 콜레스테롤의 LDL 수용체 매개 제거를 촉진할 수 있는 기능 상실 변이체이다. 일부 실시양태에서, 본 개시 내용의 방법을 사용하여 생성된 PCSK9 기능 상실 변이체는 세포에서 효율적으로 발현된다. 일부 실시양태에서, 본 개시 내용의 방법을 사용하여 생성된 PCKS9 기능 상실 변이체는 활성화되고 유출되어 주변분비 기전에서 비변형된 세포로부터의 클라트린 코팅된 피트(pit)와 맞물려서, 야생형 PCSK9 단백질과 경쟁한다. 일부 실시양태에서, PCSK9 기능 상실 변이체는 LDL-R 단백질과 직접 접촉하는 LDL-R 결합 영역 내 잔기에서의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, LDL-R 단백질과 직접 접촉하는 LDL-R 결합 영역 내 잔기는 R194, R237, F379, S372, D374, D375, D378, R46, R237, 및 A443으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본원에 기재된 바와 같이, 기능 상실 PCSK9 변이체는 야생형 PCSK9 단백질과 비교하여 감소된 활성을 가질 수 있다. PCSK9 활성은 당업계에서 PCSK9 단백질의 임의의 공지된 생물학적 활성을 지칭한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, PCSK9 활성은 그의 프로테아제 활성을 지칭한다. 일부 실시양태에서, PCSK9 활성은 세포 분비 경로를 통해 분비되는 그의 능력을 지칭한다. 일부 실시양태에서, PCSK9 활성은 클라트린 코팅된 소포에서 단백질 결합 어댑터로서 작용하는 그의 능력을 지칭한다. 일부 실시양태에서, PCSK9 활성은 LDL 수용체와 상호작용하는 그의 능력을 지칭한다. 일부 실시양태에서, PCSK9 활성은 LDL 수용체 재순환을 방지하는 그의 능력을 지칭한다. 이러한 예는 제한적임을 의도하는 것은 아니다.
일부 실시양태에서, 기능 상실 PCSK9 변이체의 활성은 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 99% 이상 감소될 수 있다. 일부 실시양태에서, 기능 상실 PCSK9 변이체는 야생형 PCSK9 단백질과 비교하여 50% 이하, 40% 이하, 30% 이하, 20% 이하, 10% 이하, 5% 이하, 1% 이하의 활성을 갖는다. PCSK9 활성을 결정하기 위한 비제한적이고 예시적인 분석은 당업계에, 예를 들어 미국 특허 공보 US20120082680에 기술되었으며, 이는 본원에 참고로 포함된다.
일부 실시양태에서, 적절하게 폴딩되고 활성인 PCSK9 단백질의 수준을 감소시킴으로써 세포 PCSK9 활성이 감소될 수 있다. 야생형 PCSK9 단백질에 불안정화 돌연변이를 도입하면 단백질이 잘못 폴딩되거나 비활성화될 수 있다. 본원에 기재된 하나 이상의 불안정화 돌연변이를 포함하는 PCSK9 변이체는 야생형 PCSK9 단백질과 비교하여 감소된 활성을 가질 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 하나 이상의 불안정화 돌연변이를 포함하는 PCSK9 변이체의 활성은 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 99% 이상 감소될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법 및 조성물은 표적 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 발현 및/또는 그의 기능을 감소 또는 제거한다. 예를 들어, 본원에 개시된 방법 및 조성물은 대조군에 비해 PCSK9 유전자에 의해 코딩되는 PCSK9 단백질의 발현 및/또는 기능을 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 6배, 적어도 7배, 적어도 8배, 적어도 9배, 또는 적어도 10배 감소시킨다. 예를 들어, 본원에 개시된 방법 및 조성물은 대조군에 비해 APOC3 유전자에 의해 코딩되는 APOC3 단백질의 발현 및/또는 기능을 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 6배, 적어도 대조군에 비해 7배, 적어도 8배, 적어도 9배, 또는 적어도 10배 감소시킨다. 예를 들어, 본원에 개시된 방법 및 조성물은 대조군에 비해 ANGPTL3 유전자에 의해 코딩되는 ANGPTL3 단백질의 발현 및/또는 기능을 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 6배, 적어도 7배, 적어도 8배, 적어도 9배, 또는 적어도 10배 감소시킨다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 유전자 변형 방법 및 조성물은 세포에서 PCSK9 유전자에 의해 코딩되는 기능적 PCSK9 단백질의 발현을 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9%, 또는 100% 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 변형은 세포에서 PCSK9 유전자에 의해 코딩되는 기능적 PCSK9 단백질의 발현을 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 25배, 적어도 30배, 적어도 40배, 적어도 50배, 적어도 60배, 적어도 70배, 적어도 80배, 적어도 90배, 적어도 100배, 적어도 200배, 적어도 300배, 적어도 400배, 적어도 500배, 적어도 600배, 적어도 700배, 적어도 800배, 적어도 900배, 적어도 1000배, 적어도 2000배, 적어도 3000배, 적어도 4000배, 적어도 5000배, 적어도 6000배, 적어도 7000배, 적어도 8000배, 적어도 9000배, 또는 적어도 10000배 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 변형은 세포에서 PCSK9 유전자에 의해 코딩되는 기능적 PCSK9 단백질의 발현을 제거한다.
본 개시 내용의 일부 측면은 PCSK9 mRNA 성숙 및 생성을 방지함으로써 세포 PCSK9 활성을 감소시키는 전략을 제공한다. 일부 실시양태에서, 이러한 전략은 PCSK9 유전자에서 스플라이싱 부위의 변경을 포함한다. 변경된 스플라이싱 부위는 PCSK9 mRNA의 변경된 스플라이싱 및 성숙으로 이어질 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 변경된 스플라이싱 부위는 엑손의 건너뛰기를 유도할 수 있고, 이는 차례로 단축된 단백질 생성물 또는 변경된 판독 프레임을 유도할 수 있다. 일부 실시양태에서, 변경된 스플라이싱 부위는 인트론 서열의 번역 및 인트론에서 번역 리보솜이 프레임 내 정지 코돈을 만날 때 조기 번역 종결을 초래할 수 있다. 일부 실시양태에서, 개시 코돈이 편집되고 단백질 번역은 정확한 코딩 프레임에 있지 않을 수 있는 다음 ATG 코돈에서 개시된다.
스플라이싱 부위는 일반적으로 인트론 도너 부위, Lariat 분기점, 및 인트론 억셉터 부위를 포함한다. 스플라이싱의 메커니즘은 당업자에게 친숙하다. 비제한적 예로서, 인트론 도너 부위는 GGGTRAGT의 컨센서스 서열을 가지며, 인트론 도너 부위 컨센서스 서열의 G 염기와 쌍을 이루는 C 염기는 본원에 기재된 방법 및 조성물에 의해 표적화됨으로써 인트론 도너 부위를 변경할 수 있다. Lariat 분기점에는 YTRAC와 같은 컨센서스 서열을 가지며, 여기서 Y는 피리미딘이고 R은 퓨린이다. Lariat 분기점 컨센서스 서열의 C 염기는 본원에 기재된 핵염기 에디터에 의해 표적화되어 다음 엑손을 건너뛸 수 있다. 인트론 억셉터 부위는 YNCAGG의 컨센서스 서열을 가지며, 여기서 Y는 피리미딘이고 N은 임의의 뉴클레오티드이다. 인트론 억셉터 부위의 컨센서스 서열의 C 염기, 및 인트론 억셉터 부위의 컨센서스 서열의 G 염기와 쌍을 이루는 C 염기는 본원에 기재된 핵염기 에디터에 의해 표적화됨으로써 인트론 억셉터 부위를 변경하고, 차례로 엑손의 건너뛰기를 유도한다. 본원에 기재된 바와 같이, 인간 PCSK9에 대한 유전자 서열은 ~22 kb 길이이고 12개의 엑손 및 11개의 인트론을 함유한다. 각각의 엑손-인트론 접합이 변경되어 PCSK9 mRNA의 처리 및 성숙을 방해할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 염기 에디터 시스템에 의해 생성된 스플라이스 부위 파괴는 PCSK9 유전자에 의해 코딩되는 전령 RNA(mRNA)에 인트론 서열의 포함을 초래할 수 있다. 일부 실시양태에서, 스플라이스 부위 파괴는 단백질 활성을 파괴하는 조기 정지 코돈 또는 아미노산의 삽입/결실을 초래하는 넌센스, 프레임 이동, 또는 프레임 내 삽입-결실 돌연변이를 생성한다. 일부 실시양태에서, 스플라이스 부위 파괴는 엑손 서열의 배제를 일으킨다. 일부 실시양태에서, 스플라이스 부위 파괴는 PCSK9 전사물에서 넌센스, 프레임 이동 또는 프레임 내 삽입-결실 돌연변이를 초래하는 엑손 서열의 배제를 일으킨다. 표준 스플라이스 도너는 센스 가닥의 DNA 서열 GT를 포함하는 반면, 표준 스플라이스 억셉터는 DNA 서열 AG를 포함한다. 서열의 변경은 정상적인 스플라이싱을 방해한다. 스플라이스 도너는 안티센스 가닥(GT에서 GC로)의 두 번째 위치에 있는 상보적 염기의 아데닌 염기 편집에 의해 파괴될 수 있고, 스플라이스 억셉터는 센스 가닥(AG에서 GG로)의 첫 번째 위치의 아데닌 염기 편집에 의해 파괴될 수 있다. .
추가로, 본 개시 내용은 또한 기능 획득 PCSK9 변이체의 효과를 상쇄하기 위한 불안정화 돌연변이의 사용을 고려한다. 기능 획득 PCSK9 변이체(예를 들어, 기능 획득 변이체)는 당업계에 기술되어 있으며 고콜레스테롤혈증과 관련된 것으로 밝혀져 있다(예를 들어, Peterson et al., J Lipid Res. 2008 Jun; 49(6): 1152-1156; Benjannet et al., J Biol Chem. 2012 Sep 28;287(40):33745-55; Abifadel et al, Atherosclerosis. 2012 Aug;223(2):394-400; 및 Cameron et al, Hum. Mol. Genet. (1 May 2006) 15(9): 1551-1558, 이들 각각은 본원에 참고로 포함됨). 이러한 기능 획득 PCSK9 변이체에 불안정화 돌연변이를 도입하면 이들 기능 획득 변이체의 폴딩 오류 및 비활성화가 발생함으로써, 기능 획득 돌연변이에 의해 야기된 과잉 활성을 상쇄할 수 있다. 또한, LDL-R 매개 콜레스테롤 제거 경로의 몇 가지 다른 주요 인자, 예를 들어, LDL- R, APOB, 또는 APOC에서의 기능 획득 돌연변이도 당업계에 기술되었다. 따라서, 본원에 기재된 조성물 및 방법을 사용하여 기능 획득 돌연변이의 해로운 효과를 상쇄하기 위해 이들 인자에서 불안정화 돌연변이를 만드는 것 또한 본 개시 내용의 범위 내에 있다. 이와 같이, 본 개시 내용은 PCSK9 단백질의 폴딩 오류 또는 PCSK9 단백질의 구조적 불안정화를 야기하는 돌연변이를 추가로 제공한다.
PCSK9 및 인간 기원의 패밀리의 다른 구성원의 폴리펩티드 및 코딩 핵산 서열 및 많은 동물의 폴리펩티드 및 코딩 핵산 서열은 예를 들어 NCBI 웹사이트 또는 ENSEMBL 웹사이트로부터 공개적으로 이용 가능하다. 예로는 다음 서열이 포함되지만 이에 제한되지는 않으며, 이들 서열 각각은 그 전체가 본원에 포함된다;
야생형 PCSK9 유전자(NG_009061.1), 호모 사피엔스(Homo sapiens) 전구단백질 전환효소 서브틸리신/켁신 9형(PCSK9), 염색체 1의 RefSeqGene (LRG_275)
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인간 PCSK9 아미노산 서열 (NP_777596.2)
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아포지단백질 C3 ( APOC3 )
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 조성물 및 방법을 사용한 변형을 위한 표적 유전자는 APOC3을 코딩하는 유전자이다. LDL-R 매개 콜레스테롤 제거 경로에는 여러 참여인자가 포함된다. 이 경로에 관련된 단백질 인자의 비제한적 예는 아포지단백질 C3(APOC3), LDL 수용체(LDL-R), 및 LDL 수용체 단백질의 분해 증가(IDOL)를 포함한다. 이들 단백질 인자 및 각각의 기능은 당업계에 기술되어 있다. 또한, 이러한 인자의 기능 상실 변이체가 확인 및 특성화되었으며 심장 보호 기능이 있는 것으로 결정되어 있다. 예를 들어, 문헌[Jorgensen et al., N Engl J Med 2014; 371:32-41 July 3, 2014; Scholtzl et al, Hum. Mol. Genet. (1999) 8 (11): 2025-2030; De Castro-Oros et al., BMC Medical Genomics, 20147: 17; and Gu et al., J Lipid Res. 2013, 54(12):3345-57, 이들 각각은 본원에 참고로 포함됨]을 참조한다. 따라서, 본 개시 내용의 일부 측면은 본원에 개시된 방법 및 조성물을 사용하여 APOC3(예를 들어, A43T 및 R19X), LDL-R, 및 IDOL(예를 들어, R266X)의 기능 상실 변이체의 생성을 제공한다.
아포지단백 C-III(APOC3)은 인간에서 APOC3 유전자에 의해 코딩되는 단백질이다. APOC3는 초저밀도 지단백질(VLDL)의 구성요소이다. APOC3은 지단백 리파아제와 간 리파아제를 억제한다. 또한 트리글리세리드가 풍부한 입자의 간 흡수를 억제하는 것으로 생각된다. APOC3의 수준 증가는 고트리글리세리드혈증의 발병을 유도한다. 최근 증거는 지질이 풍부한 조건에서 간 세포로부터 트리글리세리드가 풍부한 VLDL 입자의 조립 및 분비를 촉진하는 데 있어 APOC3의 세포 내 역할을 시사한다. 그러나 인간 apoC3 코딩 서열에서 2가지 자연 발생 점 돌연변이인 A23T 및 K58E는 간 세포로부터 트리글리세리드가 풍부한 VLDL 입자의 세포 내 조립 및 분비를 제거하는 것으로 나타났다.
본원에 기재된 방법 및 조성물을 사용하여 APOC3 유전자에서 만들어질 수 있는 기능 상실 돌연변이가 또한 제공된다. 기능 상실 돌연변이를 생성하는 전략은 PCSK9 또는 ANGPTL3에 사용되는 전략과 유사하다(예를 들어, 조기 정지 코돈, 불안정화 돌연변이, 스플라이싱 변경 등).
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 유전자 변형 방법 및 조성물은 세포에서 APOC3 유전자에 의해 코딩되는 기능적 APOC3 단백질의 발현을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 변형은 코딩된 기능적 APOC3 단백질의 발현을 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9%, 또는 100% 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 변형은 세포에서 APOC3 또는 ANGPTL3 유전자에 의해 코딩되는 기능적 ANGPTL3 단백질의 발현을 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 25배, 적어도 30배, 적어도 40배, 적어도 50배, 적어도 60배, 적어도 70배, 적어도 80배, 적어도 90배, 적어도 100배, 적어도 200배, 적어도 300배, 적어도 400배, 적어도 500배, 적어도 600배, 적어도 700배, 적어도 800배, 적어도 900배, 적어도 1000배, 적어도 2000배, 적어도 3000배, 적어도 4000배, 적어도 5000배, 적어도 6000배, 적어도 7000배, 적어도 8000배, 적어도 9000배, 또는 적어도 10000배 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 변형은 세포에서 APOC3 유전자에 의해 코딩되는 기능적 APOC3 단백질의 발현을 제거한다.
인간 APOC3의 단백질 서열은 예를 들어, 기탁 번호 NP_000031.1에서 찾을 수 있으며, 이 참고는 그 전체가 본원에 포함된다. 인간 핵산 서열은 예를 들어 GenBank 등록 번호 NG_008949.1에서 찾을 수 있으며, 이 서열은 그 전체가 본원에 포함된다. 마우스, 래트 및 원숭이 APOC3 핵산 서열은 기탁되었다. 예를 들어, Ensembl 등록 번호 ENSMUSG00000032081, ENSRNOG00000047503, 및 ENSMFAG00000001837을 각각 참조하고, 이들 각각의 서열은 그 전체가 본원에 포함된다.
APOC3 및 인간 기원 패밀리의 다른 구성원 및 다수의 동물의 폴리펩티드 및 코딩 핵산 서열은 예를 들어 NCBI 웹사이트 또는 ENSEMBL 웹사이트에서 공개적으로 이용 가능하다. 예는 하기 서열을 포함하지만 이에 제한되지 않으며, 이들 서열의 각각은 그 전체가 본원에 포함된다;
NG_008949.1:5000-8165 호모 사피엔스 아포지단백질 C3 (APOC3), 염색체 11의 RefSeqGene
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Figure pct00042
NP_000031.1 인간 아포지단백질 C-III 전구체
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안지오포이에틴 유사 3( ANGPTL3 )
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 조성물 및 방법을 사용한 변형을 위한 표적 유전자는 ANGPTL3을 코딩하는 유전자이다. ANGPTL3은 동맥경화증, 죽상동맥경화증, 심혈관 질환, 관상동맥 심장병, 당뇨병, 진성 당뇨병, 인슐린 비의존성 진성 당뇨병, 지방간, 고인슐린증, 고지혈증, 고트리글리세리드혈증, 저베타지단백혈증, 염증, 인슐린 저항성, 대사 질환, 비만, 구강의 악성 신생물, 지질 대사 장애, 입술 및 구강 암종, 이상지질혈증, 대사 증후군 X, 저트리글리세리드혈증, 오피츠 삼두증 증후군, 허혈성 뇌졸중, 고트리글리세리드혈증 결과, 저베타지단백혈증 가족성 2, 가족성 저베타지단백혈증, 및 허혈성 뇌혈관 사고와 같은, 그러나 이에 제한되지 않는 질환 및 장애와 관련되어 왔다. 본원에 기재된 임의의 방법을 사용하여 ANGPTL3 유전자를 편집하는 것은 본원에 기재된 질환 및 장애의 증상을 치료, 예방 및/또는 완화하는데 사용될 수 있다.
ANGPTL3 유전자는 인간의 고밀도 지단백질(HDL) 수준을 결정하는 인자인 안지오포이에틴 유사 3 단백질을 코딩한다. 이는 혈장 중성지방 및 HDL 콜레스테롤과 양의 상관관계가 있다. ANGPTL3의 활성은 주로 간에서 발현된다. ANGPTL3은 이상지질혈증과 관련이 있다. 이상지질혈증은 막힌 동맥(죽상동맥경화증)의 발병에 기여하는 혈액 내 지질 수준 상승을 특징으로 하는 유전 질환이다. 이러한 지질에는 혈장 콜레스테롤, 트리글리세리드, 또는 고밀도 지단백질이 포함된다. 이상지질혈증은 심장마비, 뇌졸중, 또는 기타 순환기 문제의 위험을 증가시킨다. 현재 관리에는 운동 및 식이 요법과 같은 생활 방식 변화와 스타틴과 같은 지질 저하제 사용이 포함된다. 비스타틴 지질 저하 약물에는 담즙산 격리제, 콜레스테롤 흡수 억제제, 동형 가족성 고콜레스테롤혈증 약물, 피브레이트, 니코틴산, 오메가-3 지방산 및/또는 복합 산물이 포함된다. 다양한 지질 이상이 종종 공존하지만 치료 옵션은 일반적으로 특정 지질 이상에 따라 결정된다. 어린이 치료는 식이 변화를 시행하기 어렵고 지질 저하 요법이 효과적임이 입증되지 않았기 때문에 더 어렵다.
ANGPTL3은 또한 저베타지단백혈증을 유발하는 것으로 알려져 있다. 저베타지단백혈증은 전 세계적으로 1000명 중 1명 내지 3000명 중 1명 사이에서 발생하는 유전 질환(상염색체 열성)이다. 저베타지단백혈증의 일반적인 증상에는 5백분위수 미만의 LDL 콜레스테롤 또는 아포지단백질 B의 혈장 수준이 포함되며, 이는 신체의 지방 흡수 및 수송 능력을 손상시키고 망막 변성, 신경병증, 응고 장애, 또는 간 지방증이라고 하는 간의 비정상적인 지방 축적을 유발할 수 있다. 심하게 병에 걸린 환자에서 간 지방증은 만성 간 질환(간경변)으로 진행될 수 있다. 저베타지단백혈증의 현재 치료에는 지방 흡수를 개선하기 위해 장쇄 지방산을 하루 15 g으로 엄격하게 제한하는 것이 포함된다. 저베타지단백혈증이 있는 영아의 경우 중쇄 트리글리세리드를 단기간 보충하는 것이 효과적일 수 있지만 간 독성을 피하기 위해 양을 면밀히 모니터링해야 한다. 저베타지단백혈증을 치료하기 위한 또 다른 옵션은 신경학적 합병증을 예방하기 위해 고용량의 비타민 E를 투여하는 것이다. 또는 비타민 A(10,000-25,000 IU/d) 보충은 프로트롬빈 시간의 증가가 비타민 K 고갈을 시사하는 경우 효과적일 수 있다.
한 예에서, 본원에 기재된 조성물 및 방법에 대한 표적 조직은 간 조직이다. 한 예에서, 유전자는 안지오포이에틴 5, ANGPT5, ANG-5, 안지오포이에틴 유사 단백질 3, 안지오포이에틴-5, FHBL2, 및 ANL3으로도 지칭될 수 있는 ANGPTL3이다. ANGPTL3은 lp31.3의 세포유전학적 위치를 가지며 게놈 좌표는 위치 62,597,487-62,606,159에서 정방향 가닥의 염색체 1에 있다.
본원에 기재된 방법 및 조성물을 사용하여 ANGPTL3 유전자에서 만들어질 수 있는 기능 상실 돌연변이가 또한 제공된다. 기능 상실 돌연변이를 생성하기 위한 전략은 PCSK9에 사용된 것과 유사하다(예를 들어, 조기 정지 코돈, 불안정화 돌연변이, 스플라이싱 변경 등을 포함하지만 이에 제한되지 않음).
일부 실시양태에서, 변형은 세포에서 ANGPTL3 유전자에 의해 코딩되는 기능적 ANGPTL3 단백질의 발현을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 변형은 코딩된 기능적 ANGPTL3 단백질의 발현을 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9%, 또는 100% 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 변형은 세포에서 ANGPTL3 유전자에 의해 코딩되는 기능적 ANGPTL3 단백질의 발현을 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 25배, 적어도 30배, 적어도 40배, 적어도 50배, 적어도 60배, 적어도 70배, 적어도 80배, 적어도 90배, 적어도 100배, 적어도 200배, 적어도 300배, 적어도 400배, 적어도 500배, 적어도 600배, 적어도 700배, 적어도 800배, 적어도 900배, 적어도 1000배, 적어도 2000배, 적어도 3000배, 적어도 4000배, 적어도 5000배, 적어도 6000배, 적어도 7000배, 적어도 8000배, 적어도 9000배, 또는 적어도 10000 배 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 변형은 세포에서 ANGPTL3 유전자에 의해 코딩되는 기능적 ANGPTL3 단백질의 발현을 제거한다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 염기 에디터 시스템에 의해 생성된 스플라이스 부위 파괴는 ANGPTL3 유전자에 의해 코딩되는 전령 RNA(mRNA)에 인트론 서열의 포함을 초래할 수 있다. 일부 실시양태에서, 스플라이스 부위 파괴는 조기 정지 코돈 또는 단백질 활성을 방해하는 아미노산의 삽입/결실을 초래하는 넌센스, 프레임 이동, 또는 프레임 내 삽입-결실 돌연변이를 생성한다. 일부 실시양태에서, 스플라이스 부위 파괴는 엑손 서열의 배제를 일으킨다. 일부 실시양태에서, 스플라이스 부위 파괴는 ANGPTL3 전사물에서 넌센스, 프레임 이동 또는 프레임 내 삽입-결실 돌연변이를 초래하는 엑손 서열의 배제를 일으킨다. 표준 스플라이스 도너는 센스 가닥의 DNA 서열 GT를 포함하는 반면, 표준 스플라이스 억셉터는 DNA 서열 AG를 포함한다. 서열의 변경은 정상적인 스플라이싱을 방해한다. 스플라이스 도너는 안티센스 가닥의 두 번째 위치에 있는 상보적 염기의 아데닌 염기 편집(GT에서 GC로)에 의해 파괴될 수 있고, 스플라이스 억셉터는 센스 가닥의 첫 번째 위치의 아데닌 염기 편집(AG에서 GG로)에 의해 파괴될 수 있다. .
일부 실시양태에서, 본원에서 제공되는 염기 에디터 시스템은 ANGPTL3 유전자와 접촉될 때 ANGPTL3 유전자에서 A·T에서 G·C로의 변경을 수행한다. 일부 실시양태에서, A·T에서 G·C로의 변경은 ANGPTL3 유전자의 스플라이스 도너 부위에 있다. 일부 실시양태에서, A·T에서 G·C로의 변경은 ANTPTL3 유전자의 스플라이스 억셉터 부위에 있다. 일부 실시양태에서, A·T에서 G·C로의 변경은 ANGPTL3 유전자에 의해 코딩되는 비정상 ANGPTL3 전사물을 생성한다. 일부 실시양태에서, A·T에서 G·C로의 변경은 ANGPTL3 유전자에 의해 코딩되는 비기능적 ANGPTL3 폴리펩티드를 생성한다. 일부 실시양태에서, A·T에서 G·C로의 변경은 ANGPLT3 유전자의 인트론 6의 스플라이스 도너 부위의 5' 말단에 있다.
인간 ANGPTL3의 뉴클레오티드 서열은 예를 들어 NG_028169.1에 제공되며, 이는 그 전체가 본원에 포함된다. 인간 ANGPTL3의 단백질 서열, 예를 들어 AAD34156.1이 제공되며, 이는 그 전체가 본원에 포함된다.
마우스, 래트 및 원숭이 ANGPTL3 핵산 서열은 기탁되었다. 예를 들어, Ensembl 등록 번호 ENSMUSG00000028553, ENSRNOG00000008638 및 ENSMFAG00000007083을 각각 참조하며, 이들 서열 각각은 그 전체가 본원에 포함된다.
ANGPTL3 및 인간 기원의 패밀리의 다른 구성원의 폴리펩티드 및 코딩 핵산 서열 및 많은 동물의 폴리펩티드 및 코딩 핵산 서열은 예를 들어 NCBI 웹사이트 또는 ENSEMBL 웹사이트로부터 공개적으로 이용 가능하다. 예로는 다음 서열이 포함되지만 이에 제한되지는 않으며, 이들 서열 각각은 그 전체가 본원에 포함된다; NG_028169.1 인간 안지오포이에틴 유사 3(ANGPTL3), 염색체 1의 RefSeqGene
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Figure pct00045
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AAD34156.1 인간 안지오포이에틴 관련 단백질 3
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지단백질 (a) ( LPA )
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 조성물 및 방법을 사용한 변형을 위한 표적 유전자는 지단백질 α(LPA)를 코딩하는 유전자이다. LPA는 저밀도 지단백질 변이체이다. 유전 및 역학 연구는 LPA를 죽상동맥경화증 및 관련 질환, 예컨대 관상동맥 심장병 및 뇌졸중의 위험 인자로서 확인하였다. LPA 농도는 개인마다 천 배 이상 다양하다: <0.2에서 >200 mg/dL. 이 농도 범위는 지금까지 과학자들이 연구한 모든 집단에서 관찰된다. 다양한 세계 인구 사이에서 평균 및 중앙값 농도는 뚜렷한 특이성을 나타내며, 주요한 것은 아시아, 오세아니아, 또는 유럽 인구에 비해 아프리카계 인구의 LPA 혈장 농도가 2~3배 더 높다는 것이다. 혈중 높은 LPA는 관상 동맥 심장 질환(CHD), 심혈관 질환(CVD), 죽상동맥경화증, 혈전증, 및 뇌졸중과 관련이 있다. LPA가 없거나 LPA 수준이 매우 낮은 개인은 건강한 것으로 보인다. 따라서 혈장 LPA는 적어도 정상적인 환경 조건에서는 중요하지 않다. apo(a)/LPA는 포유류 진화에서 비교적 최근에 나타났기 때문에(오직 구세계 원숭이와 인간만이 LPA를 보유하는 것으로 나타났음) 그 기능은 중요하지 않을 수 있지만 단지 특정 환경 조건 하, 특정 전염병에 노출된 경우에 진화적으로 유리할 수 있다.
인간 참조 서열 NG_016147.1에 의해 코딩되는 예시적인 LPA 아미노산 서열은 하기에 제공된다:
>sp|P08519|APOA_인간 아포지단백질(a) OS=호모 사피엔스 OX=9606 GN=LPA PE=1 SV=1
Figure pct00054
Figure pct00055
Figure pct00056
Figure pct00057
염기 에디터 단백질-gRNA 복합체
또 다른 측면에서, 염기 에디터 융합 단백질, 예를 들어, 아데노신 염기 에디터 융합 단백질과 복합체를 이루는 본원에 제공된 바와 같은 단일 가이드 RNA를 포함하는 복합체가 본원에 제공되며, 여기서 복합체는 비변형된 단일 가이드 RNA 및 염기 에디터 단백질과의 복합체와 비교하여 증가된 안정성을 포함하고, 안정성은 복합체의 생체 외 또는 시험관 내에서 반감기로 측정된다.
일부 실시양태에서, 복합체는 비변형된 단일 가이드 RNA 및 Cas9 단백질과의 복합체와 비교하여 증가된 안정성을 포함한다. 일부 실시양태에서, 복합체는 비변형된 단일 가이드 RNA 및 Cas9 단백질과의 복합체와 비교하여 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 100%, 적어도 200%, 적어도 300%, 적어도 400%, 적어도 500%, 적어도 600%, 적어도 700%, 적어도 800%, 적어도 900%, 적어도 1000%, 적어도 2000%, 적어도 3000%, 적어도 4000%, 적어도 5000%, 적어도 6000%, 적어도 7000%, 적어도 8000%, 적어도 9000%, 적어도 10000%, 적어도 20000%, 적어도 30000%, 적어도 40000%, 적어도 50000%, 적어도 60000%, 적어도 70000%, 적어도 80000%, 적어도 90000%, 또는 적어도 100000% 증가된 안정성을 포함한다. 일부 실시양태에서, 복합체는 비변형 단일 가이드 RNA 및 Cas9 단백질과의 복합체와 비교하여 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 25배, 적어도 30배, 적어도 40배, 적어도 50배, 적어도 60배, 적어도 70배, 적어도 80배, 적어도 90배, 적어도 100배, 적어도 200배, 적어도 300배, 적어도 400배, 적어도 500배, 적어도 600배, 적어도 700배, 적어도 800배, 적어도 900배, 적어도 1000배, 적어도 2000배, 적어도 3000배, 적어도 4000배, 적어도 5000배, 적어도 6000배, 적어도 7000배, 적어도 8000배, 적어도 9000배, 또는 적어도 10000배 증가된 안정성을 포함한다.
일부 실시양태에서, 복합체의 안정성은 복합체의 반감기에 의해 측정된다. 일부 실시양태에서, 복합체의 안정성은 생체 외 복합체의 반감기에 의해 측정된다. 일부 실시양태에서, 복합체의 안정성은 시험관 내에서 복합체의 반감기에 의해 측정된다.
일부 실시양태에서, 복합체는 비변형된 단일 가이드 RNA 및 Cas9 단백질과의 복합체와 비교하여 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 100%, 적어도 200%, 적어도 300%, 적어도 400%, 적어도 500%, 적어도 600%, 적어도 700%, 적어도 800%, 적어도 900%, 적어도 1000%, 적어도 2000%, 적어도 3000%, 적어도 4000%, 적어도 5000%, 적어도 6000%, 적어도 7000%, 적어도 8000%, 적어도 9000%, 적어도 10000%, 적어도 20000%, 적어도 30000%, 적어도 40000%, 적어도 50000%, 적어도 60000%, 적어도 70000%, 적어도 80000%, 적어도 90000%, 또는 적어도 100000% 증가된 반감기를 포함하며, 여기서 복합체의 반감기는 생체 외에서 측정된다. 일부 실시양태에서, 단일 가이드 RNA는 비변형된 단일 가이드 RNA 및 Cas9 단백질과의 복합체와 비교하여 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 25배, 적어도 30배, 적어도 40배, 적어도 50배, 적어도 60배, 적어도 70배, 적어도 80배, 적어도 90배, 적어도 100배, 적어도 200배, 적어도 300배, 적어도 400배, 적어도 500배, 적어도 600배, 적어도 700배, 적어도 800배, 적어도 900배, 적어도 1000배, 적어도 2000배, 적어도 3000배, 적어도 4000배, 적어도 5000배, 적어도 6000배, 적어도 7000배, 적어도 8000배, 적어도 9000배, 또는 적어도 10000배의 복합체의 증가된 반감기를 나타내며, 여기서 복합체의 반감기는 생체 외에서 측정된다.
일부 실시양태에서, 복합체는 시험관 외에서 측정될 때 비변형된 단일 가이드 RNA 및 Cas9 단백질과의 복합체와 비교하여 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 100%, 적어도 200%, 적어도 300%, 적어도 400%, 적어도 500%, 적어도 600%, 적어도 700%, 적어도 800%, 적어도 900%, 적어도 1000%, 적어도 2000%, 적어도 3000%, 적어도 4000%, 적어도 5000%, 적어도 6000%, 적어도 7000%, 적어도 8000%, 적어도 9000%, 적어도 10000%, 적어도 20000%, 적어도 30000%, 적어도 40000%, 적어도 50000%, 적어도 60000%, 적어도 70000%, 적어도 80000%, 적어도 90000%, 또는 적어도 100000% 증가된 반감기를 포함하며, 여기서 복합체의 반감기는 시험관 외에서 측정된다. 일부 실시양태에서, 단일 가이드 RNA는 비변형된 단일 가이드 RNA 및 Cas9 단백질과의 복합체와 비교하여 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 25배, 적어도 30배, 적어도 40배, 적어도 50배, 적어도 60배, 적어도 70배, 적어도 80배, 적어도 90배, 적어도 100배, 적어도 200배, 적어도 300배, 적어도 400배, 적어도 500배, 적어도 600배, 적어도 700배, 적어도 800배, 적어도 900배, 적어도 1000배, 적어도 2000배, 적어도 3000배, 적어도 4000배, 적어도 5000배, 적어도 6000배, 적어도 7000배, 적어도 8000배, 적어도 9000배, 또는 적어도 10000배의 복합체의 증가된 반감기를 나타내며, 여기서 복합체의 반감기는 시험관 내에서 측정된다.
또 다른 측면에서, 본원에 제공된 바와 같은 복합체를 포함하는 세포가 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 세포는 시험관 내 세포일 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포는 생체 외 세포일 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포는 생체 내 세포일 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포는 단리된 세포일 수 있다.
유전자 변형 조성물
또 다른 측면에서, 본원에 제공된 바와 같은 단일 가이드 RNA 및 염기 에디터 단백질 또는 염기 에디터 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 유전자 변형을 위한 조성물이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 조성물은 염기 에디터 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 핵산 서열은 DNA, RNA 또는 mRNA, 또는 변형된 핵산 서열일 수 있다. 일부 실시양태에서, 벡터는 발현 벡터일 수 있다. 일부 실시양태에서, 핵산은 벡터의 프로모터에 작동적으로 연결된다. 일부 실시양태에서, 벡터는 플라스미드 또는 바이러스 벡터이다.
치료제 및 치료 방법
일부 측면에서, 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법이 본원에 제공되며, 방법은 (i) 가이드 폴리뉴클레오티드 또는 이를 코딩하는 핵산, 및 (ii) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 핵산의 치료 유효량을 대상체에 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 염기 에디터 시스템은 가이드 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 염기 에디터 시스템은 가이드 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 염기 에디터 시스템은 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 염기 에디터 시스템은 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질을 코딩하는 핵산을 포함한다.
일부 실시양태에서, 가이드 폴리뉴클레오티드는 염기 에디터 시스템이 대상체에서 ANGPTL3 유전자 내 핵염기 변경을 일으키도록 지시한다. 일부 실시양태에서, 가이드 폴리뉴클레오티드는 염기 에디터 시스템이 대상체에서 PCSK9유전자 내 핵염기 변경을 일으키도록 지시한다.
일부 실시양태에서, 차세대 시퀀싱 또는 생어 시퀀싱에 의해 측정되는 경우 대상체에서 전체 간 세포의 적어도 35%에서 염기 변경이 발생하여 대상체의 병태를 치료하거나 예방한다.
일부 측면에서, 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법이 본원에 제공되며, 방법은 (i) 가이드 폴리뉴클레오티드 또는 이를 코딩하는 핵산, 및 (ii) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 핵산을 포함하는 제1 조성물로서, 가이드 폴리뉴클레오티드는 염기 에디터 시스템이 대상체에서 PCSK9 유전자 내 핵염기 변경을 일으키도록 지시하며, 차세대 시퀀싱 또는 생어 시퀀싱에 의해 측정되는 경우 대상체에서 전체 간 세포의 적어도 35%에서 염기 변경이 발생하는 것인 제1 조성물; 및 (i) 가이드 폴리뉴클레오티드 또는 이를 코딩하는 핵산, 및 (ii) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 핵산을 포함하는 제2 조성물로서, 가이드 폴리뉴클레오티드는 염기 에디터 시스템이 대상체에서 ANGPTL3 유전자 내 핵염기 변경을 일으키도록 지시하며, 차세대 시퀀싱 또는 생어 시퀀싱에 의해 측정되는 경우 대상체에서 전체 간 세포의 적어도 35%에서 염기 변경이 발생하는 것인 제2 조성물의 치료 유효량을 대상체에 투여하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 조성물 및 제2 조성물은 순차적으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 제1 조성물은 1회 이상의 용량으로 투여되고, 이어서 제2 조성물은 1회 이상의 용량으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 제1 조성물 및 제2 조성물은 사이사이 배치된다. 일부 실시양태에서, 제1 조성물 및 제2 조성물은 동시에 투여된다. 일부 실시양태에서, 제1 조성물 및 제2 조성물은 1회 이상의 용량으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 제1 조성물 및 제2 조성물은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30시간의 간격을 두고 투여된다. 일부 실시양태에서, 제1 조성물 및 제2 조성물은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30일의 간격을 두고 투여된다. 일부 실시양태에서, 제1 조성물 및 제2 조성물은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30주의 간격을 두고 투여된다.
일부 실시양태에서, 염기 변경은 차세대 시퀀싱 또는 생어 시퀀싱에 의해 측정되는 경우 대상체에서 전체 간 세포의 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99.3%, 99.5%, 99.7%, 99.8%, 또는 99.9%에서 발생한다. 일부 실시양태에서, 염기 변경은 차세대 시퀀싱 또는 생어 시퀀싱에 의해 측정되는 경우 대상체에서 전체 간 세포의 최대 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99.3%, 99.5%, 99.7%, 99.8%, 또는 99.9%에서 발생한다. 일부 실시양태에서, 염기 변경은 차세대 시퀀싱 또는 생어 시퀀싱에 의해 측정되는 경우 대상체에서 전체 간 세포의 1%-99.9%, 2%-99.9%, 3%-99.9%, 4%-99.9%, 5%-99.9%, 6%-99.9%, 7%-99.9%, 8%-99.9%, 9%-99.9%, 10%-99.9%, 15%-99.9%, 20%-99.9%, 25%-99.9%, 30%-99.9%, 35%-99.9%, 40%-99.9%, 45%-99.9%, 50%-99.9%, 55%-99.9%, 60%-99.9%, 65%-99.9%, 70%-99.9%, 75%-99.9%, 80%-99.9%, 85%-99.9%, 90%-99.9%, 또는 95-99.9%에서 발생한다. 일부 실시양태에서, 염기 변경은 차세대 시퀀싱 또는 생어 시퀀싱에 의해 측정되는 경우 대상체에서 전체 간 세포의 1%-99.5%, 1%-99%, 1%-98%, 1%-97%, 1%-96%, 1%-95%, 1%-90%, 1%-85%, 1%-80%, 1%-75%, 1%-70%, 1%-65%, 1%-60%, 1%-55%, 1%-50%, 1%-45%, 1%-40%, 1%-35%, 1%-30%, 1%-25%, 1%-20%, 1%-15%, 1%-10%, 1%-9%, 1%-8%, 1%-7%, 1%-6%, 1%-5%, 1%-4%, 1%-3%, 또는 1%-2%에서 발생한다. 일부 실시양태에서, 염기 변경은 차세대 시퀀싱 또는 생어 시퀀싱에 의해 측정되는 경우 대상체에서 전체 간 세포의 1%-90%, 5%-85%, 10%-80%, 15%-75%, 20%-70%, 25%-65%, 30%-60%, 35%-55%, 또는 40%-50%에서 발생한다. 일부 실시양태에서, 염기 변경은 차세대 시퀀싱 또는 생어 시퀀싱에 의해 측정되는 경우 대상체에서 전체 간 세포의 100%에서 발생한다.
일부 실시양태에서, 염기 변경은 대상체의 간세포에서 발생한다. 일부 실시양태에서, 염기 변경은 차세대 시퀀싱 또는 생어 시퀀싱에 의해 측정되는 경우 대상체에서 간세포의 적어도 30%에서 발생한다. 일부 실시양태에서, 염기 변경은 대상체의 간세포에서 발생한다. 일부 실시양태에서, 염기 변경은 차세대 시퀀싱 또는 생어 시퀀싱에 의해 측정되는 경우 대상체에서 간세포의 적어도 35%에서 발생한다. 일부 실시양태에서, 염기 변경은 차세대 시퀀싱 또는 생어 시퀀싱에 의해 측정되는 경우 대상체에서 간세포의 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99.3%, 99.5%, 99.7%, 99.8%, 또는 99.9% 에서 발생한다. 일부 실시양태에서, 염기 변경은 차세대 시퀀싱 또는 생어 시퀀싱에 의해 측정되는 경우 대상체에서 간세포의 최대 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99.3%, 99.5%, 99.7%, 99.8%, 또는 99.9% 에서 발생한다. 일부 실시양태에서, 염기 변경은 차세대 시퀀싱 또는 생어 시퀀싱에 의해 측정되는 경우 대상체에서 간세포의 1%-99.9%, 2%-99.9%, 3%-99.9%, 4%-99.9%, 5%-99.9%, 6%-99.9%, 7%-99.9%, 8%-99.9%, 9%-99.9%, 10%-99.9%, 15%-99.9%, 20%-99.9%, 25%-99.9%, 30%-99.9%, 35%-99.9%, 40%-99.9%, 45%-99.9%, 50%-99.9%, 55%-99.9%, 60%-99.9%, 65%-99.9%, 70%-99.9%, 75%-99.9%, 80%-99.9%, 85%-99.9%, 90%-99.9%, 또는 95-99.9%에서 발생한다. 일부 실시양태에서, 염기 변경은 차세대 시퀀싱 또는 생어 시퀀싱에 의해 측정되는 경우 대상체에서 간세포의 1%-99.5%, 1%-99%, 1%-98%, 1%-97%, 1%-96%, 1%-95%, 1%-90%, 1%-85%, 1%-80%, 1%-75%, 1%-70%, 1%-65%, 1%-60%, 1%-55%, 1%-50%, 1%-45%, 1%-40%, 1%-35%, 1%-30%, 1%-25%, 1%-20%, 1%-15%, 1%-10%, 1%-9%, 1%-8%, 1%-7%, 1%-6%, 1%-5%, 1%-4%, 1%-3%, 또는 1%-2%에서 발생한다. 일부 실시양태에서, 염기 변경은 차세대 시퀀싱 또는 생어 시퀀싱에 의해 측정되는 경우 대상체에서 간세포의 1%-90%, 5%-85%, 10%-80%, 15%-75%, 20%-70%, 25%-65%, 30%-60%, 35%-55%, 또는 40%-50% 에서 발생한다. 일부 실시양태에서, 염기 변경은 차세대 시퀀싱 또는 생어 시퀀싱에 의해 측정되는 경우 대상체에서 간세포의 100% 에서 발생한다.
일부 실시양태에서, 대상체의 전체 간 세포에서 발생되는 염기 변경은 차세대 시퀀싱에 의해 측정된다. 일부 실시양태에서, 대상체의 전체 간 세포에서 발생되는 염기 변경은 생어 시퀀싱에 의해 측정된다. 일부 실시양태에서, 대상체의 간세포에서 발생되는 염기 변경은 차세대 시퀀싱에 의해 측정된다. 일부 실시양태에서, 대상체의 간세포에서 발생되는 염기 변경은 생어 시퀀싱에 의해 측정된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법은 (i) 가이드 폴리뉴클레오티드 및 (ii) 염기 에디터 융합 단백질을 코딩하는 핵산을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 염기 에디터 시스템은 가이드 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 염기 에디터 시스템은 가이드 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 핵산을 포함한다.
일부 실시양태에서, 염기 에디터 융합 단백질을 코딩하는 핵산은 mRNA이다. 일부 실시양태에서, mRNA는 투여 후 대상체에서 번역시 염기 에디터 융합 단백질을 생성한다. 일부 실시양태에서, 염기 에디터 융합 단백질은 대상체에서 RNP 복합체를 형성한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법은 가이드 폴리뉴클레오티드 또는 가이드 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 핵산 (i)을 둘러싸는 지질 나노입자(LNP)를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법은 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 핵산 (ii)을 둘러싸는 제2 LNP를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법은 가이드 폴리뉴클레오티드 또는 가이드 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 핵산 (i) 및 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 핵산 (ii)을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, RNP 복합체는 대상체의 간 세포에 의한 LNP 또는 제2 LNP의 흡수 시에 형성된다.
일부 실시양태에서, 가이드 폴리뉴클레오티드 또는 가이드 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 핵산 (i)과 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 핵산 (ii)의 비는 중량 기준으로 약 1:10 내지 약 10:1이다. 일부 실시양태에서, 가이드 폴리뉴클레오티드와 염기 에디터 융합 단백질을 코딩하는 핵산의 비는 중량 기준으로 약 1:1, 1.5:1, 2:1, 3:1, 4:1, 1:1.5, 1:2, 1:3, 또는 1:4이다. 일부 실시양태에서, 가이드 폴리뉴클레오티드와 염기 에디터 융합 단백질을 코딩하는 핵산의 몰비는 약 500:1 내지 약 1:500이다.
일부 실시양태에서, 가이드 폴리뉴클레오티드와 염기 에디터 융합 단백질을 코딩하는 핵산의 비는 중량 기준으로 약 1000:1 내지 약 1:1000이다. 일부 실시양태에서, 가이드 폴리뉴클레오티드와 염기 에디터 융합 단백질을 코딩하는 핵산의 비는 중량 기준으로 약 1000:1, 950:1, 900:1, 850:1, 800:1, 750:1, 700:1, 650:1, 600:1, 550:1, 500:1, 450:1, 400:1, 350:1, 300:1, 250:1, 200:1, 100:1, 95:1, 90:1, 85:1, 80:1, 75:1, 70:1, 65:1, 60:1, 55:1, 50:1, 45:1, 40:1, 35:1, 30:1, 25:1, 20:1, 19:1, 18:1, 17:1, 17:1, 15:1, 14:1, 13:1, 12:1, 11:1, 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2;1, 1.9:1, 1.8:1, 1.7:1, 1.6:1, 1.5:1, 1.4:1, 1.3:1, 1.2:1, 1.1:1, 1.0:1, 0.9:1, 0.8:1, 0.7:1, 0.6:1, 0.5:1, 0.4:1, 0.3:1, 0.2:1, 또는 0.1이다. 일부 실시양태에서, 가이드 폴리뉴클레오티드와 염기 에디터 융합 단백질을 코딩하는 핵산의 비는 중량 기준으로 약 1:0.1, 1:0.2, 1:0.3, 1:0.4, 1:0.5, 1:0.6, 1:0.7, 1:0.8, 1:0.9, 1:1.0, 1:1.1, 1:1.2, 1:1.3, 1:1.4, 1:1.5, 1:1.6, 1:1.7, 1:1.8, 1:1.9, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1:19, 1:20, 1:25, 1:30, 1:35, 1:40, 1:45, 1:50, 1:55, 1:60, 1:65, 1:70, 1:75, 1:80, 1:85, 1:90, 1:95, 1:100, 1:150, 1:200, 1:250, 1:300, 1:350, 1:400, 1:450, 1:500, 1:550, 1:600, 1:650, 1:700, 1:750, 1:800, 1:850, 1:900, 1:950, 또는 1:1000이다. 일부 실시양태에서, 가이드 폴리뉴클레오티드와 염기 에디터 융합 단백질을 코딩하는 핵산의 비는 중량 기준으로 적어도 약 1000:1, 950:1, 900:1, 850:1, 800:1, 750:1, 700:1, 650:1, 600:1, 550:1, 500:1, 450:1, 400:1, 350:1, 300:1, 250:1, 200:1, 100:1, 95:1, 90:1, 85:1, 80:1, 75:1, 70:1, 65:1, 60:1, 55:1, 50:1, 45:1, 40:1, 35:1, 30:1, 25:1, 20:1, 19:1, 18:1, 17:1, 17:1, 15:1, 14:1, 13:1, 12:1, 11:1, 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2;1, 1.9:1, 1.8:1, 1.7:1, 1.6:1, 1.5:1, 1.4:1, 1.3:1, 1.2:1, 1.1:1, 1.0:1, 0.9:1, 0.8:1, 0.7:1, 0.6:1, 0.5:1, 0.4:1, 0.3:1, 0.2:1, 또는 0.1이다. 일부 실시양태에서, 가이드 폴리뉴클레오티드와 염기 에디터 융합 단백질을 코딩하는 핵산의 비는 중량 기준으로 적어도 약 1:0.1, 1:0.2, 1:0.3, 1:0.4, 1:0.5, 1:0.6, 1:0.7, 1:0.8, 1:0.9, 1:1.0, 1:1.1, 1:1.2, 1:1.3, 1:1.4, 1:1.5, 1:1.6, 1:1.7, 1:1.8, 1:1.9, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1:19, 1:20, 1:25, 1:30, 1:35, 1:40, 1:45, 1:50, 1:55, 1:60, 1:65, 1:70, 1:75, 1:80, 1:85, 1:90, 1:95, 1:100, 1:150, 1:200, 1:250, 1:300, 1:350, 1:400, 1:450, 1:500, 1:550, 1:600, 1:650, 1:700, 1:750, 1:800, 1:850, 1:900, 1:950, 또는 1:1000이다. 일부 실시양태에서, 가이드 폴리뉴클레오티드와 염기 에디터 융합 단백질을 코딩하는 핵산의 비는 중량 기준으로 최대 약 1000:1, 950:1, 900:1, 850:1, 800:1, 750:1, 700:1, 650:1, 600:1, 550:1, 500:1, 450:1, 400:1, 350:1, 300:1, 250:1, 200:1, 100:1, 95:1, 90:1, 85:1, 80:1, 75:1, 70:1, 65:1, 60:1, 55:1, 50:1, 45:1, 40:1, 35:1, 30:1, 25:1, 20:1, 19:1, 18:1, 17:1, 17:1, 15:1, 14:1, 13:1, 12:1, 11:1, 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2;1, 1.9:1, 1.8:1, 1.7:1, 1.6:1, 1.5:1, 1.4:1, 1.3:1, 1.2:1, 1.1:1, 1.0:1, 0.9:1, 0.8:1, 0.7:1, 0.6:1, 0.5:1, 0.4:1, 0.3:1, 0.2:1, 또는 0.1이다. 일부 실시양태에서, 가이드 폴리뉴클레오티드와 염기 에디터 융합 단백질을 코딩하는 핵산의 비는 중량 기준으로 최대 약 1:0.1, 1:0.2, 1:0.3, 1:0.4, 1:0.5, 1:0.6, 1:0.7, 1:0.8, 1:0.9, 1:1.0, 1:1.1, 1:1.2, 1:1.3, 1:1.4, 1:1.5, 1:1.6, 1:1.7, 1:1.8, 1:1.9, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1:19, 1:20, 1:25, 1:30, 1:35, 1:40, 1:45, 1:50, 1:55, 1:60, 1:65, 1:70, 1:75, 1:80, 1:85, 1:90, 1:95, 1:100, 1:150, 1:200, 1:250, 1:300, 1:350, 1:400, 1:450, 1:500, 1:550, 1:600, 1:650, 1:700, 1:750, 1:800, 1:850, 1:900, 1:950, 또는 1:1000이다.
일부 실시양태에서, 가이드 폴리뉴클레오티드와 염기 에디터 융합 단백질을 코딩하는 핵산의 몰비는 약 10000:1 내지 약 1:10000이다. 일부 실시양태에서, 가이드 폴리뉴클레오티드와 염기 에디터 융합 단백질을 코딩하는 핵산의 몰비는 약 10000:1, 9500:1, 9000:1, 8500:1, 8000:1, 7500:1, 7000:1, 6500:1, 6000:1, 5500:1, 5000:1, 4500:1, 4000:1, 3500:1, 3000:1, 2500:1, 2000:1, 1500:1, 1000:1, 950:1, 900:1, 850:1, 800:1, 750:1, 700:1, 650:1, 600:1, 550:1, 500:1, 450:1, 400:1, 350:1, 300:1, 250:1, 200:1, 190:1, 180:1, 170:1, 160:1, 150:1, 140:1, 130:1, 120:1, 110:1, 100:1, 95:1, 90:1, 85:1, 80:1, 75:1, 70:1, 69:1, 68:1, 67:1, 66:1, 65:1, 64:1, 63:1, 62:1, 61:1, 60:1, 59:1, 58:1, 57:1, 56:1, 55:1, 54:1, 53:1, 52:1, 51:1, 50:1, 49:1, 48:1, 47:1, 46:1, 45:1, 44:1, 43:1, 42:1, 41:1, 40:1, 39:1, 38:1, 37:1, 36:1, 35:1, 34:1, 33:1, 32:1, 31:1, 30:1, 29:1, 28:1, 27:1, 26:1, 25:1, 24:1, 23:1, 22:1, 21:1, 20:1, 19:1, 18:1, 17:1, 16:1, 15:1, 14:1, 13:1, 12:1, 11:1, 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 0.9:1, 0.8:1, 0.7:1, 0.6:1, 0.5:1, 0.4:1, 0.3:1, 0.2:1, 또는 0.1:1이다. 일부 실시양태에서, 가이드 폴리뉴클레오티드와 염기 에디터 융합 단백질을 코딩하는 핵산의 몰비는 적어도 약 1:10000, 1:9500, 1:9000, 1:8500, 1:8000, 1:7500, 1:7000, 1:6500, 1:6000, 1:5500, 1:5000, 1:4500, 1:4000, 1:3500, 1:3000, 1:2500, 1:2000, 1:1500, 1:1000, 1:950, 1:900, 1:850, 1:800, 1:750, 1:700, 1:650, 1:600, 1:550, 1:500, 1:450, 1:400, 1:350, 1:300, 1:250, 1:200, 1:190, 1:180, 1:170, 1:160, 1:150, 1:140, 1:130, 1:120, 1:110, 1:100, 1:95, 1:90, 1:85, 1:80, 1:75, 1:70, 1:69, 1:68, 1:67, 1:66, 1:65, 1:64, 1:63, 1:62, 1:61, 1:60, 1:59, 1:58, 1:57, 1:56, 1:55, 1:54, 1:53, 1:52, 1:51, 1:50, 1:49, 1:48, 1:47, 1:46, 1:45, 1:44, 1:43, 1:42, 1:41, 1:40, 1:39, 1:38, 1:37, 1:36, 1:35, 1:34, 1:33, 1:32, 1:31, 1:30, 1:29, 1:28, 1:27, 1:26, 1:25, 1:24, 1:23, 1:22, 1:21, 1:20, 1:19, 1:18, 1:17, 1:16, 1:15, 1:14, 1:13, 1:12, 1:11, 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1, 1:0.9, 1:0.8, 1:0.7, 1:0.6, 1:0.5, 1:0.4, 1:0.3, 1:0.2, 또는 1:0.1이다. 일부 실시양태에서, 가이드 폴리뉴클레오티드와 염기 에디터 융합 단백질을 코딩하는 핵산의 몰비는 적어도 약 10000:1, 9500:1, 9000:1, 8500:1, 8000:1, 7500:1, 7000:1, 6500:1, 6000:1, 5500:1, 5000:1, 4500:1, 4000:1, 3500:1, 3000:1, 2500:1, 2000:1, 1500:1, 1000:1, 950:1, 900:1, 850:1, 800:1, 750:1, 700:1, 650:1, 600:1, 550:1, 500:1, 450:1, 400:1, 350:1, 300:1, 250:1, 200:1, 190:1, 180:1, 170:1, 160:1, 150:1, 140:1, 130:1, 120:1, 110:1, 100:1, 95:1, 90:1, 85:1, 80:1, 75:1, 70:1, 69:1, 68:1, 67:1, 66:1, 65:1, 64:1, 63:1, 62:1, 61:1, 60:1, 59:1, 58:1, 57:1, 56:1, 55:1, 54:1, 53:1, 52:1, 51:1, 50:1, 49:1, 48:1, 47:1, 46:1, 45:1, 44:1, 43:1, 42:1, 41:1, 40:1, 39:1, 38:1, 37:1, 36:1, 35:1, 34:1, 33:1, 32:1, 31:1, 30:1, 29:1, 28:1, 27:1, 26:1, 25:1, 24:1, 23:1, 22:1, 21:1, 20:1, 19:1, 18:1, 17:1, 16:1, 15:1, 14:1, 13:1, 12:1, 11:1, 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 0.9:1, 0.8:1, 0.7:1, 0.6:1, 0.5:1, 0.4:1, 0.3:1, 0.2:1, 또는 0.1:1이다. 일부 실시양태에서, 가이드 폴리뉴클레오티드와 염기 에디터 융합 단백질을 코딩하는 핵산의 몰비는 적어도 약 1:10000, 1:9500, 1:9000, 1:8500, 1:8000, 1:7500, 1:7000, 1:6500, 1:6000, 1:5500, 1:5000, 1:4500, 1:4000, 1:3500, 1:3000, 1:2500, 1:2000, 1:1500, 1:1000, 1:950, 1:900, 1:850, 1:800, 1:750, 1:700, 1:650, 1:600, 1:550, 1:500, 1:450, 1:400, 1:350, 1:300, 1:250, 1:200, 1:190, 1:180, 1:170, 1:160, 1:150, 1:140, 1:130, 1:120, 1:110, 1:100, 1:95, 1:90, 1:85, 1:80, 1:75, 1:70, 1:69, 1:68, 1:67, 1:66, 1:65, 1:64, 1:63, 1:62, 1:61, 1:60, 1:59, 1:58, 1:57, 1:56, 1:55, 1:54, 1:53, 1:52, 1:51, 1:50, 1:49, 1:48, 1:47, 1:46, 1:45, 1:44, 1:43, 1:42, 1:41, 1:40, 1:39, 1:38, 1:37, 1:36, 1:35, 1:34, 1:33, 1:32, 1:31, 1:30, 1:29, 1:28, 1:27, 1:26, 1:25, 1:24, 1:23, 1:22, 1:21, 1:20, 1:19, 1:18, 1:17, 1:16, 1:15, 1:14, 1:13, 1:12, 1:11, 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1, 1:0.9, 1:0.8, 1:0.7, 1:0.6, 1:0.5, 1:0.4, 1:0.3, 1:0.2, 또는 1:0.1이다. 일부 실시양태에서, 가이드 폴리뉴클레오티드와 염기 에디터 융합 단백질을 코딩하는 핵산의 몰비는 최대 약 10000:1, 9500:1, 9000:1, 8500:1, 8000:1, 7500:1, 7000:1, 6500:1, 6000:1, 5500:1, 5000:1, 4500:1, 4000:1, 3500:1, 3000:1, 2500:1, 2000:1, 1500:1, 1000:1, 950:1, 900:1, 850:1, 800:1, 750:1, 700:1, 650:1, 600:1, 550:1, 500:1, 450:1, 400:1, 350:1, 300:1, 250:1, 200:1, 190:1, 180:1, 170:1, 160:1, 150:1, 140:1, 130:1, 120:1, 110:1, 100:1, 95:1, 90:1, 85:1, 80:1, 75:1, 70:1, 69:1, 68:1, 67:1, 66:1, 65:1, 64:1, 63:1, 62:1, 61:1, 60:1, 59:1, 58:1, 57:1, 56:1, 55:1, 54:1, 53:1, 52:1, 51:1, 50:1, 49:1, 48:1, 47:1, 46:1, 45:1, 44:1, 43:1, 42:1, 41:1, 40:1, 39:1, 38:1, 37:1, 36:1, 35:1, 34:1, 33:1, 32:1, 31:1, 30:1, 29:1, 28:1, 27:1, 26:1, 25:1, 24:1, 23:1, 22:1, 21:1, 20:1, 19:1, 18:1, 17:1, 16:1, 15:1, 14:1, 13:1, 12:1, 11:1, 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 0.9:1, 0.8:1, 0.7:1, 0.6:1, 0.5:1, 0.4:1, 0.3:1, 0.2:1, 또는 0.1:1이다. 일부 실시양태에서, 가이드 폴리뉴클레오티드와 염기 에디터 융합 단백질을 코딩하는 핵산의 몰비는 최대 약 1:10000, 1:9500, 1:9000, 1:8500, 1:8000, 1:7500, 1:7000, 1:6500, 1:6000, 1:5500, 1:5000, 1:4500, 1:4000, 1:3500, 1:3000, 1:2500, 1:2000, 1:1500, 1:1000, 1:950, 1:900, 1:850, 1:800, 1:750, 1:700, 1:650, 1:600, 1:550, 1:500, 1:450, 1:400, 1:350, 1:300, 1:250, 1:200, 1:190, 1:180, 1:170, 1:160, 1:150, 1:140, 1:130, 1:120, 1:110, 1:100, 1:95, 1:90, 1:85, 1:80, 1:75, 1:70, 1:69, 1:68, 1:67, 1:66, 1:65, 1:64, 1:63, 1:62, 1:61, 1:60, 1:59, 1:58, 1:57, 1:56, 1:55, 1:54, 1:53, 1:52, 1:51, 1:50, 1:49, 1:48, 1:47, 1:46, 1:45, 1:44, 1:43, 1:42, 1:41, 1:40, 1:39, 1:38, 1:37, 1:36, 1:35, 1:34, 1:33, 1:32, 1:31, 1:30, 1:29, 1:28, 1:27, 1:26, 1:25, 1:24, 1:23, 1:22, 1:21, 1:20, 1:19, 1:18, 1:17, 1:16, 1:15, 1:14, 1:13, 1:12, 1:11, 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1, 1:0.9, 1:0.8, 1:0.7, 1:0.6, 1:0.5, 1:0.4, 1:0.3, 1:0.2, 또는 1:0.1이다.
일부 실시양태에서, 가이드 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 핵산과 염기 에디터 융합 단백질을 코딩하는 핵산의 비는 중량 기준으로 약 10:1 내지 약 1:10이다. 일부 실시양태에서, 가이드 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 핵산과 염기 에디터 융합 단백질을 코딩하는 핵산의 비는 중량 기준으로 약 4:1, 3;1, 2:1, 1.5:1, 1:1, 1:1.5, 1:2, 1:3, 또는 1:4이다. 일부 실시양태에서, 가이드 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 핵산과 염기 에디터 융합 단백질을 코딩하는 핵산의 몰비는 약 500:1 내지 약 1:500이다.
일부 실시양태에서, 가이드 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 핵산과 염기 에디터 융합 단백질을 코딩하는 핵산의 비는 중량 기준으로 약 1000:1 내지 약 1:1000이다. 일부 실시양태에서, 가이드 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 핵산과 염기 에디터 융합 단백질을 코딩하는 핵산의 비는 중량 기준으로 약 1000:1, 950:1, 900:1, 850:1, 800:1, 750:1, 700:1, 650:1, 600:1, 550:1, 500:1, 450:1, 400:1, 350:1, 300:1, 250:1, 200:1, 100:1, 95:1, 90:1, 85:1, 80:1, 75:1, 70:1, 65:1, 60:1, 55:1, 50:1, 45:1, 40:1, 35:1, 30:1, 25:1, 20:1, 19:1, 18:1, 17:1, 17:1, 15:1, 14:1, 13:1, 12:1, 11:1, 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2;1, 1.9:1, 1.8:1, 1.7:1, 1.6:1, 1.5:1, 1.4:1, 1.3:1, 1.2:1, 1.1:1, 1.0:1, 0.9:1, 0.8:1, 0.7:1, 0.6:1, 0.5:1, 0.4:1, 0.3:1, 0.2:1, 또는 0.1이다. 일부 실시양태에서, 가이드 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 핵산과 염기 에디터 융합 단백질을 코딩하는 핵산의 비는 중량 기준으로 약 1:0.1, 1:0.2, 1:0.3, 1:0.4, 1:0.5, 1:0.6, 1:0.7, 1:0.8, 1:0.9, 1:1.0, 1:1.1, 1:1.2, 1:1.3, 1:1.4, 1:1.5, 1:1.6, 1:1.7, 1:1.8, 1:1.9, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1:19, 1:20, 1:25, 1:30, 1:35, 1:40, 1:45, 1:50, 1:55, 1:60, 1:65, 1:70, 1:75, 1:80, 1:85, 1:90, 1:95, 1:100, 1:150, 1:200, 1:250, 1:300, 1:350, 1:400, 1:450, 1:500, 1:550, 1:600, 1:650, 1:700, 1:750, 1:800, 1:850, 1:900, 1:950, 또는 1:1000이다. 일부 실시양태에서, 가이드 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 핵산과 염기 에디터 융합 단백질을 코딩하는 핵산의 비는 중량 기준으로 적어도 약 1000:1, 950:1, 900:1, 850:1, 800:1, 750:1, 700:1, 650:1, 600:1, 550:1, 500:1, 450:1, 400:1, 350:1, 300:1, 250:1, 200:1, 100:1, 95:1, 90:1, 85:1, 80:1, 75:1, 70:1, 65:1, 60:1, 55:1, 50:1, 45:1, 40:1, 35:1, 30:1, 25:1, 20:1, 19:1, 18:1, 17:1, 17:1, 15:1, 14:1, 13:1, 12:1, 11:1, 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2;1, 1.9:1, 1.8:1, 1.7:1, 1.6:1, 1.5:1, 1.4:1, 1.3:1, 1.2:1, 1.1:1, 1.0:1, 0.9:1, 0.8:1, 0.7:1, 0.6:1, 0.5:1, 0.4:1, 0.3:1, 0.2:1, 또는 0.1이다. 일부 실시양태에서, 가이드 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 핵산과 염기 에디터 융합 단백질을 코딩하는 핵산의 비는 중량 기준으로 적어도 약 1:0.1, 1:0.2, 1:0.3, 1:0.4, 1:0.5, 1:0.6, 1:0.7, 1:0.8, 1:0.9, 1:1.0, 1:1.1, 1:1.2, 1:1.3, 1:1.4, 1:1.5, 1:1.6, 1:1.7, 1:1.8, 1:1.9, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1:19, 1:20, 1:25, 1:30, 1:35, 1:40, 1:45, 1:50, 1:55, 1:60, 1:65, 1:70, 1:75, 1:80, 1:85, 1:90, 1:95, 1:100, 1:150, 1:200, 1:250, 1:300, 1:350, 1:400, 1:450, 1:500, 1:550, 1:600, 1:650, 1:700, 1:750, 1:800, 1:850, 1:900, 1:950, 또는 1:1000이다. 일부 실시양태에서, 가이드 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 핵산과 염기 에디터 융합 단백질을 코딩하는 핵산의 비는 중량 기준으로 최대 약 1000:1, 950:1, 900:1, 850:1, 800:1, 750:1, 700:1, 650:1, 600:1, 550:1, 500:1, 450:1, 400:1, 350:1, 300:1, 250:1, 200:1, 100:1, 95:1, 90:1, 85:1, 80:1, 75:1, 70:1, 65:1, 60:1, 55:1, 50:1, 45:1, 40:1, 35:1, 30:1, 25:1, 20:1, 19:1, 18:1, 17:1, 17:1, 15:1, 14:1, 13:1, 12:1, 11:1, 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2;1, 1.9:1, 1.8:1, 1.7:1, 1.6:1, 1.5:1, 1.4:1, 1.3:1, 1.2:1, 1.1:1, 1.0:1, 0.9:1, 0.8:1, 0.7:1, 0.6:1, 0.5:1, 0.4:1, 0.3:1, 0.2:1, 또는 0.1이다. 일부 실시양태에서, 가이드 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 핵산과 염기 에디터 융합 단백질을 코딩하는 핵산의 비는 중량 기준으로 최대 약 1:0.1, 1:0.2, 1:0.3, 1:0.4, 1:0.5, 1:0.6, 1:0.7, 1:0.8, 1:0.9, 1:1.0, 1:1.1, 1:1.2, 1:1.3, 1:1.4, 1:1.5, 1:1.6, 1:1.7, 1:1.8, 1:1.9, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1:19, 1:20, 1:25, 1:30, 1:35, 1:40, 1:45, 1:50, 1:55, 1:60, 1:65, 1:70, 1:75, 1:80, 1:85, 1:90, 1:95, 1:100, 1:150, 1:200, 1:250, 1:300, 1:350, 1:400, 1:450, 1:500, 1:550, 1:600, 1:650, 1:700, 1:750, 1:800, 1:850, 1:900, 1:950, 또는 1:1000이다.
일부 실시양태에서, 가이드 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 핵산과 염기 에디터 융합 단백질을 코딩하는 핵산의 몰비는 약 10000:1 내지 약 1:10000이다. 일부 실시양태에서, 가이드 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 핵산과 염기 에디터 융합 단백질을 코딩하는 핵산의 몰비는 약 10000:1, 9500:1, 9000:1, 8500:1, 8000:1, 7500:1, 7000:1, 6500:1, 6000:1, 5500:1, 5000:1, 4500:1, 4000:1, 3500:1, 3000:1, 2500:1, 2000:1, 1500:1, 1000:1, 950:1, 900:1, 850:1, 800:1, 750:1, 700:1, 650:1, 600:1, 550:1, 500:1, 450:1, 400:1, 350:1, 300:1, 250:1, 200:1, 190:1, 180:1, 170:1, 160:1, 150:1, 140:1, 130:1, 120:1, 110:1, 100:1, 95:1, 90:1, 85:1, 80:1, 75:1, 70:1, 69:1, 68:1, 67:1, 66:1, 65:1, 64:1, 63:1, 62:1, 61:1, 60:1, 59:1, 58:1, 57:1, 56:1, 55:1, 54:1, 53:1, 52:1, 51:1, 50:1, 49:1, 48:1, 47:1, 46:1, 45:1, 44:1, 43:1, 42:1, 41:1, 40:1, 39:1, 38:1, 37:1, 36:1, 35:1, 34:1, 33:1, 32:1, 31:1, 30:1, 29:1, 28:1, 27:1, 26:1, 25:1, 24:1, 23:1, 22:1, 21:1, 20:1, 19:1, 18:1, 17:1, 16:1, 15:1, 14:1, 13:1, 12:1, 11:1, 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 0.9:1, 0.8:1, 0.7:1, 0.6:1, 0.5:1, 0.4:1, 0.3:1, 0.2:1, 또는 0.1:1이다. 일부 실시양태에서, 가이드 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 핵산과 염기 에디터 융합 단백질을 코딩하는 핵산의 몰비는 적어도 약 1:10000, 1:9500, 1:9000, 1:8500, 1:8000, 1:7500, 1:7000, 1:6500, 1:6000, 1:5500, 1:5000, 1:4500, 1:4000, 1:3500, 1:3000, 1:2500, 1:2000, 1:1500, 1:1000, 1:950, 1:900, 1:850, 1:800, 1:750, 1:700, 1:650, 1:600, 1:550, 1:500, 1:450, 1:400, 1:350, 1:300, 1:250, 1:200, 1:190, 1:180, 1:170, 1:160, 1:150, 1:140, 1:130, 1:120, 1:110, 1:100, 1:95, 1:90, 1:85, 1:80, 1:75, 1:70, 1:69, 1:68, 1:67, 1:66, 1:65, 1:64, 1:63, 1:62, 1:61, 1:60, 1:59, 1:58, 1:57, 1:56, 1:55, 1:54, 1:53, 1:52, 1:51, 1:50, 1:49, 1:48, 1:47, 1:46, 1:45, 1:44, 1:43, 1:42, 1:41, 1:40, 1:39, 1:38, 1:37, 1:36, 1:35, 1:34, 1:33, 1:32, 1:31, 1:30, 1:29, 1:28, 1:27, 1:26, 1:25, 1:24, 1:23, 1:22, 1:21, 1:20, 1:19, 1:18, 1:17, 1:16, 1:15, 1:14, 1:13, 1:12, 1:11, 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1, 1:0.9, 1:0.8, 1:0.7, 1:0.6, 1:0.5, 1:0.4, 1:0.3, 1:0.2, 또는 1:0.1이다. 일부 실시양태에서, 가이드 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 핵산과 염기 에디터 융합 단백질을 코딩하는 핵산의 몰비는 적어도 약 10000:1, 9500:1, 9000:1, 8500:1, 8000:1, 7500:1, 7000:1, 6500:1, 6000:1, 5500:1, 5000:1, 4500:1, 4000:1, 3500:1, 3000:1, 2500:1, 2000:1, 1500:1, 1000:1, 950:1, 900:1, 850:1, 800:1, 750:1, 700:1, 650:1, 600:1, 550:1, 500:1, 450:1, 400:1, 350:1, 300:1, 250:1, 200:1, 190:1, 180:1, 170:1, 160:1, 150:1, 140:1, 130:1, 120:1, 110:1, 100:1, 95:1, 90:1, 85:1, 80:1, 75:1, 70:1, 69:1, 68:1, 67:1, 66:1, 65:1, 64:1, 63:1, 62:1, 61:1, 60:1, 59:1, 58:1, 57:1, 56:1, 55:1, 54:1, 53:1, 52:1, 51:1, 50:1, 49:1, 48:1, 47:1, 46:1, 45:1, 44:1, 43:1, 42:1, 41:1, 40:1, 39:1, 38:1, 37:1, 36:1, 35:1, 34:1, 33:1, 32:1, 31:1, 30:1, 29:1, 28:1, 27:1, 26:1, 25:1, 24:1, 23:1, 22:1, 21:1, 20:1, 19:1, 18:1, 17:1, 16:1, 15:1, 14:1, 13:1, 12:1, 11:1, 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 0.9:1, 0.8:1, 0.7:1, 0.6:1, 0.5:1, 0.4:1, 0.3:1, 0.2:1, 또는 0.1:1이다. 일부 실시양태에서, 가이드 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 핵산과 염기 에디터 융합 단백질을 코딩하는 핵산의 몰비는 적어도 약 1:10000, 1:9500, 1:9000, 1:8500, 1:8000, 1:7500, 1:7000, 1:6500, 1:6000, 1:5500, 1:5000, 1:4500, 1:4000, 1:3500, 1:3000, 1:2500, 1:2000, 1:1500, 1:1000, 1:950, 1:900, 1:850, 1:800, 1:750, 1:700, 1:650, 1:600, 1:550, 1:500, 1:450, 1:400, 1:350, 1:300, 1:250, 1:200, 1:190, 1:180, 1:170, 1:160, 1:150, 1:140, 1:130, 1:120, 1:110, 1:100, 1:95, 1:90, 1:85, 1:80, 1:75, 1:70, 1:69, 1:68, 1:67, 1:66, 1:65, 1:64, 1:63, 1:62, 1:61, 1:60, 1:59, 1:58, 1:57, 1:56, 1:55, 1:54, 1:53, 1:52, 1:51, 1:50, 1:49, 1:48, 1:47, 1:46, 1:45, 1:44, 1:43, 1:42, 1:41, 1:40, 1:39, 1:38, 1:37, 1:36, 1:35, 1:34, 1:33, 1:32, 1:31, 1:30, 1:29, 1:28, 1:27, 1:26, 1:25, 1:24, 1:23, 1:22, 1:21, 1:20, 1:19, 1:18, 1:17, 1:16, 1:15, 1:14, 1:13, 1:12, 1:11, 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1, 1:0.9, 1:0.8, 1:0.7, 1:0.6, 1:0.5, 1:0.4, 1:0.3, 1:0.2, 또는 1:0.1이다. 일부 실시양태에서, 가이드 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 핵산과 염기 에디터 융합 단백질을 코딩하는 핵산의 몰비는 최대 약 10000:1, 9500:1, 9000:1, 8500:1, 8000:1, 7500:1, 7000:1, 6500:1, 6000:1, 5500:1, 5000:1, 4500:1, 4000:1, 3500:1, 3000:1, 2500:1, 2000:1, 1500:1, 1000:1, 950:1, 900:1, 850:1, 800:1, 750:1, 700:1, 650:1, 600:1, 550:1, 500:1, 450:1, 400:1, 350:1, 300:1, 250:1, 200:1, 190:1, 180:1, 170:1, 160:1, 150:1, 140:1, 130:1, 120:1, 110:1, 100:1, 95:1, 90:1, 85:1, 80:1, 75:1, 70:1, 69:1, 68:1, 67:1, 66:1, 65:1, 64:1, 63:1, 62:1, 61:1, 60:1, 59:1, 58:1, 57:1, 56:1, 55:1, 54:1, 53:1, 52:1, 51:1, 50:1, 49:1, 48:1, 47:1, 46:1, 45:1, 44:1, 43:1, 42:1, 41:1, 40:1, 39:1, 38:1, 37:1, 36:1, 35:1, 34:1, 33:1, 32:1, 31:1, 30:1, 29:1, 28:1, 27:1, 26:1, 25:1, 24:1, 23:1, 22:1, 21:1, 20:1, 19:1, 18:1, 17:1, 16:1, 15:1, 14:1, 13:1, 12:1, 11:1, 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 0.9:1, 0.8:1, 0.7:1, 0.6:1, 0.5:1, 0.4:1, 0.3:1, 0.2:1, 또는 0.1:1이다. 일부 실시양태에서, 가이드 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 핵산과 염기 에디터 융합 단백질을 코딩하는 핵산의 몰비는 최대 약 1:10000, 1:9500, 1:9000, 1:8500, 1:8000, 1:7500, 1:7000, 1:6500, 1:6000, 1:5500, 1:5000, 1:4500, 1:4000, 1:3500, 1:3000, 1:2500, 1:2000, 1:1500, 1:1000, 1:950, 1:900, 1:850, 1:800, 1:750, 1:700, 1:650, 1:600, 1:550, 1:500, 1:450, 1:400, 1:350, 1:300, 1:250, 1:200, 1:190, 1:180, 1:170, 1:160, 1:150, 1:140, 1:130, 1:120, 1:110, 1:100, 1:95, 1:90, 1:85, 1:80, 1:75, 1:70, 1:69, 1:68, 1:67, 1:66, 1:65, 1:64, 1:63, 1:62, 1:61, 1:60, 1:59, 1:58, 1:57, 1:56, 1:55, 1:54, 1:53, 1:52, 1:51, 1:50, 1:49, 1:48, 1:47, 1:46, 1:45, 1:44, 1:43, 1:42, 1:41, 1:40, 1:39, 1:38, 1:37, 1:36, 1:35, 1:34, 1:33, 1:32, 1:31, 1:30, 1:29, 1:28, 1:27, 1:26, 1:25, 1:24, 1:23, 1:22, 1:21, 1:20, 1:19, 1:18, 1:17, 1:16, 1:15, 1:14, 1:13, 1:12, 1:11, 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1, 1:0.9, 1:0.8, 1:0.7, 1:0.6, 1:0.5, 1:0.4, 1:0.3, 1:0.2, 또는 1:0.1이다.
일부 실시양태에서, 핵염기 변경은 ELISA, 웨스턴 블롯, 또는 LC-MS/MS에 의해 측정되는 경우 투여 전과 비교하여 대상체의 혈중 PCSK9 단백질 수준에서 적어도 35% 감소를 초래한다.
일부 실시양태에서, 핵염기 변경은 ELISA, 웨스턴 블롯, 또는 LC-MS/MS에 의해 측정되는 경우 투여 전과 비교하여 대상체의 혈중 PCSK9 단백질 수준에서 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 또는 99%의 감소를 초래한다.
일부 실시양태에서, 핵염기 변경은 ELISA, 웨스턴 블롯, 또는 LC-MS/MS에 의해 측정되는 경우 투여 전과 비교하여 대상체의 혈중 PCSK9 단백질 수준에서 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99.3%, 99.5%, 99.7%, 99.8%, 또는 99.9%의 감소를 초래한다. 일부 실시양태에서, 핵염기 변경은 ELISA, 웨스턴 블롯, 또는 LC-MS/MS에 의해 측정되는 경우 투여 전과 비교하여 대상체의 혈중 PCSK9 단백질 수준에서 최대 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99.3%, 99.5%, 99.7%, 99.8%, 또는 99.9%의 감소를 초래한다. 일부 실시양태에서, 핵염기 변경은 ELISA, 웨스턴 블롯, 또는 LC-MS/MS에 의해 측정되는 경우 투여 전과 비교하여 대상체의 혈중 PCSK9 단백질 수준에서 1%-99.9%, 2%-99.9%, 3%-99.9%, 4%-99.9%, 5%-99.9%, 6%-99.9%, 7%-99.9%, 8%-99.9%, 9%-99.9%, 10%-99.9%, 15%-99.9%, 20%-99.9%, 25%-99.9%, 30%-99.9%, 31%-99.9%, 32%-99.9%, 33%-99.9%, 34%-99.9%, 35%-99.9%, 36%-99.9%, 37%-99.9%, 38%-99.9%, 39%-99.9%, 40%-99.9%, 45%-99.9%, 50%-99.9%, 55%-99.9%, 60%-99.9%, 65%-99.9%, 70%-99.9%, 75%-99.9%, 80%-99.9%, 85%-99.9%, 90%-99.9%, 또는 95-99.9%의 감소를 초래한다. 일부 실시양태에서, 핵염기 변경은 ELISA, 웨스턴 블롯, 또는 LC-MS/MS에 의해 측정되는 경우 투여 전과 비교하여 대상체의 혈중 PCSK9 단백질 수준에서 1%-99.5%, 1%-99%, 1%-98%, 1%-97%, 1%-96%, 1%-95%, 1%-90%, 1%-85%, 1%-80%, 1%-79%, 1%-78%, 1%-77%, 1%-76%, 1%-75%, 1%-74%, 1%-73%, 1%-72%, 1%-71%, 1%-70%, 1%-65%, 1%-60%, 1%-55%, 1%-50%, 1%-45%, 1%-40%, 1%-39%, 1%-38%, 1%-37%, 1%-36%, 1%-35%, 1%-34%, 1%-33%, 1%-32%, 1%-31%, 1%-30%, 1%-25%, 1%-20%, 1%-15%, 1%-10%, 1%-9%, 1%-8%, 1%-7%, 1%-6%, 1%-5%, 1%-4%, 1%-3%, 또는 1%-2%의 감소를 초래한다. 일부 실시양태에서, 핵염기 변경은 ELISA, 웨스턴 블롯, 또는 LC-MS/MS에 의해 측정되는 경우 투여 전과 비교하여 대상체의 혈중 PCSK9 단백질 수준에서 1%-99.9%, 5%-99.5%, 10%-99%, 15%-97%, 20%-95%, 25%-90%, 30%-85%, 31%-80%, 32%-79%, 33%-78%, 34%-77%, 35%-76%, 36%-76%, 37%-75%, 38%-74%, 39%-73%, 40%-72%, 45%-71%, 50%-70%, 또는 55%-65%의 감소를 초래한다. 일부 실시양태에서, 핵염기 변경은 ELISA, 웨스턴 블롯, 또는 LC-MS/MS에 의해 측정되는 경우 투여 전과 비교하여 대상체의 혈중 PCSK9 단백질 수준에서 100%의 감소를 초래한다.
일부 실시양태에서, 핵염기 변경은 ELISA, 웨스턴 블롯, 또는 LC-MS/MS에 의해 측정되는 경우 투여 전과 비교하여 대상체에서 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 75%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 210%, 220%, 230%, 240%, 250%, 260%, 270%, 280%, 290%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900%, 1000% 적은 혈중 PCSK9 단백질 수준을 초래한다. 일부 실시양태에서, 핵염기 변경은 ELISA, 웨스턴 블롯, 또는 LC-MS/MS에 의해 측정되는 경우 투여 전과 비교하여 대상체에서 적어도 1.1배, 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 1.6배, 1.7배, 1.8배, 1.9배, 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 또는 10배 이상 적은 혈중 PCSK9 단백질 수준을 초래한다.
일부 실시양태에서, 투여 전과 비교하여 대상체에서 혈중 PCSK9 단백질 수준의 감소 또는 혈중 PCSK9 단백질 수준은 ELISA(효소 결합 면역흡착 분석)에 의해 측정된다. 일부 실시양태에서, 투여 전과 비교하여 대상체에서 혈중 PCSK9 단백질 수준의 감소 또는 혈중 PCSK9 단백질 수준은 웨스턴 블롯 분석에 의해 측정된다. 일부 실시양태에서, 투여 전과 비교하여 대상체에서 혈중 PCSK9 단백질 수준의 감소 또는 혈중 PCSK9 단백질 수준은 LC-MS/MS(액체 크로마토그래피-직렬 질량 분석법)에 의해 측정된다.
일부 실시양태에서, 핵염기 변경은 ELISA, 웨스턴 블롯, 또는 LC-MS/MS에 의해 측정되는 경우 투여 전과 비교하여 대상체의 혈중 ANGPTL3 단백질 수준에서 적어도 35% 감소를 초래한다.
일부 실시양태에서, 핵염기 변경은 ELISA, 웨스턴 블롯, 또는 LC-MS/MS에 의해 측정되는 경우 투여 전과 비교하여 대상체의 혈중 ANGPTL3 단백질 수준에서 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 또는 99%의 감소를 초래한다.
일부 실시양태에서, 핵염기 변경은 ELISA, 웨스턴 블롯, 또는 LC-MS/MS에 의해 측정되는 경우 투여 전과 비교하여 대상체의 혈중 ANGPTL3 단백질 수준에서 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99.3%, 99.5%, 99.7%, 99.8%, 또는 99.9%의 감소를 초래한다. 일부 실시양태에서, 핵염기 변경은 ELISA, 웨스턴 블롯, 또는 LC-MS/MS에 의해 측정되는 경우 투여 전과 비교하여 대상체의 혈중 ANGPTL3 단백질 수준에서 최대 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99.3%, 99.5%, 99.7%, 99.8%, 또는 99.9%의 감소를 초래한다. 일부 실시양태에서, 핵염기 변경은 ELISA, 웨스턴 블롯, 또는 LC-MS/MS에 의해 측정되는 경우 투여 전과 비교하여 대상체의 혈중 ANGPTL3 단백질 수준에서 1%-99.9%, 2%-99.9%, 3%-99.9%, 4%-99.9%, 5%-99.9%, 6%-99.9%, 7%-99.9%, 8%-99.9%, 9%-99.9%, 10%-99.9%, 15%-99.9%, 20%-99.9%, 25%-99.9%, 30%-99.9%, 31%-99.9%, 32%-99.9%, 33%-99.9%, 34%-99.9%, 35%-99.9%, 36%-99.9%, 37%-99.9%, 38%-99.9%, 39%-99.9%, 40%-99.9%, 45%-99.9%, 50%-99.9%, 55%-99.9%, 60%-99.9%, 65%-99.9%, 70%-99.9%, 75%-99.9%, 80%-99.9%, 85%-99.9%, 90%-99.9%, 또는 95-99.9%의 감소를 초래한다. 일부 실시양태에서, 핵염기 변경은 ELISA, 웨스턴 블롯, 또는 LC-MS/MS에 의해 측정되는 경우 투여 전과 비교하여 대상체의 혈중 ANGPTL3 단백질 수준에서 1%-99.5%, 1%-99%, 1%-98%, 1%-97%, 1%-96%, 1%-95%, 1%-90%, 1%-85%, 1%-80%, 1%-79%, 1%-78%, 1%-77%, 1%-76%, 1%-75%, 1%-74%, 1%-73%, 1%-72%, 1%-71%, 1%-70%, 1%-65%, 1%-60%, 1%-55%, 1%-50%, 1%-45%, 1%-40%, 1%-39%, 1%-38%, 1%-37%, 1%-36%, 1%-35%, 1%-34%, 1%-33%, 1%-32%, 1%-31%, 1%-30%, 1%-25%, 1%-20%, 1%-15%, 1%-10%, 1%-9%, 1%-8%, 1%-7%, 1%-6%, 1%-5%, 1%-4%, 1%-3%, 또는 1%-2%의 감소를 초래한다. 일부 실시양태에서, 핵염기 변경은 ELISA, 웨스턴 블롯, 또는 LC-MS/MS에 의해 측정되는 경우 투여 전과 비교하여 대상체의 혈중 ANGPTL3 단백질 수준에서 1%-99.9%, 5%-99.5%, 10%-99%, 15%-97%, 20%-95%, 25%-90%, 30%-85%, 31%-80%, 32%-79%, 33%-78%, 34%-77%, 35%-76%, 36%-76%, 37%-75%, 38%-74%, 39%-73%, 40%-72%, 45%-71%, 50%-70%, 또는 55%-65%의 감소를 초래한다. 일부 실시양태에서, 핵염기 변경은 ELISA, 웨스턴 블롯, 또는 LC-MS/MS에 의해 측정되는 경우 투여 전과 비교하여 대상체의 혈중 ANGPTL3 단백질 수준에서 100%의 감소를 초래한다.
일부 실시양태에서, 핵염기 변경은 ELISA, 웨스턴 블롯, 또는 LC-MS/MS에 의해 측정되는 경우 투여 전과 비교하여 대상체에서 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 75%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 210%, 220%, 230%, 240%, 250%, 260%, 270%, 280%, 290%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900%, 1000% 적은 혈중 ANGPTL3 단백질 수준을 초래한다. 일부 실시양태에서, 핵염기 변경은 ELISA, 웨스턴 블롯, 또는 LC-MS/MS에 의해 측정되는 경우 투여 전과 비교하여 대상체에서 적어도 1.1배, 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 1.6배, 1.7배, 1.8배, 1.9배, 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 또는 10배 이상 적은 혈중 ANGPTL3 단백질 수준을 초래한다.
일부 실시양태에서, 투여 전과 비교하여 대상체에서 혈중 ANGPTL3 단백질 수준의 감소 또는 혈중 ANGPTL3 단백질 수준은 ELISA(효소 결합 면역흡착 분석)에 의해 측정된다. 일부 실시양태에서, 투여 전과 비교하여 대상체에서 혈중 ANGPTL3 단백질 수준의 감소 또는 혈중 ANGPTL3 단백질 수준은 웨스턴 블롯 분석에 의해 측정된다. 일부 실시양태에서, 투여 전과 비교하여 대상체에서 혈중 ANGPTL3 단백질 수준의 감소 또는 혈중 ANGPTL3 단백질 수준은 LC-MS/MS(액체 크로마토그래피-직렬 질량 분석법)에 의해 측정된다.
일부 실시양태에서, 핵염기 변경은 투여 전과 비교하여 대상체의 혈중 저밀도 지단백질 콜레스테롤(LDL-C) 수준에서 적어도 35%의 감소를 초래한다.
일부 실시양태에서, 핵염기 변경은 투여 전과 비교하여 대상체의 혈중 저밀도 지단백질 콜레스테롤(LDL-C) 수준에서 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 또는 99%의 감소를 초래한다. 일부 실시양태에서, 핵염기 변경은 투여 전과 비교하여 대상체의 혈중 저밀도 지단백질 콜레스테롤(LDL-C) 수준에서 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99.3%, 99.5%, 99.7%, 99.8%, 또는 99.9%의 감소를 초래한다. 일부 실시양태에서, 핵염기 변경은 투여 전과 비교하여 대상체의 혈중 저밀도 지단백질 콜레스테롤(LDL-C) 수준에서 최대 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99.3%, 99.5%, 99.7%, 99.8%, 또는 99.9%의 감소를 초래한다. 일부 실시양태에서, 핵염기 변경은 투여 전과 비교하여 대상체의 혈중 저밀도 지단백질 콜레스테롤(LDL-C) 수준에서 1%-99.9%, 2%-99.9%, 3%-99.9%, 4%-99.9%, 5%-99.9%, 6%-99.9%, 7%-99.9%, 8%-99.9%, 9%-99.9%, 10%-99.9%, 15%-99.9%, 20%-99.9%, 25%-99.9%, 30%-99.9%, 35%-99.9%, 40%-99.9%, 45%-99.9%, 50%-99.9%, 55%-99.9%, 60%-99.9%, 65%-99.9%, 70%-99.9%, 75%-99.9%, 80%-99.9%, 85%-99.9%, 90%-99.9%, 또는 95-99.9%의 감소를 초래한다. 일부 실시양태에서, 핵염기 변경은 투여 전과 비교하여 대상체의 혈중 저밀도 지단백질 콜레스테롤(LDL-C) 수준에서 1%-99.5%, 1%-99%, 1%-98%, 1%-97%, 1%-96%, 1%-95%, 1%-90%, 1%-85%, 1%-80%, 1%-75%, 1%-70%, 1%-65%, 1%-60%, 1%-55%, 1%-50%, 1%-45%, 1%-40%, 1%-35%, 1%-30%, 1%-25%, 1%-20%, 1%-15%, 1%-10%, 1%-9%, 1%-8%, 1%-7%, 1%-6%, 1%-5%, 1%-4%, 1%-3%, 또는 1%-2%의 감소를 초래한다. 일부 실시양태에서, 핵염기 변경은 투여 전과 비교하여 대상체의 혈중 저밀도 지단백질 콜레스테롤(LDL-C) 수준에서 1%-99.9%, 5%-99.5%, 10%-99%, 15%-97%, 20%-95%, 25%-90%, 30%-85%, 35%-80%, 40%-75%, 45%-70%, 50%-65%, 또는 55%-60%의 감소를 초래한다. 일부 실시양태에서, 핵염기 변경은 투여 전과 비교하여 대상체의 혈중 저밀도 지단백질 콜레스테롤(LDL-C) 수준에서 100%의 감소를 초래한다. 일부 실시양태에서, 핵염기 변경은 투여 전과 비교하여 대상체에서 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 75%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 210%, 220%, 230%, 240%, 250%, 260%, 270%, 280%, 290%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900%, 1000% 적은 혈중 저밀도 지단백질 콜레스테롤(LDL-C) 수준을 초래한다. 일부 실시양태에서, 핵염기 변경은 투여 전과 비교하여 대상체에서 적어도 1.1배, 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 1.6배, 1.7배, 1.8배, 1.9배, 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 또는 10배 이상 적은 혈중 저밀도 지단백질 콜레스테롤(LDL-C) 수준을 초래한다.
일부 실시양태에서, 핵염기 변경은 투여 전과 비교하여 대상체의 혈중 트리글리세리드 수준에서 적어도 35%의 감소를 초래한다.
일부 실시양태에서, 핵염기 변경은 투여 전과 비교하여 대상체의 혈중 트리글리세리드 수준에서 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 또는 99%의 감소를 초래한다, 일부 실시양태에서, 핵염기 변경은 투여 전과 비교하여 대상체의 혈중 트리글리세리드 수준에서 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99.3%, 99.5%, 99.7%, 99.8%, 또는 99.9%의 감소를 초래한다. 일부 실시양태에서, 핵염기 변경은 투여 전과 비교하여 대상체의 혈중 트리글리세리드 수준에서 최대 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99.3%, 99.5%, 99.7%, 99.8%, 또는 99.9%의 감소를 초래한다. 일부 실시양태에서, 핵염기 변경은 투여 전과 비교하여 대상체의 혈중 트리글리세리드 수준에서 1%-99.9%, 2%-99.9%, 3%-99.9%, 4%-99.9%, 5%-99.9%, 6%-99.9%, 7%-99.9%, 8%-99.9%, 9%-99.9%, 10%-99.9%, 15%-99.9%, 20%-99.9%, 25%-99.9%, 30%-99.9%, 35%-99.9%, 40%-99.9%, 45%-99.9%, 50%-99.9%, 55%-99.9%, 60%-99.9%, 65%-99.9%, 70%-99.9%, 75%-99.9%, 80%-99.9%, 85%-99.9%, 90%-99.9%, 또는 95-99.9%의 감소를 초래한다. 일부 실시양태에서, 핵염기 변경은 투여 전과 비교하여 대상체의 혈중 트리글리세리드 수준에서 1%-99.5%, 1%-99%, 1%-98%, 1%-97%, 1%-96%, 1%-95%, 1%-90%, 1%-85%, 1%-80%, 1%-75%, 1%-70%, 1%-65%, 1%-60%, 1%-55%, 1%-50%, 1%-45%, 1%-40%, 1%-35%, 1%-30%, 1%-25%, 1%-20%, 1%-15%, 1%-10%, 1%-9%, 1%-8%, 1%-7%, 1%-6%, 1%-5%, 1%-4%, 1%-3%, 또는 1%-2%의 감소를 초래한다. 일부 실시양태에서, 핵염기 변경은 투여 전과 비교하여 대상체의 혈중 트리글리세리드 수준에서 1%-99.9%, 5%-99.5%, 10%-99%, 15%-97%, 20%-95%, 25%-90%, 30%-85%, 35%-80%, 40%-75%, 45%-70%, 50%-65%, 또는 55%-60%의 감소를 초래한다. 일부 실시양태에서, 핵염기 변경은 투여 전과 비교하여 대상체의 혈중 트리글리세리드 수준에서 100%의 감소를 초래한다. 일부 실시양태에서, 핵염기 변경은 투여 전과 비교하여 대상체에서 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 75%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 210%, 220%, 230%, 240%, 250%, 260%, 270%, 280%, 290%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900%, 1000% 적은 혈중 트리글리세리드 수준을 초래한다. 일부 실시양태에서, 핵염기 변경은 투여 전과 비교하여 대상체에서 적어도 1.1배, 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 1.6배, 1.7배, 1.8배, 1.9배, 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 또는 10배 이상 적은 혈중 트리글리세리드 수준을 초래한다.
일부 실시양태에서, 투여 전과 비교하여 대상체에서 혈중 트리글리세리드 수준 또는 혈중 트리글리세리드 수준의 감소는 임의의 표준 기술에 의해 측정된다. 일부 실시양태에서, 투여 전과 비교하여 대상체에서 혈중 저밀도 지단백 콜레스테롤(LDL-C) 수준 또는 혈액 저밀도 지단백 콜레스테롤(LDL-C) 수준의 감소는 임의의 표준 기술에 의해 측정된다. 예를 들어, 임상 분석 기기를 사용하여 콜레스테롤(총 C), 트리글리세리드(TG) 및 고밀도 지단백 콜레스테롤(HDL-C)을 효소적으로 직접 측정하는 혈청 샘플의 '지질 패널'을 측정할 수 있다. 각 분석물에 특정한 시약 키트에는 완충액, 캘리브레이터, 블랭크 및 대조군이 포함되어 있다. 본 개시 내용에 사용되는 바와 같이, 콜레스테롤, 트리글리세리드 및 HDL-C는 특정 효소 반응 생성물의 흡광도 측정을 사용하여 정량화될 수 있다. LDL-C는 간접적으로 측정될 수 있다. 일부 경우에, 순환 콜레스테롤의 대부분이 세 가지 주요 지단백질 분획인 초저밀도 지단백질(VLDL), LDL 및 HDL에서 발견될 수 있다. 일부 실시양태에서, 총 순환 콜레스테롤은 [총 C] = [VLDL-C] + [LDL-C] + [HDL-C] 공식으로 추정될 수 있다. 따라서 LDL-C는 [LDL-C] = [총 C] - [HDL-C] - [TG]/5(여기서 [TG]/5는 VLDL-콜레스테롤의 추정치임)의 관계에 따라 총 콜레스테롤, 트리글리세리드 및 HDL-C의 측정값으로부터 계산될 수 있다. 트리글리세리드에 특이적인 시약 키트에는 완충액, 캘리브레이터, 블랭크 및 대조군이 포함되어 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 연구로부터의 혈청 샘플을 분석할 수 있고 트리글리세리드를 일련의 결합된 효소 반응을 사용하여 측정할 수 있다. 일부 실시양태에서, H2O2를 사용하여 마지막 생성물의 최종 생성물 및 500nm에서의 그의 흡광도로서 분석물을 정량화할 수 있으며, 색상 강도는 트리글리세리드 농도에 비례한다.
일부 실시양태에서, 가이드 폴리뉴클레오티드는 가이드 RNA이다. 일부 실시양태에서, 가이드 RNA는 0, 1 또는 2개의 미스매치를 가지며 ANGPTL3 유전자의 프로토스페이서 서열의 상보적 가닥에 결합하는 스페이서 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 가이드 RNA는 미스매치 없이 ANGPTL3 유전자의 프로토스페이서 서열의 상보적 가닥에 결합하는 스페이서 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 가이드 RNA는 1개의 미스매치를 가지며 ANGPTL3 유전자의 프로토스페이서 서열의 상보적 가닥에 결합하는 스페이서 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 가이드 RNA는 2개의 미스매치를 가지며 ANGPTL3 유전자의 프로토스페이서 서열의 상보적 가닥에 결합하는 스페이서 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 가이드 RNA는 3개의 미스매치를 가지며 ANGPTL3 유전자의 프로토스페이서 서열의 상보적 가닥에 결합하는 스페이서 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 가이드 RNA는 4개의 미스매치를 가지며 ANGPTL3 유전자의 프로토스페이서 서열의 상보적 가닥에 결합하는 스페이서 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 가이드 RNA는 5개의 미스매치를 가지며 ANGPTL3 유전자의 프로토스페이서 서열의 상보적 가닥에 결합하는 스페이서 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 가이드 폴리뉴클레오티드는 가이드 RNA이다. 일부 실시양태에서, 가이드 RNA는 0, 1 또는 2개의 미스매치를 가지며 PCSK9 유전자의 프로토스페이서 서열의 상보적 가닥에 결합하는 스페이서 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 가이드 RNA는 미스매치 없이 PCSK9 유전자의 프로토스페이서 서열의 상보적 가닥에 결합하는 스페이서 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 가이드 RNA는 1개의 미스매치를 가지며 PCSK9 유전자의 프로토스페이서 서열의 상보적 가닥에 결합하는 스페이서 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 가이드 RNA는 2개의 미스매치를 가지며 PCSK9 유전자의 프로토스페이서 서열의 상보적 가닥에 결합하는 스페이서 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 가이드 RNA는 3개의 미스매치를 가지며 PCSK9 유전자의 프로토스페이서 서열의 상보적 가닥에 결합하는 스페이서 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 가이드 RNA는 4개의 미스매치를 가지며 PCSK9 유전자의 프로토스페이서 서열의 상보적 가닥에 결합하는 스페이서 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 가이드 RNA는 5개의 미스매치를 가지며 PCSK9 유전자의 프로토스페이서 서열의 상보적 가닥에 결합하는 스페이서 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 핵염기 변경은 순 핵염기 편집에 의해 측정되는 경우 대상체의 전체 간 세포의 1% 미만에서 프로토스페이서 서열 외부에 있다. 일부 실시양태에서, 핵염기 변경은 순 핵염기 편집에 의해 측정되는 경우 대상체의 간세포의 1% 미만에서 프로토스페이서 서열 외부에 있다. 일부 실시양태에서, 핵염기 변경은 순 핵염기 편집에 의해 측정된 바와 같이 프로토스페이서 서열 내에만 있다.
일부 실시양태에서, 핵염기 변경은 순 핵염기 편집에 의해 측정되는 경우 대상체의 전체 간 세포의 0.01%. 0.02%, 0.03% 0.04%, 0.05%, 0.06%, 0.07%, 0.08%, 0.09%, 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9%, 1.0%, 2.0%, 3.0% 4.0%, 5.0%, 6.0%, 7.0%, 8.0%, 9.0%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 65%, 80%, 85%, 90% 미만에서 프로토스페이서 서열 외부에 있다. 일부 실시양태에서, 핵염기 변경은 순 핵염기 편집에 의해 측정되는 경우 대상체의 간세포의 0.01%. 0.02%, 0.03% 0.04%, 0.05%, 0.06%, 0.07%, 0.08%, 0.09%, 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9%, 1.0%, 2.0%, 3.0% 4.0%, 5.0%, 6.0%, 7.0%, 8.0%, 9.0%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 65%, 80%, 85%, 90% 미만에서 프로토스페이서 서열 외부에 있다. 일부 실시양태에서, 핵염기 변경은 순 핵염기 편집에 의해 측정되는 경우 대상체의 세포의 0.01%. 0.02%, 0.03% 0.04%, 0.05%, 0.06%, 0.07%, 0.08%, 0.09%, 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9%, 1.0%, 2.0%, 3.0% 4.0%, 5.0%, 6.0%, 7.0%, 8.0%, 9.0%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 65%, 80%, 85%, 90% 미만에서 프로토스페이서 서열 외부에 있다.
일부 실시양태에서, 투여는 정맥 내 주입을 통해 이루어진다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법은 (i) 가이드 폴리뉴클레오티드 또는 가이드 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP 및 (ii) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 제2 LNP의 순차적 투여를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법은 (i) 가이드 폴리뉴클레오티드 또는 가이드 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP 및 (ii) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 제2 LNP의 동시 투여를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법은 단일 용량의 (ii) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP, 이어서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7일의 간격에 걸쳐 시차를 둔 용량의 (i) 가이드 폴리뉴클레오티드 또는 가이드 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법은 단일 용량의 (ii) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP, 이어서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30시간의 간격에 걸쳐 시차를 둔 용량의 (i) 가이드 폴리뉴클레오티드 또는 가이드 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법은 단일 용량의 (ii) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP, 이어서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30일의 간격에 걸쳐 시차를 둔 용량의 (i) 가이드 폴리뉴클레오티드 또는 가이드 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법은 단일 용량의 (ii) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP, 이어서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 또는 36개월의 간격에 걸쳐 시차를 둔 용량의 (i) 가이드 폴리뉴클레오티드 또는 가이드 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계를 포함한다.
본원에 기재된 바와 같은 방법은 병태의 치료 또는 예방을 필요로 대상체의 이를 치료 또는 예방하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 방법은 (i) 가이드 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, 가이드 RNA, 또는 가이드 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP 및 (ii) 염기 에디터 융합 단백질 또는 염기 에디터 융합 단백질을 코딩하는 핵산, 예를 들어 염기 에디터 융합 단백질을 코딩하는 mRNA를 둘러싸는 LNP의 단일 용량을 투여하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 방법은 (i) 가이드 RNA 및 (i) 염기 에디터 융합 단백질을 코딩하는 mRNA를 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계를 포함할 수 있다. LNP는 단일 용량 또는 다중 용량으로 투여될 수 있다. 다른 실시양태에서, 방법은 (i) 가이드 폴리뉴클레오티드 또는 가이드 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP, 및 (ii) 염기 에디터 융합 단백질 또는 염기 에디터 융합 단백질을 코딩하는 핵산을 둘러싸는 제2 LNP를 투여하는 단계를 포함한다. LNP는 단일 용량 또는 다중 용량으로 투여될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법은 단일 용량의 (i) 가이드 폴리뉴클레오티드 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계 및 1일 후 다중 용량의 (ii) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계를 포함하며, 다중 용량은 1일 간격으로 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법은 단일 용량의 (i) 가이드 폴리뉴클레오티드 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계 및 1일 후 다중 용량의 (ii) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계를 포함하며, 다중 용량은 2일 간격으로 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법은 단일 용량의 (i) 가이드 폴리뉴클레오티드 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계 및 1일 후 다중 용량의 (ii) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계를 포함하며, 다중 용량은 3일 간격으로 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법은 단일 용량의 (i) 가이드 폴리뉴클레오티드 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계 및 1일 후 다중 용량의 (ii) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계를 포함하며, 다중 용량은 4일 간격으로 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법은 단일 용량의 (i) 가이드 폴리뉴클레오티드 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계 및 1일 후 다중 용량의 (ii) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계를 포함하며, 다중 용량은 5일 간격으로 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법은 단일 용량의 (i) 가이드 폴리뉴클레오티드 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계 및 1일 후 다중 용량의 (ii) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계를 포함하며, 다중 용량은 6일 간격으로 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법은 단일 용량의 (i) 가이드 폴리뉴클레오티드 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계 및 1일 후 다중 용량의 (ii) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계를 포함하며, 다중 용량은 7일 간격으로 제공된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법은 단일 용량의 (i) 가이드 폴리뉴클레오티드 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계 및 2일 후 다중 용량의 (ii) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계를 포함하며, 다중 용량은 1일 간격으로 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법은 단일 용량의 (i) 가이드 폴리뉴클레오티드 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계 및 2일 후 다중 용량의 (ii) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계를 포함하며, 다중 용량은 2일 간격으로 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법은 단일 용량의 (i) 가이드 폴리뉴클레오티드 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계 및 2일 후 다중 용량의 (ii) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계를 포함하며, 다중 용량은 3일 간격으로 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법은 단일 용량의 (i) 가이드 폴리뉴클레오티드 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계 및 2일 후 다중 용량의 (ii) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계를 포함하며, 다중 용량은 4일 간격으로 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법은 단일 용량의 (i) 가이드 폴리뉴클레오티드 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계 및 2일 후 다중 용량의 (ii) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계를 포함하며, 다중 용량은 5일 간격으로 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법은 단일 용량의 (i) 가이드 폴리뉴클레오티드 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계 및 2일 후 다중 용량의 (ii) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계를 포함하며, 다중 용량은 6일 간격으로 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법은 단일 용량의 (i) 가이드 폴리뉴클레오티드 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계 및 2일 후 다중 용량의 (ii) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계를 포함하며, 다중 용량은 7일 간격으로 제공된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법은 단일 용량의 (i) 가이드 폴리뉴클레오티드 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계 및 3일 후 다중 용량의 (ii) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계를 포함하며, 다중 용량은 1일 간격으로 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법은 단일 용량의 (i) 가이드 폴리뉴클레오티드 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계 및 3일 후 다중 용량의 (ii) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계를 포함하며, 다중 용량은 2일 간격으로 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법은 단일 용량의 (i) 가이드 폴리뉴클레오티드 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계 및 3일 후 다중 용량의 (ii) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계를 포함하며, 다중 용량은 3일 간격으로 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법은 단일 용량의 (i) 가이드 폴리뉴클레오티드 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계 및 3일 후 다중 용량의 (ii) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계를 포함하며, 다중 용량은 4일 간격으로 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법은 단일 용량의 (i) 가이드 폴리뉴클레오티드 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계 및 3일 후 다중 용량의 (ii) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계를 포함하며, 다중 용량은 5일 간격으로 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법은 단일 용량의 (i) 가이드 폴리뉴클레오티드 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계 및 3일 후 다중 용량의 (ii) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계를 포함하며, 다중 용량은 6일 간격으로 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법은 단일 용량의 (i) 가이드 폴리뉴클레오티드 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계 및 3일 후 다중 용량의 (ii) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계를 포함하며, 다중 용량은 7일 간격으로 제공된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법은 단일 용량의 (i) 가이드 폴리뉴클레오티드 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계 및 4일 후 다중 용량의 (ii) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계를 포함하며, 다중 용량은 1일 간격으로 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법은 단일 용량의 (i) 가이드 폴리뉴클레오티드 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계 및 4일 후 다중 용량의 (ii) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계를 포함하며, 다중 용량은 2일 간격으로 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법은 단일 용량의 (i) 가이드 폴리뉴클레오티드 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계 및 4일 후 다중 용량의 (ii) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계를 포함하며, 다중 용량은 3일 간격으로 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법은 단일 용량의 (i) 가이드 폴리뉴클레오티드 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계 및 4일 후 다중 용량의 (ii) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계를 포함하며, 다중 용량은 4일 간격으로 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법은 단일 용량의 (i) 가이드 폴리뉴클레오티드 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계 및 4일 후 다중 용량의 (ii) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계를 포함하며, 다중 용량은 5일 간격으로 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법은 단일 용량의 (i) 가이드 폴리뉴클레오티드 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계 및 4일 후 다중 용량의 (ii) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계를 포함하며, 다중 용량은 6일 간격으로 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법은 단일 용량의 (i) 가이드 폴리뉴클레오티드 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계 및 4일 후 다중 용량의 (ii) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계를 포함하며, 다중 용량은 7일 간격으로 제공된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법은 단일 용량의 (i) 가이드 폴리뉴클레오티드 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계 및 5일 후 다중 용량의 (ii) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계를 포함하며, 다중 용량은 1일 간격으로 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법은 단일 용량의 (i) 가이드 폴리뉴클레오티드 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계 및 5일 후 다중 용량의 (ii) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계를 포함하며, 다중 용량은 2일 간격으로 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법은 단일 용량의 (i) 가이드 폴리뉴클레오티드 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계 및 5일 후 다중 용량의 (ii) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계를 포함하며, 다중 용량은 3일 간격으로 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법은 단일 용량의 (i) 가이드 폴리뉴클레오티드 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계 및 5일 후 다중 용량의 (ii) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계를 포함하며, 다중 용량은 4일 간격으로 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법은 단일 용량의 (i) 가이드 폴리뉴클레오티드 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계 및 5일 후 다중 용량의 (ii) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계를 포함하며, 다중 용량은 5일 간격으로 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법은 단일 용량의 (i) 가이드 폴리뉴클레오티드 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계 및 5일 후 다중 용량의 (ii) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계를 포함하며, 다중 용량은 6일 간격으로 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법은 단일 용량의 (i) 가이드 폴리뉴클레오티드 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계 및 5일 후 다중 용량의 (ii) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계를 포함하며, 다중 용량은 7일 간격으로 제공된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법은 단일 용량의 (i) 가이드 폴리뉴클레오티드 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계 및 6일 후 다중 용량의 (ii) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계를 포함하며, 다중 용량은 1일 간격으로 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법은 단일 용량의 (i) 가이드 폴리뉴클레오티드 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계 및 6일 후 다중 용량의 (ii) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계를 포함하며, 다중 용량은 2일 간격으로 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법은 단일 용량의 (i) 가이드 폴리뉴클레오티드 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계 및 6일 후 다중 용량의 (ii) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계를 포함하며, 다중 용량은 3일 간격으로 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법은 단일 용량의 (i) 가이드 폴리뉴클레오티드 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계 및 6일 후 다중 용량의 (ii) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계를 포함하며, 다중 용량은 4일 간격으로 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법은 단일 용량의 (i) 가이드 폴리뉴클레오티드 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계 및 6일 후 다중 용량의 (ii) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계를 포함하며, 다중 용량은 5일 간격으로 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법은 단일 용량의 (i) 가이드 폴리뉴클레오티드 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계 및 6일 후 다중 용량의 (ii) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계를 포함하며, 다중 용량은 6일 간격으로 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법은 단일 용량의 (i) 가이드 폴리뉴클레오티드 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계 및 6일 후 다중 용량의 (ii) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계를 포함하며, 다중 용량은 7일 간격으로 제공된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법은 단일 용량의 (i) 가이드 폴리뉴클레오티드 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계 및 7일 후 다중 용량의 (ii) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계를 포함하며, 다중 용량은 1일 간격으로 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법은 단일 용량의 (i) 가이드 폴리뉴클레오티드 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계 및 7일 후 다중 용량의 (ii) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계를 포함하며, 다중 용량은 2일 간격으로 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법은 단일 용량의 (i) 가이드 폴리뉴클레오티드 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계 및 7일 후 다중 용량의 (ii) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계를 포함하며, 다중 용량은 3일 간격으로 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법은 단일 용량의 (i) 가이드 폴리뉴클레오티드 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계 및 7일 후 다중 용량의 (ii) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계를 포함하며, 다중 용량은 4일 간격으로 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법은 단일 용량의 (i) 가이드 폴리뉴클레오티드 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계 및 7일 후 다중 용량의 (ii) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계를 포함하며, 다중 용량은 5일 간격으로 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법은 단일 용량의 (i) 가이드 폴리뉴클레오티드 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계 및 7일 후 다중 용량의 (ii) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계를 포함하며, 다중 용량은 6일 간격으로 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법은 단일 용량의 (i) 가이드 폴리뉴클레오티드 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계 및 7일 후 다중 용량의 (ii) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계를 포함하며, 다중 용량은 7일 간격으로 제공된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법은 단일 용량의 (ii) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계 및 1일 후 다중 용량의 (i) 가이드 폴리뉴클레오티드 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계를 포함하며, 다중 용량은 1일 간격으로 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법은 단일 용량의 (ii) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계 및 1일 후 다중 용량의 (i) 가이드 폴리뉴클레오티드 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계를 포함하며, 다중 용량은 2일 간격으로 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법은 단일 용량의 (ii) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계 및 1일 후 다중 용량의 (i) 가이드 폴리뉴클레오티드 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계를 포함하며, 다중 용량은 3일 간격으로 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법은 단일 용량의 (ii) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계 및 1일 후 다중 용량의 (i) 가이드 폴리뉴클레오티드 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계를 포함하며, 다중 용량은 4일 간격으로 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법은 단일 용량의 (ii) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계 및 1일 후 다중 용량의 (i) 가이드 폴리뉴클레오티드 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계를 포함하며, 다중 용량은 5일 간격으로 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법은 단일 용량의 (ii) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계 및 1일 후 다중 용량의 (i) 가이드 폴리뉴클레오티드 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계를 포함하며, 다중 용량은 6일 간격으로 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법은 단일 용량의 (ii) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계 및 1일 후 다중 용량의 (i) 가이드 폴리뉴클레오티드 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계를 포함하며, 다중 용량은 7일 간격으로 제공된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법은 단일 용량의 (ii) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계 및 2일 후 다중 용량의 (i) 가이드 폴리뉴클레오티드 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계를 포함하며, 다중 용량은 1일 간격으로 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법은 단일 용량의 (ii) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계 및 2일 후 다중 용량의 (i) 가이드 폴리뉴클레오티드 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계를 포함하며, 다중 용량은 2일 간격으로 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법은 단일 용량의 (ii) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계 및 2일 후 다중 용량의 (i) 가이드 폴리뉴클레오티드 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계를 포함하며, 다중 용량은 3일 간격으로 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법은 단일 용량의 (ii) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계 및 2일 후 다중 용량의 (i) 가이드 폴리뉴클레오티드 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계를 포함하며, 다중 용량은 4일 간격으로 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법은 단일 용량의 (ii) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계 및 2일 후 다중 용량의 (i) 가이드 폴리뉴클레오티드 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계를 포함하며, 다중 용량은 5일 간격으로 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법은 단일 용량의 (ii) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계 및 2일 후 다중 용량의 (i) 가이드 폴리뉴클레오티드 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계를 포함하며, 다중 용량은 6일 간격으로 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법은 단일 용량의 (ii) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계 및 2일 후 다중 용량의 (i) 가이드 폴리뉴클레오티드 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계를 포함하며, 다중 용량은 7일 간격으로 제공된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법은 단일 용량의 (ii) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계 및 3일 후 다중 용량의 (i) 가이드 폴리뉴클레오티드 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계를 포함하며, 다중 용량은 1일 간격으로 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법은 단일 용량의 (ii) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계 및 3일 후 다중 용량의 (i) 가이드 폴리뉴클레오티드 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계를 포함하며, 다중 용량은 2일 간격으로 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법은 단일 용량의 (ii) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계 및 3일 후 다중 용량의 (i) 가이드 폴리뉴클레오티드 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계를 포함하며, 다중 용량은 3일 간격으로 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법은 단일 용량의 (ii) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계 및 3일 후 다중 용량의 (i) 가이드 폴리뉴클레오티드 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계를 포함하며, 다중 용량은 4일 간격으로 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법은 단일 용량의 (ii) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계 및 3일 후 다중 용량의 (i) 가이드 폴리뉴클레오티드 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계를 포함하며, 다중 용량은 5일 간격으로 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법은 단일 용량의 (ii) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계 및 3일 후 다중 용량의 (i) 가이드 폴리뉴클레오티드 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계를 포함하며, 다중 용량은 6일 간격으로 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법은 단일 용량의 (ii) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계 및 3일 후 다중 용량의 (i) 가이드 폴리뉴클레오티드 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계를 포함하며, 다중 용량은 7일 간격으로 제공된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법은 단일 용량의 (ii) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계 및 4일 후 다중 용량의 (i) 가이드 폴리뉴클레오티드 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계를 포함하며, 다중 용량은 1일 간격으로 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법은 단일 용량의 (ii) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계 및 4일 후 다중 용량의 (i) 가이드 폴리뉴클레오티드 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계를 포함하며, 다중 용량은 2일 간격으로 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법은 단일 용량의 (ii) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계 및 4일 후 다중 용량의 (i) 가이드 폴리뉴클레오티드 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계를 포함하며, 다중 용량은 3일 간격으로 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법은 단일 용량의 (ii) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계 및 4일 후 다중 용량의 (i) 가이드 폴리뉴클레오티드 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계를 포함하며, 다중 용량은 4일 간격으로 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법은 단일 용량의 (ii) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계 및 4일 후 다중 용량의 (i) 가이드 폴리뉴클레오티드 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계를 포함하며, 다중 용량은 5일 간격으로 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법은 단일 용량의 (ii) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계 및 4일 후 다중 용량의 (i) 가이드 폴리뉴클레오티드 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계를 포함하며, 다중 용량은 6일 간격으로 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법은 단일 용량의 (ii) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계 및 4일 후 다중 용량의 (i) 가이드 폴리뉴클레오티드 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계를 포함하며, 다중 용량은 7일 간격으로 제공된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법은 단일 용량의 (ii) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계 및 5일 후 다중 용량의 (i) 가이드 폴리뉴클레오티드 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계를 포함하며, 다중 용량은 1일 간격으로 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법은 단일 용량의 (ii) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계 및 5일 후 다중 용량의 (i) 가이드 폴리뉴클레오티드 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계를 포함하며, 다중 용량은 2일 간격으로 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법은 단일 용량의 (ii) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계 및 5일 후 다중 용량의 (i) 가이드 폴리뉴클레오티드 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계를 포함하며, 다중 용량은 3일 간격으로 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법은 단일 용량의 (ii) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계 및 5일 후 다중 용량의 (i) 가이드 폴리뉴클레오티드 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계를 포함하며, 다중 용량은 4일 간격으로 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법은 단일 용량의 (ii) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계 및 5일 후 다중 용량의 (i) 가이드 폴리뉴클레오티드 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계를 포함하며, 다중 용량은 5일 간격으로 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법은 단일 용량의 (ii) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계 및 5일 후 다중 용량의 (i) 가이드 폴리뉴클레오티드 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계를 포함하며, 다중 용량은 6일 간격으로 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법은 단일 용량의 (ii) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계 및 5일 후 다중 용량의 (i) 가이드 폴리뉴클레오티드 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계를 포함하며, 다중 용량은 7일 간격으로 제공된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법은 단일 용량의 (ii) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계 및 6일 후 다중 용량의 (i) 가이드 폴리뉴클레오티드 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계를 포함하며, 다중 용량은 1일 간격으로 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법은 단일 용량의 (ii) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계 및 6일 후 다중 용량의 (i) 가이드 폴리뉴클레오티드 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계를 포함하며, 다중 용량은 2일 간격으로 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법은 단일 용량의 (ii) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계 및 6일 후 다중 용량의 (i) 가이드 폴리뉴클레오티드 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계를 포함하며, 다중 용량은 3일 간격으로 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법은 단일 용량의 (ii) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계 및 6일 후 다중 용량의 (i) 가이드 폴리뉴클레오티드 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계를 포함하며, 다중 용량은 4일 간격으로 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법은 단일 용량의 (ii) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계 및 6일 후 다중 용량의 (i) 가이드 폴리뉴클레오티드 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계를 포함하며, 다중 용량은 5일 간격으로 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법은 단일 용량의 (ii) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계 및 6일 후 다중 용량의 (i) 가이드 폴리뉴클레오티드 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계를 포함하며, 다중 용량은 6일 간격으로 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법은 단일 용량의 (ii) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계 및 6일 후 다중 용량의 (i) 가이드 폴리뉴클레오티드 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계를 포함하며, 다중 용량은 7일 간격으로 제공된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법은 단일 용량의 (ii) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계 및 7일 후 다중 용량의 (i) 가이드 폴리뉴클레오티드 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계를 포함하며, 다중 용량은 1일 간격으로 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법은 단일 용량의 (ii) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계 및 7일 후 다중 용량의 (i) 가이드 폴리뉴클레오티드 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계를 포함하며, 다중 용량은 2일 간격으로 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법은 단일 용량의 (ii) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계 및 7일 후 다중 용량의 (i) 가이드 폴리뉴클레오티드 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계를 포함하며, 다중 용량은 3일 간격으로 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법은 단일 용량의 (ii) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계 및 7일 후 다중 용량의 (i) 가이드 폴리뉴클레오티드 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계를 포함하며, 다중 용량은 4일 간격으로 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법은 단일 용량의 (ii) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계 및 7일 후 다중 용량의 (i) 가이드 폴리뉴클레오티드 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계를 포함하며, 다중 용량은 5일 간격으로 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법은 단일 용량의 (ii) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계 및 7일 후 다중 용량의 (i) 가이드 폴리뉴클레오티드 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계를 포함하며, 다중 용량은 6일 간격으로 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법은 단일 용량의 (ii) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계 및 7일 후 다중 용량의 (i) 가이드 폴리뉴클레오티드 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP를 투여하는 단계를 포함하며, 다중 용량은 7일 간격으로 제공된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법은 (i) 가이드 폴리뉴클레오티드 또는 가이드 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 핵산 및 (ii) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 핵산을 둘러싸는 LNP의 단일 용량을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 단일 용량의 LNP는 0.3 mg/kg이다. 일부 실시양태에서, 단일 용량의 LNP는 0.5 mg/kg이다. 일부 실시양태에서, 단일 용량의 LNP는 1 mg/kg이다. 일부 실시양태에서, 단일 용량의 LNP는 1 mg/kg이다. 일부 실시양태에서, 단일 용량의 LNP는 약 0.3 내지 약 3 mg/kg이다.
본원에 제공된 바와 같은 병태의 치료 방법은 하나 이상의 치료의 치료 과정을 포함할 수 있으며, 각 치료는 단일 용량 또는 다중 용량의 염기 에디터 시스템, 또는 염기 에디터 시스템의 하나 이상의 구성요소를 둘러싸는 LNP를 포함한다. 예를 들어, 이를 필요로 하는 대상체는 치료를 위한 염기 에디터 융합 단백질을 코딩하는 mRNA 및 가이드 RNA를 둘러싸는 LNP의 단일 용량을 투여받을 수 있다. 일부 실시양태에서, 대상체는 하나 이상의 치료의 치료 과정을 받을 수 있으며, 여기서 각각의 치료는 LNP의 단일 용량의 하나 이상을 포함하고, 예를 들어 대상체는 또한 치료를 위한 염기 에디터 융합 단백질을 코딩하는 mRNA 및 가이드 RNA를 둘러싸는 LNP의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50회 이상의 용량을 투여받을 수 있다. 대상체는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50회 이상의 치료의 치료 과정을 받을 수 있으며, 여기서 각각의 용량은 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 1주, 2주, 3주, 1개월, 2개월, 3개월, 6개월, 9개월, 12개월, 24개월, 48개월 또는 따로 투여될 수 있다. 본원에 기재된 바와 같은 치료를 위한 단일 용량은 가이드 RNA 또는 염기 에디터 융합 단백질을 코딩하는 mRNA, 또는 둘 모두를 둘러싸는 LNP를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, LNP의 단일 용량은 0.1 mg/kg, 0.2 mg/kg, 0.3 mg/kg, 0.4 mg/kg, 0.5 mg/kg, 0.6 mg/kg, 0.7 mg/kg, 0.8 mg/kg, 0.9 mg/kg, 1.0 mg/kg, 1.1 mg/kg, 1.2 mg/kg, 1.3 mg/kg, 1.4 mg/kg, 1.5 mg/kg, 1.6 mg/kg, 1.7 mg/kg, 1.8 mg/kg, 1.9 mg/kg, 2.0 mg/kg, 2.1 mg/kg, 2.2 mg/kg, 2.3 mg/kg, 2.4 mg/kg, 2.5 mg/kg, 2.6 mg/kg, 2.7 mg/kg, 2.8 mg/kg, 2.9 mg/kg, 3.0 mg/kg, 3.1 mg/kg, 3.2 mg/kg, 3.3 mg/kg, 3.4 mg/kg, 3.5 mg/kg, 3.6 mg/kg, 3.7 mg/kg, 3.8 mg/kg, 3.9 mg/kg, 4.0 mg/kg, 4.1 mg/kg, 4.2 mg/kg, 4.3 mg/kg, 4.4 mg/kg, 4.5 mg/kg, 4.6 mg/kg, 4.7 mg/kg, 4.8 mg/kg, 4.9 mg/kg, 5.0 mg/kg, 5.1 mg/kg, 5.2 mg/kg, 5.3 mg/kg, 5.4 mg/kg, 5.5 mg/kg, 5.6 mg/kg, 5.7 mg/kg, 5.8 mg/kg, 5.9 mg/kg, 6.0 mg/kg, 6.1 mg/kg, 6.2 mg/kg, 6.3 mg/kg, 6.4 mg/kg, 6.5 mg/kg, 6.6 mg/kg, 6.7 mg/kg, 6.8 mg/kg, 6.9 mg/kg, 7.0 mg/kg, 7.1 mg/kg, 7.2 mg/kg, 7.3 mg/kg, 7.4 mg/kg, 7.5 mg/kg, 7.6 mg/kg, 7.7 mg/kg, 7.8 mg/kg, 7.9 mg/kg, 8.0 mg/kg, 8.1 mg/kg, 8.2 mg/kg, 8.3 mg/kg, 8.4 mg/kg, 8.5 mg/kg, 8.6 mg/kg, 8.7 mg/kg, 8.8 mg/kg, 8.9 mg/kg, 9.0 mg/kg, 9.1 mg/kg, 9.2 mg/kg, 9.3 mg/kg, 9.4 mg/kg, 9.5 mg/kg, 9.6 mg/kg, 9.7 mg/kg, 9.8 mg/kg, 9.9 mg/kg, 10 mg/kg, 11 mg/kg, 12 mg/kg, 13 mg/kg, 14 mg/kg, 15 mg/kg, 16 mg/kg, 17 mg/kg, 18 mg/kg, 19 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg, 30 mg/kg, 35 mg/kg, 40 mg/kg, 45 mg/kg, 50 mg/kg, 55 mg/kg, 60 mg/kg, 65 mg/kg, 70 mg/kg, 75 mg/kg, 80 mg/kg, 85 mg/kg, 90 mg/kg, 95 mg/kg, 100 mg/kg, 105 mg/kg, 110 mg/kg, 115 mg/kg, 120 mg/kg, 125 mg/kg, 130 mg/kg, 135 mg/kg, 140 mg/kg, 145 mg/kg, 150 mg/kg, 155 mg/kg, 160 mg/kg, 165 mg/kg, 170 mg/kg, 175 mg/kg, 180 mg/kg, 185 mg/kg, 190 mg/kg, 195 mg/kg, 200 mg/kg, 250 mg/kg, 300 mg/kg, 350 mg/kg, 400 mg/kg, 450 mg/kg, 또는 500 mg/kg을 포함한다.
일부 실시양태에서, 병태는 죽상동맥경화성 심혈관 질환이다. 일부 실시양태에서, 병태는 심혈관 질환, 또는 당뇨병이다. 일부 실시양태에서, 병태는 죽상동맥경화성 혈관 질환이다.
일부 실시양태에서, 대상체는 비인간 영장류이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 원숭이이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 인간이다. 일부 실시양태에서, 데아미나아제는 아데닌 데아미나아제이다. 일부 실시양태에서, 핵염기 변경은 A·T에서 G·C로의 변경이다. 일부 실시양태에서, 데아미나아제는 아데닌 데아미나아제이고 핵염기 변경은 A·T에서 G·C로의 변경이다. 일부 실시양태에서, 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인은 뉴클레아제 불활성 Cas9를 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인은 Cas9 닉카아제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인은 Cas9를 포함한다.
일부 실시양태에서, 핵염기 변경은 PCSK9 유전자의 스플라이스 부위에 있다. 일부 실시양태에서, 핵염기 변경은 PCSK9 유전자의 스플라이스 도너 부위에 있다. 일부 실시양태에서, 스플라이스 도너 부위는 서열 번호 5에 참조된 바와 같이 PCSK9 인트론 1의 5' 말단에 있다. 일부 실시양태에서, 핵염기 변경은 PCSK9 유전자의 스플라이스 억셉터 부위에 있다. 일부 실시양태에서, 핵염기 변경은 PCSK9 유전자에 의해 코딩되는 전사물에서 프레임 이동, 조기 정지 코돈, 삽입 또는 결실을 초래한다. 일부 실시양태에서, 핵염기 변경은 PCSK9 유전자에 의해 코딩되는 비정상 전사물을 생성한다. 일부 실시양태에서, 가이드 폴리뉴클레오티드는 가이드 RNA이다. 일부 실시양태에서, 가이드 RNA는 화학적으로 변형된다. 일부 실시양태에서, 가이드 RNA는 tracrRNA 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 가이드 RNA는 표 1 또는 표 24에 제시된 바와 같이 화학적 변형을 포함한다.
일부 실시양태에서, 핵염기 변경은 ANGPTL3 유전자의 스플라이스 부위에 있다. 일부 실시양태에서, 핵염기 변경은 ANGPTL3 유전자의 스플라이스 도너 부위에 있다. 일부 실시양태에서, 스플라이스 도너 부위는 서열 번호 7에 참조된 바와 같이 ANGPTL3 인트론 6의 5' 말단에 있다. 일부 실시양태에서, 핵염기 변경은 ANGPTL3 유전자의 스플라이스 억셉터 부위에 있다. 일부 실시양태에서, 핵염기 변경은 ANGPTL3 유전자에 의해 코딩되는 전사물에서 프레임 이동, 조기 정지 코돈, 삽입 또는 결실을 초래한다. 일부 실시양태에서, 핵염기 변경은 ANGPTL3 유전자에 의해 코딩되는 비정상 전사물을 생성한다. 일부 실시양태에서, 가이드 폴리뉴클레오티드는 가이드 RNA이다. 일부 실시양태에서, 가이드 RNA는 화학적으로 변형된다. 일부 실시양태에서, 가이드 RNA는 tracrRNA 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 가이드 RNA는 표 1 또는 표 24에 제시된 바와 같이 화학적 변형을 포함한다.
일부 실시양태에서, 가이드 RNA는 표 1 또는 표 24에 제시된 가이드 RNA 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 가이드 RNA는 서열 5'-5'-cscscsGCACCUUGGCGCAGCGGgUUUUAGagcuaGaaauagcaaGUUaAaAuAaggCUaGUCcG UUAucAAcuuGaaaaaguGgcaccgAgUCggugcusususu-3' (서열 번호 9), 5'-cscscsGCACCUUGGCGCAGCGGgUUUUAGagcuagaaauagcaaGUUaAaAuAaggcuaGUccGU UAucAAcuugaaaaagugGcaccgagucggugcusususu-3' (서열 번호 9), 5'-cscscsGCACCUUGGCGCAGCGGgUUUUAGagcuaGaaauagcaaGUUaAaAuAaggcuaGUccGUUAucAAcuuGaaaaagugGcaccgagucggugcusususu-3' (서열 번호 9) (GA346), 5'- cscscsGCACCUUGGCGCAGCGGgUUUUAGagcuagaaauagcaaGUUaAaAuAaggcuaGUccGUUAacAAcuugaaaaagugGcaccgagucggugcusususu-3' (서열 번호 65) (GA374), 5'- cscscsGCACCUUGGCGCAGCGGgUUUUAGagcuagaaauagcaaGUUaAaAuAaggcuaGUccGUUAucAAcuugaaaaagugGcaccgagucggugcusususuuuu-3' (서열 번호 11) (GA385), 5'- cscscsGCACCUUGGCGCAGCGGgUUUUAGagcuagaaauagcaaGUUaAaAuAaggcuaGUccGUUAucAAcuugaaaaagugGcaccgagucggugcusususuuUu-3' (서열 번호 11) (GA386) or 5'- cscscsGCACCUUGGCGCAGCGgUUUUAGagcuaGaaauagcaaGUUaAaAuAaggcuaGUccGUUAucAAcuuGaaaaagugGcaccgagucggugcuususuuuu-3' (서열 번호 12) (GA387)을 포함한다.
일부 실시양태에서, 프로토스페이서 서열은 표 1 또는 표 24에 제시된 프로토스페이서 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로토스페이서는 서열 5'-CCCGCACCTTGGCGCAGCGG-3' (서열 번호 13), AAGATACCTGAATAACTCTC-3' (서열 번호 14) 또는 5'-AAGATACCTGAATAACCCTC-3' (서열 번호 15)을 포함한다.
일부 실시양태에서, 염기 에디터 융합 단백질은 서열 번호 3의 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나아제는 서열 번호 3에 제시된 아미노산 서열 또는 본원에 제공된 임의의 아데노신 데아미나아제에 대해 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 본원에 제공된 아데노신 데아미나아제는 하나 이상의 돌연변이(예를 들어, 본원에 제공된 임의의 돌연변이)를 포함할 수 있음을 이해해야 한다. 본 개시 내용은 특정 동일성을 가진 임의의 데아미나아제 도메인 및 본원에 기재된 이들의 임의의 돌연변이 또는 조합을 제공한다. 일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나아제는 서열 번호 3에 제시된 아미노산 서열 또는 본원에 제공된 임의의 아데노신 데아미나아제와 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 21, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50개 이상의 돌연변이를 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 아데노신 데아미나아제는 서열 번호 3에 제시된 아미노산 서열 중 어느 하나 또는 본원에 제공된 임의의 아데노신 데아미나아제와 비교하여 적어도 5, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 110, 적어도 120, 적어도 130, 적어도 140, 적어도 150, 적어도 160, 또는 적어도 170개의 동일한 연속 아미노산 잔기를 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, mRNA는 cpa 유사체를 포함한다.
일부 실시양태에서, mRNA는 2'-히드록실 기, 2'-O-메틸 기, 또는 추가의 2' 화학적 변형 또는 이들의 조합을 포함하는 5' 말단에 적어도 1, 2 또는 3개의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, mRNA는 2'-히드록실 기, 2'-O-메틸 기, 또는 추가의 2' 화학적 변형 또는 이들의 조합을 포함하는 5' 말단에 적어도 1, 2 또는 3개의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, mRNA는 2'-히드록실 기, 2'-O-메틸 기, 또는 추가의 2' 화학적 변형 또는 이들의 조합을 포함하는 5' 말단에 적어도 1개의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, mRNA는 2'-히드록실 기, 2'-O-메틸 기, 또는 추가의 2' 화학적 변형 또는 이들의 조합을 포함하는 5' 말단에 적어도 2개의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, mRNA는 2'-히드록실 기, 2'-O-메틸 기, 또는 추가의 2' 화학적 변형 또는 이들의 조합을 포함하는 5' 말단에 적어도 3개의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, mRNA는 2'-히드록실 기, 2'-O-메틸 기, 또는 추가의 2' 화학적 변형 또는 이들의 조합을 포함하는 5' 말단에 적어도 4개의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, mRNA는 2'-히드록실 기, 2'-O-메틸 기, 또는 추가의 2' 화학적 변형 또는 이들의 조합을 포함하는 5' 말단에 적어도 5개의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, mRNA는 2'-히드록실 기, 2'-O-메틸 기, 또는 추가의 2' 화학적 변형 또는 이들의 조합을 포함하는 5' 말단에 적어도 6개의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, mRNA는 2'-히드록실 기, 2'-O-메틸 기, 또는 추가의 2' 화학적 변형 또는 이들의 조합을 포함하는 5' 말단에 적어도 7개의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, mRNA는 2'-히드록실 기, 2'-O-메틸 기, 또는 추가의 2' 화학적 변형 또는 이들의 조합을 포함하는 5' 말단에 적어도 8개의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, mRNA는 2'-히드록실 기, 2'-O-메틸 기, 또는 추가의 2' 화학적 변형 또는 이들의 조합을 포함하는 5' 말단에 적어도 9개의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, mRNA는 2'-히드록실 기, 2'-O-메틸 기, 또는 추가의 2' 화학적 변형 또는 이들의 조합을 포함하는 5' 말단에 적어도 10개의 뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시양태에서, mRNA는 폴리 A 꼬리를 포함한다.
높은 순환 콜레스테롤 수준과 관련된 병태를 치료하기 위해 본원에 기재된 조성물은 이를 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량으로 투여될 수 있다. 본원에 기재된 조성물 및 방법을 사용하여 치료할 수 있는 높은 순환 콜레스테롤 수준과 관련된 병태에는 고콜레스테롤혈증, 상승된 총 콜레스테롤 수준, 상승된 저밀도 지단백질(LDL) 수준, 상승된 혈중 LDL-콜레스테롤 수준, 감소된 혈중 고밀도 지단백질 콜레스테롤 수준, 간 지방증, 관상 동맥 심장 질환, 혈관 질환, 허혈, 뇌졸중, 말초 혈관 질환, 혈전증, 제2형 당뇨병, 고트리글리세리드혈증, 고혈압, 죽상동맥경화증, 비만, 알츠하이머병, 신경변성, 및 이들의 조합이 제한 없이 포함된다. 본원에 개시된 조성물 및 방법은 대상체에서 순환 콜레스테롤 수준을 감소시켜 병태를 치료하는 데 효과적이다. 본원에 개시된 조성물 및 방법은 투여 전과 비교하여 혈중 LDL 콜레스테롤 수준을 감소시키고/거나 혈중 트리글리세리드 수준을 감소시키는데 효과적이다.
또 다른 측면에서, 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법이 본원에 제공되며, 방법은 본원에 제공된 바와 같은 복합체, 본원에 제공된 바와 같은 조성물, 또는 본원에 제공된 바와 같은 지질 나노입자를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 sgRNA는 아데노신 염기 에디터 단백질이 대상체의 세포에서 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 변형을 수행하도록 지시함으로써 병태를 치료 또는 예방한다.
일부 실시양태에서, 표적 폴리뉴클레오티드 서열은 PCSK9 유전자에 있다. 일부 실시양태에서, 변형은 대상체에서 PCSK9 유전자에 의해 코딩되는 기능적 PCSK9 단백질의 발현을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 병태는 죽상동맥경화성 혈관 질환이다. 일부 실시양태에서, 표적 폴리뉴클레오티드 서열은 ANGPTL3 유전자에 있다. 일부 실시양태에서, 변형은 대상체에서 ANGPTL3 유전자에 의해 코딩되는 기능적 ANGPTL3 단백질의 발현을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 병태는 죽상동맥경화성 혈관 질환, 고트리글리세리드혈증, 또는 당뇨병이다.
병태, 질환 또는 장애로 치료를 받고 있는 환자는 의사가 그러한 상태를 가지고 있는 것으로 진단 내린 사람이다. 진단은 적절한 수단에 의해 수행될 수 있다. 진단 및 모니터링에는 예를 들어 생물학적 샘플에서 질환 세포, 죽어가는 세포 또는 죽은 세포의 존재 감지(예를 들어, 조직 생검, 혈액 검사, 또는 소변 검사), 플라크의 존재 감지, 생물학적 샘플에서 대리 마커의 수준 감지, 또는 병태와 관련된 증상 감지가 포함될 수 있다. 질환의 발병이 예방되고 있는 환자는 그러한 진단을 받았을 수도 있고 받지 않았을 수도 있다. 당업자는 이러한 환자가 상기에 기재된 바와 동일한 표준 테스트를 받았거나 검사 없이 하나 이상의 위험 인자(예를 들어, 가족력 또는 유전적 소인)의 존재로 인해 고위험에 있는 환자로 식별될 수 있다.
본 개시 내용의 치료 방법은 질환 또는 병태로 인한 병리를 나타내는 대상체, 질환 또는 병태로 인한 병리를 나타내는 것으로 의심되는 대상체, 및 질환 또는 병태로 인한 병리를 나타낼 위험이 있는 대상체에서 수행될 수 있다. 예를 들어, 질환 또는 병태에 대한 유전적 소인이 있는 대상체는 예방적으로 치료될 수 있다. 병태, 질환 또는 장애와 관련된 증상을 나타내는 대상체는 증상을 감소시키거나 증상의 추가 진행을 늦추거나 예방하기 위해 치료될 수 있다. 질환 또는 병태의 증가하는 중증도와 관련된 신체적 변화는 본원에서 진행성인 것으로 나타낸다. 따라서, 본 개시 내용의 실시양태에서, 병태 또는 질환과 관련된 병리의 경증 징후를 나타내는 대상체는 증상을 개선하고/거나 증상의 추가 진행을 예방하기 위해 치료될 수 있다.
일부 실시양태에서, 대상체는 투여 전과 비교하여 감소된 혈중 LDL 콜레스테롤 수준 및/또는 감소된 혈중 트리글리세리드 수준을 나타낸다.
일부 실시양태에서, 투여 후 대상체는 투여 전과 비교하여 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9%, 또는 100% 감소된 혈중 저밀도 지단백질(LDL) 콜레스테롤 수준을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 투여 후 대상체는 투여 전과 비교하여 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 25배, 적어도 30배, 적어도 40배, 적어도 50배, 적어도 60배, 적어도 70배, 적어도 80배, 적어도 90배, 적어도 100배, 적어도 200배, 적어도 300배, 적어도 400배, 적어도 500배, 적어도 600배, 적어도 700배, 적어도 800배, 적어도 900배, 적어도 1000배, 적어도 2000배, 적어도 3000배, 적어도 4000배, 적어도 5000배, 적어도 6000배, 적어도 7000배, 적어도 8000배, 적어도 9000배, 또는 적어도 10000배 감소된 혈중 저밀도 지단백질(LDL) 콜레스테롤 수준을 나타낸다.
일부 실시양태에서, 투여 후 대상체는 투여 전과 비교하여 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9%, 또는 100% 감소된 혈중 트리글리세리드 수준을 나타낸다.
일부 실시양태에서, 투여 후 대상체는 투여 전과 비교하여 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9%, 또는 100% 감소된 혈중 트리글리세리드 수준을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 투여 후 대상체는 투여 전과 비교하여 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 25배, 적어도 30배, 적어도 40배, 적어도 50배, 적어도 60배, 적어도 70배, 적어도 80배, 적어도 90배, 적어도 100배, 적어도 200배, 적어도 300배, 적어도 400배, 적어도 500배, 적어도 600배, 적어도 700배, 적어도 800배, 적어도 900배, 적어도 1000배, 적어도 2000배, 적어도 3000배, 적어도 4000배, 적어도 5000배, 적어도 6000배, 적어도 7000배, 적어도 8000배, 적어도 9000배, 또는 적어도 10000배 감소된 혈중 트리글리세리드 수준을 나타낸다.
포유동물에 투여되는 투여량 및 빈도(단일 또는 다중 용량)는 다양한 인자, 예를 들어 포유동물이 다른 질환을 앓고 있는지 여부, 및 그의 투여 경로; 수여자의 크기, 나이, 성별, 건강, 체중, 체질량 지수, 및 식단; 치료 중인 질환의 증상의 성질 및 정도, 동시 치료의 종류, 치료 중인 질환의 합병증 또는 기타 건강 관련 문제에 따라 달라질 수 있다. 확립된 투여량(예를 들어, 빈도 및 기간)의 조정 및 조작은 완전히 당업자의 능력 내에 있다. 본원에 개시된 것과 같은 치료는 매일 1회, 매일 2회, 격주로, 매월 또는 치료적으로 유효한 임의의 적용 가능한 기준으로 대상체에게 투여될 수 있다. 실시양태에서, 치료는 단지 필요에 따라, 예를 들어 병태 또는 질환, 예를 들어 죽상동맥경화성 혈관 질환, 고트리글리세리드혈증, 또는 당뇨병의 징후 또는 증상의 출현 시에 이루어진다.
본원에 기재된 조성물은 이를 필요로 하는 대상체에게 높은 순환 콜레스테롤 수준과 관련된 병태를 치료하기 위해 치료 유효량으로 투여될 수 있다. 본원에 기재된 조성물 및 방법을 사용하여 치료할 수 있는 높은 순환 콜레스테롤 수준과 관련된 병태에는 고콜레스테롤혈증, 상승된 총 콜레스테롤 수준, 상승된 저밀도 지단백질(LDL) 수준, 상승된 혈중 LDL-콜레스테롤 수준, 감소된 혈중 고밀도 지단백질 콜레스테롤 수준, 간 지방증, 관상 동맥 심장 질환, 혈관 질환, 허혈, 뇌졸중, 말초 혈관 질환, 혈전증, 제2형 당뇨병, 고트리글리세리드혈증, 고혈압, 죽상동맥경화증, 비만, 알츠하이머병, 신경변성 및 이들의 조합이 제한 없이 포함된다. 본원에 개시된 조성물 및 방법은 대상체에서 순환 콜레스테롤 수준을 감소시켜 병태를 치료하는 데 효과적이다. 본원에 개시된 조성물 및 방법은 투여 전과 비교하여 혈중 LDL 콜레스테롤 수준을 감소시키고/거나 혈중 트리글리세리드 수준을 감소시키는데 효과적이다.
본 개시 내용의 조성물의 독성 및 치료 효능은, 예를 들어 LD50(집단의 50%에 치명적인 용량) 및 ED50(집단의 50%에 치료적으로 효과적인 용량)을 결정하기 위해 세포 배양물 또는 실험 동물에서 표준 약학적 절차에 의해 결정될 수 있다. 독성 효과와 치료 효과 사이의 용량 비율(LD50/ED50 비율)이 치료 지수이다. 높은 치료 지수를 나타내는 작용제가 바람직하다. 작용제의 투여량은 독성이 거의 또는 전혀 없는 ED50을 포함하는 순환 농도 범위 내에 있는 것이 바람직하다. 독성 부작용을 나타내는 작용제가 사용될 수 있지만 감염되지 않은 세포에 대한 잠재적인 손상을 최소화하여 부작용을 줄이기 위해 이러한 작용제를 병에 걸린 조직 부위로 표적화하는 전달 시스템을 설계하는 데 주의를 기울여야 한다.
숙련된 기술자는 질환 또는 장애의 중증도, 이전 치료, 대상체의 건강, 성별, 체중 및/또는 나이를 비롯한 대상체의 일반적인 특징, 및 존재하는 기타 질환을 포함하지만 이에 제한되지 않는 특정 요인이 대상체를 효과적으로 치료하는데 필요한 투여량 및 투여 빈도에 영향을 줄 수 있다는 것을 이해할 것이다. 또한, 치료 유효량의 조성물로 대상체를 치료하는 것은 단일 치료를 포함할 수 있거나, 바람직하게는 일련의 치료를 포함할 수 있다. 또한, 치료에 사용되는 본 개시 내용의 조성물의 유효 투여량은 특정 치료 과정에 걸쳐 증가하거나 감소할 수 있음이 이해될 것이다. 투여량의 변화는 본원에 기재된 바와 같은 진단 분석의 결과로부터 초래하고 그로부터 명백해질 수 있다. 치료 유효 투여량은 일반적으로 투여 당시 환자의 상태에 따라 달라질 것이다. 정확한 양은 일상적인 실험에 의해 결정될 수 있지만 궁극적으로 예를 들어 질환의 징후에 대해 환자를 모니터링하고 그에 따라 치료를 조정함에 의한 임상의의 판단에 달려 있을 수 있다.
투여 빈도는 치료 과정에 걸쳐 결정되고 조정될 수 있으며, 일반적으로 반드시 그런 것은 아니지만 질환의 치료 및/또는 억제 및/또는 개선 및/또는 지연을 기반으로 한다. 대안적으로, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 지속 방출 제제가 적절할 수 있다. 지속 방출을 달성하기 위한 다양한 제제 및 장치가 당업계에 공지되어 있다. 일부 실시양태에서, 투여량은 매일, 격일로, 3일마다, 4일마다, 5일마다, 또는 6일마다이다. 일부 실시양태에서, 투여 빈도는 매주, 2주마다, 4주마다, 5주마다, 6주마다, 7주마다, 8주마다, 9주마다, 또는 10주마다 1회; 또는 매월, 2개월마다, 또는 3개월마다 1회 또는 그 이상이다. 이 요법의 진행은 종래의 기술과 분석으로 쉽게 모니터링할 수 있다.
투여 요법(본원에 개시된 조성물 포함)은 시간 경과에 따라 변할 수 있다. 일부 실시양태에서, 정상 체중의 성인 대상체의 경우, 약 0.01 내지 1000 mg/kg 범위의 용량이 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 용량은 1 내지 200 mg이다. 특정 투여 요법, 즉, 용량, 시기 및 반복은 특정 대상체 및 해당 대상체의 병력, 뿐만 아니라 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 특성(예컨대, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 반감기, 및 당업계에 잘 알려진 기타 고려사항)에 따라 결정될 것이다.
본 개시 내용의 목적을 위해, 본원에 기재된 바와 같은 조성물의 적절한 치료 투여량은 사용된 특정 작용제(또는 그의 조성물), 제형 및 투여 경로, 질환의 유형 및 중증도, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드가 예방 또는 치료 목적으로 투여되는 지의 여부, 이전 요법, 대상체의 임상 병력 및 길항제에 대한 반응, 및 주치의의 재량에 따라 결정될 것이다. 전형적으로, 임상의는 원하는 결과를 달성하는 투여량에 도달할 때까지 폴리펩티드를 투여할 것이다.
하나 이상의 조성물의 투여는 예를 들어 수여자의 생리학적 상태, 투여 목적이 치료적 또는 예방적인지 여부, 및 숙련된 의사에게 공지된 기타 요인에 따라 연속적 또는 간헐적일 수 있다. 조성물의 투여는 미리 선택된 기간에 걸쳐 본질적으로 연속적일 수 있거나, 예를 들어 질환이 발병하기 전, 발병 중 또는 발병 후에 일련의 간격을 둔 용량일 수 있다.
본원에 기재된 개시 내용의 방법 및 조성물은 그의 실시양태를 포함하여 포유동물에게 공동-투여될 수 있는 하나 이상의 추가의 치료 요법 또는 작용제 또는 치료제와 함께 투여될 수 있다.
대사 증후군 및 심혈관 질환
특히 염기를 직접 편집하는 유전자 변형의 능력은 DSB를 생성할 필요 없이 생체 내에서 유전자의 정확한 편집, 변형, 및/또는 파괴를 허용하고 인간 질환을 치료하는 개선된 방법을 허용한다. 예를 들어, 문헌[Chadwick et. al]은 시토신 염기 편집을 사용하여 성체 마우스의 Pcsk9 유전자에 넌센스 돌연변이를 도입하였다. 아데노바이러스 벡터를 통한 BE3 및 gRNA의 간으로의 전달은 혈장 PCSK9 수준을 56% 감소시켰다. 또한, 염기 편집된 마우스의 콜레스테롤 수준은 대략 30% 감소하였다. 후속 연구에서, 성체 마우스에서 Angptl3 유전자를 파괴하기 위한 시토신 염기 편집은 혈중 콜레스테롤 및 트리글리세리드 수준을 상당히 감소시켰고, 태아 마우스에서 Pcsk9 유전자 또는 Hpd 유전자를 파괴하기 위한 시토신 염기 편집은 출생 후 콜레스테롤 수준을 감소시키거나 질환 유전성 티로신혈증 1형을 치료하는 결과를 가져왔다.
심혈관 질환, 비만, 제2형 당뇨병, 대사 증후군은 하나 이상의 유사한 기저 병인을 공유할 수 있다. 인간 PCSK9 유전자는 혈류 중 콜레스테롤 양을 조절하는 데 도움이 되는 단백질을 코딩한다. 인간의 간 단백질 전구단백질 전환효소 서브틸리신/켁신 9형(PCSK9)은 분비되는 구형의 자가 활성화 세린 프로테아제로, LDL 입자의 엔도시토시스 동안 저밀도 지단백질 수용체(LDL-R)와 pH 의존적 상호작용을 연결하는 엔도솜 소포 내에서 단백질 결합 어댑터로 작용하여, LDL-R이 세포 표면으로 재활용되는 것을 방지하고 LDL-콜레스테롤 청소율을 감소시킨다. PCSK9 오솔로그는 많은 종에서 발견된다. PCSK9 단백질은 세포 표면에 도달하기 전에 저밀도 지단백질 수용체를 분해하여 혈류에 더 많은 콜레스테롤이 남을 수 있다. 결과적으로, PCSK9 유전자와 코딩된 PCSK9 단백질은 특히 혈중 콜레스테롤 수준을 낮추는 콜레스테롤 대사를 조절하는 매력적인 표적이다.
트리글리세리드(TG), 저밀도 지단백 콜레스테롤(LDL-C), 및 고밀도 지단백 콜레스테롤(HDL-C)의 감소된 혈장 수준과 관련된 다른 표적도 밝혀졌으며, 이는 심혈관 위험에 유의한 감소를 유발한다. 예를 들어, 인간 ANGPTL3은 심혈관 질환 치료를 위한 중요한 새로운 약리학적 표적으로 간주된다. 실험적 증거는 항-ANGPTL3 요법이 중요한 항-죽상동맥경화 효과를 갖는다는 것을 입증한다. 단클론 항-ANGPTL3 항체(에비나쿠맙) 및 안티센스 올리고뉴클레오티드(ASO)를 사용한 1상 임상 시험의 결과는 현저한 지질 저하 효과를 분명히 보여준다.
인간 ANGPTL3 유전자는 염색체 1p31에 위치한다. 인간 ANGPTL3 유전자의 유전적 변이체는 다양한 혈장 지질 프로파일과 연관되었다. 예를 들어, ANGPTL3 유전자의 동형접합 기능 상실(LOF: homozygous loss of function) 변이체는 모든 혈장 지단백질 수준을 크게 감소시킨다. ANGPTL3은 간에서만 독점적으로 발현되고 순환계로 분비되어 간 전구단백질 전환효소에 의해 절단된다. ANGPTL3 단백질은 독특한 신호 펩티드 서열, N-말단 나선 도메인 및 C-말단 구형 피브리노겐 상동성 도메인을 갖는 460개 아미노산(aa) 폴리펩티드이다. N-말단 코일드 코일(coiled-coil) 영역(17-207aa)은 LPL의 촉매 활성을 가역적으로 억제함으로써 혈장 TG 수준에 영향을 미치는 반면, 피브리노겐 유사 도메인(207-460aa)은 인테그린 αvβ3 수용체에 결합하고 안지오포이에틴의 기능과 유사한 혈관신생에 영향을 미친다. N- 및 C-말단 도메인 사이의 짧은 링커 영역(221-222 및 224-225)은 푸린에 의해 분할되는 것으로 확인된 특수 영역이다. 기존 결과는 절단 ANGPTL3의 단축된 형태가 LPL 및 내피 리파아제(EL)의 억제 활성을 강화할 수 있음을 보여주었으며, 이는 절단 유형의 ANGPTL3이 더 효과적으로 기능할 수 있음을 시사한다.
더욱이, 인간 아포지단백질 C-III(APOC3)는 잠재적으로 또 다른 치료 표적이 될 수 있다. APOC3은 인간에서 APOC3 유전자에 의해 코딩되는 단백질이다. APOC3은 VLDL의 구성요소이다. APOC3은 지단백 리파아제와 간 리파아제를 억제한다. 또한 트리글리세리드가 풍부한 입자의 간 흡수를 억제하는 것으로 생각된다. APOC3 수준의 증가는 고트리글리세리드혈증의 발병을 유도한다. 최근 증거는 지질이 풍부한 조건에서 간 세포로부터 트리글리세리드가 풍부한 VLDL 입자의 조립 및 분비를 촉진하는 APOC3의 세포 내 역할을 시사한다. 그러나 인간 apoC3 코딩 서열에서 자연적으로 발생하는 2개의 점 돌연변이인 A23T 및 K58E는 간 세포로부터 트리글리세리드가 풍부한 VLDL 입자의 세포 내 조립 및 분비를 제거하는 것으로 밝혀졌다.
표적 유전자를 이용한 표적화된 염기 편집은 문헌[Chadwick AC, Wang X, Musunuru K. In vivo base editing of PCSK9 (proprotein convertase subtilisin/kexin type 9) as a therapeutic alternative to genome editing. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2017, 37: 1741-7; Chadwick AC, Evitt NH, Lv W, et al. Reduced blood lipid levels with in vivo CRISPR-Cas9 base editing of ANGPTL3. Circulation, 2018, 137: 975-7; Rossidis AC, Stratigis JD, Chadwick AC, et al. In utero CRISPR-mediated therapeutic editing of metabolic genes. Nat Med, 2018, 24: 1513-8, 이들은 그 전체가 본원에 참고로 포함됨]에 기술된 바와 같이 혈관 질환 및 당뇨병과 관련되었다. CSK9를 포함하여 지질 대사에 관여하는 유전자는 현재 유전자 편집 기술에 의해 표적화되어 편집되었지만 개선된 편집 결과를 위해 이러한 유전자를 표적화하는 정확한 염기 편집이 여전히 필요하다.
약학 조성물
일부 측면에서, 본원은 본원에 제공된 바와 같은 염기 에디터 시스템 및 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
일부 측면에서, 본원은 본원에 기재된 gRNA 또는 sgRNA 및 염기 에디터 융합 단백질 또는 염기 에디터 융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 유전자 변형을 위한 약학 조성물을 제공한다. 본원에 기재된 gRNA 또는 sgRNA 및 염기 에디터 융합 단백질 또는 염기 에디터 융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 유전자 변형을 위한 조성물은 약학 조성물로 제제화될 수 있다. 약학 조성물은 활성 화합물을 약학적으로 사용될 수 있는 제제로의 가공을 용이하게 하는 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 불활성 성분을 사용하여 통상적인 방식으로 제제화된다. 본 개시 내용에 사용하기에 적합한 제제 및 전달 방법은 일반적으로 당업계에 잘 알려져 있다. 적절한 제제는 선택한 투여 경로에 따라 다르다. 본원에 기재된 약학 조성물의 요약은 예를 들어 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Nineteenth Ed (Easton, Pa.: Mack Publishing Company, 1995); Hoover, John E., Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania 1975; Liberman, H.A. and Lachman, L., Eds., Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Decker, New York, N.Y., 1980; and Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Seventh Ed. (Lippincott Williams & Wilkins 1999, 이러한 개시 내용을 위한 참고로 본원에 포함됨)에서 찾아볼 수 있다.
약학 조성물은 본원에 기재된 gRNA 또는 sgRNA와 염기 에디터 융합 단백질 또는 염기 에디터 융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열과 담체, 부형제, 결합제, 충전제, 현탁제, 향미제, 감미제, 붕해제, 분산제, 계면활성제, 윤활제, 착색제, 희석제, 가용화제, 습윤제, 가소제, 안정제, 침투 촉진제, 습윤제, 소포제, 항산화제, 방부제, 또는 이들의 하나 이상의 조합과 같은 하나 이상의 다른 화학적 성분(즉, 약학적으로 허용 가능한 성분)의 혼합물일 수 있다. 약학 조성물은 본원에 기재된 gRNA 또는 sgRNA 및 염기 에디터 융합 단백질 또는 염기 에디터 융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 이를 필요로 하는 유기체 또는 대상체에 투여하는 것을 용이하게 한다.
본 개시 내용의 약학 조성물은 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법을 사용하여 대상체에게 투여될 수 있다. 본원에 기재된 약학 조성물은 비경구, 정맥 내, 피 내, 근육 내, 결장 내, 직장 또는 복강 내를 비롯한 다양한 방식으로 대상체에게 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 약학 조성물은 대상체의 복강 내 주사, 근육 내 주사, 피하 주사, 또는 정맥 내 주사에 의해 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 약학 조성물은 비경구, 정맥 내, 근육 내, 또는 경구 투여될 수 있다.
흡입에 의한 투여를 위해, 본원에 기술된 아데노바이러스는 에어로졸, 미스트, 또는 분말로서 사용하기 위해 제제화될 수 있다. 협측 또는 설하 투여를 위해, 약학 조성물은 통상적인 방식으로 제제화된 정제, 로젠지, 또는 겔의 형태로 제제화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 아데노바이러스는 경피 제형으로 제조될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 아데노바이러스는 근육 내, 피하 또는 정맥 내 주사에 적합한 약학 조성물로 제제화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 아데노바이러스는 국소 투여될 수 있고 다양한 국소 투여 가능한 조성물, 예컨대 용액, 현탁액, 로션, 겔, 페이스트, 약용 스틱, 밤, 크림, 또는 연고로 제제화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 아데노바이러스는 관장제, 직장 겔, 직장 포말, 직장 에어로졸, 좌약, 젤리 좌약, 또는 정체 관장제와 같은 직장 조성물로 제제화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 아데노바이러스는 정제, 캡슐, 또는 수성 경구 분산액, 에멀젼, 용액, 엘릭시르, 겔, 및 시럽을 포함하는, 그러나 이에 제한되지 않는 군으로부터 선택된 수성 현탁액 또는 용액 형태의 액체와 같이 경구 투여용으로 제제화된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 gRNA 또는 sgRNA 및 II형 Cas 단백질 또는 II형 Cas 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 유전자 변형을 위한 약학 조성물은 치료제를 추가로 포함한다. 추가 치료제는 치료되는 질환, 장애 또는 병태의 상이한 측면을 조절할 수 있고 복제 적격 재조합 아데노바이러스 또는 치료제 단독의 투여보다 더 큰 전체 이익을 제공할 수 있다. 치료제는 화학 치료제, 방사선 치료제, 호르몬 치료제, 및/또는 면역 치료제를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 치료제는 방사선치료제일 수 있다. 일부 실시양태에서, 치료제는 호르몬 치료제일 수 있다. 일부 실시양태에서, 치료제는 면역치료제일 수 있다. 일부 실시양태에서, 치료제는 화학치료제이다. 추가 치료제에 대한 준비 및 투여 일정은 제조업체의 지침에 따라 또는 숙련된 의사가 경험적으로 결정한 대로 사용될 수 있다. 예를 들어, 화학요법에 대한 준비 및 투여 일정은 문헌[The Chemotherapy Source Book, 4th Edition, 2008, M. C. Perry, Editor, Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, PA]에도 설명되어 있다.
본원에 기재된 화학적으로 변형된 gRNA 또는 sgRNA 및 II형 Cas 단백질 또는 II형 Cas 단백질을 코딩하는 핵산 서열의 유전자 변형 조성물 및 본원에 기재된 방법으로 치료될 수 있는 대상체는 질환 또는 병태를 갖는 임의의 대상체일 수 있다. 예를 들어, 대상체는 동물과 같은 진핵생물 대상체일 수 있다. 일부 실시양태에서, 대상체는 포유동물, 예를 들어 인간이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 인간이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 비인간 동물이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 태아, 배아, 또는 어린이이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 침팬지, 및 기타 유인원 및 원숭이 종과 같은 비인간 영장류; 소, 말, 양, 염소, 돼지와 같은 농장 동물; 토끼, 개 및 고양이와 같은 가축; 래트, 마우스, 및 기니피그와 같은 설치류를 포함하는 실험 동물 등이다.
일부 실시양태에서, 대상체는 출산 전(예를 들어, 태아), 어린이(예를 들어, 신생아, 영아, 유아, 사춘기전), 청소년, 사춘기, 또는 성인(예를 들어, 청년, 중년, 노인)이다. 인간 대상체는 약 0개월 내지 약 120세, 또는 그 이상일 수 있다. 인간 대상체는 약 0 내지 약 12개월, 예를 들어 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12개월일 수 있다. 인간 대상체는 약 0 내지 12세, 예를 들어, 약 0 내지 30일;약 1개월 내지 12개월; 약 1세 내지 3세; 약 4세 내지 5세; 약 4세 내지 12세; 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12세일 수 있다. 인간 대상체는 약 13 내지 19세; 예를 들어, 약 13, 14, 15, 16, 17, 18, 또는 19세일 수 있다. 인간 대상체는 약 20 내지 약 39세; 예를 들어, 약 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 또는 39세일 수 있다. 인간 대상체는 약 40 내지 약 59세; 예를 들어, 약 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 또는 59세일 수 있다. 인간 대상체는 59세 초과; 예를 들어, 약 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 또는 120세일 수 있다. 인간 대상체는 남성 대상체 및/또는 여성 대상체를 포함할 수 있다.
지질 나노입자(LNP) 조성물
일부 실시양태에서, LNP는 문헌[Conway, A. et al. 2019 Mol. Ther. 27, 866-877, 및 Villiger, L. et al 2021 Nat. Biomed. Eng. 5, 179-18, 이는 참고로 포함됨]에 따라 제조된다. 일부 실시양태에서, LNP는 아미노 지질, PEG-지질로 불리는 지질에 접합된 평균 분자량 2000 Da의 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜(또는 메톡시폴리에틸렌 글리콜), 콜레스테롤 및 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC)으로 구성된다. 일부 실시양태에서, LNP는 독점 이온화 가능한 양이온성 지질, 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 콜레스테롤, 및 PEG-지질로 구성된다.
일부 실시양태에서, LNP는 약 30 - 약 160, 약 35 - 약 160, 약 40 - 약 160, 약 45 - 약 160, 약 50 - 약 160, 약 55 - 약 160, 약 60 - 약 160, 약 65 - 약 160, 약 70 - 약 160, 약 75 - 약 160, 약 80 - 약 160, 약 85 - 약 160, 약 90 - 약 160, 약 95 - 약 160, 약 100 - 약 160, 약 105 - 약 160, 약 110 - 약 160, 약 115 - 약 160, 약 120 - 약 160, 약 125 - 약 160, 약 130 - 약 160, 약 135 - 약 160, 약 140 - 약 160, 약 145 - 약 160, 약 150 - 약 160, 약 30 - 약 155, 약 30 - 약 150, 약 30 - 약 145, 약 30 - 약 140, 약 30 - 약 135, 약 30 - 약 130, 약 30 - 약 125, 약 30 - 약 120, 약 30 - 약 115, 약 30 - 약 110, 약 30 - 약 105, 약 30 - 약 100, 약 30 - 약 95, 약 30 - 약 90, 약 30 - 약 85, 약 30 - 약 80, 약 30 - 약 75, 약 30 - 약 70, 약 30 - 약 65, 약 30 - 약 60, 약 30 - 약 55, 약 30 - 약 50, 약 30 - 약 45, 약 30 - 약 40, 약 30 - 약 45, 약 35 - 약 45, 약 35 - 약 50, 약 40 - 약 50, 약 40 - 약 55, 약 45 - 약 55, 약 45 - 약 60, 약 50 - 약 60, 약 50 - 약 65, 약 55 - 약 60, 약 55 - 약 65, 약 55 - 약 70, 약 60 - 약 70, 약 60 - 약 75, 약 65 - 약 75, 약 65 - 약 80, 약 70 - 약 80, 약 70 - 약 85, 약 75 - 약 85, 약 75 - 약 90, 약 80 - 약 90, 약 80 - 약 95, 약 85 - 약 95, 약 85 - 약 100, 약 90 - 약 100, 약 90 - 약 105, 약 95 - 약 105, 약 95 - 약 110, 약 100 - 약 110, 약 100 - 약 115, 약 105 - 약 115, 약 105 - 약 120, 약 110 - 약 120, 약 110 - 약 125, 약 115 - 약 125, 약 115 - 약 130, 약 120 - 약 130, 약 120 - 약 135, 약 125 - 약 135, 약 125 - 약 140, 약 130 - 약 140, 약 130 - 약 145, 약 35 - 약 140, 약 45 - 약 130, 약 55 - 약 120, 약 65 - 약 110, 약 75 - 약 100, 또는 약 85 - 약 90 nm의 평균 유체역학적 직경을 갖는다.
일부 실시양태에서, LNP는 약 1 - 약 97, 약 5 - 약 97, 약 10 - 약 97, 약 15 - 약 97, 약 20 - 약 97, 약 25 - 약 97, 약 30 - 약 97, 약 35 - 약 97, 약 40 - 약 97, 약 45 - 약 97, 약 50 - 약 97, 약 55 - 약 97, 약 60 - 약 97, 약 65 - 약 97, 약 70 - 약 97, 약 75 - 약 97, 약 80 - 약 97, 약 1 - 약 95, 약 1 - 약 90, 약 1 - 약 85, 약 1 - 약 80, 약 1 - 약 75, 약 1 - 약 70, 약 1 - 약 65, 약 1 - 약 60, 약 1 - 약 55, 약 1 - 약 50, 약 1 - 약 45, 약 1 - 약 40, 약 1 - 약 35, 약 1 - 약 30, 약 1 - 약 25, 약 1 - 약 20, 약 1 - 약 15, 약 1 - 약 10, 약 10 - 약 30, 약 10 - 약 35, 약 15 - 약 35, 약 15 - 약 40, 약 20 - 약 40, 약 20 - 약 45, 약 25 - 약 45, 약 25 - 약 50, 약 30 - 약 50, 약 30 - 약 55, 약 35 - 약 55, 약 35 - 약 60, 약 40 - 약 60, 약 40 - 약 65, 약 45 - 약 65, 약 45 - 약 70, 약 50 - 약 70, 약 50 - 약 75, 약 55 - 약 75, 약 55 - 약 80, 또는 약 60 - 약 80%의 아미노 지질(몰%)을 포함한다.
일부 실시양태에서, LNP는 약 1 - 약 40, 약 1 - 약 38, 약 1 - 약 36, 약 1 - 약 34, 약 1 - 약 32, 약 1 - 약 30, 약 1 - 약 28, 약 1 - 약 26, 약 1 - 약 24, 약 1 - 약 22, 약 1 - 약 20, 약 1 - 약 18, 약 1 - 약 16, 약 1 - 약 14, 약 1 - 약 12, 약 1 - 약 10, 약 1 - 약 8, 약 1 - 약 6, 약 1 - 약 4, 약 1 - 약 2, 약 2 - 약 40, 약 4 - 약 40, 약 6 - 약 40, 약 8 - 약 40, 약 10 - 약 40, 약 12 - 약 40, 약 14 - 약 40, 약 16 - 약 40, 약 18 - 약 40, 약 20 - 약 40, 약 22 - 약 40, 약 24 - 약 40, 약 26 - 약 40, 약 28 - 약 40, 약 30 - 약 40, 약 32 - 약 40, 약 34 - 약 40, 약 36 - 약 40, 약 38 - 약 40, 약 2 - 약 35, 약 2 - 약 30, 약 2 - 약 25, 약 2 - 약 20, 약 2 - 약 15, 약 2 - 약 10, 약 2 - 약 8, 약 2 - 약 6, 또는 약 2 - 약 4% DSPC(몰%)를 포함한다.
일부 실시양태에서, LNP 는 약 1 - 약 20, 약 1 - 약 19, 약 1 - 약 18, 약 1 - 약 17, 약 1 - 약 16, 약 1 - 약 15, 약 1 - 약 14, 약 1 - 약 13, 약 1 - 약 12, 약 1 - 약 11, 약 1 - 약 10, 약 1 - 약 9, 약 1 - 약 8, 약 1 - 약 7, 약 1 - 약 6, 약 1 - 약 5, 약 1 - 약 4, 약 1 - 약 3, 약 2 - 약 6, 약 3 - 약 7, 약 4 - 약 8, 약 5 - 약 9, 약 6 - 약 10, 약 7 - 약 11, 약 8 - 약 12, 약 9 - 약 13, 약 10 - 약 14, 약 11 - 약 15, 약 12 - 약 16, 약 13 - 약 17, 약 14 - 약 18, 약 15 - 약 19, 또는 약 16 - 약 20% PEG-지질(몰%)을 포함한다.
일부 실시양태에서, LNP는 약 1 - 약 97, 약 5 - 약 97, 약 10 - 약 97, 약 15 - 약 97, 약 20 - 약 97, 약 25 - 약 97, 약 30 - 약 97, 약 35 - 약 97, 약 40 - 약 97, 약 45 - 약 97, 약 50 - 약 97, 약 55 - 약 97, 약 60 - 약 97, 약 65 - 약 97, 약 70 - 약 97, 약 75 - 약 97, 약 80 - 약 97, 약 1 - 약 95, 약 1 - 약 90, 약 1 - 약 85, 약 1 - 약 80, 약 1 - 약 75, 약 1 - 약 70, 약 1 - 약 65, 약 1 - 약 60, 약 1 - 약 55, 약 1 - 약 50, 약 1 - 약 45, 약 1 - 약 40, 약 1 - 약 35, 약 1 - 약 30, 약 1 - 약 25, 약 1 - 약 20, 약 1 - 약 15, 약 1 - 약 10, 약 10 - 약 30, 약 10 - 약 35, 약 15 - 약 35, 약 15 - 약 40, 약 20 - 약 40, 약 20 - 약 45, 약 25 - 약 45, 약 25 - 약 50, 약 30 - 약 50, 약 30 - 약 55, 약 35 - 약 55, 약 35 - 약 60, 약 40 - 약 60, 약 40 - 약 65, 약 45 - 약 65, 약 45 - 약 70, 약 50 - 약 70, 약 50 - 약 75, 약 55 - 약 75, 약 55 - 약 80, 또는 약 60 - 약 80%의 콜레스테롤(몰%)을 포함한다
일부 실시양태에서, LNP는 약 1 - 약 97, 5 - 약 97, 10 - 약 97, 15 - 약 97, 20 - 약 97, 25 - 약 97, 30 - 약 97, 35 - 약 97, 40 - 약 97, 45 - 약 97, 50 - 약 97, 55 - 약 97, 60 - 약 97, 65 - 약 97, 70 - 약 97, 75 - 약 97, 80 - 약 97, 1 - 약 95, 1 - 약 90, 1 - 약 85, 1 - 약 80, 1 - 약 75, 1 - 약 70, 1 - 약 65, 1 - 약 60, 1 - 약 55, 1 - 약 50, 1 - 약 45, 1 - 약 40, 1 - 약 35, 1 - 약 30, 1 - 약 25, 1 - 약 20, 1 - 약 15, 1 - 약 10, 10 - 약 30, 10 - 약 35, 15 - 약 35, 15 - 약 40, 20 - 약 40, 20 - 약 45, 25 - 약 45, 25 - 약 50, 30 - 약 50, 30 - 약 55, 35 - 약 55, 35 - 약 60, 40 - 약 60, 40 - 약 65, 45 - 약 65, 45 - 약 70, 50 - 약 70, 50 - 약 75, 55 - 약 75, 55 - 약 80, 또는 60 - 약 80%의 아미노 지질; 1 - 약 40, 1 - 약 38, 1 - 약 36, 1 - 약 34, 1 - 약 32, 1 - 약 30, 1 - 약 28, 1 - 약 26, 1 - 약 24, 1 - 약 22, 1 - 약 20, 1 - 약 18, 1 - 약 16, 1 - 약 14, 1 - 약 12, 1 - 약 10, 1 - 약 8, 1 - 약 6, 1 - 약 4, 1 - 약 2, 2 - 약 40, 4 - 약 40, 6 - 약 40, 8 - 약 40, 10 - 약 40, 12 - 약 40, 14 - 약 40, 16 - 약 40, 18 - 약 40, 20 - 약 40, 22 - 약 40, 24 - 약 40, 26 - 약 40, 28 - 약 40, 30 - 약 40, 32 - 약 40, 34 - 약 40, 36 - 약 40, 38 - 약 40, 2 - 약 35, 2 - 약 30, 2 - 약 25, 2 - 약 20, 2 - 약 15, 2 - 약 10, 2 - 약 8, 2 - 약 6, 또는 2 - 약 4% DSPC; 1 - 약 20, 1 - 약 19, 1 - 약 18, 1 - 약 17, 1 - 약 16, 1 - 약 15, 1 - 약 14, 1 - 약 13, 1 - 약 12, 1 - 약 11, 1 - 약 10, 1 - 약 9, 1 - 약 8, 1 - 약 7, 1 - 약 6, 1 - 약 5, 1 - 약 4, 1 - 약 3, 2 - 약 6, 3 - 약 7, 4 - 약 8, 5 - 약 9, 6 - 약 10, 7 - 약 11, 8 - 약 12, 9 - 약 13, 10 - 약 14, 11 - 약 15, 12 - 약 16, 13 - 약 17, 14 - 약 18, 15 - 약 19, 및 약 16 - 약 20% PEG-지질, 나머지는 콜레스테롤(모두 몰%)을 포함한다.
아미노 지질
아미노 지질, 인지질, PEG지질, 콜레스테롤 또는 이의 유도체, 페이로드, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 LNP 조성물이 본원에 기재된다. 일부 실시양태에서, LNP 조성물은 아미노 지질을 포함한다. 한 측면에서, 화학식 (I)의 구조를 갖는 아미노 지질, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 또는 용매화물이 본원에 개시된다.
Figure pct00058
여기서
각각의 R1 및 R2는 독립적으로 C7-C22 알킬, C7-C22 알케닐, C3-C8 시클로알킬,- C2-C10 알킬렌 -L-R6, 또는
Figure pct00059
이며, 여기서 각각의 알킬, 알킬렌, 알케닐, 및 시클로알킬은 독립적으로 치환 또는 비치환되며;
각각의 X, Y, 및 Z는 독립적으로 -C(=O)NR4-, -NR4C(=O)-, -C(=O)O-, -OC(=O)-, -OC(=O)O-, -NR4C(=O)O-, -OC(=O)NR4-, -NR4C(=O)NR4-, -NR4C(=NR4)NR4-, -C(=S)NR4-, -NR4C(=S)-, -C(=O)O-, -OC(=S)-, OC(=S)O-, -NR4C(=S)O-, -OC(=S)NR4-, -NR4C(=S)NR4-, -C(=O)S-, -SC(=O)-, -OC(=O)S-, -NR4C(=O)S-. -SC(=O)NR4-, -C(=S)S-, -SC(=S)-, -SC(=S)O-, -NR4C(=S)S-, -SC(=S)NR4-, -C(=S)S-, -SC(=S)-, -SC(=O)S-, -SC(=S)S-, -NR4C(=S)S-, - SC(=S)NR4- O, S, 또는 결합이며;
각각의 L은 독립적으로 -C(=O)NR4-, -NR4C(=O)-, -C(=O)O-. -OC(=O)O-, -NR4C(=O)O-, -OC(=O)NR4-, -NR4C(=O)NR4-, -NR4C(=NR4)NR4-, -C(=S)NR4-, -NR4C(=S)-, -C(=O)O-, -OC(=S)-, OC(=S)O-, -NR4C(=S)O-, -OC(=S)NR4-, -NR4C(=S)NR4-, -C(=O)S-, SC(=O)-, -OC(=O)S-, -NR4C(=O)S-, -SC(=O)NR4-, -C(=S)S-, -SC(=S)-, -SC(=S)O-, - NR4C(=S)S-, -SC(=S)NR4-, -C(=S)S-, -SC(=S)-, -SC(=O)S-, -SC(=S)S-, -NR4C(=S)S-, - SC(=S)NR4-, O, S, -C1-C10 알킬렌-O-, -C1-C10 알킬렌-C(=O)O-, -C1-C10 알킬렌-OC(=O)-, 또는 결합이며, 여기서 알킬렌은 치환 또는 비치환되며;
R3은 -C0-C10 알킬렌-NR7R8, -C0-C10 알킬렌-헤테로시클로알킬, 또는 -C0-C10 알킬렌-헤테로시킬로아릴이며,
여기서 알킬렌, 헤테로시클로알킬 및 헤테로시클로아릴은 독립적으로 치환 또는 비치환되며; 각각의 R4는 독립적으로 수소 또는 치환 또는 비치환된 C1-C6 알킬이며;
R5는 수소 또는 치환 또는 비치환된 C1-C6 알킬이며;
각각의 R6은 독립적으로 치환 또는 비치환된 C3-C22 알킬 또는 치환 또는 비치환된 C3-C22 알케닐이며;
각각의 R7 및 R8은 독립적으로 수소 또는 치환 또는 비치환된 C1-C6 알킬이거나, R7 및 R8은 이들이 부착되는 질소와 함께 취해질 때 치환 또는 비치환된 C2-C6 헤테로시클릴을 형성하며;
p는 1 내지 10으로부터 선택된 정수이며;
각각의 n, m, 및 q는 독립적으로 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5이다.
화학식 (I)의 실시양태에서, 구조가 하나 초과의 비대칭 C-원자를 보유하는 경우, 각각의 비대칭 C-원자는 독립적으로 라세미, 키랄적으로 순수한 R 및/또는 키랄적으로 순수한 S 이성질체, 또는 이들의 조합을 나타낸다.
일부 실시양태에서, 화학식 (I)에서 각각의 n, m, 및 q는 독립적으로 0, 1, 2, 또는 3이다. 일부 실시양태에서, 화학식 (I)에서 각각의 n, m, 및 q는 1이다.
일부 실시양태에서, 화학식 (I)의 화합물은 화학식 (Ia)의 구조, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 또는 약학적으로 허용 가능한 용매화물을 갖는다:
Figure pct00060
여기서
각각의 R1 및 R2는 독립적으로 C7-C22 알킬, C7-C22 알케닐, C3-C8 시클로알킬, -C2-C10 알킬렌-L-R6, 또는
Figure pct00061
이며, 여기서 각각의 알킬, 알킬렌, 알케닐, 및 시클로알킬은 독립적으로 치환 또는 비치환되며;
각각의 X, Y, 및 Z는 독립적으로 C(=O)NR4-, -NR4C(D)-, -C(=O)O-, -OC(=O)-, -OC(=O)O-, - NR4C(=O)O-, -OC(=O)NR4-, -NR4C=O)NR4-, -NR4C(=NR4)NR4-. -C(=S)NR4-, -NR4C(=S)-, -C(E)O-, -OC(=S)-, OC(=S)O-, -NR4C(=S)O-, -OC(=S)NR4-, -NR4C(=S)NR4-, -C(=O)S-, -SC(=O)-, -OC(=O)S-, -NR4C(=O)S-, -SC(=O)NR4- -C(=S)S-, -SC(=S)-, -SC(=S)O-, - NR4C(=S)S-, -SC(=S)NR4-, -C(=S)S-. -SC(=S)-, -SC(=O)S-, -SC(=S)S-. -NR4C(=S)S-, - SC(=S)NR4-, O, S, -C1-C10 알킬렌-O-, 또는 결합이며, 여기서 알킬렌은 치환 또는 비치환되며;
각각의 L은 독립적으로 -C(=O)NR4-, -NR4C(=O)-, -C(=O)O-, -OC(=O)-, -OC(=O)O-, - NR4C(=O)O-, -OC(=O)NR4-, -NR4C(=O)NR4-, -NR4C(=NR4)NR4-. -C(=S)NR4-, -NR4C(=S)-, -C(=O)O-, -OC(=S)-, OC(=S)O-, -NR4C(=S)O-, -OC(=S)NR4-, -NR4C(=S)NR4-, -C(=O)S-, -SC(=O)-, -OC(=O)S-, -NR4C(=O)S-, -SC(=O)NR4- -C(=S)S-, -SC(=S)-, -SC(=S)O-, -NR4C(=S)S-, -SC(=S)NR4-, -C(=S)S-, -SC(=S)-, -SC(=O)S-, -SC(=S)S-, -NR4C(=S)S-, - SC(=S)NR4-, O, S. -C1-C10 알킬렌-O-, -C1-C10 알킬렌-C(=O)O-, -C1-C10 알킬렌- OC(=O)-, 또는 결합이며, 여기서 알킬렌은 치환 또는 비치환되며;
R3은 - C0-C10 알킬렌-NR7R8, - C0-C10 알킬렌-헤테로시클로알킬, 또는 - C0-C10 알킬렌-헤테로시클로아릴이며, 여기서 알킬렌, 헤테로시클로알킬 및 헤테로시킬로아릴은 독립적으로 치환 또는 비치환되며;
각각의 R4는 독립적으로 수소 또는 치환 또는 비치환된 C1-C6 알킬이며;
R5는 수소 또는 치환 또는 비치환된 C1-C6 알킬이며;
각각의 R6은 독립적으로 치환 또는 비치환된 C3-C22 알킬 또는 치환 또는 비치환된 C3-C22 알케닐이며;
각각의 R7 및 R8은 독립적으로 수소 또는 치환 또는 비치환된 C1-C6 알킬이거나, R7 및 R8은 이들이 부착되는 질소와 함께 취해져 치환 또는 비치환된 C2-C6 헤테로시클릴을 형성하며;
p는 1 내지 10으로부터 선택된 정수이다.
화학식 (la)의 일부 실시양태에서, 구조가 하나 초과의 비대칭 C-원자를 보유하는 경우, 각각의 비대칭 C-원자는 독립적으로 라세미, 키랄적으로 순수한 R 및/또는 키랄적으로 순수한 S 이성질체, 또는 이들의 조합을 나타낸다.
일부 실시양태에서, 화학식 (I) 및 화학식 (Ia)에서 R1 및 R2는 독립적으로 C7-C22 알킬, C7-C22 알케닐, -C2-C10 알킬렌-L- R6, 또는
Figure pct00062
이며, 여기서 각각의 알킬, 알킬렌, 알케닐, 및 시클로알킬은 독립적으로 치환 또는 비치환된다. 일부 실시양태에서, 화학식 (I) 및 화학식 (Ia)에서 R1 및 R2는 독립적으로 C10-C20 알킬, C10-C20 알케닐. - C8-C7 알킬렌-L- R6, 또는
Figure pct00063
이며, 여기서 각각의 알킬, 알킬렌, 알케닐, 및 시클로알킬은 독립적으로 치환 또는 비치환된다. 일부 실시양태에서, 화학식 (I) 및 화학식 (Ia)에서 R1은
Figure pct00064
이다.
일부 실시양태에서, 화학식 (I) 및 화학식 (Ia)에서 각각의 L은 독립적으로 O, S, -C1-C10 알킬렌-O-, - C1-C10 알킬렌-C(=O)O-, - C1-C10 알킬렌-OC(=O)-, 또는 결합이며, 여기서 알킬렌은 치환 또는 비치환된다. 일부 실시양태에서, 화학식 (I) 및 화학식 (Ia)에서 각각의 L은 독립적으로 O, S, - C1-C3 알킬렌-O-, - C1-C3 알킬렌-C(=O)O-, - C1-C3 알킬렌-OC(=O)-, 또는 결합이며. 여기서 알킬렌은 치환 또는 비치환된다. 일부 실시양태에서, 화학식 (I) 및 화학식 (Ia)에서 각각의 L은 독립적으로 O, S, - C1-C3 알킬렌-O-, - C1-C3 알킬렌-C(=O)O-, -C1-C3 알킬렌-OC(=O)-, 또는 결합이며, 여기서 알킬렌은 선형 또는 분지형 비치환된 알킬렌이다.
일부 실시양태에서, 화학식 (I) 및 화학식 (Ia)에서, 각각의 R6은 독립적으로 치환 또는 비치환된 선형 C3-C22 알킬 또는 치환 또는 비치환된 선형 C3-C22 알케닐이다. 일부 실시양태에서, 화학식 (I) 및 화학식 (Ia)에서 각각의 R6은 독립적으로 치환 또는 비치환된 C3-C20 알킬 또는 치환 또는 비치환된 C3-C20 알케닐이다. 일부 실시양태에서, 화학식 (I) 및 화학식 (Ia)에서 각각의 R6은 독립적으로 치환 또는 비치환된 C3-C10 알킬 또는 치환 또는 비치환된 C3-C10 알케닐이다. 일부 실시양태에서, 화학식 (I) 및 화학식 (Ia)에서 각각의 R6은 독립적으로 치환 또는 비치환된 C3-C10 알킬이다. 일부 실시양태에서, 화학식 (I) 및 화학식 (Ia)에서 각각의 R6은 독립적으로 치환 또는 비치환된 선형 C3-C10 알킬이다. 일부 실시양태에서, 화학식 (I) 및 화학식 (Ia)에서 각각의 R6은 독립적으로 치환 또는 비치환된 n-펜틸, n-헥실, n-헵틸, n-옥틸, n-노닐, n-데실, n-운데실, 또는 n-도데실이다. 일부 실시양태에서, 화학식 (I) 및 화학식 (Ia)에서 각각의 R6은 독립적으로 치환 또는 비치환된 n-옥틸이다. 일부 실시양태에서, 화학식 (I) 및 화학식 (Ia)에서 각각의 R6은 n-옥틸이다.
일부 실시양태에서, 화학식 (I) 및 화학식 (Ia)에서 각각의 L은 독립적으로 -C(=O)O-, -OC(=O)-, -C1-C10 알킬렌-O-, 또는 O이다. 일부 실시양태에서, 화학식 (I) 및 화학식 (Ia)에서 각각의 L은 O이다. 일부 실시양태에서, 화학식 (I) 및 화학식 (Ia)에서 각각의 L은 -C1-C3 알킬렌-O-이다. 일부 실시양태에서, 화학식 (I) 및 화학식 (Ia)에서 p는 1, 2, 3, 4, 또는 5이다. 일부 실시양태에서, 화학식 (I) 및 화학식 (Ia)에서 p는 2이다.
일부 실시양태에서, 화학식 (I) 및 화학식 (Ia)에서 R1은 다음이다:
Figure pct00065
일부 실시양태에서, 화학식 (I) 및 화학식 (Ia)에서 각각의 R4는 독립적으로 H 또는 치환 또는 비치환된 C1-C4 알킬이다. 일부 실시양태에서, 화학식 (I) 및 화학식 (Ia)에서 각각의 R4는 독립적으로 치환 또는 비치환된 선형 C1-C4 알킬이다. 일부 실시양태에서, 화학식 (I) 및 화학식 (Ia)에서 각각의 R4는 H이다. 일부 실시양태에서, 화학식 (I) 및 화학식 (Ia)에서 각각의 R4는 독립적으로 H, -CH3, -CH2CH3, -CH2CH2CH3, 또는 -CH(CH3)2이다. 일부 실시양태에서, 화학식 (I) 및 화학식 (Ia)에서 각각의 R4는 독립적으로 H 또는 -CH3.이다. 일부 실시양태에서, 화학식 (I) 및 화학식 (Ia)에서 각각의 R4는 -CH3이다.
일부 실시양태에서, 화학식 (I) 및 화학식 (Ia)에서 X는 -C(=O)O- 또는 -OC(=O))-이다. 일부 실시양태에서, 화학식 (I) 및 화학식 (Ia)에서 X는 -C(=O)NR4- 또는 -NR4C(=O)-. 일부 실시양태에서, 화학식 (I) 및 화학식 (Ia)에서 X는 -C(=O)N(CH3)-, -N(CH3)C(=O)-, -C(=O)NH-, 또는 -NHC(=O)-이다. 일부 실시양태에서, 화학식 (I) 및 화학식 (Ia)에서 X는 -C(=O))NH-, -C(=O)N(CH3)-. -OC(=O))-, -NHC(=O)-, -N(CH3)C(=O))-, -C(=O)O-, -OC(=O)O-, -NHC(=O)O-, -N(CH3)C(=O)O-, - OC(=O))NH-, -OC(=O)N(CH3)-, -NHC(=O)NH-, -N(CH3)C(=O))NH-, -NHC(=O)N(CH3)-, - N(CH3)C(=O)N(CH3)-, NHC(=NH)NH-, -N(CH3)C(=NH)NH-, -NHC(=NH)N(CH3)-, - N(CH3)C(=NH)N(CH3)-, NHC(=NMe)NH-, -N(CH3)C(=NMe)NH-, -NHC(=NMe)N(CH3)-, 또는 - N(CH3)C(=NMe)N(CH3)-이다.
일부 실시양태에서, 화학식 (I) 및 화학식 (Ia)에서 R2는 C7-C22 알킬, C7-C22 알케닐, - C2-C10 알킬렌-L- R6, 또는
Figure pct00066
이며, 여기서 각각의 알킬, 알킬렌, 알케닐, 및 시클로 알킬은 독립적으로 치환 또는 비치환된다. 일부 실시양태에서, 화학식 (I) 및 화학식 (Ia)에서 R2는 치환 또는 비치환된 C7-C22 알킬 또는 치환 또는 비치환된 C7-C22 알케닐이다. 일부 실시양태에서, 화학식 (I) 및 화학식 (Ia)에서 R2는 치환 또는 비치환된 선형 C7-C22 알킬 또는 치환 또는 비치환된 선형 C7-C22 알케닐이다. 일부 실시양태에서, 화학식 (I) 및 화학식 (Ia)에서 R2는 치환 또는 비치환된 C10-C20 알킬 또는 치환 또는 비치환된 C10-C20 알케닐이다. 일부 실시양태에서, 화학식 (I) 및 화학식 (Ia)에서 R2는 비치환된 C10-C20 알킬이다. 일부 실시양태에서, 화학식 (I) 및 화학식 (Ia)에서 R2는 비치환된 C10-C20 알케닐이다. 일부 실시양태에서, 화학식 (I) 및 화학식 (Ia)에서 R2는 -C2-C10 알킬렌-L- R6이다. 일부 실시양태에서, 화학식 (I) 및 화학식 (Ia)에서 R2는 -C2-C10 알킬렌- C(=O)O- R6 또는 -C2-C10 알킬렌-OC(=O)- R6이다.
일부 실시양태에서, 화학식 (I) 및 화학식 (Ia)에서 R2는 다음이다:
Figure pct00067
일부 실시양태에서, 화학식 (I) 및 화학식 (Ia)에서 Y는 -C(=O)O- 또는 -OC(=O)-이다. 일부 실시양태에서, 화학식 (I) 및 화학식 (Ia)에서 Y는 -C(=O)NR4- 또는 -NR4C(=O)-이다. 일부 실시양태에서, 화학식 (I) 및 화학식 (Ia)에서 Y는 -C(=O)N(CH3)-, -N(CH3)C(=O)-, -C(=O)NH-, 또는 -NHC(=O)-이다. 일부 실시양태에서, 화학식 (I) 및 화학식 (Ia)에서 Y는 -OC(=O)O-, -NR4C(=O)O-, -OC(=O)NR4-, 또는 -NR4C(=O)NR4-. 일부 실시양태에서, 화학식 (I) 및 화학식 (Ia)에서 Y는 - OC(=O)O-, -NHC(=O)O-, -OC(=O)NH-, -NHC(=O)NH-, -N(CH3)C(=O)O-. -OC(=O)N(CH3)-, - N(CH3)C(=O)N(CH3)- 또는 -N(CH3)C(=O)NH-이다. 일부 실시양태에서, 화학식 (I) 및 화학식 (Ia)에서 Y는 -OC(=O)O-, -NHC(=O)0-, -OC(=O)NH-, 또는 -NHC(=O)NH-이다.
일부 실시양태에서, 화학식 (I) 및 화학식 (Ia)에서 R3은 -C0-C10 알킬렌-NR7R8 또는 -C0-C10 알킬렌-헤테로시클로알킬이며, 여기서 알킬렌 및 헤테로시클로알킬은 독립적으로 치환 또는 비치환된다. 일부 실시양태에서, 화학식 (I) 및 화학식 (Ia)에서 R3은 -C0-C10 알킬렌-NR7R8이다. 일부 실시양태에서, 화학식 (I) 및 화학식 (Ia)에서 R3은 -C1-C6 알킬렌-NR7R8이다. 일부 실시양태에서, 화학식 (I) 및 화학식 (Ia)에서 R3은 - C1-C4 알킬렌-NR7R8이다. 일부 실시양태에서, 화학식 (I) 및 화학식 (Ia)에서 R3은 -C1- 알킬렌-NR7R8이다. 일부 실시양태에서, 화학식 (I) 및 화학식 (Ia)에서 R3은 -C2-- 알킬렌-NR7R8이다. 일부 실시양태에서, 화학식 (I) 및 화학식 (Ia)에서 R3은 -C3- 알킬렌-NR7R8이다. 일부 실시양태에서, 화학식 (I) 및 화학식 (Ia)에서 R3은 -C4- 알킬렌- NR7R8이다. 일부 실시양태에서, 화학식 (I) 및 화학식 (Ia)에서 R3은 -C5- 알킬렌-NR7R8이다. 일부 실시양태에서, 화학식 (I) 및 화학식 (Ia)에서 R3은 - C0-C10 알킬렌-헤테로시클로알킬이다. 일부 실시양태에서, 화학식 (I) 및 화학식 (Ia)에서 R3은 - C1-C6 알킬렌-헤테로시클로알킬이며, 여기서 헤테로시클로알킬은 1 내지 3개의 질소 및 0-2개의 산소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학식 (I) 및 화학식 (Ia)에서 R3은 -C1-C6 알킬렌-헤테로시클로아릴이다.
일부 실시양태에서, 화학식 (I) 및 화학식 (Ia)에서 각각의 R7 및 R8은 독립적으로 수소 또는 치환 또는 비치환된 C1-C6 알킬 이다. 일부 실시양태에서, 화학식 (I) 및 화학식 (Ia)에서 각각의 R7 및 R8은 독립적으로 수소 또는 치환 또는 비치환된 C1-C3 알킬이다. 화학식 (I) 및 화학식 (Ia)에서 각각의 R7 및 R8은 독립적으로 치환 또는 비치환된 C1-C3 알킬 이다. 화학식 (I) 및 화학식 (Ia)에서 각각의 R7 및 R8은 독립적으로 -CH3, -CH2CH3, -CH2CH2CH3, 또는 -CH(CH3)2 이다. 화학식 (I) 및 화학식 (Ia)에서 각각의 R7 및 R8은 CH3 이다. 화학식 (I) 및 화학식 (Ia)에서 각각의 R7 및 R8은 -CH2CH3이다.
일부 실시양태에서, 화학식 (I) 및 화학식 (Ia)에서 R7 및 R8은 이들이 부착되는 질소와 함께 취해져 치환 또는 비치환된 C2-C6 헤테로시클릴을 형성한다. 일부 실시양태에서, 화학식 (I) 및 화학식 (Ia)에서 R7 및 R8은 이들이 부착되는 질소와 함께 취해져 치환 또는 비치환된 C2-C6 헤테로시클로알킬을 형성한다. 일부 실시양태에서, 화학식 (I) 및 화학식 (Ia)에서 각각의 R7 및 R8은 이들이 부착되는 질소와 함께 취해져 치환 또는 비치환된 3-7원 헤테로시클로알킬을 형성한다.
일부 실시양태에서, 화학식 (I) 및 화학식 (Ia)에서 R3은 다음이다:
Figure pct00068
일부 실시양태에서, 화학식 (I) 및 화학식 (Ia)에서 R3은 다음이다:
Figure pct00069
일부 실시양태에서, 화학식 (I) 및 화학식 (Ia)에서 R3은 다음이다:
Figure pct00070
일부 실시양태에서, 화학식 (I) 및 화학식 (Ia)에서 Z는 -C(=O)O- 또는 -OC(=O)-이다. 일부 실시양태에서, 화학식 (I) 및 화학식 (Ia)에서 Z는 -C(=O)NR4- 또는 -NR4C(=O)-이다. 일부 실시양태에서, 화학식 (I) 및 화학식 (Ia)에서 Z는 -C(=O)N(CH3)-, -N(CH3)C( =O)-, -C(=O)NH-, 또는 -NHC(=O)-이다. 일부 실시양태에서, 화학식 (I) 및 화학식 (Ia)에서 Z는 -OC(=O)O-, -NR4C(=O)O-, -OC(O)NR4-, 또는 -NR4C(=O)NR4-이다. 일부 실시양태에서, 화학식 (I) 및 화학식 (Ia)에서 Z는 -OC(=O)O-, - NHC(=O)O-, -OC(=O)NH-, -NHC(=O)NH-, -N(CH3)C(=O)O-, -OC(=O)N(CH3)-, - N(CH3)C(=O)N(CH3)-, -NHC(=O)N(CH3)- 또는 -N(CH3)C(=O)NH-이다. 일부 실시양태에서, 화학식 (I) 및 화학식 (Ia)에서 Y는 -OC(=O)O-, -NHC(=O)O-, -OC(=O)NH-, 또는 -NHC(=O)NH-이다.
일부 실시양태에서, 화학식 (I) 및 화학식 (Ia)에서 R5는 수소 또는 치환 또는 비치환된 C1-C3 알킬이다. 일부 실시양태에서, 화학식 (I) 및 화학식 (Ia)에서 R5는 H, -CH3, - CH-)CH3, -CH2CH2CH3, 또는 -CH(CH3)2이다. 일부 실시양태에서, 화학식 (I) 및 화학식 (Ia)에서 R5는 H이다.
일부 실시양태에서, LNP는 복수의 아미노 지질을 포함한다. 예를 들어, LNP 조성물은 2, 3, 4, 5, 6.7, 8, 9. 10가지 이상의 아미노 지질을 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, LNP 조성물은 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 9, 적어도 10, 또는 적어도 20가지 아미노 지질을 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, LNP 조성물은 최대 2, 최대 3, 최대 4, 최대 5, 최대 6, 최대 7, 최대 9, 최대 10, 최대 20, 또는 최대 30가지 아미노 지질을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, LNP 조성물은 제1 아미노 지질을 포함한다. 일부 실시양태에서, LNP 조성물은 제1 아미노 지질 및 제2 아미노 지질을 포함한다. 일부 실시양태에서, LNP 조성물은 제1 아미노 지질, 제2 아미노 지질, 및 제3 아미노 지질을 포함한다. 일부 실시양태에서, LNP 조성물은 제1 아미노 지질, 제2 아미노 지질, 제3 아미노 지질, 및 제4 아미노 지질을 포함한다. 일부 실시양태에서, LNP 조성물은 제4 아미노 지질을 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, LNP 조성물은 제3 아미노 지질을 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 제1 아미노 지질 대 제2 아미노 지질의 몰비는 약 0.1 내지 약 10이다. 일부 실시양태에서, 제1 아미노 지질 대 제2 아미노 지질의 몰비는 약 0.20 내지 약 5이다. 일부 실시양태에서, 제1 아미노 지질 대 제2 아미노 지질의 몰 비는 약 0.25 내지 약 4이다. 일부 실시양태에서, 제1 아미노 지질 대 제2 아미노 지질의 몰비는 약 0.25, 약 0.33, 약 0.5, 약 1, 약 2, 약 3, 또는 약 4이다.
일부 실시양태에서, 제1 아미노 지질:제2 아미노 지질: 제3 아미노 지질의 몰비는 약 4:1:1이다. 일부 실시양태에서, 제1 아미노 지질:제2 아미노 지질: 제3 아미노 지질의 몰비는 약 1:1:1이다. 일부 실시양태에서, 제1 아미노 지질:제2 아미노 지질: 제3 아미노 지질의 몰비는 약 2:1:1이다. 일부 실시양태에서, 제1 아미노 지질:제2 아미노 지질: 제3 아미노 지질의 몰비는 약 2:2:1이다. 일부 실시양태에서, 제1 아미노 지질:제2 아미노 지질: 제3 아미노 지질의 몰비는 약 3:2:1이다. 일부 실시양태에서, 제1 아미노 지질:제2 아미노 지질: 제3 아미노 지질의 몰비는 약 3:1:1이다. 일부 실시양태에서, 제1 아미노 지질:제2 아미노 지질: 제3 아미노 지질의 몰비는 약 5:1:1이다. 일부 실시양태에서, 제1 아미노 지질:제2 아미노 지질: 제3 아미노 지질의 몰비는 약 3:3:1이다. 일부 실시양태에서, 제1 아미노 지질:제2 아미노 지질: 제3 아미노 지질의 몰비는 약 4:4:1이다.
일부 실시양태에서, LNP 조성물은 하나 이상의 아미노 지질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 아미노 지질은 입자에 존재하는 총 지질의 약 40 몰% 내지 약 65 몰%를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 아미노 지질은 입자에 존재하는 총 지질의 약 40 몰%, 약 41 몰%, 약 42 몰%, 약 43 몰%, 약 44 몰%, 약 45 몰%, 약 46 몰%, 약 47 몰%, 약 48 몰%, 약 49 몰%, 약 50 몰%, 약 51 몰%, 약 52 몰%, 약 53 몰%, 약 54 몰%, 약 55 몰%, 약 56 몰%, 약 57 몰%, 약 58 몰%, 약 59 몰%, 약 60 몰%, 약 61 몰%, 약 62 몰%, 약 63 몰%, 약 64 몰%, 또는 약 65 몰%를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 아미노 지질은 입자에 존재하는 총 아미노 지질의 약 1 몰% 내지 약 99 몰%를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 아미노 지질은 입자에 존재하는 총 아미노 지질의 약 16.7 몰% 내지 약 66.7 몰%를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 아미노 지질은 입자에 존재하는 총 아미노 지질의 약 20 몰% 내지 약 60 몰%를 포함한다.
일부 실시양태에서, 아미노 지질은 이온화 가능한 지질이다. 이온화 가능한 지질은 하나 이상의 이온화 가능한 질소 원자를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 이온화 가능한 질소 원자 중 적어도 하나는 양전하를 띤다. 일부 실시양태에서, LNP 조성물에서 이온화 가능한 질소 원자의 적어도 10 몰%, 20 몰%, 30 몰%, 40 몰%, 50 몰%, 60 몰%, 70 몰%, 80 몰%. 90 몰%, 95 몰%, 또는 99 몰%는 양전하를 띤다. 일부 실시양태에서, 아미노 지질은 1차 아민, 2차 아민, 3차 아민, 이민, 아미드, 구아니딘 모이어티, 히스티딘 잔기, 리신 잔기, 아르기닌 잔기, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 아미노 지질은 1차 아민, 2차 아민, 3차 아민, 구아니딘 모이어티, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 아미노 지질은 3차 아민을 포함한다.
일부 실시양태에서, 아미노 지질은 양이온성 지질이다. 일부 실시양태에서, 아미노 지질은 이온화 가능한 지질이다. 일부 실시양태에서, 아미노 지질은 하나 이상의 질소 원자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 아미노 지질은 하나 이상의 이온화 가능한 질소 원자를 포함한다. 예시적인 양이온성 및/또는 이온화 가능한 지질은 3-(디도데실아미노)-N1,N1,4-트리도데실-1-피페라진에탄 아민(KL10), N142-(디도데실아미노)에틸]-N1,N4,N4-트리도데실-1,4-피페라진디에탄아민(KL22), 14,25-디트리데실-15,18,21,24-테트라아자-옥타트리아콘탄(KL25), 1,2-디리놀레일옥시-N,N-디메틸아미노프로판(DLin-DMA), 2,2-디리놀레일-4-디메틸아미노메틸-[1,3]-디옥솔란(DLin-K-DMA), 헵타트리아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-일 4-(디메틸아미노)부타노에이트(DLin- MC 3-DMA), 2,2-딜리놀레일-4-(2-디메틸아미노에틸)-[1,3]-디옥솔란(DLin-KC2-DMA), 1,2-디올레일옥시-N,N-디메틸아미노프로판(DODMA), 2-({8-[(3β)-콜레스트-5-엔-3-일옥시]옥틸}옥시)-N,N-디메틸1-3-[(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일옥시]프로판-1-아민(옥틸-CLinDMA), (2R)-2-({8-[(3β)-콜레스트-5-엔-3-일옥시]옥틸}옥시)-N,N-디메틸-3-[(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일옥시]프로판-1-아민(옥틸-CLinDMA(2R)), 및 (2S)-2-({8-[(3β)-콜레스트-5-엔-3-일옥시]옥틸}옥시)-N,N-디메틸-3-[(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일옥시]프로판-1-아민(옥틸-CLinDMA(2S))를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 아미노 지질은 약학적으로 허용 가능한 염과 같은 염의 형태를 취할 수 있다. 아미노 지질의 모든 약학적으로 허용 가능한 염은 본 개시 내용에 포함된다. 본원에 사용되는 바와 같이, 아미노 지질은 또한 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 및 이의 부분입체이성질체, 거울상이성질체 및 에피머 형태를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 아미노 지질은 하나 이상의 입체중심을 보유하고 각각의 입체중심은 R 또는 S 배열로 독립적으로 존재한다. 본원에 제시된 지질은 모든 부분입체이성질체, 거울상이성질체, 및 에피머 형태 뿐만 아니라 이들의 적절한 혼합물을 포함한다. 본원에서 제공되는 지질은 모든 cis, trans, syn, anti, entgegen(E) 및 zusammen(Z) 이성질체 뿐만 아니라 이들의 적절한 혼합물을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 지질은 화합물의 라세미 혼합물을 광학 활성 분할제와 반응시켜 한 쌍의 부분입체이성질체 화합물/염을 형성하고, 부분입체이성질체를 분리하고 광학적으로 순수한 거울상이성질체를 회수함으로써 개별 입체이성질체로서 제조된다. 일부 실시양태에서, 거울상이성질체의 분할은 본원에 기재된 화합물의 공유 부분입체이성질체 유도체를 사용하여 수행된다. 또 다른 실시양태에서, 부분입체이성질체는 용해도의 차이에 기초한 분리/분할 기술에 의해 분리된다. 다른 실시양태에서, 입체이성질체의 분리는 크로마토그래피에 의해 또는 부분입체이성질체 염의 형성 및 재결정화, 또는 크로마토그래피, 또는 이들의 임의의 조합에 의한 분리에 의해 수행된다(Jean Jacques, Andre Collet, Samuel H. Wilen, "Enantiomers, Racemates and Resolutions", John Wiley and Sons, Inc., 1981). 한 측면에서, 입체이성질체는 입체선택적 합성에 의해 얻어진다.
일부 실시양태에서, 아미노 지질과 같은 지질은 본원에 개시된 구조에 기초하여 치환된다. 일부 실시양태에서, 아미노 지질과 같은 지질은 치환되지 않는다. 또 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 지질은 동위원소로(예를 들어, 방사성 동위원소로) 또는 발색단 또는 형광 모이어티, 생물발광 표지, 또는 화학발광 표지의 사용을 포함하나 이에 제한되지 않는 다른 수단에 의해 표지된다.
본원에 기재된 지질은 하나 이상의 원자가 일반적으로 자연에서 발견되는 원자 질량 또는 질량수와 상이한 원자 질량 또는 질량수를 갖는 원자로 대체된 사실을 제외하고는 본원에 제시된 다양한 화학식 및 구조에 열거된 것과 동일한 동원원소 표지된 화합물을 포함한다. 본 지질에 혼입될 수 있는 동위원소의 예는 수소, 탄소, 질소, 산소, 황, 불소 및 염소의 동위원소, 예를 들어 2H, 3H, 13C, 14C, 15N, 18O, 17O, 35S, 18F, 36Cl를 포함한다. 한 측면에서, 본원에 기재된 동위원소 표지된 지질, 예를 들어 3H 및 14C와 같은 방사성 동위원소가 혼입된 지질은 약물 및/또는 기질 조직 분포 분석에 유용하다. 한 측면에서, 중수소와 같은 동위원소로의 치환은 더 큰 대사 안정성, 예를 들어 생체 내 반감기 증가 또는 투여량 요건 감소로 인한 특정 치료 이점을 제공한다.
일부 실시양태에서, 아미노 지질의 비대칭 탄소 원자는 거울상이성질체적으로 풍부한 형태로 존재한다. 특정 실시양태에서, 아미노 지질의 비대칭 탄소 원자는 (S)- 또는 (R)-배열에서 적어도 50%의 거울상 이성질체 과잉율, 적어도 60%의 거울상 이성질체 과잉율, 적어도 70%의 거울상 이성질체 과잉율, 적어도 80%의 거울상 이성질체 과잉율, 적어도 90%의 거울상 이성질체 과잉율, 적어도 95% 거울상 이성질체 과잉율, 또는 적어도 99% 거울상 이성질체 과잉율을 갖는다.
일부 실시양태에서, 개시된 아미노 지질은 N-옥시드로 전환될 수 있다. 일부 실시양태에서, N-옥시드는 산화제(예를 들어, 3-클로로퍼옥시벤조산 및/또는 과산화수소)에 의한 처리에 의해 형성된다. 따라서, 원자가 및 구조에 의해 허용되는 경우, NO 또는 N+-O-로 표시될 수 있는 기재된 아미노 지질의 N-옥시드 화합물이 본원에 개시된다. 일부 실시양태에서, 본 개시 내용의 화합물 중 질소는 N-히드록시 또는 N-알콕시로 전환될 수 있다. 예를 들어, N-히드록시 화합물은 ra-CPBA와 같은 산화제에 의한 모 아민의 산화에 의해 제조될 수 있다. 제시되고 청구된 모든 질소 함유 화합물도 고려된다. 따라서, 기재된 아미노 지질의 N-히드록시 및 N-알콕시(예를 들어, N-OR, 여기서 R은 치환 또는 비치환된 C1-C6 알킬, C1-C6 알케닐, C1-C6 알키닐, 3-14원 카르보사이클 또는 3-14원 헤테로사이클) 유도체도 본원에 개시된다.
PEG-지질
본원에 사용되는 바와 같이, "PEG 지질" 또는 "PEG-지질"은 폴리에틸렌 글리콜 성분을 포함하는 지질을 지칭한다.
일부 실시양태에서, 기재된 LNP 조성물은 PEG-지질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 기재된 LNP 조성물은 둘 이상의 PEG-지질을 포함한다. 예시적인 PEG-지질은 지질을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 예시적인 PEG-지질은 또한 PEG-변형된 포스파티딜에탄올아민, PEG-변형된 포스파티드산, PEG-변형된 세라마이드, PEG-변형된 디알킬아민, PEG-변형된 디아실글리세롤, PEG-변형된 디알킬글리세롤, 및 이들의 혼합물을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 하나 이상의 PEG-지질은 PEG-c-DOMG, PEG-DMG, PEG-DLPE, PEG-DMPE, PEG-DPPC, PEG-DSPE 지질, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, PEG 모이어티는 에틸렌 글리콜 또는 에틸렌 옥시드의 선택적으로 치환된 선형 또는 분지형 중합체이다. 일부 실시양태에서, PEG 모이어티는 예를 들어 하나 이상의 알킬, 알콕시, 아실, 히드록시, 또는 아릴 기로 치환된다. 일부 실시양태에서, PEG 모이어티는 PEG-폴리우레탄 또는 PEG-폴리프로필렌과 같은 PEG 공중합체를 포함한다(예를 들어, j. Milton Harris, Poly(ethylene glycol) chemistry: biotechnical and biomedical applications (1992) 참조). 일부 실시양태에서, PEG 모이어티는 PEG 공중합체를 포함하지 않으며, 예를 들어, PEG 단일중합체일 수 있다. 예시적인 PEG-지질은 PEG-디라우로일글리세롤, PEG-디미리스토일글리세롤(PEG-DMG), PEG-디팔미토일글리세롤, PEG-디스테아로일글리세롤(PEG-DSPE), PEG-디팔미토일글리세롤, PEG-디스테아로일글리세롤, PEG-디라우릴글리카미드, PEG- PEG-디미리스틸글리카미드, PEG-디팔미토일글리카미드, PEG-디스테릴글루카미드, PEG-콜레스테롤 및 PEG-DMB(3,4-디테트라데콕실벤질-[오메가]-메틸-폴리(에틸렌 글리콜)에테르), 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000]을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, PEG-지질은 PEG-지질 접합체, 예를 들어 디알킬옥시프로필에 커플링된 PEG(예를 들어, PEG-DAA 접합체), 디아실글리세롤에 커플링된 PEG(예를 들어, PEG-DAG 접합체), 콜레스테롤에 커플링된 PEG, 포스파티딜에탄올아민에 커플링된 PEG, 및 세라마이드에 접합된 PEG(예를 들어, 미국 특허 제5,885,613호 참조), 양이온성 PEG 지질, 폴리옥사졸린(POZ)-지질 접합체(예를 들어, POZ-DAA 접합체, 예를 들어 WO 2010/006282 참조), 폴리아미드 올리고머(예를 들어, ATTA-지질 접합체), 및 이들의 혼합물이다.
PEG-지질은 하나 이상의 에틸렌 글리콜 단위, 예를 들어 적어도 1, 적어도 2, 적어도 5, 적어도 10, 적어도 20, 적어도 30, 적어도 40, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 120, 또는 적어도 150 에틸렌 글리콜 단위를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, PEG-지질의 평균 수분자량은 약 200 Da 내지 약 5000 Da이다. 일부 실시양태에서, PEG-지질의 평균 수분자량은 약 500Da 내지 약 3000 Da이다. 일부 실시양태에서, PEG-지질의 평균 수분자량은 약 750 Da 내지 약 2500 Da이다. 일부 실시양태에서, PEG-지질의 평균 수분자량은 약 750 Da 내지 약 2500 Da 이다. 일부 실시양태에서, PEG-지질의 평균 수분자량은 약 500 Da, 약 750 Da, 약 1000 Da, 약 1250 Da, 약 1500 Da, 약 1750 Da, 또는 약 2000 Da이다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 PEG-지질의 다분산 지수(PD1)는 2보다 작다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 PEG-지질의 PDI는 최대 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3. 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 또는 3.0이다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 PEG-지질의 PDI는 적어도 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 또는 3.0이다.
일부 실시양태에서, PEG-지질은 입자에 존재하는 총 지질의 약 0.1 몰% 내지 약 10 몰%를 포함한다. 일부 실시양태에서, PEG-지질은 입자에 존재하는 총 지질의 약 0.1 몰% 내지 약 6 몰%를 포함한다. 일부 실시양태에서, PEG-지질은 입자에 존재하는 총 지질의 약 0.5 몰% 내지 약 5 몰%를 포함한다. 일부 실시양태에서, PEG-지질은 입자에 존재하는 총 지질의 약 1 몰% 내지 약 3 몰%를 포함한다. 일부 실시양태에서, PEG-지질은 입자에 존재하는 총 지질의 약 2.0 몰% 내지 약 2.5 몰%를 포함한다. 일부 실시양태에서, PEG-지질은 입자에 존재하는 총 지질의 약 1 몰%, 약 1.1 몰%, 약 1.2 몰%, 약 1.3 몰%, 약 1.4 몰%, 약 1.5 몰%, 약 1.6 몰%, 약 1.7 몰%, 약 1.8 몰%, 약 1.9 몰%, 약 2.0 몰%, 약 2.1 몰%, 약 2.2 몰%, 약 2.3 몰%, 약 2.4 몰%, 약 2.5 몰%, 약 2.6 몰%, 약 2.7 몰%, 약 2.8 몰%, 약 2.9 몰%, 또는 약 3.0 몰%를 포함한다.
일부 실시양태에서, LNP 조성물은 복수의 PEG-지질, 예를 들어, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10가지 이상의 별개 PEG-지질을 포함한다.
인지질
본원에 사용되는 바와 같이, "인지질"은 포스페이트 모이어티 및 불포화 지방산 사슬과 같은 하나 이상의 탄소 사슬을 포함하는 지질을 지칭한다. 인지질은 하나 이상의 다중(예를 들어, 이중 또는 삼중) 결합을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 인지질은 막에 대한 융합을 촉진할 수 있다. 예를 들어, 양이온성 인지질은 막(예를 들어, 세포 또는 세포내 막)의 하나 이상의 음으로 하전된 인지질과 상호작용할 수 있다. 막에 대한 인지질의 융합은 LNP의 하나 이상의 요소가 막을 통과하도록 할 수 있으며, 즉 하나 이상의 요소를 세포로 전달할 수 있다.
일부 실시양태에서, 기재된 LNP 조성물은 인지질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인지질은 포스파티딜콜린(PC), 포스파티딜에탄올아민, 글리세로인지질, 스핑고인지질, 구리세로호수호노, 스핑고지질, 포스포노지질, 천연 레시틴, 및 수소화된 인지질로 이루어진 군으로부터 선택된 지질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인지질은 포스파티딜콜린을 포함한다. 예시적인 포스파티딜콜린에는 대두 포스파티딜콜린, 난황 포스파티딜콜린(EPC), 디스테아로일포스파티딜콜린, 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC), 디팔미토일 포스파티딜콜린, 디팔미토일-sn-글리세로-3-포스파티딜콜린(DPPC), 2-올레오일-1-팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(POPC), 디미리스토일 포스파티딜콜린(DMPC), 및 디올레오일 포스파티딜콜린(DOPC)이 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 특정의 구체적인 실시양태에서, 인지질은 DSPC이다.
일부 실시양태에서, 인지질은 포스파티딜에탄올아민 아민을 포함한다. 일부 실시양태에서, 포스파티딜에탄올아민 아민은 디스테아로일 포스파티딜에탄올아민(DSPE), 디팔미토일 포스파티딜 에탄올아민(DPPE), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE), 디미리스토일 포스포에탄올아민(DMPE), 16-0-Monome Le PE, 16-0-디메틸 PE, 18-1-트랜스 PE, 팔미토일 올레오일-포스파티딜에탄올아민 (POPE), 또는 1-스테아로일-2- 올레오일-포스파티딜 에탄올아민(SOPE)이다. 일부 실시양태에서, 인지질은 글리세로인지질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 글리세로인지질은 플라스말로겐, 포스파티데이트, 또는 포스파티딜콜린이다. 일부 실시양태에서, 글리세로인지질은 포스파티딜세린, 포스파티드산, 포스파티딜글리세롤, 포스파티딜이노시톨, 팔미토일 올레오일 포스파티딜글리세롤(POPG), 또는 리소포스파티딜콜린이다. 일부 실시양태에서, 인지질은 스핑고인지질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 스핑고인지질은 스핑고마이엘린, 세라마이드 포스포에탄올아민, 세라마이드 포스포글리세롤, 또는 세라마이드 포스포글리세로인산이다. 일부 실시양태에서, 인지질은 천연 레시틴을 포함한다. 일부 실시양태에서, 천연 레시틴은 난황 레시틴 또는 대두 레시틴이다. 일부 실시양태에서, 인지질은 수소화 인지질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 수소화 인지질은 수소화 대두 포스파티딜콜린이다. 일부 실시양태에서, 인지질은 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨, 포스파티드산, 팔미토일올레오일 포스파티딜콜린, 리소포스파티딜콜린, 리소포스파티딜에탄올아민, 디팔미토일포스파티딜콜린, 디올레오일포스파티딜콜린, 디스테아로일포스파티딜콜린, 및 디리놀레오일포스파티딜콜린으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 인지질은 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC). 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE), 1,2- 디리놀레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DLPC), 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-포스포콜린(DMPC), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DPPC), 1,2-디운데카노일-sn-글리세로-포스포콜린(DUPC), 2-올레오일-1-팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(POPC), 1,2-디-O-옥타데세닐-sn-글리세로-3-포스포콜린(18:0 디에테르 PC), 1-올레오일-2-콜레스테릴헤미숙시노일-sn-글리세로-3-포스포콜린(OChemsPC), 1-헥사데실-sn-글리세로-3-포스포콜린(C16 리소 PC), 1,2-디리놀레노일-sn-글리세로-3- 포스포콜린, 1,2-디아라키노일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 1,2-디 도코사헥사에노일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(ME 16.0 PE), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, 1,2-디리놀레일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, 1,2-디리놀레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, 1,2-디아라키도노일-sn-글리세로 -3-포스포에탄올 아민, 1,2-디도코사헥사에노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포-rac-(1-글리세롤) 나트륨염(DOPG), 및 스핑고마이엘린으로부터 선택된 지질을 포함한다.
인지질은 인지질 모이어티 및 하나 이상의 지방산 모이어티를 포함할 수 있다. 인지질 모이어티는 포스파티딜 콜린, 포스파티딜 에탄올아민, 포스파티딜 글리세롤, 포스파티딜 세린, 포스파티드산, 2-리소포스파티딜 콜린, 또는 스핑고마이엘린을 포함할 수 있다. 지방산 모이어티는 라우르산, 미리스트산, 미리스톨레산, 팔미트산, 팔미톨레산, 스테아르산, 올레산, 리놀레산, 알파-리놀렌산, 에루크산, 피탄산, 아라키드산, 아라키돈산, 에이코사펜타엔산, 베헨산, 도코사펜타엔산, 또는 도코사헥사엔산을 포함할 수 있다. 일부 특정 실시양태에서, 인지질은 하나 이상의 알킨으로 작용화되거나 이에 가교될 수 있으며, 이는 아지드에 노출 시 구리-촉매 고리화첨가를 거칠 수 있다.
일부 실시양태에서, LNP 조성물은 복수의 인지질, 예를 들어, 적어도 2, 3, 4, 5가지 이상의 별개의 인지질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인지질은 입자에 존재하는 총 지질의 1 몰% 내지 20 몰%를 포함한다. 일부 실시양태에서, 인지질은 입자에 존재하는 총 지질의 약 5 몰% 내지 약 15 몰%를 포함한다. 일부 실시양태에서, 인지질은 입자에 존재하는 총 지질의 약 8 몰% 내지 약 12 몰%를 포함한다. 일부 실시양태에서, 인지질은 입자에 존재하는 총 지질의 약 9 몰%, 10 몰%, 또는 11 몰%를 포함한다.
콜레스테롤
일부 실시양태에서, LNP 조성물은 콜레스테롤 또는 이의 유도체를 포함한다. 일부 실시양태에서, LNP 조성물은 구조적 지질을 포함한다. 구조적 지질은 스테로이드, 스테롤, 알킬 레소레이놀, 콜레스테롤 또는 이의 유도체, 페코스테롤, 시토스테롤, 에르고스테롤, 캄페스테롤, 스티그마스테롤, 브라시카스테롤, 토마티딘, 토마틴, 우르솔산, 알파토코페롤, 및 이들의 조합으로부터 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 구조적 지질은 프레드니솔론, 덱사메타손, 프레드니손, 및 히드로코르티손과 같은 코르티코스테로이드이다. 일부 실시양태에서, 콜레스테롤 또는 이의 유도체는 콜레스테롤, 5-헵타데실레조르시놀, 또는 콜레스테롤 헤미숙시네이트이다. 일부 실시양태에서, 콜레스테롤 또는 이의 유도체는 콜레스테롤이다.
일부 실시양태에서, 콜레스테롤 또는 이의 유도체는 콜레스테롤 유도체이다. 일부 실시양태에서, 콜레스테롤 유도체는 극성 콜레스테롤 유사체이다. 일부 실시양태에서, 극성 콜레스테롤 유사체는 5α-콜레스탄올, 513-코프로스탄올, 콜레스테릴-(2'-히드록시)-에틸 에테르, 콜레스테릴-(4'-히드록시)-부틸 에테르, 또는 6-케토콜레스탄올이다. 일부 실시양태에서, 극성 콜레스테롤 유사체는 콜레스테릴-(4'-히드록시)-부틸 에테르이다. 일부 실시양태에서, 콜레스테롤 유도체는 비극성 콜레스테롤 유사체이다. 일부 실시양태에서, 비극성 콜레스테롤 유사체는 5아콜레스탄, 콜레스테논, 5α-콜레스타논, 5β-콜레스타논, 또는 콜레스테릴 데카노에이트이다.
일부 실시양태에서, 콜레스테롤 또는 이의 유도체는 입자에 존재하는 총 지질의 20 몰% 내지 50 몰%를 포함한다. 일부 실시양태에서, 콜레스테롤 또는 이의 유도체는 입자에 존재하는 총 지질의 약 20 몰%, 약 21 몰%, 약 22 몰%, 약 23 몰%, 약 24 몰%, 약 25 몰%, 약 26 몰%, 약 27 몰%, 약 28 몰%, 약 29 몰%, 약 30 몰%, 약 31 몰%, 약 32 몰%, 약 33 몰%, 약 34 몰%, 약 35 몰%, 약 36 몰%, 약 37 몰%, 약 38 몰%, 약 39 몰%, 약 40 몰%, 약 41 몰%, 약 42 몰%, 약 43 몰%, 약 44 몰%. 약 45 몰%. 약 46 몰%, 약 47 몰%, 약 48 몰%, 또는 약 50 몰%를 포함한다.
포스페이트 전하 중화제
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 LNP는 포스페이트 전하 중화제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 포스페이트 전하 중화제는 아르기닌, 아스파라긴, 글루타민, 리신, 히스티딘, 양이온성 덴드리머, 폴리아민, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 포스페이트 전하 중화제는 하나 이상의 질소 원자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 포스페이트 전하 중화제는 폴리아민을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리아민은 1,3-프로판디아민, 스페르민, 스페르미딘, 노르스페르미딘, 트리스(2-아미노에틸)아민, 사이클렌, 1,4,7-트리아자시클로노난, 1,1,1-트리스(아미노메틸)에탄, 디에틸렌트리아민, 트리에틸렌테트라민, 또는 이들의 조합이다. 일부 실시양태에서, 폴리아민은 1,3-프로판디아민, 1,4-부탄디아민, 스페르민, 스페르미딘, 또는 이들의 조합이다. 일부 실시양태에서, 포스페이트 전하 중화제에 대한 N/P 비는 약 0.01 내지 약 10이다. 일부 실시양태에서, 포스페이트 전하 중화제에 대한 N/P 비는 약 0.05 내지 약 2이다. 일부 실시양태에서, 포스페이트 전하 중화제에 대한 N/P 비는 약 0.1 내지 약 1이다. 일부 실시양태에서, 포스페이트 전하 중화제에 대한 N/P 비는 약 0.1, 약 0.2, 약 0.3, 약 0.4, 약 0.5, 약 0.6, 약 0.7, 약 0.8, 약 0.9, 또는 약 1이다. 일부 실시양태에서, 포스페이트 전하 중화제에 대한 NIP 비는 약 0.25, 0.5 또는 0.75이다.
항산화제
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 LNP는 하나 이상의 항산화제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 항산화제는 양이온성 지질, 페이로드, 또는 둘 모두의 분해를 감소시키는 기능을 한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 항산화제는 친수성 항산화제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 항산화제는 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 및 시트레이트와 같은 킬레이트제이다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 항산화제는 EDTA이다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 항산화제는 친유성 항산화제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 친유성 항산화제는 비타민 E 이성질체 또는 폴리페놀을 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 항산화제는 LNP 조성물에 적어도 1 mM, 적어도 10 mM, 적어도 20 mM, 적어도 50 mM, 또는 적어도 100 mM의 농도로 존재한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 항산화제는 입자에 약 20 mM의 농도로 존재한다.
페이로드
본원에 기재된 LNP는 치료제, 또는 관심 표적과 같은 페이로드를 전달하도록 설계될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 LNP는 본원에 기재된 바와 같은 염기 에디터 시스템의 하나 이상의 구성요소를 둘러싼다. 예를 들어, LNP는 가이드 RNA, 가이드 RNA를 코딩하는 핵산, 가이드 RNA를 코딩하는 벡터, 염기 에디터 융합 단백질, 염기 에디터 융합 단백질을 코딩하는 핵산, 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인, 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인을 코딩하는 핵산, 데아미나아제, 데아미나아제를 코딩하는 핵산, 또는 이들 모두 또는 임의의 조합 중 하나 이상을 둘러쌀 수 있다. 일부 실시양태에서, 핵산은 DNA이다. 일부 실시양태에서, 핵산은 RNA, 예를 들어 mRNA이다.
추가의 예시적인 치료제는 항체(예를 들어, 단클론, 키메라, 인간화, 나노바디 및 이의 단편 등), 콜레스테롤, 호르몬, 펩티드, 단백질, 화학치료제 및 기타 유형의 항종양제, 저분자량 약물, 비타민, 보조인자, 뉴클레오시드, 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 효소 핵산, 안티센스 핵산, 삼중체 형성 올리고뉴클레오티드, 안티센스 DNA 또는 RNA 조성물, 키메라 DNA:RNA 조성물, 알로자임, 앱타머, 리보자임, 유인체 및 이들의 유사체, 플라스미드 및 기타 유형의 발현 벡터, 및 작은 핵산 분자, RNAi 작용제, 짧은 간섭 핵산(siNA), 전령 리보핵산(전령 RNA, mRNA), 짧은 간섭 RNA(siRNA), 이중 가닥 RNA(dsRNA), 마이크로-RNA(miRNA), 및 짧은 헤어핀 RNA(shRNA) 분자, 펩티드 핵산(PNA), 잠금 핵산 리보뉴클레오티드(LNA), 모르폴리노 뉴클레오티드, 트레오스 핵산(TNA), 글리콜 핵산(GNA), sisiRNA(작은 내부 분절 간섭 RNA), aiRNA(비대칭 간섭 RNA), 및 예를 들어 세포 배양물, 대상체 또는 유기체에서 관련 세포 및/또는 조직에 대한 센스 및 안티센스 가닥 사이에 1, 2개 이상의 미스매치를 가진 siRNA를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 치료제는 정제되거나 부분적으로 정제될 수 있으며, 자연 발생적이거나 합성되거나 화학적으로 변형될 수 있다. 일부 실시양태에서, 치료제는 RNAi 작용제, 짧은 간섭 핵산(siNA), 짧은 간섭 RNA(siRNA), 이중 가닥 RNA(dsRNA), 마이크로-RNA(miRNA), 또는 짧은 헤어핀 RNA(shRNA) 분자이다. 일부 실시양태에서, 치료제는 mRNA이다.
일부 실시양태에서, 페이로드는 하나 이상의 핵산(들)(즉, 하나 이상의 핵산 분자체)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 단일 가닥 핵산이다. 일부 실시양태에서, 단일 가닥 핵산은 DNA이다. 일부 실시양태에서, 단일 가닥 핵산은 RNA이다. 일부 실시양태에서, 핵산은 이중 가닥 핵산이다. 일부 실시양태에서, 이중 가닥 핵산은 DNA이다. 일부 실시양태에서, 이중 가닥 핵산은 RNA이다. 일부 실시양태에서, 이중 가닥 핵산은 DNA-RNA 하이브리드이다. 일부 실시양태에서, 핵산은 전령 RNA(mRNA), 마이크로RNA, 비대칭 간섭 RNA(aiRNA), 소형 헤어핀 RNA(shRNA), 또는 다이서-기질 dsRNA이다.
기타 지질
일부 실시양태에서, 개시된 LNP 조성물은 헬퍼 지질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 개시된 LNP 조성물은 중성 지질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 개시된 LNP 조성물은 스텔스 지질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 개시된 LNP 조성물은 추가 지질을 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 본 개시 내용의 지질 조성물에 사용하기에 적합한 중성 지질은 예를 들어 다양한 중성, 전하를 띠지 않는 또는 쯔비터이온성 지질을 포함한다. 본 개시 내용에서 사용하기에 적합한 중성 인지질의 예는 5-헵타데실벤젠-1,3-디올(레조르시놀), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DPPC), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3- 포스포콜린(DSPC), 포스포콜린(DOPC), 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-포스포콜린(DMPC), 포스파티딜콜린(PLPC), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DAPC), 포스파티딜에탄올아민(PE), 난황 포스파티딜콜린(EPC), 디라우릴로일포스파티딜콜린(DLPC), 1-미리스토일-2-팔미토일 포스파티딜콜린(MPPC), 1-팔미토일-2-미리스토일 포스파티딜콜린(PMPC), 1-팔미토일-2-스테아로일 포스파티딜콜린(PSPC), 1,2-디아라키도일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DBPC), 1-스테아로일-2-팔미토일 포스파티딜콜린(SPPC), 1,2-디에이코세노일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DEPC), 2-올레오일-1-팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(POPC), 리소포스파티딜 콜린, 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE), 디리놀레오일포스파티딜콜린 디스테아로일포스파티딜에탄올아민(DSPE), 디미리스토일 포스파티딜에탄올아민(DMPE), 디팔미토일 포스파티딜에탄올아민(DPPE), 팔미토일올레오일 포스파티딜에탄올아민(POPE), 리소포스파티딜에탄올아민 및 이들의 조합을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 중성 인지질은 DSPC 및 디미리스토일 포스파티딜 에탄올아민(DMPE)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 중성 인지질은 DSPC이다. 중성 인지질은 LNP의 처리를 안정화하고 개선하는 기능을 할 수 있다.
헬퍼 지질은 형질감염(예를 들어, 생물학적 활성제를 포함하는 본원에 제공된 바와 같은 조성물을 포함하는 나노입자(LNP)의 형질감염)을 향상시키는 지질을 지칭할 수 있다. 헬퍼 지질이 형질감염을 향상시키는 메커니즘은 입자 안정성을 향상시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 헬퍼 지질은 막 융합형성을 향상시킨다. 헬퍼 지질에는 스테로이드, 스테롤, 및 알킬 레조르시놀이 포함될 수 있다. 본 개시 내용에서 사용하기에 적합한 헬퍼 지질은 콜레스테롤, 5-헵타데실레조르시놀, 및 콜레스테롤 헤미숙시네이트를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 헬퍼 지질은 콜레스테롤이다. 일부 실시양태에서, 헬퍼 지질은 콜레스테롤 헤미숙시네이트이다.
스텔스 지질은 나노입자가 생체 내(예를 들어, 혈액 내)에 존재할 수 있는 시간의 길이를 변경하는 지질을 지칭할 수 있다. 스텔스 지질은 예를 들어 입자 응집을 줄이고 입자 크기를 제어함으로써 제제화 과정을 지원할 수 있다. 본원에 사용된 스텔스 지질은 LNP의 약동학적 특성을 조절할 수 있다. 본 개시 내용의 지질 조성물에 사용하기에 적합한 스텔스 지질은 지질 모이어티에 연결된 친수성 헤드 기를 갖는 스텔스 지질을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 본 개시 내용의 지질 조성물에 사용하기에 적합한 스텔스 지질 및 이러한 지질의 생화학에 대한 정보는 문헌[Romberg et al, Pharmaceutical Research, Vol. 25, No. 1, 2008, pg. 55-71 및 I-Toekstra et al, Biochimica et Biophysica Acta 1660 (2004) 41-52]에서 찾아볼 수 있다. 추가의 적합한 PEG 지질은 예를 들어 WO 2006/007712에 개시되어 있다.
일부 실시양태에서, 스텔스 지질은 PEG-지질이다. 한 실시양태에서, 스텔스 지질의 친수성 헤드 기는 PEG(때때로 폴리(에틸렌 옥시드)로 지칭됨), 폴리(옥사졸린), 폴리(비닐 알코올), 폴리(글리세롤), 폴리(N-비닐피롤리돈), 폴리아미노산 및 폴리 N-(2-히드록시프로필)메타크릴아미드]에 기반한 중합체로부터 선택된 중합체 모이어티를 포함한다. 스텔스 지질은 지질 모이어티를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 스텔스 지질의 지질 모이어티는 약 C4 내지 약 C40 포화 또는 불포화 탄소 원자를 독립적으로 포함하는 알킬 사슬 길이를 갖는 디알킬글리세롤 또는 디알킬글리카미드 기를 포함하는 것을 포함하는 디아실글리세롤 또는 디아실글리카미드로부터 유도될 수 있으며, 여기서 사슬은 예를 들어, 아미드 또는 에스테르와 같은 하나 이상의 작용기를 포함할 수 있다. 디알킬글리세롤 또는 디알킬글리카미드 기는 하나 이상의 치환된 알킬 기를 추가로 포함할 수 있다.
헬퍼 지질, 중성 지질, 스텔스 지질 및/또는 기타 지질의 구조 및 특성은 W02017173054A1, W02019067999A1, US20180290965A1, US20180147298A1, US20160375134A1, US8236770, US8021686, US8236770B2, US7371404B2, US7780983B2, US7858117B2, US20180200186A1, US20070087045A1, W02018119514A1, 및 W02019067992A1에 추가로 기술되어 있으며, 이들 모두는 이로써 그 전체가 참고로 포함된다.
LNP 제제
본원에 기재된 LNP는 하나 이상의 특정 적용 또는 표적을 위해 설계될 수 있다. 나노입자(LNP) 조성물 또는 조성물의 요소는 특정 적용 또는 표적에 기초하여, 및/또는 효능, 독성, 비용, 사용 용이성, 및 가용성에 기초하여 선택될 수 있다. 유사하게, 특정 적용 또는 표적을 위해 선택될 수 있는 나노입자 조성물의 특정 제제는 하나 이상의 기재된 지질을 포함하는 조성물이다. 제제에 사용하기에 적합한 포스페이트 전하 중화제는 스페르미딘 및 1,3-프로판디아민을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
기재된 LNP 제제는 하나 이상의 특정 적용 또는 표적을 위해 설계될 수 있다. 예를 들어, 나노입자 조성물은 RNA와 같은 치료제를 포유동물의 신체의 특정 세포, 조직, 기관, 또는 시스템 또는 이들의 군에 전달하도록 설계될 수 있다. 나노입자 조성물의 물리화학적 특성은 특정 신체 표적에 대한 선택성을 증가시키기 위해 변경될 수 있다. 예를 들어, 입자 크기는 다양한 기관의 구멍 크기에 따라 조정될 수 있다. 나노입자 조성물에 포함된 치료제는 또한 원하는 전달 표적 또는 표적들에 기초하여 선택될 수 있다. 예를 들어, 치료제는 특정 적응증, 병태, 질환 또는 장애에 대해 및/또는 특정 세포, 조직, 기관, 시스템 또는 이들의 군으로의 전달(예를 들어, 국부적 또는 특이적 전달)을 위해 선택될 수 있다. 특정 실시양태에서, 나노입자 조성물은 관심 폴리펩티드를 생성하기 위해 세포 내에서 번역될 수 있는 관심 폴리펩티드를 코딩하는 mRNA를 포함할 수 있다. 이러한 조성물은 특정 기관에 특이적으로 전달되도록 설계될 수 있다.
LNP 조성물 중 치료제의 양은 나노입자 조성물의 크기, 조성, 원하는 표적 및/또는 적용, 또는 기타 특성에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 나노입자 조성물에 포함된 RNA의 양은 RNA의 크기, 서열, 및 기타 특성에 따라 달라질 수 있다. 나노입자 조성물 중 치료제 및 기타 요소(예를 들어, 지질)의 상대적인 양은 또한 변할 수 있다. 일부 실시양태에서, 나노입자 조성물 중 지질 성분 대 치료제의 중량/중량 비는 약 5:1 내지 약 60:1, 예컨대 약 5:1. 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 11:1, 12:1, 13:1, 14:1, 15:1, 16:1, 17:1, 18:1, 19:1, 20:1, 25:1, 30:1, 35:1, 40:1, 45:1, 50:1, 및 60:1일 수 있다. 예를 들어, 지질 성분 대 치료제의 중량/중량 비는 약 10:1 내지 약 40:1일 수 있다. 특정 실시양태에서, 중량/중량 비는 약 20:1이다. 나노입자 조성물 중 치료제의 양은 흡수 분광법(예를 들어, 자외선-가시광선 분광법)을 사용하여 측정될 수 있다.
일부 실시양태에서, LNP 조성물은 RNA와 같은 하나 이상의 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 RNA, 지질, 및 그의 양은 특정 NIP 비를 제공하도록 선택될 수 있다. NIP 비는 약 1 내지 약 30에서 선택될 수 있다. N/P 비는 약 2 내지 약 10에서 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, NIP 비는 약 0.1 내지 약 50이다. 일부 실시양태에서, NIP 비는 약 2 내지 약 8이다. 일부 실시양태에서, NIP 비는 약 2 내지 약 15, 약 2 내지 약 10, 약 2 내지 약 8, 약 2 내지 약 6, 약 3 내지 약 15, 약 3 내지 약 10, 약 3 내지 약 8, 약 3 내지 약 6, 약 4 내지 약 15, 약 4 내지 약 10, 약 4 내지 약 8, 또는 약 4 내지 약 6이다. 일부 실시양태에서, N/P 비는 약 2, 약 2.5, 약 3, 약 3.5, 약 4, 약 4.5, 약 5, 약 5.5, 약 6, 또는 약 6.5이다. 일부 실시양태에서, NIP 비는 약 4 내지 약 6이다. 일부 실시양태에서, NIP 비는 약 4, 약 4.5, 약 5, 약 5.5, 또는 약 6이다.
일부 실시양태에서, LNP는 약 50% 내지 약 70%, 약 70% 내지 약 90%, 또는 약 90% 내지 약 100% 범위의 평균 캡슐화 효율로 형성된다. 일부 실시양태에서, LNP는 약 75% 내지 약 95% 범위의 평균 캡슐화 효율로 형성된다.
또 다른 측면에서, 본원에 제공된 바와 같은 조성물을 포함하는 지질 나노입자(LNP)가 본원에 제공된다. 본원에 사용되는 바와 같이, 지질 나노입자(LNP) 조성물 또는 나노입자 조성물은 하나 이상의 기재된 지질을 포함하는 조성물이다. LNP 조성물은 일반적으로 대략 마이크로미터 이하의 크기이며 지질 이중층을 포함할 수 있다. 나노입자 조성물은 지질 나노입자(LNP), 리포솜(예를 들어,지질 소포), 및 리포플렉스를 포함한다. 일부 실시양태에서, LNP는 1000 nm, 500 nm, 250 nm, 200 nm, 150 nm, 100 nm, 75 nm, 50 nm, 또는 25 nm 미만의 직경을 갖는 임의의 입자를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 나노입자는 1-1000 nm, 1-500 nm, 1-250 nm, 25-200 nm, 25-100 nm, 35-75 nm, 또는 25-60 nm의 크기 범위일 수 있다. 일부 실시양태에서, 리포솜은 500 nm 이하의 직경을 갖는 지질 이중층을 갖는다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 LNP는 약 1 nm 내지 약 2500 nm, 약 10 nm 내지 약 1500 nm, 약 20 nm 내지 약 1000 nm, 약 30 nm 내지 약 150 nm, 약 40 nm 내지 약 150 nm, 약 50 nm 내지 약 150 nm, 약 60 nm 내지 약 130 nm, 약 70 nm 내지 약 110 nm, 약 70 nm 내지 약 100 nm, 약 80 nm 내지 약 100 nm, 약 90 nm 내지 약 100 nm, 약 70 내지 약 90 nm, 약 80 nm 내지 약 90 nm 또는 약 70 nm 내지 약 80 nm의 평균 직경을 가질 수 있다. 본원에 기재된 LNP는 약 30 nm, 35 nm, 40 nm, 45 nm, 50 nm, 55 nm, 60 nm, 65 nm, 70 nm, 75 nm, 80 nm, 85 nm, 90 nm, 95 nm, 100 nm, 105 nm, 110 nm, 115 nm, 120 nm, 125 nm, 130 nm, 135 nm, 140 nm, 145 nm, 150 nm 이상의 평균 직경을 가질 수 있다. 본원에 기재된 LNP는 실질적으로 무독성일 수 있다.
일부 실시양태에서, LNP는 양이온성, 음이온성, 또는 중성 지질로부터 제조될 수 있다. 일부 실시양태에서, LNP는 형질감염 활성 및 나노입자 안정성을 향상시키기 위한 헬퍼 지질로서 융합유도성 인지질 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE) 또는 막 성분 콜레스테롤과 같은 중성 지질을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, LNP는 소수성 지질, 친수성 지질, 또는 소수성 및 친수성 지질 둘 다를 포함할 수 있다. 당업계에 공지된 임의의 지질 또는 지질의 조합을 사용하여 LNP를 생성할 수 있다. LNP를 생산하는 데 사용되는 지질의 예에는 DOTMA(N[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드), DOSPA(N,N-디메틸-N-([2-스페르민카르복스아미도]에틸)-2,3-비스(디올레일옥시)-1-프로파니미늄 펜타히드로클로라이드), DOTAP(1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄 프로판), DMRIE(N-(2-히드록시에틸)-N,N-디메틸-2,3-비스(테트라데실옥시-1-프로판암미늄브로마이드), DC-콜레스테롤(3β-[N-(N',N'-디메틸아미노에탄)- 카르바모일]콜레스테롤), DOTAP- 콜레스테롤, GAP-DMORIE-DPyPE, 및 GL67A-DOPE-DMPE(1,2-비스(디메틸포스피노)에탄)-폴리에틸렌 글리콜(PEG)이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. 양이온성 지질의 예로는 98N12-5, C12-200, DLin-KC2-DMA (KC2), DLin-MC3 -DMA (MC3), XTC, MD1, 및 7C1이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. 중성 지질의 예에는 DPSC, DPPC(디팔미토일포스파티딜콜린), POPC(1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린), DOPE, 및 SM(스핑고마이엘린)이 포함되지 않지만 이에 제한되지는 않는다. PEG-변형 지질의 예에는 PEG-DMG(디미리스토일 글리세롤), PEG-CerC14, 및 PEG-CerC20이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 지질은 LNP를 생성하기 위해 임의의 수의 몰비로 조합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 LNP를 생성하기 위해 광범위한 몰비로 지질(들)과 조합될 수 있다.
달리 표시되지 않는 한, 용어 "치환된"은 주어진 구조에서 하나 이상의 수소 라디칼을 할로, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 헤테로시클릴, 티올, 알킬티오, 옥소, 티옥시, 아릴티오, 알킬티오알킬, 아릴티오알킬, 알킬설포닐, 알킬설포닐알킬, 아릴설포닐알킬, 알콕시, 아릴옥시, 아르알콕시, 아미노카르보닐, 알킬아미노카르보닐, 아릴아미노카르보닐, 알콕시카르보닐, 아릴옥시카르보닐, 할로알킬 아미노, 트리플루오로메틸, 시아노, 니트로, 알킬 아미노, 아릴아미노, 알킬아미노알킬, 아릴아미노알킬, 아미노알킬아미노, 히드록시, 알콕시알킬, 카르복시알킬, 알콕시카르보닐알킬, 아미노카르보닐알킬, 아실, 아르알콕시카르보닐, 카르복실산, 설폰산, 설포닐, 포스폰산, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릭, 및 지방족 기를 포함하지만 이에 제한되지는 않는 지정된 치환기의 라디칼로 대체함을 지칭한다. 치환기는 추가로 치환될 수 있는 것으로 이해된다. 예시적인 치환기는 아미노, 알킬아미노 등을 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "치환기"는 지정된 원자의 정상 원자가를 초과하지 않고 그 치환이 안정한 화합물을 초래한다면, 지정된 원자 상의 하나 이상의 수소를 대체하여 지정된 원자 위치에서 치환되는 코어 분자의 원자 상의 위치 변수를 의미한다. 치환기 및/또는 변수의 조합은 이러한 조합이 안정한 화합물을 생성하는 경우에만 허용된다. 당업자는 본원에 기재되거나 나타낸 바와 같이 충족되지 않은 것으로 보이는 원자가를 갖는 임의의 탄소 및 헤테로원자가 기재되거나 나타낸 원자가를 충족시키기에 충분한 수소 원자(들) 수를 가지는 것으로 추정됨을 알아야 한다. 특정 경우에, 부착 지점으로서 이중 결합을 갖는 하나 이상의 치환기(예를 들어, "옥소" 또는 "=O")는 치환 기 내에서 본원에 기재, 표시 또는 나열될 수 있으며, 여기서 구조는 화학식 (I)의 코어 구조에 대한 부착 지점으로서 단일 결합만을 나타낼 수 있다. 당업자는 단일 결합만이 도시되어 있지만 이중 결합이 이러한 치환기에 대해 의도된다는 것을 이해할 것이다.
용어 "알킬"은 1 내지 20개의 탄소 원자를 갖고 단일 결합에 의해 분자의 나머지 부분에 부착된 직쇄 또는 분지형 탄화수소 사슬 라디칼을 지칭한다. 10개 이하의 탄소 원자를 포함하는 알킬은 C1-C10 알킬로 지칭되며, 마찬가지로 예를 들어 6개 이하의 탄소 원자를 포함하는 알킬은 C1-C6 알킬이다. 다른 탄소 원자 수를 포함하는 알킬(및 본원에 정의된 다른 모이어티)은 유사하게 표시된다. 알킬 기는 C1-C10 알킬, C1-C9 알킬, C1-C8 알킬, C1-C7 알킬, C1-C6 알킬, C1-C5 알킬, C1-C4 알킬, C1-C3 알킬, C1-C2 알킬, C2-C8 알킬, C3-C8 알킬 및 C4-C8 알킬을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 대표적인 알킬 기는 메틸, 에틸, n-프로필, 1-메틸에틸(i-프로필), n-부틸, i-부틸, s-부틸, n-펜틸, 1,1-디메틸에틸(t-부틸), 3-메틸헥실, 2-메틸헥실, 1-에틸-프로필 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 알킬은 메틸 또는 에틸이다. 일부 실시양태에서, 알킬은 -CH(CH3)2또는 -C(CH3)3이다. 명세서에서 구체적으로 달리 언급하지 않는 한, 알킬기는 하기 기재된 바와 같이 선택적으로 치환될 수 있다. "알킬렌" 또는 "알킬렌 사슬"은 분자의 나머지를 라디칼 기에 연결하는 직쇄 또는 분지형 2가 탄화수소 사슬을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 알킬렌은 -Cl-12-, -CH2CH2-, 또는 -CH2CH2CH2-이다. 일부 실시양태에서, 알킬렌은 -CH2-이다. 일부 실시양태에서, 알킬렌은 -CH2CH2-이다. 일부 실시양태에서, 알킬렌은 -CH2CH2CH2-이다.
"알케닐"이라는 용어는 하나 이상의 탄소-탄소 이중 결합이 존재하는 알킬 기의 한 형태를 지칭한다. 한 실시양태에서, 알케닐 기는 화학식 -C(R)=CR2를 가지며, 여기서 R은 동일하거나 상이할 수 있는 알케닐 기의 나머지 부분을 나타낸다. 일부 실시양태에서, R은 H 또는 알킬이다. 일부 실시양태에서, 알케닐은 에테닐(즉, 비닐), 프로페닐(즉, 알릴), 부테닐, 펜테닐, 펜타디에닐 등으로부터 선택된다. 알케닐기의 비제한적인 예는 -CH=CH2, -C(CH3)=CH2, -CH=CHCH3, -C(CH3)=CHCH3, 및 -CH2CH=CH2를 포함한다.
용어 "시클로알킬"은 고리를 형성하는 각각의 원자(즉, 골격 원자)가 탄소 원자인 모노시클릭 또는 폴리시클릭 비방향족 라디칼을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 시클로알킬은 포화되거나 부분적으로 불포화된다. 일부 실시양태에서, 시클로알킬은 스피로시클릭 또는 가교된 화합물이다. 일부 실시양태에서, 시클로알킬은 방향족 고리와 융합된다(이 경우 시클로알킬은 비방향족 고리 탄소 원자를 통해 결합됨). 시클로알킬 기는 3 내지 10개의 고리 원자를 갖는 기를 포함한다. 대표적인 시클로알킬은 3 내지 10개의 탄소 원자, 3 내지 8개의 탄소 원자, 3 내지 6개의 탄소 원자, 또는 3 내지 5개의 탄소 원자를 갖는 시클로알킬을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 모노시클릭 시클로알킬 라디칼은 예를 들어 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로헥실, 시클로헵틸, 및 시클로옥틸을 포함한다. 일부 실시양태에서, 모노시클릭 시클로알킬은 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸 또는 시클로헥실이다. 일부 실시양태에서, 모노시클릭 시클로알킬은 시클로펜테닐 또는 시클로헥세닐이다. 일부 실시양태에서, 모노시클릭 시클로알킬은 시클로펜테닐이다. 폴리시클릭 라디칼은 예를 들어, 아다만틸, 1,2-디히드로나프탈레닐, 1,4-디히드로나프탈레닐, 테트라이닐, 데칼리닐, 3,4-디히드로나프탈렌-1(2H)-온, 스피로[2.2]펜틸, 노르보밀 및 비사이클[1.1.1]펜틸을 포함한다. 명세서에서 구체적으로 달리 언급하지 않는 한, 시클로알킬 기는 선택적으로 치환될 수 있다. 구조에 따라, 시클로알킬 기는 1가 또는 2가(즉, 시클로알킬렌 기)일 수 있다.
용어 "헤테로사이클" 또는 "헤테로시클릭"은 질소, 산소 및 황으로부터 선택된 하나 이상의 헤테로원자를 포함하는 헤테로방향족 고리(헤테로아릴로도 알려짐) 및 헤테로시클로알킬 고리(헤테로지환족 기로도 알려짐)를 지칭하며, 여기서 각각의 헤테로시클릭 기는 고리 시스템에서 3 내지 12개의 원자를 가지며, 단 어떤 고리도 두 개의 인접한 O 또는 S 원자를 포함하지 않는다. "헤테로시클릴"은 헤테로시클릭 화합물의 임의의 고리 원자로부터 수소 원자를 제거함으로써 형성된 1가 기이다. 일부 실시양태에서, 헤테로사이클은 모노시클릭, 비시클릭, 폴리시클릭, 스피로시클릭 또는 가교된 화합물이다. 비방향족 헤테로시클릭 기(헤테로시클로알킬로도 알려짐)은 고리 시스템에 3 내지 12개의 원자를 갖는 고리를 포함하고 방향족 헤테로시클릭 기는 고리 시스템에 5 내지 12개의 원자를 갖는 고리를 포함한다. 헤테로시클릭 기는 벤조융합된 고리 시스템을 포함한다. 비방향족 헤테로시클릭 기의 예는 피롤리디닐, 테트라히드로푸라닐, 디히드로푸라닐, 테트라히드로티에닐, 옥사졸리디노닐, 테트라히드로피라닐, 디히드로피라닐, 테트라히드로티오피라닐, 피페리디닐, 모르폴리닐, 티오모르폴리닐, 티옥사닐, 피페라지닐, 아지리디닐, 아제티디닐, 옥세타닐, 티에타닐, 호모피페리디닐, 옥세파닐, 티에파닐, 옥사제피닐, 디아제피닐, 티아제피닐, 1,2,3,6-테트라히드로피리디닐, 피롤린-2-일, 피롤린-3-일, 인돌리닐, 2H-피라닐, 4H피라닐, 디옥사닐, 1,3-디옥솔라닐, 피라졸리닐, 디티아닐, 디티올라닐, 디히드로피라닐, 디히드로티에닐, 디히드로푸라닐, 피라졸리디닐, 이미다졸리닐, 이미다졸리디닐, 3-아자비시클로[3.1.0]헥사닐, 3-아자비시클로[4.1.0]헵타닐, 3h-인돌릴, 인돌린-2-오닐, 이소인돌린-1-오닐, 이소인돌린-1,3-디오닐, 3,4-디히드로이소퀴놀린-1(2H)-오닐, 3,4-디히드로퀴놀린-2(1H)-오닐, 이소인돌린-1,3-디티오닐, 벤조[d]옥사졸-2(3H)-오닐, 1H-벤조[d]이미다졸-2(3H)-오닐, 벤조[d]티아졸-2(3H)-오닐, 및 퀴놀리지닐이다. 방향족 헤테로시클릭 기의 예는 피리디닐, 이미다졸릴, 피리미디닐, 피라졸릴, 트리아졸릴, 피라지닐, 테트라졸릴, 푸틸, 티에닐, 이속사졸릴, 티아졸릴, 옥사졸릴, 이소티아졸릴, 피롤릴, 퀴놀리닐, 이소퀴놀리닐, 인돌릴 벤즈이미다졸릴, 벤조푸라닐, 신놀리닐, 인다졸릴, 인돌리지닐, 프탈라지닐, 피리다지닐, 트리아지닐, 이소인돌릴, 프테리디닐, 퓨리닐, 옥사디아졸릴, 티아디아졸릴, 푸라자닐, 벤조푸라자닐, 벤조티오페닐, 벤조티아졸릴, 벤족사졸릴, 퀴나졸리닐, 퀴녹살리닐, 나프티리디닐, 및 푸로피리디닐이다. 상기 기는 가능한 경우 C-부착(또는 C-연결)되거나 N-부착된다. 예를 들어, 피롤로부터 유도된 기는 피롤-1-일(N-부착) 또는 피롤-3-일(C-부착)을 모두 포함한다. 또한, 이미다졸로부터 유도된 기는 이미다졸-1-일 또는 이미다졸-3-일(모두 N-부착됨) 또는 이미다졸-2-일, 이미다졸-4-일 또는 이미다졸-5-일(모두 C-부착됨)을 포함한다. 헤테로시클릭 기는 벤조융합 고리 시스템을 포함한다. 비방향족 헤테로사이클은 피롤리딘-2-온과 같은 1개 또는 2개의 옥소(=O) 모이어티로 선택적으로 치환된다. 일부 실시양태에서, 비시클릭 헤테로사이클의 2개의 고리 중 적어도 하나는 방향족이다. 일부 실시양태에서, 비시클릭 헤테로사이클의 두 고리는 모두 방향족이다.
용어 "헤테로시클로알킬"은 질소, 산소, 및 황으로부터 선택된 하나 이상의 헤테로원자를 포함하는 시클로알킬 기를 지칭한다. 명세서에서 구체적으로 달리 언급되지 않는 한, 헤테로시클로알킬 라디칼은 융합(아릴 또는 헤테로아릴 고리와 융합되는 경우, 헤테로시클로알킬은 비방향족 고리 원자를 통해 결합됨) 또는 가교된 고리를 포함할 수 있는 모노시클릭 또는 비시클릭 고리 시스템일 수 있다. 헤테로시클릴 라디칼의 질소, 탄소 또는 황 원자는 선택적으로 산화될 수 있다. 질소 원자는 선택적으로 4차화될 수 있다. 헤테로시클로알킬 라디칼은 부분적으로 또는 완전히 포화된다. 헤테로시클로알킬 라디칼의 예는 디옥솔라닐, 티에닐[1,3]디티아닐, 테트라히드로퀴놀릴, 테트라히드로이소퀴놀릴, 데카히드로퀴놀릴, 데카히드로이소퀴놀릴, 이미다졸리닐, 이미다졸리디닐, 이소티아졸리디닐, 이속사졸리디닐, 모르폴리닐, 옥타히드로인돌릴, 옥타히드로이소인돌릴, 2-옥소피페라지닐, 2-옥소피페리디닐, 2-옥소피롤리디닐, 옥사졸리디닐, 피페리디닐, 피페라지닐, 4-피페리도닐, 피롤리디닐, 피라졸리디닐, 퀴누클리디닐, 티아졸리디닐, 테트라히드로푸릴, 트리티아닐, 테트라히드로피라닐, 티오모르폴리닐, 티아모르폴리닐, 1-옥소티오모르폴리닐, 1,2-디옥소-티오모르폴리닐을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 헤테로시클로알킬이라는 용어는 또한 단당류, 이당류 및 올리고당류를 포함하나 이에 제한되지 않는 모든 고리 형태의 탄수화물을 포함한다. 달리 언급되지 않는 한, 헤테로시클로알킬은 고리에 2 내지 12개의 탄소를 갖는다. 일부 실시양태에서, 헤테로시클로알킬은 고리에 2 내지 10개의 탄소를 갖는다. 일부 실시양태에서, 헤테로시클로알킬은 고리 내에 2 내지 10개의 탄소 및 1 또는 2개의 N 원자를 갖는다. 일부 실시양태에서, 헤테로시클로알킬은 고리 내에 2 내지 10개의 탄소 및 3 또는 4개의 N 원자를 갖는다. 일부 실시양태에서, 헤테로시클로알킬은 고리 내에 2 내지 12개의 탄소, 0 내지 2개의 N 원자, 0 내지 2개의 O 원자, 0 내지 2개의 P 원자, 및 0 내지 1개의 S 원자를 갖는다. 일부 실시양태에서, 헤테로시클로알킬은 고리 내에 2 내지 12개의 탄소, 1 내지 3개의 N 원자, 0 내지 1개의 O 원자, 및 0 내지 1개의 S 원자를 갖는다. 헤테로시클로알킬의 탄소 원자의 수를 언급할 때, 헤테로시클로알킬의 탄소 원자의 수는 헤테로시클로알킬을 구성하는 원자(즉, 헤테로시클로알킬 고리의 골격 원자)(헤테로원자 포함)의 총 수와 동일하지 않다. 명세서에서 달리 구체적으로 언급되지 않는 한, 헤테로시클로알킬 기는 선택적으로 치환될 수 있다. 본원에 사용되는 바와 같이 용어 "헤테로시클로알킬렌"은 2가 헤테로시클로알킬 기를 지칭할 수 있다.
용어 "헤테로아릴"은 질소, 산소 및 황으로부터 선택된 하나 이상의 고리 헤테로원자를 포함하는 아릴 기를 지칭한다. 헤테로아릴은 모노시클릭 또는 바시클릭이다. 모노시클릭 헤테로아릴의 예시적인 예로는 피리디닐, 이미다졸릴, 피리미디닐, 피라졸릴, 트리아졸릴, 피라지닐, 테트라졸릴, 푸릴, 티에닐, 이속사졸릴, 티아졸릴, 옥사졸릴, 이소티아졸릴, 피롤릴, 피리다지닐, 트리아지닐, 옥사디아졸릴, 티아디아졸릴, 푸라자닐, 인돌리진, 인돌, 벤조푸란, 벤조티오펜, 인다졸, 벤즈이미다졸, 퓨린, 퀴놀리진, 퀴놀린, 이소퀴놀린, 신놀린, 프탈라진, 퀴나졸린, 퀴녹살린, 1,8-나프티리딘, 및 프테리딘이 포함된다. 모노시클릭 헤테로아릴의 예시적인 예로는 피리디닐, 이미다졸릴, 피리미디닐, 피라졸릴, 트리아졸릴, 피라지닐, 테트라졸릴, 푸릴, 티에닐, 이속사졸릴, 티아졸릴, 옥사졸릴, 이소티아졸릴, 피롤릴, 피리다지닐, 트리아지닐, 옥사디아졸릴, 티아디아졸릴, 및 푸라자닐이 포함된다. 비시클릭 헤테로아릴의 예시적인 예에는 인돌리진, 인돌, 벤조푸란, 벤조티오펜, 인다졸, 벤즈이미다졸, 퓨린, 퀴놀리진, 퀴놀린, 이소퀴놀린, 신놀린, 프탈라진, 퀴나졸린, 퀴녹살린, 1,8-나프티리딘, 및 프테리딘이 포함된다. 일부 실시양태에서, 헤테로아릴은 피리디닐, 피라지닐, 피리미디닐, 티아졸릴, 티에닐, 티아디아졸릴 또는 푸릴이다. 일부 실시양태에서, 헤테로아릴은 고리에 0-6개의 N 원자를 함유한다. 일부 실시양태에서, 헤테로아릴은 고리에 1-4개의 N 원자를 함유한다, 일부 실시양태에서, 헤테로아릴은 고리에 4-6개의 N 원자를 함유한다. 일부 실시양태에서, 헤테로아릴은 고리에 0-4개의 N 원자, 0-1개의 O 원자, 0-1개의 P 원자, 및 0-1개의 S 원자를 함유한다. 일부 실시양태에서, 헤테로아릴은 고리에 1-4개의 N 원자, 0-1개의 O 원자, 및 0-1개의 S 원자를 함유한다. 일부 실시양태에서, 헤테로아릴은 C1-C9 헤테로아릴이다. 일부 실시양태에서, 모노시클릭 헤테로아릴은 C1-C5 헤테로아릴이다. 일부 실시양태에서, 모노시클릭 헤테로아릴은 5원 또는 6원 헤테로아릴이다. 일부 실시양태에서, 비시클릭 헤테로아릴은 C6-C9 헤테로아릴이다. 일부 실시양태에서, 헤테로아릴 기는 부분적으로 환원되어 본원에 정의된 헤테로시클로알킬 기를 형성한다. 일부 실시양태에서, 헤테로아릴 기는 완전히 환원되어 본원에 정의된 헤테로시클로알킬 기를 형성한다.
본원에 사용되는 바와 같이, "N/P 비"는 지질(또는 지질들) 내의 이온화 가능한(예를 들어, 생리학적 pH 범위에서) 질소 원자 대 예를 들어 지질 성분 및 RNA를 포함하는 나노입자 조성물 중 핵산 분자체(또는 핵산 분자체) 내의 포스페이트 기의 몰비이다. 이온화 가능한 질소 원자는 예를 들어 약 pH 1, 약 pH 2, 약 pH 3, 약 pH 4, 약 pH 5, 약 pH 6, 약 pH 7, 약 pH 7.5, 또는 약 pH8 이상에서 양성자화될 수 있는 질소 원자를 포함할 수 있다. 생리학적 pH 범위는 예를 들어 다양한 세포 구획(예를 들어, 장기, 조직, 및 세포) 및 체액(예를 들어, 혈액, CSF, 위액, 우유, 담즙, 타액, 눈물, 및 소변)의 pH 범위를 포함할 수 있다. 특정 구체적인 실시양태에서, 생리학적 pH 범위는 포유동물에서 혈액의 pH 범위, 예를 들어 약 7.35 내지 약 7.45를 지칭한다. 유사하게, 하나 이상의 이온화 가능한 질소 원자를 갖는 포스페이트 전하 중화제의 경우, N/P 비는 포스페이트 전하 중화제 내의 이온화 가능한 질소 원자 대 핵산의 포스페이트 기의 몰 비를 지칭할 수 있다. 일부 실시양태에서, 이온화 가능한 질소 원자는 5 내지 14의 pH 범위 내에서 이온화 가능한 질소 원자를 지칭한다.
본원에 기재된 gRNA 및 mRNA 원료 의약품을 캡슐화하는 LNP 제제는 2021년 3월 4일자로 출원된 공동 소유의 미국 특허 출원 일련 번호 17/192,709와 동일한 날짜에 국제 출원 번호 PCT/US21/20955로 출원된 병행 PCT 출원에 개시된 것과 같은 GalNac 지질 제제를 포함하도록 변형될 수 있음이 추가로 고려된다. 이러한 GalNac 지질 제제의 사용은 이형 및 동형 가족성 고콜레스테롤혈증 환자 집단과 관련된 것과 같은 LDL-R 결핍 세포에서 LNP 흡수를 향상시킬 수 있는 것으로 이해된다.
포스페이트 기를 포함하지 않는 페이로드의 경우, N/P 비는 페이로드의 총 음전하에 대한 지질의 이온화 가능한 질소 원자의 몰비를 나타낼 수 있다. 예를 들어, LNP 조성물의 N/P 비는 조성물에 존재하는 페이로드의 총 음전하에 대한 LNP 조성물의 총 이온화 가능한 질소 원자의 몰비를 나타낼 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, 아미노 지질은 pH 범위 4 내지 14에서 양성자화 가능한(또는 이온화 가능한) 적어도 하나의 1차, 2차 또는 3차 아민 모이어티를 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 아민 모이어티/모이어티들은 아미노 지질의 친수성 헤드 기로서 기능을 한다. 핵산-지질 나노입자 제제에서 아미노 지질(또는 아미노 지질들)의 아민 모이어티(들)의 대부분이 생리학적 pH에서 양성자화되는 경우, 나노입자는 양이온성 지질 나노입자(cLNP)로 지칭될 수 있다. 핵산-지질 나노입자 제제에서 아미노 지질(또는 아미노 지질들)의 아민 모이어티(들)의 대부분이 생리학적 pH에서 양성자화되지 않지만 산성 pH에서 양성자화될 수 있는 경우, 엔도솜 pH는 예를 들어 이온화 가능한 지질 나노 입자(iLNP)로 지칭될 수 있다. cLNP를 구성하는 아미노 지질은 일반적으로 양이온성 아미노 지질(cLipid)로 불릴 수 있다. iLNP를 구성하는 아미노 지질은 이온화 가능한 아미노 지질(iLipid)이라고 불릴 수 있다. 아미노 지질은 생리학적 pH에서 iLipid 또는 cLipid일 수 있다.
키트
본 개시 내용의 한 측면은 병태를 치료 또는 예방하기 위한, 본원에 제공된 바와 같은 단일 가이드 RNA, 본원에 제공된 바와 같은 염기 에디터 시스템 및 복합체, 본원에 제공된 바와 같은 조성물, 또는 본원에 제공된 바와 같은 지질 나노입자를 포함하는 조성물을 포함하는 키트에 관한 것이다. 키트는 병태를 치료 또는 예방하기 위한 하나 이상의 추가 치료 요법 또는 작용제를 추가로 포함할 수 있다.
또한, 특정 실시양태에서 본원에 기재된 하나 이상의 방법과 함께 사용하기 위한 키트 및 제조 물품이 본원에 개시된다. 이러한 키트는 바이알, 튜브 등과 같은 하나 이상의 용기를 수용하도록 구획화된 캐리어, 패키지, 또는 용기를 포함하며, 각각의 용기(들)는 본원에 기재된 방법에 사용되는 별개의 요소 중 하나를 포함한다. 적합한 용기에는 예를 들어 병, 바이알, 주사기, 및 시험관이 포함된다. 한 실시양태에서, 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 재료로 형성된다.
본원에 제공된 제조 물품에는 포장재가 포함된다. 약학적 포장 재료의 예는 블리스터 팩, 병, 튜브, 백, 용기, 병, 및 선택된 제제 및 의도된 투여 및 치료 방식에 적합한 임의의 포장 재료를 포함되지만 이에 제한되지는 않는다.
예를 들어, 용기(들)는 본 개시 내용의 조성물, 및 선택적으로 본원에 개시된 치료 요법 또는 작용제를 추가로 포함한다. 이러한 키트는 선택적으로 본원에 기재된 방법에서의 사용과 관련된 식별하는 설명 또는 라벨 또는 지침을 포함한다.
키트에는 일반적으로 내용물 및/또는 사용 지침을 나열하는 라벨과 사용 지침이 포함된 패키지 삽입물이 포함된다. 일반적으로 일련의 지침도 포함된다.
실시양태에서, 라벨은 용기 위에 있거나 용기와 연관되어 있다. 한 실시양태에서, 라벨을 형성하는 문자, 숫자 또는 기타 문자가 용기 자체에 부착, 성형 또는 에칭될 때 라벨은 용기 상에 있으며, 라벨이 예를 들어 패키지 삽입물과 같이 용기를 보유하는 통 또는 캐리어 내에 존재할 때 용기와 연관된다. 한 실시양태에서, 라벨은 내용물이 특정 치료 적용을 위해 사용되어야 함을 나타내기 위해 사용된다. 라벨은 또한 본원에 기재된 방법에서와 같이 내용물의 사용에 대한 지침을 표시한다.
실시예
도입
본 개시 내용은 구체적인 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명될 것이다. 이러한 실시예는 설명의 목적으로만 제공되며 본원에 제공된 청구 범위를 제한하지 않는다. 당업자는 본 개시 내용에 따른 대안적인 실시양태를 산출하기 위해 변경 또는 수정될 수 있는 다양한 중요하지 않은 파라미터를 쉽게 인식할 것이다.
CRISPR-Cas9 뉴클레아제 및 CRISPR 염기 에디터를 포함한 유전자 편집 기술은 인간 환자의 질환 유발 유전자를 정확하고 영구적으로 변형시킬 가능성이 있다. 비인간 영장류(NHP)의 표적 기관에서 지속 가능한 편집을 입증하는 것은 임상 시험에서 환자에게 유전자 에디터를 생체 내 투여하기 전에 중요하고 필요한 단계이다. 본원은 지질 나노입자(LNP)를 사용하여 생체 내에서 전달된 CRISPR 염기 에디터가 살아있는 NHP에서 질환 관련 유전자를 효율적으로 변형시킬 수 있다는 첫 번째 증명을 제공한다. 이 결과는 전 세계적으로 주요 사망 원인인 콜레스테롤을 줄이고 관상 동맥 심장 질환을 치료하기 위한 일회성 접근 방식에 대한 개념 증명을 제공하는 것 외에도 CRISPR 염기 에디터가 간 및 잠재적으로 다른 기관에서 다양한 치료 표적 유전자에 생산적으로 적용될 수 있는 방법을 보여준다.
생체 내 유전자 편집은 간과 같은 기관에서 환자 자신의 신체에서 DNA 변형을 만드는 새로운 치료법이다. 유전자 편집 방법에는 CRISPR-Cas9 및 -Cas12 뉴클레아제, CRISPR 시토신 염기 에디터, CRISPR 아데닌 염기 에디터, 및 CRISPR 프라임 에디터가 포함된다. 인간 PCSK9 및 ANGPTL3 유전자는 생체 내 유전자 편집을 위한 특히 매력적인 잠재적 표적(들)이다. 원칙적으로, PCSK9의 편집은 혈중 LDL-C 수준을 지속적으로 감소시켜 매일 또는 수 주에서 수 개월마다 복용해야 하고 환자의 순응도 부족이 문제가 될 수 있는 기존의 모든 요법(예를 들어, 스타틴, 에제티미브 또는 PCSK9 억제제)과 대조적으로 LDL-C 누적 노출을 극적으로 낮출 수 있다.
간에서 PCSK9 또는 ANGPTL3 기능 상실 돌연변이를 도입할 수 있는 유전자 에디터의 생체 내 전달은 관상 동맥 심장 질환의 평생 치료를 제공하는 새로운 종류의 일회성 요법을 제공할 가능성이 있다. CRISPR 염기 에디터는 정확한 표적화된 변경을 도입하는 데 효율적으로 기능을 하고 CRISPR-Cas9 및 기타 유전자 편집 뉴클레아제와 대조적으로 이중 가닥 DNA 파손 도입의 어떠한 유해한 결과든 최소화하기 때문에 이러한 목적을 위해 매력적인 유전자 편집 양식이 된다.
CRISPR 아데닌 염기 에디터는 DNA에서 표적화된 A->G 편집을 유도할 수 있으며(반대 가닥의 T->C) 이를 사용하여 시작 코돈, 엑손-인트론 또는 인트론-엑손 경계에서 스플라이스 도너(센스 가닥의 표준 GT 서열) 또는 스플라이스 억셉터(표준 센스 가닥의 AG 서열)을 파괴하거나, 미스센스 돌연변이를 도입함으로써 유전자를 불활성화할 수 있다. 아데닌 8.8-m(이하 ABE8.8로 지칭함)은 가이드 RNA(gRNA)와 함께 코어 스트렙토코커스 피오게네스 닉카아제 Cas9(nSpCas9) 단백질을 사용하여 3' 말단에 NGG 프로토스페이서 인접 모티프(PAM) 서열 측면에 있는 이중 가닥 프로토스페이서 서열을 인게이징한다. 프로토스페이서 서열은 "표적" DNA 가닥의 상보적 서열과 gRNA의 처음 20개 염기의 혼성화를 통해 지정되며, 다른("비표적") 가닥의 일부는 R 루프라고 불리는 노출된 단일 가닥 형태 구조로 남는다. ABE 염기 에디터는 진화된 데옥시아데노신 데아미나아제 도메인(nSpCas9에 융합됨)을 사용하여 R-루프의 단일 가닥 DNA 부분에 포함된 아데노신 뉴클레오시드를 이노신으로 화학적으로 변형하고 R 루프의 DNA:RNA 이종이중체 내의 표적 DNA 가닥에 닉을 형성한다. 이 닉은 DNA 복구 기구가 새로 탈아미노화된 가닥을 주형으로 사용하도록 편향시켜 표적화 부위에서 매우 효율적인 전이 돌연변이를 가능하게 한다. ABE8.8의 활성 창은 일반적으로 gRNA에 의해 지정된 프로토스페이서 DNA 서열의 위치 3에서 9, NGG PAM(위치 21에서 23)의 5'에서 12에서 18개의 염기쌍의 범위이며, 피크 편집은 프로토스페이서의 위치 6에서 관찰된다. ABE8.8의 작용 기전은 이중 가닥 DNA 파손을 포함하지 않지만, 삽입-결실 돌연변이유발은 낮은 빈도로 발생할 수 있다.
유전자 불활성화 또는 다른 유형의 유전자 변경을 위한 CRISPR-Cas9 게놈 편집과 비교하여 염기 편집의 이점이 주목된다. 표준 CRISPR-Cas9 편집은 이중 가닥 파손(대규모 결실, 벡터 DNA 서열 통합, 염색체 재배열, p53 활성 유도 등)에서 발생하는 원치 않는 온 타겟 효과 및 오프 타겟 효과의 위험이 더 높다. 단축된 단백질 생성물의 말단에 다양한 변칙 아미노산 문자열을 추가하는 프레임 이동 돌연변이, 또는 기능을 녹아웃시키지 않고 단백질에서 아미노산을 첨가 또는 제거하는 프레임 내 돌연변이를 초래할 수 있기 때문에 의도된 온 타겟 효과(작은 삽입-결실 돌연변이)조차도 예측 불가능한 요소를 갖는다. 대조적으로, 염기 편집은 게놈에서 정확하고 정형화된 변화를 효율적으로 만들어 유전자 기능의 재현 가능한 변경을 허용하는 수단을 제공한다. 염기 편집은 이중 가닥 파손을 필요로 하지 않고 대신 데아미나아제 도메인을 통한 DNA 염기의 효소적 변형을 통해 작용함으로써 의도하지 않은 온 타겟 효과를 완화한다.
본 발명의 바람직한 실시양태가 본원에 제시되고 설명되었지만, 그러한 실시양태는 단지 예로서 제공된다는 것이 당업자에게 명백할 것이다. 본 발명이 명세서 내에 제공된 특정 예에 의해 제한되는 것으로 의도되지 않는다. 본 발명이 전술한 명세서를 참조하여 설명되었지만, 본원의 실시양태의 설명 및 예시는 제한적인 의미로 해석되어서는 안 된다. 수많은 변형, 변경 및 대체가 이제 본 발명을 벗어나지 않고 당업자에게 발생할 것이다. 또한, 본 발명의 모든 측면은 다양한 조건 및 변수에 의존하는 본원 제시된 특정 도시, 구성 또는 상대적 비율로 제한되지 않는다는 것을 이해해야 한다. 본원에 기재된 본 발명의 실시양태에 대한 다양한 대안이 본 발명을 실시하는데 이용될 수 있음을 이해해야 한다. 따라서, 본 발명은 그러한 대안, 변형, 변화 또는 균등물도 포함하는 것으로 고려된다.
프로토스페이서 선택 및 편집
실시예 1. PCSK9 및 ANGPTL3을 표적화하기 위한 gRNA 설계
표 1 및 표 24에 제시된 모든 프로토스페이서는 두 가지 기준에 따라 선택하였다. 첫째, 그들은 유전자의 인간, 시노몰구스 원숭이, 및/또는 마우스 오솔로그의 서열과 일치(또는 매우 밀접하게 일치)하였다. 둘째, MIT 특이성 점수(https://crispor.tefor.net/에 의해 계산됨, 최소 점수 50)에 의해 판단되는 바와 같이 그들은 유리한 예측 오프 타겟 프로파일을 가지고 있었다.
목적이 치료 목적을 위해 생체 내에서 유전자를 파괴하는 것인 경우, 시토신 염기 에디터는 글루타민 (CAG->TAG, CAA->TAA), 아르기닌(CGA->TGA), 및 트립토판(TGG->TAG/TAA/TGA, 안티센스 가닥의 시토신 편집으로)에 대한 특정 코돈을 변경함으로써 정지 코돈을 유전자의 코딩 서열에 직접 도입할 수 있다(넌센스 돌연변이)는 이점이 있다. 대조적으로, 아데닌 염기 에디터는 넌센스 돌연변이를 초래하는 A->G 변화가 없기 때문에 정지 코돈을 직접 도입할 수 없다. 그럼에도 불구하고, 특히 gRNA 비의존적 오프 타겟 DNA 염기 편집과 관련하여 아데닌 염기 에디터의 더 유리한 오프 타겟 프로파일은 치료 목적으로 시토신 염기 에디터보다 아데닌 염기 에디터의 사용을 권장한다. 유사한 접근법을 따라 표 1 및 24에 나열된 마우스/설치류 특이적 프로토스페이서를 식별하고 선택하였다.
유전자 기능을 파괴하기 위해 아데닌 염기 에디터를 사용할 수 있는 한 가지 전략은 ATG->GTG 또는 ATG->ACG와 같은 개시 코돈을 편집하는 것이다. 따라서, 단백질로의 결과 번역은 표준 ATG 부위에서 개시되지 않을 것이다. 유전자 기능을 파괴하기 위해 아데닌 염기 에디터를 사용할 수 있는 두 번째 전략은 인트론의 5' 말단에 있는 스플라이스 도너 또는 인트론의 3' 말단에 있는 스플라이스 억셉터에 상관없이 스플라이스 부위를 편집하는 것이다. 스플라이스 부위 파괴는 전령 RNA(mRNA)에서 인트론 서열의 포함(단백질 활성을 파괴하는 조기 정지 코돈 또는 아미노산의 삽입/결실을 초래하는 넌센스, 프레임 이동, 또는 프레임 내 삽입-결실 돌연변이를 잠재적으로 도입), 또는 넌센스, 프레임 이동 또는 프레임 내 삽입-결실 돌연변이를 또한 도입할 수 있는 엑손 서열의 배제를 초래할 수 있다. 표준 스플라이스 도너는 센스 가닥의 DNA 서열 GT를 포함하는 반면, 표준 스플라이스 억셉터는 DNA 서열 AG를 포함한다. 서열의 변경은 정상적인 스플라이싱을 방해한다. 스플라이스 도너는 안티센스 가닥의 두 번째 위치에 있는 상보적 염기의 아데닌 염기 편집(GT->GC)에 의해 파괴될 수 있고, 스플라이스 억셉터는 센스 가닥의 첫 번째 위치의 아데닌 염기 편집(AG->GG)에 의해 파괴될 수 있다. 유전자 기능을 파괴하기 위해 아데닌 염기 에디터를 사용할 수 있는 세 번째 전략은 미스센스 돌연변이(들)를 유전자의 코딩 영역에 도입하여 덜 기능적이거나 비기능적인 단백질을 생성하는 것이다.
편집 창(DNA의 20-nt 프로토스페이서 영역에서 대략 위치 3 내지 9) 내에서 A->G 편집을 통해 도너 또는 억셉터가 식별되는지 여부와 관계없이, ABE8.8(및 ABE7.10과 같은 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9를 포함하는 다른 ABE 변이체, 또는 NGG PAM을 사용할 수 있는 또 다른 Cas 단백질)이 스플라이스 부위를 파괴하도록 허용하는 모든 gRNA 스페이서 서열을 식별하였다. 각각의 프로토스페이서 서열과 일치하고 그렇지 않으면 표준 100-nt 스트렙토코커스 피오게네스 CRISPR gRNA 서열에 일치하는 가이드 RNA를 합성하였으며, 각 gRNA 분자는 적당한 정도의 화학적 변형을 가졌다(예를 들어, 표 1).
[표 1]
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Figure pct00096
상기 표 1, 표 23, 및 표 24에서 사용되는 바와 같이, 달리 명시되지 않는 한, 프로토스페이서에서: 대문자 뉴클레오티드(A, G, C, I 및 T)는 각각 2'-데옥시리보뉴클레오티드, 아데닌, 구아닌, 시토신, 이노신, 및 티민을 나타내고; 가이드 RNA 서열에서: 대문자 뉴클레오티드(A, C, G, I 및 U)는 각각 리보뉴클레오티드, 아데닌, 구아닌, 시토신, 이노신, 및 우라실을 나타내고 소문자 뉴클레오티드(a, g, c, i 및 u)는 2'-O-메틸리보뉴클레오티드(2'-OMe)를 나타낸다. DNA 프로토스페이서는 2'-데옥시리보뉴클레오티드를 포함한 다른 변형이 단일 가이드 RNA의 스페이서 섹션에 도입되는 경우를 제외하고 가이드 RNA 설계에서 RNA 또는 RNA 등가물로 전환되는 것으로 이해된다. s: 포스포로티오에이트(PS), X = 리보네불라린; x= 2'-O-메틸네불라린; dX = 2'-데옥시네불라린; 5'-NNN-3'은 균일한 A, C, G, I, U, dA, dG, dC, dI, T, X, x, dX, 및 이들의 조합을 나타낸다. 5'-nnn-3'은 균일한 a, c, g, i, u, dA, dG, dC 또는 T, x, dX, 및 이들의 조합을 나타낸다. mANGPTL3: 마우스 ANGPTL3; hANGPTL3: 인간 ANGPTL3; cANGPTL3: 시노몰구스 ANGPTL3; mcANGPTL3: 마우스, 시노몰구스 교차 반응성 ANGPTL3; hcANGPTL3: 인간, 시노몰구스 교차 반응성 ANGPTL3; mPCSK9: 마우스 PCSK9; hPCSK9: 인간 PCSK9; cPCSK9: 시노몰구스 PCSK9; mcPCSK9: 마우스, 시노몰구스 교차 반응성 PCSK9; hcPCSK9: 인간, 시노몰구스 교차 반응성 PCSK9; hcAPOC3: 인간, 시노몰구스 교차 반응성 APOC3. 본원에 개시된 바와 같이, 뉴클레오티드 서열 및 변형 패턴은 RNA 또는 이의 단편, CRISPR 가이드 RNA, 예를 들어 sgRNA 이중 가이드 RNA, 또는 mRNA의 모든 길이, 구조 및 유형을 포함한다. 예를 들어, 상기 표에 기재된 바와 같은 뉴클레오티드 서열 및 변형 패턴은 단일 가이드 RNA, 이중 가이드 RNA, 뉴클레아제 mRNA, 또는 이들의 임의의 단편 또는 분절에서의 RNA 서열 및 변형 패턴을 나타낼 수 있다. 표 23에서, u'는 N1-메틸슈도우리딘을 나타낸다.
실시예 2. 시험관 내 PCSK9 및 ANGPTL3 Cas9 편집
일련의 실험에서, PCSK9 gRNA는 2500, 500, 또는 100ng/RNA/mL에서 TriLink Biotechnologies에서 구입한 시험관 내 전사된 상업적으로 이용 가능한 SpCas9 mRNA MS002(1:1 중량비)의 등가량과 함께 1차 인간 간세포에 공동 형질감염시키고 상세한 방법에 기재된 바와 같이 처리하였다. 추출된 게놈 DNA는 표적 부위 주변에서 생성된 PCR 앰플리콘의 차세대 시퀀싱으로 표적 부위의 유전자 편집율에 대해 분석하였다. 샘플은 제조업체의 프로토콜에 따라 Nextera XT DNA 라이브러리 제조 키트(Illumina)를 사용하여 준비하였다. 간략하게, 첫 번째로 관심 영역을 증폭하기 위해, 두 번째로 차세대 시퀀싱 및 샘플 식별에 필요한 DNA 서열을 초기 생성물에 추가하기 위해 2회의 PCR을 수행하였다. 최종 앰플리콘은 제조업체의 프로토콜에 따라 Illumina MiSeq 기기에서 시퀀싱하였다. 광범위한 편집 활성(표 2)이 관찰되었다. 두 번째 실험 세트에서, ANGPTL3 gRNA를 등가량의 시험관 내 전사된 SpCas9 mRNA(1:1 중량비)과 함께 1차 인간 간세포에 공동 형질감염시키고 유사하게 처리 및 분석하였다(표 3).
[표 2]
Figure pct00097
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[표 3]
Figure pct00102
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"프로토스페이서", "PAM", "스페이서"를 포함하는 본 출원에 사용된 관련 용어와 함께 Cas9, 시티딘 염기 에디터(CBE), 및 아데닌 염기 에디터(ABE)의 작동 모드가 각각 예시되어 있다(도 1a- 1c). 잘 수행하는 가이드 중 하나인 스페이서 서열 5'-GGTGCTAGCCTTGCGTTCCG-3'(서열 번호 66)을 가진 GA156에 대해, tracrRNA 서열에 대한 변형을 갖는 추가 가이드를 합성하였다. 추가적으로, X선 결정 구조 가이드된 접근법을 사용하였다(도 1d). 구조 가이드된 스페이서 및 tracr 설계는 sgRNA와 복합체를 이루는 에스. 피오게네스 Cas9(Jiang et al., 2015, PDB ID 4ZT0)와 촉매전 삼원 복합체(Jiang et al., 2016, PDB ID 5F9R)의 에스 피오게네스 Cas9의 결정 구조에서 정보를 얻었다(도 2). 주어진 뉴클레오티드의 2'-OH와 Cas9 단백질(또는 sgRNA의 다른 부분) 사이에 수소 결합이 있는 것으로 보이는 결정 구조의 모든 위치는 변형되지 않았다. 또한, 2'-OM과 단백질 사이에 입체 클래쉬가 발생할 것으로 예상되는 위치는 변형되지 않았다. 2'-OH가 용매에 노출되거나 그렇지 않으면 단백질 잔기에서 멀리 떨어진 위치에서 2'-OMe 치환이 이루어졌다. 두 결정 구조가 일치하지 않는 경우에는 변형이 이루어지지 않았다. 이 전략은 전체 sgRNA 또는 tracr 영역에만 적용되었다. 예시적인 구조는 [도 3-7]에 도시되어 있다.
PCSK9 gRNA는 등가량의 시험관 내 전사된 SpCas9 mRNA MS002(1:1 중량비)과 함께 1차 인간 간세포에 공동 형질감염시키고 상세한 방법에 기재된 바와 같이 처리하였다. 광범위한 편집 활성을 관찰하였다(표 4; ND=결정되지 않음). 형질감염 후 5일에 편집 활성이 가장 높은 가이드는 GA001, GA002, GA007, 및 GA008이었다. 구조 가이드된 2'-OMe 무거운 가이드 RNA(gRNA) 설계인 GA007 및 GA008은 최소한으로 변형된 대조군 gRNA GA009보다 향상된 편집율을 보여주었다.
[표 4]
Figure pct00104
실시예 3 시험관 내 PCSK9 및 ANGPTL3 염기 편집
ABE8.8에 의한 PCSK9의 편집을 1차 간세포에서 관찰하였다. PCSK9 gRNA를 등가량의 시험관 내 전사된 ABE8.8 mRNA MA002(1:1 중량비)와 함께 1차 간세포에 공동 형질감염시키고 상세한 방법에 기재된 바와 같이 처리하였다. 한 세트의 실험에서, 추출된 게놈 DNA는 표적 부위 주변에서 생성된 PCR 앰플리콘의 차세대 시퀀싱으로 표적 스플라이스 부위의 염기 편집율에 대해 분석하였다. 샘플은 제조업체의 프로토콜에 따라 Nextera XT DNA 라이브러리 제조 키트(Illumina)를 사용하여 준비하였다. 간략하게, 첫 번째로 관심 영역을 증폭하기 위해, 두 번째로 차세대 시퀀싱 및 샘플 식별에 필요한 DNA 서열을 초기 생성물에 추가하기 위해 2회의 PCR을 수행하였다. 최종 앰플리콘은 제조업체의 프로토콜에 따라 Illumina MiSeq 기기에서 시퀀싱하였다. 다양한 편집 활성(표 5, 도 8)을 관찰하였으며 가이드 GA066, GA073 및 GA074가 가장 잘 수행하였다.
[표 5]
Figure pct00105
1차 인간 간세포의 데이터를 고려할 때, 다음 3개의 프로토스페이서 서열과 일치하는 PCSK9 표적화 gRNA가 1차 인간 간세포와 1차 시노몰구스 간세포 사이에서 최고의 교차 종 활성을 갖는 것으로 확인하였다: 5'-CCCGCACCTTGGCGCAGCGG-3' (서열 번호 13) (GA066), 5'-GCTTACCTGTCTGTGGAAGC-3' (서열 번호 67)(GA073), 및 5'-TGCTTACCTGTCTGTGGAAG-3' (서열 번호 68)(GA074). GA066 서열은 인간 PCSK9 인트론 1의 5' 말단에 있는 스플라이스 도너를 표적화하고 엑손 1로부터 번역된 비정상적인 PCSK9 단백질 이어서 인트론 1의 시작 부분으로부터 번역된 여러 아미노산(엑손 1에서 인트론 1로 번역 초과), 이어서 조기 정지 코돈을 생성할 것으로 예측된다(도 9). GA073 및 GA074 서열은 각각 인간 PCSK9 인트론 4의 5' 말단에 있는 스플라이스 도너를 표적화하며 엑손 1, 2, 3, 및 4로부터 번역된 비정상적인 PCSK9 단백질, 이어서 인트론 4로부터 번역된 여러 아미노산(엑손 4에서 인트론 4로 번역 초과), 이어서 조기 정지 코돈을 생성할 것으로 예측된다. 이들 각각의 경우에 예측된 조기 단축된 단백질은 자연 발생 야생형 인간 PCSK9 아미노산 서열의 일부와 거의 동일하게 일치하기 때문에 기능이 완전히 상실될 뿐만 아니라 최소 면역원성을 가질 가능성이 있다. 동일한 프로토스페이서 서열인 5'-CCCGCACCTTGGCGCAGCGG-3' (서열 번호 13)(GA066)은 시노 PCSK9 인트론 1의 5' 말단에 있는 스플라이스 도너를 유사하게 표적화하는 시노몰구스 원숭이 게놈에서 발견된다.
ABE8.8에 의한 ANGPTL3의 편집율을 1차 간세포에서 관찰하였다. ANGPTL3 gRNA를 등가량의 시험관 내 전사된 ABE8.8 mRNA MA004(1:1 중량비)와 함께 1차 간세포에 공동 형질감염시키고 상세한 방법에 기재된 바와 같이 처리하였다. 다음 프로토스페이서 서열 5'-AAGATACCTGAATAACCCTC-3' (서열 번호 15)(GA091)과 일치하는 인간 ANGPTL3-표적화 gRNA가 확인되었다. GA091 서열은 인간 ANGPTL3 인트론 6의 5' 말단에 있는 스플라이스 도너를 표적화하고 엑손 1, 2, 3, 4, 5 및 6으로부터 번역된 비정상적인 ANGPTL3 단백질, 이어서 인트론 6의 시작으로부터 번역된 여러 아미노산 서열(엑손 6에서 인트론 6으로 번역 초과), 이어서 조기 정지 코돈(도 10)을 생성할 것으로 예측된다. 특히, 동일한 스플라이스 도너를 파괴하고 rs398122985라는 명칭을 갖는 자연 발생 희귀 인간 DNA 변이체가 있다. gRNA는 1개의 뉴클레오티드가 상이한 오솔로그 이종 시노몰구스 스페이서 서열: 5'-AAGATACCTGAATAACTCTC-3' (서열 번호 14) (GA067)을 가지며 적당한 화학적 변형을 보유하는 gRNA를 합성하였다(표 1). 인간 1차 간세포에서 GA091과 시노몰구스 1차 간세포에서 GA067은 모두 ABE8.8 mRNA(프로토콜은 자세한 방법 섹션에 설명됨)와 공동 형질감염될 때 실질적인 스플라이스 편집으로 이어진다(표 6). RNA는 2500, 1250, 625 및 312.5ng/테스트 물품/mL에서 형질감염시켰으며, 2개의 복제물을 보고하였다(rep 1 및 rep 2).
[표 6]
Figure pct00106
유전자 기능을 파괴하기 위해 아데닌 염기 에디터를 사용할 수 있는 또 다른 전략은 미스센스 돌연변이(들)를 유전자의 코딩 영역에 도입하여 덜 기능적이거나 비기능적인 단백질을 생성하는 것이다. ANGPTL3 엑손에서 프로토스페이서를 표적화하는 가이드 RNA를 미스센스 돌연변이(들)를 도입하는 염기 편집 활성에 대해 평가하였다. 등가량의 시험관 내 전사된 ABE8.8 mRNA MA004와 각 gRNA(1:1 중량비)를 2500, 1250, 625 및 312.5 ng/RNA/mL로 2개의 복제물(rep 1 및 rep 2)로 1차 인간 간세포에 공동 형질감염시키고 자세한 방법에 기재된 바와 같이 처리하였다. 결과적인 염기 편집 효율과 하나의 잠재적인 아미노산 치환이 표 7에 나열되어 있다.
일부 실시양태에서, 아데닌 염기 에디터는 A, R, N, D, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, 및 V로부터 선택된 어느 하나의 아미노산을 동일하지 않은 아미노산 A, R, N, D, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, 및 V로 대체함으로써 유전자 기능을 파괴한다. 일부 실시양태에서, 아데닌 염기 에디터는 I를 T 또는 V로 치환함으로써 유전자 기능을 파괴한다. 일부 실시양태에서, 아데닌 염기 에디터는 D를 G로 치환함으로써 유전자 기능을 파괴한다. 일부 실시양태에서, 아데닌 염기 에디터는 E를 G로 치환함으로써 유전자 기능을 파괴한다. 일부 실시양태에서, 아데닌 염기 에디터는 F를 L 또는 P로 치환함으로써 유전자 기능을 파괴한다. 일부 실시양태에서, 아데닌 염기 에디터 는 H를 R로 치환함으로써 유전자 기능을 파괴한다. 일부 실시양태에서, 아데닌 염기 에디터는 L을 P로 치환함으로써 유전자 기능을 파괴한다. 일부 실시양태에서, 아데닌 염기 에디터는 S를 P로 치환함으로써 유전자 기능을 파괴한다. 일부 실시양태에서, 아데닌 염기 에디터는 M을 T로 치환함으로써 유전자 기능을 파괴한다. 일부 실시양태에서, 아데닌 염기 에디터는 N을 G로 치환함으로써 유전자 기능을 파괴한다. 일부 실시양태에서, 아데닌 염기 에디터는 Q를 R로 치환함으로써 유전자 기능을 파괴한다. 일부 실시양태에서, 아데닌 염기 에디터는 R을 G로 치환함으로써 유전자 기능을 파괴한다. 실시양태에서, 아데닌 염기 에디터는 T를 A로 치환함으로써 유전자 기능을 파괴한다. 일부 실시양태에서, 아데닌 염기 에디터는 V를 A로 치환함으로써 유전자 기능을 파괴한다. 일부 실시양태에서, 아데닌 염기 에디터는 Y를 C 또는 H로 치환함으로써 유전자 기능을 파괴한다. 실시양태에서, 아데닌 염기 에디터는 K를 G로 치환함으로써 유전자 기능을 파괴한다. 일부 실시양태에서, 아데닌 염기 에디터는 표 7에 열거된 아미노산 치환물을 도입함으로써 유전자 기능을 파괴한다.
[표 7]
Figure pct00107
Figure pct00108
Figure pct00109
Figure pct00110
Figure pct00111
5'-CCCGCACCTTGGCGCAGCGG-3' (서열 번호 13)(GA066) 프로토스페이서 서열과 일치하지만 다양한 종류의 보다 광범위한 화학적 변형을 포함하는 gRNA GA066/GA095, GA096, G097, GA346을 합성하였다(표 1). 유사하게, 5'-AAGATACCTGAATAACCCTC-3' (서열 번호 15)(GA091) 인간 프로토스페이서 서열에 일치하는 3개의 gRNA(GA098, GA099, GA100)뿐만 아니라, 5'-AAGATACCTGAATAACTCTC-3' (서열 번호 14)(GA067) 시노몰구스 프로토스페이서 서열에 일치하지만 다양한 종류의 보다 광범위한 화학적 변형을 가진 4개의 gRNA(GA067/GA101, GA102, GA103, GA347)을 합성하였다(표 1). GA066 및 GA095는 동일한 조성 및 변형 패턴을 포함하며, GA067 및 GA101도 서로 그렇다. 이러한 gRNA는 뉴클레아제 및 gRNA 염기 에디터 복합체에 대한 안정성을 개선하고, gRNA 유발 면역 반응을 감소 또는 억제할 수 있는 것으로 고려된다. 표 8에 기재된 각각의 gRNA를 등가량의 시험관 내 전사된 ABE8.8 mRNA MA002 (1:1 중량비)와 MessengerMax 시약에 의해 다양한 희석액을 사용하여 1차 인간 간세포 및 1차 시노몰구스 간세포에 공동 형질감염시켜 다양한 농도의 테스트 물품에서 편집 활성에 대해 평가하였다. 형질감염 3일 후, 게놈 DNA를 간세포로부터 수거하고, 차세대 시퀀싱으로 표적 스플라이스 부위의 염기 편집에 대해 평가하였다. 인간 및 시노몰구스 간세포 둘 다에서, 표적 스플라이스 부위(PCSK9 인트론 1 스플라이스 도너; ANGPTL3 인트론 6 스플라이스 도너)의 60%-70%만큼 높은 편집율이 관찰되었다(표 8).
[표 8]
Figure pct00112
고전적인 CRISPR/Cas9가 궁극적으로 삽입-결실을 도입하여 유전자를 파괴하는 방법은 염기 편집과 뚜렷하고 현저하게 다르다. 특히, 염기 편집은 CRISPR/Cas9에서 일상적으로 볼 수 있듯이 PAM에서 3-4bp 떨어진 것과 반대로 프로토스페이서의 5' 영역에 더 가까운 표적 창 내에 염기 돌연변이(들)를 도입하는 데 사용된다. 또한, CRISPR/Cas9 편집이 매우 쉬운 표적 영역이 해당 위치에서 염기 편집이 발생할 것이라는 것을 반드시 의미하지는 않으며 그 반대의 경우도 마찬가지이다. (1) Cas9 mRNA MS010 및 5'-CCCGCACCTTGGCGCAGCGG-3' (서열 번호 13) (GA097) 프로토스페이서 서열에 일치하는 gRNA; 또는 (2) ABE8.8 mRNA MA004 및 5'-CCCGCACCTTGGCGCAGCGG-3' (서열 번호 13) (GA097) 프로토스페이서 서열에 일치하는 gRNA를 함유하는 LNP를 인간 1차 간세포에 형질감염시켰다. 편집된 게놈 DNA의 생어 시퀀싱을 수행하여 염기 편집과 비교하여 CRISPR/Cas9에서 발생한 유전자 편집의 차이를 설명하였다(도 11). 화살표는 주요 염기 편집 위치를 강조 표시하는 한편, 가위는 Cas9가 절단하는 일반 영역을 강조 표시한다.
스플라이스 부위의 염기 편집이 스플라이싱을 방해한다는 것을 입증하기 위해, 엑손 1 및 엑손 2의 프라이머를 사용하여 처리된 1차 인간 간세포로부터 mRNA의 역전사 PCR을 수행하였다. 결과는 스플라이스 부위 파괴가 프레임 내 TAG 정지 코돈의 훨씬 하류에 인트론 1 내의 대체 스플라이스 도너 부위의 사용을 초래했음을 확인해 주었다(도 12, 표 9). 이 표는 차세대 시퀀싱에서 결정된 바와 같이 각 스플라이스 부위 도너에 대해 맵핑된 리드(read) 수를 보고한다.
[표 9]
Figure pct00113
실시예 4. 시험관 내 PCSK9 및 ANGPTL3 오프 타겟 검증
생체 내 인간 간에서 PCSK9를 녹다운시키는 염기 편집 요법의 안전성을 확립하기 위한 관점에서, 오프 타겟 돌연변이유발 분석을 평가하였다. 오프 타겟 돌연변이유발을 위한 인간 게놈의 후보 부위 목록을 두 가지 상이한 방법을 사용하여 수집하였다. 첫 번째 방법은 인간 게놈의 생물정보학 분석을 사용하여 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9(따라서 ABE 8.8)와 호환되는 PAM 서열과 서열 5'-CCCGCACCTTGGCGCAGCGG-3' (서열 번호 13)와 최대 4개의 단일 뉴클레오티드 미스매치가 있는 프로토스페이서 서열이 있는 모든 부위를 식별하였다. 후보 부위를 생성하기 위한 두 번째 방법은 ABE8.8 염기 에디터 단백질 및 PCSK9 gRNA(5'-CCCGCACCTTGGCGCAGCGG-3'(서열 번호 13))를 포함하는 리보핵단백질이 라이브러리에서 올리고뉴클레오티드를 절단하는 경향을 결정하는 시험관 내 생화학 분석법인 ONE-seq를 사용하였다. 참조 인간 게놈(GRCh38)을 PCSK9 gRNA(5'-CCCGCACCTTGGCGCAGCGG-3' (서열 번호 13))에 의해 지정된 프로토스페이서 서열에 최대 6개의 미스매치가 있는 부위에 대해 검색하였고, Cas-Designer를 사용하여 최대 4개의 미스매치 및 최대 2개의 DNA 또는 RNA 돌출이 있는 부위를 식별하였다. ONE-seq 라이브러리 제조, 실험 프로토콜, 및 생물정보학 분석에 대한 자세한 내용은 추가 세부 방법 섹션에 설명되어 있다.
절단된 모든 올리고뉴클레오티드는 PCR 증폭하고 차세대 시퀀싱을 거친다. 더 높은 서열 수를 갖는 올리고뉴클레오티드는 시험관 내 Cas9/gRNA 절단에 대한 더 높은 경향을 반영하고 세포에서 오프 타겟 돌연변이유발을 겪을 가능성이 가장 높은 부위를 나타낸다. ONE-seq 분석에 의해 식별된 상위 부위가 온 타겟 PCSK9 부위였다. 오프 타겟 부위 후보 목록은 250개 이상의 부위를 포함하며, 추가 조사가 필요하였다(표 10).
1차 인간 간세포를 ABE8.8 mRNA MA004 및 PCSK9 gRNA(GA097 또는 GA346)를 1:1 중량비로 캡슐화하는 지질 나노입자(LNP)로 처리하였다(LNP 제제에 대한 자세한 내용에 대해 지질 나노입자 제제 및 분석 참조). Agilent SureSelect 기술을 사용한 차세대 시퀀싱(표 11) 시, 대조군 세포에서 관찰된 염기 편집 비율을 온 타겟 부위 및 후보 오프 표적 부위에 걸쳐 LNP 처리된 세포에서 관찰된 염기 편집 비율에서 뺀 경우(차세대 시퀀싱에 내재되어 있는 배경 시퀀싱 오류를 설명하기 위해), 온 타겟 PCSK9 표적 부위에서 상당한 염기 편집이 관찰되었다. 이러한 결과는 2명의 남성 환자와 1명의 여성 환자의 3가지 상이한 1차 간세포 로트(STL, HLY, 및 JLP)에서 반복되었다.
추가로, 4명의 개별 기증자의 간세포(위에 나열된 3개의 로트 외에 여성 환자의 로트 TLY 포함)를 사용하여 LNP 처리된 대 미처리된 간세포로부터 표적화된 PCR 앰플리콘의 차세대 시퀀싱을 수행하여 50개 이상의 오프 타겟 부위를 평가하였다. 이들 잠재적인 오프 타겟 부위 중 어느 곳에서도 편집이 관찰되지 않았고 PCSK9 표적 부위에서 온 타겟 편집만이 관찰되었다(도 13).
[표 10]
Figure pct00114
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[표 11]
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Figure pct00133
아데닌 염기 에디터는 데옥시아데노신 데아미나아제 도메인을 통해 gRNA 비의존적 RNA 편집을 유도하는 것으로 보고되었다. gRNA 비의존적 RNA 편집을 평가하기 위해 1차 인간 간세포를 mRNA 및 PCSK9 gRNA(n = 4 생물학적 복제물), SpCas9 mRNA 및 gRNA(n = 4)로 처리하거나 처리하지 않았다(n = 4). 2일 후에 RNA를 추출하고 추가 세부 방법 섹션에 설명된 바와 같이 처리하였다. ABE8.8- 및 SpCas9-처리된 간세포의 RNA 프로파일을 미처리된 간세포와 비교하면, ABE8.8처리된 간세포에서 실질적인 RNA 편집이 관찰되지 않았다(도 14). 각 복제물을 4개의 미처리된 간세포 샘플 각각에 대해 비교하여 두 조건에 공통적인 편집이 있는 모든 위치를 제거하였다. jitter 플롯은 처리된 샘플에서 편집이 있는 트랜스크립톰 유전자좌를 나타낸다(숫자는 처리된 샘플에서 식별된 총 편집된 유전자좌를 나타내고, 상자 플롯은 샘플의 편집된 모든 유전자좌에서 편집된 리드의 비율의 중앙값 ± 사분위수 범위를 나타냄).
gRNA의 스페이서 또는 tracr 부분에 대한 변형 및/또는 단축을 GA066 스페이서(5'-CCCGCACCTTGGCGCAGCGG-3'(서열 번호 13))의 변경에 의해 평가하였다(표 12). 가이드에 대한 변형은 온 타겟 편집 효율을 개선하고/거나 오프 타겟 편집 효율을 개선하는 데 도움이 될 수 있다. 각각의 gRNA를 등가량의 시험관 내 전사된 ABE8.8 mRNA(1:1 중량비)와 함께1차 인간 간세포 및 1차 시노몰구스 간세포에 공동 형질감염시키고 상세한 방법에 기재된 바와 같이 처리하였다.
[표 12]
Figure pct00134
생체 내 인간 간에서 ANGPTL3을 녹다운시키는 염기 편집 요법의 안전성을 확립하기 위한 관점에서, 오프 타겟 돌연변이유발을 위한 인간 게놈의 후보 부위 목록을 두 회 상이한 방법을 사용하여 수집하였다. 첫 번째 방법은 인간 게놈의 생물정보학 분석을 사용하여 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9(따라서 ABE 8.8)와 호환되는 PAM 서열과 GA100 스페이서 서열 5'-AAGATACCTGAATAACTCTC-3' (서열 번호 14)와 최대 4개의 단일 뉴클레오티드 미스매치가 있는 프로토스페이서 서열이 있는 모든 부위를 식별하였다.
후보 부위를 생성하는 두 번째 방법은 ABE8.8 염기 에디터 단백질 및 gRNA GA441을 포함하는 리보핵단백질이 라이브러리에서 올리고뉴클레오티드를 절단하는 경향을 결정하는 시험관 내 생화학적 분석인 ONE-seq를 사용하였다. 참조 인간 게놈(GRCh38)을 ANGPTL3 gRNA(5' -AAGATACCTGAATAACTCTC-3' (서열 번호 14))에 의해 지정된 프로토스페이서 서열에 최대 6개의 미스매치가 있는 부위에 대해 검색하였고, Cas-Designer를 사용하여 최대 4개의 미스매치 및 최대 2개의 DNA 또는 RNA 돌출이 있는 부위를 식별하였다. ONE-seq 라이브러리 제조, 실험 프로토콜, 및 생물정보학 분석에 대한 자세한 내용은 추가 세부 방법 섹션에 설명되어 있다.
더 높은 서열 수를 갖는 올리고뉴클레오티드는 시험관 내 Cas9/gRNA 절단에 대한 더 높은 경향을 반영하고 세포에서 오프 타겟 돌연변이유발을 겪을 가능성이 가장 높은 부위를 나타낸다. 상위 후보 부위는 표 13에서 식별되어 있다. 후보 부위의 검증은 ANGPTL3 편집되고 미처리된 인간 1차 간세포를 사용하여 수행하였다. 차세대 시퀀싱(표 14) 시, 대조군 세포에서 관찰된 염기 편집 비율을 온 타겟 부위 및 후보 오프 표적 부위에 걸쳐 LNP 처리된 세포에서 관찰된 염기 편집 비율에서 뺀 경우(차세대 시퀀싱에 내재되어 있는 배경 시퀀싱 오류를 설명하기 위해), 온 타겟 ANGPTL3 표적 부위에서 상당한 염기 편집이 관찰되었다.
[표 13]
Figure pct00135
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[표 14]
Figure pct00153
Figure pct00154
Figure pct00155
gRNA의 스페이서 또는 tracr 부분에 대한 변형 및/또는 단축을 gRNA GA100 스페이서(5'-AAGATACCTGAATAACCCTC-3'(서열 번호 15))의 변경에 의해 평가하였다(표 15). 가이드에 대한 변형은 온 타겟 편집 효율을 개선하고/거나 오프 타겟 편집 효율을 개선하는 데 도움이 될 수 있다. 추가로, 4개의 상이한 ABE8.8 mRNA를 2개의 상이한 실험(하기 표에서 분리됨)에서 평가하였다(MA004, MA040, MA041, MA045; 표 23). 각각의 gRNA를 등가량의 시험관 내 전사된 ABE8.8 mRNA(1:1 중량비)와 함께 5000, 2500 및 1250 ng/RNA/mL에서 1차 인간 간세포 및 1차 시노몰구스 간세포에 공동 형질감염시키고 기재된 바와 같이 처리하였다.
[표 15]
Figure pct00156
Figure pct00157
최고 용량의 5,000ng/RNA/mL 에서 변경된 gRNA/mRNA 조합에 대한 오프 타겟 분석은 오프 타겟 편집을 나타내는 이전에 식별된 2개 부위에 대해 수행하였다(표 16). 프로토스페이서에 걸쳐 계산된 편집 백분율을 합산하고 음성 대조군 편집율%을 차감하였다. 이 데이터는 가이드 및/또는 ABE mRNA에 대한 변형이 오프 타겟 편집 효율을 향상시킨다는 것을 보여준다.
[표 16]
Figure pct00158
ABE8.8 mRNA 및 PCSK9 인트론 1의 5' 말단에서 스플라이스 도너를 표적화하는 인간/시노몰구스 5'-CCCGCACCTTGGCGCAGCGG-3' (서열 번호 13) 서열(GA066)과 일치하는 gRNA를 함유하는 지질 나노입자를 1:1 중량비로 제제화하였다. LNP는 다양한 농도의 테스트 물품에서 편집 활성을 평가하기 위해 다양한 희석액을 사용하여 1차 인간 간세포 및 1차 시노몰구스 간세포에 투여하였다. Cas9 mRNA와 또 다른 유전자 ANGPTL3의 프로토스페이서 서열과 일치하는 gRNA를 포함하는 LNP를 양성 대조군으로 이 실험에 사용하였다. 이 Cas9 mRNA/gRNA 조합은 1차 인간 간세포, 1차 시노몰구스 간세포 및 생체 내 시노몰구스 간에서 높은 수준의 게놈 편집 활성을 생성하는 것으로 이전에 관찰되었기 때문에 선택하였다. ABE8.8/GA066 LNP는 편집과 관련하여 대조군 LNP를 실질적으로 능가하여 인간 및 시노몰구스 간세포 모두에서 훨씬 더 높은 효능을 나타내는 것으로 관찰되었다(도 15).
실시예 5. 마우스에서 Pcsk9 유전자 편집
SpCas9 mRNA 및 상이한 tracr 설계(GA052, GA053, GA054, 및 GA055)을 갖는 마우스 Pcsk9 표적화 gRNA를 1:1 중량비로 포함하는 LNP를 제제화하였다. 야생형 C57BL/6 마우스에 2 mg/kg의 LNP 테스트 물품을 투여하였다. 투여 7일 후, 마우스를 안락사시키고 마우스 간으로부터 게놈 DNA를 수거한 다음, 차세대 시퀀싱으로 표적 부위의 편집에 대해 평가하였다. GA052, GA054 및 GA055는 모두 이전에 개시된 tracr 설계를 가진 GA053을 능가하였다(도 16).
실시예 6. 마우스에서 Pcsk9 염기 편집
ABE8.8 mRNA 및 마우스 Pcsk9 표적화 gRNA를 1:1 중량비로 함유하는 LNP를 제제화하였다. 이 gRNA는 5'-CCCATACCTTGGAGCAACGG-3'(서열 번호 69) 프로토스페이서 서열과 일치하며, 이는 PCSK9 인트론 1의 5' 말단에서 스플라이스 도너를 표적화하는 인간 5'-CCCGCACCTTGGCGCAGCGG-3'(서열 번호 13) 서열(GA066, GA095, GA096, GA097 및 GA346에 의해 일치)의 마우스 오솔로그이다. 야생형 C57BL/6 마우스에 2 mg/kg의 LNP 테스트 물품을 총 부피 10 ml/kg로 측면 꼬리 정맥 또는 안와후를 통해 투여하였다. 투여 7일 후, 마우스를 안락사시키고 마우스 간으로부터 게놈 DNA를 수거한 다음, 차세대 시퀀싱으로 표적 스플라이스 부위의 염기 편집에 대해 평가하였다. 표적 스플라이스 부위의 대략 60% 편집이 관찰되었으며(마우스 Pcsk9 인트론 1 스플라이스 도너)(도 17), 이는 생체 내 간에서 PCSK9를 녹다운시키는 염기 편집 요법의 개념의 전임상 증거를 제공한다.
후속 연구에서, ABE8.8 mRNA와 마우스 Pcsk9 표적화 gRNA를 1:1 중량비로 함유하는 LNP를 제제화하고 0-2.0 mg 총 RNA/kg 범위의 용량으로 야생형 C57BL/6 마우스에 투여하였다. 0.05mg RNA/kg의 낮은 용량은 높은 편집율(>45%)을 나타낸 반면, 염기 편집의 포화는 약 0.25mg RNA/kg 용량에서 발생하였다(도 18).
추가 연구에서, ABE8.8 mRNA와 마우스 Pcsk9 표적화 gRNA를 포함하는 LNP를 1:1-1:6 및 2:1-6:1 범위의 mRNA와 gRNA의 서로 다른 중량비로 제제화하였다. 이 gRNA는 5'-CCCATACCTTGGAGCAACGG-3'(서열 번호 69) 프로토스페이서 서열과 일치하며, 이는 PCSK9 인트론 1의 5' 말단에서 스플라이스 도너를 표적화하는 인간 5'-CCCGCACCTTGGCGCAGCGG-3'(서열 번호 13) 서열(GA066, GA095, GA096, GA097 및 GA346에 의해 일치)의 마우스 오솔로그이다. 야생형 마우스에 0.05 mg/kg 총 RNA 용량으로 LNP를 투여하였다. 또한, 동일한 mRNA 및 5'-CCCATACCTTGGAGCAACGG-3'(서열 번호 69) 프로토스페이서 서열과 일치하지만 안정성을 개선하기 위해 tracr에 변형이 있는 2개의 가이드, GA255 및 GA257로 구성된 2개의 개별 LNP도 마우스에 주사하였다. 투여 7일 후, 마우스를 안락사시키고 마우스 간으로부터 게놈 DNA를 수거한 다음, 차세대 시퀀싱으로 표적 스플라이스 부위의 염기 편집에 대해 평가하였다(도 19). 염기 편집은 많은 비율에서 비슷하였으며, 1:6 및 6:1(gRNA:mRNA)이 가장 불량하였다. tracr이 변형된 가이드는 편집 효율을 높였다.
실시예 7. 마우스에서 Angptl3 염기 편집
ABE8.8 mRNA 및 마우스 Angptl3 표적화 gRNA(GA258, GA259, GA260, GA349, GA353)를 1:1 중량비로 함유하는 LNP를 제제화하였다. 야생형 C57BL/6 마우스에 0.05 mg/kg 총 RNA 용량으로 LNP 테스트 물품을 투여하였다. 나중에 마우스를 안락사시키고 마우스 간으로부터 게놈 DNA를 수거한 다음, 차세대 시퀀싱으로 표적 스플라이스 부위의 염기 편집에 대해 평가하였다(도 20).
비인간 영장류(NHP)에서 생체 내 평가
실시예 8. PCSK9/ABE의 평가
먼저, LNP 투여를 통해 특정 gRNA 및 염기 에디터 뉴클레아제 ABE 8.8을 사용하여 시노몰구스 원숭이에서 PCSK9 유전자의 편집을 평가하기 위해 2주간 연구를 수행하였다(도 21). 간에서 PCSK9 유전자의 높은 수준의 염기 편집을 생성하기 위해 ABE8.8/GA066 LNP를 3 mg/kg(n = 3마리 동물) 및 1 mg/kg(n = 2마리 동물)의 두 가지 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이에게 투여하였다. 테스트 물품 투여 2주 후, 임상 화학 분석 및 PCSK9 ELISA 분석을 위해 혈액 샘플을 수집하고, 간 샘플, 간의 4개의 엽 각각으로부터 각각 2개의 샘플(각 동물에서 총 8개)을 수집하기 위해 동물을 부검하였다.
간 표본의 편집 분석은 차세대 시퀀싱으로 수행하였다. 3 mg/kg 용량에서 간 샘플의 표적 스플라이스 부위에서 아데닌 염기의 평균 55% 편집율이 관찰되었고, 1 mg/kg 용량에서, 간 샘플의 표적 스플라이스 부위에서 아데닌 염기의 평균 24% 편집율이 관찰되었다(도 22). PCSK9 ELISA 분석을 위해, 투여 전 D-10, D-7 및 D-5일(평균 표시) 및 투여 후 D8 및 D15에 동물로부터 혈액 샘플을 수집하였다. 투여 후 2주에 3 mg/kg 군에서 투여 전 수준과 비교하여 혈중 PCSK9 단백질 수준에서 평균 76% 감소가 있었고(도 23), 1 mg/kg 군에서 혈중 PCSK9 단백질 수준에서 32% 감소가 있었다(표 17). 저밀도 지단백질 콜레스테롤(LDL-C)은 표준 임상 분석기를 사용하여 투여 전 및 D8 및 D15에 채취한 혈청 샘플에서 측정하였다(표 18). 3 mg/kg 군에서 혈중 저밀도 지단백 콜레스테롤(LDL-C) 수준이 평균 57% 감소하였으며(도 24), 1 mg/kg군에서 혈중 LDL-C 수준이 평균 25% 감소하였다.
[표 17]
Figure pct00159
[표 18]
Figure pct00160
후속 실험에서 LNP는 1.0 mg/kg 용량으로 정맥 내 주입을 통해 원숭이에게 전달하였다. LNP 주입 후 2주에 부검을 받은 3마리의 원숭이에 대해, 간에서 PCSK9 스플라이스 부위 아데닌의 평균 63% 염기 편집 빈도가 있었고, 프로토스페이서의 다른 곳에서 관찰된 방관자 염기 편집이 관찰되지 않았고(도 25); 평균 삽입-결실 빈도는 0.5%였다. 편집은 혈중 PCSK9 수준의 평균 81% 감소와 혈중 LDL-C 수준의 평균 65% 감소를 동반하였다. LNP 주입 후 24시간에 부검을 받은 두 마리의 원숭이의 경우 평균 편집 빈도가 48%였다.
후속 단기 용량 반응 연구(0.5, 1.0, 및 1.5 mg/kg 용량, 각각 3마리의 원숭이, 2주에 부검)에서, 모든 용량은 >50%의 평균 염기 편집 비율을 달성하였다. PCSK9 편집 및 PCSK9 단백질 및 LDL-C의 감소는 ≥1.0 mg/kg의 용량에서 포화되는 것으로 나타났다(도 26).
이 연구에서 본 연구자들은 간 기능 검사를 평가하였으며 일부 군에서는 AST 및 ALT의 중간 정도의 상승을 기록했는데, 이는 첫 주 종료까지 대부분 분석되었고 LNP 주입 후 2주까지 완전히 분석되었으며 어떤 동물에서도 건강 이상 반응이 관찰되지 않았다. 다양한 조직에서 염기 편집을 분석할 때, 본 발명자들은 간이 주요 편집 부위임을 발견했으며, 비장과 부신에서 훨씬 낮은 편집율이 관찰되었고 다른 곳에서는 최소한의 편집율이 관찰되었다(도 27).
[표 25]
Figure pct00161
추가 연구에서 다양한 tracr 설계를 평가하였다. LNP는 달리 명시되지 않는 한 1.0 mg/kg 총 RNA 용량으로 정맥 내 주입을 통해 NHP로 전달하였다. 간의 염기 편집을 평가하였고, 몇몇 가이드는 문헌 tracr를 가진 GA066을 능가하였다(도 28).
동일한 NHP 연구에서, 1) Cas9 mRNA 및 5'-CCCGCACCTTGGCGCAGCGG-3'(서열 번호 13)(GA097) 프로토스페이서 서열과 일치하는 gRNA;. 또는 2) ABE8.8 mRNA 및 5'-CCCGCACCTTGGCGCAGCGG-3'(서열 번호 13)(GA097) 프로토스페이서 서열과 일치하는 gRNA를 함유하는 LNP를 NHP에 정맥 내로 전달하였다. 중요하게도, 고전적인 CRISPR/Cas9가 궁극적으로 삽입-결실을 도입하여 유전자를 파괴하는 방법은 염기 돌연변이가 발생한 염기 편집과 상이하다. 또한, CRISPR/Cas9 편집이 매우 쉬운 표적 영역이 해당 위치에서 염기 편집이 발생할 것이라는 것을 반드시 의미하지는 않으며 그 반대의 경우도 마찬가지이다. 이것은 SpCas9/gRNA를 함유하는 LNP가 낮은 간 편집율을 초래한 반면(<5%), ABE8.8/gRNA를 함유하는 LNP가 SpCas9/gRNA 용량(1.5 mg/kg)보다 낮은 용량(1 mg/kg)으로 40%에 가까운 상당히 더 높은 편집율을 나타낸 NHP 연구에서 강조된다(도 29).
또 다른 연구에서는, 두 LNP를 0.5mg/kg-3.0mg/kg 범위의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 NHP에 전달한 후 염기 편집 활성에 대해 비교하였다. 두 LNP 모두 높은 효율을 나타냈으며, 50% 초과의 평균 편집율을 나타내는 0.5mg/kg의 낮은 용량에서 첫 번째 LNP(LNP#1)가 두 번째 LNP(LNP#2)를 능가하였다(도 30). 과거 실험과 유사하게, PCSK9 단백질 수준은 스플라이스 부위에서 높은 수준의 염기 편집 시 유의하게 감소하여 순환하는 PCSK9 단백질을 80-90%까지 감소시켰다(도 31).
장기 연구(4마리 동물, 2주에 간 생검)에서 LNP를 3.0 mg/kg의 고용량으로 정맥 내 주입하여 약물 내약성과 PCSK9 단백질의 지속성 및 PCSK9 편집으로 인한 LDL-C 감소를 평가하였다. 간 생검 샘플은 평균 66%의 염기 편집 빈도를 나타내었다(도 32). 혈중 PCSK9 단백질 수준은 1주일까지 저점에 도달했으며 그 후 적어도 6개월까지 안정적으로 유지되어 대략 90%로 감소하였다(도 33). 혈중 LDL-C 및 지단백질(a)[Lp(a)] 수준은 유사하게 8개월까지 지속되는 안정적인 최저치를 달성하여 각각
Figure pct00162
60% 및
Figure pct00163
35%로 감소하였다(도 34, 도 35).
LNP 주입 후 2주까지 완전히 분석된 AST 및 ALT의 일시적이고 중간 정도의 상승이 있었고(도 36), 다른 간 기능 검사에는 전혀 변화가 없었고 현재까지 관찰된 건강 이상 반응은 없었다(도 37). 중요하게는, 늦은 AST 및 ALT 상승 없이 8개월 동안 PCSK9 및 LDL-C 감소의 지속은 이러한 반응이 규모에 상관없이 치료의 효능에 부정적인 영향을 미치지 않는다는 것을 보여준다.
1차 시노 간세포 및 원숭이 간 샘플에서 ABE8.8/gRNA(GA346에 일치하는 프로토스페이서) LNP 매개 오프 타겟 편집을 평가하기 위해, gRNA 스페이서 서열에 대한 상동성에 의해 선택된 합성 시노몰구스 게놈 라이브러리로 ONE-seq를 수행하였다. 이 라이브러리를 ABE8.8 단백질과 PCSK9 gRNA로 처리하고, PCSK9 표적 부위가 최상위 부위인 상위 48개 ONE-seq 지정 부위(도 38)를 LNP 처리 대 미처리 NHP 샘플로부터의 표적화된 PCR 앰플리콘의 차세대 시퀀싱으로 평가하였다(도 39).
LNP 처리된 1차 시노몰구스 간세포에서, PCSK9 표적 부위에서의 편집 외에, 인간 게놈과의 상동성이 높지 않은 C5로 지정된 한 부위에서만 명백한 오프 타겟 편집율(평균 <1%)이 있었다(도 39). 1.0 mg/kg LNP 용량으로 처리된 원숭이의 간 샘플에서 동일한 48개 부위를 평가하여(앞서 언급한 용량-반응 연구에서), C5 부위에서만 낮은 수준의 오프 타겟 편집율(평균 <1%)이 관찰되었다(도 40). 0.5 mg/kg LNP 용량으로 오프 타겟 편집이 없었고 1.5 mg/kg LNP 용량으로 단지 낮은 수준의 오프 타겟 편집(평균 <1%)이 감지되었다.
실시예 9. ANGPTL3/ABE의 평가
ABE/PCSK9 가이드(들)로 수행한 NHP 연구와 유사하게, 간에서 ANGPTL3의 높은 수준의 염기 편집을 생성할 목적으로 ABE8.8 mRNA 및 5'-AAGATACCTGAATAACTCTC-3'(서열 번호 14)(GA067) 시노몰구스 스페이서가 있는 gRNA로 제제화된 LNP를 3 mg/kg(n = 3마리 동물) 및 1 mg/kg(n = 2마리 동물)의 2가지 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이에 투여하였다. 테스트 물품 투여 2주 후, 임상 화학 분석 및 ANGPTL3 ELISA 분석을 위해 혈액 샘플을 수집하고, 간 샘플 수집을 위해 동물을 부검하였다. 간의 각 엽의 중심과 주변에서 작은 부분을 절제하고 액체 질소에서 급속 동결하고 -86 내지 -60℃에 보관하였다. 스플라이스 부위 편집을 차세대 시퀀싱으로 분석하여 염기 변화가 발생했음을 확인하였다. 최고 용량(3 mg/kg)에서 평균 61%의 아데닌 염기 편집이 간의 표적 스플라이스 부위에서 관찰되었다. 가장 낮은 용량(1 mg/kg)에서 관찰된 편집율은 간의 표적 스플라이스 부위에서 28%였다(표 19).
또한, 혈액 샘플을 투여 전, 투여 후 D7 및 D15에 수집하여 혈청 ANGPTL3 및 트리글리세리드를 측정하였다. 투여 후 2주에 더 높은(3 mg/kg) 및 더 낮은(1 mg/kg) 투여 군에서 투여 전 수준과 비교하여 혈중 ANGPTL3 단백질 수준에서 평균 90% 및 31% 감소가 있었다(표 20).
[표 19]
Figure pct00164
[표 20]
Figure pct00165
트리글리세리드는 표준 임상 분석기를 사용하여 투여 전 및 D8 및 D15에 채취한 혈청 샘플에서 측정하였다. ABE8.8 및 GA067을 사용한 LNP 매개 ANGPTL3 염기 편집에 대한 혈청 트리글리세리드 감소는 표 21에 요약되어 있다. 트리글리세리드 수준은 ANGPTL3을 표적화하는 염기 에디터 ABE8.8 및 GA067 1 mg/kg 및 3 mg/kg의 용량에 반응하여 24% 및 59% 감소하였다.
[표 21]
Figure pct00166
또 다른 독립적인 연구에서, 간에서 ANGPTL3의 높은 수준의 염기 편집을 생성할 의도로 동일한 ABE8.8/GA067 LNP를 3 mg/kg(n = 3마리 동물)의 정맥 주입을 통해 시노몰구스 원숭이에게 투여하였다. 테스트 물품 투여 2주 후, 임상 화학 분석을 위해 혈액 샘플을 수집하고, 간 샘플 수집을 위해 동물에 간 생검을 시행하였다. 3 mg/kg 용량에서, 표적 스플라이스 부위에서 아데닌 염기의 평균 60% 편집율이 간 생검 샘플에서 달성되었다. 일치하게, 투여 후 2주에 투여 전 수준과 비교하여 혈중 ANGPTL3 단백질 수준에서 평균 95% 감소가 있었고 혈중 트리글리세리드 수준에서 평균 64% 감소가 있었다(도 41). 이러한 결과는 생체 내 간에서 ANGPTL3를 녹다운시키고 혈액 ANGPTL3 단백질 및 트리글리세리드 수준을 감소시키는 염기 편집 요법의 개념에 대한 추가적인 전임상 증거를 제공한다.
실시예 10. 이중 PCSK9 및 ANGPTL3 염기 편집의 평가
단일 테스트 물품으로 PCSK9 및 ANGPTL3의 동시 염기 편집에 영향을 미칠 수 있는지 여부를 평가하기 위해 3가지 구성요소 ABE8.8 mRNA, PCSK9 표적화 gRNA(GA095), 및 ANGPTL3 표적화 gRNA(GA098)의 혼합물을 2:1:1 중량비로 함유하는 LNP를 제제화하였다. 1차 인간 간세포를 LNP의 다양한 희석액과 함께 인큐베이션하였다. 인큐베이션 3일 후, 간세포로부터 게놈 DNA를 수거한 다음 차세대 시퀀싱으로 표적 스플라이스 부위의 염기 편집에 대해 평가하였다. 가장 높은 LNP 농도에서, PCSK9 스플라이스 부위(인트론 1 스플라이스 도너)의
Figure pct00167
40% 편집 및 ANGPTL3 스플라이스 부위(인트론 6 스플라이스 도너)의
Figure pct00168
40% 편집이 관찰되었으며(도 42), 이는 단일 테스트 물품으로 인간 간세포의 이중 유전자 파괴의 실행가능성을 입증하고 PCSK9 및 ANGPTL3을 동시에 녹다운시키는 단일 염기 편집 요법의 개념에 대한 전임상 증거를 제공하며, 이는 인간 수여자의 혈중 LDL 콜레스테롤 수준 및 혈중 트리글리세드 수준을 모두 상당히 감소시킬 것으로 예측될 것이다. 이 접근 방식의 장점은 표준 CRISPR-Cas9와 대조적으로 염기 에디터가 편집을 위해 이중 가닥 파손(DSB)을 필요로 하지 않기 때문에 게놈에서 2가지 상이한 부위의 동시 표적화에 내재된 염색체 재배열 또는 기타 구조적 변화의 위험이 상당히 낮다는 것이다.
1) 투여된 LNP의 두 번째 용량이 표적 유전자의 편집을 유발할 수 있는지; 2) 상이한 표적을 염기 편집할 수 있는 지를 다루기 위해 추적 NHP 연구를 수행하였다. ABE8.8 mRNA 및 PCSK9를 표적화하는 gRNA(GA346) 또는 ANGPTL3을 표적화하는 gRNA(GA347)로 제제화된 LNP를 0.5-2mg/kg 범위의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이에게 투여하였다. 테스트 물품 투여 2주 후, 염기 편집에 대해 평가하기 위해 생검을 수행하였다. 연구 개시로부터 30일 후, 반대의 LNP를 투여하였다. 추가 2주 후 두 번째 생검 후 gDNA를 추출하고 차세대 시퀀싱을 사용하여 염기 편집을 평가하였다. 이 연구의 결과는 PCSK9 및 ANGPTL3 표적 모두의 높은 수준의 편집이 LNP의 첫 번째 및 두 번째 용량 후에 달성되었음을 보여준다(도 43). 혈액 샘플은 생검 시점 둘 모두에서 수집하였고, 1mg/kg LNP로 후속 투여한 후 순환하는 PCSK9 및 ANGPTL3에서 약 90%의 상당한 감소를 나타냈다(도 44). 동일한 연구에서 ABE8.8 mRNA, PCSK9 gRNA GA346 및 ANGPTL3 gRNA GA347을 1:0.5:0.5 중량비로 캡슐화하는 LNP를 2 mg/kg 총 RNA 용량으로 투여하여 강력한 동기화된 PCSK9 및 ANGPTL3 유전자 편집을 초래하였다(도 44, GA346+GA347(D1)로 표시된 상단 및 하단 데이터 - 상단 및 하단 패널은 PSCK9 및 ANGPTL3 편집율을 보여준다. 데이터는 강력한 다중 유전자 편집이 포유동물(및/또는 포유동물 세포)에서 ABE 염기 에디터 mRNA 및 둘 이상의 관심 유전자를 표적화하는 둘 이상의 gRNA의 단일 1회 용량 투여로 가능함을 입증한다. [도 44]는 ANGPTL3(하단) 및 PCSK9(상단) 단백질의 해당 녹다운을 반영한다.
또 다른 연구에서, NHP에 LNP를 반복 투여하였다(도 45). NHP에 ABE8.8 mRNA MA004 및 PCSK9 표적화 gRNA(GA097)로 제제화된 LNP#1 및 LNP#2를 0.5mg/kg의 총 RNA 용량으로 정맥 내 주입을 통해 투여하였다. NHP는 제30일 및 제60일에 추가 LNP 용량을 받았다. 아데노신 염기 편집 분석을 위해 제14일, 제46일 및 제75일에 간 생검을 추출하였다. 모든 gDNA를 추출하고 차세대 시퀀싱을 사용하여 염기 편집을 평가하였다. 이러한 결과는 ABE8.8 mRNA 및 PCSK9 gRNA를 함유하는 LNP의 반복 투여가 LNP의 첫 번째 용량 후에 편집 효율이 거의 30%인 반면 세 번째 용량 LNP 후에는 50% 이상이었기 때문에 간에서 부가적인 염기 편집을 유발한다는 것을 입증한다. 또한 부가적인 편집의 크기가 LNP에 의존하는 것으로 관찰되었다.
또한, LNP의 반복 투여는 NHP에서 PCSK9 단백질 수준을 감소시켰다(도 46). PCSK9 단백질 수준은 ABE8.8 mRNA MA004 및 PCSK9를 표적화하는 gRNA(GA097)로 제제화된 LNP로 반복 투여된 NHP에서 90일 동안 모니터링하였다. NHP에 제0일, 제30일 및 제60일에 0.5mg/kg의 총 RNA 용량으로 정맥 내 주입을 통해 투여하였다(투여를 나타내기 위해 화살표를 그래프에 표시함). PCSK9 단백질 수준 분석에 대한 설명은 자세한 방법 섹션을 참조한다. 기저 수준과 비교하여 PCSK9 단백질은 LNP의 초기 용량 후 거의 40% 감소하였지만 추가 용량 시에는 훨씬 더 감소하였다.
LNP의 반복 투여 후에 간 마커를 평가하였다(도 47). ALT, AST, 총 빌리루빈, 및 크레아틴 키나아제 수준을 ABE8.8 mRNA MA004 및 PCSK9 표적화 gRNA(GA097)로 제제화된 LNP로 반복 투여된 NHP에서 71일까지 평가하였다. NHP에 제0일, 제30일 및 제60일에 0.5mg/kg의 총 RNA 용량으로 정맥 내 주입을 통해 투여하였으며, 이는 각각 그래프에 D1, D2 및 D3으로 나타낸다. 간 생검은 그래프에서 각각 B1 및 B2로 표시된 제14일 및 제46일에 수행하였다. 그래프에 도시된 대로 여러 시점에서 혈액을 수집하였다. ALT와 AST는 투여 시 최소한으로 상승했지만, 이는 며칠의 기간 후에 정상으로 돌아오는 일시적인 반응이었다. 유사하게, 크레아틴 키나아제 수준은 투여 시 증가하였으며, 첫 번째 용량 후에 가장 큰 효과가 나타났고, 며칠의 기간 후에 기저 수준으로 돌아갔다.
ABE8.8 mRNA MA004 및 PCSK9 표적화 gRNA(GA097)로 제제화된 LNP로 반복 투여된 NHP에서 간 효소, LDH, GLDH, GGT 및 ALP를 평가하였다(도 48). NHP에 제0일, 제30일 및 제60일에 0.5mg/kg의 총 RNA 용량으로 정맥 내 주입을 통해 투여하였다. 그래프에 도시된 대로 여러 시점에서 혈액을 수집하였다. LDH와 GLDH가 투여 시 상승하였지만, 이는 며칠의 기간 후에 정상으로 돌아오는 일시적인 반응이었다.
또한, ANGPTL3의 장기간 아데닌 염기 편집을 비인간 영장류에서 평가하였다(도 49). 시노몰구스 원숭이에 ABE8.8 mRNA MA004 및 ANGPTL3 gRNA GA067을 포함하는 3 mg/kg 용량의 LNP 제제를 정맥 내 주입하였다. 그래프에 지정된 시점에서 혈액을 수집하고, ANGPTL3 단백질 수준(도 49a) 및 트리글리세리드 수준(도 49b)을 분석하였다. 대조군과 비교하여, ANGPTL3 단백질 수준(96% 감소)과 트리글리세리드 수준은 모두 유전자의 염기 편집 시 실질적으로 감소했으며 170일 이상 동안 안정적으로 감소된 상태를 유지한다.
사이토카인 활성화 및 면역 반응을 LNP를 받은 NHP에서 평가하였다. 한 세트의 연구에서, 시노몰구스 원숭이는 ABE8.8 mRNA MA004 및 PCSK9 gRNA GA346을 포함한 LNP 제제를 3개의 지정된 시점(도 50a 및 도 50b)에 0.5 mg/kg 용량의 정맥 내 주입을 받았다. 그래프에 지정된 시점에 혈액을 수집하여, IP-10 및 MCP-1을 분석하였다. 이러한 결과는 1) LNP를 받은 NHP가 대조군과 비교하여 사이토카인 활성화나 면역 반응의 증거가 없었으며 2) 동일한 LNP의 반복 투여가 사이토카인 활성화나 면역 반응을 유도하지 않음을 입증하였다.
추가 연구에서, IL-6, MCP-1, 및 SC5b-9(각각 도 50c, 도 50d, 및 도 50e)를 MA004 및 PCSK9 gRNA GA346으로 제제화된 LNP의 1.0 mg/kg의 총 RNA 용량의 정맥 내 주입을 받은 NHP로부터 수집된 혈액으로부터 상이한 시점에서 분석하였다. 이는 대조군과 비교하여 336시간까지/이전에 기준선으로 복귀한 최소 사이토카인/보체 활성화를 야기하였다.
실시예 11. SpCa9 매개 온 타겟 편집 효율의 평가
비인간 영장류에서 ANGPTL3 또는 PCSK9의 유전자 편집을 평가하였다. 시노몰구스 원숭이에 SpCas9 mRNA MS004 및 ANGPTL3(GA261-GA263) 또는 PCSK9(GA266-GA271)를 표적화하는 하나의 gRNA를 포함하는 1.5mg/kg 용량의 LNP 제제를 정맥 내 주입하였다. 2주 후 부검 시, 각 간엽에서 두 조각(총 8개)를 단리하고 gDNA를 추출하였다. 샘플은 상세한 방법 섹션에 설명된 대로 처리하였다. 삽입-결실%는 각각의 개별 조각에 대해 분석하였으며 개별 포인트로 그래프로 나타낸다(도 51). 대부분의 NHP 간에서 높은 편집 효율이 관찰되었다. LDL-C 수준을 측정하였다(도 52). SpCas9 mRNA/PCSK9 gRNA를 포함한 LNP를 받은 모든 NHP는 순환 LDL-C 수준이 35% 이상 감소하였다. 더 적지만 SpCas9 mRNA/ANGPTL3 gRNA를 포함한 LNP는 순환 LDL-C 수준에서 10-25% 감소를 보였다. 추가로, SpCas9 mRNA/ANGPTL3 gRNA를 포함한 LNP를 받은 NHP는 트리글리세리드 수준에서 약 10-50% 감소를 보였다(도 53). SpCas9 mRNA/PCSK9 gRNA를 포함한 LNP를 받은 NHP는 트리글리세리드 수준에서 유의한 감소를 나타내지 않았다.
시노몰구스 1차 간세포를 2500, 1250, 및 625 ng/테스트 물품/mL로 SpCas9 mRNA MS002 및 tracr에 대한 변형을 갖는 PCSK9표적화 gRNA로 형질감염시켰다. 게놈 DNA는 자세한 방법 섹션에 설명된 대로 처리, 시퀀싱 및 분석하였다. GA266은 두 개의 양성 대조군으로 사용하기 위해 두 번 독립적으로 형질감염시켰다. 거의 모든 형질감염은 양성 대조군에 비해 높은 편집 효율을 보인 반면, GA405는 약간 낮은 편집 효율을 보였다.
[표 22]
Figure pct00169
gRNA에 대한 PACE 변형은 오프 타겟 편집 효율을 감소시키는 것으로 이전에 입증되었다. 인간 1차 간세포를 2500, 1250, 500, 및 250ng/테스트 물품/mL에서 SpCas9 mRNA MS002 및 tracr에 대한 변형을 갖는 PCSK9 표적화 gRNA로 형질감염시켰다. 게놈 DNA는 자세한 방법 섹션에 설명된 대로 처리, 시퀀싱, 및 분석하였다. GA156을 양성 대조군으로 형질감염시켰다. GA248 및 GA249에는 오프 타겟 편집 효율을 감소시키는 것으로 이전에 입증된 gRNA에 대한 PACE 변형이 포함되어 있다. 실제로, GA248 및 GA249가 비변형된 gRNA에 비해 더 낮은 온 타겟 편집을 보였음에도 불구하고, GA156(도 54a), GA248 및 GA249는 식별된 오프 타겟 부위에서 감소된 오프 타겟 편집을 나타냈다(도 54b).
ABE mRNA 서열 - MA004, MA019, MA020, 및 MA021-을 이들의 GC 함량에 대해 평가하였다(도 55a). 일반적으로 MA004 서열은 MA019, MA020, MA021, 및 ABE8.8m 서열보다 GC 함량이 높다. 서열 MA004의 GC 수준은 또한 TadA 도메인, N-말단 링커 및 C-말단 링커 뿐만아니라 다양한 하위 영역과 같이ABE 서열 전체의 특정 영역에서 상승한다(60% 초과). 모든 서열에 대해 60% 미만의 GC 수준은 회색으로 음영처리되어 상승된 GC 영역과 대조를 이룬다. GC 함량은 전체 mRNA 서열에 걸쳐 주어진 25개 뉴클레오티드 스트레치 내에서 G 및 C의 상대적 양을 결정하여 계산한다. 즉, 25개 뉴클레오티드마다 G와 C의 합을 총 뉴클레오티드 수로 나눈다. 이 비교는 mRNA MA004 서열이 다른 mRNA 서열에 비해 G 및 C 뉴클레오티드의 뚜렷한 분포 및 풍부함을 갖는다는 것을 보여준다.
서열 MA004의 영역 특이적 GC 특성화가 추가로 예시되어 있다(도 55). 각 행의 그래프는 전체 ABE 코딩 서열(4,767 nt)을 포함하는 매 1,000개 뉴클레오티드 스트레치의 GC 함량을 보여준다. GC 함량은 TadA 영역과 N-말단 링커를 포함하는 서열의 5' 말단에서 특히 높다. GC 함량은 또한 Cas9 닉카아제의 다양한 부분과 ABE 서열의 3' 말단에서 높다. 높은 GC%는 NLS 대신 링커 영역 주위에 집중된다. GC 함량이 높은 하위 영역은 GC가 60%의 임계값 수준에 도달하는 위치로 표시된다. 각 하위 영역의 GC 함량은 각 하위 영역에 대한 뉴클레오티드 총 수로 나눈 G 및 C 뉴클레오티드의 수를 결정하여 계산한다.
[표 26]
Figure pct00170
이들 mRNA 구축물의 편집 효율을 마우스에서 평가하였다(도 55b). 이들 mRNA, MA004, MA019, MA020, 및 MA021은 동일한 ABE 단백질 서열을 코딩하지만 뉴클레오티드 서열 최적화가 상이하다. 이 군 사이의 유일한 차이는 mRNA 서열이다. mRNA는 동일한 염기 변형을 가지며, 각 군은 동일한 LNP 제제 및 gRNA를 사용하였다. 각 군을 마우스에 정맥 내 투여하였으며, 효능 차이를 분석하기 위해 간 편집의 포화 수준 이하를 달성하기 위해 이 연구에서 0.05 mg/kg의 저용량을 사용하였다. 투여 후 제5일에, gDNA를 단리하고 차세대 시퀀싱에 의해 염기 편집을 평가하였다. 이러한 결과는 mRNA 서열 변화가 생체 내에서 아데노신 염기 편집 성능에 영향을 미칠 수 있음을 입증한다.
기재된 방법에 대한 추가 상세 내용
1차 간세포의 플레이팅, 배양, 및 형질감염. BioIVT의 1차 인간 간 간세포(PHH) 및 1차 시노몰구스 간 간세포(PCH)를 제조업체의 프로토콜에 따라 배양하였다. 간략하게, 1차 인간 간세포 및 1차 시노 간세포를 BioIVT로부터 냉동 분취물로서 얻었다. 각각이 비식별 처리된 개별 기증자로부터 유래된 4개 로트의 1차 인간 간세포를 실험에 사용하였다. STL(주 기증자)은 스크리닝 실험 및 오프 타겟 실험을 포함한 모든 실험에 사용하였다. HLY, JLP, 및 TLY는 오프 타겟 실험에 사용하였다. 1차 시노 간세포의 HFG 로트를 실험에 사용하였다. 제조업체의 지침에 따라 세포를 해동하고 헹군 후, TORPEDO 항생제 믹스(BioIVT)가 보충된 INVITROGRO 간세포 배지에서 대략 350,000 세포/웰의 밀도로 밤새 소 콜라겐으로 코팅된 24웰 플레이트에 플레이팅하였다. 세포를 해동하고 간세포 해동 배지에 재현탁한 후 4℃에서 10분 동안 100 g에서 원심분리하였다. 상층액을 버리고 펠렛화된 세포를 간세포 플레이팅 배지에 재현탁하였다. 각 바이알에는 하나의 24웰 플레이트를 플레이팅하는 데 사용된 약 5백만 개의 세포가 들어 있다. 플레이팅된 세포를 5% CO2 분위기 하에 37℃의 조직 배양 인큐베이터에서 4-6시간 동안 정착 및 부착하도록 두었다. 인큐베이션 후, 세포의 단층 형성에 대해 확인하였다. 그 다음 인큐베이션 배지를 새로운 간세포 유지 배지(세포주 공급자인 BioIVT에서 얻은 완전한 INVITROGRO 배지)로 교체하였다. 따라서 세포는 형질감염을 위한 준비가 되었다. 각각의 gRNA는 MessengerMax 시약(리포펙타민)에 의해 1차 인간 간세포에 등가량의 시험관 내 전사된 ABE8.8 mRNA(1:1 분자 중량비)와 공동 형질감염시켰으며, 다양한 희석액을 사용하여 테스트 물품의 다양한 농도에서 편집 활성을 평가하였다. Thermo Fisher의 MessengerMAX를 형질감염에 사용한다. 용액 A: 원하는 양의 가이드 RNA를 OptiMEM에 1:1 중량비의 mRNA와 혼합한다. 용액 B: OptiMEM 중 MessengerMAX. 용액 A와 B를 혼합한 후, 혼합물을 실온에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션된 용액 60㎕를 각 세포 웰에 적가하였다. 상응하는 시노몰구스 원숭이 PCSK9 또는 ANGPTL3 유전자 서열과 완벽하게 일치하는 프로토스페이서 서열의 경우, 각 gRNA는 또한 등가량의 ABE8.8 mRNA(1:1 분자 중량비)로 1차 시노몰구스 간세포에 공동 형질감염시켰고, 동일한 형질감염 프로토콜을 따랐다. 그런 다음 세포를 37℃에서 3일 동안 유지하도록 하였다. 제조업체의 지침에 따라 Thermo Kingfisher 또는 Qiagen DNEasy 혈액 및 조직 키트를 사용한 게놈 DNA 추출을 위해 세포를 수거하고 준비하였다.
생물정보학 분석. 표적화된 앰플리콘 시퀀싱 데이터는 CRISPResso2 v2.0.31로 배치 모드(CRISPRessoBatch)에서 분석하였다. Cas9 실험에 대해 다음 매개변수를 설정하였다: "--quantification_window_center -3 --quantification_window_size 5 --min_frequency_alleles_around_cut_to_plot 0.1 --max_rows_alleles_around_cut_to_plot 100". ABE 실험에 대해 다음 매개변수를 설정하였다: "-default_min_aln_score 95 --quantification_window_center -10 --quantification_window_size 10 --base_editor_output --conversion_nuc_from A --conversion_nuc_to G --min_frequency_alleles_around_cut_to_plot 0.1 --max_rows_alleles_around_cut_to_plot 100". NHP 실험에 대해 저품질 리드를 제외하도록 추가 매개변수를 설정하였다: "--min_single_bp_quality 30". 또한 모든 경우에 매개변수 "--max_paired_end_reads_overlap"은 FLASH 권장 사항(https://ccb.jhu.edu/software/FLASH/)에 따라 2R-F+0.25*F로 설정하였으며, 여기서 R은 리드 길이이고 F는 앰플리콘 길이였다.
편집율은 "Quantification_window_nucleotide_percentage_table.txt" 출력 테이블에서 주 편집 위치(프로토스페이서 DNA 서열의 위치 6)에서 모든 A에서 G/C/T로의 치환을 지원하는 리드의 백분율로서 정량화하였다. 삽입-결실율은 "Alleles_frequency_table_around_sgRNA_*.txt" 출력 테이블로부터 닉 부위(PAM 서열 상류 위치 -3에서)의 양쪽에 있는 5bp 창에서 삽입 또는 결실을 지원하는 리드의 백분율로서 정량화하였으며, 30bp보다 큰 결실을 지원하는 리드는 제외하였다. 후보 오프 타겟 부위의 경우, 편집율은 "Alleles_frequency_table_around_sgRNA_*.txt" 출력 테이블로부터 편집 창(프로토스페이스의 PAM 원위 쪽의 위치 1-10)에서 A->G 치환이 있는 대립 유전자의 리드 백분율로서 정량화하였으며, 30bp보다 큰 결실이 있는 대립유전자로부터의 리드는 제외하였다.
역전사. 수집된 세포를 제조업체의 지침에 따라 miRNeasy Mini Kit(QIAGEN)로 처리하여 크고 작은 RNA 종을 모두 단리하고, 나머지 부분은 게놈 DNA용으로 수거하여 PCSK9 편집을 확립하여 세포에서 염기 에디터 활성을 확인하였다. 역전사는 제조업체의 지침에 따라 iScript Reverse Transcription Supermix 시약을 사용하여 수행하였으며, 인트론 1의 일부가 있거나 없는, 엑손 1 및 엑손 2에 걸친 전사물의 PCR 증폭에 4개의 상이한 프라이머 쌍을 사용하였다. 상기에 기재된 바와 같이 Illumina MiSeq 시스템을 사용하여 생성된 250bp 길이의 페어드 엔드(paired end) 리드를 매개변수 "ILLUMINACLIP:NexteraPE-PE.fa:2:30:10:1:true LEADING:3 TRAILING:3 SLIDINGWINDOW:4:15 MINLEN:36"를 사용하는 trimmomatic v0.39를 사용하여 어댑터에 대해 트리밍하였다. 그런 다음 리드를 FLASH v1.2.1134와 병합하고 매개변수 "--local --very-sensitive-local -k 1 --np 0"를 사용하는 Bowtie2 v2.4.1을 사용하여 PCSK9 유전자 본체에 정렬하였다. 유전자 주석은 Ensembl v98 (ftp:https://ftp.ensembl.org/pub/release-98/gtf/homo_sapiens/Homo_sapiens.GRCh38.98.gtf.gz)로부터 얻었다. 정렬은 samtools v1.10으로 필터링하였고 bedtools v2.25.0 bamtobed 기능을 사용하여 BED 형식으로 변환하였다. 샘플당 최소 1000개의 맵핑된 리드가 필요하였으며 맵핑된 리드의 끝 위치를 집계하였다. 적어도 하나의 처리된 샘플에서 최소 10개의 리드가 지원되는 PCSK9 인트론 1 전체의 위치를 보고한다.
후보 오프 타겟 부위를 예측하기 위한 ONE-seq 분석. ONE-seq 라이브러리의 설계는 온 타겟에 대해 서열 상동성을 갖는 참조 게놈의 부위를 컴퓨터로 식별하는 것으로 시작된다. 인간 ONE-seq 라이브러리의 경우, 참조 인간 게놈(GRCh38,　Ensembl　v98, chromosomes　ftp:https://ftp.ensembl.org/pub/release-98/fasta/homo_sapiens/dna/Homo_sapiens.GRCh38.dna.chromosome.{1-22,X,Y,MT}.fa　and　ftp:https://ftp.ensembl.org/pub/release-98/fasta/homo_sapiens/dna/Homo_sapiens.GRCh38.dna.nonchromosomal.fa)을 Cas-Designer v1.2(https://www.rgenome.net/cas-designer/)를 사용하여 최대 4개의 미스매치 및 최대 2개의 DNA 또는 RNA 돌출이 있는 부위, 및 상기 프로토스페이서 서열에 최대 6개의 미스매치를 갖는 잠재적 오프 타겟 부위에 대해 검색하였다.
시노몰구스 원숭이와 관련된 ONE-seq 라이브러리의 경우, 참조 시노몰구스 원숭이 게놈(macFas5,　Ensembl　98, chromosomes　ftp:https://ftp.ensembl.org/pub/release-98/fasta/macaca_fascicularis/dna/Macaca_fascicularis.Macaca_fascicularis_5.0.dna.chromosome.{1-20,X,MT}.fa.gz　and　ftp:https://ftp.ensembl.org/pub/release-98/fasta/macaca_fascicularis/dna/Macaca_fascicularis.Macaca_fascicularis_5.0.dna.nonchromosomal.fa.gz)을 유사한 매개변수를 사용하여 검색하였다.
최대 6개의 미스매치가 있고 돌출이 없는 부위는 X<미스매치 수><돌출 수> 코드를 사용하여 나타낸다. 이와 같이, 오프 타겟 부위는 X00 으로 표시하고, 온 타겟에 대해 1개의 미스매치를 갖고 돌출이 없는 부위는 X10 등으로 표시한다. DNA 돌출이 있는 부위는 유사한 명명법 DNA<미스매치 수 ><돌 출 수>로 나타낸다. 이와 같이, 온 타겟에 4개의 미스매치가 있고 2개의 DNA 돌출이 있는 부위는 DNA42로 표시한다. RNA 돌출에 대해 동일한 명명법을 사용하지만 이는 RNA<미스매치 수 ><돌출 수 >로 코딩한다.
식별된 프로토스페이서 서열은 각각의 참조 게놈으로부터의 인접 서열과 함께 양쪽에서 10개의 뉴클레오티드(nt)만큼 확장하였다(이 영역은 본원에서 게놈 컨텍스트로 지칭됨). 그 다음, 이들 확장된 서열은 상이한 뉴클레오티드 조성 및 서열 길이의 6개의 미리 정의된 불변 영역;　중앙 프로토스페이서 서열의 각 측면에 하나씩 2개 카피의 14-nt 부위 특이적 바코드; 중앙 프로토스페이서 서열의 각 측면에 하나씩 2개의 별개의 11-nt 고유 분자 식별자(UMI)를 포함하여 대략 200 nt의 최종 길이까지 추가 서열에 의해 패딩하였다. UMI를 사용하여 PCR 증폭으로 인한 편향을 교정하고, 바코드는 분석 중에 각 부위에 대한 명확한 식별을 가능하게 한다. 바코드는 668,420개 바코드의 초기 목록으로부터 선택하며, 서열에 CC나 GG가 포함되지 않으며 각 바코드는 임의의 다른 바코드로부터 2의 해밍 거리를 가진다. 사용자 정의 Python script를 사용하여 최종 라이브러리를 설계하였다.
최종 올리고뉴클레오티드 라이브러리는 상용 판매자(Agilent Technologies)에 의해 합성한다. 각 라이브러리를 PCR 증폭하고 1.25X AMPure XP 비드 정제(Beckman Coulter)를 거친다. CutSmart 완충액(New England Biolabs)에서 25℃에서 10분 동안 인큐베이션한 후, 769 nM 재조합 ABE8.8-m 단백질과 1.54μM gRNA를 포함하는 RNP를 100 ng의 정제된 라이브러리와 혼합하고 37℃에서 8시간 동안 인큐베이션한다. RNP 용량은 과포화 용량, 즉 생화학적 분석에서 온 타겟 편집의 최대량을 달성하는 용량보다 높다는 것을 문서화하는 분석으로부터 유도한다.
프로테이나제 K(New England Biolabs)를 첨가하여 37℃에서 45분 동안 반응을 켄칭한 후 2x AMPure XP 비드 정제를 수행한다. 그런 다음, 반응물을 37℃에서 30분 동안 EndoV(New England Biolabs), 37℃에서 30분 동안 Klenow Fragment(New England Biolabs), 20℃에서 30분 동안 이어서 65℃에서 30분 동안 NEBNext Ultra II End Prep Enzyme Mix(New England Biolabs)와 연속적으로 인큐베이션하며, 각 인큐베이션 후 2x AMPure XP 비드 정제를 수행한다. 반응물을 어닐링된 어댑터 올리고뉴클레오티드 이중체와 20℃에서 1시간 동안 결찰하여 절단된 라이브러리 생성물의 PCR 증폭을 용이하게 한 다음, 2x AMPure XP 비드 정제를 수행한다. 결찰된 반응의 크기 선택은 PippinHT 시스템(Sage Sciences)에서 수행하여 3% 아가로스 겔 카세트에서 150 ~ 200bp의 DNA를 단리한 다음 2회 PCR 증폭을 수행하여 바코드된 라이브러리를 생성하고, 이는 상기에 기재된 바와 같이 Illumina MiSeq 시스템에서 페어드 엔드 시퀀싱을 거친다.
ONE-seq 실험에서 두 개의 절단 산물을 얻는다. PROTO 쪽은 절단 위치의 상류에 있는 올리고뉴클레오티드의 일부를 포함하는 반면, PAM 쪽은 절단 위치의 하류에 있는 올리고뉴클레오티드의 일부를 포함한다. ABE 실험에서, PROTO 쪽만 편집 활성에 대한 정보를 제공한다(A->G 치환). 따라서 이 쪽만 시퀀싱한다.
페어드 엔드 리드를 맞춤형 Nextera 어댑터(PrefixPE/1: ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT;　PrefixPE/2: GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT; 파일에 지정된 바와 같음) 및 매개변수"ILLUMINACLIP:NEB_custom.fa:2:30:10:1:true　LEADING:0 TRAILING:0 SLIDINGWINDOW:4:30 MINLEN:36"과 함께 trimmomatic　v0.39(Bolger et al., 2014)을 사용하여 시퀀싱 어댑터에 대해 트리밍하였다. 시퀀싱 품질이 낮은 실험(VOL014)의 경우 이 매개변수는 "ILLUMINACLIP NEB_custom.fa:2:30:10:1:true　LEADING:2 TRAILING:0　SLIDINGWINDOW:30:30 MINLEN:36"로 설정하였다. 그 후 매개변수 "--max-mismatch-density=0.25 --max-overlap=160"를 이용한 FLASH v1.2.11(Magoc and Salzberg, 2011)을 사용하여 리드를 병합하였다. 병합된 리드를 불변 서열, 바코드 및 각 부위에 고유한 프로토스페이서 서열에 대해 스캐닝하고 편집 창(프로토스페이서의 1-10 가장 PAM 원위 위치로 정의됨)에서 A->G 치환의 증거가 있는 것으로 필터링하였다. 중복된 리드는 삭제하였다
각 부위에 대해, 편집된 총 리드 수는 온 타겟 부위에 할당된 총 편집된 리드 수에 대해 정규화하였으며 이 비율은 부위에 대한 ONE-seq 점수를 정의한다. 부위는 ONE-seq 점수로 순위를 매겼으며 검증을 위해 0.001 이상의 점수를 가진 부위를 선택하였다. 이는 스폰서가 온 타겟 부위의 편집에 비해 생화학적 분석에서 편집 활성이 1000배 낮은 부위에 대해 추적한다는 것을 의미한다. 이 임계값은 세포에서 100% 온 타겟 편집율이 있는 경우 1/1000배 낮은 편집 활성이 < 0.1% 오프 타겟 편집율로 변환된다는 전제를 기반으로 하며, 이는 NGS에 의한 편집 감지 하한보다 낮다.
SureSelect. SureSelect 패널은 Agilent Technologies에서 설계 및 구입하였다. 품질이 30 미만인 원시 FASTQ 파일의 염기는 seqtk　v1.3-r106 (https://github.com/lh3/seqtk)를 사용하여 N으로 마스킹하였다. Agilent's AGeNT v2.0.5 도구의 "Trimmer" script를 사용하여 어댑터를 트리밍하였다. 매개변수 "-C"를 이용한 BWA MEM v 0.7.17-r1188을 사용하여 리드를 GRCh38 참조 인간 게놈(ftp:https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/all/GCA/000/001/405/GCA_000001405.15_GRCh38/seqs_for_alignment_pipelines.ucsc_ids/GCA_000001405.15_GRCh38_no_alt_analysis_set.fna)에 정렬하였다. 정렬된 리드를 처리하고 "-I -R -IB -OB -U -l < Covered.bed >"를 이용한 Agilent's AGeNT v2.0.5 도구에서 "LocatIt" script를 사용하여 중복체를 제거하였다. 편집 창(프로토스페이서의 PAM 원위측에서 위치 1-10)에서 각 위치에서 뉴클레오티드 분포를 매개변수 "base-depth -F 3848"을 이용한 perbase　v0.6.3 (https://github.com/sstadick/perbase)를 사용하여 결정하였다. 편집 창에서 A->G 치환을 지원하는 리드 백분율을 합산하여 편집율을 정량화하였다.
가이드 비의존적 오프 타겟 분석을 위한 RNA-seq. RNA 샘플은 GENEWIZ에 의해 처리하고 시퀀싱하였다. rRNA 고갈 후 라이브러리를 제조하고 Illumina HiSeq 시스템에서 샘플당 약 5천만 개의 리드로 2x150bp 페어드 엔드 시퀀싱을 수행하였다. 모든 샘플에 대한 RNA-seq 변이체 호출은 GATK Best Practices를 사용하여 실행하였다. 간략하게, gencode v34(ftp:https://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/gencode/Gencode_human/release_34/gencode.v34.primary_assembly.annotation.gtf.gz)를 이용한 GRCh38 참조 게놈(ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/all/GCA/000/001/405/GCA_000001405.15_GRCh38/seqs_for_alignment_pipelines.ucsc_ids/GCA_000001405.15_GRCh38_no_alt_analysis_set.fna.gz)에 대해 STAR를 사용하여 리드를 정렬하였다. GATK MarkDuplicates를 사용하여 PCR 중복체를 제거한 다음 GATK HaplotypeCaller를 사용하여 변이체를 식별하였다. 그런 다음 QD(Quality of Depth) < 2.0 및 FS(Fisher 가닥 - 가닥 편향의 증거) > 30을 갖는 변이체를 제외하여 변이체를 필터링하였다. 모든 GATK 분석은 gatk4 v4.1.8.1로 수행하였다.
상기와 같이 수득된 변이체를 하기와 같이 미처리 대조군 샘플과 비교하여 추가로 필터링하였다. (1) perbase v0.5.1 (https://github.com/sstadick/perbase)를 사용하여 각 미처리된 대조군 샘플 및 각 처리된 샘플의 처리된 세포에서 각각의 식별된 변이체에서 뉴클레오티드 분포. (2) 처리된 및 미처리된 조건 모두에서 적어도 20개 리드에 의해 커버되는 모든 변이체에 대해, RNA 편집은 모든 미처리된 대조군 샘플에서 리드의 적어도 95%에서 참조 대립유전자(A 또는 T) 및 처리된 샘플에서 적어도 하나의 리드에서 대체 대립유전자(G 또는 C)를 갖는 것으로 식별되었다. 상기 단계는 ABE8.8 처리 및 SpCas9 처리 샘플 각각에 대해 실행하였다.
가이드 RNA 합성. 표 1에 나타낸 가이드 RNA는 제어된 기공 유리 지지체 및 상업적으로 입수가능한 포스포라미다이트 단량체 및 올리고뉴클레오티드 합성 시약을 사용하여 고체상 올리고뉴클레오티드 합성 및 탈보호 조건 하에서 합성하였다(Methods in Molecular Biology, 1993, 20, 81-114; ACS Chem. Biol. 2015, 10, 1181-1187, 그 전체가 본원에 참고로 포함됨). 가이드 RNA의 스페이서 섹션은 5'-말단으로부터 처음 1-3개의 뉴클레오티드를 제외하고 해당 리보뉴클레오티드로 전환하였다. 5'-말단의 처음 1-3개 뉴클레오티드는 표 1에 요약된 바와 같이 해당 2'-O-메틸리보뉴클레오티드로 전환하였다. 탈보호된 가이드 RNA를 HPLC로 정제하고 각 가이드 RNA의 무결성을 질량 분광분석으로 확인하였다. 각 가이드 RNA의 관찰된 질량은 계산된 질량과 일치하였다.
시험관 내 전사( IVT )에 의한 mRNA 생산 본원에 기재된 mRNA는 당업계에 널리 공지된 다양한 방법에 의해 생산한다. 이러한 방법 중 하나는 T7 중합효소 또는 추가 RNA 중합효소 변이체를 사용하는 시험관 내 전사(IVT)이다. 일반적으로 mRNA의 IVT는 T7 중합효소 프로모터 및 관련 조절 서열, mRNA 코딩 서열(CDS), 3' 및 5' 비번역 영역(UTR), 폴리 A 꼬리, 및 mRNA 안정성 및 생체 내 성능을 향상시키기 위한 추가 서열 요소를 포함하는 선형화된 DNA 주형을 사용한다. IVT 이전에, DNA 주형은 플라스미드, PCR 산물, 합성 DNA 산물, 또는 임의의 기타 이중 가닥 DNA 구축물의 형태이다. 일반적으로 제한 분해 효소를 사용한 DNA 주형의 선형화는 유출(run-off) 전사를 촉진하기 위해 수행한다. 전형적인 IVT 반응에는 T7 중합효소, DNA 주형, RNase 억제제, cap 유사체, 무기 피로포스파타제, 및 GTP, ATP, CTP, UTP와 같은 자연 발생 리보뉴클레오티드 삼인산(NTP), 또는 천연 NTP의 슈도우리딘, N1-메틸슈도우리딘, 5'메틸시티딘, 5-메톡시우리딘, N6-메틸아데노신, 및 N4-아세틸시티딘과 같은 변형된 NTP로의 치환이 포함된다. cap 유사체는 전사 동안 추가되거나 캡핑 효소를 사용하여 IVT 반응 후에 보충될 수 있다. 두 경우 모두 2'-O-메틸 기, 또는 추가 2' 화학적 변형이 첫 번째 개시 뉴클레오티드에 추가되어 mRNA의 cap-1 형태를 생성한다. 일부 경우에, 폴리 A 꼬리는 RNA 리가제 효소를 사용하여 IVT 반응 후에 mRNA에 추가된다. IVT 후, 일부 경우에 DNase가 전사 혼합물에 추가되어 DNA 주형을 제거한다. 대안적으로, 잔류 DNA는 크로마토그래피, 침전 또는 접선 흐름 여과로 제거된다. mRNA의 정제 및 농축은 이온 교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 침전, 이온쌍 역상 크로마토그래피, 수소 결합 크로마토그래피, 셀룰로오스 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 효소 반응, 크기 배제 크로마토그래피, 및 접선 흐름 여과와 같은 방법으로 수행된다. 유사한 IVT 및 정제 과정이 루시퍼라제, eGFP, SpCas9, Cas12b, CBE, 및 ABE를 코딩하는 mRNA를 생성하는 데 사용된다. 모든 경우에 DNA 주형, 반응 조건, 및 정제 매개변수는 특정 관심 유전자에 대해 최적화된다.
지질 나노입자 제제 및 분석. 사용된 LNP는 이전에 설명한 대로 제제화하였으며(Conway, A. et al. 2019 Mol . Ther.　27, 866-877; Villiger, L. et al 2021 Nat. Biomed . Eng. 5, 179-189) (1) 개별 페이로드에 대한 일부 최적화와 함께, 제조업체의 프로토콜에 따라 Precision Nanosystems NanoAssemblr 시스템을 사용한 미세유체 혼합에 의해 또는 (2) 유기 용매 중 지질 부형제 용액 및 gRNA 및 mRNA의 수용액의 신속한 인라인 혼합에 의해 생성하였다. 지질 용액은 에탄올에 미리 정해진 몰비로 혼합된 일반적으로 4가지 제제 부형제, 즉 아미노 지질, PEG-지질로 불리는 지질에 접합된 평균 분자량 2000 Da의 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜(또는 메톡시폴리에틸렌 글리콜), 콜레스테롤 및 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC)의 혼합물을 포함한다. LNP 조성물은 40-65%의 아미노 지질, 2-20% DSPC, 1-5% PEG-지질을 포함하고 나머지는 콜레스테롤(모두 몰%)이다. RNA 수용액은 달리 명시되지 않는 한 원하는 mRNA와 가이드 RNA(gRNA)의 중량 기준으로 1:1 혼합물을 포함한다. mRNA 대 gRNA 비의 영향을 평가하기 위해, 평가를 위한 상응하는 LNP의 제조를 제조, 예를 들어, 마우스에서 6:1, 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3 및 1:6 mRNA 대 gRNA 비를 평가하기 위한 LNP 테스트 물품의 제조 전에 mRNA와 gRNA의 원하는 중량 비를 포함하는 수용액을 제조하였다(실시예 6, 도 19). 일부 다른 경우에, mRNA 및 2개의 gRNA를 1:0.5:0.5(mRNA:gRNA1:gRNA2) 중량비로 혼합하여 단일 테스트 물품에서 원하는 mRNA 및 2개의 gRNA를 함유하는 LNP를 제조하였다(실시예 10, 도 43). 그런 다음 원하는 mRNA 대 gRNA의 수용액을 에탄올 중 지질 부형제와 미세유체에 의해 또는 급속 인라인 혼합에 의해 혼합하였다. 보고된 NHP 연구에 대한 모든 LNP는WO 2019/036028 Al, WO 2015/199952 A1, WO 2017/004143, WO 2020/081938 Al 및 WO 2020/061426 A2에 기술된 바와 같이 인라인 혼합 프로토콜을 따라 제조하였다. NHP LNP 테스트 물품의 제조에 사용된 PEG-지질은 WO 2019/036028 Al, WO 2015/199952 A1로부터 선택하였다. LNP 조성물 및 이온화 가능한 아미노 지질은 특허 공보 WO/2017/004143A1, WO/2017/075531A1 및 WO/2018/191719　A1로부터 선택하였다. LNP#1 및 LNP#2의 제조에 사용된 이온화 가능한 아미노 지질(실시예 8, 도 30 및 도 45)은 공보 WO 2018/191719 A1로부터 선택하였다. 생성된 LNP 제제는 후속적으로 테스트 물품 완충액에 대해 투석하고 0.2 μm 멸균 필터를 사용하여 여과하였다.
예를 들어, 세포 및 NHP 연구에 사용된 LNP는 평균 유체역학적 직경 범위가 55 내지 65nm이고, 동적 광산란에 의해 결정된 바와 같이 다분산 지수가 0.2 미만이고 Quant-iT Ribogreen 분석에 의해 측정된 바와 같이 총 RNA 캡슐화가 85-98%이었다. LNP 입자 크기(Z-Ave, 유체역학적 직경), 다분산 지수 및 총 RNA 캡슐화를 투여 전에 문헌에 기재된 바와 같이 측정하였다.
예를 들어, 세포 및 마우스 연구에 사용된 LNP는 입자 크기가 55-120 nm(Z-Ave, 유체역학적 직경)이고 동적 광산란(Malvern NanoZS Zetasizer)에 의해 결정된 바와 같이 다분산 지수가 0.2 미만이고 Quant-iT Ribogreen 분석(Thermo Fisher)에 의해 측정된 바와 같이 총 RNA 캡슐화가 85-100%이었다.
게놈 DNA 추출. 전체 마우스 간 또는 100-200 mg의 원숭이 간을 2 mL 용해 매트릭스 튜브(MP Bio)에 로딩하였다. 제조사의 프로토콜에 따라 FastPrep-24 시스템(MP Bio)을 사용하여 간을 마우스 간의 경우 0.5 ml PBS 또는 원숭이 간의 경우 0.25 ml PBS로 용해시켰다. 제조업체의 프로토콜에 따라 KingFisher Flex 자동 추출 기기(Thermo-Fisher Scientific)에서 비드 기반 추출 키트인 MagMAX-96 DNA 다중 샘플 키트(Thermo-Fisher Scientific)를 사용하여 약 20 μL의 마우스 또는 원숭이 간 용해물로부터 게놈 DNA를 단리하였다. 원숭이 간 생검 샘플의 경우, 제조업체의 지침에 따라 Qiagen DNEasy 혈액 및 조직 키트 추출을 사용하여 게놈 DNA를 추출하였다. 추출된 게놈 DNA는 추가로 사용할 때까지 4℃에서 보관하거나 장기 보관을 위해 -80℃에서 보관하였다.
ELISA에 의해 정량화된 PCSK9 단백질 수준. 채혈 후 혈액 샘플을 수집하고 혈장으로 처리하였다. 혈장 시노몰구스 PCSK9 수준은 기재된 ELISA를 이용하여 ELISA에 의해 결정하였다. 간략히, 분석 희석제 D(Biolegend, 부품 번호 76384)에 희석된 정제된 시노몰구스 원숭이 PCSK9의 테스트 샘플 또는 표준을 인간 PCSK9에 특이적인 단클론 항체(Biolegend, 부품 번호 76157)로 코팅된 96웰 마이크로플레이트에서 분석 완충액 A(Biolegend, 부품 번호 78232)와 함께 인큐베이션하였다. 세척 완충액(Biolegend, 부품 번호 78233)으로 4회 세척한 후, 인간 PCSK9에 특이적인 다클론 항체(Biolegend, 부품 번호 76158)를 개별 웰에서 인큐베이션하였다. 4회 세척 후, 아비딘-HRP(Biolegend, 부품 번호 77897)를 다음으로 개별 웰에서 인큐베이션하였다. 6회 세척 후 TMB를 포함하는 기질 용액 F(Biolegend, 부품 번호 79132)를 사용하여 플레이트를 발색하였다. 450 nm로 설정된 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 광학 밀도를 결정하였다. 플레이트의 광학적 결함을 보정하기 위해 450 nm에서의 판독값에서 570 nm에서의 판독값을 차감하였다. 채혈 후 혈액 샘플을 수집하여 혈장으로 처리하고 분석할 때까지 -86 내지 -60℃에서 보관하였다.
ELISA에 의해 정량화된 ANGPTL3 단백질 수준. 혈장 시노몰구스 ANGPTL3 수준은 ELISA에 의해 결정하였다. 간략히, 캘리브레이터 희석제 RD6Q(R&D, 부품 번호 895128)에 희석된 정제된 시노몰구스 원숭이 ANGPTL3의 테스트 샘플 또는 표준을 인간 ANGPTL3에 특이적인 단클론 항체(R&D, 부품 번호 893734)로 코팅된 96웰 마이크로플레이트에서 분석 희석제 RD1-76(R&D, 부품 번호 895812)과 함께 인큐베이션하였다. 세척 완충액(R&D, 부품 번호 895003)으로 4회 세척한 후, 양고추냉이 퍼옥시다제(HRP)에 접합된 인간 ANGPTL3에 특이적인 다클론 항체를 함유하는 인간 ANGPTL3 접합체(R&D, 부품 번호 893735)를 다음으로 개별 웰에서 인큐베이션하였다. 4회 세척 후 TMB 기질 용액(R&D, 부품 번호 895000 및 895001)을 사용하여 플레이트를 발색하였다. 450 nm로 설정된 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 광학 밀도를 결정하였다. 플레이트의 광학적 결함을 보정하기 위해 450 nm에서의 판독값에서 540 nm에서의 판독값을 차감하였다.
지질 수준의 정량화. 각 분석물을 위한 시약 키트에는 시약이 포함된다. 콜레스테롤, 트리글리세리드 및 HDL-C는 특정 효소 반응 생성물의 흡광도 측정을 사용하여 정량화한다. LDL-C는 간접적으로 결정한다. 순환 콜레스테롤의 대부분은 세 가지 주요 지단백질 분획인 초저밀도 지단백질(VLDL), LDL 및 HDL에서 발견된다. [총 C] = [VLDL-C] + [LDL-C] + [HDL-C]. 따라서 LDL-C는 [LDL-C] = [총 C] - [HDL-C] - [TG]/5의 관계에 따라 총 콜레스테롤, 트리글리세리드 및 HDL-C의 측정값으로부터 계산할 수 있다. 여기서 [TG]/5는 발현된 VLDL-콜레스테롤의 추정치이다. 이러한 결과는 생체 내 인간 간에서 PCSK9를 녹다운시키고 혈액 PCSK9 단백질 및 LDL-C 수준을 감소시키는 염기 편집 요법의 개념에 대한 전임상 증거를 제공한다.
트리글리세리드 수준의 직접 측정. 임상 분석기를 사용하여 혈청 샘플의 '지질 패널'을 측정한다. 이는 콜레스테롤(총 C), 트리글리세리드(TG) 및 고밀도 지단백 콜레스테롤(HDL-C)의 직접적인 측정을 수반한다. 트리글리세리드에 특이적인 시약 키트에는 완충액, 캘리브레이터, 블랭크 및 대조군이 포함되어 있다. 제공된 시약을 사용하여, 연구의 혈청 샘플을 분석한다. 트리글리세리드는 일련의 커플링된 효소 반응을 사용하여 측정한다. H2O2는 마지막 반응의 최종 생성물이며 500nm에서의 흡광도를 사용하여 분석물을 정량화한다. 색상 강도는 트리글리세리드 농도에 비례한다. 모든 값은 mg/dL로 보고한다.
마우스의 LNP 처리. 마우스 연구는 연구가 수행된 CRADL(Charles River Accelerator and Development Lab)의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았다. 암컷 C57BL/6J 마우스는 Jackson Laboratory에서 8-10주령에 다양한 실험군에 동물을 무작위로 할당하여 실험에 사용하였다. LNP는 동물 체중(킬로그램)당 총 RNA의 mg에 해당하는 mg/kg 용량으로 측면 꼬리 정맥 주사 및/또는 정맥동의 안와후 주사를 통해 마우스에 투여하였다(Lab Anim 2011; 40(5): 155-160). LNP를 제제화한 후 mRNA와 gRNA의 양을 구성하는 총 RNA를 기준으로 용량을 계산한다. 처리 1주일 후, 달리 명시되지 않는 한 마우스를 안락사시키고, 간 샘플을 부검하여 채취하고, 제조업체의 지침에 따라 KingFisher Flex 정제 시스템으로 처리하여 게놈 DNA를 단리하였다.
NHP의 LNP 처리. NHP 연구는 각각 Envol Biomedical 및 Altasciences의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았다. NHP 연구는 Envol Biomedical(연구 #VTP2001) 및 Altasciences(연구 #1388.02, 04, 05, 09, 및 11)에서 수행하였으며, 두 연구 모두 캄보디아 원산지의 마카카 파시쿨라리스를 사용하였다. 동물의 나이는 2-3세였으며 연구 시작 당시 체중은 2-3 킬로그램이었다. 모든 동물은 PCSK9 및/또는 ANGPTL3 편집 부위(들)에서 유전자형을 결정하여 LNP를 받은 모든 동물이 gRNA 서열과 완벽하게 일치하는 프로토스페이서 DNA 서열에 대해 동형접합성임을 확인하고 동물을 다양한 실험군에 무작위로 할당하였다. 달리 언급되지 않는 한, 동물은 LNP 투여 전에 1 mg/kg 덱사메타손, 0.5 mg/kg 파모티딘, 및 5 mg/kg 디펜히드라민으로 사전 투약받았다. LNP는 프라이밍된 주입 라인에 연결된 말초 정맥에 삽입된 임시 카테터를 사용하여 1시간(+/- 5분)에 걸쳐 투여하였다. 투여 제제는 달리 명시되지 않는 한 6 ml/kg의 부피로 투여하였고 동물 체중(kg)당 총 RNA의 mg에 해당하는 mg/kg으로 투여하였다. LNP를 제제화한 후 mRNA와 gRNA의 양을 구성하는 총 RNA를 기준으로 용량을 계산한다. 동물의 체중을 기준으로 적절한 부피를 주입 펌프를 사용하여 전달하였다. 대조군 동물은 동일한 주입 조건 하에 LNP 대신 포스페이트 완충 식염수를 받았다. 동일한 NHP 연구에 사용된 아미노 지질 1 및 아미노 지질 2로 구성된 두 개의 LNP가 있는 경우 이러한 LNP를 제조하는 데 사용되는 mRNA와 gRNA가 동일한 테스트 물품은 LNP#1 및 LNP#2로 식별된다. 연구에 사용된 하나의 LNP 조성물만이 존재하는 경우, 테스트 물품은 LNP로 식별된다.
혈액 화학 샘플의 경우, 말초 정맥 천자를 통해 수집하기 전에 동물을 적어도 4시간 동안 금식시켰다. NHP 연구는 일반적으로 다음 일정으로 수집을 따랐다: 제-10일, 제-7일, 제-5일, 제1일(LNP 주입 후 6시간), 제2일, 제3일, 제5일, 제8일, 및 제15일. 장기 연구에서, 샘플은 제21일과 제28일에도 수집하였으며 일반적으로 그 이후에는 2주마다 수집하여 LDL 콜레스테롤, HDL 콜레스테롤, 총 콜레스테롤, 트리글리세리드, AST 및 ALT에 대해 연구 부위별로 분석하였다. 각 분석물에 대해, 제-10일, 제-7일 및 제-5일 값의 평균을 기준 값으로 간주하였다. PCSK9 또는 ANGPTL3 단백질 측정을 위해 각 혈액 샘플의 일부를 연구자에게 보냈다.
사이토카인 수준 분석. 혈청 시노몰구스 IL-6, MCP-1 및 IP-10 수준은 제조업체의 지침에 따라 U-PLEX Biomarker Group 1(NHP) 분석(Meso Scale Discovery, #K15068L-2)에 의해 결정하였다. 간략하게, U-PLEX(Meso Scale Discovery, #N05230) 플레이트를 링커-커플링된 포획 항체(MCP-1 항체; Meso Scale Discovery, #C26UG-3, IL-6 항체; Meso Scale Discovery, #C21TX-3, IP-10 항체; Meso Scale Discovery, #C21UF-3)와 함께 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. PBS-T(0.05% Tween 20을 함유하는 PBS)로 3회 세척한 후, 테스트 샘플 또는 캘리브레이터 표준(캘리브레이터 1; Meso Scale Discovery, #C0060-2, 캘리브레이터 2: Meso Scale Discovery, #C0061-2)을 혈청, 차단제 및 방부제가 포함된 분석 희석제 43(Meso Scale Discovery, #R50AG-2)과 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 3회 세척 후, IL-6(Meso Scale Discovery, #D26TX-3), MCP-1(Meso Scale Discovery, #D26UG-3) 및 IP-10(Meso Scale Discovery, #D21UF-3)에 대한 SULFO-TAG 접합된 검출 항체를 개별 웰에서 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 3회 세척하고 GoldTM 판독 완충액 B(Meso Scale Discovery, #R60AM-2)를 각 웰에 첨가한 후, 플레이트를 MSD 기기(Meso Scale Discovery, #R31QQ-3)에 의해 분석하였다.
[표 23]
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본 명세서에 언급된 모든 특허 및 간행물은 각각의 독립 특허 및 간행물이 참고로 포함되는 것으로 구체적이고 개별적으로 표시된 것처럼 동일한 정도로 본원에 참고로 포함된다.
기타 실시양태
전술한 설명으로부터, 다양한 용법 및 조건에 채택하기 위해 본원에 기재된 개시 내용에 변화 및 변형이 이루어질 수 있음이 명백할 것이다. 이러한 실시양태는 또한 다음 청구범위의 범위 내에 있다.
본원에서 변수의 임의의 정의에서 요소 목록의 열거는 나열된 요소의 임의의 단일 요소 또는 조합(또는 하위 조합)으로서 해당 변수의 정의를 포함한다. 본원의 실시양태의 열거는 해당 실시양태를 임의의 단일 실시양태, 실시양태의 임의의 부분, 또는 임의의 다른 실시양태 또는 이의 임의의 부분과 조합하여 포함한다.
본원에 제시된 바와 같이, 본 개시 내용은 이러한 염기 에디터 시스템, 설계 및 이에 대한 변형을 포함하는 조성물을 포함하는 유전자의 핵염기 변경을 수행하는 염기 에디터 시스템 및 질환 치료에 이를 사용하는 방법의 구체적인 실시양태 및 실시예; 및 질환 치료를 위한 그리고 기재된 조건 하에서 포유동물 세포에 활성제의 생체 내 및 시험관 내 전달을 위한 약학 조성물을 포함하는 상기의 합성, 제조, 사용, 및 효율을 개별적으로 및 조합하여 기술하는 구체적인 실시예 및 실시양태를 포함한다는 것을 이해할 것이다.
구체적인 예 및 수많은 실시양태가 상기의 측면 및 측면의 조합을 예시하기 위해 제공되었지만, 예시적인 또는 개시된 실시양태의 임의의 측면 또는 이들의 조합이 그로부터 제외되어 제한 없이 또 다른 실시양태를 구성할 수 있으며 임의의 이러한 조합이 별도의 독립적인 청구항을 구성할 수 있음이 고려된다는 것을 인식하고 이해해야 한다. 유사하게, 하나 이상의 실시양태의 임의의 측면 또는 측면의 조합이 또한 하나 이상의 실시양태의 임의의 측면 또는 측면의 조합과 함께 포함되거나 조합될 수 있고, 이들의 모든 이러한 조합이 본 개시 내용의 범위 내에 속하며 제한없이 별도의 독립적인 청구항으로서 제시될 수 있음이 본원에서 고려된다는 것을 인식하고 이해해야 한다. 따라서, 하나의 청구항에 제시된 임의의 특징은 다른 청구항에 포함될 수 있고, 하나의 청구항에 제시된 임의의 특징은 그 특징이 없는 청구항을 구성하기 위해 청구항에서 제거될 수 있고, 하나의 청구항에 제시된 임의의 특징은 다른 청구항의 임의의 특징과 결합될 수 있으며, 이들 각각은 본원에서 고려됨을 이해해야 한다. 다음의 열거된 조항은 전술한 실시양태 및 예의 측면 및 측면들의 조합의 추가 예시적인 예이다.
다음은 열거된 조항의 첫 번째 예이다:
1. (i) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 mRNA,
(ii) 염기 에디터 융합 단백질에 대한 결합 스캐폴드로서 역할을 하는 tracr 서열, 및 PCSK9 유전자 상의 프로토스페이서에 상응하는 스페이서 서열을 포함하는 가이드 RNA
를 포함하는 유전자 표적을 편집하기 위한 조성물로서,
가이드 RNA는 포유동물 대상체에게 투여될 때 염기 에디터 융합 단백질이 생체 내에서 PCSK9 유전자 내 핵염기 변경을 수행하도록 지시하며,
가이드 RNA 및 mRNA가 적어도 0.05 mg/kg의 총량으로 투여될 때, 차세대 시퀀싱 또는 생어 시퀀싱에 의해 측정되는 경우 포유동물 대상체에서 전체 간 세포의 적어도 35%에서 염기 변경이 발생하는 것인 조성물.
2. 조항 1에 있어서, 포유동물 대상체는 시노몰구스 원숭이이며,
가이드 RNA 및 mRNA가 적어도 0.5 mg/kg의 총량으로 투여될 때, 차세대 시퀀싱 또는 생어 시퀀싱에 의해 측정되는 경우 시노몰구스 원숭이에서 전체 간 세포의 적어도 40%에서 염기 변경이 발생하는 것인 조성물.
3. 조항 1에 있어서, 포유동물 대상체는 시노몰구스 원숭이이며,
가이드 RNA 및 mRNA가 적어도 1 mg/kg의 총량으로 투여될 때, 차세대 시퀀싱 또는 생어 시퀀싱에 의해 측정되는 경우 시노몰구스 원숭이에서 전체 간 세포의 적어도 45%에서 염기 변경이 발생하는 것인 조성물.
4. 조항 1에 있어서, 포유동물 대상체는 시노몰구스 원숭이이며,
가이드 RNA 및 mRNA가 적어도 1.5 mg/kg의 총량으로 투여될 때, 차세대 시퀀싱 또는 생어 시퀀싱에 의해 측정되는 경우 시노몰구스 원숭이에서 전체 간 세포의 적어도 50%에서 염기 변경이 발생하는 것인 조성물.
5. 조항 1에 있어서, 포유동물 대상체는 시노몰구스 원숭이이며,
가이드 RNA 및 mRNA가 적어도 3 mg/kg의 총량으로 투여될 때, 차세대 시퀀싱 또는 생어 시퀀싱에 의해 측정되는 경우 시노몰구스 원숭이에서 전체 간 세포의 적어도 55%에서 염기 변경이 발생하는 것인 조성물.
6. 조항 1에 있어서, 포유동물 대상체는 마우스이며,
가이드 RNA 및 mRNA가 적어도 0.125 mg/kg의 총량으로 투여될 때, 차세대 시퀀싱 또는 생어 시퀀싱에 의해 측정되는 경우 마우스에서 전체 간 세포의 적어도 40%에서 염기 변경이 발생하는 것인 조성물.
7. 조항 1에 있어서, 포유동물 대상체는 마우스이며,
가이드 RNA 및 mRNA가 적어도 0.5 mg/kg의 총량으로 투여될 때, 차세대 시퀀싱 또는 생어 시퀀싱에 의해 측정되는 경우 마우스에서 전체 간 세포의 적어도 45%에서 염기 변경이 발생하는 것인 조성물.
8. 조항 1에 있어서, 포유동물 대상체는 마우스이며,
가이드 RNA 및 mRNA가 적어도 2 mg/kg의 총량으로 투여될 때, 차세대 시퀀싱 또는 생어 시퀀싱에 의해 측정되는 경우 마우스에서 전체 간 세포의 적어도 50%에서 염기 변경이 발생하는 것인 조성물.
9. 조항 2에 있어서, 핵염기 변경은 투여 전과 비교하여 대상체의 혈중 저밀도 지단백질 콜레스테롤(LDL-C) 수준에서 적어도 50%의 감소를 초래하는 것인 조성물.
10. 조항 1-9 중 어느 하나에 있어서, 프로토스페이서는 스플라이스 부위에 위치하는 것인 조성물.
11. 조항 1-9 중 어느 하나에 있어서, 프로토스페이서 상보적 서열은 PCSK9 유전자의 안티센스 가닥에 있는 것인 조성물.
12. 조항 1-9 중 어느 하나에 있어서, 프로토스페이서 상보적 서열은 PCSK9 유전자의 센스 가닥에 있는 것인 조성물.
13. 조항 1-12 중 어느 하나에 있어서, 염기 변경은 PCSK9 유전자 상의 프로토스페이서 외부(오프 타겟 부위)에서 일어나며,
표 11에 제시된 오프 타겟 부위의 편집 백분율은 각각 표 11에 제시된 편집 백분율 이하인 조성물.
14. 조항 1-13 중 어느 하나에 있어서, 데아미나아제는 아데닌 데아미나아제이며 핵염기 변경은 A·T에서 G·C로의 변경인 조성물.
15. 조항 1-14 중 어느 하나에 있어서, 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인은 뉴클레아제 불활성 Cas9 또는 Cas9 닉카아제를 포함하는 것인 조성물.
16. 조항 1-15 중 어느 하나에 있어서, 핵염기 변경은 PCSK9 유전자의 스플라이스 부위에 있는 것인 조성물.
17. 조항 16에 있어서, 핵염기 변경은 PCSK9 유전자의 스플라이스 도너 부위에 있는 것인 조성물.
18. 조항 17에 있어서, 스플라이스 도너 부위는 서열 번호 5에 참조된 바와 같이 PCSK9 인트론 1의 5' 말단에 있는 것인 조성물.
19. 조항 16에 있어서, 핵염기 변경은 PCSK9 유전자의 스플라이스 억셉터 부위에 있는 것인 조성물.
20. 조항 1-19 중 어느 하나에 있어서, 핵염기 변경은 PCSK9 유전자에 의해 코딩되는 전사물에서 프레임 이동, 조기 정지 코돈, 삽입 또는 결실을 초래하는 것인 조성물.
21. 조항 1-20 중 어느 하나에 있어서, 핵염기 변경은 PCSK9 유전자에 의해 코딩되는 비정상 전사물을 생성하는 것인 조성물.
22. 조항 1-21 중 어느 하나에 있어서, 가이드 RNA는 화학적으로 변형된 것인 조성물.
23. 조항 16에 있어서, 가이드 RNA의 tracr 서열은 [도 7]에 도시된 도식에 따라 화학적으로 변형된 것인 조성물.
24. 조항 1-22 중 어느 하나에 있어서, 스페이서 서열은 표 1에 제시된 PCSK9 ABE 가이드 RNA 스페이서 서열을 포함하는 것인 조성물.
25. 조항 24에 있어서, 가이드 RNA는 표 1에 제시된 GA096, GA097, GA343, GA346, GA375-377, GA380-389, GA391, GA439 또는 GA440의 PCSK9 ABE 가이드 RNA 서열을 포함하는 것인 조성물.
26. 조항 1-23 중 어느 하나에 있어서, 프로토스페이서 서열은 표 1에 제시된 PCSK9 ABE 프로토스페이서 서열을 포함하는 것인 조성물.
27. 조항 26에 있어서, 프로토스페이서는 서열 5'-CCCGCACCTTGGCGCAGCGG-3'(서열 번호 13) 또는 5'-CCGCACCTTGGCGCAGCGG-3'(서열 번호 247)를 포함하는 것인 조성물.
28. 조항 1-27 중 어느 하나에 있어서, 염기 에디터 융합 단백질은 서열 번호 2137의 아미노산 서열을 포함하는 것인 조성물.
29. 조항 1-28 중 어느 하나에 있어서, mRNA 서열의 GC% 함량은 50% 초과인 조성물.
30. 조항 29에 있어서, mRNA 서열의 GC% 함량은 56% 초과인 조성물.
31. 조항 30에 있어서, mRNA 서열의 GC% 함량은 63% 이상인 조성물.
32. 조항 29에 있어서, mRNA는 아데닌 tTNA 데아미나아제(TadA) 영역, Cas9 영역 및 핵 국소화 서열(NLS) 영역을 포함하는 것인 조성물.
33. 조항 32에 있어서, mRNA는 TadA 영역과 Cas9 영역을 연결하는 제1 링커 영역, 및 Cas9 영역과 NLS 영역을 연결하는 제2 링커 영역을 추가로 포함하는 것인 조성물.
34. 조항 32 또는 33에 있어서, TadA 영역의 GC% 함량은 60% 초과인 조성물.
35. 조항 32 또는 33에 있어서, TadA 영역의 GC% 함량은 70% 이상인 조성물.
36. 조항 32 또는 33에 있어서, Cas9 영역의 GC% 함량은 56% 초과인 조성물.
37. 조항 32 또는 33에 있어서, Cas9 영역의 GC% 함량은 62% 이상인 조성물.
38, 조항 32 또는 33에 있어서, NLS 영역의 GC% 함량은 54% 초과인 조성물.
39. 조항 32 또는 33에 있어서, NLS 영역의 GC% 함량은 63% 이상인 조성물.
40. 조항 33에 있어서, 제1 링커 영역의 GC% 함량은 65% 초과인 조성물.
41. 조항 33에 있어서, 제1 링커 영역의 GC% 함량은 79% 이상인 조성물.
42. 조항 33에 있어서, 제2 링커 영역의 GC% 함량은 67% 초과인 조성물.
43. 조항 33에 있어서, 제2 링커 영역의 GC% 함량은 83% 이상인 조성물.
44. 조항 33에 있어서, TadA 영역의 GC% 함량은 60% 초과이며, Cas9 영역의 GC% 함량은 56% 초과이며, NLS 영역의 GC% 함량은 54% 초과이며, 제1 링커 영역의 GC% 함량은 65% 초과이며, 제2 링커 영역의 GC% 함량은 67% 초과인 조성물.
45. 조항 29에 있어서, mRNA는 표 23으로부터 선택된 mRNA 서열을 포함하는 것인 조성물.
46. 조항 45에 있어서, mRNA는 서열 번호 2136의 mRNA 서열을 포함하는 것인 조성물.
47. 조항 29-46 중 어느 하나에 있어서, mRNA는 폴리 A 꼬리를 포함하는 것인 조성물.
48. 조항 1-47 중 어느 하나에 있어서, (i)를 둘러싸는 지질 나노입자(LNP)를 추가로 포함하는 조성물.
49. 조항 48에 있어서, LNP는 (ii)를 추가로 둘러싸는 것인 조성물.
50. 조항 48에 있어서, (ii)를 둘러싸는 제2 LNP를 추가로 포함하는 조성물.
51. 조항 1-44 중 어느 하나에 있어서, 가이드 RNA와 염기 에디터 융합 단백질을 코딩하는 mRNA의 비는 중량 기준으로 약 1:10 내지 약 10:1인 조성물.
52. 조항 51에 있어서, 가이드 RNA와 염기 에디터 융합 단백질을 코딩하는 mRNA의 비는 중량 기준으로 약 1:1, 1.5:1, 2:1, 3:1, 4:1, 1:1.5, 1:2, 1:3, 또는 1:4인 조성물.
53. 조항 51에 있어서, 가이드 RNA와 염기 에디터 융합 단백질을 코딩하는 mRNA의 비는 중량 기준으로 약 1:1인 조성물.
54. 조항 1-53 중 어느 하나의 조성물 및 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 약학 조성물.
55. 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법으로서, 조항 1의 조성물의 치료 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
56. 조항 55에 있어서, 투여는 정맥 내 주입을 통해 이루어지는 것인 방법.
57. 조항 55 또는 56에 있어서, (i)를 둘러싸는 LNP 및 (ii)를 둘러싸는 LNP의 순차적 투여를 포함하는 방법.
58. 조항 55 또는 56에 있어서, (i)를 둘러싸는 LNP 및 (ii)를 둘러싸는 LNP의 동시 투여를 포함하는 방법.
59. 조항 57에 있어서, (ii)를 둘러싸는 LNP의 단일 용량의 투여 이후에, 1일의 간격으로 (i)를 둘러싸는 LNP의 시간차 용량을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
60. 조항 57에 있어서, (ii)를 둘러싸는 LNP의 단일 용량의 투여 이후에, 2일의 간격으로 (i)를 둘러싸는 LNP의 시간차 용량을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
61. 조항 57에 있어서, (ii)를 둘러싸는 LNP의 단일 용량의 투여 이후에, 3일의 간격으로 (i)를 둘러싸는 LNP의 시간차 용량을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
62. 조항 57에 있어서, (ii)를 둘러싸는 LNP의 단일 용량의 투여 이후에, 4일의 간격으로 (i)를 둘러싸는 LNP의 시간차 용량을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
63. 조항 57에 있어서, (ii)를 둘러싸는 LNP의 단일 용량의 투여 이후에, 5일의 간격으로 (i)를 둘러싸는 LNP의 시간차 용량을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
64. 조항 57에 있어서, (ii)를 둘러싸는 LNP의 단일 용량의 투여 이후에, 6일의 간격으로 (i)를 둘러싸는 LNP의 시간차 용량을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
65. 조항 57에 있어서, (ii)를 둘러싸는 LNP의 단일 용량의 투여 이후에, 7일의 간격으로 (i)를 둘러싸는 LNP의 시간차 용량을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
66. 조항 55 또는 56에 있어서, (i) 및 (ii)를 둘러싸는 LNP의 단일 용량을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
67. 조항 66에 있어서, LNP의 단일 용량은 약 0.3 내지 약 3mg/kg인 방법.
68. 조항 66 또는 67에 있어서, 대상체에게 하나 이상의 치료의 치료 과정을 시행하는 단계를 포함하고, 하나 이상의 치료 각각은 LNP의 단일 용량의 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
69. 조항 68에 있어서, 2 내지 10회 치료의 치료 과정을 시행하는 단계를 포함하는 방법.
70. 조항 68에 있어서, 2 내지 5회 치료의 치료 과정을 시행하는 단계를 포함하는 방법.
71. 조항 68에 있어서, 2회 치료의 치료 과정을 시행하는 단계를 포함하는 방법.
72. 조항 68에 있어서, 3회 치료의 치료 과정을 시행하는 단계를 포함하는 방법.
73. 조항 68에 있어서, 4회 치료의 치료 과정을 시행하는 단계를 포함하는 방법.
74. 조항 68에 있어서, 5회 치료의 치료 과정을 시행하는 단계를 포함하는 방법.
75. 조항 55-74 중 어느 하나에 있어서, 병태는 죽상동맥경화성 심혈관 질환인 방법.
76. 조항 55-74 중 어느 하나에 있어서, 병태는 죽상동맥경화성 혈관 질환인 방법.
77, 조항 55-74 중 어느 하나에 있어서, 대상체는 인간인 방법.
78. (i) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 mRNA,
(ii) 염기 에디터 융합 단백질에 대한 결합 스캐폴드로서 역할을 하는 tracr 서열, 및 PCSK9 유전자 상의 프로토스페이서에 상응하는 스페이서 서열을 포함하는 가이드 RNA
를 포함하는 유전자 표적을 편집하기 위한 조성물로서,
가이드 RNA는 포유동물 대상체에게 투여될 때 염기 에디터 융합 단백질이 생체 내에서 PCSK9 유전자 내 핵염기 변경을 수행하도록 지시하며, 가이드 RNA는 표 1에 제시된 바와 같은 PCSK9 ABE 가이드 RNA 서열을 포함하는 것인 조성물.
79. (i) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 mRNA,
(ii) 염기 에디터 융합 단백질에 대한 결합 스캐폴드로서 역할을 하는 tracr 서열, 및 PCSK9 유전자 상의 프로토스페이서에 상응하는 스페이서 서열을 포함하는 가이드 RNA
를 포함하는 유전자 표적을 편집하기 위한 조성물로서,
가이드 RNA는 포유동물 대상체에게 투여될 때 염기 에디터 융합 단백질이 생체 내에서 PCSK9 유전자 내 핵염기 변경을 수행하도록 지시하며,
mRNA는 표 23으로부터 선택된 서열을 포함하는 것인 조성물.
80. 죽상동맥경화성 심혈관 질환의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법으로서,
(i) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 mRNA,
(ii) 염기 에디터 융합 단백질에 대한 결합 스캐폴드로서 역할을 하는 tracr 서열, 및 PCSK9 유전자 상의 프로토스페이서에 상응하는 스페이서 서열을 포함하는 가이드 RNA를 포함하는 제1 조성물로서,
가이드 RNA는 포유동물 대상체에게 투여될 때 염기 에디터 융합 단백질이 생체 내에서 PCSK9 유전자 내 핵염기 변경을 수행하도록 지시하며, 가이드 RNA 및 mRNA가 적어도 0.05 mg/kg의 총량으로 투여될 때, 차세대 시퀀싱 또는 생어 시퀀싱에 의해 측정되는 경우 포유동물 대상체에서 전체 간 세포의 적어도 35%에서 염기 변경이 발생하는 것인 제1 조성물; 및
(i) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 mRNA,
(ii) 염기 에디터 융합 단백질에 대한 결합 스캐폴드로서 역할을 하는 tracr 서열, 및 ANGPTL3 유전자 상의 프로토스페이서에 상응하는 스페이서 서열을 포함하는 가이드 RNA를 포함하는 제2 조성물로서,
가이드 RNA는 포유동물 대상체에게 투여될 때 염기 에디터 융합 단백질이 생체 내에서 ANGPTL3 유전자 내 핵염기 변경을 수행하도록 지시하며, 가이드 RNA 및 mRNA가 적어도 0.5 mg/kg의 총량으로 투여될 때, 차세대 시퀀싱 또는 생어 시퀀싱에 의해 측정되는 경우 포유동물 대상체에서 전체 간 세포의 적어도 35%에서 염기 변경이 발생하는 것인 제2 조성물
의 치료 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
81. 조항 80에 있어서, 제1 조성물 및 제2 조성물의 순차적 투여를 포함하는 방법.
82. 조항 81에 있어서, 1회 이상의 용량의 제1 조성물을 투여한 후 1회 이상의 용량의 제2 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
83. 조항 82에 있어서, 1회 이상의 용량의 제2 조성물을 투여한 후 1회 이상의 용량의 제1 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
84. 조항 80에 있어서, 제1 조성물 및 제2 조성물의 동시 투여를 포함하는 방법.
85. 조항 84에 있어서, 제1 조성물 및 제2 조성물의 1회 이상의 용량을 포함하는 방법.
86. (i) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 mRNA,
(ii) 염기 에디터 융합 단백질에 대한 결합 스캐폴드로서 역할을 하는 tracr 서열, 및 APOC3 유전자 상의 프로토스페이서에 상응하는 스페이서 서열을 포함하는 가이드 RNA
를 포함하는 유전자 표적을 편집하기 위한 조성물로서,
가이드 RNA는 표 24에 제시된 바와 같은 GA300-303의 APOC3 ABE 가이드 RNA 서열을 포함하는 것인 조성물.
87. (i) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 mRNA,
(ii) 염기 에디터 융합 단백질에 대한 결합 스캐폴드로서 역할을 하는 tracr 서열, 및 PCSK9 유전자 상의 프로토스페이서에 상응하는 스페이서 서열을 포함하는 가이드 RNA
를 포함하는 유전자 표적을 편집하기 위한 조성물로서,
가이드 RNA는 염기 에디터 융합 단백질이 시험관 내에서 PCSK9 유전자 내 핵염기 변경을 수행하도록 지시하며,
가이드 RNA 및 mRNA가 적어도 2.5 mg/kg의 총량으로 투여될 때, 차세대 시퀀싱 또는 생어 시퀀싱에 의해 측정되는 경우 포유동물 대상체에서 전체 간 세포의 적어도 35%에서 염기 변경이 발생하는 것인 조성물.
88. (a) 편집 창을 갖는 아데닌 염기 에디터 단백질을 코딩하는 mRNA, 및
(b) 염기 에디터 단백질에 대한 결합 스캐폴드 역할을 하는 tracr 서열 및 염기 에디터 단백질을 PCSK9 유전자 상의 프로토스페이서 서열로 안내하는 역할을 하는 스페이서 서열을 포함하는 가이드 RNA
를 포함하는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물로서,
스페이서 서열은 PCSK9 유전자의 스플라이스 부위 또는 엑손 영역에 적어도 부분적으로 상보적인 것인 조성물.
89. 조항 88에 있어서, 염기 에디터 단백질이 가이드 RNA에 작동적으로 결합되고 가이드 RNA가 PCSK9 유전자 상의 프로토스페이서 서열에 상보적인 가닥과 혼성화되는 경우, 편집 창은 PCSK9 유전자의 스플라이스 부위를 포함하는 것인 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
90. 조항 88에 있어서, 염기 에디터 단백질이 가이드 RNA에 작동적으로 결합되고 가이드 RNA가 PCSK9 유전자 상의 프로토스페이서 서열에 상보적인 가닥과 혼성화되는 경우, 편집 창은 PCSK9 유전자의 인트론의 영역을 포함하는 것인 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
91. 조항 88에 있어서, 염기 에디터 단백질이 가이드 RNA에 작동적으로 결합되고 가이드 RNA가 PCSK9 유전자 상의 프로토스페이서 서열에 상보적인 가닥과 혼성화되는 경우, 편집 창은 PCSK9 유전자의 인트론 1, 인트론 3 또는 인트론 4의 영역을 포함하는 것인 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
92. 조항 88에 있어서, 염기 에디터 단백질이 가이드 RNA에 작동적으로 결합되고 가이드 RNA가 PCSK9 유전자 상의 프로토스페이서 서열에 상보적인 가닥과 혼성화되는 경우, 편집 창은 PCSK9 유전자의 인트론 1의 영역을 포함하는 것인 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
93. 조항 88에 있어서, 스페이서 서열은 GA066, GA073 및 GA074로 식별된 가이드 RNA 서열의 군으로부터 선택된 스페이서 서열에 대해 80-100% 뉴클레오티드 서열 동일성을 갖는 것인 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
94. 조항 88에 있어서, tracr 서열은 GA066, GA095, GA096, GA097, GA343, GA346, GA375, GA376, GA377, GA380, GA381, GA382, GA383, GA384, GA385, GA386, GA387, GA388, GA389, GA439, 및 GA440으로 식별된 가이드 RNA 서열의 군으로부터 선택된 tracr 서열에 대해 80-100% 뉴클레오티드 서열 동일성을 갖는 것인 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
95. 조항 88에 있어서, mRNA는 MA002, MA004, MA040, MA0041, 또는 MA045로 식별된 mRNA 서열에 대해 80-100% 서열 동일성을 갖는 것인 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
96. 조항 88에 있어서, mRNA는 하기 표에 제시된 GC 뉴클레오티드 영역 백분율 중 하나 이상을 갖는 것인 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물:
Figure pct00377
97. 조항 88에 있어서, mRNA는 하기 표에 제시된 GC 뉴클레오티드 영역 백분율 중 하나 이상을 갖는 것인 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물:
Figure pct00378
98. 조항 88에 있어서, mRNA 및 gRNA는 지질 나노입자 내에 캡슐화된 것인 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
99. 조항 88에 있어서, mRNA 및 gRNA는 하기를 갖는 지질 나노입자 내에 캡슐화된 것인 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물:
LNP 조성(몰%):
40-65% iLipid
2-20% DSPC
1-5% PEG
나머지 몰% 밸런스는 콜레스테롤;
LNP 입자 크기: 55-120 nm Z 평균 유체역학적 직경; 및
동적 광산란에 의해 결정된 <0.2의 다분산 지수.
100. 조항 88에 있어서, mRNA 및 gRNA는 50-70 nm Z 평균 유체역학적 직경의 LNP 입자 크기를 갖는 지질 나노입자 내에 캡슐화된 것인 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
101. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 0.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 40% 초과의 평균 편집 백분율로 시노몰구스 원숭이의 간의 PCSK9 표적 스플라이스 부위에서 아데닌 염기 편집을 유도할 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
102. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 0.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 50% 초과의 평균 편집 백분율로 시노몰구스 원숭이의 간의 PCSK9 표적 스플라이스 부위에서 아데닌 염기 편집을 유도할 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
103. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 0.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 30% 초과의 평균 편집 백분율로 시노몰구스 원숭이의 간의 PCSK9 표적 스플라이스 부위에서 아데닌 염기 편집을 유도할 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
104. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 40% 초과의 평균 편집 백분율로 시노몰구스 원숭이의 간의 PCSK9 표적 스플라이스 부위에서 아데닌 염기 편집을 유도할 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
105. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 50% 초과의 평균 편집 백분율로 시노몰구스 원숭이의 간의 PCSK9 표적 스플라이스 부위에서 아데닌 염기 편집을 유도할 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
106. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 60% 초과의 평균 편집 백분율로 시노몰구스 원숭이의 간의 PCSK9 표적 스플라이스 부위에서 아데닌 염기 편집을 유도할 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
107. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 70% 초과의 평균 편집 백분율로 시노몰구스 원숭이의 간의 PCSK9 표적 스플라이스 부위에서 아데닌 염기 편집을 유도할 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
108. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 40% 초과의 평균 편집 백분율로 시노몰구스 원숭이의 간의 PCSK9 표적 스플라이스 부위에서 아데닌 염기 편집을 유도할 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
109. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 50% 초과의 평균 편집 백분율로 시노몰구스 원숭이의 간의 PCSK9 표적 스플라이스 부위에서 아데닌 염기 편집을 유도할 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
110. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 60% 초과의 평균 편집 백분율로 시노몰구스 원숭이의 간의 PCSK9 표적 스플라이스 부위에서 아데닌 염기 편집을 유도할 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
111. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 70% 초과의 평균 편집 백분율로 시노몰구스 원숭이의 간의 PCSK9 표적 스플라이스 부위에서 아데닌 염기 편집을 유도할 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
112. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 80% 초과의 평균 편집 백분율로 시노몰구스 원숭이의 간의 PCSK9 표적 스플라이스 부위에서 아데닌 염기 편집을 유도할 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
113. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 3 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 40% 초과의 평균 편집 백분율로 시노몰구스 원숭이의 간의 PCSK9 표적 스플라이스 부위에서 아데닌 염기 편집을 유도할 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
114. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 3 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 50% 초과의 평균 편집 백분율로 시노몰구스 원숭이의 간의 PCSK9 표적 스플라이스 부위에서 아데닌 염기 편집을 유도할 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
115. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 3 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 60% 초과의 평균 편집 백분율로 시노몰구스 원숭이의 간의 PCSK9 표적 스플라이스 부위에서 아데닌 염기 편집을 유도할 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
116. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 3 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 70% 초과의 평균 편집 백분율로 시노몰구스 원숭이의 간의 PCSK9 표적 스플라이스 부위에서 아데닌 염기 편집을 유도할 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
117. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 3 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 80% 초과의 평균 편집 백분율로 시노몰구스 원숭이의 간의 PCSK9 표적 스플라이스 부위에서 아데닌 염기 편집을 유도할 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
118. 조항 87-117 중 어느 하나에 있어서, 퍼센트 편집율은 원숭이의 간 생검 또는 부검을 통해 투여된 시노몰구스 원숭이 간의 분석을 통해 투여 후 15일에 결정되는 것인 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
119. 조항 87-117 중 어느 하나에 있어서, 퍼센트 편집율은 투여 후 적어도 168일의 범위에 걸쳐 투여된 시노몰구스 원숭이의 주기적인 간 생검 테스트에 의해 지속적으로 유지되는 것으로 결정되는 것인 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
120. 조항 87-117 중 어느 하나에 있어서, 퍼센트 편집율은 투여 후 적어도 300일의 범위에 걸쳐 투여된 시노몰구스 원숭이의 주기적인 간 생검 테스트에 의해 지속적으로 유지되는 것으로 결정되는 것인 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
121. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 0.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 PCSK9 단백질을 기준선과 비교하여 평균 35% 이상 감소시킬 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
122. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 0.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 PCSK9 단백질을 기준선과 비교하여 평균 40% 이상 감소시킬 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
123. 조항 88에 있어서, 조성물은 원숭이 체중 1 kg당 대략 0.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 PCSK9 단백질을 기준선과 비교하여 평균 50% 이상 감소시킬 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
124. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 0.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 원숭이의 혈장에서 PCSK9 단백질을 기준선과 비교하여 평균 60% 이상 감소시킬 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
125. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 0.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 PCSK9 단백질을 기준선과 비교하여 평균 70% 이상 감소시킬 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
126. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 0.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 PCSK9 단백질을 기준선과 비교하여 평균 80% 이상 감소시킬 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
127. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 PCSK9 단백질을 기준선과 비교하여 평균 35% 이상 감소시킬 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
128. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 PCSK9 단백질을 기준선과 비교하여 평균 40% 이상 감소시킬 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
129. 조항 88에 있어서, 조성물은 원숭이 체중 1 kg당 대략 1 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 PCSK9 단백질을 기준선과 비교하여 평균 50% 이상 감소시킬 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
130. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 PCSK9 단백질을 기준선과 비교하여 평균 60% 이상 감소시킬 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
131. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 PCSK9 단백질을 기준선과 비교하여 평균 70% 이상 감소시킬 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
132. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 PCSK9 단백질을 기준선과 비교하여 평균 80% 이상 감소시킬 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
133. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 PCSK9 단백질을 기준선과 비교하여 평균 35% 이상 감소시킬 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
134. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 PCSK9 단백질을 기준선과 비교하여 평균 40% 이상 감소시킬 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
135. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 PCSK9 단백질을 기준선과 비교하여 평균 50% 이상 감소시킬 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
136. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 PCSK9 단백질을 기준선과 비교하여 평균 60% 이상 감소시킬 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
137. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 PCSK9 단백질을 기준선과 비교하여 평균 70% 이상 감소시킬 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
138. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 PCSK9 단백질을 기준선과 비교하여 평균 80% 이상 감소시킬 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
139. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 3 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 PCSK9 단백질을 기준선과 비교하여 평균 35% 이상 감소시킬 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
140. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 3 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 PCSK9 단백질을 기준선과 비교하여 평균 40% 이상 감소시킬 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
141. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 3 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 PCSK9 단백질을 기준선과 비교하여 평균 50% 이상 감소시킬 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
142. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 3 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 PCSK9 단백질을 기준선과 비교하여 평균 60% 이상 감소시킬 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
143. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 3 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 PCSK9 단백질을 기준선과 비교하여 평균 70% 이상 감소시킬 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
144. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 3 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 PCSK9 단백질을 기준선과 비교하여 평균 80% 이상 감소시킬 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
145. 조항 121-144 중 어느 하나에 있어서, 혈장 단백질의 감소는 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈액 샘플링 및 분석을 통해 투여 후 15일에 결정되는 것인 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
146. 조항 88에 있어서, 조성물은 원숭이 체중 1 kg당 대략 0.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 원숭이의 혈장에서 LDL-C를 기준선과 비교하여 평균 20% 이상 감소시킬 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
147. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 0.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 LDL-C를 기준선과 비교하여 평균 25% 이상 감소시킬 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
148. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 0.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 LDL-C를 기준선과 비교하여 평균 30% 이상 감소시킬 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
149. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 0.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 LDL-C를 기준선과 비교하여 평균 35% 이상 감소시킬 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
150. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 0.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 LDL-C를 기준선과 비교하여 평균 40% 이상 감소시킬 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
151. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 0.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 LDL-C를 기준선과 비교하여 평균 45% 이상 감소시킬 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
152. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 LDL-C를 기준선과 비교하여 평균 20% 이상 감소시킬 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
153. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 LDL-C를 기준선과 비교하여 평균 25% 이상 감소시킬 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
154. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 LDL-C를 기준선과 비교하여 평균 30% 이상 감소시킬 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
155. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 LDL-C를 기준선과 비교하여 평균 35% 이상 감소시킬 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
156. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 LDL-C를 기준선과 비교하여 평균 40% 이상 감소시킬 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
157. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 LDL-C를 기준선과 비교하여 평균 45% 이상 감소시킬 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
158. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 LDL-C를 기준선과 비교하여 평균 50% 이상 감소시킬 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
159. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 LDL-C를 기준선과 비교하여 평균 55% 이상 감소시킬 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
160. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 LDL-C를 기준선과 비교하여 평균 60% 이상 감소시킬 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
161. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 LDL-C를 기준선과 비교하여 평균 20% 이상 감소시킬 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
162. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 LDL-C를 기준선과 비교하여 평균 25% 이상 감소시킬 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
163. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 LDL-C를 기준선과 비교하여 평균 30% 이상 감소시킬 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
164. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 LDL-C를 기준선과 비교하여 평균 35% 이상 감소시킬 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
165. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 LDL-C를 기준선과 비교하여 평균 40% 이상 감소시킬 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
166. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 LDL-C를 기준선과 비교하여 평균 45% 이상 감소시킬 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
167. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 LDL-C를 기준선과 비교하여 평균 50% 이상 감소시킬 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
168. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 LDL-C를 기준선과 비교하여 평균 55% 이상 감소시킬 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
169. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 LDL-C를 기준선과 비교하여 평균 60% 이상 감소시킬 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
170. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 LDL-C를 기준선과 비교하여 평균 65% 이상 감소시킬 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
171. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 3 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 LDL-C를 기준선과 비교하여 평균 20% 이상 감소시킬 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
172. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 3 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 원숭이의 혈장에서 LDL-C를 기준선과 비교하여 평균 25% 이상 감소시킬 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
173. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 3 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 LDL-C를 기준선과 비교하여 평균 30% 이상 감소시킬 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
174. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 3 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 LDL-C를 기준선과 비교하여 평균 35% 이상 감소시킬 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
175. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 3 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 LDL-C를 기준선과 비교하여 평균 40% 이상 감소시킬 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
176. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 3 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 LDL-C를 기준선과 비교하여 평균 45% 이상 감소시킬 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
177. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 3 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 LDL-C를 기준선과 비교하여 평균 50% 이상 감소시킬 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
178. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 3 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 LDL-C를 기준선과 비교하여 평균 55% 이상 감소시킬 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
179. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 3 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 LDL-C를 기준선과 비교하여 평균 60% 이상 감소시킬 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
180. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 3 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 LDL-C를 기준선과 비교하여 평균 65% 이상 감소시킬 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
181. 조항 148-182 중 어느 하나에 있어서, LDL-C의 감소는 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈액 샘플링 및 분석을 통해 투여 후 15일에 결정되는 것인 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
182. 조항 148-182 중 어느 하나에 있어서, LDL-C의 감소는 투여된 시노몰구스 원숭이의 주기적 혈액 샘플링 및 분석에 의해 적어도 168일의 범위에 걸쳐 지속적으로 유지되는 것으로 결정되는 것인 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
183. 조항 148-182에 있어서, LDL-C의 감소는 투여된 시노몰구스 원숭이의 주기적 혈액 샘플링 및 분석에 의해 적어도 300일의 범위에 걸쳐 지속적으로 유지되는 것으로 결정되는 것인 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
184. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 3 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 지단백질(a)를 기준선과 비교하여 평균 10% 이상 감소시킬 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
185. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 3 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 지단백질(a) 수준을 기준선과 비교하여 평균 15% 이상 감소시킬 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
186. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 3 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 지단백질(a) 수준을 기준선과 비교하여 평균 20% 이상 감소시킬 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
187. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 3 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 지단백질(a) 수준을 기준선과 비교하여 평균 25% 이상 감소시킬 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
188. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 3 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 지단백질(a) 수준을 기준선과 비교하여 평균 30% 이상 감소시킬 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
189. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 3 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 지단백질(a) 수준을 기준선과 비교하여 평균 대략 35% 감소시킬 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
190. 조항 186-191 중 어느 하나에 있어서, 지단백질(a)의 감소는 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈액 샘플링 및 분석을 통해 투여 후 15일에 결정되는 것인 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
191. 조항 186-191 중 어느 하나에 있어서, 지단백질(a)의 감소는 투여된 시노몰구스 원숭이의 주기적 혈액 샘플링 및 분석에 의해 적어도 224일의 범위에 걸쳐 지속적으로 유지되는 것으로 결정되는 것인 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
192. 조항 186-191 중 어느 하나에 있어서, 지단백질(a)의 감소는 투여된 시노몰구스 원숭이의 주기적 혈액 샘플링 및 분석에 의해 적어도 300일의 범위에 걸쳐 지속적으로 유지되는 것으로 결정되는 것인 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
193. 조항 101-194 중 어느 하나에 있어서, 시노몰구스 원숭이의 투여가 AST, ALT, 또는 사이토카인의 상승을 초래하는 정도로, 조성물의 투여로 인한 상승은 일시적이고 투여 후 3-15일 이내에 대략 기준선 수준으로 다시 해소되는 것인 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
194. 조항 101-103, 121-126, 148-153 중 어느 하나에 있어서, PCSK9의 퍼센트 편집율은 [도 27]에 예시된 바와 같이 간, 비장 및 부신 조직 외부에서 무시할 수 있는 것인 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
195. 조항 101-107, 121-132, 148-162 중 어느 하나에 있어서, 반복 투여 결과는 PCSK9 편집 백분율의 편집 백분율과 관련하여 부가적인 것인 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
196. 조항 195에 있어서, 반복 투여는 사이토카인 활성화도 면역 반응도 유발하지 않는 것인 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
197. 조항 88에 있어서, 스페이서 서열은 PCSK9 유전자 상의 표적화된 프로토스페이서의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%의 뉴클레오티드 상관관계를 가지며, 스페이서 서열 상의 RNA 뉴클레오티드는 DNA 뉴클레오티드와 동일한 뉴클레오티드를 동일한 순서로 가질 경우 프로토스페이서의 DNA 뉴클레오티드와 상관관계에 있고 우라실 및 티민 염기는 상관관계를 결정하기 위해 동일한 뉴클레오티드로 간주되는 것인 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
198. 조항 197에 있어서, 스페이서 서열은 PCSK9 유전자 상의 표적화된 프로토스페이서의 뉴클레오티드 서열과 적어도 85%의 뉴클레오티드 상관관계를 갖는 것인 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
199. 조항 197에 있어서, 스페이서 서열은 PCSK9 유전자 상의 표적화된 프로토스페이서의 뉴클레오티드 서열과 적어도 90%의 뉴클레오티드 상관관계를 갖는 것인 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
200. 조항 197에 있어서, 스페이서 서열은 PCSK9 유전자 상의 표적화된 프로토스페이서의 뉴클레오티드 서열과 적어도 95%의 뉴클레오티드 상관관계를 갖는 것인 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
201. 조항 197에 있어서, 스페이서 서열은 PCSK9 유전자 상의 표적화된 프로토스페이서의 뉴클레오티드 서열과 적어도 99%의 뉴클레오티드 상관관계를 갖는 것인 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
202. 조항 197에 있어서, 스페이서 서열은 PCSK9 유전자 상의 표적화된 프로토스페이서의 뉴클레오티드 서열과 적어도 100%의 뉴클레오티드 상관관계를 갖는 것인 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
203. 죽상동맥경화성 심혈관 질환의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법으로서,
(a) 편집 창을 갖는 아데닌 염기 에디터 단백질을 코딩하는 mRNA,
(b) 염기 에디터 단백질에 대한 결합 스캐폴드 역할을 하는 tracr 서열 및 염기 에디터 단백질을 PCSK9 유전자 상의 프로토스페이서 서열로 안내하는 역할을 하는 스페이서 서열을 포함하는 제1 가이드 RNA로서, 스페이서 서열은 PCSK9 유전자의 스플라이스 부위 또는 엑손 영역에 적어도 부분적으로 상보적인 것인 제1 가이드 RNA; 및
(c) 염기 에디터 단백질에 대한 결합 스캐폴드 역할을 하는 tracr 서열 및 염기 에디터 단백질을 ANGPTL3 유전자 상의 프로토스페이서 서열로 안내하는 역할을 하는 스페이서 서열을 포함하는 제2 가이드 RNA로서, 스페이서 서열은 ANGPTL3 유전자의 스플라이스 부위 또는 엑손 영역에 적어도 부분적으로 상보적인 것인 제2 가이드 RNA
의 치료 유효량을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법.
204. 조항 203에 있어서, (a)를 둘러싸는 제1 LNP를 추가로 포함하는 방법.
205. 조항 204에 있어서, 제1 LNP는 (b) 및 (c)를 둘러싸는 것인 방법.
206. 조항 204에 있어서, 제1 LNP는 반복적으로 투여되는 것인 방법.
207. 조항 204에 있어서, 제1 LNP는 1 내지 60일의 간격으로 반복적으로 투여되는 것인 방법.
208. 조항 204에 있어서, 제1 LNP는 7일의 간격으로 반복적으로 투여되는 것인 방법.
209. 조항 204에 있어서, 제1 LNP는 (b)를 추가로 둘러싸는 것인 방법.
210. 조항 209에 있어서, (a) 및 (c)를 둘러싸는 제2 LNP를 추가로 포함하는 방법.
211. 조항 210에 있어서, 제1 LNP 및 제2 LNP는 순차적으로 투여되는 것인 방법.
212. 조항 211에 있어서, 제1 LNP 및 제2 LNP는 1일 내지 12개월의 간격으로 순차적으로 투여되는 것인 방법.
213. 조항 212에 있어서, 간격은 1일인 방법.
214. 조항 212에 있어서, 간격은 5일인 방법.
215. 조항 212에 있어서, 간격은 10일인 방법.
216. 조항 212에 있어서, 간격은 15일인 방법.
217. 조항 212에 있어서, 간격은 20일인 방법.
218. 조항 212에 있어서, 간격은 25일인 방법.
219. 조항 212에 있어서, 간격은 1개월인 방법.
220. 조항 212에 있어서, 간격은 2개월인 방법.
221. 조항 212에 있어서, 간격은 3개월인 방법.
222. 조항 212에 있어서, 간격은 5개월인 방법.
223. 조항 212에 있어서, 간격은 8개월인 방법.
224. 조항 212에 있어서, 간격은 10개월인 방법.
225. 조항 212에 있어서, 간격은 12개월인 방법.
다음은 열거된 조항의 두 번째 예이다:
1. 다음을 포함하는 단일 가이드 RNA: (a) (i) 하나 이상의 화학적 변형(들) 및 (ii) 선택 위치(들)에서 하나 이상의 비변형된 뉴클레오티드(들)를 포함하는 스페이서 서열, 및 (b) 서열 번호 61에 대해 적어도 70% 동일성을 갖는 tracr 서열로서, II형 Cas 단백질에 대한 결합 스캐폴드로서 작용하고, (i) 하나 이상의 화학적 변형(들) 및 (ii) 선택 위치(들)에서 하나 이상의 비변형된 뉴클레오티드(들)를 포함하는 tracr 서열.
2. 조항 1에 있어서, 스페이서 서열은 표적 폴리뉴클레오티드 서열과 접촉될 때 관심 유전자 내의 표적 폴리뉴클레오티드 서열과 혼성화하고, 단일 가이드 RNA는 포유동물 대상체에게 투여될 때 Cas 단백질이 유전자 내 변경을 수행하도록 지시하는 단일 가이드 RNA.
3. 조항 1 또는 2에 있어서, tracr 서열은 서열 번호 61에 넘버링된 바와 같이 위치 2 내지 7, 23 내지 25, 27, 29, 31, 38, 39, 42 내지 45, 48, 49 및 62 또는 이들에 상응하는 위치에서 비변형된 뉴클레오티드를 포함하는 것인 단일 가이드 RNA.
4. 항목 1 또는 2에 있어서, tracr 서열은 서열 번호 61에 넘버링된 바와 같이 위치 2 내지 7, 13, 23 내지 25, 27, 29, 31, 38, 39, 42 내지 45, 48, 49, 53 및 62 또는 이들에 상응하는 위치에서 비변형된 뉴클레오티드를 포함하는 것인 단일 가이드 RNA.
5. 조항 1 또는 2에 있어서, tracr 서열은 서열 번호 61에 넘버링된 바와 같이 위치 2 내지 7, 13, 23 내지 25, 27, 29, 31, 38, 39, 42 내지 45, 48, 49, 53, 61, 68, 70 및 11 또는 이들에 상응하는 위치에서 비변형된 뉴클레오티드를 포함하는 것인 단일 가이드 RNA.
6. 조항 1-3 중 어느 하나에 있어서, tracr 서열은 서열 번호 61에 넘버링된 바와 같이 위치 1, 8 내지 22, 26, 28, 30, 32 내지 37, 40, 41, 46, 47, 50 내지 61, 및 63 내지 80 또는 이들에 상응하는 위치에서 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 것인 단일 가이드 RNA.
7. 조항 1-3 중 어느 하나에 있어서, tracr 서열은 서열 번호 61에 넘버링된 바와 같이 위치 1, 8 내지 12, 14 내지 22, 26, 28, 30, 32 내지 37, 40, 41, 46, 47, 50 내지 52, 54 내지 61, 및 63 내지 80 또는 이들에 상응하는 위치에서 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 것인 단일 가이드 RNA.
8. 조항 1-7 중 어느 하나에 있어서, tracr 서열은 서열 번호 61에 넘버링된 바와 같이 위치 1, 8 내지 12, 14 내지 22, 26, 28, 30, 32 내지 34, 37, 41, 46, 47, 50 내지 52, 54 내지 60, 62 내지 67, 69 및 72 내지 80 또는 이들에 상응하는 위치에서 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 것인 단일 가이드 RNA.
9. 조항 3-8 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 61을 가진 tracr 서열에서 60% 초과의 뉴클레오티드는 변형된 것인 단일 가이드 RNA.
10. 조항 9에 있어서, 서열 번호 61을 가진 tracr 서열에서 70% 초과의 뉴클레오티드는 변형된 것인 단일 가이드 RNA.
11. 조항 1-10중 어느 하나에 있어서, tracr 서열은 서열 번호 61에 넘버링된 바와 같이 위치 13, 49, 53 및 62 또는 이들에 상응하는 위치에서 비변형된 뉴클레오티드를 포함하는 것인 단일 가이드 RNA.
12. 조항 11에 있어서, tracr 서열은 서열 번호 61에 넘버링된 바와 같이 위치 49 및 62 또는 이들에 상응하는 위치에서 비변형된 뉴클레오티드를 포함하는 것인 단일 가이드 RNA.
13. 조항 1-10 중 어느 하나에 있어서, tracr 서열은 서열 번호 61에 넘버링된 바와 같이 위치 13, 40, 49, 53, 61, 68, 70 및 71 또는 이들에 상응하는 위치에서 비변형된 뉴클레오티드를 포함하는 것인 단일 가이드 RNA.
14. 조항 13에 있어서, tracr 서열은 서열 번호 61에 넘버링된 바와 같이 위치 13, 49 및 53 또는 이들에 상응하는 위치에서 비변형된 뉴클레오티드를 포함하는 것인 단일 가이드 RNA.
15. 조항 1-10 중 어느 하나에 있어서, tracr 서열은 서열 번호 61에 넘버링된 바와 같이 위치 1, 8, 21, 22, 26, 28, 30, 32 내지 37, 40, 41, 46 및 47 또는 이들에 상응하는 위치에서 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 것인 단일 가이드 RNA.
16. 조항 1-15 중 어느 하나에 있어서, tracr 서열은 서열 번호 61에 대해 적어도 80% 동일성을 포함하는 것인 단일 가이드 RNA.
17. 조항 1-15 중 어느 하나에 있어서 tracr 서열은 서열 번호 61에 대해 적어도 90% 동일성을 포함하는 것인 단일 가이드 RNA.
18. 조항 1-17 중 어느 하나에 있어서, 화학적 변형은 2'-OMe 변형을 포함하는 것인 단일 가이드 RNA.
19. 조항 1-17 중 어느 하나에 있어서, 화학적 변형은 네불라린 또는 데옥시네불라린을 포함하는 것인 단일 가이드 RNA.
20. 조항 1-17 중 어느 하나에 있어서, 화학적 변형은 포스포로티오에이트 결합을 포함하는 것인 단일 가이드 RNA.
21. 조항 1-20 중 어느 하나에 있어서, tracr 서열은 서열 번호 61을 포함하고, 단일 가이드 RNA는 5' 말단, 3' 말단, 선택된 내부 위치 또는 이들의 조합에서 하나 이상의 포스포로티오에이트 결합을 추가로 포함하는 단일 가이드 RNA.
22. 조항 21에 있어서, 단일 가이드 RNA는 5' 말단, 3' 말단 또는 둘 다에서 2개 이하의 연속적인 포스포로티오에이트 결합을 추가로 포함하는 단일 가이드 RNA.
23. 조항 21에 있어서, 단일 가이드 RNA는 5' 말단, 3' 말단 또는 둘 다에서 3개의 연속적인 포스포로티오에이트 결합을 추가로 포함하는 단일 가이드 RNA.
24. 조항 1-21 중 어느 하나에 있어서, 단일 가이드 RNA는 3' 말단에 서열 5'-ususuNNN-3'을 포함하며, 여기서 N은 독립적으로 비변형된 리보뉴클레오티드를 나타내고, 각각의 u는 2'-O-메틸우리딘을 나타내고 각 s는 포스포로티오에이트 결합을 나타내는 것인 단일 가이드 RNA.
25. 조항 24에 있어서, 각각의 N은 우리딘인 단일 가이드 RNA.
26, 조항 1-21 중 어느 하나에 있어서, 단일 가이드 RNA는 3' 말단에 서열 5'-ususuNNn-3'을 포함하며, 여기서 각각의 N은 독립적으로 비변형된 리보뉴클레오티드를 나타내고, n은 변형된 뉴클레오티드를 나타내고, 각각의 u는 2'-O-메틸우리딘을 나타내고, 각각의 s는 포스포로티오에이트 결합을 나타내는 것인 단일 가이드 RNA.
27, 조항 26에 있어서, 각각의 N은 우리딘이고 n은 2'-O-메틸우리딘인 단일 가이드 RNA.
28. (i) 스페이서 서열 및 (ii) tracr 서열을 포함하는 단일 가이드 RNA로서, 스페이서 서열은 표적 폴리뉴클레오티드 서열과 접촉될 때 PCSK9 유전자 또는 ANGPTL3 유전자 내 표적 폴리뉴클레오티드 서열과 혼성화하고, tracr 서열은 II형 Cas 단백질과 접촉될 때 II형 Cas 단백질에 결합하고, 단일 가이드 RNA는 네불라린, 데옥시네불라린 또는 2'-O-메틸네불라린을 포함하는 단일 가이드 RNA.
29. (i) 스페이서 서열 및 (ii) tracr 서열을 포함하는 단일 가이드 RNA로서, 스페이서 서열은 표적 폴리뉴클레오티드 서열과 접촉될 때 PCSK9 유전자 또는 ANGPTL3 유전자 내 표적 폴리뉴클레오티드 서열과 혼성화하고, tracr 서열은 II형 Cas 단백질과 접촉될 때 II형 Cas 단백질에 결합하고, 단일 가이드 RNA는 5' 말단 또는 3' 말단에 2개 이하의 포스포로티오에이트 결합을 포함하는 단일 가이드 RNA.
30. 조항 29에 있어서, 단일 가이드 RNA는 5' 말단 및 3' 말단에 2개 이하의 포스포로티오에이트 결합을 포함하는 단일 가이드 RNA.
31. 조항 29에 있어서, 단일 가이드 RNA는 5' 말단에 3개의 포스포로티오에이트 결합을 포함 하는 단일 가이드 RNA.
32. 조항 29에 있어서, 단일 가이드 RNA는 3' 말단에 3개의 포스포로티오에이트 결합을 포함하는 단일 가이드 RNA.
33. 조항 29에 있어서, 5' 말단에 있는 2개의 포스포로티오에이트 결합은 5' 말단의 처음 2개의 뉴클레오티드 위치에 있는 2개의 연속적인 포스포로티오에이트 결합인 단일 가이드 RNA.
34. 조항 29에 있어서, 5' 말단에 있는 2개의 포스포로티오에이트 결합은 5' 말단의 처음 3-10개 뉴클레오티드 내에 있는 것인 단일 가이드 RNA.
35. 조항 29에 있어서, 3' 말단에 있는 2개의 포스포로티오에이트 결합은 3' 말단의 마지막 2개의 뉴클레오티드 위치에 있는 2개의 연속적인 포스포로티오에이트 결합인 단일 가이드 RNA.
36. 조항 29에 있어서, 3' 말단에 있는 2개의 포스포로티오에이트 결합은 3' 말단의 마지막 3-10개 뉴클레오티드 내에 있는 것인 단일 가이드 RNA.
37. 조항 29에 있어서, 3' 말단에 서열 5'-UsUsUs-3'를 포함하고, 여기서 U는 우리딘을 나타내고 s는 포스포로티오에이트 결합을 나타내는 것인 단일 가이드 RNA.
38. 조항 29에 있어서, 3' 말단에 서열 5'-UUU-3'을 포함하는 단일 가이드 RNA.
39. 조항 1-27 중 어느 하나에서, tracr 서열은 비변형된 단일 가이드 RNA의 tracr 서열과 비교하여 증가된 결합 친화성으로 II형 Cas 단백질에 결합하는 것인 단일 가이드 RNA.
40. 조항 28-38에 있어서, II형 Cas 단백질은 Cas9 단백질인 단일 가이드 RNA.
41. 조항 40에 있어서, Cas9 단백질은 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9인 단일 가이드 RNA.
42. 표 1로부터 선택된 가이드 RNA 서열을 포함하는 단일 가이드 RNA로서, a, u, g, 및 c는 2'-OMe 변형된 아데닌, 우리딘, 구아닌, 및 시티딘을 나타내고, s는 포스포로티오에이트 결합을 나타내고, X는 네불라린을 나타내고, x는 2'-O-메틸네불라린을 나타내고, dX는 2'-데옥시네불라린을 나타내는 것인 단일 가이드 RNA.
43. 조항 1-42 중 어느 하나의 단일 가이드 RNA 및 II형 Cas 단백질 또는 II형 Cas 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 유전자 변형을 위한 약학 조성물.
44. 조항 43에 있어서, II형 Cas 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터를 추가로 포함하는 약학 조성물.
45. 조항 43 또는 조항 44에 있어서, II형 Cas 단백질은 Cas9인 약학 조성물.
46. 조항 43-45 중 어느 하나에 있어서, 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함하는 약학 조성물.
47. 조항 43-46 중 어느 하나의 약학 조성물을 포함하는 지질 나노입자.
48. 조항 43-46 중 어느 하나의 약학 조성물을 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는 세포에서 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 변형시키는 방법으로서, 단일 가이드 RNA는 II형 Cas 단백질이 세포에서 표적 폴리뉴클레오티드 서열 내 변형을 수행하도록 지시하는 것인 방법.
49. 조항 48에 있어서, 표적 폴리뉴클레오티드 서열은 PCSK9 유전자에 있는 것인 방법.
50. 조항 49에 있어서, 변형은 세포에서 PCSK9 유전자에 의해 코딩되는 기능적 PCSK9 단백질의 발현을 감소시키는 것인 방법.
51. 조항 50에 있어서, 표적 폴리뉴클레오티드 서열은 ANGPTL3 유전자에 있는 것인 방법.
52. 조항 51에 있어서, 변형은 세포에서 ANGPTL3 유전자에 의해 코딩되는 기능적 ANGPTL3 단백질의 발현을 감소시키는 것인 방법.
53. 조항 48-52 중 어느 하나에 있어서, 도입은 조성물을 포함하는 지질 나노입자를 통해 수행되는 것인 방법.
54. 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법으로서, 조항 43-46 중 어느 하나의 약학 조성물 또는 조항 47의 지질 나노입자를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 단일 가이드 RNA는 II형 Cas 단백질이 대상체의 세포에서 표적 폴리뉴클레오티드 서열 내 변형을 수행하도록 지시하여 병태를 치료 또는 예방하는 것인 방법.
55. 조항 54에 있어서, 표적 폴리뉴클레오티드 서열은 PCSK9 유전자에 있는 것인 방법.
56. 조항 54에 있어서, 표적 폴리뉴클레오티드 서열은 ANGPTL3 유전자에 있는 것인 방법.
57. 조항 55에 있어서, 변형은 대상체에서 PCSK9 유전자에 의해 코딩되는 기능적 PCSK9 단백질의 발현을 감소시키는 것인 방법.
58. 조항 56에 있어서, 변형은 대상체에서 ANGPTL3 유전자에 의해 코딩되는 기능적 ANGPTL3 단백질의 발현을 감소시키는 것인 방법.
59. 조항 48-58 중 어느 하나에 있어서, 병태는 죽상동맥경화성 혈관 질환인 방법.
60. 조항 48-58 중 어느 하나에 있어서, 병태는 죽상동맥경화성 혈관 질환, 고트리글리세리드혈증, 또는 당뇨병인 방법.
61. 조항 48-60 중 어느 하나에 있어서, 대상체는 투여 전과 비교하여 감소된 혈중 LDL 콜레스테롤 수준 및/또는 감소된 혈중 트리글리세리드 수준을 나타내는 것인 방법.
다음은 열거된 조항의 세 번째 예이다:
(i) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 mRNA,
(ii) 염기 에디터 융합 단백질에 대한 결합 스캐폴드로서 역할을 하는 tracr 서열, 및 ANGPTL3 유전자 상의 프로토스페이서에 상응하는 스페이서 서열을 포함하는 가이드 RNA
를 포함하는 유전자 표적을 편집하기 위한 조성물로서,
가이드 RNA는 포유동물 대상체에게 투여될 때 염기 에디터 융합 단백질이 생체 내에서 ANGPTL3 유전자 내 핵염기 변경을 수행하도록 지시하며,
가이드 RNA 및 mRNA가 적어도 0.5 mg/kg의 총량으로 투여될 때, 차세대 시퀀싱 또는 생어 시퀀싱에 의해 측정되는 경우 포유동물 대상체에서 전체 간 세포의 적어도 35%에서 염기 변경이 발생하는 것인 조성물.
2. 조항 1에 있어서, 포유동물 대상체는 시노몰구스 원숭이이며,
가이드 RNA 및 mRNA가 약 1 mg/kg의 총량으로 투여될 때, 차세대 시퀀싱 또는 생어 시퀀싱에 의해 측정되는 경우 시노몰구스 원숭이에서 전체 간 세포의 적어도 35%에서 염기 변경이 발생하는 것인 조성물.
3. 조항 1에 있어서, 포유동물 대상체는 시노몰구스 원숭이이며,
가이드 RNA 및 mRNA가 약 3 mg/kg의 총량으로 투여될 때, 차세대 시퀀싱 또는 생어 시퀀싱에 의해 측정되는 경우 시노몰구스 원숭이에서 전체 간 세포의 적어도 50%에서 염기 변경이 발생하는 것인 조성물.
4. 조항 2에 있어서, 핵염기 변경은 투여 전과 비교하여 시노몰구스 원숭이의 혈중 트리글리세리드 수준에서 적어도 20%의 감소를 초래하는 것인 조성물.
5. 조항 3에 있어서, 핵염기 변경은 투여 전과 비교하여 시노몰구스 원숭이의 혈중 트리글리세리드 수준에서 적어도 50%의 감소를 초래하는 것인 조성물.
6. 조항 1-5 중 어느 하나에 있어서, 프로토스페이서는 스플라이스 부위에 위치하는 것인 조성물.
7. 조항 1-5 중 어느 하나에 있어서, 프로토스페이서 상보적 서열은 ANGPTL3 유전자의 안티센스 가닥에 있는 것인 조성물.
8. 조항 1-5 중 어느 하나에 있어서, 프로토스페이서 상보적 서열은 ANGPTL3 유전자의 센스 가닥에 있는 것인 조성물.
9. 조항 1-8 중 어느 하나에 있어서, 염기 변경은 ANGPTL3 유전자 상의 프로토스페이서 외부(오프 타겟 부위)에서 일어나며, 표 14에 제시된 오프 타겟 부위의 편집 백분율은 각각 표 14에 제시된 편집 백분율 이하인 조성물.
10. 조항 1-9 중 어느 하나에 있어서, 데아미나아제는 아데닌 데아미나아제이며 핵염기 변경은 A·T에서 G·C로의 변경인 조성물.
11. 조항 1-10 중 어느 하나에 있어서, 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인은 뉴클레아제 불활성 Cas9 또는 Cas9 닉카아제를 포함하는 것인 조성물.
12. 조항 1-11 중 어느 하나에 있어서, 핵염기 변경은 ANGPTL3 유전자의 스플라이스 부위에 있는 것인 조성물.
13. 조항 12에 있어서, 핵염기 변경은 ANGPTL3 유전자의 스플라이스 도너 부위에 있는 것인 조성물.
14. 조항 13에 있어서, 스플라이스 도너 부위는 서열 번호 7에 참조된 바와 같이 ANGPTL3 인트론 6의 5' 말단에 있는 것인 조성물.
15. 조항 12에 있어서, 핵염기 변경은 ANGPTL3 유전자의 스플라이스 억셉터 부위에 있는 것인 조성물.
16. 조항 1-15 중 어느 하나에 있어서, 핵염기 변경은 ANGPTL3 유전자에 의해 코딩되는 전사물에서 프레임 이동, 조기 정지 코돈, 삽입 또는 결실을 초래하는 것인 조성물.
17. 조항 1-16 중 어느 하나에 있어서, 핵염기 변경은 ANGPTL3 유전자에 의해 코딩되는 비정상 전사물을 생성하는 것인 조성물.
18. 조항 1-17 중 어느 하나에 있어서, 가이드 RNA는 화학적으로 변형된 것인 조성물.
19. 조항 16에 있어서, 가이드 RNA의 tracr 서열은 [도 7]에 도시된 도식에 따라 화학적으로 변형된 것인 조성물.
20. 조항 1-19 중 어느 하나에 있어서, 스페이서 서열은 표 1에 제시된 ANGPTL3 ABE 가이드 RNA 스페이서 서열을 포함하는 것인 조성물.
21. 조항 20에 있어서, 가이드 RNA는 표 1에 제시된 GA067, GA091, GA098, GA099, GA100, GA101, GA102, GA103, GA347, GA441, GA442, GA472, GA473, GA474, GA475, GA476, GA517 또는 GA547의 ANGPTL3 ABE 가이드 RNA 서열을 포함하는 것인 조성물.
22. 조항 1-19 중 어느 하나에 있어서, 프로토스페이서 서열은 표 1에 제시된 ANGPTL3 ABE 프로토스페이서 서열을 포함하는 것인 조성물.
23. 조항 22에 있어서, 프로토스페이서는 서열 5' AAGATACCTGAATAACTCTC-3' (서열 번호 14), 5'-AAGATACCTGAATAACCCTC-3' (서열 번호 15), 5'- GATACCTGAATAACTCTC-3' (서열 번호 1606), 5'- AGATACCTGAATAACCCTC-3' (서열 번호 248), 또는 5'- GATACCTGAATAACCCTC-3' (서열 번호 249)
를 포함하는 것인 조성물.
24. 조항 1-23 중 어느 하나에 있어서, 염기 에디터 융합 단백질은 서열 번호 2137의 아미노산 서열을 포함하는 것인 조성물.
25. 조항 1-24 중 어느 하나에 있어서, mRNA 서열의 GC% 함량은 56% 초과인 조성물.
26. 조항 25에 있어서, mRNA 서열의 GC% 함량은 56% 초과인 조성물.
27. 조항 26에 있어서, mRNA 서열의 GC% 함량은 63% 이상인 조성물.
28. 조항 25에 있어서, mRNA는 아데닌 tTNA 데아미나아제(TadA) 영역, Cas9 영역 및 핵 국소화 서열(NLS) 영역을 포함하는 것인 조성물.
29. 조항 28에 있어서, mRNA는 TadA 영역과 Cas9 영역을 연결하는 제1 링커 영역, 및 Cas9 영역과 NLS 영역을 연결하는 제2 링커 영역을 추가로 포함하는 것인 조성물.
30. 조항 28 또는 29에 있어서, TadA 영역의 GC% 함량은 60% 초과인 조성물.
31. 조항 28 또는 29에 있어서, TadA 영역의 GC% 함량은 70% 이상인 조성물.
32. 조항 28 또는 29에 있어서, Cas9 영역의 GC% 함량은 56% 초과인 조성물.
33. 조항 28 또는 29에 있어서, Cas9 영역의 GC% 함량은 62% 이상인 조성물.
34, 조항 28 또는 29에 있어서, NLS 영역의 GC% 함량은 54% 초과인 조성물.
35. 조항 28 또는 29에 있어서, NLS 영역의 GC% 함량은 63% 이상인 조성물.
36. 조항 29에 있어서, 제1 링커 영역의 GC% 함량은 65% 초과인 조성물.
37. 조항 29에 있어서, 제1 링커 영역의 GC% 함량은 79% 이상인 조성물.
38. 조항 29에 있어서, 제2 링커 영역의 GC% 함량은 67% 초과인 조성물.
39. 조항 29에 있어서, 제2 링커 영역의 GC% 함량은 83% 이상인 조성물.
40. 조항 29에 있어서, TadA 영역의 GC% 함량은 60% 초과이며, Cas9 영역의 GC% 함량은 56% 초과이며, NLS 영역의 GC% 함량은 54% 초과이며, 제1 링커 영역의 GC% 함량은 65% 초과이며, 제2 링커 영역의 GC% 함량은 67% 초과인 조성물.
41. 조항 25에 있어서, mRNA는 표 23으로부터 선택된 mRNA 서열을 포함하는 것인 조성물.
42. 조항 41에 있어서, mRNA는 서열 번호 2136의 mRNA 서열을 포함하는 것인 조성물.
43. 조항 25-42 중 어느 하나에 있어서, mRNA는 폴리 A 꼬리를 포함하는 것인 조성물.
44. 조항 1-43 중 어느 하나에 있어서, (i)를 둘러싸는 지질 나노입자(LNP)를 추가로 포함하는 조성물.
45. 조항 44에 있어서, LNP는 (ii)를 추가로 둘러싸는 것인 조성물.
46. 조항 44에 있어서, (ii)를 둘러싸는 제2 LNP를 추가로 포함하는 조성물.
47. 조항 1-44 중 어느 하나에 있어서, 가이드 RNA와 염기 에디터 융합 단백질을 코딩하는 mRNA의 비는 중량 기준으로 약 1:10 내지 약 10:1인 조성물.
48. 조항 47에 있어서, 가이드 RNA와 염기 에디터 융합 단백질을 코딩하는 mRNA의 비는 중량 기준으로 약 1:1, 1.5:1, 2:1, 3:1, 4:1, 1:1.5, 1:2, 1:3, 또는 1:4인 조성물.
49. 조항 48에 있어서, 가이드 RNA와 염기 에디터 융합 단백질을 코딩하는 mRNA의 비는 중량 기준으로 약 1:1인 조성물.
50. 조항 1-49 중 어느 하나의 조성물 및 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 약학 조성물.
51. 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법으로서, 조항 1의 조성물의 치료 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
52. 조항 51에 있어서, 투여는 정맥 내 주입을 통해 이루어지는 것인 방법.
53. 조항 51 또는 52에 있어서, (i)를 둘러싸는 LNP 및 (ii)를 둘러싸는 LNP의 순차적 투여를 포함하는 방법.
54. 조항 51 또는 52에 있어서, (i)를 둘러싸는 LNP 및 (ii)를 둘러싸는 LNP의 동시 투여를 포함하는 방법.
55. 조항 53에 있어서, (ii)를 둘러싸는 LNP의 단일 용량의 투여 이후에, 1일의 간격으로 (i)를 둘러싸는 LNP의 시간차 용량을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
56. 조항 53에 있어서, (ii)를 둘러싸는 LNP의 단일 용량의 투여 이후에, 2일의 간격으로 (i)를 둘러싸는 LNP의 시간차 용량을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
57. 조항 53에 있어서, (ii)를 둘러싸는 LNP의 단일 용량의 투여 이후에, 3일의 간격으로 (i)를 둘러싸는 LNP의 시간차 용량을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
58. 조항 53에 있어서, (ii)를 둘러싸는 LNP의 단일 용량의 투여 이후에, 4일의 간격으로 (i)를 둘러싸는 LNP의 시간차 용량을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
59. 조항 53에 있어서, (ii)를 둘러싸는 LNP의 단일 용량의 투여 이후에, 5일의 간격으로 (i)를 둘러싸는 LNP의 시간차 용량을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
60. 조항 53에 있어서, (ii)를 둘러싸는 LNP의 단일 용량의 투여 이후에, 6일의 간격으로 (i)를 둘러싸는 LNP의 시간차 용량을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
61. 조항 53에 있어서, (ii)를 둘러싸는 LNP의 단일 용량의 투여 이후에, 7일의 간격으로 (i)를 둘러싸는 LNP의 시간차 용량을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
62. 조항 51 또는 52에 있어서, (i) 및 (ii)를 둘러싸는 LNP의 단일 용량을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
63. 조항 62에 있어서, LNP의 단일 용량은 약 0.3 내지 약 3mg/kg인 방법.
64. 조항 62 또는 63에 있어서, 대상체에게 하나 이상의 치료의 치료 과정을 시행하는 단계를 포함하고, 하나 이상의 치료 각각은 LNP의 단일 용량의 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
65. 조항 64에 있어서, 2 내지 10회 치료의 치료 과정을 시행하는 단계를 포함하는 방법.
66. 조항 64에 있어서, 2 내지 5회 치료의 치료 과정을 시행하는 단계를 포함하는 방법.
67. 조항 64에 있어서, 2회 치료의 치료 과정을 시행하는 단계를 포함하는 방법.
68. 조항 64에 있어서, 3회 치료의 치료 과정을 시행하는 단계를 포함하는 방법.
69. 조항 64에 있어서, 4회 치료의 치료 과정을 시행하는 단계를 포함하는 방법.
70. 조항 62에 있어서, 5회 치료의 치료 과정을 시행하는 단계를 포함하는 방법.
71. 조항 51-70 중 어느 하나에 있어서, 병태는 죽상동맥경화성 심혈관 질환인 방법.
72. 조항 51-70 중 어느 하나에 있어서, 병태는 죽상동맥경화성 혈관 질환인 방법.
73, 조항 51-72 중 어느 하나에 있어서, 대상체는 인간인 방법.
74. (i) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 mRNA,
(ii) 염기 에디터 융합 단백질에 대한 결합 스캐폴드로서 역할을 하는 tracr 서열, 및 ANGPTL3 유전자 상의 프로토스페이서에 상응하는 스페이서 서열을 포함하는 가이드 RNA
를 포함하는 유전자 표적을 편집하기 위한 조성물로서,
가이드 RNA는 포유동물 대상체에게 투여될 때 염기 에디터 융합 단백질이 생체 내에서 ANGPTL3 유전자 내 핵염기 변경을 수행하도록 지시하며,
가이드 RNA는 표 1에 제시된 바와 같은 ANGPTL3 ABE 가이드 RNA 서열을 포함하는 것인 조성물.
75. (i) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 mRNA,
(ii) 염기 에디터 융합 단백질에 대한 결합 스캐폴드로서 역할을 하는 tracr 서열, 및 ANGPTL3 유전자 상의 프로토스페이서에 상응하는 스페이서 서열을 포함하는 가이드 RNA
를 포함하는 유전자 표적을 편집하기 위한 조성물로서,
가이드 RNA는 포유동물 대상체에게 투여될 때 염기 에디터 융합 단백질이 생체 내에서 ANGPTL3 유전자 내 핵염기 변경을 수행하도록 지시하며,
mRNA는 표 23으로부터 선택된 서열을 포함하는 것인 조성물.
76. 죽상동맥경화성 심혈관 질환의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법으로서,
(i) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 mRNA,
(ii) 염기 에디터 융합 단백질에 대한 결합 스캐폴드로서 역할을 하는 tracr 서열, 및 PCSK9 유전자 상의 프로토스페이서에 상응하는 스페이서 서열을 포함하는 가이드 RNA를 포함하는 제1 조성물로서,
가이드 RNA는 포유동물 대상체에게 투여될 때 염기 에디터 융합 단백질이 생체 내에서 PCSK9 유전자 내 핵염기 변경을 수행하도록 지시하며, 가이드 RNA 및 mRNA가 적어도 0.5 mg/kg의 총량으로 투여될 때, 차세대 시퀀싱 또는 생어 시퀀싱에 의해 측정되는 경우 포유동물 대상체에서 전체 간 세포의 적어도 35%에서 염기 변경이 발생하는 것인 제1 조성물; 및
(i) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 mRNA,
(ii) 염기 에디터 융합 단백질에 대한 결합 스캐폴드로서 역할을 하는 tracr 서열, 및 ANGPTL3 유전자 상의 프로토스페이서에 상응하는 스페이서 서열을 포함하는 가이드 RNA를 포함하는 제2 조성물로서,
가이드 RNA는 포유동물 대상체에게 투여될 때 염기 에디터 융합 단백질이 생체 내에서 ANGPTL3 유전자 내 핵염기 변경을 수행하도록 지시하며, 가이드 RNA 및 mRNA가 적어도 1 mg/kg의 총량으로 투여될 때, 차세대 시퀀싱 또는 생어 시퀀싱에 의해 측정되는 경우 포유동물 대상체에서 전체 간 세포의 적어도 35%에서 염기 변경이 발생하는 것인 제2 조성물
의 치료 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
77. 조항 76에 있어서, 제1 조성물 및 제2 조성물의 순차적 투여를 포함하는 방법.
78. 조항 77에 있어서, 1회 이상의 용량의 제1 조성물을 투여한 후 1회 이상의 용량의 제2 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
79. 조항 78에 있어서, 1회 이상의 용량의 제2 조성물을 투여한 후 1회 이상의 용량의 제1 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
80. 조항 76에 있어서, 제1 조성물 및 제2 조성물의 동시 투여를 포함하는 방법.
81. 조항 80에 있어서, 제1 조성물 및 제2 조성물의 1회 이상의 용량을 포함하는 방법.
82. (i) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 mRNA,
(ii) 염기 에디터 융합 단백질에 대한 결합 스캐폴드로서 역할을 하는 tracr 서열, 및 ANGPTL3 유전자 상의 프로토스페이서에 상응하는 스페이서 서열을 포함하는 가이드 RNA
를 포함하는 유전자 표적을 편집하기 위한 조성물로서,
가이드 RNA는 염기 에디터 융합 단백질이 시험관 내에서 ANGPTL3 유전자 내 핵염기 변경을 수행하도록 지시하며,
가이드 RNA 및 mRNA가 적어도 0.5 mg/kg의 총량으로 투여될 때, 차세대 시퀀싱 또는 생어 시퀀싱에 의해 측정되는 경우 포유동물 대상체에서 전체 간 세포의 적어도 35%에서 염기 변경이 발생하는 것인 조성물.
83. 조항 82에 있어서, 가이드 RNA 및 mRNA가 적어도 1 mg/kg의 총량으로 투여될 때, 차세대 시퀀싱 또는 생어 시퀀싱에 의해 측정되는 경우 포유동물 대상체에서 전체 간 세포의 적어도 40%에서 염기 변경이 발생하는 것인 조성물.
84. 조항 82에 있어서, 가이드 RNA 및 mRNA가 적어도 1.5 mg/kg의 총량으로 투여될 때, 차세대 시퀀싱 또는 생어 시퀀싱에 의해 측정되는 경우 포유동물 대상체에서 전체 간 세포의 적어도 45%에서 염기 변경이 발생하는 것인 조성물.
85. 조항 82에 있어서, 가이드 RNA 및 mRNA가 적어도 2 mg/kg의 총량으로 투여될 때, 차세대 시퀀싱 또는 생어 시퀀싱에 의해 측정되는 경우 포유동물 대상체에서 전체 간 세포의 적어도 50%에서 염기 변경이 발생하는 것인 조성물.
86. 조항 82에 있어서, 가이드 RNA 및 mRNA가 적어도 2.5 mg/kg의 총량으로 투여될 때, 차세대 시퀀싱 또는 생어 시퀀싱에 의해 측정되는 경우 포유동물 대상체에서 전체 간 세포의 적어도 55%에서 염기 변경이 발생하는 것인 조성물.
87. 조항 82에 있어서, 가이드 RNA 및 mRNA가 적어도 3 mg/kg의 총량으로 투여될 때, 차세대 시퀀싱 또는 생어 시퀀싱에 의해 측정되는 경우 포유동물 대상체에서 전체 간 세포의 적어도 60%에서 염기 변경이 발생하는 것인 조성물.
88. (a) 편집 창을 갖는 아데닌 염기 에디터 단백질을 코딩하는 mRNA, 및
(b) 염기 에디터 단백질에 대한 결합 스캐폴드 역할을 하는 tracr 서열 및 염기 에디터 단백질을 ANGPTL3 유전자 상의 프로토스페이서 서열로 안내하는 역할을 하는 스페이서 서열을 포함하는 가이드 RNA
를 포함하는 ANGPTL3 유전자를 편집하기 위한 조성물로서,
스페이서 서열은 ANGPTL3 유전자의 스플라이스 부위 또는 엑손 영역에 적어도 부분적으로 상보적인 것인 조성물.
89. 조항 83에 있어서, 염기 에디터 단백질이 가이드 RNA에 작동적으로 결합되고 가이드 RNA가 ANGPTL3 유전자 상의 프로토스페이서 서열에 상보적인 가닥과 혼성화되는 경우, 편집 창은 ANGPTL3 유전자의 스플라이스 부위를 포함하는 것인 ANGPTL3 유전자를 편집하기 위한 조성물.
90. 조항 88에 있어서, 염기 에디터 단백질이 가이드 RNA에 작동적으로 결합되고 가이드 RNA가 ANGPTL3 유전자 상의 프로토스페이서 서열에 상보적인 가닥과 혼성화되는 경우, 편집 창은 ANGPTL3 유전자의 인트론의 영역을 포함하는 것인 ANGPTL3 유전자를 편집하기 위한 조성물.
91. 조항 88에 있어서, 염기 에디터 단백질이 가이드 RNA에 작동적으로 결합되고 가이드 RNA가 ANGPTL3 유전자 상의 프로토스페이서 서열에 상보적인 가닥과 혼성화되는 경우, 편집 창은 ANGPTL3 유전자의 인트론 1, 인트론 3 또는 인트론 4의 영역을 포함하는 것인 ANGPTL3 유전자를 편집하기 위한 조성물.
92. 조항 88에 있어서, 염기 에디터 단백질이 가이드 RNA에 작동적으로 결합되고 가이드 RNA가 ANGPTL3 유전자 상의 프로토스페이서 서열에 상보적인 가닥과 혼성화되는 경우, 편집 창은 ANGPTL3 유전자의 인트론 1의 영역을 포함하는 것인 ANGPTL3 유전자를 편집하기 위한 조성물.
93. 조항 88에 있어서, 스페이서 서열은 GA067, GA100 및 GA574로 식별된 가이드 RNA 서열의 군으로부터 선택된 스페이서 서열에 대해 80-100% 뉴클레오티드 서열 동일성을 갖는 것인 ANGPTL3 유전자를 편집하기 위한 조성물.
94. 조항 88에 있어서, tracr 서열은 GA067, GA091, GA098, GA099, GA100, GA101, GA102, GA103, GA347, GA441, GA442, GA472, GA473, GA474, GA475, GA476, GA517 및 GA547로 식별된 가이드 RNA 서열의 군으로부터 선택된 tracr 서열에 대해 80-100% 뉴클레오티드 서열 동일성을 갖는 것인 ANGPTL3 유전자를 편집하기 위한 조성물.
95. 조항 88에 있어서, mRNA는 MA002, MA004, MA040, MA0041, 또는 MA045로 식별된 mRNA 서열에 대해 80-100% 서열 동일성을 갖는 것인 ANGPTL3 유전자를 편집하기 위한 조성물.
96. 조항 88에 있어서, mRNA는 하기 표에 제시된 GC 뉴클레오티드 영역 백분율 중 하나 이상을 갖는 것인 ANGPTL3 유전자를 편집하기 위한 조성물:
Figure pct00379
97. mRNA는 하기 표에 제시된 GC 뉴클레오티드 영역 백분율 중 하나 이상을 갖는 것인 ANGPTL3 유전자를 편집하기 위한 조성물:
Figure pct00380
98. 조항 88에 있어서, mRNA 및 gRNA는 지질 나노입자 내에 캡슐화된 것인 ANGPTL3 유전자를 편집하기 위한 조성물.
99. 조항 88에 있어서, mRNA 및 gRNA는 하기를 갖는 지질 나노입자 내에 캡슐화된 것인 ANGPTL3 유전자를 편집하기 위한 조성물:
LNP 조성(몰%):
40-65% iLipid
2-20% DSPC
1-5% PEG
나머지 몰% 밸런스는 콜레스테롤;
LNP 입자 크기: 55-120 nm Z 평균 유체역학적 직경; 및
동적 광산란에 의해 결정된 <0.2의 다분산 지수.
100. 조항 88에 있어서, mRNA 및 gRNA는 50-70 nm Z 평균 유체역학적 직경의 LNP 입자 크기를 갖는 지질 나노입자 내에 캡슐화된 것인 ANGPTL3 유전자를 편집하기 위한 조성물.
101. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 0.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 40% 초과의 평균 편집 백분율로 시노몰구스 원숭이의 간의 ANGPTL3 표적 스플라이스 부위에서 아데닌 염기 편집을 유도할 수 있는 ANGPTL3 유전자를 편집하기 위한 조성물.
102. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 0.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 50% 초과의 평균 편집 백분율로 시노몰구스 원숭이의 간의 ANGPTL3 표적 스플라이스 부위에서 아데닌 염기 편집을 유도할 수 있는 ANGPTL3 유전자를 편집하기 위한 조성물.
103. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 0.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 30% 초과의 평균 편집 백분율로 시노몰구스 원숭이의 간의 ANGPTL3 표적 스플라이스 부위에서 아데닌 염기 편집을 유도할 수 있는 ANGPTL3 유전자를 편집하기 위한 조성물.
104. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 40% 초과의 평균 편집 백분율로 시노몰구스 원숭이의 간의 ANGPTL3 표적 스플라이스 부위에서 아데닌 염기 편집을 유도할 수 있는 ANGPTL3 유전자를 편집하기 위한 조성물.
105. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 50% 초과의 평균 편집 백분율로 시노몰구스 원숭이의 간의 ANGPTL3 표적 스플라이스 부위에서 아데닌 염기 편집을 유도할 수 있는 ANGPTL3 유전자를 편집하기 위한 조성물.
106. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 60% 초과의 평균 편집 백분율로 시노몰구스 원숭이의 간의 ANGPTL3 표적 스플라이스 부위에서 아데닌 염기 편집을 유도할 수 있는 ANGPTL3 유전자를 편집하기 위한 조성물.
107. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 70% 초과의 평균 편집 백분율로 시노몰구스 원숭이의 간의 ANGPTL3 표적 스플라이스 부위에서 아데닌 염기 편집을 유도할 수 있는 ANGPTL3 유전자를 편집하기 위한 조성물.
108. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 40% 초과의 평균 편집 백분율로 시노몰구스 원숭이의 간의 ANGPTL3 표적 스플라이스 부위에서 아데닌 염기 편집을 유도할 수 있는 ANGPTL3 유전자를 편집하기 위한 조성물.
109. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 50% 초과의 평균 편집 백분율로 시노몰구스 원숭이의 간의 ANGPTL3 표적 스플라이스 부위에서 아데닌 염기 편집을 유도할 수 있는 ANGPTL3 유전자를 편집하기 위한 조성물.
110. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 60% 초과의 평균 편집 백분율로 시노몰구스 원숭이의 간의 ANGPTL3 표적 스플라이스 부위에서 아데닌 염기 편집을 유도할 수 있는 ANGPTL3 유전자를 편집하기 위한 조성물.
111. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 70% 초과의 평균 편집 백분율로 시노몰구스 원숭이의 간의 ANGPTL3 표적 스플라이스 부위에서 아데닌 염기 편집을 유도할 수 있는 ANGPTL3 유전자를 편집하기 위한 조성물.
112. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 80% 초과의 평균 편집 백분율로 시노몰구스 원숭이의 간의 ANGPTL3 표적 스플라이스 부위에서 아데닌 염기 편집을 유도할 수 있는 ANGPTL3 유전자를 편집하기 위한 조성물.
113. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 3 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 40% 초과의 평균 편집 백분율로 시노몰구스 원숭이의 간의 ANGPTL3 표적 스플라이스 부위에서 아데닌 염기 편집을 유도할 수 있는 ANGPTL3 유전자를 편집하기 위한 조성물.
114. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 3 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 50% 초과의 평균 편집 백분율로 시노몰구스 원숭이의 간의 ANGPTL3 표적 스플라이스 부위에서 아데닌 염기 편집을 유도할 수 있는 ANGPTL3 유전자를 편집하기 위한 조성물.
115. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 3 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 60% 초과의 평균 편집 백분율로 시노몰구스 원숭이의 간의 ANGPTL3 표적 스플라이스 부위에서 아데닌 염기 편집을 유도할 수 있는 ANGPTL3 유전자를 편집하기 위한 조성물.
116. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 3 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 70% 초과의 평균 편집 백분율로 시노몰구스 원숭이의 간의 ANGPTL3 표적 스플라이스 부위에서 아데닌 염기 편집을 유도할 수 있는 ANGPTL3 유전자를 편집하기 위한 조성물.
117. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 3 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 80% 초과의 평균 편집 백분율로 시노몰구스 원숭이의 간의 ANGPTL3 표적 스플라이스 부위에서 아데닌 염기 편집을 유도할 수 있는 ANGPTL3 유전자를 편집하기 위한 조성물.
118. 조항 87-117 중 어느 하나에 있어서, 퍼센트 편집율은 원숭이의 간 생검 또는 부검을 통해 투여된 시노몰구스 원숭이 간의 분석을 통해 투여 후 15일에 결정되는 것인 ANGPTL3 유전자를 편집하기 위한 조성물.
119. 조항 87-117 중 어느 하나에 있어서, 퍼센트 편집율은 투여 후 적어도 168일의 범위에 걸쳐 투여된 시노몰구스 원숭이의 주기적인 간 생검 테스트에 의해 지속적으로 유지되는 것으로 결정되는 것인 ANGPTL3 유전자를 편집하기 위한 조성물.
120. 조항 87-117 중 어느 하나에 있어서, 퍼센트 편집율은 투여 후 적어도 300일의 범위에 걸쳐 투여된 시노몰구스 원숭이의 주기적인 간 생검 테스트에 의해 지속적으로 유지되는 것으로 결정되는 것인 ANGPTL3 유전자를 편집하기 위한 조성물.
121. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 0.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 ANGPTL3 단백질을 기준선과 비교하여 평균 35% 이상 감소시킬 수 있는 ANGPTL3 유전자를 편집하기 위한 조성물.
122. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 0.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 ANGPTL3 단백질을 기준선과 비교하여 평균 40% 이상 감소시킬 수 있는 ANGPTL3 유전자를 편집하기 위한 조성물.
123. 조항 88에 있어서, 조성물은 원숭이 체중 1 kg당 대략 0.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 ANGPTL3 단백질을 기준선과 비교하여 평균 50% 이상 감소시킬 수 있는 ANGPTL3 유전자를 편집하기 위한 조성물.
124. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 0.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 원숭이의 혈장에서 ANGPTL3 단백질을 기준선과 비교하여 평균 60% 이상 감소시킬 수 있는 ANGPTL3 유전자를 편집하기 위한 조성물.
125. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 0.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 ANGPTL3 단백질을 기준선과 비교하여 평균 70% 이상 감소시킬 수 있는 ANGPTL3 유전자를 편집하기 위한 조성물.
126. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 0.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 ANGPTL3 단백질을 기준선과 비교하여 평균 80% 이상 감소시킬 수 있는 ANGPTL3 유전자를 편집하기 위한 조성물.
127. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 ANGPTL3 단백질을 기준선과 비교하여 평균 35% 이상 감소시킬 수 있는 ANGPTL3 유전자를 편집하기 위한 조성물.
128. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 ANGPTL3 단백질을 기준선과 비교하여 평균 40% 이상 감소시킬 수 있는 ANGPTL3 유전자를 편집하기 위한 조성물.
129. 조항 88에 있어서, 조성물은 원숭이 체중 1 kg당 대략 1 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 ANGPTL3 단백질을 기준선과 비교하여 평균 50% 이상 감소시킬 수 있는 ANGPTL3 유전자를 편집하기 위한 조성물.
130. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 ANGPTL3 단백질을 기준선과 비교하여 평균 60% 이상 감소시킬 수 있는 ANGPTL3 유전자를 편집하기 위한 조성물.
131. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 ANGPTL3 단백질을 기준선과 비교하여 평균 70% 이상 감소시킬 수 있는 ANGPTL3 유전자를 편집하기 위한 조성물.
132. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 ANGPTL3 단백질을 기준선과 비교하여 평균 80% 이상 감소시킬 수 있는 ANGPTL3 유전자를 편집하기 위한 조성물.
133. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 ANGPTL3 단백질을 기준선과 비교하여 평균 35% 이상 감소시킬 수 있는 ANGPTL3 유전자를 편집하기 위한 조성물.
134. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 ANGPTL3 단백질을 기준선과 비교하여 평균 40% 이상 감소시킬 수 있는 ANGPTL3 유전자를 편집하기 위한 조성물.
135. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 ANGPTL3 단백질을 기준선과 비교하여 평균 50% 이상 감소시킬 수 있는 ANGPTL3 유전자를 편집하기 위한 조성물.
136. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 ANGPTL3 단백질을 기준선과 비교하여 평균 60% 이상 감소시킬 수 있는 ANGPTL3 유전자를 편집하기 위한 조성물.
137. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 ANGPTL3 단백질을 기준선과 비교하여 평균 70% 이상 감소시킬 수 있는 ANGPTL3 유전자를 편집하기 위한 조성물.
138. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 ANGPTL3 단백질을 기준선과 비교하여 평균 80% 이상 감소시킬 수 있는 ANGPTL3 유전자를 편집하기 위한 조성물.
139. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 3 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 ANGPTL3 단백질을 기준선과 비교하여 평균 35% 이상 감소시킬 수 있는 ANGPTL3 유전자를 편집하기 위한 조성물.
140. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 3 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 ANGPTL3 단백질을 기준선과 비교하여 평균 40% 이상 감소시킬 수 있는 ANGPTL3 유전자를 편집하기 위한 조성물.
141. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 3 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 ANGPTL3 단백질을 기준선과 비교하여 평균 50% 이상 감소시킬 수 있는 ANGPTL3 유전자를 편집하기 위한 조성물.
142. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 3 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 ANGPTL3 단백질을 기준선과 비교하여 평균 60% 이상 감소시킬 수 있는 ANGPTL3 유전자를 편집하기 위한 조성물.
143. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 3 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 ANGPTL3 단백질을 기준선과 비교하여 평균 70% 이상 감소시킬 수 있는 ANGPTL3 유전자를 편집하기 위한 조성물.
144. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 3 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 ANGPTL3 단백질을 기준선과 비교하여 평균 80% 이상 감소시킬 수 있는 ANGPTL3 유전자를 편집하기 위한 조성물.
145. 조항 121-144 중 어느 하나에 있어서, 혈장 단백질의 감소는 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈액 샘플링 및 분석을 통해 투여 후 15일에 결정되는 것인 ANGPTL3 유전자를 편집하기 위한 조성물.
146. 조항 88에 있어서, 조성물은 원숭이 체중 1 kg당 대략 0.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 원숭이의 혈장에서 트리글리세리드 수준을 기준선과 비교하여 평균 20% 이상 감소시킬 수 있는 ANGPTL3 유전자를 편집하기 위한 조성물.
147. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 0.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 트리글리세리드 수준을 기준선과 비교하여 평균 25% 이상 감소시킬 수 있는 ANGPTL3 유전자를 편집하기 위한 조성물.
148. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 0.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 트리글리세리드 수준을 기준선과 비교하여 평균 30% 이상 감소시킬 수 있는 ANGPTL3 유전자를 편집하기 위한 조성물.
149. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 0.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 트리글리세리드 수준을 기준선과 비교하여 평균 35% 이상 감소시킬 수 있는 ANGPTL3 유전자를 편집하기 위한 조성물.
150. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 0.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 트리글리세리드 수준을 기준선과 비교하여 평균 40% 이상 감소시킬 수 있는 ANGPTL3 유전자를 편집하기 위한 조성물.
151. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 0.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 트리글리세리드 수준을 기준선과 비교하여 평균 45% 이상 감소시킬 수 있는 ANGPTL3 유전자를 편집하기 위한 조성물.
152. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 트리글리세리드 수준을 기준선과 비교하여 평균 20% 이상 감소시킬 수 있는 ANGPTL3 유전자를 편집하기 위한 조성물.
153. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 트리글리세리드 수준을 기준선과 비교하여 평균 25% 이상 감소시킬 수 있는 ANGPTL3 유전자를 편집하기 위한 조성물.
154. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 트리글리세리드 수준을 기준선과 비교하여 평균 30% 이상 감소시킬 수 있는 ANGPTL3 유전자를 편집하기 위한 조성물.
155. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 트리글리세리드 수준을 기준선과 비교하여 평균 35% 이상 감소시킬 수 있는 ANGPTL3 유전자를 편집하기 위한 조성물.
156. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 트리글리세리드 수준을 기준선과 비교하여 평균 40% 이상 감소시킬 수 있는 ANGPTL3 유전자를 편집하기 위한 조성물.
157. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 트리글리세리드 수준을 기준선과 비교하여 평균 45% 이상 감소시킬 수 있는 ANGPTL3 유전자를 편집하기 위한 조성물.
158. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 트리글리세리드 수준을 기준선과 비교하여 평균 50% 이상 감소시킬 수 있는 ANGPTL3 유전자를 편집하기 위한 조성물.
159. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 트리글리세리드 수준을 기준선과 비교하여 평균 55% 이상 감소시킬 수 있는 ANGPTL3 유전자를 편집하기 위한 조성물.
160. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 트리글리세리드 수준을 기준선과 비교하여 평균 60% 이상 감소시킬 수 있는 ANGPTL3 유전자를 편집하기 위한 조성물.
161. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 트리글리세리드 수준을 기준선과 비교하여 평균 20% 이상 감소시킬 수 있는 ANGPTL3 유전자를 편집하기 위한 조성물.
162. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 트리글리세리드 수준을 기준선과 비교하여 평균 25% 이상 감소시킬 수 있는 ANGPTL3 유전자를 편집하기 위한 조성물.
163. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 트리글리세리드 수준을 기준선과 비교하여 평균 30% 이상 감소시킬 수 있는 ANGPTL3 유전자를 편집하기 위한 조성물.
164. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 트리글리세리드 수준을 기준선과 비교하여 평균 35% 이상 감소시킬 수 있는 ANGPTL3 유전자를 편집하기 위한 조성물.
165. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 트리글리세리드 수준을 기준선과 비교하여 평균 40% 이상 감소시킬 수 있는 ANGPTL3 유전자를 편집하기 위한 조성물.
166. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 트리글리세리드 수준을 기준선과 비교하여 평균 45% 이상 감소시킬 수 있는 ANGPTL3 유전자를 편집하기 위한 조성물.
167. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 트리글리세리드 수준을 기준선과 비교하여 평균 50% 이상 감소시킬 수 있는 ANGPTL3 유전자를 편집하기 위한 조성물.
168. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 트리글리세리드 수준을 기준선과 비교하여 평균 55% 이상 감소시킬 수 있는 ANGPTL3 유전자를 편집하기 위한 조성물.
169. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 트리글리세리드 수준을 기준선과 비교하여 평균 60% 이상 감소시킬 수 있는 ANGPTL3 유전자를 편집하기 위한 조성물.
170. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 트리글리세리드 수준을 기준선과 비교하여 평균 65% 이상 감소시킬 수 있는 ANGPTL3 유전자를 편집하기 위한 조성물.
171. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 3 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 트리글리세리드 수준을 기준선과 비교하여 평균 20% 이상 감소시킬 수 있는 ANGPTL3 유전자를 편집하기 위한 조성물.
172. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 3 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 트리글리세리드 수준을 기준선과 비교하여 평균 25% 이상 감소시킬 수 있는 ANGPTL3 유전자를 편집하기 위한 조성물.
173. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 3 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 트리글리세리드 수준을 기준선과 비교하여 평균 30% 이상 감소시킬 수 있는 ANGPTL3 유전자를 편집하기 위한 조성물.
174. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 3 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 트리글리세리드 수준을 기준선과 비교하여 평균 35% 이상 감소시킬 수 있는 ANGPTL3 유전자를 편집하기 위한 조성물.
175. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 3 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 트리글리세리드 수준을 기준선과 비교하여 평균 40% 이상 감소시킬 수 있는 ANGPTL3 유전자를 편집하기 위한 조성물.
176. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 3 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 트리글리세리드 수준을 기준선과 비교하여 평균 45% 이상 감소시킬 수 있는 ANGPTL3 유전자를 편집하기 위한 조성물.
177. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 3 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 트리글리세리드 수준을 기준선과 비교하여 평균 50% 이상 감소시킬 수 있는 ANGPTL3 유전자를 편집하기 위한 조성물.
178. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 3 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 트리글리세리드 수준을 기준선과 비교하여 평균 55% 이상 감소시킬 수 있는 ANGPTL3 유전자를 편집하기 위한 조성물.
179. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 3 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 트리글리세리드 수준을 기준선과 비교하여 평균 60% 이상 감소시킬 수 있는 ANGPTL3 유전자를 편집하기 위한 조성물.
180. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 3 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 트리글리세리드 수준을 기준선과 비교하여 평균 65% 이상 감소시킬 수 있는 ANGPTL3 유전자를 편집하기 위한 조성물.
181. 조항 148-182 중 어느 하나에 있어서, 트리글리세리드 수준의 감소는 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈액 샘플링 및 분석을 통해 투여 후 15일에 결정되는 것인 ANGPTL3 유전자를 편집하기 위한 조성물.
182. 조항 148-182 중 어느 하나에 있어서, 트리글리세리드 수준의 감소는 투여된 시노몰구스 원숭이의 주기적 혈액 샘플링 및 분석에 의해 적어도 168일의 범위에 걸쳐 지속적으로 유지되는 것으로 결정되는 것인 ANGPTL3 유전자를 편집하기 위한 조성물.
183. 조항 148-182에 있어서, 트리글리세리드 수준의 감소는 투여된 시노몰구스 원숭이의 주기적 혈액 샘플링 및 분석에 의해 적어도 300일의 범위에 걸쳐 지속적으로 유지되는 것으로 결정되는 것인 ANGPTL3 유전자를 편집하기 위한 조성물.
184. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 3 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 지단백질(a)를 기준선과 비교하여 평균 10% 이상 감소시킬 수 있는 ANGPTL3 유전자를 편집하기 위한 조성물.
185. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 3 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 지단백질(a) 수준을 기준선과 비교하여 평균 15% 이상 감소시킬 수 있는 ANGPTL3 유전자를 편집하기 위한 조성물.
186. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 3 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 지단백질(a) 수준을 기준선과 비교하여 평균 20% 이상 감소시킬 수 있는 ANGPTL3 유전자를 편집하기 위한 조성물.
187. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 3 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 지단백질(a) 수준을 기준선과 비교하여 평균 25% 이상 감소시킬 수 있는 ANGPTL3 유전자를 편집하기 위한 조성물.
188. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 3 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 지단백질(a) 수준을 기준선과 비교하여 평균 30% 이상 감소시킬 수 있는 ANGPTL3 유전자를 편집하기 위한 조성물.
189. 조항 88에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 3 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 지단백질(a) 수준을 기준선과 비교하여 평균 대략 35% 감소시킬 수 있는 ANGPTL3 유전자를 편집하기 위한 조성물.
190. 조항 186-191 중 어느 하나에 있어서, 지단백질(a)의 감소는 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈액 샘플링 및 분석을 통해 투여 후 15일에 결정되는 것인 ANGPTL3 유전자를 편집하기 위한 조성물.
191. 조항 186-191 중 어느 하나에 있어서, 지단백질(a)의 감소는 투여된 시노몰구스 원숭이의 주기적 혈액 샘플링 및 분석에 의해 적어도 224일의 범위에 걸쳐 지속적으로 유지되는 것으로 결정되는 것인 ANGPTL3 유전자를 편집하기 위한 조성물.
192. 조항 186-191 중 어느 하나에 있어서, 지단백질(a)의 감소는 투여된 시노몰구스 원숭이의 주기적 혈액 샘플링 및 분석에 의해 적어도 300일의 범위에 걸쳐 지속적으로 유지되는 것으로 결정되는 것인 ANGPTL3 유전자를 편집하기 위한 조성물.
193. 조항 101-194 중 어느 하나에 있어서, 시노몰구스 원숭이의 투여가 AST, ALT, 또는 사이토카인의 상승을 초래하는 정도로, 조성물의 투여로 인한 상승은 일시적이고 투여 후 3-15일 이내에 대략 기준선 수준으로 다시 해소되는 것인 ANGPTL3 유전자를 편집하기 위한 조성물.
194. 조항 101-103, 121-126, 148-153 중 어느 하나에 있어서, ANGPTL3의 퍼센트 편집율은 [도 27]에 예시된 바와 같이 간, 비장 및 부신 조직 외부에서 무시할 수 있는 것인 ANGPTL3 유전자를 편집하기 위한 조성물.
195. 조항 101-107, 121-132, 148-162 중 어느 하나에 있어서, 반복 투여 결과는 ANGPTL3 편집 백분율의 편집 백분율과 관련하여 부가적인 것인 ANGPTL3 유전자를 편집하기 위한 조성물.
196. 조항 195에 있어서, 반복 투여는 사이토카인 활성화도 면역 반응도 유발하지 않는 것인 ANGPTL3 유전자를 편집하기 위한 조성물.
197. 조항 88에 있어서, 스페이서 서열은 ANGPTL3 유전자 상의 표적화된 프로토스페이서의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%의 뉴클레오티드 상관관계를 가지며, 스페이서 서열 상의 RNA 뉴클레오티드는 DNA 뉴클레오티드와 동일한 뉴클레오티드를 동일한 순서로 가질 경우 프로토스페이서의 DNA 뉴클레오티드와 상관관계에 있고 우라실 및 티민 염기는 상관관계를 결정하기 위해 동일한 뉴클레오티드로 간주되는 것인 ANGPTL3 유전자를 편집하기 위한 조성물.
198. 조항 197에 있어서, 스페이서 서열은 ANGPTL3 유전자 상의 표적화된 프로토스페이서의 뉴클레오티드 서열과 적어도 85%의 뉴클레오티드 상관관계를 갖는 것인 ANGPTL3 유전자를 편집하기 위한 조성물.
199. 조항 197에 있어서, 스페이서 서열은 ANGPTL3 유전자 상의 표적화된 프로토스페이서의 뉴클레오티드 서열과 적어도 90%의 뉴클레오티드 상관관계를 갖는 것인 ANGPTL3 유전자를 편집하기 위한 조성물.
200. 조항 197에 있어서, 스페이서 서열은 ANGPTL3 유전자 상의 표적화된 프로토스페이서의 뉴클레오티드 서열과 적어도 95%의 뉴클레오티드 상관관계를 갖는 것인 ANGPTL3 유전자를 편집하기 위한 조성물.
201. 조항 197에 있어서, 스페이서 서열은 ANGPTL3 유전자 상의 표적화된 프로토스페이서의 뉴클레오티드 서열과 적어도 99%의 뉴클레오티드 상관관계를 갖는 것인 ANGPTL3 유전자를 편집하기 위한 조성물.
202. 조항 197에 있어서, 스페이서 서열은 ANGPTL3 유전자 상의 표적화된 프로토스페이서의 뉴클레오티드 서열과 적어도 100%의 뉴클레오티드 상관관계를 갖는 것인 ANGPTL3 유전자를 편집하기 위한 조성물.
203. 죽상동맥경화성 심혈관 질환의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법으로서,
(a) 편집 창을 갖는 아데닌 염기 에디터 단백질을 코딩하는 mRNA,
(b) 염기 에디터 단백질에 대한 결합 스캐폴드 역할을 하는 tracr 서열 및 염기 에디터 단백질을 PCSK9 유전자 상의 프로토스페이서 서열로 안내하는 역할을 하는 스페이서 서열을 포함하는 제1 가이드 RNA로서, 스페이서 서열은 PCSK9 유전자의 스플라이스 부위 또는 엑손 영역에 적어도 부분적으로 상보적인 것인 제1 가이드 RNA; 및
(c) 염기 에디터 단백질에 대한 결합 스캐폴드 역할을 하는 tracr 서열 및 염기 에디터 단백질을 ANGPTL3 유전자 상의 프로토스페이서 서열로 안내하는 역할을 하는 스페이서 서열을 포함하는 제2 가이드 RNA로서, 스페이서 서열은 ANGPTL3 유전자의 스플라이스 부위 또는 엑손 영역에 적어도 부분적으로 상보적인 것인 제2 가이드 RNA
의 치료 유효량을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법.
204. 조항 203에 있어서, (a)를 둘러싸는 제1 LNP를 추가로 포함하는 방법.
205. 조항 204에 있어서, 제1 LNP는 (b) 및 (c)를 둘러싸는 것인 방법.
206. 조항 204에 있어서, 제1 LNP는 반복적으로 투여되는 것인 방법.
207. 조항 204에 있어서, 제1 LNP는 1 내지 60일의 간격으로 반복적으로 투여된 것인 방법.
208. 조항 204에 있어서, 제1 LNP는 7일의 간격으로 반복적으로 투여되는 것인 방법.
209. 조항 204에 있어서, 제1 LNP는 (b)를 추가로 둘러싸는 것인 방법.
210. 조항 209에 있어서, (a) 및 (c)를 둘러싸는 제2 LNP를 추가로 포함하는 방법.
211. 조항 210에 있어서, 제1 LNP 및 제2 LNP는 순차적으로 투여되는 것인 방법.
212. 조항 211에 있어서, 제1 LNP 및 제2 LNP는 1일 내지 12개월의 간격으로 순차적으로 투여되는 것인 방법.
213. 조항 212에 있어서, 간격은 1일인 방법.
214. 조항 212에 있어서, 간격은 5일인 방법.
215. 조항 212에 있어서, 간격은 10일인 방법.
216. 조항 212에 있어서, 간격은 15일인 방법.
217. 조항 212에 있어서, 간격은 20일인 방법.
218. 조항 212에 있어서, 간격은 25일인 방법.
219. 조항 212에 있어서, 간격은 1개월인 방법.
220. 조항 212에 있어서, 간격은 2개월인 방법.
221. 조항 212에 있어서, 간격은 3개월인 방법.
222. 조항 212에 있어서, 간격은 5개월인 방법.
223. 조항 212에 있어서, 간격은 8개월인 방법.
224. 조항 212에 있어서, 간격은 10개월인 방법.
225. 조항 212에 있어서, 간격은 12개월인 방법.
또한, 본 개시 내용을 검토함으로써, 관련 조항 중 하나 또는 군에 제시된 하나 이상의 측면 또는 특징이 또한 다른 조항에 포함될 수 있거나 다른 조항의 하나 이상의 측면 또는 특징과 조합될 수 있음이 고려됨을 이해할 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> VERVE THERAPEUTICS, INC. <120> BASE EDITING OF PCSK9 AND METHODS OF USING SAME FOR TREATMENT OF DISEASE <130> 53989-707.601 <140> <141> <150> 63/136,087 <151> 2021-01-11 <150> 63/045,032 <151> 2020-06-26 <150> 63/045,033 <151> 2020-06-26 <150> 63/007,797 <151> 2020-04-09 <150> 63/007,803 <151> 2020-04-09 <160> 2230 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 167 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 1 Met Ser Glu Val Glu Phe Ser His Glu Tyr Trp Met Arg His Ala Leu 1 5 10 15 Thr Leu Ala Lys Arg Ala Trp Asp Glu Arg Glu Val Pro Val Gly Ala 20 25 30 Val Leu Val His Asn Asn Arg Val Ile Gly Glu Gly Trp Asn Arg Pro 35 40 45 Ile Gly Arg His Asp Pro Thr Ala His Ala Glu Ile Met Ala Leu Arg 50 55 60 Gln Gly Gly Leu Val Met Gln Asn Tyr Arg Leu Ile Asp Ala Thr Leu 65 70 75 80 Tyr Val Thr Leu Glu Pro Cys Val Met Cys Ala Gly Ala Met Ile His 85 90 95 Ser Arg Ile Gly Arg Val Val Phe Gly Ala Arg Asp Ala Lys Thr Gly 100 105 110 Ala Ala Gly Ser Leu Met Asp Val Leu His His Pro Gly Met 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Asp Leu Arg Leu Ile 340 345 350 Tyr Leu Ala Leu Ala His Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile 355 360 365 Glu Gly Asp Leu Asn Pro Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile 370 375 380 Gln Leu Val Gln Thr Tyr Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn 385 390 395 400 Ala Ser Gly Val Asp Ala Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys 405 410 415 Ser Arg Arg Leu Glu Asn Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys 420 425 430 Asn Gly Leu Phe Gly Asn Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro 435 440 445 Asn Phe Lys Ser Asn Phe Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu 450 455 460 Ser Lys Asp Thr Tyr Asp Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile 465 470 475 480 Gly Asp Gln Tyr Ala Asp Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp 485 490 495 Ala Ile Leu Leu Ser Asp Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys 500 505 510 Ala Pro Leu Ser Ala Ser Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln 515 520 525 Asp Leu Thr Leu Leu Lys Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys 530 535 540 Tyr Lys Glu Ile Phe Phe Asp Gln Ser Lys Asn Gly 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DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 4 atgagcgagg tcgagttctc tcacgaatat tggatgagac acgctctcac cctggctaag 60 agagccaggg acgaaagaga ggtgccagtt ggcgctgtcc tggtgttgaa caatcgcgtc 120 atcggagaag gatggaatcg cgccattggc ctgcacgatc caaccgcaca tgccgaaatt 180 atggctctgc ggcaaggcgg cctcgtgatg caaaattaca gactgatcga tgctaccctc 240 tacgtcacct tcgagccctg tgtcatgtgt gctggggcaa tgattcactc ccggattggc 300 cgcgtggtgt ttggagtgcg gaatgccaag actggcgccg ctggatctct gatggacgtc 360 ctgcaccatc ctgggatgaa ccaccgggtc gagatcacag agggaattct ggctgacgag 420 tgcgctgccc tgctgtgcag gttctttaga atgcctagaa gggtgttcaa cgcccagaaa 480 aaagctcaga gcagcaccga ttccggcgga agcagcggag gatcttctgg aagcgaaacc 540 ccaggcacca gcgagtctgc cacaccagaa tcatctggcg gtagctccgg cggcagcgac 600 aagaagtatt ctatcggact ggccatcggc accaactctg ttggatgggc cgtgatcacc 660 gacgagtaca aggtgcccag caagaaattc aaggtgctgg gcaacaccga caggcacagc 720 atcaagaaga acctgatcgg cgcactgctg ttcgactctg 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actcagctca 1860 gtatagccct cttccttgtt ccctgagcct ttgactttct cgagggatgt tgtggggttg 1920 tggccaggat aagaaagggc atttcaagtt accactgctc caaaacaact gttctggaaa 1980 tagtgagtac cccatcctga gaggtgagta agcagaggct gtatgaccac ctgaaccaag 2040 cccttgagga tgtttcttct ctggtggaag tttggaacag gagcctcctc aagttcattt 2100 attcattcat tcaatggtta ttttgtggga atcgaattta gaatgaaaat attttttggc 2160 aagcagaaaa taatttttag accaatcctt ttcttttagt catgagaaac tgaggcccag 2220 agagaggagg tcaccccagg tgcattagaa ctgggtttcc agaactgaca ctccactgca 2280 cagagtactc tcccaattca ttcaattttt atttagcgga aggcattttc agatgggtct 2340 ttgaagcatt agtaggagtt cagcgatgat ggtgtcatga gaattttatt ctaggattag 2400 gaggtaccat gaacaaagat acagagctgg gaaaaccaga ggtggaagat aaggagcaca 2460 tgtccacagt tctttttctt ttttttttga gatggagttt cgctcttgtt gcccaggctg 2520 gagtgcaatg gtgcagtctc agctcactgc aacatctgtc tcccgggttc aagtggttct 2580 cctgcctcag cctcccaaga agctgggatt acaggtacct gccaccacgc ccggctaatt 2640 tttgtatttt tagtagagaa ggggtttcac cacgttggcc aggctagtcg 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aaaaacaaga taatagcatc aaagaccttc tccagaccgt ggaagaccaa 6240 tataaacaat taaaccaaca gcatagtcaa ataaaagaaa tagaaaatca ggtaagtcag 6300 tattttaatg gtatgtccca tctttcacac aggtctgtaa aaacactgaa tcctaaaatt 6360 atttacaagc tttaactgga tcatgagtaa aattatcaca tcagcataac tgttaaaatt 6420 gcaggctctg aagctaataa actacctgca tttaaaccat ggctctaaaa ctttgtgtga 6480 ccttgaataa attacttcac ccctttatct ctcagtttcc tcacatatac tacaaagata 6540 ataacagaac ttataggatt attgtaagaa aaaaaattaa ttcatagcag ccaatgtcat 6600 cttactaaaa ttcaaattag atcatgtttc tctttgctca aaaccacaca atagctttcc 6660 atttcactca tattggctct ttagaccaag attacccaac ccttcgtcat ctcactgact 6720 tcacctcctc tactctagtt attctgaccg ctttaccagt attcaaacac atcaaacata 6780 ctgccacctc aaagcctttg cccttgttgt ttcctctaac tggaacgctc ttctgccctg 6840 gtatctacgt ggcccactct ctgatttccc ttagggtcgt tatcaaacaa aaaattccca 6900 atgaagactt acaaggtcac ttaaccaaaa atcacaaccg cctggtccca tccctgaaaa 6960 cttctacttc cttagctact tttctcctgc acactcacct ttatttaaca taacataaat 7020 tttagttatt 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tttaaataag gtcctaggaa atatcattca tgccagcatc aaaaaactaa 7920 cactaataat gcaagatatt atatattctg cttttcttac tgtcaatgag aaaaactatc 7980 attcaataaa ttgcaaaccc aacacactta aataaaaata aaatgttact gctaaactaa 8040 cgataaacta ctgaatatat agaaagtaag caaacaaact tgccaacctg ccaacatcta 8100 cagatatgtt tacaggtcaa aaattatcaa attatcaaga aagcctggtt caaattatgt 8160 attatgtctt tatcacaggt ctgaagatca gtaagaccta aaactgaaaa ttattaaact 8220 taaaatctga acagaatatc aaatatattt tattcatata aataaaagaa tacattacaa 8280 tattctaagc aaagcagtct ctacttttgg ccttgctctg ttttccgacc aatgtctgct 8340 tttttgcctt gctttatttt tttatcttat taaataatgt ccctgattaa atattttgag 8400 aacaggtaat ctgtacaatc tgaataacac tgtttatcta aatatcaaac accgttataa 8460 cattatgaac tgaaagacaa actgtacttc tgacatcctt actcagattt cccctaattg 8520 tatattcagt atcattttaa aaaacagatt tatattcttt tatcagctca gaaggactag 8580 tattcaagaa cccacagaaa tttctctatc ttccaagcca agagcaccaa gaactactcc 8640 ctttcttcag ttgaatgaaa taagaaatgt aaaacatgat ggtaagacac tttggtgggt 8700 ttccttcttg 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cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 10 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 10 cccgcaccuu ggcgcagcgg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaacaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 11 <211> 103 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 11 cccgcaccuu ggcgcagcgg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uuu 103 <210> 12 <211> 101 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 12 ccgcaccuug gcgcagcggu uuuagagcua gaaauagcaa guuaaaauaa ggcuaguccg 60 uuaucaacuu gaaaaagugg caccgagucg gugcuuuuuu u 101 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 13 cccgcacctt ggcgcagcgg 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 14 aagatacctg aataactctc 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 15 aagatacctg aataaccctc 20 <210> 16 <211> 84 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Bacillus phage PBS2 sequence <400> 16 Met Thr Asn Leu Ser Asp Ile Ile Glu Lys Glu Thr Gly Lys Gln Leu 1 5 10 15 Val Ile Gln Glu Ser Ile Leu Met Leu Pro Glu Glu Val Glu Glu Val 20 25 30 Ile Gly Asn Lys Pro Glu Ser Asp Ile Leu Val His Thr Ala Tyr Asp 35 40 45 Glu Ser Thr Asp Glu Asn Val Met Leu Leu Thr Ser Asp Ala Pro Glu 50 55 60 Tyr Lys Pro Trp Ala Leu Val Ile Gln Asp Ser Asn Gly Glu Asn Lys 65 70 75 80 Ile Lys Met Leu <210> 17 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 17 Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser 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Gly Ser Pro Ala Gly 35 40 45 Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly 50 55 60 Ser Ala Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly 65 70 75 80 Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala 85 90 95 Thr Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser 100 <210> 22 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 22 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 23 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 23 Ser Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr 1 5 10 15 Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser 20 <210> 24 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 24 Ser Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr 1 5 10 15 Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Ser Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser 20 25 30 Ser Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser 35 40 <210> 25 <211> 64 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 25 Ser Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr 1 5 10 15 Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Ser Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser 20 25 30 Ser Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr 35 40 45 Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Ser Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser 50 55 60 <210> 26 <211> 92 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 26 Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser 1 5 10 15 Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser 20 25 30 Glu Gly Ser Ala Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu 35 40 45 Glu Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser 50 55 60 Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr 65 70 75 80 Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser 85 90 <210> 27 <211> 7 <212> PRT <213> Macaca mulatta polyomavirus 1 <400> 27 Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val 1 5 <210> 28 <211> 30 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: NLS sequence <400> 28 Met Asp Ser Leu Leu Met Asn Arg Arg Lys Phe Leu Tyr Gln Phe Lys 1 5 10 15 Asn Val Arg Trp Ala Lys Gly Arg Arg Glu Thr Tyr Leu Cys 20 25 30 <210> 29 <211> 36 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Zn -coordinating motif sequence <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(29) <223> Any amino acid <220> <221> SITE <222> (4)..(29) <223> This sequence may encompass 23-26 residues <220> <221> MOD_RES <222> (32)..(35) <223> Any amino acid <220> <221> SITE <222> (32)..(35) <223> This sequence may encompass 2-4 residues <400> 29 His Xaa Glu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Cys Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Cys 35 <210> 30 <211> 160 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <400> 30 Met Gly Ser His Met Thr Asn Asp Ile Tyr Phe Met Thr Leu Ala Ile 1 5 10 15 Glu Glu Ala Lys Lys Ala Ala Gln Leu Gly Glu Val Pro Ile Gly Ala 20 25 30 Ile Ile Thr Lys Asp Asp Glu Val Ile Ala Arg Ala His Asn Leu Arg 35 40 45 Glu Thr Leu Gln Gln Pro Thr Ala His Ala Glu His Ile Ala Ile Glu 50 55 60 Arg Ala Ala Lys Val Leu Gly Ser Trp Arg Leu Glu Gly Cys Thr Leu 65 70 75 80 Tyr Val Thr Leu Glu Pro Cys Val Met Cys Ala Gly Thr Ile Val Met 85 90 95 Ser Arg Ile Pro Arg Val Val Tyr Gly Ala Asp Asp Pro Lys Gly Gly 100 105 110 Cys Ser Gly Ser Leu Met Asn Leu Leu Gln Gln Ser Asn Phe Asn His 115 120 125 Arg Ala Ile Val Asp Lys Gly Val Leu Lys Glu Ala Cys Ser Thr Leu 130 135 140 Leu Thr Thr Phe Phe Lys Asn Leu Arg Ala Asn Lys Lys Ser Thr Asn 145 150 155 160 <210> 31 <211> 161 <212> PRT <213> Bacillus subtilis <400> 31 Met Thr Gln Asp Glu Leu Tyr Met Lys Glu Ala Ile Lys Glu Ala Lys 1 5 10 15 Lys Ala Glu Glu Lys Gly Glu Val Pro Ile Gly Ala Val Leu Val Ile 20 25 30 Asn Gly Glu Ile Ile Ala Arg Ala 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pyogenes <400> 37 atggataaga aatactcaat aggcttagat atcggcacaa atagcgtcgg atgggcggtg 60 atcactgatg aatataaggt tccgtctaaa aagttcaagg ttctgggaaa tacagaccgc 120 cacagtatca aaaaaaatct tataggggct cttttatttg acagtggaga gacagcggaa 180 gcgactcgtc tcaaacggac agctcgtaga aggtatacac gtcggaagaa tcgtatttgt 240 tatctacagg agattttttc aaatgagatg gcgaaagtag atgatagttt ctttcatcga 300 cttgaagagt cttttttggt ggaagaagac aagaagcatg aacgtcatcc tatttttgga 360 aatatagtag atgaagttgc ttatcatgag aaatatccaa ctatctatca tctgcgaaaa 420 aaattggtag attctactga taaagcggat ttgcgcttaa tctatttggc cttagcgcat 480 atgattaagt ttcgtggtca ttttttgatt gagggagatt taaatcctga taatagtgat 540 gtggacaaac tatttatcca gttggtacaa acctacaatc aattatttga agaaaaccct 600 attaacgcaa gtggagtaga tgctaaagcg attctttctg cacgattgag taaatcaaga 660 cgattagaaa atctcattgc tcagctcccc ggtgagaaga aaaatggctt atttgggaat 720 ctcattgctt tgtcattggg tttgacccct aattttaaat caaattttga tttggcagaa 780 gatgctaaat tacagctttc aaaagatact tacgatgatg atttagataa tttattggcg 840 caaattggag atcaatatgc tgatttgttt ttggcagcta agaatttatc agatgctatt 900 ttactttcag atatcctaag agtaaatact gaaataacta aggctcccct atcagcttca 960 atgattaaac gctacgatga acatcatcaa gacttgactc ttttaaaagc tttagttcga 1020 caacaacttc cagaaaagta taaagaaatc ttttttgatc aatcaaaaaa cggatatgca 1080 ggttatattg atgggggagc tagccaagaa gaattttata aatttatcaa accaatttta 1140 gaaaaaatgg atggtactga ggaattattg gtgaaactaa atcgtgaaga tttgctgcgc 1200 aagcaacgga cctttgacaa cggctctatt ccccatcaaa ttcacttggg tgagctgcat 1260 gctattttga gaagacaaga agacttttat ccatttttaa aagacaatcg tgagaagatt 1320 gaaaaaatct tgacttttcg aattccttat tatgttggtc cattggcgcg tggcaatagt 1380 cgttttgcat ggatgactcg gaagtctgaa gaaacaatta ccccatggaa ttttgaagaa 1440 gttgtcgata aaggtgcttc agctcaatca tttattgaac gcatgacaaa ctttgataaa 1500 aatcttccaa atgaaaaagt actaccaaaa catagtttgc tttatgagta ttttacggtt 1560 tataacgaat tgacaaaggt caaatatgtt actgaaggaa tgcgaaaacc agcatttctt 1620 tcaggtgaac agaagaaagc cattgttgat ttactcttca aaacaaatcg aaaagtaacc 1680 gttaagcaat taaaagaaga ttatttcaaa aaaatagaat gttttgatag tgttgaaatt 1740 tcaggagttg aagatagatt taatgcttca ttaggtacct accatgattt gctaaaaatt 1800 attaaagata aagatttttt ggataatgaa gaaaatgaag atatcttaga ggatattgtt 1860 ttaacattga ccttatttga agatagggag atgattgagg aaagacttaa aacatatgct 1920 cacctctttg atgataaggt gatgaaacag cttaaacgtc gccgttatac tggttgggga 1980 cgtttgtctc gaaaattgat taatggtatt agggataagc aatctggcaa aacaatatta 2040 gattttttga aatcagatgg ttttgccaat cgcaatttta tgcagctgat ccatgatgat 2100 agtttgacat ttaaagaaga cattcaaaaa gcacaagtgt ctggacaagg cgatagttta 2160 catgaacata ttgcaaattt agctggtagc cctgctatta aaaaaggtat tttacagact 2220 gtaaaagttg ttgatgaatt ggtcaaagta atggggcggc ataagccaga aaatatcgtt 2280 attgaaatgg cacgtgaaaa tcagacaact caaaagggcc agaaaaattc gcgagagcgt 2340 atgaaacgaa tcgaagaagg tatcaaagaa ttaggaagtc agattcttaa agagcatcct 2400 gttgaaaata ctcaattgca aaatgaaaag ctctatctct attatctcca aaatggaaga 2460 gacatgtatg tggaccaaga attagatatt aatcgtttaa gtgattatga tgtcgatcac 2520 attgttccac aaagtttcct taaagacgat tcaatagaca ataaggtctt aacgcgttct 2580 gataaaaatc gtggtaaatc ggataacgtt ccaagtgaag aagtagtcaa aaagatgaaa 2640 aactattgga gacaacttct aaacgccaag ttaatcactc aacgtaagtt tgataattta 2700 acgaaagctg aacgtggagg tttgagtgaa cttgataaag ctggttttat caaacgccaa 2760 ttggttgaaa ctcgccaaat cactaagcat gtggcacaaa ttttggatag tcgcatgaat 2820 actaaatacg atgaaaatga taaacttatt cgagaggtta aagtgattac cttaaaatct 2880 aaattagttt ctgacttccg aaaagatttc caattctata aagtacgtga gattaacaat 2940 taccatcatg cccatgatgc gtatctaaat gccgtcgttg gaactgcttt gattaagaaa 3000 tatccaaaac ttgaatcgga gtttgtctat ggtgattata aagtttatga tgttcgtaaa 3060 atgattgcta agtctgagca agaaataggc aaagcaaccg caaaatattt cttttactct 3120 aatatcatga acttcttcaa aacagaaatt acacttgcaa atggagagat tcgcaaacgc 3180 cctctaatcg aaactaatgg ggaaactgga gaaattgtct gggataaagg gcgagatttt 3240 gccacagtgc gcaaagtatt gtccatgccc caagtcaata ttgtcaagaa aacagaagta 3300 cagacaggcg gattctccaa ggagtcaatt ttaccaaaaa gaaattcgga caagcttatt 3360 gctcgtaaaa aagactggga tccaaaaaaa tatggtggtt ttgatagtcc aacggtagct 3420 tattcagtcc tagtggttgc taaggtggaa aaagggaaat cgaagaagtt aaaatccgtt 3480 aaagagttac tagggatcac aattatggaa agaagttcct ttgaaaaaaa tccgattgac 3540 tttttagaag ctaaaggata taaggaagtt aaaaaagact taatcattaa actacctaaa 3600 tatagtcttt ttgagttaga aaacggtcgt aaacggatgc tggctagtgc cggagaatta 3660 caaaaaggaa atgagctggc tctgccaagc aaatatgtga attttttata tttagctagt 3720 cattatgaaa agttgaaggg tagtccagaa gataacgaac aaaaacaatt gtttgtggag 3780 cagcataagc attatttaga tgagattatt gagcaaatca gtgaattttc taagcgtgtt 3840 attttagcag atgccaattt agataaagtt cttagtgcat ataacaaaca tagagacaaa 3900 ccaatacgtg aacaagcaga aaatattatt catttattta cgttgacgaa tcttggagct 3960 cccgctgctt ttaaatattt tgatacaaca attgatcgta aacgatatac gtctacaaaa 4020 gaagttttag atgccactct tatccatcaa tccatcactg gtctttatga aacacgcatt 4080 gatttgagtc agctaggagg tgactga 4107 <210> 38 <211> 1368 <212> PRT <213> Streptococcus pyogenes <400> 38 Met Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Asp Ile 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<400> 56 cagguuccau gggaugcucu 20 <210> 57 <211> 80 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 57 guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu 60 ggcaccgagu cggugcuuuu 80 <210> 58 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 58 cccgcacctt ggcgcagcgg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 59 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 59 aagauaccug aauaacccuc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 60 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 60 aagauaccug aauaacccuc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 61 <211> 80 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 61 guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu 60 ggcaccgagu cggugcuuuu 80 <210> 62 <211> 3166 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 62 ctgctcagtt catccctaga ggcagctgct ccaggtaatg ccctctgggg aggggaaaga 60 ggaggggagg aggatgaaga ggggcaagag gagctccctg cccagcccag ccagcaagcc 120 tggagaagca cttgctagag ctaaggaagc ctcggagctg gacgggtgcc ccccacccct 180 catcataacc tgaagaacat ggaggcccgg gaggggtgtc acttgcccaa agctacacag 240 ggggtggggc tggaagtggc tccaagtgca ggttcccccc tcattcttca ggcttagggc 300 tggaggaagc cttagacagc ccagtcctac cccagacagg gaaactgagg cctggagagg 360 gccagaaatc acccaaagac acacagcatg ttggctggac tggacggaga tcagtccaga 420 ccgcaggtgc cttgatgttc agtctggtgg gttttctgct ccatcccacc cacctccctt 480 tgggcctcga tccctcgccc ctcaccagtc ccccttctga gagcccgtat tagcagggag 540 ccggccccta ctccttctgg cagacccagc taaggttcta ccttaggggc cacgccacct 600 ccccagggag gggtccagag gcatggggac ctggggtgcc cctcacagga cacttccttg 660 caggaacaga ggtgccatgc agccccgggt actccttgtt gttgccctcc tggcgctcct 720 ggcctctgcc cgtaagcact tggtgggact gggctggggg cagggtggag gcaacttggg 780 gatcccagtc ccaatgggtg gtcaagcagg agcccagggc tcgtccagag gccgatccac 840 cccactcagc cctgctcttt cctcaggagc ttcagaggcc gaggatgcct cccttctcag 900 cttcatgcag ggttacatga agcacgccac caagaccgcc aaggatgcac tgagcagcgt 960 gcaggagtcc caggtggccc agcaggccag gtacacccgc tggcctccct ccccatcccc 1020 cctgccagct gcctccattc ccacccgccc ctgccctggt gagatcccaa caatggaatg 1080 gaggtgctcc agcctcccct gggcctgtgc ctcttcagcc tcctctttcc tcacagggcc 1140 tttgtcaggc tgctgcggga gagatgacag agttgagact gcattcctcc caggtccctc 1200 ctttctcccc ggagcagtcc tagggcgtgc cgttttagcc ctcatttcca ttttcctttc 1260 ctttcccttt ctttctcttt ctatttcttt ctttctttct ttctttcttt ctttctttct 1320 ttctttcttt ctttctttct ttctttcttt cctttctttc 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ccagtgtgag cagaagtgtg 2220 tccttcctct cccatcctgc ccctgcccat cagtactctc ctctccccta ctcccttctc 2280 cacctcaccc tgactggcat tagctggcat agcagaggtg ttcataaaca ttcttagtcc 2340 ccagaaccgg ctttggggta ggtgttattt tctcactttg cagatgagaa aattgaggct 2400 cagagcgatt aggtgacctg ccccagatca cacaactaat caatcctcca atgactttcc 2460 aaatgagagg ctgcctccct ctgtcctacc ctgctcagag ccaccaggtt gtgcaactcc 2520 aggcggtgct gtttgcacag aaaacaatga cagccttgac ctttcacatc tccccaccct 2580 gtcactttgt gcctcaggcc caggggcata aacatctgag gtgacctgga gatggcaggg 2640 tttgacttgt gctggggttc ctgcaaggat atctcttctc ccagggtggc agctgtgggg 2700 gattcctgcc tgaggtctca gggctgtcgt ccagtgaagt tgagagggtg gtgtggtcct 2760 gactggtgtc gtccagtggg gacatgggtg tgggtcccat ggttgcctac agaggagttc 2820 tcatgccctg ctctgttgct tcccctgact gatttagggg ctgggtgacc gatggcttca 2880 gttccctgaa agactactgg agcaccgtta aggacaagtt ctctgagttc tgggatttgg 2940 accctgaggt cagaccaact tcagccgtgg ctgcctgaga cctcaatacc ccaagtccac 3000 ctgcctatcc atcctgcgag ctccttgggt cctgcaatct ccagggctgc ccctgtaggt 3060 tgcttaaaag ggacagtatt ctcagtgctc tcctacccca cctcatgcct ggcccccctc 3120 caggcatgct ggcctcccaa taaagctgga caagaagctg ctatga 3166 <210> 63 <211> 99 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 63 Met Gln Pro Arg Val Leu Leu Val Val Ala Leu Leu Ala Leu Leu Ala 1 5 10 15 Ser Ala Arg Ala Ser Glu Ala Glu Asp Ala Ser Leu Leu Ser Phe Met 20 25 30 Gln Gly Tyr Met Lys His Ala Thr Lys Thr Ala Lys Asp Ala Leu Ser 35 40 45 Ser Val Gln Glu Ser Gln Val Ala Gln Gln Ala Arg Gly Trp Val Thr 50 55 60 Asp Gly Phe Ser Ser Leu Lys Asp Tyr Trp Ser Thr Val Lys Asp Lys 65 70 75 80 Phe Ser Glu Phe Trp Asp Leu Asp Pro Glu Val Arg Pro Thr Ser Ala 85 90 95 Val Ala Ala <210> 64 <211> 4548 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 64 Met Glu His Lys Glu Val Val Leu Leu Leu Leu Leu Phe Leu Lys Ser 1 5 10 15 Ala Ala Pro Glu Gln Ser His Val Val Gln Asp Cys Tyr His Gly Asp 20 25 30 Gly Gln Ser Tyr Arg Gly Thr Tyr Ser Thr Thr Val Thr Gly Arg Thr 35 40 45 Cys Gln Ala Trp Ser Ser Met Thr Pro His Gln His Asn Arg 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<210> 69 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 69 cccatacctt ggagcaacgg 20 <210> 70 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 70 ccagccaagc gcacctaatt tcc 23 <210> 71 <211> 98 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 71 ggaaauuagg ugcgcuuggc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuu 98 <210> 72 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 72 ggcgcauaaa gaugagacgc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu gucaccgagu cggugcuucg 100 <210> 73 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 73 cagguuccau gggaugcucu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 74 <211> 118 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 74 ggcgcauaaa gaugagacgc guuuuagagc uaugcuguuu ugaaaaaaac agcauagcaa 60 guuaaaauaa ggcuaguccg uuaucaacuu gaaaaagugg caccgagucg gugcuuuu 118 <210> 75 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 75 gctgcgccaa ggcgcgggtg tagggatgg 29 <210> 76 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (11)..(11) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (13)..(13) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 76 ggttattcag ncntcttttt ctgatac 27 <210> 77 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 77 acacccgcac cttggcgcag cggtggaagg tgg 33 <210> 78 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 78 acacccgcac cttggcgcag gggggagggg ggg 33 <210> 79 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 79 acacccgcgc cttggcgcag cggtggaagg tgg 33 <210> 80 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 80 cccgcacctt ggcgcagcgg tgg 23 <210> 81 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 81 caggttccat gggatgctct 20 <210> 82 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 82 ggtggctcac cagctccagc 20 <210> 83 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 83 ttggaaagac ggaggcagcc 20 <210> 84 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 84 gaaagacgga ggcagcctgg 20 <210> 85 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 85 tcccaggcct ggagtttatt 20 <210> 86 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 86 agcacctacc tcgggagctg 20 <210> 87 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 87 ctttccaggt catcacagtt 20 <210> 88 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 88 cctttccagg tcatcacagt 20 <210> 89 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 89 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Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 126 tgaagaaagg gagtagttct 20 <210> 127 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 127 agttcttggt gctcttggct 20 <210> 128 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 128 atgatggtaa gacactttgg 20 <210> 129 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 129 gaagatagag aaatttctgt 20 <210> 130 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 130 ggaagataga gaaatttctg 20 <210> 131 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 131 tatttcattc aactgaagaa 20 <210> 132 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 132 atttcattca actgaagaaa 20 <210> 133 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 133 gtctactgtg atgttatatc 20 <210> 134 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 134 taaatggtgg tacattcagc 20 <210> 135 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 135 tatcaggtaa aacctgtcta 20 <210> 136 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 136 tgtaccacca tttataacag 20 <210> 137 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 137 ttcacctctg ttataaatgg 20 <210> 138 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 138 aacagaggtg aacatacaag 20 <210> 139 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 139 ttgagagttg ctgggtctga 20 <210> 140 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 140 tgaaaaactt gagagttgct 20 <210> 141 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 141 ttaattcaac atcgaataga 20 <210> 142 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 142 tttgggaggc ttgatggtaa 20 <210> 143 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 143 cattatattc aggtagtcca 20 <210> 144 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 144 ttgggaggct tgatggtaag 20 <210> 145 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 145 ttttgggagg cttgatggta 20 <210> 146 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 146 acaaaacttc aatgaaacgt 20 <210> 147 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 147 tatggttttg ggaggcttga 20 <210> 148 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 148 actacaaata tggttttggg 20 <210> 149 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 149 gagaactaca aatatggttt 20 <210> 150 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 150 aggacacttc aactgtccag 20 <210> 151 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 151 gccgtcctcc tcggaacgca 20 <210> 152 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 152 gctagccttg cgttccgagg 20 <210> 153 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 153 gcgttccgag gaggacggcc 20 <210> 154 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 154 gccttgcgtt ccgaggagga 20 <210> 155 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 155 ggacgaggac ggcgactacg 20 <210> 156 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide 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<210> 175 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 175 ggcttcctgg tgaagatgag 20 <210> 176 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 176 cacctacgtg gtggtgctga 20 <210> 177 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 177 ctacgtggtg gtgctgaagg 20 <210> 178 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 178 atggaagaca tgcaggatct 20 <210> 179 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 179 agacatgcag gatcttggtg 20 <210> 180 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 180 ctcatcttca ccaggaagcc 20 <210> 181 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 181 ctcctcgatg tagtcgacat 20 <210> 182 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 182 tattcatccg cccggtaccg 20 <210> 183 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 183 tcctcgatgt agtcgacatg 20 <210> 184 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 184 cctcctcgat gtagtcgaca 20 <210> 185 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 185 gccccatgtc gactacatcg 20 <210> 186 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 186 ccatgtcgac tacatcgagg 20 <210> 187 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 187 ggggctggta ttcatccgcc 20 <210> 188 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 188 gtcgacatgg ggcaacttca 20 <210> 189 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 189 accaccggga aatcgagggc 20 <210> 190 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 190 gagtgaccac cgggaaatcg 20 <210> 191 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 191 agtgaccacc gggaaatcga 20 <210> 192 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 192 ccaccgggaa atcgagggca 20 <210> 193 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 193 gaagcgggtc ccgtcctcct 20 <210> 194 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 194 ctaggagata cacctccacc 20 <210> 195 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 195 cagcatacag agtgaccacc 20 <210> 196 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 196 aagcgggtcc cgtcctcctc 20 <210> 197 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 197 tgaccctgcc ctcgatttcc 20 <210> 198 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 198 cactctgtat gctggtgtct 20 <210> 199 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 199 ccctgccctc gatttcccgg 20 <210> 200 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 200 ccggtggtca ctctgtatgc 20 <210> 201 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 201 ggaaatcgag ggcagggtca 20 <210> 202 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 202 ccagcataca gagtgaccac 20 <210> 203 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 203 cttggcagtt gagcacgcgc 20 <210> 204 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 204 ctgcgcgtgc tcaactgcca 20 <210> 205 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 205 tgcgcgtgct caactgccaa 20 <210> 206 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 206 cgggatgccg gcgtggccaa 20 <210> 207 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 207 cgtgctcaac tgccaaggga 20 <210> 208 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 208 ccttggccac gccggcatcc 20 <210> 209 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 209 cagcggccgg gatgccggcg 20 <210> 210 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 210 ccgggatgcc ggcgtggcca 20 <210> 211 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 211 gtggtcagcg gccgggatgc 20 <210> 212 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 212 cgctgaccac ccctgccagg 20 <210> 213 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 213 ggcaggggtg gtcagcggcc 20 <210> 214 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 214 gtgctcaact gccaagggaa 20 <210> 215 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 215 tcatggcacc cacctggcag 20 <210> 216 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 216 tggcaggggt ggtcagcggc 20 <210> 217 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 217 gctgaccacc cctgccaggt 20 <210> 218 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 218 ggccgctgac cacccctgcc 20 <210> 219 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 219 ggcatcgtcc cggaagttgc 20 <210> 220 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 220 ggcttttccg aataaactcc 20 <210> 221 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 221 gtcccggaag ttgccggcag 20 <210> 222 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 222 cggctgtacc cacccgccag 20 <210> 223 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 223 gtcgtgctgg tcaccgctgc 20 <210> 224 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 224 agtagaggca ggcatcgtcc 20 <210> 225 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 225 tccgaataaa ctccaggcct 20 <210> 226 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 226 gtttattcgg aaaagccagc 20 <210> 227 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 227 gcggctgtac ccacccgcca 20 <210> 228 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 228 caccgctgcc ggcaacttcc 20 <210> 229 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 229 agccctcgcc aggcgctggc 20 <210> 230 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 230 caacgccgcc tgccagcgcc 20 <210> 231 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 231 gcacgacccc agccctcgcc 20 <210> 232 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 232 ccgcctgcca gcgcctggcg 20 <210> 233 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 233 tgccagcgcc tggcgagggc 20 <210> 234 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 234 tgctgctgcc cctggcgggt 20 <210> 235 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 235 tcaccgctgc cggcaacttc 20 <210> 236 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 236 ggcgagggct ggggtcgtgc 20 <210> 237 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 237 ttccgaataa actccaggcc 20 <210> 238 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 238 gtgctgctgc ccctggcggg 20 <210> 239 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 239 gccagcgcct ggcgagggct 20 <210> 240 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 240 cctcgccagg cgctggcagg 20 <210> 241 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 241 gagatacctg agtaactttc 20 <210> 242 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 242 acgtgggaga actacaaata 20 <210> 243 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 243 cgatgttgaa ttaatgtcca 20 <210> 244 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 244 cacaaaactt caatgaaacg 20 <210> 245 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 245 tacgaattga gttggaagac 20 <210> 246 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 246 ctatggagta tatcttctct 20 <210> 247 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 247 ccgcaccttg gcgcagcgg 19 <210> 248 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 248 agatacctga ataaccctc 19 <210> 249 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 249 gatacctgaa taaccctc 18 <210> 250 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 250 atacctgaat aaccctc 17 <210> 251 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 251 ggctgatgag gccgcacatg 20 <210> 252 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 252 cgcctgccag cgcctggcga 20 <210> 253 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 253 ggugcuagcc uugcguuccg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 254 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 254 ggugcuagcc uugcguuccg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 255 <211> 101 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 255 ggugcuagcc uugcguuccg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu u 101 <210> 256 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 256 ggugcuagcc uugcguuccg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 257 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 257 aagauaccug aauaacucuc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 258 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 258 gguggcucac cagcuccagc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 259 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 259 gcuuaccugu cuguggaagc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 260 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 260 ugcuuaccug ucuguggaag guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 261 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 261 uuggaaagac ggaggcagcc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 262 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 262 gaaagacgga ggcagccugg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 263 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 263 ucccaggccu ggaguuuauu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 264 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 264 agcaccuacc ucgggagctg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 265 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 265 cuuuccaggu caucacaguu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 266 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 266 ccuuuccagg ucaucacagu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 267 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 267 uuuccagguc aucacaguug guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 268 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 268 cuuaccugcc ccaugggugc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 269 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 269 uaaggcccaa gggggcaagc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 270 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 270 ccucuucacc ugcuccugag guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 271 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 271 gccucuucac cugcuccuga guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 272 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 272 uucaccugcu ccugaggggc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 273 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 273 ucaccugcuc cugaggggcc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 274 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 274 cccaggcugc agcucccacu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 275 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 275 ccccaggcug cagcucccac guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 276 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 276 gcaggugacc guggccugcg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 277 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 277 cuccuuuagg aggcuggugg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 278 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 278 uuuucaggag aauuuugguu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 279 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 279 cuuuucagga gaauuuuggu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 280 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 280 uaauuuggcc cuucgucuua guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 281 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 281 agacuuuguc cauaagacga guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 282 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 282 gacuuugucc auaagacgaa guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 283 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 283 agccaauggc cuccuucagu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 284 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 284 ucccaacuga aggaggccau guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 285 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 285 ggccuccuuc aguugggaca guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 286 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 286 gaccaugucc caacugaagg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 287 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 287 gccaauggcc uccuucaguu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 288 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 288 auugucuuga ucaauucugg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 289 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 289 auucuggagg aaauaacuag guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 290 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 290 ucuggguguu cuggaguuuc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 291 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 291 aacauagcaa aucuugauuu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 292 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 292 guagaauuuu uucuucuagg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 293 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 293 acuacaaguc aaaaaugaag guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 294 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 294 uauauugguc uuccacgguc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 295 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 295 caaagaccuu cuccagaccg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 296 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 296 ggucuuccac ggucuggaga guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 297 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 297 uuguuuauau uggucuucca guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 298 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 298 cuuuuauuug acuaugcugu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 299 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 299 aaagucugga uauagagagu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 300 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 300 guugguuuaa uuguuuauau guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 301 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 301 ugaugguaag acacuuuggu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 302 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 302 ggaguaguuc uuggugcucu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 303 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 303 aacaugaugg uaagacacuu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu 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60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 308 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 308 ggaagauaga gaaauuucug guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 309 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 309 uauuucauuc aacugaagaa guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 310 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 310 auuucauuca acugaagaaa guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 311 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 311 gucuacugug auguuauauc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 312 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 312 uaaauggugg uacauucagc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 313 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 313 uaucagguaa aaccugucua guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 314 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 314 uguaccacca uuuauaacag guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 315 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 315 uucaccucug uuauaaaugg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 316 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 316 aacagaggug aacauacaag guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 317 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 317 uugagaguug cugggucuga guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 318 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 318 ugaaaaacuu gagaguugcu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 319 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 319 uuaauucaac aucgaauaga guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 320 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 320 uuugggaggc uugaugguaa guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 321 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 321 cauuauauuc agguagucca guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 322 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 322 uugggaggcu ugaugguaag guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 323 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 323 uuuugggagg cuugauggua guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 324 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 324 acaaaacuuc aaugaaacgu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 325 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 325 uaugguuuug ggaggcuuga guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 326 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 326 acuacaaaua ugguuuuggg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 327 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 327 gagaacuaca aauaugguuu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 328 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 328 aggacacuuc aacuguccag guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 329 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 329 gccguccucc ucggaacgca guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 330 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 330 gcuagccuug cguuccgagg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 331 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 331 gcguuccgag gaggacggcc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 332 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 332 gccuugcguu ccgaggagga guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 333 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 333 ggacgaggac ggcgacuacg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 334 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 334 ggacggcgac uacgaggagc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 335 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 335 cguccucguc cuccugcgca guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 336 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 336 guccucgucc uccugcgcac guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 337 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 337 ccgucagcuc caggcggucc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 338 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 338 cgcccgugcg caggaggacg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu 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cuccuucagc accaccacgu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 351 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 351 gaguggcgac cugcuggagc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 352 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 352 gcgcacugcc cgccgccugc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 353 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 353 ggcuuccugg ugaagaugag guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 354 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 354 caccuacgug guggugcuga guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 355 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 355 cuacguggug gugcugaagg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 356 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 356 auggaagaca ugcaggaucu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 357 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 357 agacaugcag gaucuuggug guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 358 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 358 cucaucuuca ccaggaagcc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 359 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 359 cuccucgaug uagucgacau guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 360 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 360 uauucauccg cccgguaccg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 361 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 361 uccucgaugu agucgacaug guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 362 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 362 ccuccucgau guagucgaca guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 363 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 363 gccccauguc gacuacaucg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 364 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 364 ccaugucgac uacaucgagg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 365 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 365 ggggcuggua uucauccgcc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 366 <211> 100 <212> RNA 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polynucleotide <400> 389 guggucagcg gccgggaugc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 390 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 390 cgcugaccac cccugccagg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 391 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 391 ggcaggggug gucagcggcc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 392 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 392 gugcucaacu gccaagggaa guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 393 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 393 ucauggcacc caccuggcag guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 394 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 394 uggcaggggu ggucagcggc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 395 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 395 gcugaccacc ccugccaggu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 396 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 396 ggccgcugac caccccugcc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 397 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 397 ggcaucgucc cggaaguugc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 398 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 398 ggcuuuuccg aauaaacucc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 399 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 399 gucccggaag uugccggcag guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 400 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 400 cggcuguacc cacccgccag guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 401 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 401 gucgugcugg ucaccgcugc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 402 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 402 aguagaggca ggcaucgucc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 403 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 403 uccgaauaaa cuccaggccu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 404 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 404 guuuauucgg aaaagccagc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 405 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 405 gcggcuguac ccacccgcca guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 406 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 406 caccgcugcc ggcaacuucc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 407 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 407 agcccucgcc aggcgcuggc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 408 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 408 caacgccgcc ugccagcgcc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu 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ggugcuagcc uugcguuccg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 421 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 421 cccauaccuu ggagcaacgg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 422 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 422 gagauaccug aguaacuuuc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 423 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 423 acgugggaga acuacaaaua guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 424 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 424 cgauguugaa uuaaugucca guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 425 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 425 cacaaaacuu caaugaaacg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 426 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 426 uacgaauuga guuggaagac guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 427 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 427 cuauggagua uaucuucucu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 428 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 428 cccgcaccuu ggcgcagcgg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaacaac gggaaaccgu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 429 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 429 cccgcaccuu ggcgcagcgg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 430 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 430 cccgcaccuu ggcgcagcgg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 431 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 431 cccgcaccuu ggcgcagcgg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 432 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 432 cccgcaccuu ggcgcagcgg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 433 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 433 cccgcaccuu ggcgcagcgg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 434 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 434 cccgcaccuu ggcgcagcgg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 435 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 435 cccgcaccuu ggcgcagcgg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 436 <211> 102 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 436 cccgcaccuu ggcgcagcgg uuuuagagcu agaaauagca aguuaaaaua aggcuagucc 60 guuaucaacu ugaaaaagug gcaccgaguc ggugcuuuuu uu 102 <210> 437 <211> 99 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 437 ccgcaccuug gcgcagcggg uuuuagagcu agaaauagca aguuaaaaua aggcuagucc 60 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100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> modified_base <222> (10)..(10) <223> Inosine <400> 441 aagauaccun aauaacccuc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 442 <211> 99 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 442 agauaccuga auaacccucg uuuuagagcu agaaauagca aguuaaaaua aggcuagucc 60 guuaucaacu ugaaaaagug gcaccgaguc ggugcuuuu 99 <210> 443 <211> 98 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 443 gauaccugaa uaacccucgu uuuagagcua gaaauagcaa guuaaaauaa ggcuaguccg 60 uuaucaacuu gaaaaagugg caccgagucg gugcuuuu 98 <210> 444 <211> 97 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 444 auaccugaau aacccucguu uuagagcuag aaauagcaag uuaaaauaag 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guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uuu 103 <210> 449 <211> 103 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 449 ucagcuccag gcgguccugg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uuu 103 <210> 450 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 450 ucagcuccag gcgguccugg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 451 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 451 ucagcuccag gcgguccugg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 452 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 452 cgccugccag cgccuggcga guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 453 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 453 ctagcacctg ccccagcggt gg 22 <210> 454 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 454 tccctaccct ggcacagcag ggg 23 <210> 455 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 455 cccacactca gacgcagcga ggg 23 <210> 456 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 456 cccgcactgg agcagcaggg a 21 <210> 457 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 457 cttgcacctt ggtagcagct gggg 24 <210> 458 <211> 23 <212> DNA <213> 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Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 559 ccagcacctt ggcagcagca ccgg 24 <210> 560 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 560 tcccccactt ggcacagctg ggg 23 <210> 561 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 561 ccagcacagg gcgcagaggt gg 22 <210> 562 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 562 cccacccctt agcacagcaa tgg 23 <210> 563 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 563 cccacaccgt ggcccagagg tgg 23 <210> 564 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 564 ccagcacctg gcacagcata gg 22 <210> 565 <211> 23 <212> DNA 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DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 571 cccgcacctg gctcagaggg gt 22 <210> 572 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 572 accgcacctg gcccagtgga gg 22 <210> 573 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 573 cccacatcct ggcccagcag ggg 23 <210> 574 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 574 cctgcaccag gctcagtggg gg 22 <210> 575 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 575 cgagcacctt ggcagcagct gagg 24 <210> 576 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 576 accgcacctg gcccagagta gg 22 <210> 577 <211> 22 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Synthetic oligonucleotide <400> 630 cccgcactgg gtgcagcgga ag 22 <210> 631 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 631 gccgcacttg gcgcagctgt gg 22 <210> 632 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 632 ctaacacctt ggtgcagagg tgg 23 <210> 633 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 633 cctacaccat ggcgcagcgt cag 23 <210> 634 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 634 ccagcacctg gcacatcggt gg 22 <210> 635 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 635 cccgcacatg gtgcagtggc tg 22 <210> 636 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial 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Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 642 cccacacctg ccccagaggt gg 22 <210> 643 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 643 cccacagctg gcccagcagg gg 22 <210> 644 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 644 tcagcacctt ggcacagctg aag 23 <210> 645 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 645 acagcacctc ggtgcagcag aga 23 <210> 646 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 646 ccctcccatg gcgcagcttc gg 22 <210> 647 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 647 cccgcaccgg gcgcagcagc tg 22 <210> 648 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description 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Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 654 ctcccacctt aaagcagcgg tgg 23 <210> 655 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 655 accgcacctg gcccagagtg gg 22 <210> 656 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 656 cccccacctt ggcccagcgt tgg 23 <210> 657 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 657 gccacacctc gcacagcggt gg 22 <210> 658 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 658 accacacctt gctgcagagg agg 23 <210> 659 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 659 cccgcagagg gcgcagcggc tg 22 <210> 660 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 660 ccagcactgg ctcagcagag g 21 <210> 661 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 661 accgcacccg gcccagtgga gg 22 <210> 662 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 662 cctgcactca ggcgcagacg ggg 23 <210> 663 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 663 gctgcacctt ggcacagtgg agg 23 <210> 664 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 664 cccacaccca ggcccagagg agg 23 <210> 665 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 665 cctgcacctg cacagcaggg g 21 <210> 666 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence 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Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 755 tctataccta aatagtcctc agg 23 <210> 756 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 756 aaaataccag aataacccat tta 23 <210> 757 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 757 aagatatctg aataaactcc aaa 23 <210> 758 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 758 atgattatta aataaccctc aag 23 <210> 759 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 759 aagatccctg attaccattc cag 23 <210> 760 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 760 aagatacctg gctcaacctc atc 23 <210> 761 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 761 aatgtggctg aaaaagcctc tgg 23 <210> 762 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 762 aagataccta aacattccag tgg 23 <210> 763 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 763 aagagagctg gacaactcta agg 23 <210> 764 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 764 aagataggtc aataaccacc cgg 23 <210> 765 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 765 tagataactg aataaactct atgg 24 <210> 766 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 766 aagatgtatt attgaccctc tgg 23 <210> 767 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence 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Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 856 aagataccag gatggctctc tgc 23 <210> 857 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 857 caacaaccag aataacccac agg 23 <210> 858 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 858 aagattaaaa gaataaacct cagg 24 <210> 859 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 859 aacttacctg caaaaccatc tgg 23 <210> 860 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 860 aagatctgaa ttaccatcag t 21 <210> 861 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 861 gagatcctta acaaccctca ag 22 <210> 862 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> 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Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 951 ttgatacctg aataacactc cag 23 <210> 952 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 952 aaaaaaaatg aattaccctc atg 23 <210> 953 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 953 gagatccaga attacccttg gg 22 <210> 954 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 954 aacataccta aataactcct ggc 23 <210> 955 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 955 aatctacctg atgaccctcg gc 22 <210> 956 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 956 aagttaactg taaaacagcc tcagg 25 <210> 957 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 957 aagaaatctg aaagccctgg gg 22 <210> 958 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 958 gagatacctg cataacactt aat 23 <210> 959 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 959 cagataactg aacaaccaga tgg 23 <210> 960 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 960 aacttaggtg attaaccctc acg 23 <210> 961 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 961 atgatactga ataagtctca gg 22 <210> 962 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 962 agaataccta gtgaccctca gg 22 <210> 963 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> 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Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1022 aaattaactg cataaccctg ggt 23 <210> 1023 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1023 aaaaaacttg aattaccttc tag 23 <210> 1024 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1024 ctgaaaccta aataatcccc cgg 23 <210> 1025 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1025 aagacccagg aatcacactc tgg 23 <210> 1026 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1026 agaagacctg aataccccca gg 22 <210> 1027 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1027 caaataccta aagaactctc ctg 23 <210> 1028 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1028 cctataccta ataaccttca gg 22 <210> 1029 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1029 aagatacctg gaaaactccc aaa 23 <210> 1030 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1030 tagacaccta ataatcccca gg 22 <210> 1031 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1031 gtgatacctg tcagaccctc ggg 23 <210> 1032 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1032 aagataccag aattcccctc ttc 23 <210> 1033 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1033 aagatggctg agaaaaactc agg 23 <210> 1034 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial 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<400> 1057 aagaaggtga ataacactta gg 22 <210> 1058 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1058 aagatacctg gctagccata tgc 23 <210> 1059 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1059 aagctaccag aggaacaatc agg 23 <210> 1060 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1060 catttactga ataacccttt gg 22 <210> 1061 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1061 gataaacatg aaggaccctc agg 23 <210> 1062 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1062 aacgtacctg aacaaccctc agg 23 <210> 1063 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1063 acactacctg aatgaccctc aag 23 <210> 1064 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1064 aatatacatg aaacacactt agg 23 <210> 1065 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1065 aagataccta aatgtccatc aac 23 <210> 1066 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1066 cagatatgaa taaacctcta g 21 <210> 1067 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1067 aatagtactc aataaacctc tgg 23 <210> 1068 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1068 agtatacatg aatagccctc agg 23 <210> 1069 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1069 ttgctacctg aataaccctc ttg 23 <210> 1070 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1070 aagatatctg aggaagcgtc ttg 23 <210> 1071 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1071 aagatacctg aaaccctctg g 21 <210> 1072 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1072 cagatattga aaaaccctct gg 22 <210> 1073 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1073 aaggtatcca aataaccctt tgg 23 <210> 1074 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1074 taaatacctg aacaactcta ggg 23 <210> 1075 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> 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oligonucleotide <400> 1104 gagacacctg aataagtgtc tgg 23 <210> 1105 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1105 aagctagtga aaaaccatca gg 22 <210> 1106 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1106 aggatacttg aatatccctg cct 23 <210> 1107 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1107 cagatactga aaaacactct gg 22 <210> 1108 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1108 aagaaatctg gataaccccc aat 23 <210> 1109 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1109 aacataccca aaaaaacctc tga 23 <210> 1110 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1110 aaaatatcca aataaccccc tgg 23 <210> 1111 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1111 aagatatctg aataatcatc agg 23 <210> 1112 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1112 aagatactga gtaacactga ag 22 <210> 1113 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1113 aagttaccta aataactttg g 21 <210> 1114 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1114 accataattg attaactctc tgg 23 <210> 1115 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1115 aagaaaccta agtaaacctc taa 23 <210> 1116 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1116 aagatacatc atcaccctcc tg 22 <210> 1117 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1117 aagacacata aggaaccctc atg 23 <210> 1118 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1118 gagatacctg agctgccctc agc 23 <210> 1119 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1119 gagataccta aataaccttc cag 23 <210> 1120 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1120 aagatacgaa taatcctccg a 21 <210> 1121 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1121 attaaaccaa aataaccctc ggg 23 <210> 1122 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1122 cacaaacctt aataaccctc aag 23 <210> 1123 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1123 aagataaaaa aataccccta ggg 23 <210> 1124 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1124 aagatatctg aaaaagtctt gag 23 <210> 1125 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1125 gagataactg aataaccatt tgg 23 <210> 1126 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1126 aagatatctg taaaaccctt cag 23 <210> 1127 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1127 aacatacatg aaaaatcctc aac 23 <210> 1128 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1128 aaggtaactg gatagccatc tgc 23 <210> 1129 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1129 aagagacctg agtcaccctg tct 23 <210> 1130 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1130 aagataaatg aatttccttc tgt 23 <210> 1131 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1131 aagatacggg aaatcccctt tgg 23 <210> 1132 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1132 cagatatcag ataaccctat gg 22 <210> 1133 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1133 cagatgcttg taaaaccatc agg 23 <210> 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Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1157 aaaacacctg aaaaatcctc cac 23 <210> 1158 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1158 aagaaacact gaatgtccct cttg 24 <210> 1159 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1159 gtgaaaccta aataaccctc aga 23 <210> 1160 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1160 aatataccag aatagttctc agt 23 <210> 1161 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1161 aagatactga atattcctca gg 22 <210> 1162 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1162 gagatacttg aataaccatc tca 23 <210> 1163 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1163 aaagtacatt aaaaaccttc tgg 23 <210> 1164 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1164 aagataattg aatagccatc tta 23 <210> 1165 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1165 aacaaacccg taaaaccctc acg 23 <210> 1166 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1166 aagatagtta aatatccccc tgt 23 <210> 1167 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1167 aagataataa ataaccctca ag 22 <210> 1168 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1168 aagctacttg ataaccctat gg 22 <210> 1169 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1169 attatacctg aatccctcag g 21 <210> 1170 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1170 aagttatcct aataacccta tgg 23 <210> 1171 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1171 atgtttactg aatacccctc tgg 23 <210> 1172 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1172 aagggacctg aaattccctg agg 23 <210> 1173 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1173 tagataacag aatgactcac agg 23 <210> 1174 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1174 aagattctga atagacccca gg 22 <210> 1175 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1175 aacataccca aatactctca gg 22 <210> 1176 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1176 aagatacctc aataagactc ggg 23 <210> 1177 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1177 tagatactga aaatctctca gg 22 <210> 1178 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1178 agaatacaag aataaccctg ggg 23 <210> 1179 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1179 aagatacctg aaattcctgc aga 23 <210> 1180 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1180 ctggtactta ataaccctca gg 22 <210> 1181 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oligonucleotide <400> 1198 aaaattagtg gataaacctc tgg 23 <210> 1199 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1199 aagatcctga agaattctct ga 22 <210> 1200 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1200 agaatacctg aacaacactc tag 23 <210> 1201 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1201 attaaacctg aaaccctcag g 21 <210> 1202 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1202 aagatagcta aataacctct ga 22 <210> 1203 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1203 gagacaactg attatccctc aag 23 <210> 1204 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1204 aatttaccag aatagccctc tga 23 <210> 1205 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1205 aagatactga aataccccta tgg 23 <210> 1206 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1206 aaggtaaatg agtaatcctt tgg 23 <210> 1207 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1207 aagattactt gaagaagcct ctga 24 <210> 1208 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1208 aaagtagctg aataaacctc aag 23 <210> 1209 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1209 aagataactg aaatgccttc gag 23 <210> 1210 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1210 actattcctg aataaccctt tgg 23 <210> 1211 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1211 aacatcctga atcaacctct gc 22 <210> 1212 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1212 gaaatactga gtacccctca gg 22 <210> 1213 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1213 tagatctaga ataagcctct gg 22 <210> 1214 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1214 aagataccca aataaccatc aga 23 <210> 1215 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1215 aagacagcta actaactctc ggg 23 <210> 1216 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1216 aaagtagctg aacagccctc agg 23 <210> 1217 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1217 aagatacctc attaatcatc aca 23 <210> 1218 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1218 aagatatgga atcaacctca gg 22 <210> 1219 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1219 aagataccta ataaccacag gg 22 <210> 1220 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1220 acagcacctg aatcacactc tgg 23 <210> 1221 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1221 aagatacaaa aacaaccgac tgg 23 <210> 1222 <211> 22 <212> DNA 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Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1251 taattaccag aataacccta tga 23 <210> 1252 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1252 aagatacctg aaatacctgg gt 22 <210> 1253 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1253 aaggtacctg agtaaacatt ctg 23 <210> 1254 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1254 aagatacatg aatgaattca gg 22 <210> 1255 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1255 cagataccta agaaccctga cg 22 <210> 1256 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1256 agtataacag aataacccta tgt 23 <210> 1257 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> 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Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1263 aagatacttg aataaccatt tca 23 <210> 1264 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1264 tgcttacatg aataaccctc cag 23 <210> 1265 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1265 tctgtacctg gataaccccc tgg 23 <210> 1266 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1266 aaggtaactg acaaaccatc tga 23 <210> 1267 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1267 aaaataaatg aataaaactg tgg 23 <210> 1268 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1268 aagtcaccag tttaacactc agg 23 <210> 1269 <211> 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oligonucleotide <400> 1286 aagctatctg agaaaccctt ttg 23 <210> 1287 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1287 cagataccta ataaccacac gg 22 <210> 1288 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1288 aagatacctg aaattatttc agg 23 <210> 1289 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1289 ttgataccta aataccctgt gg 22 <210> 1290 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1290 taaatacatg aataatcctc ggg 23 <210> 1291 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1291 aattaaccta cataaccctc agt 23 <210> 1292 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1292 aagattctta aataacccac ttt 23 <210> 1293 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1293 aagatttaag aatgaacctc agg 23 <210> 1294 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1294 tggatacctg tcaaccctct gg 22 <210> 1295 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1295 aagatccgtg aataaaccac agc 23 <210> 1296 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1296 aacatacacg aatacctcac agg 23 <210> 1297 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1297 aagatgataa acaaccctct gg 22 <210> 1298 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1298 tagatcctaa ttaaccctca ga 22 <210> 1299 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1299 aagatacagg tgtagccctc ctg 23 <210> 1300 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1300 ctgatatgtg aaaaacccta agg 23 <210> 1301 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1301 aacatactga accagcctct gg 22 <210> 1302 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1302 aagacacgag aagaaccttc tga 23 <210> 1303 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1303 aagacacttg aataccactc ttt 23 <210> 1304 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial 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Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1345 aagattcagc aataccctct gg 22 <210> 1346 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1346 caaaaaccag aaaaccctca gg 22 <210> 1347 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1347 catataccaa aataacccat ggg 23 <210> 1348 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1348 aaaatacaaa taaccctcag a 21 <210> 1349 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1349 aaaatacctg aataaacctg aag 23 <210> 1350 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1350 aagataactt aataggcctc cac 23 <210> 1351 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial 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DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1357 aagatgcctg agtctccccc gtg 23 <210> 1358 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1358 aaggaaactg aataaccctc aga 23 <210> 1359 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1359 ctgagaactg aataaacctc gag 23 <210> 1360 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1360 aaggttacag aataaaactc tgg 23 <210> 1361 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1361 caggatactg aataaccctc aga 23 <210> 1362 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1362 ccattacatg aataaccttc agg 23 <210> 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23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1451 aagatacatt cttagccctc aag 23 <210> 1452 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1452 aagaaacctt gtgaaccctc agt 23 <210> 1453 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1453 aagaaatgga tagccctctg g 21 <210> 1454 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1454 aaaatagctt aaaaagcctg tgg 23 <210> 1455 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1455 agggtgcccc aacaaccctc ggg 23 <210> 1456 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1456 aagaaatgtg ggtaagcctc agg 23 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<400> 1468 aagacacttg tctagtcctc tgg 23 <210> 1469 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1469 aagaatccgg aaaaacccta tgc 23 <210> 1470 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1470 aagacagctg gagaactctc agg 23 <210> 1471 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1471 aagaaaaatg aacaaacctc aga 23 <210> 1472 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1472 aagttacgtg aataggactc agt 23 <210> 1473 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1473 aagataaaga acaactctct gg 22 <210> 1474 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1474 cagatacaca gataaccccc agg 23 <210> 1475 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1475 aagaaacttg aaaaatccca gg 22 <210> 1476 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1476 cagataacag aaaaaccctg ttg 23 <210> 1477 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1477 aagataccca gatccccctc cag 23 <210> 1478 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1478 tagatattct gaatatacct ctgg 24 <210> 1479 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1479 cagatacatg aaataatcct ccag 24 <210> 1480 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1480 agtcatcctg aataaccctc atg 23 <210> 1481 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1481 gccataccaa ataaccctct gg 22 <210> 1482 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1482 aagatacctg gataagcaac tgc 23 <210> 1483 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1483 aagaaaccta tagaaccctg agt 23 <210> 1484 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1484 aagaaaacag aataaacctc taa 23 <210> 1485 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1485 aagatacctt atcaacccta aag 23 <210> 1486 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> 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oligonucleotide <400> 1515 aagatacttt attaactctc aag 23 <210> 1516 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1516 tagatatgtg aattaacttc tgg 23 <210> 1517 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1517 aagatacctg atcacacatc aga 23 <210> 1518 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1518 cagatacctc aataaccctg atg 23 <210> 1519 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1519 aagatacttg gataatgctt ggt 23 <210> 1520 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1520 aaggtatctg aattaccctc aag 23 <210> 1521 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1521 ctgagacctg agtaactctc atg 23 <210> 1522 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1522 aagaaaatga ataaccctac ag 22 <210> 1523 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1523 tagatacatg aaaaaccctt cag 23 <210> 1524 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1524 tagatgctta aatgaccctc tgc 23 <210> 1525 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1525 taggatcctg gataaccctc cag 23 <210> 1526 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1526 ttgatacttg aataaccatc tga 23 <210> 1527 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1527 aagaaaccaa taaccctcag g 21 <210> 1528 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1528 aaggaaccag aattactctc agt 23 <210> 1529 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1529 cagaaaccag aataaccttc agg 23 <210> 1530 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1530 aaaattcctg aatagctctc tgg 23 <210> 1531 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1531 atgatagtga ataacactca tg 22 <210> 1532 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1532 aggatacaga atatccatct gg 22 <210> 1533 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial 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<400> 1556 tagacacctg aacaacccca ggc 23 <210> 1557 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1557 aagacacctg gctgacccca gg 22 <210> 1558 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1558 aagacacctg agcaacctca gg 22 <210> 1559 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1559 aagatatctg agcaacactc tgt 23 <210> 1560 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1560 gagatatgtg aataaaactc tga 23 <210> 1561 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1561 cagaagctga atgacccttt gg 22 <210> 1562 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1562 aaaataactg ataaatcctc tga 23 <210> 1563 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1563 aagctcctgc atagcccaca gg 22 <210> 1564 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1564 aacataccta aatataccct gg 22 <210> 1565 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1565 tagatacctg actttcccac ttg 23 <210> 1566 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1566 aagattcctg aagcctcctc aga 23 <210> 1567 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1567 catatactga ataaccatct gg 22 <210> 1568 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1568 aagatatctg aaatgcccta gag 23 <210> 1569 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1569 aaatagcctg aataacccta gtg 23 <210> 1570 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1570 aacaaacatg aataacacta agc 23 <210> 1571 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1571 aagaaatctg acaaaccttt agg 23 <210> 1572 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1572 aagatccaga agaactctct ga 22 <210> 1573 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1573 tagataccta aatagcccat ggg 23 <210> 1574 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1574 aagaaacctc tataagcctc tta 23 <210> 1575 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1575 aatctactga ataactctca gg 22 <210> 1576 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1576 atgaatactg aataacattc agg 23 <210> 1577 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1577 aagataccaa taaccctcaa a 21 <210> 1578 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1578 aatgtacccg aacaaccctc agg 23 <210> 1579 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1579 cagatagctg aaagaacact cagg 24 <210> 1580 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial 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Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1624 caauggccuc cuucaguugu uuuagagcua gaaauagcaa guuaaaauaa ggcuaguccg 60 uuaucaacuu gaaaaagugg caccgagucg gugcuuuu 98 <210> 1625 <211> 98 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1625 caauggccuc cuucaguugu uuuagagcua gaaauagcaa guuaaaauaa ggcuaguccg 60 uuaucaacuu gaaaaagugg caccgagucg gugcuuuu 98 <210> 1626 <211> 97 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1626 aauggccucc uucaguuguu uuagagcuag aaauagcaag uuaaaauaag gcuaguccgu 60 uaucaacuug aaaaaguggc accgagucgg ugcuuuu 97 <210> 1627 <211> 97 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1627 aauggccucc uucaguuguu uuagagcuag aaauagcaag uuaaaauaag gcuaguccgu 60 uaucaacuug aaaaaguggc accgagucgg ugcuuuu 97 <210> 1628 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> 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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1634 gcgaauggcc uccugcagcu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 1635 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1635 agcccuucaa cacaagguca guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 1636 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1636 uaagaccaug ucccaacuga guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 1637 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1637 caaugucccc aaugcaaucc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 1638 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1638 uuguuuuccg ggauugcauu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 1639 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1639 uuuguuuucc gggauugcau guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 1640 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1640 aaucccggaa aacaaagauu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 1641 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1641 uguuuuccgg gauugcauug guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 1642 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1642 cccauaccuu ggagcaacgg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 1643 <211> 103 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1643 cccauaccuu ggagcaacgg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uuu 103 <210> 1644 <211> 103 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1644 cccauaccuu ggagcaacgg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uuu 103 <210> 1645 <211> 103 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1645 cccauaccuu ggagcaacgg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uuu 103 <210> 1646 <211> 103 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1646 cccauaccuu ggagcaacgg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uuu 103 <210> 1647 <211> 103 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1647 cccauaccuu ggagcaacgg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uuu 103 <210> 1648 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1648 cccgcaccuu ggcgcagcgg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 1649 <211> 108 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1649 cccgcaccuu ggcgcagcgg guuuuagagu uuuagagcua gaaauagcaa guuaaaauaa 60 ggcuaguccg uuaucaacuu gaaaaagugg caccgagucg gugcuuuu 108 <210> 1650 <211> 99 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1650 agauaccuga auaacccucg uuuuagagcu agaaauagca aguuaaaaua aggcuagucc 60 guuaucaacu ugaaaaagug gcaccgaguc ggugcuuuu 99 <210> 1651 <211> 98 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1651 gauaccugaa uaacccucgu uuuagagcua gaaauagcaa guuaaaauaa ggcuaguccg 60 uuaucaacuu gaaaaagugg caccgagucg gugcuuuu 98 <210> 1652 <211> 98 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1652 gauaccugaa uaacucucgu uuuagagcua gaaauagcaa guuaaaauaa ggcuaguccg 60 uuaucaacuu gaaaaagugg caccgagucg gugcuuuu 98 <210> 1653 <211> 97 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1653 auaccugaau aacucucguu uuagagcuag aaauagcaag uuaaaauaag gcuaguccgu 60 uaucaacuug aaaaaguggc accgagucgg ugcuuuu 97 <210> 1654 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> modified_base <222> (6)..(6) <223> Nebularine <400> 1654 aagaunccug aauaacccuc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 1655 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> modified_base <222> (6)..(6) <223> Nebularine <220> <221> modified_base <222> (11)..(11) <223> Nebularine <400> 1655 aagaunccug nauaacccuc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 1656 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> modified_base <222> (6)..(6) <223> Nebularine <220> <221> modified_base <222> (15)..(15) <223> Nebularine <400> 1656 aagaunccug aauancccuc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 1657 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> modified_base <222> (6)..(6) <223> Nebularine <220> <221> modified_base <222> (11)..(11) <223> Nebularine <220> <221> modified_base <222> (14)..(14) <223> Nebularine <400> 1657 aagaunccug naunacccuc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 1658 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> modified_base <222> (4)..(4) <223> Nebularine <220> <221> 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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1664 cagguuccau gggaugcucu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 1665 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1665 cccauaccuu ggagcaacgg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 1666 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1666 gagauaccug aguaacuuuc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 1667 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1667 cagguuccau gggaugcucu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 1668 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1668 cagguuccau gggaugcucu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 1669 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1669 cccauaccuu ggagcaacgg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 1670 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1670 gagauaccug aguaacuuuc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 1671 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1671 cagguuccau gggaugcucu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 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uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 1676 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1676 cccauaccuu ggagcaacgg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 1677 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1677 gagauaccug aguaacuuuc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 1678 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1678 cagguuccau gggaugcucu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 1679 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1679 cagguuccau gggaugcucu guuuuagagc uagaaauagc 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aguaacuuuc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 1684 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1684 cagguuccau gggaugcucu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 1685 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1685 cccauaccuu ggagcaacgg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 1686 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1686 gagauaccug aguaacuuuc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 1687 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1687 cagguuccau gggaugcucu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 1688 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1688 cagguuccau gggaugcucu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 1689 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1689 cccauaccuu ggagcaacgg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 1690 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1690 gagauaccug aguaacuuuc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 1691 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1691 cagguuccau gggaugcucu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 1692 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1692 cagguuccau gggaugcucu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 1693 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1693 cccauaccuu ggagcaacgg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 1694 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1694 gagauaccug aguaacuuuc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 1695 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1695 cagguuccau gggaugcucu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 1696 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1696 cccauaccuu ggagcaacgg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 1697 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1697 gagauaccug aguaacuuuc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 1698 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1698 cagguuccau gggaugcucu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 1699 <211> 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cagguuccau gggaugcucu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uuu 103 <210> 1749 <211> 103 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1749 cagguuccau gggaugcucu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uuu 103 <210> 1750 <211> 103 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1750 gagauaccug aguaacuuuc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uuu 103 <210> 1751 <211> 103 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1751 gagauaccug aguaacuuuc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uuu 103 <210> 1752 <211> 103 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1752 cagguuccau gggaugcucu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uuu 103 <210> 1753 <211> 103 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1753 gagauaccug aguaacuuuc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uuu 103 <210> 1754 <211> 103 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1754 cagguuccau gggaugcucu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uuu 103 <210> 1755 <211> 103 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1755 cccauaccuu ggagcaacgg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uuu 103 <210> 1756 <211> 103 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1756 gagauaccug aguaacuuuc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uuu 103 <210> 1757 <211> 103 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1757 cagguuccau gggaugcucu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uuu 103 <210> 1758 <211> 103 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1758 gagauaccug aguaacuuuc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uuu 103 <210> 1759 <211> 103 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1759 cagguuccau gggaugcucu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu 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<213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> modified_base <222> (101)..(103) <223> a, c, u, g, unknown or other <400> 1803 gagauaccug aguaacuuuc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu nnn 103 <210> 1804 <211> 103 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> modified_base <222> (101)..(103) <223> a, c, u, g, unknown or other <400> 1804 cagguuccau gggaugcucu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu nnn 103 <210> 1805 <211> 103 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> modified_base <222> (101)..(103) <223> a, c, u, g, unknown or other <400> 1805 cccauaccuu ggagcaacgg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu nnn 103 <210> 1806 <211> 103 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> modified_base <222> (101)..(103) <223> a, c, u, g, unknown or other <400> 1806 gagauaccug aguaacuuuc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu nnn 103 <210> 1807 <211> 103 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> modified_base <222> (101)..(103) <223> a, c, u, g, unknown or other <400> 1807 cagguuccau gggaugcucu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu nnn 103 <210> 1808 <211> 103 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> modified_base <222> (101)..(103) <223> a, c, u, g, unknown or other <400> 1808 cccauaccuu ggagcaacgg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu 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<223> a, c, u, g, unknown or other <400> 1823 gagauaccug aguaacuuuc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu nnn 103 <210> 1824 <211> 103 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> modified_base <222> (101)..(103) <223> a, c, u, g, unknown or other <400> 1824 cccauaccuu ggagcaacgg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu nnn 103 <210> 1825 <211> 103 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> modified_base <222> (101)..(103) <223> a, c, u, g, unknown or other <400> 1825 gagauaccug aguaacuuuc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu nnn 103 <210> 1826 <211> 103 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> modified_base <222> (101)..(103) <223> a, c, u, g, unknown or other <400> 1826 cagguuccau gggaugcucu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu nnn 103 <210> 1827 <211> 103 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> modified_base <222> (101)..(103) <223> a, c, u, g, unknown or other <400> 1827 cccauaccuu ggagcaacgg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu nnn 103 <210> 1828 <211> 103 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> modified_base <222> (101)..(103) <223> a, c, u, g, unknown or other <400> 1828 gagauaccug aguaacuuuc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu nnn 103 <210> 1829 <211> 103 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> modified_base <222> (101)..(103) <223> a, c, u, g, unknown or other <400> 1829 cagguuccau gggaugcucu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu nnn 103 <210> 1830 <211> 103 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> modified_base <222> (101)..(103) <223> a, c, u, g, unknown or other <400> 1830 cccauaccuu ggagcaacgg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu nnn 103 <210> 1831 <211> 103 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> modified_base <222> (101)..(103) <223> a, c, u, g, unknown or other <400> 1831 gagauaccug aguaacuuuc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu nnn 103 <210> 1832 <211> 103 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> modified_base <222> (101)..(103) <223> a, c, u, g, unknown or other <400> 1832 cagguuccau gggaugcucu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu nnn 103 <210> 1833 <211> 103 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> modified_base <222> (101)..(103) <223> a, c, u, g, unknown or other <400> 1833 cccauaccuu ggagcaacgg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu nnn 103 <210> 1834 <211> 103 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> modified_base <222> (101)..(103) <223> a, c, u, g, unknown or other <400> 1834 gagauaccug aguaacuuuc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu nnn 103 <210> 1835 <211> 103 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> modified_base <222> (101)..(103) <223> a, c, u, g, unknown or other <400> 1835 cagguuccau gggaugcucu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu nnn 103 <210> 1836 <211> 103 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> modified_base <222> (101)..(103) <223> a, c, u, g, unknown or other <400> 1836 cccauaccuu ggagcaacgg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu nnn 103 <210> 1837 <211> 103 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> modified_base <222> (101)..(103) <223> a, c, u, g, unknown or other <400> 1837 gagauaccug aguaacuuuc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu nnn 103 <210> 1838 <211> 103 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> modified_base <222> (101)..(103) <223> a, c, u, g, unknown or other <400> 1838 cagguuccau gggaugcucu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu nnn 103 <210> 1839 <211> 103 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> modified_base <222> (101)..(103) <223> a, c, u, g, unknown or other <400> 1839 cccauaccuu ggagcaacgg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu nnn 103 <210> 1840 <211> 103 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> modified_base <222> (101)..(103) <223> a, c, u, g, unknown or other <400> 1840 gagauaccug aguaacuuuc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu nnn 103 <210> 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cggugcuuuu nnn 103 <210> 1844 <211> 102 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> modified_base <222> (100)..(102) <223> a, c, u, g, unknown or other <400> 1844 gaauaccuga guaacuuucg uuuuagagcu agaaauagca aguuaaaaua aggcuagucc 60 guuaucaacu ugaaaaagug gcaccgaguc ggugcuuuun nn 102 <210> 1845 <211> 103 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> modified_base <222> (101)..(103) <223> a, c, u, g, unknown or other <400> 1845 cagguuccau gggaugcucu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu nnn 103 <210> 1846 <211> 103 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> modified_base <222> (101)..(103) <223> a, c, u, g, unknown or other <400> 1846 cagguuccau gggaugcucu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu nnn 103 <210> 1847 <211> 103 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> modified_base <222> (101)..(103) <223> a, c, u, g, unknown or other <400> 1847 cagguuccau gggaugcucu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu nnn 103 <210> 1848 <211> 103 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> modified_base <222> (101)..(103) <223> a, c, u, g, unknown or other <400> 1848 cccauaccuu ggagcaacgg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu nnn 103 <210> 1849 <211> 103 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> modified_base <222> (101)..(103) <223> a, c, u, g, unknown or other <400> 1849 gagauaccug aguaacuuuc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu nnn 103 <210> 1850 <211> 103 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> modified_base <222> (101)..(103) <223> a, c, u, g, unknown or other <400> 1850 cccauaccuu ggagcaacgg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu nnn 103 <210> 1851 <211> 103 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> modified_base <222> (101)..(103) <223> a, c, u, g, unknown or other <400> 1851 gagauaccug aguaacuuuc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu nnn 103 <210> 1852 <211> 103 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> modified_base <222> (101)..(103) <223> a, c, u, g, unknown or other <400> 1852 cagguuccau 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Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> modified_base <222> (101)..(103) <223> a, c, u, g, unknown or other <400> 1867 cagguuccau gggaugcucu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu nnn 103 <210> 1868 <211> 103 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> modified_base <222> (101)..(103) <223> a, c, u, g, unknown or other <400> 1868 cccauaccuu ggagcaacgg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu nnn 103 <210> 1869 <211> 103 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> modified_base <222> (101)..(103) <223> a, c, u, g, unknown or other <400> 1869 gagauaccug aguaacuuuc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu nnn 103 <210> 1870 <211> 103 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> modified_base <222> (101)..(103) <223> a, c, u, g, unknown or other <400> 1870 cagguuccau gggaugcucu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu nnn 103 <210> 1871 <211> 103 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> modified_base <222> (101)..(103) <223> a, c, u, g, unknown or other <400> 1871 cagguuccau gggaugcucu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu nnn 103 <210> 1872 <211> 103 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> modified_base <222> (101)..(103) <223> a, c, u, g, unknown or other <400> 1872 cagguuccau gggaugcucu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu nnn 103 <210> 1873 <211> 103 <212> RNA 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Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> modified_base <222> (14)..(14) <223> Nebularine <400> 2059 cagguuccau gggnugcucu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 2060 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> modified_base <222> (34)..(34) <223> Nebularine <400> 2060 cagguuccau gggaugcucu guuuuagagc uagnaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 2061 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> modified_base <222> (34)..(34) <223> Nebularine <220> <221> modified_base <222> (57)..(57) <223> Nebularine <400> 2061 cagguuccau gggaugcucu guuuuagagc uagnaauagc aaguuaaaau aaggcunguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 2062 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 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oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (101)..(103) <223> Nebularine <400> 2121 cagguuccau gggaugcucu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu nnn 103 <210> 2122 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 2122 gccaauggcc uccuucaguu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 2123 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 2123 gcaaaucuug auuuuggcuc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 2124 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 2124 gauguaaaaa uuuuagccaa guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 2125 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 2125 augaaaaacu ugagaguugc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 2126 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 2126 acuugggauc acaaagcaaa guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 2127 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 2127 aagauuuggu guuuucuacu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 2128 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 2128 aaggaguacc cggggcugca guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 2129 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 2129 cagaggccag gagcgccagg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 2130 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 2130 agaggccagg agcgccagga guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 2131 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 2131 cucggccucu gaagcuccug guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 2132 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 2132 cagguuccau gggaugcucu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 2133 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 2133 cagguuccau gggaugcucu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 2134 <211> 99 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2134 cagcuccagg cgguccuggg uuuuagagcu agaaauagca aguuaaaaua aggcuagucc 60 guuaucaacu ugaaaaagug gcaccgaguc ggugcuuuu 99 <210> 2135 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 2135 ucagcuccag gcgguccugg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 2136 <211> 4929 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 2136 augagcgagg uggaguucag ccacgaguac uggaugcggc acgcccugac ccuggccaag 60 cgggcccggg acgagcggga ggugcccgug ggcgccgugc uggugcugaa caaccgggug 120 aucggcgagg gcuggaaccg ggccaucggc cugcacgacc ccaccgccca cgccgagauc 180 auggcccugc ggcagggcgg ccuggugaug cagaacuacc ggcugaucga cgccacccug 240 uacgugaccu ucgagcccug cgugaugugc gccggcgcca ugauccacag ccggaucggc 300 cggguggugu ucggcgugcg gaacgccaag accggcgccg ccggcagccu gauggacgug 360 cugcaccacc ccggcaugaa ccaccgggug gagaucaccg agggcauccu ggccgacgag 420 ugcgccgccc ugcugugccg guucuuccgg augccccggc ggguguucaa cgcccagaag 480 aaggcccaga gcagcaccga caggaaauaa gagagaaaag aagaguaaga agaaauauaa 540 gagccaccag cggcggcagc agcggcggca gcagcggcag cgagacaccc ggcaccagcg 600 agagcgccac ccccgagagc agcggcggca gcagcggcgg cagcgacaag aaguacagca 660 ucggccuggc caucggcacc aacagcgugg gcugggccgu gaucaccgac gaguacaagg 720 ugcccagcaa gaaguucaag gugcugggca acaccgaccg gcacagcauc aagaagaacc 780 ugaucggcgc ccugcuguuc gacagcggcg agacagccga ggccacccgg cugaagcgga 840 ccgcccggcg gcgguacacc cggcggaaga accggaucug cuaccugcag gagaucuuca 900 gcaacgagau ggccaaggug gacgacagcu ucuuccaccg gcuggaggag agcuuccugg 960 uggaggagga caagaagcac gagcggcacc ccaucuucgg caacaucgug gacgaggugg 1020 ccuaccacga gaaguacccc accaucuacc accugcggaa gaagcuggug gacagcaccg 1080 acaaggccga ccugcggcug aucuaccugg cccuggccca caugaucaag uuccggggcc 1140 acuuccugau cgagggcgac cugaaccccg acaacagcga cguggacaag cuguucaucc 1200 agcuggugca gaccuacaac cagcuguucg aggagaaccc caucaacgcc agcggcgugg 1260 acgccaaggc cauccugagc gcccggcuga gcaagagccg gcggcuggag aaccugaucg 1320 cccagcugcc cggcgagaag aagaacggcc uguucggcaa ccugaucgcc cugagccugg 1380 gccugacccc caacuucaag agcaacuucg accuggccga ggacgccaag cugcagcuga 1440 gcaaggacac cuacgacgac gaccuggaca accugcuggc ccagaucggc gaccaguacg 1500 ccgaccuguu ccuggccgcc aagaaccuga gcgacgccau ccugcugagc gacauccugc 1560 gggugaacac cgagaucacc aaggcccccc ugagcgccag caugaucaag cgguacgacg 1620 agcaccacca ggaccugacc cugcugaagg cccuggugcg gcagcagcug cccgagaagu 1680 acaaggagau cuucuucgac cagagcaaga acggcuacgc cggcuacauc gacggcggcg 1740 ccagccagga ggaguucuac aaguucauca agcccauccu ggagaagaug gacggcaccg 1800 aggagcugcu ggugaagcug aaccgggagg accugcugcg gaagcagcgg accuucgaca 1860 acggcagcau cccccaccag auccaccugg gcgagcugca cgccauccug cggcggcagg 1920 aggacuucua ccccuuccug aaggacaacc gggagaagau cgagaagauc cugaccuucc 1980 ggauccccua cuacgugggc ccccuggccc ggggcaacag ccgguucgcc uggaugaccc 2040 gcaagagcga ggagacaauc acccccugga acuucgagga ggugguggac aagggcgcca 2100 gcgcccagag cuucaucgag cggaugacca acuucgacaa gaaccugccc aacgagaagg 2160 ugcugcccaa gcacagccug cuguacgagu acuucaccgu guacaacgag cugaccaagg 2220 ugaaguacgu gaccgagggc augcggaagc ccgccuuccu gagcggcgag cagaagaagg 2280 ccaucgugga ccugcuguuc aagaccaacc ggaaggugac cgugaagcag cugaaggagg 2340 acuacuucaa 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ucucucccuu gcaccuguac cucuuggucu uugaauaaag ccugaguagg 4920 aagucuaga 4929 <210> 2137 <211> 1588 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 2137 Met Ser Glu Val Glu Phe Ser His Glu Tyr Trp Met Arg His Ala Leu 1 5 10 15 Thr Leu Ala Lys Arg Ala Arg Asp Glu Arg Glu Val Pro Val Gly Ala 20 25 30 Val Leu Val Leu Asn Asn Arg Val Ile Gly Glu Gly Trp Asn Arg Ala 35 40 45 Ile Gly Leu His Asp Pro Thr Ala His Ala Glu Ile Met Ala Leu Arg 50 55 60 Gln Gly Gly Leu Val Met Gln Asn Tyr Arg Leu Ile Asp Ala Thr Leu 65 70 75 80 Tyr Val Thr Phe Glu Pro Cys Val Met Cys Ala Gly Ala Met Ile His 85 90 95 Ser Arg Ile Gly Arg Val Val Phe Gly Val Arg Asn Ala Lys Thr Gly 100 105 110 Ala Ala Gly Ser Leu Met Asp Val Leu His His Pro Gly Met Asn His 115 120 125 Arg Val Glu Ile Thr Glu Gly Ile Leu Ala Asp Glu Cys Ala Ala Leu 130 135 140 Leu Cys Arg Phe Phe Arg Met Pro Arg Arg Val Phe Asn Ala Gln Lys 145 150 155 160 Lys Ala Gln Ser Ser Thr Asp Ser Gly 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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2138 aggaaauaag agagaaaaga agaguaagaa gaaauauaag agccacc 47 <210> 2139 <211> 501 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 2139 augagcgagg uggaguucag ccacgaguac uggaugcggc acgcccugac ccuggccaag 60 cgggcccggg acgagcggga ggugcccgug ggcgccgugc uggugcugaa caaccgggug 120 aucggcgagg gcuggaaccg ggccaucggc cugcacgacc ccaccgccca cgccgagauc 180 auggcccugc ggcagggcgg ccuggugaug cagaacuacc ggcugaucga cgccacccug 240 uacgugaccu ucgagcccug cgugaugugc gccggcgcca ugauccacag ccggaucggc 300 cggguggugu ucggcgugcg gaacgccaag accggcgccg ccggcagccu gauggacgug 360 cugcaccacc ccggcaugaa ccaccgggug gagaucaccg agggcauccu ggccgacgag 420 ugcgccgccc ugcugugccg guucuuccgg augccccggc ggguguucaa cgcccagaag 480 aaggcccaga gcagcaccga c 501 <210> 2140 <211> 167 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 2140 Met Ser Glu Val Glu Phe Ser His Glu Tyr Trp Met Arg His Ala Leu 1 5 10 15 Thr Leu Ala Lys Arg Ala Arg Asp Glu Arg Glu Val Pro Val Gly Ala 20 25 30 Val Leu Val Leu Asn Asn Arg Val Ile Gly Glu Gly Trp Asn Arg Ala 35 40 45 Ile Gly Leu His Asp Pro Thr Ala His Ala Glu Ile Met Ala Leu Arg 50 55 60 Gln Gly Gly Leu Val Met Gln Asn Tyr Arg Leu Ile Asp Ala Thr Leu 65 70 75 80 Tyr Val Thr Phe Glu Pro Cys Val Met Cys Ala Gly Ala Met Ile His 85 90 95 Ser Arg Ile Gly Arg Val Val Phe Gly Val Arg Asn Ala Lys Thr Gly 100 105 110 Ala Ala Gly Ser Leu Met Asp Val Leu His His Pro Gly Met Asn His 115 120 125 Arg Val Glu Ile Thr Glu Gly Ile Leu Ala Asp Glu Cys Ala Ala Leu 130 135 140 Leu Cys Arg Phe Phe Arg Met Pro Arg Arg Val Phe Asn Ala Gln Lys 145 150 155 160 Lys Ala Gln Ser Ser Thr Asp 165 <210> 2141 <211> 96 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2141 agcggcggca gcagcggcgg cagcagcggc agcgagacac ccggcaccag cgagagcgcc 60 acccccgaga gcagcggcgg cagcagcggc ggcagc 96 <210> 2142 <211> 4101 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 2142 gacaagaagu acagcaucgg ccuggccauc ggcaccaaca gcgugggcug ggccgugauc 60 accgacgagu acaaggugcc cagcaagaag uucaaggugc ugggcaacac cgaccggcac 120 agcaucaaga agaaccugau cggcgcccug cuguucgaca gcggcgagac agccgaggcc 180 acccggcuga agcggaccgc ccggcggcgg uacacccggc ggaagaaccg gaucugcuac 240 cugcaggaga ucuucagcaa cgagauggcc aagguggacg acagcuucuu ccaccggcug 300 gaggagagcu uccuggugga ggaggacaag aagcacgagc ggcaccccau cuucggcaac 360 aucguggacg agguggccua ccacgagaag uaccccacca ucuaccaccu gcggaagaag 420 cugguggaca gcaccgacaa ggccgaccug cggcugaucu accuggcccu ggcccacaug 480 aucaaguucc ggggccacuu ccugaucgag ggcgaccuga accccgacaa cagcgacgug 540 gacaagcugu ucauccagcu ggugcagacc uacaaccagc uguucgagga gaaccccauc 600 aacgccagcg gcguggacgc caaggccauc cugagcgccc ggcugagcaa gagccggcgg 660 cuggagaacc ugaucgccca gcugcccggc gagaagaaga acggccuguu cggcaaccug 720 aucgcccuga gccugggccu gacccccaac uucaagagca acuucgaccu ggccgaggac 780 gccaagcugc agcugagcaa ggacaccuac gacgacgacc uggacaaccu gcuggcccag 840 aucggcgacc aguacgccga ccuguuccug gccgccaaga accugagcga cgccauccug 900 cugagcgaca uccugcgggu gaacaccgag aucaccaagg ccccccugag cgccagcaug 960 aucaagcggu acgacgagca ccaccaggac cugacccugc ugaaggcccu ggugcggcag 1020 cagcugcccg agaaguacaa ggagaucuuc uucgaccaga gcaagaacgg cuacgccggc 1080 uacaucgacg gcggcgccag ccaggaggag uucuacaagu ucaucaagcc cauccuggag 1140 aagauggacg gcaccgagga gcugcuggug aagcugaacc gggaggaccu gcugcggaag 1200 cagcggaccu ucgacaacgg cagcaucccc caccagaucc accugggcga gcugcacgcc 1260 auccugcggc ggcaggagga cuucuacccc uuccugaagg acaaccggga gaagaucgag 1320 aagauccuga ccuuccggau ccccuacuac gugggccccc uggcccgggg caacagccgg 1380 uucgccugga ugacccgcaa gagcgaggag acaaucaccc ccuggaacuu cgaggaggug 1440 guggacaagg gcgccagcgc ccagagcuuc aucgagcgga ugaccaacuu cgacaagaac 1500 cugcccaacg agaaggugcu gcccaagcac agccugcugu acgaguacuu 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ggacuucgcc 3240 accgugcgga aggugcugag caugccccag gugaacaucg ugaagaagac cgaggugcag 3300 accggcggcu ucagcaagga gagcauccug cccaagcgga acagcgacaa gcugaucgcc 3360 cggaagaagg acugggaccc caagaaguac ggcggcuucg acagccccac cguggccuac 3420 agcgugcugg ugguggccaa gguggagaag ggcaagagca agaagcucaa gagcgugaag 3480 gagcugcugg gcaucaccau cauggagcgg agcagcuucg agaagaaccc caucgacuuc 3540 cuggaggcca agggcuacaa ggaggugaag aaggaccuga ucaucaagcu gcccaaguac 3600 agccuguucg agcuggagaa cggccggaag cggaugcugg ccagcgccgg cgagcugcag 3660 aagggcaacg agcuggcccu gcccagcaag uacgugaacu uccuguaccu ggccagccac 3720 uacgagaagc ugaagggcag ccccgaggac aacgagcaga agcagcuguu cguggagcag 3780 cacaagcacu accuggacga gaucaucgag cagaucagcg aguucagcaa gcgggugauc 3840 cuggccgacg ccaaccugga caaggugcug agcgccuaca acaagcaccg ggacaagccc 3900 auccgggagc aggccgagaa caucauccac cuguucaccc ugaccaaccu gggcgccccc 3960 gccgccuuca aguacuucga caccaccauc gaccggaagc gguacaccag caccaaggag 4020 gugcuggacg ccacccugau ccaccagagc aucaccggcc uguacgagac 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cuguaccucu uggucuuuga auaaagccug aguaggaagu cuaga 115 <210> 2148 <211> 4929 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 2148 aggaaauaag agagaaaaga agaguaagaa gaaauauaag agccaccaug agcgaggugg 60 aguucagcca cgaguacugg augcggcacg cccugacccu ggccaagcgg gcccgggacg 120 agcgggaggu gcccgugggc gccgugcugg ugcugaacaa ccgggugauc ggcgagggcu 180 ggaaccgggc caucggccug cacgacccca ccgcccacgc cgagaucaug gcccugcggc 240 agggcggccu ggugaugcag aacuaccggc ugaucgacgc cacccuguac gugaccuucg 300 agcccugcgu gaugugcgcc ggcgccauga uccacagccg gaucggccgg gugguguucg 360 gcgugcggaa cgccaagacc ggcgccgccg gcagccugau ggacgugcug caccaccccg 420 gcaugaacca ccggguggag aucaccgagg gcauccuggc cgacgagugc gccgcccugc 480 ugugccgguu cuuccggaug ccccggcggg uguucaacgc ccagaagaag gcccagagca 540 gcaccgacag cggcggcagc agcggcggca gcagcggcag cgagacaccc ggcaccagcg 600 agagcgccac ccccgagagc agcggcggca gcagcggcgg cagcgacaag aaguacagca 660 ucggccuggc caucggcacc aacagcgugg 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cgacaagaac cggggcaaga 3240 gcgacaacgu gcccagcgag gaggugguga agaagaugaa gaacuacugg cggcagcugc 3300 ugaacgccaa gcugaucacc cagcggaagu ucgacaaccu gaccaaggcc gagcggggcg 3360 gccugagcga gcuggacaag gccggcuuca ucaagcggca gcugguggag acacggcaga 3420 ucaccaagca cguggcccag auccuggaca gccggaugaa caccaaguac gacgagaacg 3480 acaagcugau ccgggaggug aaggugauca cccucaagag caagcuggug agcgacuucc 3540 ggaaggacuu ccaguucuac aaggugcggg agaucaacaa cuaccaccac gcccacgacg 3600 ccuaccugaa cgccguggug ggcaccgccc ugaucaagaa guaccccaag cuggagagcg 3660 aguucgugua cggcgacuac aagguguacg acgugcggaa gaugaucgcc aagagcgagc 3720 aggagaucgg caaggccacc gccaaguacu ucuucuacag caacaucaug aacuucuuca 3780 agaccgagau cacccuggcc aacggcgaga uccggaagcg gccccugauc gagacaaacg 3840 gcgagacagg cgagaucgug ugggacaagg gccgggacuu cgccaccgug cggaaggugc 3900 ugagcaugcc ccaggugaac aucgugaaga agaccgaggu gcagaccggc ggcuucagca 3960 aggagagcau ccugcccaag cggaacagcg acaagcugau cgcccggaag aaggacuggg 4020 accccaagaa guacggcggc uucgagagcc ccaccguggc cuacagcgug cugguggugg 4080 ccaaggugga gaagggcaag agcaagaagc ucaagagcgu gaaggagcug cugggcauca 4140 ccaucaugga gcggagcagc uucgagaaga accccaucga cuuccuggag gccaagggcu 4200 acaaggaggu gaagaaggac cugaucauca agcugcccaa guacagccug uucgagcugg 4260 agaacggccg gaagcggaug cuggccagcg ccggcgagcu gcagaagggc aacgagcugg 4320 cccugcccag caaguacgug aacuuccugu accuggccag ccacuacgag aagcugaagg 4380 gcagccccga ggacaacgag cagaagcagc uguucgugga gcagcacaag cacuaccugg 4440 acgagaucau cgagcagauc agcgaguuca gcaagcgggu gauccuggcc gacgccaacc 4500 uggacaaggu gcugagcgcc uacaacaagc accgggacaa gcccauccgg gagcaggccg 4560 agaacaucau ccaccuguuc acccugacca accugggcgc ccccgccgcc uucaaguacu 4620 ucgacaccac caucgaccgg aagcgguaca ccagcaccaa ggaggugcug gacgccaccc 4680 ugauccacca gagcaucacc ggccuguacg agacacggau cgaccugagc cagcugggcg 4740 gcgacgaggg cgccgacaag cggaccgccg acggcagcga guucgagagc cccaagaaga 4800 agcggaaggu gugagcggcc gcuuaauuaa gcugccuucu gcggggcuug ccuucuggcc 4860 augcccuucu ucucucccuu gcaccuguac cucuuggucu 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Sequence: Synthetic polypeptide <400> 2150 Ser Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr 1 5 10 15 Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Ser Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser 20 25 30 <210> 2151 <211> 4101 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 2151 gacaagaagu acagcaucgg ccuggccauc ggcaccaaca gcgugggcug ggccgugauc 60 accgacgagu acaaggugcc cagcaagaag uucaaggugc ugggcaacac cgaccggcac 120 agcaucaaga agaaccugau cggcgcccug cuguucgaca gcggcgagac agccgaggcc 180 acccggcuga agcggaccgc ccggcggcgg uacacccggc ggaagaaccg gaucugcuac 240 cugcaggaga ucuucagcaa cgagauggcc aagguggacg acagcuucuu ccaccggcug 300 gaggagagcu uccuggugga ggaggacaag aagcacgagc ggcaccccau cuucggcaac 360 aucguggacg agguggccua ccacgagaag uaccccacca ucuaccaccu gcggaagaag 420 cugguggaca gcaccgacaa ggccgaccug cggcugaucu accuggcccu ggcccacaug 480 aucaaguucc ggggccacuu ccugaucgag ggcgaccuga accccgacaa cagcgacgug 540 gacaagcugu ucauccagcu ggugcagacc 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Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 2153 aggaaauaag agagaaaaga agaguaagaa gaaauauaag agccaccaug agcgaggugg 60 aguucagcca cgaguacugg augcggcacg cccugacccu ggccaagcgg gcccgggacg 120 agcgggaggu gcccgugggc gccgugcugg ugcugaacaa ccgggugauc ggcgagggcu 180 ggaaccgggc caucggccug cacgacccca ccgcccacgc cgagaucaug gcccugcggc 240 agggcggccu ggugaugcag aacuaccggc ugaucgacgc cacccuguac gugaccuucg 300 agcccugcgu gaugugcgcc ggcgccauga uccacagccg gaucggccgg gugguguucg 360 gcgugcggaa cgccaagacc ggcgccgccg gcagccugau ggacgugcug caccaccccg 420 gcaugaacca ccggguggag aucaccgagg gcauccuggc cgacgagugc gccgcccugc 480 ugugccgguu cuuccggaug ccccggcggg uguucaacgc ccagaagaag gcccagagca 540 gcaccgacag cggcggcagc agcggcggca gcagcggcag cgagacaccc ggcaccagcg 600 agagcgccac ccccgagagc agcggcggca gcagcggcgg cagcgacaag aaguacagca 660 ucggccuggc caucggcacc aacagcgugg gcugggccgu gaucaccgac gaguacaagg 720 ugcccagcaa gaaguucaag gugcugggca acaccgaccg gcacagcauc 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aagaaccggg gcaagagcga caacgugccc agcgaggagg uggugaagaa gaugaagaac 2640 uacuggcggc agcugcugaa cgccaagcug aucacccagc ggaaguucga caaccugacc 2700 aaggccgagc ggggcggccu gagcgagcug gacaaggccg gcuucaucaa gcggcagcug 2760 guggagacac ggcagaucac caagcacgug gcccagaucc uggacagccg gaugaacacc 2820 aaguacgacg agaacgacaa gcugauccgg gaggugaagg ugaucacccu caagagcaag 2880 cuggugagcg acuuccggaa ggacuuccag uucuacaagg ugcgggagau caacaacuac 2940 caccacgccc acgacgccua ccugaacgcc guggugggca ccgcccugau caagaaguac 3000 cccaagcugg agagcgaguu cguguacggc gacuacaagg uguacgacgu gcggaagaug 3060 aucgccaaga gcgagcagga gaucggcaag gccaccgcca aguacuucuu cuacagcaac 3120 aucaugaacu ucuucaagac cgagaucacc cuggccaacg gcgagauccg gaagcggccc 3180 cugaucgaga caaacggcga gacaggcgag aucguguggg acaagggccg ggacuucgcc 3240 accgugcgga aggugcugag caugccccag gugaacaucg ugaagaagac cgaggugcag 3300 accggcggcu ucagcaagga gagcauccug cccaagcgga acagcgacaa gcugaucgcc 3360 cggaagaagg acugggaccc caagaaguac ggcggcuucg agagccccac cguggccuac 3420 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aucuaccugg cccuggccca caugaucaag uuccggggcc 1140 acuuccugau cgagggcgac cugaaccccg acaacagcga cguggacaag cuguucaucc 1200 agcuggugca gaccuacaac cagcuguucg aggagaaccc caucaacgcc agcggcgugg 1260 acgccaaggc cauccugagc gcccggcuga gcaagagccg gcggcuggag aaccugaucg 1320 cccagcugcc cggcgagaag aagaacggcc uguucggcaa ccugaucgcc cugagccugg 1380 gccugacccc caacuucaag agcaacuucg accuggccga ggacgccaag cugcagcuga 1440 gcaaggacac cuacgacgac gaccuggaca accugcuggc ccagaucggc gaccaguacg 1500 ccgaccuguu ccuggccgcc aagaaccuga gcgacgccau ccugcugagc gacauccugc 1560 gggugaacac cgagaucacc aaggcccccc ugagcgccag caugaucaag cgguacgacg 1620 agcaccacca ggaccugacc cugcugaagg cccuggugcg gcagcagcug cccgagaagu 1680 acaaggagau cuucuucgac cagagcaaga acggcuacgc cggcuacauc gacggcggcg 1740 ccagccagga ggaguucuac aaguucauca agcccauccu ggagaagaug gacggcaccg 1800 aggagcugcu ggugaagcug aaccgggagg accugcugcg gaagcagcgg accuucgaca 1860 acggcagcau cccccaccag auccaccugg gcgagcugca cgccauccug cggcggcagg 1920 aggacuucua ccccuuccug aaggacaacc gggagaagau cgagaagauc cugaccuucc 1980 ggauccccua cuacgugggc ccccuggccc ggggcaacag ccgguucgcc uggaugaccc 2040 gcaagagcga ggagacaauc acccccugga acuucgagga ggugguggac aagggcgcca 2100 gcgcccagag cuucaucgag cggaugacca acuucgacaa gaaccugccc aacgagaagg 2160 ugcugcccaa gcacagccug cuguacgagu acuucaccgu guacaacgag cugaccaagg 2220 ugaaguacgu gaccgagggc augcggaagc ccgccuuccu gagcggcgag cagaagaagg 2280 ccaucgugga ccugcuguuc aagaccaacc ggaaggugac cgugaagcag cugaaggagg 2340 acuacuucaa gaagaucgag ugcuucgaca gcguggagau cagcggcgug gaggaccggu 2400 ucaacgccag ccugggcacc uaccacgacc ugcugaagau caucaaggac aaggacuucc 2460 uggacaacga ggagaacgag gacauccugg aggacaucgu gcugacccug acccuguucg 2520 aggaccggga gaugaucgag gagcggcuga agaccuacgc ccaccuguuc gacgacaagg 2580 ugaugaagca gcugaagcgg cggcgguaca ccggcugggg ccggcugagc cggaagcuga 2640 ucaacggcau ccgggacaag cagagcggca agaccauccu ggacuuccuc aagagcgacg 2700 gcuucgccaa cgccaacuuc augcagcuga uccacgacga cagccugacc uucaaggagg 2760 acauccagaa ggcccaggug 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uuccggggag caaaagaagg 2280 ccaucgugga ccuguuguuc aagaccaacc ggaaggucac cgucaagcag cugaaggagg 2340 acuacuuuaa gaaaaucgag ugcuuugauu ccgucgaaau cuccggagug gaagauagau 2400 ucaacgccag ccuaggcacc uaccacgauc ugcucaagau cauuaaggau aaggauuucc 2460 uggacaacga ggagaacgag gauauccugg aggacauugu gcugacccug acacuguucg 2520 aagaucgcga aaugaucgag gagcggcuga aaacauacgc ccaccuguuc gacgacaagg 2580 ucaugaagca gcucaagcgg aggagguaca cgggaugggg aaggcugucc cggaagcuga 2640 ucaacgggau uagagacaag caguccggaa agaccauucu ggacuuccuc aagucggacg 2700 gcuucgcgaa ccggaacuuc augcaacuga uccacgacga cucccugacg uucaaggagg 2760 acauucagaa ggcccaagug uccggacagg gagauucacu gcacgaacac aucgccaauc 2820 uggcuggaag uccggccauc aagaaaggca uccugcaaac cgugaagguc guggacgagc 2880 ucgugaaggu caugggccgc cacaagccug agaacaucgu gaucgaaaug gcccgggaga 2940 accagaccac gcagaaaggg cagaagaaca gccgcgagag gaugaagaga aucgaggaag 3000 gaaucaagga acuuggaagc cagauccuga aggaacaccc cguggaaaac acucagcuuc 3060 aaaacgaaaa gcuguaccuc uacuaucugc aaaacggacg ggauauguac guggaccagg 3120 aauuggacau caaucgccug uccgacuacg auguggauca cauugugccg cagagcuuuc 3180 ugaaggacga uucaauugau aacaaggugc ucacccgguc cgacaagaac cggggcaaaa 3240 gcgauaacgu gccgagcgaa gaggugguca agaagaugaa gaauuacugg cggcagcucu 3300 ugaacgccaa acugaucacc cagcggaagu ucgacaaccu gaccaaggcc gaaaggggcg 3360 gucuuuccga acuggacaag gccggguuua ucaagcgcca acugguggaa acccggcaga 3420 ucacuaagca cguggcccag auacuggacu cuaggaugaa uaccaaauac gacgagaacg 3480 acaagcugau ucgcgaaguc aaagucauua cccugaaauc caagcucgug uccgacuucc 3540 ggaaggacuu ccaguucuau aagguucgcg aaaucaacaa cuaccaccac gcccaugacg 3600 cguaccugaa cgccgucgug gguaccgccc ugauuaagaa guacccuaag cucgaguccg 3660 aguucgucua cggagacuac aaaguguacg acgugcggaa gaugaucgcc aaguccgagc 3720 aggaaauagg gaaggccacc gccaaguacu ucuucuacuc caacaucaug aacuucuuca 3780 agaccgagau cacccuugcc aacggggaga uucggaagcg cccguugauu gagacuaacg 3840 gagaaaccgg cgaaauugug ugggauaagg gcagagacuu ugcgacugug cgcaaagucu 3900 ugucaaugcc ccaagucaac auugucaaaa agaccgaagu gcaaaccggc ggcuucagca 3960 aggaaagcau ccugcccaag cgcaauuccg acaagcucau cgcccggaag aaggacuggg 4020 accccaagaa auauggaggc uucgacuccc ccacuguggc cuacuccguc cugguggucg 4080 cgaaagugga aaagggaaag ucgaagaagc ucaaguccgu gaaggagcuc cuggggauca 4140 ccauuaugga acgguccagc uucgagaaga acccgauuga cuuccuggaa gccaaggguu 4200 acaaggaggu caagaaggau cugauuauua agcugccgaa guauucccuc uucgaacucg 4260 aaaauggccg caagcgaaug uuggcaucgg cgggagagcu ccagaaggga aacgaacugg 4320 ccuugccuuc caaauacgug aacuuucugu accuggccag ccacuacgag aagcugaagg 4380 guucccccga ggacaacgag cagaagcagc uguucgugga gcagcacaag cacuaccugg 4440 augagaucau cgaacagauc ucggaauucu ccaagagagu gauccuggcc gacgcgaacc 4500 uggauaaggu ccuguccgcg uacaacaagc accgggacaa gcccauccgg gagcaggcug 4560 agaacauuau ccaccuguuc acccucacua accuuggagc gccugccgca uucaaguacu 4620 ucgacacaac caucgacaga aagcgcuaca cuuccaccaa ggaggugcug gacgccaccc 4680 ugauccacca guccaucacu gggcucuaug agacucgcau ugaccugucc caguugggag 4740 gggacgaagg agccgauaag agaaccgccg auggguccga 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Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2163 ucuggagguu ccucgggcgg aucgucaggg uccgaaacuc cuggaaccuc ggagucagca 60 acuccggaau ccucaggagg cuccagcgga ggcucc 96 <210> 2164 <211> 4101 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 2164 gauaagaagu acagcaucgg gcuugccauc ggaaccaacu cggucggcug ggcugugauc 60 acugacgagu acaagguccc uuccaaaaag uucaaagugc ucggcaacac ugaucggcac 120 ucgauuaaga agaaccugau cggugcacug cuguucgacu cuggggagac ugcggaagca 180 acucgccuga agaggacugc gcgcagacgg uacaccaggc gcaagaaccg gaucugcuac 240 uugcaagaga uuuucagcaa cgagauggcc aaggucgacg acucguuuuu ccaccggcuc 300 gaggaaagcu uccuggugga ggaagauaag aagcaugagc gccaucccau cuucggaaac 360 aucguggacg aaguggccua ccaugagaag uacccgacca ucuaccaucu gcgcaagaag 420 cucguggaca gcacugacaa agccgacuug cgccugaucu accuugcccu ggcccacaug 480 aucaaguuca gagggcacuu ccugaucgag ggcgaccuga acccggacaa uuccgacgug 540 gauaagcugu ucauccaacu gguacaaacu uacaaccagc uguuugagga 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1440 guggacaagg gcgccucagc gcaauccuuc aucgaacgga ugaccaacuu cgacaagaac 1500 uugccuaacg agaaagugcu uccuaagcau ucccuccuuu acgaauacuu cacuguguac 1560 aacgagcuua ccaaggucaa auaugugacc gagggcaugc gcaagccggc cuuucuuucc 1620 ggggagcaaa agaaggccau cguggaccug uuguucaaga ccaaccggaa ggucaccguc 1680 aagcagcuga aggaggacua cuuuaagaaa aucgagugcu uugauuccgu cgaaaucucc 1740 ggaguggaag auagauucaa cgccagccua ggcaccuacc acgaucugcu caagaucauu 1800 aaggauaagg auuuccugga caacgaggag aacgaggaua uccuggagga cauugugcug 1860 acccugacac uguucgaaga ucgcgaaaug aucgaggagc ggcugaaaac auacgcccac 1920 cuguucgacg acaaggucau gaagcagcuc aagcggagga gguacacggg auggggaagg 1980 cugucccgga agcugaucaa cgggauuaga gacaagcagu ccggaaagac cauucuggac 2040 uuccucaagu cggacggcuu cgcgaaccgg aacuucaugc aacugaucca cgacgacucc 2100 cugacguuca aggaggacau ucagaaggcc caaguguccg gacagggaga uucacugcac 2160 gaacacaucg ccaaucuggc uggaaguccg gccaucaaga aaggcauccu gcaaaccgug 2220 aaggucgugg acgagcucgu gaaggucaug ggccgccaca agccugagaa caucgugauc 2280 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Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2166 gaaggagccg au 12 <210> 2167 <211> 57 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2167 aagagaaccg ccgauggguc cgaauucgag ucgcccaaga agaagcggaa aguguaa 57 <210> 2168 <211> 4929 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 2168 aggaaauaag agagaaaaga agaguaagaa gaaauauaag agccaccaug ucagaaguag 60 aauucuccca cgaguauugg augagacacg cucucacacu cgccaagcga gcuagggaug 120 aaagggaagu accagugggg gccguacugg uacucaacaa uagggucaua ggagaggggu 180 ggaaucgagc aauugggcug caugauccca cugcacacgc ggagauuaug gcucuuagac 240 aagggggccu ggugaugcag aauuaccgcc ucauugacgc aacccuuuac gugacauuug 300 agccaugcgu uaugugcgcg ggcgcaauga uacacucuag gauaggccgc guaguuuucg 360 gaguccgaaa ugcgaagacu ggggcggccg gaucucugau ggacgugcuc caccauccag 420 gcaugaacca ccgaguggag auaacggaag gcaucuuggc ggacgaaugu gcugcgcucc 480 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acucggguca caaauauuga aggagcaucc uguagagaac acacagcuuc 3060 agaacgagaa gcuguaccug uauuaucucc agaauggcag agacauguau gucgaccaag 3120 aacuggauau caaucgcuug uccgauuaug auguagauca cauaguccca caauccuucu 3180 ugaaagacga uaguauugac aauaagguac uuacgagauc cgacaagaac cgcggaaagu 3240 ccgauaacgu accgagugaa gaagugguaa agaagaugaa gaauuauugg aggcagcucc 3300 ucaacgccaa acuuauuacu cagagaaagu ucgauaaccu uacgaaagcu gagcgaggcg 3360 gguugucuga gcucgauaaa gcuggauuca uaaagcggca gcuuguggaa acuagacaga 3420 ucacaaagca cguugcacag auccuugauu ccagaaugaa cacuaaauau gaugagaacg 3480 auaagcugau acgcgaggug aaaguaauaa cacuuaaguc aaagcuggua agcgauuuuc 3540 gcaaagacuu ccaauuuuau aaggucagag agauaaacaa uuaucaucac gcgcaugacg 3600 cuuaccugaa cgcaguugug gggacagcac uuauaaagaa auacccaaag uuggaaagug 3660 aauuugucua uggagacuau aagguauacg auguacggaa gaugauugcg aagucagagc 3720 aagaaaucgg uaaggcaacu gcuaaguacu ucuuuuacuc aaauauuaug aacuuuuuca 3780 agacggaaau cacucuggcu aacggagaaa uucggaagag gcccuugaua gagacgaaug 3840 gggagacugg 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ucuuaucgag ggcgaucuua auccggacaa cuccgacgug 540 gauaagcugu ucauccagcu cguccaaacg uauaaccaac ucuucgagga gaauccgauc 600 aaugccucug gaguggacgc gaaagcgaua cucucagcaa ggcuuaguaa gucucgccgg 660 cuugagaacc ucaucgcaca guugccagga gagaagaaga auggcuuguu ugguaaccuu 720 auugcacuca gucucggccu uacaccuaac uucaagucca acuucgaucu ugccgaggac 780 gccaagcucc agcuuagcaa ggauaccuac gaugacgauc uugauaaccu gcuggcccag 840 auaggcgacc aguacgcgga ccuuuucuug gcagcaaaga auuuguccga cgccauccuc 900 uugagcgaca uccuccgggu aaacacugaa auuacuaagg cgccacuuuc cgccagcaug 960 aucaagagau acgaugagca ucaucaggau cugacccugc uuaaagcgcu uguacgccag 1020 caauugccug agaaguauaa agaaaucuuu uucgaccaaa gcaagaacgg uuaugcuggc 1080 uacauagacg gcggggcuuc ucaggaggaa uucuacaagu uuaucaagcc gauucucgag 1140 aagauggaug gaacagagga gcuguuggug aaacugaacc gggaggaccu gcucagaaag 1200 cagcggaccu ucgauaaugg gagcaucccg caccagauuc auuuggguga gcugcaugca 1260 aucuugcgca ggcaagaaga uuuuuacccc uuccucaagg acaauagaga gaagauugag 1320 aagauccuua cguuuaggau uccguauuac 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gacuauaagg uauacgaugu acggaagaug 3060 auugcgaagu cagagcaaga aaucgguaag gcaacugcua aguacuucuu uuacucaaau 3120 auuaugaacu uuuucaagac ggaaaucacu cuggcuaacg gagaaauucg gaagaggccc 3180 uugauagaga cgaaugggga gacuggugag aucguuuggg acaaagggcg agauuucgca 3240 acgguccgaa aggugcucuc aaugccacaa gucaauauag ucaagaagac agagguacaa 3300 acaggagguu ucuccaagga aucaauacuc ccaaagcgga auuccgacaa acugauagcu 3360 agaaagaagg acugggaucc gaagaaguau ggaggguuug auuccccaac aguagcguau 3420 ucaguacugg ugguagcuaa gguggagaaa ggcaagucua agaagcuuaa gucugucaaa 3480 gagcugcucg gcaucaccau uauggagcgc aguagcuucg agaagaaccc uauagauuuu 3540 cuggaagcca aaggauauaa ggagguuaag aaggaucuca ucaucaaacu cccgaaguau 3600 agucuuuuug aguuggagaa cggacgaaag cgcaugcuug cgucugcggg ugaauugcag 3660 aaaggaaaug agcucgccuu gccgucaaag uaugucaauu ucuuguaccu ugcgagucac 3720 uaugagaagc ugaaaggaag cccagaagau aaugaacaga agcaauuguu cguugaacaa 3780 cauaagcauu auuuggacga gaucaucgag caaaucagcg aguucagcaa gcgcgucaua 3840 cuugcggacg ccaaucugga caaagugcug 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cagaaauuuu augcagcuga uccaugacga uagccugaca uucaaggaag 2760 acauccagaa ggcccaggug agcgggcaag gcgacagccu gcacgagcac aucgccaacc 2820 uggccggcuc ucccgcuauc aagaagggaa uccugcagac agugaaggug guugaugagu 2880 uagugaaagu gaugggccgg cacaagccug agaauaucgu gauugaaaug gccagagaga 2940 accagacaac ucagaagggc cagaagaacu cccgagagag aaugaagaga aucgaagagg 3000 gaaucaaaga gcuaggcagc caaauccuca aagaacaccc cguggagaau acccagcugc 3060 agaacgagaa gcuguaccug uacuaccugc agaacggccg agauauguac guggaucagg 3120 agcuggacau caauaggcug ucagacuacg acguggacca caucgugccu cagagcuuuc 3180 ugaaggauga uucuaucgac aacaaggugu uaaccagauc cgacaagaac agaggcaaga 3240 gcgauaacgu cccauccgaa gaggucguga agaagaugaa gaacuacugg agacagcugc 3300 ugaacgcgaa acugauuacc cagagaaagu uugacaaccu caccaaagcu gagagaggag 3360 gccugagcga gcuggacaag gcugguuuca ucaagcggca gcuaguggaa acacggcaaa 3420 ucaccaagca cguggcucaa auccuagaua gcagaaugaa uaccaaguac gaugagaacg 3480 acaaacugau cagagaagug aaggugauca cauuaaaguc uaaacugguc agcgacuuca 3540 gaaaggacuu 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tctcgcaaag 60 agggctcgag atgaacgcga ggtgcccgtg ggggcagtac tcgtgctcaa caatcgcgta 120 atcggcgaag gttggaatag ggcaatcgga ctccacgacc ccactgcaca tgcggaaatc 180 atggcccttc gacagggagg gcttgtgatg cagaattatc gacttatcga tgcgacgctg 240 tacgtcacgt ttgaaccttg cgtaatgtgc gcgggagcta tgattcactc ccgcattgga 300 cgagttgtat tcggtgttcg caacgccaag acgggtgccg caggttcact gatggacgtg 360 ctgcatcatc caggcatgaa ccaccgggta gaaatcacag aaggcatatt ggcggacgaa 420 tgtgcggcgc tgttgtgtcg tttttttcgc atgcccaggc gggtctttaa cgcccagaaa 480 aaagcacaat cctctactga c 501 <210> 2182 <211> 96 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2182 tctggtggtt cttctggtgg ttctagcggc agcgagactc ccgggacctc agagtccgcc 60 acacccgaaa gttctggtgg ttcttctggt ggttct 96 <210> 2183 <211> 4101 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 2183 gacaagaagt acagcatcgg cctggccatc ggcaccaact ctgtgggctg ggccgtgatc 60 accgacgagt acaaggtgcc cagcaagaaa ttcaaggtgc tgggcaacac cgaccggcac 120 agcatcaaga agaacctgat cggagccctg ctgttcgaca gcggcgaaac agccgaggcc 180 acccggctga agagaaccgc cagaagaaga tacaccagac ggaagaaccg gatctgctat 240 ctgcaagaga tcttcagcaa cgagatggcc aaggtggacg acagcttctt ccacagactg 300 gaagagtcct tcctggtgga agaggataag aagcacgagc ggcaccccat cttcggcaac 360 atcgtggacg aggtggccta ccacgagaag taccccacca tctaccacct gagaaagaaa 420 ctggtggaca gcaccgacaa ggccgacctg cggctgatct atctggccct ggcccacatg 480 atcaagttcc ggggccactt cctgatcgag ggcgacctga accccgacaa cagcgacgtg 540 gacaagctgt tcatccagct ggtgcagacc tacaaccagc tgttcgagga aaaccccatc 600 aacgccagcg gcgtggacgc caaggccatc ctgtctgcca gactgagcaa gagcagacgg 660 ctggaaaatc tgatcgccca gctgcccggc gagaagaaga atggcctgtt cggaaacctg 720 attgccctga gcctgggcct gacccccaac ttcaagagca acttcgacct ggccgaggat 780 gccaaactgc agctgagcaa ggacacctac gacgacgacc tggacaacct gctggcccag 840 atcggcgacc agtacgccga cctgtttctg gccgccaaga acctgtccga cgccatcctg 900 ctgagcgaca 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guucuacaag uucaucaagc ccauccugga gaagauggac 1200 ggcaccgagg agcugcuggu gaagcugaac cgggaggacc ugcugcggaa gcagcggacc 1260 uucgacaacg gcagcauccc ccaccagauc caccugggcg agcugcacgc cauccugcgg 1320 cggcaggagg acuucuaccc cuuccugaag gacaaccggg agaagaucga gaagauccug 1380 accuuccgga uccccuacua cgugggcccc cuggcccggg gcaacagccg guucgccugg 1440 augacccgca agagcgagga gacgaucacc cccuggaacu ucgaggaggu gguggacaag 1500 ggcgccagcg cccagagcuu caucgagcgg augaccaacu ucgacaagaa ccugcccaac 1560 gagaaggugc ugcccaagca cagccugcug uacgaguacu ucaccgugua caacgagcug 1620 accaagguga aguacgugac cgagggcaug cggaagcccg ccuuccugag cggcgagcag 1680 aagaaggcca ucguggaccu gcuguucaag accaaccgga aggugaccgu gaagcagcug 1740 aaggaggacu acuucaagaa gaucgagugc uucgacagcg uggagaucag cggcguggag 1800 gaccgguuca acgccagccu gggcaccuac cacgaccugc ugaagaucau caaggacaag 1860 gacuuccugg acaacgagga gaacgaggac auccuggagg acaucgugcu gacccugacc 1920 cuguucgagg accgggagau gaucgaggag cggcugaaga ccuacgccca ccuguucgac 1980 gacaagguga ugaagcagcu gaagcggcgg cgguacaccg gcuggggccg gcugagccgg 2040 aagcugauca acggcauccg ggacaagcag agcggcaaga ccauccugga cuuccucaag 2100 agcgacggcu ucgccaaccg gaacuucaug cagcugaucc acgacgacag ccugaccuuc 2160 aaggaggaca uccagaaggc ccaggugagc ggccagggcg acagccugca cgagcacauc 2220 gccaaccugg ccggcagccc cgccaucaag aagggcaucc ugcagaccgu gaagguggug 2280 gacgagcugg ugaaggugau gggccggcac aagcccgaga acaucgugau cgagauggcc 2340 cgggagaacc agaccaccca gaagggccag aagaacagcc gggagcggau gaagcggauc 2400 gaggagggca ucaaggagcu gggcagccag auccugaagg agcaccccgu ggagaacacc 2460 cagcugcaga acgagaagcu guaccuguac uaccugcaga acggccggga cauguacgug 2520 gaccaggagc uggacaucaa ccggcugagc gacuacgacg uggaccacau cgugccccag 2580 agcuuccuga aggacgacag caucgacaac aaggugcuga cccggagcga caagaaccgg 2640 ggcaagagcg acaacgugcc cagcgaggag guggugaaga agaugaagaa cuacuggcgg 2700 cagcugcuga acgccaagcu gaucacccag cggaaguucg acaaccugac caaggccgag 2760 cggggcggcc ugagcgagcu ggacaaggcc ggcuucauca agcggcagcu gguggagacg 2820 cggcagauca ccaagcacgu ggcccagauc cuggacagcc ggaugaacac caaguacgac 2880 gagaacgaca agcugauccg ggaggugaag gugaucaccc ucaagagcaa gcuggugagc 2940 gacuuccgga aggacuucca guucuacaag gugcgggaga ucaacaacua ccaccacgcc 3000 cacgacgccu accugaacgc cguggugggc accgcccuga ucaagaagua ccccaagcug 3060 gagagcgagu ucguguacgg cgacuacaag guguacgacg ugcggaagau gaucgccaag 3120 agcgagcagg agaucggcaa ggccaccgcc aaguacuucu ucuacagcaa caucaugaac 3180 uucuucaaga ccgagaucac ccuggccaac ggcgagaucc ggaagcggcc ccugaucgag 3240 acgaacggcg agacgggcga gaucgugugg gacaagggcc gggacuucgc caccgugcgg 3300 aaggugcuga gcaugcccca ggugaacauc gugaagaaga ccgaggugca gaccggcggc 3360 uucagcaagg agagcauccu gcccaagcgg aacagcgaca agcugaucgc ccggaagaag 3420 gacugggacc ccaagaagua cggcggcuuc gacagcccca ccguggccua cagcgugcug 3480 gugguggcca agguggagaa gggcaagagc aagaagcuca agagcgugaa ggagcugcug 3540 ggcaucacca ucauggagcg gagcagcuuc gagaagaacc ccaucgacuu ccuggaggcc 3600 aagggcuaca aggaggugaa gaaggaccug aucaucaagc ugcccaagua cagccuguuc 3660 gagcuggaga acggccggaa gcggaugcug gccagcgccg gcgagcugca gaagggcaac 3720 gagcuggccc ugcccagcaa guacgugaac uuccuguacc uggccagcca cuacgagaag 3780 cugaagggca gccccgagga caacgagcag aagcagcugu ucguggagca gcacaagcac 3840 uaccuggacg agaucaucga gcagaucagc gaguucagca agcgggugau ccuggccgac 3900 gccaaccugg acaaggugcu gagcgccuac aacaagcacc gggacaagcc cauccgggag 3960 caggccgaga acaucaucca ccuguucacc cugaccaacc ugggcgcccc cgccgccuuc 4020 aaguacuucg acaccaccau cgaccggaag cgguacacca gcaccaagga ggugcuggac 4080 gccacccuga uccaccagag caucaccggc cuguacgaga cgcggaucga ccugagccag 4140 cugggcggcg acagcggcgg caagcggccc gccgccacca agaaggccgg ccaggccaag 4200 aagaagaagu aaugauag 4218 <210> 2188 <211> 1403 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 2188 Met Ala Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Gly Ile His Gly Val Pro Ala 1 5 10 15 Ala Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Asp Ile Gly Thr Asn Ser Val 20 25 30 Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe 35 40 45 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gcgcccugcu guucgacagc ggcgagacag ccgaggccac ccgccugaag cgcaccgccc 300 gccgccgcua cacccgccgc aagaaccgca ucugcuaccu gcaggagauc uucagcaacg 360 agauggccaa gguggacgac agcuucuucc accgccugga ggagagcuuc cugguggagg 420 aggacaagaa gcacgagcgc caccccaucu ucggcaacau cguggacgag guggccuacc 480 acgagaagua ccccaccauc uaccaccugc gcaagaagcu gguggacagc accgacaagg 540 ccgaccugcg ccugaucuac cuggcccugg cccacaugau caaguuccgc ggccacuucc 600 ugaucgaggg cgaccugaac cccgacaaca gcgacgugga caagcuguuc auccagcugg 660 ugcagaccua caaccagcug uucgaggaga accccaucaa cgccagcggc guggacgcca 720 aggccauccu gagcgcccgc cugagcaaga gccgccgccu ggagaaccug aucgcccagc 780 ugcccggcga gaagaagaac ggccuguucg gcaaccugau cgcccugagc cugggccuga 840 cccccaacuu caagagcaac uucgaccugg ccgaggacgc caagcugcag cugagcaagg 900 acaccuacga cgacgaccug gacaaccugc uggcccagau cggcgaccag uacgccgacc 960 uguuccuggc cgccaagaac cugagcgacg ccauccugcu gagcgacauc cugcgcguga 1020 acaccgagau caccaaggcc ccccugagcg ccagcaugau caagcgcuac gacgagcacc 1080 accaggaccu gacccugcug aaggcccugg ugcgccagca gcugcccgag aaguacaagg 1140 agaucuucuu cgaccagagc aagaacggcu acgccggcua caucgacggc ggcgccagcc 1200 aggaggaguu cuacaaguuc aucaagccca uccuggagaa gauggacggc accgaggagc 1260 ugcuggugaa gcugaaccgc gaggaccugc ugcgcaagca gcgcaccuuc gacaacggca 1320 gcauccccca ccagauccac cugggcgagc ugcacgccau ccugcgccgc caggaggacu 1380 ucuaccccuu ccugaaggac aaccgcgaga agaucgagaa gauccugacc uuccgcaucc 1440 ccuacuacgu gggcccccug gcccgcggca acagccgcuu cgccuggaug acccgcaaga 1500 gcgaggagac aaucaccccc uggaacuucg aggagguggu ggacaagggc gccagcgccc 1560 agagcuucau cgagcgcaug accaacuucg acaagaaccu gcccaacgag aaggugcugc 1620 ccaagcacag ccugcuguac gaguacuuca ccguguacaa cgagcugacc aaggugaagu 1680 acgugaccga gggcaugcgc aagcccgccu uccugagcgg cgagcagaag aaggccaucg 1740 uggaccugcu guucaagacc aaccgcaagg ugaccgugaa gcagcugaag gaggacuacu 1800 ucaagaagau cgagugcuuc gacagcgugg agaucagcgg cguggaggac cgcuucaacg 1860 ccagccuggg caccuaccac gaccugcuga agaucaucaa ggacaaggac uuccuggaca 1920 acgaggagaa cgaggacauc cuggaggaca ucgugcugac ccugacccug uucgaggacc 1980 gcgagaugau cgaggagcgc cugaagaccu acgcccaccu guucgacgac aaggugauga 2040 agcagcugaa gcgccgccgc uacaccggcu ggggccgccu gagccgcaag cugaucaacg 2100 gcauccgcga caagcagagc ggcaagacca uccuggacuu ccucaagagc gacggcuucg 2160 ccaaccgcaa cuucaugcag cugauccacg acgacagccu gaccuucaag gaggacaucc 2220 agaaggccca ggugagcggc cagggcgaca gccugcacga gcacaucgcc aaccuggccg 2280 gcagccccgc caucaagaag ggcauccugc agaccgugaa ggugguggac gagcugguga 2340 aggugauggg ccgccacaag cccgagaaca ucgugaucga gauggcccgc gagaaccaga 2400 ccacccagaa gggccagaag aacagccgcg agcgcaugaa gcgcaucgag gagggcauca 2460 aggagcuggg cagccagauc cugaaggagc accccgugga gaacacccag cugcagaacg 2520 agaagcugua ccuguacuac cugcagaacg gccgcgacau guacguggac caggagcugg 2580 acaucaaccg ccugagcgac uacgacgugg accacaucgu gccccagagc uuccugaagg 2640 acgacagcau cgacaacaag gugcugaccc gcagcgacaa gaaccgcggc aagagcgaca 2700 acgugcccag cgaggaggug gugaagaaga ugaagaacua cuggcgccag cugcugaacg 2760 ccaagcugau cacccagcgc aaguucgaca accugaccaa ggccgagcgc ggcggccuga 2820 gcgagcugga caaggccggc uucaucaagc gccagcuggu ggagacacgc cagaucacca 2880 agcacguggc ccagauccug gacagccgca ugaacaccaa guacgacgag aacgacaagc 2940 ugauccgcga ggugaaggug aucacccuca agagcaagcu ggugagcgac uuccgcaagg 3000 acuuccaguu cuacaaggug cgcgagauca acaacuacca ccacgcccac gacgccuacc 3060 ugaacgccgu ggugggcacc gcccugauca agaaguaccc caagcuggag agcgaguucg 3120 uguacggcga cuacaaggug uacgacgugc gcaagaugau cgccaagagc gagcaggaga 3180 ucggcaaggc caccgccaag uacuucuucu acagcaacau caugaacuuc uucaagaccg 3240 agaucacccu ggccaacggc gagauccgca agcgcccccu gaucgagaca aacggcgaga 3300 caggcgagau cgugugggac aagggccgcg acuucgccac cgugcgcaag gugcugagca 3360 ugccccaggu gaacaucgug aagaagaccg aggugcagac cggcggcuuc agcaaggaga 3420 gcauccugcc caagcgcaac agcgacaagc ugaucgcccg caagaaggac ugggacccca 3480 agaaguacgg cggcuucgac agccccaccg uggccuacag cgugcuggug guggccaagg 3540 uggagaaggg caagagcaag aagcucaaga gcgugaagga gcugcugggc aucaccauca 3600 uggagcgcag 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Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 2190 auggccccca agaagaagcg caaggugggc auccacggcg ugcccgccgc cgacaagaag 60 uacagcaucg gccuggacau cggcaccaac agcgugggcu gggccgugau caccgacgag 120 uacaaggugc ccagcaagaa guucaaggug cugggcaaca ccgaccgcca cagcaucaag 180 aagaaccuga ucggcgcccu gcuguucgac agcggcgaga cagccgaggc cacccgccug 240 aagcgcaccg cccgccgccg cuacacccgc cgcaagaacc gcaucugcua ccugcaggag 300 aucuucagca acgagauggc caagguggac gacagcuucu uccaccgccu ggaggagagc 360 uuccuggugg aggaggacaa gaagcacgag cgccacccca ucuucggcaa caucguggac 420 gagguggccu accacgagaa guaccccacc aucuaccacc ugcgcaagaa gcugguggac 480 agcaccgaca aggccgaccu gcgccugauc uaccuggccc uggcccacau gaucaaguuc 540 cgcggccacu uccugaucga gggcgaccug aaccccgaca acagcgacgu ggacaagcug 600 uucauccagc uggugcagac cuacaaccag cuguucgagg agaaccccau caacgccagc 660 ggcguggacg ccaaggccau ccugagcgcc cgccugagca agagccgccg ccuggagaac 720 cugaucgccc agcugcccgg cgagaagaag aacggccugu ucggcaaccu gaucgcccug 780 agccugggcc ugacccccaa cuucaagagc aacuucgacc uggccgagga cgccaagcug 840 cagcugagca aggacaccua cgacgacgac cuggacaacc ugcuggccca gaucggcgac 900 caguacgccg accuguuccu ggccgccaag aaccugagcg acgccauccu gcugagcgac 960 auccugcgcg ugaacaccga gaucaccaag gccccccuga gcgccagcau gaucaagcgc 1020 uacgacgagc accaccagga ccugacccug cugaaggccc uggugcgcca gcagcugccc 1080 gagaaguaca aggagaucuu cuucgaccag agcaagaacg gcuacgccgg cuacaucgac 1140 ggcggcgcca gccaggagga guucuacaag uucaucaagc ccauccugga gaagauggac 1200 ggcaccgagg agcugcuggu gaagcugaac cgcgaggacc ugcugcgcaa gcagcgcacc 1260 uucgacaacg gcagcauccc ccaccagauc caccugggcg agcugcacgc cauccugcgc 1320 cgccaggagg acuucuaccc cuuccugaag gacaaccgcg agaagaucga gaagauccug 1380 accuuccgca uccccuacua cgugggcccc cuggcccgcg gcaacagccg cuucgccugg 1440 augacccgca agagcgagga gacaaucacc cccuggaacu ucgaggaggu gguggacaag 1500 ggcgccagcg cccagagcuu caucgagcgc augaccaacu ucgacaagaa ccugcccaac 1560 gagaaggugc ugcccaagca cagccugcug uacgaguacu ucaccgugua caacgagcug 1620 accaagguga aguacgugac cgagggcaug cgcaagcccg ccuuccugag cggcgagcag 1680 aagaaggcca ucguggaccu gcuguucaag accaaccgca aggugaccgu gaagcagcug 1740 aaggaggacu acuucaagaa gaucgagugc uucgacagcg uggagaucag cggcguggag 1800 gaccgcuuca acgccagccu gggcaccuac cacgaccugc ugaagaucau caaggacaag 1860 gacuuccugg acaacgagga gaacgaggac auccuggagg acaucgugcu gacccugacc 1920 cuguucgagg accgcgagau gaucgaggag cgccugaaga ccuacgccca ccuguucgac 1980 gacaagguga ugaagcagcu gaagcgccgc cgcuacaccg gcuggggccg ccugagccgc 2040 aagcugauca acggcauccg cgacaagcag agcggcaaga ccauccugga cuuccucaag 2100 agcgacggcu ucgccaaccg caacuucaug cagcugaucc acgacgacag ccugaccuuc 2160 aaggaggaca uccagaaggc ccaggugagc ggccagggcg acagccugca cgagcacauc 2220 gccaaccugg ccggcagccc cgccaucaag aagggcaucc ugcagaccgu gaagguggug 2280 gacgagcugg ugaaggugau gggccgccac aagcccgaga acaucgugau cgagauggcc 2340 cgcgagaacc agaccaccca gaagggccag aagaacagcc gcgagcgcau gaagcgcauc 2400 gaggagggca ucaaggagcu gggcagccag auccugaagg agcaccccgu ggagaacacc 2460 cagcugcaga acgagaagcu guaccuguac uaccugcaga acggccgcga cauguacgug 2520 gaccaggagc uggacaucaa ccgccugagc gacuacgacg uggaccacau cgugccccag 2580 agcuuccuga aggacgacag caucgacaac aaggugcuga cccgcagcga caagaaccgc 2640 ggcaagagcg acaacgugcc cagcgaggag guggugaaga agaugaagaa cuacuggcgc 2700 cagcugcuga acgccaagcu gaucacccag cgcaaguucg acaaccugac caaggccgag 2760 cgcggcggcc ugagcgagcu ggacaaggcc ggcuucauca agcgccagcu gguggagaca 2820 cgccagauca ccaagcacgu ggcccagauc cuggacagcc gcaugaacac caaguacgac 2880 gagaacgaca agcugauccg cgaggugaag gugaucaccc ucaagagcaa gcuggugagc 2940 gacuuccgca aggacuucca guucuacaag gugcgcgaga ucaacaacua ccaccacgcc 3000 cacgacgccu accugaacgc cguggugggc accgcccuga ucaagaagua ccccaagcug 3060 gagagcgagu ucguguacgg cgacuacaag guguacgacg ugcgcaagau gaucgccaag 3120 agcgagcagg agaucggcaa ggccaccgcc aaguacuucu ucuacagcaa caucaugaac 3180 uucuucaaga ccgagaucac ccuggccaac ggcgagaucc gcaagcgccc ccugaucgag 3240 acaaacggcg agacaggcga gaucgugugg gacaagggcc gcgacuucgc caccgugcgc 3300 aaggugcuga gcaugcccca ggugaacauc gugaagaaga ccgaggugca gaccggcggc 3360 uucagcaagg agagcauccu gcccaagcgc aacagcgaca agcugaucgc ccgcaagaag 3420 gacugggacc ccaagaagua cggcggcuuc gacagcccca ccguggccua cagcgugcug 3480 gugguggcca agguggagaa gggcaagagc aagaagcuca agagcgugaa ggagcugcug 3540 ggcaucacca ucauggagcg cagcagcuuc gagaagaacc ccaucgacuu ccuggaggcc 3600 aagggcuaca aggaggugaa gaaggaccug aucaucaagc ugcccaagua cagccuguuc 3660 gagcuggaga acggccgcaa gcgcaugcug gccagcgccg gcgagcugca gaagggcaac 3720 gagcuggccc ugcccagcaa guacgugaac uuccuguacc uggccagcca cuacgagaag 3780 cugaagggca gccccgagga caacgagcag aagcagcugu ucguggagca gcacaagcac 3840 uaccuggacg agaucaucga gcagaucagc gaguucagca agcgcgugau ccuggccgac 3900 gccaaccugg acaaggugcu gagcgccuac aacaagcacc gcgacaagcc cauccgcgag 3960 caggccgaga acaucaucca ccuguucacc cugaccaacc ugggcgcccc cgccgccuuc 4020 aaguacuucg acaccaccau cgaccgcaag cgcuacacca gcaccaagga ggugcuggac 4080 gccacccuga uccaccagag caucaccggc cuguacgaga cacgcaucga ccugagccag 4140 cugggcggcg acagcggcgg caagcgcccc gccgccacca agaaggccgg ccaggccaag 4200 aagaagaagu aauaauaa 4218 <210> 2191 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 2191 uaagaccaug ucccaacuga guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 2192 <211> 4929 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 2192 aggaaauaag agagaaaaga agaguaagaa gaaauauaag agccaccaug agcgaggugg 60 aguucagcca cgaguacugg augcggcacg cccugacccu ggccaagcgg gcccgggacg 120 agcgggaggu gcccgugggc gccgugcugg ugcugaacaa ccgggugauc ggcgagggcu 180 ggaaccgggc caucggccug cacgacccca ccgcccacgc cgagaucaug gcccugcggc 240 agggcggccu ggugaugcag aacuaccggc ugaucgacgc cacccuguac gugaccuucg 300 agcccugcgu gaugugcgcc ggcgccauga uccacagccg gaucggccgg gugguguucg 360 gcgugcggaa cgccaagacc ggcgccgccg gcagccugau ggacgugcug caccaccccg 420 gcaugaacca ccggguggag aucaccgagg gcauccuggc cgacgagugc gccgcccugc 480 ugugccgguu cuuccggaug ccccggcggg uguucaacgc ccagaagaag gcccagagca 540 gcaccgacag cggcggcagc agcggcggca gcagcggcag cgagacaccc ggcaccagcg 600 agagcgccac ccccgagagc agcggcggca gcagcggcgg cagcgacaag aaguacagca 660 ucggccuggc caucggcacc aacagcgugg gcugggccgu gaucaccgac gaguacaagg 720 ugcccagcaa gaaguucaag gugcugggca acaccgaccg gcacagcauc aagaagaacc 780 ugaucggcgc ccugcuguuc gacagcggcg agacagccga ggccacccgg cugaagcgga 840 ccgcccggcg gcgguacacc cggcggaaga accggaucug cuaccugcag gagaucuuca 900 gcaacgagau ggccaaggug gacgacagcu ucuuccaccg gcuggaggag agcuuccugg 960 uggaggagga caagaagcac gagcggcacc ccaucuucgg caacaucgug gacgaggugg 1020 ccuaccacga gaaguacccc accaucuacc accugcggaa gaagcuggug gacagcaccg 1080 acaaggccga ccugcggcug aucuaccugg cccuggccca caugaucaag uuccggggcc 1140 acuuccugau cgagggcgac cugaaccccg acaacagcga cguggacaag cuguucaucc 1200 agcuggugca gaccuacaac cagcuguucg aggagaaccc caucaacgcc agcggcgugg 1260 acgccaaggc cauccugagc gcccggcuga gcaagagccg gcggcuggag aaccugaucg 1320 cccagcugcc cggcgagaag aagaacggcc uguucggcaa ccugaucgcc cugagccugg 1380 gccugacccc caacuucaag agcaacuucg accuggccga ggacgccaag cugcagcuga 1440 gcaaggacac cuacgacgac gaccuggaca accugcuggc ccagaucggc gaccaguacg 1500 ccgaccuguu ccuggccgcc aagaaccuga gcgacgccau ccugcugagc gacauccugc 1560 gggugaacac cgagaucacc aaggcccccc ugagcgccag caugaucaag cgguacgacg 1620 agcaccacca ggaccugacc cugcugaagg cccuggugcg gcagcagcug cccgagaagu 1680 acaaggagau cuucuucgac cagagcaaga acggcuacgc cggcuacauc gacggcggcg 1740 ccagccagga ggaguucuac aaguucauca agcccauccu ggagaagaug gacggcaccg 1800 aggagcugcu ggugaagcug aaccgggagg accugcugcg gaagcagcgg accuucgaca 1860 acggcagcau cccccaccag auccaccugg gcgagcugca cgccauccug cggcggcagg 1920 aggacuucua ccccuuccug aaggacaacc gggagaagau cgagaagauc cugaccuucc 1980 ggauccccua cuacgugggc ccccuggccc ggggcaacag ccgguucgcc uggaugaccc 2040 gcaagagcga ggagacaauc acccccugga acuucgagga ggugguggac aagggcgcca 2100 gcgcccagag cuucaucgag cggaugacca acuucgacaa gaaccugccc aacgagaagg 2160 ugcugcccaa gcacagccug cuguacgagu acuucaccgu guacaacgag cugaccaagg 2220 ugaaguacgu gaccgagggc augcggaagc ccgccuuccu gagcggcgag cagaagaagg 2280 ccaucgugga ccugcuguuc aagaccaacc ggaaggugac cgugaagcag cugaaggagg 2340 acuacuucaa gaagaucgag ugcuucgaca gcguggagau cagcggcgug gaggaccggu 2400 ucaacgccag ccugggcacc uaccacgacc ugcugaagau caucaaggac aaggacuucc 2460 uggacaacga ggagaacgag gacauccugg aggacaucgu gcugacccug acccuguucg 2520 aggaccggga gaugaucgag gagcggcuga agaccuacgc ccaccuguuc gacgacaagg 2580 ugaugaagca gcugaagcgg cggcgguaca ccggcugggg ccggcugagc cggaagcuga 2640 ucaacggcau ccgggacaag cagagcggca agaccauccu ggacuuccuc aagagcgacg 2700 gcuucgccaa ccggaacuuc augcagcuga uccacgacga cagccugacc uucaaggagg 2760 acauccagaa ggcccaggug agcggccagg gcgacagccu gcacgagcac aucgccaacc 2820 uggccggcag ccccgccauc aagaagggca uccugcagac cgugaaggug guggacgagc 2880 uggugaaggu gaugggccgg cacaagcccg agaacaucgu gaucgagaug gcccgggaga 2940 accagaccac ccagaagggc cagaagaaca gccgggagcg gaugaagcgg aucgaggagg 3000 gcaucaagga gcugggcagc cagauccuga aggagcaccc cguggagaac acccagcugc 3060 agaacgagaa gcuguaccug uacuaccugc agaacggccg ggacauguac guggaccagg 3120 agcuggacau caaccggcug agcgacuacg acguggacca caucgugccc cagagcuucc 3180 ugaaggacga cagcaucgac aacaaggugc ugacccggag cgacaagaac cggggcaaga 3240 gcgacaacgu gcccagcgag gaggugguga agaagaugaa gaacuacugg cggcagcugc 3300 ugaacgccaa gcugaucacc cagcggaagu ucgacaaccu gaccaaggcc gagcggggcg 3360 gccugagcga gcuggacaag gccggcuuca ucaagcggca gcugguggag acacggcaga 3420 ucaccaagca cguggcccag auccuggaca gccggaugaa caccaaguac gacgagaacg 3480 acaagcugau ccgggaggug aaggugauca cccucaagag caagcuggug agcgacuucc 3540 ggaaggacuu ccaguucuac aaggugcggg agaucaacaa cuaccaccac gcccacgacg 3600 ccuaccugaa cgccguggug ggcaccgccc ugaucaagaa guaccccaag cuggagagcg 3660 aguucgugua cggcgacuac aagguguacg acgugcggaa gaugaucgcc aagagcgagc 3720 aggagaucgg caaggccacc gccaaguacu ucuucuacag caacaucaug aacuucuuca 3780 agaccgagau cacccuggcc aacggcgaga uccggaagcg gccccugauc gagacaaacg 3840 gcgagacagg cgagaucgug ugggacaagg gccgggacuu cgccaccgug cggaaggugc 3900 ugagcaugcc ccaggugaac aucgugaaga agaccgaggu gcagaccggc ggcuucagca 3960 aggagagcau ccugcccaag cggaacagcg acaagcugau cgcccggaag aaggacuggg 4020 accccaagaa guacggcggc uucgacagcc ccaccguggc cuacagcgug cugguggugg 4080 ccaaggugga gaagggcaag agcaagaagc ucaagagcgu gaaggagcug cugggcauca 4140 ccaucaugga gcggagcagc uucgagaaga accccaucga cuuccuggag gccaagggcu 4200 acaaggaggu gaagaaggac cugaucauca agcugcccaa guacagccug uucgagcugg 4260 agaacggccg gaagcggaug cuggccagcg ccggcgagcu gcagaagggc aacgagcugg 4320 cccugcccag caaguacgug aacuuccugu accuggccag ccacuacgag aagcugaagg 4380 gcagccccga ggacaacgag cagaagcagc uguucgugga gcagcacaag cacuaccugg 4440 acgagaucau cgagcagauc agcgaguuca gcaagcgggu gauccuggcc gacgccaacc 4500 uggacaaggu gcugagcgcc uacaacaagc accgggacaa gcccauccgg gagcaggccg 4560 agaacaucau ccaccuguuc acccugacca accugggcgc ccccgccgcc uucaaguacu 4620 ucgacaccac caucgaccgg aagcgguaca ccagcaccaa ggaggugcug gacgccaccc 4680 ugauccacca gagcaucacc ggccuguacg agacacggau cgaccugagc cagcugggcg 4740 gcgacgaggg cgccgacaag cggaccgccg acggcagcga guucgagagc cccaagaaga 4800 agcggaaggu gugagcggcc gcuuaauuaa gcugccuucu gcggggcuug ccuucuggcc 4860 augcccuucu ucucucccuu gcaccuguac cucuuggucu uugaauaaag ccugaguagg 4920 aagucuaga 4929 <210> 2193 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2193 cccgcacctg gcacagagag gg 22 <210> 2194 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2194 cagcaccttg gcagcagagg tgg 23 <210> 2195 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2195 cccgcacctg gtgcagcaag tg 22 <210> 2196 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2196 accgcaccag gcccagcggc gg 22 <210> 2197 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2197 accacacctg gcccagcaga gg 22 <210> 2198 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2198 cctgcacctt ggagcagcag ggg 23 <210> 2199 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2199 ccagcacctt agtgcagcag aag 23 <210> 2200 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2200 cccgcaccca gacacagcgg cgg 23 <210> 2201 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2201 cccacacctg gcacagcgcc gg 22 <210> 2202 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2202 ccgcactcat ggagcagctg tgg 23 <210> 2203 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2203 gccgcacctg gcgcagggga gg 22 <210> 2204 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2204 cccacaccta ggcacagcta ggg 23 <210> 2205 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2205 accacacctt ggtgcaaagg agg 23 <210> 2206 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2206 aatgcacctt ggcatagtgg ggg 23 <210> 2207 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2207 gccgcacctt ggcacaccag tgg 23 <210> 2208 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2208 cccacacctg gcccagcggg gc 22 <210> 2209 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2209 gtggcacctt ggtgcagcca agg 23 <210> 2210 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2210 ccagcaccct agtgcagcgt ggg 23 <210> 2211 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2211 cccacacatg gagcagcagg gg 22 <210> 2212 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2212 aagcaccttg gcagcagctg agg 23 <210> 2213 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2213 tctgcacctt ggcccagcgt aag 23 <210> 2214 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2214 cccgcacctg gctcagcagt ga 22 <210> 2215 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2215 cccgcactgg gtgcagaggt gg 22 <210> 2216 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2216 cccgcactcg gcgcagccat gg 22 <210> 2217 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2217 cccgcacccg gcgtagcgac gg 22 <210> 2218 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2218 gctgcaccct gccgcagagg agg 23 <210> 2219 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2219 gagcaccttg gcagcagctg agg 23 <210> 2220 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2220 cccgcacctg gcgcagcgcc cg 22 <210> 2221 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2221 atggcacctt ggcacagcag agg 23 <210> 2222 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2222 gaggcaccat gacgcagcag tgg 23 <210> 2223 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2223 cccacaacct ggcacagagg cgg 23 <210> 2224 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2224 tctgcaccat ggtgcagctg agg 23 <210> 2225 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2225 accgcacctg gcccagccag gg 22 <210> 2226 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2226 ccagcacctt ggcacagagt agg 23 <210> 2227 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2227 cccgcagttg gcccagctga gg 22 <210> 2228 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2228 ccagcacctt tgtgcagtgg agg 23 <210> 2229 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2229 ccagcaccaa gacacagcag tgg 23 <210> 2230 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2230 ttagcatctt ggtgcagagg tgg 23

Claims (225)

  1. (i) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 mRNA,
    (ii) 염기 에디터 융합 단백질에 대한 결합 스캐폴드로서 역할을 하는 tracr 서열, 및 PCSK9 유전자 상의 프로토스페이서에 상응하는 스페이서 서열을 포함하는 가이드 RNA
    를 포함하는 유전자 표적을 편집하기 위한 조성물로서,
    가이드 RNA는 포유동물 대상체에게 투여될 때 염기 에디터 융합 단백질이 생체 내에서 PCSK9 유전자 내 핵염기 변경을 수행하도록 지시하며,
    가이드 RNA 및 mRNA가 적어도 0.05 mg/kg의 총량으로 투여될 때, 차세대 시퀀싱 또는 생어(Sanger) 시퀀싱에 의해 측정되는 경우 포유동물 대상체에서 전체 간 세포의 적어도 35%에서 염기 변경이 발생하는 것인 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 포유동물 대상체는 시노몰구스 원숭이이며,
    가이드 RNA 및 mRNA가 적어도 0.5 mg/kg의 총량으로 투여될 때, 차세대 시퀀싱 또는 생어 시퀀싱에 의해 측정되는 경우 시노몰구스 원숭이에서 전체 간 세포의 적어도 40%에서 염기 변경이 발생하는 것인 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 포유동물 대상체는 시노몰구스 원숭이이며,
    가이드 RNA 및 mRNA가 적어도 1 mg/kg의 총량으로 투여될 때, 차세대 시퀀싱 또는 생어 시퀀싱에 의해 측정되는 경우 시노몰구스 원숭이에서 전체 간 세포의 적어도 45%에서 염기 변경이 발생하는 것인 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 포유동물 대상체는 시노몰구스 원숭이이며,
    가이드 RNA 및 mRNA가 적어도 1.5 mg/kg의 총량으로 투여될 때, 차세대 시퀀싱 또는 생어 시퀀싱에 의해 측정되는 경우 시노몰구스 원숭이에서 전체 간 세포의 적어도 50%에서 염기 변경이 발생하는 것인 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 포유동물 대상체는 시노몰구스 원숭이이며,
    가이드 RNA 및 mRNA가 적어도 3 mg/kg의 총량으로 투여될 때, 차세대 시퀀싱 또는 생어 시퀀싱에 의해 측정되는 경우 시노몰구스 원숭이에서 전체 간 세포의 적어도 55%에서 염기 변경이 발생하는 것인 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 포유동물 대상체는 마우스이며,
    가이드 RNA 및 mRNA가 적어도 0.125 mg/kg의 총량으로 투여될 때, 차세대 시퀀싱 또는 생어 시퀀싱에 의해 측정되는 경우 마우스에서 전체 간 세포의 적어도 40%에서 염기 변경이 발생하는 것인 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 포유동물 대상체는 마우스이며,
    가이드 RNA 및 mRNA가 적어도 0.5 mg/kg의 총량으로 투여될 때, 차세대 시퀀싱 또는 생어 시퀀싱에 의해 측정되는 경우 마우스에서 전체 간 세포의 적어도 45%에서 염기 변경이 발생하는 것인 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 포유동물 대상체는 마우스이며,
    가이드 RNA 및 mRNA가 적어도 2 mg/kg의 총량으로 투여될 때, 차세대 시퀀싱 또는 생어 시퀀싱에 의해 측정되는 경우 마우스에서 전체 간 세포의 적어도 50%에서 염기 변경이 발생하는 것인 조성물.
  9. 제2항에 있어서, 핵염기 변경은 투여 전과 비교하여 대상체의 혈중 저밀도 지단백질 콜레스테롤(LDL-C) 수준에서 적어도 50%의 감소를 초래하는 것인 조성물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 하나의 항에 있어서, 프로토스페이서는 스플라이스 부위에 위치하는 것인 조성물.
  11. 제1항 내지 제9항 중 어느 하나의 항에 있어서, 프로토스페이서 상보적 서열은 PCSK9 유전자의 안티센스 가닥에 있는 것인 조성물.
  12. 제1항 내지 제9항 중 어느 하나의 항에 있어서, 프로토스페이서 상보적 서열은 PCSK9 유전자의 센스 가닥에 있는 것인 조성물.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 하나의 항에 있어서, 염기 변경은 PCSK9 유전자 상의 프로토스페이서 외부(오프 타겟 부위)에서 일어나며,
    표 11에 제시된 오프 타겟 부위의 편집 백분율은 각각 표 11에 제시된 편집 백분율 이하인 조성물.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 하나의 항에 있어서, 데아미나아제는 아데닌 데아미나아제이며 핵염기 변경은 A·T에서 G·C로의 변경인 조성물.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 하나의 항에 있어서, 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인은 뉴클레아제 불활성 Cas9 또는 Cas9 닉카아제를 포함하는 것인 조성물.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 하나의 항에 있어서, 핵염기 변경은 PCSK9 유전자의 스플라이스 부위에 있는 것인 조성물.
  17. 제16항에 있어서, 핵염기 변경은 PCSK9 유전자의 스플라이스 도너 부위에 있는 것인 조성물.
  18. 제17항에 있어서, 스플라이스 도너 부위는 서열 번호 5에 참조된 PCSK9 인트론 1의 5' 말단에 있는 것인 조성물.
  19. 제16항에 있어서, 핵염기 변경은 PCSK9 유전자의 스플라이스 억셉터 부위에 있는 것인 조성물.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 하나의 항에 있어서, 핵염기 변경은 PCSK9 유전자에 의해 코딩되는 전사물에서 프레임 이동, 조기 정지 코돈, 삽입 또는 결실을 초래하는 것인 조성물.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 하나의 항에 있어서, 핵염기 변경은 PCSK9 유전자에 의해 코딩되는 비정상 전사물을 생성하는 것인 조성물.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 하나의 항에 있어서, 가이드 RNA는 화학적으로 변형된 것인 조성물.
  23. 제16항에 있어서, 가이드 RNA의 tracr 서열은 도 7에 도시된 도식에 따라 화학적으로 변형된 것인 조성물.
  24. 제1항 내지 제22항 중 어느 하나의 항에 있어서, 스페이서 서열은 표 1에 제시된 PCSK9 ABE 가이드 RNA 스페이서 서열을 포함하는 것인 조성물.
  25. 제24항에 있어서, 가이드 RNA는 표 1에 제시된 GA096, GA097, GA343, GA346, GA375-377, GA380-389, GA391, GA439 또는 GA440의 PCSK9 ABE 가이드 RNA 서열을 포함하는 것인 조성물.
  26. 제1항 내지 제23항 중 어느 하나의 항에 있어서, 프로토스페이서 서열은 표 1에 제시된 PCSK9 ABE 프로토스페이서 서열을 포함하는 것인 조성물.
  27. 제26항에 있어서, 프로토스페이서는 서열 5'-CCCGCACCTTGGCGCAGCGG-3'(서열 번호 13) 또는 5'-CCGCACCTTGGCGCAGCGG-3'(서열 번호 247)를 포함하는 것인 조성물.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 하나의 항에 있어서, 염기 에디터 융합 단백질은 서열 번호 2137의 아미노산 서열을 포함하는 것인 조성물.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 하나의 항에 있어서, mRNA 서열의 GC% 함량은 50% 초과인 조성물.
  30. 제29항에 있어서, mRNA 서열의 GC% 함량은 56% 초과인 조성물.
  31. 제30항에 있어서, mRNA 서열의 GC% 함량은 63% 이상인 조성물.
  32. 제29항에 있어서, mRNA는 아데닌 tTNA 데아미나아제(TadA) 영역, Cas9 영역 및 핵 국소화 서열(NLS) 영역을 포함하는 것인 조성물.
  33. 제32항에 있어서, mRNA는, TadA 영역과 Cas9 영역을 연결하는 제1 링커 영역, 및 Cas9 영역과 NLS 영역을 연결하는 제2 링커 영역을 추가로 포함하는 것인 조성물.
  34. 제32항 또는 제33항에 있어서, TadA 영역의 GC% 함량은 60% 초과인 조성물.
  35. 제32항 또는 제33항에 있어서, TadA 영역의 GC% 함량은 70% 이상인 조성물.
  36. 제32항 또는 제33항에 있어서, Cas9 영역의 GC% 함량은 56% 초과인 조성물.
  37. 제32항 또는 제33항에 있어서, Cas9 영역의 GC% 함량은 62% 이상인 조성물.
  38. 제32항 또는 제33항에 있어서, NLS 영역의 GC% 함량은 54% 초과인 조성물.
  39. 제32항 또는 제33항에 있어서, NLS 영역의 GC% 함량은 63% 이상인 조성물.
  40. 제33항에 있어서, 제1 링커 영역의 GC% 함량은 65% 초과인 조성물.
  41. 제33항에 있어서, 제1 링커 영역의 GC% 함량은 79% 이상인 조성물.
  42. 제33항에 있어서, 제2 링커 영역의 GC% 함량은 67% 초과인 조성물.
  43. 제33항에 있어서, 제2 링커 영역의 GC% 함량은 83% 이상인 조성물.
  44. 제33항에 있어서, TadA 영역의 GC% 함량은 60% 초과이며, Cas9 영역의 GC% 함량은 56% 초과이며, NLS 영역의 GC% 함량은 54% 초과이며, 제1 링커 영역의 GC% 함량은 65% 초과이며, 제2 링커 영역의 GC% 함량은 67% 초과인 조성물.
  45. 제29항에 있어서, mRNA는 표 23으로부터 선택된 mRNA 서열을 포함하는 것인 조성물.
  46. 제45항에 있어서, mRNA는 서열 번호 2136의 mRNA 서열을 포함하는 것인 조성물.
  47. 제29항 내지 제46항 중 어느 하나의 항에 있어서, mRNA는 폴리 A 꼬리를 포함하는 것인 조성물.
  48. 제1항 내지 제47항 중 어느 하나의 항에 있어서, (i)를 둘러싸는 지질 나노입자(LNP)를 추가로 포함하는 조성물.
  49. 제48항에 있어서, LNP는 (ii)를 추가로 둘러싸는 것인 조성물.
  50. 제48항에 있어서, (ii)를 둘러싸는 제2 LNP를 추가로 포함하는 조성물.
  51. 제1항 내지 제44항 중 어느 하나의 항에 있어서, 가이드 RNA와 염기 에디터 융합 단백질을 코딩하는 mRNA의 비는 중량 기준으로 약 1:10 내지 약 10:1인 조성물.
  52. 제51항에 있어서, 가이드 RNA와 염기 에디터 융합 단백질을 코딩하는 mRNA의 비는 중량 기준으로 약 1:1, 1.5:1, 2:1, 3:1, 4:1, 1:1.5, 1:2, 1:3, 또는 1:4인 조성물.
  53. 제51항에 있어서, 가이드 RNA와 염기 에디터 융합 단백질을 코딩하는 mRNA의 비는 중량 기준으로 약 1:1인 조성물.
  54. 제1항 내지 제53항 중 어느 하나의 항의 조성물 및 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 약학 조성물.
  55. 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법으로서, 제1항의 조성물의 치료 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  56. 제55항에 있어서, 투여는 정맥 내 주입에 의한 것인 방법.
  57. 제55항 또는 제56항에 있어서, (i)를 둘러싸는 LNP 및 (ii)를 둘러싸는 LNP의 순차적 투여를 포함하는 방법.
  58. 제55항 또는 제56항에 있어서, (i)를 둘러싸는 LNP 및 (ii)를 둘러싸는 LNP의 동시 투여를 포함하는 방법.
  59. 제57항에 있어서, (ii)를 둘러싸는 LNP의 단일 용량의 투여 이후에, 1일의 간격으로 (i)를 둘러싸는 LNP의 시간차 용량을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  60. 제57항에 있어서, (ii)를 둘러싸는 LNP의 단일 용량의 투여 이후에, 2일의 간격으로 (i)를 둘러싸는 LNP의 시간차 용량을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  61. 제57항에 있어서, (ii)를 둘러싸는 LNP의 단일 용량의 투여 이후에, 3일의 간격으로 (i)를 둘러싸는 LNP의 시간차 용량을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  62. 제57항에 있어서, (ii)를 둘러싸는 LNP의 단일 용량의 투여 이후에, 4일의 간격으로 (i)를 둘러싸는 LNP의 시간차 용량을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  63. 제57항에 있어서, (ii)를 둘러싸는 LNP의 단일 용량의 투여 이후에, 5일의 간격으로 (i)를 둘러싸는 LNP의 시간차 용량을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  64. 제57항에 있어서, (ii)를 둘러싸는 LNP의 단일 용량의 투여 이후에, 6일의 간격으로 (i)를 둘러싸는 LNP의 시간차 용량을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  65. 제57항에 있어서, (ii)를 둘러싸는 LNP의 단일 용량의 투여 이후에, 7일의 간격으로 (i)를 둘러싸는 LNP의 시간차 용량을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  66. 제55항 또는 제56항에 있어서, (i) 및 (ii)를 둘러싸는 LNP의 단일 용량을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  67. 제66항에 있어서, LNP의 단일 용량은 약 0.3 내지 약 3mg/kg인 방법.
  68. 제66항 또는 제67항에 있어서, 대상체에게 하나 이상의 치료의 치료 과정을 시행하는 단계를 포함하고, 하나 이상의 치료 각각은 LNP의 단일 용량의 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
  69. 제68항에 있어서, 2 내지 10회 치료의 치료 과정을 시행하는 단계를 포함하는 방법.
  70. 제68항에 있어서, 2 내지 5회 치료의 치료 과정을 시행하는 단계를 포함하는 방법.
  71. 제68항에 있어서, 2회 치료의 치료 과정을 시행하는 단계를 포함하는 방법.
  72. 제68항에 있어서, 3회 치료의 치료 과정을 시행하는 단계를 포함하는 방법.
  73. 제68항에 있어서, 4회 치료의 치료 과정을 시행하는 단계를 포함하는 방법.
  74. 제68항에 있어서, 5회 치료의 치료 과정을 시행하는 단계를 포함하는 방법.
  75. 제55항 내지 제74항 중 어느 하나의 항에 있어서, 병태는 죽상동맥경화성 심혈관 질환인 방법.
  76. 제55항 내지 제74항 중 어느 하나의 항에 있어서, 병태는 죽상동맥경화성 혈관 질환인 방법.
  77. 제55항 내지 제74항 중 어느 하나의 항에 있어서, 대상체는 인간인 방법.
  78. (i) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 mRNA,
    (ii) 염기 에디터 융합 단백질에 대한 결합 스캐폴드로서 역할을 하는 tracr 서열, 및 PCSK9 유전자 상의 프로토스페이서에 상응하는 스페이서 서열을 포함하는 가이드 RNA
    를 포함하는 유전자 표적을 편집하기 위한 조성물로서,
    가이드 RNA는 포유동물 대상체에게 투여될 때 염기 에디터 융합 단백질이 생체 내에서 PCSK9 유전자 내 핵염기 변경을 수행하도록 지시하며,
    가이드 RNA는 표 1에 제시된 PCSK9 ABE 가이드 RNA 서열을 포함하는 것인 조성물.
  79. (i) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 mRNA,
    (ii) 염기 에디터 융합 단백질에 대한 결합 스캐폴드로서 역할을 하는 tracr 서열, 및 PCSK9 유전자 상의 프로토스페이서에 상응하는 스페이서 서열을 포함하는 가이드 RNA
    를 포함하는 유전자 표적을 편집하기 위한 조성물로서,
    가이드 RNA는 포유동물 대상체에게 투여될 때 염기 에디터 융합 단백질이 생체 내에서 PCSK9 유전자 내 핵염기 변경을 수행하도록 지시하며,
    mRNA는 표 23으로부터 선택된 서열을 포함하는 것인 조성물.
  80. 죽상동맥경화성 심혈관 질환의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법으로서,
    (i) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 mRNA,
    (ii) 염기 에디터 융합 단백질에 대한 결합 스캐폴드로서 역할을 하는 tracr 서열, 및 PCSK9 유전자 상의 프로토스페이서에 상응하는 스페이서 서열을 포함하는 가이드 RNA를 포함하는 제1 조성물로서,
    가이드 RNA는 포유동물 대상체에게 투여될 때 염기 에디터 융합 단백질이 생체 내에서 PCSK9 유전자 내 핵염기 변경을 수행하도록 지시하며, 가이드 RNA 및 mRNA가 적어도 0.05 mg/kg의 총량으로 투여될 때, 차세대 시퀀싱 또는 생어 시퀀싱에 의해 측정되는 경우 포유동물 대상체에서 전체 간 세포의 적어도 35%에서 염기 변경이 발생하는 것인 제1 조성물; 및
    (i) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 mRNA,
    (ii) 염기 에디터 융합 단백질에 대한 결합 스캐폴드로서 역할을 하는 tracr 서열, 및 ANGPTL3 유전자 상의 프로토스페이서에 상응하는 스페이서 서열을 포함하는 가이드 RNA를 포함하는 제2 조성물로서,
    가이드 RNA는 포유동물 대상체에게 투여될 때 염기 에디터 융합 단백질이 생체 내에서 ANGPTL3 유전자 내 핵염기 변경을 수행하도록 지시하며, 가이드 RNA 및 mRNA가 적어도 0.5 mg/kg의 총량으로 투여될 때, 차세대 시퀀싱 또는 생어 시퀀싱에 의해 측정되는 경우 포유동물 대상체에서 전체 간 세포의 적어도 35%에서 염기 변경이 발생하는 것인 제2 조성물
    의 치료 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  81. 제80항에 있어서, 제1 조성물 및 제2 조성물의 순차적 투여를 포함하는 방법.
  82. 제81항에 있어서, 1회 이상의 용량의 제1 조성물을 투여한 후 1회 이상의 용량의 제2 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  83. 제82항에 있어서, 1회 이상의 용량의 제2 조성물을 투여한 후 1회 이상의 용량의 제1 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  84. 제80항에 있어서, 제1 조성물 및 제2 조성물의 동시 투여를 포함하는 방법.
  85. 제84항에 있어서, 제1 조성물 및 제2 조성물의 1회 이상의 용량을 포함하는 방법.
  86. (i) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 mRNA,
    (ii) 염기 에디터 융합 단백질에 대한 결합 스캐폴드로서 역할을 하는 tracr 서열, 및 APOC3 유전자 상의 프로토스페이서에 상응하는 스페이서 서열을 포함하는 가이드 RNA
    를 포함하는 유전자 표적을 편집하기 위한 조성물로서,
    가이드 RNA는 표 24에 제시된 GA300-303의 APOC3 ABE 가이드 RNA 서열을 포함하는 것인 조성물.
  87. (i) 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인 및 데아미나아제를 포함하는 염기 에디터 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 mRNA,
    (ii) 염기 에디터 융합 단백질에 대한 결합 스캐폴드로서 역할을 하는 tracr 서열, 및 PCSK9 유전자 상의 프로토스페이서에 상응하는 스페이서 서열을 포함하는 가이드 RNA
    를 포함하는 유전자 표적을 편집하기 위한 조성물로서,
    가이드 RNA는 염기 에디터 융합 단백질이 시험관 내에서 PCSK9 유전자 내 핵염기 변경을 수행하도록 지시하며,
    가이드 RNA 및 mRNA가 적어도 2.5 mg/kg의 총량으로 투여될 때, 차세대 시퀀싱 또는 생어 시퀀싱에 의해 측정되는 경우 포유동물 대상체에서 전체 간 세포의 적어도 35%에서 염기 변경이 발생하는 것인 조성물.
  88. (a) 편집 창을 갖는 아데닌 염기 에디터 단백질을 코딩하는 mRNA, 및
    (b) 염기 에디터 단백질에 대한 결합 스캐폴드 역할을 하는 tracr 서열 및 염기 에디터 단백질을 PCSK9 유전자 상의 프로토스페이서 서열로 안내하는 역할을 하는 스페이서 서열을 포함하는 가이드 RNA
    를 포함하는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물로서,
    스페이서 서열은 PCSK9 유전자의 스플라이스 부위 또는 엑손 영역에 적어도 부분적으로 상보적인 조성물.
  89. 제88항에 있어서, 염기 에디터 단백질이 가이드 RNA에 작동적으로 결합되고 가이드 RNA가 PCSK9 유전자 상의 프로토스페이서 서열에 상보적인 가닥과 혼성화되는 경우, 편집 창은 PCSK9 유전자의 스플라이스 부위를 포함하는 것인 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
  90. 제88항에 있어서, 염기 에디터 단백질이 가이드 RNA에 작동적으로 결합되고 가이드 RNA가 PCSK9 유전자 상의 프로토스페이서 서열에 상보적인 가닥과 혼성화되는 경우, 편집 창은 PCSK9 유전자의 인트론의 영역을 포함하는 것인 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
  91. 제88항에 있어서, 염기 에디터 단백질이 가이드 RNA에 작동적으로 결합되고 가이드 RNA가 PCSK9 유전자 상의 프로토스페이서 서열에 상보적인 가닥과 혼성화되는 경우, 편집 창은 PCSK9 유전자의 인트론 1, 인트론 3 또는 인트론 4의 영역을 포함하는 것인 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
  92. 제88항에 있어서, 염기 에디터 단백질이 가이드 RNA에 작동적으로 결합되고 가이드 RNA가 PCSK9 유전자 상의 프로토스페이서 서열에 상보적인 가닥과 혼성화되는 경우, 편집 창은 PCSK9 유전자의 인트론 1의 영역을 포함하는 것인 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
  93. 제88항에 있어서, 스페이서 서열은 GA066, GA073 및 GA074로 식별된 가이드 RNA 서열의 군으로부터 선택된 스페이서 서열에 대해 80-100% 뉴클레오티드 서열 동일성을 갖는 것인 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
  94. 제88항에 있어서, tracr 서열은 GA066, GA095, GA096, GA097, GA343, GA346, GA375, GA376, GA377, GA380, GA381, GA382, GA383, GA384, GA385, GA386, GA387, GA388, GA389, GA439, 및 GA440으로 식별된 가이드 RNA 서열의 군으로부터 선택된 tracr 서열에 대해 80-100% 뉴클레오티드 서열 동일성을 갖는 것인 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
  95. 제88항에 있어서, mRNA는 MA002, MA004, MA040, MA0041, 또는 MA045로 식별된 mRNA 서열에 대해 80-100% 서열 동일성을 갖는 것인 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
  96. 제88항에 있어서, mRNA는 하기 표에 제시된 GC 뉴클레오티드 영역 백분율 중 하나 이상을 갖는 것인 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물:
    Figure pct00381
  97. 제88항에 있어서, mRNA는 하기 표에 제시된 GC 뉴클레오티드 영역 백분율 중 하나 이상을 갖는 것인 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물:
    Figure pct00382
  98. 제88항에 있어서, mRNA 및 gRNA는 지질 나노입자 내에 캡슐화된 것인 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
  99. 제88항에 있어서, mRNA 및 gRNA는 하기를 갖는 지질 나노입자 내에 캡슐화된 것인 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물:
    LNP 조성(몰%):
    40-65% iLipid
    2-20% DSPC
    1-5% PEG
    나머지 몰% 밸런스는 콜레스테롤;
    LNP 입자 크기: 55-120 nm Z 평균 유체역학적 직경; 및
    동적 광산란에 의해 결정된 <0.2의 다분산 지수.
  100. 제88항에 있어서, mRNA 및 gRNA는 50-70 nm Z 평균 유체역학적 직경의 LNP 입자 크기를 갖는 지질 나노입자 내에 캡슐화된 것인 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
  101. 제88항에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 0.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 40% 초과의 평균 편집 백분율로 시노몰구스 원숭이의 간의 PCSK9 표적 스플라이스 부위에서 아데닌 염기 편집을 유도할 수 있는 것인 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
  102. 제88항에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 0.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 50% 초과의 평균 편집 백분율로 시노몰구스 원숭이의 간의 PCSK9 표적 스플라이스 부위에서 아데닌 염기 편집을 유도할 수 있는 것인 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
  103. 제88항에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 0.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 30% 초과의 평균 편집 백분율로 시노몰구스 원숭이의 간의 PCSK9 표적 스플라이스 부위에서 아데닌 염기 편집을 유도할 수 있는 것인 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
  104. 제88항에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 40% 초과의 평균 편집 백분율로 시노몰구스 원숭이의 간의 PCSK9 표적 스플라이스 부위에서 아데닌 염기 편집을 유도할 수 있는 것인 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
  105. 제88항에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 50% 초과의 평균 편집 백분율로 시노몰구스 원숭이의 간의 PCSK9 표적 스플라이스 부위에서 아데닌 염기 편집을 유도할 수 있는 것인 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
  106. 제88항에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 60% 초과의 평균 편집 백분율로 시노몰구스 원숭이의 간의 PCSK9 표적 스플라이스 부위에서 아데닌 염기 편집을 유도할 수 있는 것인 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
  107. 제88항에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 70% 초과의 평균 편집 백분율로 시노몰구스 원숭이의 간의 PCSK9 표적 스플라이스 부위에서 아데닌 염기 편집을 유도할 수 있는 것인 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
  108. 제88항에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 40% 초과의 평균 편집 백분율로 시노몰구스 원숭이의 간의 PCSK9 표적 스플라이스 부위에서 아데닌 염기 편집을 유도할 수 있는 것인 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
  109. 제88항에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 50% 초과의 평균 편집 백분율로 시노몰구스 원숭이의 간의 PCSK9 표적 스플라이스 부위에서 아데닌 염기 편집을 유도할 수 있는 것인 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
  110. 제88항에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 60% 초과의 평균 편집 백분율로 시노몰구스 원숭이의 간의 PCSK9 표적 스플라이스 부위에서 아데닌 염기 편집을 유도할 수 있는 것인 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
  111. 제88항에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 70% 초과의 평균 편집 백분율로 시노몰구스 원숭이의 간의 PCSK9 표적 스플라이스 부위에서 아데닌 염기 편집을 유도할 수 있는 것인 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
  112. 제88항에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 80% 초과의 평균 편집 백분율로 시노몰구스 원숭이의 간의 PCSK9 표적 스플라이스 부위에서 아데닌 염기 편집을 유도할 수 있는 것인 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
  113. 제88항에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 3 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 40% 초과의 평균 편집 백분율로 시노몰구스 원숭이의 간의 PCSK9 표적 스플라이스 부위에서 아데닌 염기 편집을 유도할 수 있는 것인 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
  114. 제88항에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 3 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 50% 초과의 평균 편집 백분율로 시노몰구스 원숭이의 간의 PCSK9 표적 스플라이스 부위에서 아데닌 염기 편집을 유도할 수 있는 것인 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
  115. 제88항에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 3 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 60% 초과의 평균 편집 백분율로 시노몰구스 원숭이의 간의 PCSK9 표적 스플라이스 부위에서 아데닌 염기 편집을 유도할 수 있는 것인 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
  116. 제88항에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 3 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 70% 초과의 평균 편집 백분율로 시노몰구스 원숭이의 간의 PCSK9 표적 스플라이스 부위에서 아데닌 염기 편집을 유도할 수 있는 것인 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
  117. 제88항에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 3 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 80% 초과의 평균 편집 백분율로 시노몰구스 원숭이의 간의 PCSK9 표적 스플라이스 부위에서 아데닌 염기 편집을 유도할 수 있는 것인 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
  118. 제87항 내지 제117항 중 어느 하나의 항에 있어서, 퍼센트 편집율은, 시노몰구스 원숭이의 간 생검 또는 부검에 의해, 투여된 시노몰구스 원숭이 간의 분석을 통해 투여 후 15일에 결정되는 것인 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
  119. 제87항 내지 제117항 중 어느 하나의 항에 있어서, 퍼센트 편집율은, 투여 후 적어도 168일의 범위에 걸쳐, 투여된 시노몰구스 원숭이의 주기적인 간 생검 테스트에 의해 지속적으로 유지되는 것으로 결정되는 것인 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
  120. 제87항 내지 제117항 중 어느 하나의 항에 있어서, 퍼센트 편집율은, 투여 후 적어도 300일의 범위에 걸쳐, 투여된 시노몰구스 원숭이의 주기적인 간 생검 테스트에 의해 지속적으로 유지되는 것으로 결정되는 것인 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
  121. 제88항에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 0.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 PCSK9 단백질을 기준선과 비교하여 평균 35% 이상 감소시킬 수 있는 것인 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
  122. 제88항에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 0.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 PCSK9 단백질을 기준선과 비교하여 평균 40% 이상 감소시킬 수 있는 것인 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
  123. 제88항에 있어서, 조성물은 원숭이 체중 1 kg당 대략 0.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 PCSK9 단백질을 기준선과 비교하여 평균 50% 이상 감소시킬 수 있는 것인 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
  124. 제88항에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 0.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 원숭이의 혈장에서 PCSK9 단백질을 기준선과 비교하여 평균 60% 이상 감소시킬 수 있는 것인 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
  125. 제88항에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 0.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 PCSK9 단백질을 기준선과 비교하여 평균 70% 이상 감소시킬 수 있는 것인 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
  126. 제88항에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 0.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 PCSK9 단백질을 기준선과 비교하여 평균 80% 이상 감소시킬 수 있는 것인 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
  127. 제88항에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 PCSK9 단백질을 기준선과 비교하여 평균 35% 이상 감소시킬 수 있는 것인 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
  128. 제88항에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 PCSK9 단백질을 기준선과 비교하여 평균 40% 이상 감소시킬 수 있는 것인 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
  129. 제88항에 있어서, 조성물은 원숭이 체중 1 kg당 대략 1 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 PCSK9 단백질을 기준선과 비교하여 평균 50% 이상 감소시킬 수 있는 것인 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
  130. 제88항에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 PCSK9 단백질을 기준선과 비교하여 평균 60% 이상 감소시킬 수 있는 것인 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
  131. 제88항에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 PCSK9 단백질을 기준선과 비교하여 평균 70% 이상 감소시킬 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
  132. 제88항에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 PCSK9 단백질을 기준선과 비교하여 평균 80% 이상 감소시킬 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
  133. 제88항에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 PCSK9 단백질을 기준선과 비교하여 평균 35% 이상 감소시킬 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
  134. 제88항에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 PCSK9 단백질을 기준선과 비교하여 평균 40% 이상 감소시킬 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
  135. 제88항에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 PCSK9 단백질을 기준선과 비교하여 평균 50% 이상 감소시킬 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
  136. 제88항에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 PCSK9 단백질을 기준선과 비교하여 평균 60% 이상 감소시킬 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
  137. 제88항에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 PCSK9 단백질을 기준선과 비교하여 평균 70% 이상 감소시킬 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
  138. 제88항에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 PCSK9 단백질을 기준선과 비교하여 평균 80% 이상 감소시킬 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
  139. 제88항에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 3 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 PCSK9 단백질을 기준선과 비교하여 평균 35% 이상 감소시킬 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
  140. 제88항에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 3 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 PCSK9 단백질을 기준선과 비교하여 평균 40% 이상 감소시킬 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
  141. 제88항에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 3 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 PCSK9 단백질을 기준선과 비교하여 평균 50% 이상 감소시킬 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
  142. 제88항에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 3 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 PCSK9 단백질을 기준선과 비교하여 평균 60% 이상 감소시킬 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
  143. 제88항에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 3 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 PCSK9 단백질을 기준선과 비교하여 평균 70% 이상 감소시킬 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
  144. 제88항에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 3 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 PCSK9 단백질을 기준선과 비교하여 평균 80% 이상 감소시킬 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
  145. 제121항 내지 제144항 중 어느 하나의 항에 있어서, 혈장 단백질의 감소는 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈액 샘플링 및 분석을 통해 투여 후 15일에 결정되는 것인 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
  146. 제88항에 있어서, 조성물은 원숭이 체중 1 kg당 대략 0.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 원숭이의 혈장에서 LDL-C를 기준선과 비교하여 평균 20% 이상 감소시킬 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
  147. 제88항에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 0.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 LDL-C를 기준선과 비교하여 평균 25% 이상 감소시킬 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
  148. 제88항에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 0.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 LDL-C를 기준선과 비교하여 평균 30% 이상 감소시킬 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
  149. 제88항에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 0.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 LDL-C를 기준선과 비교하여 평균 35% 이상 감소시킬 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
  150. 제88항에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 0.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 LDL-C를 기준선과 비교하여 평균 40% 이상 감소시킬 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
  151. 제88항에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 0.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 LDL-C를 기준선과 비교하여 평균 45% 이상 감소시킬 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
  152. 제88항에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 LDL-C를 기준선과 비교하여 평균 20% 이상 감소시킬 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
  153. 제88항에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 LDL-C를 기준선과 비교하여 평균 25% 이상 감소시킬 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
  154. 제88항에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 LDL-C를 기준선과 비교하여 평균 30% 이상 감소시킬 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
  155. 제88항에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 LDL-C를 기준선과 비교하여 평균 35% 이상 감소시킬 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
  156. 제88항에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 LDL-C를 기준선과 비교하여 평균 40% 이상 감소시킬 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
  157. 제88항에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 LDL-C를 기준선과 비교하여 평균 45% 이상 감소시킬 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
  158. 제88항에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 LDL-C를 기준선과 비교하여 평균 50% 이상 감소시킬 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
  159. 제88항에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 LDL-C를 기준선과 비교하여 평균 55% 이상 감소시킬 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
  160. 제88항에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 LDL-C를 기준선과 비교하여 평균 60% 이상 감소시킬 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
  161. 제88항에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 LDL-C를 기준선과 비교하여 평균 20% 이상 감소시킬 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
  162. 제88항에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 LDL-C를 기준선과 비교하여 평균 25% 이상 감소시킬 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
  163. 제88항에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 LDL-C를 기준선과 비교하여 평균 30% 이상 감소시킬 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
  164. 제88항에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 LDL-C를 기준선과 비교하여 평균 35% 이상 감소시킬 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
  165. 제88항에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 LDL-C를 기준선과 비교하여 평균 40% 이상 감소시킬 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
  166. 제88항에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 LDL-C를 기준선과 비교하여 평균 45% 이상 감소시킬 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
  167. 제88항에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 LDL-C를 기준선과 비교하여 평균 50% 이상 감소시킬 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
  168. 제88항에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 LDL-C를 기준선과 비교하여 평균 55% 이상 감소시킬 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
  169. 제88항에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 LDL-C를 기준선과 비교하여 평균 60% 이상 감소시킬 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
  170. 제88항에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 1.5 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 LDL-C를 기준선과 비교하여 평균 65% 이상 감소시킬 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
  171. 제88항에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 3 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 LDL-C를 기준선과 비교하여 평균 20% 이상 감소시킬 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
  172. 제88항에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 3 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 LDL-C를 기준선과 비교하여 평균 25% 이상 감소시킬 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
  173. 제88항에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 3 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 LDL-C를 기준선과 비교하여 평균 30% 이상 감소시킬 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
  174. 제88항에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 3 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 LDL-C를 기준선과 비교하여 평균 35% 이상 감소시킬 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
  175. 제88항에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 3 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 LDL-C를 기준선과 비교하여 평균 40% 이상 감소시킬 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
  176. 제88항에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 3 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 LDL-C를 기준선과 비교하여 평균 45% 이상 감소시킬 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
  177. 제88항에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 3 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 LDL-C를 기준선과 비교하여 평균 50% 이상 감소시킬 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
  178. 제88항에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 3 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 LDL-C를 기준선과 비교하여 평균 55% 이상 감소시킬 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
  179. 제88항에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 3 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 LDL-C를 기준선과 비교하여 평균 60% 이상 감소시킬 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
  180. 제88항에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 3 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 LDL-C를 기준선과 비교하여 평균 65% 이상 감소시킬 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
  181. 제148항 내지 제180항 중 어느 하나의 항에 있어서, LDL-C의 감소는 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈액 샘플링 및 분석을 통해 투여 후 15일에 결정되는 것인 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
  182. 제148항 내지 제180항 중 어느 하나의 항에 있어서, LDL-C의 감소는 투여된 시노몰구스 원숭이의 주기적 혈액 샘플링 및 분석에 의해 적어도 168일의 범위에 걸쳐 지속적으로 유지되는 것으로 결정되는 것인 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
  183. 제148항 내지 제182항에 있어서, LDL-C의 감소는 투여된 시노몰구스 원숭이의 주기적 혈액 샘플링 및 분석에 의해 적어도 300일의 범위에 걸쳐 지속적으로 유지되는 것으로 결정되는 것인 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
  184. 제88항에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 3 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 지단백질(a)를 기준선과 비교하여 평균 10% 이상 감소시킬 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
  185. 제88항에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 3 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 지단백질(a) 수준을 기준선과 비교하여 평균 15% 이상 감소시킬 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
  186. 제88항에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 3 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 지단백질(a) 수준을 기준선과 비교하여 평균 20% 이상 감소시킬 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
  187. 제88항에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 3 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 지단백질(a) 수준을 기준선과 비교하여 평균 25% 이상 감소시킬 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
  188. 제88항에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 3 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 지단백질(a) 수준을 기준선과 비교하여 평균 30% 이상 감소시킬 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
  189. 제88항에 있어서, 조성물은 시노몰구스 원숭이 체중 1 kg당 대략 3 mg의 가이드 RNA 및 mRNA 합산 총 중량의 용량으로 정맥 내 주입을 통해 시노몰구스 원숭이 군에 투여될 때 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈장에서 지단백질(a) 수준을 기준선과 비교하여 평균 대략 35% 감소시킬 수 있는 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
  190. 제186항 내지 제189항 중 어느 하나의 항에 있어서, 지단백질(a)의 감소는 투여된 시노몰구스 원숭이의 혈액 샘플링 및 분석을 통해 투여 후 15일에 결정되는 것인 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
  191. 제186항 내지 제189항 중 어느 하나의 항에 있어서, 지단백질(a)의 감소는 투여된 시노몰구스 원숭이의 주기적 혈액 샘플링 및 분석에 의해 적어도 224일의 범위에 걸쳐 지속적으로 유지되는 것으로 결정되는 것인 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
  192. 제186항 내지 제189항 중 어느 하나의 항에 있어서, 지단백질(a)의 감소는 투여된 시노몰구스 원숭이의 주기적 혈액 샘플링 및 분석에 의해 적어도 300일의 범위에 걸쳐 지속적으로 유지되는 것으로 결정되는 것인 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
  193. 제101항 내지 제192항 중 어느 하나의 항에 있어서, 시노몰구스 원숭이의 투여가 AST, ALT, 또는 사이토카인의 상승을 초래하는 정도로, 조성물의 투여로 인한 상승은 일시적이고 투여 후 3-15일 이내에 대략 기준선 수준으로 다시 해소되는 것인 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
  194. 제101항 내지 제103항, 제121항 내지 제126항, 제148항 내지 제153항 중 어느 하나의 항에 있어서, PCSK9의 퍼센트 편집율은 도 27에 도시된 바와 같이 간, 비장 및 부신 조직의 외부에서 무시할 수 있는 것인 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
  195. 제101항 내지 제107항, 제121항 내지 제132항, 제148항 내지 제162항 중 어느 하나의 항에 있어서, 반복 투여 결과는 PCSK9 편집 백분율의 편집 백분율과 관련하여 부가적인 것인 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
  196. 제195항에 있어서, 반복 투여는 사이토카인 활성화도 면역 반응도 유발하지 않는 것인 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
  197. 제88항에 있어서, 스페이서 서열은 PCSK9 유전자 상의 표적화된 프로토스페이서의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%의 뉴클레오티드 상관관계를 가지며, 스페이서 서열 상의 RNA 뉴클레오티드는 DNA 뉴클레오티드와 동일한 뉴클레오티드를 동일한 순서로 가질 경우 프로토스페이서의 DNA 뉴클레오티드와 상관관계에 있고 우라실 및 티민 염기는 상관관계를 결정하기 위해 동일한 뉴클레오티드로 간주되는 것인 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
  198. 제197항에 있어서, 스페이서 서열은 PCSK9 유전자 상의 표적화된 프로토스페이서의 뉴클레오티드 서열과 적어도 85%의 뉴클레오티드 상관관계를 갖는 것인 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
  199. 제197항에 있어서, 스페이서 서열은 PCSK9 유전자 상의 표적화된 프로토스페이서의 뉴클레오티드 서열과 적어도 90%의 뉴클레오티드 상관관계를 갖는 것인 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
  200. 제197항에 있어서, 스페이서 서열은 PCSK9 유전자 상의 표적화된 프로토스페이서의 뉴클레오티드 서열과 적어도 95%의 뉴클레오티드 상관관계를 갖는 것인 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
  201. 제197항에 있어서, 스페이서 서열은 PCSK9 유전자 상의 표적화된 프로토스페이서의 뉴클레오티드 서열과 적어도 99%의 뉴클레오티드 상관관계를 갖는 것인 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
  202. 제197항에 있어서, 스페이서 서열은 PCSK9 유전자 상의 표적화된 프로토스페이서의 뉴클레오티드 서열과 적어도 100%의 뉴클레오티드 상관관계를 갖는 것인 PCSK9 유전자를 편집하기 위한 조성물.
  203. 죽상동맥경화성 심혈관 질환의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하는 방법으로서,
    (a) 편집 창을 갖는 아데닌 염기 에디터 단백질을 코딩하는 mRNA,
    (b) 염기 에디터 단백질에 대한 결합 스캐폴드 역할을 하는 tracr 서열 및 염기 에디터 단백질을 PCSK9 유전자 상의 프로토스페이서 서열로 안내하는 역할을 하는 스페이서 서열을 포함하는 제1 가이드 RNA로서, 스페이서 서열은 PCSK9 유전자의 스플라이스 부위 또는 엑손 영역에 적어도 부분적으로 상보적인 것인 제1 가이드 RNA; 및
    (c) 염기 에디터 단백질에 대한 결합 스캐폴드 역할을 하는 tracr 서열 및 염기 에디터 단백질을 ANGPTL3 유전자 상의 프로토스페이서 서열로 안내하는 역할을 하는 스페이서 서열을 포함하는 제2 가이드 RNA로서, 스페이서 서열은 ANGPTL3 유전자의 스플라이스 부위 또는 엑손 영역에 적어도 부분적으로 상보적인 것인 제2 가이드 RNA
    의 치료 유효량을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  204. 제203항에 있어서, (a)를 둘러싸는 제1 LNP를 추가로 포함하는 방법.
  205. 제204항에 있어서, 제1 LNP는 (b) 및 (c)를 둘러싸는 것인 방법.
  206. 제204항에 있어서, 제1 LNP는 반복적으로 투여되는 것인 방법.
  207. 제204항에 있어서, 제1 LNP는 1 내지 60일의 간격으로 반복적으로 투여되는 것인 방법.
  208. 제204항에 있어서, 제1 LNP는 7일의 간격으로 반복적으로 투여되는 것인 방법.
  209. 제204항에 있어서, 제1 LNP는 (b)를 추가로 둘러싸는 것인 방법.
  210. 제209항에 있어서, (a) 및 (c)를 둘러싸는 제2 LNP를 추가로 포함하는 방법.
  211. 제210항에 있어서, 제1 LNP 및 제2 LNP는 순차적으로 투여되는 것인 방법.
  212. 제211항에 있어서, 제1 LNP 및 제2 LNP는 1일 내지 12개월의 간격으로 순차적으로 투여되는 것인 방법.
  213. 제212항에 있어서, 간격은 1일인 방법.
  214. 제212항에 있어서, 간격은 5일인 방법.
  215. 제212항에 있어서, 간격은 10일인 방법.
  216. 제212항에 있어서, 간격은 15일인 방법.
  217. 제212항에 있어서, 간격은 20일인 방법.
  218. 제212항에 있어서, 간격은 25일인 방법.
  219. 제212항에 있어서, 간격은 1개월인 방법.
  220. 제212항에 있어서, 간격은 2개월인 방법.
  221. 제212항에 있어서, 간격은 3개월인 방법.
  222. 제212항에 있어서, 간격은 5개월인 방법.
  223. 제212항에 있어서, 간격은 8개월인 방법.
  224. 제212항에 있어서, 간격은 10개월인 방법.
  225. 제212항에 있어서, 간격은 12개월인 방법.
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