KR102534977B1 - 로얄젤리의 락토바실러스 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 로얄젤리 추출물; 및 레몬타임과 허니로커스트의 복합 추출물을 락토바실러스 균주로 발효한 발효 추출물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 제공하는 조성물은 천연 물질로부터 제조되어 피부에 적용 시 세포 독성이 없이 안전할 뿐만 아니라, 피부 보습, 피부 장벽 강화 및 주름 개선 등 피부 개선 효능이 매우 우수하므로 항노화 화장료로 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명에서 제공하는 조성물은 천연 물질로부터 제조되어 피부에 적용 시 세포 독성이 없이 안전할 뿐만 아니라, 피부 보습, 피부 장벽 강화 및 주름 개선 등 피부 개선 효능이 매우 우수하므로 항노화 화장료로 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 로얄젤리(Royal jelly)의 락토바실러스 발효 추출물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다.
피부의 노화가 진행됨에 따라 표피와 진피에서 생리적, 물리적 기능이 저하된다. 특히 피부 노화는 피부의 건조로부터 시작이 되고 표피와 진피의 접촉 부위가 느슨해지고 얇아지며 증상이 심화된다. 표피에서는 각질층의 대사 속도가 감소하여 피부 장벽 기능이 저하되고, 건조하고 꺼칠하며 윤기가 없어진다. 진피에 서는 콜라겐 생성량의 감소, 기질 금속 단백분해효소-1(matrix metallopeptidase-1; MMP-1)에 의한 콜라겐 분해의 가속화 및 대사 회전속도 저하로 인해 탄력이 줄어들고 진피의 두께가 얇아져 주름이 형성되게 되고 수분 손실 등을 가속화한다(김란, 2012; 김은아, 2007). 그러므로 피부 노화를 효과적으로 관리하기 위해 피부 표피에서 일어나는 수분 손실, 피부 장벽 기능 약화 등의 징후와 피부 진피에서 일어나는 탄력 감소, 주름 생성 등의 징후를 모두 관리하는 것이 무엇보다 중요하다.
한편, 로얄젤리(Royal jelly)는 양봉 산물 중 벌꿀 다음으로 중요한 생산물 중 하나로 항노화, 항염증, 항균, 항산화 등 다양한 기능성을 보유하고 있는 것으로 알려져 있다. 로얄젤리는 어린 일벌 유충 및 여왕벌 유충의 먹이로 사용되며, 5~15일령 일벌 머리의 하인두선(hypopharyngeal glands)과 큰턱샘(mandibular)에서 분비되는 유백색의 물질로 독특한 향과 맛을 지니고 있다(김혜경 외 2017). 로얄젤리의 주요성분은 수분(60~70%), 단백질(12~15%), 당(10~16%), 지방(3~6%), 비타민, 호르몬 등이 있다. 특히 로얄젤리 단백질 중 82~90%를 주요 로얄젤리 단백질(Major royal jelly proteins, MRJPs)이 차지하고 있다. MRJP1은 일명 로얄락틴(Royalactin)이라고도 불리는데, MRJPs 중 가장 다량을 차지하며 여왕벌로의 분화, 면역력 강화, 성장 등에 작용하는 것으로 알려져 있다(Celeste C. I. et al., 2014).
풍부한 영양 성분을 함유하고 있는 로얄젤리는 종래 식품 및 화장품의 원료로 다양하게 사용되어 왔다. 대한민국 공개특허 제2016-0034573호에는 단백질 분해효소 및 비전분 다당류 분해효소를 처리한 로얄젤리의 동결건조물을 유효성분으로 포함하는, 피부의 유리 아미노산 함량 증가에 의한 피부 보습 증진용 식품 조성물이 개시되어 있으며, 대한민국 공개특허 제10-2013-0108826호에는 '주름 생성 억제능을 갖는 봉독과 피부 보습효과를 갖는 로열젤리를 유효성분으로 함유하는 피부 노화 억제용 화장료 조성물'이 개시되어 있고, 대한민국 공개특허 제10-2015-0136857호에는 '알레르기 유발 단백질이 제거된 수용성 로열젤리를 포함하는 피부 미백 및 노화방지용 화장료 조성물'이 개시되어 있다.
Celeste C. I. et al., 2014
본 발명의 일 목적은 로얄젤리의 락토바실러스 발효 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 개선용 화장료 조성물을 제공하고자 한다.
본 발명의 다른 목적은 로얄젤리의 락토바실러스 발효 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 개선용 화장료 조성물의 제조 방법을 제공하고자 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명의 일 구현 예에 따르면, 로얄젤리 추출물; 및 레몬타임과 허니로커스트의 복합 추출물을 락토바실러스 균주로 발효한 발효 추출물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 로얄젤리 추출물 또는 상기 레몬타임과 허니로커스트의 복합 추출물은 로얄젤리 또는 레몬타임과 허니로커스트의 혼합물에 물, 탄소수 1 내지 4의 무수알코올, 에틸아세테이트, 아세톤, 글리세린, 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜, 카프릴릭/카프릭트리글리세라이드, 디메치콘, 미네랄오일, 사이클로메치콘, 옥틸도데칸올, 세틸에칠헥사노에이트, 트리레칠헥사노인, 이소프로필미리스테이트 및 식물성 오일로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 추출 용매를 처리하여 수득된 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 레몬타임과 허니로커스트의 복합 추출물은 레몬타임과 허니로커스트를 1~3:1~3의 중량비로 혼합한 혼합물을 추출한 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 로얄젤리 추출물은 가수분해 효소 처리된 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 가수분해 효소는 β-글루코시다아제일 수 있다.
본 발명에서 상기 락토바실러스 균주는 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei), 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 람노수스(Lactobacillus rhamnosus) 및 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있다.
본 발명에서 상기 발효 추출물은 로얄락틴(Royalactin)을 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 화장료 조성물은 피부 생기 부여, 피부 활력 증진, 피부 수렴용, 주름 개선용, 피부 장벽 강화 또는 장벽 기능 보호, 피부 재생, 보습, 탄력 유지, 항산화, 항노화의 피부 개선용일 수 있다.
본 발명의 다른 구현 예에 따르면, 로얄젤리 추출물을 준비하는 단계; 레몬타임과 허니로커스트의 복합 추출물을 준비하는 단계; 상기 로얄젤리 추출물 및 상기 레몬타임과 허니로커스트의 복합 추출물을 혼합하여 추출 혼합물을 얻는 단계; 및 상기 추출 혼합물을 락토바실러스 균주로 발효하여 발효 추출물을 얻는 단계를 포함하는 화장료 조성물의 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 로얄젤리 추출물 또는 상기 레몬타임과 허니로커스트의 복합 추출물은 로얄젤리 또는 레몬타임과 허니로커스트의 혼합물에 물, 탄소수 1 내지 4의 무수알코올, 에틸아세테이트, 아세톤, 글리세린, 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜, 카프릴릭/카프릭트리글리세라이드, 디메치콘, 미네랄오일, 사이클로메치콘, 옥틸도데칸올, 세틸에칠헥사노에이트, 트리레칠헥사노인, 이소프로필미리스테이트 및 식물성 오일로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 추출 용매를 처리하여 수득된 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 로얄젤리 추출물은 로얄젤리 중량의 1 내지 100 배의 추출 용매를 첨가한 뒤, 20 내지 40℃의 추출 온도에서 120분 내지 180분 동안 추출하여 얻어지는 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 레몬타임과 허니로커스트의 복합 추출물은 레몬타임과 허니로커스트를 1~3:1~3의 중량비로 혼합한 혼합물을 추출한 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 레몬타임과 허니로커스트의 복합 추출물은 레몬타임과 허니로커스트의 혼합물 중량의 1 내지 100 배의 추출 용매를 첨가한 뒤, 80 내지 100℃의 추출 온도에서 100분 내지 120분 동안 추출하여 얻어지는 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 제조 방법은, 상기 로얄젤리 추출물 또는 상기 레몬타임과 허니로커스트의 복합 추출물을 여과지에 1회 내지 10회 여과하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 제조 방법은, 상기 로얄젤리 추출물을 가수분해 효소 처리하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 가수분해 효소는 β-글루코시다아제일 수 있다.
본 발명에서 상기 가수분해 효소 처리하는 단계는 30 내지 40℃에서 10분 내지 480분 동안 교반한 뒤, 70 내지 100℃에서 30초 내지 5분간 가온하며 수행될 수 있다.
본 발명에서 상기 락토바실러스 균주는 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei), 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 람노수스(Lactobacillus rhamnosus) 및 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있다.
본 발명에서 상기 발효는 pH 5.0 내지 6.0, 35 내지 40℃의 온도 조건 하에서 12 내지 96시간 동안 수행될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 로얄젤리 추출물; 및 레몬타임과 허니로커스트의 복합 추출물을 락토바실러스 균주로 발효한 발효 추출물을 유효성분으로 포함하는 식품 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 제공하는 조성물은 천연 물질로부터 제조되어 피부에 적용 시 세포 독성이 없어 안전할 뿐만 아니라, 피부 보습, 피부 장벽 강화 및 주름 개선 등 피부 개선 효능이 매우 우수하므로 항노화 화장료로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 실험예 7에서 본 발명의 일 실시예에 따른 혼합 발효 추출물 내에 로얄락틴 단백질이 함유되어 있는 지 확인한 실험 결과의 사진을 나타낸 것이다.
도 2는 실시예 5 및 6에서 제조한 제형에 대하여 실온(25℃), 냉장(4℃), 항온(50℃) 및 온도 순환 조건(-5 ~ 50℃)에서 불투명 초자 용기에 담아 0 및 24주 동안 보관한 후 촬영한 사진이다.
도 2는 실시예 5 및 6에서 제조한 제형에 대하여 실온(25℃), 냉장(4℃), 항온(50℃) 및 온도 순환 조건(-5 ~ 50℃)에서 불투명 초자 용기에 담아 0 및 24주 동안 보관한 후 촬영한 사진이다.
본 발명의 일 구현 예에 따르면, 로얄젤리 추출물; 및 레몬타임과 허니로커스트의 복합 추출물을 락토바실러스 균주로 발효한 발효 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 개선용 화장료 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 "로얄젤리"는 꿀벌 유충의 영양 섭취에 사용되는 꿀벌의 분비물로, 젊은 일벌의 머리 부분에 잇는 인두선에서 분비되며, 단백질, 당질이 주요 구성으로서, 비타민 A, B1, B2 가 풍부하고 수분, 지질, 당질, 회분, 효소, 호르몬, 스테로이드 등을 함유한다.
본 발명에서 상기 "레몬타임(Lemon Thyme, Thymus citriodorus)"은 꿀풀과의 여러해살이 풀이며, 레몬향이 나는 특성이 있어 향신료, 샐러드, 허브차 등에 사용된다. 또한 탈취제, 방부제, 항균제 등에 사용되었으며, 항산화 효능이 알려져 있다. 주요 성분으로는 phenolic compounds, geraniol, nerol, citronellol 등이 알려져 있다(S. Kizil et al., 2016; Olivia R. P. et al., 2010).
본 발명에서 상기 "허니로커스트(Honey locust, Gleditsia Triacanthos)"는 콩과 식물로, 단단하고 빠르게 성장하므로 관상용 나무로 널리 사용된다. 예로부터 아메리카 원주민의 백일해, 통증, 홍역, 천연두 둥의 치료를 위해 사용되어 왔다. Gleditsia 식물은 항암, 항염증, 항알러지, 항산화, 항균 등의 효능이 보고된 바 있으며, 주요 성분으로는 트리테르펜(triterpenes), 스테롤(sterols), 플라보노이드(flavonoids), 알칼로이드(alkaloid) 및 페놀 화합물(phenolic compounds) 등이 알려져 있다(Jian-Ping Z et al., 2016).
본 발명에서 상기 로얄젤리 추출물, 또는 레몬타임과 허니로커스트의 복합 추출물 각각은 로얄젤리, 또는 레몬타임과 허니로커스트의 혼합물에 추출 용매를 처리하여 수득하여 얻이질 수 있고, 이때 다양한 추출 용매가 이용될 수 있다.
본 발명에서 상기 추출 용매로는 극성 용매 또는 비극성 용매를 이용할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에서 상기 로얄젤리 추출물 또는 레몬타임과 허니로커스트의 복합 추출물 각각은 로얄젤리, 또는 레몬타임과 허니로커스트의 혼합물에 물, 탄소수 1 내지 4의 무수알코올, 에틸아세테이트, 아세톤, 글리세린, 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜, 카프릴릭/카프릭트리글리세라이드, 디메치콘, 미네랄오일, 사이클로메치콘, 옥틸도데칸올, 세틸에칠헥사노에이트, 트리레칠헥사노인, 이소프로필미리스테이트 및 식물성 오일로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 추출 용매를 처리하여 수득된 것일 수 있다.
본 발명에서 추출 방법으로는 냉침 추출, 열 추출, 초음파 추출, 환류 냉각 추출 등 당업계에서 당업자에 의해 통상적으로 사용하는 모든 추출 방법을 사용할 수 있다.
본 발명에서 상기 추출 방법의 일 예시로, 상기 로얄젤리 중량의 1 내지 100 배, 바람직하게는 5 내지 50배의 추출 용매를 첨가한 뒤, 20 내지 40℃의 추출 온도에서 120분 내지 180분 동안 추출하는 것이 상기 로얄젤리에 포함되는 로얄락틴에 변성 없이 추출할 수 있어 바람직하다.
본 발명에서 상기 추출 방법의 다른 일 예시로, 상기 레몬타임과 허니로커스트의 혼합물 중량의 1 내지 100 배, 바람직하게는 5 내지 50배의 추출 용매를 첨가한 뒤, 80 내지 100℃의 추출 온도에서 100분 내지 120분 동안 추출할 수 있다.
본 발명에서 상기 “추출물”은 상술한 바와 같이 당업계에서 조추출물(crude extract)로 통용되는 의미를 갖지만, 광의적으로는 추출물을 추가적으로 분획(fractionation)한 분획물도 포함한다. 즉, 로얄젤리 추출물 또는 레몬타임과 허니로커스트의 복합 추출물은 상술한 추출 용매를 이용하여 얻은 것뿐만 아니라, 여기에 정제 과정을 추가적으로 적용하여 얻은 것도 포함한다. 예컨대, 상기 추출물을 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 통과시켜 얻은 분획, 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등, 추가적으로 실시된 다양한 정제 방법을 통해 얻어진 분획도 본 발명의 로얄젤리 추출물 또는 레몬타임과 허니로커스트의 복합 추출물에 포함되는 것이다.
본 발명에서 이용되는 로얄젤리 추출물 또는 레몬타임과 허니로커스트의 복합 추출물은 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조될 수 있다.
한편, 본 발명의 추출물은 상기한 추출 용매뿐만 아니라, 다른 추출 용매를 이용하여도 실질적으로 동일한 효과를 나타내는 본 발명의 추출물이 얻어질 수 있다는 것은 당업자에게 자명한 것이다.
또한, 본 발명에서 상기 로얄젤리 추출물은 가수분해 효소 처리된 것일 수 있다. 여기서 상기 가수분해 효소는 β-글루코시다아제일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 가수분해 효소 처리는 30 내지 40℃에서 10분 내지 480분, 바람직하게는 180분 내지 240분 동안 교반한 뒤, 70 내지 100℃에서 30초 내지 5분간 가온하며 수행될 수 있다.
본 발명에서 상기 레몬타임 추출물의 제조에 사용되는 레몬타임의 부위는 특별히 제한하지 않으며, 뿌리, 줄기, 잎, 꽃, 종자 및/또는 열매가 모두 사용 가능하나, 바람직하게는 꽃, 잎 또는 전초를 사용할 수 있다.
본 발명에서 상기 허니로커스트 추출물의 제조에 사용되는 허니로커스트의 부위는 특별히 제한하지 않으며, 뿌리, 줄기, 잎, 꽃, 종자 및/또는 열매가 모두 사용 가능하나, 바람직하게는 종자 또는 목부를 사용할 수 있다.
본 발명에서 상기 레몬타임과 허니로커스트의 복합 추출물은 레몬타임과 허니로커스트를 1~3:1~3의 중량비, 바람직하게는 1:2~3의 중량비, 보다 바람직하게는 1:3의 중량비로 혼합한 혼합물을 추출한 것일 수 있다.
본 발명의 각 추출물은 필요에 따라서는 여과지에 1회 내지 10회, 바람직하게는 1회 내지 5회 여과된 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 발효 추출물은 로얄젤리 추출물, 바람직하게는 상기와 같이 가수분해 효소 처리된 로얄젤리 추출물 및 레몬타임과 허니로커스트의 복합 추출물, 바람직하게는 이들의 추출 혼합물을 락토바실러스 균주로 발효하여 얻어진 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 발효 시 사용되는 상기 락토바실러스 균주는 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei), 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 람노수스(Lactobacillus rhamnosus) 및 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있고, 바람직하게는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 또는 이를 포함하는 혼합 균주일 수 있다.
본 발명에서 상기 발효는 pH 5.0 내지 6.0의 조건 하에서 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에서 상기 발효는 35 내지 40℃의 온도 조건에서 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에서 상기 발효는 12 내지 96시간, 바람직하게는 48 내지 72시간 동안 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 피부 개선용 화장료 조성물 또는 상기 발효 추출물은 로얄락틴(Royalactin)을 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 상기 “유효성분으로 포함하는”이란 하기의 발효 추출물의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 포함하는 것을 의미한다. 본 발명의 조성물에 포함된 발효 추출물의 양적 상한은 당업자가 적절한 범위 내에서 선택하여 실시할 수 있다. 다만, 본 발명에서 피부 개선용 화장료 조성물이 그 효과를 발휘하기 위해서는 상기 발효 추출물은 조성물 총 중량에 대하여 0.001 내지 50 중량%, 바람직하게는 0.01 내지 15 중량%로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 "피부 개선"은 피부 생기 부여, 피부 활력 증진, 피부 수렴용, 주름 개선용, 피부 장벽 강화 또는 장벽 기능 보호, 피부 재생, 보습, 탄력 유지, 항산화, 항노화 등 다양한 피부 활성 개선 기능을 포함한다.
본 발명에서 상기 피부 개선용 화장료 조성물은 약학, 화장료 또는 식품 조성물의 다양한 용도로 이용될 수 있다.
본 발명의 다른 구현 예에 따르면, 로얄젤리 추출물을 준비하는 단계; 레몬타임과 허니로커스트의 복합 추출물을 준비하는 단계; 상기 로얄젤리 추출물 및 상기 레몬타임과 허니로커스트의 복합 추출물을 혼합하여 추출 혼합물을 얻는 단계; 및 상기 추출 혼합물을 락토바실러스 균주로 발효하여 발효 추출물을 얻는 단계를 포함하는 피부 개선용 화장료 조성물의 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 로얄젤리 추출물 및 상기 레몬타임과 허니로커스트의 복합 추출물을 준비하는 단계 시 상기 추출은 로얄젤리 또는 레몬타임과 허니로커스트의 혼합물 각각에 추출 용매를 처리하여 수득하며 수행될 수 있고, 이 경우 다양한 추출 용매가 이용될 수 있다.
본 발명에서 상기 추출 용매로는 극성 용매 또는 비극성 용매를 이용할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에서 상기 로얄젤리 추출물 또는 상기 레몬타임과 허니로커스트의 복합 추출물 각각은 로얄젤리 또는 레몬타임과 허니로커스트의 혼합물에 물, 탄소수 1 내지 4의 무수알코올, 에틸아세테이트, 아세톤, 글리세린, 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜, 카프릴릭/카프릭트리글리세라이드, 디메치콘, 미네랄오일, 사이클로메치콘, 옥틸도데칸올, 세틸에칠헥사노에이트, 트리레칠헥사노인, 이소프로필미리스테이트 및 식물성 오일로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 추출 용매를 처리하여 수득된 것일 수 있다.
본 발명에서 추출 방법으로는 냉침 추출, 열 추출, 초음파 추출, 환류 냉각 추출 등 당업계에서 당업자에 의해 통상적으로 사용하는 모든 추출 방법을 사용할 수 있다.
본 발명에서 상기 추출 방법의 일 예시로, 상기 로얄젤리 중량의 1 내지 100 배, 바람직하게는 5 내지 50배의 추출 용매를 첨가한 뒤, 20 내지 40℃의 추출 온도에서 120분 내지 180분 동안 추출하는 것이 상기 로얄젤리에 포함되는 로얄락틴에 변성 없이 추출할 수 있어 바람직하다.
본 발명에서 상기 추출 방법의 다른 일 예시로, 상기 레몬타임과 허니로커스트의 혼합물 중량의 1 내지 100 배, 바람직하게는 5 내지 50배의 추출 용매를 첨가한 뒤, 80 내지 100℃의 추출 온도에서 100분 내지 120분 동안 추출할 수 있다.
본 발명에서 이용되는 로얄젤리 추출물 또는 레몬타임과 허니로커스트의 복합 추출물은 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조될 수 있다.
한편, 본 발명의 추출물은 상기한 추출 용매뿐만 아니라, 다른 추출 용매를 이용하여도 실질적으로 동일한 효과를 나타내는 본 발명의 추출물이 얻어질 수 다는 것은 당업자에게 자명한 것이다.
본 발명의 제조 방법은 상기 로얄젤리 추출물을 가수분해 효소 처리하는 단계를 더 포함할 수 있다. 여기서 상기 가수분해 효소는 β-글루코시다아제일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 가수분해 효소 처리하는 단계는 30 내지 40℃에서 10분 내지 480분, 바람직하게는 180분 내지 240분 동안 교반한 뒤, 70 내지 100℃에서 30초 내지 5분간 가온하며 수행될 수 있다.
본 발명에서 상기 레몬타임 추출물의 제조에 사용되는 레몬타임의 부위는 특별히 제한하지 않으며, 뿌리, 줄기, 잎, 꽃, 종자 및/또는 열매가 모두 사용 가능하나, 바람직하게는 꽃, 잎 또는 전초를 사용할 수 있다.
본 발명에서 상기 허니로커스트 추출물의 제조에 사용되는 허니로커스트의 부위는 특별히 제한하지 않으며, 뿌리, 줄기, 잎, 꽃, 종자 및/또는 열매가 모두 사용 가능하나, 바람직하게는 종자 또는 목부를 사용할 수 있다.
본 발명에서 상기 레몬타임과 허니로커스트의 복합 추출물은 레몬타임과 허니로커스트를 1~3:1~3의 중량비, 바람직하게는 1:2~3의 중량비, 보다 바람직하게는 1:3의 중량비로 혼합한 혼합물을 추출한 것일 수 있다.
본 발명의 제조 방법은, 필요에 따라서는 얻어진 각 추출물을 여과지에 1회 내지 10회, 바람직하게는 1회 내지 5회 여과하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 발효 추출물을 얻는 단계 시 사용되는 상기 락토바실러스 균주는 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei), 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 람노수스(Lactobacillus rhamnosus) 및 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있고, 바람직하게는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 또는 이를 포함하는 혼합 균주일 수 있다.
본 발명에서 상기 발효는 pH 5.0 내지 6.0의 조건 하에서 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에서 상기 발효는 35 내지 40℃의 온도 조건에서 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에서 상기 발효는 12 내지 96시간, 바람직하게는 48 내지 72시간 동안 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 제조 방법에서 최종 제조되는 피부 개선용 화장료 조성물 또는 상기 발효 추출물은 로얄락틴(Royalactin)을 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 상기와 같이 제조된 피부 개선용 화장료 조성물은 피부 생기 부여, 피부 활력 증진, 피부 수렴용, 주름 개선용, 피부 장벽 강화 또는 장벽 기능 보호, 피부 재생, 보습, 탄력 유지, 항산화, 항노화 등 다양한 피부 활성 개선 기능을 가진다.
본 발명에 있어서, 상기한 바와 같이 본 발명에 따른 피부 개선용 화장료 조성물은 약학 조성물로 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기한 바와 같이 본 발명의 피부 개선용 조성물은 화장료 조성물로 사용할 수 있다. 여기서 상기 화장료 조성물은 화장수, 영양로션, 영양에센스, 마사지 크림, 미용목욕물첨가제, 바디로션, 바디밀크, 배스오일, 베이비오일, 베이비파우더, 샤워겔, 샤워크림, 선스크린로션, 선스크린크림, 선탠크림, 스킨로션, 스킨크림, 자외선차단용 화장품, 크렌징밀크, 탈모제{화장용}, 페이스 및 바디로션, 페이스 및 바디크림, 피부미백크림, 핸드로션, 헤어로션, 화장용크림, 쟈스민오일, 목욕비누, 물비누, 미용비누, 샴푸, 손세정제(핸드클리너), 약용비누{비의료용}, 크림비누, 페이셜 워시, 전신 세정제, 두피 세정제, 헤어린스, 화장비누, 치아미백용 겔, 치약 등의 형태로 제조될 수 있다. 이를 위해 본 발명의 조성물은 화장료 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 용매나, 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예
[제조예 1] 로얄젤리 추출물의 제조
로얄젤리 1g에 추출 용매로서 정제수를 50배 중량을 가하고 냉각 콘덴서가 달린 추출기(Cosmos-660, 경서기계)에서 95℃로 가열하여 100분 동안 추출하였다. 침전물을 300메쉬 여과지로 여과하고, 침전물을 에드벤텍 5번 여과지와 와트만 GFC 150mm 여과지로 2번 여과하여 추출물을 제조하였다.
[제조예 2] 가수분해 효소 처리된 로얄젤리 추출물의 제조
로얄젤리 1g에 추출 용매로서 정제수를 50배 중량을 가하고 30℃의 온도에서 120분 동안 추출하였다. 이후 아세테이트 버퍼(acetate buffer, pH 4.0) 100ml와 β-글루코시다아제 효소 10ml를 넣어 35℃에서 100rpm으로 240분 동안 반응시켰다. 다음으로 90℃로 3분간 가온하여 효소 반응을 완료하였다. 300메쉬 여과지로 여과하고, 침전물을 에드벤텍 5번 여과지와 와트만 GFC 150mm 여과지로 2번 여과하여 추출물을 제조하였다.
[제조예 3] 레몬타임 추출물의 제조
건조된 레몬타임 꽃과 잎 혼합물 100g에 추출 용매로서 정제수를 5배 중량을 가하고 냉각 콘덴서가 달린 추출기에서 95℃로 가열하여 100분 동안 추출하였다. 침전물을 300메쉬 여과지로 여과하고, 침전물을 에드벤텍 5번 여과지와 와트만 GFC 150mm 여과지로 2번 여과하여 추출물을 제조하였다.
[제조예 4] 허니로커스트 추출물의 제조
건조된 허니로커스트 씨 100g에 추출 용매로서 정제수를 5배 중량을 가하고 냉각 콘덴서가 달린 추출기에서 95℃로 가열하여 100분 동안 추출하였다. 침전물을 300메쉬 여과지로 여과하고, 침전물을 에드벤텍 5번 여과지와 와트만 GFC 150mm 여과지로 2번 여과하여 추출물을 제조하였다.
[제조예 5 내지 9] 레몬타임 및 허니로커스트의 복합 추출물의 제조
건조된 레몬타임 꽃과 잎 혼합물 및 허니로커스트 씨를 표 1의 중량비로 혼합한 후(100g), 추출 용매로서 정제수를 5배 중량을 가하고 냉각 콘덴서가 달린 추출기에서 95℃로 가열하여 100분 동안 추출하였다. 침전물을 300메쉬 여과지로 여과하고, 침전물을 에드벤텍 5번 여과지와 와트만 GFC 150mm 여과지로 2번 여과하여 추출물을 제조하였다.
| 중량비 | 레몬타임 | 허니로커스트 |
| 제조예 5 | 1 | 1 |
| 제조예 6 | 2 | 1 |
| 제조예 7 | 3 | 1 |
| 제조예 8 | 1 | 2 |
| 제조예 9 | 1 | 3 |
[제조예 10] 가수분해 효소처리 로얄젤리 추출물과 레몬타임 및 허니로커스트 복합 추출물의 혼합물 제조
상기 제조예 2에서 제조된 가수분해 효소처리된 로얄젤리 추출물에, 상기 제조예 9에서 제조된 레몬타임 및 허니로커스트의 복합 추출물을 충분히 식혀 동량 가하였다. 이후 에드벤텍 5번 여과지와 와트만 GFC 150mm 여과지로 여과하여 혼합물을 제조하였다.
[실시예 1 내지 4] 가수분해 효소처리 로얄젤리 추출물과 레몬타임 및 허니로커스트 복합 추출물의 락토바실러스 혼합 발효 추출물의 제조
상기 제조예 10에서 제조된, 가수분해 효소처리 로얄젤리 추출물과 레몬타임 및 허니로커스트 복합 추출물의 혼합물에 락토바실러스 균주를 최종 농도 1×106 CFU/ml이 되도록 접종한 후, pH 5.0, 혐기 조건 37℃에서 48 시간 동안 발효하였다. 각 발효물 제조에 사용된 락토바실러스 균주는 하기 표 2와 같이 락토바실러스 사케이(실시예 1), 락토바실러스 카세이(실시예 2), 락토바실러스 람노수스(실시예 3) 또는 락토바실러스 플란타룸(실시예 4)에 해당하였다. 이후 95℃, 5분 조건에서 실활하여 냉침한 후 여과지를 이용하여 여과하여 혼합 발효 추출물을 제조하였다.
| 구분 | 발효 시 사용한 균주 |
| 실시예 1 | Lactobacillus sakei |
| 실시예 2 | Lactobacillus casei |
| 실시예 3 | Lactobacillus rhamnosus |
| 실시예 4 | Lactobacillus plantarum |
[비교예 1 내지 5] 가수분해 효소처리 로얄젤리 추출물과 레몬타임 및 허니로커스트 복합 추출물의 혼합 발효 추출물 제조
제조예 10의 가수분해 효소처리 로얄젤리 추출물과 레몬타임 및 허니로커스트 복합 추출물의 혼합물에 미생물이 최종 농도 1×106 CFU/ml이 되도록 접종한 후, 48시간 동안 발효하였다. 이때 사용된 발효 균주 및 발효 조건은 하기 표 3에 나타내었다. 이후 95℃, 5분 조건에서 실활하여 냉침한 후 여과지를 이용하여 여과하여 혼합 발효 추출물을 제조하였다.
| 구분 | 발효 시 사용한 균주 | 온도 | 조건 |
| 비교예 1 | Bifidobacterium longum | 37℃ | 혐기 |
| 비교예 2 | Saccharomyces cerevisiae | 25℃ | 호기 |
| 비교예 3 | Bacillus subtilis | 25℃ | 호기 |
| 비교예 4 | Streptococcus thermophilus | 37℃ | 혐기 |
| 비교예 5 | Aspergillus oryzae | 25℃ | 호기 |
[실험예 1] 세포 독성 여부 확인
세포 독성 여부를 확인하기 위해 각질세포주인 HaCaT와 섬유아세포인 NHDF(normal human dermal fibroblast)를 10% FBS를 첨가한 DMEM 배지에 배양하였으며, 96 웰 플레이트에 각각 5105 및 3104의 세포 농도로 접종하여 37℃ 및 5% CO2 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 배지를 제거하고 상기 세포에 제조예 1 내지 10, 실시예 1 내지 4 및 비교예 1 내지 5에서 제조한 추출물을 농도가 0.1 또는 1.0% 가 되도록 디메틸설폭시드에 희석하여 제조한 희석 용액을 처리하여 24시간 배양한 후에, MTT(3-[4,5-dimethylthiazol-2yl]-2,5-diphenyltetrazoliumboromide, Sigma) 용액을 각 웰에 100 ㎖씩 첨가한 후(3 ㎎/㎖) 4시간 동안 더 배양하였다. 이후 상층액을 제거하고, 150 ㎕의 디메틸 설폭시드를 첨가한 후, 30분간 쉐이킹(shaking)하여 생성된 포마잔(formazan)을 녹여 멀티마이크로플레이트 리더(Molecular device Spectra max190)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포생존율은 아래의 식에 따라 계산하였으며 그 결과는 하기의 표 4에 나타내었다.
세포 생존율(%)=시료 첨가군의 흡광도 / 대조군의 흡광도 100
| 구분 | 세포 생존율(%) | |||
| HaCAT | NHDF | |||
| 0.1% | 1.0% | 0.1% | 1.0% | |
| 대조군 | 100 | |||
| 제조예 1 | 100 | 101 | 98 | 98 |
| 제조예 2 | 100 | 100 | 99 | 100 |
| 제조예 3 | 101 | 100 | 102 | 101 |
| 제조예 4 | 100 | 99 | 101 | 102 |
| 제조예 5 | 99 | 97 | 100 | 100 |
| 제조예 6 | 100 | 99 | 100 | 98 |
| 제조예 7 | 101 | 98 | 101 | 99 |
| 제조예 8 | 102 | 100 | 102 | 97 |
| 제조예 9 | 100 | 101 | 99 | 100 |
| 제조예 10 | 101 | 100 | 98 | 101 |
| 비교예 1 | 100 | 100 | 100 | 102 |
| 비교예 2 | 99 | 97 | 99 | 103 |
| 비교예 3 | 101 | 100 | 101 | 100 |
| 비교예 4 | 100 | 99 | 102 | 100 |
| 비교예 5 | 100 | 101 | 100 | 99 |
| 실시예 1 | 102 | 100 | 101 | 98 |
| 실시예 2 | 99 | 98 | 100 | 98 |
| 실시예 3 | 100 | 100 | 98 | 100 |
| 실시예 4 | 100 | 101 | 99 | 98 |
상기 표 4의 결과에서 보는 바와 같이, 적용한 시료 모두 95% 이상의 세포 생존율을 나타냄에 따라 인간 피부 유래 세포의 세포 독성에는 영향을 미치지 않는 것으로 확인되었고, 이에 안전에는 문제가 없는 것을 확인하였다.
[실험예 2] 히알루로난 합성효소-3(Hyaluronan Synthase-3; HAS-3)의 발현 증가 효과 확인
인간 섬유아세포 NHDF를 10% FBS가 첨가된 DMDM 배지를 이용하여 5×105 세포/웰로 조절한 후 12 웰 플레이트에 접종하고 18시간 동안 배양하였다. 배양한 뒤 상기 제조예 1 내지 10, 실시예 1 내지 4 및 비교예 1 내지 5의 추출물을 처리하고 24시간 동안 배양하였다. 배양된 세포에서 RNA를 추출하여 역전사 중합효소 연쇄 반응(Reverse transcription polymerase chain reaction; RT-PCR)을 통해 히알루로난 합성효소-3(Hyaluronan Synthase-3; HAS-3)의 발현 증가율을 확인하였다. 유전자 발현의 차이를 확인하기 위해 항존 유전자로 글리세랄데하이드 3-포스페이트 디하이드로제네이즈(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase; GAPDH)를 사용하였다. 각각의 유전자의 프라이머 서열은 표 5에 나타냈다. 추출된 RNA를 주형으로 올리고 dT-어댑터 프라이머(Oligo dT-adaptor primer)와 DEPC 워터(water)를 이용하여 총량 15㎕로 하고 70℃, 10분 변성 후, M-MLV(Moloney murine leukemia virus) RNA의 역전사를 수행하여 42℃, 60분; 70℃, 15분 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA는 PCR 반응을 통해 증폭하였으며, 총 반응액은 25 ㎕로 하였다. 각 반응물의 최종 농도는 프라이머 100 pmol, 1.0μM, dNTP 혼합액 0.2mM, 5x 녹색 또는 무색 GoTaq 반응 버퍼 1x1.5mM, MgCl2(PCR완충액) 및 GoTaq DNA 폴리머라제 1.25 유닛이었다. 변성(Denaturation), 어닐링(annealing) 및 익스텐션(extension)에 대한 PCR 반응 조건은 다음과 같으며, 95℃, 2분; 95℃, 30초; 60℃, 30초; 72℃, 1분; 72℃, 5분; 30~40 사이클로 수행하였다. PCR 반응 후 생성물의 10㎕를 2% 아가로즈 겔(agarose gel)에서 전기영동 하였다. Gel Documentation system(코리아랩텍, Cat. No DGS-200D)을 이용하여 발현 양을 확인했다. HAS-3 발현 증가율은 하기 식에 의해 산출되었고, 그 결과는 표 6에 나타내었다. 대조군으로는 히알루론산(Hyaluronic Acid)을 사용하였다.
HAS-3 발현 증가율(%)=(시료참가군의 HAS-3 발현 양/대조군의 HAS-3 발현 양) × 100
| 프라이머 이름 | 염기서열 |
| GAPDH | Forward : GGCATTGCTCTCAATGACAA |
| Reverse : TGTGAGGGAGATGCTCAGTG | |
| HAS-3 | Forward : GGGCATTATCAAGGCCACCTA |
| Reverse : CAGATTTGTTGATGGTAGCAATGG | |
| TGase-1 | Forward : TGATCGCATCACCCTTGAGT |
| Reverse : GTAGATCTCATTGCGGGGGT | |
| MMP-1 | Forward : GGTGATGAAGCAGCCCAG |
| Reverse : CAGTAGAATGGGAGAGTC |
| 구분 | HAS-3 증가율(%) | |
| 0.1% | 1.0% | |
| 제조예 1 | 24 | 32 |
| 제조예 2 | 30 | 36 |
| 제조예 3 | 22 | 31 |
| 제조예 4 | 25 | 34 |
| 제조예 5 | 35 | 46 |
| 제조예 6 | 36 | 45 |
| 제조예 7 | 35 | 46 |
| 제조예 8 | 39 | 49 |
| 제조예 9 | 43 | 52 |
| 제조예 10 | 52 | 68 |
| 비교예 1 | 55 | 70 |
| 비교예 2 | 56 | 71 |
| 비교예 3 | 55 | 72 |
| 비교예 4 | 54 | 70 |
| 비교예 5 | 55 | 71 |
| 실시예 1 | 64 | 82 |
| 실시예 2 | 66 | 83 |
| 실시예 3 | 65 | 82 |
| 실시예 4 | 70 | 88 |
| 히알루론산 | 71 | 90 |
상기 표 6에서 보는 바와 같이, 로얄젤리 열수 추출물을 함유하는 제조예 1 보다 가수분해 효소처리 로얄젤리 추출물을 함유하는 제조예 2에서 더 우수한 HAS-3 발현 증가율을 나타냈었다. 또한 레몬타임 또는 허니로커스트 각각의 추출물(제조예 3 내지 4) 보다 이들의 복합 추출물(제조예 5 내지 9)을 처리한 경우가 HAS-3 발현 수준이 더욱 증가하였으며, 이 중 레몬타임과 허니로커스트를 1:3의 중량비로 혼합하여 제조한 복합 추출물(제조예 9)에서 발현 수준의 증가 효과가 가장 뛰어났다.
한편, 가수분해 효소처리 로얄젤리 추출물과 레몬타임 및 허니로커스트 복합 추출물을 혼합한 제조예 10의 경우 앞서 설명한 제조예보다 우수한 HAS-3 발현량 증가 효과를 나타내으나, 이러한 복합 추출물을 균주로 발효시킨 발효물을 처리한 경우(실시예 1 내지 4 및 비교예 1 내지 5)가 HAS-3 발현 수준이 더욱 증가하였지만, 실시예 1 내지 4와 같이 락토바실러스 균주로 발효한 경우가 HAS-3 발현 수준이 현저하게 증가하였으며, 특히 락토바실러스 플란타룸으로 발효시킨 실시예 4에서 가장 우수한 HAS-3 발현 증가 효과를 확인할 수 있었다.
[실험예 3] 트랜스글루타미나제-1(Transglutaminase-1; TGase-1)의 유전자 발현 증가 효과 확인
인간 각질세포주 HaCaT을 10% FBS가 첨가된 DMDM 배지를 이용하여 5×105 세포/웰로 조절한 후 12 웰 플레이트에 접종하고 18시간 동안 배양하였다. 배양한 뒤 상기 제조예 1 내지 10, 실시예 1 내지 4 및 비교예 1 내지 5의 추출물을 처리하고 24시간 동안 배양하였다. 배양된 세포에서 RNA를 추출하여 RT-PCR을 통해 트랜스글루타미나제-1(Transglutaminase-1; TGase-1)의 발현 증가율을 확인하였다. 유전자 발현의 차이를 확인하기 위해 항존 유전자로 GAPDH를 사용하였다. 각각의 유전자의 프라이머 서열은 상기 표 5에 나타냈다. TGase-1 발현 증가율은 하기 식에 의해 산출되었고, 그 결과는 표 7에 나타내었다.
TGase-1 발현 증가율(%)=(시료 첨가군의 TGase-1 발현양/ 대조군의 TGase-1 발현양) × 100
| 구분 | TGase-1 증가율(%) | |
| 0.1% | 1.0% | |
| 제조예 1 | 11 | 13 |
| 제조예 2 | 15 | 20 |
| 제조예 3 | 8 | 10 |
| 제조예 4 | 12 | 15 |
| 제조예 5 | 23 | 29 |
| 제조예 6 | 22 | 30 |
| 제조예 7 | 24 | 30 |
| 제조예 8 | 28 | 33 |
| 제조예 9 | 32 | 38 |
| 제조예 10 | 44 | 51 |
| 비교예 1 | 48 | 54 |
| 비교예 2 | 49 | 53 |
| 비교예 3 | 48 | 55 |
| 비교예 4 | 47 | 54 |
| 비교예 5 | 49 | 55 |
| 실시예 1 | 54 | 68 |
| 실시예 2 | 56 | 67 |
| 실시예 3 | 56 | 69 |
| 실시예 4 | 63 | 75 |
상기 표 7에서 보는 바와 같이, 실시예 1 내지 4로 가수분해 효소 처리된 로얄젤리 추출물과 레몬타임 및 허니로커스트 복합 추출물의 혼합물을 락토바실러스 균주로 발효 시킨 혼합 발효 추출물을 처리한 경우가, 다른 제조예 1 내지 10 또는 비교예 1 내지 5를 처리한 경우에 비하여 TGase-1 발현 수준이 현저히 증가하였으며, 특히 락토바실러스 플라타룸으로 발효한 실시예 4에서 TGase-1 발현 증가 효과가 가장 뛰어났다.
[실험예 4] 히알루로니다제(Hyaluronidase)의 활성 억제 효과 확인
히알루로니다제(Hyaluronidase)의 활성 억제 효과는 Morgan-Elson법을 응용하여 다음과 같이 확인하였다. 구체적으로, 히알루로니다제의 최종 효소 활성을 400 NF unit/㎖, HA의 최종 농도를 0.4 ㎎/㎖로 하고 활성제인 Compound 48/80 완충(buffer) 용액(0.1 ㎎/㎖)을 사용하여 불활성형 히알루로니다제의 활성화 단계의 저해 작용을 중심으로 히알루로니다제 활성을 측정하였다. 시료인 상기 제조예 1 내지 10, 실시예 1 내지 4 및 비교예 1 내지 5의 추출물을 완충 용액(buffer)에 용해하여 시료 용액으로 하고 대조군으로는 히알루론산을 사용하였다. 히알루로니다제의 활성 저해율(%)은 아래의 수학식으로 계산하였으며, 그 결과는 표 8에 나타내었다.
히알루로니다제 활성 저해율(%) = {(대조군의 히알루로니다제 효소 활성 - 시료 첨가군의 히알루로니다제 효소활성) / 대조군의 히알루로니다제 효소 활성} × 100
| 구분 | 히알루로니다제 활성 저해율(%) | |
| 0.1% | 1.0% | |
| 제조예 1 | 10 | 14 |
| 제조예 2 | 12 | 18 |
| 제조예 3 | 7 | 10 |
| 제조예 4 | 10 | 15 |
| 제조예 5 | 19 | 24 |
| 제조예 6 | 20 | 24 |
| 제조예 7 | 19 | 26 |
| 제조예 8 | 23 | 30 |
| 제조예 9 | 26 | 34 |
| 제조예 10 | 37 | 49 |
| 비교예 1 | 40 | 53 |
| 비교예 2 | 39 | 54 |
| 비교예 3 | 41 | 55 |
| 비교예 4 | 39 | 53 |
| 비교예 5 | 39 | 54 |
| 실시예 1 | 54 | 68 |
| 실시예 2 | 58 | 69 |
| 실시예 3 | 55 | 67 |
| 실시예 4 | 63 | 77 |
| 히알루론산 | 72 | 83 |
상기 표 8에서 보는 바와 같이, 실시예 1 내지 4로 가수분해 효소 처리된 로얄젤리 추출물과 레몬타임 및 허니로커스트 복합 추출물의 혼합물을 락토바실러스 균주로 발효시킨 혼합 발효 추출물을 처리한 경우가 다른 제조예 1 내지 10 또는 비교예 1 내지 5를 처리한 경우에 비하여 히알루로니다제 활성 억제 효과가 현저히 뛰어났으며, 특히 락토바실러스 플란타룸으로 발효한 실시예 4에서 가장 우수한 히알루로니다제 활성 억제 효과를 나타내었다.
[실험예 5] 프로콜라겐 타입 I(Procollagen type I)의 생성 증가 효과 확인
프로콜라겐 타입 I(Procollagen type I)의 생성 억제 효과를 확인하기 위해 NHDF 세포를 24 웰 플레이트에 접종하여 37℃ 및 5% CO2 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 이후 상기 제조예 1 내지 10, 실시예 1 내지 4 및 비교예 1 내지 5에서 제조한 추출물을 시료 농도가 0.1 또는 1.0% 가 되도록 처리한 후 24시간 동안 배양하였다. 이후에 배양된 세포의 배지를 수거하여 프로콜라겐 타입 I c-펩타이드 EIA 키트(TAKARA, MK101)를 사용하여 프로콜라겐 타입 I의 양을 측정하였다. 한편, 바닥에 부착되어 있는 세포는 PBS로 세척한 후 1N NaOH로 용해시켜 총 단백질 양을 측정하여, 일정 단백질 당 프로콜라겐 타입 I의 생성량을 계산하였다. 그 결과를 하기 표 9에 나타내었다.
| 구분 | 프로콜라겐 타입 I 생성량 / 총 단백질량 | |
| 0.1% | 1.0% | |
| 대조군 | 5.0 | |
| 제조예 1 | 5.3 | 5.7 |
| 제조예 2 | 5.5 | 5.9 |
| 제조예 3 | 5.2 | 5.5 |
| 제조예 4 | 5.4 | 5.8 |
| 제조예 5 | 6.2 | 6.3 |
| 제조예 6 | 6.3 | 6.3 |
| 제조예 7 | 6.3 | 6.4 |
| 제조예 8 | 6.5 | 6.8 |
| 제조예 9 | 6.8 | 7.0 |
| 제조예 10 | 7.3 | 8.1 |
| 비교예 1 | 7.5 | 8.6 |
| 비교예 2 | 7.4 | 8.5 |
| 비교예 3 | 7.5 | 8.6 |
| 비교예 4 | 7.6 | 8.6 |
| 비교예 5 | 7.4 | 8.4 |
| 실시예 1 | 8.3 | 9.0 |
| 실시예 2 | 8.4 | 9.3 |
| 실시예 3 | 8.3 | 9.1 |
| 실시예 4 | 8.9 | 9.6 |
상기 표 9에서 보는 바와 같이, 실시예 1 내지 4의 가수분해 효소 처리된로얄젤리 추출물과 레몬타임 및 허니로커스트 복합 추출물의 혼합물을 락토바실러스 균주로 발효시킨 혼합 발효 추출물을 처리한 경우가, 제조예 1 내지 10의 추출물 및 비교예 1 내지 5의 발효 추출물들을 처리한 경우와 비교할 때, 인간 섬유아세포에서 프로콜라겐 타입 I의 생성이 현저히 촉진되는 것을 확인할 수 있었다.
[실험예 6] 기질 금속 단백질 분해 효소-1(Matrix metalloproteinase-1; MMP-1) 발현 억제 효과 확인
인간 섬유아세포 NHDF를 10% FBS가 첨가된 DMDM 배지를 이용하여 5×105 세포/웰로 조절한 후 12 웰 플레이트에 접종하고 18시간 동안 배양하였다. 배양한 뒤 시료를 처리하고 24시간 동안 배양하였다. 배양된 세포에서 RNA를 추출하여 RT-PCR을 통해 MMP-1의 발현 억제율을 확인하였다. 유전자 발현의 차이를 확인하기 위해 항존 유전자로 GAPDH를 사용하였다. 각각의 유전자의 프라이머 서열은 상기 표 4에 나타냈다. MMP-1의 발현 억제율은 하기 식에 의해 산출되었고, 그 결과는 표 10에 나타내었다.
MMP-1 발현 억제율(%) = {(대조군의 MMP-1 발현 양 - 시료처리군의 MMP-1 발현 양)/ 대조군의 MMP-1 발현 양} × 100
| 구분 | 히알루로니다제 활성 저해율(%) | |
| 0.1% | 1.0% | |
| 제조예 1 | 9 | 15 |
| 제조예 2 | 12 | 20 |
| 제조예 3 | 5 | 13 |
| 제조예 4 | 9 | 18 |
| 제조예 5 | 19 | 28 |
| 제조예 6 | 18 | 30 |
| 제조예 7 | 18 | 31 |
| 제조예 8 | 20 | 36 |
| 제조예 9 | 24 | 40 |
| 제조예 10 | 31 | 52 |
| 비교예 1 | 33 | 54 |
| 비교예 2 | 34 | 55 |
| 비교예 3 | 33 | 57 |
| 비교예 4 | 35 | 56 |
| 비교예 5 | 34 | 57 |
| 실시예 1 | 42 | 69 |
| 실시예 2 | 44 | 70 |
| 실시예 3 | 44 | 68 |
| 실시예 4 | 51 | 75 |
상기 표 10에서 보는 바와 같이, 실시예 1 내지 4로 가수분해 효소처리 로얄젤리 추출물과 레몬타임 및 허니로커스트 복합 추출물의 혼합물에 대한 락토바실러스 균주로 발효시킨 혼합 발효 추출물을 처리한 경우가, 제조예 1 내지 10의 추출물, 또는 다른 균주로 발효시킨 비교예 1 내지 5의 발효 추출물들을 처리한 경우에 비하여 MMP-1 발현 억제 효과가 현저히 뛰어났으며, 특히 락토바실러스 플라타룸으로 발효한 실시예 4가 MMP-1 발현 억제 효과가 가장 뛰어난 것을 알 수 있었다.
[실험예 7] 로얄락틴(Royalactin) 단백질의 함유 확인
상기 실험예 1 내지 6을 통해 실시예 4의 복합 발효 추출물이 여러 면에서 가장 우수한 효능을 나타냄을 확인할 수 있었다. 이에 따라 상기 실시예 4의 복합 발효 추출물에서, 로얄젤리에 함유되어 있는 주요 생리활성 단백질인 로얄락틴(Royalactin; Major royal jelly peotein 1)이 함유되어 있는지를 확인하기 위하여 이하의 실험을 수행하였다. 구체적으로 실시예 4를 정제수에 희석하여 최종 농도를 100%, 50%, 10% 및 5%로 제조한 후 각각의 샘플을 10% 아크릴아마이드 겔에 15 μl/레인으로 로딩(loading) 하였으며, 니트로셀루롤오스 막(nitrocellulose membrane)에 단백질을 이동시켰다. 막을 5% 탈지 우유(non-fat skim milk)에 1:1000의 비율로 첨가한 로얄락틴에 대한 1차 항체(ABIN1993062, Antibodies) 및 1:3000의 비율로 첨가한 2차 항체(anti-Rabbit)를 반응시키고 ECL 시약(Amersham Pharmacia Biotech, UK)을 이용하여 현상하였으며, 그 결과를 도 1에 나타내었다.
그 결과, 도 1 에서 보는 바와 같이, 실시예 4에서, 가수분해 효소처리된 로얄젤리 추출물과 레몬타임 및 허니로커스트 복합 추출물의 혼합물을 락토바실러스 균주로 발효하여 제조된 혼합 발효 추출물에는 로얄락틴 단백질이 함유되어 있음을 확인할 수 있었다.
[실시예 5] 혼합 발효 추출물을 함유하는 세럼의 제조
상기 실시예 4의 혼합발효추출물을 함유하는 세럼을 하기의 표 11의 조성 및 함량으로 통상의 방법에 따라 제조하였다.
| 원료 | 함량(중량%) |
| 실시예 4 | 1.0 |
| 솔비탄 세스퀴올레이트 | 0.5 |
| 스쿠알란 | 10.0 |
| 글리세릴 스테아레이트 | 1.0 |
| 세테아릴알코올 | 1.5 |
| 글리세릴스테아레이트/피이지-100 스테아레이트 | 1.0 |
| 프로필렌글리콜 | 3.0 |
| 카르복시폴리머 | 0.1 |
| 트리에탄올아민 | 0.1 |
| 페녹시에탄올 | 적량 |
| 정제수 | To 100 |
[실시예 6] 혼합 발효 추출물을 함유하는 크림의 제조
상기 실시예 4의 혼합 발효 추출물을 함유하는 크림을 하기의 표 12의 조성 및 함량으로 통상의 방법에 따라 제조하였다.
| 원료 | 함량(중량%) |
| 실시예 4 | 1.0 |
| 부틸렌글라이콜 | 5.0 |
| 프로판다이올 | 3.0 |
| 소듐하이알루로네이트(1%) | 2.0 |
| 트레할로오스 | 0.2 |
| 다이소듐이디티에이 | 0.02 |
| 1,2-헥산다이올 | 2.0 |
| 카보머 | 0.15 |
| 다이메티콘 | 4.0 |
| 폴리글리세릴-3다이아이소스테아레이트 | 2.0 |
| 시어버터 | 2.0 |
| 세테아릴알코올 | 1.5 |
| 카프릴릭/카프릭트라이글리세라이드 | 5.0 |
| 비즈왁스 | 1.0 |
| 솔비탄올리에이트 | 0.8 |
| 글리세릴스테아레이트 | 0.5 |
| 올리브오일 | 0.5 |
| 알지닌 | 0.15 |
| 정제수 | To 100 |
[실험예 8] 제형의 안정도 확인
상기 실시예 5 및 6에서 제조한 제형에 대하여 실온(25℃), 냉장(4℃) 및 항온(50℃)으로 일정하게 유지되는 실내, 냉장고 및 인큐베이터에서 불투명 초자 용기에 담아 24주 동안 보관 및 관찰(변색, 변취 및 분리)하였다. 또한 온도 순환 조건(-5 ~ 50℃)에서도 안정성을 확인하였고, 그 결과는 하기 표 13 및 도 2에 나타내었다. 다만, 제형 안정 등급은 아래를 기준으로 평가하였다:
< 제형 안정 등급 >
0: 변화 없음 1: 미세한 변화 2: 변화 3: 극심한 변화
| 온도 조건 | 안정성 확인 | |||||
| 실시예 5 | 실시예 6 | |||||
| 변색 | 변취 | 분리 | 변색 | 변취 | 분리 | |
| 실온(25℃) | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 냉장(4℃) | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 항온(50℃) | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 순환(-5 ~ 50℃) | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
상기 표 13 및 도 2에서 보는 바와 같이, 실시예 5의 세럼 제형과, 실시예 6의 크림 제형 모두 25℃, 4℃ 및 50℃의 온도 조건과, 순환 조건 하에서 변색 변취 및 분리 현상이 나타나지 않고 안정함이 확인되었다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
Claims (20)
- 가수분해 효소 β-글루코시다아제로 처리된 로얄젤리 추출물; 및 레몬타임과 허니로커스트의 복합 추출물을 락토바실러스 균주로 발효한 발효 추출물을 유효성분으로 포함하고, 상기 레몬타임과 허니로커스트의 복합 추출물은 레몬타임과 허니로커스트를 1~3:1~3의 중량비로 혼합한 혼합물을 추출한 것인, 화장료 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 로얄젤리 추출물 또는 상기 레몬타임과 허니로커스트의 복합 추출물은 로얄젤리 또는 레몬타임과 허니로커스트의 혼합물에 물, 탄소수 1 내지 4의 무수알코올, 에틸아세테이트, 아세톤, 글리세린, 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜, 카프릴릭/카프릭트리글리세라이드, 디메치콘, 미네랄오일, 사이클로메치콘, 옥틸도데칸올, 세틸에칠헥사노에이트, 트리레칠헥사노인, 이소프로필미리스테이트 및 식물성 오일로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 추출 용매를 처리하여 수득된 것인, 화장료 조성물. - 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 락토바실러스 균주는 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei), 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 람노수스(Lactobacillus rhamnosus) 및 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나인, 화장료 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 발효 추출물은 로얄락틴(Royalactin)을 포함하는, 화장료 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 화장료 조성물은 피부 생기 부여, 피부 활력 증진, 피부 수렴용, 주름 개선용, 피부 장벽 강화 또는 장벽 기능 보호, 피부 재생, 보습, 탄력 유지, 항산화 및 항노화의 피부 개선용인, 화장료 조성물. - 가수분해 효소 β-글루코시다아제로 처리된 로얄젤리 추출물을 준비하는 단계;
레몬타임과 허니로커스트의 복합 추출물을 준비하는 단계;
상기 로얄젤리 추출물 및 상기 레몬타임과 허니로커스트의 복합 추출물을 혼합하여 추출 혼합물을 얻는 단계; 및
상기 추출 혼합물을 락토바실러스 균주로 발효하여 발효 추출물을 얻는 단계를 포함하고,
상기 레몬타임과 허니로커스트의 복합 추출물은 레몬타임과 허니로커스트를 1~3:1~3의 중량비로 혼합한 혼합물을 추출한 것인, 화장료 조성물의 제조 방법. - 제9항에 있어서,
상기 로얄젤리 추출물 또는 상기 레몬타임과 허니로커스트의 복합 추출물은 로얄젤리 또는 레몬타임과 허니로커스트의 혼합물에 물, 탄소수 1 내지 4의 무수알코올, 에틸아세테이트, 아세톤, 글리세린, 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜, 카프릴릭/카프릭트리글리세라이드, 디메치콘, 미네랄오일, 사이클로메치콘, 옥틸도데칸올, 세틸에칠헥사노에이트, 트리레칠헥사노인, 이소프로필미리스테이트 및 식물성 오일로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 추출 용매를 처리하여 수득된 것인, 제조 방법. - 제9항에 있어서,
상기 로얄젤리 추출물은 로얄젤리 중량의 1 내지 100 배의 추출 용매를 첨가한 뒤, 20 내지 40℃의 추출 온도에서 120분 내지 180분 동안 추출하여 얻어지는 것인, 제조 방법. - 삭제
- 제9항에 있어서,
상기 레몬타임과 허니로커스트의 복합 추출물은 레몬타임과 허니로커스트의 혼합물 중량의 1 내지 100 배의 추출 용매를 첨가한 뒤, 80 내지 100℃의 추출 온도에서 100분 내지 120분 동안 추출하여 얻어지는 것인, 제조 방법. - 제9항에 있어서,
상기 제조 방법은, 상기 로얄젤리 추출물 또는 상기 레몬타임과 허니로커스트의 복합 추출물을 여과지에 1회 내지 10회 여과하는 단계를 더 포함하는, 제조 방법. - 삭제
- 삭제
- 제9항에 있어서,
상기 가수분해 효소 처리하는 단계는 30 내지 40℃에서 10분 내지 480분 동안 교반한 뒤, 70 내지 100℃에서 30초 내지 5분간 가온하며 수행되는, 제조 방법. - 제9항에 있어서,
상기 락토바실러스 균주는 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei), 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 람노수스(Lactobacillus rhamnosus) 및 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나인, 제조 방법. - 제9항에 있어서,
상기 발효는 pH 5.0 내지 6.0, 35 내지 40℃의 온도 조건 하에서 12 내지 96시간 동안 수행되는, 제조 방법. - 가수분해 효소 β-글루코시다아제로 처리된 로얄젤리 추출물; 및 레몬타임과 허니로커스트의 복합 추출물을 락토바실러스 균주로 발효한 발효 추출물을 유효성분으로 포함하고, 상기 레몬타임과 허니로커스트의 복합 추출물은 레몬타임과 허니로커스트를 1~3:1~3의 중량비로 혼합한 혼합물을 추출한 것인, 식품 조성물.
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