KR20160027019A - 뎅기 바이러스 백신에 대한 방법 및 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 뎅기 바이러스 E 당단백질 백본의 뎅기 바이러스 혈청형과 상이한 뎅기 바이러스 혈청형으로부터 항체에 의해 인식되는 에피토프를 도입하는 아미노산 치환을 포함하는 뎅기 바이러스 E 당단백질 백본을 포함하는 키메라 뎅기 바이러스 E 당단백질을 포함하는 조성물 및 사용 방법을 제공한다.

Description

뎅기 바이러스 백신에 대한 방법 및 조성물 {METHODS AND COMPOSITIONS FOR DENGUE VIRUS VACCINES}

우선권의 진술

본원은 35 U.S.C. § 119(e) 하에 2013년 6월 26일에 출원된 미국 가출원 일련 번호 61/839,687에 대한 이익을 주장하며, 그 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.

정부 지원의 진술

본 발명은 미국 국립 보건원에 의해 수여된 승인 번호 U54 AI057157 하에 정부 지원으로 이루어졌다. 미국 정부는 본 발명에서 특정 권리를 갖는다.

발명의 분야

본 발명은 단일 공급원으로부터 1종 초과의 뎅기 바이러스 혈청형에 대한 중화 항체를 유도하는 뎅기 바이러스 백신에 관한 것이다.

뎅기는 전례없는 속도로 확산되고 50개를 초과하는 국가에서 주요 건강 및 경제적 부담으로 발전된 모기-매개 플라비바이러스이다. 모든 4종의 DENV 혈청형으로부터 보호하는 현행 DENV 백신은 각각 그러한 혈청형에 대한 보호를 제공하도록 의도되는 4종 바이러스 또는 4종 재조합 단백질의 "4가" 제제로서 전달되어야 한다. 최근에 가장 진전된 4가 생 약독화 키메라 바이러스가 태국에서의 대규모 2B상 시험에서 임상적으로 의미있는 보호를 제공하는데 실패한 것에 의해 분명해진 바와 같이, 균형잡힌 항체 반응을 달성하기 위한 4가 칵테일에서 혈청형의 정확한 혼합은 알려져 있지 않다 (Sabchareon A, et al., 2012). 1종 이상의 바이러스 혈청형이 다른 것을 경쟁에서 이기기 때문에 바이러스 간섭이 실패를 야기하는 것으로 생각된다. DENV-1/3 및 DENV 3/1 키메라 바이러스는 DENV-1 및 DENV-3 면역 개체 둘 다로부터의 중화 항체에 의해 인식되는 에피토프를 제시하는 단일 바이러스이다. 이는 2종의 바이러스 (DENV-1 및 3)를 1종의 바이러스 (DENV-1/3 또는 DENV-3/1)로 대체하여, 단일 바이러스가 2종의 혈청형을 한 번에 표적화하는 중화 항체를 도출할 수 있어야 함을 나타낸다.

<도면의 간단한 설명>

도 1a-b. DENV-1/3 돌연변이체의 경우에, DENV3으로부터의 EDI-II 힌지를 DENV-1 배경, WestPac'74로 이식하여, DENV-3/1 힌지 돌연변이체를 생성하였다. EDI-II 힌지는 DENV3 특이적 인간 mAb 5J7을 사용하여 규정되었다. a) 생성된 바이러스, rDENV-1/3을 모노클로날 항체 5J7에 대해 시험하였다. 본 도면은 DENV-1이 5J7에 의해 중화되지 않지만, DENV-3은 중화됨을 제시한다. 오직 DENV-3 EDI/II 힌지 만을 함유하는 rDENV-1/3은 DENV-3 중화 농도와 등가인 농도에서 5J7에 의해 중화된다. 이는 DENV-1로의 5J7 에피토프의 성공적인 이식을 입증한다. b) 본 패널은 DENV-3이 mAb 1F4에 의해 중화되지 않고, DENV-1은 1F4에 의해 중화되고, rDENV-1/3이 또한 중화됨을 제시하고, 이는 1F4가 키메라 바이러스에 여전히 결합하여 이를 중화시킬 수 있음을 나타낸다.

도 2a-b. 본 도면은 DENV-1, DENV-3 및 힌지 키메라 바이러스 WestPac-3001 힌지 (rDENV-1/3)에 대해 시험된 1차 DENV-1 및 DENV-3 인간 면역 혈청을 제시한다. Y - 축은 조직 배양에서 투입된 바이러스의 50%를 중화시키는데 요구되는 면역 혈청의 배수 희석을 제시한다. 보다 높은 값은 보다 강력한 혈청을 나타낸다. a) DENV-1 1차 면역 혈청은 DENV-1을 강력하게 중화시키지만 DENV-3은 그렇지 않다. rDENV-1/3은 DENV-1과 유사한 농도에서 DENV-1 면역 혈청에 의한 중화에 감수성이며, 이는 모 DENV-3 바이러스와 대조적으로 키메라 바이러스가 DENV-1 면역 혈청에 의해 인식되는 에피토프를 디스플레이함을 나타낸다. b) DENV-3 1차 면역 혈청은 DENV-1을 중화시키지 않지만 DENV-3은 중화시킨다. rDENV-1/3은 DENV-3과 유사한 농도에서 DENV-3 1차 면역 혈청에 의해 중화되며, 이는 키메라 바이러스 rDENV-1/3이 DENV-3 인간 면역 혈청 중 DENV-3 항체에 의해 표적화되는 중요한 DENV-3 에피토프를 보존함을 나타낸다. *는 중화되지 않았음을 나타낸다.

도 3. 본 도면은 WestPac'74 3001-힌지가 레서스 마카크(rhesus macaque)에서 28, 60, 90, 120 및 180의 감염 후 일수에 교차-중화 항체를 광범위하게 유도함을 제시한다. Y 축은 상기와 같이 중화 항체 역가를 나타낸다. X 축은 각각의 바이러스 혈청형을 나타낸다. 각각의 플롯팅 지점은 주어진 혈청형에 대한 단일 레서스 마카크에 대한 중화 역가이다. 지점의 각 클러스터를 통한 중심 선은 각각의 혈청형에 대한 각각의 마카크 군에 대한 기하 평균 중화 역가이다. 위스커는 평균의 표준 오차를 제시한다. 각각의 시점 (28, 30, 60, 90, 120, 180일)은 모든 4종의 혈청형에 대한 광범위한 교차-중화 항체 반응을 제시한다.

도 4a-b. DENV-3/1 돌연변이체의 경우에, DENV1 (WestPac '74)로부터의 모노클로날 항체 1F4 풋프린트에 의해 규정된 EDI-II 힌지를 DENV-3 배경 (3001)에 이식하여 DENV-1/3 힌지 돌연변이체를 생성하였다. 이러한 이식을 3종의 상이한 바이러스 (1F4S, 1F4R, 및 1F4E)에 대해 실행하였고, 각각의 변이체는 보다 큰 에피토프 영역을 나타내었다. rDENV-3으로부터의 EDI-II 힌지를 재조합 rDENV-1 바이러스에 넣었다. 본 도면은 Y-축 상의 광학 밀도 (OD)에 의한 항체의 상대 결합 및 X-축 상의 증가하는 항체 농도에 의한, 효소 연결 면역흡착 검정 (ELISA) 데이터를 제시한다. a) 3001-1F4S, R 및 E에 대한 mAb 1F4의 결합. 키메라 바이러스에 대한 상승 곡선은, mAb 1F4와 결합하지 않는 모 3001과 대조적인, 항체의 결합을 제시한다. b) 모 3001, 3001-1F4S, R 및 E에 대한 mAb 5J7의 결합. 5J7 결합은 이들 바이러스에서 보존되는 반면에, 에피토프 공여자 icWestPac '74는 5J7과 결합하지 않는다.

도 5a-b. 본 도면은 DENV-1, DENV-3 및 힌지 키메라 바이러스 3001-1F4E에 대해 시험된 1차 DENV-1 및 DENV-3 인간 면역 혈청을 제시한다. Y - 축은 조직 배양에서 투입된 바이러스의 50%를 중화시키는데 요구되는 면역 혈청의 배수 희석을 제시한다. 보다 높은 값은 보다 강력한 혈청을 나타낸다. a) DENV-1 1차 면역 혈청은 DENV-1을 강력하게 중화시키지만 DENV-3은 그렇지 않다. 3001 1F4E는 DENV-1과 유사한 농도에서 DENV-1 면역 혈청에 의한 중화에 감수성이며, 이는 모 DENV-3 바이러스와 대조적으로 키메라 바이러스가 DENV-1 면역 혈청에 의해 인식되는 에피토프를 디스플레이함을 나타낸다. b) DENV-3 1차 면역 혈청은 DENV-1을 중화시키지 않지만 DENV-3은 중화시킨다. 3001 1F4E는 DENV-3과 유사한 농도에서 DENV-3 1차 면역 혈청에 의해 중화되며, 이는 키메라 바이러스 3001-1F4E가 DENV-3 인간 면역 혈청 중 DENV-3 항체에 의해 표적화되는 중요한 DENV-3 에피토프를 보존함을 나타낸다.

도 6. 레서스 마카크에서 3001-1F4E의 면역원성. WestPac-3001 힌지에 대해 관찰된 것과 일치하는, 광범위한 교차-중화 항체를 제시하는 한 시점 만을 제공한다.

본 발명은 뎅기 바이러스 E 당단백질 백본의 뎅기 바이러스 혈청형과 상이한 뎅기 바이러스 혈청형과 반응성인 항체에 의해 인식되는 에피토프를 도입하는 아미노산 치환을 포함하는 뎅기 바이러스 E 당단백질 백본을 포함하는 키메라 뎅기 바이러스 E 당단백질을 제공한다. 한 실시양태에서, 뎅기 바이러스 E 당단백질 백본은 뎅기 바이러스 혈청형 1로부터의 것이고, 한 실시양태에서 뎅기 바이러스 E 당단백질 백본은 뎅기 바이러스 혈청형 3으로부터의 것이다. 일부 실시양태에서 항체는 뎅기 바이러스 혈청형 3과 반응성이고 (예를 들어, 모노클로날 항체 5J7), 다른 실시양태에서 항체는 뎅기 바이러스 혈청형 1과 반응성이다 (예를 들어, 모노클로날 항체 1F4).

본 발명은 하기 아미노산 서열:

을 포함하는 키메라 뎅기 바이러스 E 당단백질을 추가로 제공한다.

또한 본원은 하기 아미노산 서열:

을 포함하는 키메라 뎅기 바이러스 E 당단백질을 제공한다.

추가로 본원은 본 발명의 E 당단백질을 포함하는 플라비바이러스 입자 또는 바이러스 유사 입자 (VLP)를 제공한다.

본 발명의 E 당단백질을 코딩하는 단리된 핵산 분자, 뿐만 아니라 본 발명의 플라비바이러스 입자 또는 VLP를 코딩하는 단리된 핵산 분자가 또한 본원에서 제공된다.

본 발명은 또한 제약상 허용되는 담체 중 본 발명의 E 당단백질을 포함하는 조성물을 제공하고, 제약상 허용되는 담체 중 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 대상체 (예를 들어, 뎅기 바이러스에 대한 면역 반응의 생성을 필요로 하는 대상체)에게 본 발명의 E 당단백질, 본 발명의 플라비바이러스 입자, 본 발명의 핵산 분자 및/또는 본 발명의 조성물 및 그의 임의의 조합의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 뎅기 바이러스에 대한 면역 반응을 생성하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 대상체에게 본 발명의 E 당단백질, 본 발명의 플라비바이러스 입자, 임의의 본 발명의 핵산 분자 및/또는 본 발명의 조성물 및 그의 임의의 조합의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 뎅기 바이러스 감염을 치료하는 방법을 제공한다.

추가로 본원은 대상체 (예를 들어, 뎅기 바이러스 감염의 예방을 필요로 하는 대상체)에게 본 발명의 E 당단백질, 본 발명의 플라비바이러스 입자, 임의의 본 발명의 핵산 분자 및/또는 본 발명의 조성물 및 그의 임의의 조합의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 뎅기 바이러스 감염을 예방하는 방법을 제공한다.

대상체 (예를 들어, 뎅기 바이러스 감염의 영향으로부터 보호를 필요로 하는 대상체)에게 본 발명의 E 당단백질, 본 발명의 플라비바이러스 입자, 임의의 본 발명의 핵산 분자 및/또는 본 발명의 조성물 및 그의 임의의 조합의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 뎅기 바이러스 감염의 영향으로부터 대상체를 보호하는 방법이 또한 본원에서 제공된다.

본 발명은 추가로, 대상체에서 뎅기 바이러스에 대한 면역 반응을 생성하고/거나, 뎅기 바이러스 감염의 치료를 필요로 하는 대상체에서 뎅기 바이러스 감염을 치료하고/거나, 대상체에서 뎅기 바이러스 감염을 예방하고/거나, 뎅기 바이러스 감염의 영향으로부터 대상체를 보호하기 위한 의약의 제조에 사용하기 위한, 본 발명의 E 당단백질, 본 발명의 플라비바이러스 입자, 본 발명의 핵산 분자 및/또는 본 발명의 조성물을 제공한다.

또한 본원은 대상체에서 뎅기 바이러스에 대한 면역 반응을 생성하고/거나, 뎅기 바이러스 감염의 치료를 필요로 하는 대상체에서 뎅기 바이러스 감염을 치료하고/거나, 대상체에서 뎅기 바이러스 감염을 예방하고/거나, 뎅기 바이러스 감염의 영향으로부터 대상체를 보호하는데 사용하기 위한 본 발명의 E 당단백질, 본 발명의 플라비바이러스 입자, 본 발명의 핵산 분자 및/또는 본 발명의 조성물의 용도를 제공한다.

본 발명은 DENV 혈청형을 규정하는 에피토프 영역을 상이한 DENV 혈청형의 단백질 백본으로 전달하여, 둘 다의 혈청형에 대한 항체 표적을 함유함으로써 단일 공급원으로부터 2종의 상이한 DENV 혈청형에 대한 중화 항체를 유도할 수 있는 2가 백신으로서 기능하는 키메라 분자를 생성할 수 있다는 예상치 못한 발견을 기반으로 한다. 따라서, 한 실시양태에서, 본 발명은 뎅기 바이러스 E 당단백질 백본의 뎅기 바이러스 혈청형과 상이한 뎅기 바이러스 혈청형과 반응성인 항체에 의해 인식되는 에피토프를 도입하는 아미노산 치환을 포함하는 키메라 뎅기 바이러스 E 당단백질 백본의 구축을 위한 플랫폼을 제공한다.

일부 실시양태에서, 뎅기 바이러스 E 당단백질 백본은 뎅기 바이러스 혈청형 1로부터의 것이다. 일부 실시양태에서, 뎅기 바이러스 E 당단백질 백본은 뎅기 바이러스 혈청형 2, 뎅기 바이러스 혈청형 3 또는 뎅기 바이러스 혈청형 4로부터의 것일 수 있다.

일부 실시양태에서, 뎅기 바이러스 E 당단백질 백본의 뎅기 바이러스 혈청형과 상이한 뎅기 바이러스 혈청형과 반응성인 항체는 뎅기 바이러스 혈청형 3과 반응성인 항체이다. 이러한 항체의 비제한적 예는 모노클로날 항체 5J7이다.

다른 실시양태에서, 뎅기 바이러스 E 당단백질 백본의 뎅기 바이러스 혈청형과 상이한 뎅기 바이러스 혈청형과 반응성인 항체는 뎅기 바이러스 혈청형 1, 뎅기 바이러스 혈청형 2 또는 뎅기 바이러스 혈청형 4와 반응성인 항체이다.

뎅기 바이러스 E 당단백질 백본에 대한 제1 뎅기 바이러스 혈청형 및 E 당단백질 백본 내에 도입된 에피토프를 인식하는 항체의 표적인 제2 뎅기 바이러스 혈청형의 임의의 조합이 사용될 수 있지만, 단 제1 뎅기 바이러스 혈청형 및 제2 뎅기 바이러스 혈청형은 상이하다는 것 (즉, 동일한 혈청형이 아님)이 이해되어야 한다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 키메라 뎅기 바이러스 E 당단백질은 하기 아미노산 서열을 포함하거나, 그로 본질적으로 이루어거나, 또는 그로 이루어질 수 있다:

WestPac74-3001 힌지 (rDENV-1/3)

일부 실시양태에서, 본 발명의 키메라 뎅기 바이러스 E 당단백질은 하기 아미노산 서열을 포함하거나, 그로 본질적으로 이루어거나, 또는 그로 이루어질 수 있다:

3001-1F4E (rDENV-3/1)

본 발명은 또한 본 발명의 키메라 E 당단백질을 포함하는 플라비바이러스 입자 또는 바이러스 유사 입자 (VLP)를 제공한다.

본 발명의 키메라의 생성은 표 1에서 확인되는 아미노산 치환의 일부 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15개 등) 또는 전부를 뎅기 바이러스 E 당단백질 백본 또는 플라비바이러스 E 당단백질 백본 내로 도입하는 것에 의해 수행될 수 있다. 표 1에서 확인되는 모든 아미노산이 본 발명의 키메라 단백질의 생성을 위해 치환되도록 요구되는 것은 아니다. 예를 들어, 일부 실시양태에서 각각의 에피토프 영역으로서 표 1에서 확인되는 인접 아미노산 서열의 어느 한 말단에서 약 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산의 추가의 치환 및/또는 치환의 생략이 본 발명의 키메라의 생성에 포함될 수 있다. 목적하는 입체형태적 에피토프를 생성하는데 필요한 치환의 수는 본원의 교시에 따라, 그리고 관련 기술분야에 널리 공지되어 있는 프로토콜에 따라 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 표 1에서 아미노산 위치 넘버링은 본원에 제공된 바와 같은 WestPac74 (DENV-1)의 아미노산 서열 또는 UNC 3001 (DENV-3)의 아미노산 서열을 기반으로 한다. 그러나 다른 뎅기 바이러스 E 당단백질 아미노산 서열 또는 다른 플라비바이러스 E 당단백질 아미노산 서열에서 동등한 아미노산 위치가 용이하게 확인될 수 있고, 본 발명의 키메라 단백질의 생성에 사용될 수 있음은 통상의 기술자에 의해 용이하게 이해될 것이다.

표 2는 DENV-3과 반응성인 모노클로날 항체 5J7에 의해 인식되는 에피토프를 도입하기 위해 DENV-1 E 당단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 대해 이루어질 수 있는 변형의 한 예를 제시한다. 이들 치환을 포함하는 뉴클레오티드 서열의 번역으로부터 생성된 아미노산 서열은 다음과 같다:

표 2에 제공된 변형은 상기 아미노산 서열을 수득할 수 있는 방법의 한 예를 제공하며, 아미노산 코돈의 축중성으로 인해 이러한 아미노산 서열을 수득하기 위해 DENV-3 E 당단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 수많은 다른 변형이 이루어질 수 있음을 이해할 것이다.

표 3은 WestPac'74 3001-힌지가 500,000 감염 단위의 바이러스에 의해 피하로 감염된 레서스 마카크에서 감염성임을 제시한다. 각각의 일에 보고된 값은 면역초점 검정에 의해 정량화된 로그 변환된 원숭이 혈청 바이러스 역가이다.

표 4. 레서스 마카크에서 3001-1F4E의 약독화. 이러한 표는 3001-1F4E가 500,000 감염 단위의 바이러스에 의해 피하로 감염된 레서스 마카크에서 감염성임을 제시한다. 그러나, 이 바이러스는 정량적 검출 수준 미만이다 (50 감염성 바이러스/mL 혈청). 보다 민감한 검정, 지연된 포커스 검정은 <50 감염 단위/mL의 바이러스를 검출할 수 있지만, 낮은 수준으로 존재하는 바이러스는 정량화할 수 없다. 따라서, 본 발명자들의 가장 민감한 검정에 의해 바이러스가 검출된 일은 "+"로 양으로 스코어링한다. 감염된 총 일수를 좌측 칼럼에 제시한다. 낮은 수준의 바이러스혈증 및 낮은 감염된 평균 일수 (2.25일)는 마카크에서의 바이러스 약독화와 일치한다.

표 5. 키메라 바이러스 DENV 1/3을 추가로 특성화하기 위해, DENV-1 특이적 모노클로날 항체, 1F4로 탐침하였다. 1F4는 혈청형 특이적이고, 그의 표적 에피토프는 EDI-II 힌지 내에 존재한다. 이식된 DENV-3 EDI-II 힌지가 1F4 에피토프를 교란시키는 경우에, 1F4는 키메라 WestPac74/3001 바이러스를 더 이상 중화시키지 않아야 한다.

일부 실시양태에서, 본 발명은 뎅기 바이러스가 아닌 플라비바이러스로부터의 플라비바이러스 E 당단백질 내에 뎅기 바이러스 에피토프를 도입하기 위해 아미노산 치환이 이루어진 키메라 플라비바이러스 E 당단백질을 제공한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본 발명은 뎅기 바이러스 E 당단백질 백본이 아닌 플라비바이러스 E 당단백질 백본을 포함하는 키메라 E 당단백질을 포함하는 플라비바이러스 E 당단백질을 제공하며, 여기서 플라비바이러스 E 당단백질 백본은 뎅기 바이러스와 반응성인 항체에 의해 인식되는 에피토프를 도입하는 아미노산 치환을 포함한다.

사용될 수 있는 플라비바이러스의 비제한적 예는 황열 바이러스(yellow fever virus)(YFV) (예를 들어, 진뱅크(GenBank)® 데이터베이스 수탁 번호 JX503529), 일본 뇌염 바이러스(Japanese encephalitis virus)(JEV) (예를 들어, 진뱅크® 데이터베이스 수탁 번호 U14163), 웨스트 나일 바이러스(West Nile virus)(WNV) (예를 들어, 진뱅크® 데이터베이스 수탁 번호 DQ211652) 및 현재 공지되어 있거나 이후에 확인될 임의의 다른 플라비바이러스를 포함한다.

뎅기 바이러스 백신을 생성하기 위한 많은 시도는 비-중화 항체의 생성을 야기하고, 이는 천연 감염 또는 백신에 대한 후속 노출 시 병리상태의 가능성을 증가시킬 수 있는 것으로 관련 기술분야에 공지되어 있다. 조작된 에피토프를 제공하기 위한 또 다른 접근법은 또 다른 플라비바이러스 입자 또는 VLP 내에 혼입되어 있는 뎅기 바이러스 E 단백질의 전부 또는 일부를 전달하는 것이다. 대표적인 실시양태에서, 이종 플라비바이러스는 웨스트 나일 바이러스 또는 황열 바이러스이다. E 단백질의 부분은, 예를 들어 뎅기 바이러스 E 단백질 및/또는 다른 뎅기 바이러스 구조 단백질 내에 존재하는 비-중화 에피토프에 대한 비-중화 뎅기 바이러스 항체의 생성을 감소시키기 위해 이종 플라비바이러스 백본의 E 단백질에 그라프팅될 수 있다.

따라서, 키메라 플라비바이러스 또는 키메라 플라비바이러스 VLP는 키메라 플라비바이러스 또는 플라비바이러스 VLP 내에 존재하지 않는 뎅기 바이러스 E 단백질 및/또는 다른 구조 단백질의 다른 부분에 대한 비-중화 항체의 생성을 감소시키는 한편 4차 뎅기 바이러스 에피토프를 적절한 입체형태로 제시할 수 있다.

본 발명의 일부 실시양태에서 플라비바이러스 E 당단백질 또는 뎅기 바이러스 E 당단백질의 개별적 및 입체형태적 에피토프는 합성 백본 또는 지지체 구조 상에서 제시되어, 합성 백본 또는 지지체 구조 내의 에피토프가 E 당단백질, 바이러스 입자 또는 VLP의 구조 내의 에피토프의 입체형태 및 배열을 모방하도록 할 수 있다.

본 발명의 추가 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 E 당단백질의 개별적 및 입체형태적 에피토프를 모방한 펩티드 미모토프 (문헌 [Meloen et al. (2000) J. Mol. Recognit. 13, 352-359] 참조)를 제공한다. 미모토프는 임의의 관련 기술분야에 공지된 기술을 사용하여, 예컨대 표면 자극, 무작위 펩티드 라이브러리 또는 파지 디스플레이 라이브러리에 의해, 본 발명의 E 당단백질의 개별적 및 입체형태적 에피토프에 대한 항체 또는 항체들을 사용하여 확인될 수 있다.

본 발명은 뎅기 바이러스 에피토프 또는 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 (예를 들어, 단리된 핵산)을 추가로 제공한다.

본 발명은 본 발명의 키메라 플라비바이러스 VLP 또는 키메라 플라비바이러스 입자 (예를 들어, 플라비바이러스 입자의 바이러스 코트)를 코딩하는 핵산 (예를 들어, 단리된 핵산)을 추가로 제공한다.

또한, 본 발명의 핵산을 코딩하는 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명의 벡터, 핵산, 뎅기 바이러스 에피토프, 폴리펩티드, 키메라 플라비바이러스 VLP 또는 키메라 플라비바이러스 입자를 포함하는 세포를 제공한다.

본 발명은 또한 본 발명의 세포, 벡터, 핵산, 뎅기 바이러스 에피토프, 폴리펩티드, 키메라 플라비바이러스 VLP 또는 키메라 플라비바이러스 입자를 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다. 실시양태에서, 면역원성 조성물은 1가이다. 실시양태에서, 면역원성 조성물은 뎅기 바이러스 혈청형 DEN1, DEN2, DEN 3 및/또는 DEN4에 대해 다가 (예를 들어, 4가)이다.

본 발명은 대상체에게 본 발명의 뎅기 바이러스 에피토프, 폴리펩티드, 키메라 플라비바이러스 VLP 또는 키메라 플라비바이러스 입자, 핵산, 벡터, 세포 또는 면역원성 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 뎅기 바이러스에 대한 면역 반응을 생성하는 방법을 포괄한다.

추가로, 본 발명은 1, 2, 3 또는 모든 4종의 DEN1, DEN2, DEN3 및 DEN4에 대한 면역 반응을 유도하기 위해 유리하게 실시될 수 있다. 혈청형 사이의 간섭 문제로 인해 효과적이고 안전한 다가 뎅기 백신을 설계하는 것이 도전과제인 것으로 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 면역 반응은 표적 혈청형 중 일부에 대해서만 우세하게 지시될 수 있다. 모든 혈청형에 대한 반응을 달성하기 위해서는 다중 백신접종을 시도하는 것이 요구되지만; 그러나, 뎅기 바이러스의 경우에, 이러한 접근법은 항체가 이미 존재하는 대상체에 대한 반복 투여가 뎅기 출혈열로 이어질 수 있기 때문에 위험할 수 있다.

본 발명의 추가 측면은 대상체에게 본 발명의 뎅기 바이러스 에피토프, 폴리펩티드, 키메라 플라비바이러스 VLP 또는 키메라 플라비바이러스 입자, 핵산, 벡터, 세포, 또는 면역원성 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 뎅기 바이러스 감염을 치료하는 방법이다.

본 발명의 추가 측면은 대상체에게 본 발명의 뎅기 바이러스 에피토프, 폴리펩티드, 키메라 플라비바이러스 VLP 또는 키메라 플라비바이러스 입자, 핵산, 벡터, 세포, 또는 면역원성 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 뎅기 바이러스 감염을 예방하는 방법이다.

본 발명의 추가 측면은 대상체에게 본 발명의 뎅기 바이러스 에피토프, 폴리펩티드, 키메라 플라비바이러스 VLP 또는 키메라 플라비바이러스 입자, 핵산, 벡터, 세포, 또는 면역원성 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 뎅기 바이러스 감염의 영향으로부터 대상체를 보호하는 방법이다.

4종의 뎅기 바이러스 혈청형 (DENV-1, DENV-2, DENV-3 및 DENV-4)이 존재한다. 각각의 혈청형 내에는 수많은 상이한 균주 또는 유전자형이 존재한다. 본 발명의 뎅기 바이러스 항원 및 에피토프는 현재 공지되어 있거나 이후에 확인될 모든 혈청형, 균주 및 유전자형을 비롯하여 임의의 뎅기 바이러스로부터 유래될 수 있다.

본 발명의 실시양태에서, 뎅기 바이러스는 UNC1017 균주 (DEN1), 웨스트 퍼시픽(West Pacific) 74 균주 (DEN1), S16803 균주 (DEN2), UNC2005 균주 (DEN2), UNC3001 균주 (DEN3), UNC3043 (DEN3 균주 059.AP-2, 필리핀, 1984), UNC3009 균주 (DEN3, D2863, 스리랑카 1989), UNC3066 (DEN3, 균주 1342, 푸에르토리코, 1977), CH53489 균주 (DEN3), UNC4019 균주 (DEN4), 또는 TVP-360 (DEN4)이다.

본 발명의 실시양태에서, 뎅기 바이러스 폴리펩티드의 "면역원성 활성 단편" (예를 들어, E 단백질)은 적어도 약 6, 8, 10, 12, 15, 20, 30, 50, 75, 100, 125, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450개 또는 그 초과의 아미노산, 임의로 인접 아미노산, 및/또는 약 495, 475, 450, 425, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100, 75 또는 50개 미만의 아미노산, 임의로 인접 아미노산 (하한치가 상한치 미만인 한 상기의 임의의 조합을 포함)을 포함하거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 이루어지고, "면역원성 활성 단편"은 숙주에서 뎅기 바이러스에 대해 면역 반응 (예를 들어, 천연 항원과 반응하는 IgG 및/또는 IgA), 임의로 보호성 면역 반응을 유도하고, 본 발명자들에 의해 새롭게 확인된 4차 뎅기 바이러스 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체의 생산을 유도한다.

본원에 사용된 용어 "에피토프"는 적절한 입체형태로 존재하는 경우에 항체 (예를 들어, B 세포 에피토프) 또는 T 세포 수용체 (예를 들어, T 세포 에피토프)에 대해 반응성 부위를 제공하는 특정 아미노산 서열을 의미한다.

B-세포 에피토프를 포함하는 주어진 폴리펩티드의 부분은 관련 기술분야에 공지되어 있는 임의의 수의 에피토프 맵핑 기술을 사용하여 확인될 수 있다. (예를 들어, 문헌 [Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, Glenn E. Morris, Ed., 1996, Humana Press, Totowa, N.J.] 참조). 예를 들어, 선형 에피토프는, 예를 들어 고체 지지체 상에서 단백질 분자의 부분에 상응하는 다수의 펩티드를 공동으로 합성하고, 펩티드가 상기 지지체에 부착되어 있는 동안 상기 펩티드를 항체와 반응시킴으로써 결정될 수 있다. 이러한 기술은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 예를 들어 미국 특허 번호 4,708,871; 문헌 [Geysen et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3998-4002; Geysen et al. (1986) Molec. Immunol. 23:709-715]에 기재되어 있다.

유사하게, 아미노산의 공간 입체형태를 예컨대 예를 들어 X-선 결정학 및 2차원 핵 자기 공명에 의해 결정함으로써 입체형태적 에피토프를 용이하게 확인할 수 있다. 또한, 단백질의 항원 영역은 표준 항원성 및 소수친수성 플롯, 예컨대 예를 들어 옥스포드 몰레큘라 그룹(Oxford Molecular Group)으로부터 입수가능한 오미가(Omiga) 버전 1.0 소프트웨어 프로그램을 사용하여 계산된 것을 사용하여 확인할 수 있다. 이러한 컴퓨터 프로그램은 항원성 프로파일을 결정하기 위해 홉/우즈(Hopp/Woods) 방법 (Hopp et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA (1981) 78:3824-3828) 및 소수친수성 플롯을 위해 카이트-두리틀(Kyte-Doolittle) 기술 (Kyte et al., J. Mol. Biol. (1982) 157:105-132)을 사용한다.

일반적으로, 대상체의 면역계의 세포성 아암을 자극하는데 관여하는 T-세포 에피토프는 약 8-25개의 아미노산의 짧은 펩티드이다. T-세포 에피토프를 확인하는 통상적인 방식은 중첩 합성 펩티드를 사용하고, 예를 들어 효소-연결된 면역스팟 검정 (ELISPOT)을 사용하여 관심 항원에 대해 면역화된 동물로부터 T 세포에 의해 인식되는 이들 펩티드의 풀 또는 개별 펩티드를 분석하는 것이다. 이들 중첩 펩티드는 또한 다른 검정, 예컨대 시토카인 방출 또는 분비의 자극에서 사용될 수 있거나, 또는 펩티드를 함유하는 주요 조직적합성 (MHC) 사량체를 구축하는 것에 의해 평가될 수 있다. 이러한 면역원성 활성 단편은 또한 관심 항원으로부터의 다양한 단편에 의한 자극에 반응하여 림프구 증식을 자극하는 그의 능력을 기반으로 하여 확인할 수 있다.

본 발명은 예방, 치료 및/또는 진단 목적을 위해 실시될 수 있다. 또한, 본 발명은 임의의 목적, 예컨대 진단 또는 연구 목적을 위해, 또는 또 다른 대상체로의 전달에 의한 수동 면역화를 위해 항체를 생산하기 위해 실시될 수 있다.

본 발명은 본 발명의 1종 이상의 조성물을 포함하는 키트를 추가로 제공한다. 본 발명의 키트는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있는 바와 같이, 적절한 완충제 및/또는 희석제 및/또는 다른 용액과 함께 키트의 시약 (예를 들어, 항체, 항원, 핵산)을 수용하기 위한 1개 이상의 용기 및/또는 리셉터클, 및 키트를 사용하는 것에 대한 지침서를 포함할 수 있는 것으로 통상의 기술자에 의해 잘 이해될 것이다. 이러한 키트는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있는 바와 같이, 아주반트 및/또는 다른 면역자극 또는 면역조절제를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물 및 키트는 또한 다른 의약제, 제약 작용제, 담체, 희석제, 면역자극 시토카인 등을 포함할 수 있다. 이러한 투여 형태의 실제 제조 방법은 이러한 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있거나, 자명할 것이다.

대상체에 대한 투여는 관련 기술분야에 공지된 임의의 경로에 의할 수 있다. 비제한적 예로서, 투여 경로는 흡입 (예를 들어, 경구 및/또는 비강 흡입), 경구, 협측 (예를 들어, 설하), 직장, 질, 국소 (기도로의 투여 포함), 안내, 경피, 비경구 (예를 들어, 근육내 [예를 들어, 골격근에의 투여], 정맥내, 동맥내, 복강내 등), 피하 (발바닥으로의 투여 포함), 피내, 흉막내, 뇌내, 및/또는 척수강내 경로에 의할 수 있다.

본 발명의 에피토프, 폴리펩티드, VLP 및 바이러스 벡터는 그 자체로, 또는 그것을 코딩하는 핵산 (예를 들어, DNA)을 전달하는 것에 의해 전달될 수 있다.

면역조절 화합물, 예컨대 면역조절 케모카인 및 시토카인 (바람직하게는, CTL 유도 시토카인)이 대상체에게 공동으로 투여될 수 있다.

시토카인은 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해 투여될 수 있다. 외인성 시토카인이 대상체에게 투여될 수 있거나, 또는 대안적으로 시토카인을 코딩하는 핵산이 적합한 벡터를 사용하여 대상체에게 전달될 수 있고, 시토카인은 생체내 생산된다. 특정한 실시양태에서, 바이러스 아주반트가 시토카인을 발현한다.

본 발명의 실시양태에서, 본 발명의 조성물의 다중 투여량 (예를 들어, 2, 3 또는 그 초과)은 검출가능한 병원성 (예를 들어, 뎅기 쇼크 증후군/뎅기 출혈열) 없이 투여될 수 있다.

본 발명의 실시양태에서, 본 발명의 다가 백신은 면역 간섭을 생성하지 않으며, 예를 들어 제시된 모든 항원에 대해 균형잡힌 면역 반응이 유도된다. 본 발명의 실시양태에서, 균형잡힌 반응은 DENV-1, DENV-2, DENV-3 및 DENV-4에 대해 보호성 면역을 생성한다.

본 발명의 실시양태에서, 다가 백신은 항-뎅기 모체 항체가 존재하는 대상체에게 투여될 수 있다.

본 발명은 상이한 형태로 실시될 수 있으며 본원에 제시된 실시양태로만 제한되는 것으로 해석되어서는 안된다는 것을 인지하여야 한다. 오히려, 이들 실시양태가 제공됨으로써 본 개시내용은 철저하고 완벽해질 것이며, 본 발명의 범위가 통상의 기술자에게 완전하게 전달될 것이다.

달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에서 본 발명의 설명에 사용된 용어는 단지 특정한 실시양태만을 기재하려는 목적을 위한 것이고, 본 발명을 제한하고자 의도되는 것은 아니다.

본원에 사용된 단수 용어는 1 또는 1 초과를 의미할 수 있다. 예를 들어, 세포는 단일 세포 또는 다수의 세포를 의미할 수 있다.

또한 본원에 사용된 "및/또는"은 연관된 열거된 항목 중 하나 이상의 임의의 및 모든 가능한 조합, 뿐만 아니라 대안적인 것 ("또는")으로 해석되는 경우에 조합의 부재를 지칭하고 이를 포괄한다.

본원에 사용된 용어 "약"은 측정가능한 값, 예컨대 용량의 양 (예를 들어, 지방산의 양) 등을 지칭하는 경우에, 명시된 양의 ±20%, ±10%, ±5%, ±1%, ±0.5% 또는 심지어 ±0.1%의 변화를 포괄하는 것으로 의도된다.

본원에 사용된 연결 어구 "로 본질적으로 이루어진"은 청구범위의 범위가 청구범위에서 언급된 명시된 물질 또는 단계, 및 청구된 본 발명의 "기본적이고 신규한 특징(들)에 실질적으로 영향을 미치지 않는 것"을 포괄하는 것으로 해석되어야 한다. 문헌 [In re Herz, 537 F.2d 549, 551-52, 190 U.S.P.Q. 461, 463 (CCPA 1976) (원본으로 강조)]을 참조하고; 또한 MPEP § 2111.03을 참조한다. 따라서, 용어 "로 본질적으로 이루어진"이 본 발명의 청구범위에서 사용된 경우에 이는 "포함하는"과 동등한 것으로 해석되도록 의도되지 않는다.

본원에 사용된 용어 "핵산"은 cDNA, 게놈 DNA, 합성 (예를 들어, 화학적 합성) DNA, 및 RNA 및 DNA의 키메라를 비롯하여, RNA 및 DNA 둘 다를 포괄한다. 핵산은 이중-가닥 또는 단일-가닥일 수 있다. 핵산은 뉴클레오티드 유사체 또는 유도체 (예를 들어, 이노신 또는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드)를 사용하여 합성될 수 있다. 이러한 뉴클레오티드는, 예를 들어 변경된 염기-쌍형성 능력 또는 뉴클레아제에 대해 증가된 내성을 갖는 핵산을 제조하는데 사용될 수 있다.

본원에 사용된 용어 "폴리펩티드"는, 달리 나타내지 않는 한, 펩티드 및 단백질 둘 다 (융합 단백질 포함)를 포괄한다.

"융합 단백질"은 자연에서 함께 융합된 채로 발견되지 않는 2종 (또는 그 초과)의 상이한 폴리펩티드를 코딩하는 2종의 이종 뉴클레오티드 서열 또는 그의 단편이 정확한 번역 리딩 프레임으로 함께 융합된 경우에 생산된 폴리펩티드이다.

"재조합" 핵산, 폴리뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 서열은 유전자 조작 기술에 의해 생산된 것이다.

"재조합" 폴리펩티드는 재조합 핵산, 폴리펩티드 또는 뉴클레오티드 서열로부터 생성된다.

본원에 사용된 "단리된" 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, "단리된 핵산" 또는 "단리된 뉴클레오티드 서열")는 자연 발생 유기체 또는 바이러스의 다른 성분, 예를 들어 세포 또는 바이러스 구조적 성분 또는 폴리뉴클레오티드와 회합되어 통상적으로 발견되는 다른 폴리펩티드 또는 핵산의 적어도 일부로부터 적어도 부분적으로 분리된 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 임의로, 그러나 반드시 그러하지는 않지만, "단리된" 폴리뉴클레오티드는 출발 물질과 비교하여 더 높은 농도로 존재한다 (즉, 풍부화된다) (예를 들어, 적어도 약 2-배, 3-배, 4-배, 10-배, 20-배, 50-배, 100-배, 500-배, 1000-배, 10000-배 또는 그 초과의 농도). 대표적인 실시양태에서, 단리된 폴리뉴클레오티드는 적어도 약 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 그 초과로 순수하다.

"단리된" 폴리펩티드는 자연 발생 유기체 또는 바이러스의 다른 성분, 예를 들어 세포 또는 바이러스 구조적 성분 또는 폴리펩티드와 회합되어 통상적으로 발견되는 다른 폴리펩티드 또는 핵산의 적어도 일부로부터 적어도 부분적으로 분리된 폴리펩티드를 의미한다. 임의로, 그러나 반드시 그러하지는 않지만, "단리된" 폴리펩티드는 출발 물질과 비교하여 더 높은 농도로 존재한다 (즉, 풍부화된다) (예를 들어, 적어도 약 2-배, 3-배, 4-배, 10-배, 20-배, 50-배, 100-배, 500-배, 1000-배, 10000-배 또는 그 초과의 농도). 대표적인 실시양태에서, 단리된 폴리펩티드는 적어도 약 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 그 초과로 순수하다.

또한, "단리된" 세포는 자연에서 정상적으로는 회합되어 있는 다른 성분으로부터 부분적으로 또는 완전히 분리된 세포이다. 예를 들어, 단리된 세포는 배양 배지 내의 세포 및/또는 제약상 허용되는 담체 중의 세포일 수 있다.

용어 "면역원" 및 "항원"은 본원에서 상호교환가능하게 사용되고, 세포성 및/또는 체액성 면역 반응이 지시될 수 있는 임의의 화합물 (폴리펩티드 포함)을 의미한다. 특정한 실시양태에서, 면역원 또는 항원은 뎅기 바이러스 감염의 영향에 대해 보호성 면역 반응을 유도할 수 있다.

본원에 사용된 "유효량"은 치료 및/또는 유익한 효과일 수 있는 목적하는 효과를 생성하기에 충분한 본 발명의 벡터, 핵산, 에피토프, 폴리펩티드, 세포, 입자, VLP, 조성물 또는 제제의 양을 지칭한다. 유효량은 대상체의 연령, 전반적 상태, 치료할 상태의 중증도, 투여된 특정한 작용제, 치료 지속기간, 임의의 공동 치료의 속성, 사용된 제약상 허용가능한 담체, 및 통상의 기술자의 지식 및 경험 내의 기타 인자에 의해 달라질 것이다. 적절하게는, 임의의 개별적 경우에 "유효량"은 관련 문서 및 문헌을 참조하고/거나 상용 실험을 사용하여 통상의 기술자에 의해 결정될 수 있다.

본원에 사용된 용어 "면역원성 양" 또는 "효과적인 면역화 용량"은, 달리 나타내지 않는 한, 비-면역화 대상체의 고유 면역보다 더 큰, 치료된 대상체에서 면역 반응 (임의로 보호성 반응일 수 있음)을 유도하기에 충분한 양 또는 용량을 의미한다. 임의의 특정한 문맥에서 면역원성 양 또는 효과적인 면역화 용량은 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 상용적으로 결정될 수 있다.

용어 "백신", "백신접종" 및 "면역화"는 관련 기술분야에서 잘 이해되고, 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. 예를 들어, 용어 백신, 백신접종 또는 면역화는 (예를 들어, 능동 면역 반응을 제공하는 것에 의해) 면역원에 대한 대상체의 면역 반응을 증가시키고, 따라서 감염으로부터 저항, 극복 및/또는 회복하는 그의 능력 (즉, 보호성 면역 반응)을 증가시키는 과정 또는 조성물인 것으로 이해될 수 있다.

용어 "치료하다", "치료하는" 또는 "의 치료" (및 그의 문법적 변형)는, 대상체의 상태의 중증도가 감소되거나, 적어도 부분적으로 개선 또는 호전되고/거나, 적어도 하나의 임상 증상에서 일부 경감, 완화 또는 감소가 달성되고/거나, 질환 또는 장애의 진행에서 지연이 존재하는 것을 의미한다. 대표적인 실시양태에서, 용어 "치료하다", "치료하는" 또는 "의 치료" (및 그의 문법적 변형)는 임상 질환의 다른 징후의 존재 또는 부재 하에, 바이러스혈증의 중증도에서의 감소 및/또는 바이러스혈증의 진행에서의 지연을 지칭한다.

본원에 사용된 "치료 유효"량은 대상체를 치료 (본원에 정의된 바와 같음)하기에 충분한 양이다. 통상의 기술자는 대상체에게 일부 이익이 제공되는 한 치료 효과가 완전하거나 치유적일 필요는 없음을 인식할 것이다.

용어 "예방하다", "예방하는" 또는 "의 예방" (및 그의 문법적 변형)은, 본 발명의 방법의 부재 하에 일어나는 것에 비해 대상체에서 질환, 장애 및/또는 임상 증상(들)의 발병 및/또는 진행의 예방 및/또는 지연, 및/또는 질환, 장애 및/또는 임상 증상(들)의 발병 및/또는 진행의 중증도에서의 감소를 지칭한다. 대표적인 실시양태에서, 용어 "예방하다", "예방하는" 또는 "의 예방" (및 그의 문법적 변형)은 임상 질환의 다른 징후의 존재 또는 부재 하에, 대상체에서 바이러스혈증의 발병 및/또는 진행의 예방 및/또는 지연을 지칭한다. 예방은 완전할 수 있고, 예를 들어 질환, 장애 및/또는 임상 증상(들)이 전체적으로 부재할 수 있다. 예방은 또한, 대상체에서의 질환, 장애 및/또는 임상 증상(들)의 발생 및/또는 발병의 중증도 및/또는 진행이 본 발명의 부재 하에 일어나는 것보다 낮도록 부분적일 수 있다.

본원에 사용된 "예방 유효"량은 대상체에서 질환, 장애 및/또는 임상 증상을 예방 (본원에 정의된 바와 같음)하기에 충분한 양이다. 통상의 기술자는 대상체에게 일부 이익이 제공되는 한 예방 수준이 완전할 필요는 없음을 인식할 것이다.

본 발명의 방법에 의한 뎅기 바이러스 감염을 치료 및/또는 예방하는 효능은, 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있는 바와 같이, 대상체의 증상 및/또는 임상 파라미터 (예를 들어, 바이러스혈증)에서의 변화에 의해 나타내어지는 임상 개선을 검출하는 것에 의해 결정될 수 있다.

달리 나타내지 않는 한, 용어 "보호하다", "보호하는", "보호" 및 "보호성" (및 그의 문법적 변형)은 뎅기 바이러스의 1종 또는 다중 균주, 유전자형 또는 혈청형에 관계없이, 대상체에서 뎅기 바이러스 감염을 예방 및 치료하는 방법 둘 다를 포괄한다.

본원에 사용된 용어 "보호성" 면역 반응 또는 "보호성" 면역은 면역 반응이 질환 또는 감염의 임의의 다른 징후의 발생 및/또는 중증도 및/또는 지속을 예방하거나 감소시킨다는 점에서 대상체에게 일부 이익을 제공하는 것을 나타낸다. 예를 들어, 대표적인 실시양태에서, 보호성 면역 반응 또는 보호성 면역은 임상 질환을 동반하든 그렇지 않든, 감소된 바이러스 혈증을 생성한다. 대안적으로, 보호성 면역 반응 또는 보호성 면역은 기존 질환의 치유적 치료에 유용할 수 있다.

"능동 면역 반응" 또는 "능동 면역"은 면역원과의 접촉 후에 숙주 조직 및 세포의 참여를 특징으로 한다. 이는 림프세망 조직에서 면역적격 세포의 분화 및 증식을 수반하며, 이는 항체의 합성 또는 세포-매개 반응성의 발생, 또는 둘 다로 이어진다. 문헌 [Herbert B. Herscowitz, Immunophysiology: Cell Function and Cellular Interactions in Antibody Formation, in IMMUNOLOGY: BASIC PROCESSES 117 (Joseph A. Bellanti ed., 1985)]. 대안적으로 말하면, 능동 면역 반응은 감염에 의한 또는 백신접종에 의한 면역원에의 노출 후에 숙주에 의해 시작된다. 능동 면역은 "능동적으로 면역화된 숙주로부터 사전형성된 물질 (항체, 전달 인자, 흉선 이식편, 인터류킨-2)의 비-면역 숙주로의 전달"을 통해 획득되는 수동 면역과 대조될 수 있다. Id.

본 발명의 "대상체"는 뎅기 바이러스 감염에 감수성인 임의의 동물을 포함한다. 이러한 대상체는 일반적으로 포유동물 대상체 (예를 들어, 실험 동물, 예컨대 래트, 마우스, 기니 피그, 토끼, 영장류 등), 농장 또는 상업용 동물 (예를 들어, 소, 말, 염소, 당나귀, 양 등) 또는 가축 (예를 들어, 고양이, 개, 페릿 등)이다. 특정한 실시양태에서, 대상체는 영장류 대상체, 비-인간 영장류 대상체 (예를 들어, 침팬지, 개코원숭이, 원숭이, 고릴라 등) 또는 인간이다. 본 발명의 대상체는 뎅기 바이러스에 의한 감염의 위험이 있는 것으로 공지되어 있거나 그러한 것으로 여겨지는 대상체일 수 있다. 대안적으로, 본 발명에 따른 대상체는 또한 뎅기 바이러스에 의해 감염된 것으로 또는 뎅기 바이러스 감염에 대한 치료를 필요로 하는 것으로 이전에 공지되어 있거나 그러한 것으로 의심되지 않은 대상체를 포함할 수 있다.

대상체는 임의의 목적을 위해, 예컨대 보호성 면역 반응을 도출하기 위해 또는 그러한 대상체에서 항체의 생산을 도출하기 위해 치료될 수 있고, 항체는 연구 또는 진단 목적과 같은 다른 목적을 위해 또는 다른 대상체에게 투여하여 그 내에서 수동 면역 반응을 생성하기 위해서 등으로 수집 및 사용될 수 있다.

대상체는 신생아, 소아, 성숙 및 노령 대상체를 비롯하여 임의의 연령의 수컷 및/또는 암컷을 포함한다. 인간 대상체와 관련하여, 대표적인 실시양태에서, 대상체는 영아 (예를 들어, 약 12개월, 10개월, 9개월, 8개월, 7개월, 6개월 미만, 또는 그보다 어림), 유아 (예를 들어, 적어도 약 12, 18 또는 24개월 및/또는 약 36, 30 또는 24개월 미만), 또는 어린이 (예를 들어, 적어도 약 1, 2, 3, 4 또는 5세 연령 및/또는 약 14, 12, 10, 8, 7, 6, 5, 또는 4세 연령 미만)일 수 있다. 본 발명의 실시양태에서, 대상체는 약 0 내지 3, 4, 5, 6, 9, 12, 15, 18, 24, 30, 36, 48 또는 60개월 연령, 약 3 내지 6, 9, 12, 15, 18, 24, 30, 36, 48 또는 60개월 연령, 약 6 내지 9, 12, 15, 18, 24, 30, 36, 48 또는 60개월 연령, 약 9 내지 12, 15, 18, 24, 30, 36, 48 또는 60개월 연령, 약 12 내지 18, 24, 36, 48 또는 60개월 연령, 약 18 내지 24, 30, 36, 48 또는 60개월 연령, 또는 약 24 내지 30, 36, 48 또는 60개월 연령인 인간 대상체이다.

본 발명의 실시양태에서, 대상체는 뎅기 바이러스에 대해 모체 항체를 갖는다.

본 발명의 방법을 "필요로 하는 대상체"는 뎅기 바이러스에 감염된 것으로 또는 그에 감염될 위험이 있는 것으로 공지되어 있거나 의심되는 대상체일 수 있다.

본 발명의 뎅기 바이러스 에피토프, 폴리펩티드, 키메라 플라비바이러스 VLP 또는 키메라 플라비바이러스 입자, 핵산, 벡터, 세포 또는 조성물 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 제제 (예를 들어, 면역원성 제제)가 또한 제공되고, 이는 공지된 기술에 따라 투여를 위해 제약 담체 중에서 제제화될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Remington, The Science And Practice of Pharmacy (최신판)]을 참조한다. 본 발명의 실시양태에 따른 제약 조성물의 제조에서, 본 발명의 조성물은 전형적으로, 특히 제약상 허용되는 담체와 혼합된다. "제약상 허용되는 담체"는 제약 조성물 중에서 다른 성분과 상용가능하고 대상체에 유해하거나 해롭지 않은 담체를 의미한다. 담체는 고체 또는 액체 또는 둘 다일 수 있고, 바람직하게는 본 발명의 조성물과 함께 단위-용량 제제, 예를 들어 조성물의 약 0.01 또는 0.5 중량% 내지 약 95 중량% 또는 99 중량% 함유할 수 있는 정제로서 제제화된다. 제약 조성물은 임의로 1종 이상의 보조 성분을 포함하는 성분의 혼합을 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 널리 공지되어 있는 제약 기술에 의해 제조된다. 특정 실시양태에서, 제약상 허용되는 담체는 멸균성이고, 담체를 포함하는 제약 조성물에 대한 규제 가이드라인에 따라 인간 대상체에게 투여하는데 적합한 것으로 간주될 것이다.

또한, "제약상 허용되는" 성분, 예컨대 본 발명에 따른 조성물의 염, 담체, 부형제 또는 희석제는 (i) 조성물을 그의 의도되는 목적에 부적합하게 하지 않으면서 본 발명의 조성물과 조합될 수 있다는 점에서 조성물의 다른 성분과 상용가능하고, (ii) 과도한 유해 부작용 (예컨대 독성, 자극 및 알레르기 반응) 없이 본원에 제공된 바와 같은 대상체에 사용하기에 적합한 성분이다. 부작용은 그의 위험이 조성물에 의해 제공되는 이익을 능가하는 경우에 "과도"하다. 제약상 허용되는 성분의 비제한적 예는 임의의 표준 제약 담체, 예컨대 포스페이트 완충 염수 용액, 물, 에멀젼, 예컨대 오일/물 에멀젼, 마이크로에멀젼 및 다양한 유형의 습윤제를 포함한다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 1종 또는 1종 초과의 아주반트를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 아주반트는 아미노산 서열의 형태 및/또는 아주반트를 코딩하는 핵산의 형태일 수 있다. 핵산의 형태인 경우에, 아주반트는 폴리펩티드(들) 또는 단편(들) 또는 에피토프(들)를 코딩하는 핵산의 성분 및/또는 본 발명의 폴리펩티드(들) 또는 단편(들) 또는 에피토프(들)를 코딩하는 핵산을 포함하는 조성물의 개별 성분일 수 있다. 본 발명에 따르면, 아주반트는 또한 아주반트로서 기능하는 펩티드, 단백질 단편 또는 전체 단백질인 아미노산 서열일 수 있고/거나, 아주반트는 아주반트로서 기능하는 펩티드, 단백질 단편 또는 전체 단백질을 코딩하는 핵산일 수 있다. 본원에 사용된 "아주반트"는 대상체에서 면역 반응을 증진, 개선 또는 달리 조절하기 위해 본 발명의 조성물과 조합될 수 있는 임의의 면역조절 물질일 수 있는 물질을 기재한다.

추가 실시양태에서, 아주반트는 면역자극 시토카인 (GM/CSF, 인터류킨-2, 인터류킨-12, 인터페론-감마, 인터류킨-4, 종양 괴사 인자-알파, 인터류킨-1, 조혈 인자 flt3L, CD40L, B7.1 공동-자극 분자 및 B7.2 공동-자극 분자를 포함하나 이에 제한되지는 않음), 포스페이트 완충 염수 중 5 퍼센트 (wt/vol) 스쿠알렌 (다스프(DASF), 뉴저지주 파시파니), 2.5 퍼센트 플루로닉, L121 중합체 (알드리치 케미칼(Aldrich Chemical), 밀워키) 및 0.2 퍼센트 폴리소르베이트 (트윈(Tween) 80, 시그마(Sigma))로 구성된 신텍스(SYNTEX) 아주반트 제제 1 (SAF-1)을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 적합한 아주반트는 또한 알루미늄 염, 예컨대 수산화알루미늄 겔 (명반), 인산알루미늄 또는 알간뮬린을 포함하지만, 또한 칼슘, 철 또는 아연의 염일 수 있거나, 또는 아실화 티로신 또는 아실화 당, 양이온 또는 음이온으로 유도체화된 폴리사카라이드 또는 폴리포스파젠의 불용성 현탁액일 수 있다.

다른 아주반트가 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 제한 없이 MF 59, LT-K63, LT-R72 (Pal et al., Vaccine 24(6):766-75 (2005)), QS-21, 프로인트 아주반트 (완전 및 불완전), 수산화알루미늄, N-아세틸-뮤라밀-L-트레오닐-D-이소글루타민 (thr-MDP), N-아세틸-노르뮤라밀-L-알라닐-D-이소글루타민 (CGP 11637, nor-MDP로 지칭됨), N-아세틸뮤라밀-L-알라닐-D-이소글루타미닐-L-알라닌-2-(1'-2'-디팔미토일-sn-글리세로-3-히드록시포스포릴옥시)-에틸아민 (CGP 19835A, MTP-PE로 지칭됨), 및 2% 스쿠알렌/트윈 80 에멀젼 중 박테리아로부터 추출된 3종의 성분, 모노포스포릴 지질 A, 트레할로스 디미콜레이트 및 세포벽 골격 (MPL+TDM+CWS)을 함유하는 RIBI를 포함한다.

추가의 아주반트는, 예를 들어 알루미늄 염과 함께 모노포스포릴 지질 A, 바람직하게는 3-탈-O-아실화 모노포스포릴 지질 A (3D-MPL)의 조합물을 포함할 수 있다. 증진된 아주반트 시스템은 모노포스포릴 지질 A 및 사포닌 유도체의 조합물, 특히 PCT 공개 번호 WO 94/00153에 개시된 바와 같은 QS21 및 3D-MPL의 조합물, 또는 PCT 공개 번호 WO 96/33739에 개시된 바와 같은 QS21이 콜레스테롤에 의해 켄칭된, 덜 반응원성인 조성물을 수반한다. 수중유 에멀젼 중 QS21 3D-MPL & 토코페롤을 수반하는 특히 강력한 아주반트 제제가 PCT 공개 번호 WO 95/17210에 기재되어 있다. 또한, 본 발명의 핵산 조성물은 항원을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 아주반트 기능을 제공하는 뉴클레오티드 서열, 예컨대 CpG 서열을 포함하는 것에 의해 아주반트를 포함할 수 있다. 이러한 CpG 서열 또는 모티프는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다.

본 발명과 함께 사용하기 위한 아주반트, 예컨대 예를 들어 면역자극 시토카인은 본 발명의 조성물을 대상체에게 투여하기 전에, 그와 공동으로, 및/또는 투여 전 및/또는 후의 단시간, 수시간 및/또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 및/또는 10일 내에 투여될 수 있다.

또한, 아주반트, 예컨대 면역자극 시토카인의 임의의 조합물은 대상체에게 본 발명의 면역원성 조성물의 투여 전에, 후에, 및/또는 그와 공동으로 공-투여될 수 있다. 예를 들어, 면역자극 시토카인의 조합물은 2종 이상의 면역자극 시토카인, 예컨대 GM/CSF, 인터류킨-2, 인터류킨-12, 인터페론-감마, 인터류킨-4, 종양 괴사 인자-알파, 인터류킨-1, 조혈 인자 flt3L, CD40L, B7.1 공동-자극 분자 및 B7.2 공동-자극 분자로 이루어질 수 있다. 아주반트 및 아주반트 조합물의 유효성은 아주반트 또는 아주반트 조합물의 존재 및 부재 하에 본 발명의 조성물의 대상체에 대한 투여에 반응하여 생성된 면역 반응을 본원에 기재된 바와 같이, 그리고 관련 기술분야에 공지되어 있는 바와 같이 표준 절차를 사용하여 측정함으로써 결정할 수 있다.

본 발명의 실시양태에서, 아주반트는 예를 들어 U.S. 7,862,829에 기재된 바와 같은 알파바이러스 아주반트를 포함한다.

부스팅 투여량이 수일, 수주, 수개월 또는 수년의 시간의 경과에 걸쳐 추가로 투여될 수 있다. 만성 감염에서, 초기의 고용량에 이은 부스팅 용량이 유리할 수 있다.

본 발명의 제약 제제는 다른 의약 작용제, 제약 작용제, 안정화제, 완충제, 담체, 희석제, 염, 장성 조절제, 습윤제 등, 예를 들어 아세트산나트륨, 락트산나트륨, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘, 소르비탄 모노라우레이트, 트리에탄올아민 올레에이트 등을 임의로 포함할 수 있다.

주사의 경우에, 담체는 전형적으로 액체일 것이다. 다른 투여 방법의 경우에, 담체는 고체 또는 액체일 수 있다. 흡입 투여의 경우에, 담체는 호흡가능한 것일 것이고, 전형적으로 고체 또는 액체 미립자 형태이다.

본 발명의 조성물은 공지된 기술에 따라 투여를 위해 제약 담체 중에서 제제화될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Remington, The Science And Practice of Pharmacy (9^th Ed. 1995)]을 참조한다. 본 발명에 따른 제약 조성물의 제조에서, VLP는 전형적으로, 특히 허용되는 담체와 혼합된다. 담체는 고체 또는 액체, 또는 둘 다일 수 있고, 임의로 화합물과 함께 단위-용량 제제, 예를 들어 정제로서 제제화된다. 다양한 제약상 허용되는 수성 담체, 예를 들어 물, 완충수, 0.9% 염수, 0.3% 글리신, 히알루론산, 발열원 무함유 물, 발열원 무함유 포스페이트-완충 염수 용액, 정박테리아수 또는 크레모포르 EL[R] (바스프(BASF), 뉴저지주 파시파니) 등이 사용될 수 잇다. 이들 조성물은 통상의 기술에 의해 멸균될 수 있다. 본 발명의 제제는 임의의 널리 공지되어 있는 제약 기술에 의해 제조될 수 있다.

제약 제제는 사용을 위해 그 자체로 또는 동결건조되어 포장될 수 있으며, 동결건조된 제제는 일반적으로 투여 전에 멸균 수용액과 조합된다. 조성물은 추가로 단위/용량 또는 다중-용량 용기 내에, 예를 들어 실링된 앰플 및 바이알 내에 포장될 수 있다.

제약 제제는 통상의 제약 기술에 따라 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의한 투여를 위해 제제화될 수 있다. 예를 들어, 조성물은 비강내로, 흡입 (예를 들어, 경구 흡입)에 의해, 경구로, 협측으로 (예를 들어, 설하로), 직장으로, 질로, 국소로, 척수강내로, 안내로, 경피로, 비경구 투여에 의해 (예를 들어, 근육내 [예를 들어, 골격근], 정맥내, 피하, 피내, 흉막내, 뇌내 및 동맥내, 척수강내), 또는 국소로 (예를 들어, 피부 및 기도 표면을 비롯한 점막 표면 둘 다에) 투여되도록 제제화될 수 있다.

비강내 또는 흡입 투여를 위해, 제약 제제는 에어로졸 (이 용어는 액체 및 건조 분말 에어로졸 둘 다를 포함함)로서 제제화될 수 있다. 예를 들어, 제약 제제는 계면활성제 및 추진제와 함께 미분된 형태로 제공될 수 있다. 전형적인 조성물의 백분율은 0.01-20 중량%, 바람직하게는 1-10 중량%이다. 계면활성제는 일반적으로 비독성이고 추진제 중에 가용성이다. 대표적인 이러한 작용제는 6 내지 22개의 탄소 원자를 함유하는 지방산의 에스테르 또는 부분 에스테르, 예컨대 지방족 다가 알콜 또는 그의 시클릭 무수물을 갖는 카프로산, 옥탄산, 라우르산, 팔미트산, 스테아르산, 리놀레산, 리놀렌산, 올레스테르산 및 올레산이다. 혼합 에스테르, 예컨대 혼합 또는 천연 글리세리드가 사용될 수 있다. 계면활성제는 조성물의 0.1-20 중량%, 바람직하게는 0.25-5 중량%를 구성할 수 있다. 조성물의 나머지는 통상적으로 추진제이다. 원하는 경우에, 비강내 전달을 위한 레시틴과 같은 담체가 또한 포함될 수 있다. 액체 입자 에어로졸은 임의의 적합한 수단에 의해, 예컨대 통상의 기술자에게 공지된 바와 같이 압력-가동 에어로졸 네뷸라이저 또는 초음파 네뷸라이저에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 4,501,729를 참조한다. 고체 입자 에어로졸도 마찬가지로 제약 기술분야에 공지되어 있는 기술에 의해, 임의의 고체 미립자 의약 에어로졸 발생기에 의해 생성될 수 있다. 비강내 투여는 또한 비강 표면에의 액적 투여에 의할 수 있다.

주사가능한 제제는 액체 용액 또는 현탁액으로서, 주사 전에 액체 중의 용액 또는 현탁액으로 적합한 고체 형태로서, 또는 에멀젼으로서 통상의 형태로 제조될 수 있다. 대안적으로, 전신 방식보다는 국부에, 예를 들어 데포 또는 지속-방출 제제로 제약 제제를 투여할 수 있다.

즉석 주사 용액 및 현탁액은 이전에 기재된 종류의 멸균 분말, 과립 및 정제로부터 제조될 수 있다. 예를 들어, 밀봉된 용기 내의 단위 투여 형태의 본 발명의 주사가능한, 안정한, 멸균 제제가 제공될 수 있다. 제제는 동결건조물 형태로 제공될 수 있고, 이는 적합한 제약상 허용되는 담체에 의해 재구성되어 대상체에게 주사하기에 적합한 액체 조성물을 형성할 수 있다. 단위 투여 형태는 제제의 약 1 μg 내지 약 10 그램일 수 있다. 제제가 실질적으로 수불용성인 경우에, 제약상 허용되는 충분한 양의 유화제가 수성 담체 중에 제제를 유화시키기에 충분한 양으로 포함될 수 있다. 한 이러한 유용한 유화제는 포스파티딜 콜린이다.

경구 투여에 적합한 제약 제제는 이산 단위, 예컨대 캡슐, 카쉐, 로젠지, 또는 정제로, 분말 또는 과립으로서; 수성 또는 비-수성 액체 중 용액 또는 현탁액으로서; 또는 수중유 또는 유중수 에멀젼으로서 제공될 수 있다. 경구 전달은 본 발명의 화합물(들)을 동물의 장에서 소화 효소에 의한 분해를 견딜 수 있는 담체와 복합체화함으로써 수행될 수 있다. 이러한 담체의 예는 관련 기술분야에 공지되어 있는 바와 같은 플라스틱 캡슐 또는 정제를 포함한다. 이러한 제제는 단백질(들) 및 적합한 담체 (이는 상기 나타낸 바와 같이 1종 이상의 보조 성분을 함유할 수 있음)가 회합되게 하는 단계를 포함하는 임의의 적합한 제약 방법에 의해 제조된다. 일반적으로, 제약 제제는 화합물(들)을 액체 또는 미분된 고체 담체, 또는 둘 다와 함께 균일하고 친밀하게 혼합한 다음, 필요한 경우에 생성된 혼합물을 성형하는 것에 의해 제조된다. 예를 들어, 정제는 분말 또는 과립을 임의로 1종 이상의 보조 성분과 함께 압축 또는 몰딩하는 것에 의해 제조될 수 있다. 압축된 정제는 임의로 결합제, 윤활제, 불활성 희석제 및/또는 표면 활성/분산제(들)와 혼합된 자유-유동 형태의 제제, 예컨대 분말 또는 과립을 적합한 기계 내에서 압축하는 것에 의해 제조된다. 몰딩된 정제는 불활성 액체 결합제로 습윤시킨 분말화 단백질을 적합한 기계 내에서 몰딩하는 것에 의해 제조된다.

협측 (설하) 투여에 적합한 제약 제제는 향미 베이스, 통상적으로 수크로스 및 아카시아 또는 트라가칸트 중 화합물(들)을 포함하는 로젠지; 및 불활성 기재, 예컨대 젤라틴 및 글리세린 또는 수크로스 및 아카시아 중 파스틸을 포함한다.

비경구 투여에 적합한 제약 제제는 멸균 수성 및 비-수성 주사 용액을 포함할 수 있고, 제제는 바람직하게는 의도되는 수용자의 혈액과 등장성이다. 이들 제제는 조성물이 의도되는 수용자의 혈액과 등장성이 되게 하는 항산화제, 완충제, 정박테리아제 및 용질을 함유할 수 있다. 수성 및 비-수성 멸균 현탁액, 용액 및 에멀젼은 현탁화제 및 증점제를 포함할 수 있다. 비수성 용매의 예는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 오일, 예컨대 올리브 오일 및 주사가능한 유기 에스테르, 예컨대 에틸 올레에이트이다. 수성 담체는 염수 및 완충 매질을 비롯하여, 물, 알콜성/수성 용액, 에멀젼 또는 현탁액을 포함한다. 비경구 비히클은 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로스, 덱스트로스 및 염화나트륨, 락테이트화 링거, 또는 고정 오일을 포함한다. 정맥내 비히클은 유체 및 영양 보충물, 전해질 보충물 (예컨대 링거 덱스트로스를 기반으로 하는 것) 등을 포함한다. 보존제 및 다른 첨가제, 예컨대 예를 들어 항미생물제, 항산화제, 킬레이트화제 및 불활성 기체 등이 또한 존재할 수 있다.

직장 투여에 적합한 제약 제제는 임의로 단위 용량 좌제로서 제공된다. 이들은 활성제를 1종 이상의 통상의 고체 담체, 예컨대 예를 들어 코코아 버터와 혼합한 다음, 생성된 혼합물을 성형하는 것에 의해 제조될 수 있다.

피부에의 국소 적용에 적합한 제약 제제는 바람직하게는 연고, 크림, 로션, 페이스트, 겔, 스프레이, 에어로졸 또는 오일의 형태를 취한다. 사용될 수 있는 담체는 석유 젤리, 라놀린, 폴리에틸렌 글리콜, 알콜, 경피 증진제 및 그의 2종 이상의 조합을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 예를 들어 국소 전달은 본 발명의 제약 제제를 피부를 통과할 수 있는 친지성 시약 (예를 들어, DMSO)과 혼합하는 것에 의해 수행될 수 있다.

경피 투여에 적합한 제약 제제는 장기간 동안 대상체의 표피와 친밀한 접촉을 유지하도록 적합화된 개별 패치의 형태일 수 있다. 경피 투여에 적합한 제제는 또한 이온영동에 의해 전달될 수 있고 (예를 들어, 문헌 [Pharmaceutical Research 3:318 (1986)] 참조), 전형적으로 화합물(들)의 완충 수용액의 형태를 취한다. 적합한 제제는 시트레이트 또는 비스/트리스 완충제 (pH 6) 또는 에탄올/물을 포함할 수 있고, 0.1 내지 0.2M의 활성 성분을 함유할 수 있다.

본 발명의 실시양태에서, 본 발명의 바이러스 입자의 투여량은 약 10⁴ 내지 약 10⁷ 플라크 형성 단위 (PFU)의 범위 내일 수 있다. 본 발명의 실시양태에서, 본 발명의 VLP의 투여량은 약 500 마이크로그램 내지 약 5 밀리그램의 범위 내일 수 있다. 본 발명의 실시양태에서, 본 발명의 단백질의 투여량은 약 10⁰ 내지 약 10⁴ 마이크로그램 +/- 아주반트의 범위 내일 수 있다.

또한, 조성물은 리포솜 제제로서 제제화될 수 있다. 사용되는 지질 층은 임의의 통상의 조성일 수 있고, 콜레스테롤을 함유할 수 있거나 또는 콜레스테롤-무함유일 수 있다. 생성된 리포솜은, 예를 들어 표준 초음파처리 및 균질화 기술의 사용을 통해 크기 면에서 감소될 수 있다.

리포솜 제제는 동결건조되어 동결건조물로 생성될 수 있고, 이는 제약상 허용되는 담체, 예컨대 물에 의해 재구성되어 리포솜 현탁액을 재생성할 수 있다.

본 발명의 면역원성 제제는 임의로 멸균성일 수 있고, 밀폐된 병원체-투과불가능한 용기 내에 추가로 제공될 수 있다.

실시예

합성 생물학은 바이러스 게놈의 게놈 구조, 발현 및 편성에 대해 비할 바 없는 유전자 제어를 제공한다. 뎅기 바이러스 (DENV) 복합체는 DENV 혈청형 1-4로 지정되는 4종의 밀접하게 관련된 바이러스로 이루어지고, 이는 항원성 면에서 유사하지만 인간 집단에서 복잡한 패턴의 교차 반응성 중화 및 증진 항체 반응을 유도한다. DENV 혈청형 사이의 항원 관계를 연구하기 위해, 본 발명자들은 낮은 계대 임상 분리주를 기반으로 하여 한 패널의 안정한 DENV1-4 분자 클론 및 재조합 바이러스의 구축 및 특성화를 기재하였다. 재조합 바이러스는 야생형 바이러스와 유사하게 복제하고 적절한 마커 돌연변이를 코딩하였다. DENV3에서 천연 변이의 역할을 평가하기 위해, 모 외피 (E) 당단백질 유전자를 4종의 유전적 및 지리적으로 구분되는 DENV-3 유전자형을 기반으로 한 E 유전자로 대체하여 4종의 합성적으로 설계된 동질유전자 구축물을 제조하였다. 재조합 바이러스는 생존가능하였고, 곤충 및 포유동물 숙주 상에서의 성장에 대해 평가되었고, 모노클로날 및 폴리클로날 중화 시험은 DEN3 중화 중에서 천연 미세변이가 교차 중화 감수성 패턴에 영향을 미침을 입증하였다. 규정된 에피토프를 맵핑하는데 재조합 DNA 기술의 용도를 평가하기 위해, 본 발명자들은 회피 돌연변이 및 에피토프 맵핑을 사용하여 여러 에피토프의 좌표를 맵핑하였다. 이어서, 본 발명자들은 균주 사이에서 이들 에피토프를 교환하였다. 재조합 바이러스는 생존가능하였고, 모노클로날 및 폴리클로날 혈청에 의한 기능 획득 및 상실 검정은 백신 설계에서 중요한 고려사항으로 밝혀진 항원 패턴을 밝혀내었다.

항-뎅기 바이러스 (DENV) 인간 모노클로날 항체 (mAb) 5J7은 DENV 혈청형 3 (DENV-3) 외피 (E) 당단백질 상의 에피토프에 결합함으로써 DENV-3을 강력하게 중화시켰다. 이러한 에피토프는 E 도메인 I-II (EDI-II) 힌지로 공지되어 있는 E 영역에 걸쳐있다. DENV 감염 클론 플랫폼을 사용하여, DENV-3 5J7 에피토프를 DENV 혈청형 1 (DENV-1) E 당단백질 내로 이식하였다. 이러한 이식은 재조합 DENV-1/3 바이러스가 mAb 5J7에 의한 중화에 감수성이게 하였다. 유의하게는, 이식은 천연 DENV-1 항원 구조를 교란시키지 않고, 재조합 바이러스는 DENV-1 및 DENV-3 인간 폴리클로날 혈청 둘 다에 대해 감수성이다. 이러한 감수성은 DENV-1/3 키메라 E 당단백질이 2종의 바이러스 혈청형 - DENV-1 및 DENV-3에 대한 중화 항체를 유도할 수 있는 2가 백신으로서 기능할 수 있음을 나타낸다.

상기 내용은 본 발명의 예시이며, 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 본 발명은 하기 청구범위에 의해 정의되며, 청구범위의 등가물은 본 발명에 포함된다.

본원에 인용된 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 다른 참고문헌은 언급이 제공된 문장 및/또는 단락과 관련된 교시내용에 대해 그의 전문이 참조로 포함된다.

<표 1> DENV-1/3 및 DENV-3/1을 생성하기 위한 아미노산 치환

<표 2> DENV 1-3 힌지를 생성하기 위한 WestPac'74 (DENV-1) CDS에서의 뉴클레오티드 치환

<표 3>

<표 4>

<표 5>

서열

UNC 3001 (DENV-3) 아미노산 서열

WestPac74 (DENV-1) 아미노산 서열

WestPac74 힌지 (DENV 1/3) 아미노산 서열

3001-1F4E (DENV 3/1) 아미노산 서열

ic뎅기III UNC 3001

ic뎅기I WestPac'74

SEQUENCE LISTING <110> The University of North Carolina at Chapel Hill Messer, William Baric, Ralph Desilva, Aravinda Yount, Boyd <120> METHODS AND COMPOSITIONS FOR DENGUE VIRUS VACCINES <130> 5470-671WO <140> PCT/US2014/044410 <141> 2014-06-26 <150> US 61/839,687 <151> 2013-06-26 <160> 6 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 393 <212> PRT <213> Dengue virus type 3 <400> 1 Met Arg Cys Val Gly Ile Gly Asn Arg Asp Phe Val Glu Gly Leu Ser 1 5 10 15 Gly Ala Thr Trp Val Asp Val Val Leu Glu His Gly Gly Cys Val Thr 20 25 30 Thr Met Ala Lys Asn Lys Pro Thr Leu Asp Ile Glu Leu Gln Lys Thr 35 40 45 Glu Ala Thr Gln Leu Ala Thr Leu Arg Lys Leu Cys Ile Glu Gly Lys 50 55 60 Ile Thr Asn Ile Thr Thr Asp Ser Arg Cys Pro Thr Gln Gly Glu Ala 65 70 75 80 Val Leu Pro Glu Glu Gln Asp Gln Asn Tyr Val Cys Lys His Thr Tyr 85 90 95 Val Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly Lys Gly Ser 100 105 110 Leu Val Thr Cys Ala Lys Phe Gln Cys Leu Glu Pro Ile Glu Gly Lys 115 120 125 Val Val Gln Tyr Glu Asn Leu 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ttctagccat tccaccaaca gcaggagtct tggctagatg 300 gggaaccttc aagaagtcgg gagccattaa ggtcctgaaa ggcttcaaga aggagatctc 360 aaacatgctg agcataatca acaaacggaa aaagacatcg ctctgtctca tgatgatatt 420 gccagcagca cttgctttcc acttgacttc acgagatgga gagccgcgca tgattgtggg 480 gaagaatgaa agaggaaaat ccctactttt taagacagcc tctggaatta acatgtgcac 540 actcatagcc atggacttgg gagagatgtg tgatgacacg gtcacttaca aatgccccca 600 cattaccgaa gtggaacctg aagacattga ctgctggtgc aaccttacat caacatgggt 660 gacttatgga acgtgcaatc aagctggaga gcatagacgc gacaaaagat cagtggcgtt 720 agctcctcat gtcggcatgg gactggacac acgcacccaa acctggatgt cggctgaagg 780 agcttggaga caagtcgaga aggtagagac atgggccctc aggcacccag ggttcaccat 840 actagcccta tttcttgccc attacatagg cacttccttg acccagaagg tggttatttt 900 tatactacta atgctggtca ccccatccat gacaatgaga tgtgtgggaa taggaaacag 960 agattttgtg gaaggtctat caggagctac gtgggttgac gtggtgctcg agcacggggg 1020 gtgtgtgact accatggcta agaacaagcc cacgctggat atagagcttc agaagaccga 1080 ggccacccaa ctggcgaccc taaggaagct atgcattgag gggaaaatta ccaacataac 1140 aactgactca agatgtccta cccaagggga agcggttttg cctgaggagc aggaccagaa 1200 ctacgtgtgt aagcatacat acgtagacag aggctggggg aacggttgtg gcttgtttgg 1260 caagggaagc ttggtaacgt gtgcgaaatt tcaatgcctg gaaccaatag agggaaaagt 1320 ggtgcaatat gagaacctca aatacaccgt catcattaca gtgcacacag gagaccaaca 1380 ccaggtagga aatgaaacgc agggagtcac ggctgagata acacctcagg catcaaccac 1440 tgaagccatc ttgcctgaat atggaaccct tgggctagaa tgctcaccac ggacaggttt 1500 ggatttcaat gaaatgatct tactaacaat gaagaacaaa gcatggatgg tacatagaca 1560 atggtttttt gacctacctc taccatggac atcaggagct acaacagaaa cgccaacctg 1620 gaacaggaag gagcttcttg tgacattcaa aaacgcacat gcgaaaaaac aagaagtagt 1680 cgtccttgga tcgcaagagg gagcaatgca taccgcactg acaggagcca cagaaatcca 1740 aaactcagga ggcacaagca tttttgcggg gcacttaaaa tgtagactta agatggacaa 1800 attggaactc aaggggatga gctatgcaat gtgcacgaat acctttgtgt tgaagaaaga 1860 agtctcagaa acgcagcatg ggacaatact cattaaggtc gagtacaagg gggaagatgc 1920 gccttgcaag attcctttct ccacagagga tggacaaggg aaagctcaca atggcagact 1980 gatcacagcc aacccagtgg tgactaagaa ggaggagcct gtcaatattg aggctgaacc 2040 tccttttggg gaaagtaata tagtaattgg aattggagac aacgccttga aaatcaactg 2100 gtacaagaag ggaagctcta ttgggaagat gttcgaggcc actgccagag gtgcaaggcg 2160 catggccatc ttgggagaca cagcttggga ctttggatca gtgggtggtg ttctgaactc 2220 attaggcaaa atggtgcacc aaatattcgg aagtgcttac acagccctat tcagtggagt 2280 ctcttgggtg atgaaaattg gaataggtgt tctcttgact tggatagggt tgaattcaaa 2340 aaacacatcc atgtcatttt catgcattgc gataggaatc attacactct atctgggagc 2400 tgtggtacaa gctgacatgg ggtgtgtcat aaactggaaa ggcaaagaac tcaaatgtgg 2460 aagtggaatt ttcgtcacca acgaggtcca tacctggaca gagcaataca aattccaagc 2520 agactcccca aaaagattgg cgacagccat tgcaggcgct tgggagaatg gagtgtgcgg 2580 aattaggtca acaaccagaa tggagaatct cctgtggaag caaatagcca atgaactgaa 2640 ctacatatta tgggaaaaca atatcaaatt aacggtagtt gtgggcgata caattggggt 2700 cttagagcaa ggaaaaagaa cactaacacc acaacccatg gagctaaaat actcatggaa 2760 aacatgggga aaggcaaaaa tagtgacagc 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ggtagcagac tagtggttag aggagacccc tcccaagaca caacgcagca gcggggccca 10560 acaccagggg aagctgtacc ctggtggtaa ggactagagg ttagaggaga ccccccgcac 10620 aacaacaaac agcatattga cgctgggaga gaccagagat cctgctgtct ctacagcatc 10680 attccaggca cagaacgcca gaaaatggaa tggtgctgtt gaatcaacag gttctaaacg 10740 aagagc 10746

Claims (18)

1. 뎅기 바이러스 E 당단백질 백본의 뎅기 바이러스 혈청형과 상이한 뎅기 바이러스 혈청형과 반응성인 항체에 의해 인식되는 에피토프를 도입하는 아미노산 치환을 포함하는 뎅기 바이러스 E 당단백질 백본을 포함하는 키메라 뎅기 바이러스 E 당단백질.
2. 제1항에 있어서, 뎅기 바이러스 E 당단백질 백본이 뎅기 바이러스 혈청형 1로부터의 것인 키메라 뎅기 바이러스 E 당단백질.
3. 제1항에 있어서, 뎅기 바이러스 E 당단백질 백본이 뎅기 바이러스 혈청형 3으로부터의 것인 키메라 뎅기 바이러스 E 당단백질.
4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 항체가 뎅기 바이러스 혈청형 3과 반응성인 것인 키메라 뎅기 바이러스 E 당단백질.
5. 제1항 또는 제3항에 있어서, 항체가 뎅기 바이러스 혈청형 1과 반응성인 것인 키메라 뎅기 바이러스 E 당단백질.
6. 제4항에 있어서, 항체가 모노클로날 항체 5J7인 키메라 뎅기 바이러스 E 당단백질.
7. 제5항에 있어서, 항체가 모노클로날 항체 1F4인 키메라 뎅기 바이러스 E 당단백질.
8. 제1항에 있어서, 하기 아미노산 서열:
   

   

   
   을 포함하는 키메라 뎅기 바이러스 E 당단백질.
9. 제1항에 있어서, 하기 아미노산 서열:
   

   

   
   을 포함하는 키메라 뎅기 바이러스 E 당단백질.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 E 당단백질을 포함하는 플라비바이러스 입자 또는 바이러스 유사 입자 (VLP).
11. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 E 당단백질을 코딩하는 단리된 핵산 분자.
12. 제10항의 플라비바이러스 입자 또는 VLP를 코딩하는 단리된 핵산 분자.
13. 제약상 허용되는 담체 중 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 E 당단백질을 포함하는 조성물.
14. 제약상 허용되는 담체 중 제11항 또는 제12항의 핵산 분자를 포함하는 조성물.
15. 대상체에게 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 E 당단백질, 제10항의 플라비바이러스 입자, 제11항 또는 제12항의 핵산 분자 및/또는 제13항 또는 제14항의 조성물 및 그의 임의의 조합의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 뎅기 바이러스에 대한 면역 반응을 생성하는 방법.
16. 대상체에게 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 E 당단백질, 제10항의 플라비바이러스 입자, 제11항 또는 제12항의 핵산 분자 및/또는 제13항 또는 제14항의 조성물 및 그의 임의의 조합의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 뎅기 바이러스 감염을 치료하는 방법.
17. 대상체에게 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 E 당단백질, 제10항의 플라비바이러스 입자, 제11항 또는 제12항의 핵산 분자 및/또는 제13항 또는 제14항의 조성물 및 그의 임의의 조합의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 뎅기 바이러스 감염을 예방하는 방법.
18. 대상체에게 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 E 당단백질, 제10항의 플라비바이러스 입자, 제11항 또는 제12항의 핵산 분자 및/또는 제13항 또는 제14항의 조성물 및 그의 임의의 조합의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 뎅기 바이러스 감염의 영향으로부터 대상체를 보호하는 방법.

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