KR102485788B1 - 항체, 조성물 및 용도 - Google Patents

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Abstract

본 개시내용은 항-B7H3 항체 작용제 및 이와 관련된 용도를 설명한다. 다른 것들 중에서, 본 발명은 상기 특정 항체의 특정 면역 조절 효과를 입증한다. 본 개시내용은 특히 8H9 항체의 특정 인간화 및/또는 친화도 성숙 버전을 포함하는, 특히 고-친화도 또는 다른 방식으로 유용한 항체 및 그것에 기초한 항체 작용제를 설명한다. 일부 실시양태에서, 제공되는 항체 작용제는 예를 들어 암의 치료에 유용하다. 일부 실시양태에서, 제공된 항체 작용제는 예를 들어 B7H3-양성 세포에 의해 매개되는 면역 억제를 완화시키는데 유용하다.

Description

항체, 조성물 및 용도{ANTIBODIES, COMPOSITIONS, AND USES}
서열 목록
본 명세서는 서열 목록 (2015년 8월 26일에 "2003080-0937_SL.txt"로 명명된 .txt 파일로서 전자적으로 제출됨)을 참조한다. .txt 파일은 2015년 7월 31일에 생성되었고, 크기는 129,896 바이트이다. 서열 목록의 전체 내용은 본원에 참고로 포함된다. 하기 서열의 설명은 서열 목록에 있는 서열의 동일성을 나열한다.
종양은 종종 면역계를 억제하는 미세 환경을 생성한다. 이 면역학적 차단을 제거하는 것은 효과적인 요법을 개발하기 위한 많은 노력의 주요 대상이었다.
개요
본 발명은 B7H3에 결합하는 신규한 항체를 제공한다. 일부 실시양태에서, 이러한 항체는 8H9와 유의한 서열 동일성을 공유한다. 일부 실시양태에서, 제공된 항체는 8H9의 친화도 성숙된 인간화 변이체를 나타낸다.
일부 실시양태에서, 제공된 항체는 8H9에 의해 인식되는 B7H3의 에피토프에 결합한다. 무엇보다도, 본 발명은 m8H9 및 그의 인간화된 변이체가, B7H3에 대한 다른 특정 항체에 의해 인식되지 않는 B7H3 상의 별개의 에피토프에 결합한다는 놀라운 통찰을 제공한다. 따라서, 본 발명은 m8H9는 아니지만 동일한 에피토프에 결합하는 새로운 항체의 유용한 세트를 규정한다.
본 발명은 단백질 2Ig-B7H3 또는 4Ig-B7H3에 특이적으로 결합하고 서열식별번호(SEQ ID NO.) 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 및 8로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열식별번호에 제시된 이뮤노글로불린 경쇄를 포함하고 서열식별번호: 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 및 16으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열식별번호에 제시된 이뮤노글로불린 중쇄를 포함하는 항체 작용제 (antibody agent)를 제공한다.
일부 실시양태에서, 이뮤노글로불린 경쇄는 서열식별번호: 1에 제시되고, 이뮤노글로불린 중쇄는 서열식별번호: 9에 제시된다. 일부 실시양태에서, 항체 작용제는 서열식별번호: 1에 제시된 이뮤노글로불린 경쇄 및 서열식별번호: 9에 제시된 이뮤노글로불린 중쇄를 갖는 항체이다. 일부 실시양태에서, 이뮤노글로불린 경쇄는 서열식별번호: 2에 제시되고, 이뮤노글로불린 중쇄는 서열식별번호: 10에 제시된다. 일부 실시양태에서, 항체 작용제는 서열식별번호: 2에 제시된 이뮤노글로불린 경쇄 및 서열식별번호: 10에 제시된 이뮤노글로불린 중쇄를 갖는 항체이다. 일부 실시양태에서, 이뮤노글로불린 경쇄는 서열식별번호: 3에 제시되고, 이뮤노글로불린 중쇄는 서열식별번호: 11에 제시된다. 일부 실시양태에서, 항체 작용제는 서열식별번호: 3에 제시된 이뮤노글로불린 경쇄 및 서열식별번호: 11에 제시된 이뮤노글로불린 중쇄를 갖는 항체이다. 일부 실시양태에서, 이뮤노글로불린 경쇄는 서열식별번호: 4에 제시되고, 이뮤노글로불린 중쇄는 서열식별번호: 12에 제시된다. 일부 실시양태에서, 항체 작용제는 서열식별번호: 4에 제시된 이뮤노글로불린 경쇄 및 서열식별번호: 12에 제시된 이뮤노글로불린 중쇄를 갖는 항체이다. 일부 실시양태에서, 이뮤노글로불린 경쇄는 서열식별번호: 2에 제시되고, 이뮤노글로불린 중쇄는 서열식별번호: 11에 제시된다. 일부 실시양태에서, 항체 작용제는 서열식별번호: 2에 제시된 이뮤노글로불린 경쇄 및 서열식별번호: 11에 제시된 이뮤노글로불린 중쇄를 갖는 항체이다. 일부 실시양태에서, 이뮤노글로불린 경쇄는 서열식별번호: 3에 제시되고, 이뮤노글로불린 중쇄는 서열식별번호: 10에 제시된다. 일부 실시양태에서, 항체 작용제는 서열식별번호: 3에 제시된 이뮤노글로불린 경쇄 및 서열식별번호: 10에 제시된 이뮤노글로불린 중쇄를 갖는 항체이다. 일부 실시양태에서, 이뮤노글로불린 경쇄는 서열식별번호: 5에 제시되고, 이뮤노글로불린 중쇄는 서열식별번호: 13에 제시된다. 일부 실시양태에서, 항체 작용제는 서열식별번호: 5에 제시된 이뮤노글로불린 경쇄 및 서열식별번호: 13에 제시된 이뮤노글로불린 중쇄를 갖는 항체이다. 일부 실시양태에서, 이뮤노글로불린 경쇄는 서열식별번호: 6에 제시되고, 이뮤노글로불린 중쇄는 서열식별번호: 14에 제시된다. 일부 실시양태에서, 항체 작용제는 서열식별번호: 6에 제시된 이뮤노글로불린 경쇄 및 서열식별번호: 14에 제시된 이뮤노글로불린 중쇄를 갖는 항체이다. 일부 실시양태에서, 이뮤노글로불린 경쇄는 서열식별번호: 7에 제시되고, 이뮤노글로불린 중쇄는 서열식별번호: 15에 제시된다. 일부 실시양태에서, 항체 작용제는 서열식별번호: 7에 제시된 이뮤노글로불린 경쇄 및 서열식별번호: 15에 제시된 이뮤노글로불린 중쇄를 갖는 항체이다. 일부 실시양태에서, 이뮤노글로불린 경쇄는 서열식별번호: 8에 제시되고, 이뮤노글로불린 중쇄는 서열식별번호: 16에 제시된다. 일부 실시양태에서, 항체 작용제는 서열식별번호: 8에 제시된 이뮤노글로불린 경쇄 및 서열식별번호: 16에 제시된 이뮤노글로불린 중쇄를 갖는 항체이다. 일부 실시양태에서, 이뮤노글로불린 경쇄는 위치 20에서의 트레오닌 잔기 및 위치 34에서의 티로신 잔기를 포함하고, 이뮤노글로불린 중쇄는 위치 24에서의 트레오닌 잔기, 위치 42에서의 글리신 잔기, 위치 56에서의 아스파르트산 잔기, 및 위치 102에서의 글리신 잔기를 포함한다.
본 발명은 이뮤노글로불린 경쇄가 위치 20에서의 트레오닌 잔기 및 위치 34에서의 티로신 잔기를 포함하고, 이뮤노글로불린 중쇄가 위치 24에서의 트레오닌 잔기, 위치 42에서의 글리신 잔기, 위치 56에서의 아스파르트산 잔기 및 위치 102에서의 글리신 잔기를 포함하는 것인 뮤린 8H9 항체를 제공한다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 임의의 항체는 이뮤노글로불린 경쇄의 위치 20에서의 트레오닌 잔기 및 위치 34에서의 티로신 잔기 중 하나 이상 및 이뮤노글로불린 중쇄의 위치 24에서의 트레오닌 잔기, 위치 42에서의 글리신 잔기, 위치 56에서의 아스파르트산 잔기 및 위치 102에서의 글리신 잔기를 포함하거나, 또는 이들 위치 중 임의의 위치에서 그의 상동성 아미노산 치환을 포함한다.
일부 실시양태에서, 이뮤노글로불린 경쇄는 서열식별번호: 30 또는 서열식별번호: 31에 제시된 폴리펩티드에 융합된다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 임의의 항체 작용제는 치료제 또는 검출제에 접합된다.
일부 실시양태에서, 항체를 비롯하여 본원에 개시된 임의의 항체 작용제는 방사성 동위원소, 약물 접합체, 나노 입자, 면역독소 또는 임의의 다른 페이로드 (payload)에 접합된다.
일부 실시양태에서, 항체를 비롯하여 본원에 개시된 임의의 항체 작용제는 진단 또는 영상화제, 또는 둘 모두에 접합된다.
일부 실시양태에서, 항체 작용제는 이중특이적 항체이다.
일부 실시양태에서, 항체 작용제는 제1 및 제2 특이성을 갖고, 제1 특이성은 단백질 2Ig-B7H3 또는 4Ig-B7H3에 결합하고, 제2 특이성은 T 세포 상의 CD3 또는 DOTA에 결합한다.
본 발명은 단백질 2Ig-B7H3 또는 4Ig-B7H3에 특이적으로 결합하고 서열식별번호: 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 및 27로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열식별번호에 제시된 폴리펩티드를 포함하는 scFv를 제공한다.
일부 실시양태에 있어서, scFv의 폴리펩티드는 위치 24에서의 트레오닌, 위치 42에서의 글리신, 위치 56에서의 아스파르트산 잔기, 위치 102에서의 글리신 잔기, 위치 153에서의 트레오닌 잔기 및 위치 167에서의 티로신 잔기를 포함한다.
일부 실시양태에서, scFv는 위치 24에서의 트레오닌, 위치 42에서의 글리신, 위치 56에서의 아스파르트산 잔기, 위치 102에서의 글리신 잔기, 위치 153에서의 트레오닌 잔기 및 위치 167에서의 티로신 잔기 중 하나 이상을 포함하거나, 이들 위치 중 임의의 위치에서 상동성 아미노산 치환을 포함한다.
일부 실시양태에서, scFv의 폴리펩티드는 서열식별번호: 28 또는 서열식별번호: 29에 제시된 제2 폴리펩티드에 융합된다.
일부 실시양태에서, scFv는 치료제 또는 검출제에 접합된다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 임의의 scFv는 키메라 항원 수용체의 일부이다.
본 발명은 단백질 2Ig-B7H3의 V-도메인 내 및 단백질 4Ig-B7H3의 V1 및 V2 도메인 내의 FG 루프에 위치한 서열식별번호: 32에 제시된 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 작용제를 제공하고, 상기 항체 작용제는 m8H9가 아니다.
본 발명은 단백질 2Ig-B7H3의 V-도메인 내 및 단백질 4Ig-B7H3의 V1 및 V2 도메인 내의 FG 루프에 2 nM 미만의 KD로 특이적으로 결합하는 항체 작용제를 제공하고, 이 항체 작용제는 m8H9가 아니다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 임의의 항체 작용제는 T 세포 증식 및 기능에 대한 B7H3의 억제 효과를 억제한다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 임의의 항체 작용제는 NK 세포 활성 및 기능에 대한 B7H3의 억제 효과를 억제한다.
본 발명은 본원에 개시된 임의의 항체 작용제, scFv 또는 인간화 항체 또는 그의 항원-결합 단편 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
본 발명은 본원에 개시된 항체 작용제, scFv, 인간화 항체 또는 그의 항원-결합 단편 중 임의의 하나 이상의 치료 유효량을 그 치료가 필요한 환자에게 투여하는 것을 포함하는 암 치료 방법을 제공한다.
본 발명은 본원에 개시된 항체 작용제, scFv, 인간화 항체 또는 그의 항원-결합 단편 중 임의의 하나 이상의 치료 유효량을 그 조절이 필요한 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 면역계를 조절하는 방법을 제공한다.
본 발명은 B7H3의 FG-루프에 결합하는 항-B7H3 항체 작용제를 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 암을 치료하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 암은 신경모세포종이거나 이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 암은 자궁경부암이거나 이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 암은 B7H3-양성 종양 세포를 포함한다.
본 발명은 B7H3의 FG-루프에 결합하는 항-B7H3 항체 작용제를 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 T-세포 매개 세포독성을 증강시키는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 항체 작용제는 8H9 항체 작용제이거나 이를 포함한다.
일부 실시양태에서, 8H9 항체 작용제는 서열식별번호: 33, 34, 39, 40, 45, 46, 51 및 52로 이루어지는 군으로부터 선택되는 경쇄 CDR1 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다.
일부 실시양태에서, 8H9 항체 작용제는 서열식별번호: 35, 36, 41, 42, 47, 48, 53 및 54로 이루어지는 군으로부터 선택되는 경쇄 CDR2 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다.
일부 실시양태에서, 8H9 항체 작용제는 서열식별번호: 37, 38, 43, 44, 49, 50, 55 및 56으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 경쇄 CDR3 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다.
일부 실시양태에 있어서, 8H9 항체 작용제는 서열식별번호: 57, 58, 63, 64, 69, 70, 75 및 76으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 중쇄 CDR1 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다.
일부 실시양태에서, 8H9 항체 작용제는 서열식별번호: 59, 60, 65, 66, 71, 72, 77 및 78로 이루어지는 군으로부터 선택되는 중쇄 CDR2 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다.
일부 실시양태에서, 8H9 항체 작용제는 서열식별번호: 61, 62, 67, 68, 73, 74, 79 및 80으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 중쇄 CDR3 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다.
일부 실시양태에서, 8H9 항체 작용제는 서열식별번호: 33, 34, 39, 40, 45, 46, 51 및 52로 이루어지는 군으로부터 선택되는 경쇄 CDR1 서열; 서열식별번호: 35, 36, 41, 42, 47, 48, 53 및 54로 이루어지는 군으로부터 선택되는 경쇄 CDR2 서열; 및 서열식별번호: 37, 38, 43, 44, 49, 50, 55 및 56으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 경쇄 CDR3 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다.
일부 실시양태에서, 8H9 항체 작용제는 서열식별번호: 57, 58, 63, 64, 69, 70, 75 및 76로 이루어지는 군으로부터 선택되는 중쇄 CDR1 서열; 서열식별번호: 59, 60, 65, 66, 71, 72, 77 및 78로 이루어지는 군으로부터 선택되는 중쇄 CDR2 서열; 및 서열식별번호: 61, 62, 67, 68, 73, 74, 79 및 80으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 중쇄 CDR3 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다.
일부 실시양태에서, 8H9 항체 작용제는 서열식별번호: 33, 34, 39, 40, 45, 46, 51 및 52로 이루어지는 군으로부터 선택되는 경쇄 CDR1 서열; 서열식별번호: 35, 36, 41, 42, 47, 48, 53 및 54로 이루어지는 군으로부터 선택되는 경쇄 CDR2 서열; 및 서열식별번호: 37, 38, 43, 44, 49, 50, 55 및 56으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 경쇄 CDR3 서열; 및 서열식별번호: 57, 58, 63, 64, 69, 70, 75 및 76으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 중쇄 CDR1 서열; 서열식별번호: 59, 60, 65, 66, 71, 72, 77 및 78로 이루어지는 군으로부터 선택되는 중쇄 CDR2 서열; 및 서열식별번호: 61, 62, 67, 68, 73, 74, 79 및 80으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 중쇄 CDR3 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 임의의 항체 작용제는 8H9 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함한다.
일부 실시양태에서, 8H9 항체는 m8H9, h8H9 또는 ham8H9이거나 이를 포함한다.
일부 실시양태에서, 8H9 항체는 서열식별번호: 9-16 중 하나에 제시된 중쇄 및 서열식별번호: 1-8 중 하나에 제시된 경쇄를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 임의의 항체 작용제는 B7H3에 대한 결합을 위해 8H9 항체와 경쟁한다.
본 발명은 본 명세서에 개시된 임의의 항체 작용제 또는 그의 단편을 코딩하는 DNA 또는 RNA를 제공한다.
본 발명은 본원에 개시된 임의의 항체 작용제 또는 그의 단편을 발현하는 세포를 제공한다.
본 발명은 본원에 개시된 임의의 항체 작용제를 코딩하는 DNA 또는 RNA로 세포를 형질감염시키거나 바이러스에 의해 형질도입하는 것을 포함하는, 항체 작용제 또는 그의 단편을 발현하는 세포를 제조하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 세포는 환자 내에서 바이러스에 의해 형질도입된다.
일부 실시양태에서, 세포는 면역 세포이다.
일부 실시양태에서, 세포는 항원 제시 세포이다.
일부 실시양태에서, 세포는 T 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 NK 세포이다.
본 발명은 본원에 개시된 임의의 DNA 또는 RNA를 포함하는 백신을 제공한다.
본 발명은 본원에 개시된 임의의 백신을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 환자에게 백신을 접종하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 환자는 개과의 동물 또는 고양이과의 동물이다.
본 발명은 본 명세서에 개시된 임의의 항체 작용제 또는 그의 단편을 포함하는 키메라 항원 수용체를 제공한다.
일부 실시양태에서, DNA 또는 RNA는 키메라 항원 수용체를 코딩한다.
본 발명은 본원에 개시된 임의의 키메라 항원 수용체를 발현하는 세포 (예를 들어, T 세포 또는 NK 세포)를 제공한다.
본 발명은 본원에 개시된 임의의 DNA 또는 RNA로 세포를 형질감염시키거나 바이러스에 의해 형질도입시키는 것을 포함하는, 세포의 제조 방법을 제공한다.
본 발명은 치료 유효량의 본원에 개시된 임의의 세포를 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 입양 세포 요법을 제공한다.
본 발명은 본원에 개시된 임의의 항체 작용제 또는 그의 단편을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 서열식별번호: 32에 제시된 펩티드 에피토프를 표적화함으로써 환자를 치료하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 환자는 인간, 개, 고양이, 침팬지, 오랑우탄, 긴팔원숭이 (gibbon), 짧은 꼬리 원숭이 (macaque), 마모셋 (marmoset), 돼지, 말, 팬더 및 코끼리로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
본 발명은 본원에 개시된 임의의 세포를 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 환자의 치료 방법을 제공한다.
본 발명은 본원에 개시된 임의의 항체 작용제 또는 그의 단편을 코딩하는 DNA 또는 RNA를 포함하는 바이러스를 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 환자의 치료 방법을 제공한다.
본 발명은 본원에 개시된 임의의 항체 작용제 또는 그의 단편을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 구획 방사선 면역요법 (cRIT)에 의해 환자를 치료하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 항체는 척수강내, 복강내 또는 전달 증진 전달 (convection enhanced delivery)에 의해 투여된다.
이하의 도면으로 이루어지는, 본원에 포함된 도면은 본 발명을 제한하고자 하는 것이 아니라, 단지 설명을 위한 것이다.
도 1은 ch8H9 Fab의 결정 구조의 리본 다이아그램을 보여준다. A: 개별 Ig 도메인 및 상보성 결정 영역 (CDR)을 보여주는 Fab의 측면도. B: 6개의 CDR 루프의 방향을 보여주는, 항원 결합 부위에 대한 하향식 도면. C: -1에서 +1 kT/e의 범위에서 음으로 하전된 (적색)에서 양으로 하전된 (청색) 항원 결합 부위의 정전 표면 전위.
도 2는 인간화 및 친화도 성숙된 8H9 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 개발을 위해 제시된 전략을 도시한 것이다.
도 3은 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정된 뮤린 8H9 (m8H9) 및 마우스/인간 키메라 8H9 (ch8H9) IgG 항체의 2Ig-B7H3-Fc에 대한 결합의 동역학을 보여준다.
도 4는 다양한 농도의 ch8H9 및 인간화된 8H9 IgG 변이체 H1L1, H1L2, H2L1 및 H2L2가 4Ig-B7H3에 결합된 ELISA의 결과를 보여준다.
도 5는 연속 희석된 HRP-스트렙타비딘 (A) 또는 ch8H9 IgG (B)에 의한 비오티닐화된 B7H3-mFc 항원의 ELISA-검출을 보여준다.
도 6은 인간화된 (hu) 8H9 H3L3 scFv의 친화도 성숙과 관련된 유동 세포 계측 데이터를 보여준다.
도 7은 hu8H9 H3L3 scFv를 제시하는 효모 세포 (왼쪽) 및 세포 분류의 마지막/제7 라운드로부터 유래된 효모 세포 (오른쪽)의 비교를 보여준다. 효모 세포를 0.1 또는 1 ㎍/ml의 B7H3-mFc로 염색한 후, APC-염소 항-마우스 항체로 검출하였다.
도 8은 기재된 바와 같이 제7 라운드의 세포 분류로부터 유래된 hu8H9 단일쇄 Fv (scFv) 변이체에 대한 아미노산 서열 정렬을 보여준다. 강력한 결합제의 서열 데이터는 클러스터 분석에 의해 분류되었다. 다음 5가지의 scFv 변이체가 반복적으로 선택되었다: S7.2, S7.17, S7.22, S7.28 및 S7.29. S3.3은 제3 라운드의 세포 분류로부터 유래된 scFv이다. 8H9 H3L3 (서열식별번호: 87); 8H9S3.3 (서열식별번호: 88); 8H9S7.2 (서열식별번호: 89); 8H9S7.3 (서열식별번호: 90); 8H9S7.4 (서열식별번호: 91); 8H9S7.5 (서열식별번호: 92); 8H9S7.6 (서열식별번호: 93); 8H9S7.7 (서열식별번호: 94); 8H9S7.8 (서열식별번호: 95); 8H9S7.9 (서열식별번호: 96); 8H9S7.17 (서열식별번호: 97); 8H9S7.18 (서열식별번호: 98); 8H9S7.19 (서열식별번호: 99); 8H9S7.20 (서열식별번호: 100); 8H9S7.21 (서열식별번호: 101); 8H9S7.22 (서열식별번호: 102); 8H9S7.27 (서열식별번호: 103); 8H9S7.28 (서열식별번호: 104); 8H9S7.29 (서열식별번호: 105).
도 9는 hu8H9 scFv 변이체가 4Ig-B7H3 (왼쪽) 및 2Ig-B7H3 (오른쪽)에 결합된 ELISA 실험의 결과를 보여준다.
도 10은 hu8H9 scFv 변이체가 M14 신경모세포종 세포에 결합된 실험의 결과를 보여준다. 종양 세포는 1 ㎍/ml의 hu8H9 scFv H3L3 (청색), S3.3 (주황색), S7.22 (녹색) 또는 이소형 대조군 (적색) 및 항-his 항체로 염색되었다. 결합은 유동 세포 계측법으로 정량하였다.
도 11은 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정된, IgG 항체 ch8H9 및 hu8H9 H1L2, H3L3, 3.1 및 5.1에 의한 4Ig-B7H3-Fc에 대한 결합의 동역학을 보여준다.
도 12는 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정된, IgG 항체 ch8H9 및 hu8H9 H1L2, H3L3, 3.1 및 5.1에 의한 2Ig-B7H3-mFc에 대한 결합의 동역학을 보여준다.
도 13은 ch8H9 및 hu8H9 IgG 변이체가 M14 신경모세포종 세포에 결합된 실험의 결과를 보여준다. 결합은 유동 세포 계측법으로 정량하였다.
도 14는 인간 PBMC를 이펙터 세포로 사용하여, B7-H3(+) 신경모세포종 LAN-1 세포에 대한 8H9 항체 구축물의 시험관내 항체 의존 세포 매개 세포독성 (ADCC)을 보여준다. 세포독성은 51크로뮴 방출에 의해 측정되었다.
도 15는 피하 신경모세포종 LAN-1 종양이 이종이식된 무흉선 누드 마우스에 주사된 131I-표지된 8H9 항체 작용제의 생체 분포를 보여준다.
도 16은 ch8H9와 huB7H3 사이의 시뮬레이션된 결합의 그래픽 디스플레이를 보여준다. IRDF (서열식별번호: 32)는 화살표로 표시하였다.
도 17은 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정된, IgG 항-B7H3 항체 ch8H9, MIH42, 6A1 및 클론 185504에 의한 야생형 2Ig-B7H3-mFc 및 2Ig-B7H3-mFc 돌연변이체 R127A 및 D128A에 대한 결합의 동역학을 보여준다.
도 18은 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정된, IgG 항-B7H3 항체 hu8H9 3.1 및 5.1에 의한 야생형 2Ig-B7H3-mFc 및 2Ig-B7H3-mFc 돌연변이체 R127A 및 D128A에 대한 결합의 동역학을 보여준다.
도 19는 CD3/CD8 활성화 비드의 존재 하에 및 B7H3 양성 신경모세포종 IMR-32 세포의 존재 또는 부재 하에 T 세포 증식을 측정한 실험의 결과를 보여준다.
도 20은 CD3/CD8 활성화 비드 및 B7H3 양성 신경모세포종 IMR-32 세포의 존재 하에 ch8H9의 농도를 증가시키면서 T 세포 증식을 측정한 실험의 결과를 보여준다.
도 21은 인간 자궁경부 암종 세포 (HeLa)에 대한 T 세포 매개 세포독성을 측정한 실험의 결과를 보여준다. 암종 세포는 Her2xCD3 이중특이적 항체 단독으로, 또는 상기 항체 및 추가의 m8H9 IgG로 전처리되었다.
서열 목록의 간단한 설명
서열식별번호: 1 (ch8H9 경쇄)
Figure 112017028155957-pct00001

서열식별번호: 2 (hu8H9 L1 경쇄)
Figure 112017028155957-pct00002

서열식별번호: 3 (hu8H9 L2 경쇄)
Figure 112017028155957-pct00003

서열식별번호: 4 (hu8H9 L3 경쇄)
Figure 112017028155957-pct00004

서열식별번호: 5 (hu8H9 3.1 경쇄)
Figure 112017028155957-pct00005

서열식별번호: 6 (hu8H9 4.1 경쇄)
Figure 112017028155957-pct00006

서열식별번호: 7 (hu8H9 5.1 경쇄)
Figure 112017028155957-pct00007

서열식별번호: 8 (ch8H9 6.1 경쇄; ch8H9 + 6개 친화도 성숙 돌연변이)
Figure 112017028155957-pct00008

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서열식별번호: 28 (링커 huOKT3 (항-CD3) scFv)
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IRDF
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서열식별번호: 86
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정의
본원에서, 문맥으로부터 달리 명확하지 않으면, (i) 용어 "한 (a)"은 "적어도 하나"를 의미하는 것으로 이해될 수 있고; (ii) 용어 "또는"은 "및/또는"을 의미하는 것으로 이해될 수 있고; (iii) 용어 "포함하는" 및 "비롯한"은 그 단독으로 또는 하나 이상의 추가의 성분 또는 단계와 함께 제시되는 항목별 성분 또는 단계를 포함하는 것으로 이해될 수 있고; (iv) 용어 "약" 및 "대략"은 통상의 기술자가 이해할 수 있는 표준 편차를 허용하는 것으로 이해될 수 있고; (v) 범위가 제공되는 경우에는, 종점이 포함된다.
투여 : 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "투여"는 대상체 또는 시스템에 대한 조성물의 투여를 의미한다. 동물 대상체 (예를 들어, 사람)에게 투여하는 것은 적절한 경로에 의한 것일 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 투여는 기관지 (기관지 점적 포함), 협측, 경장, 진피내, 동맥내, 피내, 위내, 골수내, 근내, 비내, 복강내, 척수강내, 정맥내, 뇌실내, 점막, 비강, 구강, 직장, 피하, 설하, 국소, 기관 (기관내 점적 포함), 경피, 질내 및 유리체내일 수 있다. 일부 실시양태에서, 투여는 간헐적 투여를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 투여는 적어도 선택된 기간 동안 연속 투여 (예를 들어, 관류)를 포함할 수 있다.
친화도 : 관련 기술 분야에 공지된 바와 같이, "친화도"는 특정 리간드가 그의 파트너에 결합하는 경우의 그 견고성의 척도이다. 친화도는 다른 방식으로 측정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 친화도는 정량 검정에 의해 측정된다. 이러한 일부 실시양태에서, 결합 파트너 농도는 생리학적 조건을 모방하기 위해 리간드 농도를 초과하도록 고정될 수 있다. 별법으로 또는 추가로, 일부 실시양태에서, 결합 파트너 농도 및/또는 리간드 농도는 다양할 수 있다. 이러한 일부 실시양태에서, 친화도는 비교가능한 조건 (예를 들어, 농도) 하에서 참조 기준과 비교될 수 있다.
작용제: 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "작용제"는 예를 들어 폴리펩티드, 핵산, 당류, 지질, 소분자, 금속 또는 이들의 조합물을 포함하는 임의의 화학적 클래스의 화합물 또는 엔티티 (entity)를 의미할 수 있다. 문맥에서 명확하게 알 수 있듯이, 일부 실시양태에서, 작용제는 세포 또는 유기체, 또는 그의 분획, 추출물 또는 성분일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 작용제는 자연에서 발견되고/되거나 자연으로부터 수득된다는 점에서 천연 생성물이거나 천연 생성물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 작용제는 인간의 손의 작용을 통해 설계, 조작 및/또는 생산되고/되거나 자연에서 발견되지 않는다는 점에서 사람이 만든 하나 이상의 엔티티이거나 이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 작용제는 단리된 또는 순수한 형태로 이용될 수 있고; 일부 실시양태에서, 작용제는 조질 형태로 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 잠재적 작용제는 예를 들어 그 중에서 활성 작용제를 확인하거나 특성화하기 위해 스크리닝될 수 있는 집합체 또는 라이브러리로서 제공된다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 작용제의 일부 특정 실시양태는 소분자, 항체, 항체 단편, 앱타머, 핵산 (예를 들어, siRNA, shRNA, DNA/RNA 하이브리드, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 리보자임), 펩티드, 펩티드 모방체 등을 포함한다. 일부 실시양태에서, 작용제는 중합체이거나 중합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 작용제는 중합체가 아니고/아니거나 임의의 중합체가 실질적으로 없다. 일부 실시양태에서, 제제는 적어도 하나의 중합체 모이어티를 함유한다. 일부 실시양태에서, 작용제는 임의의 중합체 모이어티가 결여되거나 실질적으로 없다.
아미노산 : 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "아미노산"은 그의 가장 넓은 의미에서, 폴리펩티드 사슬에 혼입될 수 있는 임의의 화합물 및/또는 물질을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 아미노산은 일반 구조 H2N-C(H)(R)-COOH를 갖는다. 일부 실시양태에서, 아미노산은 천연 생성 아미노산이다. 일부 실시양태에서, 아미노산은 합성 아미노산이고; 일부 실시양태에서, 아미노산은 d-아미노산이고; 일부 실시양태에서, 아미노산은 l-아미노산이다. "표준 아미노산"은 천연 생성 펩티드에서 통상적으로 발견되는 20개의 표준 l-아미노산 중 임의의 것을 의미한다. "비표준 아미노산"은 합성에 의해 제조했는지 또는 천연 공급원으로부터 얻은 것인지 여부와 관계없이, 표준 아미노산 이외의 다른 임의의 아미노산을 의미한다. 본원에서 사용되는 "합성 아미노산"은 염, 아미노산 유도체 (예를 들어, 아미드) 및/또는 치환을 포함하고 이로 제한되지 않는 화학적으로 변형된 아미노산을 포함한다. 펩티드 내의 카르복시- 및/또는 아미노-말단 아미노산을 비롯한 아미노산은 그의 활성에 유해한 영향을 주지 않으면서 메틸화, 아미드화, 아세틸화, 보호기 및/또는 펩티드의 순환 반감기를 변화시킬 수 있는 다른 화학기로의 치환에 의해 변형될 수 있다. 아미노산은 디술피드 결합에 참여할 수 있다. 아미노산은 하나 이상의 번역후 변형, 예컨대 하나 이상의 화학적 엔티티 (예를 들어, 메틸기, 아세테이트기, 아세틸기, 포스페이트기, 포르밀 모이어티, 이소프레노이드기, 술페이트기, 폴리에틸렌 글리콜 모이어티, 지질 모이어티, 탄수화물 모이어티, 비오틴 모이어티 등)와의 회합을 포함할 수 있다. 용어 "아미노산"은 "아미노산 잔기"와 교환가능하게 사용되고, 자유 아미노산 및/또는 펩티드의 아미노산 잔기를 나타낼 수 있다. 이 용어가 자유 아미노산 또는 펩티드의 잔기를 의미하는지는 그 용어가 사용되는 문맥으로부터 명백해질 것이다.
유사체 : 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "유사체"는 하나 이상의 특정 구조적 특징, 요소, 성분 또는 모이어티를 참조 물질과 공유하는 물질을 지칭한다. 전형적으로, "유사체"는 참조 물질과의 유의한 구조적 유사성을 보이고, 예를 들어 핵심 또는 컨센서스 구조를 공유하지만 별개의 특정 방식으로 다르다. 일부 실시양태에서, 유사체는 참조 물질의 화학적 조작에 의해 참조 물질로부터 생성될 수 있는 물질이다. 일부 실시양태에서, 유사체는 참조 물질을 생성하는 것과 실질적으로 유사한 (예를 들어, 복수의 단계를 공유하는) 합성 공정의 수행을 통해 생성될 수 있는 물질이다. 일부 실시양태에서, 유사체는 참조 물질을 생성하는데 사용된 것과 상이한 합성 공정의 수행을 통해 생성되거나 생성될 수 있다.
동물 : 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "동물"은 동물계의 임의의 구성원을 지칭한다. 일부 실시양태에서, "동물"은 임의의 발달 단계에서의 인간을 의미한다. 일부 실시양태에서, "동물"은 임의의 발달 단계에서의 비-인간 동물을 의미한다. 일부 실시양태에서, 비-인간 동물은 포유동물 (예를 들어, 설치류, 마우스, 래트, 토끼, 원숭이, 개, 고양이, 양, 소, 영장류 및/또는 돼지)이다. 일부 실시양태에서, 동물은 포유동물, 조류, 파충류, 양서류, 어류 및/또는 벌레를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 동물은 트랜스제닉 (transgenic) 동물, 유전자 조작 동물 및/또는 클론일 수 있다.
길항제 : 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "길항제"는 i) 또 다른 작용제의 효과를 억제, 감소 또는 저하시키는; 및/또는 ii) 하나 이상의 생물학적 사건을 억제, 감소, 저하 또는 지연시키는 작용제이다. 길항제는 예를 들어 소분자, 폴리펩티드, 핵산, 탄수화물, 지질, 금속 및/또는 관련 억제 활성을 나타내는 임의의 다른 엔티티를 포함하는 임의의 화학적 종류의 작용제일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 길항제는 직접적일 수도 있거나 (예를 들어 그의 표적에 대해 그의 영향을 직접 미침) 또는 간접적일 수 있다 (예를 들어, 그의 표적에 대한 결합 이외의 다른 방식으로, 예를 들어 표적의 수준 또는 활성이 변경되도록, 예를 들어 표적의 조절자와 상호작용함으로써 그의 영향을 발휘함).
항체 : 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "항체"는 특정 표적 항원에 특이적인 결합을 부여하기에 충분한 표준 이뮤노글로불린 서열 요소를 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다. 관련 기술 분야에 공지된 바와 같이, 자연에서 생산된 무손상 항체는 서로 연관되어 일반적으로 "Y-자형" 구조로 불리는 구조를 형성하는, 2개의 동일한 중쇄 폴리펩티드 (각각 약 50 kD) 및 2개의 동일한 경쇄 폴리펩티드 (각각 약 25 kD)를 포함하는 약 150 kD의 사량체 작용제이다. 각각의 중쇄는 다음과 같이 적어도 4개의 도메인 (각각 약 110개 아미노산 길이)을 포함한다: 아미노-말단 가변 (VH) 도메인 (Y 구조의 말단에 위치함), 이어서 3개의 불변 도메인, 즉 CH1, CH2 및 카르복시-말단 CH3 (Y의 줄기의 기부에 위치함). "스위치"로 알려진 짧은 영역은 중쇄 가변 영역 및 불변 영역을 연결한다. "힌지"는 CH2 및 CH3 도메인을 항체의 나머지 부분에 연결한다. 이 힌지 영역 내의 2개의 디술피드 결합은 2개의 중쇄 폴리펩티드를 무손상 항체에서 서로 연결시킨다. 각각의 경쇄는 또 다른 "스위치"에 의해 서로 분리된 2개의 도메인, 즉 아미노-말단 가변 (VL) 도메인, 이어서 카르복시-말단 불변 (CL) 도메인을 포함한다. 무손상 항체 사량체는 중쇄 및 경쇄가 단일 디술피드 결합에 의해 서로 연결된 2개의 중쇄-경쇄 이량체를 포함하고; 2개의 다른 디술피드 결합은 중쇄 힌지 영역을 서로 연결하여, 이량체가 서로 연결되고 사량체가 형성된다. 천연 생성된 항체는 또한 일반적으로 CH2 도메인에서 글리코실화된다. 천연 항체의 각각의 도메인은 압축된 역평행 베타 배럴 (antiparallel beta barrel)에서 서로에 대해 채워진 (packed) 2개의 베타 시트 (예를 들어, 3-, 4- 또는 5-가닥 시트)로 형성된 "이뮤노글로불린 폴드"를 특징으로 하는 구조를 갖는다. 각각의 가변 도메인은 "상보성 결정 영역" (CDR1, CDR2 및 CDR3)으로 알려진 3개의 초가변 루프 및 4개의 다소 불변인 "프레임워크" 영역 (FR1, FR2, FR3 및 FR4)을 포함한다. 천연 항체가 폴딩할 때, FR 영역은 도메인에 대한 구조적 프레임워크를 제공하는 베타 시트를 형성하고, 중쇄 및 경쇄 둘 모두로부터의 CDR 루프 영역은 3차원 공간에서 함께 모여서 Y 구조의 말단에 위치한 단일 초가변 항원-결합 부위를 생성한다. 항체 폴리펩티드 사슬 간의 아미노산 서열 비교는 2개의 경쇄 (κ 및 λ) 클래스, 몇 개의 중쇄 (예를 들어, μ, γ, α, ε, δ) 클래스 및 특정 중쇄 서브클래스 (α1, α2, γ1, γ2, γ3 및 γ4)를 규정한다. 항체 클래스 (IgA [IgA1, IgA2 포함], IgD, IgE, IgG [IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 포함], IgM)는 사용된 중쇄 서열의 클래스에 기초하여 규정된다. 천연 생성 항체의 Fc 영역은 보체 시스템의 요소, 및 또한 예를 들어 세포독성을 매개하는 이펙터 세포를 포함하는 이펙터 세포 상의 수용체에 결합한다. 관련 기술 분야에 공지된 바와 같이, Fc 수용체에 대한 Fc 영역의 친화도 및/또는 다른 결합 특성은 글리코실화 또는 다른 변형을 통해 조절될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명에 따라 생성 및/또는 이용되는 항체는 변형 또는 조작된 글리코실화를 갖는 Fc 도메인을 포함하는 글리코실화된 Fc 도메인을 포함한다. 본 발명의 목적을 위해, 특정 실시양태에서, 천연 항체에서 발견되는 충분한 이뮤노글로불린 도메인 서열을 포함하는 임의의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체는 그러한 폴리펩티드가 천연 생성되는지 (예를 들어 항원에 반응하는 유기체에 의해 생성됨), 또는 재조합 조작, 화학적 합성 또는 다른 인공 시스템 또는 방법에 의해 생성되는지의 여부와 관계없이 "항체"로 언급될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체는 폴리클로날이고; 일부 실시양태에서, 항체는 모노클로날이다. 일부 실시양태에서, 항체는 마우스, 토끼, 영장류 또는 인간 항체에 특유한 불변 영역 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, 항체 서열 요소는 관련 기술 분야에 공지된 바와 같이 인간화, 영장류화, 키메라 요소 등이다. 또한, 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "항체"는 (달리 언급되거나 문맥상 명확하지 않는 한) 적절한 대안으로 항체 구조 및 기능적 특징을 포착하기 위한 관련 기술 분야에 공지된 또는 개발된 임의의 구축물 또는 포맷을 지칭하는 것으로 이해될 것이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 이 용어는 이중 또는 다른 다중특이적 (예를 들어, 자이바디 (zybody) 등) 항체, 소형 모듈형 면역 약제 (Small Modular ImmunoPharmaceuticals; SMIPsTM), 단일쇄 항체 (scAb), 카멜로이드 항체 및/또는 항체 단편을 의미할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체는 천연 생성될 경우 보유할 공유 변형 (예를 들어, 글리칸의 부착)이 결여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체는 공유 변형 (예를 들어, 글리칸, 페이로드 [예를 들어, 검출가능한 모이어티, 치료 모이어티, 촉매 모이어티 등]의 부착) 또는 다른 매달린 기 (예를 들어, 폴리-에틸렌 글리콜 등)를 보유할 수 있다.
항체 작용제 : 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "항체 작용제"는 특정 항원에 특이적으로 결합하는 작용제를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 이 용어는 특이적 결합을 부여하기에 충분한 이뮤노글로불린 구조 요소를 갖는 임의의 폴리펩티드를 포함한다. 적합한 항체 작용제는 인간 항체, 영장류화 항체, 키메라 항체, 이중특이적 항체, 인간화 항체, 접합된 항체 (즉, 다른 단백질에 접합되거나 융합된 항체, 방사성 표지, 세포독소), 소형 모듈형 면역 약제 ("SMIPsTM"), 단일쇄 항체, 카멜로이드 항체 및 항체 단편을 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 본원에서 사용된 용어 "항체 작용제"는 또한 무손상 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 단일 도메인 항체 (예를 들어, 상어 단일 도메인 항체 (예를 들어, IgNAR 또는 그의 단편)), 적어도 2개의 무손상 항체로 형성된 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체), 및 요구되는 생물학적 활성을 나타내는 항체 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이 용어는 스테이플링된 (stapled) 펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 이 용어는 하나 이상의 항체-유사 결합 펩티드모방체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 이 용어는 하나 이상의 항체-유사 결합 스캐폴드 단백질을 포함한다. 다음의 실시양태에서, 이 용어는 모노바디 (monobody) 또는 애드넥틴 (adnectin)을 포함한다. 많은 실시양태에서, 항체 작용제는 그의 아미노산 서열이 상보성 결정 영역 (CDR)으로서 관련 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 인식되는 하나 이상의 구조적 요소를 포함하는 폴리펩티드이거나 이 폴리펩티드를 포함하고; 일부 실시양태에서, 항체 작용제는 그의 아미노산 서열이 참조 항체에서 발견되는 것과 실질적으로 동일한 적어도 하나의 CDR (예를 들어, 적어도 하나의 중쇄 CDR 및/또는 적어도 하나의 경쇄 CDR)을 포함하는 폴리펩티드이거나 이 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 포함된 CDR은, 서열이 동일하거나 참조 CDR과 비교하여 1-5개의 아미노산 치환을 함유한다는 점에서 참조 CDR과 실질적으로 동일하다. 일부 실시양태에서, 포함된 CDR은 참조 CDR과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 보인다는 점에서 참조 CDR과 실질적으로 동일하다. 일부 실시양태에서, 포함된 CDR은 참조 CDR과 적어도 96%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 보인다는 점에서 참조 CDR과 실질적으로 동일하다. 일부 실시양태에서, 포함된 CDR은 포함된 CDR 내의 적어도 하나의 아미노산이 참조 CDR에 비해 결실, 부가 또는 치환되지만, 포함된 CDR이 그렇지 않으면 참조 CDR과 동일한 아미노산 서열을 갖는다는 점에서 참조 CDR과 실질적으로 동일하다. 일부 실시양태에서, 포함된 CDR은 포함된 CDR 내의 1 내지 5개의 아미노산이 참조 CDR에 비해 결실, 부가 또는 치환되지만, 포함된 CDR이 그렇지 않으면 참조 CDR과 동일한 아미노산 서열을 갖는다는 점에서 참조 CDR과 실질적으로 동일하다. 일부 실시양태에서, 포함된 CDR은 포함된 CDR 내의 적어도 하나의 아미노산이 참조 CDR에 비해 치환되지만, 포함된 CDR이 그렇지 않으면 참조 CDR과 동일한 아미노산 서열을 갖는다는 점에서 참조 CDR과 실질적으로 동일하다. 일부 실시양태에서, 포함된 CDR은 포함된 CDR 내의 1 내지 5개의 아미노산이 참조 CDR에 비해 결실, 부가 또는 치환되지만, 포함된 CDR이 그렇지 않으면 참조 CDR과 동일한 아미노산 서열을 갖는다는 점에서 참조 CDR과 실질적으로 동일하다. 일부 실시양태에서, 항체 작용제는 그의 아미노산 서열이 이뮤노글로불린 가변 도메인으로서 관련 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 인식되는 구조적 요소를 포함하는 폴리펩티드이거나 이 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 작용제는 이뮤노글로불린 결합 도메인에 상동성이거나 대체로 상동성인 결합 도메인을 갖는 폴리펩티드 단백질이다. 항체 작용제라는 용어는 키메라 항원 수용체를 포함한다.
항체 단편 : 본원에서 사용되는 "항체 단편"은 무손상 항체의 일부, 예를 들어 항체의 항원-결합 또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편는 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편; 트리아바디 (triabody); 테트라바디 (tetrabody); 선형 항체; 단일쇄 항체 분자; 및 항체 단편으로 형성된 다중특이적 항체를 포함한다. 예를 들어, 항체 단편은 단리된 단편, 중쇄 및 경쇄의 가변 영역으로 이루어진 "Fv" 단편, 경쇄 및 중쇄 가변 영역이 펩티드 링커로 연결된 재조합 단일쇄 폴리펩티드 분자 ("ScFv 단백질") 및 초가변 영역을 모방하는 아미노산 잔기로 이루어진 최소 인식 단위를 포함한다. 많은 실시양태에서, 항체 단편은 모 항체와 동일한 항원에 결합하는 모 항체의 단편인 모 항체의 충분한 서열을 함유하고; 일부 실시양태에서, 단편은 모 항체와 대등한 친화도로 항원에 결합하고/하거나 항원에 대한 결합을 위해 모 항체와 경쟁한다. 항체의 항원 결합 단편의 예는 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, scFv 단편, Fv 단편, dsFv 디아바디, dAb 단편, Fd' 단편, Fd 단편, 및 단리된 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함한다. 항체의 항원-결합 단편은 임의의 수단에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 항체의 항원-결합 단편은 무손상 항체의 단편화에 의해 효소적 또는 화학적으로 생성될 수 있고/있거나 부분 항체 서열을 코딩하는 유전자로부터 재조합 방식으로 생산될 수 있다. 별법으로 또는 추가로, 항체의 항원-결합 단편은 전체적으로 또는 부분적으로 합성 방식으로 제조될 수 있다. 항체의 항원-결합 단편은 임의로 단일쇄 항체 단편을 포함할 수 있다. 별법으로 또는 추가로, 항체의 항원-결합 단편은 예를 들어 디술피드 결합에 의해 함께 연결된 다중 사슬을 포함할 수 있다. 항체의 항원-결합 단편은 임의로 다중-분자 복합체를 포함할 수 있다. 기능성 항체 단편은 전형적으로 적어도 약 50개의 아미노산을 포함하고, 보다 전형적으로는 적어도 약 200개의 아미노산을 포함한다.
항체 폴리펩티드 : 본원에서 사용되는 바와 같이, 교환가능하게 사용될 수 있는 용어 "항체 폴리펩티드" 또는 "항체" 또는 "그의 항원-결합 단편"은 에피토프에 결합할 수 있는 폴리펩티드(들)를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 항체 폴리펩티드는 전장 항체이고, 일부 실시양태에서 전체 길이보다 작지만 적어도 하나의 결합 부위 (항체 "가변 영역"의 구조를 갖는 적어도 하나, 바람직하게는 적어도 2개의 서열을 포함함)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 용어 "항체 폴리펩티드"는 이뮤노글로불린-결합 도메인에 상동성이거나 대체로 상동성인 결합 도메인을 갖는 임의의 단백질을 포함한다. 특정 실시양태에서, "항체 폴리펩티드"는 이뮤노글로불린-결합 도메인과 적어도 99%의 동일성을 나타내는 결합 도메인을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, "항체 폴리펩티드"는 이뮤노글로불린-결합 도메인, 예를 들어 참조 이뮤노글로불린-결합 도메인과 적어도 70%, 80%, 85%, 90% 또는 95%의 동일성을 나타내는 결합 도메인을 갖는 임의의 단백질이다. 포함된 "항체 폴리펩티드"는 천연 공급원에서 발견되는 항체와 동일한 아미노산 서열을 가질 수 있다. 본 발명에 따른 항체 폴리펩티드는 예를 들어 천연 공급원 또는 항체 라이브러리로부터의 단리, 숙주 시스템에서의 또는 숙주 시스템을 사용한 재조합 생산, 화학적 합성 등, 또는 이들의 조합을 포함하는 임의의 이용가능한 수단에 의해 제조될 수 있다. 항체 폴리펩티드는 모노클로날 또는 폴리클로날일 수 있다. 항체 폴리펩티드는 다음 인간 클래스 중 임의의 것을 포함하는 임의의 이뮤노글로불린 클래스의 구성원일 수 있다: IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE. 특정 실시양태에서, 항체는 IgG 이뮤노글로불린 클래스의 구성원일 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "항체 폴리펩티드" 또는 "항체의 특징적인 부분"은 교환가능하게 사용되고, 관심 에피토프에 결합하는 능력을 갖는 항체의 임의의 유도체를 지칭한다. 특정 실시양태에서, "항체 폴리펩티드"는 전장 항체의 특이적 결합능의 적어도 유의한 부분을 보유하는 항체 단편이다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2, scFv, Fv, dsFv 디아바디 및 Fd 단편을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 별법으로 또는 추가로, 항체 단편은 예를 들어 디술피드 연결에 의해 함께 연결된 다중 사슬을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체 폴리펩티드는 인간 항체일 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체 폴리펩티드는 인간화될 수 있다. 인간화 항체 폴리펩티드는 비-인간 이뮤노글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 이뮤노글로불린, 이뮤노글로불린 사슬 또는 항체 폴리펩티드 (예컨대 Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 항체의 다른 항원-결합 하위 서열)일 수 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 수용자의 상보성 결정 영역 (CDR)으로부터의 잔기가 요구되는 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 마우스, 래트 또는 토끼와 같은 비-인간 종 (공여자 항체)의 CDR로부터의 잔기로 교체된 인간 이뮤노글로불린 (수용자 항체)이다.
항원 : "항원"은 i) 면역 반응을 유도하고/하거나; (ii) 예를 들어 유기체에 노출되거나 투여될 때, T 세포 수용체 (예를 들어, MHC 분자에 의해 제시되는 경우) 또는 항체 (예를 들어, B 세포에 의해 생성되는)에 의해 특이적으로 결합되는 분자 또는 엔티티이다. 일부 실시양태에서, 항원은 유기체에서 체액 반응 (예를 들어 항원-특이적 항체의 생성을 포함)을 유도하고; 별법으로 또는 추가로, 일부 실시양태에서, 항원은 유기체에서 세포 반응 (예를 들어, 그의 수용체가 항원과 특이적으로 상호작용하는 T- 세포를 포함)을 유도한다. 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 특정 항원이 표적 유기체 (예를 들어, 마우스, 토끼, 영장류, 인간)의 하나 또는 여러 구성원에서 면역 반응을 유도할 수 있지만, 표적 유기체 종의 모든 구성원에서 면역 반응을 유도하는 것은 아님을 이해할 것이다. 일부 실시양태에서, 항원은 표적 유기체 종의 구성원의 적어도 약 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%에서 면역 반응을 유도한다. 일부 실시양태에서, 항원은 항체 및/또는 T 세포 수용체에 결합하고, 유기체에서 특정 생리적 반응을 유도할 수도 있고 유도하지 않을 수도 있다. 일부 실시양태에서, 예를 들어, 항원은 생체 내에서 이러한 상호작용이 발생하는지 여부와 관계없이, 시험관 내에서 항체 및/또는 T 세포 수용체에 결합할 수 있다. 일반적으로, 항원은 임의의 화학적 엔티티, 예컨대 예를 들어, 소분자, 핵산, 폴리펩티드, 탄수화물, 지질, 중합체 [일부 실시양태에서 생물학적 중합체 이외의 다른 (예를 들어, 핵산 또는 아미노산 중합체 이외의 다른)] 등이거나 이를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항원은 폴리펩티드이거나 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원은 글리칸이거나 글리칸을 포함한다. 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 일반적으로 항원이 단리되거나 순수한 형태로 제공되거나 이용될 수 있거나, 또는 별법으로 조질 형태로 (예를 들어, 다른 물질, 예를 들어 추출물, 예컨대 세포 추출물 또는 항원 함유 공급원의 다른 비교적 조잡한 제제와 함께) 제공될 수 있음을 인식할 것이다. 일부 실시양태에서, 항원은 재조합 항원이거나 이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원은 폴리펩티드 또는 그의 일부이거나 이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원은 감염 인자와 관련된다 (예를 들어, 감염 인자에 의해 발현된다). 일부 실시양태에서, 항원은 암과 (예를 들어, 종양 세포 및/또는 전이와) 관련된다.
항원-결합 단편 : 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "항원-결합 단편"은 항원에 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편을 말한다. 항체의 항원-결합 기능은 무손상 항체의 단편에 의해 수행될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 항체의 "항원-결합 단편"이라는 용어 내에 포함되는 결합 단편의 예는 다음을 포함한다: (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 디술피드 다리에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 아암 (arm)의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편, (v) VH 도메인으로 이루어진 dAb 단편 (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546); (vi) 추가의 서열 (링커, 프레임워크 영역(들) 등)을 포함하거나 포함하지 않는 단리된 상보성 결정 영역 (CDR), 예를 들어 VH CDR3 및 (vii) 추가의 서열 (링커, 프레임워크 영역(들) 등)을 포함하거나 포함하지 않는 2 내지 6개의 단리된 CDR의 조합물. 또한, Fv 단편의 2개의 도메인인 VL 및 VH가 별개의 유전자에 의해 코딩되지만, 이들은 VL 및 VH 영역이 쌍을 이루어 1가 분자 (단일쇄 Fv (scFv)로 알려짐; 예를 들어 문헌 [Bird et al. (1988) Science 242:423-426] 및 [Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883] 참고)를 형성하는 단일 폴리펩티드 사슬로 만들어질 수 있도록 하는 합성 링커에 의해 재조합 방법을 사용하여 결합될 수 있다. 이러한 단일쇄 항체는 또한 항체의 "항원-결합 단편"이라는 용어 내에 포함되는 것으로 의도된다. 또한, 항원-결합 단편은 (i) 이뮤노글로불린 힌지 영역 폴리펩티드에 융합된 결합 도메인 폴리펩티드 (예컨대 중쇄 가변 영역, 경쇄 가변 영역 또는 링커 펩티드를 통해 경쇄 가변 영역에 융합된 중쇄 가변 영역), (ii) 힌지 영역에 융합된 이뮤노글로불린 중쇄 CH2 불변 영역 및 (iii) CH2 불변 영역에 융합된 이뮤노글로불린 중쇄 CH3 불변 영역을 포함하는 결합-도메인 이뮤노글로불린 융합 단백질을 포함한다. 힌지 영역은 이량체화를 방지하기 위해 하나 이상의 시스테인 잔기를 세린 잔기로 교체함으로써 변형될 수 있다. 이러한 결합-도메인 이뮤노글로불린 융합 단백질은 US 2003/0118592 및 US 2003/0133939에 추가로 개시되어 있다. 이들 항체 단편은 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 공지된 통상적인 기술을 사용하여 수득되고, 단편은 무손상 항체와 동일한 방식으로 유용성에 대해 스크리닝된다. 또한, 항원-결합 단편은 표준 분자 생물학적 수단에 의해 조작될 수 있는 2가 (또는 이가) 단일쇄 가변 단편 (디-scFv, 비-scFv) 또는 별법으로 소위 디아바디를 포함한다.
항원 제시 세포 : 본원에서 사용되는 "항원 제시 세포" 또는 "APC"라는 문구는 항원을 처리하여 T 세포에 제시하는 세포를 나타내는, 그의 관련 기술 분야에서 이해되는 의미를 갖는다. 예시적인 항원 세포는 수지상 세포, 대식세포 및 특정 활성화된 상피세포를 포함한다.
항원 동일성 : 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "항원 동일성" (AI)은 관련 참조 폴리펩티드 (예를 들어, 대유행성 HA일 수 있는 모 HA 폴리펩티드) 또는 그의 일부와 공유되는 관심 폴리펩티드 또는 그의 일부 [예를 들어, HA 폴리펩티드 또는 그의 에피토프 (예를 들어, 면역우성 에피토프) 내의] 아미노산 부분의 백분율을 의미한다. 임의의 2개의 폴리펩티드 또는 서열의 비교로부터 유래된 AI 값은 0 내지 100의 수이고, 100의 값은 2개의 폴리펩티드 또는 그의 일부의 서열이 동일함을 나타낸다.
대략 : 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "대략" 및 "약"은 관련 문맥에 적합한 것으로 관련 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 이해되는 정상적인 통계적 변화를 포함하도록 의도된다. 특정 실시양태에서, 용어 "대략" 또는 "약"은 달리 언급되거나 문맥상 명백하지 않는 한 (예를 들어, 그러한 숫자가 가능한 값의 100%를 초과하는 경우가 아니라면), 언급된 값의 어느 한 방향으로 (더 크거나 더 작음) 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 내에 해당하는 값의 범위를 각각 의미한다.
와 관련(회합)된다 : 하나의 존재, 수준 및/또는 형태가 다른 것과 관련되어 있다면, 2개의 이벤트 또는 엔티티는 서로 "관련된다". 예를 들어, 특정 엔티티 (예를 들어, 폴리펩티드)는 그 존재, 수준 및/또는 형태가 질환, 장애 또는 병태의 발병률 및/또는 감수성과 관련이 있는 경우 (예를 들어, 관련 집단에 걸쳐) 특정 질환, 장애 또는 병태와 관련된 것으로 간주된다. 일부 실시양태에서, 2개 이상의 엔티티는 이들이 서로 직접적으로 또는 간접적으로 상호작용하여 서로 물리적으로 근접하게 유지되는 경우 서로 물리적으로 "회합된다". 일부 실시양태에서, 서로 물리적으로 회합되는 2 이상의 엔티티는 서로 공유 연결되고; 일부 실시양태에서, 서로 물리적으로 관련된 2 이상의 엔티티는 서로 공유 연결되지 않지만, 예를 들어 수소 결합, 반 데르 발스 상호작용, 소수성 상호작용, 자성 및 이들의 조합에 의해 비공유 회합된다.
생물학적 활성 : 본원에서 사용되는 바와 같이, "생물학적으로 활성"이란 용어는 생물학적 시스템에서 (예를 들어, 세포에서 (예를 들어, 단리된 상태에서, 배양액에서, 조직 내에서, 또는 생체 내에서), 세포 배양액에서, 조직 내에서, 유기체 내에서 등) 활성을 갖는 물질을 지칭한다. 예를 들어, 유기체에 투여될 때 그 유기체에 대해 생물학적 영향을 미치는 물질은 생물학적으로 활성인 것으로 간주된다. 생물학적 활성 물질의 일부 또는 단편만이 활성 존재를 위해 요구되는 (예를 들어, 필요하고 충분한) 것이 관련 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 인식될 것이고; 그러한 상황에서 해당 부분 또는 단편은 "생물학적으로 활성인" 부분 또는 단편으로 간주된다.
결합 : 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "결합"은 전형적으로 2 이상의 엔티티 사이 또는 이들 중에서의 비-공유 회합을 지칭함을 이해할 것이다. "직접적인" 결합은 엔티티 또는 모이어티 사이의 물리적 접촉을 포함하고, 간접적인 결합은 하나 이상의 중간 엔티티와의 물리적 접촉을 통한 물리적 상호작용을 포함한다. 2 이상의 엔티티 사이의 결합은 일반적으로 상호작용하는 엔티티 또는 모이어티가 단독으로 또는 보다 복잡한 시스템의 맥락에서 연구되는 경우 (예를 들어, 담체 엔티티 및/또는 생물학적 시스템 또는 세포와 공유 또는 다른 방식으로 회합된 상태에서)를 포함하는 다양한 상황에서 평가될 수 있다.
결합제 : 일반적으로, 용어 "결합제"는 본원에서 기술된 바와 같이 관심 표적에 결합하는 임의의 엔티티를 지칭하는데 사용된다. 많은 실시양태에서, 관심 결합제는 특정 상호작용 측면에서 다른 잠재적 결합 파트너로부터 그의 표적을 구별한다는 점에서 그의 표적과 특이적으로 결합하는 것이다. 일반적으로, 결합제는 임의의 화학적 클래스 (예를 들어, 중합체, 비-중합체, 소분자, 폴리펩티드, 탄수화물, 지질, 핵산 등)의 엔티티이거나 이를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 결합제는 단일 화학적 엔티티이다. 일부 실시양태에서, 결합제는 비공유 상호작용에 의해 관련 조건 하에서 서로 회합된 2 이상의 개별 화학적 엔티티의 복합체이다. 예를 들어, 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 일부 실시양태에서 결합제가 "일반적인" 결합 모이어티 (예를 들어, 비오틴/아비딘/스트렙타비딘 및/또는 클래스-특이적 항체 중 하나) 및 "특이적" 결합 모이어티 (예를 들어, 특정 분자 표적을 갖는 항체 또는 앱타머)를 포함할 수 있음을 이해할 것이다. 일부 실시양태에서, 이러한 접근법은 동일한 일반 결합 모이어티 파트너와 상이한 특이적 결합 모이어티의 연결을 통한 다수 결합제의 모듈식 조립을 허용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 결합제는 폴리펩티드 (예를 들어, 항체 또는 항체 단편 포함)이거나 이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 결합제는 소분자이거나 이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 결합제는 핵산이거나 이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 결합제는 앱타머이다. 일부 실시양태에서, 결합제는 중합체이고; 일부 실시양태에서, 결합제는 중합체가 아니다. 일부 실시양태에서, 결합제는 중합체 모이어티가 없기 때문에 비-중합체이다. 일부 실시양태에서, 결합제는 탄수화물이거나 이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 결합제는 렉틴이거나 이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 결합제는 펩티드 모방체이거나 이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 결합제는 스캐폴드 단백질이거나 이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 결합제는 미메오토프 (mimeotope)이거나 이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 결합제는 스테이플링된 펩티드이거나 이를 포함한다. 특정 실시양태에서, 결합제는 DNA 또는 RNA와 같은 핵산이거나 이를 포함한다.
특징적인 부분 : 본원에서 사용된 바와 같이, "특징적인 부분"이라는 용어는 가장 넓은 의미에서, 그의 존재 (또는 부재)가 물질의 특정 특징, 속성 또는 활성의 존재 (또는 부재)와 상호 관련되는 물질의 일부를 지칭하는데 사용된다. 일부 실시양태에서, 물질의 특징적인 부분은 물질에서 및 특정 특징, 속성 또는 활성을 공유하는 관련 물질에서 발견되지만 특정 특징, 속성 또는 활성을 공유하지 않는 물질에서는 발견되지 않는 부분이다. 특정 실시양태에서, 특징적인 부분은 무손상 물질과 적어도 하나의 기능적 특징을 공유한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 단백질 또는 폴리펩티드의 "특징적인 부분"은 함께 단백질 또는 폴리펩티드의 특징인 아미노산의 연속적인 스트레치 또는 아미노산의 연속적인 스트레치의 집합체를 함유하는 것이다. 일부 실시양태에서, 각각의 이러한 연속적인 스트레치는 일반적으로 적어도 2, 5, 10, 15, 20, 50개 또는 그 이상의 아미노산을 함유한다. 일반적으로, 물질 (예를 들어, 단백질, 항체 등)의 특징적인 부분은 위에 명시된 서열 및/또는 구조적 동일성 외에 관련 무손상 물질과 적어도 하나의 기능적 특성을 공유한다. 일부 실시양태에서, 특징적인 부분은 생물학적으로 활성일 수 있다.
특징적인 서열 : "특징적인 서열"은 폴리펩티드 또는 핵산의 패밀리의 모든 구성원에서 발견되는 서열이고, 따라서 패밀리의 구성원을 정의하기 위해 관련 기술 분야의 통상의 기술자가 사용할 수 있다.
특징적인 서열 요소 : 본원에서 사용된 "특징적인 서열 요소"라는 문구는 그 중합체의 특징적인 부분을 나타내는 중합체 (예를 들어, 폴리펩티드 또는 핵산)에서 발견되는 서열 요소를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 특징적인 서열 요소의 존재는 중합체의 특정 활성 또는 특성의 존재 또는 수준과 상호관련된다. 일부 실시양태에서, 특징적인 서열 요소의 존재 (또는 부재)는 특정 중합체를 특정 중합체의 특정 패밀리 또는 군의 구성원 (또는 비-구성원)으로서 규정한다. 특징적인 서열 요소는 전형적으로 적어도 2개의 단량체 (예를 들어, 아미노산 또는 뉴클레오티드)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 특징적인 서열 요소는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50개 또는 그 초과의 단량체 (예를 들어, 연속적으로 연결된 단량체)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 특징적인 서열 요소는 그의 길이가 서열 요소를 공유하는 중합체에 걸쳐 변할 수도 있고 변하지 않을 수도 있는 하나 이상의 스페이서 영역에 의해 이격된 연속적인 단량체의 적어도 제1 및 제2 스트레치를 포함한다.
키메라 항원 수용체/입양 세포 요법 : 단일쇄 가변 단편 (scFv)을 포함하는 본 발명의 항체 작용제는 키메라 항원 수용체의 제조에 사용될 수 있고, 이의 제조 및 사용은 관련 기술 분야에 일반적으로 공지되어 있다. 키메라 항원 수용체 (CAR)는 전형적으로 T 세포 신호전달 도메인에 연결된 scFv 또는 다른 항체 작용제의 항원 결합 도메인을 함유하는 인위적으로 구축된 하이브리드 단백질 또는 폴리펩티드이다. CAR의 특징은 T 세포 특이성 및 반응성을 모노클로날 항체의 항원-결합 특성을 이용하여 비-MHC-제한 방식으로 선택된 표적을 향하도록 전환시키는 능력을 포함한다. 비-MHC-제한 항원 인식은 CAR을 발현하는 T 세포에게 항원 처리와 무관하게 항원을 인식할 수 있는 능력을 부여하고, 이에 의해 종양 회피의 주요 메카니즘을 우회한다. 키메라 항원 수용체는 예를 들어 입양 세포 요법을 비롯한 치료 처치를 위해 사용될 수 있다. 입양 세포 요법은 전형적으로 면역 세포, 종종 T 세포의 단리 및 생체 외 팽창 및/또는 조작, 및 예를 들어 암의 치료를 위한 이들 세포의 환자에 대한 후속 투여를 포함하는 치료 방법이다. 투여된 세포는 자가 또는 동종이계 세포일 수 있다. 세포는 예를 들어, RNA 및 DNA 형질감염을 사용하는 것을 포함하여 공지된 방법 중 임의의 하나에서 키메라 항원 수용체를 발현하도록 조작될 수 있고, 이들 기술은 모두 관련 기술 분야에 공지되어 있다.
조합 요법 : 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "조합 요법"은 2개 이상의 다른 약제 또는 치료제를 중복 또는 연속 요법으로 투여하여 대상체가 두 작용제에 동시에 또는 순차적으로 노출되는 상황을 의미한다. "와 조합하여"라는 것은 이러한 전달 방법이 본 발명의 범위 내에 있음에도 불구하고, 작용제들이 동시에 투여되고/되거나 함께 전달되도록 제제화되어야 함을 의미하고자 의도되지 않는다. 본 발명의 조성물은 하나 이상의 다른 요구되는 치료제 또는 의학적 처치와 동시에, 전에 또는 후에 투여될 수 있다. 조합 사용되는 치료 활성제는 단일 조성물로 함께 투여되거나 상이한 조성물로 별개로 투여될 수 있음을 이해할 것이다. 일반적으로, 각각의 작용제는 그 작용제에 대해 결정된 투여량 및/또는 시간 스케쥴로 투여될 것이다.
비교가능한 : 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "비교가능한"은 서로 동일하지는 않을 수 있지만, 관찰된 차이점 또는 유사점을 바탕으로 결론을 합리적으로 도출할 수 있도록 그 사이의 비교를 허용하기에 충분히 유사한 2 이상의 작용제, 엔티티, 상황, 조건 세트 등을 지칭한다. 일부 실시 예에서, 조건, 상황, 개체 또는 집단의 비교가능한 세트는 복수의 실질적으로 동일한 특징 및 하나 또는 소수의 다양한 특징에 의해 특성화된다. 관련 기술 분야의 통상의 기술자라면, 2 이상의 상기 작용제, 엔티티, 상황, 조건 세트 등이 비교가능한 것으로 여겨지는 임의의 제시된 상황에서 어떤 정도의 동일성이 요구되는지를 이해할 것이다. 예를 들어, 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 상이한 환경 세트, 개체 또는 집단에서 또는 이들과 함께 수득된 결과 또는 관찰되는 현상의 상이성이, 변화된 특징의 차이에 의해 유발되거나 그 차이를 나타낸다는 합리적인 결론을 보장하기에 충분한 수 및 유형의 실질적으로 동일한 특징에 의해 특성화될 때, 환경 세트, 개체 또는 집단은 서로 비교될 수 있음을 인식할 것이다.
에 대응하는 : 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "대응하는"은 적당한 참조 작용제에 존재하는 것과 위치를 공유하는 관심 작용제의 구조적 요소 또는 모이어티를 나타내기 위해 종종 사용된다 (예를 들어, 3차원 공간에서 또는 다른 요소 또는 모이어티에 대해)를 넣는다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 이 용어는 폴리펩티드 내의 아미노산 잔기 또는 핵산의 뉴클레오티드 잔기와 같은, 중합체 내의 잔기의 위치/동일성을 지칭하는데 사용된다. 통상의 기술자라면, 간략화를 위해, 그러한 중합체 내의 잔기가 종종 참조 관련 중합체에 기초한 표준 넘버링 시스템을 사용하여 지정되어, 참조 중합체 내의 위치 190의 잔기에 "대응하는" 제1 중합체 내의 잔기는 예를 들어 실제로 제1 중합체에서 190번째 잔기일 필요는 없고, 오히려 참조 중합체에서 190번째 위치에서 발견된 잔기에 대응함을 이해할 것이고; 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 중합체 서열 비교를 위해 특별히 고안된 하나 이상의 상업적으로 이용가능한 알고리즘의 사용을 포함하여 "대응하는" 아미노산을 확인하는 방법을 쉽게 이해할 것이다.
유도체 : 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "유도체"는 참조 물질의 구조적 유사체를 지칭한다. 즉, "유도체"는 참조 물질과의 유의한 구조적 유사성을 나타내는 물질, 예를 들어 핵심 또는 컨센서스 구조를 공유하지만 별개의 특정 방식에서 또한 상이한 물질이다. 일부 실시양태에서, 유도체는 화학적 조작에 의해 참조 물질로부터 생성될 수 있는 물질이다. 일부 실시양태에서, 유도체는 참조 물질을 생성하는 것과 실질적으로 유사한 (예를 들어, 복수의 단계를 공유하는) 합성 공정의 수행을 통해 생성될 수 있는 물질이다.
검출 엔티티/ 검출제 : 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "검출 엔티티" 또는 "검출제"는 검출가능한 임의의 요소, 분자, 관능기, 화합물, 단편 또는 모이어티를 말한다. 일부 실시양태에서, 검출 엔티티는 단독으로 제공되거나 이용된다. 일부 실시양태에서, 검출 엔티티는 다른 검출제와 관련하여 (예를 들어, 연결되어) 제공 및/또는 이용된다. 검출 엔티티의 예는 다음을 포함하고 이로 제한되지 않는다: 다양한 리간드, 방사성 핵종 (예를 들어, 3H, 14C, 18F, 19F, 32P, 35S, 135I, 125I, 123I, 64Cu, 187Re, 111In, 90Y, 99mTc, 177Lu, 89Zr 등), 형광 염료 (특정 예시적인 형광 염료에 대해서는 하기 참조), 화학발광제 (예컨대, 아크리디눔 에스테르, 안정화된 디옥세탄 등), 생물발광제, 분광적으로 분해가능한 무기 형광 반도체 나노결정 (예를 들어, 양자점), 금속 나노입자 (예를 들어, 금, 은, 구리, 백금 등) 나노클러스터, 상자성 금속 이온, 효소 (효소의 구체적인 예에 대해서는 하기 참조), 비색 표지 (예컨대, 염료, 콜로이드성 금 등), 비오틴, 디옥시게닌, 합텐, 및 그에 대한 항혈청 또는 모노클로날 항체가 이용가능한 단백질.
결정하다 : 본원에서 설명되는 많은 방법은 "결정" 단계를 포함한다. 관련 기술 분야의 통상의 기술자라면, 본 명세서를 읽으면, 그러한 "결정"이 예를 들어 본원에서 명시적으로 언급된 특정 기술을 비롯하여 통상의 기술자가 이용할 수 있는 임의의 다양한 기술을 이용하거나 이들의 이용을 통해 달성할 수 있음을 이해할 것이다. 일부 실시양태에서, 결정은 물리적 샘플의 조작을 포함한다. 일부 실시양태에서, 결정은 예를 들어 관련 분석을 수행하기에 적합한 컴퓨터 또는 다른 처리 장치를 이용하여 데이터 또는 정보의 고려 및/또는 조작을 포함한다. 일부 실시양태에서, 결정은 공급원으로부터 관련 정보 및/또는 물질을 수용하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 결정은 샘플 또는 엔티티의 하나 이상의 특징을 비교가능한 참조 기준과 비교하는 것을 포함한다.
투여 형태 : 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "투여 형태"는 대상체에게 투여하기 위한 활성제 (예를 들어, 치료제 또는 진단제)의 물리적으로 분리된 단위를 의미한다. 각각의 단위에는 미리 정해진 양의 활성제가 들어 있다. 일부 실시양태에서, 그러한 양은 관련 집단에 투여될 때 원하는 또는 유익한 결과와 상호관련이 있다고 결정된 투여 요법에 따라 (즉, 치료 투여 요법으로) 투여하기에 적합한 단위 투여량 (또는 그의 전체 분획)이다. 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 특정 대상체에게 투여되는 치료 조성물 또는 치료제의 총량이 1명 이상의 주치의에 의해 결정되고, 다중 투여 형태의 투여를 포함할 수 있음을 인식한다.
투여 요법 : 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "투여 요법"은 일반적으로 일정 시간 간격으로 분리된, 대상체에게 개별적으로 투여되는 단위 투여 (전형적으로 1회 초과)의 세트를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 제시된 치료제는 1회 이상의 투여를 수반할 수 있는 권장 투여 요법으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 투여 요법은 각각 동일한 시간 간격으로 서로 분리된 복수의 투여를 포함하고; 일부 실시양태에서, 투여 요법은 복수의 투여 및 개별 투여를 분리하는 적어도 2개의 상이한 시간 간격을 포함한다. 일부 실시양태에서, 투여 요법 내의 모든 투여량은 동일한 단위 투여량이다. 일부 실시양태에서, 투여 요법 내의 상이한 투여량은 상이한 양이다. 일부 실시양태에서, 투여 요법은 제1 투여량의 제1 투여, 이어서 제1 투여량과 상이한 제2 투여량의 1회 이상의 추가의 투여를 포함한다. 일부 실시양태에서, 투여 요법은 제1 투여량의 제1 투여, 이어서 제1 투여량과 동일한 제2 투여량의 1회 이상의 추가의 투여를 포함한다. 일부 실시양태에서, 투여 요법은 관련 집단에 투여될 때 원하는 또는 유익한 결과와 밀접한 관련이 있다 (즉, 치료 투여 요법이다).
조작된 : 일반적으로, "조작된"이란 용어는 사람의 손에 의해 조작된 측면을 의미한다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드는 자연에서 그 순서로 함께 연결되지 않은 2개 이상의 서열이 사람의 손으로 조작되어 조작된 폴리뉴클레오티드에서 서로 직접 연결될 때 "조작"된 것이다. 예를 들어, 본 발명의 일부 실시양태에서, 조작된 폴리뉴클레오티드는, 자연에서 제1 코딩 서열과 작동적으로 연관되지만 제2 코딩 서열과는 작동적으로 연관되지 않은 상태로 발견되는 조절 서열을 포함하고, 여기서 조절 서열은 제2 코딩 서열과 작동적으로 연관되도록 사람의 손에 의해 연결된다. 이와 유사하게, 세포 또는 유기체가 조작되어 그의 유전 정보가 변경되면 (예를 들어, 이전에 존재하지 않은 새로운 유전 물질이 형질전환, 교배, 체세포 교잡, 형질감염, 형질도입, 또는 다른 메카니즘에 의해 도입되거나, 또는 이전에 존재하는 유전 물질이 예를 들어 치환 또는 결실 돌연변이에 의해 또는 교배 프로토콜에 의해 변경되거나 제거됨), 세포 또는 유기체는 "조작된" 것으로 간주된다. 통상적인 관례로서 관련 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 이해되는 바와 같이, 조작된 폴리뉴클레오티드 또는 세포의 자손체는 실제 조작이 이전 개체에 대해 수행되더라도 일반적으로 여전히 "조작된" 것으로 언급된다.
에피토프 : 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "에피토프"는 관련 기술 분야에서 이해되는 의미를 갖는다. 항원 결정자로도 알려져 있는 에피토프는 면역계, 구체적으로 항체, B 세포 또는 T 세포에 의해 인식되는 항원의 분자 영역임을 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 이해할 것이다. 에피토프는 당, 지질 또는 아미노산으로 이루어질 수 있음을 추가로 이해될 것이다. 단백질 항원의 에피토프는 그의 구조 및 파라토프 (paratope) (에피토프를를 인식하는 항체의 일부)와의 상호작용에 기초하여, 입체형태적 에피토프 및 선형 에피토프라는 2개의 범주로 나뉜다. 입체형태적 에피토프는 항원의 아미노산 서열의 불연속 부분으로 이루어지고, 이들 에피토프는 항원의 3-D 표면 특징 및 형태 또는 3차 구조에 기초하여 파라토프와 상호작용한다. 선형 에피토프는 그의 1차 구조에 기초하여 파라토프와 상호작용하고, 선형 에피토프는 항원으로부터의 아미노산의 연속 서열에 의해 형성된다.
발현 : 본원에서 사용되는 바와 같이, 핵산 서열의 "발현"은 하기 이벤트 중 하나 이상을 지칭한다: (1) DNA 서열로부터 RNA 주형의 생산 (예를 들어, 전사에 의한); (2) RNA 전사체의 처리 (예를 들어, 스플라이싱, 편집, 5' 캡 형성 및/또는 3' 말단 형성); (3) RNA의 폴리펩티드 또는 단백질로의 번역; 및/또는 (4) 폴리펩티드 또는 단백질의 번역후 변형.
기능적 : 본원에서 사용된 "기능적" 생물학적 분자는 그것이 특성화되는 특성 및/또는 활성을 보이는 형태의 생물학적 분자이다. 생물학적 분자는 2개의 기능 (즉, 2기능성) 또는 많은 기능 (즉, 다기능성)을 가질 수 있다.
단편 : 본원에서 설명되는 바와 같은 물질 또는 엔티티의 "단편"은 전체의, 그러나 전체에서 발견되는 하나 이상의 모이어티가 결여된 불연속적인 부분을 포함하는 구조를 갖는다. 일부 실시양태에서, 단편은 상기 불연속적인 부분으로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 단편은 전체에서 발견되는 특징적인 구조적 요소 또는 모이어티로 이루어지거나 이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 중합체 단편은 전체 중합체에서 발견되는 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500개 또는 그 초과의 단량체 단위 (예를 들어, 잔기)를 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 중합체 단편은 중합체 전체에서 발견되는 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 25%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 초과의 단량체 단위 (예를 들어, 잔기)를 포함하거나 이로 이루어진다. 전체적인 물질 또는 엔티티는 일부 실시양태에서 전체의 "모체"로 언급될 수 있다.
유전자 : 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "유전자"는 관련 기술 분야에서 이해되는 의미를 갖는다. 용어 "유전자"는 유전자 조절 서열 (예를 들어, 프로모터, 인핸서 등) 및/또는 인트론 서열을 포함할 수 있음이 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 이해될 것이다. 유전자의 정의에는 단백질을 코딩하지 않고 오히려 tRNA, RNAi-유도제 등과 같은 기능성 RNA 분자를 코딩하는 핵산에 대한 언급이 포함됨을 이해할 것이다. 명확하게 하기 위해, 본 발명자들은 본원에서 사용되는 바와 같이 용어 "유전자"가 일반적으로 단백질을 코딩하는 핵산의 일부를 지칭하고; 이 용어는 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 문맥으로부터 명백할 바와 같이 조절 서열을 임의로 포함할 수 있음을 언급한다. 이 정의는 비-단백질 코딩 발현 단위에 대해 "유전자"라는 용어를 적용하는 것을 배제하는 것이 아니라, 대부분의 경우 본 명세서에서 사용된 용어가 단백질 코딩 핵산을 지칭한다는 것을 명확히 하기 위한 것이다.
유전자 산물 또는 발현 산물 : 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "유전자 산물" 또는 "발현 산물"은 일반적으로 유전자로부터 전사된 RNA (처리 전 및/또는 후) 또는 유전자로부터 전사된 RNA에 의해 코딩되는 폴리펩티드 (변형 전 및/또는 후)를 지칭한다.
고친화도 결합 : 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "고친화도 결합"은 특정 리간드가 그의 파트너에 결합하는 고도의 견고성을 지칭한다. 친화도는 관련 기술 분야에 공지된 것을 포함하여 임의의 이용가능한 방법에 의해 측정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 결합은 Kd가 결합 검정에서 약 500 pM 이하 (예를 들어, 약 400 pM, 약 300 pM, 약 200 pM, 약 100 pM, 약 90 pM, 약 80 pM, 약 70 pM, 약 60 pM, 약 50 pM, 약 40 pM, 약 30 pM, 약 20 pM, 약 10 pM, 약 5 pM, 약 4 pM, 약 3 pM, 약 2 pM 미만 등)이면 고친화도인 것으로 간주된다. 일부 실시양태에서, 결합은 선택된 참조 폴리펩티드보다 관심 폴리펩티드에 대해 친화도가 더 강하면 (예를 들어, Kd가 더 낮으면) 고친화도인 것으로 간주된다. 일부 실시양태에서, 결합은 관심 폴리펩티드에 대한 Kd 대 선택된 참조 폴리펩티드에 대한 Kd의 비가 1:1 이하 (예를 들어, 0.9:1, 0.8:1, 0.7:1, 0.6:1, 0.5:1. 0.4:1, 0.3:1, 0.2:1, 0.1:1, 0.05:1, 0.01:1 또는 그 미만)이면 고친화도인 것으로 간주된다. 일부 실시양태에서, 결합은 관심 폴리펩티드에 대한 Kd가 선택된 참조 폴리펩티드에 대한 Kd의 약 100% 이하 (예를 들어, 약 99%, 약 98%, 약 97%, 약 96%, 약 95%, 약 90%, 약 85%, 약 80%, 약 75%, 약 70%, 약 65%, 약 60%, 약 55%, 약 50%, 약 45%, 약 40%, 약 35%, 약 30%, 약 25%, 약 20%, 약 15%, 약 10%, 약 5%, 약 4%, 약 3%, 약 2%, 약 1% 또는 그 미만)이면 고친화도인 것으로 간주된다.
상동성 : 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "상동성"은 중합체 분자 사이, 예를 들어 핵산 분자 (예를 들어, DNA 분자 및/또는 RNA 분자) 사이 및/또는 폴리펩티드 분자 사이의 전반적인 관련성을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 중합체 분자는 그들의 서열이 적어도 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 동일하면 서로 "상동성"인 것으로 간주된다. 일부 실시양태에서, 중합체 분자는 그들의 서열이 적어도 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 유사 (예를 들어, 대응하는 위치에 관련된 화학적 성질을 갖는 잔기를 포함)하면 서로 "상동성"인 것으로 간주된다. 예를 들어, 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 공지된 바와 같이, 특정 아미노산은 전형적으로 "소수성" 또는 "친수성" 아미노산으로 및/또는 "극성" 또는 "비-극성" 측쇄를 갖는 것으로서 서로 유사한 것으로 분류된다. 한 아미노산을 동일한 종류의 다른 아미노산으로 치환하는 것은 종종 "상동성" 치환으로 간주될 수 있다. 일반적인 아미노산 분류는 다음과 같이 요약된다.
Figure 112017028155957-pct00040
Figure 112017028155957-pct00041
통상의 기술자가 이해할 수 있는 바와 같이, 어떤 잔기가 상이한 서열 내에서 서로 "대응"하는지 고려할 때, 다른 서열에 비해 하나의 서열 내에 지정된 길이의 갭을 허용하는 것을 포함하는 방법에 의해 그의 상동성 정도를 결정하기 위한 서열의 비교를 허용하는 다양한 알고리즘이 이용가능하다. 예를 들어, 2개의 핵산 서열 간의 상동성 비율의 계산은 최적의 비교 목적을 위해 2개의 서열을 정렬함으로써 수행될 수 있다 (예를 들어, 갭은 최적 정렬을 위해 제1 및 제2 핵산 서열 중 어느 하나 또는 둘 모두에 도입될 수 있고, 비-대응 서열은 비교 목적을 위해 무시될 수 있다). 특정 실시양태에서, 비교 목적을 위해 정렬된 서열의 길이는 참조 서열의 길이의 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 실질적으로 100%이다. 이어서, 대응하는 뉴클레오티드 위치의 뉴클레오티드를 비교한다. 제1 서열 내의 한 위치가 제2 서열 내의 대응하는 위치와 동일한 뉴클레오티드에 의해 점유될 때, 분자는 그 위치에서 동일하고; 제1 서열 내의 한 위치가 제2 서열 내 대응하는 위치와 유사한 뉴클레오티드에 의해 점유될 때, 분자는 그 위치에서 유사하다. 두 서열 간의 상동성 비율은 두 서열의 최적 정렬을 위해 도입될 필요가 있는 갭의 수 및 각각의 갭의 길이를 고려하여 서열에 의해 공유되는 동일하고 유사한 위치의 수의 함수이다. 2개의 뉴클레오티드 서열 사이의 상동성 비율을 결정하는데 유용한 대표적인 알고리즘 및 컴퓨터 프로그램은 예를 들어 PAM120 가중 잔기표, 갭 길이 페널티 12 및 갭 페널티 4를 사용하는 ALIGN 프로그램 (버전 2.0)에 통합된, 문헌 [Meyers and Miller (CABIOS, 1989, 4:11-17)]의 알고리즘을 포함한다. 별법으로, 두 뉴클레오티드 서열 간의 상동성 비율은 NWSgapdna.CMP 매트릭스를 사용하는 GCG 소프트웨어 패키지에서 GAP 프로그램을 사용하여 결정할 수 있다.
인간 : 일부 실시양태에서, 인간은 배아, 태아, 유아, 어린이, 십대, 성인 또는 노인이다.
친수성 : 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "친수성" 및/또는 "극성"은 물과 혼합되거나 물에 쉽게 용해되는 경향을 나타낸다.
소수성 : 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "소수성" 및/또는 "비-극성"은 물을 밀어내거나, 물과 조합되지 않거나, 또는 물에 쉽게 용해되지 않는 경향을 나타낸다.
동일성 : 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "동일성"은 중합체 분자, 예를 들어 핵산 분자 (예를 들어, DNA 분자 및/또는 RNA 분자) 및/또는 폴리펩티드 분자 사이의 전반적인 관련성을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 중합체 분자는 그들의 서열이 적어도 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 경우 서로 "실질적으로 동일"한 것으로 고려된다. 2개의 핵산 또는 폴리펩티드 서열의 동일성 비율의 계산은 예를 들어 최적 비교 목적을 위해 2개의 서열을 정렬함으로써 수행될 수 있다 (예를 들어, 갭은 최적 정렬을 위해 제1 및 제2 서열 중 어느 하나 또는 둘 모두에 도입될 수 있고, 동일하지 않은 서열은 비교 목적으로 무시할 수 있음). 특정 실시양태에서, 비교 목적을 위해 정렬된 서열의 길이는 참조 서열의 길이의 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 실질적으로 100%이다. 이어서, 대응하는 위치의 뉴클레오티드를 비교한다. 제1 서열의 한 위치가 제2 서열의 대응하는 위치와 동일한 잔기 (예를 들어, 뉴클레오티드 또는 아미노산)에 의해 점유되는 경우, 분자는 그 위치에서 동일하다. 두 서열 간의 동일성 비율은 두 서열의 최적 정렬을 위해 도입되어야 할 필요가 있는 갭의 수 및 각각의 갭의 길이를 고려하여, 서열에 의해 공유되는 동일한 위치의 수의 함수이다. 서열의 비교 및 두 서열 간의 동일성 비율의 결정은 수학적 알고리즘을 사용하여 달성될 수 있다. 예를 들어, 두 뉴클레오티드 서열 간의 동일성 비율은 ALIGN 프로그램 (버전 2.0)에 통합된, 문헌 [Meyers and Miller (CABIOS, 1989, 4:11-17)]의 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다. 일부 예시적인 실시양태에서, ALIGN 프로그램을 이용한 핵산 서열 비교는 PAM120 가중 잔기표, 갭 길이 페널티 12 및 갭 패널티 4를 사용한다. 두 뉴클레오티드 서열 간의 동일성 비율은 NWSgapdna.CMP 매트릭스를 사용하는 GCG 소프트웨어 패키지에서 GAP 프로그램을 사용하여 결정할 수 있다.
단리된 : 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "단리된"은 (1) 초기 생성되었을 때 (자연에서 및/또는 실험실 환경에서) 그와 회합된 성분의 적어도 일부로부터 분리된 및/또는 (2) 인간의 손에 의해 설계, 생산, 준비 및/또는 제조된 물질 및/또는 엔티티를 의미한다. 단리된 물질 및/또는 엔티티는 초기에 그와 함께 회합되는 다른 성분의 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 약 99% 초과로부터 분리될 수 있다. 일부 실시양태에서, 단리된 작용제는 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 약 99% 초과의 순도를 갖는다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 물질은 다른 성분이 실질적으로 없으면 "순수한" 것이다. 일부 실시양태에서, 관련 기술 분야의 통상의 기술자가 이해할 수 있는 바와 같이, 물질은 예를 들어 하나 이상의 담체 또는 부형제 (예를 들어, 완충제, 용매, 물 등)와 같은 특정한 다른 성분과 조합된 후에도 여전히 "단리된" 또는 "순수한" 것으로 간주될 수 있고; 그러한 실시양태에서, 물질의 단리 또는 순도 %는 이러한 담체 또는 부형제를 포함하지 않고 계산된다. 일부 실시양태에서, 단리는 공유 결합의 파괴를 포함하거나 또는 필요로 한다 (예를 들어, 보다 긴 폴리펩티드로부터 폴리펩티드 도메인을 단리하고/하거나 더 긴 올리고뉴클레오티드 또는 핵산으로부터 뉴클레오티드 서열 요소를 단리하기 위해).
마커 . 본원에서 사용되는 바와 같이, 마커는 그의 존재 또는 수준이 특정 상태 또는 이벤트의 특징인 엔티티 또는 모이어티를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 특정 마커의 존재 또는 수준은 질환, 장애 또는 병태의 존재 또는 병기의 특징일 수 있다. 단지 하나의 예를 제공하기 위해, 일부 실시양태에서, 이 용어는 특정 종양, 종양 하위클래스, 종양의 병기 등의 특징적인 유전자 발현 산물을 지칭한다. 별법으로 또는 추가로, 일부 실시양태에서, 특정 마커의 존재 또는 수준은 예를 들어 특정 종양의 특징일 수 있는 특정 신호전달 경로의 활성 (또는 활성 수준)과 관련이 있다. 마커의 존재 유무에 대한 통계적 유의성은 특정 마커에 따라 다를 수 있다. 일부 실시양태에서, 마커의 검출은 종양이 특정 하위클래스일 높은 확률을 반영한다는 점에서 매우 특이적이다. 그러한 특이성은 민감도를 희생시킬 수 있다 (즉, 종양이 마커를 발현할 것으로 예상되는 종양인 경우에도 음성 결과가 발생할 수 있다). 반대로, 민감도가 높은 마커는 민감도가 더 낮은 마커보다 덜 특이적일 수 있다. 본 발명에 따르면, 유용한 마커는 100%의 정확도로 특정 하위클래스의 종양을 구별할 필요가 없다.
돌연변이체 : 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "돌연변이체"는 참조 엔티티와 유의한 구조적 동일성을 보이지만, 참조 엔티티에 비해 하나 이상의 화학적 모이어티의 존재 또는 수준에서 참조 엔티티와 구조적으로 상이한 엔티티를 지칭한다. 많은 실시양태에서, 돌연변이체는 또한 그의 참조 엔티티와 기능적으로 상이하다. 일반적으로, 특정 엔티티가 참조 엔티티의 "돌연변이체"로 적절하게 간주되는지의 여부는 참조 개체와의 구조적 동일성 정도에 기초하여 결정된다. 관련 기술 분야의 통상의 기술자라면 이해할 수 있는 바와 같이, 임의의 생물학적 또는 화학적 참조 엔티티는 일정한 특징적인 구조적 요소를 갖는다. 정의에 따르면, 돌연변이체는 하나 이상의 상기 특징적인 구조적 요소를 공유하는 별개의 화학적 엔티티이다. 단지 몇 가지 예를 들자면, 소분자는 특징적인 코어 구조적 요소 (예를 들어, 거대고리 코어) 및/또는 하나 이상의 특징적인 매달린 모이어티를 가질 수 있으므로, 소분자의 돌연변이체는 코어 구조적 요소를 공유하고 특징적인 매달린 모이어티는 공유하지만 다른 매달린 모이어티 및/또는 코어 내에 존재하는 결합의 유형 (단일 대 이중, E 대 Z 등)이 다른 것이고, 폴리펩티드는 선형 또는 3차원 공간에서 서로에 대해 지정된 위치를 갖는 및/또는 특정 생물학적 기능에 기여하는 다수의 아미노산을 포함하는 특징적인 서열 요소를 가질 수 있고, 핵산은 선형 또는 3차원 공간에서 서로에 대해 지정된 위치를 갖는 다수의 뉴클레오티드 잔기를 포함하는 특징적인 서열 요소를 가질 수 있다. 예를 들어, 돌연변이체 폴리펩티드는 아미노산 서열의 하나 이상의 차이 및/또는 폴리펩티드 백본에 공유 부착된 화학적 모이어티 (예를 들어, 탄수화물, 지질 등)의 하나 이상의 차이에 의해 참조 폴리펩티드와 다를 수 있다. 일부 실시양태에 있어서, 돌연변이체 폴리펩티드는 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% 또는 99%의, 참조 폴리펩티드와의 총 서열 동일성을 보인다. 별법으로 또는 추가로, 일부 실시양태에서, 돌연변이체 폴리펩티드는 적어도 하나의 특징적인 서열 요소를 참조 폴리펩티드와 공유하지 않는다. 일부 실시양태에서, 참조 폴리펩티드는 하나 이상의 생물학적 활성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 폴리펩티드는 참조 폴리펩티드의 하나 이상의 생물학적 활성을 공유한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 폴리펩티드는 참조 폴리펩티드의 하나 이상의 생물학적 활성이 결여된다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 폴리펩티드는 참조 폴리펩티드에 비해 하나 이상의 생물학적 활성의 감소된 수준을 보인다.
핵산 : 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "핵산"은 그의 가장 넓은 의미에서, 올리고뉴클레오티드 사슬에 있거나 또는 올리고뉴클레오티드 사슬에 혼입될 수 있는 임의의 화합물 및/또는 물질을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 포스포디에스테르 연결을 통해 올리고뉴클레오티드 사슬에 있거나 또는 올리고뉴클레오티드 사슬에 혼입될 수 있는 화합물 및/또는 물질이다. 문맥에서 명백해지는 바와 같이, 일부 실시양태에서, "핵산"은 개개의 핵산 잔기 (예를 들어, 뉴클레오티드 및/또는 뉴클레오시드)를 지칭하고; 일부 실시양태에서, "핵산"은 개개의 핵산 잔기를 포함하는 올리고뉴클레오티드 사슬을 지칭한다. 일부 실시양태에서, "핵산"은 RNA이거나 이를 포함하고; 일부 실시양태에서, "핵산"은 DNA이거나 이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 하나 이상의 천연 핵산 잔기이거나, 이를 포함하거나, 이로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 핵산은 하나 이상의 핵산 유사체이거나, 이를 포함하거나, 이로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 핵산 유사체는 포스포디에스테르 백본을 이용하지 않는다는 점에서 핵산과 다르다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 핵산은 관련 기술 분야에 공지되어 있고 백본에 포스포디에스테르 결합 대신에 펩티드 결합을 갖고 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 간주되는 하나 이상의 "펩티드 핵산"이거나, 이를 포함하거나, 이로 이루어진다. 별법으로 또는 추가로, 일부 실시양태에서, 핵산은 포스포디에스테르 결합보다는 하나 이상의 포스포로티오에이트 및/또는 5'-N-포스포르아미다이트 결합을 갖는다. 일부 실시양태에서, 핵산은 하나 이상의 천연 뉴클레오시드 (예를 들어, 아데노신, 티미딘, 구아노신, 시티딘, 우리딘, 데옥시아데노신, 데옥시티미딘, 데옥시구아노신 및 데옥시시티딘)이거나, 이를 포함하거나, 이로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 핵산은 하나 이상의 뉴클레오시드 유사체 (예를 들어, 2-아미노아데노신, 2-티오티미딘, 이노신, 피롤로-피리미딘, 3-메틸 아데노신, 5-메틸시티딘, C-5 프로피닐-시티딘, C-5 프로피닐-우리딘, 2-아미노아데노신, C5-브로모우리딘, C5-플루오로우리딘, C5-아이오도우리딘, C5-프로피닐-우리딘, C5-프로피닐-시티딘, C5-메틸시티딘, 2-아미노아데노신, 7-데아자아데노신, 7-데아자구아노신, 8-옥소아데노신, 8-옥소구아노신, O(6)-메틸구아닌, 2-티오시티딘, 메틸화 염기, 삽입 (intercalated) 염기 및 이들의 조합물)이거나, 이를 포함하거나, 이로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 핵산은 천연 핵산에 비해 하나 이상의 변형된 당 (예를 들어, 2'-플루오로리보스, 리보스, 2'-데옥시리보스, 아라비노스 및 헥소스)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 RNA 또는 단백질과 같은 기능성 유전자 산물을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, 핵산은 하나 이상의 인트론을 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 천연 공급원으로부터의 단리, 상보성 주형에 기초한 중합에 의한 효소적 합성 (생체내 또는 시험관내), 재조합 세포 또는 시스템에서의 생산 및 화학적 합성 중 하나 이상에 의해 제조된다. 일부 실시양태에서, 핵산의 길이는 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000개 또는 그 초과의 잔기이다.
환자 : 본원에서 사용되는 용어 "환자" 또는 "대상체"는 제공된 조성물이 예를 들어 실험적, 진단, 예방, 미용 및/또는 치료 목적으로 투여되거나 투여될 수 있는 임의의 유기체를 지칭한다. 전형적인 환자는 동물 (예를 들어, 마우스, 래트, 토끼, 비-인간 영장류 및/또는 인간과 같은 포유동물)을 포함한다. 관련 기술 분야의 통상의 기술자가 이해할 수 있는 바와 같이, 일부 실시양태에서 동물은 가축 (예를 들어, 농업용 동물, 반려 동물 등)일 수 있다. 일부 실시양태에서, 환자는 인간이다. 일부 실시양태에서, 환자는 하나 이상의 장애 또는 병태로 고통받거나 또는 이에 걸리기 쉽다. 일부 실시양태에서, 환자는 장애 또는 병태의 하나 이상의 증상을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 환자는 하나 이상의 장애 또는 병태로 진단되었다. 일부 실시양태에서, 장애 또는 병태는 암 또는 하나 이상의 종양의 존재이거나 이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 이러한 암 또는 종양은 전립선암 또는 전립선 종양이거나 이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 장애 또는 병태는 전이성 암이다.
펩티드 : 용어 "펩티드"는 펩티드 결합 또는 변형된 펩티드 결합에 의해 서로 연결된 2개 이상의 아미노산을 지칭한다. 특정 실시양태에서, "펩티드"는 약 100개 미만의 아미노산, 약 50개 미만의 아미노산, 20개 미만의 아미노산 또는 10개 미만의 아미노산 길이를 갖는 폴리펩티드를 나타낸다.
제약 조성물 : 본원에서 사용되는 바와 같이, "제약 조성물"은 하나 이상의 제약상 허용되는 담체와 함께 제제화된 활성제를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 활성제는 관련 집단에 투여될 때 미리 결정된 치료 효과를 달성할 통계적으로 유의한 확률을 나타내는 치료 요법에서의 투여에 적합한 단위 투여량으로 존재한다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 다음 투여를 위해 변형된 것을 비롯하여 고체 또는 액체 형태로 투여하기 위해 특수하게 제제화될 수 있다: 경구 투여, 예를 들어, 물약 (drench) (수성 또는 비-수성 용액 또는 현탁액), 정제, 예를 들어, 협측, 설하 및 전신 흡수를 위한 정제, 볼러스, 분말, 과립, 혀에 적용하기 위한 페이스트; 예를 들어, 멸균 용액 또는 현탁액으로서 피하, 근내, 정맥내 또는 경막외 주사, 또는 지속 방출 제제에 의한 비경구 투여; 피부, 폐 또는 구강에 적용되는 크림, 연고 또는 조절 방출 패치 또는 스프레이로서의 국소 도포; 예를 들어 페서리, 크림 또는 포움으로서의 질내 또는 직장내; 설하; 안내; 경피; 또는 비내, 폐 및 다른 점막 표면 투여.
제약상 허용되는 : 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "제약상 허용되는"은 합리적인 이익/위험 비에 상응하는, 타당한 의학적 판단의 범위 내에서 과도한 독성, 자극, 또는 알레르기 반응, 또는 다른 문제 또는 합병증 없이 인간 및/또는 동물의 조직과의 접촉에 사용하기 적합한 작용제를 지칭한다.
제약상 허용되는 담체 : 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "제약상 허용되는 담체"는 하나의 장기 또는 신체 일부로부터 또 다른 장기 또는 신체 일부로 해당 화합물을 운반 또는 수송할 때 관여하는 제약상 허용되는 물질, 조성물 또는 비히클, 예컨대 액체 또는 고체 충전제, 희석제, 부형제 또는 용매 캡슐화 물질을 의미한다. 각각의 담체는 제제의 다른 성분과 상용성이고 환자에게 해를 끼치지 않는다는 의미에서 "수용가능"해야 한다. 제약상 허용되는 담체로 작용할 수 있는 물질의 일부 예는 다음을 포함한다: 당, 예컨대 락토오스, 글루코스 및 수크로스; 전분, 예컨대 옥수수 전분 및 감자 전분; 셀룰로스, 및 그의 유도체, 예컨대 나트륨 카르복시메틸 셀룰로스, 에틸 셀룰로스 및 셀룰로스 아세테이트; 분말형 트라가칸트; 맥아; 젤라틴; 탈크; 부형제, 예컨대 코코아 버터 및 좌제 왁스; 오일, 예컨대 땅콩유, 면실유, 홍화유, 참기름, 올리브유, 옥수수유 및 대두유; 글리콜, 예컨대 프로필렌 글리콜; 폴리올, 예컨대 글리세린, 소르비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜; 에스테르, 예컨대 에틸 올레에이트 및 에틸 라우레이트; 아가; 완충제, 예컨대 수산화마그네슘 및 수산화알루미늄; 알긴산; 발열원 미함유 물; 등장성 염수; 링거액; 에틸 알콜; pH 완충 용액; 폴리에스테르, 폴리카르보네이트 및/또는 폴리안히드라이드; 및 제약 제제에 사용되는 다른 비-독성 상용성 물질.
폴리펩티드 : 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "폴리펩티드"는 일반적으로 펩티드 결합에 의해 서로 연결된 적어도 3개의 아미노산의 중합체에 대한 그의 관련 기술 분야에서 인정된 의미를 갖는다. 일부 실시양태에서, 이 용어는 폴리펩티드의 특이적 기능 클래스를 지칭하는데 사용된다. 이러한 각각의 클래스에 대하여, 본 명세서는 클래스 내의 공지된 예시적인 폴리펩티드의 아미노산 서열의 몇 가지 예를 제공하고; 일부 실시양태에서, 상기 폴리펩티드는 그 클래스에 대한 참조 폴리펩티드이다. 그러한 실시양태에서, 용어 "폴리펩티드"는 관련 참조 폴리펩티드와 유의한 서열 상동성 또는 동일성을 나타내는 클래스의 임의의 구성원을 지칭한다. 많은 실시양태에서, 이러한 구성원은 또한 참조 폴리펩티드와 유의한 활성을 공유한다. 별법으로 또는 추가로, 많은 실시양태에서, 이러한 구성원은 또한 참조 폴리펩티드와 (및/또는 클래스 내의 다른 폴리펩티드와, 일부 실시양태에서는 클래스 내의 모든 폴리펩티드와) 특정한 특징적인 서열 요소를 공유한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 구성원 폴리펩티드는 적어도 약 30-40%이고, 종종 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 초과인, 참조 폴리펩티드와의 총 서열 상동성 또는 동일성 정도를 보이고/보이거나 종종 90% 초과 또는 심지어 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 매우 높은 서열 동일성을 보이는 적어도 하나의 영역 (즉, 일부 실시양태에서 특징적인 서열 요소이거나 이를 포함할 수 있는 보존된 영역)을 포함한다. 그러한 보존된 영역은 대개 적어도 3 내지 4개, 종종 20개까지 또는 그 초과의 아미노산을 포함하고; 일부 실시양태에서, 보존된 영역은 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15개 또는 그 초과의 인접 아미노산의 적어도 하나의 스트레치를 포함한다. 일부 실시양태에서, 유용한 폴리펩티드는 모 폴리펩티드의 단편을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 일부 실시양태에서, 유용한 폴리펩티드는 다수의 단편을 포함하거나 이로 이루어질 수 있고, 그 각각은 관심 폴리펩티드에서 발견되는 것과 상이한 서로에 대한 공간 배열로 동일한 모 폴리펩티드에서 각각 발견되고 (예를 들어, 모 폴리펩티드에서 직접 연결된 단편은 관심 폴리펩티드에서는 공간적으로 분리될 수 있거나 또는 그 반대일 수 있고/있거나 단편은 모 폴리펩티드보다 관심 폴리펩티드에서 상이한 순서로 존재할 수 있음), 이에 의해 관심 폴리펩티드는 그의 모 폴리펩티드의 유도체이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 천연 아미노산, 비-천연 아미노산, 또는 둘 모두를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 천연 아미노산만을 또는 비-천연 아미노산만을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 D-아미노산, L-아미노산 또는 둘 모두를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 D-아미노산만을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 L-아미노산만을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 예를 들어, 하나 이상의 아미노산 측쇄를 변형하거나 이에 부착된, 및/또는 폴리펩티드의 N-말단, 폴리펩티드의 C-말단 또는 둘 모두에 하나 이상의 매달린 기를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 시클릭일 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 시클릭이 아니다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 선형이다.
단백질 : 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "단백질"은 폴리펩티드 (즉, 펩티드 결합에 의해 서로 연결된 적어도 2개의 아미노산의 스트링)를 의미한다. 단백질은 아미노산 이외의 모이어티 (예를 들어, 당단백질, 프로테오글리칸 등일 수 있음)를 포함할 수 있고/있거나, 달리 처리되거나 변형될 수 있다. 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 "단백질"이 세포에 의해 생성되는 완전한 폴리펩티드 사슬 (신호 서열을 갖거나 갖지 않는)일 수 있거나 또는 그의 특징적인 부분일 수 있음을 인식할 것이다. 통상의 기술자는 단백질이 때로는 하나 이상의 디술피드 결합에 의해 연결되거나 다른 수단에 의해 회합된 하나 초과의 폴리펩티드 사슬을 포함할 수 있음을 이해할 것이다. 폴리펩티드는 L-아미노산, D-아미노산 또는 이들 모두를 함유할 수 있고, 관련 기술 분야에 공지된 다양한 아미노산 변형 또는 유사체 중 임의의 것을 포함할 수 있다. 유용한 변형은 예를 들어 말단 아세틸화, 아미드화, 메틸화 등을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단백질은 천연 아미노산, 비-천연 아미노산, 합성 아미노산 및 이들의 조합물을 포함할 수 있다. 용어 "펩티드"는 일반적으로 약 100개 미만, 약 50개 미만, 20개 미만 또는 10개 미만의 아미노산 길이를 갖는 폴리펩티드를 지칭하는데 사용된다. 일부 실시양태에서, 단백질은 항체, 항체 단편, 그의 생물학적 활성 부분 및/또는 그의 특징적인 부분이다.
순수 : 본원에서 사용되는 바와 같이, 작용제 또는 엔티티는 실질적으로 다른 성분이 없는 경우 "순수한" 것이다. 예를 들어, 약 90% 초과의 특정 작용제 또는 엔티티를 함유하는 제제는 일반적으로 순수한 제제로 간주된다. 일부 실시양태에서, 작용제 또는 엔티티는 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 순수하다.
참조 : 용어 "참조"는 종종 관심 작용제, 개체, 집단, 샘플, 서열 또는 값이 비교되는 표준 또는 대조 작용제, 개체, 집단, 샘플, 서열 또는 값을 설명하기 위해 본원에서 사용된다. 일부 실시양태에서, 참조 작용제, 개체, 집단, 샘플, 서열 또는 값은 관심 작용제, 개체, 집단, 샘플, 서열 또는 값의 시험 또는 결정과 실질적으로 동시에 시험 및/또는 결정된다. 일부 실시양태에서, 참조 작용제, 개체, 집단, 샘플, 서열 또는 값은 임의로 유형의 매체에 구체화되는 역사적인 참조이다. 전형적으로, 관련 기술 분야의 통상의 기술자가 이해할 수 있는 바와 같이, 참조 작용제, 개체, 집단, 샘플, 서열 또는 값은 관심 작용제, 개체, 집단, 샘플, 서열 또는 값을 결정 또는 특성화하기 위해 이용되는 것과 대등한 조건 하에서 결정되거나 특성화된다.
반응 : 본원에서 사용되는 바와 같이, 치료에 대한 반응은 치료의 결과로서 발생하거나 치료와 상호관련되는 대상체의 병태의 임의의 유익한 변경을 지칭할 수 있다. 그러한 변경은 병태의 안정화 (예를 들어, 치료 부재시에 일어날 수 있는 악화의 예방), 병태의 증상의 개선 및/또는 병태의 치유 가능성의 개선 등을 포함할 수 있다. 이것은 대상체의 반응 또는 종양의 반응을 나타낼 수 있다. 종양 또는 대상체 반응은 임상 기준 및 객관적인 기준을 포함한 다양한 기준에 따라 측정될 수 있다. 반응을 평가하는 기술은 임상 검사, 양전자 방출 단층 촬영, 흉부 X-선 CT 스캔, MRI, 초음파, 내시경 검사, 복강경 검사, 대상체에서 얻은 샘플의 종양 마커의 존재 또는 수준, 세포학, 및/또는 조직학을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 이러한 기술 중 상당수는 종양의 크기를 결정하거나 총 종양 부하를 결정한다. 치료에 대한 반응을 평가하기 위한 방법 및 지침은 문헌 [Therasse et al., "New guidelines to evaluate the response to treatment in solid tumors", European Organization for Research and Treatment of Cancer, National Cancer Institute of the United States, National Cancer Institute of Canada, J. Natl. Cancer Inst., 2000, 92(3):205-216]에 논의되어 있다. 종양 및/또는 환자 그룹을 비교할 때, 비교되는 그룹을 반응 비율을 결정하기 위한 동일하거나 대등한 기준에 따라 평가한다면, 정확한 반응 기준은 적절한 방식으로 선택할 수 있다. 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 적절한 기준을 선택할 수 있을 것이다.
특이적 결합 : 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "특이적 결합" 또는 "에 대해 특이적" 또는 "에 특이적"은 표적 엔티티 (예를 들어, 표적 단백질 또는 폴리펩티드)와 결합제 (예를 들어, 제공된 항체와 같은 항체) 사이의 상호작용을 의미한다. 통상의 기술자가 이해할 수 있는 바와 같이, 상호작용은 대체 상호작용의 존재 하에 선호될 경우, "특이적인" 것으로 간주된다. 많은 실시 태양에서, 상호작용은 전형적으로 표적 분자의 특정 구조적 특징, 예컨대 결합 분자에 의해 인식되는 항원 결정자 또는 에피토프의 존재에 의존한다. 예를 들어, 항체가 에피토프 A에 특이적인 경우, 에피토프 A를 함유하는 폴리펩티드의 존재 또는 자유로운 표지된 A 및 그에 대한 항체 둘 모두를 함유하는 반응액에서 자유로운 비-표지된 A의 존재는 항체에 결합하는 표지된 A의 양을 감소시킬 것이다. 특이성이 절대적일 필요는 없다는 것을 이해해야 한다. 예를 들어, 다수의 항체가 표적 분자에 존재하는 에피토프 이외의 다른 에피토프와 교차반응한다는 것은 관련 기술 분야에 잘 알려져 있다. 이러한 교차반응성은 항체가 사용되는 용도에 따라 허용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 수용체 티로신 키나제에 특이적인 항체는 프로테아제 억제제 (예를 들어, ACT)에 결합된 수용체 티로신 키나제와 10% 미만의 교차반응성을 갖는다. 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 임의의 주어진 적용 (예를 들어, 표적 분자의 검출, 치료 목적을 위한 등의)에서 적절하게 수행하기에 충분한 정도의 특이성을 갖는 항체를 선택할 수 있을 것이다. 특이성은 표적 분자에 대한 결합 분자의 친화도 대 다른 표적 (예컨대, 경쟁자)에 대한 결합 분자의 친화도와 같은 추가의 인자의 측면에서 평가될 수 있다. 결합 분자가 검출이 요구되는 표적 분자에 대해 높은 친화도를 나타내고 비-표적 분자에 대해 낮은 친화도를 나타내는 경우, 항체는 면역진단 목적을 위해 허용되는 시약일 수 있다. 일단 결합 분자의 특이성이 하나 이상의 상황에서 확립되면, 반드시 그 특이성을 재평가하지 않고도 다른, 바람직하게는 유사한 측면에서 사용될 수 있다.
특이성 : 관련 기술 분야에 공지된 바와 같이, "특이성"은 특정 리간드가 다른 잠재적인 결합 파트너로부터 그의 결합 파트너를 구별하는 능력의 척도이다.
대상체 : "대상체"는 포유동물 (예를 들어, 일부 실시양태에서 인간 태아 형태를 포함하는 인간)을 의미한다. 일부 실시양태에서, 대상체는 관련된 질환, 장애 또는 병태로 고통받고 있다. 일부 실시양태에서, 대상체는 질환, 장애 또는 병태에 걸리기 쉽다. 일부 실시양태에서, 대상체는 질환, 장애 또는 병태의 하나 이상의 증상 또는 특징을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 대상체는 질환, 장애 또는 병태의 증상 또는 특징을 나타내지 않는다. 일부 실시예에서, 대상체는 질환, 장애 또는 병태에 대한 감수성 또는 위험에 특유한 하나 이상의 특징을 갖는 대상체이다. 대상체는 질환의 진단 또는 치료를 위해 의료 제공자에게 제시하는 인간을 지칭하는 환자일 수 있다. 일부 실시양태에서, 대상체는 요법이 시행되는 개체이다.
실질적으로 : 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "실질적으로"는 관심 특징 또는 특성의 전체 또는 거의 전체 범위 또는 정도를 나타내는 정성적 상태를 의미한다. 생물학적 기술 분야의 통상의 기술자는 생물학적 및 화학적 현상이 거의 완성되고/되거나 완성을 향해 진행하거나 또는 절대적 결과를 달성하거나 회피하지 않는다는 것을 이해할 것이다. 따라서, "실질적으로"라는 용어는 많은 생물학적 및 화학적 현상에 내재된 완전성의 잠재적인 결여를 포착하기 위해 본원에서 사용된다.
실질적인 서열 상동성 : "실질적인 상동성"이라는 문구는 본원에서 아미노산 또는 핵산 서열 간의 비교를 지칭하기 위해 사용된다. 관련 기술 분야의 통상의 기술자가 이해할 수 있는 바와 같이, 두 서열은 대응하는 위치에 상동성 잔기를 함유하는 경우 일반적으로 "실질적으로 상동성"인 것으로 간주된다. 상동성 잔기는 동일한 잔기일 수 있다. 별법으로, 상동성 잔기는 동일하지 않은 잔기일 수 있고, 적절하게 유사한 구조적 및/또는 기능적 특성을 갖는다. 예를 들어, 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 공지된 바와 같이, 특정 아미노산은 전형적으로 "소수성" 또는 "친수성" 아미노산으로, 및/또는 "극성" 또는 "비극성" 측쇄를 갖는 것으로 분류된다. 한 아미노산을 동일한 유형의 또 다른 아미노산으로 치환하는 것은 종종 "상동성" 치환으로 간주될 수 있다. 일반적인 아미노산 분류는 다음과 같이 요약된다.
Figure 112017028155957-pct00042
Figure 112017028155957-pct00043
상기 기술 분야에 잘 공지된 바와 같이, 아미노산 또는 핵산 서열은 상업적 컴퓨터 프로그램, 예컨대 뉴클레오티드 서열에 대한 BLASTN 및 아미노산에 대한 BLASTP, 갭 형성 (gapped) BLAST 및 PSI-BLAST에서 이용가능한 것을 포함한 임의의 다양한 알고리즘을 사용하여 비교될 수 있다. 이러한 예시적인 프로그램은 다음 문헌에 기재되어 있다: [Altschul et al., Basic local alignment search tool, J. Mol. Biol, 215(3): 403-410, 1990]; [Altschul, et al., Methods in Enzymology]; [Altschul, et al., "Gapped BLAST와 PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997]; [Baxevanis, et al., Bioinformatics : A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley, 1998]; [Misener et al., (eds.), Bioinformatics Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, Vol. 132), Humana Press, 1999]. 상동성 서열을 확인하는 것에 더하여, 상기 언급된 프로그램은 전형적으로 상동성 정도의 지표를 제공한다. 일부 실시양태에서, 두 서열은 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%의 대응하는 잔기가 관련된 잔기의 스트레치에 상동성일 경우 실질적으로 상동성인 것으로 간주된다. 일부 실시양태에서, 관련 스트레치는 완전한 서열이다. 일부 실시양태에서, 관련 스트레치는 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 55, 적어도 60, 적어도 65, 적어도 70, 적어도 75, 적어도 80, 적어도 85, 적어도 90, 적어도 95, 적어도 100, 적어도 125, 적어도 150, 적어도 175, 적어도 200, 적어도 225, 적어도 250, 적어도 275, 적어도 300, 적어도 325, 적어도 350, 적어도 375, 적어도 400, 적어도 425, 적어도 450, 적어도 475, 적어도 500개 또는 그 초과의 잔기이다.
실질적인 동일성 : 본원에서 "실질적인 동일성"이라는 문구는 아미노산 서열 또는 핵산 서열 간의 비교를 지칭하기 위해 본원에서 사용된다. 관련 기술 분야의 통상의 기술자라면 이해할 수 있는 바와 같이, 두 서열은 일반적으로 대응하는 위치에 동일한 잔기를 함유하는 경우 "실질적으로 동일한" 것으로 간주된다. 관련 기술 분야에 공지된 바와 같이, 아미노산 또는 핵산 서열은 상업적 컴퓨터 프로그램, 예컨대 뉴클레오티드 서열에 대한 BLASTN 및 아미노산에 대한 BLASTP, 갭 형성 BLAST 및 PSI-BLAST에서 이용가능한 것을 포함한 임의의 다양한 알고리즘을 사용하여 비교될 수 있다. 이러한 예시적인 프로그램은 다음 문헌에 기재되어 있다: [Altschul et al., Basic local alignment search tool, J. Mol. Biol, 215(3): 403-410, 1990]; [Altschul, et al., Methods in Enzymology]; [Altschul, et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997]; [Baxevanis, et al., Bioinformatics : A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley, 1998]; 및 [Misener et al., (eds.), Bioinformatics Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, Vol. 132), Humana Press, 1999]. 동일한 서열을 확인하는 것에 더하여, 상기 언급된 프로그램은 전형적으로 동일성 정도의 지표를 제공한다. 일부 실시양태에서, 두 서열은 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 초과의 그의 대응하는 잔기가 관련된 잔기의 스트레치에 걸쳐 동일한 경우 실질적으로 동일한 것으로 간주된다. 일부 실시양태에서, 관련 스트레치는 완전한 서열이다. 일부 실시양태에서, 관련 스트레치는 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500개 또는 그 초과의 잔기이다.
실질적인 구조적 유사성 : 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "실질적인 구조적 유사성"은 특정 위치에서 특정 아미노산의 존재 및/또는 동일성과 같은 공유된 구조적 특징의 존재를 의미한다 ("공유된 서열 상동성" 및 "공유된 서열 동일성"의 정의 참조). 일부 실시양태에서, 용어 "실질적인 구조적 유사성"은 구조적 요소 (예를 들어, 루프, 시트, 나선, H-결합 공여자, H-결합 수용자, 글리코실화 패턴, 염 다리 및 디술피드 결합)의 존재 및/또는 동일성을 의미한다. 일부 다른 실시양태에서, 용어 "실질적인 구조적 유사성"은 서로에 대한 원자 또는 모이어티의 3차원 배열 및/또는 배향 (예를 들어, 관심 작용제와 참조 작용제 사이의 거리 및/또는 각도)을 의미한다.
치료제 : 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "치료제"는 일반적으로 유기체에 투여될 때 원하는 약리학적 효과를 유도하는 임의의 작용제를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 작용제는 적절한 집단에 걸쳐 통계적으로 유의한 효과를 나타내는 경우 치료제로 간주된다. 일부 실시양태에서, 적절한 집단은 모델 유기체의 집단일 수 있다. 일부 실시양태에서, 적절한 집단은 특정 연령 집단, 성별, 유전적 배경, 기존의 임상 병태 등과 같은 다양한 기준에 의해 정의될 수 있다. 일부 실시양태에서, 치료제는 질환, 장애 및/또는 병태의 하나 이상의 증상 또는 특징의 완화, 개선, 경감, 억제, 예방, 발병 지연, 중증도 감소 및/또는 발병률 감소를 위해 사용될 수 있는 물질이다. 일부 실시양태에서, "치료제"는 인간에 대한 투여를 위해 판매될 수 있기 전에 정부 기관에 의해 승인되었거나 또는 승인될 필요가 있는 작용제이다. 일부 실시양태에서, "치료제"는 인간에게 투여하기 위해 의학적 처방이 요구되는 작용제이다.
치료 요법 : 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "치료 요법"은 관련 집단에 걸쳐 그의 투여가 요망되거나 유익한 치료 결과와 상관되는 투여 요법을 의미한다.
치료 유효량 : 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "치료 유효량"은 치료 투여 요법에 따라 질환, 장애 및/또는 병태를 앓고 있거나 걸리기 쉬운 대상체에게 투여될 때 질병, 장애 및/또는 병태를 치료하기 위해 충분한 양을 의미한다. 일부 실시양태에서, 치료 유효량은 질환, 장애 및/또는 병태의 하나 이상의 증상의 발병률 및/또는 중증도를 감소시키고/시키거나 발병을 지연시키는 것이다. 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 "치료 유효량"이라는 용어가 실제로 특정 개체에서 성공적인 치료가 이루어질 것을 요구하지 않는다는 것을 이해할 것이다. 오히려, 치료 유효량은 그러한 치료를 필요로 하는 환자에게 투여될 때 상당한 수의 대상체에서 특정한 바람직한 약리학적 반응을 제공하는 양일 수 있다. 특정 대상체는 실제로 "치료 유효량"에 대해 "불응성"일 수 있음이 구체적으로 이해된다. 단지 하나의 예를 들자면, 불응성 대상체는 임상 효능을 얻을 수 없도록 낮은 생체이용률을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 치료 유효량에 대한 언급은 하나 이상의 특정 조직 (예를 들어, 질환, 장애 또는 병태에 의해 영향을 받는 조직) 또는 유체 (예를 들어, 혈액, 타액, 혈청, 땀, 눈물, 소변 등)에서 측정된 양에 대한 언급일 수 있다. 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 일부 실시양태에서 치료 유효량이 단일 투여로 제제화 및/또는 투여될 수 있음을 이해할 것이다. 일부 실시양태에서, 치료 유효량은 예를 들어 투여 요법의 일부로서 복수의 투여량으로 제제화 및/또는 투여될 수 있다.
치료 : 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "치료" (또한 "치료하다" 또는 "치료하는")는 특정 질병, 장애 및/또는 병태의 하나 이상의 증상의 발생률, 특징 및/또는 원인을 부분적으로 또는 완전히 완화, 개선, 경감, 억제, 발병 지연, 중증도 감소 및/또는 발병률 감소를 위해 작용하는 물질 (예를 들어, 제공된 조성물)의 임의의 투여를 의미한다. 일부 실시양태에서, 그러한 치료는 관련된 질병, 장애 및/또는 병태의 징후를 나타내지 않는 대상체 및/또는 질병, 장애 및/또는 병태의 조기 징후만을 나타내는 대상체에게 투여될 수 있다. 별법으로 또는 추가로, 일부 실시양태에서, 치료는 관련된 질병, 장애 및/또는 병태의 하나 이상의 확립된 징후를 나타내는 대상체에게 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 치료는 관련된 질병, 장애 및/또는 병태를 앓고 있는 것으로 진단된 대상체일 수 있다. 일부 실시양태에서, 치료는 관련된 질병, 장애 및/또는 병태의 발병 위험 증가와 통계적으로 상관되는 하나 이상의 감수성 인자를 갖는 것으로 알려진 대상체일 수 있다.
항체의 생체내 발현에 의한 치료 : 림프양 및 비-림프양 세포 (예컨대, 근모세포, 중간엽 줄기 세포)는 전장 IgG를 분비하기 위해 생체 외에서 또는 생체 내에서 유전자 조작될 수 있다 ([Compte et al., 2013 Biomatter 3]; [Noel et al., 1997 Hum Gene Ther 8:1219-1229]). DNA 서열을 갖는 재조합 아데노바이러스를 이용한 IgG 유전자 요법은 높은 혈청 IgG 수준을 달성할 수 있었지만, 내구성은 바이러스 면역원성에 의해 제한되었다 ([Noel et al., 2002 Hum Gene Ther 13:1483-1493]; [Jooss & Chirmule, 2004 Gene Ther 10:955-963]). 아데노-연관 바이러스 (rAAV), 특히 선택적 혈청형은 면역원성이 덜하고 (Xiao et al., 2012 Therapeutic Delivery 3:835-856), 인간 유전자 요법을 위한 지속적인 벡터로 입증된 바 있다 (Nathwani et al., 2011, N. Engl. J. Med. 365:2357-2365]; [Patel et al., 2014 International Journal of Hematology 99:372-376]). 전임상 개념 증거는 VEGFR-2 (DC101) (Fang et al., 2005 Nat. Biotechnol. 23:584-590), VEGF (Watanabe et al., 2009 Hum. Gene Ther. 20:598-610), HER-2 ([Ho et al., 2009 Cancer Gene Ther. 16:184-194]; [Wang et al., 2010 Cancer Gene Ther. 17, 559-570]), Met (Vigna et al., 2008 Cancer Res. 68:9176-9183) 및 HIV (Balazs et al., 2012 Nature 481:81-84)에 특이적인 전장 IgG에 대해 보고된 바 있다. 유사한 성공이 혈관신생-관련 라미닌에 대한 단일쇄 Fv 단편 (scFv) ([Arafat et al., 2002 Gene Ther 9:256-262]; [Sanz et al., 2001 Cancer Immunol. Immunother. 50:557-565]; [Sanz et al., 2003 EMBO J. 22:1508-1517]; [Sanz et al., 2002 Gene Ther. 9:1049-1053]) 및 그의 3가 및 6가 형태 [Sanchez-Arevalo et al., 2006 Int. J. Cancer 119:455-462), 또는 VEGF에 대한 scFv (Afanasieva et al., 2003 Gene Ther. 10:1850-1859) 및 그의 2가 유도체 (미니바디 및 scFv-Fc) 또는 scFv 항-HER2 면역독소 (Liu et al., 2009 Cancer Gene Ther. 16:861-872) 또는 CEA x CD3 이중특이적 디아바디 ([Blanco et al., 2007 J. Immunol. 171:1070-1077]; [Compte et al., 2007 Cancer Gene Ther. 14:380-388])에 대해 기술되어 있다.
변이체 : 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "변이체"는 참조 엔티티와 유의 한 구조적 동일성을 나타내지만 참조 엔티티와 비교하여 하나 이상의 화학적 모이어티의 존재 또는 수준에서 참조 엔티티와 구조적으로 다른 엔티티를 나타낸다. 많은 실시양태에서, 변이체는 또한 그의 참조 엔티티와 기능적으로 상이하다. 일반적으로, 특정 엔티티가 참조 엔터티의 "변이체"로 적절하게 간주되는지의 여부는 그의 참조 엔터티와의 구조적 동일성 정도에 따라 결정된다. 통상의 기술자라면 이해할 수 있는 바와 같이, 임의의 생물학적 또는 화학적 참조 엔티티는 일정한 특징적인 구조적 요소를 갖는다. 정의에 따라 변이체는 하나 이상의 그러한 특징적인 구조 요소를 공유하는 별개의 화학적 엔티티이다. 단지 몇 가지 예를 들면, 소분자는 특징적인 코어 구조 요소 (예를 들어, 거대고리 코어) 및/또는 하나 이상의 특징적인 매달린 모이어티를 가질 수 있으므로, 소분자의 변이체는 코어 구조 요소 및 특징적인 매달린 모이어티를 공유하지만 다른 매달린 모이어티 및/또는 코어 내에 존재하는 결합의 유형 (단일 대 이중, E 대 Z 등)이 다른 것이고, 폴리펩티드는 선형 또는 3차원 공간에서 서로에 대해 지정된 위치를 갖는 및/또는 특정 생물학적 기능에 기여하는 다수의 아미노산을 포함하는 특징적인 서열 요소를 가질 수 있고, 핵산은 선형 또는 3차원 공간에서 서로에 대해 지정된 위치를 갖는 다수의 뉴클레오티드 잔기를 포함하는 특징적인 서열 요소를 가질 수 있다. 예를 들어, 변이체 폴리펩티드는 아미노산 서열의 하나 이상의 차이 및/또는 폴리펩티드 백본에 공유 부착된 화학적 모이어티 (예를 들어, 탄수화물, 지질 등)의 하나 이상의 차이에 의해 참조 폴리펩티드와 다를 수 있다. 일부 실시양태에 있어서, 변이체 폴리펩티드는 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% 또는 99%의, 참조 폴리펩티드와의 총 서열 동일성을 보인다. 별법으로 또는 추가로, 일부 실시양태에서, 변이체 폴리펩티드는 적어도 하나의 특징적인 서열 요소를 참조 폴리펩티드와 공유하지 않는다. 일부 실시양태에서, 참조 폴리펩티드는 하나 이상의 생물학적 활성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 변이체 폴리펩티드는 참조 폴리펩티드의 하나 이상의 생물학적 활성을 공유한다. 일부 실시양태에서, 변이체 폴리펩티드는 참조 폴리펩티드의 하나 이상의 생물학적 활성이 결여된다. 일부 실시양태에서, 변이체 폴리펩티드는 참조 폴리펩티드에 비해 하나 이상의 생물학적 활성의 감소된 수준을 보인다. 많은 실시양태에서, 관심 폴리펩티드가 모체의 아미노산 서열과 동일하지만 특정 위치에서 소수의 서열 변경을 갖는 아미노산 서열을 갖는 경우, 관심 폴리펩티드는 모 폴리펩티드 또는 참조 폴리펩티드의 "변이체"로 간주된다. 전형적으로, 변이체의 잔기의 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 미만이 모체와 비교하여 치환된다. 일부 실시양태에서, 변이체는 모체와 비교하여 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개의 치환된 잔기를 갖는다. 종종, 변이체는 매우 적은 수 (예를 들어, 5, 4, 3, 2 또는 1개 미만)의 치환된 기능성 잔기 (즉, 특정 생물학적 활성에 참여하는 잔기)를 갖는다. 또한, 변이체는 전형적으로 5, 4, 3, 2 또는 1개 이하의 부가 또는 결실을 갖고, 종종 모체와 비교하여 부가 또는 결실을 갖지 않는다. 또한, 임의의 부가 또는 결실은 전형적으로 약 25, 약 20, 약 19, 약 18, 약 17, 약 16, 약 15, 약 14, 약 13, 약 10, 약 9, 약 8, 약 7, 약 6개 미만이고, 일반적으로 약 5, 약 4, 약 3 또는 약 2개 미만이다. 일부 실시양태에서, 모체 또는 참조 폴리펩티드는 자연계에서 발견되는 것이다. 관련 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 이해되는 바와 같이, 관심 특정 폴리펩티드의 다수의 변이체는 특히 관심 폴리펩티드가 감염 인자 폴리펩티드인 경우, 통상적으로 자연에서 발견될 수 있다.
벡터 . 본원에서 사용되는 바와 같이, "벡터"는 그것이 회합된 또 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 벡터는 숙주 세포, 예컨대 진핵 및/또는 원핵 세포에서 연결되는 핵산의 염색체외 복제 및/또는 발현이 가능하다. 작동가능하게 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있는 벡터는 본원에서 "발현 벡터"로 언급된다.
야생형 : 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "야생형"은 자연에서 "정상" (돌연변이체, 이환된, 변경된 등과 대조적인) 상태 또는 상황에서 발견되는 구조 및/또는 활성을 갖는 엔티티를 지칭하는, 관련 기술 분야에서 이해되는 의미를 갖는다. 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 야생형 유전자 및 폴리펩티드가 종종 다수의 상이한 형태 (예를 들어 대립 유전자)로 존재함을 인식할 것이다.
특정 실시양태의 상세한 설명
면역 억제 완화
면역 세포를 억제하는 음성 조절 경로의 제거는 암 치료에서 급속히 중요해지고 있다. 그러한 치료 방법의 초기 성공 사례 중 하나는 미국 식약청 (Food and Drug Administration, FDA)에서 2001년 3월에 승인한 흑색종 치료를 위한 이필리무맙이었다. 이필리무맙은 활성화된 T 세포에서 발견되는 주요 음성 조절자인 CTLA-4를 표적으로 하는 모노클로날 항체 (MAb)이다. CTLA-4는 수지상 세포 (DC) 및 기타 항원 제시 세포 (APC)에 의해 발현되는 보조 분자의 B7 패밀리 구성원에 결합한다. 이러한 보조 분자에 대한 CTLA-4의 결합은 추가의 T 세포 활성화 및 팽창을 효과적으로 억제하고, 이것은 상기 세포를 수반하는 면역 반응의 진행을 차단한다 (Mellman et al., 2011 Nature 480:480-489). CTLA-4를 표적화함으로써, 이필리무맙은 상기 억제를 해제하여, 특히 암세포를 파괴하는 것을 포함하는 T 세포의 활성화 및 팽창을 가능하게 한다.
면역 억제를 제거함으로써 암을 치료하기 위한 다른 방법은 면역억제성 종양 미세환경을 유지하는 경로의 일부인 프로그램된 사멸-1 (PD-1) T 세포 공-수용체 및 이의 리간드 B7-H1/PD-L1 및 B7-DC/PD-L2를 표적화하는 것을 포함한다 (Topalian et al., 2012 Curr. Opin. Immunol. 24:207-212). 특히, 항-PD-1 (Topalian et al., 2012 N. Engl. J. Med. 366:2443-2454) 또는 항 PD-L1 (Brahmer et al., 2012 N. Engl. J. Med. 366:2455-2465) 항체를 이용한 I상/II상 임상 시험은 흑색종, 비-소세포 폐암, 신장 세포 암종 및 난소암에서 종양 퇴행 또는 안정화를 입증하였다.
자연 살해 세포 (NK 세포)에 의해 유도된 면역 억제를 제거하기 위해 또 다른 접근법이 고안되었다. 예를 들어, 인간 살해 세포 Ig-유사 수용체 (KIR)는 NK 세포의 표면에 발현되고 잠재적 표적 세포 상의 주조직 적합성 복합체 (MHC)/인간 백혈구 항원 (HLA) 클래스 I 아형에 결합하는 당단백질이다. 이 결합 상호작용은 NK 세포의 세포독성을 억제한다. KIR을 표적으로 하는 모노클로날 항체는 상기 억제를 차단하여 NK 활성의 억제를 완화시키는 것으로 임상 시험에서 밝혀졌다 (Romagne et al., 2009, Blood 114:2667-2677).
유사하게, 백혈구 Ig-유사 수용체 (LIR, Ig-유사 전사체, 즉 ILT로도 공지됨)는 또한 NK 세포 (및 일부 T 및 B 림프구 및 특정 대식세포, 비만 세포 및 수지상 세포)의 표면 상에 발현되고, 또한 MHC/HLA 클래스 I 아형에 결합하여 LIR-발현 이펙터 세포의 활성을 억제한다. 일부 연구에서는 LIR과 MHC/GLA 클래스 I 분자 사이의 상호작용을 차단하여 이펙터 세포 세포독성을 자극하는 데 성공한 것으로 보고되었다 (Godal et al., 2010, Biol. Blood Marrow Transplant 16:612-621).
또한, 종양-관련 항원을 표적화함으로써 종양-관련 면역 억제를 제거하려는 다양한 방법이 시도되었다. 예를 들어, 차단 MAb (예를 들어, 항-CD47)이 연구되었고, 시험관 내 및 생체 내에서 백혈병/림프종 및 고형 종양 모델에서 종양 세포를 포식하기 위해 대식세포를 자극할 때 효과적이라는 것이 밝혀졌다 ([Zhao et al., 2011, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108:18342-18247]; [Majeti et al., 2009, Cell 138:286-299]; [Chao et al., 2011, Cancer Res.71:1374-1384]; [Chao et al., 2010, Sci. Transl. Med. 2:63ra94]; [Chao et al., 2010, Cell 142:699-713]; [Willingham et al., 2012, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109:6662-6667] 참조).
특히 관심을 끄는 다른 종양 항원 표적은 신경 외배엽-유도된 종양 및 육종에서 고도로 발현되지만 정상 세포에서는 발현이 제한되는 강글리오시드 GD2를 포함한다. GD2-표적화는 항체-의존성 세포 매개 세포독성 (ADCC)을 통해 NK 세포 활성화를 촉진하는 것으로 밝혀졌다 (Tarek et al., 2012, J. Clin. Invest. 122:3260-3270).
인간 B7H3 (CD276으로도 알려짐)는 B7/CD28 이뮤노글로불린 수퍼패밀리의 구성원이고, 종양 감시뿐만 아니라 감염 및 자가면역 질환의 상황에서 T 세포 기능을 조절하는 중요한 동시자극 신호를 제공한다 (Wilcox et al., 2012, Eur. J. Haematol. 88:465-475).
B7H3은 전립선암 ([Roth et al., 2007, Cancer Res. 67:7893-900]; [Zang et al., 2007, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104:19458-19463) 신장 세포 암종, 요로상피세포 암종 ([Crispen et al., 2008, Clin. Cancer Res. 14:5150-157]; [Boorjian et al., 2008, Clin. Cancer Res. 14:4800-4808]), 난소암 (Zang et al., 2010, Mod. Pathol. 23:1104-1112), 아교모세포종 (Lemke et al., 2012, Clin. Cancer Res. 18:105-117), 골육종 (Wang et al., 2013, PLoS One 8:e70689), 신경모세포종 (Gregorio et al., 2008, Histopathology 53:73-80), 미만성 내재 뇌교 신경교종 (DIPG) (Zhou et al., 2013, J. Neurooncol, 111:257-264), 중피종 (Calabro et al., 2011, J. Cell Physiol., 226:2595-600) 및 췌장암 (Yamato et al., 2009, Br. J. Cancer 101:1709-1716)을 포함하는 많은 고형 종양 유형에서 광범위하게 발현된다.
B7H3은 모든 다른 B7 패밀리 구성원과 유사하게 단지 하나의 V-유사 및 하나의 C-유사 Ig 도메인을 함유하는 세포외 영역을 갖는 타입 I 막횡단 단백질로 처음 확인되었다 (이 형태의 B7H3은 2Ig-B7H3으로 명명됨) (Chapoval et al., 2001, Nat. Immunol. 2:269-274). 이어서 V-유사 및 C-유사 Ig 도메인을 직렬로 2개 포함하는 제2 형태의 인간 B7H3 (huB7H3)이 확인되었다 (4Ig-B7H3으로 명명됨) ([Steinberger et al., 2004, J. Immunol.172:2352-2359]; [Sun et al., 2002, J. Immunol. 168:6294-6297]).
B7H3은 NK 세포 및 T-세포 둘 모두에 대해 억제성으로 간주된다. B7H3의 억제 역할에 대한 아이디어는 2Ig 및 4Ig 형태의 인간 B7H3 둘 모두가 T 세포 증식 및 시토카인 생산을 억제할 수 있음을 나타내는 보고에 의해 지지된다 (Steinberger et al., 2004, J. Immunol. 172:2352-2359]; [Sun et. al. 2002 J. Immunol. 168:6294-6297]). B7H3 결핍 마우스에 대한 연구는 B7H3이 (TH2-매개 면역 반응과 다르게) TH1-매개 면역 반응을 우선적으로 하향 조절함을 제시하였다 (Suh et al., 2003, Nat. Immunol. 4:899-906). 그리고, 다른 연구들은 4Ig-B7H3 형태가 NK 세포의 표면 상의 추정 억제 수용체와 상호작용함으로써 신경모세포종 세포의 NK-매개 용해를 억제할 수 있음을 보여 주었다 (Castriconi et al., 2004, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101:12640-12645). 전립선암 환자를 대상으로 한 최근의 연구에서, 수술 당시 종양 조직에서의 B7H3 발현 수준은 종양이 전이된 정도, 임상에서 암 재발의 위험 증가 및 암 특이적 사망과 강하게 연관되었다 ([Roth et al., 2007, Cancer Res. 67:7893-7900]; [Zang et al., 2007, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104:19458-19463]). 유사하게, 종양 조직에서 B7H3의 높은 발현 수준은 투명세포 신장 세포 암종, 요로상피세포 암종 (Crispen et al., 2008, Clin. Cancer Res. 14:5150-5157]; [Boorjian et al., 2008, Clin. Cancer Res. 14:4800-4808], 난소암 [Zang et al., 2010, Mod. Pathol. 23:1104-1112], 아교모세포종 (Lemke et al., 2012, Clin. Cancer Res. 18:105-117), 골육종 (Wang et al., 2013, PLoS One 8:e70689), 췌장암 (Yamato et al., 2009, Br. J. Cancer 101:1709-1716) 및 신경모세포종 (Gregorio et al., 2008, Histopathology 53:73-80)에서의 불량한 환자 생존율과 상관관계가 있었다.
뮤린 B7H3 (muB7H3)에 대한 결정 구조 데이터에 기초하여, B7H3은 적어도 부분적으로는, 그의 IgV 도메인의 FG 루프를 통해 T 세포 증식을 억제하는 것이 제안되었다 (Vigdorovich et al., 2013, Structure 21:707-717).
다른 한편으로, B7H3은 또한 그와 상호작용하는 수용체에 따라 T-세포 자극 특성을 가질 수 있다 (Hofmeyer et al., 2008, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105:10277-10278). 예를 들어, 몇몇 초기 보고서는 인간 2Ig-B7H3이 활성화된 T 세포 상의 추정 수용체에 결합함으로써 T 세포 활성화 및 IFN-γ 생산을 촉진한다는 것을 보여주었다 (Chapoval et al., 2001, Nat. Immunol. 2:269-274). 또한, 특정 뮤린 종양 모델을 사용한 연구에서 B7H3 발현에 의해 면역계의 항종양 반응이 향상된다는 데이터가 제시되었다 (Sun et al., 2003, Gene Ther. 10:1728-1734). 그리고, 인간에 대한 연구는 B7H3의 존재가 위암 (Wu et al., 2006, World J. Gastroenterol. 12:457-459) 및 췌장암 (Loos et al., 2009, BMC Cancer 9:463)에서의 생존율 증가와 상관성이 있다고 제시하였다.
B7H3에 결합하는, m8H9로 알려진 뮤린 항체는 뇌종양, 소아 육종 및 신경모세포종, 및 보다 작은 정도로 선암종을 표적으로 하는 것으로 밝혀졌다 ([Modak et al., 2001, Cancer Res. 61:4048-4054]; [Xu et al., 2009, Cancer Res. 69:6275-6281]). 원발성 뇌종양 중에서, 17개의 시험된 아교모세포종 중 15, 4개의 시험된 혼합 신경교종 중 3, 11개의 시험된 희소돌기 아교세포종 중 4, 8개의 시험된 성상세포종 중 6, 2개의 시험된 수막종 중 2, 3개의 시험된 신경초종 중 3, 2개의 시험된 수모세포종 중 2, 1개의 시험된 신경섬유종 중 1, 2개의 시험된 신경아교종양 중 1, 3개의 시험된 뇌실막세포종 중 2, 및 1개의 시험된 송과체모세포종 중 1건에서 8H9에 의한 결합을 나타냈다. 육종 중에서, 21개의 시험된 유잉 (Ewing)/원시 신경외배엽 종양 중 21, 29개의 시험된 횡문근육종 중 28, 29개의 시험된 골육종 중 28, 37개의 시험된 결합조직 형성 작은 원형 세포 종양 중 35개, 3개의 시험된 활막 육종 중 2개, 4개의 시험된 평활근육종 중 4, 1개의 악성 섬유성 조직구종 중 1, 및 2개의 시험된 미분화 육종 중 2건은 8H9 결합에 대해 양성으로 시험되었다. 90개의 시험된 신경모세포종 중 87, 16개의 시험된 흑색종 중 12, 4개의 시험된 간세포암종 중 3, 8개의 시험된 윌름 (Wilms) 종양 중 7, 3개의 시험된 횡문근양 종양 중 3, 및 27개의 시험된 선암종 중 12건이 양성으로 시험되었다. 대조적으로, m8H9는 골수, 결장, 위, 심장, 폐, 근육, 갑상선, 고환, 췌장 및 인간 뇌 (전두엽, 소뇌, 교뇌 및 척수)를 포함한 정상적인 인간 조직에 결합하지 않았다 (Modak et al., 2001 Cancer Res 61:4048-4054).
8H9 항체 작용제
상기한 바와 같이, 8H9 항체는 B7H3에 특이적으로 결합한다. 시험된 다른 항-B7H3 항체와는 달리, 8H9만이 B7H3의 FG-루프를 결합시키고 B7H3의 면역 억제 기능을 차단하기 위해 사용될 수 있다.
면역-조직화학적 연구는 m8H9가 배아 종양 및 암종을 포함한 인간 고형 종양과 광범위하게 반응성임을 증명하였다 (Modak et al., 2001, Cancer Res. 61:4048-4054). m8H9는 이종이식 모델에서 육종 및 뇌 종양 둘 모두에 대해 양호한 종양 흡수를 나타내었고 ([Modak et al., 2005, Cancer Biother. Radiopharm. 20:534-546]; [Luther et al., 2008, Neurosurgery 63:1166-1174; discussion 1174]), 항체가 코브라-독 인자에 접합될 때, 이것은 효과적인 보체 매개 종양 용해를 유도한다 (Juhl et al., 1997, Immunobiology 197:444-459). 더욱이, m8H9의 단일쇄 Fv (scFv) 형태는 전임상 모델 시스템에서 강력한 면역독소를 육종 및 신경교종에 대해 표적화할 수 있는 것으로 밝혀졌다 ([Onda et al., 2004, Cancer Res. 64:1419-1424]; [Luther et al., 2010, Mol. Cancer Ther. 9:1039-1046]).
키메라 항원 수용체 (CAR)의 일부로서, m8H9의 scFv 형태는 B7H3(+) 양성 종양 세포를 죽이기 위해 NK 세포를 유도할 수 있다 (Cheung et al., 2003, Hybrid Hybridomics 22:209-218). 또한, 일부 초기 인간 임상 시험에서 131I-표지된 8H9를 사용한 방사선 면역요법은 전이성 중추 신경계 (CNS) 암을 가진 고위험군 환자의 생존을 연장시킨다는 사실이 밝혀졌다 ([Kramer et al., 2007, American Association for Cancer Research LB-4 (Presentation)]; [Kramer et al., 2008, Presentation at the ISPNO 2008]).
현재 여러 1상 임상 시험이 연수막 전이 (NCT00089245) (Kramer et al., 2010 J Neurooncol 97:409-418) 및 미만성 내재 뇌교 신경교종 (DIPG) (NCT01502917) (Zhou et al., 2013, J. Neurooncol. 111:257-264)의 m8H9-기반 방사선 면역요법에 대해 진행중이다. 본 발명자들의 지식에 따르면, 임상 시험에 적용되는 유일한 다른 항-B7H3 항체는 인간화된 IgG1 MAb인 MGA271 (NCT01391143)이다 (Loo et al., 2012, Clin. Cancer. Res. 18:3834-3845, 2012).
방사성 표지된 m8H9 항체는 현재 결합조직 형성 작은 원형 세포 종양 및 복막을 포함하는 다른 고형 종양 (NCI 프로토콜 ID 09-090 NCT01099644)의 치료를 위한 임상 시험 중이다.
마우스
뮤린 8H9 (m8H9)는 B7H3을 표적으로 하는 IgG1 모노클로날 항체 (MAb)이다.
인간화 및 친화도 성숙
m8H9는 인간의 암 치료를 위한 치료제로서 유망하지만, 뮤린 기원의 것이다. 인간 항체의 사용은 특히 이러한 상황에서 바람직하고, 그 이유는 인간 항체가 투여된 항체에 대한 면역 반응의 가능성을 감소시키기 때문이다.
본 발명은 B7H3 및 특히 그의 FG-루프에 결합하는 항체에서 발견되는, 특정 인간화 항체 서열 및 또한 특정 친화도-성숙 항체 서열을 제공한다. 예를 들어, 본원에서 설명되는 서열 요소를 함유하는 폴리펩티드를 포함하는 항체 작용제 (예를 들어, 전장 항체, 그의 단편, 단일쇄 항체, 이중특이적 항체 또는 본원에서 설명되거나 관련 기술 분야에 공지된 다른 항체 작용제 형태)가 특히 본원에서 예시된다.
특히, 본 발명은 단백질 2Ig-B7H3에 특이적으로 결합하고 서열식별번호: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 및 8 (아래에 제시됨)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열식별번호에 제시된 이뮤노글로불린 경쇄, 또는 그의 관련 에피토프-결합 부분 및/또는 서열식별번호: 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 및 16 (아래에 제시됨)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열식별번호에 제시된 이뮤노글로불린 중쇄 또는 그의 관련 에피토프-결합 부분을 포함하는 항체 작용제를 제공한다.
서열식별번호: 1 (ch8H9 경쇄)
Figure 112017028155957-pct00044
서열식별번호: 2 (hu8H9 L1 경쇄)
Figure 112017028155957-pct00045
서열식별번호: 3 (hu8H9 L2 경쇄)
Figure 112017028155957-pct00046
서열식별번호: 4 (hu8H9 L3 경쇄)
Figure 112017028155957-pct00047
서열식별번호: 5 (hu8H9 3.1 경쇄)
Figure 112017028155957-pct00048
서열식별번호: 6 (hu8H9 4.1 경쇄)
Figure 112017028155957-pct00049
서열식별번호: 7 (hu8H9 5.1 경쇄)
Figure 112017028155957-pct00050
서열식별번호: 8 (ch8H9 6.1 경쇄; ch8H9 + 6개 친화도 성숙 돌연변이)
Figure 112017028155957-pct00051
서열식별번호: 9 (ch8H9 중쇄)
Figure 112017028155957-pct00052
서열식별번호: 10 (hu8H9 H1 중쇄)
Figure 112017028155957-pct00053
서열식별번호: 11 (hu8H9 H2 중쇄)
Figure 112017028155957-pct00054
서열식별번호: 12 (hu8H9 H3 중쇄)
Figure 112017028155957-pct00055
서열식별번호: 13 (hu8H9 3.1 중쇄)
Figure 112017028155957-pct00056
서열식별번호: 14 (hu8H9 4.1 중쇄)
Figure 112017028155957-pct00057
서열식별번호: 15 (hu8H9 5.1 중쇄)
Figure 112017028155957-pct00058
서열식별번호: 16 (ch8H9 6.1 중쇄; ch8H9 + 6개 친화도 성숙 돌연변이)
Figure 112017028155957-pct00059
일부 실시양태에서, 제공된 항체 작용제는 IgG, IgM, IgA, IgD, IgE 또는 그의 단편으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 항체 클래스의 구성원인 항체이거나 이를 포함한다.
항체 및/또는 그의 특징적인 부분 또는 이들을 코딩하는 핵산을 포함하는 제공된 항체 작용제는 임의의 이용가능한 수단에 의해 생산될 수 있다. 항체 (예를 들어, 모노클로날 항체 및/또는 폴리클로날 항체)를 생성하는 기술은 관련 기술 분야에 잘 알려져 있다. 토끼, 마우스, 래트, 햄스터, 기니 피그 또는 염소를 포함하는 다양한 동물 종이 항혈청 생산을 위해 사용할 수 있음을 알 것이다. 동물의 선택은 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 공지된 바와 같이 조작 용이성, 비용 또는 혈청의 원하는 양에 따라 결정될 수 있다. 항체 작용제는 또한 관심 이뮤노글로불린 중쇄 및 경쇄 서열에 대해 트랜스제닉인 포유동물 또는 식물의 생성을 통해 트랜스제닉 방식으로 생산될 수 있음을 이해할 것이다. 포유동물의 트랜스제닉 생산과 관련하여, 항체는 염소, 소 또는 다른 포유동물의 젖에서 생산되고 이로부터 회수될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 5,827,690, 5,756,687, 5,750,172 및 5,741,957 (그 전체가 본원에 참고로 포함됨)을 참고한다.
제공된 항체 작용제 (항체 및/또는 특징적인 부분 포함)는 예를 들어, 본 발명의 항체-코딩 핵산을 발현하도록 조작된 숙주 세포 시스템을 이용하여 생산될 수 있다. 별법으로 또는 추가로, 제공되는 항체 작용제는 화학적 합성 (예를 들어, 자동화된 펩티드 합성기를 사용하여)에 의해 부분적으로 또는 완전히 제조될 수 있다.
폴리클로날 및 모노클로날 항체의 제조 및 사용 기술은 예를 들어 문헌 [Harlow et al., Using Antibodies: A Laboratory Manual: Portable Protocol I. Cold Spring Harbor Laboratory (Dec. 1, 1998)]에 기재되어 있다. 항체 및 항체 단편 (예를 들어, 키메라 항체, 재구성된 항체, 인간화 항체 또는 그의 단편, 예컨대 Fab', Fab, F(ab')2 단편) 또는 생합성 항체 (예를 들어, 단일쇄 항체, 단일 도메인 항체 (DAB), Fv, 단일 쇄 Fv (scFv) 등)와 같은 변형된 항체 작용제 제조 기술은 관련 기술 분야에 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [Zola, Monoclonal Antibodies: Preparation and Use of Monoclonal Antibodies and Engineered Antibody Derivatives, Springer Verlag (Dec. 15, 2000; 1st edition)에서 찾을 수 있다.
본 발명에 적합한 항체 작용제 제제를 위한 예시적인 공급원은 관심 단백질을 발현하는 재조합 세포주 배양으로부터 유래된 조건화된 배양 배지, 또는 예를 들어 항체-생산 세포, 박테리아, 진균 세포, 곤충 세포, 트랜스제닉 식물 또는 식물 세포, 트랜스제닉 동물 또는 동물 세포, 또는 동물의 혈청, 복수액, 하이브리도마 또는 골수종 상청액의 세포 추출물을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 적합한 박테리아 세포는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 세포를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 적합한 이. 콜라이 균주의 예는 HB101, DH5α, GM2929, JM109, KW251, NM538, NM539 및 외래 DNA를 절단하지 못하는 임의의 이. 콜라이 균주를 포함한다. 사용될 수 있는 적합한 진균 숙주 세포는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 피치아 파스토리스(Pichia pastoris) 및 아스페르길루스(Aspergillus) 세포를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 적합한 곤충 세포는 S2 쉬나이더(Schneider) 세포, D. Mel-2 세포, SF9, SF21, 하이(High)-5™, 미믹(Mimic)™-SF9, MG1 및 KC1 세포를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 적합한 예시적인 재조합 세포주는 BALB/c 마우스 골수종 세포주, 인간 망막모세포 (PER.C6), 원숭이 신장 세포, 인간 배아 신장 세포주 (293), 베이비 햄스터 신장 세포 (BHK), 차이니즈 햄스터 난소 세포 (CHO), 마우스 세르톨리 세포, 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76), 인간 자궁경부 암종 세포 (HeLa), 개 신장 세포, 버팔로 래트 간 세포, 인간 폐 세포, 인간 간 세포, 마우스 유방 종양 세포, TRI 세포, MRC 5 세포, FS4 세포 및 인간 간암종 세포주 (Hep G2)를 포함하고 이로 제한되지 않는다.
관심의 항체 작용제는 임의의 적합한 벡터를 사용하여 발현될 수 있다. 다양한 벡터 (예를 들어, 바이러스 벡터)가 관련 기술 분야에 공지되어 있고; 그러한 벡터가 내부에 도입된 세포 (또는 그러한 세포의 자손체)는 관련 기술 분야에 공지된 바와 같이 배양될 수 있다 (예를 들어, 연속 배양 또는 유가식 배양 시스템 사용). 일부 실시양태에서, 세포는 유전자 조작될 수 있고; 조작된 폴리펩티드 (예를 들어, 본원에서 설명되는 바와 같은 항체 작용제 폴리펩티드)를 발현하도록 세포를 유전자 조작하는 기술은 관련 기술 분야에 잘 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Ausabel et al., eds. (1990), Current Protocols in Molecular Biology (Wiley, New York)]을 참고한다.
일부 실시양태에서, 제공되는 항체 작용제는 필요한 경우, 여과, 원심분리 및/또는 HPLC 또는 친화도 크로마토그래피와 같은 다양한 크로마토그래피 기술을 사용하여 정제될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제공되는 항체 작용제의 단편은 펩신 또는 파파인과 같은 효소에 의한 소화 및/또는 화학적 환원에 의한 디술피드 결합의 절단을 포함하는 방법에 의해 수득된다.
일반적으로, 본원에서 설명되는 바와 같이, 제공된 항체 작용제는 예를 들어 폴리클로날 항체; 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편; 키메라 항체, 재구성된 항체, 인간화 항체 또는 그의 단편 (예를 들어, Fab', Fab, F(ab')2)과 같은 변형된 항체; 또는 생합성 항체, 예를 들어 단일쇄 항체, 단일 도메인 항체 (DAB), Fv, 단일쇄 Fv (scFv) 등이거나 이를 포함할 수 있다.
제공된 항체 작용제는 항체 작용제의 특성 및/또는 활성을 개선하는 방식으로 조작, 생산 및/또는 정제될 수 있음을 알 것이다. 예를 들어, 제공된 항체 작용제의 개선된 특징은 증가된 안정성, 개선된 결합 친화도 및/또는 결합력, 증가된 결합 특이성, 증가된 생산, 감소된 응집, 감소된 비특이적 결합 등을 포함하고 이로 제한되지 않는다.
구체적인 예시적인 실시양태 - 경쇄 및 중쇄의 조합
본 발명의 일부 실시양태에서, 항체 작용제는 서열식별번호: 1에 제시된 이뮤노글로불린 경쇄 및/또는 서열식별번호: 9에 제시된 이뮤노글로불린 중쇄를 포함한다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 항체 작용제는 서열식별번호: 1에 제시된 이뮤노글로불린 경쇄 및/또는 서열 9에 제시된 이뮤노글로불린 중쇄를 포함하는 항체이다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 항체 작용제는 서열식별번호: 2에 제시된 이뮤노글로불린 경쇄 및/또는 서열식별번호: 10에 제시된 이뮤노글로불린 중쇄를 포함한다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 항체 작용제는 서열식별번호: 2에 제시된 이뮤노글로불린 경쇄 및/또는 서열 10에 제시된 이뮤노글로불린 중쇄를 포함하는 항체이다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 항체 작용제는 서열식별번호: 3에 제시된 이뮤노글로불린 경쇄 및/또는 서열식별번호: 11에 제시된 이뮤노글로불린 중쇄를 포함한다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 항체 작용제는 서열식별번호: 3에 제시된 이뮤노글로불린 경쇄 및/또는 서열 11에 제시된 이뮤노글로불린 중쇄를 포함하는 항체이다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 항체 작용제는 서열식별번호: 4에 제시된 이뮤노글로불린 경쇄 및/또는 서열식별번호: 12에 제시된 이뮤노글로불린 중쇄를 포함한다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 항체 작용제는 서열식별번호: 4에 제시된 이뮤노글로불린 경쇄 및/또는 서열 12에 제시된 이뮤노글로불린 중쇄를 포함하는 항체이다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 항체 작용제는 서열식별번호: 2에 제시된 이뮤노글로불린 경쇄 및/또는 서열식별번호: 11에 제시된 이뮤노글로불린 중쇄를 포함한다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 항체 작용제는 서열식별번호: 2에 제시된 이뮤노글로불린 경쇄 및/또는 서열 11에 제시된 이뮤노글로불린 중쇄를 포함하는 항체이다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 항체 작용제는 서열식별번호: 3에 제시된 이뮤노글로불린 경쇄 및/또는 서열식별번호: 10에 제시된 이뮤노글로불린 중쇄를 포함한다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 항체 작용제는 서열식별번호: 3에 제시된 이뮤노글로불린 경쇄 및/또는 서열 10에 제시된 이뮤노글로불린 중쇄를 포함하는 항체이다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 항체 작용제는 서열식별번호: 5에 제시된 이뮤노글로불린 경쇄 및/또는 서열식별번호: 13에 제시된 이뮤노글로불린 중쇄를 포함한다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 항체 작용제는 서열식별번호: 5에 제시된 이뮤노글로불린 경쇄 및/또는 서열 13에 제시된 이뮤노글로불린 중쇄를 포함하는 항체이다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 항체 작용제는 서열식별번호: 6에 제시된 이뮤노글로불린 경쇄 및/또는 서열식별번호: 14에 제시된 이뮤노글로불린 중쇄를 포함한다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 항체 작용제는 서열식별번호: 6에 제시된 이뮤노글로불린 경쇄 및/또는 서열 14에 제시된 이뮤노글로불린 중쇄를 포함하는 항체이다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 항체 작용제는 서열식별번호: 7에 제시된 이뮤노글로불린 경쇄 및/또는 서열식별번호: 15에 제시된 이뮤노글로불린 중쇄를 포함한다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 항체 작용제는 서열식별번호: 7에 제시된 이뮤노글로불린 경쇄 및/또는 서열 15에 제시된 이뮤노글로불린 중쇄를 포함하는 항체이다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 항체 작용제는 서열식별번호: 8에 제시된 이뮤노글로불린 경쇄 및/또는 서열식별번호: 16에 제시된 이뮤노글로불린 중쇄를 포함한다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 항체 작용제는 서열식별번호: 8에 제시된 이뮤노글로불린 경쇄 및/또는 서열 16에 제시된 이뮤노글로불린 중쇄를 포함하는 항체이다.
본 발명은 다른 것들 중에서도, 표시된 서열식별번호에 제시된 이뮤노글로불린 경쇄 또는 그의 에피토프-결합 부분 및 표시된 서열식별번호에 제시된 이뮤노글로불린 중쇄 또는 그의 에피토프-결합 부분을 포함하는 하기 열거된 항체를 고려한다.
<표 1>
Figure 112017028155957-pct00060
Figure 112017028155957-pct00061
구체적인 예시적인 실시양태 - 구체적인 아미노산 잔기
본 발명의 일부 실시양태에서, 항체 작용제는 위치 20에서의 트레오닌 잔기 및 위치 34에서의 티로신 잔기를 포함하는 이뮤노글로불린 경쇄 및/또는 위치 24에서의 트레오닌 잔기, 위치 42에서의 글리신 잔기, 위치 56에서의 아스파르트산 잔기 및 위치 102에서의 글리신 잔기를 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄를 포함한다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 항체 작용제는 경쇄 위치 20에서의 트레오닌, 경쇄 위치 34에서의 티로신, 중쇄 위치 24에서의 트레오닌, 중쇄 위치 42에서의 글리신, 중쇄 위치 56에서의 아스파르트산 및 중쇄 위치 102에서의 글리신에 대해 상동성 아미노산 치환을 보유한다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 항체 작용제는 위치 20에서의 트레오닌 잔기 및 위치 34에서의 티로신 잔기를 포함하는, 서열식별번호: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 및 8로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열식별번호에 제시된 이뮤노글로불린 경쇄를 포함하고/하거나, 위치 24의 트레오닌 잔기, 위치 42의 글리신 잔기, 위치 56의 아스파르트산 잔기 및 위치 102의 글리신 잔기를 포함하는, 서열식별번호: 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 및 16으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열식별번호에 제시된 이뮤노글로불린 중쇄를 포함한다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 항체 작용제는 뮤린 8H9 항체이고, 여기서 이뮤노글로불린 경쇄는 위치 20에서의 트레오닌 잔기 및 위치 34에서의 티로신 잔기를 포함하고, 이뮤노글로불린 중쇄는 위치 24에서의 트레오닌 잔기, 위치 42에서의 글리신 잔기, 위치 56에서의 아스파르트산 잔기 및 위치 102에서의 글리신 잔기를 포함한다.
다른 것들 중에서, 본 발명은 8H9 항체 작용제에서 이들 아미노산 잔기의 존재가 B7H3에 대한 항체 작용제의 결합 친화도를 m8H9에서 관찰된 것보다 증가시킨다는 것을 입증한다. 즉, m8H9에 이러한 잔기를 도입하면 B7H3에 대한 및 특히 그의 V-도메인의 FG 루프에 대한 결합 친화도가 개선된다.
관련 기술 분야의 통상의 기술자는 그러한 도입을 달성하거나, 또는 그러한 서열을 함유하는 폴리펩티드를 준비, 제공 또는 제조하기 위한, 관련 기술 분야에 잘 확립된 다양한 기술을 알고 있다. 이와 관련하여 유용한 기술의 예는 예를 들어 문헌 [Green & Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press 2012]에 제시되어 있다.
구체적인 예시적인 실시양태 - 특이적인 친화도
본원은 B7H3의 FG-루프를 표적으로 하는 8H9 항체 작용제를 포함하는 항체 작용제가 B7H3의 면역-억제 기능을 차단하기 위해 사용될 수 있다는 최초의 증명을 제공한다.
본 발명은 단백질 2Ig-B7H3의 V-도메인 및 단백질 4Ig-B7H3의 V1 및 V2 도메인의 FG 루프에 위치한 서열식별번호: 32 (하기 제시됨)에 제시된 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 작용제 및 2 nM 미만의 해리 상수 (KD)로 동일한 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 작용제를 제공한다. 본원의 실시예에 개시되는 바와 같이, 설명된 인간화 및 친화도 성숙된 8H9 항체 및 그의 결합 단편은 이러한 특성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 이들 항체 작용제는 m8H9가 아니다.
IRDF 에피토프는 종간에 보존되고, 예를 들어 인간, 개, 침팬지, 오랑우탄, 긴팔원숭이, 짧은 꼬리 원숭이, 마모셋, 돼지, 말, 팬더 및 코끼리에서 발견된다. 본 발명은 인간 및 개, 침팬지, 오랑우탄, 긴팔원숭이, 짧은 꼬리 원숭이, 마모셋, 돼지, 말, 팬더 및 코끼리를 포함하는 비-인간 동물에 존재하는 서열식별번호: 32에 제시된 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 작용제를 제공한다.
서열식별번호: 32는 IRDF이다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 항체 작용제는 단백질 2Ig-B7H3의 V-도메인 및 단백질 4Ig-B7H3의 V1 및 V2 도메인의 FG 루프에 100 nM 미만, 80 nM 미만, 50 nM 미만, 30 nM 미만, 10 nM 미만, 5 nM 미만 및 2 nM 미만의 KD (nM)로 결합한다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 항체 작용제는 T 세포 증식 및 기능에 대한 B7H3의 억제 효과를 억제한다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 항체 작용제는 T 세포 증식 및 기능에 대한 B7H3의 억제 효과를 억제하고/하거나, T-세포 매개 세포독성을 증강시킨다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 본원에서 설명되는 항체 작용제는 NK 세포 활성 및/또는 기능에 대한 B7H3의 억제 효과를 억제한다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 본원에서 설명되는 항체 작용제는 NK 세포 활성 및/또는 기능에 대한 B7H3의 억제 효과를 억제하고/하거나 NK 세포 활성 및/또는 기능을 향상시킨다.
상기 효과를 결정하기 위한 검정은 관련 기술 분야에 널리 공지되어 있다. 제한되지는 않지만 일부 예시적인 분석이 본원의 실시예에서 제공된다.
일부 실시양태에서, 항체 작용제는 항체, 항체 단편 및/또는 scFv이고/이거나 이를 포함한다.
구체적인 예시적인 실시양태 - 특이적인 CDR
관련 기술 분야에 일반적으로 공지된 바와 같이, 인간 및 뮤린 항체는 대체로 가변 영역 및 불변 영역을 각각 포함하는, 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄로 이루어진다. 경쇄 가변 영역은 대체로 프레임워크 영역이 측면에 있는 3개의 CDR (상보성 결정 영역) (본원에서 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3으로서 확인됨)을 포함한다. 중쇄 가변 영역은 대체로 프레임워크 영역이 측면에 있는 3개의 CDR (본원에서 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3으로서 확인됨)을 포함한다 (예를 들어, 문헌 [William E. Paul, Fundamental Immunology (7th ed.), Lippincott Williams & Wilkins, 2013] 참조).
본 발명의 일부 실시양태에서, 단백질 2Ig-B7H3 또는 4Ig-B7H3에 특이적으로 결합하는 항체 작용제는 서열식별번호: 33, 34, 39, 40, 45, 46, 51 및 52 (아래에 제시됨)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열식별번호에 제시된 CDRL1을 포함하는 이뮤노글로불린 경쇄, 또는 그의 관련 에피토프-결합 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 작용제는 항체, scFv 및/또는 그의 관련 에피토프-결합 부분이다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 단백질 2Ig-B7H3 또는 4Ig-B7H3에 특이적으로 결합하는 항체 작용제는 서열식별번호: 35, 36, 41, 42, 47, 48, 53 및 54 (아래에 제시됨)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열식별번호에 제시된 CDRL2를 포함하는 이뮤노글로불린 경쇄 또는 그의 관련 에피토프-결합 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 작용제는 항체, scFv 및/또는 그의 관련 에피토프-결합 부분이다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 단백질 2Ig-B7H3 또는 4Ig-B7H3에 특이적으로 결합하는 항체 작용제는 서열식별번호: 37, 38, 43, 44, 49, 50, 55 및 56 (아래에 제시됨)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열식별번호에 제시된 CDRL3을 포함하는 이뮤노글로불린 경쇄 또는 그의 관련 에피토프-결합 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 작용제는 항체, scFv 및/또는 그의 관련 에피토프-결합 부분이다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 단백질 2Ig-B7H3 또는 4Ig-B7H3에 특이적으로 결합하는 항체 작용제는 서열식별번호: 57, 58, 63, 64, 69, 70, 75 및 76 (아래에 제시됨)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열식별번호에 제시된 CDRH1을 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄 또는 그의 관련 에피토프-결합 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 작용제는 항체, scFv 및/또는 그의 관련 에피토프-결합 부분이다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 단백질 2Ig-B7H3 또는 4Ig-B7H3에 특이적으로 결합하는 항체 작용제는 서열식별번호: 59, 60, 65, 66, 71, 72, 77 및 78 (아래에 제시됨)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열식별번호에 제시된 CDRH2를 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄 또는 그의 관련 에피토프-결합 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 작용제는 항체, scFv 및/또는 그의 관련 에피토프-결합 부분이다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 단백질 2Ig-B7H3 또는 4Ig-B7H3에 특이적으로 결합하는 항체 작용제는 서열식별번호: 61, 62, 67, 68, 73, 74, 79 및 80 (아래에 제시됨)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열식별번호에 제시된 CDRH3을 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄 또는 그의 관련 에피토프-결합 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 작용제는 항체, scFv 및/또는 그의 관련 에피토프-결합 부분이다.
본 발명은 임의의 가능한 조합으로 아래에 제시된 CDR을 포함하는 항체 작용제를 고려한다. 제한하려는 것이 아닌 예로서, 본 발명은 서열식별번호: 34, 서열식별번호: 36, 서열식별번호: 38, 서열식별번호: 58, 서열식별번호: 60 및 서열식별번호: 62로 제시되는 CDRL1, CDRL2, CDRL3, CDRH1, CDRH2 및 CDRH3을 포함하는 항체 작용제를 포함한다.
바람직한 CDR 및/또는 프레임워크 영역을 갖는 항체의 제조는 관련 기술 분야에 일반적으로 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [Strohl & Strohl, Therapeutic Antibody Engineering, Woodhead Publishing Limited 2012]에 기재되어있다.
Figure 112017028155957-pct00062
Figure 112017028155957-pct00063
항체 작용제 형식
본 개시내용을 통해, 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 제시된 항체 서열 또는 그의 에피토프-결합 부분이 임의의 다양한 이뮤노글로불린-기반 또는 다른 폴리펩티드 형식 내에 유용하게 포함될 수 있다는 것을 이해할 것이고; 따라서, 본 발명의 실시양태는 본원에서 설명되는 바와 같은 서열 요소 또는 그의 에피토프-결합 부분을 포함하는 다양한 폴리펩티드 및 폴리펩티드 형식을 포함한다. 상기 제공된 폴리펩티드 및 폴리펩티드 형식 내에는 B7H3 및 특히 그의 FG-루프에 특이적으로 결합하는 것이 포함된다. 일부 특정 실시양태에서, 제공된 폴리펩티드 및/또는 폴리펩티드 형식은 B7H3, 예를 들어, 그의 FG-루프에 결합하기 위해 m8H9와 경쟁한다.
단일쇄 Fv ( scFv )
단일쇄 Fv (scFv)는 관련 기술 분야에 널리 공지되고, 사용되고 있다. 단일쇄 Fv는 종종 짧은 링커 펩티드에 의해 연결된 이뮤노글로불린의 중쇄 (VH) 및 경쇄 (VL)의 가변 영역의 융합 단백질이다 (예를 들어, 문헌 [Benny K. C. Lo (ed.), Antibody Engineering - Methods and Protocols, Humana Press 2004] 및 여기서 인용된 참고 문헌을 참고한다).
본 발명은 또한 단백질 B7H3에 특이적으로 결합하고 서열식별번호: 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 및 27 (아래에 제시됨)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열식별번호에 제시된 폴리펩티드를 포함하는 단일쇄 Fv (scFv)를 제공한다. 서열식별번호: 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 및 27에 제시된 폴리펩티드는 본원의 실시예에서 추가로 설명된다.
본 발명의 일부 실시양태에서, scFv 폴리펩티드는 치료제 또는 검출제에 접합되거나, 또는 위치 24에서의 트레오닌, 위치 42에서의 글리신, 위치 56에서의 아스파르트산 잔기, 위치 102에서의 글리신 잔기, 위치 153에서의 트레오닌 잔기 및 위치 167에서의 티로신 잔기를 포함한다. 이들 6개의 특정 위치에서의 6개의 특정 아미노산 잔기는 실시예에서 추가로 설명된다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 이들 아미노산 잔기는 상동성 아미노산 (즉, 유사한 특징을 갖는 아미노산)으로 치환된다.
통상의 기술자에게 공지된 바와 같이, 본 발명에 따른 scFv의 생성 및 그의 변형은 관련 기술 분야에서 일상적이다 (예를 들어, 문헌 [Benny K. C. Lo (ed.), Antibody Engineering - Methods and Protocols, Humana Press 2004], 및 여기서 인용된 참고 문헌 참고).
본 발명의 일부 실시양태에서, scFv 폴리펩티드는 제2 폴리펩티드에 융합된다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 서열식별번호: 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 및 27로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열식별번호에 제시된 scFv 폴리펩티드는 서열식별번호: 28 또는 서열식별번호: 29 (아래에 제시됨)에 제시된 제2 폴리펩티드에 융합되어 이중특이적 직렬 scFv를 생성한다. 서열식별번호: 28은 T 세포 수용체 복합체의 일부인 scFv 결합 huOkt3 (항-CD3)의 펩티드 서열 및 펩티드 링커 서열을 포함한다. 유사하게, 서열식별번호: 29는 펩티드 링커 서열 및 항-DOTA C825 scFv 항체 단편의 펩티드 서열을 포함한다.
이중특이적 직렬 scFv의 유용성은 관련 기술 분야에 널리 알려지고 허용되고, 본원의 다른 곳에서 설명되는 이중특이적 항체의 유용성과 유사하다. 통상의 기술자에게 공지된 바와 같이, 본 발명에 따른, 이중특이적 직렬 scFv의 제조를 포함하고 이로 제한되지 않는 scFv의 생성 및 그의 변형은 관련 기술 분야에서 일상적인 것이다 (예를 들어, 문헌 [Benny K. C. Lo (ed.), Antibody Engineering - Methods and Protocols, Humana Press 2004] 및 여기에 인용된 참고 문헌 참고).
일부 실시양태에서, 서열식별번호: 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 및 27로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열식별번호에 제시된 폴리펩티드를 포함하는 scFv는 그의 C-말단에서 서열식별번호: 28 또는 서열식별번호: 29에 제시된 폴리펩티드의 N-말단에 융합된다. 일부 실시양태에서, 서열식별번호: 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 및 27로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열식별번호에 제시된 폴리펩티드를 포함하는 scFv는 그의 N-말단에서 서열식별번호: 28 또는 서열식별번호: 29에 제시된 폴리펩티드의 C-말단에 융합된다.
서열식별번호: 17 (hu8H9 H3L3 scFv)은 다음과 같다:
Figure 112017028155957-pct00064
서열식별번호: 18 (hu8H9 클론 S3.3 scFv)은 다음과 같다:
Figure 112017028155957-pct00065
서열식별번호: 19 (hu8H9 클론 S7.2 scFv)는 다음과 같다:
Figure 112017028155957-pct00066
서열식별번호: 20 (hu8H9 클론 S7.17 scFv)은 다음과 같다:
Figure 112017028155957-pct00067
서열식별번호: 21 (hu8H9 클론 S7.22 scFv)은 다음과 같다:
Figure 112017028155957-pct00068
서열식별번호: 22 (hu8H9 클론 S7.28 scFv)는 다음과 같다:
Figure 112017028155957-pct00069
서열식별번호: 23 (hu8H9 클론 S7.29 scFv)은 다음과 같다:
Figure 112017028155957-pct00070
서열식별번호: 24 (hu8H9 3.1 scFv)는 다음과 같다:
Figure 112017028155957-pct00071
서열식별번호: 25 (hu8H9 4.1 scFv)는 다음과 같다:
Figure 112017028155957-pct00072
서열식별번호: 26 (hu8H9 5.1 scFv)은 다음과 같다:
Figure 112017028155957-pct00073
서열식별번호: 27 (ch8H9 6.1 scFv)은 다음과 같다:
Figure 112017028155957-pct00074
서열식별번호: 28 (링커 huOKT3 (항-CD3) scFv)은 다음과 같다:
Figure 112017028155957-pct00075
서열식별번호: 29 (링커 C825 (항-DOTA) scFv)는 다음과 같다:
Figure 112017028155957-pct00076
이중특이적 항체
이중특이적 항체는 관련 기술 분야에 널리 공지되어 사용되고 있다. 이중특이적 항체는 2 이상의 상이한 항체로부터의 단편을 포함하고 결과적으로 2 이상의 상이한 유형의 항원에 결합하는 인공 단백질이다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 이중특이적 항체는 2개의 상이한 중쇄 및 2개의 상이한 경쇄를 포함한다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 이중특이적 항체 작용제, 예를 들어 이중특이적 항체는 2개의 특이성을 가지며, 그 중 하나는 B7H3에 결합하고 다른 하나는 T 세포 상의 CD3 또는 DOTA에 결합한다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 본원에서 설명되는 이뮤노글로불린 경쇄는 서열식별번호: 30 또는 서열식별번호: 31에 제시된 폴리펩티드 (아래에 제시됨)에 융합된다. 서열식별번호: 30은 T 세포 수용체 복합체의 일부인 scFv 결합 huOKT3 (항-CD3)의 펩티드 서열 및 펩티드 링커 서열을 포함한다. 유사하게, 서열식별번호: 31은 펩티드 링커 서열 및 항-DOTA C825 scFv 항체 단편의 펩티드 서열을 포함한다. 이어서, 생성되는 경쇄-scFv 융합 단백질은 본원에서 설명되는 임의의 중쇄와 조합된다.
서열식별번호: 30 (링커 huOKT3 (항-CD3) scFv)
Figure 112017028155957-pct00077
서열식별번호: 31 (링커 C825 (항-DOTA) scFv)
Figure 112017028155957-pct00078
이뮤노글로불린 경쇄와 서열식별번호: 30 또는 서열식별번호: 31의 융합 및 이뮤노글로불린 중쇄와의 후속 쌍형성은 상이한 유형의 항원에 결합하는 이중특이적 항체를 생성한다. 항체 융합 단백질의 생성은 관련 기술 분야에서 표준이고, 널리 알려져 있고 사용되는 분자 생물학적 기술을 사용하여 일상적으로 수행되는 것으로 이해된다. 이중특이적 항체는 예를 들어 종양 세포 및 면역 세포를 서로 묶기 위해 사용될 수 있다 (결합된 항원 중의 하나는 종양 세포에 위치하고 다른 항원은 면역 세포에 위치한다).
접합체
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 항체 작용제는 페이로드 엔티티와 회합된다. 일부 실시양태에서, 페이로드 엔티티는 치료제이거나 이를 포함하고; 일부 실시양태에서, 페이로드 엔티티는 검출제이거나 이를 포함한다.
치료제
치료제는 예를 들어 단백질, 탄수화물, 지질, 핵산, 소형 유기 분자, 비-생물학적 중합체, 금속, 이온, 방사성 동위원소 등을 포함하고 이로 제한되지 않는 임의의 클래스의 화학적 물질이거나 이를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 치료제는 암의 하나 이상의 증상 또는 원인의 치료와 관련된 생물학적 활성을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명에 따른 사용을 위한 치료제는 면역계의 조절 및/또는 T-세포 매개 세포독성의 증진 및/또는 T 세포 증식 및 기능에 대한 B7H3의 억제 효과의 억제와 관련된 생물학적 활성을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 치료제는 하나 이상의 다른 활성을 갖는다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 접합된 치료제는 방사성 동위원소, 약물 접합체, 나노입자, 면역독소 또는 임의의 다른 치료 페이로드이다.
검출제
검출제는 예를 들어 그의 특이적 기능적 특성 및/또는 화학적 특성으로 인해 검정을 사용하여 검출될 수 있는 임의의 모이어티를 포함한다. 이러한 검출제의 비-제한적인 예는 효소, 방사성 표지, 합텐, 형광 표지, 인광 분자, 화학발광 분자, 발색단, 발광 분자, 광친화성 분자, 착색 입자 또는 리간드 (예를 들어, 비오틴)를 포함한다.
항체에 대한 그의 부착을 위한 시스템인 많은 검출제가 관련 기술 분야에 공지되어 있다 (예를 들어, 각각 참조로 본원에 통합된 미국 특허 5,021,236, 4,938,948 및 4,472,509 참조). 이러한 검출제의 예는 특히 상자성 이온, 방사성 동위원소, 형광단, NMR-검출가능 물질, X-선 영상화제 등을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 상자성 이온은 크로뮴 (III), 망가니즈 (II), 철 (III), 철 (II), 코발트 (II), 니켈 (II), 구리 (II), 네오디뮴 (III), 사마륨 (III), 이테르븀 (III), 가돌리늄 (III), 바나듐 (II), 테르븀 (III), 디스프로슘 (III), 홀뮴 (III), 에르븀 (III), 란타넘 (III), 금 (III), 납 (II) 및/또는 비스무트 (III) 중의 하나 이상이다.
방사성 동위원소는 악티늄-225, 아스타틴-211, 비스무트-212, 탄소-14, 크로뮴-51, 염소-36, 코발트-57, 코발트-58, 구리-67, 유로퓸-152, 갈륨-67, 수소-3, 아이오딘-123, 아이오딘-124, 아이오딘-125, 아이오딘-131, 인듐-111, 철-59, 납-212, 루테튬-177, 인-32, 라듐-223, 라듐-224, 레늄-186, 레늄-188, 셀레늄-75, 황-35, 테크니슘-99m, 토륨-227, 이트륨-90 및 지르코늄-89 중의 하나 이상일 수 있다. 방사성 표지된 항체 작용제는 관련 기술 분야에 공지된 기술에 따라 제조될 수 있다. 예를 들어, 모노클로날 항체는 나트륨 및/또는 칼륨 아이오다이드 및 화학적 산화제, 예컨대 차아염소산나트륨 또는 락토퍼옥시다제와 같은 효소적 산화제와의 접촉에 의해 아이오딘화될 수 있다. 제공된 항체 작용제는 예를 들어 퍼테크네테이트를 주석 용액으로 환원시키고, 환원된 테크네튬을 세파덱스 (Sephadex) 컬럼에 킬레이팅하고, 항체를 이 컬럼에 적용함으로써 리간드 교환 공정에 의해 테크네튬-99m로 표지될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제공된 항체 작용제는 직접 표지화 기술을 사용하여, 예를 들어 퍼테크네테이트, SNCl2와 같은 환원제, 나트륨-칼륨 프탈레이트 용액과 같은 완충제, 및 항체를 인큐베이팅함으로써 표지된다. 금속 이온으로 존재하는 방사성 동위원소를 항체에 결합시키는 데 종종 사용되는 중개 관능기는 디에틸렌트리아민펜타아세트산 (DTPA) 또는 에틸렌 디아민테트라아세트산 (EDTA) 또는 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산 (DOTA), 또는 p-아미노벤질-DOTA (DOTA-Bn)이다. 방사성 동위원소는 예를 들어 선량 측정에 의해 검출될 수 있다.
형광 표지는 알렉사(Alexa) 350, 알렉사 430, AMCA, 보디피(BODIPY) 630/650, 보디피 650/665, 보디피-FL, 보디피-R6G, 보디피-TMR, 보디피-TRX, 캐스케이드 블루(Cascade Blue), Cy3, Cy5,6-FAM, 플루오레세인 이소티오시아네이트, HEX, 6-JOE, 오레곤 그린(Oregon Green) 488, 오레곤 그린 500, 오레곤 그린 514, 퍼시픽 블루(Pacific Blue), REG, 로다민 그린(Rhodamine Green), 로다민 레드(Rhodamine Red), 레노그라핀(Renographin), ROX, TAMRA, TET, 테트라메틸로다민 및/또는 텍사스 레드(Texas Red) 등 중 하나 이상이거나 이를 포함할 수 있다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 접합된 검출제는 진단 또는 영상화제이다.
접합체 제조
항체 작용제의 치료제 또는 검출제에 대한 결합 또는 접합을 위한 여러 기술이 관련 기술 분야에 공지되어 있다. 일부 부착 기술은 예를 들어 항체에 부착된 유기 킬레이팅제, 예컨대 디에틸렌트리아민펜타아세트산 무수물 (DTPA); 에틸렌트리아민테트라아세트산; N-클로로-p-톨루엔술폰아미드; 및/또는 테트라클로로-3α-6α-디페닐글리코우릴-3을 사용하는 금속 킬레이트 복합체의 사용을 포함한다 (각각 본원에 참고로 포함된 미국 특허 4,472,509 및 4,938,948). 제공된 항체 작용제는 또한 글루타르알데히드 또는 퍼아이오데이트와 같은 커플링제의 존재 하에 효소와 반응할 수 있다. 예를 들어, 플루오레세인 마커와의 접합체는 이들 커플링제의 존재 하에 또는 이소티오시아네이트와의 반응에 의해 제조된다.
유용한 항- B7H3 항체 작용제의 확인 및/또는 특성화
본 개시내용은 B7H3의 FG-루프를 표적으로 하는 8H9 항체 작용제를 포함하는 항체 작용제가 B7H3의 면역-억제 기능을 차단하는데 사용될 수 있다는 최초 증명을 제공한다. 따라서, 본 개시내용은 그러한 활성을 갖는 항체 작용제를 확인 및/또는 특성화하는 것이 바람직함을 입증한다. 본 개시내용은 또한 상기 확인 및/또는 특성화를 수행하기 위한 다양한 시스템을 제공한다. 일부 실시양태에서, 예를 들어, 결합이 직접 평가된다. 일부 실시양태에서, T 세포 증식, 활성화 및/또는 기능에 대한 효과가 평가된다. 일부 실시양태에서, 면역 조절이 평가된다. 일부 실시양태에서, 면역 관문 (immune checkpoint) 억제 및/또는 차단이 평가된다. 일부 실시양태에서, 종양 세포 사멸, 종양 세포 표적화 및/또는 이펙터 세포 사멸이 평가된다. 일부 실시양태에서, 본원에서 설명되는 바와 같은 8H9 항체 작용제와의 경쟁이 평가된다. 일부 실시양태에서, 본원에서 설명되는 바와 같은 8H9 항체 작용제와 비교하여 치료 효능이 평가된다.
조성물
또한, 본 발명은 항체 작용제, scFv 또는 인간화 항체 또는 그의 항원 결합 단편 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
본원에서 제공되는 제약 조성물은 멸균 주사가능 형태 (예를 들어, 피하 주사 또는 정맥내 주입에 적합한 형태)로 제공될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 주사에 적합한 액체 투여 형태로 제공된다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 주사 전에 수성 희석제 (예를 들어, 물, 완충제, 염 용액 등)로 재구성되는, 임의로 진공 하에 분말 (예를 들어, 동결 건조 및/또는 멸균)로서 제공된다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 물, 염화나트륨 용액, 아세트산나트륨 용액, 벤질 알콜 용액, 인산염 완충 염수 등으로 희석 및/또는 재구성된다. 일부 실시양태에서, 분말은 수성 희석제와 부드럽게 (예를 들어, 진탕하지 않으면서) 혼합되어야 한다.
본 발명의 일부로서 고려되는 제약 조성물은 주사가능한 제약 조성물로 제한되지 않고, 관련 기술 분야에 일반적으로 공지되고 사용되는 모든 유형의 제약 조성물을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제공된 제약 조성물은 하나 이상의 제약상 허용되는 부형제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 하나 이상의 보존제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 보존제를 포함하지 않는다. 본원에서 사용된 부형제는 원하는 특정 투여 형태에 적합한 용매, 분산매, 희석제 또는 다른 액체 비히클, 분산 또는 현탁 조제, 표면 활성제, 등장제, 증점제 또는 유화제, 보존제, 고체 결합제, 윤활제 등이거나 이를 포함할 수 있다. 문헌 [Remington's The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, A. R. Gennaro, (Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2006)]에는 제약 조성물을 제제화할 때 사용되는 다양한 부형제 및 그의 제조를 위한 공지된 기술이 개시되어 있다. 임의의 통상적인 부형제 매질이 예컨대 임의의 바람직하지 않은 생물학적 효과를 생성하거나 제약 조성물의 임의의 다른 성분(들)과 유해한 방식으로 상호작용함으로써 물질 또는 그의 유도체와 상용성이 아닌 경우를 제외하고, 그의 사용은 본 발명의 범위 내에 포함되는 것으로 고려된다.
일부 실시양태에서, 제약 조성물은 냉장 및/또는 동결될 수 있는 형태로 제공된다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 냉장 및/또는 동결할 수 없는 형태로 제공된다. 일부 실시양태에서, 재구성된 용액 및/또는 액체 투여 형태는 재구성 후 일정 기간 동안 (예를 들어, 2시간, 12시간, 24시간, 2일, 5일, 7일, 10일, 2주, 1개월, 2개월 또는 그 이상) 보관될 수 있다.
액체 투여 형태 및/또는 재구성된 용액은 투여 전에 미립자 물질 및/또는 변색을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 변색되거나 흐려지거나 및/또는 여과 후에 입자상 물질이 남아있는 경우에는 용액을 사용하지 않아야 한다.
본원에서 설명되는 제약 조성물의 제제는 약학 기술 분야에서 공지된 또는 이후 개발되는 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 일부 실시양태에서, 그러한 제조 방법은 활성 성분을 하나 이상의 부형제 및/또는 하나 이상의 다른 보조 성분과 배합한 후, 필요하다면 및/또는 바람직하다면 생성물을 원하는 단일 또는 다중 투여 단위로 성형 및/또는 포장하는 단계를 포함한다.
본 발명에 따른 제약 조성물은 포장하지 않은 상태로, 단일 단위 투여량으로, 및/또는 복수의 단일 단위 투여량으로 제조, 포장 및/또는 판매될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "단위 투여량"은 미리 결정된 양의 활성 성분을 포함하는 제약 조성물의 분리된 양이다. 활성 성분의 양은 일반적으로 대상체에게 투여될 투여량 및/또는 상기 투여량의 편리한 분획, 예컨대 상기 투여량의 1/2 또는 1/3과 동일하다.
본 발명에 따른 제약 조성물 내의 활성 성분, 제약상 허용되는 부형제 및/또는 임의의 추가 성분의 상대적인 양은 치료되는 대상체의 신원, 크기 및/또는 상태에 따라 및/또는 조성물이 투여될 경로에 따라 달라질 수 있다. 예로서, 조성물은 0.1% 내지 100% (w/w)의 활성 성분을 포함할 수 있다.
용도
암 치료 & 면역억제 완화
본 발명은 또한 치료 유효량의 항체 작용제, scFv 또는 인간화된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 이를 필요로 하는 환자에게 투여함으로써 암을 치료하는 방법을 제공한다. 항체 작용제의 투여가 암을 치료하는지의 여부는 본원의 실시예에서 설명되는 방법을 포함하는 공지된 방법으로 결정될 수 있다.
본 발명은 또한 면역계의 조절 및/또는 T-세포 매개 세포독성의 증진 및/또는 B7H3의 T 세포 증식 및 기능에 대한 억제 효과의 억제를 필요로 하는 환자에게 치료 유효량의 항체 작용제, scFv 또는 인간화 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 투여함으로써 면역계를 조절하고/하거나 T-세포 매개 세포독성을 증강시키고/시키거나 B7H3의 T 세포 증식 및 기능에 대한 억제 효과를 억제하는 방법을 제공한다. 항체 작용제의 투여가 면역계를 조절하고/하거나 T-세포 매개 세포독성을 증강시키는 지의 여부는 본원에서 설명되는 실시예에 기재된 방법을 포함하는 공지된 방법에 의해 결정될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 예를 들어 면역계의 조절 및/또는 NK 세포 매개 기능의 향상 및/또는 NK 세포 활성 및/또는 기능에 대한 B7H3의 억제 효과의 억제를 필요로 하는 환자에게 치료 유효량의 항체 작용제, scFv 또는 인간화 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 투여함으로써 대상체에서 면역계를 조절하고/하거나 NK 세포 매개 기능을 향상시키고/시키거나 NK 세포 활성 및/또는 기능에 대한 B7H3의 억제 효과를 억제하는 방법을 제공한다. 항체 작용제의 투여가 면역계를 조절하고/하거나 NK 세포 활성 및/또는 기능을 향상시키는 지의 여부는 본원에서 설명되는 방법을 포함하는 공지된 방법으로 결정될 수 있다.
일부 실시양태에서, 투여되는 정확한 양은 의학 분야에서 잘 공지된 하나 이상의 인자에 따라 대상체마다 다를 수 있다. 이러한 인자는 예를 들어 종, 연령, 대상체의 일반적인 상태, 감염의 중증도, 특정 조성물, 그의 투여 방식, 그의 활성 형태, 치료되는 장애 및 장애의 중증도; 사용된 특정 항체 작용제의 활성; 투여된 특정 제약 조성물; 투여 후 조성물의 반감기; 대상체의 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별 및 식이; 투여 시간, 투여 경로 및 사용된 특정 화합물의 배설 속도; 치료 기간; 사용된 특정 화합물과 조합되거나 또는 동시에 사용되는 약물 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 제약 조성물은 투여 용이성 및 투여량의 균일성을 위해 단위 투여 형태로 제제화될 수 있다. 그러나, 본 발명의 조성물의 총 1일 사용량은 건전한 의학적 판단 범위 내에서 주치의에 의해 결정될 것임을 이해할 것이다.
일부 실시양태에서, 투여되는 정확한 양은 적어도 일부 실시양태에서 T 및/또는 NK 세포 활성 및/또는 기능의 B7H3 억제, 저해 또는 차단을 조절하는 것을 포함하는, 본원에서 설명되는 하나 이상의 조절 효과를 효과적으로 달성하기 위한 본원에서 설명되는 항체 작용제의 양일 수 있다.
본 발명에 따른 항체 작용제 및 본 발명에 따른 그의 제약 조성물은 임의의 적절한 경로 및 요법에 따라 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 경로 또는 요법은 긍정적인 치료 효과와 상호관련된 것이다. 일부 실시양태에서, 경로 또는 요법은 FDA 및/또는 EP에 의해 승인된 것이다.
본 발명의 제약 조성물은 통상의 기술자에게 이해될 임의의 경로로 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물은 경구 (PO), 정맥내 (IV), 근내 (IM), 동맥내, 골수내, 척수강내, 피하 (SQ), 뇌실내, 경피, 진피내, 피내, 직장 (PR), 질내, 복강내 (IP), 위내 (IG), 국소 (예를 들어, 분말, 연고, 크림, 젤, 로션 및/또는 점적제에 의한), 점막, 비내, 협측, 경장, 유리체내, 설하; 기관내 점적, 기관지 점적 및/또는 흡입에 의해; 구강 스프레이, 비내 스프레이 및/또는 에어로졸로서, 및/또는 문맥 카테테르를 통해 투여된다.
일부 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체 작용제 및/또는 그의 제약 조성물은 정맥내 주입에 의해 정맥 내로 투여될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체 작용제 및/또는 그의 제약 조성물은 근내 주사에 의해 투여될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체 작용제 및/또는 그의 제약 조성물은 피하 주사에 의해 투여될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체 작용제 및/또는 그의 제약 조성물은 문맥 카테테르를 통해 투여될 수 있다. 그러나, 본 발명은 약물 전달 과학의 발전 가능성을 고려한 임의의 적절한 경로에 의한 본 발명에 따른 항체 작용제 및/또는 그의 제약 조성물의 전달을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체 작용제 및/또는 본 발명에 따른 그의 제약 조성물은 원하는 치료 효과를 얻기 위해 1일당 대상체의 체중 기준으로 약 0.001 mg/kg 내지 약 100 mg/kg, 약 0.01 mg/kg 내지 약 50 mg/kg, 약 0.1 mg/kg 내지 약 40 mg/kg, 약 0.5 mg/kg 내지 약 30 mg/kg, 약 0.01 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 0.1 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 또는 약 1 mg/kg 내지 약 25 mg/kg을 전달하기에 충분한 투여 수준으로 투여될 수 있다. 요구되는 용량은 1일 3회 초과, 1일 3회, 1일 2회, 1일 1회, 격일로, 3일마다, 매주, 2주마다, 3주마다, 4주마다, 2개월마다, 6개월마다, 또는 12개월마다 전달될 수 있다. 특정 실시양태에서, 요구되는 용량은 다중 투여 (예를 들어, 2회, 3회, 4회, 5회, 6회, 7회, 8회, 9회, 10회, 11회, 12회, 13회, 14회 또는 이보다 많은 투여)를 사용하여 전달될 수 있다.
조합 요법
본 발명에 따른 항체 작용제 및/또는 그의 제약 조성물이 조합 요법에 사용될 수 있다는 것은 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 이해될 것이다.
조합 요법에 사용하기 위한 요법 (예를 들어, 치료제 또는 절차)의 특정 조합은 요구되는 치료제 및/또는 절차의 적합성 및 달성될 요구되는 치료 효과를 고려할 것이다. 또한, 본 발명의 제약 조성물은 조합 요법 (예를 들어, 조합 항체 요법)에 사용될 수 있고, 즉, 제약 조성물은 하나 이상의 다른 요구되는 치료 절차와 동시에, 그 전에 또는 그 후에 투여될 수 있음을 이해할 것이다.
본 발명에 따른 항체 작용제의 치료 유효량은 제공되는 제약 조성물에서 적어도 하나의 다른 활성 성분과 조합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 또 다른 활성 성분은 항암제, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, RNA 폴리머라제 억제제, 프로테아제 억제제, 헬리카제 억제제, 면역조절제, 안티센스 화합물, 짧은 간섭 RNA, 짧은 헤어핀 RNA, 마이크로 RNA, RNA 앱타머, 리보자임, 및 이들의 조합물이다. 조합 요법에서 사용하기 위한 치료법의 특정 조합은 일반적으로 요구되는 치료제 및/또는 절차의 적합성 및 달성될 요구되는 치료 효과를 고려할 것이다. 또한, 사용되는 요법은 동일한 장애에 대해 요구되는 효과를 달성할 수 있거나, 상이한 효과를 달성할 수 있음을 이해할 것이다.
사용되는 치료법은 동일한 목적을 위해 요구되는 효과를 달성할 수 있거나, 상이한 효과 (예를 들어, 임의의 부작용의 조절)를 달성할 수 있음이 이해될 것이다. 본 발명은 그의 생체이용률을 개선하고, 그의 대사를 감소시키고/시키거나 변경하고/하거나, 그의 배출을 억제하고/하거나, 신체 내의 그의 분포를 변형시킬 수 있는 작용제와 조합한 제약 조성물의 전달을 포함한다.
일부 실시양태에서, 조합하여 사용되는 작용제는 이들이 개별적으로 이용되는 수준을 초과하지 않는 수준에서 이용될 것이다. 일부 실시양태에서, 조합하여 이용되는 수준은 개별적으로 이용되는 수준보다 낮을 것이다.
일부 실시양태에서, 조합 요법은 단일 에피토프 (예를 들어, 단일 입체형태 에피토프)에 대해 작용하는 다수의 항체 작용제의 투여를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 조합 요법은 예를 들어 종양 형성 과정에서의 다중 메카니즘을 동시에 방해하기 위해, 별개의 에피토프를 인식하는 다수의 항체 작용제를 포함할 수 있다.
통상의 기술자는 본 발명에 따른 항체 작용제의 임의의 치환군 (permutation) 또는 조합물이 임의의 다른 항체 작용제와 조합되어 다수의 상이한 항체 작용제를 포함하는 조성물 및/또는 조합 요법제를 제제화할 수 있음을 이해할 것이다.
핵산
특정 실시양태에서, 본 발명은 본원에서 설명되는 항체 작용제를 코딩하는 핵산 (예를 들어, DNA 및 RNA 포함)을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 본원에서 설명되는 항체 작용제를 코딩하는 핵산에 상보적인 핵산을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 항체 작용제를 코딩하는 핵산에 혼성화하는 핵산 분자를 제공한다. 이러한 핵산은 예를 들어 프라이머 또는 프로브로서 사용될 수 있다. 단지 몇 가지의 예를 들면, 상기 핵산은 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)에서 프라이머로서, 혼성화 (인 시츄 (in situ) 혼성화 포함)를 위한 프로브로서 및/또는 역전사-PCR (RT-PCR)을 위한 프라이머로서 사용할 수 있다.
특정 실시양태에서, 핵산은 DNA 또는 RNA일 수 있고, 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 일부 실시양태에서, 핵산은 하나 이상의 비-천연 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 핵산은 천연 뉴클레오티드만을 포함한다.
항체 작용제, 특히 항체 및 그의 에피토프-결합 단편을 코딩하는 핵산의 생성 및 조작은 관련 기술 분야에 공지되어 있고, 비제한적인 예를 들어 문헌 [Green & Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press 2012]에 기재되어 있다.
본원에서 설명되는 핵산은 관련 기술 분야에 널리 공지된 기술을 사용하여 관련 기술 분야에 공지된 많은 발현 벡터 및 시스템 중 임의의 하나에 클로닝되고 조직 배양에서 핵산을 발현하도록 선택된 세포 내로 형질감염될 수 있다. 이와 관련하여 본 발명의 범위 내에 속하는 세포의 비-제한적인 예는 일반적으로 면역 세포 및 T 세포 및 보다 특히 다른 항원 제시 세포이다. 예를 들어, 문헌 [Green & Sambrook, Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press 2012]을 참조한다.
하기 실시예는 본 발명을 추가로 설명하지만, 본 발명의 범위를 어떤 식으로도 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다.
본원에 인용된 모든 특허 및 비-특허 문헌은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
실시예
결과
ch8H9의 결정화
ch8H9 Fab 단편의 결정 구조는 PDB 엔트리 (3D85)를 사용하여 분자 치환에 의해 결정되고 2.5Å 분해능으로 정밀화되었다. 수집 및 정밀화 통계는 표 2에 제시된다 (최고 분해능 쉘에 대한 통계는 괄호 안에 표시됨). 최종 모델은 프로테인 데이터 뱅크 (Protein Data Bank) (액세스 코드 5CMA)에 기탁되었다.
ch8H9 Fab 구조는 모든 Fab 구조에 공통적인 이뮤노글로불린 폴드 도메인을 갖고, 항원 인식 부위를 형성하는 6개의 CDR 루프 (H1, H2, H3, L1, L2 및 L3)는 잘 규정된 전자 밀도를 가졌다 (도 1 참조). 항원-결합 부위의 정전 표면 전위는 델파이 (DelPhi) (도 1c; Rocchia, W. et al., 2002, J. Comput. Chem. 23:128-137)를 사용하여 계산하였다. 결합 부위의 중심에는 L3 및 H3 루프가 우세한 양으로 하전된 표면 영역의 큰 영역이 존재한다. 음으로 하전된 표면 영역 (H2 및 L1 루프 영역에서)의 두 개의 포켓이 중앙 영역의 측면에 인접하고, 이것은 8H9에 의해 인식되는 항원이 혼합된 표면 전하 분포를 갖는다는 것을 나타낸다.
<표 2>
Figure 112017028155957-pct00079
m8H9의 인간화
m8H9의 중쇄 및 경쇄의 CDR을, 중쇄에 대해서는 인간 생식계열 서열 IGHV1-46 및 경쇄에 대해서는 IGKV-7에 대한 상동성을 기초로 하여 IgG1 프레임워크에 이식하였다. 인간화된 중쇄의 2가지 버전인 H1 및 H2가 생성되었고, H1은 더 많은 인간 주형 서열을 포함하였다. 인간화된 경쇄의 2가지 버전인 L1 (서열식별번호: 2) 및 L2 (서열식별번호: 3)도 생성되었고, L1은 보다 많은 인간 주형 서열을 함유하였다. 이어서, 인간화된 8H9 IgG1 항체의 4가지 버전 (H1L1 [서열식별번호: 10, 서열식별번호: 2], H1L2 [서열식별번호: 10, 서열식별번호: 3], H2L1 [서열식별번호: 11, 서열식별번호: 2] 및 H2L2 [서열식별번호: 11, 서열식별번호: 3])을 키메라 (ch) 8H9 IgG1과 함께 클로닝하고, 발현 및 정제하였다.
도 3 및 표 3은 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정된, B7H3에 대한 m8H9 및 ch8H9의 결합 특성을 나타낸다. 두 항체 모두 매우 유사한 결합 동역학을 보였다 (각각 0.28 nM KD 및 0.74 nM).
도 4 및 표 4는 4개의 인간화된 8H9 (hu8H9) IgG1의 결합 특성을 보여준다. 대부분의 인간 성분을 함유하는 변이체 H1L1 (서열식별번호: 10, 서열식별번호: 2)은 3개의 다른 변이체보다 B7H3에 더 약하게 (112 nM KD) 결합하지만, 단지 최적 미만의 결합 능력 (34.8-38.6 nM KD)을 보일 뿐이었다.
<표 3>
Figure 112017028155957-pct00080
<표 4>
Figure 112017028155957-pct00081
hu8H9의 B7H3에 대한 결합을 개선하기 위해, m8H9의 구조 모델을 생성하고, CHARMm 역장 (force field)을 사용하여 시뮬레이션하였다. 인 실리코 (in silico) 돌연변이 유발은 모든 가능한 단일 인간화 돌연변이의 영향을 분석하기 위해 수행되었다. 하기 표 5는 m8H9의 고유 구조의 불안정화를 초래할 수 있는 프레임워크 영역 내의 6개의 돌연변이 (경쇄: S20T, S69T, L106I; 중쇄: V12K, R40A, E42G)를 나타낸다. 이들 6개의 돌연변이의 역 (경쇄: T20S, T69S, I106L; 중쇄: K12V, A40R, G42E)을 hu8H9 H1L2 내에 도입하여 hu8H9 H3L3 (서열식별번호: 12, 서열식별번호: 4)을 제조하였다. 돌연변이는 항체 인간화 및 최적화의 비-표준 방법인 인 실리코 에너지 계산을 기초로 하여 만들어졌다. 항체 인간화의 표준 방법은 CDR 이식 및 CDR 잔기에 대한 서열 상동성 및 근접성을 기초로 한 역돌연변이를 만드는 것을 수반한다. 구축물 H1L1, H1L2, H2L1 및 H2L2는 표준 CDR 이식 방법으로 만들었다.
<표 5>
Figure 112017028155957-pct00082
상동성 모델링에 기초한 hu8H9 H3L3 (서열식별번호: 12, 서열식별번호: 4)의 설계 후에, ch8H9 Fab 단편의 결정 구조가 2.5Å에서 분해되었다. hu8H9 H3L3의 인간 함량을 증가시키기 위한 노력으로, ch8H9 Fab 단편의 결정 구조를 CHARMm 역장으로 시뮬레이션하고, 인 실리코 돌연변이 유발을 수행하여 모든 가능한 단일 인간화 돌연변이의 효과를 다시 한번 분석하였다. 하기 표 6 및 표 7 둘 다는 8H9 구조를 안정화시킬 것으로 예측된 경쇄 내의 7개의 돌연변이 (S20T, E42Q, S43A, N76S, V78L, E79Q, V83F) 및 중쇄 내의 5개의 돌연변이 (L20V, K67R, A68V, L70M 및 A79V)를 보여준다. 이들 12개의 인간화 돌연변이를 hu8H9 H3L3에 도입하여 hu8H9 4.1 (서열식별번호: 14, 서열식별번호: 6)을 생성하였다. 이들 돌연변이는 항체 인간화 및 최적화의 비-표준 방법인 인 실리코 에너지 계산을 기초로 하여 만들어졌다.
<표 6>
Figure 112017028155957-pct00083
<표 7>
Figure 112017028155957-pct00084
효모 디스플레이에 의한 친화도 성숙
특히 바람직한 친화도-성숙 인간화 8H9 항체의 선택을 돕기 위해 비오티닐화된 B7H3 구축물을 사용하였다. 이 방법을 위해, 마우스 Fc에 융합된 4Ig-B7H3을 DG44 CHO 세포에서 발현시켰다. 비오티닐화를 위해, NHS-활성화된 비오틴을 사용하여 라이신 (K) 잔기의 측쇄 및 폴리펩티드의 N-말단의 1차 아미노기 (-NH2)와 효율적으로 반응시켰다. 과량의 비-반응된 비오틴은 한외여과 컬럼을 사용하여 크기 배제에 의해 제거하였다. B7H3-mFc 항원의 성공적인 비오티닐화는 ELISA에서 HRP 접합된 스트렙타비딘으로 염색함으로써 확인되었다 (도 5a). 마우스/인간 키메라 8H9 IgG에 의한 비오티닐화된 B7H3-Fc의 검출은 비오틴 모이어티가 B7H3-Fc에 대한 8H9 항체의 특이적인 결합을 방해하지 않음을 확인하였다 (도 5b).
인간화된 hu8H9 H3L3의 친화도를 증가시키기 위해, 이것은 scFv로 전환되고, 오류 유발 (error-prone) PCR에 의해 무작위로 돌연변이 유발되었다. 이전에, 본 발명자들은 유동 세포 계측을 통해 돌연변이체를 정밀하게 구별할 수 있도록 하기 때문에 항체의 추가의 성숙을 위해 효모 디스플레이를 성공적으로 사용하였다. 따라서, 돌연변이체 라이브러리는 c-myc 태그를 포함하는 벡터와 상동성 재조합에 의해 효모 세포 상에 디스플레이되었다. 상대적으로 큰 (최대 108개) 크기의 돌연변이체 효모 라이브러리를 생성하고, 먼저 비오티닐화된 B7H3-mFc에 접합된 자성 비드를 사용하여 사전에 선택하여, 항체를 발현하지 않거나 항원에 약하게 결합된 효모 세포를 제거할 수 있게 하였다. 그 후, 엄격한 조건 하에서 B7H3에 대한 결합에 대해 선택하기 위해 돌연변이체 라이브러리를 FACS로 수회 분류하였다 (도 6). 분류된 scFv 변이체는 전체 유전자의 오류 유발 PCR에 의해 추가로 돌연변이시켜 새로운 하위 라이브러리를 만들었다. 이어서, 분류 및 돌연변이 유발 과정은 주기적으로 반복되었다. B7H3에 가장 강하게 결합하는 클론은 최종 성숙 라운드에서 수득되었다 (도 6). 최종 (7차) 라운드의 분류로부터 유래된 효모는 B7H3-mFc 항원으로 염색될 때 모 hu8H9 H3L3 (서열식별번호: 12, 서열식별번호: 4)를 디스플레이하는 효모보다 유의하게 더 강한 결합을 나타내었다 (도 7). 이러한 결과는 강화된 효모 돌연변이체가 돌연변이 유발되지 않은 모체에 비해 유의하게 증가된 결합 친화도를 가짐을 나타냈다. 최종 성숙 라운드로부터의 가장 높은 친화도 클론이 확인되었다. 강력한 결합 클론의 서열 데이터는 클러스터 분석에 의해 분류되었다. 다음 scFv 변이체가 반복적으로 선택되었다: S7.2 (서열식별번호: 19), S7.17 (서열식별번호: 20), S7.22 (서열식별번호: 21), S7.28 (서열식별번호: 22) 및 S7.29 (서열식별번호: 23) (도 8).
선택된 scFv 돌연변이체의 결합 특성
ELISA에서, FACS-선택된 scFv 변이체는 모 hu8H9 H3L3 또는 S3.3 (Sort3)에서 관찰된 것보다 B7H3의 4Ig 또는 2Ig 형태에 더 우수한 결합을 나타냈다 (도 9). CM5 칩 상에 항원-코팅된 4Ig-B7H3에 대한 상이한 8H9 변이체의 결합을 비아코어 (Biacore) T-100을 사용한 표면 플라즈몬 공명에 의해 비교하였다. hu8H9 H3L3 및 S3.3을 포함한, 선택된 모든 변이체의 얻어진 KD 값을 하기 표 8에 열거한다.
<표 8>
Figure 112017028155957-pct00085
7차 분류로부터의 scFv 변이체는 모 hu8H9 H3L3 및 S3.3에 대해 각각 관찰된 144 nM 및 10 nM의 해리 상수 (KD)에 비해 약 6 nM, 2 nM, 1 nM, 277 nM 및 3 nM의 해리 상수 (KD)로 항원에 결합하였다. 7차 분류로부터의 scFv 변이체 중, scFv S7.17, S7.22 및 S7.29는 가장 높은 결합 친화도를 나타내어, 50배 초과의 친화도 개선을 달성하였다. scFv S7.22 (서열식별번호: 21)는 특히 모 hu8H9 H3L3 scFv (서열식별번호: 17)에 비해 100배 초과의 결합 개선을 가져왔다.
친화도 성숙 scFv 변이체에 의한 종양 세포의 면역 염색
본 발명자들은 hu8H9 H3L3 (서열식별번호: 17), S3.3 (서열식별번호: 18) 및 S7.22 (서열식별번호: 21) scFv 변이체의 신경모세포종 M14 세포에 대한 결합을 비교하였다 (도 10). 본 발명자들은 scFv S7.22가 scFv 변이체 Hu8H9 및 S3.3보다 우수한 결합을 나타냄을 발견하였다.
주요 친화도 향상 돌연변이의 결정
아래의 표 9는 친화도 성숙 분류 서열로부터 동정된 6개의 돌연변이 (LC: S20T, LC: H34Y, HC: A24T, HC: E42G, HC: G56D, HC: A102G)를 나열한다. 돌연변이 중 4개 (LC: S20T, LC: H34Y, HC: A24T, HC: E42G)는 제3 라운드의 분류 (클론 S3.3 [서열식별번호: 18]로부터 유래하고, 이어서 제7 라운드의 분류로부터의 대부분의 클론에 존재하였다.
<표 9>
Figure 112017028155957-pct00086
가장 높은 친화도 클론인 S7.22는 2개의 추가의 돌연변이 (HC: G56D, HC: A102G)를 갖는다. 확인된 돌연변이 중 3개는 CDR 영역에 직접 존재한다 (LC: H34Y, HC: G56D, HC: A102G). 2개의 돌연변이 (LC: S20T, HC: E42G)는 인간화에 사용된 인간 생식계열 주형과 서열이 동일하다.
친화도 향상 및 인간화 변형
hu8H9 H3L3 서열 (서열식별번호: 12, 서열식별번호: 4)에 6개의 친화도 성숙 돌연변이 (LC: S20T, LC: H34Y, HC: A24T, HC: E42G, HC: G56D, HC: A102G)를 도입하여 hu8H9 3.1 (서열식별번호: 24) scFv 및 IgG1 변이체를 생성하였다. hu8H9 4.1 (서열식별번호: 25)의 서열은 이미 친화도 성숙으로부터 확인된 돌연변이 중의 하나 (LC: S20T)를 포함하였고, 추가의 5개의 돌연변이 (LC: H34Y, HC: A24T, HC: E42G, HC: G56D, HC: A102G)를 도입하여 hu8H9 5.1 scFv (서열식별번호: 26) 및 IgG1 변이체를 생성하였다.
hu8H9 H3L3 (서열식별번호: 17), 3.1 (서열식별번호: 24), 4.1 (서열식별번호: 25) 및 5.1 (서열식별번호: 26) scFv 변이체의 결합 동역학이 아래의 표 10에 제시되어있다.
<표 10>
Figure 112017028155957-pct00087
알 수 있는 바와 같이, 친화도 향상 돌연변이의 부가는 비-친화도 성숙 서열의 결합 친화도에 대한 비교에 의해 실질적으로 더 높은 결합 친화도 (hu8H9 3.1에 대해 0.9 nM의 KD 및 hu8H9 5.1에 대해 1.7 nM의 KD)를 유도하였다.
IgG1 항체 ch8H9 (서열식별번호: 9, 서열식별번호: 1), H1L2 (서열식별번호: 10, 서열식별번호: 3), H3L3 (서열식별번호: 12, 서열식별번호: 4), 3.1 (서열식별번호: 13, 서열식별번호: 5) 및 5.1 (서열식별번호: 15, 서열식별번호: 7)에 의한 4Ig-B7H3-Fc에 대한 결합의 동역학을 도 11 및 하기 표 11에 제시한다.
<표 11>
Figure 112017028155957-pct00088
표준 CDR 이식 기술에 의해 설계된 인간화 변이체 H1L2 (서열식별번호: 10, 서열식별번호: 3)는 ch8H9 (서열식별번호: 9, 서열식별번호: 1)보다 실질적으로 더 약한 결합을 갖는다 (hu8H9 H1L2에 대해 42.7 nM의 KD 및 ch8H9에 대해 1.2 nM의 KD). 본원에서 설명되는 바와 같이, 에너지 계산 및 분자 동역학 시뮬레이션에 기초한 새로운 컴퓨터 모델링 방법을 hu8H9 H3L3을 생성하기 위해 본 발명에 따라 이용하였고, 이에 의해 친화도 (6.6 nM)의 실질적인 개선이 달성되었다. 친화도 향상 돌연변이의 도입은 추가의 개선을 유도하고, ch8H9의 결합 특성과 대등한 결합 특징을 갖는 hu8H9 3.1 (서열식별번호: 13, 서열식별번호: 5) 및 5.1 (서열식별번호: 15, 서열식별번호 7) (각각 2.0 및 1.3 nM KD)을 생성하였다. 2Ig-B7H3-Fc에 결합할 때 유사한 향상이 관찰되었다 (도 12 및 하기 표 12).
<표 12>
Figure 112017028155957-pct00089
ch8H9 (서열식별번호: 9, 서열식별번호: 1) 및 hu8H9 H1L2 (서열식별번호: 10, 서열식별번호: 3), 3.1 (서열식별번호: 13, 서열식별번호: 5) 및 5.1 (서열식별번호: 15, 서열식별번호: 7)의 B7H3-양성 흑색종 M14 종양 세포에 대한 결합을 시험하고, 생성되는 데이터를 도 13에 제시한다. Hu8H9 3.1 및 5.1의 결합은 ch8H9의 결합과 대등하고, hu8H9 H1L2의 결합보다 상당히 더 강하였다.
Fc 융합이 없는 IgG 구축물 (m8H9, ch8H9, hu8H9 H3L3 및 hu8H9 3.1)의 4Ig-B7-H3 및 2Ig-B7-H3 둘 모두에 대한 결합 동역학을 결정하였다 (표 13). m8H9 및 ch8H9 항체는 모두 4Ig-B7-H3보다 더 높은 친화도로 2Ig-B7-H3에 결합하였고, 이것은 결합 에피토프가 2Ig-B7-H3 형식에서 보다 완전하게 노출될 수 있음을 나타낸다. hu8H9 H3L3 IgG (4Ig-B73H3에 대해 33 nM의 KD 및 2Ig-B7-H3에 대해 45 nM의 KD)는 ch8H9 (4Ig-B73H3에 대해 7.7 nM의 KD 및 2Ig-B7-H3에 대해 2.7 nM의 KD)에 비해 친화도의 부분적인 상실이 있었다. 친화도-성숙 hu8H9 3.1은 모 hu8H9 H3L3에 비해 2.5 내지 9배의 친화도 향상을 보였다 (4Ig-B73H3에 대해 13 nM의 KD 및 2Ig-B7-H3에 대해 5.0 nM의 KD). hu8H9 3.1은 ch8H9보다 더 높은 친화도를 가지지 않았기 때문에, 6개의 친화도 성숙 돌연변이 (LC: S20T, LC: H34Y, HC: A24T, HC: E42G, HC: G56D, HC: A102G)를 ch8H9 IgG에 도입하여 ch8H9 6.1을 생성하였다. ch8H9 6.1의 결합 동역학은 4Ig-B73H3에 대해 3.7 nM의 KD 및 2Ig-B7-H3에 대해 0.6 nM의 KD이었고, 이것은 ch8H9에 비해 2 내지 4배의 결합 향상을 입증하였다.
<표 13>
Figure 112017028155957-pct00090
8H9 항체의 시험관내 종양 살해 특성
이어서, 본 발명자들은 표적으로서 신경모세포종 LAN-1 종양 세포 및 이펙터 세포로서 인간 PBMC를 사용하여 5개의 IgG 항체 구축물 (m8H9, ch8H9, ch8H9 6.1, hu8H9 H3L3 및 hu8H9 3.1)의 시험관내 종양 살해 ADCC 특성을 시험하였다. 세포독성은 51크로뮴 방출에 의해 측정되었다 (도 14 및 표 14). m8H9는 뮤린 IgG1 이소형에 대해 예상되는 ADCC 기능을 인간 PBMC 사용시에 갖지 않았다. ch8H9 및 hu8H9 H3L3 구축물은 강력한 ADCC를 보였다 (각각 1.4 및 0.7 ㎍/mL EC50). ch8H9 6.1 (0.1 ㎍/mL EC50)은 ch8H9에 비해 세포독성이 14배 향상되었고, hu8H9 3.1 (0.3 ㎍/mL EC50)은 hu8H9 H3L3에 비해 살해가 2배 증가하였고 ch8H9에 비해서는 5배 증가되었다.
<표 14>
Figure 112017028155957-pct00091
인간 신경모세포종 이종이식편의 생체내 표적화
8H9 항체 구축물 (m8H9 및 ch8H9와 비교한 hu8H9 3.1 및 ch8H9 6.1)의 생체내 생체분포를 마우스 이종이식편을 사용하여 결정하였다. 간단히 설명하면, 모든 항체를 131I로 방사성 표지하고, LAN-1 세포에 대한 이들의 시험관내 면역반응성을 측정하였다 (m8H9:69%, ch8H9:75%, ch8H9 6.1:73%, 및 hu8H9 3.1:54%). 주사 48시간 후에 각각의 항체의 생체내 생체분포를 피하 신경모세포종 LAN-1 이종이식편을 갖는 마우스를 사용하여 분석하였다 (도 15 및 표 15 [Avg: 평균]). 그램당 주사된 투여량 비율 (% ID/gm)에 의해 측정된 종양 흡수는 m8H9의 경우 8.9%, ch8H9의 경우 6.1%, ch8H9 6.1의 경우 6.8%, hu8H9 3.1의 경우 10.6%이었다. 종양 대 정상 조직 비율을 표 16에 나타냈다 (Avg: 평균). 시험된 모든 항체는 대부분의 조직에서 대등한 종양 대 비-종양 비를 나타내었다. hu8H9 3.1에 대해 가장 높은 종양 흡수가 관찰되었고, 이것은 ch8H9보다 통계적으로 더 높았고 (p<0.05), ch8H9보다 더 높은 종양 대 혈액 비 (0.72에 비해 1.26, p<0.05)가 관찰되었다. ch8H9 6.1에 대해 약간 낮은 종양 흡수가 관찰되었지만, 종양 대 혈액 비는 대등하였다.
<표 15>
Figure 112017028155957-pct00092
<표 16>
Figure 112017028155957-pct00093
에피토프 결정
분자 도킹 (docking) 기술을 사용하여 8H9의 결합을 담당하는 B7H3 상의 정확한 분자 에피토프를 예측하였다. 구체적으로, 인간 2Ig-B7H3의 상동성 모델을 생성한 후, 도킹 실험을 ZDOCK을 사용하여 ch8H9 Fab의 결정 구조로 수행하였다. 도 16은 도킹 계산으로부터 도출된 예측된 모델을 보여준다. 상기 모델은 8H9가 2Ig-B7H3의 V-도메인 내의 FG 루프의 IRDF 서열 (잔기 126-129, 서열식별번호: 32)에 특이적으로 결합함을 보여준다. 4Ig-B7H3에서, 이 서열은 두 번 존재한다 (V1 도메인의 잔기 126-129 및 V2 도메인의 잔기 344-347). 도킹된 복합체의 2Ig-B7H3 상호작용 잔기 각각에 대한 예측된 상호작용 에너지를 하기 표 17에 제시한다. Arg127 및 Asp128은 가장 높은 상호작용 에너지 (각각 -55.2 및 -46.3 kcal/mol)를 갖는다.
<표 17>
Figure 112017028155957-pct00094
분자 모델링에 기초하여, R127A 및 D128A 점 돌연변이를 2개의 별개의 2Ig-B7H3-mFc 구축물에서 만들고 재조합 방식으로 발현시켰다. 도 17은 3개의 시판 중인 항-B7H3 MAb (써모 사이언티픽 피어스 (Thermo Scientific Pierce, 미국 일리노이주 록포드)의 MIH42 및 6A1, 및 R&D 시스템즈 (R&D Systems, 미국 미네소타주 미네아폴리스)의 클론 185504)의 결합 동역학과 함께, 2Ig-B7H3의 R127A 및 D128A 돌연변이체에 대한 ch8H9 (서열식별번호: 9, 서열식별번호: 1)의 결합 동역학을 보여준다. 돌연변이체 R127A 및 D128A의 상대적인 결합뿐만 아니라 WT 2Ig-B7H3-Fc에 대한 결합의 최대 RU가 표 18에 제시되어 있다. ch8H9는 야생형 구축물과 비교하여 R127A 돌연변이에 대한 거의 완전한 결합의 상실 (99.9%) 및 D128A 돌연변이에 대한 결합의 부분적 상실 (40%)을 나타낸다. 3개의 다른 항-B7H3 항체 중 어느 것도 돌연변이체 B7H3 단백질에 대한 결합의 실질적인 상실을 보였다 (즉, 항체 MIH42 및 클론 185504는 R127A 및 D128A 돌연변이체 둘 모두에 대한 그 각각의 결합의 ~70-75%를 보유하고; 항체 6A1은 WT 2Ig-B7H3에 대한 약한 전체적인 결합, 및 R127A에 대한 동일한 결합 또는 D128A 돌연변이체에 대한 상승된 결합을 나타내었다). ch8H9 (서열식별번호: 9, 서열식별번호: 1)와 유사하게, hu8H9 3.1 (서열식별번호: 13, 서열식별번호: 5) 및 5.1 (서열식별번호: 15, 서열식별번호: 7) 변이체는 또한 결합의 전체적인 및 부분적인 상실을 보였다 (도 18). 이러한 결합 연구는 ch8H9가 B7H3의 IRDF 서열에 특유하게 특이적이라는 것을 입증하였다. 인간화된 8H9 구축물의 SPR에 의한 R127A 및 D128A B7-H3 돌연변이체에 대한 결합도 상실되었다.
<표 18>
Figure 112017028155957-pct00095
면역 조절을 위한 MAb 8H9의 사용
B7H3의 IgV 도메인의 FG 루프는 마우스에서 단백질의 T-세포 억제 기능에 중요한 역할을 하는 것으로 이전에 밝혀졌다. 마우스 B7H3은 2Ig-B7H3 형태로만 존재하고, 여기서 억제 기능을 담당하는 핵심 서열은 IQDF (잔기 126-129, 서열식별번호: 86)이다. 본 발명자들은 m8H9 및 클론 3.1 및 5.1 모두가 인간 B7H3 (서열식별번호: 32)에서 상동성 IRDF 서열 (잔기 126-129)에, 특히 Arg127에 결합한다는 것을 입증하였다. 추가로, m8H9 및 그의 인간화된 형태는 Gln127을 포함하는 뮤린 B7H3에 결합하지 않는다. 시험된 다른 항-B7H3 항체와 달리, 오직 8H9만이 B7H3의 FG-루프에 결합하기 위해 사용할 수 있고, 이것은 B7H3의 면역 억제 기능을 차단하기 위해 사용될 수 있다.
도 19는 B7H3-양성 신경모세포종 IMR-32 세포가 T 세포 증식을 억제할 수 있음을 보여주는 데이터를 제시한다. 이 검정에서, IMR-32 세포가 존재할 때 T 세포의 증식이 60% 감소되었다. 키메라 8H9는 T 세포 증식에 대한 상기 억제 효과를 투여량 의존적 방식으로 억제하고, 심지어 종양 세포의 존재 하에서 T 세포의 증식을 향상시킨다 (도 20).
m8H9가 T-세포 기능에 대한 B7H3의 억제 효과를 극복할 수 있는지 또한 시험하였다. 항-Her2 x 항-CD3 이중특이적 항체 (huOKT3 scFv에 융합된 트라스트주맙)를 사용하여, m8H9가 Her2-양성, B7H3-양성 인간 자궁경부 암종 세포 (HeLa)의 T-세포 매개 세포독성을 증강시킬 수 있는지 시험하였다 (도 21). 종양 세포를 8H9로 사전 인큐베이팅할 때, 최대 살해가 58% (전처리 없음)에서 71% (8H9 전처리)로 향상된다는 것이 관찰되었다.
이러한 실험 세트는 m8H9 및 그의 유도체가 면역-조절 요법에 사용될 수 있다는 최초의 증명이다.
방법
상동성 모델링
로제타 (ROSETTA) 항체 모델링 서버 및 디스커버리 스튜디오 (Discovery Studio) 3.0 (액설리스 (Accerlys), 미국 캘리포니아주 샌디에고)을 사용하여 8H9의 가변 영역의 상동성 모델을 생성하였다.
X선 결정학
ch8H9의 Fab 단편은 표준 Fab 제조 키트 (피어스 바이오테크놀로지 (Pierce Biotechnology), 미국 일리노이주 록포드)를 사용하여 파파인 소화에 의해 생성되었다. 정제된 Fab 단편을 20 mM HEPES, pH 6.5에서 10 mg/ml로 농축한 후, 0.2 M 황산리튬 일수화물, 0.1 M BIS-TRIS pH 6.5 및 25% w/v 폴리에틸렌 글리콜 3,350 (햄턴 리써치 (Hampton Research), 미국 캘리포니아주 알리소 비에조)를 함유하는 햄턴 인덱스 (Hampton Index) 시약의 저장소에 대해 16℃에서 증기 확산에 의해 현적법 (hanging drop)으로 결정화시켰다. 소적은 1 μL의 단백질 용액과 1 μL의 저장 용액을 혼합하여 형성되었다. 데이터는 아르곤 어드밴스트 포톤 쏘스 빔라인 (Argonne Advanced Photon Source beamline) 24IDE에서 수집하였다. Fab 구조는 MolRep (CCP4 스위트)를 사용하여 분자 치환에 의해 해결되었다 (Mccoy, A. J., et al., 2007, J. Appl. Crystallogr. 40:658-674). 피닉스 (Phenix) (Adams, P. D. et al., 2010, Acta crystallographica Section D Biological crystallography 66:213-221)를 사용하여 최고의 분자 교체 모델을 개량하고, O로 수동 피팅을 수행하였다 (Bailey, S., 1994, Acta Crystallogr. D 50:760-763). 결정 구조는 2.5 Å에서 분해되었다.
ch8H9 구조의 분자 시뮬레이션
ch8H9의 결정 구조를 CHARMm (하버드 몰레큘라 머캐닉스 (Harvard Molecular mechanics)의 케미스트리 (CHemistry)) 역장 및 돌연변이된 단백질과 야생형 단백질의 폴딩 자유 에너지 간의 차이로부터 계산된 각각의 점 돌연변이의 효과를 사용하여 시뮬레이션하였다. 일반화된 본 근사법 (Born approximation)을 사용하여 용매의 효과를 설명하였고, 모든 정전기 항은 쿨롬 상호작용과 용매화 에너지에 대한 극성 기여도의 합으로 계산되었다. 반 데르 발스 (van der Waals), 정전기, 엔트로피 및 비-극성 항의 가중치 합계가 각각의 점 돌연변이에 대해 계산되었다. 모든 계산은 디스커버리 스튜디오 3.0 ((액설리스, 미국 캘리포니아주 샌디에고)을 사용하여 수행되었다. 전방 및 후방 돌연변이는 차세대 hu8H9의 안정성에 미치는 그의 영향에 대해 시험되었다. 도킹 시뮬레이션은 ZDOCK 소프트웨어 (보스톤 유니버시티 (Boston University, 미국 매사추세츠주 보스톤)로부터 입수가능)를 사용하여 생성되었다. 도킹 시뮬레이션은 ZDOCK (Chen, R. et al., 2003, Proteins 52:80-87)을 사용하여 생성되었고, B7H3의 상동성 모델링은 MODELLER (Sanchez, R., and Sali, A., 1997, Proteins Suppl. 1:50-58)를 사용하여 수행하였다. 정전기 표면 전위는 델파이 (Rocchia, W. et al., 2002, J. Comput. Chem. 23:128-137)를 사용하여 생성되었다.
B7H3 항원의 비오티닐화
인간 B7H3-마우스-Fc (mFc) 융합 단백질에 대한 유전자를 CHO 세포 (젠스크립트 (Genscript), 미국 뉴저지주 피스카타웨이)에서의 발현을 위해 최적화하였다. pBluescript 벡터 (애질런트 테크놀로지스, 인크. (Agilent Technologies, Inc.), 미국 캘리포니아주 산타 클라라)를 사용하여, 유전자를 DG44 CHO 세포 내에 형질감염시키고, 이전에 설명된 바와 같이 발현시켰다 (Cheung et al., 2012 Oncolmmunology 1:477-486). B7H3-mFc 융합 단백질의 비오티닐화는 EZ-Link 술포-NHS-비오틴 및 비오티닐화 키트 (써모 사이언티픽, 미국 매사추세츠주 턱스베리)를 사용하여 제조자의 지시에 따라 수행하였다. 비오티닐화 단백질을 50,000 MWCO 비바스핀 (Vivaspin) 원심분리관 (사르토리우스 스테딤 (Sartorius Stedim), 독일 괴팅겐)를 사용하여 연속적으로 농축하고, 스트렙타비딘 결합 ELISA에서 그의 비오티닐화를 시험하였다.
오류 유발 PCR에 의한 돌연변이 유발
전체 hu8H9의 scFv (V3) 유전자의 오류 유발 PCR은 스트라타젠 (Stratagene) 젠모프(GeneMorph)® II 무작위 돌연변이 유발 키트를 제조업체의 지침에 따라 사용하여 수행하였다. 간단히 설명하면, PCR은 1x 뮤타짐 (Mutazyme) II 반응 완충제, 각각 0.5 μM의 각각의 프라이머 ERRORF (5' TCAGTTTTGGCCCAGGCGGCC 3'; 서열식별번호: 81) 및 ERRORR (5' ACCACTAGTTGGGCCGGCCTG 3' 서열식별번호: 82); 0.2 mM (각각의) dNTP, 1 ng의 DNA 주형, 2 μM 8-옥소-데옥시구아노신 트리포스페이트, 2 μM 2'-데옥시-p-뉴클레오시드-5'-트리포스페이트, 및 2.5 U의 뮤타짐 II DNA 폴리머라제를 함유하는 50 μL 반응액에서 수행하였다. 반응 혼합물을 95℃에서 2분 동안 변성시키고, 95℃에서 1분, 60℃에서 1분, 72℃에서 1분을 35회 반복하고, 마지막으로 72℃에서 10분 동안 연장시켰다. PCR 산물을 1% 아가로스 겔 전기영동으로 정제하고, 1x NEB PCR 반응 혼합물, 1 μM의 프라이머 YDRDF (5' CTTCGCTGTT TTTCAATATT TTCTGTTATT GCTTCAGTTT TGGCCCAGGC GGCC 3'; 서열식별번호: 83) 및 YDRDR (5' GAGCCGCCAC CCTCAGAACC GCCACCCTCA GAGCCACCAC TAGTTGGGCC GGCCTG 3'; 서열식별번호: 84), 120 ng의 오류 유발 PCR 산물 및 2.5 U의 DNA 폴리머라제를 함유하는 4개의 100 μL PCR 반응액에서 각각 증폭하였다. 상기 반응은 30 사이클을 사용하고 상기한 바와 달리 열 순환되었다. 반응 산물을 1% 아가로스 겔 전기 영동에 의해 정제하고, 물로 한외여과하여 농축하였다.
효모 라이브러리로부터 hu8H9 돌연변이체의 선택
친화도 성숙을 위한 효모 라이브러리의 구축 및 성장은 이전에 발표된 프로토콜 (Zhao et al., 2011 Mol Cancer Ther 10:1677-1685)로부터 변형시켰다. 형광 세포 분류 (FACS) 전에, 효모 라이브러리 (1x109 세포)는 1시간 동안 RT에서 마우스 3F8 IgG와 함께 사전 인큐베이팅하고, PBSA 완충제 (PBS 중 0.1% BSA) 내에서 RT에서 1시간 동안 10 ㎍의 B7H3-mFc-접합된 자성 비드에 대해 순차적으로 패닝한 후, 자기 스탠드를 사용하여 분리하였다. 분리된 비드를 PBSA 완충제로 3회 세척하고, 10 ㎖의 SDCAA 배지에 재현탁시키고, 250 rpm에서 30℃ 진탕기에서 밤새 성장시켰다. 자성 비드로부터 회수된 효모 세포를 SG/RCAA 배지에서 250 rpm으로 진탕하면서 20℃에서 18시간 동안 인큐베이팅하였다. 제1 FACS 선택을 위해, 약 1x108개의 효모 세포를 펠렛화하고, PBSA 완충제로 2회 세척하고, 10 ㎍/ml의 비오티닐화 B7H3-mFc 및 마우스 항-c-myc 항체 (잭슨 리써치 래보래토리스 (Jackson Research Laboratories), 미국 메인주 바 하버)를 함유하는 1 ml PBSA 완충제 내에 재현탁하였다. 인큐베이팅 후, 효모 세포를 3회 세척한 후, 1 ml PBSA 완충제에 재현탁하였다. R-피코에리트린 접합된 스트렙타비딘 (비디 바이오사이언스 (BD Bioscience)) 및 FITC 접합된 염소 항-마우스 (Fab)2 (인비트로겐 (Invitrogen), 미국 캘리포니아주 칼스바드)의 1:100 희석액 둘 모두를 분류하고자 하는 효모 세포에 첨가한 후, 세포를 4℃에서 30분 동안 인큐베이팅하고, PBSA 완충제로 3회 세척한 후, 분류를 위해 PBSA 완충제에 재현탁하였다. 분류 게이트는 보다 높은 항원 결합 신호를 선택하도록 결정되었다. 수집된 세포를 30℃에서 SDCAA 배지에서 밤새 성장시킨 후, 다음 라운드의 분류를 위해 SG/RCAA에서 인큐베이팅하였다. 다음 두 가지 선택을 위해, 약 1-2x107개의 효모 세포를 각각 3 ㎍/ml 및 1 ㎍/ml 비오티닐화 B7H3으로 염색하기 위해 사용하였다. 효모 플라스미드는 제조사의 지시에 따라 자이모프렙 (Zymoprep) 효모 플라스미드 미니프렙 (Plasmid Mimiprep) II 키트 (자이모 리써치 (Zymo Research), 미국 캘리포니아주 어빈)를 사용하여 단리하고, 제2 라이브러리 구축을 위한 주형으로 사용하였다. 제2 라이브러리의 구축 및 선택은 제1 효모 라이브러리에 설명한 바와 같이 수행되었다. 그러나, 제2 효모 라이브러리에 대해서는 각각 1, 0.2, 0.05 및 0.01 ㎍/ml의 비오티닐화 B7H3-mFc를 사용한 4회의 FACS 선택을 수행하였다. 마지막 선택으로부터 얻은 세포를 SDCAA 플레이트 상에 산포하였다. 모노클로날 효모 세포를 특성화하고, 향상된 친화도를 갖는 scFv를 코딩하는 단리된 플라스미드를 서열결정하였다.
가용성 scFv의 발현 및 정제
이전에 설명된 바와 같이 (Zhao et al., 2011, Mol. Cancer Ther. 10:1677-1685), ScFv를 발현시키고 정제하였다. HB2151 박테리아 세포를 scFv 서열을 함유하는 pComb3x 플라스미드로 형질전환시켰다. 신선한 단일 콜로니를 100 ㎍/ml 암피실린 및 0.2% 글루코스를 함유하는 2YT 배지에 접종하였다. 배양은 이소프로필-L-티오-h-D-갈락토피라노시드 (최종 농도 0.5 mM)에 의해 유도되었다. 30℃에서 밤새 성장시킨 후, 박테리아를 5,000xg에서 15분 동안 원심분리하였다. 가용성 scFv는 박테리아를 30℃에서 30분 동안 인큐베이팅함으로써 박테리아 주변세포질에서 방출되었다. 맑은 상청액을 회수하고, Ni-NTA 컬럼에서 정제하였다. 모든 재조합 scFv는 FLAG 및 His 태그를 가졌다.
IgG 구축물의 발현 및 정제
8H9의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자 구축물 (pBluescript 벡터 (애질런트 테크놀로지스, 인크., 미국 캘리포니아주 산타 클라라)에 기초한)을 CHO-S 세포에 형질감염시키고, G418 (인비트로겐, 미국 캘리포니아주 칼스바드)로 선택하였다. 항체 생산 세포주를 OptiCHO 무혈청 배지 (인비트로겐, 미국 캘리포니아주 칼스바드)에서 배양하고, 상청액을 수거하였다. 단백질 A-친화도 컬럼을 pH 8.2에서 25 mM 시트르산나트륨 완충제/0.15 M NaCl로 예비 평형화하였다. 결합된 8H9를 0.1 M 시트르산/시트르산나트륨 완충제 (pH 3.9)로 용리하고, pH 8.2에서 25 mM 시트르산나트륨 및 150 mM NaCl에서 투석시켰다.
ELISA
B7H3-mFc (100 ng/웰) 또는 2IgB7H3 (R&D, 미국 미네소타주 미네아폴리스) (25 ng/웰)을 PBS 내의 폴리비닐 미량역가 플레이트 상에 밤새 코팅하였다. 그 후, 플레이트를 실온에서 1시간 동안 웰당 150 ㎕로 PBS 내의 0.5% BSA로 차단하였다. 항체를 0.5% BSA 내에서 연속 희석하여 3중으로 첨가하였다. 실온에서 1시간 동안 인큐베이팅하고 PBS로 세척한 후, HRP-마우스 항-인간 Fc 항체, HRP-스트렙타비딘 또는 HRP-마우스 항-Flag 항체를 첨가하였다. 실온에서 1시간 동안 인큐베이팅하고 추가로 세척한 후, 발색시키고, 490 nm에서 ELISA 플레이트 판독기를 사용하여 정량하였다.
유동 세포 계측 분석
그 표면 상에 scFv를 디스플레이하는 효모 세포의 염색을 위해, 세포를 PBSA 내의 상이한 농도 (0.1 및 1 ㎍/ml)의 B7H3-mFc 항원과 함께 빙상에서 30분 동안 인큐베이팅한 후, 2차 항체로 APC-접합된 항-마우스 항체 (비디 바이오사이언스, 미국 캘리포니아주 산호세)와 함께 인큐베이팅하였다. 종양 세포의 염색을 위해, 세포를 배양 배지에서 수거하고, 1 ㎍/ml의 정제된 scFv와 함께 인큐베이팅한 후, 마우스 항-his 항체 및 PE-항-마우스 항체와 함께 순차적으로 인큐베이팅하였다. 유동 세포 계측법은 FACScalibur™ (비디 바이오사이언스, 미국 캘리포니아주 산호세)를 사용하여 수행되었다.
표면 플라즈몬 공명에 의한 친화도 결정
간단히 설명하면, B7H3 항원 (2Ig-B7H3, 4Ig-B7H3, 2Ig-B7H3-mFc, 4Ig-B7H3-mFc)은 소수성 상호작용을 통해 CM5 센서 칩 상에 직접 고정화되었다. 참조 표면은 비특이적 결합 및 굴절률 변화를 위해 설정되었다. 상호작용의 동역학 분석을 위해, 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA 및 0.05% 계면활성제 P-20 (pH 7.4)을 포함하는 이동 완충제를 사용하여 다양한 농도의 scFv를 30 μL/분의 유속으로 주입하였다. 회합 및 해리 단계 데이터는 BIAevaluation 3.2를 사용하여 1:1 모델에 동시에 피팅되었다. 모든 실험은 25℃에서 수행되었다. 에피토프 결정을 위해, WT 2Ig-B7H3, R127A 및 D128A를 칩 상에 고정하고, 400 nM의 ch8H9, MIH42, 6A1 및 클론 185504를 상기한 바와 같이 주입하였다 (접촉 시간 180s, 해리 시간 600s).
T 세포 증식 분석
T 세포를 Pan T 세포 단리 키트 (밀테니이 바이오텍 (Miltenyi Biotec), 미국 매사추세츠주 캠브리지)를 사용하여 인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)로부터 정제하였다. 신경모세포종 IMR-32 세포를 80 Gy에서 조사하고, RPMI (깁코 (GIBCO))에 1십만/ml로 재현탁하였다. 상이한 농도의 ch8H9 (50 μl)와 함께 1x104 IMR-32 세포/웰 (100 μl)를 96웰 세포 배양 플레이트에 첨가하고, 실온에서 2시간 동안 배양하였다. 이어서, 2x105/웰의 정제된 T 세포를 1.5 μl CD3/CD28 다이나비드 (인비트로겐, 미국 캘리포니아주 칼스바드)와 혼합하고, IMR-32 세포와 함께 웰에 첨가하였다. 세포를 FBS 및 30 U/ml IL-2가 보충된 RPMI에서 배양하고 37℃에서 6일간 유지하였다. T 세포 증식을 제조사의 프로토콜에 따라 세포 계수 키트-8 (CCK-8) 검정 (도진도 몰 (Dojindo Mol), 미국 메릴랜드주 록빌)을 사용하여 정량하였다.
T 세포 매개된 세포독성 검정
HER2(+) 및 B7H3(+) 인간 자궁경부 암종 세포 (HeLa)를 RPMI + 10% FBS, 2% L-글루타민 및 1% P/S와 함께 37℃에서 배양하였다. 세포를 트립신/EDTA로 수거하고, 1x106 세포를 37℃에서 60분 동안 100 mg/mL의 B7H3 특이성 마우스 항체 8H9를 포함하거나 포함하지 않은 상태로 100 mCi의 51Cr과 함께 인큐베이팅하였다. 인큐베이팅 후, 세포를 2회 세척하고, 5000개의 표적 세포를 T-세포와 함께 96-웰 둥근 바닥 플레이트의 각각의 웰에 1:10의 비율로 각각 플레이팅하였다. 이어서, 다른 농도 (1 내지 1x10-6 1mg/mL)의 항-HER2 x 항-CD3 이중특이적 항체 (huOKT3 scFv에 융합된 트라스투주맙) 및 10 mg/mL의 뮤린 8H9 항체를 첨가하였다 (후자는 8H9 항체와 함께 사전 인큐베이팅된 세포에만 첨가됨). 4시간 인큐베이팅 후 상청액을 수거하고, 이들의 방사능을 섬광 계수기로 측정하였다. 종양 세포의 특이적 용해는 다음 식을 기초로 하여 계산하였다: % 특이적 용해 = [(샘플 cpm - 자발적인 cpm)/(최대 cpm - 자발적인 cpm)] x 100%.
종양 세포 배양 및 항체-의존성 세포 매개 세포독성 ( ADCC ) 검정
신경모세포종 LAN-1 종양 세포는 로스 엔젤레스 아동 병원 (Children's Hospital of Los Angeles)으로부터 얻었다. 세포를 5% CO2 가습 인큐베이터에서 37℃에서 10% 태아 소 혈청 (FBS, 라이프 테크놀로지스 (Life Technologies), 미국 뉴욕주 그랜드 아일랜드)이 보충된 RPMI 1640 (셀그로 (Cellgro), 미국 버니지아주 매나서스)에서 배양하였다. ADCC 검정은 이전에 설명된 바와 같이 수행되었다 (Cheung, N.K. et al., 2012, Oncoimmunology 1:477-48652). 간단히 설명하면, LAN-1 신경모세포종 종양 세포를 51Cr로 방사선 표지하고, 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 25:1의 이펙터 대 표적 비로 이펙터로서 사용하였다. 세포독성은 51Cr 방출에 의해 측정되었다.
이종이식된 마우스에서 항체의 생체분포
암컷 무흉선 누드 마우스 (6-8주령)를 할란 스프라그 돌리, 인크. (Harlan Sprague Dawley, Inc.)로부터 구입하였다. 모든 절차는 메모리얼 슬로안-케터링 암 센터 (Memorial Sloan-Kettering Cancer Center) 동물 실험 윤리 위원회 ( Institutional Animal Care and Use Committee) 및 연구에서 동물의 적절하고 인도적인 사용을 위한 기관 지침에 의해 승인된 프로토콜에 따라 수행되었다. 종양 세포 (LAN-1)를 수거하고, 마우스의 옆구리에 피하 (s.c.) 이식하였다 (5x106 세포/마우스). 종양 부피가 약 200 mm3일 때, 무작위 분류된 마우스의 군 (n=4-5/군, 하나의 방사성 표지된 항체 제제/군)에게 50 μCi의 131I 방사성 아이오딘 항체 (IODO-GEN 방법 ([Salacinski, P.R. et al., 1981, Analytical biochemistry 117:136-146]; [Harlow, E. and D. Lane, 1999, Using Antibodies: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.])에 따라 제조된 후, 예비 충전된 세파덱스 G-25 컬럼을 사용한 PBS + 1% BSA 내로의 겔-여과 정제를 수행함; 특이적 활성: 1.67-3.81 mCi/mg; 13-30 ㎍의 항체/용량)를 정맥 내로 주사하였다. 새로 수거된 LAN-1을 사용하여 시험관내 세포 결합 검정을 사용하여 각각의 추적자의 면역반응성을 평가하였다. 마우스를 주입 후 (p.i.) 48시간에 희생시키고, 장기를 제거하고, 감마 계수기 (퍼킨 엘머 월락 위자드 (Perkin Elmer Wallac Wizard) 3)에서 계수하였다. 이 장기는 피부, 간, 비장, 신장, 부신, 위, 소장, 대장, 대퇴골, 근육, 종양, 심장, 폐, 척추 및 뇌를 포함한다. 계수 속도는 배경이었고, 감쇠 (decay)가 보정되었고, 동위원소에 특이적인 시스템 보정 계수를 사용하여 활성으로 전환되고, 투여된 활동에 대해 표준화되었고, 그램당 주사된 투여량 백분율 (%ID/g)로 표현하였다. % ID/gm의 종양 대 비-종양 비도 계산되었다.
구획 방사선 면역요법에서 8H9의 임상적 사용
중추신경계 (CNS)로의 전이
뇌 전이는 대부분의 고형 종양에 대한 암 치료의 파괴적인 합병증이자 주요한 장애물이고; 그에 대한 생물학은 잘 이해되지 않은 상태이고, 관리가 적절하지 않으며, 치료법은 드물다 (Maher EA et al., Cancer Res 69:6015-20, 2009). 혈액 또는 두뇌 전이로부터의 종양 세포는 CSF를 침범하여, 뇌실로부터 척수관으로의 CSF의 일정한 유동에 의해 신경축 전체에 걸쳐 및 연수막 (LM) 암종증으로도 불리는 병태인 피질 궁융부 (cortical convexity) 상에서 진행될 수 있다 ([Grossman, S.A. et al., 1999, Oncology 13:144-152]; [Bruno, M.K. et al., 2005, Cancer Treat. Res. 125:31-52]; [Gleissner, B. et al., 2006, Lancet Neurol. 5:443-52]).
LM 암종증은 전신 전이가 진행된 환자에서 가장 흔하다 ([Wasserstrom, W.R. et al., 1982, Cancer 49:759-72]; [Balm, M. et al., 1996, Arch. Neurol. 53:626-32]; [Chamberlain, M.C. et al., 2005, J. Clin. Oncol. 23:3605-13]). 동시의 실질 뇌 전이는 드물지 않다 (환자의 11%-31%) ([Wasserstrom, W.R. et al., 1982, Cancer 49:759-72]; [Freilich, R.J et al., 1995, Annals of Neurology 38:51-57]; [Posner, J.B., Neurologic Cancer Complications, Comtemporary Neurology Series, Philadelphia, F.A. Davis Company, 1995]). LM 전이가 척수강내 화학요법에 의해 잘 조절되는 백혈병과 달리 (Littman, P. et al., 1987, Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 13:1443-9), 고형 종양에 대한 예후는 화학요법 및 방사선 요법의 사용에도 불구하고 극히 신중하게 접근해야 한다 ([Wasserstrom, W.R. et al., 1982, Cancer 49:759-72]; [Grossman, S.A. et al., 1991, Neurol. Clin. 9:843-56]).
악성 복수
악성 복수 (복막 암종증)는 광범위한 복부 및 복강외 종양을 수반한다. 림프관 폐색 및 혈관 투과성은 그의 발병의 주요 인자이다 ([Holm-Nielsen, P., 1953, Acta Pathol. Microbiol. Scand. 33:10-21]; [Sangisetty, S.L. et al., 2012, World J. Gastrointest. Surg. 4:87-95]). 악성 복수는 단백질 상실, 전해질 불균형, 확산 부종 및 복부 패혈증을 초래하기 때문에 환자의 삶의 질을 크게 떨어뜨린다. 복부 종양 중에서, 난소, 자궁내막, 결직장, 위, 췌장 및 복막 악성 종양은 악성 복수와 관련이 있다. 일부 연구에서, 위장암을 가진 모든 환자의 15%까지가 그 질병의 일부 단계에서 악성 복수를 발생시킨다 ([Smith, E.M. et al., 2003, Clin. Oncol. (R. Coll. Radiol.) 15:59-72]; [Koppe, M.J. et al., 2006, Ann. Surg., 243:212-22]). 상피성 난소암이 모든 여성 생식기 암의 25% (미국에서 22,240건의 새로운 사례, 연간 14,030건의 사망)를 차지하는 반면, 이들 환자의 3분의 2는 악성 복수를 발생시킨다 (Eskander, R.N. et al., 2012, Int. J. Womens Health 4:395-404).
또한, 복강외 종양, 예를 들어 유방암, 폐암 및 림프종은 악성 복수를 유발하는 것으로 알려져 있다. 악성 복수를 가진 모든 환자의 20%까지에서, 원발성 종양 부위는 알려지지 않았다 (Saif, M.W. et al., 2009, Ann. Saudi Med. 29:369-77).
복막 암종증의 다기관 평가 (EVOCAPE) 연구에 따르면, 악성 복수는 수개월의 중앙 생존값을 야기하는 불리한 예후 인자이다 (Sadeghi, B. et al., 2000, Cancer 88:358-63). 치유 요법은 존재하지 않으며, 완화 치료는 부적절하고, 종종 고통스러운 사망으로 이어진다 ([Sangisetty, S.L. et al., 2012, World J. Gastrointest. Surg. 4:87-95]; [Sugarbaker, P.H. et al., 2006, Ann. Surg. Oncol.13:635-44]).
구획 방사선 면역요법 ( cRIT )에 대한 이전의 경험
악성 복수 및 LM 암종증에 대한 한 방법은 종양에 방사선을 표적화하기 위해 방사성 표지된 항체가 구획 (복강 또는 CSF 공간)에 직접 주입되는 구획 방사선 면역요법 (cRIT)이다. 항체 90Y-CC49 (마우스 항-TAG-72, ≤24 mCi/m2) (Alvarez, R.D. et al., 2002, Clin. Cancer Res. 8:2806-11) 및 항체 90Y-HMFG1 (마우스 항-MUC1, 666 MBq/m2) (Verheijen, R.H. et al., 2006, J. Clin. Oncol. 24:571-8)의 복강내 투여는 재발성 난소암 환자에서 관용되었지만, 연구는 생존의 증거는 보이지 않았다. 항체 131I-81C6 (항-테나신 MAb)을 사용하여 LM 암종증의 치료 및 악성 뇌종양의 종양내 치료를 위한 척수강내 및 심실내 투여는 환자의 생존을 연장시켰다 ([Reardon et al., 2006, J. Clin. Oncol. 24:115-22]; [Reardon, D.A. et al., 2008, Neuro. Oncol. 10:182-9]). 항체 At-81C6의 사용은 악성 신경교종에서 최소 잔존 질환에 대한 α-입자 요법의 한 예이다 (Zalutsky, M.R. et al., 2008, J. Nucl. Med. 49:30-8).
CSF 구획은 매우 유리한 치료 지수를 달성하기 위한 cRIT에 이상적으로 적합하다.
CSF (건초낭) 공간은 cRIT에 적합한 독특한 특징을 갖는다: (1) 혈액 뇌 장벽 (BBB)이 MAb 재순환을 방지하고; (2) 혈액과 비교하여 CSF는 백혈구가 적기 때문에 FcR(N)이 없고, ~1000배 더 적은 IgG를 갖고 (Davson, H., Segal MB: Physiology of the CSF and blood-brain barriers. Boca Raton, FL, CRC Press, 1996, pp 489-523), (3) CSF 구획 내로 주입된 MAb는 Fc 수용체에 의한 격리 또는 효소에 의한 분해에 의해 숙주 면역으로부터 더 잘 보호되고; (4) CSF의 200배 더 낮은 단백질 함량 (혈청 대비)은 의도된 표적에 대한 그의 MAb 결합을 촉진하고; (5) CSF 부피가 작기 때문에 (140 ml), MAb는 매우 높은 구획 농도를 달성하고; (6) CSF 구획은 7-8시간마다 새롭게 되어 자체의 고유한 (built-in) 세척 단계를 제공하고, (7) CSF 유동은 약리학적으로 감소되어, 더 긴 MAb 반응 시간을 허용하고; (8) 해부학적 장벽의 명백한 부재는 특히 종양 또는 수술에 의한 뇌척수막의 손상이 있는 경우, CSF와 뇌의 세포외 공간 사이의 MAb의 이동을 촉진한다 ([Davson H, Segal MB: Physiology of the CSF and blood-brain barriers. Boca Raton, FL, CRC Press, 1996, pp 489-523]; [Spector, R., Mock D.M., 1988, Neurochem. Res. 13:213-9]).
CNS로의 신경모세포종 전이
CNS로의 신경모세포종 전이는 한때 드문 것으로 간주되었다. 지난 10년에 걸쳐 메모리얼 슬로안-케터링 암 센터에서 CNS로 전이된 신경모세포종 환자 61명에 대한 후향적 분석 결과, CNS NB (두개골의 뼈 질환에 대한 증거가 없음) 환자 34명은 MYCN 증폭 질환을 가졌고, 9명은 초기 진단시에 요추 천자를 받았고, 이 두 가지는 모두 알려진 위험 인자이다 (Kramer, K. et al., 2001, Cancer 91:1510-9). 2명의 환자는 초기 NB 검진에서 CNS 질환을 앓았으며, 두통 및 높은 두개내압 둘 모두가 션트 (shunt)를 필요로 하였다. 57명의 환자는 진단시로부터 5-61개월 (중앙값 21.7)에 CNS NB를 보였고, MYCN 증폭 코호트에서 중앙값은 18.5개월이었다. 40명의 환자 (68%)는 고립성 CNS 재발을 보였고, 이 중 26명 (44%)은 단일 실질 병소를 보였다. 연수막 전이는 19명 (32%)의 환자에서 발생하였고, 나머지는 다병소 질환이 있었다. NB의 자연 이력 (natural history)이 바뀌면서 고립성 CNS 재발은 치료가 어려워졌고, 그의 전신 질환이 "근절"된 MSKCC 환자의 20% 초과의 환자가 현재 고통받고 있다 (Cheung, N.K. et al., 2012, Clin. J. Oncol., 30:3264-70). 외과적 절제술, 화학요법 및 방사선 치료를 포함한 통상적인 치료 방법은 환자 결과를 개선하지 못했다 ([Caussa, L. et al., 2010, Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 79(1):214-9]; [Croog, V.J. et al., 2010, Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 78(3):849-54).
오마야 ( Ommaya ) 내 131 I- 8H9를 사용한 I/ II상 연구에서 중추신경계로의 전이 암의 cRIT
척수강내 131I-모노클로날 항체의 인간에 대한 최초 사용은 유리한 독성 프로파일 및 환자 결과를 갖는 I상 임상 시험에서 성공적으로 시험되었다 (Kramer, K. et al., 2007, J. Clin. Oncol. 25:5465-70). 이 플랫폼을 사용하여, 131I-8H9를 I상/II상 연구에서 시험하였다. 환자들은 오마야 저장기 (Ommaya reservoir)를 통해 주입된 124I-8H9를 투여받은 후, 2 mCi의 131I-8H9 또는 PET (양전자 방출 단층 촬영)를 받은 후 SPECT (단일 광자 방출 단층 촬영)로 연구하였다. 순차적 CSF 및 혈액 샘플을 선량 측정 계산을 위해 48시간에 걸쳐 채취하였다. SPECT 또는 PET 스캔은 약 4, 24 및 48시간에 얻었다. MR 뇌 및 척수뿐만 아니라 CSF 세포검사는 주사 전 및 주사 4주 후에 얻었다. 131I-8H9의 2차 주사는 환자가 진행성 질환을 나타내지 않는 한 시행되었다. 급성 부작용은 1등급 또는 2등급의 발열, 두통 또는 구토, 및 가끔의 일시적인 3등급 ALT 상승을 포함한다. CSF에 대한 계산된 평균 방사선량은 36.3 (범위 12.8-106) cGy/mCi이었고; 평균 혈액 선량은 2.5 cGy/mCi이었다. 124I-8H9/PET는 CSF 공간 내 약물 분포의 고해상도 영상을 제공하고, 131I-8H9 요법에 의해 전달된 예상 선량과 밀접하게 관련되었다. LM 질환의 방사선 반응이 관찰되었고; 급성 부작용은 제한적이었다. 오마야내 131I-8H9는 상대적으로 안전한 것으로 보이고, 유리한 치료 비율을 갖고, 골수 독성외에 MTD에는 아직 도달하지 않았다 (투여량당 80 mCi).
CNS 신경모세포종 환자에 대한 생존 연장 ([Kramer K et al., J Neurooncol 97:409-18, 2010]; [Kramer K et al., Advances in Neuroblastoma Research A -0241, 2014)
메모리얼 슬로안 케터링 암 센터의 환자에게 131I-8H9 (n=37) 및 131I-3F8 (n=5)를 사용한 cRIT, 및 3F8 + GMCSF (과립구 대식세포 콜로니-자극 인자) (Gp1)를 사용한 전신 면역요법을 포함하는 테모졸라미드/이리노테칸 기반 CNS 구제 요법을 시행하였다. 비-요법 치료는 다른 요법 +/- cRIT (Gp2, 모두 131I-8H9)를 사용하였다. 질환 평가는 순차적인 MR 뇌/척추, MIBG, CT 및 골수를 포함하였다. CNS NB 환자 83명 중, cRIT는 56명 (67%), 구제 요법 (Gp1) 후 42명 (51%), 다중 실질 종괴 +/- 연수막 질환이 있는 33%에서 가능하였다. Gp1에서, 26/42명 (62%)의 환자가 생존하고, 연수막 질환 또는 다중 실질 종괴를 갖는 5/14명 (35%)을 포함하여 평균 총 생존율 (OS)은 82.6개월이고, 3/42명 (7%)의 사망은 비-NB 합병증으로 인한 것이었다. Gp2 환자의 OS는 15% (평균 21개월)이었다. Gp2 환자 중 유일한 장기 생존자는 cRIT (평균 OS 42.8개월)를 받은 7명을 포함하였다. 전체적으로, CNS 단독 (n=12, 25%), 전신 단독 (n=14, 30%), CNS 및 전신 (n=16, 34%) 또는 독성 (n=5, 11%)과 관련된 NB로 총 47명의 환자 (56%)가 사망하였다. 치료와 관련된 독성에는 CNS 출혈 (1) 및 화학요법 동안 폐 기능부전 (1)이 포함되었다. 장기 생존자의 사망에는 감염 (1), 폐 섬유증 (1), AML (1)이 포함되었다. 방사선 괴사는 드물었다 (Kramer, K. et al., 2014, Advances in Neuroblastoma Research A-0246). 이것은 CNS에서 그의 첫 재발시 cRIT로 치료받은 환자의 생존율의 유의한 개선이었다. cRIT 요법은 그의 집중적인 세포독성 요법의 병력에도 불구하고 젊은 환자들에 의해 내약성이 양호하였다. 이것은 예상보다 양호한 삶의 질로 생존율을 높일 수 있을 가능성을 갖는다.
131 I- 8H9를 사용한 복강내 (IP) cRIT ( Modak , MJ et al., ASCO Annual Meeting, J Clin Oncol 2013)
결합조직 형성 작은 원형 세포 종양 (DSRCT) 및 복막을 수반하는 다른 고형 종양 환자에 대한 131I-8H9를 사용한 복강내 (IP) cRIT의 I상 연구는 소아 및 젊은 성인에서 거의 완료되었다 (clinicaltrials.gov NCT01099644). DSRCT는 대개 복막으로 인해 발생하는 청소년 및 젊은 성인의 희귀 육종으로, 침습적인 다유형 치료에도 불구하고 80% 초과의 환자에서 치명적이다. 재발은 종종 다발성 복막 이식 (multifocal peritoneal implant)으로 나타나기 때문에, IP 표적화에 특유하게 적합하다. IP cRIT는 장기간의 체류 시간 및 순환계로의 느린/불완전한 전달에 의해 기관 독성을 최소화하면서 IP 질환을 선택적으로 표적화할 수 있다. 이 연구에서 환자 3-6명의 코호트는 단일 IP 주사로 30 mCi/m2으로부터 60 mCi/m2로 상승된 선량으로 131I-8H9로 치료되었다. 2 mCi 124I-8H9의 추적자 선량은 131I-8H9 이전에 IP로 적용하여 PET 영상 및 생체분포 데이터를 획득하였다. 약동학 (PK)은 순차적 채혈을 사용하여 연구되었다. 집중적인 선행 치료를 받은 환자 15명 (그 중 13명은 DSRCT를 가졌고, 2명은 횡문근 육종을 보유하였다)에게 30, 40, 50 mCi/m2 131I-8H9 (각각의 선량 수준에서 3명) 또는 60 mCi/m2 (n=6)을 적용하였다. 용량 제한 독성은 보이지 않았다. 3개의 별개의 일시적인 자기제한적, 가능하게는 요법 관련 3등급 독성인 호중구 감소증, 간 트랜스아미나제 상승 및 혈소판 감소증이 3명의 환자에서 각각 나타났다. 조혈 줄기 세포 구조가 필요한 환자는 없었다. 혈액 반감기는 32.5±11.5시간 (n=12)이었고, 평균 복막 체류 시간은 14.6시간 (n=3)이었다. 혈액 샘플링에 근거한 혈액에 대한 평균 흡수 선량은 0.56±0.21 rad/mCi (n=14)이었다. 신장, 간, 폐 및 비장에 대한 평균 흡수 선량 (rad/mCi)은 각각 1.72, 1.92, 0.64 및 1.03이었다 (n=3). 탈할로겐화는 유의하지 않았다: >80%의 아이오딘이 혈액 내에 단백질 결합 상태로 유지되었다 (n=10). 평가할 수 있는 질환없이 치료된 6/7명의 DSRCT 환자는 131I-8H9 11.1개월 후의 중앙값에서 완화된 상태로 유지되었다. IP 131I-8H9를 사용한 cRIT는 안전하였고, 124I-8H9는 유용한 PK 및 선량 측정 데이터를 제공하였다. 최대 허용 선량에 도달하지 않았기 때문에, 환자에 대한 선량은 치료를 위해 90 mCi/m2까지 확대되었다.
이전에 외부 광선 방사선 요법으로 치료된 비-진행성 미만성 뇌교 신경교종 환자에 대한 124 I-8H9 전달 증진 전달 (CED) (Clinicaltrials.gov NCT01502917)
아동에서의 미만성 뇌교 신경교종 (DPG)은 진단으로부터 단지 8-10개월의 중앙 수명 예상값을 갖는 균일하게 치명적인 병태이다 ([Dunkel, I.J. et al., 1998, J. Neurooncol. 37:67-73]; [Kaplan, A.M et al., 1996, Pediatr. Neurosurg. 24:185-92]). 과다 불할 방사선 요법 및 고용량 화학 요법을 포함한 혁신적인 임상 시험에도 불구하고, DPG 환자의 생존율은 변하지 않았다. 간질 주입 (interstitial infusion)으로도 언급되는 CED는 균일한 주입액 분산 및 분배 부피를 향상시키기 위해 압력-의존성 구배에 의존하는 국소 약물 전달 방식이다 (Laske, D.W. et al., 1997, J. Neurosurg., 87:586-94]; [Morrison, P.F. et al., 1994, Am. J. Physiol. 266:R292-305). 작은 게이지의 카뉼라는 실질 또는 종양에 정위적으로 위치하고, 주입액은 느린 일정한 속도로 전달된다. 이것은 뇌에서 전신 투여된 치료제의 높은 지역 농도 및 분포에 대한 자연스런 장애를 제시하는 BBB를 우회한다. BBB가 대체로 무손상인 DPG의 경우, 경구 또는 전신 투여된 항암 요법은 CNS 침투를 제한한다. 전임상 연구는 설치류 뇌간에서 8H9의 CED가 안전하다는 것을 보여주었다 ([Luther, N. et al., 2008, Neurosurgery 63:1166-74]; [Occhiogrosso, G. et al., 2003, Neurosurgery 52:388-94]; [Luther, N. et al., 2014, Neuro. Oncol., in press]). 또한, 래트 뇌에서의 면역반응성 U87 이종이식편에서 8H9의 종양내 CED (Luther, N. et al., 2008, Neurosurgery 63:1166-74) 또는 그의 면역독소 (8H9-슈도모나스 외독소) (Luther, N. et al., 2010, Mol. Cancer. Ther. 9:1039-46)도 안전한 것으로 밝혀졌고, 미처리된 뇌에서 발견된 것과 유사한 분포를 보였다. 마지막으로, 124I-8H9는 간질 주입 후 설치류와 영장류 뇌간에서 내약성이 양호하였다 (Luther, N. et al., 2014, Neuro. Oncol.:in press). 항체 주입량 또는 부피를 증가시킴으로써, 8H9 분배 부피를 증가시킬 수 있다. 124I-8H9는 선량 측정 및 요법을 위한 이상적인 치료진단제이다. I상 임상 시험에서, 치료 표준의 일부로서 외부 광선 방사선 요법을 받은 DIPG 환자에게 각각의 군당 3-6명씩 4가지 선량 (0.25, 0.5, 0.75 및 1 mCi/주사)으로 124I-8H9의 CED를 시행하였다. 1 mCi/주사에서는, MTD에 도달하지 않았다. PET에 의해, 124I-8H9는 우수한 종양 국재화를 보여주었다. CED로부터 어떠한 합병증도 없었고, 유의한 독성 (>2 등급)도 발견되지 않았다. 더 높은 124I-8H9 선량 수준으로 치료된 환자는 과거 평균 사망 시간을 초과하여 생존하였다. 이 시험은 3가지의 추가적인 선량 수준 (2.5, 3.5 및 4 mCi)으로 선량을 계속 증가시키도록 수정되고 있다. 방사성 표지된 8H9의 CED는 다른 고립성 침윤성 원발성 또는 전이성 뇌종양에 적용될 수 있다.
균등물 및 범위
통상의 기술자는 본원에서 설명되는 본 발명의 구체적인 실시양태에 대한 많은 균등물을 인지하거나, 단지 통상적인 실험을 사용하여 확인할 수 있을 것이다. 본 발명의 범위는 상기 설명에 한정되는 것으로 의도되는 것이 아니라, 오히려 첨부된 청구 범위에 제시된다.
특허 청구 범위에서, 관사, 예컨대 "a", "an" 및 "the"는 문맥으로부터 반대로 지시되거나 달리 명백하지 않으면 하나 또는 하나 초과를 의미할 수 있다. 군의 하나 이상의 구성원 사이에 "또는"을 포함하는 청구항 또는 설명은 문맥으로부터 반대로 지시되거나 달리 명백하지 않으면, 군 구성원 중 하나, 하나 초과 또는 전부가 제시된 생성물 또는 방법에 존재하거나, 사용되거나, 또는 달리 관련될 경우 충족된 것으로 간주된다. 본 발명은 군의 정확히 한 구성원이 제시된 생성물 제품 또는 방법에 존재하거나, 사용되거나, 또는 달리 관련되는 실시양태를 포함한다. 본 발명은 군 구성원 중 하나 초과 또는 전부가 제시된 생성물 또는 방법에 존재하거나, 사용되거나, 또는 달리 관련되는 실시양태를 포함한다. 또한, 본 발명은 제시되는 청구항 중 하나 이상으로부터 하나 이상의 제한, 요소, 절, 설명적인 용어 등이 또 다른 청구항에 도입되는 모든 변형, 조합 및 순열을 포함함이 이해되어야한다. 예를 들어, 또 다른 청구항에 종속된 임의의 청구항은 동일한 기본 청구항에 의존하는 임의의 다른 청구항에서 발견되는 하나 이상의 제한을 포함하도록 변형될 수 있다. 또한, 청구항이 조성물을 언급하는 경우, 달리 나타내지 않는 한 또는 관련 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 모순 또는 불일치가 발생할 것이라는 것이 명백하지 않는 한, 본원에 개시된 임의의 목적을 위해 조성물을 사용하는 방법이 포함되고, 본원에 개시된 임의의 제조 방법 또는 관련 기술 분야에 공지된 다른 방법에 따라 조성물을 제조하는 방법이 포함됨을 이해하여야 한다.
요소가 목록으로, 예를 들어 마커시 (Markush) 군 형식으로 제공되는 경우, 요소들의 각각의 하위군이 또한 개시되고, 임의의 요소(들)가 군으로부터 제거될 수 있음을 이해하여야 한다. 일반적으로, 본 발명 또는 본 발명의 측면이 특정 요소, 특징 등을 포함하는 것으로 언급되는 경우, 본 발명의 특정 실시양태 또는 본 발명의 측면은 그러한 요소, 특징 등으로 이루어지거나 또는 본질적으로 이들로 이루어진다는 것을 이해하여야 한다. 간략화를 위해, 이들 실시양태는 본원에서 이들 용어로 구체적으로 제시되지 않았다. "포함하는"이라는 용어는 개방된 것으로 의도되고 추가의 요소 또는 단계의 포함을 허용한다는 것을 유의해야 한다.
범위가 제시된 경우, 종점이 포함된다. 또한, 달리 지시되거나 문맥 및 통상의 기술자의 이해로부터 달리 명백한 경우를 제외하고, 범위로 표현된 값은 본 발명의 다른 실시양태에서 언급된 범위 내의 임의의 특정 값 또는 하위범위를, 문맥상 분명히 달리 나타내지 않으면 범위의 하한 단위의 1/10까지 포함할 수 있음이 이해되어야 한다.
또한, 선행 기술에 속하는 본 발명의 임의의 특정 실시양태는 임의의 하나 이상의 청구항으로부터 명백하게 배제될 수 있음을 이해해야 한다. 이러한 실시양태는 통상의 기술자에게 알려진 것으로 간주되기 때문에, 배제가 본원에서 명시적으로 제시되지 않아도 배제될 수 있다.
상기에서 및 본원 명세서 전반에 걸쳐 논의된 간행물은 본원의 출원일 이전의 그들의 개시에 대해서만 제공된다. 본원의 어떠한 내용도, 본 발명자들이 선행 개시내용 때문에 그 개시내용보다 선행할 자격이 없다고 인정하는 것으로 해석되지 않아야 한다.
통상의 기술자는 본원에서 설명되는 본 발명의 특정 실시양태에 대한 많은 균등물을 인식할 수 있거나 또는 단지 통상적인 실험을 사용하여 확인할 수 있을 것이다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명에 한정되는 것으로 의도되지 않고, 오히려 다음의 청구범위에 설명된 바와 같다.
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SEQUENCE LISTING <110> MEMORIAL SLOAN KETTERING CANCER CENTER <120> ANTIBODIES, COMPOSITIONS, AND USES <130> 2003080-0937 <140> <141> <150> 62/042,457 <151> 2014-08-27 <160> 105 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 1 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asp Tyr 20 25 30 Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Ser Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Asn Gly His Ser Phe Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 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Synthetic polypeptide <400> 6 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asp Tyr 20 25 30 Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Ser Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Asn Gly His Ser Phe Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 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Synthetic polypeptide <400> 26 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Asp Ile Asn Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Trp Ile Phe Pro Gly Asp Asp Ser Thr Gln Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Gln Thr Thr Gly Thr Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu 130 135 140 Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Val Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln 145 150 155 160 Ser Ile Ser Asp Tyr Leu Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Gln Ala 165 170 175 Pro Arg Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro 180 185 190 Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Glu Phe Thr Leu Thr Ile 195 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Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 51 Gln Ser Ile Ser Asp Tyr 1 5 <210> 52 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 52 Gln Ser Ile Ser Asp Tyr 1 5 <210> 53 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 53 Tyr Ala Ser 1 <210> 54 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 54 Tyr Ala Ser 1 <210> 55 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 55 Gln Asn Gly His Ser Phe Pro Leu Thr 1 5 <210> 56 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 56 Gln Asn Gly His Ser Phe Pro Leu Thr 1 5 <210> 57 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 57 Asn Tyr Asp Ile Asn 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Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 81 tcagttttgg cccaggcggc c 21 <210> 82 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 82 accactagtt gggccggcct g 21 <210> 83 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 83 cttcgctgtt tttcaatatt ttctgttatt gcttcagttt tggcccaggc ggcc 54 <210> 84 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 84 gagccgccac cctcagaacc gccaccctca gagccaccac tagttgggcc ggcctg 56 <210> 85 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 85 Phe Val Ser Ile Arg Asp Phe Gly 1 5 <210> 86 <211> 4 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Conserved mammalian peptide <400> 86 Ile Gln Asp Phe 1 <210> 87 <211> 200 <212> PRT <213> 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Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Gln Thr Thr Ala Thr Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 Gly Gly Val Gly Ser Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu 130 135 140 Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Val Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln 145 150 155 160 Ser Ile Gly Asp Tyr Leu Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser 165 170 175 Pro Arg Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro 180 185 190 Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser 195 200 <210> 92 <211> 200 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 92 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Asp Ile Asn Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Trp Ile Phe Pro Gly Asp Gly Ser Thr Gln Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 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Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Asp Ile Asn Trp Ala Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Trp Ile Phe Pro Gly Asp Gly Ser Thr Gln Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Thr Ser Thr Gly Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Gln Thr Thr Ala Thr Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Val Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Asn Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu 130 135 140 Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Val Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln 145 150 155 160 Ser Ile Ser Asp Tyr Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro His Glu Ser 165 170 175 Pro Arg Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro 180 185 190 Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser 195 200 <210> 95 <211> 200 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> Any amino acid <400> 95 Gln Val Xaa Leu Xaa Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Asp Ile Asn Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Trp Ile Phe Pro Gly Asp Gly Ser Thr Gln Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Glu Leu Ser Ser Leu Gly Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Gln Thr Thr Gly Thr Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu 130 135 140 Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Val Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln 145 150 155 160 Ser Ile Ser Asp Tyr Leu Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser 165 170 175 Pro Arg Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro 180 185 190 Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser 195 200 <210> 96 <211> 200 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 96 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Asp Ile Asn Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Trp Ile Phe Pro Gly Asp Gly Ser Thr Gln Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Ser Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Gln Thr Thr Ala Thr Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu 130 135 140 Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Val Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ile Ser Asp Tyr Leu Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser 165 170 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160 Glu Ile Ser Asp Tyr Leu Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser 165 170 175 Pro Arg Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro 180 185 190 Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser 195 200 <210> 98 <211> 200 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 98 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Asp Ile Asn Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Trp Ile Phe Pro Gly Asp Gly Ser Thr Gln Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Glu Leu Ser Ser Leu Gly Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Gln Thr Thr Gly Thr Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu 130 135 140 Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Val Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln 145 150 155 160 Ser Ile Ser Asp Tyr Leu Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser 165 170 175 Pro Arg Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro 180 185 190 Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser 195 200 <210> 99 <211> 200 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(6) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (17)..(19) <223> Any amino acid <400> 99 Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Leu Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Asp Ile Asn Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Trp Ile Phe Pro Gly Asp Gly Ser Thr Gln Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Glu Leu Ser Ser Leu Gly Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Gln Thr Thr Gly Thr Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu 130 135 140 Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Val Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln 145 150 155 160 Ser Ile Ser Asp Tyr Leu Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser 165 170 175 Pro Arg Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro 180 185 190 Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser 195 200 <210> 100 <211> 200 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(5) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (170)..(171) <223> Any amino acid <400> 100 Gln Val Xaa Xaa Xaa Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Asp Ile Asn Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Trp Ile Phe Pro Gly Asp Gly Ser Thr Gln Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Glu Leu Ser Ser Leu Gly Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Gln Thr Thr Gly Thr Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu 130 135 140 Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Val Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln 145 150 155 160 Ser Ile Ser Asp Tyr Leu Tyr Trp Tyr Xaa Xaa Lys Ser His Glu Ser 165 170 175 Pro Arg Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro 180 185 190 Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser 195 200 <210> 101 <211> 200 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(5) <223> Any amino acid <400> 101 Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Asp Ile Asn Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Trp Ile Phe Pro Gly Asp Gly Ser Thr Gln Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Gln Thr Thr Ala Thr Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 Gly Gly Val Gly Ser Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu 130 135 140 Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Val Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln 145 150 155 160 Ser Ile Gly Asp Tyr Leu Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser 165 170 175 Pro Arg Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro 180 185 190 Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser 195 200 <210> 102 <211> 200 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(5) <223> Any amino acid <400> 102 Gln Val Xaa Xaa Xaa Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Asp Ile Asn Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Trp Ile Phe Pro Gly Asp Asp Ser Thr Gln Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Gln Thr Thr Gly Thr Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu 130 135 140 Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Val Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln 145 150 155 160 Ser Ile Ser Asp Tyr Leu Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser 165 170 175 Pro Arg Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Pro Gly Ile Pro 180 185 190 Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser 195 200 <210> 103 <211> 200 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> Any amino acid <400> 103 Gln Val Xaa Leu Xaa Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Asp Ile Asn Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Trp Ile Phe Pro Gly Asp Gly Ser Thr Gln Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Gln Thr Thr Ala Thr Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu 130 135 140 Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Val Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln 145 150 155 160 Ser Ile Ser Asp Tyr Leu Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser 165 170 175 Pro Arg Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro 180 185 190 Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser 195 200 <210> 104 <211> 200 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Any amino acid <400> 104 Gln Val Xaa Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Asp Ile Asn Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Trp Ile Phe Pro Gly Asp Gly Ser Thr Gln Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Gly Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Thr Arg Gln Thr Thr Ala Thr Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 Ser Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu 130 135 140 Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Val Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln 145 150 155 160 Ser Ile Gly Asp Tyr Leu Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser 165 170 175 Pro Arg Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro 180 185 190 Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser 195 200 <210> 105 <211> 200 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> Any amino acid <400> 105 Gln Val Xaa Leu Xaa Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Asp Ile Asn Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Trp Ile Phe Pro Gly Asp Gly Ser Thr Gln Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Glu Leu Ser Ser Leu Gly Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Gln Thr Thr Gly Thr Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu 130 135 140 Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Val Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln 145 150 155 160 Ser Ile Ser Asp Tyr Leu Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser 165 170 175 Pro Arg Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro 180 185 190 Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser 195 200

Claims (88)

  1. 단백질 2Ig-B7H3 또는 4Ig-B7H3에 특이적으로 결합하고,
    (i) 각각 서열식별번호: 34, 36, 및 38에 제시된 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3, 및 각각 서열식별번호: 58, 60, 및 62에 제시된 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3;
    (ii) 각각 서열식별번호: 40, 42, 및 44에 제시된 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3, 및 각각 서열식별번호: 64, 66, 및 68에 제시된 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3;
    (iii) 각각 서열식별번호: 46, 48, 및 50에 제시된 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3, 및 각각 서열식별번호: 70, 72, 및 74에 제시된 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3; 또는
    (iv) 각각 서열식별번호: 52, 54, 및 56에 제시된 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3, 및 각각 서열식별번호: 76, 78, 및 80에 제시된 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3
    을 포함하는 항체 작용제.
  2. 이뮤노글로불린 중쇄 및 이뮤노글로불린 경쇄를 포함하는 항체 작용제이며, 여기서 항체 작용제는 단백질 2Ig-B7H3 또는 4Ig-B7H3에 특이적으로 결합하고, 상기 이뮤노글로불린 경쇄 가변 도메인은 서열식별번호: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 및 8로 이루어진 군으로부터 선택된 서열식별번호에 제시된 서열을 포함하고, 상기 이뮤노글로불린 중쇄 가변 도메인은 서열식별번호: 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 및 16으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열식별번호에 제시된 서열을 포함하는 것인 항체 작용제.
  3. 제2항에 있어서,
    (i) 이뮤노글로불린 경쇄가 서열식별번호: 1에 제시되고, 이뮤노글로불린 중쇄가 서열식별번호: 9에 제시되거나,
    (ii) 이뮤노글로불린 경쇄가 서열식별번호: 2에 제시되고, 이뮤노글로불린 중쇄가 서열식별번호: 10에 제시되거나,
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    (ix) 이뮤노글로불린 경쇄가 서열식별번호: 7에 제시되고, 이뮤노글로불린 중쇄가 서열식별번호: 15에 제시되거나, 또는
    (x) 이뮤노글로불린 경쇄가 서열식별번호: 8에 제시되고, 이뮤노글로불린 중쇄가 서열식별번호: 16에 제시된 것인 항체 작용제.
  4. 제2항에 있어서, 이뮤노글로불린 경쇄가 서열식별번호: 5에 제시되고, 이뮤노글로불린 중쇄가 서열식별번호: 13에 제시된 것인 항체 작용제.
  5. 제2항에 있어서, 이뮤노글로불린 경쇄가 서열식별번호: 7에 제시되고, 이뮤노글로불린 중쇄가 서열식별번호: 15에 제시된 것인 항체 작용제.
  6. 제2항에 있어서, 이뮤노글로불린 경쇄가 서열식별번호: 30 또는 서열식별번호: 31에 제시된 폴리펩티드에 융합된 것인 항체 작용제.
  7. 제1항에 있어서, 치료제 또는 검출제에 접합된 항체 작용제.
  8. 제7항에 있어서, 항체가 방사성 동위원소, 약물 제제, 나노입자, 또는 면역독소에 접합된 것인 항체 작용제.
  9. 제7항에 있어서, 항체가 진단제 또는 영상화제 또는 둘 모두에 접합된 것인 항체 작용제.
  10. 제1항에 있어서, 항체 작용제가 제1 및 제2 특이성을 갖는 이중특이적 항체이고, 제1 특이성이 단백질 2Ig-B7H3 또는 4Ig-B7H3에 결합하고, 제2 특이성이 T 세포 상의 CD3 또는 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산 (DOTA)에 결합하는 것인 항체 작용제.
  11. 단백질 2Ig-B7H3 또는 4Ig-B7H3에 특이적으로 결합하고, 서열식별번호: 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 및 27로 이루어진 군으로부터 선택된 서열식별번호에 제시된 폴리펩티드를 포함하는 scFv.
  12. 제11항에 있어서, 폴리펩티드가 서열식별번호: 28 또는 서열식별번호: 29에 제시된 제2 폴리펩티드에 융합된 것인 scFv.
  13. 제11항에 있어서, scFv가 치료제 또는 검출제에 접합된 것인 scFv.
  14. 암을 치료 또는 예방하기 위한, 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 항체 작용제 또는 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항의 scFv, 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물.
  15. B7H3-양성 종양 세포를 포함하는 암을 치료 또는 예방하기 위한, 치료 유효량의 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 항체 작용제 또는 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항의 scFv를 포함하는 제약 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 암이 신경모세포종이거나 또는 신경모세포종을 포함하는 것인 제약 조성물.
  17. 제15항에 있어서, 암이 자궁경부암이거나 또는 자궁경부암을 포함하는 것인 제약 조성물.
  18. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 항체 작용제 또는 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항의 scFv를 코딩하는 서열을 포함하는 핵산.
  19. 제18항의 핵산을 포함하는 단리된 숙주 세포.
  20. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 항체 작용제 또는 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항의 scFv를 발현하는 단리된 숙주 세포.

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