KR20140108937A - 금속 나노구조를 이용한 실시간 단백질 검출 방법 및 검출 키트 - Google Patents

금속 나노구조를 이용한 실시간 단백질 검출 방법 및 검출 키트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 금속 나노구조에 양전하 고분자를 코팅하는 단계; 상기 코팅된 금속 나노구조에, 형광물질이 표지된 DNA 앱타머(aptamer)를 흡착하는 단계; 및 상기 형광물질이 표지된 DNA 앱타머가 흡착된 금속 나노구조에 표적 단백질을 결합시키는 단계;를 포함하는 실시간 단백질 검출방법 및 단백질 검출키트를 제공한다. 본 발명의 실시간 단백질 검출방법 및 단백질 검출키트는 형광 측정에 의하여 단백질의 실시간 검출이 가능하고, 검출 감도 및 검출 특이성이 우수하면서도 조작 방법이 간단하므로 광학 단백질 센서로 널리 적용될 수 있다.

Description

금속 나노구조를 이용한 실시간 단백질 검출 방법 및 검출 키트{METHOD AND KIT FOR DETECTING PROTEIN IN REAL-TIME USING NANO METAL STRUCTURE}
본 발명은 금속 나노구조를 이용한 실시간 단백질 검출 방법 및 검출 키트에 관한 것으로, 보다 구체적으로 금속 나노구조의 형광증폭효과를 이용하여 DNA 앱타머에 결합된 형광물질의 형광증폭을 측정하는 실시간 단백질 검출 방법 및 검출 키트에 관한 것이다.
현장 진단 및 검출기술은 의료 및 환경분야의 기술적 병목 지점이라고 할 만큼 그 중요성이 대두되고 있다. 세계 진단시장의 규모는 맞춤의약진단, 분자진단 및 체외진단시장 분야에 있어서 모두 급격하게 성장하고 있는 추세이다. 이와 관련하여 샘플 전달, 샘플 제조, 데이터 분석 및 검출에 대한 연구가 주를 이루고 있다.
종래 금 나노 구조를 이용한 센서에 대한 선행 연구로 전기화학적 센서가 있었으나(Chem. Asian J. 2010, 5, pp.294-300), 전기화학적 센서의 경우 표적물질 검출에 대한 신호 뿐만 아니라, 전기화학적 활성을 지닌 분자들에 의한 교란 신호가 같이 나타나므로 신호의 신뢰성 문제가 있었다. 또한, 양자점(quantum dot) 과 활성감소제(quencher)를 이용하는 연구(Biosensors and Bioelectronics 26(2011), pp.3870-3875)의 경우, 초기 센서의 구성에 필요한 프로토콜이 복잡하고 표적 DNA의 검출에는 사용될 수 있으나 단백질에는 적용되지 않는다는 단점이 있었다. 또한, 종래 공개특허 제10-2008-0084029호는 표적 단백질에 결합하는 DNA 앱타머, 앱타머의 일부에 상보적인 단일가닥 DNA, 상기 단일가닥 DNA에 상보적인 단일가닥 RNA 및 RNase H를 이용한 표적 단백질 검출 방법 및 검출키트에 관한 것이나, 형광을 장착한 상보적 DNA를 사용한다는 점에서 조작 단계가 복잡하고 실시간 측정이 불가능하다는 문제점이 있었다.
대한민국 공개특허 제10-2008-0084029호
상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 본 발명은 형광 측정 방식을 사용하여 단백질의 실시간 검출이 가능하고, 검출 감도 및 검출 특이성이 우수하면서도 조작 방법이 간단한 금속 나노구조를 이용한 실시간 단백질 검출 방법 및 검출 키트를 제공하는 것을 그 목적으로 한다.
상기와 같은 목적을 해결하기 위하여 본 발명은 금속 나노구조에 양전하 고분자를 코팅하는 단계; 상기 코팅된 금속 나노구조에, 형광물질이 표지된 DNA 앱타머(aptamer)를 흡착하는 단계; 및 상기 형광물질이 표지된 DNA 앱타머가 흡착된 금속 나노구조에 표적 단백질을 결합시키는 단계;를 포함하는 실시간 단백질 검출방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 표적 단백질을 결합시키는 단계에서 금속 나노구조의 형광 세기의 변화를 측정하는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 금속 나노구조는 나노플라워(nanoflower) 또는 나노론(nanolawn) 구조일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 금속 나노구조는 치환 금속보다 환원전위가 낮은 씨앗 금속을 기질에 증착시켜 금속층을 형성하는 단계; 및
상기 금속층과 치환 금속 이온이 포함된 도금 용액을 반응시키는 단계;를 포함하는 무전해 치환 도금 방법으로 제조되는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 금속 나노구조의 금속은 금, 은, 티탄, 및 아연산화물로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 양전하 고분자는 키토산(chitosan), 폴리에틸렌 이민(polyethylene imine), 폴리라이신(polylysine), 폴리아스파르트산 (poly-aspartic acid), 스퍼민(spermine), 프로타민(protamine), 폴리아미도아민(polyamidoamine), 폴리프로필렌이민 (polypropyleneimine), 폴리브렌(polybrene), 폴리아크릴아마이드(polyacrylamide), 폴리비닐아민 (polyvinyl amine) 및 디이에이이 덱스트란(DEAE-dextran)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 양전하 고분자의 분자량은 300 내지 1000일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 금속 나노구조에 양전하 고분자를 코팅하는 단계에서 100 내지 500rpm의 속도로 20 내지 40분간 교반하는 워싱을 거치는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 형광물질은 Cy3, 플루오레세인(fluorescein), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), 텍사스 레드(Texas Red) 및 NADH (nicotinamide adenine dinucleotide)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 형광물질은 양자수율(quantum yield)이 1 내지 50%일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 형광물질 및 금속 나노 구조 간 거리는 20 내지 50 nm 일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 DNA 앱타머(aptamer)는 10 내지 30mer의 길이인 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 표적 단백질은 트롬빈일 수 있다.
또한, 본 발명은 양전하 고분자가 코팅된 금속 나노구조; 및 상기 양전하 고분자가 코팅된 금속 나노구조에 흡착된 형광물질이 표지된 DNA 앱타머(aptamer);를 포함하고, 상기 DNA 앱타머(aptamer)에 표적 단백질이 결합하는 것인, 실시간 단백질 검출키트를 제공한다.
본 발명의 실시간 단백질 검출방법은 형광 측정에 의하여 단백질의 실시간 검출이 가능하고, 검출 감도 및 검출 특이성이 우수하면서도 조작 방법이 간단하므로 광학 단백질 센서로 널리 적용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 실시간 단백질 검출방법을 나타내는 모식도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 실시간 단백질 검출방법 중 키토산의 분자량 및 워싱 방법에 따른 금속 나노구조를 나타내는 SEM 사진이다.
도 3 및 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 실시간 단백질 검출방법에서 사용되는 형광물질의 양자수율에 따른 형광 이미지 및 형광 세기 그래프이다.
도 5 및 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 실시간 단백질 검출방법에서 사용되는 DNA 앱타머의 길이에 따른 형광 이미지 및 형광 세기 그래프이다.
도 7 및 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 실시간 단백질 검출방법의 표적 단백질 농도에 따른 형광 이미지 및 형광 세기 그래프이다.
도 9 및 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 실시간 단백질 검출방법의 검출 특이성을 나타내는 형광 이미지 및 형광 세기 그래프이다.
이하에서는, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 본 발명을 용이하게 실시할 수 있도록 하기 위하여, 본 발명의 바람직한 실시예들에 관하여 상세히 설명하기로 한다.
본 발명은 금속 나노구조에 양전하 고분자를 코팅하는 단계;
상기 코팅된 금속 나노구조에, 형광물질이 표지된 DNA 앱타머(aptamer)를 흡착하는 단계; 및
상기 형광물질이 표지된 DNA 앱타머가 흡착된 금속 나노구조에 표적 단백질을 결합시키는 단계;를 포함하는 실시간 단백질 검출방법을 제공한다.
이하, 본 발명의 실시간 단백질 검출방법에 대하여 보다 구체적으로 알아보도록 한다.
먼저, 금속 나노구조에 양전하 고분자를 코팅한다.
본 발명에서, 상기 금속 나노구조는 나노플라워(nanoflower) 또는 나노론(nanolawn) 구조일 수 있다. 나노플라워(nanoflower) 구조는 치환된 금속이 꽃잎 모양인 것을 의미하고, 나노론(nanolawn) 구조 치환된 금속이 바늘 모양인 것을 의미한다. 상기 나노플라워(nanoflower) 또는 나노론(nanolawn) 구조는 200 내지 250nm의 침상 구조일 수 있다. 나노플라워(nanoflower) 또는 나노론(nanolawn) 구조의 금속 나노구조는 둥근 구조의 금속 나노구조에 비하여 증가된 형광 증폭 효과를 가진다.
이러한 나노플라워(nanoflower) 또는 나노론(nanolawn) 구조의 금속 나노구조는 구체적으로 하기의 방법으로 제조될 수 있다. 즉, 상기 금속 나노구조는, 치환 금속보다 환원전위가 낮은 씨앗 금속을 기질에 증착시켜 금속층을 형성하는 단계; 및 상기 금속층과 치환 금속 이온이 포함된 도금 용액을 반응시키는 단계;를 포함하는 무전해 치환 도금 방법으로 제조되는 것일 수 있다.
본 발명에서 용어 "무전해 치환 도금"이란 금속염과 환원제가 함유되어 있는 용액에 도금을 하고자 하는 표면을 접촉시킬 때 얻어지게 되는 도금 방법으로, 씨앗 금속의 산화에서 얻어지는 전자가 용액 내에 있는 치환 금속 이온에 전이되어 금속 피막이 형성되는 것을 말한다. 이러한 도금 방식은 균일한 두께를 형성하기에 유리하고, 도금 공정이 간단하다는 장점을 지닌다.
본 발명에서 금속은 전도성을 가지는 금속 및 금속 산화물을 포함하는 것을 의미한다. 본 발명에서 금속은 금, 은, 티탄, 및 아연산화물로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있고, 바람직하게는 금일 수 있다. 예를 들어, 치환 금속이 금(Au)인 경우, 금보다 환원전위가 낮은 Ni, Pt, Ag 또는 Cu, 바람직하게는 Pt, Ag 또는 Cu가 씨앗 금속이 될 수 있다.
본 발명에서, 상기 양전하 고분자는 양전하를 띄는 고분자로서 중합도에 따라 다양한 분자량을 가지는 고분자이면 특별히 한정되는 것은 아니나, 바람직하게는 키토산(chitosan), 폴리에틸렌 이민(polyethylene imine), 폴리라이신(polylysine), 폴리아스파르트산 (poly-aspartic acid), 스퍼민(spermine), 프로타민(protamine), 폴리아미도아민(polyamidoamine), 폴리프로필렌이민 (polypropyleneimine), 폴리브렌(polybrene), 폴리아크릴아마이드(polyacrylamide), 폴리비닐아민 (polyvinyl amine) 및 디이에이이 덱스트란(DEAE-dextran) 으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다. 더욱 바람직하게는 키토산(chitosan)일 수 있으며, 키토산은 끝단에 아민기(-NH2)를 가지고 있어 전체적으로 양전하를 띠는 폴리머 재료로, 상대적으로 음전하를 띠는 DNA에 대해 흡착을 도모하는 역할을 한다. 키토산은 하기 화학식 1과 같이 표현된다.
[화학식 1]
Figure pat00001

상기 양전하 고분자의 분자량은 300 내지 1000일 수 있다. 분자량이 300 미만이면 양전하의 강도가 약하고 금속에 의한 형광의 소거(quenching)이 발생하며, 1000 초과이면 형광신호를 증폭하는 효과가 약해지기 때문이다.
상기 금속 나노구조에 양전하 고분자를 코팅하는 방법은 당업계에 알려진 코팅 방법이면 특별히 한정되는 것은 아니나, 예를 들어 양전하 고분자 분말을 산 용액에 용해하여 3 내지 5시간 동안 반응시키는 방법을 이용할 수 있다. 반응 이후, 워싱(washing)은 고분자를 증류수에 담그어 20 내지 40분간 100 내지 500rpm의 속도로 셰이킹(shaking)하는 것이 바람직하다. 셰이킹을 하지 않고 증류수에 담구어 놓기만 하는 경우에는 코팅이 너무 두껍게 되어 코팅 이전의 금속 나노구조를 유지할 수 없어, 나노 구조에 대한 효과를 볼 수 없는 표면이 만들어진다. 이에 반하여, 고분자를 증류수에 담그고 셰이킹(shaking)하는 경우, 금속 나노구조의 나노플라워(nanoflower) 또는 나노론(nanolawn) 구조가 유지되고, 특히 20 내지 40분간 100 내지 500rpm의 속도로 셰이킹(shaking)하는 경우 구조의 유지가 가장 우수하다.
양전하 고분자를 금속 나노구조에 코팅한 경우 형광 증폭 효과가 커지게 된다. 금속 나노구조와 형광물질 간의 거리가 너무 가까운 경우, 형광 분자가 가진 에너지가 금속으로 모두 전이가 되어 형광이 나타나지 않는 ?칭(Quenching) 현상이 발생하여 형광신호 강도가 감소하므로, ?칭 현상을 방지하여 금속 나노 구조에 의한 형광 증폭 효과를 증진시키기 위하여 양전하 고분자를 코팅하는 것이다. 양전하 고분자는 분자량이 다양하여 코팅층의 두께를 조절하기가 용이하므로, 금속과 형광물질 간의 적정 거리 유지에 사용되기에 바람직하다. 본 발명에서 양전하 고분자가 코팅되는 코팅층의 두께는 20 내지 50 nm인 것이 바람직하다.
이에 따라, 형광물질 및 나노 구조간 거리는 20 내지 50nm인 것이 바람직하다. 20nm 미만이면 ?칭 효과가 발생하여 형광 강도가 감소하며, 50nm 초과이면 나노 구조에 의한 신호 증폭 효과가 감소하게 된다.
그 다음, 상기 코팅된 금속 나노구조에, 형광물질이 표지된 DNA 앱타머(aptamer)를 흡착한다.
본 발명에서, 상기 DNA 앱타머(aptamer)는 형광물질을 DNA에 표지한 것이다. DNA 앱타머는 전기적으로 음성을 띠기 때문에 양전하 고분자로 코팅된 금속 나노구조에 정전기적 인력으로 흡착이 일어난다. 흡착 반응 시간은 약 1시간이며, DNA 용액 반응을 할 수 있다.
본 발명에서, 상기 형광물질은 Cy3, 플루오레세인(fluorescein), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), 텍사스 레드(Texas Red) 및 NADH (nicotinamide adenine dinucleotide)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다. 바람직하게는 Cy3일 수 있다.
또한, 상기 형광물질은 양자수율(Quantum Yield)이 1 내지 50%일 수 있다. 바람직하게는 1 내지 10%일 수 있다. 양자수율이 상기 범위 내인 경우, 형광 증폭 효과가 더욱 크게 나타난다. 예를 들어, Cy3은 양자수율이 10%로 형광 증폭 효과가 10 내지 15배 커짐을 확인할 수 있다.
본 발명에서, 상기 DNA 앱타머(aptamer)는 10 내지 30mer의 길이인 것일 수 있다. DNA 앱타머(aptamer)의 길이가 10mer 미만이면 음전하로 인한 고정화가 불가이고, 30mer 초과이면 DNA 앱타머에 단백질이 결합될 때 DNA 앱타머가 표면 밖으로 분리되지 못하기 때문이다. DNA 앱타머가 상기 범위의 길이를 가질 때 단백질의 실시간 검출이 가능하다.
마지막으로, 상기 형광물질이 표지된 DNA 앱타머가 흡착된 금속 나노구조에 표적 단백질을 결합시킨다.
주입된 표적 단백질은 DNA 앱타머와 반응하는데, 이 때 전하 차폐(charge shielding)가 발생하여 형광물질이 표지된 DNA 앱타머가 떨어져 나오게 된다. 따라서, 표적 단백질의 주입 전후 금속 나노구조의 형광 세기의 변화를 측정하는 것으로, 단백질의 농도를 측정할 수 있다. 도 1에 형광물질이 표지된 DNA 앱타머와 단백질이 결합하여 형광물질이 분리되는 과정의 모식도를 도시하였다.
본 발명에서, 상기 표적 단백질은 앱타머와 선택적으로 결합하는 단백질이면 특별히 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는 트롬빈일 수 있다. 본 발명에서 표적 단백질을 선택적으로 검출할 수 있는 이유는 형광표지된 앱타머와 선택적으로 결합하며 표면에서 박리되도록 유도하여 형광의 세기를 감소시키기 때문이다.
또한, 본 발명은 양전하 고분자가 코팅된 금속 나노구조; 및 상기 양전하 고분자가 코팅된 금속 나노구조에 흡착된 형광물질이 표지된 DNA 앱타머(aptamer);를 포함하는 실시간 단백질 검출키트를 제공한다. 상기 단백질 검출 키트는 DNA 앱타머(aptamer)에 표적 단백질이 결합함으로써 발생되는 형광 세기의 변화량을 측정하는 것이다.
본 발명에 따른 실시간 단백질 검출키트에 의한 형광 세기 변화량 측정시, 표적 단백질의 농도가 1nM 수준까지 30% 이상의 형광신호 감소 변화를 나타내어, 형광 증폭 효과가 충분하여 검출 감도가 매우 뛰어남을 알 수 있었다.
이하의 실시를 통하여 본 발명이 더욱 상세하게 설명된다. 단, 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로서 이들만으로 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1] 양전하 고분자가 코팅된 금속 나노구조에 흡착된 형광물질이 표지된 DNA 앱타머
결정질 (100) p타입 Si 웨이퍼(wafer)를 표준 RCA 방법으로 세척하고 나서, Si 표면에 Ti 100 Å을 증착하였다. 그리고 나서 각각의 샘플에 1000 Å의 두께로 Cu를 증착하였다. Ti 층(100 Å)와 금속 층 (1000 Å) 모두 e-beam evaporator (Ultech) 를 사용하여 3 Å/s의 속도로 증착하였다. 증발 압력은 2X10-6 Torr였다. 금속 증착 후에, 기질을 희석된 Au 금속 염 [KAu(CN)2 aqua] 을 포함한 무전해 도금 용액에 담갔다. 이 용액에 존재하는 Au 금속 염은 금속층을 Au 금속 층으로 치환시켰다. 이 용액의 진행 온도는 더블 보일러(double boiler)를 사용하여 80 ℃로 유지시켰다. 치환 시간은 2분이었다. 용액을 자석 교반기로 교반하였다. 2분의 반응시간 후에 금 입자가 금속 기질에 시드로 분포되었다. 금 도금 용액 속에 담긴 기질은 분포되지 않은 채로 남아있었다. 상기, 금 도금 용액을 포함하는 반응 용기는 핫 플레이트로부터 제거되었다. 기질을 포함하는 금 도금 용액을 실온에서 냉각하였다. 따라서, 실온에서 나노플라워의 성장이 금속층에서 이루어졌다.
그 다음, 키토산 분말을 아세트산에 녹이고(220mg/1.5ml), 상기에서 얻은 시편을 상기 아세트산 용액에 담그어 4시간 동안 반응을 하여 키토산 코팅을 진행하였다. 이 때 사용된 키토산의 분자량은 1000이었다. 이후, 키토산에 대한 워싱(washing)을 위해서, 280rpm으로 흔드는 상태로 증류수에 담가 30분간 처리를 하였다.
키토산 코팅 후, 형광물질이 표지된 앱타머 DNA를 금 나노구조에 흡착하였다. 이때, 앱타머 DNA의 경우 전기적으로 음성을 띠기 때문에 키토산에 정전기적 인력으로 흡착이 일어났다. 이때 사용한 형광물질은 Cy3로, 양자 효율(Quantum yield)이 10%인 형광 분자이었다. 앱타머 DNA의 흡착 반응 시간은 1시간이었으며, 이 때 10 mM 의 DNA 용액 반응을 하였다.
[시험예 1] 키토산 분자량 및 워싱 방법에 따른 금 나노구조
상기 실시예 1에서 제조된 키토산(분자량 1000)이 코팅된 금 나노구조에 흡착된 형광물질이 표지된 DNA 앱타머를 가지고 키토산 분자량에 구조를 관찰하였다. 분자량 1000~3000의 키토산 및 분자량 5000의 키토산인 것을 제외하고 나머지 조건은 실시예 1과 동일한 DNA 앱타머를 비교예 1 및 2로 하였다.
실시예 1, 비교예 1 및 2를 가지고 각각 증류수를 분무하여 표면의 키토산을 제거를 하고 증류수에 30분간 담그는 워싱, 및 증류수를 분무하여 표면의 키토산을 제거하고 증류수에 15분 및 30분간 담가 두면서 280 rpm의 속도로 셰이킹하는 워싱을 실시하였다. 이러한 워싱 후 표면에 형성된 구조를 SEM을 통해서 확인을 하였다. 도 2는 각각의 조건에 대한 SEM 측정 사진이다.
도 2에서 볼 수 있듯이, 워싱의 두 가지 방법 중 첫 번째 방법인 흔드는 것 없이 30분간 증류수에 담가두는 경우에는 키토산 코팅 전의 금 나노 구조를 찾아보기 어려웠다. 이는 키토산 코팅이 두껍게 되어, 나노 구조에 대한 효과를 볼 수 없는 표면을 의미한다. 셰이킹 워싱 방법은 15분 및 30분간 증류수에 담가둔 채로 280 rpm의 속도로 흔드는 것인데, 이 방법은 증류수에 담가두기만 하는 워싱 방법과는 다르게 코팅 이전의 원래 구조를 유지함을 확인할 수 있었다. 특히, 30분간 셰이킹하는 경우 구조가 더욱 선명하게 관찰되었다. 다만, 1000~3000의 분자량에서는 원래의 구조를 확인할 수 없었으며, 1000 및 5000의 두 분자량의 경우에는 처음의 구조와 거의 똑같은 구조가 확인되었다. 따라서 형광 증폭 센서로 이용될 키토산 코팅은 30분간 증류수 내에서 280rpm의 속도로 흔들면서 워싱하는 방식이 바람직하고, 키토산의 분자량은 1000~3000이 부적절한 것임을 알 수 있었다.
[시험예 2] 형광 물질의 양자수율(quantum yield)에 따른 형광 세기
상기 실시예 1에서 제조된 키토산(분자량 1000)이 코팅된 금 나노구조에 흡착된 형광물질(Cy3)이 표지된 DNA 앱타머를 가지고 형광 물질의 양자수율에 따른 형광 세기를 측정하였다. 실시예 1의 형광 분자는 양자수율이 10%인 Cy3를 이용한 것이다. 이에 대한 비교를 위해서 양자수율이 90%인 FAM 형광 분자를 사용한 것을 제외하고 나머지 조건은 실시예 1과 동일한 것을 비교예 3으로 하였고, 또한 키토산의 분자량이 5000인 것을 제외하고 실시예 1 및 비교예 3과 동일한 것을 각각 비교예 4 및 5로 하였다.
먼저, 형광 증폭 효과를 비교해보기 위해서 일반적인 금 표면과 나노 구조를 가진 금 표면에 형광분자가 달린 DNA를 흡착하여 확인하였으며, 이때 이용된 키토산 코팅의 경우 1000 및 5000의 분자량을 갖는 키토산을 이용하였다.
그 후, 각 표면에 대해서는 2가지의 다른 형광 분자가 달린 DNA 처리를 하였으며, 각각 1시간의 흡착 반응하였다. 그리고 스캔 어레이 라이트(Scan Array Lite) 장비를 통해 형광 이미지 측정을 하였다. 도 3은 Cy3 형광 분자 및 FAM 형광 분자에 대한 형광 이미지이고, 도 4는 형광 세기(Fluorescence intensity)를 나타내는 그래프로, 형광 분자, 키토산 코팅, 나노 구조에 따라서 형광 증폭 효과를 알아보기 위한 것이다. 제작된 금 나노 구조와 일반적인 금에 대한 형광 세기비로 하여, 형광 분자와 키토산 코팅에 대해 형광 증폭비를 계산, 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.
키토산의 분자량 Cy3 염색
(양자수율 10%)		 FAM염색
(양자수율 90%)
1000 (실시예 1)
Inano/Ibare:15		 (비교예 3)
Inano/Ibare:3.69
5000 (비교예 4)
Inano/Ibare:3.0		 (비교예 5)
Inano/Ibare:3.05
키토산 코팅 전의 경우, 나노 구조 기판에서 약 1.5배의 형광 신호가 높게 나타났다. 키토산 코팅 후 경우, 대부분 3배 정도의 나노 구조 효과를 볼 수 있었다. 하지만 1000의 분자량을 갖는 키토산 중 Cy3 형광 분자를 이용하였던 표면에서만 유일하게 나노 구조에 대한 효과가 5 내지 10배 가량 높이 나타나는 것을 확인할 수 있었다. 이 결과를 통해서 광학 센서로 이용하기 위한 표면으로는 양자수율이 낮은 Cy3 형광 분자를 이용하면서 금 나노 구조를 가진 표면이 유리함을 알 수 있었다.
[시험예 3] DNA 앱타머의 길이에 따른 형광 세기
상기 실시예 1에서 제조된 키토산이 코팅된 금 나노구조에 흡착된 형광물질이 표지된 DNA 앱타머를 가지고, DNA 앱타머에 따른 형광 세기를 측정하였다. 실시예 1의 DNA 앱타머는 15mer의 길이를 가지고, 비교를 위하여 21mer의 길이의DNA 앱타머를 비교예 6으로 하였다. DNA 앱타머에서 트롬빈과 반응하는 영역은 15mer 길이이며, 따라서 15mer및 이보다 긴 21mer를 이용하여 형광세기 변화를 확인해 보고자 한 것이다. 이 변화를 통해 형광증폭 신호를 이용한 광학센서로 적합한 길이의 앱타머 DNA를 찾는 것이 목적이다.
트롬빈 주입 후, 실시간 검출에 대한 실험으로 용액의 존재 유무에서의 실험을 실시하였다. 사용된 트롬빈의 농도는 뚜렷한 확인을 위해서 비교적 높은 농도인 10μM을 이용하였으며, 트롬빈 주입 후 반응은 15분으로, 반응 전후의 형광세기 변화를 측정하였다. 그 결과를 도 5 및 6에 나타내었다.
도 5 및 6에서 볼 수 있듯이, 용액의 유무에 대해, DNA 앱타머의 길이에 따른 형광 세기 변화가 다른 결과를 보였다. 즉, 표면에 용액이 없는 경우에는 거의 비슷한 형광 세기 감소를 보였다. 하지만 용액이 있는 경우, 짧은 길이의 15mer에서만 용액의 유무에 관계없이 형광 세기가 변화하는 것을 보여주었다. 이는 용액이 존재하는 표면에서 트롬빈 주입에 대한 실시간 감지가 가능한 표면을 말한다. 도 5 및 6에서 볼 수 있듯이, 센서에 적용하기 더 적절한 길이는 더 짧은 길이의 앱타머가 흡착된 면임을 알 수 있었다. 이는 전기적으로 흡착되어 있던 DNA 앱타머가 트롬빈에 특이적 반응을 보이면서 표면 밖으로 분리되는데, 상대적으로 짧은 길이의 DNA 앱타머가 표면으로부터 쉽게 분리된 것으로 분석된다.
[시험예 4] 검출 감도 실험: 트롬빈의 농도에 따른 형광 세기
상기 실시예 1에서 제조된 키토산이 코팅된 금 나노구조에 흡착된 형광물질이 표지된 DNA 앱타머를 가지고, 센서로서 중요한 특성인 검출 감도(민감도) 실험을 하였다. 민감도 실험을 위해 다양한 농도의 트롬빈을 사용하여 트롬빈 주입 전후의 형광 세기를 비교하였다. 사용한 트롬빈의 농도는 100pM, 1nM, 10nM, 100nM, 1μM 및 10μM을 이용하였다. 각 농도에 대해서 3번의 실험을 시행하였다. 각 반응은 트롬빈 주입 후 10분 간의 반응시간을 두고 측정하였다. 그 결과를 도 7 및 8에 나타내었다.
도 8은 트롬빈 주입 전후에 대한 형광 세기의 감소량을 나타낸 그래프이다. 도 8에서 볼 수 있듯이, 약 1nM 수준의 농도까지 검출 가능함을 확인할 수 있었다.
[시험예 5] 검출 특이성 실험
상기 실시예 1에서 제조된 키토산이 코팅된 금 나노구조에 흡착된 형광물질이 표지된 DNA 앱타머를 가지고, 센서에서 중요한 특성인 물질의 특이적 반응에 대한 평가를 실시하였다. 이 실험에서 앱타머-트롬빈의 특정 반응에 대해서, 트롬빈과 비교군으로 HSA(Human serum albumin, ZLB Behring, USA)를 주입하였고, 앱타머에 대한 비교군으로 ref. DNA를 이용하였다. 그 결과를 도 9 및 10에 나타내었다.
도 10에서 볼 수 있듯이, HAS를 주입한 경우 및 트롬빈을 ref. DNA과 반응시킨 경우 모두 4% 이내의 형광 감소율을 보였다. 이는 30% 이상의 형광 감소율을 나타낸 본 발명에 따른 트롬빈-앱타머 간의 반응과는 대조적이었으며, 본 발명의 센서로서 키토산이 코팅된 금 나노구조에 흡착된 형광물질이 표지된 DNA 앱타머가 특정 물질에 대한 검출이 가능함을 보여주었다.

Claims (22)

  1. 금속 나노구조에 양전하 고분자를 코팅하는 단계;
    상기 코팅된 금속 나노구조에, 형광물질이 표지된 DNA 앱타머(aptamer)를 흡착하는 단계; 및
    상기 형광물질이 표지된 DNA 앱타머가 흡착된 금속 나노구조에 표적 단백질을 결합시키는 단계;를 포함하는 실시간 단백질 검출방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 표적 단백질을 결합시키는 단계에서 금속 나노구조의 형광 세기의 변화를 측정하는 것인 실시간 단백질 검출방법.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 금속 나노구조는 나노플라워(nanoflower) 또는 나노론(nanolawn) 구조인 실시간 단백질 검출방법.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 금속 나노구조는 치환 금속보다 환원전위가 낮은 씨앗 금속을 기질에 증착시켜 금속층을 형성하는 단계; 및
    상기 금속층과 치환 금속 이온이 포함된 도금 용액을 반응시키는 단계;를 포함하는 무전해 치환 도금 방법으로 제조되는 것인 실시간 단백질 검출방법.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 금속 나노구조의 금속은 금, 은, 티탄, 및 아연산화물로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 실시간 단백질 검출방법.
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 양전하 고분자는 키토산(chitosan), 폴리에틸렌 이민(polyethylene imine), 폴리라이신(polylysine), 폴리아스파르트산 (poly-aspartic acid), 스퍼민(spermine), 프로타민(protamine), 폴리아미도아민(polyamidoamine), 폴리프로필렌이민 (polypropyleneimine), 폴리브렌(polybrene), 폴리아크릴아마이드(polyacrylamide), 폴리비닐아민 (polyvinyl amine) 및 디이에이이 덱스트란(DEAE-dextran)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 실시간 단백질 검출방법.
  7. 제 1항에 있어서,
    상기 양전하 고분자의 분자량은 300 내지 1000인 실시간 단백질 검출방법.
  8. 제 1항에 있어서,
    상기 금속 나노구조에 양전하 고분자를 코팅하는 단계에서 100 내지 500rpm의 속도로 20 내지 40분간 교반하는 워싱을 거치는 것인 실시간 단백질 검출방법.
  9. 제 1항에 있어서,
    상기 형광물질은 Cy3, 플루오레세인(fluorescein), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), 텍사스 레드(Texas Red) 및 NADH (nicotinamide adenine dinucleotide)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 실시간 단백질 검출방법.
  10. 제 1항에 있어서,
    상기 형광물질은 양자수율이 1 내지 50%인 것인 실시간 단백질 검출방법.
  11. 제 1항에 있어서,
    상기 형광물질 및 금속 나노 구조 간 거리는 20 내지 50nm인 실시간 단백질 검출방법.
  12. 제 1항에 있어서,
    상기 DNA 앱타머(aptamer)는 10 내지 30mer의 길이인 것인 실시간 단백질 검출방법.
  13. 제 1항에 있어서,
    상기 표적 단백질은 트롬빈인 실시간 단백질 검출방법.
  14. 양전하 고분자가 코팅된 금속 나노구조; 및
    상기 양전하 고분자가 코팅된 금속 나노구조에 흡착된 형광물질이 표지된 DNA 앱타머(aptamer);를 포함하고,
    상기 DNA 앱타머(aptamer)에 표적 단백질이 결합하는 것인, 실시간 단백질 검출키트.
  15. 제 14항에 있어서,
    상기 양전하 고분자는 키토산(chitosan), 폴리에틸렌 이민(polyethylene imine), 폴리라이신(polylysine), 폴리아스파르트산 (poly-aspartic acid), 스퍼민(spermine), 프로타민(protamine), 폴리아미도아민(polyamidoamine), 폴리프로필렌이민 (polypropyleneimine), 폴리브렌(polybrene), 폴리아크릴아마이드(polyacrylamide), 폴리비닐아민 (polyvinyl amine) 및 디이에이이 덱스트란(DEAE-dextran)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 실시간 단백질 검출키트.
  16. 제 14항에 있어서,
    상기 양전하 고분자의 분자량은 300 내지 1000인 실시간 단백질 검출키트.
  17. 제 14항에 있어서,
    상기 금속 나노구조는 나노플라워(nanoflower) 또는 나노론(nanolawn) 구조인 실시간 단백질 검출키트.
  18. 제 14항에 있어서,
    상기 형광물질은 Cy3, 플루오레세인(fluorescein), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), 텍사스 레드(Texas Red) 및 NADH (nicotinamide adenine dinucleotide)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 실시간 단백질 검출키트.
  19. 제 14항에 있어서,
    상기 형광물질은 양자수율이 1 내지 50%인 것인 실시간 단백질 검출키트.
  20. 제 14항에 있어서,
    상기 형광물질 및 금속 나노 구조 간 거리는 20 내지 50nm인 실시간 단백질 검출키트.
  21. 제 14항에 있어서,
    상기 DNA 앱타머(aptamer)는 10 내지 30mer의 길이인 것인 실시간 단백질 검출키트.
  22. 제 14항에 있어서,
    상기 표적 단백질은 트롬빈인 실시간 단백질 검출키트.
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