KR102641194B1 - 개선된 ｔｎｆ 결합제 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 종양 괴사 인자 알파("TNF" 또는 "TNF-알파")에 결합하는 아미노산 서열, 화합물 및 폴리펩타이드에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 종양 괴사 인자 알파에 결합하는 개선된 중쇄 면역글로불린 단일 가변 도메인(본원에서 "ISV" 또는 "ISVD"으로도 지칭됨), 뿐만 아니라 이러한 ISVD를 포함하는 단백질, 폴리펩타이드 및 다른 구축물, 화합물, 분자 또는 화학적 엔터티(entity), 종합적으로 TNF 결합제에 관한 것이다. 본 발명의 다른 양태, 실시형태, 특징, 용도 및 이점들은 본원의 개시내용을 기반으로 당업자에게 명확해질 것이다.

Description

개선된 ＴＮＦ 결합제
본 발명은 종양 괴사 인자 알파("TNF" 또는 "TNF -알파")에 결합하는 아미노산 서열, 화합물 및 폴리펩타이드에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 종양 괴사 인자 알파에 결합하는 개선된 중쇄 면역글로불린 단일 가변 도메인(본원에서 "ISV" 또는 "ISVD"으로도 지칭됨), 뿐만 아니라 이러한 ISVD를 포함하는 단백질, 폴리펩타이드 및 다른 구축물, 화합물, 분자 또는 화학적 엔터티(entity), 종합적으로 TNF 결합제에 관한 것이다. 본 발명의 다른 양태, 실시형태, 특징, 용도 및 이점들은 본원의 개시내용을 기반으로 당업자에게 명확해질 것이다.
본 출원에서, 면역글로불린 중쇄 가변 도메인 내 아미노산 잔기/위치는 카바트(Kabat)에 따른 넘버링으로 표시될 것이다. 편의를 위해, 도 1은, 본원에서 구체적으로 지칭될 일부 아미노산 위치들, 및 일부 대안적인 넘버링 시스템(예컨대 아호(Aho) 및 IMGT. 주: 명백하게 다르게 지시되지 않는 한, 본 상세한 설명 및 청구항에서 카바트 넘버링이 결정적이며; 다른 넘버링 시스템은 단지 참조로서 주어짐)에 따른 이들 위치의 넘버링을 열거하는 표를 제공한다.
CDR과 관련하여, 당업계에 잘 공지된 바와 같이, VH 또는 VHH 단편의 CDR을 정의하고 기재하기 위한 다수의 관례들, 예컨대 카바트 정의(서열 가변성을 기반으로 하고 가장 보편적으로 사용됨) 및 코티아(Chothia) 정의(구조적 루프 영역의 위치를 기반으로 함)가 존재한다. 예를 들어, 웹사이트 https://www.bioinf.org.uk/abs/를 참조한다. 본 명세서 및 청구항의 목적을 위해, 카바트에 따른 CDR이 또한 언급될 수 있더라도, CDR은 가장 바람직하게는, Abm 정의(옥스포드 분자 AbM 항체 모델링 소프트웨어를 기반으로 함)가 카바트 정의와 코티아 정의 사이에서 최적의 타협인 것으로 간주되기 때문에, 이러한 Abm 정의를 기반으로 정의된다. 마찬가지로, 웹사이트　https://www.bioinf.org.uk/abs/를 참조한다.
염증성 장질환(IBD; inflammatory bowel disease), 크론병(CD; Crohn's disease) 및 궤양성 대장염(UC; ulcerative colitis)은 만성, 불능화(disabling) 및 진행성 질병이다. 대부분의 비-생물학적 약물 요법들, 예컨대 아미노살리실레이트, 스테로이드 및 면역조정제가 증상적인(symptomatic) 개선은 제공하나, 기저(underlying) 염증 과정은 중단시키지 못하고, 질병 경로(disease course)를 변화시키지 않는다. 항종양 괴사 인자-α(항-TNF-α) 제제(인플릭시맙(infliximab), 아달리무맙(adalimumab), 세르톨리주맙(certolizumab) 페골(pegol))의 출현은, 질병 경로(CD 및 UC 둘 다에서 더 적은 수술 횟수, 더 적은 입원, 더 양호한 삶의 질, 스테로이드 감량(sparing), 더 큰 임상적 관해 및 점막 치유 속도)와 환자의 삶의 질 및 노동 생산성 둘 다를 변화시킴으로써 IBD가 치료되는 방식을 크게 변화시켰다(문헌[Amiot and Peyrin-Biroulet 2015 Ther Adv Gastroenterol 8:66-82] 참조). 이들 치료용 단백질의 가장 보편적인 투여 경로는 주사이다. 이들 단백질의 대부분은 짧은 혈청 반감기를 갖고 있기 때문에, 이들 단백질이 효과가 있으려면 빈번하게 또는 고용량으로 투여될 필요가 있다. 더욱이, 전신 투여는 증가된 감염 위험성과 연관이 있다. 이들이 함께, 환자의 응낙 상태(patient compliance)의 소실을 초래한다(문헌[Singh et al. 2008 J Pharm Sci 97:2497-2523] 참조).
그러나, 결핵 및 비호지킨 림프종을 포함하여 요망되지 않는 장기간 부작용 및 기회 감염은 전반적인 면역억제에 의해 유발되고, 현재 사용되는 모노클로날 항체 치료의 반복된 전신 주사로 인한 것이다(문헌[Ali et al., 2013; Galloway et al., 2011; Ford & Peyrin-Biroulet, 2013; Kozuch & Hanauer, 2008; Schreiber et al., 2007; Syed et al., 2013]).
항-TNF-α 항체의 경구 투여는 이들 부작용 중 일부를 피할 것이다.
그러나, 이들 항-TNF-α 제제는 복합적인 단백질이다. 경구 전달은 위장(GI)관의 산성 및 프로테아제-풍부한 환경에서 분해를 초래한다.
치료용 항체를 보호하기 위해 디코이(decoy) 단백질을 사용하는 경우, 경구 경로를 통해 투여되는, 인간 TNF 알파에 대한 폴리클로날 소(bovine) 초유(colostral) 항체(AVX-470)를 포함하는 환자-기반 연구는 최근, Avaxia Biologics Inc사에 의해 수행된 바 있다. 그러나, 이 연구는 중단되었다.
따라서, 새로운 IBD 약물이 요망되고 있다.
TNF에 결합할 수 있는 ISVD(및 특히 나노바디(nanobody))들 및 이들의 용도는 당업계에서, 예를 들어 WO 2004/041862 및 WO 2006/122786으로부터 잘 공지되어 있으며, 이들 문헌은 TNF에 대한 나노바디들, 및 TNF-α 또는 TNF-α 신호전달과 연관이 있고/있거나 매개되는 질병 및 장애, 예컨대 염증, 류마티스 관절염, 크론병, 궤양성 대장염, 염증성 장 증후군, 다발성 경화증, 애디슨병, 자가면역 간염, 자가면역 이하선염, 1형 당뇨병, 부고환염, 사구체신염, 그레이브스병, 길랑 바레 증후군, 하시모토병, 용혈성 빈혈, 전신 홍반성 루푸스, 남성 불임, 중증 근무력증, 수포창, 건선, 류마티스 열, 유육종증(sarcoidosis), 경피증, 쇼그렌 증후군, 척추관절증(spondyloarthropathy), 갑상선염 및 맥관염의 예방 및/또는 치료를 위한 이들 나노바디의 용도를 기재하고 있다.
WO 2006/122786은 NC55TNF_NC7(PMP6C11)로 지칭되는 특이적인 항-TNF-α 나노바디를 서열 번호 125로서 개시하고 있다. 이러한 선행 기술의 나노바디의 서열은 하기 표 A에서 서열 번호 58로 주어져 있다. 표 A는 또한, 이러한 선행 기술의 TNF 결합제의 서열 최적화된 버전(본원에서 "참조 A"로도 지칭됨)의 서열을 이의 CDR(카바트 관례 및 Abm 관례에 따름)과 함께 (서열 번호 1로서) 제공한다. 도 2의 정렬로부터 알 수 있듯이, 이러한 서열 최적화된 버전은 선행 기술의 서열 번호 58의 서열과 비교하여, 하기 돌연변이: Q1E, A14P, Q27F, S29F, P40A, A49S, K73N, Q75K, V78L, D82aN, K83R 및 Q108L(카바트 넘버링에 따름)을 함유한다.
WO 2015/1733256은 소위 기존의 항체("PEA"; pre-existing antibody)의 결합을 방지하는 C-말단 연장을 포함하는 개선된 면역글로불린 도메인에 관한 것이다. WO 2015/1733256은 특이적인 항-TNF-α 나노바디로서 서열 번호 345를 개시하고 있으며, 이는 본원에서 또한 TNF345(서열 번호 59)로서 지칭된다. 도 2의 정렬로부터 알 수 있듯이, 서열 최적화된 버전 참조 A는 선행 기술의 서열 번호 59의 서열과 비교하여, 하기 돌연변이: V11L 및 L89V(카바트 넘버링에 따름)를 함유한다.
독소-중화 라마(llama) 모노클로날 VHH 항체 단편들의 칵테일이 최근, 잠재적인 경구 요법에 대해 제안되었다(문헌[Hussack et al., 2011 J Biol Chem 286, 8961-76]). 그러나, Dumoulin 등(문헌[2002 Protein Sci, 11, 500-15]), Harmsen 등(문헌[2006 Appl Microbiol Biotechnol, 72, 544-51]) 및 Hussack 등(문헌[2012 Methods Mol Biol, 911, 417-29])은, 단일 도메인 라마 항체 단편이 인간 위장계 내에서 단백분해성 파괴에 대단히 취약한 것으로 보인다고 주장하였다.
WO2007/025977은 경구 투여되는 엘. 락티스(L. lactis) 박테리아에 의한 항-mTNF 나노바디의 인 시추 분비를 수반하는, 만성 전장염(enterocolitis)의 치료를 기재하고 있다.
본 발명은 개선된 TNF 결합제, 특히 개선된 항-TNF 화합물 및 폴리펩타이드, 보다 특히 항-TNF ISVD, 보다 더 특히 개선된 항-TNF 나노바디를 제공하는 것을 목적으로 한다. 본 발명에 의해 제공되는 개선된 TNF 결합제는 또한 본원에서, "본 발명의 TNF 결합제" 또는 "TNF 결합제"로서 지칭된다.
보다 특히, 본 발명은 소화관의 질병, 예컨대 염증성 장질환(IBD), 과민성 대장 증후군, 크론병, 궤양성 대장염, 점막염, 아프타성 구내염(aphthous stomatitis), 셀리악 병, 소화관에 대한 외상 및/또는 소화관에 대한 암의 치료에 유용할 개선된 TNF-결합제를 제공하는 것을 목적으로 한다. 이들 TNF-결합제는 바람직하게는, 경구 투여에 안정하고 가능할 것이다.
경구 투여된 TNF-결합제는 소화관 내강(lumen)에서 TNF를 중화시킬 뿐만 아니라, 비제한적으로 치주병, 아프타성 구내염, 소화관의 박테리아, 바이러스, 진균류 또는 기생충 감염, 소화성 궤양, 스트레스 또는 에이치. 파일로리(H. pylori) 감염과 연관된 궤양, 식도 역류에 의해 유발된 손상, 염증성 장질환, 소화관에 대한 암에 의해 유발된 손상, 셀리악 병을 포함한 음식 과민증, 또는 NSAID 또는 다른 섭취된 또는 전신 전달된 약물에 의해 유도되는 궤양을 포함하여 총체적인(gross) 염증 및/또는 궤양화를 통해 소화관의 장 장벽(intestinal barrier)이 관통(breach)되거나 손상(compormise)될 수 있으므로, 고유판(lamina propria) 및 점막하층(submucosa)까지 접근하게 되는 것으로 예상된다.
따라서, 본 발명은, 참조 A의 변이체이며, 일부 건강한 인간 피험자들뿐만 아니라 환자들 유래의 혈청에 존재할 수 있는 인자(일반적으로 "기존의 항체" 또는 "PEA"로 지칭됨)를 방해함으로써 결함을 감소시킨, 개선된 TNF 결합제를 제공하는 것을 목적으로 한다. WO 2012/175741, WO 2013/024059 및 또한 예를 들어 Holland 등(문헌[J. Clin. Immunol. 2013, 33(7):1192-203]), 뿐만 아니라 2015년 5월 13일에 출원된 발명의 명칭이 "개선된 면역글로불린 가변 도메인"인 Ablynx N.V.에 의한 동시계속 공개 PCT 출원 WO2015/173325(출원 번호 PCT/EP2015/060643)를 참조로 한다.
본원에 더 기재된 바와 같이, 본 발명의 TNF 결합제는 바람직하게는, 참조 A에 제시된 바와 동일한 CDR들(즉, CDR1, CDR2 및 CDR3)의 조합을 가진다.
본 발명의 일부 바람직하지만 비제한적인 TNF 결합제들은 도 3a~도 3f에서 서열 번호 8 내지 41, 62, 63, 64, 65, 66 및 69로서 열거되어 있다. 도 4a~도 4b는 서열 번호 8-41과 서열 번호 1(참조 A) 및 서열 번호 58(PMP6C11)의 정렬을 보여준다. 서열 번호 22 내지 41, 62-66 및 69의 결합제들은 C-말단 알라닌 연장, 즉, 유용한 C-말단 서열 VTVSS(참조 A에 제시된 바와 같이 서열 번호 55)와 비교하여 ISVD-서열의 C-말단(또한 이따금 "위치 114"로 지칭됨)에 알라닌 잔기를 가진 본 발명의 TNF 결합제의 예들이다. WO 2012/175741(그러나 또한 예를 들어 WO 2013/024059 및 WO2015/173325에 있음)에 기재된 바와 같이, 이러한 C-말단 알라닌 연장은 ISVD의 C-말단 영역에 위치한 추정상 에피토프(putative epitope)에 소위 "기존의 항체"(IgG로 추정됨))가 결합되는 것을 방지할 수 있다. 이러한 에피토프는 다른 잔기들 중에서, C-말단 서열 VTVSS의 표면-노출된 아미노산 잔기뿐만 아니라 위치 14에 아미노산 잔기(및 아미노산 서열에서의 아미노산 잔기 다음의/근접한 아미노산 잔기, 예컨대 위치 11, 13 및 15)를 포함하는 것으로 추정되고, 또한, 위치 83에 아미노산 잔기(및 아미노산 서열에서의 아미노산 잔기 다음의/근접한 아미노산 잔기, 예컨대 위치 82, 82a, 82b 및 84) 및/또는 위치 108에서의 아미노산 잔기(및 아미노산 서열에서의 아미노산 잔기 다음의/근접한 아미노산 잔기, 예컨대 위치 107)를 포함할 수 있다.
그러나, 이러한 C-말단 알라닌(또는 일반적으로 C-말단 연장)의 존재가, 다양한 피험자들(건강한 피험자뿐만 아니라 환자 둘다) 유래의 혈청에서 발견될 수 있는 "기존의 항체"의 결합을 대단히 감소시킬 수 있긴 하지만(또한 많은 경우에는 심지어 본질적으로 완전히 방지할 수 있음), 일부 피험자들 유래의 혈청(예컨대 일부 면역 질병, 예컨대 SLE를 가진 환자 유래의 혈청)은 심지어 ISVD가 이러한 C-말단 알라닌(또는 보다 일반적으로 이러한 C-말단 연장)을 함유하는 경우 ISVD의 C-말단 영역(이러한 영역이 노출된 경우)에 결합할 수 있는 기존의 항체를 함유할 수 있는 것으로 확인되었다. 마찬가지로, 2015년 5월 13일에 출원되고 발명의 명칭이 "개선된 면역글로불린 가변 도메인"인 Assignee에 의한 동시계속 공개 PCT 출원 WO2015/173325를 참조한다.
이에, 본 발명의 하나의 구체적인 목적은, 본원에서 "참조 A"로 지칭되는 항-TNF 나노바디의 개선된 변이체이면서 소위 "기존의 항체", 특히 WO2015/173325에 기재된 종류(즉, 심지어 C-말단 연장의 존재 하에서도 ISVD의 노출된 C-말단 영역에 결합할 수 있는 기존의 항체)에 의한 결합을 감소시킨 TNF 결합제를 제공하는 것이다.
일반적으로, 본 발명은 하기 아미노산 잔기(즉, 서열 번호 1의 서열과 비교하여 돌연변이)를 포함하는 서열 번호 1의 서열의 변이체인 아미노산 서열을 제공함으로써 이러한 목적을 달성한다:
- 89T; 또는
- 11V와 조합된 89L; 또는
- 110K 또는 110Q와 조합된 89L; 또는
- 112K 또는 112Q와 조합된 89L; 또는
- 11V 및 110K 또는 110Q와 조합된 89L; 또는
- 11V 및 112K 또는 112Q와 조합된 89L; 또는
- 110K 또는 110Q와 조합된 11V; 또는
- 112K 또는 112Q와 조합된 11V.
특히, 본 발명에 의해 제공되는 TNF 결합제에서:
­ 위치 11의 아미노산 잔기는 바람직하게는 L 또는 V로부터 선택되며;
­ 위치 89의 아미노산 잔기는 바람직하게는 T, V 또는 L로부터 적합하게 선택되며;
­ 위치 110의 아미노산 잔기는 T, K 또는 Q로부터 선택되고;
­ 위치 112의 아미노산 잔기는 바람직하게는 S, K 또는 Q로부터 적합하게 선택되어,
(i) 위치 89는 T이거나; (ii) 위치 89는 L이고, 위치 11은 V이거나; (iii) 위치 89는 L이고, 위치 110은 K 또는 Q이거나; (iv) 위치 89는 L이고, 위치 112는 K 또는 Q이거나; (v) 위치 89는 L이고, 위치 11은 V이고, 위치 110은 K 또는 Q이거나; (vi) 위치 89는 L이고, 위치 11은 V이고, 위치 112는 K 또는 Q이거나; (vii) 위치 11은 V이고, 위치 110은 K 또는 Q이거나; (vii) 위치 11은 V이고, 위치 112는 K 또는 Q가 된다.
본 발명에 의해 제공되는 아미노산 서열 중에서, 위치 89가 T이거나 위치 11이 V이고, 위치 89가 L(선택적으로 110K 또는 110Q 돌연변이 및/또는 112K 또는 112Q 돌연변이와의 적합한 조합, 특히 110K 또는 110Q 돌연변이와의 조합에서)인 아미노산 서열이 특히 바람직하다. 위치 11이 V이고, 위치 89가 L이며, 선택적으로 110K 또는 110Q 돌연변이를 가진 아미노산 서열이 더욱 더 바람직하다.
특히 바람직한 실시형태에서, 본 발명에 의해 제공되는 TNF 결합제에서, 위치 11의 아미노산 잔기는 V이며, 위치 89의 아미노산 잔기는 L이며, 위치 110의 아미노산 잔기는 T이고, 위치 112의 아미노산 잔기는 S이다.
특히 바람직한 실시형태에서, 본 발명은 TNF 결합제, 예컨대 면역글로불린 단일 가변 도메인(ISVD)에 관한 것으로서, 이는
- 아미노산 서열 GFTFSTADMG(서열 번호 5)인 CDR1(Abm에 따름);
- 아미노산 서열 RISGIDGTTY(서열 번호 6)인 CDR2(Abm에 따름); 및
- 아미노산 서열 PRYADQWSAYDY(서열 번호 4)인 CDR3(Abm에 따름)
를 가지고,
- 서열 번호 1의 아미노산 서열과 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 90%, 보다 바람직하게는 적어도 95%의 서열 동일성 정도(여기서, CDR뿐만 아니라 존재할 수 있는 임의의 C-말단 연장은 서열 동일성 정도를 확인하는 데 고려되지 않음);
및/또는
- 서열 번호 1의 아미노산 서열과 7개 이하, 예컨대 5개 이하, 바람직하게는 3개 이하, 예컨대 단지 3개, 2개 또는 1개의 "아미노산 차이"(본원에 정의된 바와 같이, 존재할 수 있는 위치(들) 11, 89, 110 또는 112에서 상기 열거된 돌연변이 중 어느 것도 고려하지 않고 존재할 수 있는 임의의 C-말단 연장을 고려하지 않음)(여기서, 상기 아미노산 차이는, 존재한다면, 프레임워크 및/또는 CDR에 존재할 수 있으나 바람직하게는 CDR이 아니라 프레임워크에만 존재함)
를 가지고,
- 위치 11의 아미노산 잔기는 V이며;
- 위치 89의 아미노산 잔기는 L이며;
- 위치 110의 아미노산 잔기는 T이며;
- 위치 112의 아미노산 잔기는 S이며;
- 위치 49의 아미노산 잔기는 A이고;
- 위치 74의 아미노산 잔기는 S이다.
언급된 바와 같이, 본원에 기재된 본 발명에 의해 제공되는 아미노산 서열은 TNF에 결합할 수 있다(특히, 특이적으로 결합할 수 있다).
본 발명에 의해 제공되는 아미노산 서열은 바람직하게는, WO 04/041862의 3) 하에 실시예 1에 기재된 KYM 세포를 사용한 세포-기반 검정법에서 EC50 값을 50 nM보다 양호하게, 보다 바람직하게는 25 nM보다 양호하게, 예컨대 10nM 미만으로 가진다.
표 B는 본 발명의 TNF 결합제에서 위치 11, 89, 110 및 112에 존재할 수 있는 아미노산 잔기들의 일부 비제한적인 가능한 조합들을 열거하고 있다. 특히 바람직한 조합들은 볼드체로 표시되어 있고, 가장 바람직한 실시형태는 볼드체/밑줄 로 표시되어 있다.
그러나, TNF-결합제의 서열을, 한편으로는 기존의 항체에 대한 결합 부위를 최소화하거나 없애고 다른 한편으로는 인간화하는 측면에서 최적화하는 경우("서열 최적화"), TNF-결합제의 안정성을 포함하여 다양한 특성들은 (뚜렷하게) 부정적으로 영향을 받았다. 특히, 물리적 안정성에 대한 측정치인 용융점이 저하하였고, 진핵 숙주 피. 파스토리스(P. pastoris) 및 원핵 숙주 이. 콜라이(E. coli) 둘 다에서의 제조가 줄어들었고, GI 유체에서의 안정성이 감소되었다.
PEA에 대한 결합 부위 및 인간화 돌연변이를 "복귀 돌연변이화(mutating back)"시킴으로써 서열 최적화와 타협하는 대신에, 본 발명자들은 놀랍게도, 2개의 외견상 상호적으로 독점적인 요건들이 충족되도록 아미노산 잔기 49 및/또는 74가 변경될 수 있음을 확인하였다. 표 B-1 및 B-2는, 본 발명의 TNF 결합제에서 위치 11, 89, 110, 112, 49 및/또는 74에 존재할 수 있는 아미노산 잔기들의 일부 비제한적인 가능한 조합들을 열거하고 있다.
본 발명에 의해 제공되는 TNF 결합제는 본원의 상세한 설명, 실시예 및 도면에 더 기재된 바와 같으며, 즉, 이들 결합제는 본원에 기재된 바와 같은 CDR을 가지고, 본원에 개시된 바와 같은 서열 번호 1의 서열과 전체적인 서열 동일성 정도(본원에 정의된 바와 같음)를 가지고/갖거나 이들 참조 서열들(중 하나)과 제한된 수의 "아미노산 차이"(본원에 기재된 바와 같음)를 가질 수 있다.
본 발명의 TNF 결합제는 바람직하게는 하기 CDR(카바트 관례에 따름)을 포함한다:
- 아미노산 서열 TADMG(서열 번호 2)인 CDR1(카바트에 따름);
- 아미노산 서열 RISGIDGTTYYDEPVKG(서열 번호 3)인 CDR2(카바트에 따름); 및
- 아미노산 서열 PRYADQWSAYDY(서열 번호 4)인 CDR3(카바트에 따름).
대안적으로, CDR이 Abm 관례에 따라 주어지는 경우, 본 발명의 TNF 결합제는 바람직하게는, 하기 CDR을 포함한다:
- 아미노산 서열 GFTFSTADMG(서열 번호 5)인 CDR1(Abm에 따름);
- 아미노산 서열 RISGIDGTTY(서열 번호 6)인 CDR2 (Abm에 따름); 및
- 아미노산 서열 PRYADQWSAYDY(서열 번호 4)인 CDR3(Abm에 따름).
본 발명의 TNF 결합제는 바람직하게는 또한,
- 서열 번호 1의 아미노산 서열과 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 90%, 보다 바람직하게는 적어도 95%의 서열 동일성 정도(여기서, CDR뿐만 아니라 존재할 수 있는 임의의 C-말단 연장은 서열 동일성 정도를 확인하는 데 고려되지 않음); 및/또는
- 서열 번호 1의 아미노산 서열과 7개 이하, 예컨대 5개 이하, 바람직하게는 3개 이하, 예컨대 단지 3개, 2개 또는 1개의 "아미노산 차이"(본원에 정의된 바와 같이, 존재할 수 있는 위치(들) 11, 89, 110 또는 112에서 상기 열거된 돌연변이 중 어느 것도 고려하지 않고 존재할 수 있는 임의의 C-말단 연장을 고려하지 않음)(여기서, 상기 아미노산 차이는, 존재한다면, 프레임워크 및/또는 CDR에 존재할 수 있으나 바람직하게는 CDR이 아니라 프레임워크에만 존재함)
를 가진다.
본 발명에 의해 제공되는 본 발명의 TNF 결합제의 다양한 양태들 및 바람직한 양태들과 관련하여, 본 발명의 이러한 결합제에 존재할 수 있는(즉, 서열 번호 1의 서열과 비교하여) 서열 번호 1에 대한 서열 동일성 정도 및/또는 "아미노산 차이"의 수 및 종류에 관하여, (i) 본 발명의 아미노산 서열이 서열 번호 1의 서열과 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 90%, 보다 바람직하게는 적어도 95%의 서열 동일성 정도를 가진다고 하는 경우(여기서, CDR, 존재할 수 있는 임의의 C-말단 연장, 뿐만 아니라 관여된 특정 양태에 의해 요구되는 위치 11, 89, 110 및/또는 112에서의 돌연변이는 서열 동일성 정도의 확인에 고려되지 않음); 및/또는 (ii) 본 발명의 아미노산 서열이 서열 번호 1의 서열과 7개 이하, 바람직하게는 5개 이하, 예컨대 단지 3개, 2개 또는 1개의 "아미노산 차이"를 가진다고 하는 경우(마찬가지로, 존재할 수 있는 임의의 C-말단 연장을 고려하지 않고 관여된 특정한 양태에 의해 요구되는 위치 11, 89, 110 및/또는 112에서의 돌연변이를 고려하지 않음), 이는 또한, 관여된 특정 양태에 의해 요구되는 위치 11, 89, 110 및/또는 112에서의 돌연변이 이외에 서열 번호 1의 서열과 아미노산 차이를 갖지 않는 서열, 및 존재할 수 있는 임의의 C-말단 연장을 포함함을 주지해야 한다.
따라서, 본 발명의 특정한 일 양태에서, 본 발명의 TNF 결합제는 서열 번호 1과 100% 서열 동일성(CDR을 포함하지만, 본원에 개시된 위치 11, 49, 74 89, 110 및/또는 112에서의 돌연변이(들) 또는 돌연변이들의 조합 및/또는 존재할 수 있는 임의의 C-말단 연장을 고려하지 않음)을 가질 수 있고/있거나 서열 번호 1과 아미노산 차이(즉, 본원에 개시된 위치 11, 89, 110 및/또는 112에서의 돌연변이(들) 또는 돌연변이들의 조합 및 존재할 수 있는 임의의 C-말단 연장 이외의 것)를 갖지 않을 수 있다.
임의의 아미노산 차이가 존재하는 경우(즉, 임의의 C-말단 연장 및 관여된 본 발명의 특정 양태에 의해 요구되는 위치 11, 89, 110 및/또는 112에서의 돌연변이 이외에), 이들 아미노산 차이는 CDR 및/또는 프레임워크 영역에 존재할 수 있으나, 이들은 바람직하게는 프레임워크 영역에만 존재하며(Abm 관례에 의해 정의된 바와 같으며, 즉, Abm 관례에 따라 정의된 바와 같은 CDR이 아님), 즉, 본 발명의 TNF 결합제는 서열 번호 1에 존재하는 것과 동일한 CDR(Abm 관례에 따라 정의됨)을 가지게 된다.
또한, 본 발명의 임의의 양태에 따른 본 발명의 TNF 결합제가 서열 번호 1의 서열과 하나 이상의 아미노산 차이를 갖는 경우(관여된 특정 양태에 의해 요구되는 위치 11, 89, 110 및/또는 112에서의 돌연변이 이외에), 존재할 수 있는 이러한 돌연변이/아미노산 차이들의 일부 구체적이지만 비제한적인 예들(즉, 서열 번호 1의 서열과 비교하여)은 예를 들어 E1D, P40A, P40L, P40S(특히 P40A), S49A, A74S, L78V, T87A 또는 이들의 임의의 적합한 조합이다. 또한, 본 발명의 TNF 결합제는 적합하게는, D60A, E61D 및/또는 P62S 돌연변이(이들의 적합한 조합)를 특히 위치 60-62에서의 ADS 모티프(비제한적인 예로서 서열 번호 39를 참조)로서 포함할 수 있다. 돌연변이의 다른 예들은 하나 이상의 적합한 "인간화" 치환(이들의 적합한 조합)이며; 예를 들어 WO 2009/138519(또는 WO 2009/138519에 인용된 선행 기술) 및 WO 2008/020079(또는 WO 2008/020079에 인용된 선행 기술), 뿐만 아니라 WO 2008/020079의 표 A-3 내지 A-8(가능한 인간화 치환을 보여주는 리스트임)을 참조한다.
상기 언급된 돌연변이들 중에서, S49A, A74S 및/또는 L78V 돌연변이(또는 이들 중 모든 3개를 포함하여 이들 중 임의의 2개의 임의의 적합한 조합)의 존재가 바람직하다(서열 번호 40, 39, 36, 64, 69, 37, 38, 41 및 62-63 참조). 도 5는 서열 번호 1, 서열 번호 31 및 서열 번호 36 내지 41의 정렬을 보여준다.
또한, 본 발명의 TNF 결합제들이, 이들 결합제가 존재하는 폴리펩타이드 또는 화합물의 N-말단 부분에 존재하고/하거나 형성하는 경우, 이들 결합제는 바람직하게는 위치 1에 D(즉, 참조 A와 비교하여 E1D 돌연변이)를 함유한다. 이에 추가의 양태에서, 본 발명은 N-말단에 본 발명의 TNF 결합제(본원에 추가로 기재된 바와 같음)를 가진 본 발명의 폴리펩타이드(본원에 추가로 기재된 바와 같음)에 관한 것이며, 여기서, 상기 본 발명의 TNF 결합제는 위치 1에 D를 가진다.
유사하게는, 본 발명의 TNF 결합제가 1가 포맷으로 사용되는 경우, 이러한 결합제는 바람직하게는, 본원에 기재된 바와 같은 C-말단 연장 X(n), 및 위치 1에 D를 둘 다 가진다.
위치 1에서의 D 및 C-말단 연장을 가진 1가 TNF 결합제의 일부 바람직하지만 비제한적인 예들은 서열 번호 40, 39, 36, 64, 69, 37, 38, 41 및 62-63, 바람직하게는 서열 번호 36, 39 및 40, 가장 바람직하게는 서열 번호 40으로 주어져 있다. 이러한 측면에서, 서열 번호 40, 39, 36, 64, 69, 37, 38, 41 및 62-63의 TNF 결합제는 또한, 1가 포맷이 아닌 본 발명의 화합물 또는 폴리펩타이드에 사용될 수 있음을 주지해야 한다. 이러한 경우, 서열 번호 40, 39, 36, 64, 69, 37, 38, 41 및 62-63의 TNF 결합제들이 바람직하게는 이들의 N-말단에 D 대신에 E(즉, 서열 번호 40, 39, 36, 64, 69, 37, 38, 41 및 62-63의 서열과 비교하여 D1E 돌연변이)를 가지게 될 경우, 이들이 본 발명의 상기 폴리펩타이드 또는 화합물의 N-말단부에 존재하지 않는 경우(대신에 바람직하게는, 본 발명의 상기 폴리펩타이드 또는 화합물의 N-말단 ISVD가 위치 1에 D를 가지게 될 경우); 또한, 이들은 바람직하게는 C-말단 연장(예컨대 서열 번호 40, 39, 36, 64, 69, 37, 38, 41 및 62-63에 존재하는 C-말단 알라닌)을 함유하지 않을 것이며, 이들이 화합물 또는 폴리펩타이드의 C-말단부에 존재하지 않는 경우이다(대신에 바람직하게는, 본 발명의 상기 폴리펩타이드 또는 화합물의 C-말단 ISVD는 C-말단 연장을 가질 것임).
바람직하지만 비제한적인 예들에 의해, 서열 번호 40, 39, 36, 64, 69, 37, 38 및 62-63은 또한, 서열 번호 1과 추가의 아미노산 차이, 즉 S49A, A74S 및/또는 L78V를 가진 본 발명의 TNF 결합제들의 예들이다. 따라서, 특정한 양태에서, 본 발명은 적어도 S49A, A74S 및/또는 L78V 돌연변이의 적합한 조합, 바람직하게는 이들 돌연변이 중 임의의 2개, 예컨대 이들 돌연변이 중 3개 모두의 적합한 조합을 가진 본 발명의 TNF 결합제(즉, 본원에 기재된 바와 같이 위치 11, 89, 110 및/또는 112에 돌연변이를 가지고 또한 본원에 추가로 기재된 바와 같음)에 관한 것이다.
본 발명의 TNF 결합제들은, 이들이 1가 포맷으로 사용되는 경우 및/또는 이들이, 이들 결합제가 존재하는 단백질, 폴리펩타이드 또는 다른 화합물 또는 구축물에 존재하고/하거나 이의 C-말단부를 형성하는 경우(또는 그렇지 않다면 이들 결합제가 이러한 단백질, 폴리펩타이드 또는 다른 화합물 또는 구축물에 "노출된" C-말단부를 가지는 경우, 이러한 노출된이란 표현은 일반적으로, ISV의 C-말단부가 불변 도메인(예컨대 CH1 도메인)과 연관이 있거나 연결되어 있지 않음을 의미하며; WO 2012/175741 및 WO 2015/1733256을 또한 참조함), 바람직하게는 또한 식 (X)n의 C-말단 연장을 가지며, 이 식에서, n은 1 내지 10, 바람직하게는 1 내지 5, 예컨대 1, 2, 3, 4 또는 5(바람직하게는 1 또는 2, 예컨대 1)이고; 각각의 X는 천연 발생 아미노산 잔기들로부터 독립적으로 선택되는(바람직한 일 양태에 따르면, 이것이 임의의 시스테인 잔기를 포함하지 않더라도), 바람직하게는 알라닌(A), 글리신(G), 발린(V), 루신(L) 또는 이소루신(I)으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 (바람직하게는 천연 발생) 아미노산 잔기이다.
이러한 C-말단 연장 X(n)의 일부 바람직하지만 비제한적인 예들에 따르면, X 및 n은 하기와 같을 수 있고:
(a) n = 1 및 X = Ala;
(b) n = 2 및 각각의 X = Ala;
(c) n = 3 및 각각의 X = Ala;
(d) n = 2 및 적어도 하나의 X = Ala(이때, 잔여 아미노산 잔기(들) X는 독립적으로 임의의 천연 발생 아미노산으로부터 선택되지만 바람직하게는 독립적으로 Val, Leu 및/또는 Ile으로부터 선택됨);
(e) n = 3 및 적어도 하나의 X = Ala(이때, 잔여 아미노산 잔기(들) X는 독립적으로 임의의 천연 발생 아미노산으로부터 선택되지만 바람직하게는 독립적으로 Val, Leu 및/또는 Ile으로부터 선택됨);
(f) n = 3 및 적어도 2개의 X = Ala(이때, 잔여 아미노산 잔기(들) X는 독립적으로 임의의 천연 발생 아미노산으로부터 선택되지만 바람직하게는 독립적으로 Val, Leu 및/또는 Ile으로부터 선택됨);
(g) n = 1 및 X = Gly;
(h) n = 2 및 각각의 X = Gly;
(i) n = 3 및 각각의 X = Gly;
(j) n = 2 및 적어도 하나의 X = Gly(이때, 잔여 아미노산 잔기(들) X는 독립적으로 임의의 천연 발생 아미노산으로부터 선택되지만 바람직하게는 독립적으로 Val, Leu 및/또는 Ile으로부터 선택됨);
(k) n = 3 및 적어도 하나의 X = Gly(이때, 잔여 아미노산 잔기(들) X는 독립적으로 임의의 천연 발생 아미노산으로부터 선택되지만 바람직하게는 독립적으로 Val, Leu 및/또는 Ile으로부터 선택됨);
(l) n = 3 및 적어도 2개의 X = Gly(이때, 잔여 아미노산 잔기(들) X는 독립적으로 임의의 천연 발생 아미노산으로부터 선택되지만 바람직하게는 독립적으로 Val, Leu 및/또는 Ile으로부터 선택됨);
(m) n = 2 및 각각의 X = Ala 또는 Gly;
(n) n = 3 및 각각의 X = Ala 또는 Gly;
(o) n = 3 및 적어도 하나의 X = Ala 또는 Gly(이때, 잔여 아미노산 잔기(들) X는 독립적으로 임의의 천연 발생 아미노산으로부터 선택되지만 바람직하게는 독립적으로 Val, Leu 및/또는 Ile으로부터 선택됨); 또는
(p) n = 3 및 적어도 2개의 X = Ala 또는 Gly(이때, 잔여 아미노산 잔기(들) X는 독립적으로 임의의 천연 발생 아미노산으로부터 선택되지만 바람직하게는 독립적으로 Val, Leu 및/또는 Ile으로부터 선택됨);
양태 (a), (b), (c), (g), (h), (i), (m) 및 (n)이 특히 바람직하며, n = 1 또는 2인 양태가 바람직하고, n = 1인 양태가 특히 바람직하다.
또한, 바람직하게는, 본 발명의 TNF 결합제에 존재하는 임의의 C-말단 연장은 (유리) 시스테인 잔기를 함유하지 않음(상기 시스테인 잔기가 추가의 작용화, 예를 들어 페길화(PEG화)에 사용되거나 의도되지 않는 한)을 주지해야 한다.
유용한 C-말단 연장들의 일부 구체적이지만 비제한적인 예들은 하기 아미노산 서열이다: A, AA, AAA, G, GG, GGG, AG, GA, AAG, AGG, AGA, GGA, GAA 또는 GAG.
본 발명의 TNF 결합제가 위치 110 또는 112에 돌연변이를 (선택적으로 본원에 기재된 바와 같이 위치 11 및/또는 89에서의 돌연변이와 조합하여) 함유하는 경우, 프레임워크 4의 (위치 109로부터 출발하는) C-말단 아미노산 잔기는 하기와 같을 수 있다: (i) C-말단 연장이 존재하지 않는 경우: VTVKS(서열 번호 43), VTVQS(서열 번호 44), VKVSS(서열 번호 45) 또는 VQVSS(서열 번호 46); 또는 (ii) C-말단 연장이 존재하는 경우: VTVKSX(n)(서열 번호 47), VTVQSX(n)(서열 번호 48), VKVSSX(n)(서열 번호 49) 또는 VQVSSX(n)(서열 번호 50), 예컨대 VTVKSA(서열 번호 51), VTVQSA(서열 번호 52), VKVSSA(서열 번호 53) 또는 VQVSSA(서열 번호 54). 본 발명의 TNF 결합제가 위치 110 또는 112에 돌연변이를 함유하지 않는 경우(그러나, 본원에 기재된 바와 같이 위치 11 및/또는 89에서의 돌연변이만 존재함), 프레임워크 4의 (위치 109로부터 출발하는) C-말단 아미노산 잔기는 통상: (i) C-말단 연장이 존재하지 않는 경우: VTVSS(서열 번호 55)(서열 번호 1의 서열에서와 같음); 또는 (ii) C-말단 연장이 존재하는 경우: VTVSSX(n)(서열 번호 56) 예컨대 VTVSSA(서열 번호 57) 중 하나일 것이다. 이들 C-말단 서열에서, X 및 n은 C-말단 연장에 대해 본원에 정의된 바와 같다.
도 4a~도 4b뿐만 아니라 도 3a~도 3f에서의 정렬로부터 알 수 있듯이, 서열 번호 40, 39, 36, 64, 69, 37, 38, 41 및 62-63의 TNF 결합제들은 E1D 돌연변이 및 C-말단 알라닌 연장을 둘 다 가진다. 언급된 바와 같이, 위치 1에서의 D, 뿐만 아니라 C-말단 연장 둘 다의 존재는 이들 TNF 결합제(및 위치 1에서의 D 및 C-말단 연장을 가진 본 발명의 다른 TNF 결합제)를 1가 포맷(즉, 본원에 기재된 목적)으로 사용하기에 특히 적합하게 만든다.
이에 추가의 양태에서, 본 발명은, 위치 1에서의 D 및 C-말단 연장 X(n)(이는 바람직하게는 단일 Ala 잔기임)을 가진 본 발명의 TNF 결합제(본원에 추가로 기재된 바와 같음)에 관한 것이다. 상기 TNF 결합제는 바람직하게는 1가 포맷으로 (사용되고/되거나 사용되기 위해) 존재한다. 하나의 구체적인 양태에서, 상기 1가 TNF 결합제는 서열 번호 40, 39, 36, 64, 69, 37, 38, 62, 63 및 41로부터 선택된다.
본 발명의 TNF 결합제의 일부 바람직하지만 비제한적인 예들은 서열 번호 8 내지 41 및 62-69에 주어져 있고, 이들 각각의 서열은 (이들 서열 중 하나를 포함하는 단백질, 폴리펩타이드 또는 다른 화합물 또는 구축물과 마찬가지로) 본 발명의 추가의 양태를 형성한다.
본 발명의 특히 바람직한 일부 TNF 결합제는 서열 번호 40, 39, 36, 64, 69, 37, 38, 41 및 62-63의 서열(또는 본원에 기재된 바와 같이, 본 발명의 폴리펩타이드 또는 화합물에서의 의도된 용도에 따라, 위치 1에서의 E를 가지고/갖거나 C-말단 연장을 갖지 않는 이의 변이체)이다.
따라서, 제1 양태에서, 본 발명은 면역글로불린 단일 가변 도메인에 관한 것이며, 이러한 도메인은
- 아미노산 서열 TADMG(서열 번호 2)인 CDR1(카바트에 따름);
- 아미노산 서열 RISGIDGTTYYDEPVKG(서열 번호 3)인 CDR2(카바트에 따름); 및
- 아미노산 서열 PRYADQWSAYDY(서열 번호 4)인 CDR3(카바트에 따름)
를 가지고,
- 서열 번호 1의 아미노산 서열과 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 90%, 보다 바람직하게는 적어도 95%의 서열 동일성 정도(여기서, CDR뿐만 아니라 존재할 수 있는 임의의 C-말단 연장은 서열 동일성 정도를 확인하는 데 고려되지 않음);
및/또는
- 서열 번호 1의 아미노산 서열과 7개 이하, 예컨대 5개 이하, 바람직하게는 3개 이하, 예컨대 단지 3개, 2개 또는 1개의 "아미노산 차이"(본원에 정의된 바와 같이, 존재할 수 있는 위치(들) 11, 89, 110 또는 112에서 상기 열거된 돌연변이 중 어느 것도 고려하지 않고 존재할 수 있는 임의의 C-말단 연장을 고려하지 않음)(여기서, 상기 아미노산 차이는, 존재한다면, 프레임워크 및/또는 CDR에 존재할 수 있으나 바람직하게는 CDR이 아니라 프레임워크에만 존재함)
를 가지고,
선택적으로,
- C-말단 연장 (X)n을 가지고, 여기서, n은 1 내지 10, 바람직하게는 1 내지 5, 예컨대 1, 2, 3, 4 또는 5(바람직하게는 1 또는 2, 예컨대 1)이고; 각각의 X는 독립적으로 선택되는, 바람직하게는 알라닌(A), 글리신(G), 발린(V), 루신(L) 또는 이소루신(I)으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 (바람직하게는 천연 발생) 아미노산 잔기이며;
- 위치 11의 아미노산 잔기는 바람직하게는 L 또는 V로부터 선택되며;
- 위치 89의 아미노산 잔기는 바람직하게는 T, V 또는 L로부터 적합하게 선택되며;
- 위치 110의 아미노산 잔기는 바람직하게는 T, K 또는 Q로부터 적합하게 선택되고;
- 위치 112의 아미노산 잔기는 바람직하게는 S, K 또는 Q로부터 적합하게 선택되며;
따라서, (i) 위치 89는 T이거나; (ii) 위치 89는 L이고, 위치 11은 V이거나; (iii) 위치 89는 L이고, 위치 110은 K 또는 Q이거나; (iv) 위치 89는 L이고, 위치 112는 K 또는 Q이거나; (v) 위치 89는 L이고, 위치 11은 V이고, 위치 110은 K 또는 Q이거나; (vi) 위치 89는 L이고, 위치 11은 V이고, 위치 112는 K 또는 Q이거나; (vii) 위치 11은 V이고, 위치 110은 K 또는 Q이거나; (vii) 위치 11은 V이고, 위치 112는 K 또는 Q이다.
추가의 양태에서, 본 발명은 면역글로불린 단일 가변 도메인에 관한 것이며, 이러한 도메인은
- 아미노산 서열 TADMG(서열 번호 2)인 CDR1(카바트에 따름);
- 아미노산 서열 RISGIDGTTYYDEPVKG(서열 번호 3)인 CDR2(카바트에 따름); 및
- 아미노산 서열 PRYADQWSAYDY(서열 번호 4)인 CDR3(카바트에 따름)
를 가지고,
- 서열 번호 1의 아미노산 서열과 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 90%, 보다 바람직하게는 적어도 95%의 서열 동일성 정도(여기서, CDR뿐만 아니라 존재할 수 있는 임의의 C-말단 연장은 서열 동일성 정도를 확인하는 데 고려되지 않음);
및/또는
- 서열 번호 1의 아미노산 서열과 7개 이하, 예컨대 5개 이하, 바람직하게는 3개 이하, 예컨대 단지 3개, 2개 또는 1개의 "아미노산 차이"(본원에 정의된 바와 같이, 존재할 수 있는 위치(들) 11, 89, 110 또는 112에서 상기 열거된 돌연변이 중 어느 것도 고려하지 않고 존재할 수 있는 임의의 C-말단 연장을 고려하지 않음)(여기서, 상기 아미노산 차이는, 존재한다면, 프레임워크 및/또는 CDR에 존재할 수 있으나 바람직하게는 CDR이 아니라 프레임워크에만 존재함)
를 가지고,
선택적으로,
- C-말단 연장 (X)n을 가지고, 여기서, n은 1 내지 10, 바람직하게는 1 내지 5, 예컨대 1, 2, 3, 4 또는 5(바람직하게는 1 또는 2, 예컨대 1)이고; 각각의 X는 독립적으로 선택되는, 바람직하게는 알라닌(A), 글리신(G), 발린(V), 루신(L) 또는 이소루신(I)으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 (바람직하게는 천연 발생) 아미노산 잔기이며;
면역글로불린 단일 가변 도메인은 언급된 위치(카바트에 따른 넘버링)에 하기 아미노산 잔기(즉, 서열 번호 1의 아미노산 서열과 비교하여 돌연변이)를 포함한다:
- 89T; 또는
- 11V와 조합된 89L; 또는
- 110K 또는 110Q와 조합된 89L; 또는
- 112K 또는 112Q와 조합된 89L; 또는
- 11V 및 110K 또는 110Q와 조합된 89L; 또는
- 11V 및 112K 또는 112Q와 조합된 89L; 또는
- 110K 또는 110Q와 조합된 11V; 또는
- 112K 또는 112Q와 조합된 11V.
특히, 본 발명의 TNF 결합제는 바람직하게는, 서열 번호 1의 아미노산 서열과 7개 이하, 예컨대 5개 이하, 바람직하게는 3개 이하, 예컨대 단지 3개, 2개 또는 1개의 "아미노산 차이"(본원에 정의된 바와 같이, 존재할 수 있는 위치(들) 11, 89, 110 또는 112에서 상기 열거된 돌연변이 중 어느 것도 고려하지 않고 존재할 수 있는 임의의 C-말단 연장을 고려하지 않음)(여기서, 상기 아미노산 차이는, 존재한다면, 프레임워크 및/또는 CDR에 존재할 수 있으나 바람직하게는 CDR이 아니라 프레임워크에만 존재함)를 가진다.
특히, 본 발명에 의해 제공되는 TNF 결합제에서, 위치 11의 아미노산 잔기는 V이며 위치 89의 아미노산 잔기는 L이며, 위치 110의 아미노산 잔기는 T이고, 위치 112의 아미노산 잔기는 S이다.
본원에 기재된 바와 같이, 존재할 수 있는(즉, 적합한 조합에서) 이러한 돌연변이/아미노산 차이의 일부 구체적이지만 비제한적인 예들로는 예를 들어, E1D, P40A, P40L, P40S(특히 P40A), S49A, A74S, L78V, T87A 또는 이들의 임의의 적합한 조합, 뿐만 아니라 예를 들어 D60A, E61D 및/또는 P62S 돌연변이(특히 위치 60-62에서 ADS 모티프로서)(의 적합한 조합) 및 하나 이상의 적합한 "인간화" 치환(이의 적합한 조합, 예를 들어 서열 번호 39 참조) 등이 있다. 또한 언급된 바와 같이, S49A, A74S 및/또는 L78V 돌연변이(또는 이들의 모든 3개를 포함하여 이들의 임의의 2개의 임의의 적합한 조합)의 존재(뿐만 아니라 TNF 결합제가 존재하고/하거나 본 발명의 화합물 또는 폴리펩타이드의 N-말단부를 형성하거나 1가 포맷으로 존재하는 경우 위치 1에서의 D의 존재)가 바람직하다.
바람직한 양태에서, 본 발명의 TNF 결합제, 예컨대 ISVD는 위치 49에 알라닌(A49)을 포함한다.
추가의 바람직한 양태에서, 본 발명의 TNF 결합제, 예컨대 ISVD는 위치 74에 세린(S74)을 포함한다.
추가의 바람직한 양태에서, 본 발명의 TNF 결합제, 예컨대 ISVD는 위치 73에 아스파라긴(N73) 및/또는 위치 75에 라이신(K75)을 포함한다.
본 발명에 언급된 바와 같이, 위치 89가 T이거나, 위치 11이 V이고, 위치 89가 L(선택적으로 110K 또는 110Q 돌연변이 및/또는 112K 또는 112Q 돌연변이와의 적합한 조합, 특히 110K 또는 110Q 돌연변이와의 조합에서)인 아미노산 서열이 특히 바람직하다. 선택적으로 110K 또는 110Q 돌연변이를 가지며, 위치 11이 V이고, 위치 89가 L인 아미노산 서열이 보다 더 바람직하다.
따라서, 바람직한 일 양태에서, 본 발명은 면역글로불린 단일 가변 도메인에 관한 것이며, 이러한 도메인은
- 아미노산 서열 TADMG(서열 번호 2)인 CDR1(카바트에 따름);
- 아미노산 서열 RISGIDGTTYYDEPVKG(서열 번호 3)인 CDR2(카바트에 따름); 및
- 아미노산 서열 PRYADQWSAYDY(서열 번호 4)인 CDR3(카바트에 따름)
를 가지고,
- 서열 번호 1의 아미노산 서열과 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 90%, 보다 바람직하게는 적어도 95%의 서열 동일성 정도(여기서, CDR뿐만 아니라 존재할 수 있는 임의의 C-말단 연장은 서열 동일성 정도를 확인하는 데 고려되지 않음);
및/또는
- 서열 번호 1의 아미노산 서열과 7개 이하, 예컨대 5개 이하, 바람직하게는 3개 이하, 예컨대 단지 3개, 2개 또는 1개의 "아미노산 차이"(본원에 정의된 바와 같이, 존재할 수 있는 위치(들) 11, 89, 110 또는 112에서 상기 열거된 돌연변이 중 어느 것도 고려하지 않고 존재할 수 있는 임의의 C-말단 연장을 고려하지 않음)(여기서, 상기 아미노산 차이는, 존재한다면, 프레임워크 및/또는 CDR에 존재할 수 있으나 바람직하게는 CDR이 아니라 프레임워크에만 존재함)
를 가지고,
선택적으로,
- C-말단 연장 (X)n을 가지고, 여기서, n은 1 내지 10, 바람직하게는 1 내지 5, 예컨대 1, 2, 3, 4 또는 5(바람직하게는 1 또는 2, 예컨대 1)이고; 각각의 X는 독립적으로 선택되는, 바람직하게는 알라닌(A), 글리신(G), 발린(V), 루신(L) 또는 이소루신(I)으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 (바람직하게는 천연 발생) 아미노산 잔기이며;
여기서,
- 위치 11의 아미노산 잔기는 바람직하게는 L 또는 V로부터 선택되며;
- 위치 89의 아미노산 잔기는 T이며;
- 위치 110의 아미노산 잔기는 바람직하게는 T, K 또는 Q로부터 적합하게 선택되고(바람직하게는 T임);
- 위치 112의 아미노산 잔기는 바람직하게는 S, K 또는 Q로부터 적합하게 선택된다(바람직하게는 S임).
또 다른 바람직한 양태에서, 본 발명은 면역글로불린 단일 가변 도메인에 관한 것이며, 이러한 도메인은
- 아미노산 서열 TADMG(서열 번호 2)인 CDR1(카바트에 따름);
- 아미노산 서열 RISGIDGTTYYDEPVKG(서열 번호 3)인 CDR2(카바트에 따름); 및
- 아미노산 서열 PRYADQWSAYDY(서열 번호 4)인 CDR3(카바트에 따름)
를 가지고,
- 서열 번호 1의 아미노산 서열과 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 90%, 보다 바람직하게는 적어도 95%의 서열 동일성 정도(여기서, CDR뿐만 아니라 존재할 수 있는 임의의 C-말단 연장은 서열 동일성 정도를 확인하는 데 고려되지 않음);
및/또는
- 서열 번호 1의 아미노산 서열과 7개 이하, 예컨대 5개 이하, 바람직하게는 3개 이하, 예컨대 단지 3개, 2개 또는 1개의 "아미노산 차이"(본원에 정의된 바와 같이, 존재할 수 있는 위치(들) 11, 89, 110 또는 112에서 상기 열거된 돌연변이 중 어느 것도 고려하지 않고 존재할 수 있는 임의의 C-말단 연장을 고려하지 않음)(여기서, 상기 아미노산 차이는, 존재한다면, 프레임워크 및/또는 CDR에 존재할 수 있으나 바람직하게는 CDR이 아니라 프레임워크에만 존재함)
를 가지고,
선택적으로,
- C-말단 연장 (X)n을 가지고, 여기서, n은 1 내지 10, 바람직하게는 1 내지 5, 예컨대 1, 2, 3, 4 또는 5(바람직하게는 1 또는 2, 예컨대 1)이고; 각각의 X는 독립적으로 선택되는, 바람직하게는 알라닌(A), 글리신(G), 발린(V), 루신(L) 또는 이소루신(I)으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 (바람직하게는 천연 발생) 아미노산 잔기이며;
여기서,
- 위치 11의 아미노산 잔기는 V이며;
- 위치 89의 아미노산 잔기는 L이며;
- 위치 110의 아미노산 잔기는 바람직하게는 T, K 또는 Q로부터 적합하게 선택되고;
- 위치 112의 아미노산 잔기는 바람직하게는 S, K 또는 Q로부터 적합하게 선택된다.
구체적이지만 비제한적인 일 양태에서, 본 발명의 TNF 결합제는 언급된 위치(카바트에 따른 넘버링)에 하기 아미노산 잔기(즉, 돌연변이 서열 번호 1의 서열과 비교하여)를 포함하고:
- 89L와 조합된 11V; 또는
- 110K 또는 110Q와 조합된 11V;
- 112K 또는 112Q와 조합된 11V;
- 89L 및 110K 또는 110Q와 조합된 11V; 또는
- 89L 및 112K 또는 112Q와 조합된 11V;
CDR(카바트에 따름)을 가지고, 본원에 기재된 바와 같이 서열 번호 1의 아미노산 서열과 전체적인 서열 동일성 정도를 가진다.
또 다른 구체적이지만 비제한적인 양태에서, 본 발명의 TNF 결합제는 언급된 위치(카바트에 따른 넘버링)에 하기 아미노산 잔기(즉, 돌연변이 서열 번호 1의 서열과 비교하여)를 포함하고:
- 11V와 조합된 89L; 또는
- 110K 또는 110Q와 조합된 89L; 또는
- 112K 또는 112Q와 조합된 89L; 또는
- 11V 및 110K 또는 110Q와 조합된 89L; 또는
- 11V 및 112K 또는 112Q와 조합된 89L;
CDR(카바트에 따름)을 가지고, 본원에 기재된 바와 같이 서열 번호 1의 아미노산 서열과 전체적인 서열 동일성 정도를 가진다.
또 다른 구체적이지만 비제한적인 양태에서, 본 발명의 TNF 결합제는 언급된 위치(카바트에 따른 넘버링)에 하기 아미노산 잔기(즉, 돌연변이 서열 번호 1의 서열과 비교하여)를 포함하고:
- 11V와 조합된 110K 또는 110Q; 또는
- 89L과 조합된 110K 또는 110Q; 또는
- 11V 및 89L과 조합된 110K 또는 110Q;
CDR(카바트에 따름)을 가지고, 본원에 기재된 바와 같이 서열 번호 1의 아미노산 서열과 전체적인 서열 동일성 정도를 가진다.
또 다른 구체적이지만 비제한적인 양태에서, 본 발명의 TNF 결합제는 언급된 위치(카바트에 따른 넘버링)에 하기 아미노산 잔기(즉, 돌연변이 서열 번호 1의 서열과 비교하여)를 포함하고:
- 11V와 조합된 112K 또는 112Q; 또는
- 89L과 조합된 112K 또는 112Q; 또는
- 11V 및 89L과 조합된 112K 또는 112Q;
CDR(카바트에 따름)을 가지고, 본원에 기재된 바와 같이 서열 번호 1의 아미노산 서열과 전체적인 서열 동일성 정도를 가진다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 TNF 결합제는 위치 89에 T를 포함하고, CDR(카바트에 따름)을 가지고, 본원에 기재된 바와 같이 서열 번호 1의 아미노산 서열과 전체적인 서열 동일성 정도를 가진다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 TNF 결합제는 위치 11에 V 및 위치 89에 L을 포함하고, CDR(카바트에 따름)을 가지고, 본원에 기재된 바와 같이 서열 번호 1의 아미노산 서열과 전체적인 서열 동일성 정도를 가진다.
언급된 바와 같이, 상기 양태에 따른 본 발명의 TNF 결합제는 바람직하게는 추가로, 이들 결합제가 S49A, A74S 및/또는 L78V 돌연변이의 적합한 조합, 바람직하게는 이들 돌연변이 중 임의의 2개, 예컨대 이들 돌연변이 중 3개 모두의 적합한 조합을 함유하도록 된다(또한, TNF 결합제가 1가이거나, 본 발명의 화합물 또는 폴리펩타이드의 N-말단부에 존재하는 경우, 바람직하게는 또한 E1D 돌연변이).
또 다른 양태에서, 본 발명은 면역글로불린 단일 가변 도메인에 관한 것이며, 이러한 도메인은
- 아미노산 서열 GFTFSTADMG(서열 번호 5)인 CDR1(Abm에 따름);
- 아미노산 서열 RISGIDGTTY(서열 번호 6)인 CDR2(Abm에 따름); 및
- 아미노산 서열 PRYADQWSAYDY(서열 번호 4)인 CDR3(Abm에 따름)
을 가지고,
- 서열 번호 1의 아미노산 서열과 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 90%, 보다 바람직하게는 적어도 95%의 서열 동일성 정도(여기서, CDR뿐만 아니라 존재할 수 있는 임의의 C-말단 연장은 서열 동일성 정도를 확인하는 데 고려되지 않음);
및/또는
- 서열 번호 1의 아미노산 서열과 7개 이하, 예컨대 5개 이하, 바람직하게는 3개 이하, 예컨대 단지 3개, 2개 또는 1개의 "아미노산 차이"(본원에 정의된 바와 같이, 존재할 수 있는 위치(들) 11, 89, 110 또는 112에서 상기 열거된 돌연변이 중 어느 것도 고려하지 않고 존재할 수 있는 임의의 C-말단 연장을 고려하지 않음)(여기서, 상기 아미노산 차이는, 존재한다면, 프레임워크 및/또는 CDR에 존재할 수 있으나 바람직하게는 CDR이 아니라 프레임워크에만 존재함)
를 가지고,
선택적으로,
- C-말단 연장 (X)n을 가지고, 여기서, n은 1 내지 10, 바람직하게는 1 내지 5, 예컨대 1, 2, 3, 4 또는 5(바람직하게는 1 또는 2, 예컨대 1)이고; 각각의 X는 독립적으로 선택되는, 바람직하게는 알라닌(A), 글리신(G), 발린(V), 루신(L) 또는 이소루신(I)으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 (바람직하게는 천연 발생) 아미노산 잔기이며;
여기서:
- 위치 11의 아미노산 잔기는 바람직하게는 L 또는 V로부터 선택되며;
- 위치 89의 아미노산 잔기는 바람직하게는 T, V 또는 L로부터 적합하게 선택되며;
- 위치 110의 아미노산 잔기는 바람직하게는 T, K 또는 Q로부터 적합하게 선택되고;
- 위치 112의 아미노산 잔기는 바람직하게는 S, K 또는 Q로부터 적합하게 선택되며;
따라서, (i) 위치 89는 T이거나; (ii) 위치 89는 L이고, 위치 11은 V이거나; (iii) 위치 89는 L이고, 위치 110은 K 또는 Q이거나; (iv) 위치 89는 L이고, 위치 112는 K 또는 Q이거나; (v) 위치 89는 L이고, 위치 11은 V이고, 위치 110은 K 또는 Q이거나; (vi) 위치 89는 L이고, 위치 11은 V이고, 위치 112는 K 또는 Q이거나; (vii) 위치 11은 V이고, 위치 110은 K 또는 Q이거나; (vii) 위치 11은 V이고, 위치 112는 K 또는 Q이다.
추가의 양태에서, 본 발명은 면역글로불린 단일 가변 도메인에 관한 것이며, 이러한 도메인은
- 아미노산 서열 GFTFSTADMG(서열 번호 5)인 CDR1(Abm에 따름);
- 아미노산 서열 RISGIDGTTY(서열 번호 6)인 CDR2(Abm에 따름); 및
- 아미노산 서열 PRYADQWSAYDY(서열 번호 4)인 CDR3(Abm에 따름)
를 가지고,
- 서열 번호 1의 아미노산 서열과 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 90%, 보다 바람직하게는 적어도 95%의 서열 동일성 정도(여기서, CDR뿐만 아니라 존재할 수 있는 임의의 C-말단 연장은 서열 동일성 정도를 확인하는 데 고려되지 않음);
및/또는
- 서열 번호 1의 아미노산 서열과 7개 이하, 예컨대 5개 이하, 바람직하게는 3개 이하, 예컨대 단지 3개, 2개 또는 1개의 "아미노산 차이"(본원에 정의된 바와 같이, 존재할 수 있는 위치(들) 11, 89, 110 또는 112에서 상기 열거된 돌연변이 중 어느 것도 고려하지 않고 존재할 수 있는 임의의 C-말단 연장을 고려하지 않음)(여기서, 상기 아미노산 차이는, 존재한다면, 프레임워크 및/또는 CDR에 존재할 수 있으나 바람직하게는 CDR이 아니라 프레임워크에만 존재함)
를 가지고,
선택적으로,
- C-말단 연장 (X)n을 가지고, 여기서, n은 1 내지 10, 바람직하게는 1 내지 5, 예컨대 1, 2, 3, 4 또는 5(바람직하게는 1 또는 2, 예컨대 1)이고; 각각의 X는 독립적으로 선택되는, 바람직하게는 알라닌(A), 글리신(G), 발린(V), 루신(L) 또는 이소루신(I)으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 (바람직하게는 천연 발생) 아미노산 잔기이며;
면역글로불린 단일 가변 도메인은 언급된 위치(카바트에 따른 넘버링)에 하기 아미노산 잔기(즉, 서열 번호 1의 아미노산 서열과 비교하여 돌연변이)를 포함한다:
- 89T; 또는
- 11V와 조합된 89L; 또는
- 110K 또는 110Q와 조합된 89L; 또는
- 112K 또는 112Q와 조합된 89L; 또는
- 11V 및 110K 또는 110Q와 조합된 89L; 또는
- 11V 및 112K 또는 112Q와 조합된 89L; 또는
- 110K 또는 110Q와 조합된 11V; 또는
- 112K 또는 112Q와 조합된 11V.
언급된 바와 같이, 본 발명의 TNF 결합제가 1가 포맷으로 사용되고/되거나 본 발명의 화합물의 C-말단부에 존재하는 경우(본원에 정의된 바와 같음), TNF 결합제(및 결과적으로, 생성된 본 발명의 화합물)는 바람직하게는, 본원에 기재된 바와 같은 C-말단 연장 X(n)을 가지며, 여기서, C-말단 연장은 본 발명의 TNF 결합제에 대해 본원에 기재된 바와 같을 수 있고/있거나 WO 2012/175741 또는 WO2015/173325에 기재된 바와 같을 수 있다.
본 발명에 언급된 바와 같이, 위치 89가 T이거나, 위치 11이 V이고, 위치 89가 L(선택적으로 110K 또는 110Q 돌연변이 및/또는 112K 또는 112Q 돌연변이와의 적합한 조합, 특히 110K 또는 110Q 돌연변이와의 조합에서)인 아미노산 서열이 특히 바람직하다. 선택적으로 110K 또는 110Q 돌연변이를 가지며, 위치 11이 V이고, 위치 89가 L인 아미노산 서열이 보다 더 바람직하다.
따라서, 바람직한 일 양태에서, 본 발명은 면역글로불린 단일 가변 도메인에 관한 것이며, 이러한 도메인은
- 아미노산 서열 GFTFSTADMG(서열 번호 5)인 CDR1(Abm에 따름);
- 아미노산 서열 RISGIDGTTY(서열 번호 6)인 CDR2(Abm에 따름); 및
- 아미노산 서열 PRYADQWSAYDY(서열 번호 4)인 CDR3(Abm에 따름)
을 가지고,
- 서열 번호 1의 아미노산 서열과 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 90%, 보다 바람직하게는 적어도 95%의 서열 동일성 정도(여기서, CDR뿐만 아니라 존재할 수 있는 임의의 C-말단 연장은 서열 동일성 정도를 확인하는 데 고려되지 않음);
및/또는
- 서열 번호 1의 아미노산 서열과 7개 이하, 예컨대 5개 이하, 바람직하게는 3개 이하, 예컨대 단지 3개, 2개 또는 1개의 "아미노산 차이"(본원에 정의된 바와 같이, 존재할 수 있는 위치(들) 11, 89, 110 또는 112에서 상기 열거된 돌연변이 중 어느 것도 고려하지 않고 존재할 수 있는 임의의 C-말단 연장을 고려하지 않음)(여기서, 상기 아미노산 차이는, 존재한다면, 프레임워크 및/또는 CDR에 존재할 수 있으나 바람직하게는 CDR이 아니라 프레임워크에만 존재함)
를 가지고,
선택적으로,
- C-말단 연장 (X)n을 가지고, 여기서, n은 1 내지 10, 바람직하게는 1 내지 5, 예컨대 1, 2, 3, 4 또는 5(바람직하게는 1 또는 2, 예컨대 1)이고; 각각의 X는 독립적으로 선택되는, 바람직하게는 알라닌(A), 글리신(G), 발린(V), 루신(L) 또는 이소루신(I)으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 (바람직하게는 천연 발생) 아미노산 잔기이며;
여기서:
- 위치 11의 아미노산 잔기는 바람직하게는 L 또는 V로부터 선택되며;
- 위치 89의 아미노산 잔기는 T이며;
- 위치 110의 아미노산 잔기는 바람직하게는 T, K 또는 Q로부터 적합하게 선택되고(바람직하게는 T임);
- 위치 112의 아미노산 잔기는 바람직하게는 S, K 또는 Q로부터 적합하게 선택된다(바람직하게는 S임).
또 다른 바람직한 양태에서, 본 발명은 면역글로불린 단일 가변 도메인에 관한 것이며, 이러한 도메인은
- 아미노산 서열 GFTFSTADMG(서열 번호 5)인 CDR1(Abm에 따름);
- 아미노산 서열 RISGIDGTTY(서열 번호 6)인 CDR2(Abm에 따름); 및
- 아미노산 서열 PRYADQWSAYDY(서열 번호 4)인 CDR3(Abm에 따름)
을 가지고,
- 서열 번호 1의 아미노산 서열과 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 90%, 보다 바람직하게는 적어도 95%의 서열 동일성 정도(여기서, CDR뿐만 아니라 존재할 수 있는 임의의 C-말단 연장은 서열 동일성 정도를 확인하는 데 고려되지 않음);
및/또는
- 서열 번호 1의 아미노산 서열과 7개 이하, 예컨대 5개 이하, 바람직하게는 3개 이하, 예컨대 단지 3개, 2개 또는 1개의 "아미노산 차이"(본원에 정의된 바와 같이, 존재할 수 있는 위치(들) 11, 89, 110 또는 112에서 상기 열거된 돌연변이 중 어느 것도 고려하지 않고 존재할 수 있는 임의의 C-말단 연장을 고려하지 않음)(여기서, 상기 아미노산 차이는, 존재한다면, 프레임워크 및/또는 CDR에 존재할 수 있으나 바람직하게는 CDR이 아니라 프레임워크에만 존재함)
를 가지고,
선택적으로,
- C-말단 연장 (X)n을 가지고, 여기서, n은 1 내지 10, 바람직하게는 1 내지 5, 예컨대 1, 2, 3, 4 또는 5(바람직하게는 1 또는 2, 예컨대 1)이고; 각각의 X는 독립적으로 선택되는, 바람직하게는 알라닌(A), 글리신(G), 발린(V), 루신(L) 또는 이소루신(I)으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 (바람직하게는 천연 발생) 아미노산 잔기이며;
여기서:
- 위치 11의 아미노산 잔기는 V이며;
- 위치 89의 아미노산 잔기는 L이며;
- 위치 110의 아미노산 잔기는 바람직하게는 T, K 또는 Q로부터 적합하게 선택되고;
- 위치 112의 아미노산 잔기는 바람직하게는 S, K 또는 Q로부터 적합하게 선택된다.
구체적이지만 비제한적인 일 양태에서, 본 발명의 TNF 결합제는 언급된 위치(카바트에 따른 넘버링)에 하기 아미노산 잔기(즉, 돌연변이 서열 번호 1의 서열과 비교하여)를 포함하고:
- 89L과 조합된 11V; 또는
- 110K 또는 110Q와 조합된 11V;
- 112K 또는 112Q와 조합된 11V;
- 89L 및 110K 또는 110Q와 조합된 11V; 또는
- 89L 및 112K 또는 112Q와 조합된 11V;
CDR(Abm에 따름)을 가지고, 본원에 기재된 바와 같이 서열 번호 1의 아미노산 서열과 전체적인 서열 동일성 정도를 가진다.
또 다른 구체적이지만 비제한적인 양태에서, 본 발명의 TNF 결합제는 언급된 위치(카바트에 따른 넘버링)에 하기 아미노산 잔기(즉, 돌연변이 서열 번호 1의 서열과 비교하여)를 포함하고:
- 11V와 조합된 89L; 또는
- 110K 또는 110Q와 조합된 89L; 또는
- 112K 또는 112Q와 조합된 89L; 또는
- 11V 및 110K 또는 110Q와 조합된 89L; 또는
- 11V 및 112K 또는 112Q와 조합된 89L;
CDR(Abm에 따름)을 가지고, 본원에 기재된 바와 같이 서열 번호 1의 아미노산 서열과 전체적인 서열 동일성 정도를 가진다.
또 다른 구체적이지만 비제한적인 양태에서, 본 발명의 TNF 결합제는 언급된 위치(카바트에 따른 넘버링)에 하기 아미노산 잔기(즉, 돌연변이 서열 번호 1의 서열과 비교하여)를 포함하고:
- 11V와 조합된 110K 또는 110Q; 또는
- 89L과 조합된 110K 또는 110Q; 또는
- 11V 및 89L과 조합된 110K 또는 110Q;
CDR(Abm에 따름)을 가지고, 본원에 기재된 바와 같이 서열 번호 1의 아미노산 서열과 전체적인 서열 동일성 정도를 가진다.
또 다른 구체적이지만 비제한적인 양태에서, 본 발명의 TNF 결합제는 언급된 위치(카바트에 따른 넘버링)에 하기 아미노산 잔기(즉, 돌연변이 서열 번호 1의 서열과 비교하여)를 포함하고:
- 11V와 조합된 112K 또는 112Q; 또는
- 89L과 조합된 112K 또는 112Q; 또는
- 11V 및 89L과 조합된 112K 또는 112Q;
CDR(Abm에 따름)을 가지고, 본원에 기재된 바와 같이 서열 번호 1의 아미노산 서열과 전체적인 서열 동일성 정도를 가진다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 TNF 결합제는 위치 89에 T를 포함하고, CDR(Abm에 따름)을 가지고, 본원에 기재된 바와 같이 서열 번호 1의 아미노산 서열과 전체적인 서열 동일성 정도를 가진다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 TNF 결합제는 위치 11에 V 및 위치 89에 L을 포함하고, CDR(Abm에 따름)을 가지고, 본원에 기재된 바와 같이 서열 번호 1의 아미노산 서열과 전체적인 서열 동일성 정도를 가진다.
언급된 바와 같이, 상기 양태에 따른 본 발명의 TNF 결합제는 바람직하게는 추가로, 이들 결합제가 S49A, A74S 및/또는 L78V 돌연변이의 적합한 조합, 바람직하게는 이들 돌연변이 중 임의의 2개, 예컨대 이들 돌연변이 중 3개 모두의 적합한 조합을 함유하도록 된다(또한, TNF 결합제가 1가이거나, 본 발명의 화합물 또는 폴리펩타이드의 N-말단부에 존재하는 경우, 바람직하게는 또한 E1D 돌연변이).
또 다른 구체적이지만 비제한적인 양태에서, 본 발명은 1가 포맷인 본원에 기재된 바와 같은 TNF 결합제, 특히 1가 포맷이고 위치 1에 D(및/또는 E1D 돌연변이) 및 본원에 기재된 바와 같은 C-말단 연장 X(n)(예컨대 C-말단 알라닌 잔기))을 가진 본원에 기재된 바와 같은 TNF 결합제에 관한 것이다.
또 다른 구체적이지만 비제한적인 양태에서, 본 발명은 하기 아미노산 서열들 중 하나로부터 선택되는 아미노산 서열이거나 본질적으로 구성된 면역글로불린 단일 가변 도메인에 관한 것이다: 서열 번호 40, 서열 번호 39, 서열 번호 36, 서열 번호 64, 서열 번호 69, 서열 번호 62, 서열 번호 63, 서열 번호 8, 서열 번호 9, 서열 번호 10, 서열 번호 11, 서열 번호 12, 서열 번호 13, 서열 번호 14, 서열 번호 15, 서열 번호 16, 서열 번호 17, 서열 번호 18, 서열 번호 19, 서열 번호 20, 서열 번호 21, 서열 번호 22, 서열 번호 23, 서열 번호 24, 서열 번호 25, 서열 번호 26, 서열 번호 27, 서열 번호 28, 서열 번호 29, 서열 번호 30, 서열 번호 31, 서열 번호 32, 서열 번호 33, 서열 번호 34, 서열 번호 35, 서열 번호 37, 서열 번호 38, 서열 번호 41, 서열 번호 65, 서열 번호 66, 서열 번호 67 및 서열 번호 68.
또 다른 구체적이지만 비제한적인 양태에서, 본 발명은 하기 아미노산 서열들 중 하나로부터 선택되는 아미노산 서열이거나 본질적으로 구성된 면역글로불린 단일 가변 도메인에 관한 것이다: 서열 번호 40, 서열 번호 39, 서열 번호 36, 서열 번호 64, 서열 번호 69, 서열 번호 62, 서열 번호 63, 서열 번호 37, 서열 번호 38, 서열 번호 41, 서열 번호 65, 서열 번호 66, 서열 번호 67 및 서열 번호 68.
본 발명의 목적을 위해, 소화관은 입, 인두, 식도, 위, 소장(십이지장, 공장(jejunum), 회장(ileum)), 대장(맹장, 결장, 직장) 및 항문으로 구성된다.
본 발명의 목적을 위해, "위장관", 또는 "GI 관"은 위, 소장(십이지장, 공장, 회장), 대장(맹장, 결장, 직장) 및 항문을 포함하는 것으로 이해된다. 본원에 사용된 바와 같이 용어 "위내 소화"는 위, 소장 및/또는 대장에서의 소화를 기재하는 것으로 이해된다.
용어 항체의 "위내 분해"는 본원에서, 위, 소장 및 대장에 존재하는 내인성 또는 외인성 효소 또는 위내 소화 동안 산성 조건에의 노출로 인한, 위, 소장, 대장에서의 본 발명의 ISVD, 화합물 또는 폴리펩타이드의 분해를 지칭하는 데 사용된다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "안정화된 ISVD", "안정화된 화합물" 및 "안정화된 폴리펩타이드"는 국소 투여되는 경우, 소화관에서의 분해에 더 안정하도록 각각 조작된 ISVD, 화합물 또는 폴리펩타이드를 기재하는 것으로 이해된다. 본 발명에 따라 가공되거나 조작되지 않은 ISVD, 화합물 또는 폴리펩타이드와 비교하여, 본 발명에 따라 조작된 안정화된 ISVD, 화합물 또는 폴리펩타이드는 위내 소화, 예컨대 위, 소장 및 대장에 존재하는 내인성 또는 외인성 효소 및/또는 위에 존재하는 산성 조건에 의한 소화에 의해 더 느리게 또는 더 적은 범위로 분해된다. "안정화된 ISVD", "안정화된 화합물" 및 "안정화된 폴리펩타이드"는 또한, 각각 "GI 관에서의 분해에 대해 증강된 안정성을 가진 ISVD", "GI 관에서의 분해에 대해 증강된 안정성을 가진 화합물" 및 "GI 관에서의 분해에 대해 증강된 안정성을 가진 폴리펩타이드"로 지칭된다.
소화관은 국소 적용된 ISVD, 화합물 및 폴리펩타이드를 분해하고 소화시키기 때문에, ISVD, 화합물 또는 폴리펩타이드의 국소 투여는 도전적이다. 위에서, 낮은 pH 및 프로테아제 펩신이 섭취된 ISVD, 화합물 및 폴리펩타이드를 분해한다. 소장에서, 특히 효소 트립신 및 키모트립신이 섭취된 ISVD, 화합물 및 폴리펩타이드를 분해한다. 대장에서, 박테리아-유래 프로테아제가 섭취된 ISVD, 화합물 및 폴리펩타이드를 분해한다. 위내 소화에 대해 개선된 안정성을 가진 ISVD, 화합물 및 폴리펩타이드가 GI 관에 국소 적용하는 데 바람직할 것이다.
안정화된 ISVD, 화합물 및 폴리펩타이드는, 위내 분해에 취약한 하나 이상의 아미노산 잔기를 위내 분해에 내성인 아미노산 잔기로 돌연변이시킴으로써 생성될 수 있다. 안정화된 ISVD, 화합물 및 폴리펩타이드는 위내 분해에 대한 안정성을 증가시키는 다수의 아미노산 잔기 모이어티들의 돌연변이에 의해 생성될 수 있다.
따라서, 본 발명은 본 발명의 TNF 결합제의 안정성을 부여하는 아미노산 잔기를 식별하고, 이러한 TNF 결합제의 안정성을 증강시키는 것에 관한 것이다. 바람직하게는, TNF 결합제는 낮은 pH 조건 또는 하나 이상의 프로테아제, 예컨대 펩신, 트립신, 케모트립신 및/또는 박테리아-유래 프로테아제의 활성 중 하나 이상에 의한 위내 분해에 더 내성을 갖게 된다.
일 실시형태에서, 본 발명은 위내 분해에 대한 ISVD, 화합물 또는 폴리펩타이드의 안정성을 부여하는 아미노산 잔기를 식별하는 방법에 관한 것이며, 이러한 방법은: (a) ISVD, 화합물 또는 폴리펩타이드를 하나 이상의 프로테아제에 의해 단편으로 분해하는 단계; 및 (b) 단계 (a)의 단편을 적합한 수단, 예컨대 LC-MS에 의해 분석함으로써; 위내 분해에 대한 ISVD, 화합물 또는 폴리펩타이드의 안정성을 부여하는 아미노산 잔기(들)를 식별하는 단계를 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명은 위내 분해에 대한 ISVD, 화합물 또는 폴리펩타이드의 안정성을 증강시키는 방법에 관한 것이며, 이러한 방법은 상기 단계 (a) 및 (b), 그 이후에: (c) 위내 분해에 대한 ISVD, 화합물 또는 폴리펩타이드의 안정성을 부여하는 아미노산 잔기(들)를 돌연변이화시키는 단계; 및 (d) 상기 단계 (a) 및 (b)를 반복함으로써; 하나 이상의 단편의 부재가, 위내 분해에 대한 ISVD, 화합물 또는 폴리펩타이드의 증강된 안정성을 나타내는 단계를 포함한다.
본 명세서에서:
- 용어 "면역글로불린 단일 가변 도메인"("ISV" 또는 ISVD"로도 지칭됨)은 일반적으로, 또 다른 가변 도메인과의 상호작용 없이(예를 들어 종래의 4-사슬 모노클로날 항체의 VH 도메인과 VL 도메인 사이에 요구되는 바와 같은 VH/VL 상호작용 없이) 기능적인 항원 결합 부위를 형성할 수 있는 면역글로불린 가변 도메인(VH, VHH 또는 VL 도메인을 포함하여, 중쇄 또는 경쇄 도메인일 수 있음)을 지칭하는 데 사용된다. ISVD의 예들은 당업자에게 명확할 것이고, 예를 들어 나노바디(VHH, 인간화된 VHH 및/또는 낙타화된(camelized) VH, 예컨대 낙타화된 인간 VH를 포함함), IgNAR, 도메인, VH 도메인이거나 VH 도메인으로부터 유래되는 (단일 도메인) 항체(예컨대 dAb's™) 및 VL 도메인이거나 VL 도메인으로부터 유래되는 (단일 도메인) 항체(예컨대 dAb's™)를 포함한다. 본원에서 명확하게 다르게 언급되지 않는 한, 중쇄 가변 도메인(예컨대 VH 또는 VHH 도메인)을 기반으로 하고/하거나 유래되는 ISVD가 일반적으로 바람직하다. 가장 바람직하게는, 본원에서 명시적으로 다르게 지시되지 않는 한, ISVD는 나노바디일 것이다.
- 용어 "나노바디"는 일반적으로 WO 2008/020079 또는 WO 2009/138519에 정의된 바와 같고, 따라서 구체적인 양태에서 일반적으로 VHH, 인간화된 VHH 또는 낙타화된 VH(예컨대 낙타화된 인간 VH) 또는 일반적으로 서열 최적화된 VHH(예컨대 화학적 안정성 및/또는 용해성에 대해 최적화되며, 공지된 인간 프레임워크 영역과 최대 중첩(overlap) 및 최대 발현)를 나타낸다. 용어 나노바디 또는 나노바디들은 Ablynx N.V.사의 등록된 상표명이며, 따라서 나노바디(Nanobody)® 및/또는 나노바디들(Nanobodies)®로서 지칭될 수 있음을 주지한다;
- 일반적으로, 본원에서 다르게 지시되지 않는 한, 본원에 지칭된 ISVD, 나노바디, 폴리펩타이드, 단백질 및 다른 화합물 및 구축물은 인간(및/또는 선택적으로 또한 온혈 동물, 특히 포유류)에서 질병 또는 장애의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 것일 것이다. 따라서 일반적으로, 본원에 기재된 ISVD, 나노바디, 폴리펩타이드, 단백질 및 다른 화합물 및 구축물은 바람직하게는, 이들이 (생물학적) 약물 또는 다른 약제학적으로 또는 치료적 활성 화합물 및/또는 약제학적 생성물 또는 조성물로서 사용될 수 있고/있거나 적합하게는 그 일부일 수 있도록 되어 있다. 이러한 약물, 화합물 또는 생성물은 바람직하게는, 예를 들어 이러한 예방 또는 치료가 필요한 피험자의 예방 또는 치료를 위해 또는 예를 들어 임상 시험의 일부로서, 인간에게 투여되기에 적합하도록 되어 있다. 본원에 추가로 기재된 바와 같이 이러한 목적을 위해, 이러한 약물 또는 화합물은 본 발명에 의해 제공되는 ISVD 이외에 다른 모이어티, 엔터티 또는 결합 단위(또한 본원에 기재된 바와 같이 예를 들어 ISVD-기반 또는 나노바디-기반 생물학적 제제의 약물동력학적 또는 약역학적 특성, 예컨대 이의 반감기에 영향을 주는 하나 이상의 다른 추가의 치료적 모이어티 및/또는 하나 이상의 다른 모이어티일 수 있음)를 함유할 수 있다. 이러한 추가의 치료적 또는 다른 모이어티의 적합한 예들은 당업자에게 명확할 것이고, 예를 들어 일반적으로, 임의의 치료적 활성 단백질, 폴리펩타이드 또는 다른 결합 도메인 또는 결합 단위, 뿐만 아니라 예를 들어 변형, 예컨대 WO 2009/138159의 페이지 149 내지 152에 기재된 것들을 포함할 수 있다. ISVD-기반 생물학적 제제 또는 나노바디-기반 생물학적 제제는 바람직하게는 치료용이거나 치료용(예방 및 진단을 포함함)으로서 사용되기 위한 것이고, 이러한 목적을 위해 바람직하게는, 치료적으로 관련있는 표적(예를 들어 RANK-L, vWF, IgE, RSV, CXCR4, IL-23 또는 다른 인터루킨 등)에 대한 적어도 하나의 ISVD를 함유한다. 이러한 ISVD-기반 또는 나노바디-기반 생물학적 제제의 일부 구체적이지만 비제한적인 예들에 대해, 실시예 8 내지 18, 및 또한 예를 들어 Ablynx N.V.에 의한 다양한 출원들(예를 들어 비제한적으로 WO 2004/062551, WO 2006/122825, WO 2008/020079 및 WO 2009/068627), 뿐만 아니라 예를 들어(비제한적으로) 출원, 예컨대 WO 2006/038027, WO 2006/059108, WO 2007/063308, WO 2007/063311, WO 2007/066016 및 WO 2007/085814를 참조로 한다. 또한, 본원에 추가로 기재된 바와 같이, 추가의 모이어티는 (인간) 혈청 단백질, 예컨대 (인간) 혈청 알부민에 대한 본원에 기재된 바와 같은 ISVD 또는 나노바디일 수 있고, 이러한 ISVD 또는 나노바디 또한, 치료적 용도로, 특히 본원에 기재된 TNF 결합제의 반감기를 연장시키는 데 있어서 및/또는 연장시키기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, WO 2004/041865, WO 2006/122787 및 WO 2012/175400을 참조하며, 이들은 일반적으로 반감기 연장을 위한 혈청-알부민 결합 나노바디의 용도를 기재하고 있다. 또한 본 명세서에서, 본원에서 명확하게 다르게 언급되지 않는 한, 본원에서 언급된 모든 용어들은 WO 2009/138519(또는 WO 2009/138519에서 인용된 선행 기술) 또는 WO 2008/020079(또는 WO 2008/020079에서 인용된 선행 기술)에 주어진 의미를 가진다. 또한, 방법 또는 기술이 본원에서 구체적으로 기재되어 있지 않은 경우, 이러한 방법 또는 기술은 WO 2009/138519(또는 WO 2009/138519에서 인용된 선행 기술) 또는 WO 2008/020079(또는 WO 2008/020079에서 인용된 선행 기술)에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다. 또한 본원에 기재된 바와 같이, 본 발명의 임의의 ISVD 또는 화합물을 포함하는 임의의 약제학적 생성물 또는 조성물은 또한, 그 자체로 약제학적 생성물 또는 조성물에 사용하기 위한 것으로 공지된 하나 이상의 추가의 구성성분(즉, 의도된 약제학적 형태에 따라) 및/또는 예를 들어 치료적 용도를 위한 하나 이상의 다른 화합물 또는 활성 원리(즉, 조합 생성물을 제공하기 위해)를 포함할 수 있다.
또한, 본 명세서 또는 청구항에 사용되는 경우, 하기의 용어들은 주어진 것과 동일한 의미를 가지고/갖거나 적용 가능한 경우 WO 2009/138519의 페이지 62 내지 75에 기재된 방식으로 확인될 수 있다: "효능제", "길항제", "역(inverse) 효능제", "비극성의 비하전된 아미노산 잔기", "극성의 비하전된 아미노산 잔기", "극성의 하전된 아미노산 잔기", "서열 동일성", "정확하게 동일한" 및 "아미노산 차이"(2개의 아미노산 서열들의 서열 비교를 지칭하는 경우), "본질적으로 단리된 (형태)(로)", "도메인", "결합 도메인", "항원 결정기 ", " 에피토프 ", (항원) "~에 대해(against)" 또는 "에 대한", "특이성" 및 "반감기". 또한, 용어 "조정하는" 및 "조정하기 위해", "상호작용 부위", "~에 특이적인", "교차 차단하다(cross-block)", "교차 차단된" 및 "교차 차단하는" 및 "본질적으로 pH에 독립적인"은 Ablynx N.V.의 WO 2010/130832의 페이지 74 내지 79에 정의된 바와 같다(및/또는 기재된 바와 같이 확인될 수 있음). 또한, 본 발명의 구축물, 화합물, 단백질 또는 폴리펩타이드를 지칭하는 경우, "1가", "2가"(또는 "다가"), "이중특이적인"(또는 "다중특이적인") 및 "비파라토픽(biparatopic)"(또는 "멀티파라토픽(multiparatopic)")와 같은 용어들은 WO 2009/138519, WO 2010/130832 또는 WO 2008/020079에 주어진 의미를 가질 수 있다.
본원에 지칭된 ISVD, 나노바디, ISVD-기반 생물학적 제제, 나노바디-기반 생물학적 제제 또는 임의의 다른 아미노산 서열, 화합물 또는 폴리펩타이드와 관련하여 본원에 사용된 바와 같은 용어 "반감기"는 일반적으로, WO 2008/020079의 페이지 57의 단락 o)에서 기재된 바와 같이 정의될 수 있고, 상기 문헌에서 언급된 바와 같이 생체 내에서 예를 들어 서열 또는 화합물의 분해 및/또는 천연 메커니즘에 의한 서열 또는 화합물의 청소(clearance) 또는 격리(sequestration)로 인해 아미노산 서열, 화합물 또는 폴리펩타이드의 혈청 농도가 50%만큼 감소하는 데 소요되는 시간을 지칭한다. 본 발명의 아미노산 서열, 화합물 또는 폴리펩타이드의 생체내 반감기는 당업계에 공지된 임의의 방식, 예컨대 약물동력학적 분석에 의해 확인될 수 있다. 적합한 기술은 당업자에게 명확하게 될 것이고, 예를 들어 일반적으로 WO 2008/020079의 페이지 57의 단락 o)에 기재된 바와 같을 수 있다. 또한 WO 2008/020079의 페이지 57의 단락 o)에서 언급된 바와 같이, 반감기는 파라미터들, 예컨대 t1/2-알파, t1/2-베타 및 곡선하 면적(AUC; area under the curve)을 사용하여 표현될 수 있다. 이러한 측면에서, 본원에 사용된 바와 같이 용어 "반감기"는 특히 t1/2-베타 또는 종말(terminal) 반감기를 지칭함을 주지해야 한다(t1/2-알파 및/또는 AUC 또는 둘 다는 고려되지 않을 수 있음). 예를 들어, 하기 실험 파트, 뿐만 아니라 표준 편람, 예컨대 문헌[Kenneth, A et al: Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists and Peters et al, Pharmacokinetic analysis: A Practical Approach (1996)]을 참조한다. 또한, 문헌["Pharmacokinetics", M Gibaldi& D Perron, published by Marcel Dekker, 2nd Rev. edition (1982)]를 참조한다. 유사하게는, 용어 "반감기 증가" 또는 "증가된 반감기"는 또한, WO 2008/020079의 페이지 57의 단락 o)에 정의된 바와 같고, 특히 t1/2-알파 및/또는 AUC 또는 둘 다의 증가와 함께 또는 없이, t1/2-베타의 증가를 지칭한다.
이에 일 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 화합물에 관한 것이며, 여기서, 상기 화합물은 혈청 단백질 결합 모이어티를 추가로 포함한다.
추가의 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 화합물에 관한 것이며, 여기서, 상기 혈청 단백질 결합 모이어티는 혈청 알부민에 결합한다.
용어가 본원에서 구체적으로 정의되지 않는 경우, 이러한 용어는 당업계에서의 이의 통상적인 의미를 가지며, 이러한 의미는 당업자에게 명확할 것이다. 예를 들어, 표준 편람, 예컨대 문헌[Sambrook et al, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (2nd.Ed.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); F. Ausubel et al., eds., "Current protocols in molecular biology", Green Publishing and Wiley Interscience, New York (1987); Lewin, "Genes II", John Wiley & Sons, New York, N.Y., (1985); Old et al., "Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Engineering", 2nd edition, University of California Press, Berkeley, CA (1981); Roitt et al., "Immunology" (6th. Ed.), Mosby/Elsevier, Edinburgh (2001); Roitt et al., Roitt's Essential Immunology, 10th Ed. Blackwell Publishing, UK (2001)]; 및 [Janeway et al., "Immunology" (6th. Ed.), Garland Science Publishing/Churchill Livingstone, New York (2005)], 뿐만 아니라 본원에서 인용된 일반적인 배경지식을 참조한다.
또한 본원에서 이미 지시된 바와 같이, 나노바디의 아미노산 잔기는 문헌[Riechmann and Muyldermans, J. Immunol. Methods 2000 Jun 23; 240 (1-2): 185-195]의 논문에서 낙타과(Camelid)의 VHH 도메인에 적용된 바와 같이; 또는 본원에 지칭된 바와 같이 카바트 등(문헌["Sequence of proteins of immunological interest", US Public Health Services, NIH, Bethesd, MD, Publication No. 91])에 의해 주어진 VH에 대한 일반적인 넘버링에 따라 넘버링된다. 이러한 넘버링에 따르면, 나노바디의 FR1은 위치 1-30에 아미노산 잔기를 포함하고, 나노바디의 CDR1은 위치 31-35에 아미노산을 포함하며, 나노바디의 FR2는 위치 36-49에 아미노산을 포함하고, 나노바디의 CDR2는 위치 50-65에 아미노산을 포함하며, 나노바디의 FR3은 위치 66-94에 아미노산을 포함하고, 나노바디의 CDR3은 위치 95-102에 아미노산을 포함하며, 나노바디의 FR4는 위치 103-113에 아미노산을 포함한다. [이러한 측면에서, - VH 도메인 및 VHH 도메인에 대해 당업계에 잘 공지된 바와 같이 - 각각의 CDR 내 아미노산 잔기의 총 수는 다양할 수 있고, 카바트 넘버링에 의해 지시된 아미노산 잔기의 총 수에 상응하지 않을 수 있음(즉, 카바트 넘버링에 따른 하나 이상의 위치는 실제 서열에 점유되지 않을 수 있거나, 실제 서열은 카바트 넘버링에 의해 허용된 수보다 더 많은 아미노산 잔기를 함유할 수 있음)을 주지해야 한다. 이는 일반적으로, 카바트에 따른 넘버링이 실제 서열에서의 아미노산 잔기의 실제 넘버링에 상응할 수 있거나 상응하지 않을 수 있음을 의미한다. 그러나 일반적으로, 카바트 넘버링에 따라 그리고 CDR 내 아미노산 잔기의 수와는 상관 없이, 카바트 넘버링에 따른 위치 1은 FR1의 시작에 상응하고 그 반대이기도 하며, 카바트 넘버링에 따른 위치 36은 FR2의 시작에 상응하고 그 반대이기도 하며, 카바트 넘버링에 따른 위치 66은 FR3의 시작에 상응하고 그 반대이기도 하고, 카바트 넘버링에 따른 위치 103은 FR4의 시작에 상응하고 그 반대이기도 한 것으로 말할 수 있다.]
VH 도메인의 아미노산 잔기를 넘버링하는 대안적인 방법은 코티아 등(문헌[Nature 342, 877-883 (1989)])에 의해 기재된 방법, 소위 "AbM 정의" 및 소위 "접촉 정의(contact definition)"이며, 이러한 방법은 낙타과 유래의 VHH 도메인 및 나노바디에 유사한 방식으로 적용될 수 있다. 그러나, 본 명세서, 양태 및 도면에서, Riechmann 및 Muyldermans에 의해 VHH 도메인에 적용된 바와 같이 카바트에 따른 넘버링이 다르게 지시되지 않는 한, 후속될 것이다.
또한, 도면, 임의의 서열 목록 및 실험 파트/실시예는 단지 본 발명을 추가로 예시하기 위해 주어질 뿐이고, 본원에서 명시적으로 다르게 지시되지 않는 한, 본 발명 및/또는 첨부된 청구항의 범위를 임의의 방식으로 제한하려는 것으로 해석되거나 간주되어서는 안됨을 주지해야 한다.
본 발명은 또한, 본원에 기재된 바와 같은 본 발명의 TNF 결합제를 포함하거나 본질적으로 구성된(즉, 하나 이상의 이러한 TNF 결합제, 예컨대 1개, 2개 또는 3개의 이러한 TNF 결합제를 포함하거나 본질적으로 구성된) 단백질, 폴리펩타이드 및 다른 구축물, 분자 또는 화학적 엔터티; 본 발명의 TNF 결합제의 발현/제조 및/또는 이러한 TNF 결합제를 포함하는 단백질, 폴리펩타이드 및 다른 구축물, 분자 또는 화학적 엔터티의 발현/제조 방법; 본 발명의 TNF 결합제 및/또는 이러한 TNF 결합제를 포함하는 단백질, 폴리펩타이드 및 다른 구축물, 분자 또는 화학적 엔터티를 포함하는 조성물 및 생성물(예컨대 약제학적 조성물 및 생성물); 본 발명의 TNF 결합제를 코딩하고/하거나 이러한 TNF 결합제를 포함하는 단백질 또는 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및 핵산; 및 본 발명의 TNF 결합제 및 이러한 TNF 결합제를 포함하는 단백질, 폴리펩타이드 및 다른 구축물, 분자 또는 화학적 엔터티의 용도(특히, 치료적, 예방적 및 진단적 용도)에 관한 것이다.
본 발명의 이들 양태 및 다른 양태, 실시형태, 이점, 적용 및 용도들은 본원의 추가의 설명으로부터 명확해질 것이다.
이에 추가의 양태에서, 본 발명은 적어도 하나의(예컨대 1개, 2개 또는 3개의) 본 발명의 TNF 결합제를 포함하거나 본질적으로 구성된 단백질(예컨대 융합 단백질), 폴리펩타이드, 구축물, 화합물 또는 다른 화학적 엔터티(또한 종합적으로 본원에서 "본 발명의 화합물", "본 발명의 폴리펩타이드", "본 발명의 구축물", 또는 "본 발명의 융합 단백질"로 지칭됨)에 관한 것이다. 따라서, 본 발명의 화합물은 폴리펩타이드일 수 있다.
본 발명의 이러한 화합물은 본 발명의 하나 이상의 TNF 결합제 외에도, 하나 이상의 다른 아미노산 서열, 화학적 엔터티 또는 모이어티를 추가로 함유할 수 있다. 이들 다른 아미노산 서열, 화학적 엔터티 또는 모이어티는, 예를 들어 (생성된) 본 발명의 화합물에 요망되는 생물학적 및/또는 치료적 활성을 제공하기 위해(예를 들어, 생성된 본 발명의 화합물에 친화성 및 바람직하게는 또 다른 치료적으로 관련있는 표적에 대한 약효를 제공하여, 생성된 화합물이 TNF 및 해당되는 다른 치료적으로 관련있는 표적에 대해 "이중특이적"으로 되게 하기 위해), 요망되는 반감기를 제공하고/하거나 (그렇지 않다면) 약물동력학적 및/또는 약역학적 특성을 변형시키거나 개선하기 위해, 본 발명의 화합물을 특정 세포, 조직 또는 기관(암세포 및 암조직을 포함함)으로 표적화하기 위해, 세포독성 효과를 제공하기 위해 및/또는 검출 가능한 태그 또는 표지로서 역할을 하기 위해, (생성된) 본 발명의 화합물에 하나 이상의 요망되는 특성을 부여할 수 있고/있거나 (생성된) 본 발명의 화합물의 특성을 요망되는 방식으로 변경할 수 있다. 이러한 다른 아미노산 서열, 화학적 엔터티 또는 모이어티의 일부 비제한적인 예들은:
- 하나 이상의 적합한 링커(예컨대 9GS, 15GS 또는 35GS 링커); 및/또는
- TNF 이외의 치료적으로 관련있는 표적에 대한 하나 이상의 결합 도메인 또는 결합 단위(즉, TNF 및 다른 치료적으로 관련있는 표적 둘 다에 대해 이중특이적인 본 발명의 화합물을 제공하기 위해); 및/또는
- 반감기 증가를 제공하는 하나 이상의 결합 도메인 또는 결합 단위(예를 들어, 혈청 단백질, 예컨대 혈청 알부민에 대해 결합할 수 있는 결합 도메인 또는 결합 단위); 및/또는
- 본 발명의 화합물을 요망되는 세포, 조직 또는 기관(예컨대 암세포)으로 표적화하는 하나 이상의 결합 도메인 또는 결합 단위; 및/또는
- TNF에 대해 증가된 특이성을 제공하는 하나 이상의 결합 도메인 또는 결합 단위(통상, 이들은 TNF에 결합할 수 있을 것이지만, 일반적으로 그 자체로는 본질적으로 TNF에 대해 기능적이지 않을 것임); 및/또는
- 본 발명의 화합물을 (요망되는) 세포 내로 내재화시킬 수 있는 결합 도메인, 결합 단위 또는 다른 화학적 엔터티(예를 들어, WO 2005/044858에 기재된 바와 같은 내재화(internalizing) 항-EGFR 나노바디); 및/또는
- 반감기를 개선하는 모이어티, 예컨대 적합한 폴리에틸렌글리콜 기(즉, PEG화) 또는 증가된 반감기를 제공하는 아미노산 서열, 예컨대 WO 2008/068280에 기재된 바와 같은 인간 혈청 알부민 또는 이의 적합한 단편(즉, 알부민 융합) 또는 예를 들어 혈청 알부민 결합 펩타이드; 및/또는
- 페이로드(payload), 예컨대 세포독성 페이로드; 및/또는
- 검출 가능한 표지 또는 태그, 예컨대 방사성표지 또는 형광 표지; 및/또는
- 본 발명의 화합물의 고정, 검출 및/또는 정제를 도울 수 있는 태그, 예컨대 HIS 또는 FLAG3 태그; 및/또는
- 작용화될 수 있는 태그, 예컨대 C-말단 GGC 또는 GGGC 태그; 및/또는
- 본 발명의 TNF 결합제에 대해 본원에 추가로 기재된 바와 같고/같거나 WO 2012/175741 또는 WO2015/173325에 기재된 바와 같을 수 있는 C-말단 연장 X(n)
이다.
통상 덜 바람직하긴 하지만, 본 발명의 화합물은 또한 종래의 (바람직하게는 인간) 항체(예컨대 Fc 파트 또는 이의 기능적 단편 또는 하나 이상의 불변 도메인) 및/또는 낙타과 중쇄 단독 항체(예컨대 하나 이상의 불변 도메인)의 하나 이상의 파트 또는 단편을 함유할 수 있다는 것이 또한, 본 발명의 범위로부터 배제되지 않는다.
특정한 양태에서, 본 발명은, 본원에 정의된 바와 같은 ISVD 또는 본원에 정의된 바와 같은 화합물을 포함하거나 본질적으로 구성되고, 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위를 선택적으로는 하나 이상의 펩타이드 링커를 통해 연결하여 추가로 포함하는 구축물에 관한 것이다.
추가의 특정 양태에서, 본 발명은 본원에 정의된 바와 같은 구축물에 관한 것이며, 여기서, 상기 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위는 폴리에틸렌 글리콜 분자, 혈청 단백질 또는 이의 단편, 혈청 단백질에 결합할 수 있는 결합 단위, Fc 부위, 및 혈청 단백질에 결합할 수 있는 작은 단백질 또는 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 화합물이 하나 이상의 추가의 결합 도메인 또는 결합 단위(예를 들어 TNF에 대해 증가된 특이성을 제공하는 TNF에 대한 추가의 본질적으로 비-기능적인 결합 도메인 또는 결합 단위, TNF 이외의 치료적 표적에 대한 결합 도메인 또는 결합 단위, 증가된 반감기를 제공하는 표적, 예컨대 인간 혈청 알부민에 대한 결합 도메인 또는 결합 단위, 및/또는 본 발명의 화합물을 특정 세포, 조직 또는 기관으로 표적화하고/하거나 본 발명의 화합물을 세포 내로 내재화시킬 수 있는 결합 도메인 또는 결합 단위)를 함유하는 경우, 이들 다른 결합 도메인 또는 결합 단위는 바람직하게는 하나 이상의 ISVD를 포함하고, 보다 바람직하게는 모두 ISVD이다. 예를 들어 비제한적으로, 이들 하나 이상의 추가의 결합 도메인 또는 결합 단위는 하나 이상의 나노바디(VHH, 인간화된 VHH 및/또는 낙타화된 VH, 예컨대 낙타화된 인간 VH를 포함함), VH 도메인이거나 VH 도메인으로부터 유래되는 (단일 도메인) 항체, VH 도메인이거나 본질적으로 구성되거나 VH 도메인으로부터 유래되는 dAb, 또는 심지어 VL 도메인이거나 본질적으로 구성되는 (단일) 도메인 항체 또는 dAb일 수 있다. 특히, 이들 하나 이상의 결합 도메인 또는 결합 단위가 존재하는 경우, 이들은 하나 이상의 나노바디를 포함할 수 있고, 보다 특히 모두 나노바디이다.
본 발명의 화합물이 이의 C-말단부에 ISVD를 갖는 경우(이러한 C-말단 ISVD는 본 발명의 TNF 결합제일 수 있거나, 예를 들어 본 발명의 화합물에 존재하는 경우, TNF에 대해 증가된 특이성을 제공하는 TNF에 대한 추가의 본질적으로 비-기능적인 ISVD, TNF 이외의 치료적 표적에 대한 ISVD, 증가된 반감기를 제공하는 표적, 예컨대 인간 혈청 알부민에 대한 ISVD, 또는 본 발명의 화합물을 특정 세포, 조직 또는 기관으로 표적화하고/하거나 본 발명의 화합물을 세포 내로 내재화시킬 수 있는 ISVD일 수 있음), 본 발명의 화합물(즉, 상기 C-말단 ISVD)은 바람직하게는 C-말단 연장 X(n)을 가지며, 이러한 C-말단 연장은 본원에서 본 발명의 TNF 결합제에 대해 본원에서 기재된 바와 같고/같거나 WO 2012/175741 또는 WO2015/173325에 기재된 바와 같을 수 있다.
본 발명의 화합물이 본 발명의 하나 이상의 TNF 결합제 외에도, 임의의 추가의 ISVD를 함유하고(하나 이상의 추가의 ISVD는 언급된 바와 같이, TNF에 대해 증가된 특이성을 제공하는 TNF에 대한 추가의 본질적으로 비-기능적인 ISVD, TNF 이외의 치료적 표적에 대한 ISVD, 증가된 반감기를 제공하는 표적, 예컨대 인간 혈청 알부민에 대한 ISVD, 및/또는 본 발명의 화합물을 특정 세포, 조직 또는 기관으로 표적화하고/하거나 본 발명의 화합물을 세포 내로 내재화시킬 수 있는 ISVD일 수 있음), 이러한 추가의 ISVD가 나노바디이거나 본질적으로 VH 서열로 구성되고/되거나 유래되는 ISVD인 경우, 본 발명의 바람직한 양태에 따르면, 본 발명의 화합물에 존재하는 상기 하나 이상의 (바람직하게는 모든) 추가의 ISVD는, 기존의 항체에 의한 결합을 감소시키는 하나 이상의 프레임워크 돌연변이를 이들의 서열 내에 함유할 것이다. 특히 본 발명의 이러한 양태에 따르면, 이러한 추가의 ISVD는 WO2015/173325에 기재된 바와 같고/같거나 본질적으로 본 발명의 TNF 결합제에 대해 본원에 기재된 바와 같이 위치 11, 89, 110 및/또는 112에 아미노산 잔기/돌연변이(의 적합한 조합)를 함유할 수 있다. 하나의 구체적인 양태에서, 본 발명의 화합물이 이의 C-말단부에 이러한 ISVD를 갖는 경우(즉, 이의 C-말단부에 본 발명의 TNF 결합제를 갖지 않음), C-말단부에 존재하고/하거나 형성하는 적어도 상기 ISVD는 기존의 항체에 의한 결합을 감소시키는 이러한 프레임워크 돌연변이를 가진다(및 상기 C-말단 ISVD는 바람직하게는 또한, 본원에 기재된 바와 같은 C-말단 연장 X(n)을 가질 것임).
언급된 바와 같이, 본 발명의 화합물이 증가된 반감기를 (즉, 본 발명의 1가 TNF 결합제와 비교하여) 가져야 하는 경우, 본 발명의 화합물은 바람직하게는, 이러한 증가된 반감기를 제공하는 적어도 하나의(예컨대 하나의) ISVD(및 특히 나노바디)를 함유한다. 이러한 ISVD는 통상, 적합한 혈청 단백질, 예컨대 트랜스페린, 특히 (인간) 혈청 알부민에 대한 것일 것이다. 특히, 이러한 ISVD 또는 나노바디는 예를 들어 EP 2 139 918, WO 2011/006915, WO 2012/175400, WO 2014/111550에 기재된 바와 같이 인간 혈청 알부민에 대한 (단일) 도메인 항체 또는 dAb일 수 있고, 특히 WO 2004/041865, WO 2006/122787, WO 2012/175400 또는 WO2015/173325에 기재된 바와 같이 혈청 알부민 결합 나노바디일 수 있다. 특히 바람직한 혈청 알부민 결합 ISVD는 나노바디 Alb-1(WO 2006/122787 참조) 또는 이의 인간화된 변이체, 예컨대 Alb-8(WO 2006/122787, 서열 번호 62), Alb-23(WO 2012/175400, 서열 번호 1) 및 Alb-1의 다른 인간화된 (및 바람직하게는 또한 서열-최적화된) 변이체 및/또는 Alb-8 또는 Alb-23의 변이체(또는 보다 일반적으로, Alb-1, Alb-8 및 Alb-23과 동일한 CDR을 본질적으로 가진 ISVD)이다.
마찬가지로 언급된 바와 같이, 이러한 혈청 알부민 결합 ISVD가 존재하는 경우, 이러한 ISVD는 기존의 항체에 의한 결합을 감소시키는 하나 이상의 프레임워크 돌연변이를 이의 서열 내에 함유할 수 있다. 특히, 이러한 혈청 알부민 결합 ISVD가, VH 도메인으로 본질적으로 구성되고/되거나 유래되는 나노바디 또는 (단일) 도메인 항체인 경우, 혈청 알부민 결합 ISVD는 WO2015/173325에 기재된 바와 같고/같거나 본질적으로 본 발명의 TNF 결합제에 대해 본원에 기재된 바와 같이 위치 11, 89, 110 및/또는 112에 아미노산 잔기/돌연변이(의 적합한 조합)를 함유할 수 있다. 예를 들어, WO2015/173325는, 본 발명의 화합물에 사용될 수 있는 기존의 항체에 의한 결합을 감소시키는 위치 11, 89, 110 및/또는 112에 아미노산 잔기/돌연변이를 함유하는 Alb-1, Alb-8 및 Alb-23의 다수의 변이체들을 기재하고 있다.
본 발명의 특정한 비제한적인 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같이 TNF에 결합하는 하나 이상의 빌딩 블록(building block), 예를 들어 ISVD 이외에, 혈청 알부민에 결합하는 적어도 하나의 빌딩 블록, 예컨대 혈청 알부민 결합 ISVD, 바람직하게는 인간 혈청 알부민 결합 ISVD를 포함하는 본 발명의 화합물, 예컨대 본 발명의 폴리펩타이드를 제공하며, 여기서, 상기 혈청 알부민 결합 ISVD는 본질적으로 4개의 프레임워크 영역(각각 FR1 내지 FR4) 및 3개의 상보성 결정 영역(각각 CDR1 내지 CDR3)으로 구성되며, 여기서, CDR1은 SFGMS이며, CDR2는 SISGSGSDTLYADSVKG이고, CDR3은 GGSLSR이다. 바람직하게는, 상기 인간 혈청 알부민 결합 ISVD은 Alb8, Alb23, Alb129, Alb132, Alb11, Alb11 (S112K)-A, Alb82, Alb82-A, Alb82-AA, Alb82-AAA, Alb82-G, Alb82-GG, Alb82-GGG, Alb92 또는 Alb223로 이루어진 군으로부터 선택된다(표 D 참조).
마찬가지로, 이러한 혈청 알부민 결합 ISVD가 본 발명의 화합물의 C-말단부에 존재하는 경우, 혈청 알부민 결합 ISVD(및 그 결과 본 발명의 화합물)는 바람직하게는 C-말단 연장 X(n)을 가지며, 여기서, C-말단 연장은 본 발명의 TNF 결합제에 대해 본원에 기재된 바와 같고/같거나 WO 2012/175741 또는 WO2015/173325에 기재된 바와 같을 수 있다. 또한, 이는 바람직하게는 기존의 항체의 결합을 감소시키는 돌연변이, 예컨대 WO2015/173325에 기재된 위치 11, 89, 110 및/또는 112에서의 아미노산 잔기/돌연변이(의 적합한 조합)를 가진다.
그러나 언급된 바와 같이, 본 발명의 화합물의 반감기를 증가시키는 다른 수단들(예컨대 PEG화(PEGylation), 인간 알부민 또는 이의 적합한 단편에의 융합, 또는 적합한 혈청 알부민 결합 펩타이드의 사용)도 덜 바람직하긴 하더라도, 본 발명의 범위 내에 포함된다.
이에 일 실시형태에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 화합물에 관한 것이며, 여기서, 상기 혈청 단백질 결합 모이어티는 비-항체-기반 폴리펩타이드이다.
추가의 실시형태에서, 본 발명은 PEG를 추가로 포함하는 본원에 기재된 바와 같은 화합물에 관한 것이다.
일반적으로, 본 발명의 화합물이 증가된 반감기를 (예를 들어 반감기를 증가시키는 ISVD의 존재 또는 반감기를 증가시키는 임의의 다른 적합한 방식을 통해) 갖는 경우, 생성된 본 발명의 화합물은 바람직하게는, (인간 및/또는 적합한 동물 모델, 예컨대 마우스 또는 시노몰구스 원숭이에서 측정된 바와 같이) 본 발명의 1가 TNF 결합제의 반감기보다 적어도 2배, 바람직하게는 적어도 5배, 예를 들어 적어도 10배 또는 20배 초과인 반감기(본원에 정의된 바와 같음)를 가진다. 특히, 본 발명의 화합물은 바람직하게는, 인간 피험자에서 적어도 1일, 바람직하게는 적어도 3일, 보다 바람직하게는 적어도 7일, 예컨대 적어도 10일의 반감기(본원에 정의된 바와 같음)를 가진다.
본원의 개시내용으로부터, 하나 이상의 ISVD를 기반으로 한 본 발명의 화합물은 상이한 "포맷"들을 가질 수 있으며, 예를 들어 본질적으로 1가, 2가 또는 3가일 수 있으며, 단일특이적, 이중특이적, 삼중특이적 등일 수 있고, 비파라토픽(본원 및 예를 들어 WO 2009/068625에 정의된 바와 같음)일 수 있음이 명확할 것이다. 예를 들어, 본 발명의 화합물은:
- (본질적으로) 1가일 수 있으며, 즉, (본질적으로) 본 발명의 단일 TNF 결합제를 포함할 수 있다. 언급된 바와 같이, 1가 포맷으로 사용되는 경우, 본 발명의 TNF 결합제는 바람직하게는 본원에 추가로 기재된 바와 같은 C-말단 연장 X(n)을 가진다. 본 발명의 이러한 화합물도 반감기가 연장될 수 있다;
- (본질적으로) 2가 또는 3가 및 단일특이적일 수 있다. 본 발명의 이러한 화합물은 TNF에 대한 2개 이상의 ISVD를 포함할 것이며, 이들 ISVD는 동일하거나 상이할 수 있고, 상이한 경우, TNF 상의 동일한 에피토프들에 대한 것이거나 TNF 상의 상이한 에피토프들에 대한 것일 수 있다(TNF 상의 상이한 에피토프들에 대한 것인 경우, 본 발명의 비파라토픽 또는 멀티파라토픽 화합물을 제공하기 위해). 본 발명의 이러한 화합물도 반감기가 연장될 수 있다;
- (본질적으로) 2가, 3가(또는 다가) 및 이중특이적 또는 삼중특이적(또는 다중특이적)일 수 있다. 본 발명의 이러한 화합물은 TNF 및 적어도 하나의 다른 표적에 대한 것일 것이다. 본원에 기재된 바와 같이, 상기 다른 표적은 예를 들어, TNF 및 상기 다른 치료 표적에 대해 이중특이적인 본 발명의 화합물을 제공하기 위해 또 다른 치료적으로 관련있는 표적(즉, TNF가 아님)일 수 있다. 상기 다른 표적은 또한, 증가된 반감기를 제공하는 표적(예컨대 인간 혈청 알부민)어어서, 증가된 반감기를 가진 본 발명의 화합물을 제공할 수 있다. 또한 본원에 언급된 바와 같이, 이러한 다른 표적은 또한, 본 발명의 화합물을 특정 세포, 조직 또는 기관으로 표적화시킬 수 있거나, 본 발명의 화합물을 세포 내로 내재화시킬 수 있다. 또한, 예를 들어, TNF 및 적어도 하나의 다른 치료적으로 관련있는 표적에 대해 이중특이적이고 반감기가 연장된 본 발명의 화합물을 제공하기 위해 이들 접근법/ISVD를 조합하는 것이 가능하다.
마찬가지로 바람직하게는, 본 발명의 이들 화합물이 본 발명의 적어도 하나의 TNF 결합제 이외의 하나 이상의 ISVD를 함유하는 경우, 이들 다른 ISVD 중 적어도 하나, 바람직하게는 모두는, 기존의 항체에 의한 결합을 감소시키는 하나 이상의 프레임워크 돌연변이(예컨대 특히, 본 발명의 TNF 결합제에 대해 본원에 기재된 바와 같고/같거나 일반적으로 WO2015/173325에 기재된 바와 같은 위치 11, 89, 110 및/또는 112에서의 아미노산 잔기/돌연변이들의 조합)를 이의 서열 내에 함유할 것이다. 또한, 본 발명의 이러한 화합물들이 이들의 C-말단부에 본 발명의 TNF 결합제를 갖는 경우, 상기 C-말단 TNF 결합제(및 그 결과 본 발명의 화합물)는 바람직하게는, 본원에 기재된 바와 같은 C-말단 연장 X(n)을 가질 것이다. 유사하게는, 본 발명의 이러한 화합물들이 이들의 C-말단부에 또 다른 ISVD(즉, 본 발명의 TNF 결합제가 아니라 예를 들어 반감기-연장 ISVD)를 갖는 경우, 상기 C-말단 ISVD(및 그 결과 본 발명의 화합물)는 바람직하게는 본원에 기재된 바와 같은 C-말단 연장 X(n)을 가질 것이고/이거나 기존의 항체에 의한 결합을 감소시키는 하나 이상의 프레임워크 돌연변이(마찬가지로 본원 및 WO2015/173325에 추가로 기재된 바와 같음)를 이의 서열 내에 함유할 것이다.
당업자가 알게 될 바와 같이, 본 발명의 화합물이 (예를 들어 피부 상에서 또는 눈 안에서) 국소 적용되기 위한 것이거나, 예를 들어 어떤 장소에서, 예를 들어 GI 관(위장관; 예를 들어 경구 투여 또는 좌제에 의한 투여 후) 또는 폐(예를 들어 흡입에 의한 투여 후)에서 (국지화된(localized)) 치료 작용을 갖고자 하거나, 그렇지 않다면 (예를 들어 직접적인 주사에 의해) 의도된 작용 장소에 직접적으로 적용되고자 하는 경우, 본 발명의 화합물은 통상, 반감기 연장을 필요로 하지 않을 것이다. 또한, 소정의 급성 질환 또는 적응증들의 치료의 경우, 연장된 반감기를 갖지 않는 것이 바람직할 수 있다. 이들 경우에, 반감기가 연장되지 않은 본 발명의 1가 화합물 또는 본 발명의 화합물(TNF 결합제를 포함함)(예를 들어, TNF에 대해 2가이거나 비파라토픽인 본 발명의 화합물)의 사용이 바람직하다.
본 발명의 이러한 화합물의 일부 바람직하지만 비제한적인 예들은 하기 표 C-1에 도식적으로 나타나 있고, 이들 형태는 각각 본 발명의 추가의 양태를 형성한다. 반감기가 연장되지 않은 본 발명의 적합한 화합물의 다른 예들은 본원의 개시내용을 기반으로 당업자에게 명확할 것이다.
당업자가 알게 될 바와 같이, 본 발명의 화합물이 전신 투여 및/또는 만성 질병 또는 장애의 예방 및/또는 치료를 위한 것인 경우, 통상적으로 상기 본 발명의 화합물이 즉, 본 발명의 이러한 화합물에 존재하는 TNF 결합제(들)과 비교하여 증가된 반감기(본원에 정의된 바와 같음)를 갖는 것이 바람직할 것이다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 이러한 화합물은 반감기-연장 ISVD, 예컨대 바람직하게는 인간 혈청 알부민에 결합하는 ISVD, 특히 나노바디(본원에 기재된 바와 같이)를 함유할 것이다.
본 발명의 이러한 화합물의 일부 바람직하지만 비제한적인 예들은 하기 표 C-2에 도식적으로 나타나 있으며, 이들은 각각 본 발명의 추가의 양태를 형성한다. 반감기가 연장된 본 발명의 적합한 화합물의 다른 예들은 본원의 개시내용을 기반으로 당업자에게 명확할 것이다. 일반적으로, 반감기가 연장된 본 발명의 화합물을 위해, C-말단 연장의 존재가 매우 바람직하다.
면역글로불린 단일 가변 도메인은 화합물, 예컨대 본 발명의 폴리펩타이드의 제조를 위한 "빌딩 블록"으로서 사용될 수 있으며, 이는 선택적으로 하나 이상의 추가의 "빌딩 블록", 예컨대 TNF 상의 동일한 또는 또 다른 에피토프 및/또는 TNF 이외의 하나 이상의 다른 항원, 단백질 또는 표적에 대한 ISVD, 예를 들어 치료 작용 방식을 가진 빌딩 블록을 함유할 수 있다.
일반적으로, 단일 빌딩 블록, 단일 면역글로불린, 단일 가변 도메인 또는 단일 나노바디를 포함하거나 본질적으로 구성된 화합물, 폴리펩타이드 또는 구축물은 본원에서 각각 "1가" 화합물 또는 "1가" 폴리펩타이드 또는 "1가 구축물"로 지칭될 것이다. 2개 이상의 빌딩 블록 또는 결합 단위(예컨대 ISVD)들을 포함하는 화합물, 폴리펩타이드 또는 구축물은 또한 본원에서 "다가" 화합물, 폴리펩타이드 또는 구축물로서 지칭될 것이고, 이러한 화합물, 폴리펩타이드 또는 구축물에 존재하는 빌딩 블록/ISVD는 또한 본원에서 "다가 포맷"으로 존재하는 것으로 지칭될 것이다. 예를 들어, "2가" 화합물 또는 폴리펩타이드는 2개의 면역글로불린 단일 가변 도메인들을 선택적으로 링커 서열을 통해 연결하여 포함할 수 있는 반면, "3가" 화합물 또는 폴리펩타이드는 3개의 면역글로불린 단일 가변 도메인들을 선택적으로 2개의 링커 서열들을 통해 연결하여 포함할 수 있는 반면; "4가" 화합물 또는 폴리펩타이드는 4개의 면역글로불린 단일 가변 도메인들을 선택적으로 3개의 링커 서열들을 통해 연결하여 포함할 수 있는 등이다.
다가 화합물, 폴리펩타이드 또는 구축물에서, 2개 이상의 ISVD, 예컨대 나노바디들은 동일하거나 상이할 수 있고, 동일한 항원 또는 항원 결정기들에 대한 것일 수 있거나, 대안적으로 상이한 항원 또는 항원 결정기들에 대한 것일 수 있거나(예를 들어 동일한 파트(들) 또는 에피토프(들)에 대한 것이거나 상이한 파트 또는 에피토프들에 대한 것일 수 있음); 또는 이들의 임의의 적합한 조합일 수 있다. 적어도 2개의 빌딩 블록(예컨대 ISVD)들을 함유하며 여기서 적어도 하나의 빌딩 블록이 제1 항원(즉, TNF)에 대한 것이고 적어도 하나의 빌딩 블록이 제2 항원(즉, TNF와 상이함)에 대한 것인 화합물, 폴리펩타이드 또는 구축물이 또한, 각각 "다중특이적인" 화합물, 폴리펩타이드 또는 구축물로서 지칭될 것이고, 이러한 화합물, 폴리펩타이드 또는 구축물에 존재하는 빌딩 블록(예컨대 ISVD)이 또한, 본원에서 "다중특이적인 포맷"으로 존재하는 것으로 지칭될 것이다. 따라서, 예를 들어, 본 발명의 "이중특이적인" 화합물 또는 폴리펩타이드는 제1 항원(즉, TNF)에 대한 적어도 하나의 ISVD 및 제2 항원(즉, TNF와 상이함)에 대한 적어도 하나의 추가의 ISVD를 포함하는 화합물 또는 폴리펩타이드인 반면, 본 발명의 "삼중특이적인" 화합물 또는 폴리펩타이드는 제1 항원(즉, TNF)에 대한 적어도 하나의 ISVD, 제2 항원(즉, TNF와 상이함)에 대한 적어도 하나의 추가의 ISVD 및 제3 항원(즉, TNF 및 제2 항원 둘 다와 상이함)에 대한 적어도 하나의 추가의 ISVD를 포함하는 화합물 또는 폴리펩타이드 등이다.
"멀티파라토픽" 화합물, "멀티파라토픽" 폴리펩타이드 및 "멀티파라토픽" 구축물, 예컨대 "비파라토픽" 화합물, 폴리펩타이드 또는 구축물, 또는 "트리파라토픽" 화합물, 폴리펩타이드 또는 구축물은 각각 상이한 파라토프(paratope)들을 가진 2개 이상의 빌딩 블록을 포함하거나 본질적으로 구성된다.
이에, TNF에 결합하는 본 발명의 ISVD는 본질적으로 단리된 형태(본원에 정의된 바와 같음)일 수 있거나, 이들 ISVD는 TNF에 결합하는 하나 이상의 ISVD를 포함하거나 본질적으로 구성될 수 있고 선택적으로 하나 이상의 추가의 아미노산 서열(모두 선택적으로 하나 이상의 적합한 링커를 통해 연결됨)을 추가로 포함할 수 있는 화합물, 폴리펩타이드 또는 구축물의 파트를 형성할 수 있다. 본 발명은 본원에 정의된 바와 같은 TNF에 결합하는 본 발명에 따른 적어도 하나의 ISVD, 예컨대 본 발명의 하나 이상의 ISVD(또는 이의 적합한 단편)를 포함하거나 본질적으로 구성된 화합물, 폴리펩타이드 또는 구축물에 관한 것이다.
본 발명의 하나 이상의 ISVD는 이러한 화합물, 폴리펩타이드 또는 구축물에서 결합 단위 또는 빌딩 블록로서 사용되어, 본 발명의 1가, 다가 또는 멀티파라토픽 화합물, 폴리펩타이드 또는 구축물을 제공할 수 있으며, 이들은 모두 본원에 기재된 바와 같다. 따라서, 본 발명은 또한, 본 발명의 하나의 1가 폴리펩타이드 또는 ISVD를 포함하거나 본질적으로 구성된 1가인 화합물 또는 폴리펩타이드에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 또한, 본 발명의 2개 이상의 ISVD를 포함하거나 본질적으로 구성된 각각 다가 화합물, 다가 폴리펩타이드 또는 다가 구축물, 예컨대 2가 또는 3가 화합물, 폴리펩타이드 또는 구축물인 화합물, 폴리펩타이드 또는 구축물에 관한 것이다(하나 이상의 VHH 도메인을 함유하는 다가 및 다중특이적인 화합물 또는 폴리펩타이드 및 이들의 제조에 대해서는, Conrath 등(문헌[J. Biol. Chem. 276: 7346-7350, 2001]), 뿐만 아니라 예를 들어 WO 96/34103, WO 99/23221 및 WO 2010/115998을 참조함).
본 발명은 추가로, TNF, 바람직하게는 인간 TNF에 대한 적어도 하나의 ISVD(또는 이의 적합한 단편), 및 하나의 부가적인 ISVD를 포함하거나 (본질적으로) 구성된 다가 화합물 또는 폴리펩타이드(본원에서 각각 "본 발명의 다가 화합물(들)" 및 "본 발명의 다가 폴리펩타이드(들)"로 지칭됨)에 관한 것이다.
일 양태에서, 본 발명의 다가 화합물, 폴리펩타이드 또는 구축물은 가장 간단한 형태에서, TNF에 대한 제1 ISVD, 예컨대 나노바디, 및 TNF에 대한 동일한 제2 ISVD, 예컨대 나노바디를 포함하는 본 발명의 2가 화합물, 폴리펩타이드 또는 구축물이며, 여기서, 상기 제1 및 상기 제2 ISVD, 예컨대 나노바디들은 선택적으로 링커 서열(본원에 정의된 바와 같음)을 통해 연결될 수 있다. 본 발명의 다가 화합물, 폴리펩타이드 또는 구축물은 가장 간단한 형태에서, TNF에 대한 제1 ISVD, 예컨대 나노바디, TNF에 대한 동일한 제2 ISVD, 예컨대 나노바디, 및 TNF에 대한 동일한 제3 ISVD, 예컨대 나노바디를 포함하는 본 발명의 3가 화합물, 폴리펩타이드 또는 구축물일 수 있으며, 여기서, 상기 제1, 제2 및 제3 면역글로불린 ISVD, 예컨대 나노바디들은 선택적으로 하나 이상의, 특히 2개의 링커 서열을 통해 연결될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 다가 화합물, 폴리펩타이드 또는 구축물은 TNF에 대한 제1 ISVD, 예컨대 나노바디, 및 제2 항원에 대한 제2 ISVD, 예컨대 나노바디를 포함하는 본 발명의 이중특이적인 화합물, 폴리펩타이드 또는 구축물일 수 있으며, 여기서, 상기 제1 및 제2 ISVD, 예컨대 나노바디들은 선택적으로 링커 서열(본원에 정의된 바와 같음)을 통해 연결될 수 있는 반면; 본 발명의 다가 화합물, 폴리펩타이드 또는 구축물은 또한, TNF에 대한 제1 ISVD, 예컨대 나노바디, 제2 항원에 대한 제2 ISVD, 예컨대 나노바디, 및 제3 항원에 대한 제3 ISVD, 예컨대 나노바디를 포함하는 본 발명의 삼중특이적인 화합물, 폴리펩타이드 또는 구축물일 수 있으며, 여기서, 상기 제1, 제2 및 제3 ISVD, 예컨대 나노바디들은 선택적으로 하나 이상의, 특히 2개의 링커 서열을 통해 연결될 수 있다.
특정한 양태에서, 본 발명의 화합물, 폴리펩타이드 또는 구축물은 각각 3가의 이중특이적인 화합물, 폴리펩타이드 또는 구축물이다. 본 발명의 3가의 이중특이적인 화합물, 폴리펩타이드 또는 구축물은 가장 간단한 형태에서, TNF에 대한 2개의 동일한 ISVD, 예컨대 나노바디, 및 또 다른 항원에 대한 제3 ISVD, 예컨대 나노바디를 포함하는 본 발명의 3가 화합물, 폴리펩타이드 또는 구축물(본원에 정의된 바와 같음)일 수 있으며, 여기서, 상기 제1, 제2 및 제3 ISVD, 예컨대 나노바디는 선택적으로 하나 이상의, 특히 2개의 링커 서열을 통해 연결될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 화합물 또는 폴리펩타이드는 이중특이적인 화합물 또는 폴리펩타이드이다. 본 발명의 이중특이적인 화합물, 폴리펩타이드 또는 구축물은 가장 간단한 형태에서, TNF에 대한 ISVD, 예컨대 나노바디 및 또 다른 항원에 대한 제2 ISVD, 예컨대 나노바디를 포함하는 본 발명의 2가 화합물, 폴리펩타이드 또는 구축물(본원에 정의된 바와 같음)일 수 있으며, 여기서, 상기 제1 및 제2 ISVD, 예컨대 나노바디들은 선택적으로 링커 서열을 통해 연결될 수 있다.
바람직한 양태에서, 본 발명의 다가 화합물, 폴리펩타이드 또는 구축물은 TNF에 대한 2개 이상의 면역글로불린 단일 가변 도메인들을 포함하거나 본질적으로 구성된다. 일 양태에서, 본 발명은 TNF에 결합하는 본 발명에 따른 적어도 2개의 ISVD, 예컨대 2, 3 또는 4개의 ISVD(또는 이의 적합한 단편)를 포함하거나 본질적으로 구성되는 화합물, 폴리펩타이드 또는 구축물에 관한 것이다. 2개 이상의 ISVD는 선택적으로, 하나 이상의 펩타이드 링커를 통해 연결될 수 있다.
바람직한 양태에서, 본 발명의 화합물, 폴리펩타이드 또는 구축물은 적어도 2개의 ISVD를 포함하거나 본질적으로 구성되며, 여기서, 상기 적어도 2개의 ISVD는 동일하거나 상이할 수 있지만, 이 중에서 적어도 하나의 ISVD는 TNF, 예컨대 결합 TNF에 대한 것이다.
특정한 양태에서, 본 발명의 화합물, 폴리펩타이드 또는 구축물은 적어도 2개의 ISVD를 포함하거나 본질적으로 구성되며, 여기서, 적어도 2개의 ISVD는 독립적으로 서열 번호 8 - 41 및 61-66 및 69로 이루어진 군으로부터 선택된다.
상대적 친화성(relative affinity)은 생성된 본 발명의 화합물, 폴리펩타이드 또는 구축물에서 ISVD의 위치에 따라 다를 수 있다. 본 발명의 화합물 또는 폴리펩타이드에서 ISVD의 순서(배향)는 당업자의 필요에 따라 선택될 수 있는 것으로 이해될 것이다. 개별 ISVD의 순서, 뿐만 아니라 화합물 또는 폴리펩타이드가 링커를 포함하는지의 여부는 디자인 선택의 문제이다. 링커가 있거나 없이 일부 배향들은 다른 배향들과 비교하여 바람직한 결합 특징을 제공할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 화합물, 폴리펩타이드 또는 구축물에서 제1 ISVD(예를 들어 ISVD 1) 및 제2 ISVD(예를 들어 ISVD 2)의 순서는 (N-말단으로부터 C-말단까지): (i) ISVD 1(예를 들어 나노바디 1) - [링커] - ISVD 2(예를 들어 나노바디 2); 또는 (ii) ISVD 2(예를 들어 나노바디 2) - [링커]- ISVD 1(예를 들어 나노바디 1); (여기서, 링커는 선택적임)일 수 있다. 모든 배향들은 본 발명에 포함된다. 요망되는 결합 특징을 제공하는 ISVD의 배향을 함유하는 화합물, 폴리펩타이드 및 구축물은 일상적인 스크리닝에 의해 쉽게 식별될 수 있다.
본 발명의 화합물 또는 구축물, 예컨대 본 발명의 폴리펩타이드에서, 2개 이상의 빌딩 블록, 예컨대 ISVD, 및 선택적으로 하나 이상의 다른 기, 약물, 제제, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위는 (예를 들어 WO 99/23221에 기재된 바와 같이) 서로 직접적으로 연결될 수 있고/있거나 하나 이상의 적합한 스페이서 또는 링커, 또는 이들의 임의의 조합을 통해 서로 연결될 수 있다. 다가 및 다중특이적인 화합물 또는 폴리펩타이드에 사용되기에 적합한 스페이서 또는 링커는 당업자에게 명확할 것이고, 일반적으로 당업계에서 아미노산 서열들을 연결하기 위해 사용되는 임의의 링커 또는 스페이서일 수 있다. 바람직하게는, 상기 링커 또는 스페이서는 약제학적 용도를 위한 화합물, 구축물, 단백질 또는 폴리펩타이드의 구축에 사용되기에 적합하다.
일 실시형태에서, 본 발명은 본원에 정의된 바와 같은 화합물 또는 폴리펩타이드에 관한 것이며, 여기서, 상기 ISVD들은 서로 직접적으로 연결되거나 링커를 통해 연결된다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명은 본원에 정의된 바와 같은 화합물 또는 폴리펩타이드에 관한 것이며, 여기서, 제1 ISVD 및/또는 제2 ISVD 및/또는 가능하다면 제3 ISVD 및/또는 가능하다면 혈청 알부민 결합 ISVD는 링커를 통해 연결된다.
특히 바람직한 일부 링커 및 스페이서는, 당업계에서 항체 단편 또는 항체 도메인을 연결하는 데 사용되는 스페이서 및 링커를 포함한다. 이들은 상기 인용된 일반적인 배경 기술에 언급된 링커, 뿐만 아니라 예를 들어 당업계에서 다이아바디(diabody) 또는 ScFv 단편을 구축하는 데 사용되는 링커를 포함한다(그러나 이러한 측면에서, 다이아바디 및 ScFv 단편에서, 사용되는 링커 서열이, 적절한 VH 및 VL 도메인들이 함께 완전한 항원-결합 부위를 형성하도록 할 수 있는 길이, 가요성 정도 및 다른 특성들을 가져야 하는 반면, 각각의 ISVD, 예컨대 나노바디는 그 자체가 완전한 항원-결합 부위를 형성하기 때문에 본 발명의 폴리펩타이드에 사용되는 링커의 길이 또는 가요성에는 특정한 제한이 없음).
예를 들어, 링커는 적합한 아미노산 서열일 수 있고, 특히 1 내지 50개, 바람직하게는 1 내지 30개, 예컨대 1 내지 10개의 아미노산 잔기를 가진 아미노산 서열일 수 있다. 이러한 아미노산 서열의 일부 바람직한 예로는, gly-ser 링커, 예를 들어 유형 (glyxsery)z, 예컨대(예를 들어 WO 99/42077에 기재된 바와 같은 (gly4ser)3 또는 (gly3ser2)3, 및 본원에 언급된 Ablynx에 의한 출원들에서 기재된 GS30, GS15, GS9 및 GS7 링커(예를 들어 WO 06/040153 및 WO 06/122825 참조), 뿐만 아니라 힌지(hinge)-유사 영역, 예컨대 천연 발생 중쇄 항체 또는 유사한 서열의 힌지 영역(예컨대 WO 94/04678에 기재되어 있음)이 있다. 바람직한 링커는 표 E, 예를 들어 서열 번호 85-100에 도시되어 있다.
특히 바람직한 일부 다른 링커는 폴리알라닌(예컨대 AAA), 뿐만 아니라 링커 GS30(WO 06/122825에서 서열 번호 85) 및 GS9(WO 06/122825에서 서열 번호 84)이다.
일 실시형태에서, 본 발명은 본원에 정의된 바와 같은 화합물에 관한 것이며, 여기서 상기 링커는 5GS, 7GS, 9GS, 10GS, 15GS, 18GS, 20GS, 25GS, 30GS, 35GS 및 40GS의 링커로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 적합한 링커는 일반적으로, 유기 화합물 또는 중합체, 특히 약제학적 용도용 단백질에 사용하기에 적합한 것들을 포함한다. 예를 들어, 폴리(에틸렌글리콜) 모이어티가 항체 도메인들을 연결하는 데 사용되어 왔으며, 예를 들어 WO 04/081026을 참조한다.
사용되는 링커(들)(통상적으로 ScFv 단편에 사용되는 링커에서와 같이, 중요하지는 않지만)의 길이, 가요성 정도 및/또는 다른 특성들이, 비제한적으로 케모카인 또는 하나 이상의 다른 항원에 대한 친화성, 특이성 또는 친화력(avidity)을 포함하여 본 발명의 최종 화합물 또는 구축물, 예컨대 본 발명의 폴리펩타이드의 특성에 어느 정도 영향을 미칠 수 있다는 것이 본 발명의 범위 내에 포함된다. 본원의 개시내용을 기반으로, 당업자는, 선택적으로 일부 제한된 일상적인 실험 후에, 본 발명의 구체적인 화합물 또는 구축물, 예컨대 본 발명의 폴리펩타이드에 사용하기 위한 최적의 링커(들)를 확인할 수 있을 것이다.
예를 들어, TNF 및 또 다른 표적에 대한 빌딩 블록, 예컨대 ISVD 또는 나노바디를 포함하는 본 발명의 다가 화합물 또는 폴리펩타이드에서, 링커의 길이 및 가요성은 바람직하게는, 폴리펩타이드에 존재하는 본 발명의 각각의 빌딩 블록, 예컨대 ISVD를 이의 코그니트(cognate) 표적, 예를 들어 각각의 표적 상의 항원 결정기에 결합시킬 수 있도록 된다. 마찬가지로 본원의 개시내용을 기반으로, 당업자는 선택적으로 일부 제한된 일상적인 실험 후에, 본 발명의 특정한 화합물 또는 구축물, 예컨대 본 발명의 폴리펩타이드에 사용되기에 최적인 링커(들)를 확인할 수 있을 것이다.
또한, 링커(들)는 본 발명의 화합물 또는 구축물, 예컨대 본 발명의 폴리펩타이드에 하나 이상의 다른 선호할만한 특성 또는 기능성을 부여하고/하거나 유도체의 형성 및/또는 작용기의 부착을 위한 하나 이상의 부위를 제공하는 데 사용된 것은 본 발명의 범위 내에 포함된다(예를 들어 본 발명의 ISVD의 유도체에 대해 본원에 기재된 바와 같음). 예를 들어, 하나 이상의 하전된 아미노산 잔기를 함유하는 링커는 개선된 친수성을 제공할 수 있는 반면, 작은 에피토프 또는 태그를 형성하거나 함유하는 링커는 검출, 식별 및/또는 정제에 사용될 수 있다. 마찬가지로 본원의 개시내용을 기반으로, 당업자는 선택적으로 일부 제한된 일상적인 실험 후에, 본 발명의 특정한 화합물, 구축물 또는 폴리펩타이드에 사용되기에 최적인 링커를 확인할 수 있을 것이다.
마지막으로, 2개 이상의 링커가 화합물 또는 구축물, 예컨대 본 발명의 폴리펩타이드에 사용되는 경우, 이들 링커는 동일하거나 상이할 수 있다. 또한, 본원의 개시내용을 기반으로, 당업자는 선택적으로 일부 제한된 일상적인 실험 후에, 본 발명의 특정한 화합물, 구축물 또는 폴리펩타이드에 사용되기에 최적인 링커를 확인할 수 있을 것이다.
하나 이상의 나노바디를 함유하는 다가 및 다중특이적인 화합물 및 폴리펩타이드들 및 이들의 제조에 대한 일반적인 설명에 대해, 또한 문헌[Conrath et al., J. Biol. Chem., Vol. 276, 10. 7346-7350, 2001; Muyldermans, Reviews in Molecular Biotechnology 74 (2001), 277-302]; 뿐만 아니라 예를 들어 WO 1996/34103, WO 1999/23221, WO 2004/041862, WO 2006/122786, WO 2008/020079, WO 2008/142164 또는 WO 2009/068627을 참조한다.
본 발명은 또한, 본원에 기재된 아미노산 서열, TNF 결합제, 폴리펩타이드, 융합 단백질, 화합물 및 구축물을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 또는 핵산에 관한 것이다. 본 발명은 추가로, 당업계에 공지된 유전적 구축물에 대한 상기 뉴클레오타이드 서열 또는 핵산 및 하나 이상의 요소를 포함하는 유전적 구축물을 포함한다. 유전적 구축물은 플라스미드 또는 벡터의 형태로 존재할 수 있다. 또한, 이러한 구축물은 일반적으로, Ablynx N.V.의 공개 특허 출원, 예를 들어 WO 2004/041862, WO 2006/122786, WO 2008/020079, WO 2008/142164 또는 WO 2009/068627에 기재된 바와 같을 수 있다.
일 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 ISVD, 폴리펩타이드, 화합물 또는 구축물을 코딩하는 핵산에 관한 것이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 핵산을 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 이러한 뉴클레오타이드 서열 또는 핵산을 함유하고/하거나 본원에 기재된 아미노산 서열, TNF 결합제, 폴리펩타이드, 융합 단백질, 화합물 및 구축물을 발현하는(또는 발현할 수 있는) 숙주 또는 숙주 세포에 관한 것이다. 또한, 이러한 숙주 세포는 일반적으로 Ablynx N.V.의 공개 특허 출원, 예를 들어 WO 2004/041862, WO 2006/122786, WO 2008/020079, WO 2008/142164 또는 WO 2009/068627에 기재된 바와 같을 수 있다.
일 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 핵산 또는 본 발명에 따른 발현 벡터를 포함하는 숙주 또는 숙주 세포에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 본원에 기재된 바와 같은 아미노산 서열, TNF 결합제, 폴리펩타이드, 융합 단백질, 화합물 또는 구축물의 제조 방법에 관한 것이며, 이러한 방법은, 숙주 세포가 본원에 기재된 바와 같은 아미노산 서열, TNF 결합제, 폴리펩타이드, 융합 단백질, 화합물 또는 구축물을 생성하거나 발현시키게 되는 조건 하에 본원에 기재된 바와 같은 상기 숙주 세포를 배양하거나 유지시키는 단계, 및 선택적으로 추가로, 결과적으로 생성된 아미노산 서열, TNF 결합제, 폴리펩타이드, 융합 단백질, 화합물 또는 구축물을 단리하는 단계를 포함한다. 또한, 이러한 방법은 일반적으로 Ablynx N.V.의 공개 특허 출원, 예를 들어 WO 2004/041862, WO 2006/122786, WO 2008/020079, WO 2008/142164 또는 WO 2009/068627에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다.
특정한 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 ISVD 또는 본 발명에 따른 화합물 또는 본 발명에 따른 폴리펩타이드의 제조 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 적어도,
a) 적합한 숙주 세포, 숙주 유기체 또는 또 다른 적합한 발현 시스템 내에서, 본원에 정의된 바와 같은 핵산 서열을 발현시키는 단계; 선택적으로 후속해서,
b) 본 발명에 따른 ISVD, 본 발명에 따른 화합물 또는 본 발명에 따른 폴리펩타이드를 각각 단리하고/하거나 정제하는 단계
를 포함한다.
본 발명은 또한, 본원에 기재된 바와 같은 적어도 하나의 아미노산 서열, TNF 결합제, 폴리펩타이드, 융합 단백질, 화합물 또는 구축물을 포함하는 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 본원에 기재된 바와 같은 적어도 하나의 아미노산 서열, TNF 결합제, 폴리펩타이드, 융합 단백질, 화합물 또는 구축물, 및 선택적으로 적어도 하나의 약제학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제 및/또는 보조제를 포함하고, 선택적으로 하나 이상의 추가의 약제학적으로 활성 폴리펩타이드 및/또는 화합물을 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 이러한 조제물, 담체, 부형제 및 희석제는 일반적으로, Ablynx N.V.의 공개 특허 출원, 예를 들어 WO 2004/041862, WO 2006/122786, WO 2008/020079, WO 2008/142164 또는 WO 2009/068627에 기재된 바와 같을 수 있다.
본원에 기재된 아미노산 서열, TNF 결합제, 폴리펩타이드, 융합 단백질, 화합물 또는 구축물이 증가된 반감기를 갖는 경우, 이들은 바람직하게는 순환되도록 투여된다. 이와 같이, 이들은 아미노산 서열, TNF 결합제, 폴리펩타이드, 융합 단백질, 화합물 또는 구축물을 순환계로 도입시킬 수 있는 임의의 적합한 방식, 예컨대 정맥내로, 주사 또는 주입을 통해, 또는 임의의 다른 적합한 방식(경구 투여, 피하 투여, 근육내 투여, 피부를 통한 투여, 비내 투여, 폐를 통한 투여 등을 포함함)으로 투여될 수 있다. 적합한 투여 방법 및 경로는 당업자에게 명확할 것이며, 마찬가지로 예를 들어 Ablynx N.V.의 공개 특허 출원, 예를 들어 WO 2004/041862, WO 2006/122786, WO 2008/020079, WO 2008/142164 또는 WO 2009/068627의 교시로부터도 명확할 것이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 아미노산 서열, TNF 결합제, 폴리펩타이드, 융합 단백질, 화합물 또는 구축물의 사용에 의해 예방되거나 치료될 수 있는 적어도 하나의 질병 또는 장애의 예방 및/또는 치료 방법에 관한 것이며, 이러한 방법은 약제학적 활성량의 본 발명의 아미노산 서열, TNF 결합제, 폴리펩타이드, 융합 단백질, 화합물 또는 구축물, 및/또는 이들을 포함하는 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 피험자에게 투여하는 단계를 포함한다. 본원에 기재된 바와 같은 폴리펩타이드, 융합 단백질, 화합물 또는 구축물의 사용에 의해 예방되거나 치료될 수 있는 질병 및 장애는 일반적으로, 본 발명의 폴리펩타이드, 융합 단백질, 화합물 또는 구축물에 존재하는 치료적 모이어티의 사용에 의해 예방되거나 치료될 수 있는 질병 및 장애와 동일할 것이다. 특히, 본 발명은 약제로서 사용하기 위한 본원에 기재된 바와 같은 화합물, 조성물, 구축물, 폴리펩타이드, TNF 결합제 또는 ISVD에 관한 것이다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "예방 및/또는 치료"는, 질병을 예방하고/하거나 치료하는 것을 포함할 뿐만 아니라, 일반적으로 질병의 발병(onset)을 예방하며, 질병의 진행을 늦추거나 역전시키며, 질병과 연관된 하나 이상의 증상의 발병을 예방하거나 늦추고, 질병과 연관된 하나 이상의 증상을 감소 및/또는 경감시키며, 질병 및/또는 이와 연관된 임의의 증상의 중증도 및/또는 기간을 감소시키고/감소시키거나 질병 및/또는 이와 연관된 임의의 증상의 중증도의 추가의 증상을 예방하고, 질병에 의해 유발되는 임의의 생리학적 손상 및 일반적으로 치료를 받는 환자에게 이득인 임의의 약물학적 작용을 예방하거나, 감소시키거나 역전시키는 것을 포함한다. 본 발명의 조성물은 실행 가능한 치료제를 구성하기 위해, 완전한 치유에 영향을 주거나 질병의 모든 증상 또는 징후(manifestation)를 없앨 필요가 없다. 관련 분야에 인지되는 바와 같이, 치료제로서 이용되는 약물은 주어진 질병 상태의 중증도를 감소시킬 수 있지만, 유용한 치료제로서 간주되기 위해 질병의 모든 징후들을 없앨 필요는 없다. 유사하게는, 예방적으로 투여되는 치료제는 실행 가능한 예방제를 구성하기 위해 질환의 발병을 예방하는 데 완전히 효과적일 필요는 없다. 단순히, 질병의 영향을 (예를 들어, 이의 증상의 수 또는 중증도를 감소시킴으로써, 또는 또 다른 치료의 효능을 증가시킴으로써, 또는 또 다른 유익한 효과를 발휘함으로써) 감소시키거나, 질병이 피험자에서 발생하거나 악화될 경향을 감소시키는 것으로 충분하다.
일 실시형태에서, 치료적 유효량의 조성물이 환자에게 투여되었을 때의 적응증은, 특정 장애의 중증도를 반영하는 지표(indicator)의 기준선을 능가하는 지속된 개선이다. 본 발명의 약제학적 조성물은 하나 이상의 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제와 함께 제형화된 치료적 유효량의 본 발명의 ISVD, 화합물 또는 폴리펩타이드를 포함한다. 본 발명의 ISVD, 화합물 또는 폴리펩타이드의 "치료적 유효량"이란, 임의의 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 위험편익비(benefit/risk ratio)에서 치료되는 피험자에게 치료 효과를 부여하는 조성물의 양을 의미한다. 치료 효과는 해당 용어가 본원에 사용되는 바와 같이, 환자를 "치료"하기에 충분하다.
일 실시형태에서, 본 발명은 소화관의 질병 및/또는 장애의 치료에 사용하기 위한, 본원에 기재된 바와 같은 조성물, 구축물, 화합물, TNF 결합제, ISVD 또는 폴리펩타이드에 관한 것이다.
일 실시형태에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 조성물, 구축물, 화합물, TNF 결합제, ISVD 또는 폴리펩타이드에 관한 것이며, 여기서, 상기 소화관의 질병 및/또는 장애는 염증성 장질환(IBD), 과민성 대장 증후군, 크론병, 궤양성 대장염, 점막염, 아프타성 구내염, 셀리악 병, 소화관에 대한 외상 및 소화관에 대한 암이다.
과민성 대장 증후군을 가진 환자는 장 내에서 검출 가능한 조직학적 변화를 거의 갖고 있지 않거나 전혀 갖고 있지 않음에도 불구하고 변경된 장 투과성을 가진다(문헌[Dunlop Am J Gastroenterol. 2006 Jun; 101(6): 1288-94]). 셀리악 병을 가진 환자는 변경된 장 투과성, 및 IBD와 구별 가능한, 소장 융모에의 특징적인 손상을 가진다. 염증성 장질환은 미생물-숙주 상호작용에 의해 개시되는 이상조절된(dysregulated) 면역 반응으로 인한 것으로 생각된다. 면역 시스템은 만성 염증을 발생시키는 비-병원성 공생 박테리아에 반응한다. 유사하게는, 괴사성 전장염에서, 스트레스에 의해 저발달된(underdeveloped) 면역 시스템은 정상적인 장내 박테리에 대해 부적절한 반응을 발생시켜, 잠재적으로 치명적인 형태의 결장염을 유도한다(문헌[Jilling et al, 2006, J Immunol, 177, 3273-82]).
치료를 받는 피험자는 임의의 온혈 동물일 수 있지만, 특히 포유류, 보다 특히 인간이다. 당업자가 알게 될 바와 같이, 치료를 받는 피험자는 특히, 본원에 언급된 질병 및 장애를 앓고 있거나 위험에 있는 사람일 것이다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 면역요법, 특히 수동 면역요법 방법에 관한 것이며, 이러한 방법은 본원에 언급된 질병 및 장애를 앓고 있거나 위험에 있는 피험자에게 약제학적 활성량의 본 발명의 아미노산 서열, TNF 결합제, 폴리펩타이드, 융합 단백질, 화합물 또는 구축물, 및/또는 이들을 포함하는 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
아미노산 서열, TNF 결합제, 폴리펩타이드, 융합 단백질, 화합물 또는 구축물 및/또는 이들을 포함하는 조성물은 예방되거나 치료되어야 하는 질병 또는 장애의 예방 및/또는 치료에 적합한 치료 계획에 따라 투여된다. 의사는 일반적으로, 인자들, 예컨대 예방되거나 치료되어야 하는 질병 또는 장애, 치료되어야 하는 질병의 중증도 및/또는 이의 증상의 중증도, 사용되는 본 발명의 특정 아미노산 서열, TNF 결합제, 폴리펩타이드, 융합 단백질, 화합물 또는 구축물, 사용되는 약제학적 제형 또는 조성물의 특정 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중, 식이요법, 일반적인 상태, 및 의사에게 잘 공지된 유사한 인자들에 따라, 적합한 치료 계획을 결정할 수 있을 것이다.
일반적으로, 치료 계획은 본 발명의 하나 이상의 아미노산 서열, TNF 결합제, 폴리펩타이드, 융합 단백질, 화합물 또는 구축물, 또는 이들을 포함하는 하나 이상의 조성물을 하나 이상의 약제학적 유효량 또는 용량으로 투여하는 단계를 포함할 것이다. 투여되는 특정 양(들) 또는 용량은 또한 상기 언급된 인자들을 기반으로 의사에 의해 결정될 수 있다.
일반적으로, 본원에 언급된 질병 및 장애의 예방 및/또는 치료를 위하고, 치료되어야 하는 특정 질병 또는 장애, 사용되는 특정 융합 단백질 또는 구축물의 약효 및/또는 반감기, 사용되는 특정 투여 경로 및 특정 약제학적 제형 또는 조성물에 따라, 본 발명의 아미노산 서열, TNF 결합제, 폴리펩타이드, 융합 단백질, 화합물 또는 구축물은 일반적으로 1 그램 내지 0.01 마이크로그램/kg 체중/일, 바람직하게는 0.1 그램 내지 0.1 마이크로그램/kg 체중/일, 예컨대 약 1, 10, 100 또는 1000 마이크로그램/kg 체중/일의 양으로 해당 일(day) 동안 연속적으로(예를 들어 주입에 의해), 단일 일일 용량 또는 다수의 분할된 용량으로 투여될 것이다. 의사는 일반적으로, 본원에 언급된 인자들에 따라 적합한 일일 용량을 결정할 수 있을 것이다. 또한, 특정한 경우, 의사는 예를 들어 상기 언급된 인자들 및 의사의 전문가적 판단을 기반으로 이들 양으로부터 벗어나기 위해 선택할 수 있음이 명확할 것이다. 일반적으로, 투여되는 양에 대한 일부 지도(guidance)는, 본질적으로 동일한 경로를 통해 투여되는 동일한 표적에 대한 종래의 유사한 항체 또는 항체 단편에 대해 통상적으로 투여되는 양으로부터, 당업자에게 잘 공지된 친화성/친화력, 효능, 생물분포, 반감기 및 유사한 인자들의 차이를 고려하여 수득될 수 있다.
통상적으로 상기 방법에서, 본 발명의 단일 아미노산 서열, TNF 결합제, 폴리펩타이드, 융합 단백질, 화합물 또는 구축물이 사용될 것이다. 그러나, 본 발명의 2개 이상의 아미노산 서열, TNF 결합제, 폴리펩타이드, 융합 단백질, 화합물 또는 구축물들을 조합하여 사용하는 것은 본 발명의 범위 내에 있다.
본 발명의 아미노산 서열, TNF 결합제, 폴리펩타이드, 융합 단백질, 화합물 또는 구축물은 또한, 하나 이상의 추가의 약제학적으로 활성 화합물 또는 원리와 조합하여, 즉 조합된 치료 계획으로서 사용될 수 있으며, 이러한 계획은 상승작용 효과를 초래할 수 있거나 초래하지 않을 수 있다. 마찬가지로, 의사는 상기 언급된 인자들 및 의사의 전문가적 판단을 기반으로, 이러한 추가의 화합물 또는 원리, 뿐만 아니라 적합한 조합된 치료 계획을 선택할 수 있을 것이다.
특히, 본 발명의 아미노산 서열, TNF 결합제, 폴리펩타이드, 융합 단백질, 화합물 또는 구축물은, 본 발명의 아미노산 서열, TNF 결합제, 폴리펩타이드, 융합 단백질, 화합물 또는 구축물을 이용하여 예방되거나 치료될 수 있는 질병 및 장애의 예방 및/또는 치료에 사용되거나 사용될 수 있는 다른 약제학적으로 활성 화합물 또는 원리와 조합하여 사용될 수 있으며, 그 결과 상승작용 효과가 수득될 수 있거나 수득되지 않을 수 있다.
본 발명에 따라 사용되는 치료 계획의 효과는 의사에게 명확해질 바와 같이, 관여된 질병 또는 장애에 대해 그 자체로 공지된 임의의 방식으로 확인되고/되거나 후속될 수 있다. 의사는 또한, 요망되는 치료 효과를 달성하기 위해, 원치않는 부작용을 피하거나, 제한하거나 감소시키기 위해, 및/또는 한편으로는 요망되는 치료 효과를 달성하고 다른 한편으로는 요망되지 않는 부작용을 피하거나, 제한하거나 감소시키는 것 사이에서 적절한 균형을 달성하기 위해, 적절하다면 및/또는 사례별로, 특정 치료 계획을 변화시키거나 변형시킬 수 있을 것이다.
일반적으로, 치료 계획은, 요망되는 치료 효과가 달성될 때까지 및/또는 요망되는 치료 효과가 유지될 수 있는 한, 후속될 것이다. 마찬가지로, 이는 의사에 의해 결정될 수 있다.
본 발명의 아미노산 서열, TNF 결합제, 폴리펩타이드, 융합 단백질, 화합물 또는 구축물이 TNF에 결합할 수 있기 때문에, 이들은 특히, TNF에 결합하고/하거나 TNF를 조정할 수 있는 다른 생물학적 약물(예컨대 항체, 예를 들어 아달리무맙(adalimumab)/HUMIRA™ 또는 인플릭시맙(infliximab)/REMICADE™)에 의해 치료될 수 있는 질병 또는 장애의 예방 및/또는 치료에 사용될 수 있다. 이러한 질병 및 장애는 당업자에게 명확해질 것이다. 본 발명의 TNF 결합제는 특히, WO 2004/041862 및 WO 2006/122786에 언급된 질병 및 장애의 예방 및 치료에 사용될 수 있다.
언급된 바와 같이, 본 발명의 특정한 일 양태는 1가 포맷으로 존재하는 본 발명의 TNF 결합제에 관한 것이다. 본 발명의 이들 1가 TNF 결합제들은 특히, 국소 적용(피부, GI 관 또는 폐에의 적용을 포함함) 및/또는 국소 투여(예를 들어 피부로의), 경구 투여(예를 들어 GI 관으로의), 좌제에 의한 투여(마찬가지로, 예를 들어 GI 관으로의) 및/또는 폐로의 투여(예를 들어 흡입에 의함)에 적합하다. 이와 같이, 이들 결합제는, TNF 저해제를 각각 피부, 폐 또는 GI 관에 적용함으로써 예방되거나 치료될 수 있는 피부, 폐 또는 GI 관의 질병 및 장애(예컨대 각각 피부, 폐 또는 GI 관에 영향을 미치는 염증 및/또는 자가면역 질병)의 예방 및/또는 치료에 사용될 수 있다.
일 실시형태에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 조성물, 화합물, 구축물, TNF 결합제, 폴리펩타이드 또는 ISVD에 관한 것이며, 여기서, 조성물, 화합물, 구축물, TNF 결합제, 폴리펩타이드 또는 ISVD는 소화관에 국소 투여된다.
일 실시형태에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 조성물, 화합물, 구축물, TNF 결합제, 폴리펩타이드 또는 ISVD에 관한 것이며, 여기서, 조성물, 화합물, 구축물, TNF 결합제, 폴리펩타이드 또는 ISVD는 위장관(GI)으로의 경구 투여에 적합한 투약 형태로 경구 투여된다.
일 실시형태에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 조성물, 화합물, 구축물, TNF 결합제, 폴리펩타이드 또는 ISVD에 관한 것이며, 여기서, 조성물, 화합물, 구축물, TNF 결합제, 폴리펩타이드 또는 ISVD는 GI 관으로의 경구 투여를 위한 투약 형태로 투여되고, 여기서, 투약 형태는 정제, 캡슐, 알약, 분말, 과립, 에멀젼, 마이크로에멀젼, 용액, 현탁액, 시럽 및 엘릭시르로부터 선택된다.
일 실시형태에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 조성물, 화합물, 구축물, TNF 결합제, 폴리펩타이드 또는 ISVD에 관한 것이며, 여기서, 조성물, 화합물, 구축물, TNF 결합제, 폴리펩타이드 또는 ISVD는 소화관의 질병 또는 장애의 치료를 위해 직장내 투여된다.
일 실시형태에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 조성물, 화합물, 구축물, TNF 결합제, 폴리펩타이드 또는 ISVD에 관한 것이며, 여기서, 조성물, 화합물, 구축물, TNF 결합제, 폴리펩타이드 또는 ISVD는 직장내 투여용 투약 형태, 바람직하게는 좌제 및 관장제로부터 선택되는 투약 형태로 직장내 투여된다.
일 실시형태에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 조성물, 화합물, 구축물, TNF 결합제, 폴리펩타이드 또는 ISVD에 관한 것이며, 여기서, 조성물, 화합물, 구축물, TNF 결합제, 폴리펩타이드 또는 ISVD는 피하 주사, 피내 주사, 정맥내 주사, 근육내 주사, 병변내 주사, 또는 주입 기술에 의해 비경구 투여된다.
이러한 질병 및 장애의 일부 구체적이지만 비제한적인 예들은 GI 관의 질병 또는 장애, 예컨대 염증성 장질환(IBD) 크론병, 과민성 대장 증후군, 궤양성 대장염, 점막염, 아프타성 구내염, 셀리악 병, 소화관에 대한 외상 및/또는 소화관에 대한 암이다. 언급된 바와 같이 이들 목적을 위해 사용되는 경우, 본 발명의 1가 TNF 결합제는 바람직하게는 위치 1에 D 돌연변이(또는 E1D) 및 C-말단 연장(예컨대 C-말단 알라닌)을 가지고, 서열 번호 40, 39, 36, 64, 69, 37, 38, 41, 62-63, 및 65-66, 특히 서열 번호 40, 39, 36, 64 및 69, 가장 특히 서열 번호 40의 TNF 결합제는 이들 목적에 특히 적합한 본 발명의 TNF 결합제의 바람직한 예들이다.
따라서, 추가의 양태에서, 본 발명은 피부, 폐 또는 GI 관의 질병 및 장애의 예방 및 치료, 특히 피부, 폐 또는 GI 관에 영향을 미치는 염증 및/또는 자가면역 질병의 예방 및 치료에 사용하기 위한, 본질적으로 1가 포맷(및 바람직하게는 위치 1에 D 또는 E1D 돌연변이 및 C-말단 연장, 예컨대 C-말단 알라닌)으로 존재하는 본 발명의 TNF 결합제(본원에 기재된 바와 같음)에 관한 것이다. 상기 TNF 결합제는 바람직하게는 서열 번호 40, 39, 36, 64, 69, 37, 38, 41, 62-63, 및 65-66, 특히 서열 번호 40, 39, 36, 64 및 69, 가장 특히 서열 번호 40으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명은 또한, GI 관의 질병 또는 장애, 예컨대 염증성 장질환(IBD) 크론병, 과민성 대장 증후군, 궤양성 대장염, 점막염, 아프타성 구내염, 셀리악 병, 소화관에 대한 외상 및/또는 소화관에 대한 암, 특히 IBD 및 크론병의 예방 및 치료에 사용하기 위한, 본질적으로 1가 포맷(및 바람직하게는 위치 1에 D 또는 E1D 돌연변이 및 C-말단 연장, 예컨대 C-말단 알라닌)으로 존재하는 본 발명의 TNF 결합제(본원에 기재된 바와 같음)에 관한 것이다. 마찬가지로, 상기 TNF 결합제는 바람직하게는 서열 번호 40, 39, 36, 64, 69, 37, 38, 41, 62-63, 및 65-68, 특히 서열 번호 40, 39, 36, 64 및 69, 가장 특히 서열 번호 40으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명은 또한, 피부로의 국소 적용, 흡입에 의한 투여 또는 폐로의 다른 투여, 및/또는 경구 투여, 직장내 투여 또는 GI 관으로의 다른 투여를 위한(및/또는 적합한) 것인 약제학적 조성물에 관한 것이며, 이러한 약제학적 조성물은 본질적으로 1가 포맷(및 바람직하게는 위치 1에 D 또는 E1D 돌연변이 및 C-말단 연장, 예컨대 C-말단 알라닌)으로 존재하는 본 발명의 TNF 결합제를 포함한다. 마찬가지로, 상기 TNF 결합제는 바람직하게는 서열 번호 40, 39, 36, 64, 69, 37, 38, 41, 62-63, 및 65-68, 특히 서열 번호 40, 39, 36, 64 및 69, 가장 특히 서열 번호 40으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명은 또한, 피부의 질병 또는 장애의 예방 또는 치료 방법에 관한 것이며, 이러한 방법은 이러한 치료가 필요한 피험자의 피부에, 본질적으로 1가 포맷(및 바람직하게는 위치 1에 D 또는 E1D 돌연변이 및 C-말단 연장, 예컨대 C-말단 알라닌)으로 존재하는 본 발명의 TNF 결합제 또는 이러한 1가 TNF 결합제를 포함하는 조성물을 적용하는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한, 피부의 질병 또는 장애의 예방 또는 치료 방법에 관한 것이며, 이러한 방법은 이러한 치료가 필요한 피험자의 폐에, 본질적으로 1가 포맷(및 바람직하게는 위치 1에 D 또는 E1D 돌연변이 및 C-말단 연장, 예컨대 C-말단 알라닌)으로 존재하는 본 발명의 TNF 결합제 또는 이러한 1가 TNF 결합제를 포함하는 조성물을 (예를 들어 흡입에 의해) 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한, GI 관의 질병 또는 장애, 예컨대 염증성 장질환(IBD) 크론병, 과민성 대장 증후군, 궤양성 대장염, 점막염, 아프타성 구내염, 셀리악 병, 소화관에 대한 외상 및/또는 소화관에 대한 암, 특히 IBD 또는 크론병의 예방 또는 치료 방법에 관한 것이며, 이러한 방법은 이러한 치료가 필요한 피험자의 GI 관에, 본질적으로 1가 포맷(및 바람직하게는 위치 1에 D 또는 E1D 돌연변이 및 C-말단 연장, 예컨대 C-말단 알라닌)으로 존재하는 본 발명의 TNF 결합제 또는 이러한 1가 TNF 결합제를 포함하는 조성물을 (예를 들어 경구 또는 직장내 투여에 의해) 투여하는 단계를 포함한다.
이전에 언급된 바와 같이, 염증 부위에서, 경구 투여된 단백질이 장내 조직 및 전신 순환에 들어갈 수 있기 때문에, 종종 타협된다. 따라서, 일 실시형태에서, 본 발명은 또한, 본원에 기재된 바와 같은 조성물, 화합물, 구축물, TNF 결합제, 폴리펩타이드 또는 ISVD에 관한 것이며, 여기서, 조성물, 화합물, 구축물, TNF 결합제, 폴리펩타이드 또는 ISVD는 환자의 장내 조직 및 전신 순환에 도달한다.
본 발명의 다른 양태, 실시형태, 이점 및 적용들은 본원의 추가의 설명으로부터 명확하게 될 것이다.
본 발명은 이제, 하기 비제한적인 바람직한 양태, 실시예 및 도면에 의해 더 기재될 것이며, 여기서:
- 도 1은 본원에서 구체적으로 지칭될 아미노산 위치들 중 일부, 및 일부 대안적인 넘버링 시스템(예컨대 아호 및 IMGT)에 따른 이들의 넘버링을 열거하는 표이며;
- 도 2는 서열 번호 1, 59 및 58의 정렬을 보여주며;
- 도 3a~도 3f는 본원에 지칭된 아미노산 서열을 열거하고 있으며;
- 도 4a~도 4b는 서열 번호 1, 8 내지 41 및 58의 정렬을 보여주며;
- 도 5는 서열 번호 1, 31 및 36 내지 41의 정렬을 보여주며;
- 도 6은 96개의 혈청 시료들(건강한 인간 피험자로부터 66개 및 SLE 환자로부터 30개)을 하기 아미노산 서열에의 결합에 대해 시험하였을 때, 실시예 1에서 수득된 데이터 포인트의 상응하는 플롯을 보여준다: 서열 번호 58(Q108L 돌연변이가 있음), 참조 A, 참조 A(L11V, V89L)-Ala, 참조 A(L11V, A74S, V89L)-Ala 및 참조 A(L11V, S49A, V89L)-Ala. 각각의 도트는 시험된 96개의 시료들 중 하나에 대한 결합 수준을 나타낸다. 우측 패널 및 좌측 패널에 도시된 데이터 포인트들은 동일하며; 우측 패널에서, 시험된 각각의 화합물(즉, 서열 번호 58(Q108L), 참조 A, 참조 A(L11V, V89L)-A, 참조 A(L11V, A74S, V89L)-A 및 참조 A(L11V, S49A, V89L)-A)에 대해 각각의 개별 시료를 이용하여 측정된 데이터 포인트들은 라인에 의해 연결되어 있으며(그 결과, 라인의 경사(declination)는, 본 발명의 돌연변이 및 C-말단 알라닌이 도입된 경우 기존의 항체에 의한 결합이 감소된 정도(extent)의 지표(indication)를 제공함);
- 도 7a~도 7e는 결합 데이터를 열거한 표이다(5개의 컬럼은 정규화된 PreAb 결합 수준(125초에서의 RU)을 제공하고, 4개의 컬럼은 도 6에 요약된 데이터 포인트의 참조 A와 비교하여 PreAb 결합의 감소 퍼센트를 제공함).
- 도 8a는 A016600015 서열을 기반으로 예측된("P") 및 실험적으로("E") 확인된 트립신 및 키모트립신 절단 부위이다. 도 8b: 쿠마시 염색된 SDS PAGE 겔 상에서의 A016600015 분석이다. 도 8c: A016600015 서열의 RPC LC-MS를 통한 트립신 분해 분석의 예시적인 결과이다.
- 도 9는 SHIME 모델의 도식도이다.
- 도 10은 엔브렐(Enbrel)(EC30 = 0.02 nM; 패널 A) 및 엔브렐(EC90 = 0.2 nM; 패널 B)로 처리된 HEK293 H-mTNF 세포 상에서의 경쟁 FACS이다. IRR000027 = 무관한 나노바디.
- 도 11은 비-환원성 조건 하에 5 ㎕ 시료가 적용된 12% NuPage Bis-Tris 겔 상에서의 A016600021, A016600039 및 A016600040의 발현 결과를 보여준다. 레인은 하기와 같다: (1) A016600021; (2) A016600039; (3) A016600040; (4) 무관한 비교자(irrelevant comparator); (5) 무관한 비교자; (6) 프리시전 플러스(Precision Plus) 단백질 표준(BioRad); (7) 표준 0.5 ㎍; (8) 표준 1.0 ㎍; (9) 표준 2.5 ㎍.
실시예
본 발명자들은, TNF-결합제의 아미노산 서열을 최적화하려고 하였다("서열 최적화"). 이러한 경우, TNF-결합제는 경구 투여를 위한 것이며, 이 때문에 이러한 TNF-결합제는 바람직하게는 프로테아제 안정해야 한다. 더욱이, 서열 최적화 과정에서, (1) TNF-결합제를 인간화하며; (2) 기존의 항체의 잠재적인 에피토프를 넉아웃시키고; 뿐만 아니라 (3) 번역후 변형(PTM; post-translational modification) 부위를 넉아웃시키고자 한다. 동시에, 이들 특징은 TNF-결합제의 기능적인 특징, 즉 TNFα를 저해하는 특징에 순응해야 하며, 바람직하게는 대략 동일하거나 심지어 향상되어야 한다.
실시예 1: 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)에서의 나노바디 생성 및 단백질-A 결합을 통한 정제
항-TNFα 나노바디 구축물을 함유하는 피키아 파스토리스 X33 세포를, 24웰 플레이트(24 mL)에서 BGCM 시트레이트 완충제 내에서 성장시켰다(30℃, 250 rpm). 2일 후, 배지를 메탄올-함유 완충제(BMCM 시트레이트)로 교환하여, 발현을 유도하였다. 신선한 메탄올을 규칙적인 기준으로 첨가하여, 메탄올 소모 및 증발을 보상하였으며, 2일 후 배지를 수합하였다. 나노바디를, 단백질-A 컬럼(Poros) 또는 MEP 하이퍼셀(Hypercel)(Pall) 상에서 포착하고 후속해서 제조업체의 설명서에 따라 글리신 완충제 내에서 용리함으로써 정제하였다. 후속해서, 나노바디를, 2 mL Zebaspin 컬럼(Pierce)을 사용하여 PBS 쪽으로 탈염시켰다. 분획을 VivaSpin 컬럼(MWCO 5000, PES)을 사용하여 농축시켰다. 나노바디 분획의 농도를 트리네안 드랍센스(Trinean Dropsense)를 사용하여 측정하였다. 농도는 OD280 측정을 기준으로 하였으며, OD340 값에 대해 정규화하였다. 나노바디의 순도 및 온전성(integrity)을, ESI-Q-TOF 질량분광계(Q-TOF Ultimate(Waters))와 커플링된 역상 HPLC 시스템을 사용하여 SDS-PAGE 및 MS 분석에 의해 입증하였다.
실시예 2: 인간화
본 발명의 TNF-결합제의 단백질 서열을 결국에 라마로부터 회수하였으며, 이러한 서열은 인간에서 천연 발생하는 상동성 항체와 부분적으로 구별된다. 따라서, 이들 TNF-결합제는 인간 환자에게 투여 시 잠재적으로는 면역원성이다.
일반적으로, 인간화 목적을 위해, 나노바디 서열을 인간 생식선 컨센선스(consensus) 서열과 보다 상동성이 되게 만든다. 나노바디 "홀마크(hallmark)" 잔기를 제외하고, 나노바디와 인간 생식선 컨센선스 서열 사이에서 상이한 프레임워크 영역 내 특정 아미노산은, 단백질 구조, 활성 및 안정성이 바람직하게는 온전하게 유지되는 방식으로 인간 대응자(counterpart)로 변경된다.
이러한 경우, 인간 생식선 V 유전자 데이터베이스와 정렬된 후, DP51은 서열 번호 58과 최고의 상동성을 갖는 것으로 식별되었다. 모든 가능한 치환(permutation)들은, 바람직하게는 다른 나노바디 특징들을 온전하게 유지시키거나 이들 특징들을 심지어 향상시키는 한편, 부모 나노바디 서열을 인간 DP51 생식선 컨센선스 서열에 보다 순응하도록 변경시키는 측면에서 정교해진다.
결국, 총 12개의 아미노산 잔기들을 서열 번호 58: 1E, 14P, 27F, 29F, 40A, 49S, 73N, 75K, 78L, 82aN, 83R 및 108L 내에 도입하였다. 주목할만하게는, Q27F 및 S29F가 CDR1의 파트이지만, 결합에 영향을 미치지 않았다(서열 번호 1 참조; 데이터는 도시되지 않음).
실시예 3: 기존의 항체의 결합의 감소
3.1 실험 파트
하기 실시예 3.2에서 사용된 인간 시료를 (모든 요구되는 동의 및 승인을 수득한 후) 상업적인 공급원 또는 인간 지원자로부터 수득하였으며, (비제한적으로 의료 비밀 및 환자의 프라이버시에 관한 것들을 포함하여) 적용 가능한 법적 및 규제 요건들에 따라 사용하였다.
하기 실시예 3.2에서, 명시적으로 다르게 지시되지 않는 한, 사용되는(즉, 건강한 지원자, 류마티스 관절염(RA) 환자 및 SLE 환자 유래의) 시료에 존재하는 기존의 항체와 시험된 나노바디의 결합을 ProteOn을 사용하여 하기와 같이 확인하였다:
나노바디를 혈청 알부민 상에서, 또는 모노클로날 항-FLAG M2를 사용하여 FLAG3 태그를 통해 포착하였다.
인간 혈청 알부민(HSA) 상에 포착된 나노바디 상에서의 기존의 항체의 결합을, ProteOn XPR36(Bio-Rad Laboratories, Inc.)을 사용하여 평가하였다. PBS/Tween(포스페이트 완충 식염수, pH 7.4, 0.005% Tween20)을 러닝(running) 완충제로서 사용하였으며, 실험을 25℃에서 수행하였다. ProteOn GLC 센서 칩(Sensor Chip)의 리간드 레인을 EDC/NHS(유속 30 ㎕/분(min))를 이용하여 활성화시켰으며, HSA를 ProteOn 아세테이트 완충제 pH 4.5(유속 100 ㎕/분) 내에서 10 ㎍/ml로 주사하여, 고정 수준을 대략 3200 RU로 만들었다. 고정 후, 표면을 에탄올아민 HCl(유속 30 ㎕/분)을 사용하여 탈활성화시켰다. 나노바디를 HSA 표면에 걸쳐 45 ㎕/분으로 2분 동안 주사하여, 나노바디 포착 수준을 대략 200 RU로 만들었다. 기존의 항체를 함유하는 시료를 14,000 rpm에서 2분 동안 원심분리하고, 상층액을 PBS-Tween20(0.005%)에서 1:10으로 희석시킨 후, 45 ㎕/분으로 2분 동안 주사한 다음, 후속해서 400초간의 해리 단계를 수행하였다. 각각의 사이클 후(즉, 새로운 나노바디 포착 및 혈액 시료 주사 단계 전), HCl(100 mM)을 45 ㎕/분으로 2분 동안 주사하여 HSA 표면을 재생시켰다. 센서그램 프로세싱 및 데이터 분석을 ProteOn Manager 3.1.0(Bio-Rad Laboratories, Inc.)을 이용하여 수행하였다. 기존의 항체 결합을 보여주는 센서그램을, 1) 나노바디-HSA 해리 및 2) 참조 리간드 레인에의 비특이적인 결합을 제함으로써 이중 참조화(double referencing) 후 수득하였다. 리포트 포인트를 125초(결합 종료 후 5초)로 설정함으로써, 기존의 항체의 결합 수준을 확인하였다. 기존의 항체의 결합의 감소 퍼센트를, 125초에서 참조 나노바디의 결합 수준과 비교하여 계산하였다.
모노클로날 항-FLAG M2(Sigma) 상에 포착된 FLAG-태깅된 나노바디 상의 기존의 항체의 결합을, ProteOn XPR36(Bio-Rad Laboratories, Inc.)을 사용하여 평가하였다. PBS/Tween(포스페이트 완충 식염수, pH 7.4, 0.005% Tween20)을 러닝 완충제로서 사용하였으며, 실험을 25℃에서 수행하였다. ProteOn GLC 센서 칩의 리간드 레인을 EDC/NHS(유속 30 ㎕/분)를 이용하여 활성화시켰으며, 항-FLAG M2 mAb를 ProteOn 아세테이트 완충제 pH 4.5(유속 100 ㎕/분) 내에서 10 ㎍/ml로 주사하여, 고정 수준을 대략 4000 RU로 만들었다. 고정 후, 표면을 에탄올아민 HCl(유속 30 ㎕/분)을 사용하여 탈활성화시켰다. 나노바디를 항-FLAG M2 표면에 걸쳐 45 ㎕/분으로 2분 동안 주사하여, 나노바디 포착 수준을 대략 100 RU로 만들었다. 항-FLAG M2 표면에 대한 혈액 시료의 비특이적인 결합을 감소시키기 위해, 100 nM 3xFLAG 펩타이드(Sigma)를 혈액 시료에 첨가하였다. 기존의 항체를 함유하는 시료를 14,000 rpm에서 2분 동안 원심분리하고, 상층액을 PBS-Tween20(0.005%)에서 1:10으로 희석시킨 후, 45 ㎕/분으로 2분 동안 주사한 다음, 후속해서 600초간의 해리 단계를 수행하였다. 각각의 사이클 후(즉, 새로운 나노바디 포착 및 혈액 시료 주사 단계 전), 글리신 pH 1.5(10 mM)을 150 ㎕/분으로 10초 동안 주사하여 항-FLAG M2 표면을 재생시켰다. 센서그램 프로세싱 및 데이터 분석을 ProteOn Manager 3.1.0(Bio-Rad Laboratories, Inc.)을 이용하여 수행하였다. 기존의 항체 결합을 보여주는 센서그램을, 1) 나노바디-항-FLAG M2 해리 및 2) 참조 리간드 레인에의 비특이적인 결합을 제함으로써 이중 참조화 후 수득하였다. 리포트 포인트를 125초(결합 종료 후 5초)로 설정함으로써, 기존의 항체의 결합 수준을 확인하였다. 기존의 항체의 결합의 감소 퍼센트를, 125초에서 참조 나노바디의 결합 수준과 비교하여 계산하였다.
3.2: 참조 A(서열 번호 1)에서 본 발명의 돌연변이의 도입은 기존의 항체에 의한 결합의 감소를 초래한다.
하기 아미노산 서열들: 서열 번호 58(Q108L 돌연변이를 포함함), 참조 A, 참조 A(L11V, V89L)-Ala, 참조 A(L11V, A74S, V89L)-Ala 및 참조 A(L11V, S49A, V89L)-Ala을 사용하였으며, 이들은 모두 N-말단 HIS6-FLAG3 태그(서열 번호 42)를 포함하였다. 이들 나노바디를, 건강한 인간 지원자들 유래의 96개의 혈청 시료로부터의 시료에 존재하는 기존의 항체에 의한 결합에 대해 시험하였다. FLAG-태그를 사용하여 화합물을 포착하였으며, ProteOn을 이러한 실험 파트의 서론에 주어진 프로토콜에 따라 사용하여 결합을 측정하였다.
그 결과는 도 6에 도시되어 있다. 도 7a~도 7e는 도 6의 데이터 포인트들 중 하나를 형성하는 각각의 시료에 대한 결과를 열거한 것이다.
시험된 96개의 시료들 대부분에 대해, 본 발명에 따른 돌연변이의 도입은 기존의 항체의 결합의 감소를 초래하며, 감소율은 일반적으로, 각각의 시료 내 기존의 항체가 참조 A에 결합할 수 있었던 수준에 따라 다름을 알 수 있다.
실시예 4: 화학적 안정성 평가
다양한 인간화된 및/또는 최적화된 나노바디들의 화학적 안정성을 강제(forced) 산화 및 온도 스트레스 시험을 통해 평가하였다.
새로운 참조 화합물, 즉 A016600015(서열 번호 61)를 제조하였다. 이 새로운 참조 화합물은 추정된(presumed) 임상 후보들에 더 순응적이고, 따라서, 돌연변이의 영향을 더 양호하게 평가할 수 있게 한다. A016600015는, C-말단 알라닌 및 아미노산 잔기 1에서의 아스파테이트를 제외하고는 참조 A(서열 번호 1)와 동일하다. C-말단 Ala을, WO 2012/175741(실시예 3 참조)에 따라 PEA를 감소시키기 위해 도입하였다. 피로글루타메이트 형성의 평가 후, 아미노산 잔기 1에서 아스파테이트를 N-말단 글루타메이트로 치환하였다. 새로운 참조 A016600015의 활성은 사실상, 참조 A와 동일하였다(데이터는 도시되지 않음). 이 새로운 화합물 A016600015를 다르게 지시되지 않는 한, 실시예 전반에 걸쳐 참조 화합물로서 더 사용한다.
실시예 3의 결과를 기반으로, 항-PEA 돌연변이 L11V 및 V89L을 (특히) 새로운 참조 화합물 A016600015와 비교하여 도입하여, A016600018(서열 번호 37) 및 A016600019(서열 번호 38)를 초래하였다. 서열은 도 3a~도 3f에 도시되어 있다.
4.1 강제 산화 안정성
참조 화합물 A016600015의 나노바디 시료(1 mg/ml)를 RT 및 암실에서 4시간 동안 PBS 중 10 mM H2O2로 처리하였으며, 이와 동시에 H2O2 없이 대조군 시료도 처리하였고, 이후, Zeba 탈염 스핀 컬럼(0.5 ml)(Thermo Scientific)을 사용하여 완충제를 PBS로 교환하였다. 그런 다음, 스트레스 시료 및 대조군 시료를 70℃에서 Series 1200 또는 1290 기계(Agilent Technologies) 상에서 Zorbax 300SB-C3 컬럼(Agilent Technologies)에 걸쳐 RPC에 의해 분석하였다. 산화 스트레스의 결과 발생하는 예비-피크의 피크 면적 %를 주요 단백질 피크와 비교하여 확인함으로써, 나노바디의 산화를 정량화하였다.
참조 화합물 A016600015의 산화 스트레스 시료에서는 변이체가 관찰되지 않았다(데이터는 도시되지 않음).
4.2 온도스트레스 안정성
나노바디 시료(1 내지 2 mg/ml)를 -20℃(음성 대조군), 25℃ 및 40℃에서 PBS에서 4주 동안 저장하였다. 이러한 인큐베이션 기간 후, 나노바디를 트립신 또는 LysC를 이용하여 분해하였다. 그런 다음, 스트레스 시료 및 대조군 시료의 펩타이드들을 60℃에서 Series 1290 기계(Agilent Technologies) 상에서 Acquity UPLC BEH300-C18 컬럼(Agilent Technologies)에 걸쳐 RPC에 의해 분석하였다. 컬럼은 Q-TOF 질량분광계(6530 Accurate Mass Q-TOF(Agilent))에 커플링되어 있다. 펩타이드 맵(map) UV 214 nm 또는 EIC(추출 이온 크로마토그램(Extracted Ion Chromatogram)) 크로마토그램의 통합에 의해, 주어진 변형의 신뢰 가능한 정량화가 가능하다.
40℃에서만, 어느 정도의 이성질화 및 피로글루타메이트 변이체가 관찰되었다. 주목할만하게는, 환경적으로 노출된 CDR2에 위치하고 잠재적으로 이성질화를 받을 수 있는 아미노산 잔기 54D는 사실상 이성질화를 나타내지 않았다. 나노바디가 25℃ 이하에서 연장된 기간 동안 유지된 경우, 아미노산 잔기 1의 이성질화는 미미하였다.
4.3 열 이동 검정법(TSA; Thermal shift assay)을 통한 용융점
나노바디의 용융점은 이의 생물물리학적 안정성의 측정치이다.
다양한 나노바디들의 용융점을, 본질적으로 Ericsson 등 2006(문헌[Anals of Biochemistry, 357: 289-298])에 따라 열 이동 검정법(TSA)을 통해 평가하였다. 간략하게는, 5 ㎕의 정제된 1가 나노바디(800 ㎍/ml)를, 10 ㎕의 완충제(3.5 내지 9 범위의 상이한 pH들에서 완충된 100 mM 포스페이트, 100 mM 보레이트, 100 mM 시트레이트, 115 mM NaCl) 중 5 ㎕의 형광 프로브 사이프로 오렌지(Sypro Orange)(Invitrogen, S6551)(최종 농도 10 x)와 함께 인큐베이션하였다. 시료들을 LightCycler 480II 기계(Roche)에서 4.4℃/초의 속도로 37℃로부터 99℃까지 가열하였으며, 이후 이들 시료를 0.03℃/초의 속도로 37℃까지 냉각시켰다. 가열-유도 풀림(unfolding) 시, 단백질의 소수성 패치(patch)를, 사이프로 오렌지가 결합하는 곳에 노출시켜, 형광 강도를 증가시킨다(Ex/Em = 465/580 nm). 형광 강도 곡선의 제1 유도체의 변곡점은 용융점(Tm)의 측정치로서 역할을 한다.
참조 화합물 A016600015(서열 번호 61)를 A016600018(서열 번호 37) 및 A016600019(서열 번호 38)와 비교하였다. A016600015와는 대조적으로, A016600018 및 A016600019는 둘 다 실시예 3에 따라 항-PEA 돌연변이 L11V 및 V89L을 포함한다.
그 결과는 표 4.3에 나타나 있다.
Figure 112018057684104-pct00001
표 4.3에서 알 수 있듯이, 항-PEA 돌연변이는 Tm(A016600018)에 아무런 효과를 갖지 않거나 Tm(A016600019)에 부정적인 효과를 갖는 것으로 나타났다. 주목할만하게는, A016600018("00018")과 A016600019("00019") 사이의 차이는 각각 78L 및 78V이다. 아미노산 잔기 78에서 이러한 차이의 전체적인 임의의 효과는 항-PEA 돌연변이의 도입과 비교하여 유의하지 않은 것으로 나타났다(또한, 하기를 참조).
또한, 항-PEA 돌연변이를 포함하는 이들 변이체의 생성 시, 이들 변이체의 발현은 차선인 것으로 나타났다. 이를 실시예 1의 방법을 사용하여 더 정량화하였다.
그 결과를 표 4.3에 나타낸다.
실제로, 항-PEA 돌연변이를 포함하는 2개의 변이체 모두로부터 회수 가능한 양은 참조 나노바디보다 약 2배 더 낮거나(A016600018) 심지어 4배 더 낮았다(A016600019). 이는, 이들 항-PEA 돌연변이 L11V 및 V89L의 도입이 이전에 임의의 다른 클론에 대해 확인된 바와 같이 나노바디를 회복시키는 능력의 이러한 심각한 하락을 초래하지 않았기 때문에, 본 발명자들에게 완전히 놀라웠다.
4.4 프로테아제 안정성
TNF-저해제는 결국 경구 투여될 수 있는 것이다. 그러나, 위 및 장은, 이들이 부분적으로 고형인 음식물의 효소적 절단 및 흡수를 위해 디자인되어 있기 때문에 천연적으로 적대적인 환경을 구성한다. 일반적으로, 폴리펩타이드 사슬 내 8 내지 10개의 아미노산 잔기들이 프로테아제 활성 부위에 결합하고 특정 입체화학에 맞춰질 수 있을 경우에만, 단백질 기질의 단백분해가 발생할 수 있다(문헌[Fontana et al. 2004 Acta Biochim Pol, 51, 299-321]). 따라서, 효소적 절단에 대한 취약성은 대체로 기질의 물리적 특성에 따라 다르다.
잠재적인 프로테아제 분해 부위를 식별하고 더 안정한 변이체를 디자인하기 위해, 본 발명자들은 트립신 및 키모트립신 절단 부위를 표준 방법에 따라 식별하고자 하였다.
서열 번호 58 및 새로운 참조 화합물 A016600015("00015")의 예측된 프로테아제 부위("P")들은 도 8a에서 트립신 및 케모트립신 둘 다에 대해 ("X")로서 도시되어 있다.
이러한 도면으로부터, 이미 하기와 같은 결론을 내릴 수 있다:
- CDR3은 9개의 잠재적인 프로테아제 절단 부위를 포함한다.
- 인간화 돌연변이 Q75K(VH3-DP51)는 잠재적인 트립신 절단 부위를 도입하였다.
- 인간화 돌연변이 K73N(VH3-DP51)은 잠재적인 트립신 절단 부위를 제거하였다.
- 항-PEA 돌연변이 L11V 및 V89L은 이러한 측면에서 중성이었으며, 즉, 이들 돌연변이는 예상된 바와 같이 잠재적인 프로테아제 절단 부위를 도입하거나 제거하지 않았다.
예측된 프로테아제 절단 부위를 생체내 설정에서 보다 더 평가하기 위해, 나노바디를 트립신 및 케모트립신에 의해 분해하였다. 특히, 항-TNFα 나노바디를 10% 트립신 또는 α-키모트립신 용액에서 인큐베이션하였다. 2 ㎍ 나노바디를 37℃에서 2시간, 4시간 및 밤새 트립신 분해하거나, 25℃에서 2시간, 4시간 또는 밤새 키모트립신 분해하였다. TFA(0.1% 최종)를 첨가함으로써, 단백분해성 반응을 중단시켰다. 반응 혼합물을 RPC LC-MS를 통해 분석하거나, SDS PAGE 겔 상에서 분리하고, 쿠마시 블루로 염색하였다. ImageQuant(GE)를 사용하여, 온전한 물질의 양을 계산하였으며, 참조 시점으로서 0시간으로 정규화하였다.
쿠마시 염색된 SDS PAGE 겔 상에서의 트립신 분해의 예시적인 결과를 도 8b에 제공한다. RPC LC-MS를 통한 트립신 분해 분석의 예시적인 결과를 도 8c에 제공한다. 실험적으로("E") 확인된 절단 부위를 도 8a에서 트립신("E") 및 케모트립신("E")으로서 도시한다.
도 8a로부터, 실제 절단 부위의 수는 감소되는 것이 명확하다. 그렇지만, 다양한 트립신 및 케모트립신 인지 부위들이 남는다.
트립신 내성을 최적화하기 위해, 하나의 최적화된 변이체를 조작하여 변이체 A016600013; 서열 번호 65을 수득하도록 5개의 위치들을 선택하였다: R38, K64, S94, P95 및 R96.
그러나, 이들 부위를 돌연변이화하면, 변이체(A016600013; 서열 번호 65)의 발현 수준 및 세포내 축적을 감소시켰다. 사실상, 아미노산 잔기 38이 복귀 돌연변이화된 경우, 이는 발현을 개선시켰으며, 생성된 변이체(A016600014; 서열 번호 66)는 예상과는 완전히 대조적으로 참조 화합물 A016600015(데이터는 도시되지 않음)보다 프로테아제에 더 민감하였다. 따라서, 연구 하에 참조 화합물 및 나노바디, 즉, A016600018 및 A016600019에서 이들 위치를 돌연변이화시키지 않기로 결정하였다.
그 결과의 요약은 표 4.4에 도시되어 있다.
Figure 112018057684104-pct00002
실시예 5: SHIME 모델로부터 유래된 장 유체에서의 안정성
인간 GI 관에서 항-TNFα 나노바디의 안정성을 조사하기 위해, 인간 위장관(GI)을 나타내는 SHIME(인간 장 미생물 에코시스템의 시뮬레이터) 유래의 5개의 상이한 유체들에서 나노바디를 인큐베이션하였다. SHIME 모델은 완전한 위장관의 과학적으로 입증된 동적 모델이고, 조절된 시험관내 설정에서 위장관에서 생리화학적, 효소적 및 미생물 파라미터들을 연구하는 데 사용된다.
SHIME 모델은 위(산 조건 및 펩신 소화), 소장(소화 과정) 및 대장의 3개 영역, 즉, 상행 결장("A"), 횡행 결장("T") 및 하행 결장("D")(미생물학적 과정)을 연속적으로 시뮬레이션하는 5개의 반응기들로 구성된다. 이들 반응기 내에서 환경적 파라미터들을 조심스럽게 조절하면, 인간 결장의 상이한 영역들에서 구조 및 기능 둘 다의 측면에서 미생물 커뮤니티와 고도로 유사한 복합적이고 안정한 미생물 커뮤니티가 가능하였다(도 9 참조). 모든 GI 유체들은 ProDigest(벨기에 쯔비나야드(Zwijnaarde) 9052, 테크놀로지에파크 4 소재)에 의해 공급받았다. 항-TNF 나노바디를 GI 유체 내에서 최대 39시간 동안 시험하였다. GI 유체 내에서 인큐베이션한 후, 나노바디의 안정성을 경쟁 ELISA에서 기능성 시험을 통해 확인하였다. 나노바디를, SHIME 모델에서 5개의 상이한 GI 유체들에서 37℃에서 100 ㎍/ml의 고정된 농도에서 시험하였다. 상이한 시점들에서 시료를 채취하고, 표 5.1의 스케쥴에 따라 프로테아제 저해제의 첨가와 함께 또는 없이 -20℃에 저장하였다. 시료를 코팅된 ELISA 플레이트로 옮기고, 후속해서 경쟁 ELISA에서 시험하였다. 간단하게는, A016600015를 PBS 중 1 ㎍/ml의 농도에서 코팅하였다. 블라킹 후, 상이한 GI 유체들 중 적정 시리즈의 변이체들과 함께 0.3 nM의 고정된 농도의 biot-hTNFα를 첨가하였다. 엑스트라비딘-HRP를 이용하여 검출을 수행하였다.
결장 "T"에서의 예시적인 결과를 표 5.2에 제공한다.
Figure 112018057684104-pct00004
상이한 SHIME 구획들로부터 유래된 유체를 이용한 결과를 기반으로, 안정성 평가를 통해, 모든 GI 구획들에서의 안정성을 나타내는 나노바디의 순위를 매길 수 있다: 00015 > 00019 > 00018.
종합적으로, 프로테아제 절단 부위의 제거는 예컨대 이러한 나노바디 패밀리의 안정성 및 프로테아제 민감성에 아무런 긍정적인 효과를 갖지 않는 것으로 보인다. A16600015에서 항-PEA 돌연변이 L11V 및 V89L의 도입은 이러한 특정 나노바디의 안정성에 부정적인 효과를 갖는 것으로 보인다.
실시예 6: 안정화된 변이체
프로테아제 절단 부위의 제거가 예상된 결과를 초래하지 않았기 때문에, 본 발명자들은 항-TNF-α 변이체를 더 알아보려고 하였으며, 이러한 변이체는 본래 더 안정할 것이지만 인간화 및 항-PEA 돌연변이는 바람직하게는 타협되지 않았다. 이는, 상호적으로 배제적인 특징들, 예컨대 인간화 대 프로테아제 안정성 대 친화성을 나타내는 다양한 아미노산 잔기들의 측면에서 통상적이지 않은 접근법을 필요로 하였다.
6.1 내부적인 시스테인 결합 및 CDR3 케모트립신 절단 부위의 제거
CDR3에 위치하고 잠재적으로는 결합 특성에 영향을 미치긴 하지만, 케모트립신 절단 부위인 아미노산 잔기 Y100d를 Y100dL 치환(A016600046 100dL; 서열 번호 62)에 의해 제거한 변이체를 구축하기로 결정하였다. CDR3의 위치 100d 상에서 티로신의 영향을 추가로 평가하기 위해 변이체 A016600045(서열 번호 69)를 조작하였다.
또한, 본 발명자들은, 도메인내 이황화 결합의 도입을 통해 본래 안정할 변이체를 조작할 수 있을 것으로 가정하였다(문헌[Wozniak-Knopp et al. 2012 PLoS One. 2012; 7(1): e30083] 참조). 이는 2개의 시스테인 잔기들의 도입을 필요로 할 것이며, 그런 다음 이들 잔기는 쌍을 이루어 시스틴(cystine)을 형성해야 한다. 나노바디의 단백질 구조, 및 결정화 연구(데이터는 도시되지 않음)를 통해 상기 나노바디와 표적 TNF-α와의 상호작용을 분해(resolve)한 후, 본 발명자들은, 아미노산 잔기 S49가 CDR2에 인접해 있더라도, 도메인내 이황화 결합을 도입하기 위해 아미노산 S49C 및 I69C 돌연변이를 돌연변이화하기로 결정하였고, 인간화 목적의 측면에서 도입하였다(인간 생식선 DP51에 상응하며, 실시예 2 참조). S49C, I69C 및 Y100dL을 포함하는 새로운 변이체를 A016600052(서열 번호 63)라고 주석을 단다.
아미노산 위치 49의 영향을 심도있게 평가하기 위해, 이 아미노산 잔기를 알라닌으로 돌연변이화하였다. 주목할만하게는, 위치 49에서 이러한 돌연변이는 - 비록 상이하더라도 - 인간 생식선 IgHV3-IgHJ에 상응할 것이다. 새로운 변이체 A016600046(서열 번호 62), A016600016(서열 번호 36), A016600020(서열 번호 39) 및 A016600021(서열 번호 40)은 모두 A49를 포함한다.
또한, 변이체 A016600020(서열 번호 39)에서, 위치 D60A, E61D 및 P62S를 물리적 안정성의 측면에서 평가하였다. 아미노산 잔기 A60, D61 및 S62는 실험적으로 확인된 키모트립신 절단 부위 Y58에 인접하여 위치하고, 카바트에 따르면 CDR2 내에 위치하며, 이는 약효 손실의 위험성이 높음을 내포한다.
더욱이, 인간화 돌연변이 Q75K에 의해 프로테아제 절단 부위를 우연히 도입하였다. 임의의 이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니지만, 본 발명자들은, 인접하여 위치한 아미노산 잔기 A74S에 변화를 주는 것은 잠재적으로는, 인간화뿐만 아니라 프로테아제 민감성 둘 다에 영향을 미칠 것이지만, 인간화 및 프로테아제 미감성 둘 다가 허용 가능한 정도까지 줄어드는 것이 요망되는 정도까지만 영향을 미칠 것으로 가정하였다. S74를 포함하는 변이체는 A016600016("00016"), A016600020 ("00020"), A016600021("00021"), A016600046("00046") 및 A016600052("00052")(각각 서열 번호 36, 39, 40, 62 및 63)이다. 비교자 변이체는 A016600038("00038"; 서열 번호 64)이었으며, 이는 74A 대신에 74S를 갖고 있는 점을 제외하고는 A016600021(서열 번호 40)과 동일하였다.
생성된 서열을 도 3a~도 3f에 제공한다.
6.2 안정화된 변이체의 특징
다음, 이들 변이체를 본질적으로 실시예 3 및 4에 나타낸 바와 같이 다양한 특징들에 대해 평가하였다.
처음에, 변이체 00016, 00020 및 00021의 생성을 실시예 1에 따라 피. 파스토리스에서 확인하였다.
수득된 결과의 요약을 표 6.2A에 제공한다.
Figure 112018057684104-pct00005
이들 결과로부터, 이들 돌연변이는, 87 ㎍을 생성한(실시예 4.3 참조) 참조 화합물의 생성보다 4배 내지 5배 더 많은, 또는 심지어 밀접하게 관련된 변이체 00018 및 00019보다 20배 내지 30배 더 많은 생성 증가를 초래하였음을 알 수 있다.
다음, 이들 변이체의 열적 안정성을 실시예 4.3에 따라 확인하였다. 수득된 결과의 요약을 또한, 표 6.2A에 제공한다.
생성이 크게 증가한 것뿐만 아니라, 열적 안정성도 참조 화합물과 비교하여 5-16℃ 예상치 못하게 증가하였으나, 보다 밀접하게 관련된 변이체 00018 및 00019와 비교하여 16-19℃ 이하 증가하였다.
예상치 못하게도, 아미노산 잔기 A49는 생성 및 안정성에 미치는 항-PEA 아미노산 잔기 V11 및 L89의 영향을 일소한다.
실시예 6.1의 다양한 변이체들을 실시예 5에 따른 SHIME 모델로부터 유래된 GI 유체에서 함께 평가하였다.
다양한 조건의 A016600021, A016600038, A016600046 및 A016600052 하에 인큐베이션 기간의 종료 시, 생성된 활성에 대한 요약을 표 6.2B에 제공한다. PBS에서의 인큐베이션은 나노바디의 본래의 안정성을 확인시켜 주었다(데이터는 도시되지 않음).
Figure 112018057684104-pct00006
프로테아제 절단 부위가 제거된 변이체 A016600046 Y100dL(서열 번호 62) 및 도메인내 시스테인 결합을 통해 더 안정화된 변이체 A016600052(서열 번호 63)은 이러한 측면에서 임의의 개선을 제공하지 않았다. 주목할만하게는, 변이체 00046 및 00052의 IC50은 CDR3에서의 돌연변이때문에 00021과 비교하여 2배 내지 5배 증가하였다(0.67 nM과 비교하여 각각 1.13 nM 및 3.56 nM).
SHIME 결과는 본질적으로, Tm 및 생성의 결과를 확인시켜 주었고 연장시켰다. 또한, SHIME 모델은, 변이체 00021(서열 번호 40)이 변이체 A016600040 ("00040"; 서열 번호 67) 및 변이체 00038(서열 번호 64)보다 일관되게 더 안정하고, 이는 위치 74에서 세린의 긍정적인 기여도를 나타냄을 보여주었다.
주목할만하게는, A74S를 제외하고는 변이체 00040(서열 번호 67)과 동일한 변이체 A016600039(서열 번호 68)는, S74가 SHIME 모델에서 A74보다 일관되게 덜 안정하였음을 보여주었다.
상이한 SHIME 구획들로부터 유래된 유체를 이용한 결과들을 포함하여 모든 결과들을 기반으로, 전체적인 안정성 평가는 모든 GI 구획들에서의 안정성을 나타내는 나노바디의 순위를 매길 수 있다: 00021 > 00016 > 00020 > 00040 > 00015 > 00019 > 00018.
따라서, A16600015에서 항-PEA 돌연변이 L11V 및 V89L은 이러한 특정 나노바디의 안정성에 부정적인 효과를 갖는 것으로 보이고, 이는 49C-69C에 의해서가 아니라 49A에 의해 완화될 수 있을 것이다. 더욱이, 항-PEA 돌연변이 L11V 및 V89L을 포함하는 나노바디에서, 아미노산 잔기 74S는 SHIME 모델에서 안정성에 유익하였다.
6.3 A016600021은 (A016600039 및 A016600040을 능가하는) 선호할만한 특징을 가진다
경구 투여의 경우, 안정성 다음으로 고용량이 요구될 수 있는 것으로 여겨진다. 허용 가능한 비용을 갖기 위해, 후보물질은 바람직하게는 다량으로 생성되고, 상당한 손실 없이 정제된 다음, 고농도로 제형화된다. 따라서, 본 발명자들은 이들 파라미터들을 시험하기 위해 실험을 수행하고자 하였다.
우선, 본 발명자들은 발현 수준 A016600039 및 A016600040을 A016600021과 비교하고자 하였다.
도 11a에서 알 수 있듯이, A016600039(서열 번호 68)의 발현은 A01660021(서열 번호 40) 및 A016600040(서열 번호 67)의 발현 수준보다 상당히 더 낮았다. 이들 결과는 또한, AKTAmicro를 통해 정량화하였으며, 이의 결과를 표 6.3에 나타낸다.
Figure 112018057684104-pct00007
A016600021 대 A016600040의 제조 가능성에 관하여, 둘 다를 발효 브로쓰(broth)의 농축 동안 최대 용해성에서 시험하였다. 정제된 발효 브로쓰 내에서의 최대 용해성은 A016600040의 경우 단지 30 g/L이다(vs A016600021의 경우 > 75 g/L). 또한, A016600040의 추가의 정제 동안 주된 손실이 발생하였다.
따라서, 안정성 외에도, A016600021은 또한, - 예상치 못하게도 - A016600039 및 A016600040을 능가하는 선호할만한 생성 및 정제 특징을 가진다.
유리한 안정성, 발현 및 정제 특징을 기반으로, 본 발명자들은 A016600021에 초점을 맞추었으며, 이의 용해성을 확인하였다. 본 발명자들이 완전히 놀라게도, A016600021은 H2O 내에서 전례없이 200 mg/ml까지 가용성이었다.
실시예 7: 안정화된 변이체는 벤치마크를 능가한다
변이체 A016600021(서열 번호 40), A016600038(서열 번호 64) 및 A016600045(서열 번호 69)를, TNF-R2-기반 항-TNF 치료제인 엔브렐(에타네르셉트(Etanercept))을 이용한 경쟁 검정법에서 막-결합된 인간 TNF(mTNF)에의 결합에 대해 평가하였다. 여기서, 이전에 기재된 바와 같이, 인간 TNF R77T/S78T 변이체를 코딩하는 진핵 발현 벡터를 HEK293H 세포에 형질감염시킴으로써(HEK293H-mTNF로 지칭됨), 비절단 형태의 인간 TNF를 안정하게 발현하는 세포주를 생성하였다(문헌[Harashima et al., 2001 J Immunol 166:130-136]). 퓨로마이신 내성 유전자의 공동발현에 의한 선별 후, 개별 mTNF 발현 세포의 소팅을, 상기 세포를 레미케이드(Remicade)(인플릭시맙) 및 2차 염소 F(ab')2 항-인간 IgG, 마우스 ads-PE로 염색 시 FACS(BD FACS Aria)를 통해 수행하였다. 선별된 개별 클론 상에서 막-결합된 TNF의 구성적인 발현을 유세포분석(BD FACS Array)에 의해 확인하였다.
처음에, 이들 세포 상의 mTNF에 엔브렐이 결합하는 것을 평가하였다. 여기서, 단일 HEK293H-mTNF 클론의 5.105개의 세포를 둥근 바닥 96웰 플레이트에 접종하고, FACS 완충제(10% FBS 및 0.05% 소듐 아자이드가 보충된 PBS) 내에서 희석된 상이한 농도의 엔브렐들과 함께 4℃에서 90분 동안 직접적으로 인큐베이션하였다. 세포를 FACS 완충제로 세척하고, 2차 염소 F(ab')2 항-인간 IgG, 마우스 ads-PE 항체로 4℃에서 30분 동안 염색시켰다. 데드(dead) 염색 TO-PRO-3 요오다이드의 존재 하에 FACS 완충제 내에서 세포를 세척 및 인큐베이션한 후, 살아있는 HEK293H-mTNF 세포 상의 mTNF에 대한 엔브렐의 결합을 BD FACS 어레이 상에서 판독에 의해 측정하였다. 수득된 용량 반응 곡선으로부터, mTNF에 결합하는 엔브렐의 EC30 및 EC90 값을 각각 0.02 nM 및 0.2 nM인 것으로 한정하였다. 두 농도를 모두 이후에, TNF-표적화 나노바디를 이용한 경쟁 검정법에 적용하였다.
A016600021, A016600038 및 A016600045의 mTNF 결합을 평가하기 위해, 고정된 EC30 및 EC90 농도에서 엔브렐을 이용한 경쟁 실험을 구축하였다. 항-TNF 나노바디의 약효를 벤치마크 화합물인 킴지아(Cimzia)(세르톨리주맙 페골)와 비교하였다. 부가적으로, 무관한 나노바디(IRR00027)를 음성 대조군으로서 포함하였다. 이러한 검정법에서, 제1 인큐베이션 단계를 제외하고는 엔브렐 결합에 대해 상기 기재된 바와 동일한 조건들을 적용하였으며, 이러한 실험에서, 고정된 농도의 엔브렐(EC30 또는 EC90)을 300 nM 내지 12.5 pM 범위의 상이한 농도의 항-TNF 나노바디 또는 킴지아와 조합하여 세포에 공동처리하는 단계를 수반한다. BD FACS 어레이 상에서의 판독은 HEK293H-mTNF 세포 상에서의 엔브렐의 결합을 확인해 주었으며, 이러한 결합은, 증가하는 농도의 나노바디뿐만 아니라 킴지아와 함께 공동처리한 경우 명확하게 감소하였으며, 이러한 감소는 mTNF에의 결합에 대해 항-TNF 제제와 엔브렐이 경쟁함을 나타낸다. 항-TNF 제제의 IC50 값을 표 7에 지시된 바와 같이 확인하였다.
수득된 결과는, A016600021, A016600038 및 A016600045가 EC90에서 킴지아보다 6 내지 7배 더 양호한 약효를 가지고, EC30에서는 킴지아보다 놀랍게도 15 내지 18배 더 양호한 약효를 가짐을 나타낸다. 안정화된 변이체는 mTNF 결합에 대해 엔브렐과 경쟁하기 위해 유사한 약효를 가진다.
경쟁 FACS에서, 나노바디는 또한, 엔브렐이 mTNF에 결합하는 것을 경쟁적으로 저해할 수 있을 것으로 나타났다. 이는, 경구 적용용 약제로서의 우수한 적합성에 대한 지표일 것이다. 이와는 대조적으로, 고농도의 킴지아는 엔브렐 결합의 부분적으로 차단할 뿐이었다(도 10).
본 출원 전체에서 인용된 모든 참조문헌들(문헌 참조, 등록 특허, 공개 특허 출원 및 동시계속 특허 출원을 포함함)의 전체 내용은 원용에 의해, 특히 상기 참조된 교시에 대해 본 명세서에 표현되어 포함되어 있다.
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SEQUENCE LISTING <110> ABLYNX NV <120> IMPROVED TNF BINDERS <130> 192557 <150> US62/254375 <151> 2015-11-12 <160> 105 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR Sequence <400> 1 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Ala 20 25 30 Asp Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ser Arg Ile Ser Gly Ile Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Asp Glu Pro Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Arg Ser Pro Arg Tyr Ala Asp Gln Trp Ser Ala Tyr Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR Sequence <400> 2 Thr Ala Asp Met Gly 1 5 <210> 3 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR Sequence <400> 3 Arg Ile Ser 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Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Arg Ser Pro Arg Tyr Ala Asp Gln Trp Ser Ala Tyr Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 9 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR Sequence <400> 9 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Ala 20 25 30 Asp Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ser Arg Ile Ser Gly Ile Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Asp Glu Pro Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Arg Ser Pro Arg Tyr Ala Asp Gln Trp Ser Ala Tyr Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Lys Val Ser Ser 115 120 <210> 10 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR Sequence <400> 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n amino acids, wherein each position is chosen independently from any amino acids <400> 48 Val Thr Val Gln Ser Xaa 1 5 <210> 49 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C-terminal end <220> <221> SITE <222> (6)..(6) <223> Xaa stands for (X)n which means C-terminal extension with n amino acids, wherein each position is chosen independently from any amino acids <400> 49 Val Lys Val Ser Ser Xaa 1 5 <210> 50 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C-terminal end <220> <221> SITE <222> (6)..(6) <223> Xaa stands for (X)n which means C-terminal extension with n amino acids, wherein each position is chosen independently from any amino acids <400> 50 Val Gln Val Ser Ser Xaa 1 5 <210> 51 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C-terminal end <400> 51 Val Thr Val Lys Ser Ala 1 5 <210> 52 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C-terminal end <400> 52 Val Thr Val Gln Ser Ala 1 5 <210> 53 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C-terminal end <400> 53 Val Lys Val Ser Ser Ala 1 5 <210> 54 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C-terminal end <400> 54 Val Gln Val Ser Ser Ala 1 5 <210> 55 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C-terminal end <400> 55 Val Thr Val Ser Ser 1 5 <210> 56 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C-terminal end <220> <221> SITE <222> (6)..(6) <223> Xaa stands for (X)n which means C-terminal extension with n amino acids, wherein each position is chosen independently from any amino acids <400> 56 Val Thr Val Ser Ser Xaa 1 5 <210> 57 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C-terminal end <400> 57 Val Thr Val Ser Ser Ala 1 5 <210> 58 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR Sequence <400> 58 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Gln Thr Ser Ser Thr Ala 20 25 30 Asp Met Gly Trp Phe Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Arg Glu 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Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Gly Gly 115 <210> 82 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR Sequence <400> 82 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Asn 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Gly Gly Gly 115 <210> 83 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR Sequence <400> 83 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Phe 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 84 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR Sequence <400> 84 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Phe 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Ala 115 <210> 85 <211> 5 <212> PRT <213> 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Gly Gly Cys 1

Claims (42)

  1. 종양 괴사 인자 알파(TNFα)에 특이적으로 결합하는 면역글로불린 단일 가변 도메인(ISVD)으로서,
    - 아미노산 서열 GFTFSTADMG(서열 번호 5)인 CDR1(Abm에 따름);
    - 아미노산 서열 RISGIDGTTY(서열 번호 6)인 CDR2(Abm에 따름); 및
    - 아미노산 서열 PRYADQWSAYDY(서열 번호 4)인 CDR3(Abm에 따름)
    를 가지고,
    - 위치 49의 아미노산 잔기는 알라닌이고; 및
    - 위치 74의 아미노산 잔기는 세린이고;
    - 위치 11, 89, 110 및 112의 아미노산 잔기는 하기와 같고:
    - 위치 11의 아미노산 잔기는 L 또는 V에서 선택되고;
    - 위치 89의 아미노산 잔기는 T, V 또는 L에서 선택되고;
    - 위치 110의 아미노산 잔기는 T, K 또는 Q에서 선택되고; 및
    - 위치 112의 아미노산 잔기는 S, K 또는 Q에서 선택되고;
    그 결과,
    (i) 위치 89는 T이거나;
    (ii) 위치 89는 L이고, 위치 11은 V이거나;
    (iii) 위치 89는 L이고, 위치 110은 K 또는 Q이거나;
    (iv) 위치 89는 L이고, 위치 112는 K 또는 Q이거나;
    (v) 위치 89는 L이며, 위치 11은 V이고, 위치 110은 K 또는 Q이거나;
    (vi) 위치 89는 L이며, 위치 11은 V이고, 위치 112는 K 또는 Q이거나; (vii) 위치 11은 V이고, 위치 110은 K 또는 Q이거나;
    (vii) 위치 11은 V이고, 위치 112는 K 또는 Q이고,
    - 서열 번호 1의 아미노산 서열과 적어도 90%의 서열 동일성 정도 (여기서, 존재할 수 있는 임의의 C-말단 연장, CDR, 및 위치 11, 89, 110 또는 112의 아미노산 잔기는 서열 동일성 정도를 결정하는 데 고려되지 않음);
    또는
    - 서열 번호 1의 아미노산 서열과 7개 이하의 "아미노산 차이"(여기서, 존재할 수 있는 임의의 C-말단 연장, CDR, 및 위치 11, 89, 110 또는 112의 아미노산 잔기는 서열 동일성 정도를 결정하는 데 고려되지 않음);
    를 갖는, 면역글로불린 단일 가변 도메인(ISVD).
  2. 제1항에 있어서, 위치 73의 아미노산 잔기는 N이고 위치 75의 아미노산 잔기는 K인 ISVD.
  3. 제1항에 있어서, 서열 번호 40, 39, 36, 62 및 69로 이루어진 군으로부터 선택되는 ISVD.
  4. 제3항에 있어서, 위치 1에서의 D를 갖는 ISVD.
  5. 제1항에 있어서, C-말단 연장 (X)n을 가지고, 여기서, n은 1 내지 10이고, 각각의 X는 독립적으로 선택되는 아미노산 잔기인 ISVD.
  6. 제1항의 ISVD를 적어도 1개 포함하는 TNFα에 특이적으로 결합하는 화합물.
  7. 제6항에 있어서, 적어도 2개의, 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 ISVD를 포함하는 화합물로서, 상기 적어도 2개의 ISVD는 동일하거나 상이할 수 있는 것인 화합물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 적어도 2개의 ISVD는 독립적으로 서열 번호 8-41, 61-66 및 69로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 화합물.
  9. 제6항에 있어서, 혈청 단백질 결합 모이어티를 추가로 포함하는 화합물로서, 상기 혈청 단백질 결합 모이어티는 혈청 알부민에 결합하는 것인 화합물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 혈청 단백질 결합 모이어티는 혈청 알부민 결합 ISVD이고, 상기 혈청 알부민 결합 ISVD는 본질적으로, 4개의 프레임워크 영역(각각 FR1 내지 FR4) 및 Kabat 넘버링에 따른 3개의 상보성 결정 영역(각각 CDR1 내지 CDR3)으로 구성되며, 여기서, CDR1이 SFGMS이며, CDR2가 SISGSGSDTLYADSVKG이고, CDR3이 GGSLSR인 화합물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 혈청 알부민 결합 ISVD는 서열 번호 70-84 중 어느 하나로 표시되는 것인 화합물.
  12. 제1항의 ISVD 또는 제6항의 화합물을 포함하거나 이로 본질적으로 구성되며, 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위를, 하나 이상의 펩타이드 링커를 통해 연결하여, 추가로 포함하는 구축물로서, 상기 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위는 폴리에틸렌 글리콜 분자, 혈청 단백질 또는 이의 단편, 혈청 단백질에 결합할 수 있는 결합 단위, Fc 부위, 및 혈청 단백질에 결합할 수 있는 작은 단백질 또는 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 구축물.
  13. 염증성 장질환(IBD), 과민성 대장 증후군, 크론병, 궤양성 대장염, 점막염, 아프타성 구내염(aphthous stomatitis), 셀리악 병, 소화관에 대한 외상 또는 소화관에 대한 암의 치료에 사용하기 위한, 제1항의 ISVD 또는 제6항의 화합물을 포함하는 조성물.
  14. 염증성 장질환(IBD), 과민성 대장 증후군, 크론병, 궤양성 대장염, 점막염, 아프타성 구내염(aphthous stomatitis), 셀리악 병, 소화관에 대한 외상 또는 소화관에 대한 암의 치료에 사용하기 위한 제12항의 구축물을 포함하는 조성물.
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