KR102664147B1 - A method for producing animal model infected by hepatitis virus - Google Patents
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Abstract
본 발명은 바이러스가 감염된 동물 모델의 제조 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 목적하는 동물로부터 유래된 지질막 이중층 (lipid layer)의 외피를 포함하는 외피 바이러스를 주입하는 단계를 포함하는 바이러스가 감염된 동물 모델의 제조 방법에 관한 것으로, 상기 제조 방법을 이용하는 경우 담즙산 또는 담즙산 유도체에 의해 바이러스의 지질막 이중층의 외피가, 인간으로부터 유래된 지방질 외피가 목적하는 동물 모델로부터 유래된 지방질 외피로 교체되기 때문에, 종 특이성에 의한 제한 없이 임상적으로 유용하게 활용할 수 있는 동물 모델을 제작할 수 있다.The present invention relates to a method for producing a virus-infected animal model, and more specifically, to a virus-infected animal model comprising the step of injecting an enveloped virus containing an envelope of a lipid bilayer derived from the animal of interest. Regarding the production method, when using the above production method, the envelope of the lipid membrane bilayer of the virus is replaced by the lipid envelope derived from humans with the lipid envelope derived from the desired animal model by bile acid or a bile acid derivative, thereby ensuring species specificity. Animal models that can be clinically useful can be created without any limitations.
Description
본 발명은 바이러스가 감염된 동물 모델의 제조 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 지질막 이중층이 목적하는 동물의 지질막 이중층으로 교체된 지질막 이중층 (lipid bilayer)의 외피(envelope)를 포함하는 외피 바이러스를 주입하는 단계를 포함하는 바이러스 감염 동물 모델의 제조 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for producing an animal model infected with a virus, and more specifically, to the step of injecting an enveloped virus containing the envelope of a lipid bilayer in which the lipid membrane bilayer is replaced with the lipid membrane bilayer of the target animal. It relates to a method for producing a viral infection animal model comprising.
일반적으로 숙주 세포에 감염될 수 있는 능력을 가지고 있는 바이러스 입자인 비리온 (virion)은, DNA 또는 RNA의 유전물질을 포함하는 중심부 유전체 (genome)와, 이와 같은 유전물질을 보호하는 역할을 하는 단백질 껍질인 캡시드 (capsid), 그리고 경우에 따라 외피 (envelope)를 더 포함하도록 구성되어 있다. 외피를 포함하는 바이러스 종류에는 DNA 바이러스인 헤르페스바이러스 (Herpesvirus), RNA 바이러스인 플라비바이러스 (Flavivirus), 그리고 레트로바이러스 (Retrovirus) 등이 존재한다. In general, a virion, a viral particle that has the ability to infect a host cell, has a central genome containing genetic material of DNA or RNA, and a protein that plays a role in protecting this genetic material. It is composed of a shell, a capsid, and in some cases, an envelope. Types of viruses that contain an envelope include Herpesvirus, a DNA virus, Flavivirus, an RNA virus, and Retrovirus.
한편, 간염을 일으키는 바이러스 (Hepatitis virus)는 외피가 있는 바이러스 (enveloped virus; B형, C형, D형)와, 외피가 없는 바이러스 (non-enveloped virus; A형, E형)로 구분될 수 있다. 전 세계적으로 감염율이 약 3억 5천만명 정도로 추정되는 B형 간염바이러스 (Hepatitis B virus, 이하 'HBV'라함)는 대표적인 외피를 포함하는 바이러스로서, 만성간질환의 주요 원인에 해당한다. 상기 HBV는 헤파드나바이러스 패밀리에 속하는 DNA 게놈을 갖는 바이러스로서, 급성 및 만성 간염을 유발한다. 특히 한국 및 중국에서 만성 감염자가 약 5 내지 8 %에 이르는 HBV 유병율은 현재, 백신의 개발로 어느 정도 저하되었지만 여전히 모체로부터 수직 감염에 따른 발생이 지속되어 만성 간염 환자가 상당수 존재하고 있는 현실이다. HBV의 만성 감염은 간염, 간경변 뿐만 아니라 간암을 유발하며, WHO의 조사에 따르면 약 80%의 간암은 만성 B형 간염이 원인인 것으로 확인될 정도로, 비 감염자에 비하여 HBV 감염자에서 약 300배 높은 수준으로 간암 발생빈도가 나타난다.Meanwhile, viruses that cause hepatitis (Hepatitis virus) can be divided into enveloped viruses (types B, C, D) and non-enveloped viruses (types A, E). there is. Hepatitis B virus (hereinafter referred to as 'HBV'), with an estimated infection rate of approximately 350 million people worldwide, is a representative enveloped virus and is a major cause of chronic liver disease. The HBV is a virus with a DNA genome belonging to the hepadnavirus family and causes acute and chronic hepatitis. In particular, the prevalence of HBV, which is about 5 to 8% of chronically infected people in Korea and China, has decreased to some extent with the development of vaccines, but vertical transmission from the mother still continues, resulting in a significant number of patients with chronic hepatitis. Chronic infection with HBV causes not only hepatitis and cirrhosis, but also liver cancer. According to a WHO survey, about 80% of liver cancers are confirmed to be caused by chronic hepatitis B, and the level is about 300 times higher in HBV-infected people than in non-infected people. The frequency of liver cancer appears as follows.
상기 HBV는 서로 유전자 염기서열이 약 8% 이상 다른 8개의 유전자형으로 분류하거나, HBV의 표면항원 (HBsAg) 두 곳의 항원결정부위 (d/y, w/r)를 중심으로 4종의 혈청형 (adw, adr, ayw, ayr 등)으로 구분된다. 상기 간염 바이러스의 숙주인 간은 면역 내성을 유도하기 때문에, 조직 적합성 복합체, 부정합 간 동종 이식의 경우에도 거부 반응 없이 생존할 수 있다. The HBV is classified into 8 genotypes that differ by more than 8% in gene sequence, or into 4 serotypes centered on the two epitope (d/y, w/r) of the surface antigen (HBsAg) of HBV. It is divided into (adw, adr, ayw, ayr, etc.). Since the liver, which is the host of the hepatitis virus, induces immune tolerance, it can survive without rejection even in the case of a histocompatibility complex or mismatched liver allograft.
한편, 상기 C형 간염 바이러스 (Hepatitis C virus, 이하 'HCV'라함)는 전세계적으로 약 1.7억명이 감염되어 있고, 주로 선진국에서 감염율이 높고, 문신, 마약 같은 약물 투여, 그리고 에이즈 감염과 연관성이 높으며, 대부분 만성 경과를 취하며 합병증으로 간경변과 간암을 일으킨다. HCV는 플라비비리데 패밀리에 속하는 헤파씨바이러스 (Hepacivirus)로 RNA 게놈 바이러스로서, 6가지 유전자형 (1 내지 6 형)과 각 유전자형마다 다양한 종류의 아형(subtype)으로 나누어진다. 이러한 HCV의 아형은 HCV에 감염된 환자에서 더욱 분화되어 여러 유전적 다양성 (genetic diversity)이 나타나는 유사종 (quasispecies)을 보인다. Meanwhile, the hepatitis C virus (hereinafter referred to as 'HCV') infects approximately 170 million people worldwide, has a high infection rate mainly in developed countries, and is associated with tattoos, drug administration, and AIDS infection. It is high, takes a chronic course in most cases, and causes cirrhosis and liver cancer as complications. HCV is a Hepacivirus belonging to the Flaviviride family, an RNA genome virus, and is divided into six genotypes (types 1 to 6) and various subtypes for each genotype. These HCV subtypes are further differentiated in HCV-infected patients, showing quasispecies with various genetic diversity.
만성 HBV 감염의 경우, 핵산 유도체 (nucleoside analog)를 경구 투여하여 바이러스의 증식을 억제시키거나, 감염된 환자에 인터페론을 주사하는 방식으로 치료하고 있다. 그러나, 상기 핵산 유도체는 인터페론에 비하여 그 치료 효과가 좋지만, 장기간 사용하는 경우 HBV 내성이 발생되며, 다른 약제에 대해서도 교차 내성이 발생할 수 있는 문제점이 존재한다. 또한, HCV 감염의 경우에는 1990년대 인터페론 단독 요법이 시도되었으나 치료 성공률이 10%에 불과하였다. 2000년대 들어서 페그인터페론 알파와 리바비린의 병합요법으로 치료 성공률이 약 50% 정도 향상되었으나, 약물에 의한 부작용이 심하여 실질적 치료에 어려움이 존재하였다. 최근 DAA (direct antiviral agent)의 개발되어, 이와 같은 약제를 3개월 내지 6개월 동안 경구 투여하는 경우에 부작용이 거의 없이 약 80 내지 90% 정도 치료 성공률을 얻을 수 있었다. 그러나, 상기 DAA 약제들은 매우 고가의 비용이 소요되므로 많은 환자들에게 치료의 장벽이 되고 사회적 비용의 막대한 손실을 가져온다는 문제점이 존재한다. 현재까지 개발된 HBV 및 HCV 치료제의 경우에는 바이러스를 궁극적으로 사멸시키는 것이 아닌, 증식을 억제시키는 것에 불과하다는 문제점 역시 존재한다.In the case of chronic HBV infection, treatment is performed by orally administering a nucleoside analog to suppress the proliferation of the virus or by injecting interferon into the infected patient. However, although the nucleic acid derivative has a better therapeutic effect than interferon, it causes HBV resistance when used for a long period of time, and there is a problem that cross-resistance to other drugs may occur. Additionally, in the case of HCV infection, interferon monotherapy was attempted in the 1990s, but the treatment success rate was only 10%. In the 2000s, the treatment success rate improved by about 50% with combination therapy of peginterferon alpha and ribavirin, but the side effects caused by the drugs were severe, making practical treatment difficult. Recently, with the development of DAA (direct antiviral agent), it has been possible to achieve a treatment success rate of about 80 to 90% with almost no side effects when such drugs are administered orally for 3 to 6 months. However, since the DAA drugs are very expensive, there is a problem in that they become a barrier to treatment for many patients and cause enormous loss in social costs. In the case of HBV and HCV treatments developed to date, there is also a problem in that they do not ultimately kill the virus, but only suppress its proliferation.
이와 같이 HBV 및 HCV를 궁극적으로 사멸시킬 수 있는 약물을 개발하지 못하는 이유는 시험관 내 세포 배양 시스템으로 왕성하게 바이러스를 배양하는 방법이 부재하기 때문이다. 또한, 전통적으로 감염실험에 사용될 수 있는 마우스와 같이 작은 몸집을 갖는 소동물을 감염시킴으로써 동물 모델을 제작할 수 있는 방법이 전무한 실정이다.The reason why drugs that can ultimately kill HBV and HCV cannot be developed is because there is no method for actively cultivating the virus using an in vitro cell culture system. In addition, there is no way to create an animal model by infecting small animals such as mice, which can traditionally be used in infection experiments.
이와 같은 실정으로 인하여 바이러스들의 감염 생활사 (life cycle)가 정확히 밝혀지지 못해 HBV의 경우 핵내 바이러스 유전체 복제 틀 (template)인 cccDNA를 파괴시킬 수 있는 메커니즘이 규명되지 못하고, 또한 HCV의 경우 감염 환자에서 유전적 다양성을 나타내는 유사종 (quasispecies)의 메커니즘이 규명되지 못해 완벽하고 이상적인 항바이러스제가 개발되지 못한 실정이다. Due to this situation, the infection life cycle of the viruses has not been accurately identified, so in the case of HBV, the mechanism that can destroy cccDNA, the viral genome replication template in the nucleus, has not been identified, and in the case of HCV, the inheritance of the virus in infected patients has not been identified. A perfect and ideal antiviral agent has not been developed because the mechanism of quasispecies, which exhibits antiviral diversity, has not been identified.
상기 HBV 및 HCV와 같은 지질막이중층의 외피를 포함하는 바이러스는 종 특이성 (species specificity 혹은 narrow host range)과 장기친화성 (organ tropism)을 나타내기 때문에, 이들 바이러스의 시험관 및 소동물 내 감염과 배양이 어려워 지금까지 바이러스의 치료제 개발에는 진전이 없었다. 따라서, HBV와 HCV를 포함하는 외피 있는 바이러스의 시험관내 및 소동물 감염모델은 그들 바이러스의 생활사와 병리 기작 (mechanism of life cycle and pathogenesis)을 밝혀줄 도구로 절실히 요구된다.Because viruses containing a lipid membrane bilayer envelope, such as HBV and HCV, exhibit species specificity or narrow host range and organ tropism, infection and culture of these viruses in vitro and in small animals is possible. It is difficult and so far no progress has been made in developing treatments for the virus. Therefore, in vitro and small animal infection models of enveloped viruses, including HBV and HCV, are urgently needed as tools to reveal the life cycle and pathogenesis of these viruses.
지난 몇 년 동안, HBV 및 HCV에 대한 동물 모델의 발전에서, 상기 바이러스이 감염이 가능한 키메라 동물 모델의 구축 등과 같은 유의한 진전이 있었음에도 불구하고, 동물 모델의 부족은 바이러스성 간염 질환의 적합한 치료제를 개발하는데 임상적으로 적절한 수단이 부재한다는 문제점이 존재한다. 특히, HBV와 HCV는 인간 및 침팬치 만을 숙주로 하기 때문에, 이와 같이 제한된 바이러스의 숙주 범위가 한정적이라는 문제점에 의해 시험관내 (in vitro)뿐만 아니라, 체내 (in vivo) 모델을 제작하는데 특히 어려움이 존재한다.In the past few years, despite significant progress in the development of animal models for HBV and HCV, such as the establishment of chimeric animal models capable of infection by these viruses, the lack of animal models has led to the development of suitable treatments for viral hepatitis diseases. There is a problem in the absence of clinically appropriate means for development. In particular, since HBV and HCV have only humans and chimpanzees as hosts, it is particularly difficult to create models not only in vitro but also in vivo due to the problem of the limited host range of these viruses. do.
본 발명의 일 목적은 바이러스가 감염된 동물 모델의 제조 방법과, 그에 의하여 제조된 동물 모델을 제공하는 것이다.One object of the present invention is to provide a method for producing a virus-infected animal model and an animal model produced thereby.
본 발명의 다른 목적은 바이러스가 감염된 동물 모델을 이용한 바이러스성 질환의 치료 후보물질의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a method for screening candidates for the treatment of viral diseases using a virus-infected animal model.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.However, the technical problem to be achieved by the present invention is not limited to the problems mentioned above, and other problems not mentioned will be clearly understood by those skilled in the art from the description below.
본 발명자들은 우선 세포주의 배양액에 담즙산 또는 담즙산 유도체와 외피 바이러스의 혼합물을 처리하면, 담즙산에 의해 기계적으로 상기 세포주의 지질막 이중층이 확장되고 (expanded) 세포막이 파괴되어 상기 바이러스의 종 특이성 및 조직 특이성과 무관하게 바이러스가 감염되는 사실을 확인하였다. 나아가 바이러스 감염 동물 모델을 만들기 위해, 목적하는 동물 (target animal)에서 유래된 세포주에 위와 같은 방법으로 바이러스를 감염시켜 목적하는 동물 세포주의 지질막 이중층과 동일한 지질막을 갖는 외피 바이러스를 생산한 다음, 이를 목적하는 동물 (target animal)에 주입하는 경우, 임상적으로 매우 유용하게 활용할 수 있는 동물 모델을 제조할 수 있음을 발견하여 본 발명을 완성하게 되었다.The present inventors first treated the culture medium of a cell line with bile acid or a mixture of a bile acid derivative and an enveloped virus, and the lipid membrane bilayer of the cell line was mechanically expanded by the bile acid and the cell membrane was destroyed, thereby improving the species specificity and tissue specificity of the virus. It was confirmed that the virus was infected regardless. Furthermore, in order to create a viral infection animal model, a cell line derived from a target animal is infected with the virus in the same manner as above to produce an enveloped virus with a lipid membrane identical to the lipid membrane bilayer of the target animal cell line. The present invention was completed by discovering that an animal model that can be very useful clinically can be produced when injected into a target animal.
본 발명의 또 다른 구현 예에서는 바이러스가 감염된 동물 모델의 제조 방법을 제공한다.Another embodiment of the present invention provides a method for producing a virus-infected animal model.
본 발명의 상기 제조 방법은 지질막 이중층을 포함하는 외피 바이러스의 지방질 외피를 상기 목적하는 동물로부터 유래된 지방질 외피로 교체하는 단계; 및 상기 지방질 외피가 교체된 바이러스를 상기 목적하는 동물에 주입하는 단계를 포함한다.The production method of the present invention includes the steps of replacing the lipid envelope of an enveloped virus including a lipid membrane bilayer with a lipid envelope derived from the animal of interest; and injecting the virus with the lipid envelope replaced into the target animal.
본 발명의 상기 "지질막 이중층을 포함하는 외피 바이러스"란, DNA 또는 RNA와 같은 유전물질을 포함하는 중심부 유전체 (genome)와, 이와 같은 유전물질을 보호하는 역할을 하는 단백질 껍질인 캡시드 (capsid); 및 지질막 이중층 (lipid bilayer)을 포함하는 외피 (envelope)로 구성된 외피 바이러스를 의미한다.The "enveloped virus containing a lipid membrane bilayer" of the present invention includes a central genome containing genetic material such as DNA or RNA, and a capsid, a protein shell that serves to protect such genetic material; and an envelope containing a lipid bilayer.
본 발명의 상기 외피 바이러스는 바이러스 자체를 구성하는 캡시드 이외에 지질막 이중층을 포함하는 외피를 더 포함하는 바이러스라면 모두 포함될 수 있고, 예를 들면, DNA를 유전물질로 하는 헤파드나바이러스 (hepadnavirus), 폭스바이러스 (Poxvirus), 헤르페스바이러스 (Herpesvirus) 등일 수 있고, 또는 RNA를 유전물질로 하는 코로나바이러스 (Coronavirus), 필로바이러스 (filovirus), 랍도바이러스 (rhabdovirus) 아레나바이러스 (arenavirus), 플라비바이러스 (flavivirus), 그리고 레트로바이러스 (Retrovirus) 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는 간염 바이러스 (Hepatitis virus)일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 HBV (Hepatitis B virus) 또는 HCV (Hepatitis C virus)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.The enveloped virus of the present invention may include any virus that further includes an envelope containing a lipid membrane bilayer in addition to the capsid constituting the virus itself, for example, hepadnavirus and poxvirus with DNA as a genetic material. It may be Poxvirus, Herpesvirus, etc., or coronavirus, filovirus, rhabdovirus, arenavirus, flavivirus with RNA as genetic material. , and retrovirus, etc., but is not limited thereto. Preferably, it may be a hepatitis virus, and more preferably, it may be HBV (Hepatitis B virus) or HCV (Hepatitis C virus), but is not limited thereto.
본 발명의 지질막 이중층을 포함하는 외피 바이러스의 지방질 외피를 상기 목적하는 동물로부터 유래된 지방질 외피로 교체하는 단계는, 지질막 이중층을 포함하는 외피 바이러스와 담즙산 또는 담즙산 유도체를 혼합하는 단계; 및 상기 담즙산 또는 담즙산 유도체와 혼합된 상기 바이러스를 상기 목적하는 동물로부터 유래된 불멸화 세포주의 배양액에 첨가하는 단계를 통해 제조될 수 있다. 바람직하게는, 상기 배양액으로부터 목적하는 동물로부터 유래된 지질막 이중층을 포함하는 외피 바이러스를 분리하는 단계를 더 포함할 수 있다.The step of replacing the lipid envelope of an enveloped virus including a lipid membrane bilayer of the present invention with a lipid envelope derived from the desired animal includes mixing the enveloped virus including a lipid membrane bilayer with a bile acid or bile acid derivative; and adding the virus mixed with the bile acid or bile acid derivative to the culture medium of an immortalized cell line derived from the animal of interest. Preferably, the step of isolating the enveloped virus containing a lipid membrane bilayer derived from the animal of interest from the culture medium may be further included.
본 발명의 상기 제조 방법에 따르면, 인간으로부터 유래된 바이러스의 외피를 목적하는 동물로부터 유래된 지질막 이중층으로 지방질의 외피를 교체함으로써 막 융합(membrane fusion)이 원활하게 하여 이종 간의 감염을 유도할 수 있다.According to the production method of the present invention, by replacing the outer envelope of the human-derived virus with a lipid membrane bilayer derived from the target animal, membrane fusion can be facilitated and infection between different species can be induced. .
본 발명의 상기 바이러스를 분리하는 단계는 예를 들면, 원심 분리, 크로마토 그래피 등과 같은 통상의 방법으로 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.The step of isolating the virus of the present invention may be performed by conventional methods such as centrifugation, chromatography, etc., but is not limited thereto.
본 발명의 상기 목적하는 동물은 인간을 제외한 척추 동물일 수 있고, 바람직하게는 생쥐, 쥐, 토끼, 새, 고양이, 개, 돼지, 양, 염소, 사슴, 말, 및 소로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있고, 더욱 바람직하게는 생쥐 또는 쥐일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.The animal of interest of the present invention may be any vertebrate animal other than humans, and is preferably any animal selected from the group consisting of mice, rats, rabbits, birds, cats, dogs, pigs, sheep, goats, deer, horses, and cows. There may be more than one, more preferably a mouse or rat, but it is not limited thereto.
본 발명의 상기 인간을 제외한 척추 동물을 이용하여 바이러스 감염 동물 모델을 제조하는 경우, 상기 동물 모델은 인간과 면역 체계 등이 유사하기 때문에, 바이러스의 감염 경로, 바이러스에 의한 질환의 발생 등과 같은 다양한 현상을 이해하여 임상적으로 유의미한 결과를 도출해낼 수 있다.When producing an animal model of viral infection using vertebrates other than humans of the present invention, the animal model has an immune system similar to that of humans, and therefore various phenomena such as the route of viral infection and the occurrence of diseases caused by viruses, etc. By understanding, clinically meaningful results can be derived.
본 발명의 상기 세포주는 상기 동물의 정상 또는 암 조직으로부터 유래되어 시험관 내에서 계대배양될 수 있는 것으로서, 통상의 방법에 따라 불멸화된 것일 수 있다. 상기 세포주는 예를들면, 간 세포주, 폐 세포주, 신장 세포주, 근육 세포주, 유방 세포주, 면역 T 세포주 및 생식기 세포주로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있고, 바람직하게는 생쥐의 간암 세포주인 Hepa1c1c7 세포주 또는 쥐의 간암 세포주인 H4-Ⅱ-E 세포주, 생쥐 폐암 세포주인 LA-4 세포주, 생쥐 신장암 세포주인 RAG 세포주, 생쥐 유방암 세포주인 MTV/TM-011 세포주, 생쥐 면역 T 세포주인 EL4 세포주, 생쥐 고환암 세포주인 LC54 세포주 등일 수 있다.The cell line of the present invention is derived from normal or cancerous tissue of the animal, can be subcultured in vitro, and can be immortalized according to a conventional method. The cell line may be, for example, one or more selected from the group consisting of liver cell lines, lung cell lines, kidney cell lines, muscle cell lines, breast cell lines, immune T cell lines, and genital cell lines, and is preferably Hepa1c1c7, a mouse liver cancer cell line. Cell lines or H4-Ⅱ-E cell line, a mouse liver cancer cell line, LA-4 cell line, a mouse lung cancer cell line, RAG cell line, a mouse kidney cancer cell line, MTV/TM-011 cell line, a mouse breast cancer cell line, EL4 cell line, a mouse immune T cell line, It may be the LC54 cell line, which is a mouse testicular cancer cell line.
본 발명의 상기 담즙산은 인간의 경우, 상기 담즙산은 간에서 콜레스테롤로부터 합성되는 1차 담즙산으로 콜린산 (choilic aicd)과 케노데옥시콜산 (chenodeoxycholic acid)으로 나누어지며, 2차 담즙산은 대장에서 장내 세균에 의해 대사되는데되어, 콜산이 디옥시콜린산 (deoxycholic acid)으로, 또는 케노데옥시콜산이 리토콜린산 (lithocholic acid)으로 변한대사된다. 또한, 상기 이들 담즙산은 간에서 글리신 (glycine)이나 타우린 (taurine)으로과 접합 (conjugation) 되어 타우로콜린산 (taurocholic acid)과 글라이코콜린산 (glycocholic acid) (이상 콜산 유도체, derivatives of cholic acid), 타우로케노데옥시콜린산 (taurochenodeoxycholic acid)과 글라이코케노데옥시콜린산 (glycochenodeoxycholic acid) (이상 케노데옥시콜산 유도체, derivatives of chenodeoxycholic acid), 글라이코데옥시콜린산 (glycodeoxycholic acid)과 타우로데옥시콜린산 (taurodeoxycholic acid) (이상 데옥시콜산 유도체, derivatives of deoxycholic acid), 글라이코리토콜린산 (glycolithocholic acid)과 타우로리토콜린산 (taurolithocholic acid) (이상 리토콜산 유도체, derivatives of lithocholic acid)으로 변환될 수 있다. 한편, 또한 설치류의 2차 담즙산인은 뮤리콜린산 (muricholic acid)이 존재한다.In the case of humans, the bile acid of the present invention is a primary bile acid synthesized from cholesterol in the liver and is divided into choilic acid and chenodeoxycholic acid, and the secondary bile acid is produced by intestinal bacteria in the large intestine. It is metabolized by changing cholic acid to deoxycholic acid, or chenodeoxycholic acid to lithocholic acid. Additionally, these bile acids are overconjugated with glycine or taurine in the liver to produce taurocholic acid and glycocholic acid (or derivatives of cholic acid). , taurochenodeoxycholic acid and glycochenodeoxycholic acid (derivatives of chenodeoxycholic acid), glycodeoxycholic acid and tauro Deoxycholic acid (derivatives of deoxycholic acid), glycolithocholic acid and taurolithocholic acid (derivatives of lithocholic acid) acid). Meanwhile, muricholic acid also exists as a secondary bile acid in rodents.
본 발명의 상기 담즙산 또는 담즙산 유도체는 콜린산, 케노데옥시콜산, 디옥시콜린산, 리토콜린산, 타우로콜린산, 글라이코콜린산, 타우로케노데옥시콜린산, 글라이코케노데옥시콜린산, 글라이코데옥시콜린산, 타우로데옥시콜린산, 글라이코리토콜린산, 타우로리토콜린산 및 뮤리콜린산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있고, 바람직하게는 타우로케노디옥시콜린산 또는 타우로콜린산일 수 있고, 더욱 바람직하게는 HBV의 경우 타우로케노디옥시콜린산을 사용할 수 있고, HCV의 경우 타우로콜린산 또는 타우로케노디옥시콜린산을 이용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.The bile acid or bile acid derivative of the present invention includes cholic acid, chenodeoxycholic acid, deoxycholic acid, lithocholic acid, taurocholic acid, glycocholic acid, taurochenodeoxycholic acid, and glycochenodeoxycholic acid. , it may be any one or more selected from the group consisting of glycodeoxycholic acid, taurodeoxycholic acid, glycolithocholic acid, taurolithocholic acid, and muricholic acid, preferably taurochenodeoxycholic acid. It may be acid or taurocholic acid, and more preferably, in the case of HBV, taurochenodeoxycholic acid can be used, and in the case of HCV, taurocholic acid or taurochenodeoxycholic acid can be used, but is limited thereto. no.
본 발명의 상기 담즙산 또는 담즙산 유도체는 10 내지 100 μmol/L의 농도로 혼합될 수 있고, 바람직하게는 50 내지 100 μmol/L 더욱 바람직하게는 80 내지 100 μmol/L의 농도로 혼합될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 담즙산의 농도가 10 μmol/L 미만인 경우에는 상기 바이러스의 외피를 충분히 제거할 수 없고, 100 μmol/L 초과인 경우에는 상기 바이러스의 유전체 안정성 등이 저해될 수 있다.The bile acid or bile acid derivative of the present invention can be mixed at a concentration of 10 to 100 μmol/L, preferably 50 to 100 μmol/L, and more preferably 80 to 100 μmol/L. It is not limited to this. If the bile acid concentration is less than 10 μmol/L, the outer shell of the virus cannot be sufficiently removed, and if it is more than 100 μmol/L, the genomic stability of the virus may be impaired.
본 발명의 상기 담즙산 또는 담즙산 유도체와 지질막 이중층을 포함하는 외피 바이러스를 혼합하고, 이를 목적하는 동물 모델로부터 유래된 세포주의 배양액에 첨가하는 경우, 상기 바이러스의 지질막 이중층의 외피는 목적하는 동물 모델로부터 유래된 지방질 외피로 교체되기 되기 때문에, 인간이 아닌 다른 동물에서 종의 특이성 없이 바이러스가 감염될 수 있다.When the bile acid or bile acid derivative of the present invention and an enveloped virus containing a lipid membrane bilayer are mixed and added to the culture medium of a cell line derived from the desired animal model, the envelope of the lipid membrane bilayer of the virus is derived from the desired animal model. Because it is replaced by a fatty envelope, the virus can infect animals other than humans without species specificity.
본 발명의 다른 구현 예는 바이러스가 감염된 동물 모델을 제공한다.Another embodiment of the present invention provides an animal model infected with a virus.
본 발명의 상기 동물 모델은 인간을 제외한 목적하는 동물을 준비하고, 지질막 이중층을 포함하는 외피 바이러스의 지질막 이중층의 외피를 목적하는 동물로부터 유래된 지질막 이중층의 외피로 교체한 뒤, 상기 지질막 이중층의 외피가 교체된 바이러스를 목적하는 동물에 주입하여 제조될 수 있다.The animal model of the present invention prepares a target animal other than a human, replaces the envelope of the lipid membrane bilayer of an enveloped virus containing a lipid membrane bilayer with the envelope of a lipid membrane bilayer derived from the target animal, and then replaces the envelope of the lipid membrane bilayer with the envelope of the lipid membrane bilayer. It can be manufactured by injecting the replaced virus into the target animal.
본 발명의 상기 바이러스는 목적하는 동물의 꼬리 정맥과 같은 정맥에 주입될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.The virus of the present invention can be injected into a vein such as the tail vein of the animal of interest, but is not limited thereto.
본 발명의 상기 동물 모델은 앞서 언급한 제조 방법에 의해 제조될 수 있기 때문에, 지질막 이중층의 외피를 포함하는 외피 바이러스, 담즙산, 담즙산 유도체, 세포주, 목적하는 동물, 제조 방법 등과 관련된 내용은 반복 기재에 따른 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.Since the animal model of the present invention can be produced by the above-mentioned production method, details related to enveloped viruses containing a lipid membrane bilayer envelope, bile acids, bile acid derivatives, cell lines, animals of interest, production methods, etc. are repeated in the description. To avoid excessive complexity of the following specification, its description is omitted.
본 발명의 또 다른 구현 예에서는 바이러스성 질환의 치료를 위한 치료 후보물질의 스크리닝 방법을 제공한다.Another embodiment of the present invention provides a method for screening therapeutic candidates for the treatment of viral diseases.
본 발명의 상기 바이러스성 질환의 치료 후보물질의 스크리닝 방법은 본 발명에 따른 바이러스 감염 동물 모델을 사육하는 단계; 및 상기 동물 모델에 바이러스성 질환의 치료 후보 물질을 첨가하는 단계를 포함한다.The screening method for a treatment candidate for the viral disease of the present invention includes the steps of breeding a viral infection animal model according to the present invention; and adding a candidate substance for treating viral diseases to the animal model.
본 발명의 상기 스크리닝 방법에서 사용되는 바이러스 감염 동물 모델은 앞서 언급한 제조 방법에 의해 제조될 수 있기 때문에, 지질막 이중층의 외피를 포함하는 외피 바이러스, 담즙산 유도체, 불멸화 세포주, 목적하는 동물, 제조 방법 등과 관련된 내용은 반복 기재에 따른 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.Since the viral infection animal model used in the screening method of the present invention can be prepared by the above-mentioned manufacturing method, an enveloped virus containing an envelope of a lipid membrane bilayer, a bile acid derivative, an immortalized cell line, an animal of interest, a manufacturing method, etc. Related content is omitted to avoid excessive complexity of the specification due to repetitive description.
본 발명의 상기 바이러스성 질환이란, 바이러스의 감염에 의한 감염증으로서, 상기 바이러스에 친화성을 갖는 조직이 감염에 의하여 병적인 변화가 유도되는 것을 의미한다. 상기 바이러스성 질환은 이와 같이, 조직의 병적인 변화를 일으키는 것이라면 모두 포함될 수 있고, 바람직하게는 바이러스성 감염일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.The viral disease of the present invention refers to an infectious disease caused by viral infection, in which pathological changes are induced in tissues with affinity for the virus due to infection. The viral disease may include any disease that causes pathological changes in tissues, and is preferably a viral infection, but is not limited thereto.
본 발명의 상기 바이러스성 간염은 바이러스 감염이 원인인 감염으로, 간염 환자의 86 %를 차지하는 B형 간염과 12%를 차지하는 C형 간염이 존재한다. 상기 B형 간염은 출생 시, 어머니에 의해 감염된 수직 감염과 출생 이후 감염되는 후천적 감염으로 나뉜다. 후천적 감염의 경우 95%가 감기와 비슷한 증상을 보이며 자연스럽게 완치되는 반면, 5 내지 10%의 감염자의 경우 완치되지 못하고 만성 감염으로 발전될 수 있다. 이와는 반대로 수직 감염의 경우에는 대부분 만성 감염으로 발전된다. 한편, C형 간염은 B형 간염에 비하여 비교적 적은 10 내지 15% 정도의 환자만이 병균을 스스로 개선시키며, 85 내지 90% 이상의 경우 만성 감염으로 발전하고, 이와 같은 만성 감염 환자 중 10 내지 20%는 20년 내지 30년 이내에 간경변이나 간암 등의 질병이 발병하게 된다.The viral hepatitis of the present invention is an infection caused by a viral infection, and includes hepatitis B, which accounts for 86% of hepatitis patients, and hepatitis C, which accounts for 12%. Hepatitis B is divided into vertical infection transmitted by the mother at birth and acquired infection transmitted after birth. In the case of acquired infection, 95% show symptoms similar to a cold and are naturally cured, while 5 to 10% of infected people are not completely cured and may develop into a chronic infection. On the other hand, in most cases of vertical infection, it develops into chronic infection. On the other hand, compared to hepatitis B, only about 10 to 15% of patients with hepatitis C improve the disease on their own, and in more than 85 to 90% of cases, chronic infection develops, and 10 to 20% of patients with such chronic infection Within 20 to 30 years, diseases such as cirrhosis or liver cancer will develop.
본 발명의 상기 바이러스성 질환은 혈청학 검사를 통해 관련 항원과 항체를 확인하여 감염의 여부를 확인한다. 따라서, 본 발명의 상기 스크리닝 방법은 상기 사육된 바이러스가 감염된 동물 모델과, 바이러스성 질환의 치료 후보물질이 첨가된 바이러스 감염 동물 모델에서 바이러스의 게놈 또는 표면 항원의 존재 여부를 확인하는 단계를 더 포함하여, 바이러스성 질환의 치료 후보물질의 치료 효과 여부를 확인할 수 있다. In the case of the viral disease of the present invention, infection is confirmed by checking related antigens and antibodies through serological tests. Therefore, the screening method of the present invention further includes the step of confirming the presence of the genome or surface antigen of the virus in the animal model infected with the reared virus and the virus-infected animal model to which a candidate for treatment of viral disease is added. Thus, it is possible to confirm the therapeutic effect of the candidate substance for treating viral diseases.
본 발명의 상기 사육된 바이러스가 감염된 동물 모델에 비하여, 상기 치료 후보물질이 첨가된 바이러스가 감염된 동물 모델의 바이러스 게놈 또는 표면 항원의 존재 수준이 감소된 경우, 바이러스성 질환의 치료 물질로 선별할 수 있다.When the presence level of the viral genome or surface antigen in the animal model infected with the virus to which the treatment candidate is added is reduced compared to the animal model infected with the bred virus of the present invention, it can be selected as a treatment material for viral diseases. there is.
본 발명의 상기 바이러스 게놈 또는 항원의 존재 여부를 확인하는 단계는 단백질 또는 핵산 수준에서 확인될 수 있다.The step of confirming the presence of the viral genome or antigen of the present invention can be confirmed at the protein or nucleic acid level.
본 발명의 상기 단백질 또는 핵산 수준의 검출 방법은 공지된 것으로서, 예를 들면 항원-항체 반응, 표면 항원에 특이적으로 결합하는 기질, 핵산 또는 펩타이드 앱타머 등과의 반응을 통해 검출될 수 있다.The method for detecting the protein or nucleic acid level of the present invention is known and can be detected through, for example, an antigen-antibody reaction, a reaction with a substrate that specifically binds to a surface antigen, a nucleic acid or a peptide aptamer, etc.
본 발명의 상기 바이러스성 질환 중, 상기 B형 간염의 경우, 항원으로 표면 항원인 HBsAg 항원, 분비형 항원인 HBeAg 항원, 핵심 항원인 HBcAg 항원 등의 존재 여부를 공지된 검출 방법, 예를 들면 유세포분석법 (Fluorescence-activated cell sorting), ELISA, 웨스턴 블롯, TRFIA (Time-resolved fluorescence immunoassay), 면역조직화학 등의 방법에 의해 확인할 수 있고, 상기 HBV의 DNA의 존재 여부를 중합효소연쇄반응법, 실시간 중합효소연쇄반응법 등의 유전자 증폭 실험을 통해 검사할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.Among the viral diseases of the present invention, in the case of hepatitis B, the presence of HBsAg antigen, a surface antigen, HBeAg antigen, a secreted antigen, and HBcAg antigen, a core antigen, can be determined using a known detection method, for example, flow cytometry. It can be confirmed by methods such as fluorescence-activated cell sorting, ELISA, Western blot, TRFIA (Time-resolved fluorescence immunoassay), and immunohistochemistry. The presence of the HBV DNA can be confirmed by polymerase chain reaction, real-time analysis. It can be tested through gene amplification experiments such as polymerase chain reaction, but is not limited to this.
본 발명의 상기 C형 간염의 경우 HCV 중심부 단백질의 검출, HCV에 특이적인 항체의 존재 여부를 공지된 검출 방법을 통해 확인할 수 있고, HCV의 RNA 존재 여부를 중합효소연쇄반응법, 실시간 중합효소연쇄반응법 등의 유전자 증폭 실험을 통해 검사할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In the case of hepatitis C of the present invention, the detection of HCV core protein and the presence of antibodies specific to HCV can be confirmed through known detection methods, and the presence of HCV RNA can be confirmed by polymerase chain reaction method or real-time polymerase chain reaction. It can be tested through gene amplification experiments such as reaction methods, but is not limited to this.
본 발명의 바이러스가 감염된 동물 모델의 제조 방법을 이용하는 경우, 담즙산 또는 담즙산 유도체에 의해 바이러스의 지질막 이중층의 외피가, 인간으로부터 유래된 지질막 이중층의 외피가 목적하는 동물 모델로부터 유래된 지질막 이중층의 외피로 교체되기 때문에, 종 특이성에 의한 제한 없이 임상적으로 유용하게 활용할 수 있는 동물을 매우 효과적으로 제조할 수 있다.When using the method for producing an animal model infected with the virus of the present invention, the outer shell of the lipid membrane bilayer of the virus is changed by bile acid or a bile acid derivative, and the outer shell of the lipid membrane bilayer derived from a human is changed to the outer shell of the lipid membrane bilayer derived from the desired animal model. Because they are replaced, it is possible to very effectively produce clinically useful animals without limitations due to species specificity.
도 1 내지 도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 면역염색결과를 나타낸 것이다.
도 9 내지 도 14는 본 발명의 일 실시예에 따른 바이러스가 감염된 동물 모델의 장기의 H&E 염색 결과를 나타낸 것이다.Figures 1 to 8 show immunostaining results according to an embodiment of the present invention.
Figures 9 to 14 show the results of H&E staining of organs of a virus-infected animal model according to an embodiment of the present invention.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. These examples are only for illustrating the present invention in more detail, and it will be apparent to those skilled in the art that the scope of the present invention is not limited by these examples according to the gist of the present invention. .
실시예Example
[준비예 1] [Preparation example 1] 간염 바이러스 분리Hepatitis virus isolation
원주 세브란스 병원 (윤리위원회 승인 번호 CR316312)으로부터 정상 혈청 (HBV (Hepatitis B virus) 및 HCV (Hepatitis C virus) 음성)과 간염 바이러스가 감염된 혈청 (HBV 또는 HCV 양성)을 분양 받았다.Normal serum (negative for Hepatitis B virus (HBV) and Hepatitis C virus (HCV)) and serum infected with hepatitis virus (positive for HBV or HCV) were received from Wonju Severance Hospital (Ethics Committee approval number CR316312).
20 g/L의 수크로즈, 50 mmol/L의 Tris-HCl (pH 7.5) 및 30 mmol/L의 NaCl이 포함된 완충 버퍼 (cushion buffer)가 3 ml 들어 있는 튜브에 상기 혈청 각각을 넣고, 이 혼합물을 220,000 g의 세기로 1시간 동안 원심분리하였다. 이후, 상기 튜브에서 상등액을 제거하고, HBV 또는 HCV를 희석하기 위해, 상기 튜브에 5 ml의 PBS (Phosphate-buffered saline) 용액을 넣었다. 그런 다음, 상기 희석액에 포함되어 있는 HCV의 RNA 및 HBV의 DNA를 로슈사 (Roche)의 COBAS TaqMan system을 이용한 Real-time PCR을 통해 측정하여 분리된 바이러스의 농도를 측정하였다.Each of the above sera was placed in a tube containing 3 ml of cushion buffer containing 20 g/L sucrose, 50 mmol/L Tris-HCl (pH 7.5), and 30 mmol/L NaCl. The mixture was centrifuged at 220,000 g for 1 hour. Afterwards, the supernatant was removed from the tube, and 5 ml of PBS (Phosphate-buffered saline) solution was added to the tube to dilute HBV or HCV. Then, HCV RNA and HBV DNA contained in the dilution were measured through real-time PCR using Roche's COBAS TaqMan system to determine the concentration of the isolated virus.
[준비예 2] [Preparation example 2] 세포주 배양Cell line culture
실시예에서 사용된 세포주는 한국세포주은행에서 구입하였으며, 한국세포주은행에서 지정된 배양액과 배양 방법을 사용하여 세포 배양을 수행하였다.The cell lines used in the examples were purchased from the Korea Cell Line Bank, and cell culture was performed using the culture medium and culture method specified by the Korea Cell Line Bank.
설치류 세포주는 생쥐 C57L(The Jackson Laboratory, 미국)로부터 유래된 간암 세포주인 Hepa1c1c7 세포주 또는 H4-Ⅱ-E 세포주, 신장암 세포주(RAG), 면역 T 세포주 (EL4), 고환암 세포주 (LC540) 및 폐 세포주(LA-4)를 사용하였다.Rodent cell lines include the liver cancer cell line Hepa1c1c7 cell line or H4-II-E cell line, renal cancer cell line (RAG), immune T cell line (EL4), testicular cancer cell line (LC540) and lung cell line derived from mouse C57L (The Jackson Laboratory, USA). (LA-4) was used.
인간 세포주는 간암 세포주 (HepG2, Huh-7), 신장암 세포주 (A-498), 유방암 세포주 (MDA-MB-231), 폐암 세포주 (A549), 면역 T 세포주 (Jurcat) 및 자궁암 세포주 (HeLa)를 사용하였으며, 대조군으로 간 세포주인 PLC/PRF5 세포주를 사용하였다.Human cell lines include liver cancer cell line (HepG2, Huh-7), kidney cancer cell line (A-498), breast cancer cell line (MDA-MB-231), lung cancer cell line (A549), immune T cell line (Jurcat), and uterine cancer cell line (HeLa). was used, and the PLC/PRF5 cell line, a liver cell line, was used as a control.
이때, 세포의 안정화를 위하여 해동 후 3차례 계대 배양 후 상기 세포들을 24시간 동안 배양한 뒤 간염 바이러스 감염을 수행하였다. At this time, in order to stabilize the cells, after thawing and subculturing three times, the cells were cultured for 24 hours and then infected with hepatitis virus.
[실시예 1] [Example 1] 바이러스 감염 세포주 모델의 제조Preparation of viral infection cell line models
외피 바이러스 감염 세포주 모델의 제조를 위하여, 100 μmol/L의 타우로케노디옥시콜린산 (taurochenodeoxycholic acid; 이하, 'tCDCA'라고 함)에, 상기 준비예 1에서 분리된 HBV (1 × 106 copies/ml/well of HBV)를 혼합하고, tCDCA 또는 타우로콜린산 (taurocholic acid; 이하, 'tCA'라고 함)에 상기 준비예 1에서 분리된 HCV(1 × 106 IU/ml/well of HCV)를 혼합하였다. 여기서, tCA와 혼합된 HCV는 쥐의 간세포를 감염시키는데 사용하였으며, 그 외에는 모두 tCDCA를 사용하였다.For the preparation of an enveloped virus infection cell line model, HBV isolated in Preparation Example 1 (1 × 10 6 copies/ ml/well of HBV) was mixed with tCDCA or taurocholic acid (hereinafter referred to as 'tCA') and HCV (1 × 10 6 IU/ml/well of HCV) isolated in Preparation Example 1 above. was mixed. Here, HCV mixed with tCA was used to infect rat hepatocytes, and tCDCA was used in all other cases.
6웰 플레이트의 각각의 웰에 5 × 106 세포수/ml의 세포주 (HepG2, Huh-7, A549, A-498, MDA-MB-231, Jurcat, HeLa, Hepa1c1c7, EL4, H4-Ⅱ-E, LA-4, LC540 또는 RAG 세포주)를 분주하고 24시간 동안 배양한 뒤에, 상기 HBV 또는 HCV가 혼합된 tCDCA 또는 tCA 용액을 첨가하고 24시간 동안 추가로 배양하였다. 여기서, 대조군으로는 tCDCA 또는 tCA 용액 없이 HBV 또는 HCV만을 첨가하였다. 이후, PBS (phosphate buffered saline) 용액으로 3회 세척하고, 상기 바이러스가 포함되지 않은 세포 배양액(DMEM)으로 교체하였다. 마지막으로 상기 세포 배양액에 100 μmol/L의 tCDCA 또는 tCA를 처리하고 3일 동안 추가로 배양하는 과정을 통해 바이러스 감염 세포주 모델(이하, '감염 세포주'라고 함)를 제조하였다. Cell lines (HepG2, Huh-7, A549, A-498, MDA-MB-231, Jurcat, HeLa, Hepa1c1c7, EL4, H4-Ⅱ-E) at 5 , LA-4, LC540 or RAG cell lines) were dispensed and cultured for 24 hours, then tCDCA or tCA solution mixed with the HBV or HCV was added and cultured for an additional 24 hours. Here, as a control group, only HBV or HCV was added without tCDCA or tCA solution. Afterwards, it was washed three times with PBS (phosphate buffered saline) solution and replaced with cell culture medium (DMEM) that does not contain the virus. Finally, a virus-infected cell line model (hereinafter referred to as 'infected cell line') was prepared by treating the cell culture with 100 μmol/L of tCDCA or tCA and culturing for an additional 3 days.
[실시예 2] [Example 2] HBV에 의한 감염 세포주 검증Validation of cell lines infected by HBV
상기 실시예 1에서 HBV가 감염된 감염 세포주와, 그부터 수집된 배양액에서 HBsAg 및 HBV의 DNA가 존재하는 수준을 측정하였다. 여기서, HBsAg의 측정은 Elecsys HBsAg ECLIA 키트 (REF: 07251076119, 로슈, 스위스)를 이용하여, 제조사에서 제공한 실험 방법에 의하여 측정하였으며, 로슈의 COBAS TaqMan 시스템을 이용하는 전문 검사기관 (바이오지노코리아, 한국)에 의뢰하여 HBV의 DNA를 측정하였다.The levels of HBsAg and HBV DNA present were measured in the HBV-infected cell line in Example 1 and the culture fluid collected therefrom. Here, HBsAg was measured using the Elecsys HBsAg ECLIA kit (REF: 07251076119, Roche, Switzerland) according to the experimental method provided by the manufacturer, and was performed by a professional testing agency (BioGino Korea, Korea) using Roche's COBAS TaqMan system. ) was requested to measure HBV DNA.
또한, HBcAg이 존재하는 수준을 측정하기 위하여 anti-HBcAg 항체를 이용한 FACS 분석을 수행하였다. 구체적으로, 100 ㎕/well의 anti-HBcAg 항체 (10E11) (cat no. MA1-7608; Thermo Fisher, 미국)를 마이크로 ELISA 플레이트에 넣고, 4 ℃에서 밤새도록 반응시킨 뒤에, 200 ㎕/웰의 1X ELISA/ELISPOT Diluent (Invitrogen, 미국)를 추가로 넣고 1시간 동안 반응시켰다. 반응이 완료된 각각의 웰에, 상기 실시예 1에서 HBV가 감염된 감염 세포주들을 넣은 뒤 2시간 동안 반응시켰다. 그런 다음, 100 ㎕의 1X ELISA/ELISPOT Diluent에 1: 30의 비율로 희석된 anti-HBcAg 항체 (10E11)를 상기 플레이트에 넣고, 1시간 동안 반응시킨 뒤, 100 ㎕의 HRP가 결합된 anti-rabbit IgG와 함께 30분간 추가로 반응시켰다. HBcAg의 검출을 위해 FACSCalibur를 사용하여 그 결과를 하기 표 1 및 2에 나타내었다. 여기서, 양성 대조군으로 PLC/PRF5 세포주(HBV 표면 항원을 방출하는 인간 간 유래 세포주)에서 HBsAg 및 HBcAg가 존재하는 수준을 측정하였다.In addition, FACS analysis using anti-HBcAg antibody was performed to measure the level of HBcAg. Specifically, 100 ㎕/well of anti-HBcAg antibody (10E11) (cat no. MA1-7608; Thermo Fisher, USA) was added to a micro ELISA plate, reacted at 4°C overnight, and then 200 ㎕/well of 1X ELISA/ELISPOT Diluent (Invitrogen, USA) was additionally added and reacted for 1 hour. Into each well where the reaction was completed, the HBV-infected cell lines from Example 1 were added and reacted for 2 hours. Then, anti-HBcAg antibody (10E11) diluted at a ratio of 1:30 in 100 ㎕ of 1X ELISA/ELISPOT Diluent was added to the plate, reacted for 1 hour, and then 100 ㎕ of HRP-conjugated anti-rabbit It was further reacted with IgG for 30 minutes. FACSCalibur was used to detect HBcAg, and the results are shown in Tables 1 and 2 below. Here, as a positive control, the levels of HBsAg and HBcAg were measured in the PLC/PRF5 cell line (a human liver-derived cell line that releases HBV surface antigen).
(Index)HBcAg
(Index)
± 1.5371.49
±1.53
± 176.30474.70
±176.30
±5.9726.02
±5.97
±0.195.12
±0.19
±3291081
±329
(copies/ml)HBV DNA
(copies/ml)
±1,010,0003,590,000
±1,010,000
±1,83689,000
±1,836
±23,29273,500
±23,292
±88,963868,000
±88,963
** 양성 대조군: 바이러스 및 tCDCA가 처리되지 않은 군* Negative control group: HepG2 cell line treated with HBV virus only
** Positive control: group not treated with virus or tCDCA
(Index)HBcAg
(Index)
±107.6508.26
±107.6
±4.3922.73
±4.39
±30.60192.7
±30.60
±0.443.06
±0.44
(copies/ml)HBV DNA
(copies/ml)
(622, 000)11,700
(622,000)
±60,053673,000
±60,053
±29,866149,000
±29,866
상기 표 1 및 표 2에서 보는 바와 같이, 인간의 간암 세포주인 HepG2 및 쥐의 간암 세포주인 Hepa1c1c7의 배양액에서 HBsAg 및 HBcAg가 검출되었으며, HBV의 DNA가 적어도 100 카피 수 이상이 존재하는 것을 확인하였다. 이와 마찬가지로, HBV의 HBcAg를 FACS를 통해 확인한 결과, 게놈 수준과 마찬가지로 tCDCA가 처리된 HBV가 상기 세포주들에 감염되어 있는 것을 확인하였다. As shown in Tables 1 and 2, HBsAg and HBcAg were detected in the culture medium of the human liver cancer cell line HepG2 and the rat liver cancer cell line Hepa1c1c7, and it was confirmed that at least 100 copies of HBV DNA were present. Similarly, as a result of confirming HBV's HBcAg through FACS, it was confirmed that tCDCA-treated HBV was infected in the above cell lines, as was the case at the genome level.
뿐만 아니라, 인간 및 쥐의 간 이외의 다른 다양한 장기로부터 유래된 세포주(A498, MDM-MB-231, Jurkat, HeLa, H4-Ⅱ-E, RAG, EL4 및 LC540)의 배양액에서도 HBsAg 및 HBcAg가 검출되었고, HBV의 DNA가 존재하는 것을 확인하였다.In addition, HBsAg and HBcAg were detected in the cultures of cell lines (A498, MDM-MB-231, Jurkat, HeLa, H4-Ⅱ-E, RAG, EL4, and LC540) derived from various organs other than human and mouse liver. and the presence of HBV DNA was confirmed.
상기 결과를 통해, 담즙산 또는 담즙산 유도체와 HBV를 함께 세포 배양액에 처리하는 경우, 인간 및 쥐의 간암 세포주에 HBV가 감염되도록 유도할 수 있고, HBV가 갖는 종 특이성 (혹은 좁은 숙주 범위)과 장기 친화성을 제거하여 다양한 종과 간 이외의 다른 조직으로부터 유래된 세포주들의 감염을 유도할 수 있음을 알 수 있다.Based on the above results, when bile acids or bile acid derivatives and HBV are treated together in cell culture, HBV can be induced to infect human and mouse liver cancer cell lines, and HBV has species specificity (or narrow host range) and long-term affinity. It can be seen that removal of the tumor can lead to infection of cell lines derived from various species and tissues other than the liver.
[실시예 3] [Example 3] HCV에 의한 감염 세포주 검증Validation of cell lines infected by HCV
상기 실시예 1에서 HCV가 감염된 감염 세포주와, 그로부터 수집된 배양액에서 HCV 코어 및 HCV의 RNA의 존재 수준을 측정하였다. 구체적으로, 로슈의 COBAS TaqMan 시스템을 이용하는 전문 검사기관(바이오지노코리아)에 의뢰하여 HCV의 RNA를 측정하고, 그 결과를 하기 표 3 및 4에 나타내었다. 여기서, 대조군으로는 담즙산 유도체 없이 HCV만을 처리하였다.The presence levels of HCV core and HCV RNA were measured in the HCV-infected cell line in Example 1 and the culture fluid collected therefrom. Specifically, a professional testing agency (BioGino Korea) using Roche's COBAS TaqMan system was requested to measure HCV RNA, and the results are shown in Tables 3 and 4 below. Here, as a control group, only HCV was treated without bile acid derivatives.
(IU/ml)HCV RNA
(IU/ml)
(IU/ml)HCV RNA
(IU/ml)
상기 표 3 및 표 4에서 보는 바와 같이, 인간의 간암 세포주인 HepG2 세포주 및 쥐의 간암 세포주인 Hepa1c1c7 세포주의 배양액에서 HCV의 RNA가 적어도 1000 IU/ml 이상이 존재하는 것을 확인하였다. 뿐만 아니라, 간 이외의 다른 기관으로부터 유래된 인간 및 쥐에서 유래된 세포주에서도 HCV의 RNA가 검출되는 것을 확인하였다.As shown in Tables 3 and 4, it was confirmed that at least 1000 IU/ml of HCV RNA was present in the culture medium of the HepG2 cell line, a human liver cancer cell line, and the Hepa1c1c7 cell line, a rat liver cancer cell line. In addition, it was confirmed that HCV RNA was detected in cell lines derived from humans and mice derived from organs other than the liver.
상기 결과를 통해 상기 결과를 통해, HBV의 결과와 마찬가지로, 담즙산 또는 담즙산 유도체와 HCV를 함께 세포 배양액에 처리하는 경우, 인간 및 쥐의 간암 세포주에 HCV가 감염되도록 유도할 수 있음을 알 수 있다. 나아가, HCV가 갖는 종 특이성 또는 좁은 숙주 범위와 장기 친화성을 제거하여 다양한 종과 조직으로부터 유래된 세포주들의 감염을 유도할 수 있음을 알 수 있다.The above results show that, similar to the results of HBV, when bile acids or bile acid derivatives and HCV are treated together in cell culture, HCV can be induced to infect human and mouse liver cancer cell lines. Furthermore, it can be seen that by eliminating the species specificity or narrow host range and organ tropism of HCV, it can induce infection of cell lines derived from various species and tissues.
상기 실시예 2 및 3에 기재된 결과들로부터 담즙산 또는 담즙산 유도체와 HBV 또는 HCV를 함께 처리하는 경우, 상기 담즙산 또는 담즙산 유도체에 의해 세포주의 지질 이중충이 확장되고, 세포막을 기계적으로 파괴함으로써 매우 효과적으로 간염 바이러스의 감염이 유도될 수 있음을 알 수 있다.From the results described in Examples 2 and 3, when HBV or HCV is treated with a bile acid or bile acid derivative, the lipid diploid of the cell line is expanded by the bile acid or bile acid derivative, and the hepatitis virus is very effectively destroyed by mechanically destroying the cell membrane. It can be seen that infection can be induced.
[실시예 4] [Example 4] 생쥐 간암 세포주 유래 바이러스의 제조Preparation of mouse hepatoma cell line-derived virus
외피 바이러스 감염 동물 모델의 제조를 위하여, 100 μmol/L의 tCDCA에, 상기 준비예 1에서 분리된 HBV (1 × 108 copies/ml/well of HBV) 또는 HCV(1 × 108 IU/ml/well of HCV)를 혼합하였다. For the preparation of an enveloped virus infection animal model, HBV (1 × 10 8 copies/ml/well of HBV) or HCV (1 × 10 8 IU/ml/well) isolated in Preparation Example 1 was added to 100 μmol/L of tCDCA. well of HCV) were mixed.
6웰 플레이트에 1 × 105 세포수/ml의 Hepa1c1c7 세포주를 분주하고, 24시간 동안 배양한 뒤에, 상기 HBV 또는 HCV가 혼합된 tCDCA 용액을 첨가하고 24시간 동안 추가로 배양하였다. 여기서, 대조군으로는 tCDCA 용액만을 첨가하였다. 이후, PBS 용액으로 3회 세척하고, 상기 바이러스가 포함되지 않은 세포 배양액으로 교체한 뒤에 3일 동안 추가로 배양하였다. 그런 다음, 상기 준비예 1과 동일한 방법으로 상기 Hepa1c1c7 세포주로부터 수득된 배양액에서 바이러스들을 분리하였다.Hepa1c1c7 cell line was dispensed at 1 × 10 5 cells/ml in a 6-well plate and cultured for 24 hours, then the tCDCA solution mixed with HBV or HCV was added and cultured for an additional 24 hours. Here, only the tCDCA solution was added as a control. Afterwards, the cells were washed three times with PBS solution, replaced with cell culture medium not containing the virus, and cultured for an additional three days. Then, viruses were isolated from the culture medium obtained from the Hepa1c1c7 cell line in the same manner as Preparation Example 1.
여기서, 상기 분리된 바이러스는 지질막 이중층의 외피가 Hepa1c1c7 세포주로부터 유래된 것으로 교체되어 있기 때문에, 생쥐 간암 세포주 유래 HBV (이하, 'cHBVcc'라함) 및 생쥐 간암 세포주 유래 HCV (이하, 'cHCVcc'라함)라 지칭하였다. 그런 다음, 상기 바이러스들의 농도를 코바스 텍멘 시스템(COBAS TaqMan system, Roche, 스위스)을 이용한 실시간 PCR을 통해 확인하였다.Here, since the outer shell of the lipid membrane bilayer of the isolated virus is replaced with one derived from the Hepa1c1c7 cell line, HBV derived from a mouse liver cancer cell line (hereinafter referred to as 'cHBVcc') and HCV derived from a mouse liver cancer cell line (hereinafter referred to as 'cHCVcc') It was referred to as Then, the concentration of the viruses was confirmed through real-time PCR using the COBAS TaqMan system (Roche, Switzerland).
[[ 실시예Example 5] 5] cHBVcccHBVcc 및 and cHCVcc의cHCVcc 바이러스 안정성 virus stability
교차 감염성을 확인하기 이전에 다양한 환경에서, 상기 실시예 4에서 얻은 cHBVcc 및 cHCVcc의 바이러스 안정성을 확인하였다.Before confirming cross-infectivity, the virus stability of cHBVcc and cHCVcc obtained in Example 4 was confirmed in various environments.
인간 혈청(Human serum, HS), 생쥐의 혈청(Mouse serum, MS) 및 세포주의 배양액에 상기 cHBVcc 또는 cHCVcc를 처리한 뒤, 상기 혈청 또는 배양액 내 존재하는 HBsAg 및 HBV의 DNA의 양을 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 측정하여, 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다. 여기서, 만성 간염 환자의 혈청을 대조군으로 사용하였다.After treating human serum (HS), mouse serum (MS), and cell line culture medium with the cHBVcc or cHCVcc, the amount of HBsAg and HBV DNA present in the serum or culture medium was measured according to the above example. It was measured in the same way as in 2, and the results are shown in Table 5 below. Here, serum from a chronic hepatitis patient was used as a control.
(Index)HBsAg
(Index)
(copies/ml)HBV DNA
(copies/ml)
상기 표 5에서 보는 바와 같이, 대조군과 비교하였을 때, 생쥐의 간암세포주로부터 유래된 지질막 이중층으로 교체된 cHBVcc의표면 항원성이 음성이고, 유전체도 많이 감소되었으나, 최소 감염 농도 (Minimal infectious dose)를 훨씬 상회하는 수치에 해당하기 때문에, 상기 cHBVcc의 경우에도 바이러스의 외피 상태가 안정성을 나타내며, 인간 또는 생쥐와 같은 목적하는 동물을 매우 효과적으로 감염시킬 수 있음을 알 수 있다.As shown in Table 5 above, when compared to the control group, the surface antigenicity of cHBVcc replaced with a lipid membrane bilayer derived from a mouse liver cancer cell line was negative, and the genome was greatly reduced, but the minimum infectious dose was lower. Since the value is much higher than that, it can be seen that even in the case of cHBVcc, the envelope state of the virus shows stability and can very effectively infect target animals such as humans or mice.
[실시예 6] [Example 6] 동종 세포에서 바이러스의 교차 감염 확인Confirmation of cross-infection of viruses in homogeneous cells
[6-1] [6-1] cHBVcccHBVcc 교차 감염 확인(1) Cross-infection confirmed (1)
Hepa1c1c7 세포주에서 상기 실시예 4에서 얻은 cHBVcc의 교차감염성을 확인하였다. 구체적으로, 상기 실시예 4의 cHBVcc과 100 μmol/L의 tCDCA가 혼합된 혼합 용액(cHBVcc + tCDCA) 또는 cHBVcc를 Hepa1c1c7 세포주에 처리한 뒤, 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 HBsAg 및 HBV의 DNA를 측정하여, 그 결과를 하기 표 6에 나타내었다. 여기서 대조군으로는 상기 준비예 1에서 얻은 HBV(야생형 HBV)를 사용하였다.Cross-infectivity of cHBVcc obtained in Example 4 was confirmed in the Hepa1c1c7 cell line. Specifically, the mixed solution of cHBVcc and 100 μmol/L of tCDCA (cHBVcc + tCDCA) or cHBVcc of Example 4 was treated with the Hepa1c1c7 cell line, and then HBsAg and HBV DNA were extracted in the same manner as in Example 2. Measurements were made, and the results are shown in Table 6 below. Here, as a control group, HBV (wild type HBV) obtained in Preparation Example 1 was used.
(Index)HBsAg
(Index)
(copies/ml)HBV DNA
(copies/ml)
상기 표 6에서 보는 바와 같이, 야생형 HBV를 처리한 경우에는 Hepa1c1c7 세포주에서 HBV에 의한 감염이 전혀 일어나지 않았으나, tCDCA를 혼합하여 처리한 경우에는 감염이 일어나는 것을 확인하였다. As shown in Table 6 above, when treated with wild-type HBV, no infection by HBV occurred in the Hepa1c1c7 cell line, but when treated with a mixture of tCDCA, infection occurred.
나아가, 지질막 이중층이 Hepa1c1c7 세포주로부터 유래된 것으로 교체된 cHBVcc를 처리한 경우에는 tCDCA가 존재하지 않는 경우(cHBVcc)에서도 Hepa1c1c7 세포주에서 cHBVcc에 의한 감염이 일어나는 것을 확인하였다.Furthermore, when cHBVcc, whose lipid membrane bilayer was replaced with one derived from the Hepa1c1c7 cell line, was treated, it was confirmed that infection by cHBVcc occurred in the Hepa1c1c7 cell line even in the absence of tCDCA (cHBVcc).
상기 결과를 통해, 담즙산 또는 담즙산 유도체가 존재하지 않는 환경에서도 담즙산 또는 담즙산 유도체를 이용하여 지질막 이중층의 외피가 교체된 바이러스는 동종의 다른 세포를 감염시킬 수 있고, 나아가 상기 세포와 유래가 같은 종에 해당하는 동물을 매우 효과적으로 감염시킬 수 있음을 알 수 있다.Through the above results, even in an environment where bile acids or bile acid derivatives do not exist, viruses whose lipid membrane bilayers have been replaced using bile acids or bile acid derivatives can infect other cells of the same species, and furthermore, can infect cells of the same species as the cells. It can be seen that it can infect the corresponding animal very effectively.
[6-2] [6-2] cHCVcc의cHCVcc 교차감염성 확인(2) Confirmation of cross-infection (2)
Hepa1c1c7 세포주에서 상기 실시예 4에서 얻은 cHCVcc의 교차감염성을 확인하였다. 구체적으로, 상기 실시예 4의 cHCVcc과 100 μmol/L의 tCDCA가 혼합된 혼합 용액(cHCVcc + tCDCA) 또는 cHCVcc를 Hepa1c1c7 세포주에 처리한 뒤, 상기 실시예 3과 동일한 방법으로 HCV의 RNA를 측정하여, 그 결과를 하기 표 7에 나타내었다. 여기서 대조군으로는 상기 준비예 1에서 얻은 HCV(야생형 HCV)를 사용하였다.Cross-infectivity of cHCVcc obtained in Example 4 was confirmed in the Hepa1c1c7 cell line. Specifically, the mixed solution of cHCVcc and 100 μmol/L of tCDCA (cHCVcc + tCDCA) of Example 4 or cHCVcc was treated with the Hepa1c1c7 cell line, and then the RNA of HCV was measured in the same manner as in Example 3. , the results are shown in Table 7 below. Here, HCV (wild type HCV) obtained in Preparation Example 1 above was used as a control.
(IU/ml)HCV RNA
(IU/ml)
상기 표 7에서 보는 바와 같이, 야생형 HCV만을 단독 주입한 경우에는 Hepa1c1c7 세포주에서 야생형 HCV에 의한 감염이 전혀 일어나지 않았으나, tCDCA를 혼합하여 처리한 경우에는 감염이 일어나는 것을 확인하였다. As shown in Table 7 above, when only wild-type HCV was injected alone, no infection by wild-type HCV occurred in the Hepa1c1c7 cell line, but when the cells were mixed with tCDCA, infection occurred.
나아가, 지질막 이중층이 Hepa1c1c7 세포주로부터 유래된 것으로 교체된 cHCVcc를 처리한 경우에는 tCDCA가 존재하지 않는 환경에서도 Hepa1c1c7 세포주에서 감염이 일어나는 것을 확인하였다.Furthermore, when cHCVcc, whose lipid membrane bilayer was replaced with one derived from the Hepa1c1c7 cell line, was treated, infection occurred in the Hepa1c1c7 cell line even in the absence of tCDCA.
상기 결과를 통해, 담즙산 또는 담즙산 유도체가 존재하지 않는 환경에서도 담즙산 또는 담즙산 유도체를 이용하여 지질막 이중층의 외피가 교체된 바이러스는 이종 세포를 감염시킬 수 있고, 나아가 상기 세포가 유래된 종과 같은 동물을 감염시킬 수 있음을 알 수 있다.Through the above results, even in an environment where bile acids or bile acid derivatives do not exist, viruses whose lipid membrane bilayers have been replaced using bile acids or bile acid derivatives can infect heterogeneous cells, and furthermore, can infect animals of the same species from which the cells were derived. It is known that it can cause infection.
[6-3] 교차감염성 확인(3)[6-3] Confirmation of cross-infection (3)
HepG2 세포주에 100 μmol/L의 tCDCA에, 상기 준비예 1에서 분리된 HBV (1 × 108 copies/ml/well of HBV) 또는 HCV (1 × 108 IU/ml/well of HCV)를 혼합한 용액을 넣은 뒤, 상기 실시예 4와 동일한 방법으로 지질막 이중층의 외피가 교체된 HBV 및 HCV를 수득하였다. 그런 다음, 100 μmol/L의 담즙산이 혼합된 혼합 용액 (HBV + tCDCA 또는 또는 HCV + tCDCA)를 HepG2 세포주에 처리한 뒤, 상기 실시예 2 및 3과 동일한 방법으로 HBsAg 및 HBV의 DNA 양 또는 HCV RNA를 측정하여, 그 결과를 하기 표 8 및 9에 나타내었다.HBV (1 × 10 8 copies/ml/well of HBV) or HCV (1 × 10 8 IU/ml/well of HCV) isolated in Preparation Example 1 was mixed with 100 μmol/L of tCDCA in the HepG2 cell line. After adding the solution, HBV and HCV with the outer shell of the lipid membrane bilayer replaced were obtained in the same manner as in Example 4. Then, the HepG2 cell line was treated with a mixed solution of 100 μmol/L bile acids (HBV + tCDCA or HCV + tCDCA), and then the DNA amounts of HBsAg and HBV or HCV were measured in the same manner as in Examples 2 and 3 above. RNA was measured, and the results are shown in Tables 8 and 9 below.
(Index)HBsAg
(Index)
(copies/ml)HBV DNA
(copies/ml)
(IU/ml)HCV RNA
(IU/ml)
상기 표 8에서 보는 바와 같이, tCDCA가 존재하는 조건하에서, HepG2 세포주로부터 유래된 지질막 이중층의 외피를 갖는 HBV에 의해 HepG2 세포주가 감염되어 HBsAg 및 HBV DNA가 검출되었다. 나아가, 상기 표 9에서 보는 바와 같이, HepG2 세포주로부터 유래된 지질막 이중층의 외피를 갖는 HCV에 의해 HepG2 세포주가 감염되어 182 IU/ml의 RNA가 존재하는 것으로 확인되었다.As shown in Table 8, in the presence of tCDCA, the HepG2 cell line was infected with HBV having a lipid bilayer envelope derived from the HepG2 cell line, and HBsAg and HBV DNA were detected. Furthermore, as shown in Table 9 above, the HepG2 cell line was infected with HCV having a lipid bilayer envelope derived from the HepG2 cell line, and it was confirmed that 182 IU/ml of RNA was present.
상기 결과를 통해 담즙산 또는 담즙산 유도체를 이용하여 지질막 이중층의 외피가 교체된 바이러스는 동종 세포를 매우 효율적으로 감염시킬 수 있음을 알 수 있다.The above results show that a virus whose lipid membrane bilayer envelope has been replaced using bile acid or a bile acid derivative can infect homologous cells very efficiently.
[6-4] 교차감염성 확인(4)[6-4] Confirmation of cross-infection (4)
HepG2 세포주에 100 μmol/L의 tCDCA에, 상기 준비예 1에서 분리된 HBV (1 × 108 copies/ml/well of HBV) 또는 HCV (1 × 108 IU/ml/well of HCV)를 혼합한 용액을 넣은 뒤, 상기 실시예 4와 동일한 방법으로 지질막 이중층의 외피가 교체된 HBV 및 HCV를 수득하였다. 그런 다음, 100 μmol/L의 담즙산이 혼합된 혼합 용액 (HBV + tCDCA 또는 HCV + tCDCA)를 Hepa1c1c7 세포주에 처리한 뒤, 상기 실시예 2 및 3과 동일한 방법으로 HBsAg 및 HBV의 DNA 양 또는 HCV RNA를 측정하여, 그 결과를 하기 표 10 및 표 11에 나타내었다.HBV (1 × 10 8 copies/ml/well of HBV) or HCV (1 × 10 8 IU/ml/well of HCV) isolated in Preparation Example 1 was mixed with 100 μmol/L of tCDCA in the HepG2 cell line. After adding the solution, HBV and HCV with the outer shell of the lipid membrane bilayer replaced were obtained in the same manner as in Example 4. Then, the Hepa1c1c7 cell line was treated with a mixed solution containing 100 μmol/L bile acids (HBV + tCDCA or HCV + tCDCA), and then the amount of HBsAg and HBV DNA or HCV RNA was determined in the same manner as Examples 2 and 3. was measured, and the results are shown in Tables 10 and 11 below.
(Index)HBsAg
(Index)
(copies/ml)HBV DNA
(copies/ml)
(IU/ml)HCV RNA
(IU/ml)
상기 표 10 및 11에서 보는 바와 같이, tCDCA가 존재하는 조건하에서, HepG2 세포주로부터 유래된 지질막 이중층의 외피를 갖는 HBV에 의해 Hepa1c1c7 세포주가 감염되어 HBsAg 및 HBV DNA가 검출되었다. 나아가, 상기 표 11에서 보는 바와 같이, HepG2 세포주로부터 유래된 지질막 이중층의 외피를 갖는 HCV에 의해 Hepa1c1c7 세포주가 감염되어 182.3 IU/ml의 RNA가 존재하는 것으로 확인되었다.As shown in Tables 10 and 11, in the presence of tCDCA, the Hepa1c1c7 cell line was infected with HBV having a lipid membrane bilayer envelope derived from the HepG2 cell line, and HBsAg and HBV DNA were detected. Furthermore, as shown in Table 11 above, the Hepa1c1c7 cell line was infected with HCV having a lipid bilayer envelope derived from the HepG2 cell line, and it was confirmed that 182.3 IU/ml of RNA was present.
상기 결과를 통해 담즙산 또는 담즙산 유도체를 이용하여 지질막 이중층의 외피가 교체된 바이러스는 이종 세포를 감염시킬 수 있고, 나아가 상기 세포가 유래된 종과 다른 동물을 감염시킬 수 있음을 알 수 있다.The above results show that a virus whose lipid membrane bilayer envelope has been replaced using bile acid or a bile acid derivative can infect heterogeneous cells and, furthermore, can infect animals different from the species from which the cells were derived.
[6-5] 교차감염성 확인(5)[6-5] Confirmation of cross-infection (5)
Hepa1c1c7 세포주에 100 μmol/L의 tCDCA에, 상기 준비예 1에서 분리된 HBV (1 × 108 copies/ml/well of HBV) 또는 HCV (1 × 108 IU/ml/well of HCV)를 혼합한 용액을 넣은 뒤, 상기 실시예 4와 동일한 방법으로 지질막 이중층의 외피가 교체된 HBV 및 HCV를 수득하였다. 그런 다음, 100 μmol/L의 담즙산이 혼합된 혼합 용액 (HBV + tCDCA 또는 HCV + tCDCA)를 HepG2 세포주에 처리한 뒤, 상기 실시예 2 및 3과 동일한 방법으로 HBsAg 및 HBV의 DNA 양 또는 HCV RNA를 측정하여, 그 결과를 하기 표 12 및 표 13에 나타내었다.HBV (1 × 10 8 copies/ml/well of HBV) or HCV (1 × 10 8 IU/ml/well of HCV) isolated in Preparation Example 1 was mixed with 100 μmol/L of tCDCA in the Hepa1c1c7 cell line. After adding the solution, HBV and HCV with the outer shell of the lipid membrane bilayer replaced were obtained in the same manner as in Example 4. Then, the HepG2 cell line was treated with a mixed solution of 100 μmol/L bile acids (HBV + tCDCA or HCV + tCDCA), and then the amount of HBsAg and HBV DNA or HCV RNA was determined in the same manner as Examples 2 and 3. was measured, and the results are shown in Tables 12 and 13 below.
(Index)HBsAg
(Index)
(copies/ml)HBV DNA
(copies/ml)
(IU/ml)HCV RNA
(IU/ml)
상기 표 12에서 보는 바와 같이, tCDCA가 존재하는 조건하에서, Hepa1c1c7 세포주로부터 유래된 지질막 이중층의 외피를 갖는 HBV에 의해 HepG2 세포주가 감염되어 HBsAg 및 HBV DNA가 검출되었다. 나아가, 상기 표 13에서 보는 바와 같이, HepG2 세포주로부터 유래된 지질막 이중층의 외피를 갖는 HCV에 의해 Hepa1c1c7 세포주가 감염되어 300 IU/ml의 RNA가 존재하는 것으로 확인되었다.As shown in Table 12, in the presence of tCDCA, the HepG2 cell line was infected with HBV having a lipid membrane bilayer envelope derived from the Hepa1c1c7 cell line, and HBsAg and HBV DNA were detected. Furthermore, as shown in Table 13 above, the Hepa1c1c7 cell line was infected with HCV having a lipid bilayer envelope derived from the HepG2 cell line, and 300 IU/ml of RNA was confirmed to be present.
상기 결과를 통해 담즙산 또는 담즙산 유도체를 이용하여 지질막 이중층의 외피가 교체된 바이러스는 동종 세포를 매우 효율적으로 감염시킬 수 있음을 알 수 있다.The above results show that a virus whose lipid membrane bilayer envelope has been replaced using bile acid or a bile acid derivative can infect homologous cells very efficiently.
[실시예 7] [Example 7] HBV 및 HCV 바이러스 감염 동물 모델의 제조 및 검증Preparation and validation of HBV and HCV virus infection animal models
생쥐 C57L의 꼬리 정맥에 100 ㎕의 양(1 × 108 genome equivalents)으로 상기 실시예 4에서 제조된 cHBVcc 또는 cHCVcc를 주입하고, 1주 동안 사육하여 바이러스 감염 동물 모델(이하, '감염 동물'이라 함)을 제조하였다. 여기서, 대조군으로는 100 ㎕의 양으로 인간으로부터 유래된 야생형 HBV를 주입하였다.The cHBVcc or cHCVcc prepared in Example 4 was injected in an amount of 100 μl (1 × 10 8 genome equivalents) into the tail vein of mouse C57L, and reared for 1 week to create a virus infection animal model (hereinafter referred to as ‘infected animal’). ) was manufactured. Here, as a control group, wild-type HBV derived from humans was injected in an amount of 100 μl.
[7-1] 혈청 내 바이러스 검사 [7-1] Virus test in serum
상기 감염 동물로부터 혈청을 수득한 뒤, 상기 혈청 내에서 HBsAg 및 HBV의 DNA가 존재하는 수준을 측정하였다. 여기서, 대조군으로는 인간으로부터 유래된 지질막 이중층의 외피를 갖고 있는 야생형 HBV를 사용하였다. 상기 HBsAg 및 HBV의 DNA와 HCV RNA의 측정은 상기 실시예 2 및 3과 동일한 방법으로 수행하여, 그 결과를 하기 표 14 및 15에 나타내었다.After obtaining serum from the infected animal, the levels of HBsAg and HBV DNA present in the serum were measured. Here, as a control, wild-type HBV, which has a lipid bilayer envelope derived from humans, was used. Measurement of HBsAg and HBV DNA and HCV RNA was performed in the same manner as Examples 2 and 3, and the results are shown in Tables 14 and 15 below.
(copies/ml)HBV DNA
(copies/ml)
(IU/ml)HCV RNA
(IU/ml)
상기 표 14에서 보는 바와 같이, 감염 동물의 혈청 내 HBsAg의 양은 1.2 Index이었고, HBV의 DNA는 585 copies/ml가 존재하는 것으로 확인되었다. 또한, 상기 표 15에서 보는 바와 같이, 대조군의 HCV RNA는 15 IU/ml 이하인 반면, HCV DNA는 180 IU/ml로 확인되었다.As shown in Table 14 above, the amount of HBsAg in the serum of the infected animal was 1.2 Index, and HBV DNA was confirmed to be present at 585 copies/ml. Additionally, as shown in Table 15, the HCV RNA of the control group was below 15 IU/ml, while the HCV DNA was found to be 180 IU/ml.
상기 결과를 통해, cHBVcc 및 cHCVcc의 주입을 통해 인간이 아닌 다른 종인 생쥐와 같은 소동물에 HBV의 감염이 일어날 수 있음을 알 수 있다.The above results show that HBV infection can occur in small animals such as mice, which are a species other than humans, through injection of cHBVcc and cHCVcc.
[7-2] 간기능 검사[7-2] Liver function test
상기 감염 동물에서, 바이러스 감염에 의한 간염이 발생되었는지 여부를 확인하기 위해, 혈청 내 ALT(alanine aminotransaminase)의 수치를 측정하는 간기능 검사를 이 분야의 통상의 방법에 의해 수행하였다.In order to confirm whether hepatitis caused by viral infection occurred in the infected animal, a liver function test measuring the level of ALT (alanine aminotransaminase) in the serum was performed by a conventional method in the field.
그 결과, cHBVcc가 주입된 감염 동물의 ALT는 150 U/L로 측정되었다. As a result, the ALT of infected animals injected with cHBVcc was measured at 150 U/L.
상기 결과를 통해, 정상의 ALT 값이 34 이하의 값을 가지는 바, 감염 동물은 cHBVcc의 주입을 통해 쥐에 HBV가 감염될 수 있고, 이를 통해 상기 감염 동물에서 간염이 발생되었음을 알 수 있다.From the above results, it can be seen that since the normal ALT value is 34 or less, the infected animal can be infected with HBV in mice through injection of cHBVcc, and through this, hepatitis occurred in the infected animal.
[7-3] 조직검사[7-3] Biopsy
상기 감염 동물의 간 조직을 적출한 뒤, 10%의 포르말린(formalin)을 이용하여 고정한 뒤, 파라핀에 매몰시켰다. 상기 파라핀에 매몰된 조직을 4 ㎛의 두께로 자르고, 리하이드레이션과 파라핀을 제거하는 과정을 수행하였다. 그런 다음, 이를 이용하여 통상의 방법을 통해 H&E 염색을 수행하여, 그 결과를 도 9 내지 도 16에 나타내었다.The liver tissue of the infected animal was extracted, fixed using 10% formalin, and then embedded in paraffin. The tissue embedded in the paraffin was cut to a thickness of 4 ㎛, and rehydration and paraffin removal processes were performed. Then, H&E staining was performed using this using a conventional method, and the results are shown in Figures 9 to 16.
도 1 및 도 6에서 보는 바와 같이, 간실질부에 단핵구(임파구)의 침윤이 여러군데 증가되고, peri-portal area에도 단핵구의 침윤과 풍선 모양의 덩어리가 발생된 것으로 보아 염증이 발생되었고, 인간의 급성 B형 간염의 조직학적 소견과 유사한 양상을 보임을 확인하였다.As shown in Figures 1 and 6, the infiltration of monocytes (lymphocytes) increased in several places in the liver parenchyma, and the infiltration of monocytes and balloon-shaped masses also occurred in the peri-portal area, suggesting that inflammation occurred. It was confirmed that the histological findings were similar to those of acute hepatitis B.
도 7 및 도 8에서 보는 바와 같이, 회장의 융모에 단핵구(임파구)가 침윤되어 있음을 확인하였다.As shown in Figures 7 and 8, it was confirmed that monocytes (lymphocytes) were infiltrating the villi of the ileum.
상기 결과를 통해, 본 발명에 따른 cHBVcc에 의해 설치류를 감염시킬 수 있고, 이와 같은 감염은 간 조직뿐만 아니라, 신장 및 장골 조직에도 HBV의 감염에 의한 급성 염증이 유발될 수 있음을 알 수 있다.From the above results, it can be seen that rodents can be infected with cHBVcc according to the present invention, and that such infection can cause acute inflammation due to HBV infection not only in liver tissue, but also in kidney and iliac tissue.
[7-4] 면역염색검사[7-4] Immunostaining test
상기 감염 동물의 간 조직을 적출한 뒤, 10%의 포르말린 (formalin)을 이용하여 고정한 뒤, 파라핀에 매몰시켰다. 상기 파라핀에 매몰된 조직을 4 ㎛의 두께로 자르고, 리하이드레이션과 파라핀을 제거하는 과정을 수행하였다. 이후, HBV 코어 항원인 HBcAg 항체와 상기 조직을 반응시키고, 시각화될 수 있는 물질 (Biotin)이 결합되어 있는 2차 항체로 반응시켰다. 그런 다음, Hoechst 33258을 이용하여 15분 동안 염색한 뒤, 50% glycerol을 통해 마운팅하고 현미경으로 관찰하여, 그 결과를 도 9 내지 도 14에 나타내었다.The liver tissue of the infected animal was removed, fixed using 10% formalin, and then embedded in paraffin. The tissue embedded in the paraffin was cut to a thickness of 4 ㎛, and rehydration and paraffin removal processes were performed. Afterwards, the tissue was reacted with HBcAg antibody, which is the HBV core antigen, and reacted with a secondary antibody to which a substance that can be visualized (Biotin) was bound. Then, it was stained using Hoechst 33258 for 15 minutes, mounted with 50% glycerol, and observed under a microscope. The results are shown in Figures 9 to 14.
도 9 내지 도 14에서 보는 바와 같이, 간세포, 신장세포, 회장 융모 세포의 세포질이 갈색으로 염색된 것을 확인하였다.As shown in Figures 9 to 14, it was confirmed that the cytoplasm of hepatocytes, kidney cells, and ileal villus cells were stained brown.
상기 결과를 통해, 본 발명에 따른 동물 모델의 제조 방법은 인간으로부터 유래된 지방질 외피가 목적하는 동물 모델로부터 유래된 지방질 외피로 교체되기 때문에 종 특이성에 의한 제한 없이 임상적으로 유용하게 활용할 수 있는 동물 모델을 매우 효율적으로 제작할 수 있음을 알 수 있다.Through the above results, the method for producing an animal model according to the present invention replaces the fatty envelope derived from humans with the fatty envelope derived from the target animal model, making it a clinically useful animal without limitation due to species specificity. It can be seen that the model can be produced very efficiently.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.As the specific parts of the present invention have been described in detail above, it is clear to those skilled in the art that these specific techniques are merely preferred implementation examples and do not limit the scope of the present invention. Accordingly, the substantial scope of the present invention will be defined by the appended claims and their equivalents.
Claims (13)
지질막 이중층을 포함하는 외피 바이러스의 지방질 외피(lipid layer)를 상기 목적하는 동물로부터 유래된 지방질 외피로 교체하는 단계; 및
상기 지방질 외피가 교체된 바이러스를 상기 목적하는 동물에 주입하는 단계를 포함하는, 바이러스가 감염된 동물 모델의 제조 방법으로서,
상기 목적하는 동물로부터 유래된 지방질 외피로 교체하는 단계는,
지방질 외피를 포함하는 외피 바이러스와 담즙산 또는 담즙산 유도체를 혼합하는 단계; 및
상기 담즙산 또는 담즙산 유도체와 혼합된 상기 바이러스를 상기 목적하는 동물로부터 유래된 세포주의 배양액에 첨가하는 단계를 통해 제조되는 것인, 동물 모델의 제조 방법으로,
상기 목적하는 동물은 인간을 제외한 척추 동물이고,
상기 척추 동물은 생쥐, 쥐, 토끼, 새, 고양이, 개, 돼지, 양, 염소, 사슴, 말 및 소로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상이며,
상기 지방질 외피를 포함하는 외피 바이러스는 간염 바이러스(Hepatitis virus)이고,
상기 간염 바이러스는 HBV(Hepatitis B virus)인, 바이러스가 감염된 동물 모델의 제조 방법.Preparing animals of interest other than humans;
Replacing the lipid layer of an enveloped virus comprising a lipid membrane bilayer with a lipid layer derived from the animal of interest; and
A method for producing a virus-infected animal model, comprising the step of injecting the virus with the lipid envelope replaced into the target animal,
The step of replacing the fatty envelope derived from the desired animal,
mixing an enveloped virus comprising a lipid envelope with a bile acid or bile acid derivative; and
A method for producing an animal model, which is prepared by adding the virus mixed with the bile acid or bile acid derivative to a culture medium of a cell line derived from the desired animal,
The animal of interest is a vertebrate animal excluding humans,
The vertebrates are one or more selected from the group consisting of mice, rats, rabbits, birds, cats, dogs, pigs, sheep, goats, deer, horses, and cows,
The enveloped virus containing the fatty envelope is a hepatitis virus,
The hepatitis virus is HBV (Hepatitis B virus), and a method for producing a virus-infected animal model.
상기 담즙산 유도체는 케노데옥시콜린산 (chenodeoxycholic acid), 디옥시콜린산 (deoxycholic acid), 리토콜린산 (lithocholic acid), 타우로콜린산 (taurocholic acid), 글라이코콜린산 (glycocholic acid), 타우로케노데옥시콜린산 (taurochenodeoxycholic acid), 글라이코케노데옥시콜린산 (glycochenodeoxycholic acid), 글라이코데옥시콜린산 (glycodeoxycholic acid), 타우로데옥시콜린산 (taurodeoxycholic acid), 글라이코리토콜린산 (glycolithocholic acid), 타우로리토콜린산 (taurolithocholic acid) 및 뮤리콜린산 (muricholic acid)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것인, 동물 모델의 제조 방법.According to clause 1,
The bile acid derivatives include chenodeoxycholic acid, deoxycholic acid, lithocholic acid, taurocholic acid, glycocholic acid, and tau. taurochenodeoxycholic acid, glycochenodeoxycholic acid, glycodeoxycholic acid, taurodeoxycholic acid, glycolithocolic acid ( A method for producing an animal model, comprising at least one selected from the group consisting of glycolithocholic acid, taurolithocholic acid, and muricholic acid.
상기 목적하는 동물로부터 유래된 지질막 이중층의 외피로 교체는,
지방질 외피를 포함하는 외피 바이러스와 담즙산 또는 담즙산 유도체를 혼합하고, 상기 담즙산 또는 담즙산 유도체와 혼합된 상기 바이러스를 상기 목적하는 동물로부터 유래된 세포주의 배양액에 첨가하는 것인, 동물 모델로,
상기 목적하는 동물은 인간을 제외한 척추 동물이고,
상기 척추 동물은 생쥐, 쥐, 토끼, 새, 고양이, 개, 돼지, 양, 염소, 사슴, 말 및 소로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상이며,
상기 지방질 외피를 포함하는 외피 바이러스는 간염 바이러스(Hepatitis virus)이고,
상기 간염 바이러스는 HBV(Hepatitis B virus)인, 바이러스가 감염된 동물 모델.Prepare an animal of interest other than a human, replace the envelope of the lipid membrane bilayer of an enveloped virus containing a lipid membrane bilayer with the envelope of a lipid membrane bilayer derived from the target animal, and then replace the envelope of the lipid membrane bilayer. A virus-infected animal model manufactured by injecting a virus into a target animal,
Replacing the shell with a lipid membrane bilayer derived from the animal of interest,
An animal model in which an enveloped virus containing a lipid envelope is mixed with a bile acid or a bile acid derivative, and the virus mixed with the bile acid or bile acid derivative is added to the culture medium of a cell line derived from the animal of interest,
The animal of interest is a vertebrate animal excluding humans,
The vertebrates are one or more selected from the group consisting of mice, rats, rabbits, birds, cats, dogs, pigs, sheep, goats, deer, horses, and cows,
The enveloped virus containing the fatty envelope is a hepatitis virus,
The hepatitis virus is HBV (Hepatitis B virus), an animal model infected with the virus.
상기 바이러스가 감염된 동물 모델에 바이러스성 질환의 치료 후보물질을 첨가하는 단계를 포함하는, 바이러스성 질환의 치료 후보물질의 스크리닝 방법.Raising an animal model infected with the virus of claim 8; and
A method of screening for a treatment candidate for a viral disease, comprising adding a candidate for the treatment of a viral disease to an animal model infected with the virus.
상기 바이러스성 질환은 바이러스성 간염인 것인, 바이러스성 질환의 치료 후보물질의 스크리닝 방법.According to clause 10,
A method for screening a candidate for treatment of a viral disease, wherein the viral disease is viral hepatitis.
상기 사육된 바이러스가 감염된 동물 모델과,
치료 후보물질이 첨가된 바이러스가 감염된 동물 모델 각각에서 바이러스의 게놈 또는 항원의 존재 여부를 확인하는 단계를 더 포함하는, 바이러스성 질환의 치료 후보물질의 스크리닝 방법.According to clause 10,
An animal model infected with the reared virus,
A method for screening a treatment candidate for a viral disease, further comprising the step of confirming the presence of a viral genome or antigen in each animal model infected with the virus to which the treatment candidate has been added.
상기 사육된 바이러스가 감염된 동물 모델에 비하여, 상기 치료 후보물질이 첨가된 바이러스가 감염된 동물 모델의 바이러스의 게놈 또는 표면 항원의 존재 수준이 감소된 경우, 바이러스성 질환의 치료 물질로 선별하는 것인, 바이러스성 질환의 치료 후보물질의 스크리닝 방법.According to clause 12,
When the presence level of the genome or surface antigen of the virus in the animal model infected with the virus to which the treatment candidate is added is reduced compared to the animal model infected with the reared virus, it is selected as a treatment material for viral diseases, Method for screening candidates for treatment of viral diseases.
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