KR102649941B1 - GLP1-Fc 융합 단백질 및 이의 접합체 - Google Patents

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Abstract

본 발명에 의해 신규 GLP-1 융합 단백질 및 이의 접합체, 이를 함유하는 약제학적 조성물, 및 혈당 또는 체중을 감소시키고, 특히 당뇨병, 특히 II형 당뇨병을 치료하기 위한 이의 용도가 제공된다.

Description

GLP1-Fc 융합 단백질 및 이의 접합체
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2018년 9월 26일자로 출원된 "GLP1-FC 융합 단백질 및 이의 접합체"란 발명의 명칭의 중국 특허 출원 제201811125762.9호의 우선권을 주장하고, 이의 개시내용은 전문이 본원에 참조로 인용된다.
본 발명은 생체내 긴 반감기를 갖는 생물학적 활성 폴리펩타이드 융합 단백질 및 이들의 중합체 접합체, 특히, 생체내 긴 반감기를 갖는 GLP-1 수용체 효능제, 이를 포함하는 약제학적 조성물, 및 혈당을 감소시키고 (특히, 당뇨병, 특히 II형 당뇨병의 치료에) 체중을 제어하는데 있어서 이의 용도에 관한 것이다.
경제 발전, 인구의 평균 수명의 연장 및 생활 방식의 변화와 함께, 당뇨병은 전세계적으로 주요 건강 관리 문제가 되었다. 선진국이든 개발 도상국이든 상관 없이, 당뇨병의 발생률은 급격히 증가하고 있다. 2007년에, 전세계적으로 대략 2억 4천 6백만 당뇨병 환자가 있고, 10초 마다 한명의 당뇨병 환자가 사망하였다. 2025년까지 전세계 당뇨병 환자의 수는 3억 3천 3백만명에 이를 것으로 추정된다. 중국은 현재 4천만 당뇨병 환자 및 약 5% 당뇨병 발생률과 함께 당뇨병의 "중대 재난지구"가 되었고 당뇨병 발병률이 세계에서 2번째로 큰 국가 (1위는 인도이다)이다. 당뇨병은 인슐린-의존성 당뇨병 (I형 당뇨병) 및 비-인슐린 의존성 당뇨병 (II형 당뇨병)의 두 가지 유형이 있고, 여기서, II형 당뇨병은 당뇨병 환자의 90%를 초과한다. II형 당뇨병은 인슐린 분비 또는 효과의 조절불능 및 β-세포 기능부전으로 지방, 탄수화물 및 단백질의 대사 장애를 유도하고 만성 고혈당증을 유발하고 궁극적으로 다양한 미세혈관, 거대혈관 및 다양한 기관 합병증을 유발함을 특징으로 한다. 오늘날, 당뇨병을 제어하기 위한 2가지 유형의 약물이 있다: 1) 인슐린 분비-자극 약물, 예를 들어, 설포닐우레아, 메글리티니데스, 디펩티딜 펩티다제 억제제, 및 GLP-1 유사체; 및 2) 비-인슐린 분비-자극 약물, 예를 들어, 인슐린, α-글루코시다제 억제제, 비구아니드, 티아졸리딘디온, 인슐린 유사체 등. 현재, 임상적으로 사용되는 많은 통상적인 당뇨병-치료 약물은 II형 당뇨병을 갖는 환자에게는 무력하다. 상기 약물은 췌장 β-세포의 진행성 악화를 억제하거나, 당화혈색소(HbA1c)의 수준을 감소시키거나, 당뇨병의 합병증, 예를 들어, 심장 질환 및 신부전증을 예방하는데 실패하고, 상기 약물들은 다양한 정도의 부작용을 수반한다. 따라서, II형 당뇨병의 치료를 위해 신규한 약물을 개발할 필요가 있다.
장내 호르몬 글루카곤-유사 펩타이드-1 (GLP-1)은 1985년도에 동정되었고, 이는 식후 프로글루카곤 유전자에 의해 발현되고 주로 장 점막 L-세포에 의해 분비된다. GLP-1은 췌장 β-세포를 자극하여 인슐린을 분비할 수 있고 (참조: J Med Chem, 47, 4128-4134, 2004) 혈당 수준을 안정화시키는데 중요한 역할을 수행한다. GLP-1의 외인성 투여는 II형 당뇨병을 갖는 환자에서 혈당 수준을 정상화시킬 수 있다 (참조: Diabetes Care, 15, 270-276, 1992; Lancet, 359, 824-830, 2002; Endoer. Rev, 16, 390-410, 1996; and Diabetologia, 28, 565-573, 1985). GLP-1은 하기의 기능을 갖는다: 글루코스-의존성 방식으로 췌장 β-세포에 작용하고, 인슐린 유전자의 전사를 촉진시키고, 인슐린의 생합성 및 분비를 증가시키고, β-세포의 증식 및 분화를 자극하고, β-세포 아폽토시스를 억제함으로써 췌장 β-세포의 수를 증가시키고, 글루카곤의 분비를 억제하고, 말초 세포의 인슐린 수용체의 민감성을 증가시키고, HbA1c를 감소시키고, 식욕 및 공급을 억제하고 위 공복을 지연시킨다 (참조: Diabetic Med, 18, 144-149, 2001; Diabetes, 51, 1443-1452, 2002; Diabetologia, 45, 1263-1273, 2002; Diabetes, 50, 525-529, 2001; Diabetes, 50, 725, 2001; Diabetes, 52, 365-371, 2003; Recent Prog. Hormne Res. 56, 377-399, 2001; Disbetologia, 39, 1546-1553, 1996; Am. J. Physical Endocrinol. Metab, 281, E242-247, 2001; US patent 477967, 478017, 478425; Diabetes Care, 22, 403-408, 1999; J. Clin. Endocrinology and Metabolism, 88, 3082-3089, 2003; and Diabetes, 44, 1295, 1995). 그러나, GLP-1은 생체내에서 디펩티딜 펩티다제 (DPPIV)에 의해 용이하게 분해되고 반감기는 2분 미만이고 따라서 거의 효과적인 항-당뇨 약물이 될 수 없다.
짧은 반감기 및 불량한 물리적 및 화학적 안정성으로 인해, 펩타이드 약물은 생체내에서 다양한 프로테아제에 의해 용이하게 분해되어 이들은 일반적으로 하루 이내에 수회 주사가 요구되고, 이는 환자에게 신체적, 정신적 및 재정적 부담을 안겨주고 이들의 약물 순응도를 제한한다. 따라서, 당업계에서는 이들의 혈장 사이클을 연장하고 이들의 전신 약물 노출을 증가시키는 새로운 구조를 갖는 약물이 긴급히 요구되고 있다.
개요
수년의 연구 및 장기 실험 후, 본원 발명자들은 폴리펩타이드를 폴리펩타이드의 반감기를 연장시킬 수 있는 융합 파트너 (예를 들어, Fc 단편, 알부민, XTEN 또는 트랜스페린)와 융합시켜 융합 단백질을 생성하고 추가로 친수성 중합체 (예를 들어, 폴리알킬렌 글리콜, 특이적으로 PEG)와 접합시킨 후, 이것은 효과적으로 생물학적 활성 폴리펩타이드의 생체내 안정성을 증가시키고 약물의 효능을 개선시킬 수 있음을 밝혔다. 본 발명은 상기 발견을 기초로 완성되었다.
제1 양상에서, 본 발명은 GLP-1 수용체 효능제를 포함하는 GLP-1 수용체 효능제와 생체내 융합 단백질의 반감기를 연장시킬 수 있는 융합 파트너 (FP)의 융합 단백질을 제공하고, 여기서, 상기 GLP-1 수용체 효능제 및 융합 파트너는 직접 연결되거나 제1 링커 L1을 통해 연결된다.
바람직하게, 제1 링커 L1은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 아미노산을 함유하는 펩타이드이다.
보다 바람직하게, 제1 링커 L1은 A, T, G, 및/또는 S, 예를 들어 (GS)n을 함유하는 가요성 펩타이드이고, 여기서, n은 1 내지 50의 정수, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10이다.
가장 바람직하게, 제1 링커 L1은 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된다:
GSGGGSGGGGSGGGGS (서열번호 9),
GSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (서열번호 10),
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (서열번호 11),
GSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (서열번호 12),
GGGSGGGSGGGSGGGSGGGS (서열번호 13),
PRFQDSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ (서열번호 14),
SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ (서열번호 15),
SSSSKAPPPS (서열번호 16),
SRLPGPSDTPILPQ (서열번호 17) 및
GGGGSGGGGSGGGGSA (서열번호 18).
하나의 구현예에서, GLP-1 수용체 효능제는 GLP-1 또는 GLP-1 유사체의 전장, 절단된 것 또는 변이체, 예를 들어, 엑센딘-4, GLP-1(1-36), GLP-1(1-37), GLP-1(7-36), GLP-1(7-37), 리라글루티드, 릭시세나티드, 알비글루티드, 둘라글루티드 또는 세마글루티드이다.
또 다른 구현예에서, 융합 파트너(FP)는 면역글로불린 Fc 단편, 알부민, XTEN 또는 트랜스페린의 전장, 절단된 것 또는 변이체이고; 바람직하게, Fc 단편은 인간 면역글로불린 Fc 단편으로부터 유래하고; 바람직하게, Fc 단편은 CH1 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인 및 CH4 도메인으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1 내지 4개의 도메인으로 구성되고; 바람직하게, Fc 단편은 IgG, IgA, IgD, IgE, 또는 IgM의 Fc 단편, 보다 바람직하게 IgG Fc 단편으로부터 유래하고; 보다 바람직하게, Fc 단편은 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4의 Fc 단편으로부터 유래하고, 보다 바람직하게, IgG Fc 단편은 감소된 ADCC 효과 및/또는 CDC 효과 및/또는 FcRn에 대해 증진된 결합 친화성을 갖는다.
또 다른 구현예에서, 융합 파트너(FP)는 또한 직접적으로 또는 제2 링커 L2를 통해 소르타제 인지 부위를 함유하는 ST 서열로 연결되고, 여기서, 소르타제는 예를 들어, 소르타제 A 또는 소르타제 B이고; 바람직하게, ST는 소르타제 A의 코어 인지 부위 LPXTG를 함유하고, 여기서, X는 임의의 아미노산이고, ST는 예를 들어, LPETG, LPETGG 또는 LPETGGG이고; 보다 바람직하게, ST는 추가로 소르타제 인지 부위에 연결된 친화성 태그를 함유하고, ST는 예를 들어, LPETGGHHHHHH 또는 LPETGGWSHPQFEK이다.
여기서, 제2 링커 L2는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 아미노산을 함유하는 펩타이드이다.
보다 바람직하게, 제2 링커 L2는 A, T, G, 및/또는 S, 예를 들어 (GS)n을 함유하는 가요성 펩타이드이고, 여기서, n은 1 내지 50의 정수, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10이고;
가장 바람직하게, 제2 링커 L2는 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된다:
GSGGGSGGGGSGGGGS (서열번호 9),
GGGGSGGGGSGGGGSA (서열번호 18),
GGGGS (서열번호 19),
GGGGSGGGGS (서열번호 20), 및
GGGGSGGGGSGGGGS (서열번호 21).
또 다른 구현예에서, 융합 단백질은 GLP-1-L1-FP-L2-ST의 구조를 갖고, 여기서, GLP-1은 GLP-1 수용체 효능제 및 GLP-1 수용체 효능제를 나타내고, L1, L2, FP 및 ST는 상기된 바와 동일한 정의를 갖고 L1 및 L2 중 하나 또는 둘 다는 존재하지 않을 수 있다.
특정 구현예에서, 융합 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 1, 3, 5, 7, 또는 22에 제시되거나; 융합 단백질은 서열번호 2, 4, 6, 8, 또는 23에 제시된 핵산 서열에 의해 암호화되어 있다.
본 발명의 제2 양상에서, 접합체가 제공되고, 여기서, 1개, 2개 이상의 친수성 중합체는 제1 양상의 융합 단백질의 말단에 부착되어 있고, 바람직하게, 친수성 중합체는 트랜스펩티드화 반응을 통해 소르타제 인지 부위에 부착되어 있고, 특히, 융합 단백질은 단량체 또는 이량체 형태일 수 있다.
하나의 구현예에서, 1개, 2개 이상의 친수성 중합체는 각각 독립적으로 폴리사카라이드 및 폴리알킬렌 글리콜, 예를 들어, 폴리프로필렌 글리콜 및 폴리에틸렌 글리콜로부터 선택되고; 상기 폴리알킬렌 글리콜은 말단-캡핑될 수 있고, 예를 들어, 메톡시 그룹과 같은 알콕시 그룹으로 캡핑될 수 있고/있거나 폴리알킬렌 글리콜은 선형 또는 분지형이고, 예를 들어, 폴리알킬렌 그룹은 분지형, 예를 들어, 분지된 폴리에틸렌 글리콜, 특히, 메톡시 그룹으로 캡핑된 분지된 폴리에틸렌 글리콜이고; 폴리알킬렌 글리콜의 분자량은 ≥1, ≥10, ≥20, ≥30, ≥40, ≥50, ≥60, ≥70, ≥80, ≥90, ≥100, ≥110, ≥120, ≥130, ≥140, ≥150, 또는 ≥160 kDa, 예를 들어, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100 kDa, 또는 상기 값의 임의의 2개 사이의 값일 수 있고; 바람직하게 친수성 중합체의 분자량은 20 kDa 또는 40 kDa이다.
본 발명의 제3 양상은 제2 양상에 기재된 접합체를 제조하기 위한 방법을 제공하는 것이고, 이는 제1 양상에 기재된 융합 단백질과 소르타제 (예를 들어, 소르타제 A 또는 소르타제 B) 및 친수성 중합체를 접촉시킴을 포함하고, 여기서, 친수성 중합체의 하나의 말단은 소르타제에 의해 아미드화될 수 있는 아미노 그룹을 갖는다.
하나의 구현예에서, 친수성 중합체의 하나의 말단은 폴리-Gly, 예를 들어, GGGAA를 함유한다.
본 발명의 제4 양상은 제1 양상에 기재된 유효량의 융합 단백질 및/또는 제2 양상에 기재된 접합체, 및 임의로 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.
하나의 구현예에서, 약제학적 조성물은 혈당 또는 체중을 감소시키는데, 예를 들어, 당뇨병의 치료에, 보다 구체적으로 I형 당뇨병 및/또는 II형 당뇨병의 치료에, 특히 II형 당뇨병의 치료에 사용하기 위한 것이다.
또 다른 구현예에서, 약제학적 조성물은 액체 제제 또는 동결건조된 제제 형태이다.
본 발명의 제5 양상은 혈당 또는 체중을 감소시키기 위한 약물의 제조를 위한 제1 양상에 기재된 융합단백질 또는 제2 양상에 기재된 접합체의 용도를 제공하는 것이고, 예를 들어, 상기 약물은 I형 당뇨병 및 II형 당뇨병, 특히 II형 당뇨병을 포함하는 당뇨병의 치료에 사용하기 위한 것이다.
본 발명의 제6 양상은 혈당 또는 체중을 감소시키기 위한 방법을 제공하는 것이고, 상기 방법은 예를 들어, I형 당뇨병 및 II형 당뇨병, 특히, II형 당뇨병을 포함하는 당뇨병을 치료하기 위해 제1 양상에 기재된 융합 단백질 또는 제2 양상에 기재된 접합체를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여함을 포함한다.
본 발명의 제7 양상은 제1 양상에 기재된 융합 단백질, 제2 양상에 기재된 접합체 및/또는 제4 양상에 기재된 약제학적 조성물, 및 임의의 사용 지침서를 포함하는 키트를 제공하는 것이다.
본원 발명자들은 본 발명의 GLP-1-Fc 접합체가 놀랍게도 장기적인 저혈당 효과를 제공할 수 있음을 발견하였다. 추가로, 기존의 유사 약물과 비교하여, 본 발명의 GLP-1-Fc 접합체는 저혈당 약물 복용으로 인한 급격한 체중 감소를 유의적으로 감소시켜 약물의 임상적 안전성은 크게 개선되고, 따라서 임상적 적용의 큰 가치를 가질 수 있다.
도 1a는 GLP-1 융합 단백질 진핵 발현 벡터의 구조를 보여주고 도 1b는 발효 동안에 GLP1-L1-Fc2-L2-ST 안정한 세포주 (클론 번호: P1-3G3C2)의 성장 곡선 및 세포 생존능의 시험 결과를 보여준다.
도 2는 발효 동안에 상이한 시점에서 GLP1-L1-Fc2-L2-ST 안정한 세포주 (클론 번호: P1-3G3C2)의 현미경 조사 결과를 보여준다. 도 2a는 배양 5일째 세포의 이미지이고, 도 2b는 수거된 경우 (13일)의 세포를 보여준다.
도 3은 발효 동안에 GLP1-L1-Fc2-L2-ST 안정한 세포주 (클론 번호: P1-3G3C2)의 배양 상등액 중에 글루코스 대사를 보여준다.
도 4는 발효 동안에 GLP1-L1-Fc2-L2-ST 안정한 세포주 (클론 번호: P1-3G3C2)의 배양 상등액 중에 NH4 + 및 락토스 (Lac)의 대사를 보여준다.
도 5는 비-환원 겔 (좌측: M/1/2/3) 및 환원된 겔 (우측: 4/5/6/M)에서 GLP1-L1-Fc2-L2-ST 단백질의 전기영동 결과를 보여준다. 1 및 6: 최종 발효 브로쓰의 상등액; 3 및 4: 정제 후 샘플; 2 및 5: 10일째 발효 브로쓰 샘플.
도 6은 정제된 GLP1-L1-Fc2-L2-ST 단백질의 SDS 전기영동 (A) 및 SEC 분석 (B)의 시험 결과를 보여준다.
도 7은 SDS 전기영동 및 RPC 분석에 의한 두 단백질의 가교결합율 검출 결과를 나타낸 것이다. 도 7a 및 도 7c는 각각 20 kDa 및 40 kDa PEG와 가교결합된 GLP1-L1-Fc2-L2-ST 단백질의 SDS 겔이고; 도 7b 및 도 7d는 각각 20 kDa 및 40 kDa PEG와 가교결합된 GLP1-L1-Fc2-L2-ST 단백질의 RPC 결과이고; 도 7e는 40 kDa PEG와 가교결합된 GLP1-L1-Fc2-ST 단백질의 RPC 결과이다.
도 8은 가교결합 후 GLP1-L1-Fc2-L2-ST의 음이온 교환 크로마토그램 (A) 및 RPC 시험 (B)의 결과를 보여준다.
도 9는 각각 20 kDa PEG 및 40 kDa PEG와 가교결합된 GLP1-L1-Fc2-L2-ST의 활성 시험 결과를 보여준다. 둘라글루티드와 비교하여, 비-가교결합된 기질 (GLP1-Fc)의 상대적 활성은 98.10%이다. PEG-가교결합된 생성물 둘 다의 활성은 감소하였고, 여기서, 20 kDa PEG와 가교결합된 생성물(PEG (20 kDa)-GLP1-Fc)의 상대적 활성은 40.38%이고, 40 kDa PEG와 가교결합된 생성물(PEG (40 kDa)-GLP1-Fc)의 상대적 활성은 32.85%이다.
도 10a는 투여 24시간 후 C57BL/6 마우스에서 내당능 시험의 반응 곡선을 보여주고; 도 10b는 투여 24시간 후 C57BL/6 마우스 (AUC)의 내당능에 대한 효과를 보여주고; 도 10c는 투여 144시간 후 C57BL/6 마우스에서 내당능 시험의 반응 곡선을 보여주고; 도 10d는 투여 144시간 후 C57BL/6 마우스 (AUC)의 내당능에 대한 효과를 보여주고; 도 10e는 투여 168시간 후 C57BL/6 마우스에서 내당능 시험의 반응 곡선을 보여주고; 도 10f는 투여 168시간 후 C57BL/6 마우스 (AUC)의 내당능에 대한 효과를 보여주고; 도 10g는 투여 192시간 후 C57BL/6 마우스에서 내당능 시험의 반응 곡선을 보여주고; 도 10h는 투여 192시간 후 C57BL/6 마우스 (AUC)의 내당능에 대한 효과를 보여주고; 도 10i는 투여 216시간 후 C57BL/6 마우스에서 내당능 시험의 반응 곡선을 보여주고; 도 10j는 투여 216시간 후 C57BL/6 마우스 (AUC)의 내당능에 대한 효과를 보여주고; 도 10k는 투여 240시간 후 C57BL/6 마우스에서 내당능 시험의 반응 곡선을 보여주고; 도 10l은 투여 240시간 후 C57BL/6 마우스 (AUC)의 내당능에 대한 효과를 보여주고; 도 10m은 투여 후 C57BL/6 마우스의 체중 변화를 보여준다.
도 11은 유가식 (fed-batch) 발효 동안에 GLP1-L1-Fc4-L2-STG3 안정한 세포주 (클론 번호: P1-P132C7)의 성장 곡선 및 세포 생존능을 보여준다.
도 12는 유가식 발효 동안에 상이한 시점에서 GLP1-L1-Fc4-L2-STG3 안정한 세포주 (클론 번호: P1-P132C7)의 현미경 이미지를 보여준다. 도 12a는 배양 5일째 세포를 보여주고, 도 12b는 수거된 경우 (13일)의 세포를 보여준다.
도 13은 유가식 발효 동안에 GLP1-L1-Fc4-L2-STG3 안정한 세포주 (클론 번호: P1-P132C7)의 배양 상등액 중에 글루코스 대사를 보여준다.
도 14는 유가식 발효 동안에 15L 생물반응기에서 GLP1-L1-Fc4-L2-STG3 안정한 세포주 (클론 번호: P1-P132C7) pH 경향을 보여준다.
도 15는 15L 유가식 발효 브로쓰의 상등액 중에 표적 단백질 GLP1-L1-Fc4-L2-STG3의 SDS-PAGE 전기영동 결과를 보여준다. 레인 1은 정제된 샘플이고, 레인 2는 단백질 마커이고, 레인 3, 4 및 5는 제12, 제13 및 제14 일에 발효 브로쓰의 상등액이다.
도 16은 정제된 GLP1-L1-Fc4-L2-STG3 단백질의 SDS-PAGE 전기영동 (A) 및 SEC 분석 (B)의 결과를 보여준다.
도 17은 SDS 전기영동 및 RPC 분석에 의한 두 단백질의 가교결합율 검출 결과를 나타낸 것이다. 도 17a는 40 kDa PEG와 가교결합된 GLP1-L1-Fc4-L2-STG3 단백질의 SDS 시험이고, 도 17b는 40 kDa PEG와 가교결합된 GLP1-L1-Fc4-L2-STG3 단백질의 RPC 시험이다.
도 18은 가교결합 후 GLP1-L1-Fc4-L2-STG3의 음이온 교환 크로마토그램 (A) 및 SEC 시험 (B,C)의 결과를 보여준다.
도 19는 40 kDa PEG와 가교결합된 GLP1-L1-Fc4-L2-STG3의 활성 시험 결과를 보여준다. 둘라글루티드에 대한 비-가교결합된 기질 (GLP1-Fc)의 상대적 활성은 112.24%이다. PEG-가교결합된 생성물의 활성은 감소하였고, 여기서, 40 kDa PEG 와 가교결합된 GLP1-L1-Fc4-L2-STG3 (PEG (40 kDa)-GLP1-Fc)의 상대적 활성은 21.51%이다.
도 20a는 투여 1 내지 8일 후 C57BL/6 마우스 (AUC)의 내당능을 보여주고, 도 20b는 투여 후 C57BL/6 마우스의 체중 변화를 보여준다.
도 21a는 투여 1 내지 12일 후 STZ-유도된 II형 당뇨병 마우스의 혈당에 대한 효과를 보여주고, 도 21b는 투여 후 II형 당뇨병 마우스의 체중 변화를 보여준다.
본원에 사용된 용어는 당업계에서와 동일한 의미를 갖는다. 사용되는 용어의 의미를 정의하기 위해, 본원에서 일부 용어의 구체적 의미는 하기에 나타낸다. 본원에서의 정의가 용어의 통상적인 의미와 모순되는 경우, 본원의 정의가 우선한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "아미노산"은 천연 아미노산, 비천연 아미노산 및 아미노산 유사체 및 모든 이들의 D- 및 L-입체이성체를 언급한다. 비천연 아미노산은 아제티딘 카복실산, 2-아미노아디페이트, 3-아미노아디페이트, β-알라닌, 아미노프로피온산, 2-아미노부티르산, 4-아미노부티르산, 6-아미노카프로산, 2-아미노헵탄산, 2-아미노이소부티르산, 3-아미노이소부티르산, 2-아미노피멜산, 3급-부틸글라이신, 2,4-디아미노이소부티르산, 2,2’-디아미노피멜산, 2,3-디아미노프로피온산, N-에틸 글라이신, N-에틸 아스파라긴, 호모프롤린, 하이드록실라이신, 알로-하이드록시라이신, 3-하이드록시프롤린, 4-하이드록시프롤린, 이소데스모신, 알로-이소류신, N-메틸알라닌, N-메틸글라이신, N-메틸이소류신, N-메틸펜틸글라이신, N-메틸발린, 나프탈라닌, 노르발린, 노르류신, 오르니틴, 펜틸글라이신, 피페콜산 및 티오프롤린을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 아미노산 유사체는 천연 아미노산 및 비천연 아미노산을 포함하고, 이들의 C-말단 카복실 그룹, N-말단 아미노 그룹 또는 측쇄 그룹은 화학적으로 가역적으로 또는 비가역적으로 말단 캡핑되어 있거나, 또 다른 기능성 그룹, 예를 들어, 메티오닌 설폭사이드, 메티오닌 설폰, S-(카복시메틸)-시스테인, S-(카복시메틸)-시스테인 설폭사이드 및 S-(카복시메틸)-시스테인 설폰으로 화학적으로 변형된다.
본원에서 상호교환적으로 사용된 용어 "폴리펩타이드" 또는 "단백질"은 공유 결합 (예를 들어, 펩타이드 결합)에 의해 서로 연결된 적어도 2개의 아미노산 잔기의 화합물을 언급하고, 이는 재조합 폴리펩타이드, 천연 폴리펩타이드 또는 합성 폴리펩타이드일 수 있다. 추가로, 본 발명의 "폴리펩타이드" 또는 "단백질"은 또한 변이체 또는 이의 유사체, 즉, 하나 이상의 치환, 결실, 삽입, 융합, 절단 또는 이의 임의의 조합에 의해 아미노산 서열에서 다양한 폴리펩타이드를 언급한다. 폴리펩타이드 변이체는 완전히 기능적일 수 있거나 하나 이상의 활성이 부재일 수 있다. 완전 기능적 변이체는 예를 들어, 중요하지 않은 잔기 또는 중요하지 않은 영역에서 단지 보존적 치환 또는 변화를 함유할 수 있다. 기능적 변이체는 또한 유사한 아미노산의 치환을 함유할 수 있고 이는 기능에서 변화되지 않거나 유의적이지 않은 변화를 유도한다. 기능에 필수적인 아미노산은 부위-지시된 돌연변이유발 또는 글라이신 스캐닝 돌연변이유발과 같은 당업계에 공지된 방법에 의해 동정될 수 있다 (참조: Cunningham, B. and Wells, J., Science, 244: 1081-1085, 1989). 폴리펩타이드 활성을 위한 주요 부위는 예를 들어, 결정화, 핵 자기 공명 또는 광친화성 표지와 같은 구조적 분석에 의해 결정될 수 있다 (참조: Smith, L., et al., J. Mol. Biol., 224:899-904, 1992; and de Vos, A. et al., Science, 255: 306-312, 1992).
본원에 사용된 용어 "접합체"는 본원에 기재된 변형 그룹에 공유적으로 또는 비공유적으로 연결된 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 변이체에 의해 형성된 생성물을 언급한다.
일반적으로, 본원에 사용된 용어 "중합체"는 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 의미를 갖고 달리 명백하게 기재되지 않는 경우 중합체 자체 및 이의 말단-변형된 유도체 둘 다를 언급한다.
추가로, 폴리에틸렌 글리콜과 같은 중합체에 대해, 이들의 분자량을 결정하기 위한 많은 방법이 있다. 중합체는 특정 분포 영역내에서 상이한 중합도를 갖는 분자로 구성되기 때문에, 중합체의 분자량은 일반적으로 이들의 평균 분자량, 구체적으로, 수-평균 분자량 또는 중량-평균 분자량에 의해 나타낸다. 수-평균 분자량 및 중량-평균 분자량은 중합체의 중합도가 좁은 분포 영역을 갖는 중합체에 대해 크게 상이한 경우 일부 편차를 가질 수 있지만, 상기 2개는 동일한 경향이 있다. 구체적으로 달리 특정되지 않는 경우, 본원에 언급된 폴리에틸렌 글리콜과 같은 중합체에 대해, 이의 분자량을 언급하는 경우, 이것은 중량-평균 분자량 또는 수-평균 분자량일 수 있다.
GLP-1 수용체 효능제
글루카곤-유사 펩타이드는 글루카곤-유사 펩타이드-1 (GLP-1) 및 글루카곤-유사 펩타이드-2 (GLP-2)를 포함하고, 이들 둘 다는 프로글루카곤으로부터 유래하고 이는 158개 아미노산으로 이루어지고 상이한 펩타이드 쇄로 절단될 수 있다. GLP-1은 인슐린 분비를 촉진시키고, 췌장 β-세포를 보호하고, 글루카곤 분비 및 위 공복을 억제하고 식욕을 감소시키는 약리학적 효과를 갖기 때문에, 이것은 임상적으로 II형 당뇨병 및 비만의 치료에 사용될 수 있다. GLP-2는 소장의 성장을 촉진시키고, 세포 아폽토시스를 억제하고, 위 공복을 촉진시키고 식욕을 증가시키는 영양 인자이고 따라서 이것은 임상적으로 짧은-장 증후군의 치료에 사용될 수 있다. 인간 신체에서 생물학적 활성 GLP-1은 주로 GLP-1(7-36) 아미드 및 GLP-1(7-37)이다. 천연 GLP-1 (5분 미만의 반감기를 갖는)은 디펩티딜 펩티다제 IV (DPP-IV)에 의해 용이하게 가수분해되고 불활성화되며, 따라서 이것은 임상에서 사용되기 어렵다.
용어 "GLP-1 수용체 효능제"는 GLP-1 수용체를 활성화시킬 수 있는 분자를 언급하고, 예를 들어, 천연적으로 존재하는 GLP-1은 인간 또는 동물과 같은 상이한 공급원으로부터 유래하고 기능성 변이체, 단편 및 유사체는 천연 GLP-1 수용체 효능제 (예를 들어, GLP-1 및 엑센딘-4), 예를 들어, 리라글루티드, 릭시세나티드, 알비글루티드, 둘라글루티드, 세마글루티드 등의 야생형 서열의 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 이상)의 아미노산 치환, 결실 및/또는 첨가에 의해 형성된다.
GLP-1 융합 단백질
GLP-1 수용체 효능제 (예를 들어, GLP-1 및 이의 기능성 변이체 및 이의 단편)는 반감기를 증가시킬 수 있는 인간 면역글로불린의 Fc 단편과 같은 융합 파트너에 연결되어 융합 단백질을 형성한다. 본 발명에서 융합 단백질은 GLP-1 수용체 효능제 활성을 갖는 융합 단백질" 또는 "GLP-1 융합 단백질"로서 언급된다.
인간 면역글로불린 IgG는 디설파이드 결합에 의해 공유적으로 연결된 4개의 폴리펩타이드 (경쇄 및 중쇄의 2개의 동일한 카피물)로 구성된다. 파파인에 의한 IgG 분자의 단백질 용해는 2개의 Fab 단편 및 1개의 Fc 단편을 생성한다. Fc 단편은 디설파이드 결합에 의해 함께 연결된 2개의 폴리펩타이드로 구성된다. 각각의 폴리펩타이드는 N-에서 C-말단으로 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인으로 이루어진다. Fc 단편의 구조는 인간 면역글로불린의 모든 서브타입에서 거의 동일하다. IgG는 인간 혈액 중 가장 풍부한 단백질 중 하나이고, 이는 인간 혈청 중에서 총 면역글로불린의 70% 내지 75%를 구성한다.
모든 5개 유형의 면역글로불린 중에서 가장 긴 IgG의 순환 반감기는 21일에 달할 수 있다. IgG의 Fc 영역과 다른 단백질(예를 들어, 다양한 사이토킨 및 가용성 수용체)을 조합하여 융합 단백질을 형성하는 것으로 보고되었다 (참조: Capon et al., Nature, 337:525-531, 1989; Chamow et al., Trends Biotechnol., 14: 52-60, 1996; and U.S. Patent Nos. 5,116,964 and 5,541,087). 전형적인 융합 단백질은 IgG Fc 힌지 영역에서 시스테인 잔기에 의해 연결되어 IgG와 유사하지만 CH1 도메인 및 경쇄가 없는 분자를 형성하는 이량체 단백질이다. 구조적 상동성으로 인해, Fc 융합 단백질의 시험관내 약동학적 성질은 인간 IgG의 이소타입의 것과 매우 유사하다. 따라서, 인간 IgG의 Fc 영역에 연결된 hGH 융합 단백질의 작제는 hGH의 순환 반감기의 연장 및/또는 이의 생물학적 활성의 증가를 도와준다.
면역글로불린의 Fc 영역은 약제학적 담체로서 사용하기가 안전한데 그 이유는 이것이 신체에서 대사될 수 있는 생분해성 폴리펩타이드이기 때문이다. 추가로, 전체 면역글로불린 분자와 비교하여, 면역글로불린의 Fc 영역은 상대적으로 낮은 분자량을 갖고, 이는 접합체의 제조, 정제 및 생산에 유리하다. 면역글로불린 Fc 영역은 Fab 단편을 함유하지 않기 때문에 (이의 아미노산 서열은 항체 서브클래스에 따라 다양하고 따라서 고도로 이종성이다), 이것은 면역글로불린 Fc 영역이 물질의 동종성을 크게 증가시키고 낮은 항원성을 가질 수 있는 것으로 예상된다.
본 발명에 사용된 바와 같은 용어 "면역글로불린의 Fc 영역" 또는 "Fc 단편"은 중쇄 및 경쇄의 가변 영역, 중쇄 불변 영역 1 (CH1) 및 경쇄 불변 영역 1 (CL1)이 아닌 중쇄 불변 영역 2 (CH2) 및 중쇄 불변 영역 3 (CH3)을 함유하는 단백질을 언급한다. 이것은 또한 중쇄 불변 영역 내 힌지 영역을 함유할 수 있다. 추가로, 본 발명에 사용되는 Fc 단편은 이것이 기본적으로 천연 단백질의 활성과 유사하거나 이보다 양호한 생리학적 기능을 갖는 한, 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 없이 중쇄 불변 영역 1 (CH1) 및/또는 경쇄 불변 영역 1 (CL1)을 함유하는 Fc 영역의 일부 또는 전부를 함유할 수 있다. 더욱이, 이것은 CH2 및/또는 CH3의 아미노산 서열의 상대적으로 긴 결실을 갖는 Fc 단편일 수 있다. 따라서, 본 발명에 사용되는 면역글로불린 Fc 영역은 1) CH1 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인 및 CH4 도메인; 2) CH1 도메인 및 CH2 도메인; 3) CH1 도메인 및 CH3 도메인; 4) CH2 도메인 및 CH3 도메인; 5) 하나 이상의 도메인과 면역글로불린 힌지 영역의 (일부 또는 전부) 조합; 또는 6) 중쇄 불변 영역 및 경쇄 불변 영역의 임의의 도메인의 이량체를 포함할 수 있다.
추가로, 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 천연 아미노산 서열 및 이의 유도체 (돌연변이체)를 포함한다. 아미노산 잔기들 중 하나 이상의 결실, 삽입, 비-보존성 또는 보존성 치환, 또는 이의 조합으로 인해, 아미노산 서열 유도체는 천연 아미노산 서열과 상이한 서열을 가질 수 있다. 예를 들어, IgG Fc에 대해, 결합에 중요한 것으로 공지된 위치 214 내지 238, 297 내지 299, 318 내지 322, 또는 327 내지 331에서 아미노산 잔기들은 변형을 위해 적합한 표적으로서 사용될 수 있다. 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 또한 다양한 다른 유도체를 포함할 수 있고, 이들은 디설파이드 결합을 형성할 수 있는 영역이 없는 것들, 천연 Fc의 N-말단에서 여러 아미노산 잔기 결실을 갖는 것들 또는 천연 Fc의 N-말단에 추가의 메티오닌 잔기를 갖는 것들을 포함한다. 추가로, 이펙터 기능을 제거하기 위해, 결실은 보체 결합 부위, 예를 들어, C1q 결합 부위 및 ADCC 부위에서 디자인될 수 있다. 면역글로불린 Fc 영역의 상기 유도체를 제조하기 위한 기술은 WO 97/34631 및 WO 96/32478에 기재되어 있다.
단백질 및 펩타이드에 대해, 일반적으로 분자 활성을 변화시키지 않는 아미노산 치환은 당업계에 공지되어 있다 (참조: H. Neurath, RL Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적인 치환은 어느 하나의 방식이든 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu 및 Asp/Gly이다.
필요하다면, Fc 영역은 인산화, 황화, 아크릴화, 당화, 메틸화, 파르네실화, 아세틸화 및 아미드화와 같이 변형되도록 할 수 있다.
Fc 유도체는 본 발명에서 Fc 영역과 동일한 생물학적 활성을 갖거나 이의 상응하는 Fc 영역 보다 개선된 구조적 안정성 (예를 들어, 열. pH 등에 대한 구조적 안정성)을 갖는다.
추가로, 이들 Fc 영역은 인간, 및 소, 염소, 돼지, 마우스, 토끼, 햄스터, 래트 및 기니아 피그를 포함하는 다른 동물들로부터 단리된 천연 형태로부터 유래하거나 형질전환된 동물 세포 또는 미생물의 재조합체 또는 유도체로부터 유래할 수 있다. 본원에서, Fc 영역은 인간 또는 동물 유기체로부터 온전한 면역글로불린을 분리하고 이들을 단백질 용해 효소로 처리함에 의해 천연 면역글로불린으로부터 수득될 수 있다. 파파인은 천연 면역글로불린을 Fab 및 Fc 영역으로 분해하고 펩신 처리는 pFc' 및 F(ab')2 단편을 생성시킨다. Fc 또는 pFc' 단편은, 예를 들어, 크기 배제 크로마토그래피에 의해 단리될 수 있다.
추가로, 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 천연의 당 쇄, 또는 천연 형태와 비교하여 증가되거나 감소된 당 쇄를 갖는 형태일 수 있거나 탈당화된 형태일 수 있다. 면역글로불린 Fc 당 쇄의 증가, 감소 또는 제거는 화학적 방법, 효소적 방법 및 미생물을 사용한 유전학적 가공 방법과 같이 당업계에 통상적으로 사용되는 방법에 의해 달성될 수 있다. Fc 단편으로부터 당 쇄의 제거는 보체 (C1q)에 대한 결합 친화성에서의 유의적 감소 및 항체-의존성 세포-매개된 세포독성 또는 보체-의존성 세포독성의 감소 또는 손실을 유발함으로써 불필요한 생체내 면역 반응은 유도되지 않는다. 이러한 관점에서, 탈당화되거나 당화되지 않은 형태에서 면역글로불린 Fc 영역은 약물로서 사용하기 위한 본 발명의 목적을 위해 보다 적합할 수 있다.
본 발명에 사용된 바와 같은 용어 "탈당화"는 Fc 영역으로부터 당 모이어티의 효소적 제거를 의미하고, 용어 "당화되지 않은"은 Fc 영역이 당 제거된 형태로 (예를 들어, 포유동물 세포와 같은 진핵 세포에서 또는 이. 콜라이와 같은 원핵 세포에서) 제조됨을 의미한다.
추가로, 면역글로불린 Fc 영역은 IgG, IgA, IgD, IgE, 및 IgM으로부터 유래된 Fc 영역일 수 있거나, 조합 또는 이의 하이브리드에 의해 제조될 수 있다. 바람직하게, 이것은 IgG 또는 IgM (인간 혈액 중에 가장 풍부한 단백질 중 2개), 가장 바람직하게 IgG (리간드-결합 단백질의 반감기를 연장시키는 것으로 공지된)로부터 유래한다.
본 발명에 사용된 바와 같은 용어 "조합"은 함께 연결된 2개 이상의 단일쇄 폴리펩타이드에 의해 형성된 이량체 또는 다량체를 의미하고, 여기서, 상기 단일쇄 폴리펩타이드는 동일하거나 상이한 면역글로불린 Fc 영역으로부터 유래할 수 있다. 즉, 이량체 또는 다량체는 IgG Fc 단편, IgA Fc 단편, IgM Fc 단편, IgD Fc 단편, 및 IgE Fc 단편으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 2개 이상의 단편에 의해 형성될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 GLP-1 융합 단백질은 동종이량체이다.
또 다른 구현예에서, GLP-1 융합 단백질은 소르타제 인지 부위를 함유하는 단편, 즉, 본 발명에 기재된 "ST" 단편에 추가로 연결된다.
소르타제 A 및 소르타제 B를 포함하는 용어 "소르타제"는 세균 표면 단백질을 세포벽 상에 부착시키는 기능을 갖는 것으로 처음 발견되었다. 표면 단백질의 "분류 신호"는 3개의 주요 부분으로 이루어진 것으로 동정되었다: LPXTG 서열, 소수성 서열 및 대부분의 경우에 양전하 전기들의 꼬리. LPXTG 서열은 매우 보존적이고 소르타제에 의해 인지될 수 있고, 이어서, 트랜스펩티다제의 시스테인 (Cys)은 친핵성 그룹으로 작용하여 기질 (예를 들어, 표면 단백질)의 C-말단 모티프 LPXTG의 트레오닌과 글라이신 사이의 펩타이드 결합을 공격하여 펩타이드 결합이 절단 (아실화)되도록 하여, 이는 이어서 아실라제 중간체를 생성하고 최종적으로 펩타이드는 세포벽 또는 핌브리아 서브유닛에 공유적으로 연결되어 기능 (탈아실화)한다.
본 발명의 하나의 구현예에서, 소르타제 A는 PEG의 부위-지시된 커플링을 위해 사용된다. 특정 구현예에서, 소르타제 A 코어 인지 부위 LPETG, LPETGG, 및 LPETGGG가 사용된다. 또 다른 특정 구현예에서, 상이한 친화성 태그는 LPETGGHHHHHH, LPETGGWSHPQFEK 등과 같은 인지 부위에 첨가될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 GLP-1 융합 단백질은 예를 들어, 통상적인 기술에 의해 적합한 원핵 또는 진핵 숙주 세포에서 단백질을 발현하고 본 발명의 GLP-1 융합 단백질을 단리함을 포함하는 재조합 방법에 의해 제조된다. 예를 들어, 펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 먼저 화학적 합성 방법에 의해 합성될 수 있고, 이어서 상기 서열은 적합한 프로모터의 제어 하에 발현을 위해 적합한 발현 벡터에 클로닝될 수 있다. 대안적으로, PCR 돌연변이유발과 같은 돌연변이유발 방법을 사용하여 야생형 GLP-1로부터 GLP-1을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 수득할 수 있고, 이어서 서열과 융합 단백질을 작제하기 위한 다른 요소들의 서열은 적합한 프로모터의 제어하에 발현을 위해 적합한 발현 벡터에 클로닝될 수 있다. 이들 기술은 완전하게 당업자의 능력 범위 내에 있고, 당업계에서 다양한 기술이 있다.
적합한 진핵 숙주 세포는 포유동물 세포, 예를 들어 CHO, COS, HEK 293, BHK, SK-Hep 및 HepG2를 포함한다. 세포는 바람직하게 본 발명의 GLP-1 융합 단백질을 발현하기 위해 적합한 조건하에서 성장하고 있다. 본 발명의 GLP-1 융합 단백질을 제조하거나 단리하기 위해 사용되는 시약 및 조건에 관하여, 어떠한 특별한 제한이 없고, 당업계에 공지되어 있거나 시판되는 임의의 시스템이 적용될 수 있다. 바람직한 구현예에서, GLP-1 융합 단백질은 당업계에 기재된 방법에 의해 수득된다.
GLP-1 융합 단백질을 제조하기 위해 사용될 수 있고, 진핵 및 원핵 발현 벡터로부터 선택될 수 있는 다양한 발현 벡터가 있다. 원핵 발현 벡터는 예를 들어, pRSET, pET, 및 pBAD와 같은 플라스미드를 포함할 수 있고, 여기서, 사용될 수 있는 프로모터는 예를 들어, lac, trc, trp, recA, 또는 araBAD를 포함한다. 진핵 발현 벡터는 다음을 포함한다: (i) pAO, pPIC, pYES, 및 pMET와 같은 효모에서 발현을 위해 사용되는 벡터 (여기서, AOX1, GAP, GAL1, AUG1 등과 같은 프로모터가 사용될 수 있다); (ii) pMT, pAc[델타], plB, pMIB, pBAC 등과 같은 곤충 세포에서 발현을 위해 사용되는 벡터 (여기서, PH, p10, MT, Ac5, OplE2, gp64, polh 등과 같은 프로모터가 사용될 수 있다); 및 (iii) pSVL, pCMV, pRc/RSV, pcDNA3, pBPV 등과 같은 포유동물 세포에서 발현을 위해 사용되는 벡터 및 백시니아 바이러스, 아데노-관련 바이러스, 헤르페스 바이러스, 레트로바이러스 등과 같은 바이러스 시스템으로부터 유래된 벡터 (여기서, CMV, SV40, EF-1, UbC, RSV, ADV, BPV 및 β-액틴과 같은 프로모터가 사용될 수 있다). 바람직한 구현예에서, GLP-1 융합 단백질은 원핵 또는 진핵 세포 시스템에서 발현되고, 코돈-최적화된 암호화 서열이 사용된다. 바람직한 구현예에서, GLP-1 융합 단백질을 발현시키기 위한 서열은 분리 및 정제를 위해 GLP-1 융합 단백질을 세포로부터 세포의 외부로의 분비를 촉진시키기 위해 리더 펩타이드 및/또는 신호 펩타이드를 함유한다. 또 다른 바람직한 구현예에서, GLP-1 융합 단백질을 발현하는 서열은 리더 펩타이드 및/또는 신호 펩타이드를 함유하지 않고, 세포 외부로 분비되는 대신, GLP-1 융합 단백질은 분리 및 정제를 위해 세포를 용해시킴에 의해 수득된다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 융합 단백질에서, GLP-1 단백질 및 Fc 단편은 직접 연결된다. 또 다른 구현예에서, GLP-1 단백질 및 Fc 단편은 제1 링커 L1을 통해 연결된다. 또 다른 구현예에서, Fc 단편 및 소르타제 인지 서열을 함유하는 단편은 직접 연결된다. 또 다른 구현예에서, Fc 단편 및 소르타제 인지 서열을 함유하는 단편은 제2 링커 L2를 통해 연결된다.
바람직한 구현예에서, 제1 링커 L1 및/또는 제2 링커 L2는 1, 2, 3개 이상의 아미노산을 함유하는 펩타이드이다. 보다 바람직하게, 제1 링커 L1 및/또는 제2 링커 L2는 A, T, G 및/또는 S, 예를 들어 (GS)n를 함유하는 가요성 펩타이드이고, 여기서, n은 1 내지 50의 정수, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10이다.
예를 들어, 제1 링커 L1은 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된다:
GSGGGSGGGGSGGGGS (서열번호 9),
GSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (서열번호 10),
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (서열번호 11),
GSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (서열번호 12),
GGGSGGGSGGGSGGGSGGGS (서열번호 13),
PRFQDSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ (서열번호 14),
SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ (서열번호 15),
SSSSKAPPPS (서열번호 16),
SRLPGPSDTPILPQ (서열번호 17) 및
GGGGSGGGGSGGGGSA (서열번호 18).
예를 들어, 제2 링커 L2는 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된다:
GSGGGSGGGGSGGGGS (서열번호 9),
GGGGSGGGGSGGGGSA (서열번호 18),
GGGGS (서열번호 19),
GGGGSGGGGS (서열번호 20) 및
GGGGSGGGGSGGGGS (서열번호 21).
GLP-1 융합 단백질 접합체
본 발명의 GLP-1 융합 단백질은 하나 이상의 중합체 그룹과 접합되어 GLP-1 융합 단백질 접합체를 형성할 수 있고, 여기서, 상기 중합체는 융합 단백질의 말단, 예를 들어, N-말단 또는 C-말단에 접합된다. 본원에 사용된 "중합체"는 바람직하게 생리학적으로 허용될 수 있고, 이는 수용액 또는 현탁액 중에 가용성이고 약제학적 유효량의 GLP-1 융합 단백질 접합체의 투여 후 포유동물에 대한 부작용과 같은 음성 효과가 없는 것들을 포함한다. 본 발명에 사용될 수 있는 중합체는 특히 제한되지 않는다. 중합체는 일반적으로 바람직하게 2 내지 약 3000개 반복 유닛을 갖는다. 중합체 그룹은 천연 또는 합성 중합체로부터 선택될 수 있고, 이의 예는 예를 들어, 폴리사카라이드, 폴리알킬렌 글리콜, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 폴리프로필렌 글리콜 (PPG), 폴리에틸렌 옥사이드(PEO), 에틸렌 글리콜 및 프로필렌 글리콜의 공중합체, 폴리비닐 알콜 및 이의 임의의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 GLP-1 융합 단백질 접합체는 변형을 위해 하나 이상의 PEG 그룹과 접합된다.
본 발명에서, 중합체는 특정 구조로 제한되지 않고, 이것은 선형(예를 들어, 알콕시 PEG 또는 이기능성 PEG), 분지된 또는 다중-아암된(예를 들어, 폴리올 코어에 연결된 바이푸르화된 PEG 또는 PEG), 수지상일 수 있거나 분해성 연결을 가질 수 있다. 추가로, 중합체의 내부 구조는 임의의 다수의 상이한 패턴으로 구성될 수 있고, 이들은 동종중합체, 교호 공중합체, 무작위 공중합체, 블록 공중합체, 교호 3원 중합체, 무작위 3원 중합체, 블록 3원 중합체 등으로부터 선택될 수 있다. 중합체는 또한 폴리(알킬렌 옥사이드) 중합체, 폴리말레산, 폴리(D,L-알라닌) 등을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 중합체는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 또는 이의 유도체, 예를 들어, 메톡시 폴리에틸렌 글리콜(mPEG)이다. 본원에서, 구체적으로 시사되지 않는 경우, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)은 말단 그룹으로서 하이드록실 그룹을 갖거나 말단 그룹으로서 다른 그룹을 갖는 것들을 포함한다. 다른 그룹은 알콕시, 사이클로알콕시, 사이클로알킬옥시, 알케닐, 아릴옥시 또는 아르알킬옥시를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 이들 PEG 분자 유형은 당업계에 공지되어 있고 폴리펩타이드 변형에서 통상적으로 사용된다. PEG 측쇄는 선형, 분지된, 바이푸르화될 수 있거나 다중 아암으로 구성될 수 있다. 상이한 폴리에틸렌 글리콜은 상이한 중합체 쇄 길이 및 중합체 구조를 가질 수 있다.
본 발명에서, PEG의 분자량에 대해 특정 제한이 없고, 이의 분자량은 0.1 내지 200 kDa, 예를 들어, 1 내지 150 kDa, 2 내지 100 kDa, 3 내지 80 kDa, 4 내지 50 kDa, 또는 5 내지 40 kDa 범위일 수 있다. 다른 유용한 PEG는 예를 들어, WO 03/040211, US 6,566,506, US 6,864,350, 및 US 6,455,639에 기재된 것들을 포함한다. 특히, PEG는 화학식 HO-CH2CH2O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-OH를 갖고, 여기서, n의 범위는 약 5 내지 4000이다. 상기 언급된 바와 같이, 본 발명의 PEG는 다른 말단 그룹을 갖는 PEG, 예를 들어, 메톡시 PEG, 분지된 PEG, 바이푸르화된 PEG 등을 포함한다. 적합한 분지된 PEG는 그 전체 기재가 본원에 참조로 인용된 미국 특허 제5,932,462호에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다. 바이푸르화된 PEG는 중합체 쇄의 하나의 말단 근처에 분지를 갖는 PEG를 언급하고 바이푸르화된 PEG의 주쇄는 선형 또는 분지형일 수 있다.
중합체 그룹과 접합된 생활성 분자에서, 중합체 그룹의 분자량이 증가함으로써 접합체의 생물학적 활성은 점진적으로 감소하는 것으로 당업자에게 공지되어 있다 (참조: Bailon et al. al. Rational design of potent, long-lasting form of interferon: A 40 kDa branched polyethylene glycol-conjugated interferon α-2a for the treatment of hepatitis C. Bioconjugate Chem 2001; 12: 195-202; Bowen et al. Relationship between molecular mass and duration of activity of polyethylene glycol conjugated granulocyte colony-stimulating factor mutein. Experimental Hematology 1999; 27: 425-32; and Bailon et al. PEG-modified biopharmaceuticals. Expert Opin Deliv. 2009; 6: 1-16). 또한, 중합체 그룹의 분자량이 증가함으로써 접합체의 생물학적 반감기 및/또는 혈장 반감기가 상응하게 증가하는 것으로 당업자에게 공지되어 있다.
긴 기간 동안 안정한 치료학적 효과를 제공하고 환자의 순응성을 개선시키기 위해 투여 횟수를 감소시키기 위해, GLP-1 수용체 효능제의 유의적 활성을 보유하면서 가능한 한 많이 GLP-1 융합 단백질 접합체의 생물학적 반감기를 연장하는 것이 바람직할 수 있다. 따라서, 하나의 구현예에서, 본 발명은 GLP-1 수용체 효능제의 연장된 생물학적 반감기 및 유의적 활성을 갖는 GLP-1 융합 단백질 접합체를 제공한다.
구체적 구현예에서, 본 발명의 GLP-1 융합 단백질 접합체에서, 하나 이상의 중합체 그룹 (예를 들어, PEG)의 분자량은 ≥1, ≥10, ≥ 20, ≥30, ≥40, ≥50, ≥60, ≥70, ≥80, ≥90, ≥100, ≥110, ≥120, ≥130, ≥140, ≥150, 또는 ≥160 kDa, 예를 들어, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100 kDa, 또는 상기 값의 임의의 2개 값 사이의 값이다. GLP-1 융합 단백질 접합체에서 접합된 중합체 그룹의 분자량을 기재하는 경우, 접합체 내 다수의 접합된 중합체 그룹이 있다면, 접합체에서 모든 접합된 중합체 그룹의 분자량의 합계가 달리 특정되지 않은 경우 계산되는 것으로 주지되어야 한다.
본 발명에 사용된 중합체는 선행 기술에 공지되어 있고 이것은 예를 들어, 상업적 경로 (예를 들어, CarboMer, Inc., JT Baker, The Dow Chemical Company, etc.)를 포함하는 다양한 방식을 통해 수득될 수 있거나, 이것 자체는 예를 들어, EP1245608에 기재된 바와 같이 당업계에 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다. 본 발명은 임의의 특정 방법에 의해 제조된 중합체에 제한되지 않는다.
접합 반응 후, 접합체는 예를 들어, 이의 모두가 당업자의 능력 범위 내에 있는 한외여과, 투석, 또는 크로마토그래피 등을 포함하는 적합한 방법에 의해 분리될 수 있다.
약제학적 조성물
본 발명의 GLP-1 융합 단백질 또는 GLP-1 융합 단백질 접합체는 예를 들어, 혈당을 감소시키는 용도를 포함하여 다수의 응용을 가질 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 혈당을 감소시키기 위한 약제학적 조성물을 제공하고, 상기 조성물은 본 발명의 치료학적 유효량의 융합 단백질 또는 접합체 및 임의로 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 바람직하게, 약제학적 조성물은 당뇨병의 치료를 위해, 보다 바람직하게 I형 당뇨병 및/또는 II형 당뇨병의 치료를 위해 및 특히 바람직하게 II형 당뇨병의 치료를 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 치료학적 유효량의 융합 단백질 또는 접합체는 투여 경로, 대상체의 유형 및 고려되는 특정 포유동물의 신체 특성에 의존한다. 이들 인자 및 양을 결정하는 것과의 이들의 관계는 의약 분야의 당업자에게 널리 공지되어 있다. 투여량 및 투여 방법은 대상체에 펩타이드를 전달하는 최적의 효능을 달성하기 위해 조정될 수 있지만 이는 체중, 식이, 동시 의약처리 및 다른 인자와 같이 의약 분야의 당업자에게 널리 공지된 인자들에 의존한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 조합 치료요법, 즉 하나 이상의 다른 제제와 조합하여 투여될 수 있고, 여기서, 상기 약제학적 조성물 및 다른 제제는 함께 또는 순차적으로 투여된다. 다른 구현예에서, 다른 제제는 본 발명의 융합 단백질, 접합체 또는 약제학적 조성물의 하나 이상의 투여 전, 투여 동안에 또는 투여 후 투여될 수 있다. 본 발명에 사용될 수 있는 다른 제제는 예를 들어, 혈당을 감소시킬 수 있는 제제, 예를 들어, 인슐린, 인슐린 유사체, 덱스트린 효능제, 및 콜레시스토키닌, 및/또는 질환을 치료하기 위한 다른 화합물 또는 조성물을 포함한다. 바람직하게, 상기 조합 투여는 조합되거나 심지어 상승작용 효과를 달성할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, "약제학적으로 허용되는 담체" 또는 "생리학적으로 허용되는 담체"는 상호교환적으로 사용될 수 있고, 이는 임의의 및 모든 생리학적으로 허용되는 염, 용매, 분산 매질, 코팅, 항세균 및 항진균 제제, 등장성 및 흡수 지연제 등 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 담체는 정맥내, 근육내, 피하, 비경구, 척수 또는 상피 투여 (예를 들어, 주사 또는 주입에 의해)를 위해 적합하다. 투여 경로에 의존하여, 치료학적 제제는 특정 재료로 코팅하여 치료학적 제제를 불활성화시킬 수 있는 산 및 다른 중화 조건의 작용으로부터 치료학적 제제를 보호할 수 있다.
투여되는 경우, 본 발명의 약제학적 제제는 약제학적으로 허용되는 조성물 중에서 약제학적으로 허용되는 양으로 투여된다. 용어 "약제학적으로 허용되는"은 활성 성분의 생물학적 활성 효능을 방해하지 않는 비-독성 물질을 의미한다. 상기 제제는 일반적으로 염, 완충제, 보존제, 허용되는 담체, 및 임의로 다른 치료학적 제제, 예를 들어, 애쥬반트, 케모킨 및 사이토킨을 포함하는 보충 면역 증진제를 함유한다. 약물에 사용되는 경우, 염은 약제학적으로 허용가능해야만 한다. 그러나, 약제학적으로 허용되지 않는 염은 이의 약제학적으로 허용되는 염을 제조하기 위해 간편하게 사용될 수 있고 따라서 이들은 본 발명의 범위로부터 배제되지 않는다.
필요하다면, 본 발명의 GLP-1 융합 단백질 또는 GLP-1 융합 단백질 접합체는 약제학적으로 허용되는 담체와 조합될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "약제학적으로 허용되는 담체"는 하나 이상의 허용되는 고체 또는 액체 충전제, 희석제 또는 캡슐화 물질을 언급하고, 이들은 인간과 같은 포유동물에 투여하기 위해 적합하다. 용어 "담체"는 유기 또는 무기, 천연 또는 합성 성분을 의미하고 이들은 적용을 촉진시키기 위해 활성 성분과 조합된다. 약제학적 조성물의 성분들은 또한 목적하는 약물의 치료학적 효과를 유의적으로 파괴할 수 있는 상호작용이 없는 형태로 블렌딩될 수 있다.
바람직하게, 본 발명의 약제학적 조성물은 완충 시스템을 함유할 수 있고, 바람직하게 완충 시스템은 약 3.0 내지 약 6.0의 pH를 갖는 아세테이트 완충 용액 또는 약 5.0 내지 약 9.0의 pH를 갖는 포스페이트 완충 용액이다. 일부 구체적 구현에에서, 적합한 완충액은 아세테이트, 시트레이트, 보레이트 및 포스페이트를 포함한다.
임의로, 약제학적 조성물은 또한 적합한 보존제, 예를 들어, 벤즈알코늄 클로라이드, 클로로-3급-부탄올, 파라벤 및 티메로살을 함유할 수 있다.
약제학적 조성물은 유닛 용량 형태로 간편하게 제공될 수 있고 약제학적 분야에서 임의의 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. 상기 방법은 활성제를 하나 이상의 악세서리 성분을 함유하는 담체와 조합하는 단계를 포함한다. 일반적으로, 상기 조성물은 활성 화합물을 액체 담체 및 미세하게 세분된 고체 담체 중 하나 또는 둘 다와 친밀하게 조합함에 이어서 필요한 경우 생성물을 성형함에 의해 제조된다.
비경구 투여를 위해 적합한 약제학적 조성물은 하나 이상의 융합 단백질 또는 접합체를 함유하는 멸균 수성 또는 비-수성 제형일 수 있다. 일부 구현예에서, 제형은 대상체의 혈액과 등장성이다. 상기 제제는 적합한 분산제 또는 습윤화제 및 현탁제를 사용한 공지된 방법에 따라 제형화될 수 있다. 멸균 주사 제제는 또한 비독성의 비경구적으로 허용되는 희석제 또는 용매 중에 멸균 주사 용액 또는 현탁액, 예를 들어, 1,3-부탄디올 중에 용액일 수 있다. 사용될 수 있는 허용 가능한 담체 및 용매는 물, 링거 용액, 및 등장성 염화나트륨 용액을 포함한다. 추가로, 멸균 고정 오일은 통상적으로 용매 또는 현탁 매질로서 사용된다. 이러한 이유 때문에, 임의의 온화한 고정 오일을 사용할 수 있고 이는 합성 모노- 또는 디-글리세리드를 포함한다. 또한, 올레산과 같은 지방산은 주사가능한 제형으로서 사용될 수 있다. 경구, 피하, 정맥내, 근육내 등의 투여를 위해 적합한 담체 제형은 문헌 (참조: Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA)에서 찾을 수 있다.
본 발명의 융합 단백질 또는 접합체는 신속한 방출, 예를 들어, 이식, 경피 패취제 및 마이크로캡슐화된 전달 시스템을 포함하는 제어된 방출 제형과 같은 신속한 방출로부터 이를 보호하는 담체와 함께 제조될 수 있다. 생분해성 및 생적합성 중합체, 예를 들어, 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리언하이드라이드, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산이 사용될 수 있다. 상기 제형을 제조하기 위한 많은 방법은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌 (Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978, etc.)을 참조한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 시간 경과에 따라 주사 또는 점진적 주입을 포함하는 임의의 통상적인 경로에 의해 투여될 수 있다. 예를 들어, 투여는 경구, 정맥내, 복막내, 근육내, 강내, 종양내 또는 경피일 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 유효량으로 투여된다. "유효량"은 단독으로 또는 추가의 용량 및/또는 다른 치료학적 제제와 함께 목적하는 반응 (예를 들어, 대상체에서 혈당 수준을 감소시키는)을 생성하는, 본원에 제공된 임의의 융합 단백질 또는 접합체의 양이다. 이것은 단지 일시적으로 당뇨병의 발병을 서행시키거나 일부 구현예에서 당뇨병의 발병을 영구적으로 정지시킴을 포함할 수 있다.
물론, 상기 양은 치료될 특정 질환, 질환의 중증도, 개별 환자 파라미터(연령, 신체 조건, 신장 및 체중을 포함하는), 치료 지속기간, 동시 치료의 특성(경우에 따라), 특정 투여 경로 및 의료 및 건강 근로자들의 지식 범위 내에 유사 인자들에 의존한다. 이들 인자들은 당업자에게 널리 공지되어 있고 단지 통상의 실험만을 사용하여 알 수 있다. 일반적으로 각각의 성분 또는 이의 조합물의 최대 용량을 사용하는 것이 바람직하고 즉, 최고의 안전한 용량은 합리적 의학적 판단을 기초로 한다. 그러나, 당업자는 환자가 보다 낮은 용량 또는 의학적, 정신학적 또는 기본적으로 임의의 다른 이유 때문에 허용될 수 있는 용량을 요구할 수 있음을 이해할 수 있다.
이전의 방법에 사용되는 약제학적 조성물은 바람직하게 단독으로 또는 목적하는 반응을 생성하기 위해, 예를 들어, 혈당을 감소시키기 위해 환자에게 투여하기 위해 적합한 중량 유닛 또는 용적 유닛으로 또 다른 제제와 조합하여 멸균성이고 유효량의 융합 단백질 또는 접합체를 함유한다.
대상체에게 투여되는 융합 단백질 또는 접합체의 용량은 상이한 파라미터에 따라, 특히, 투여 방식 및 대상체의 상태에 따라 선택될 수 있다. 다른 인자들은 요구되는 치료 기간을 포함한다. 적용된 초기 용량에서 대상체 내 반응이 불충분한 경우, 환자의 관용성 내 보다 높은 용량 (또는 상이한 보다 국소화된 전달 경로에 의해 달성되는 효과적인 보다 높은 양)이 적용될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 0.20 mg/㎖ ~ 5 mg/㎖의 GLP-1 융합 단백질 및/또는 4 mg/㎖ ~ 40 mg/㎖의 GLP-1 융합 단백질 접합체, 바람직하게 0.20 mg/㎖ ~ 5 mg/㎖의 GLP-1 융합 단백질 및/또는 4 mg/㎖ ~ 40 mg/㎖의 GLP-1 융합 단백질 접합체, 보다 바람직하게 0.5 mg/㎖ ~ 2 mg/㎖의 GLP-1 융합 단백질 및/또는 10 mg/㎖ ~ 20 mg/㎖의 GLP-1 융합 단백질 접합체를 함유한다. 일반적으로, 본 발명의 GLP-1 융합 단백질 또는 GLP-1 융합 단백질 접합체의 용량은 약 10 μg/kg 환자의 체중 내지 약 100,000 μg/kg 환자의 체중 범위일 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 용량은 약 0.1 mg/kg 내지 약 20 mg/kg 범위일 수 있다. 다른 구현예에서, 용량은 약 0.1 mg/kg 내지 5 mg/kg, 0.1 mg/kg 내지 10 mg/kg, 또는 0.1 mg/kg 내지 15 mg/kg 범위일 수 있다. 다른 구현예에서, 용량은 약 1 mg/kg 내지 5 mg/kg, 5 mg/kg 내지 10 mg/kg, 10 mg/kg 내지 15 mg/kg, 또는 15 mg/kg 내지 20 mg/kg 범위일 수 있다. 다른 구현예에서, 용량은 약 0.1 mg/kg, 0.5 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 5 mg/kg, 7 mg/kg, 10 mg/kg, 12 mg/kg, 15 mg/kg, 17 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg, 또는 30 mg/kg이다. 또 다른 구현예에서, 용량은 약 1 mg/kg, 3 mg/kg, 5 mg/kg, 또는 6 mg/kg이다. 조성물의 성질을 기준으로, 용량은 연속으로 (예를 들어, 연속 펌프에 의해) 또는 주기적 간격으로 전달될 수 있다. 일부 구현예에서, 정맥내로 투여되는 경우에, 본 발명의 GLP-1 융합 단백질 또는 GLP-1 융합 단백질 접합체의 용량은 0.1 내지 20 mg/kg 또는 본원에서 임의의 값일 수 있다. 특정 조성물의 다중 투여를 위해 이상적인 시간 간격은 과도한 실험 없이 당업자에 의해 결정될 수 있다. 제공된 조성물의 다른 투여 용법은 당업자에게 공지되어 있고, 여기서, 용량, 투여 스케줄, 투여 부위, 투여 방식 등이 이전의 개시내용과는 상이할 수 있다. 하나의 구현예에서, 용량은 정맥내로 투여된다. 또 다른 구현예에서, 투여 용법은 단일 정맥내 투여이다.
GLP-1 융합 단백질 또는 GLP-1 융합 단백질 접합체(예를 들어, 약제학적 조성물 중에) 및 사용 지침서를 포함하는 키트는 또한 본 발명의 범위 내에 있다. 키트는 추가로 적어도 하나의 다른 제제, 예를 들어, 혈당을 감소시키는 하나 이상의 다른 제제를 함유할 수 있다. 또 다른 예에서, 키트는 하나 이상의 컨테이너 장치 또는 일련의 컨테이너 장치 (예를 들어, 시험 튜브, 튜브, 플라스크, 병, 시린지 등)를 단단히 유지하기 위해 격실화된 담체를 포함할 수 있다. 키트의 성분들은 수성 매질 또는 동결건조된 형태로 팩키징될 수 있다.
상기 조성물은 동결건조된 형태 또는 수성 매질로 제공될 수 있다.
바람직하게, 상기 대상체는 척추동물, 보다 바람직하게, 포유동물, 가장 바람직하게 인간이지만 대상체는 또한 다른 동물, 예를 들어, 가정용 동물(예를 들어, 개, 고양이 등), 가축 (예를 들어, 소, 양 및 염소, 돼지, 말 등) 또는 실험 동물 (예를 들어, 몽키, 래트, 마우스, 토끼, 기니아 피그 등)일 수 있다.
본 발명의 GLP-1 융합 단백질 및/또는 GLP-1 융합 단백질 접합체는 단독으로 투여될 수 있지만, 바람직하게 계획된 투여 경로에 따라 선택된 적합한 약제학적 부형제, 희석제 또는 담체를 일반적으로 함유하는 약제학적 조성물로서 투여되고 이것은 임의의 적합한 방식으로 치료를 필요로 하는 환자/대상체에게 적용될 수 있다. 정확한 용량은 GLP-1 융합 단백질 및 GLP-1 융합 단백질 접합체의 정확한 특성을 포함하는 다수의 인자들에 의존한다.
일부 적합한 투여 방식은 (제한 없이) 경구, 직장, 비강, 국소 (협측 및 설하를 포함하는), 경피, 질 또는 비경구 (피하, 근육내, 정맥내, 피내, 척추강내 및 경막외를 포함하는) 투여를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 등장성 개질제 및/또는 보존제를 함유하고, 바람직하게 등장성 개질제는 슈크로스, 만니톨, 염화나트륨 및 글리세롤 중 하나 이상이고 보존제는 m-크레졸, 벤질 알콜, 메틸 p-하이드록시벤조에이트, 에틸 p-하이드록시벤조에이트, 프로필 p-하이드록시벤조에이트 및 부틸 p-하이드록시벤조에이트로부터 선택된다. 당업자는 예를 들어, 생리학적 식염수, 링거 주사액 및 락테이트화된 링거 주사액과 같은 등장성 부형제를 사용함에 의해 GLP-1 융합 단백질 또는 본 발명의 GLP-1 융합 단백질을 위해 적합한 용액을 제조할 수 있다. 요건에 따라, 안정화제, 완충제, 항산화제 및/또는 다른 첨가제가 또한 첨가될 수 있다. 경구 투여용 약제학적 조성물은 정제, 캡슐제, 산제 또는 경구 액제 형태일 수 있다. 정제는 젤라틴 또는 애쥬반트와 같은 고형 담체를 포함할 수 있다. 액체 약제학적 조성물은 일반적으로 액체 담체, 예를 들어, 물, 석유, 동물 또는 식물성 오일, 미네랄 오일, 또는 합성 오일을 포함하고, 이것은 또한 생리학적 식염수 용액, 글루코스 또는 다른 당 용액 또는 글리콜, 예를 들어, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 액체 제제 및/또는 동결건조된 제제 형태이다. 바람직하게, 동결건조된 제제는 동결보호제를 함유하고 보다 바람직하게 상기 동결보호제는 슈크로스, 락토스, 만니톨, 트레할로스 및 다른 당으로부터 선택된다.
본원에 기재된 GLP-1 융합 단백질 및/또는 GLP-1 융합 단백질 접합체는 바람직하게 "치료학적 유효량" 또는 "유효량"으로 대상체에게 투여된다. 상기 조성물은 바람직하게 "치료학적 유효량"으로 대상체에게 투여되고, 상기 치료학적 유효량 또는 유효량은 대상체에게 이의 이득을 보여주기에 충분하다. 투여되는 실제 양 및 투여율 및 시간 과정은 치료될 대상체의 병태 및 중증도에 의존한다. 치료 처방 (예를 들어, 용량 결정)은 의료진에 의해 결정되고 일반적으로 치료될 질환, 개별 환자의 병태, 전달 부위, 투여 경로 및 의사에게 공지된 다른 인자가 고려된다.
일부 구현예에서, GLP-1 융합 단백질 및/또는 GLP-1 융합 단백질 접합체의 용량 범위는 체중/일(day)의 30 mg/kg 내지 체중/일(day)의 0.00001 mg/kg, 3 mg/kg/일(day) 내지 0.0001 mg/kg/일(day), 또는 0.3 mg/kg/일(day) 내지 0.01 mg/kg/일(day) 일 수 있다.
본 발명은 또한 치료학적 유효량의 GLP-1 융합 단백질 및/또는 GLP-1 융합 단백질 접합체를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여함을 포함하는, 질환을 치료하기 위한 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 질환은 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된다: 식후 덤핑 증후군, 식후 고혈당증, 손상된 내당능, 비만, 섭취 장애, 인슐린 내성 증후군, 당뇨병 및 고혈당증. 바람직한 구현예에서, 질환은 II형 당뇨병이다.
본 발명은 추가로 하기의 실시예에 의해 설명되고 이는 어떠한 방식으로든지 추가의 제한으로서 해석되지 말아야 한다. 본원에 인용된 모든 참조문헌(논문 참조물, 등록된 특허, 공개된 특허 출원 및 공동 계류중인 특허 출원)의 전체 내용은 본원에 참조로 명백하게 인용된다. 하기의 실시예에서, 구체적으로 주지되지 않는 경우, 사용되는 시약 및 재료는 적어도 분석학적 순도 또는 등가 수준을 갖는 시판되는 제품이다.
실시예
실시예 1 GLP-1 융합 단백질의 제조
1. GLP-1 융합 단백질의 진핵 세포 발현 벡터의 작제
본 실시예에서 작제된 GLP-1 융합 단백질은 GLP-1-L1-Fc-L2-ST의 구조를 갖고, 여기서, GLP-1은 다양한 형태의 GLP-1 또는 이의 유사체를 나타내고, 바람직하게 GLP-1의 서열은 둘라글루티드 (Trulicity™)와 동일한 서열을 갖는다. L1 및 L2는 각각 제1 및 제2 링커를 나타내고, 여기서, 상기 L1의 서열은 GGGGSGGGGSGGGGSA이고, 상기 L2의 서열은 GGGGSGGGGS, GGGGSGGGGSGGGGS, 또는 GSGGGSGGGGSGGGGS이거나, L2는 없다. Fc는 인간 IgG2로부터 유래된 면역글로불린 Fc 영역 (또한 본 발명에서 Fc2로서 나타내는) 또는 IgG4로부터 유래된 면역글로불린 Fc 영역 (또한 본 발명에서 Fc4로서 나타내는)을 나타낸다. 바람직하게, Fc 영역은 인간 IgG4 (Fc4)의 변이체인 둘라글루티드 (Trulicity™)와 동일하다. ST는 LPETG 또는 LPETGGG의 ST 서열과 함께 소르타제 A 인지 부위를 나타낸다.
상이한 GLP-1 융합 단백질의 아미노산 서열은 CHO 세포의 코돈 선호도에 따라 뉴클레오타이드 서열로 역-해독된다. GLP-1 융합 단백질의 전장 DNA 단편은 전체 유전자 합성 및 PCR 증폭에 의해 수득되고, 이어서 양 말단에서 HindIII-EcoRI 제한 부위를 통해 진핵 세포 발현 벡터 pFRL-DHFR로 클로닝된다. 벡터 pFRL-DHFR은 인간 사이토메갈로바이러스 프로모터 (hCMV-MIE 프로모터), SV40 PolyA, DHFR (디하이드로폴레이트 리덕타제) 및 진핵 세포에서 외래 유전자의 효율적이고 안정한 발현을 도와줄 수 있는 다른 요소들을 함유하였다 (도 1a).
표 1 실시예에서 작제된 상이한 GLP-1 융합 단백질의 목록
[표 1]
상이한 GLP-1 융합 단백질의 아미노산 서열 특징
1. GLP1-L1-Fc4-ST의 아미노산 서열
HGEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKGGGGGGGSGGGGSGGGGSAESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGLPETG (서열번호 1)
GLP1-L1-Fc4-ST의 뉴클레오타이드 서열:
CACGGCGAGGGCACTTTCACATCCGACGTGTCTAGCTACTTGGAAGAGCAGGCCGCTAAGGAGTTCATCGCTTGGCTCGTGAAGGGAGGTGGTGGTGGAGGTGGATCTGGCGGAGGAGGATCTGGAGGTGGAGGAAGCGCCGAGTCCAAGTACGGACCTCCATGCCCACCTTGCCCAGCACCAGAGGCCGCTGGCGGCCCATCTGTGTTCCTGTTCCCACCAAAGCCAAAGGACACACTCATGATTAGCCGGACCCCTGAGGTGACATGCGTGGTGGTGGACGTGTCTCAGGAGGACCCCGAGGTGCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCTAAGACCAAGCCACGCGAGGAGCAGTTCAACAGCACATACCGGGTGGTGAGCGTGCTGACTGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGTCTAACAAGGGCCTGCCTAGCTCTATTGAAAAGACTATTTCTAAGGCTAAGGGCCAGCCTAGAGAGCCTCAGGTGTACACACTGCCACCTTCTCAGGAGGAGATGACAAAGAACCAGGTGTCCCTGACTTGCCTCGTGAAGGGCTTCTACCCATCCGACATCGCTGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACTACTCCTCCAGTGCTCGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACTCCAGACTCACAGTGGACAAGTCCCGTTGGCAGGAGGGCAACGTGTTCTCTTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTCCACAACCACTACACTCAGAAGTCCCTGTCTCTGTCCCTGGGCCTGCCCGAAACTGGG (서열번호 2)
2. GLP1-L1-Fc4-L2-ST의 아미노산 서열
HGEGT0FTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKGGGGGGGSGGGGSGGGGSAESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGGGGGSGGGGSGGGGSLPETG (서열번호 3)
GLP1-L1-Fc4-L2-ST의 뉴클레오타이드 서열:
CACGGCGAGGGCACTTTCACATCCGACGTGTCTAGCTACTTGGAAGAGCAGGCCGCTAAGGAGTTCATCGCTTGGCTCGTGAAGGGAGGTGGTGGTGGAGGTGGATCTGGCGGAGGAGGATCTGGAGGTGGAGGAAGCGCCGAGTCCAAGTACGGACCTCCATGCCCACCTTGCCCAGCACCAGAGGCCGCTGGCGGCCCATCTGTGTTCCTGTTCCCACCAAAGCCAAAGGACACACTCATGATTAGCCGGACCCCTGAGGTGACATGCGTGGTGGTGGACGTGTCTCAGGAGGACCCCGAGGTGCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCTAAGACCAAGCCACGCGAGGAGCAGTTCAACAGCACATACCGGGTGGTGAGCGTGCTGACTGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGTCTAACAAGGGCCTGCCTAGCTCTATTGAAAAGACTATTTCTAAGGCTAAGGGCCAGCCTAGAGAGCCTCAGGTGTACACACTGCCACCTTCTCAGGAGGAGATGACAAAGAACCAGGTGTCCCTGACTTGCCTCGTGAAGGGCTTCTACCCATCCGACATCGCTGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACTACTCCTCCAGTGCTCGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACTCCAGACTCACAGTGGACAAGTCCCGTTGGCAGGAGGGCAACGTGTTCTCTTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTCCACAACCACTACACTCAGAAGTCCCTGTCTCTGTCCCTGGGCGGAGGTGGCGGCTCTGGAGGCGGAGGTAGTGGTGGCGGCGGTTCACTGCCCGAAACTGGG (서열번호 4)
3. GLP1-L1-Fc2-L2-ST의 아미노산 서열
HGEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKGGGGGGGSGGGGSGGGGSAVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP㎖DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGSGGGSGGGGSGGGGSLPETG (서열번호 5)
GLP1-L1-Fc2-L2-ST의 뉴클레오타이드 서열:
CACGGCGAGGGAACATTCACCAGCGACGTGTCCAGCTACCTGGAGGAGCAGGCCGCCAAGGAGTTTATCGCCTGGCTCGTGAAAGGAGGCGGCGGCGGAGGAGGTTCTGGCGGCGGCGGCTCCGGCGGAGGCGGATCCGCTGTTGAATGTCCTCCATGTCCAGCTCCACCAGTTGCTGGGCCTTCCGTCTTCCTATTCCCCCCAAAGCCTAAGGACACCCTGATGATATCTCGTACCCCTGAGGTGACCTGTGTCGTAGTGGATGTGAGTCATGAAGATCCAGAAGTGCAGTTCAACTGGTATGTGGATGGTGTCGAAGTGCATAATGCTAAGACCAAGCCACGAGAGGAGCAGTTTAACTCAACCTTTAGGGTTGTGAGTGTGTTGACTGTCGTCCATCAAGATTGGTTAAACGGTAAAGAATACAAGTGTAAAGTCTCCAACAAGGGATTGCCTGCCCCTATTGAGAAGACCATTTCCAAGACGAAAGGCCAACCACGTGAGCCTCAAGTGTATACTCTACCCCCAAGTCGAGAGGAGATGACTAAGAATCAAGTCTCACTTACGTGTCTTGTCAAAGGTTTCTACCCATCAGACATTGCCGTGGAGTGGGAGTCAAATGGTCAACCCGAGAATAATTATAAGACCACTCCCCCCATGTTAGACTCAGACGGTTCTTTCTTCTTGTACTCTAAACTTACTGTCGACAAATCCCGATGGCAACAAGGCAATGTGTTCTCCTGTTCCGTCATGCACGAGGCCTTACACAATCACTATACCCAGAAATCCTTGTCTTTGTCTCCAGGGGGTTCTGGCGGTGGCTCCGGTGGAGGCGGAAGCGGCGGTGGAGGATCACTGCCCGAAACTGGG (서열번호 6)
4. GLP1-L1-Fc2-ST의 아미노산 서열
HGEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKGGGGGGGSGGGGSGGGGSAVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP㎖DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKLPETG (서열번호 7)
GLP1-L1-Fc2-ST의 뉴클레오타이드 서열:
CACGGCGAGGGAACATTCACCAGCGACGTGTCCAGCTACCTGGAGGAGCAGGCCGCCAAGGAGTTTATCGCCTGGCTCGTGAAAGGAGGCGGCGGCGGAGGAGGTTCTGGCGGCGGCGGCTCCGGCGGAGGCGGATCCGCTGTTGAATGTCCTCCATGTCCAGCTCCACCAGTTGCTGGGCCTTCCGTCTTCCTATTCCCCCCAAAGCCTAAGGACACCCTGATGATATCTCGTACCCCTGAGGTGACCTGTGTCGTAGTGGATGTGAGTCATGAAGATCCAGAAGTGCAGTTCAACTGGTATGTGGATGGTGTCGAAGTGCATAATGCTAAGACCAAGCCACGAGAGGAGCAGTTTAACTCAACCTTTAGGGTTGTGAGTGTGTTGACTGTCGTCCATCAAGATTGGTTAAACGGTAAAGAATACAAGTGTAAAGTCTCCAACAAGGGATTGCCTGCCCCTATTGAGAAGACCATTTCCAAGACGAAAGGCCAACCACGTGAGCCTCAAGTGTATACTCTACCCCCAAGTCGAGAGGAGATGACTAAGAATCAAGTCTCACTTACGTGTCTTGTCAAAGGTTTCTACCCATCAGACATTGCCGTGGAGTGGGAGTCAAATGGTCAACCCGAGAATAATTATAAGACCACTCCCCCCATGTTAGACTCAGACGGTTCTTTCTTCTTGTACTCTAAACTTACTGTCGACAAATCCCGATGGCAACAAGGCAATGTGTTCTCCTGTTCCGTCATGCACGAGGCCTTACACAATCACTATACCCAGAAATCCTTGTCTTTGTCTCCAGGGAAACTGCCCGAAACTGGG (서열번호 8)
5. GLP1-L1-Fc4-L2-STG3의 아미노산 서열:
HGEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKGGGGGGGSGGGGSGGGGSAESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGGGGGSGGGGSLPETGGG (서열번호 22)
GLP1-L1-Fc4-L2-STG3의 뉴클레오타이드 서열:
CACGGCGAGGGCACTTTCACATCCGACGTGTCTAGCTACTTGGAAGAGCAGGCCGCTAAGGAGTTCATCGCTTGGCTCGTGAAGGGAGGTGGTGGTGGAGGTGGATCTGGCGGAGGAGGATCTGGAGGTGGAGGAAGCGCCGAGTCCAAGTACGGACCTCCATGCCCACCTTGCCCAGCACCAGAGGCCGCTGGCGGCCCATCTGTGTTCCTGTTCCCACCAAAGCCAAAGGACACACTCATGATTAGCCGGACCCCTGAGGTGACATGCGTGGTGGTGGACGTGTCTCAGGAGGACCCCGAGGTGCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCTAAGACCAAGCCACGCGAGGAGCAGTTCAACAGCACATACCGGGTGGTGAGCGTGCTGACTGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGTCTAACAAGGGCCTGCCTAGCTCTATTGAAAAGACTATTTCTAAGGCTAAGGGCCAGCCTAGAGAGCCTCAGGTGTACACACTGCCACCTTCTCAGGAGGAGATGACAAAGAACCAGGTGTCCCTGACTTGCCTCGTGAAGGGCTTCTACCCATCCGACATCGCTGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACTACTCCTCCAGTGCTCGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACTCCAGACTCACAGTGGACAAGTCCCGTTGGCAGGAGGGCAACGTGTTCTCTTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTCCACAACCACTACACTCAGAAGTCCCTGTCTCTGTCCCTGGGCGGAGGAGGTGGATCTGGTGGAGGCGGATCTCTGCCCGAAACTGGGGGTGGA (서열번호 23)
2. 안정한 세포주의 스크리닝 및 발효
2.1 안정한 세포주의 스크리닝
상기 작제된 각각의 플라스미드로 전기형질감염에 의해 숙주 세포 CHO DG44를 형질감염시키고 세포 밀도는 6×106 cells/㎖이고, 용적은 0.8 ㎖이고, 플라스미드 양은 40 μg이었다. 플라스미드 및 세포는 약하게 혼합하고 이어서 전기천공 큐벳 (Bio-Rad, 4 mm)에 첨가하였다. 본원에 사용된 전기천공기는 제조원(Bio-Rad (GENE PULSER XCELL))의 것이고 전기천공의 파라미터는 다음과 같다: 전압 290V 및 펄스 지속기간 20 ms.
전기천공 후, 세포를 회수 배지 15 ㎖을 함유하는 페트리 디쉬에 이동시켜 48 시간 배양 후, 이어서 50 nM MTX를 함유하는 스크리닝 배지를 갖는 96-웰 플레이트에 접종하였다. 세포 컨플루언스가 50% 초과에 도달하는 경우, 세포주는 도트 블롯팅 방법에 의해 고발현에 대해 스크리닝하였고 사용되는 항체는 염소 항-인간 IgG Fc였다. 상대적 고발현 수준을 갖는 선택된 클론은 순차적으로 24-웰 플레이트, 6-웰 플레이트, T25 세포 배양 플라스크 및 확장을 위해 세포 배양 진탕 플라스크에 이동되었다.
융합 단백질의 수율을 증가시키기 위해, 세포는 MTX 농도를 높이면서 가압 방법을 사용하여 배양하였다. MTX에 의한 DHFR 유전자의 억제를 통해, DHFR 유전자 및 융합 단백질 유전자의 동시-증폭을 실현하였다.
2.2 발효
세포는 8 L의 용적 및 0.8-1.6×106 cells/㎖의 밀도로 15 L 생물반응기 (Applikon, Biobundle 15 L)에 접종하였다. 배양 파라미터는 하기와 같이 설정하였다: pH 6.95±0.15, DO 45%, 산소 공급: 대형 기포 환기 및 회전 속도: 80-140 rpm. 세포 밀도가 배양 5일 째에 약 10-12×106 cells/㎖인 경우, 배양 온도는 33℃로 낮추었다. 공급은 배양 4일 째부터 개시하였고, 잔류 글루코스 함량은 매일 측정하였다. 당은 온도를 낮추기 전에 3 g/L, 온도를 낮춘 후 4 g/L의 농도에 도달하도록 매일 보충하였다. 발효 동안에, 세포 계수 및 생존능은 매일 측정하였다. 13일 째에, 세포는 생존능이 약 90%인 경우 수거하였다.
도 1b 내지 도 4는 발효 동안에 GLP1-L1-Fc2-L2-ST 안정한 세포주 (클론 번호: P1-3G3C2)의 성장 곡선, 세포 생존능, 현미경 조사 결과 및 다양한 공정 파라미터를 보여준다. 발효 9일 째에, 세포 밀도가 20.5×106/㎖로 최고였고 13일 째에 세포가 수거된 경우 세포 밀도가 15.5×106/㎖였고 세포 생존능이 86.6%였음을 도 1b로부터 알 수 있다. 현미경 조사는 세포의 형태가 명백히 죽은 세포 없이 양호하였음을 보여준다 (도 2a 및 도 2b). 도 3 및 도 4는 발효 동안에 글루코스, NH4 + 및 락트산 (Lac)의 대사를 보여준다.
도 11 내지 도 14는 유가식 발효 동안에 GLP1-L1-Fc4-L2-STG3의 성장 곡선, 세포 생존능, 현미경 조사 결과 및 다양한 공정 파라미터를 보여준다. 발효 8일 째에, 세포 밀도가 19.9×106 cells/㎖로 최고였고 14일 째에 세포가 수거된 경우 세포 밀도가 16.0×106 cells/㎖였고 세포 생존능이 92%였음을 도 11b로부터 알 수 있다. 현미경 조사는 세포의 형태가 명백히 죽은 세포 없이 양호하였음을 보여준다 (도 12a 및 도 12b). 도 13 및 도 14는 발효 동안에 글루코스 대사 및 pH 변화를 보여준다.
발효 상등액 중에 GLP1-L1-Fc2-L2-ST 단백질의 함량은 1.8 g/L였고 GLP1-L1-Fc4-L2-STG3의 함량은 분자 상호작용 기구에 의해 1.19 g/L였다 (Pall Life Science, Qke). SDS-PAGE 전기영동을 사용하여 GLP1-L1-Fc2-L2-ST 단백질의 통합성을 검출하였다. GLP1-L1-Fc2-L2-ST는 분자량이 61.6kDa (당 쇄 없이)인 이중 쇄 Fc 융합 단백질이다. 도 5에 나타낸 바와 같이, GLP1-L1-Fc2-L2-ST의 분자량은 기본적으로 비환원 및 환원 상태에서 이론적 분자량과 동일하였다. 동시에 SDS-PAGE 전기영동을 사용하여 GLP1-L1-Fc4-L2-STG3 단백질의 변화를 검출하였다 (도 15). 표적 단백질의 수율이 발효의 12일 째 내지 14일 째에 유의적으로 증가하였고 상등액 중에 표적 단백질이 대다수였고 소량의 불순물만이 잔류함을 알 수 있다. 발현된 단백질은 ELISA에 의해 동정하였고, 결과는 양성이었다.
2.3 정제 및 검출
발효 브로쓰의 상등액 중 GLP1-L1-Fc2-L2-ST 및 GLP1-L1-Fc4-L2-STG3은 2개의 단계로 정제하였다: 친화성 크로마토그래피 (Uni mab, NanoMicro) 및 음이온 교환 크로마토그래피 (QHP, BXK). 정제된 단백질은 SDS-PAGE 및 SEC (크기 배제 크로마토그래피)에 의해 검출되었다. SDS-PAGE의 결과에 따라 (도 6a 및 도 16a), 표적 단백질의 크기는 기본적으로 이론적 분자량과 동일하였다. SEC는 Agilent Advancebio SEC 300A, 2.7μm, 7.8*300 mm 컬럼 상에서 수행하였고, 농도구배 용출은 50 mM Tris+150 mM NaCl+10% 아세토니트릴, pH 7.0 (컬럼 온도: 30℃, 유속: 0.5 ㎖/min, 샘플 주사기 온도: 4.0 ℃, 샘플 주사 용적: 50 μg, 및 샘플 분석 시간: 35분)을 사용하여 수행하였다. 도 6b로부터 GLP1-L1-Fc2-L2-ST 단백질의 체류 시간이 14.6분이었고, 2단계 정제 후 순도가 97.2%였음을 알 수 있다. 도 16b로부터 GLP1-L1-Fc4-L2-STG3 단백질의 체류 시간이 14.49분이었고, 2단계 정제 후 순도가 98.412%였음을 알 수 있다.
실시예 2 20 kDa PEG 및 40 kDa PEG의 GLP1-Fc 융합 단백질로의 연결
모든 작제된 GLP1-Fc 융합 단백질의 C-말단은 소르타제 A에 의해 특이적으로 인지될 수 있는, 소르타제 A 코어 인지 서열 LPETG를 함유하였다. 소르타제 A의 작용하에, T와 G 간의 아미드 결합은 절단되었고, T는 소르타제 위치 184에서 C의 설프하이드릴 그룹과 반응하여 티오에스테르 결합 중간체를 형성하고 이는 이어서 N-말단에서 폴리-Gly을 갖는 GGGAA-PEG에 의해 공격받았다. 최종적으로, 상이한 분자량의 PEG는 단백질의 C-말단에 연결하였다.
GLP1-L1-Fc2-L2-ST 및 GLP1-L1-Fc2-ST 단백질의 페길화 반응 시스템은 다음과 같았다: 20 kDa 또는 40 kDa GGGAA-PEG (GGGAA는 제조원 (Shanghai GL Biochem Co., Ltd.)로부터 구입하였고, 20 kDa 또는 40 kDa GGGAA-PEG는 제조원 (Beijing JenKem Technology Co., Ltd.)에 의해 합성되었다)를 완충 용액 중에 용해시켜 pH 8.0으로 조정하였고 이어서 단백질을 각각 1:15 및 1:10의 공급 비율로 50 mM Tris 150 mM NaCl pH 8.0 완충 시스템에 첨가하였다. 이어서, 소르타제 A 및 10 mM CaCl2를 첨가하였다. 샘플링은 반응의 상이한 시점에서 수행하였고, 90분 후 EDTA를 첨가하여 반응을 종료하였다.
GLP1-L1-Fc4-L2-STG3 단백질의 페길화 반응 시스템은 다음과 같다: 40 kDa GGGAA-PEG (GGGAA는 제조원 (Shanghai GL Biochem Co., Ltd.)로부터 구입하였고, 40 kDa GGGAA-PEG는 제조원(Beijing JenKem Technology Co., Ltd.)에 의해 합성하였다)는 완충 용액 중에 용해시키고 7.0으로 조정하고, 이어서 단백질 및 PEG는 1:15 (몰 비)의 공급 비율로 20 mM Tris 150 mM NaCl pH 7.0 완충 시스템에 첨가하였다. 이어서, 소르타제 A 및 CaCl2 (10 mM)는 표적 단백질의 mg 당 50IU 효소로 첨가하였고, 표적 단백질의 최종 농도는 6 mg/㎖이었다. 30분 후, EDTA를 첨가하여 반응을 종료하였다.
연결 후 상기 언급된 생성물은 SDS-PAGE 및 역상 크로마토그래피 (RPC)에 의해 검출하여 연결 속도 (가교결합 속도)를 감지하였다. 단일 가교결합은 융합 단백질 이량체의 단지 하나의 단량체가 PEG에 연결됨을 의미하고, 이중 가교결합은 융합 단백질 이량체의 단량체 둘 다가 PEG에 연결됨을 의미한다. 역상 크로마토그래피 시험은 Waters Xbridge®protein BEH C4, 3.5 μm, 4.6*250 mm 크로마토그래피 컬럼 상에서 수행하였고 농도 구배 용출은 하기의 조건하에서 0.1% TFA 물 및 0.1% TFA 아세토니트릴로 수행하였다: 50 ℃의 컬럼 온도, 280 nm의 검출 파장, 0.5 ㎖/min의 유속, 4.0 ℃의 샘플 주사기 온도, 20 μg의 샘플 주사 용적 및 50분의 샘플 분석 시간. GLP1-L1-Fc2-L2-ST 및 GLP1-L1-Fc2-ST 단백질의 시험 결과는 도 7에 나타낸다. 반응 시간이 증가함으로써, 20 kDa 또는 40 kDa PEG를 갖는 페길화 생성물은 점진적으로 증가하였다. 90분에, 페길화 생성물은 최대에 도달하였고 종결 반응을 진행하였으며 상기 시점에서, 20 kDa PEG를 갖는 GLP1-L1-Fc2-L2-ST 단백질의 총 가교결합율은 75.62%였고 이의 단일 가교결합은 55.57%를 차지하였고 이중 가교결합은 20.05%를 차지하였다. 40 kDa PEG를 갖는 GLP1-L1-Fc2-L2-ST 단백질의 총 가교결합율은 40.15%였고, 이의 단일 가교결합은 36.36%를 차지하였고 이중 가교결합은 3.79%를 차지하였다. 40 kDa PEG를 갖는 GLP1-L1-Fc2- ST 단백질의 총 가교결합율은 60.83%였고, 이의 단일 가교결합율은 48.46%였고 이중 가교결합율은 12.37%였다. 40 kDa PEG 가교결합 결과로부터, 동일한 반응 조건하에서, GLP1-L1-Fc2-ST의 가교결합 효율은 GLP1-L1-Fc2-L2-ST의 것 보다 훨씬 높았음을 알 수 있다.
GLP1-L1-Fc4-L2-STG3 단백질의 시험 결과는 도 17에 나타낸다. 반응 시간이 증가함으로써, 40 kDa 페길화 생성물은 점진적으로 증가하였다. 30분에, 페길화 생성물은 최대에 도달하였고 반응은 종결되었으며 상기 시점에서, 40 kDa PEG를 갖는 GLP1-L1-Fc4-L2-STG3 단백질의 총 가교결합율은 80.86%였고 이의 단일 가교결합은 10.543분의 피크 시간에서 40.087%를 차지하였고 이중 가교결합은 9.698분의 피크 시간에서 36.782%를 차지하였다.
가교결합 후 정제 및 검출
40 kDa PEG를 사용한 가교결합 후, GLP1-L1-Fc2-L2-ST는 부틸 HP 소수성 크로마토그래피에 적용하여 미반응된 GGGAA-PEG 및 소르타제 A를 제거하였고, 음이온 교환 크로마토그래피에 적용하여 비-가교결합된 기질 단백질을 제거하여 기질의 잔량이 1% 이내이도록 제어하였다. 도 8a에 나타낸 바와 같이, 40 kDa PEG와 가교결합된 GLP1-L1-Fc2-L2-ST는 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 2개의 피크 P1 및 P2로 나누어질 수 있다. RPC 시험 결과 (도 8b)는 P1 피크가 주로 이중 가교결합된 생성물 (이중 가교결합 생성물 90.84%, 단일 가교결합 생성물 8.4%, 기질 0.15%)이었고, P2 피크가 주로 단일 가교결합된 생성물 (이중 가교결합 생성물 8.56%, 단일 가교결합 생성물 90.12%, 기질 0.73%)이었음을 보여준다. 비-가교결합된 GLP1-L1-Fc2-L2-ST의 체류 시간은 17.3분이었고, 단일 및 이중 가교결합된 생성물의 체류 시간은 각각 22.5 및 23.2분이었다.
40 kDa PEG와의 가교결합 후, GLP1-L1-Fc4-L2-STG3는 음이온 교환 크로마토그래피 (SuperQ 5PW, TOSOH)에 의해 단일 가교결합, 이중 가교결합 및 기질로 분리될 수 있다. 크로마토그램은 도 18a에 나타낸다. SEC 시험 결과 (도 18b 및 18c)에 따라, P1 피크는 주로 이중 가교결합된 생성물 (이중 가교결합 생성물 97.172%, 단일 가교결합 생성물 2.766%, 기질 0%)이었고, P2 피크는 주로 단일 가교결합된 생성물 (이중 가교결합 생성물 19.722%, 단일 가교결합 생성물 79.754%, 기질 0.158%)이었다. 단일 및 이중 가교결합된 생성물의 체류 시간은 각각 10.63 및 9.8분이었다.
실시예 3 가교결합된 GLP1-L1-Fc2-L2-ST 단백질의 활성 검출
GLP-1은 GLP-1 수용체(GLP-1R)에 결합함에 의해 아데닐레이트 사이클라제 (AC)를 활성화시켜 cAMP를 생성할 수 있고, cAMP는 추가로 cAMP-의존성 전사 인자, 즉, cAMP 반응 요소 결합 단백질 (CREB)을 활성화시키고, 이는 cAMP 반응 요소 (CRE)에 결합한 후 다운스트림 유전자의 전사를 활성화시킨다.
본 실시예에서의 검출은 하기의 단계를 포함하였다. HEK293/CRE-Luc/GLP1R 세포 (제조원 (GenScript, #M00562)으로부터 구입)는 대수증식기까지 배양하였고, 트립신으로 분해시키고 완전 배지에 재현탁시켜 세포 밀도를 1×106 cells/㎖로 조정하였고, 이어서 세포를 백색 96-웰 플레이트에 50 μL/웰로 첨가하였다. 둘라글루티드 및 시험 물질은 완전 배지로 400 ng/㎖로 희석시켰고, 추가로 총 9개 농도구배로 4배 비율로 희석시키고, 이어서 세포에 50 μL/웰로 첨가하였다. 세포는 5시간 동안 37℃, 5% CO2에서 항온처리하였다. 이후, Bright-Glo 루시퍼라제 (promega)는 웰 당 100 μL로 첨가하였고 10분동안 광으로부터 보호하였다. 완전한 밴드 형광성 마이크로플레이트 판독기(TECAN, 200PRO)를 사용하여 형광성 값을 측정하였다.
표준 및 시험 물질의 형광 값은 세로 좌표이고 농도의 로그 값은 가로 좌표인 Softmax 분석 소프트웨어에 의해 4개 파라미터 수학식에 맞게 데이터를 가공하였다. 시험 물질의 상대적 활성은 하기의 수학식에 따라 계산하였다:
[수학식]
도 9는 각각 20 kDa PEG 및 40 kDa PEG와 가교결합된 GLP1-L1-Fc2-L2-ST의 활성 시험 결과를 보여준다. 둘라글루티드와 비교하여, 비-가교결합된 기질 (GLP1-Fc)의 상대적 활성은 98.10%였다. PEG-가교결합된 생성물 둘 다의 활성은 감소하였고, 여기서, 20 kDa PEG (도면에서 PEG (20 kDa)-GLP1-Fc로서 시사된)와 가교결합된 생성물의 상대적 활성은 40.38%였고, 40 kDa 가교결합된 생성물의 상대적 활성 (도면에서 PEG (40 kDa)-GLP1-Fc로서 시사된)은 32.85%였다.
도 19는 40 kDa PEG와 가교결합된 GLP1-L1-Fc4-L2-STG3의 활성 시험 결과를 보여준다. 디글라글루티드와 비교하여 PEG-접합된 GLP1-L1-Fc2-L2-ST와 유사하게, 40 kDa PEG-접합된 GLP1-L1-Fc4-L2-STG3 (도면에서 PEG (40 kDa)-GLP1-Fc로 지칭됨)의 활성은 감소하였고 상대적 활성은 21.51%였다.
실시예 4 GLP-1 융합 단백질 또는 이의 PEG 접합체의 생체내 저혈당 활성
C57BL/6 마우스(제조원(Beijing Vital River Co., Ltd.)으로부터 구입)는 케이지 당 5마리로 사육하였고 정상 마우스 성장 사료 및 자유롭게 음용수를 공급하였다. 조명 시간은 12h (08:00am-20:00pm)이고 암실 시간은 12h (20:00pm-08:00am)이었다.
(1) GLP1-L1-Fc2-L2-ST의 실험 결과
6 내지 8주령의 40마리의 건강한 수컷 C57BL/6 마우스는 각각의 그룹 내 8마리의 마우스를 갖는 5개 그룹으로 나누었다. 이들 그룹은 다음을 포함한다: (1) GLP1-Fc 그룹 (가교결합 전 GLP-1-L1-Fc2-L2-ST 기질); (2) 둘라글루티드 그룹; (3) 40 kDa PEG GLP1-Fc 그룹 (40 kDa PEG와 가교결합된 GLP-1-L1-Fc2-L2-ST); (4) 20 kDa PEG GLP1-Fc 그룹 (20 kDa PEG와 가교결합된 GLP-1-L1-Fc2-L2-ST); 및 (5) 대조군 그룹. 그룹 (1) 내지 (4)에는 3 mg/kg을 투여하였고, 대조군 그룹에는 정상 식염수를 투여하였다. IPGTT 실험은 투여 후 24, 144, 168, 192, 216, 및 240h에 수행하였다. 실험 과정은 하기와 같다. 마우스는 6h 동안 단식시키고, 혈당 수준 및 체중을 측정하였다. 단식 기간 동안에 마우스는 물에 자유롭게 접근가능하게 하였다. 6시간 후, 마우스에는 복막내 10 ㎖/kg의 용적과 함께 2.0g/kg의 글루코스 용액을 투여하였고, 글루코스 부하 후 10, 30, 60, 90, 120분에 혈당 값을 측정하였다. 상기 값에 따라, 내당능 곡선을 그리고 혈당의 곡선 아래 면적 (AUC)을 계산하였다. 데이터는 평균 ± 표준 오차 (평균 ±SEM)로 나타내고, Graphpad prism7.0 통계학적 소프트웨어로 분석하였다. 상기 차이는 만-휘트니 통계(Mann-Whitney statistics)로 분석하였다.
도 10a, 10b, 10c, 10d, 10e, 및 10f에 나타낸 바와 같이, 각각의 실험 그룹의 내당능 시험에서 혈당 및 곡선 아래 면적 (AUC)은 단일 투여 후 6일 이내에 대조군 그룹에서의 것들과 비교하여 유의적으로 감소하였다. 7일 후, 둘라글루티드와 GLP1-Fc 그룹 및 대조군 그룹 간에 유의적 차이가 없었고, 이는 GLP1-Fc 및 둘라글루티드의 효능이 6일동안 유지될 수 있음을 시사한다. 도 10g, 10h, 10i, 10j, 10k 및 10l에 나타낸 바와 같이, PEG (20 kDa)-GLP1-Fc는 여전히 단일 투여 후 8일 째에 유의적인 내당능 효과를 가졌다. 9일 후, 내당능 시험의 곡선 아래 면적 (AUC)은 대조군 그룹과 비교하여 어떠한 차이를 갖지 않았고, 이는 약물 효과가 8일 동안 유지될 수 있음을 시사한다. PEG (40 kDa)-GLP1-Fc는 여전히 단일 투여 후 9일까지 유의적인 내당능 효과를 가졌다. 10일 후, 내당능 시험의 곡선 아래 면적(AUC)은 대조군 그룹과 비교하여 어떠한 차이를 갖지 않았고, 이는 약물 효과가 9일 동안 유지될 수 있음을 시사한다.
도 10m은 투여 후 C57BL/6J 마우스의 매일 체중 변화를 보여준다. 대조군 그룹과 비교하여, 각각의 그룹 내 마우스의 체중은 24시간내 감소하였고, 특히, 둘라글루티드 그룹과 PEG 그룹과 비-가교결합된 GLP1-Fc에서 감소하였다. PEG (20 kDa)-GLP1-Fc 및 PEG (40 kDa)-GLP1-Fc 둘 다가 약물에 의해 유발된 급격한 체중 손실을 유의적으로 감소시킬 수 있음을 주지할 가치가 있고, 이는 페길화가 임상 적용에서 약물의 부작용을 유의적으로 개선시킬 수 있고 따라서 보다 양호한 안전성 성질을 가질 수 있음을 시사한다.
(2) GLP1-L1-Fc4-L2-STG3의 실험 결과
8 내지 10주령의 18마리의 건강한 수컷 C57BL/6 마우스는 각각의 그룹 내 6마리의 마우스를 갖는 3개 그룹으로 나누었다. 이들 그룹은 다음을 포함한다: (1) 대조군 그룹; (2) 둘라글루티드 그룹; 및 (3) PEG (40 kDa)-GLP1-Fc 그룹 (40 kDa PEG와 가교결합된 GLP1-L1-Fc4-L2-STG3). 그룹 (2) 및 (3)은 균등한 활성으로 투여하였고 (즉, 도 19에 검출된 시험관내 활성을 기준으로 매쓰 전환을 수행한다), 여기서, 둘라글루티드의 용량은 0.76 mg/kg이고, PEG (40 kDa)-GLP1-Fc는 3.5 mg/kg이고, 대조군 그룹은 식염수를 투여받았다. IPGTT 실험은 투여 후 1, 5, 6, 7, 및 8일에 수행하였고 실험 절차는 다음과 같다. 마우스는 6h 동안 단식시키고, 혈당 수준 및 체중을 측정하였다. 단식 기간 동안에 마우스는 물에 자유롭게 접근가능하게 하였다. 6시간 후, 마우스에는 복막내 10 ㎖/kg의 용적으로 2.0g/kg의 글루코스 용액을 투여하였고, 글루코스 부하 후 10, 30, 60, 90, 120분에 혈당 값을 측정하였다. 상기 값에 따라, 혈당의 곡선 아래 면적(AUC)을 계산하였다. 데이터는 평균 ± 표준 오차 (평균±SEM)로 나타내고, Graphpad prism7.0 통계학적 소프트웨어로 분석하였다. 상기 차이는 만-휘트니 통계 (Mann-Whitney statistics)로 분석하였다.
도 20a에 나타낸 바와 같이, 각각의 실험 그룹에서 내당능 시험에서 혈당 및 곡선 아래 면적 (AUC)은 단일 투여 후 5일 이내에 대조군 그룹에서의 것들과 비교하여 유의적으로 감소하였다. 5일 후, 둘라글루티드와 대조군 그룹 간에 유의적 차이가 없었고, 이는 둘라글루티드의 효능이 5일동안 유지될 수 있음을 시사한다. PEG (40 kDa)-GLP1-Fc는 여전히 단일 투여 후 7일까지 유의적인 내당능 효과를 가졌다. 8일 후, 내당능 시험의 곡선 아래 면적 (AUC)은 대조군 그룹과 비교하여 어떠한 차이를 갖지 않았고, 이는 PEG (40 kDa)-GLP1-Fc의 효능이 7일 동안 유지될 수 있음을 시사한다.
도 20b는 투여 후 C57BL/6 마우스의 체중 변화를 보여준다. 대조군 그룹과 비교하여, 그룹 둘 다에서 마우스의 체중은 24시간내 감소하였고, 특히, 둘라글루티드 그룹에서 감소하였다. PEG (40 kDa)-GLP1-Fc가 또한 약물에 의해 유발된 신속한 체중 손실을 유의적으로 감소시킬 수 있음이 주지할만한 가치가 있고, 이는 추가로 페길화가 임상 적용에서 약물에 대해 상기 GLP-1 수용체 효능제 약물의 부작용을 유의적으로 개선시킬 수 있음을 설명한다.
실시예 5 STZ-유도된 II형 당뇨병 마우스에서 가교결합된 GLP1-L1-Fc4-L2-STG3의 저혈당 활성의 검출
II형 당뇨병 마우스 모델의 작제
C57BL/6 마우스 (제조원(Beijing Vital River Co., Ltd.)로부터 구입)는 케이지 당 5마리로 사육하였고 정상 마우스 성장 사료 및 자유롭게 음용수를 공급하였다. 조명 시간은 12h (08:00am-20:00pm)이고 암실 시간은 12h (20:00pm-08:00am)이었다. 8 내지 10주령의 30마리의 건강한 암컷 C57BL/6 마우스는 4일 동안 연속으로 투여되는 60 mg/kg STZ으로 유도하였고, 혈당 값은 2주 후 측정하였다. ≥16.7 mmol/L의 비-단식 혈당 값을 갖는 마우스는 성공적으로 확립된 II형 당뇨병 마우스로 간주되었다.
프로토콜
24마리의 II형 당뇨병 마우스는 각각의 그룹 내 6마리의 마우스를 갖는 4개의 그룹으로 나누었다. 이들 그룹은 다음을 포함한다: (1) 대조군 그룹; (2) 둘라글루티드-1 mg/kg 그룹; (3) PEG (40 kDa)-GLP1-Fc (40 kDa PEG와 가교결합된 GLP1-L1-Fc4-L2-STG3)-1 mg/kg 그룹; 및 (4) PEG (40 kDa)-GLP1-Fc (40 kDa PEG와 가교결합된 GLP1-L1-Fc4-L2-STG3)-3 mg/kg 그룹. 둘라글루티드의 용량은 1 mg/kg이었고, PEG (40 kDa)-GLP1-Fc의 용량은 1 mg/kg 또는 3 mg/kg이었고, 대조군 그룹은 정상 식염수를 투여받았다. 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 및 12일 째에 혈당 값 및 체중은 단식 및 자유 음용 없이 측정하였다. 데이터는 평균 ± 표준 오차 (평균 ± SEM)로 나타내고, Graphpad prism7.0 통계학적 소프트웨어로 분석하였다. 상기 차이는 만-휘트니 통계 (Mann-Whitney statistics)로 분석하였다.
결과
도 21a에 나타낸 바와 같이, 각각의 실험 그룹에서 마우스의 혈당은 단일 투여 후 대조군 그룹에서의 것들과 비교하여 유의적으로 감소하였다. 둘라글루티드-1 mg/kg 그룹과 대조군 그룹 간의 혈당 내 차이는 여전히 6일 째에 유의적 (P=0.0022)이었으나 7일 째에는 어떠한 유의적 차이가 없었고 (P=0.9654), 이는 둘라글루티드의 저혈당 효과가 최대 6일 동안 유지될 수 있음을 시사하였다.
한편, 단일 투여 후, PEG (40 kDa)-GLP1-Fc-1mg/kg은 여전히 10일까지 유의적 저혈당 효과를 가졌고 (P=0.0381), 이의 결과는 11일까지 대조군에 근접하지 않았고 (P=0.1143); PEG (40 kDa)-GLP1-Fc-3 mg/kg은 여전히 단일 투여 후 11일 째에 유의적 저혈당 효과를 가졌고 (P=0.0381), 이것과 대조군 그룹 간의 차이는 12일까지 유의적이지 않았다 (P=0.0762). 상기 결과는 PEG (40 kDa)-GLP1-Fc가 유의적으로 보다 양호한 장기 저혈당 효과를 가졌고 II형 당뇨병의 치료에 사용될 수 있음을 시사하였다.
투여 후 당뇨병 마우스의 체중 변화가 추가로 관찰되었다. 도 21b에 나타낸 바와 같이, 모든 실험 그룹에서 마우스의 체중은 대조군 그룹, 특히 둘라글루티드 그룹에서의 것들과 비교하여 감소하였고, 여기서, 마우스의 체중은 대부분 대조군 그룹과 비교하여 2.5 g까지 감소하였다. PEG (40 kDa)-GLP1-Fc의 2개 용량 그룹은 체중에 대해 보다 작은 효과를 가졌고, 여기서, PEG (40 kDa)-GLP1-Fc-1mg/kg 그룹 내 마우스의 체중은 대조군 그룹과 비교하여 최대 0.3g까지 감소하였고, PEG (40 kDa)-GLP1-3 mg/kg 그룹에서 마우스의 체중은 대조군 그룹과 비교하여 최대 1.1 g까지 감소하였다. 상기 결과는 다양한 용량에서 PEG (40 kDa)-GLP1-Fc가 당뇨병의 치료에 사용되는 경우 약물에 의해 유발된 신속한 체중 손실을 유의적으로 개선시킬 수 있음을 입증하고, 이는 페길화 변형이 임상 적용에서 상기 약물의 부작용을 유의적으로 개선시킬 수 있고, 동시에 환자 순응도를 효과적으로 개선시킬 수 있음을 시사한다.
요약하면, 페길화된 GLP1-Fc는 췌장 β-세포에 의한 인슐린 분비를 촉진시킬 수 있고, 외인성 글루코스 섭취에 의해 유발된 혈당에서의 일시적 증가를 억제할 수 있으며 글루코스 활용을 촉진시킬 수 있다. PEG 변형 후, GLP1-Fc 단백질은 보다 긴 지속적인 저혈당 효과 및 흔히 GLP-1-유사 체중-저하 약물에 의해 유발되는 급격한 체중 손실을 회피하는 보다 적은 부작용을 보여주고, 양호한 임상 적용 전망을 갖는다.
본 발명은 다양한 구체적 구현예에 의해 예시되었다. 그러나, 당업자는 본 발명이 구체적 구현예로 제한되지 않음을 이해해야만 하고, 당업자는 본 발명의 취지 및 범위로부터 벗어나는 것 없이 본 발명의 범위 내에서 다양하게 변형시키고 변화시킬 수 있다. 상기 변형 및 변화는 모두 본 발명의 범위 내에 있다.
<110> JIANGSU GENSCIENCES INC. <120> GLP1-FC FUSION PROTEIN AND CONJUGATE THEREOF <130> PCT/CN2019/107709 <150> CN 201811125762.9 <151> 2018-09-26 <150> PCT/CN2019/107709 <151> 2019-09-25 <160> 23 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 280 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GLP1-L1-Fc4-ST amino acid sequence <400> 1 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Gly Gly 20 25 30 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Glu 35 40 45 Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala 50 55 60 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 65 70 75 80 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 85 90 95 Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 100 105 110 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr 115 120 125 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 130 135 140 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser 145 150 155 160 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 165 170 175 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val 180 185 190 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 195 200 205 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 210 215 220 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr 225 230 235 240 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 245 250 255 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 260 265 270 Ser Leu Gly Leu Pro Glu Thr Gly 275 280 <210> 2 <211> 840 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GLP1-L1-Fc4-ST nucleotide sequence <400> 2 cacggcgagg gcactttcac atccgacgtg tctagctact tggaagagca ggccgctaag 60 gagttcatcg cttggctcgt gaagggaggt ggtggtggag gtggatctgg cggaggagga 120 tctggaggtg gaggaagcgc cgagtccaag tacggacctc catgcccacc ttgcccagca 180 ccagaggccg ctggcggccc atctgtgttc ctgttcccac caaagccaaa ggacacactc 240 atgattagcc ggacccctga ggtgacatgc gtggtggtgg acgtgtctca ggaggacccc 300 gaggtgcagt tcaactggta cgtggacggc gtggaggtgc acaacgctaa gaccaagcca 360 cgcgaggagc agttcaacag cacataccgg gtggtgagcg tgctgactgt gctgcaccag 420 gactggctga acggcaagga gtacaagtgc aaggtgtcta acaagggcct gcctagctct 480 attgaaaaga ctatttctaa ggctaagggc cagcctagag agcctcaggt gtacacactg 540 ccaccttctc aggaggagat gacaaagaac caggtgtccc tgacttgcct cgtgaagggc 600 ttctacccat ccgacatcgc tgtggagtgg gagagcaacg gccagcccga gaacaactac 660 aagactactc ctccagtgct cgacagcgac ggcagcttct tcctgtactc cagactcaca 720 gtggacaagt cccgttggca ggagggcaac gtgttctctt gctccgtgat gcacgaggcc 780 ctccacaacc actacactca gaagtccctg tctctgtccc tgggcctgcc cgaaactggg 840 840 <210> 3 <211> 295 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GLP1-L1-Fc4-L2-ST amino acid sequence <400> 3 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Gly Gly 20 25 30 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Glu 35 40 45 Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala 50 55 60 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 65 70 75 80 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 85 90 95 Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 100 105 110 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr 115 120 125 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 130 135 140 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser 145 150 155 160 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 165 170 175 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val 180 185 190 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 195 200 205 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 210 215 220 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr 225 230 235 240 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 245 250 255 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 260 265 270 Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 275 280 285 Gly Ser Leu Pro Glu Thr Gly 290 295 <210> 4 <211> 885 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GLP1-L1-Fc4-L2-ST nucleotide sequence <400> 4 cacggcgagg gcactttcac atccgacgtg tctagctact tggaagagca ggccgctaag 60 gagttcatcg cttggctcgt gaagggaggt ggtggtggag gtggatctgg cggaggagga 120 tctggaggtg gaggaagcgc cgagtccaag tacggacctc catgcccacc ttgcccagca 180 ccagaggccg ctggcggccc atctgtgttc ctgttcccac caaagccaaa ggacacactc 240 atgattagcc ggacccctga ggtgacatgc gtggtggtgg acgtgtctca ggaggacccc 300 gaggtgcagt tcaactggta cgtggacggc gtggaggtgc acaacgctaa gaccaagcca 360 cgcgaggagc agttcaacag cacataccgg gtggtgagcg tgctgactgt gctgcaccag 420 gactggctga acggcaagga gtacaagtgc aaggtgtcta acaagggcct gcctagctct 480 attgaaaaga ctatttctaa ggctaagggc cagcctagag agcctcaggt gtacacactg 540 ccaccttctc aggaggagat gacaaagaac caggtgtccc tgacttgcct cgtgaagggc 600 ttctacccat ccgacatcgc tgtggagtgg gagagcaacg gccagcccga gaacaactac 660 aagactactc ctccagtgct cgacagcgac ggcagcttct tcctgtactc cagactcaca 720 gtggacaagt cccgttggca ggagggcaac gtgttctctt gctccgtgat gcacgaggcc 780 ctccacaacc actacactca gaagtccctg tctctgtccc tgggcggagg tggcggctct 840 ggaggcggag gtagtggtgg cggcggttca ctgcccgaaa ctggg 885 <210> 5 <211> 290 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GLP1-L1-Fc2-L2-ST amino acid sequence <400> 5 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Gly Gly 20 25 30 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Val 35 40 45 Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe 50 55 60 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 65 70 75 80 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 85 90 95 Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 100 105 110 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val 115 120 125 Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 130 135 140 Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 145 150 155 160 Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 165 170 175 Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 180 185 190 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 195 200 205 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp 210 215 220 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 225 230 235 240 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 245 250 255 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Ser Gly 260 265 270 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu Pro Glu 275 280 285 Thr Gly 290 <210> 6 <211> 870 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GLP1-L1-Fc2-L2-ST nucleotide sequence <400> 6 cacggcgagg gaacattcac cagcgacgtg tccagctacc tggaggagca ggccgccaag 60 gagtttatcg cctggctcgt gaaaggaggc ggcggcggag gaggttctgg cggcggcggc 120 tccggcggag gcggatccgc tgttgaatgt cctccatgtc cagctccacc agttgctggg 180 ccttccgtct tcctattccc cccaaagcct aaggacaccc tgatgatatc tcgtacccct 240 gaggtgacct gtgtcgtagt ggatgtgagt catgaagatc cagaagtgca gttcaactgg 300 tatgtggatg gtgtcgaagt gcataatgct aagaccaagc cacgagagga gcagtttaac 360 tcaaccttta gggttgtgag tgtgttgact gtcgtccatc aagattggtt aaacggtaaa 420 gaatacaagt gtaaagtctc caacaaggga ttgcctgccc ctattgagaa gaccatttcc 480 aagacgaaag gccaaccacg tgagcctcaa gtgtatactc tacccccaag tcgagaggag 540 atgactaaga atcaagtctc acttacgtgt cttgtcaaag gtttctaccc atcagacatt 600 gccgtggagt gggagtcaaa tggtcaaccc gagaataatt ataagaccac tccccccatg 660 ttagactcag acggttcttt cttcttgtac tctaaactta ctgtcgacaa atcccgatgg 720 caacaaggca atgtgttctc ctgttccgtc atgcacgagg ccttacacaa tcactatacc 780 cagaaatcct tgtctttgtc tccagggggt tctggcggtg gctccggtgg aggcggaagc 840 ggcggtggag gatcactgcc cgaaactggg 870 <210> 7 <211> 275 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GLP1-L1-Fc2-ST amino acid sequence <400> 7 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Gly Gly 20 25 30 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Val 35 40 45 Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe 50 55 60 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 65 70 75 80 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 85 90 95 Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 100 105 110 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val 115 120 125 Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 130 135 140 Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 145 150 155 160 Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 165 170 175 Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 180 185 190 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 195 200 205 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp 210 215 220 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 225 230 235 240 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 245 250 255 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Leu Pro 260 265 270 Glu Thr Gly 275 <210> 8 <211> 825 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GLP1-L1-Fc2-ST nucleotide sequence <400> 8 cacggcgagg gaacattcac cagcgacgtg tccagctacc tggaggagca ggccgccaag 60 gagtttatcg cctggctcgt gaaaggaggc ggcggcggag gaggttctgg cggcggcggc 120 tccggcggag gcggatccgc tgttgaatgt cctccatgtc cagctccacc agttgctggg 180 ccttccgtct tcctattccc cccaaagcct aaggacaccc tgatgatatc tcgtacccct 240 gaggtgacct gtgtcgtagt ggatgtgagt catgaagatc cagaagtgca gttcaactgg 300 tatgtggatg gtgtcgaagt gcataatgct aagaccaagc cacgagagga gcagtttaac 360 tcaaccttta gggttgtgag tgtgttgact gtcgtccatc aagattggtt aaacggtaaa 420 gaatacaagt gtaaagtctc caacaaggga ttgcctgccc ctattgagaa gaccatttcc 480 aagacgaaag gccaaccacg tgagcctcaa gtgtatactc tacccccaag tcgagaggag 540 atgactaaga atcaagtctc acttacgtgt cttgtcaaag gtttctaccc atcagacatt 600 gccgtggagt gggagtcaaa tggtcaaccc gagaataatt ataagaccac tccccccatg 660 ttagactcag acggttcttt cttcttgtac tctaaactta ctgtcgacaa atcccgatgg 720 caacaaggca atgtgttctc ctgttccgtc atgcacgagg ccttacacaa tcactatacc 780 cagaaatcct tgtctttgtc tccagggaaa ctgcccgaaa ctggg 825 <210> 9 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 9 Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 10 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 10 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 1 5 10 15 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 20 25 <210> 11 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 11 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser 20 <210> 12 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 12 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 1 5 10 15 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 20 25 30 Gly Gly Gly Gly Ser 35 <210> 13 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 13 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser 20 <210> 14 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 14 Pro Arg Phe Gln Asp Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu 1 5 10 15 Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro 20 25 30 Gln <210> 15 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 15 Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg 1 5 10 15 Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln 20 25 <210> 16 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 16 Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser 1 5 10 <210> 17 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 17 Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln 1 5 10 <210> 18 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 18 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala 1 5 10 15 <210> 19 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 19 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 20 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 20 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 21 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 21 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 22 <211> 292 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GLP1-L1-Fc4-L2-STG3 amino acid sequence <400> 22 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Gly Gly 20 25 30 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Glu 35 40 45 Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala 50 55 60 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 65 70 75 80 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 85 90 95 Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 100 105 110 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr 115 120 125 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 130 135 140 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser 145 150 155 160 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 165 170 175 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val 180 185 190 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 195 200 205 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 210 215 220 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr 225 230 235 240 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 245 250 255 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 260 265 270 Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu Pro Glu 275 280 285 Thr Gly Gly Gly 290 <210> 23 <211> 876 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GLP1-L1-Fc4-L2-STG3 nucleotide sequence <400> 23 cacggcgagg gcactttcac atccgacgtg tctagctact tggaagagca ggccgctaag 60 gagttcatcg cttggctcgt gaagggaggt ggtggtggag gtggatctgg cggaggagga 120 tctggaggtg gaggaagcgc cgagtccaag tacggacctc catgcccacc ttgcccagca 180 ccagaggccg ctggcggccc atctgtgttc ctgttcccac caaagccaaa ggacacactc 240 atgattagcc ggacccctga ggtgacatgc gtggtggtgg acgtgtctca ggaggacccc 300 gaggtgcagt tcaactggta cgtggacggc gtggaggtgc acaacgctaa gaccaagcca 360 cgcgaggagc agttcaacag cacataccgg gtggtgagcg tgctgactgt gctgcaccag 420 gactggctga acggcaagga gtacaagtgc aaggtgtcta acaagggcct gcctagctct 480 attgaaaaga ctatttctaa ggctaagggc cagcctagag agcctcaggt gtacacactg 540 ccaccttctc aggaggagat gacaaagaac caggtgtccc tgacttgcct cgtgaagggc 600 ttctacccat ccgacatcgc tgtggagtgg gagagcaacg gccagcccga gaacaactac 660 aagactactc ctccagtgct cgacagcgac ggcagcttct tcctgtactc cagactcaca 720 gtggacaagt cccgttggca ggagggcaac gtgttctctt gctccgtgat gcacgaggcc 780 ctccacaacc actacactca gaagtccctg tctctgtccc tgggcggagg aggtggatct 840 ggtggaggcg gatctctgcc cgaaactggg ggtgga 876

Claims (19)

1개 또는 2개의 친수성 중합체가 GLP-1 수용체 효능제 융합 단백질의 C-말단에 부착된, 접합체로서,
상기 GLP-1 수용체 효능제 융합 단백질은 GLP-1 수용체 효능제 및 생체내 상기 융합 단백질의 반감기를 증가시킬 수 있는 융합 파트너 (FP)를 포함하고,
상기 GLP-1 수용체 효능제는 엑센딘-4, GLP-1(1-36), GLP-1(1-37), GLP-1(7-36), GLP-1(7-37), 리라글루티드, 릭시세나티드, 알비글루티드, 둘라글루티드, 및 세마글루티드로 이루어진 그룹으로부터 선택되고,
상기 융합 파트너는 GLP-1 수용체 효능제의 C-말단에 직접 또는 제1 링커 L1을 통해 연결된 Fc 단편이고, 상기 제1 링커 L1은 A, T, G 및/또는 S를 포함하는 가요성 펩타이드이고,
상기 친수성 중합체는 분자량이 20 kDa 또는 40 kDa인 폴리에틸렌 글리콜(PEG)이고, 상기 폴리에틸렌 글리콜은 Fc 단편에 연결된, 접합체.
제1항에 있어서, 상기 제1 링커 L1은 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 접합체:
GSGGGSGGGGSGGGGS (서열번호 9),
GSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (서열번호 10),
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (서열번호 11),
GSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (서열번호 12),
GGGSGGGSGGGSGGGSGGGS (서열번호 13),
PRFQDSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ (서열번호 14),
SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ (서열번호 15),
SSSSKAPPPS (서열번호 16),
SRLPGPSDTPILPQ (서열번호 17) 및
GGGGSGGGGSGGGGSA (서열번호 18).
제1항에 있어서, 상기 융합 파트너(FP)가
인간 면역글로불린 Fc 단편으로부터 유래한 Fc 단편인, 접합체.
제3항에 있어서, 상기 Fc 단편이 IgG Fc 단편으로부터 유래하는, 접합체.
제4항에 있어서, 상기 Fc 단편이 IgG2 또는 IgG4의 Fc 단편으로부터 유래하는, 접합체.
제4항에 있어서, IgG Fc 단편이 감소된 ADCC 효과 및/또는 CDC 효과 및/또는 FcRn에 대해 증진된 결합 친화성을 갖는, 접합체.
제1항에 있어서, 상기 융합 파트너(FP)가 또한 소르타제 인지 부위를 함유하는 아미노산 서열 ST에 직접 또는 제2의 링커 L2를 통해 연결되고, 상기 소르타제가 소르타제 A 또는 소르타제 B인, 접합체.
제7항에 있어서, 상기 ST의 서열이, LPETG, LPETGG 또는 LPETGGG로 이루어진 그룹으로부터 선택된, 접합체.
제7항에 있어서, 상기 제2의 링커 L2는 A, T, G 및/또는 S을 함유하는 가요성 펩타이드인, 접합체.
제7항에 있어서, 상기 제2의 링커 L2가 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 접합체:
GSGGGSGGGGSGGGGS (서열번호 9),
GGGGSGGGGSGGGGSA (서열번호 18),
GGGGS (서열번호 19),
GGGGSGGGGS (서열번호 20), 및
GGGGSGGGGSGGGGS (서열번호 21).
제1항에 있어서, 상기 융합 단백질이 단량체 또는 이량체 형태로 존재하는, 접합체.
제1항에 있어서,
상기 폴리에틸렌 글리콜이 선형 또는 분지형인, 접합체.
제12항에 있어서, 상기 폴리에틸렌 글리콜은 분지형 폴리에틸렌 글리콜인, 접합체.
제7항의 접합체를 제조하기 위한 방법으로서, 상기 방법은 상기 융합 단백질과 소르타제 A 또는 소르타제 B 및 친수성 중합체를 접촉시키는 단계를 포함하고, 상기 친수성 중합체의 하나의 말단은 소르타제에 의해 아미드화될 수 있는 아미노 그룹을 갖는, 방법.
제14항에 있어서, 상기 친수성 중합체의 하나의 말단이 폴리-Gly를 함유하는, 방법.
제15항에 있어서, 상기 친수성 중합체의 하나의 말단이 GGGAA를 함유하는 , 방법.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 유효량의 접합체 및 임의로 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 혈당 또는 체중을 감소시키기 위한 약제학적 조성물.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 접합체 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 당뇨병을 치료하기 위한 약제학적 조성물.
제18항에 있어서, 상기 당뇨병이 I형 당뇨병 또는 II형 당뇨병인, 약제학적 조성물.
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