KR101815265B1 - FcRn 특이적 인간 항체 및 이를 포함하는 자가면역 질환 치료용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 IgG에 고친화성을 갖는 수용체인 FcRn에 특이적이 인간 항체, 이를 제조하는 방법, 그러한 항체를 포함하는 자가면역 질환 치료용 조성물 및 이를 이용한 자가면역 질환의 치료 및 진단 방법에 대한 것으로, 본 발명에 따른 FcRn 특이적 항체는 FcRn에 IgG 등과 비경합적으로 결합하여 혈중 내(serum) 병인성 자가항체(auto-antibody)의 양을 감소시킴으로써 자가면역질환(auto-immune disease)에 대한 치료용 및 진단용으로 활용이 가능하다.

Description

FcRn 특이적 인간 항체 및 이를 포함하는 자가면역 질환 치료용 조성물{FcRn specific human antibody and composition for treatment of autoimmune diseases}
본 발명은 IgG에 고친화성을 갖는 수용체인 FcRn(neonatal Fc receptor의 약자로, 태아 Fc-수용체, FcRP, FcRB, Brambell 수용체라고도 불린다)에 특이적인 인간 항체, 이를 제조하는 방법, 그러한 항체를 포함하는 자가면역 질환 치료용 조성물 및 이를 이용한 자가면역 질환의 치료 및 진단 방법에 대한 것으로, 본 발명에 따른 FcRn 특이적 항체는 FcRn에 IgG 등과 비경합적으로 결합하여 혈중 내(serum) 병인성 자가항체(auto-antibody)의 양을 감소시킴으로써 자가면역질환(auto-immune disease)에 대한 치료용으로 활용이 가능하다.
항체는 특정 항원에 결합하는 면역 단백질로 인간 및 생쥐를 비롯한 대부분의 동물에서 중쇄(heavy chain)과 경쇄(light chain)의 폴리펩타이드가 쌍을 이루고 있다. 각 쇄는 가변영역(variable domain) 및 불변영역(constant domain)으로 지칭되는 2개의 구별되는 영역으로 구성되어 있으며, 중쇄 및 경쇄의 가변영역은 항체 간에 상당한 서열 다양성을 나타내고, 표적 항원에 특이적 결합 특성을 담당하며, 불변영역은 항체 간 서열 다양성이 적고, 중요한 생화학적 반응을 유도하는 다수의 천연 단백질에의 결합을 담당한다. 인간에서, IgA(IgA1 및 IgA2 하위부류 포함), IgD, IgE, IgG(IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4의 하위부류로 세분된다.), 그리고 IgM를 비롯한 다섯 가지 아이소타입 (isotype) 항체가 존재하는데, 이들 아이소타입은 주로 불변영역의 특성에 따라 구분된다.
혈중 내에 가장 많이 존재하며, 병원균의 침입 시 생체를 보호하고 면역계(immune system) 관련 물질의 동원(recruitment)을 촉진하고, 조직에서 염증반응을 매개하는 IgG 항체는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄로 구성된 사합체(tetrameric) 단백질이다. IgG 중쇄는 각각 중쇄 가변 도메인(VH), 중쇄 불변 도메인 1(CH1), 중쇄 불변 도메인 2(CH2) 및 중쇄 불변 도메인 3(CH3)을 나타내는 VH-CH1-CH2-CH3의 순서로 N- 말단에서 C 말단으로 연결된 4개의 면역글로불린 도메인으로 구성되어 있다.
또한, IgG 경쇄는 각각 경쇄 가변 도메인(VL) 및 경쇄 불변 도메인(CL)을 나타내는 VL-CL의 순서로 N-말단에서 C-말단으로 연결된 2개의 면역글로불린 도메인으로 구성되어 있다.
정상적인 조건 하에, 혈청 내에서 IgG3 아이소타입을 제외한 대부분의 IgG의 반감기는 인간에서 약 22-23일인데, 이는 다른 혈장 단백질의 혈청 반감기에 비하여 비교적 긴 것이다. 이러한 긴 IgG의 혈중 반감기는 세포흡수작용(pinocytosis)에 의해 세포속으로 들어온 IgG는 pH 6.0 조건의 엔도좀(endosome)에서 Fc 감마 수용체의 일종인 신생아 Fc 수용체(neonatal Fc receptor, FcRn)에 강하게 결합하여 분해성 리소좀 (degradative lysosome) 경로를 회피할 수 있으며, 다시 세포막으로 순환하면 IgG는 약한 염기성 pH (~7.4)인 혈류 (bloodstream) 내에서 FcRn으로부터 급속하게 해리된다. 이러한 수용체-매개된 재순환 메커니즘 (receptor mediated recycling mechanism)에 의해 FcRn은 리소좀에서 IgG의 분해를 효과적으로 차단하여 IgG의 반감기를 연장하는 것으로 알려져 있다(Roopenian et al. J. Immunol. 170:3528, 2003).
FcRn은 쥐 신생아 장에서 모유로부터 IgG 항체의 흡수를 매개하는 기능을 하고 순환계 (circulatory system)로 이의 수송을 촉진하는 것으로도 밝혀져 있다. FcRn은 인간 태반으로부터도 분리되었는데, FcRn은 모계 IgG의 흡수와 태아 순환(fetal circulation)으로의 수송을 매개하는 것으로 알려져 있다. 성인에서, FcRn은 폐, 장, 신장의 상피 조직, 그리고 코, 질, 그리고 담관가지 (biliary tree) 표면을 비롯한 다수의 조직에서 발현된다.
FcRn은 전형적으로, 내피 세포와 상피 세포의 엔도솜 내에 거주하는 비-공유 이형이합체(non-covalent heterodimer)이다. FcRn은 세 개의 중쇄 알파 도메인(1, 2와 3)과 하나의 수용성 경쇄 2-microglobulin(2m) 도메인을 갖는 막결합 수용체이다. 구조적으로, 이는 공통 경쇄(light chain)로서 2m을 보유하는 주요 조직적합성 복합체 (major histocompatibility complex) 클래스 1 분자의 집단에 속한다. FcRn 쇄는 1, 2와 3 세 개의 중쇄 도메인(heavy chain domain)과 2m 경쇄 도메인(light chain domain)을 포함하고 하나의 당사슬을 가지는 세포외 도메인(ectodomain), 단일-통과 막간(single-pass transmembrane), 그리고 상대적으로 짧은 세포질 꼬리(cytoplasmic tail)로 구성되어 약 46 kD의 분자량을 가진다(Burmeister et al. Nature 372:366, 1994.).
IgG 항상성 (homeostasis)에 대한 FcRn의 역할을 확인하기 위해 생쥐의 2m과 FcRn 중쇄(heavy chain)를 인코딩하는 유전자를 "녹아웃 (knockout)"시켜 이들 단백질이 발현되지 않도록 조작했을 때, 이들 생쥐에서, IgG의 혈청 반감기와 농도가 급격하게 감소하였는데(Junghans et al, Proc. Natl. Acad. Sci. 93:5512, 1996), 이는 IgG 항상성에 대한 FcRn 의존성 메커니즘을 암시한다. 또한, 항-인간 FcRn 항체가 이들 FcRn 녹아웃 생쥐에서 산출될 수 있고, 이들 항체가 FcRn에 IgG의 결합을 예방할 수 있는 것으로 제안 되었지만, 아직 이런 항체는 산출되거나 시험되지 않았다(WO 02/43658 A).
FcRn에 대한 IgG 결합의 저해는 IgG의 재순환을 감소시킴으로써 IgG 혈청 반감기를 감소시켜 자가항체에 의한 자가면역 질환을 치료할 수 있다는 가능성은 자가면역 피부 수포성 질병의 생쥐 모형에서 밝혀졌다(Li et al. J. Clin. Invest. 115:3440, 2005). 따라서 FcRn과 IgG의 결합을 차단하거나 길항하는 작용제는 IgG에 의해 매개되는 자가면역 질환 및 염증 질환 등을 치료 또는 예방하는 방법에 이용될 수 있다.
자가면역질환 및 동종면역 질환은 병원성 항체에 의해 매개되는 질환으로, 면역성 호중구 감소증, 길랑바레 신드롬, 간질, 자가면역 대뇌 뇌염, 아이삭 신드롬, 모반 신드롬, 심상성 천포창, 낙엽성 천포창, 수포성류 천포창, 후천성 표피 수포증, 임신성 유사수포창, 뮤코스 막 유사수포창, 항인지질 신드롬, 자가면역 빈혈, 자가면역 그래이브 병, 굿파스튜어 증후군, 중증근무력증, 다발성경화증, 류마티스성 관절염, 루프스 및 특발성 혈소판 감소성 자반증(idiopathic thrombocytopenic purpura, 이하 ITP라 한다)이 대표적인 질환이다. ITP는 특정 혈소판 막당단백질에 결합하는 자가항체의 발생에 의해 말초의 혈소판 파괴가 진행되어 발생되는 질환이다. 항혈소판 항체는 혈소판을 옵소니화(opsoniaztion)하고 망상세포 (예를 들면 대식세포)에 의한 급속한 혈소판 파괴를 가져온다.
일반적으로 ITP를 치료하기 위해 면역계를 억제하여 혈소판 농도를 높이는 시도가 행해지고 있다. ITP는 남성보다 여성에서 유병율이 높고, 또 성인보다 소아에서 많이 발생하며, 그 유병율은 인구 1만 명당 1명이다. 만성적 ITP는 성인과 소아의 양쪽에 있어서 주요한 혈액질환의 하나이다. 또 미국 및 전 세계에 있어 거액의 입원료 및 치료비용을 발생시키는 원인이 되고 있다. 매년 미국에서 2만건의 새로운 증례가 발생하고 있으며, ITP의 치료 및 특별요법에 관련되는 비용 또한 막대하다. 대부분의 ITP 소아환자는 매우 낮은 수의 혈소판을 가져 돌연의 출혈(전형적인 증상으로서, 좌상, 피부의 작은 붉은 반점, 코피, 및 잇몸 출혈)이 일어난다. 소아는 때론 치료하지 않아도 회복하는 경우가 있지만 많은 의사들이 면밀한 관찰과 완화 및 감마 글로불린(globulin)의 점적 정맥주사(intravenous infusion)에 의한 치료를 추천하고 있다.
다양한 자가면역질환에 과량의 IgG를 점적정맥투여(IVIG)하여, 자가면역질환을 치료하는 방법이 널리 사용되고 있다(Arnson autoimmunity 42:553 (2009)). IVIG 효과는 다양한 기작에 의해 설명되지만 그 중 하나는 FcRn에 대한 내인성 IgG와의 경합에 의해 병원성 항체의 클리어런스(clearance)를 증가시키는 기작으로도 설명된다. 대량의 사람면역글로불린(IgG)의 정맥투여(IVIG)는 면역성 ITP에 고통 받는 소아의 혈소판 수를 증가시키며, 복수의 다른 자가면역질환의 치료에 유익하다는 것이 증명되었다. 많은 연구로, IVIG의 자가면역질환 치료에 있어서 효과를 발휘하는 메커니즘(mechanism)이 규명되었다. ITP와 관련하여, 초기 연구에서 IVIG의 효과는 주로 항체- 옵소니화 혈소판의 식균작용에 관여하는 Fc 수용체(recetor)를 차단하여 발생하는 것이라고 알려져 왔다. 그 뒤의 연구는 Fc-결손 IVIG는 일부 ITP 환자에 있어서 혈소판 수의 증가를 가져온다는 것이 밝혀졌고, 최근에는 IVIG의 효과는 혈소판 탐식의 저해에 연결되는 대식세포(macrophage) 세포상의 FcRIIb 발현을 자극하는 것에 기인한다는 보고도 있다.
그렇지만 이와 같은 IVIG 치료는 큰 부작용을 가지고 투여에 상당히 큰 비용(cost)이 든다. 또한 IVIG 이외의 자가면역/동종 면역성 질환의 치료에 사용되는 다른 치료법으로는 폴리클론날 항D 면역 글로불린, 부신피질 스테로이드(steroid) 및 화학요법제를 포함하는 면역 억제제 등을 이용하는 방법, 사이토카인 혈장 분리교환법, 체외 항체 흡착(예를 들면 Prosorba 칼럼을 사용하는 방법) 또는 비장적출 등의 외과적 처치 등이 포함된다. 그렇지만 IVIG와 마찬가지로, 이러한 치료법 역시 충분하지 않은 효력 및 고비용 때문에 그 이용이 제한적일 수 밖에 없다. 또한, FcRn결합의 IVIG 저해의 가상 기작(mechanism)의 경합적 저해는 IgG의 생리학적 pH(즉, pH7.2~7.4)에서 FcRn에 대한 낮은 친화성에 의해 병원성 항체의 클리어런스(clearance)의 실질적인 증가를 가져오기 위해서는 상당히 다량의 IVIG이 요구되는데, IVIG의 전형적인 임상용량은 2g/kg 정도이다.
IgG의 FcRn에 대한 결합을 경합적으로 억제함으로써 자가면역질환을 치료하는 개념을 갖는 저해제를 이용하는 것은 유망한 치료법 중 하나이지만, 현재로서는 내인성 IgG의 FcRn에 대한 고친화성 및 혈중의 내인성 IgG의 농도로 인해 상당히 많은 양의 저해제가 필요하고, 그로 인해 현재의 IVIG 치료법과 동일한 한계를 가지고 있는 것으로 알려져 있다.
따라서, FcRn에 대한 높은 친화력을 가지고 있어, 적은 양으로 병인성 항체를 제거할 수 있으며, 면역원성을 줄일 수 있는 인간항체에 대한 개발 필요성이 절실한 상황이다.
상기와 같은 문제를 해결하고자 본 발명자들은 FcRn에 대한 높은 친화력을 가지고 있어, 적은 양으로 병인성 항체를 제거할 수 있으며, 면역원성을 줄일 수 있는 인간항체를 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 인간항체 cDNA 라이브러리로부터 pH 비의존적으로 FcRn chain에 특이적으로 결합하는 인간 항체를 제조 및 선별하였다. 또한, 상기 항체가 자가면역질환을 예방 또는 치료할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
이에 따라 본 발명은 ITP를 포함한 자가면역질환을 효율적이고 근본적으로 치료할 수 있는 치료제를 제공하기 위하여, FcRn에 특이적으로 결합할 수 있는 능력을 가진 항체 및 그러한 항체의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 본 발명에 따른 FcRn 특이적 항체는 FcRn에 특이적이며 pH 비의존적(pH independent)으로 결합하여 FcRn에 대한 항체 Fc의 결합을 비경합적(non-competitive)으로 방해하여 자가면역질환의 원인인 생체 내 자가항체를 감소시킴으로써 자가면역질환을 치료할 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기의 FcRn 특이적 항체를 함유하는 ITP, 면역성 호중구 감소증, 길랑바레 신드롬, 간질, 자가면역 대뇌 뇌염, 아이삭 신드롬, 모반 신드롬, 심상성 천포창, 낙엽성 천포창, 수포성류 천포창, 후천성 표피 수포증, 임신성 유사수포창, 뮤코스 막 유사수포창, 항인지질 신드롬, 자가면역 빈혈, 자가면역 그래이브 병, 굿파스튜어 증후군, 증근무력증, 다발성경화증, 류마티스성 관절염 및 루프스 등의 자가면역질환 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기의 FcRn 특이적 항체를 이용한 ITP, 면역성 호중구 감소증, 길랑바레 신드롬, 간질, 자가면역 대뇌 뇌염, 아이삭 신드롬, 모반 신드롬, 심상성 천포창, 낙엽성 천포창, 수포성류 천포창, 후천성 표피 수포증, 임신성 유사수포창, 뮤코스 막 유사수포창, 항인지질 신드롬, 자가면역 빈혈, 자가면역 그래이브 병, 굿파스튜어 증후군, 중증근무력증, 다발성경화증, 류마티스성 관절염 및 루프스 등의 자가면역질환을 예방 또는 치료하는 방법 및 진단하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 FcRn에 높은 친화도(affinity)를 가지고 특이적(specific)이고 pH 비의존적으로 결합할 수 있으며, 인간에서 유래한 서열로 이루어져 체내 투여 시 면역반응 유발이 거의 없는 완전 인간 항체를 개발하였으며, 그러한 완전 인간 항체의 친화도 개선(affinity maturation)을 통해 보다 친화도가 우수한 항체를 개발하였다.
본 발명에서 제공되는 항체는 FcRn에 대한 특이성을 가지는 폴리크로날 또는 모노크노날(monoclonal) 항체이며, 바람직하게는 인간 FcRn에 대한 모노크노날 항체, 특히 인간 모노클로날 항체의 형태를 가지며, FcRn과의 결합에 있어, IgG의 비경합적 저해제(non-competitive inhibitor)로 작용한다. 본 발명에 따른 항체와 FcRn 결합에 의해 FcRn에 대한 병원성 항체의 결합이 저해되고, 이에 따라 개체의 체내로부터 병원성 항체의 클리어런스(clearance), 즉 제거가 촉진되어 반감기가 감소하게 된다.
본 발명에서 사용되는 병원성 항체는 병적인 상태 또는 질병을 일으키는 항체를 의미하며, 이와 같은 항체에는 항혈소판 항체, 항아세틸콜린 항체, 항핵산 항체, 항인지질 항체(anti-phospholipid antibody), 항콜라겐 항체 (anti-collagen antibody), 항강글리오사이드 항체(anti-ganglioside antibody), 항데스모그레인 항체 (anti-desmoglein antibody) 등이 포함되지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 항체는 생리학적 pH, 즉 pH 7.0~7.4에서 병원성 항체와 FcRn과의 결합을 비경합적으로 저해를 가능하게 한다는 장점이 있다. US 2002/0138863A 등에는 항체가 FcRn에 결합한 경우 FcRn에의 IgG의 결합이 저해되도록 FcRn에 대한 항체는 IgG이 Fc에 결합하는 것에 중요한 동일 사이트(site)에서 FcRn에 결합해야 한다고 기재되어 있다. FcRn은 그 리간드, 즉 IgG에 pH 의존적으로 결합하며, 산성이 아닌 생리학적 pH에서는 IgG에 대해 실질적으로 친화성을 나타내지 않는다. 따라서 생리학적 pH에서 FcRn에 특이적으로 결합하는 항 FcRn 항체는 IgG와 FcRn의 결합에 비경합적 저해제로서 작용하며, 이 경우 FcRn에의 항 FcRn 항체의 결합은 IgG의 존재 여부에 영향을 받지 않는다. 따라서, pH 비의존성에 의해 IgG와 비경합적으로 FcRn과 결합하는 본 발명에 따른 항체는 경합적 저해제, 즉 IgG와 경쟁적으로 FcRn에 결합하는 기존의 항체들에 비해 훨씬 낮은 농도만으로도 IgG의 FcRn 매개 신호전달로 인한 질병의 치료가 가능하다는 장점이 있다. 또한, FcRn과 결합한 상태로 세포내 이동의 과정에 있어서, 본 발명에 따른 항 FcRn 항체는 FcRn에 대해 혈중 IgG보다 높은 친화도로 결합을 유지하므로 IgG와 FcRn이 결합할 수 있는 산성 pH 환경인 엔도솜 내에서도 IgG과 FcRn의 결합을 저해할 수 있어, IgG의 클리어런스를 촉진할 수 있는 효과를 가진다.
정리하면, 선행기술에 개시된 항체와는 다르게 본 발명에 따른 항체는 IgG가 FcRn에 결합하지 못하는 환경인 생리학적 pH, 즉 pH 7.0~7.4에서도 FcRn에 친화성을 가지고 pH 6.0에서는 혈중내 IgG 보다 FcRn에 더욱 높은 친화성을 가져 비경합적 저해제로 작용한다.
본 발명에서는 단일쇄 Fv(scFv) 파지 라이브러리(phage library)로부터 파지 디스플레이(phage display) 기술을 이용하여 FcRn에 높은 친화도 및 특이성을 가지고 결합하는 완전 인간 항체를 수득하였다. 파지 라이브러리의 제조 및 파지 디스플레이는 US 7,063,943B, US 6,172,197B 등에 공지된 바와 같이 제조하여 실시할 수 있다. 선별된 완전 인간 항체의 가변영역에 무작위 돌연변이를 일으켜 구축한 라이브러리로부터 다시 파지 디스플레이 기술을 이용하여 FcRn에 더욱 높은 친화도 및 특이성을 가지는 인간 항체를 선별하기 위한 친화도 개선(affinity maturation)을 수행하여, 더욱 특이성과 친화도가 제고된 완전 인간 항체를 수득하였다. 친화도 개선은 US 5,977,3222, US 5,994,511, US 6,218,149 등에 기재된 방법에 따라 실시할 수 있다.
상기 방법을 통해 수득되어 제공되는 본 발명에 따른 항체는 서열번호 2 내지 144번 사이의 짝수번호로 이루어진 그룹(예를 들면, 2, 4, 66, 128 등)에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열, 서열번호 289 또는 서열번호 291 번에 기재된 아미노산 서열 에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 FcRn 특이적 항체의 중쇄 가변영역 중 어느 하나, 또는 그러한 중쇄 가변영역과 90%, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역 및/또는 서열번호 146 내지 288번 사이의 짝수 번호로 이루어진 그룹(예를 들면, 148, 196, 244, 266 등)에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열, 서열번호 290 또는 서열번호 292 번에 기재된 아미노산 서열 에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 FcRn 특이적 항체의 경쇄 가변영역 중 어느 하나, 또는 그러한 경쇄 가변영역과 90%, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역을 가진다.
특히 본 발명에 따른 항체는,
(1) 서열번호 2의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 146의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(2) 서열번호 4의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 148의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(3) 서열번호 6의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 150의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(4) 서열번호 8의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 152의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(5) 서열번호 10의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 154의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(6) 서열번호 12의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 156의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(7) 서열번호 14의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 158의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(8) 서열번호 16의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 160의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(9) 서열번호 18의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 162의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(10) 서열번호 20의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 164의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(11) 서열번호 22의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 166의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(12) 서열번호 24의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 168의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(13) 서열번호 26의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 170의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(14) 서열번호 28의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 172의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(15) 서열번호 30의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 174의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(16) 서열번호 32의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 176의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(17) 서열번호 34의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 178의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(18) 서열번호 36의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 180의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(19) 서열번호 38의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 182의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(20) 서열번호 40의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 184의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(21) 서열번호 42의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 186의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(22) 서열번호 44의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 188의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(23) 서열번호 46의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 190의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(24) 서열번호 48의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 192의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(25) 서열번호 50의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 194의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(26) 서열번호 52의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 196의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(27) 서열번호 54의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 198의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(28) 서열번호 56의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 200의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(29) 서열번호 58의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 202의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(30) 서열번호 60의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 204의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(31) 서열번호 62의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 206의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(32) 서열번호 64의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 208의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(33) 서열번호 66의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 210의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(34) 서열번호 68의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 212의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(35) 서열번호 70의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 214의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(36) 서열번호 72의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 216의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(37) 서열번호 74의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 218의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(38) 서열번호 76의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 220의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(39) 서열번호 78의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 222의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(40) 서열번호 80의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 224의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(41) 서열번호 82의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 226의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(42) 서열번호 84의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 228의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(43) 서열번호 86의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 230의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(44) 서열번호 88의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 232의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(45) 서열번호 90의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 234의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(46) 서열번호 92의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 236의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(47) 서열번호 94의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 238의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(48) 서열번호 96의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 240의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(49) 서열번호 98의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 242의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(50) 서열번호 100의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 244의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(51) 서열번호 102의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 246의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(52) 서열번호 104의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 248의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(53) 서열번호 106의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 250의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(54) 서열번호 108의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 252의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(55) 서열번호 110의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 254의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(56) 서열번호 112의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 256의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(57) 서열번호 114의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 258의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(58) 서열번호 116의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 260의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(59) 서열번호 118의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 262의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(60) 서열번호 120의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 264의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(61) 서열번호 122의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 266의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(62) 서열번호 124의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 268의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(63) 서열번호 126의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 270의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(64) 서열번호 128의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 272의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(65) 서열번호 130의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 274의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(66) 서열번호 132의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 276의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(67) 서열번호 134의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 278의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(68) 서열번호 136의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 280의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(69) 서열번호 138의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 282의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(70) 서열번호 140의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 284의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(71) 서열번호 142의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 286의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(72) 서열번호 144의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 288의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(73) 서열번호 289의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 290의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역; 및
(74) 서열번호 291의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 292의 아미노산 서열에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
에서 선택된 중쇄 및 경쇄 가변영역을 가진다.
더욱 바람직하게는 본 발명에 따른 항체는
(1) 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 146의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(2) 서열번호 4의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 148의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(3) 서열번호 6의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 150의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(4) 서열번호 8의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 152의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(5) 서열번호 10의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 154의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(6) 서열번호 12의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 156의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(7) 서열번호 14의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 158의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(8) 서열번호 16의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 160의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(9) 서열번호 18의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 162의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(10) 서열번호 20의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 164의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(11) 서열번호 22의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 166의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(12) 서열번호 24의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 168의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(13) 서열번호 26의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 170의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(14) 서열번호 28의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 172의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(15) 서열번호 30의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 174의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(16) 서열번호 32의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 176의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(17) 서열번호 34의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 178의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(18) 서열번호 36의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 180의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(19) 서열번호 38의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 182의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(20) 서열번호 40의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 184의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(21) 서열번호 42의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 186의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(22) 서열번호 44의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 188의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(23) 서열번호 46의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 190의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(24) 서열번호 48의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 192의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(25) 서열번호 50의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 194의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(26) 서열번호 52의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 196의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(27) 서열번호 54의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 198의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(28) 서열번호 56의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 200의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(29) 서열번호 58의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 202의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(30) 서열번호 60의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 204의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(31) 서열번호 62의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 206의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(32) 서열번호 64의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 208의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(33) 서열번호 66의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 210의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(34) 서열번호 68의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 212의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(35) 서열번호 70의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 214의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(36) 서열번호 72의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 216의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(37) 서열번호 74의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 218의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(38) 서열번호 76의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 220의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(39) 서열번호 78의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 222의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(40) 서열번호 80의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 224의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(41) 서열번호 82의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 226의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(42) 서열번호 84의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 228의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(43) 서열번호 86의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 230의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(44) 서열번호 88의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 232의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(45) 서열번호 90의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 234의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(46) 서열번호 92의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 236의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(47) 서열번호 94의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 238의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(48) 서열번호 96의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 240의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(49) 서열번호 98의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 242의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(50) 서열번호 100의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 244의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(51) 서열번호 102의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 246의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(52) 서열번호 104의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 248의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(53) 서열번호 106의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 250의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(54) 서열번호 108의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 252의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(55) 서열번호 110의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 254의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(56) 서열번호 112의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 256의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(57) 서열번호 114의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 258의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(58) 서열번호 116의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 260의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(59) 서열번호 118의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 262의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(60) 서열번호 120의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 264의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(61) 서열번호 122의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 266의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(62) 서열번호 124의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 268의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(63) 서열번호 126의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 270의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(64) 서열번호 128의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 272의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(65) 서열번호 130의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 274의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(66) 서열번호 132의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 276의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(67) 서열번호 134의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 278의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(68) 서열번호 136의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 280의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(69) 서열번호 138의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 282의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(70) 서열번호 140의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 284의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(71) 서열번호 142의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 286의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(72) 서열번호 144의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 288의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
(73) 서열번호 289의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 290의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역; 및
(74) 서열번호 291의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 292의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변영역, 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역;
에서 선택된 중쇄 및 경쇄 가변영역을 가진다.
상기와 같은 본 발명에 따른 항체에는 항체의 단편도 포함한다. 본 발명에서의 항체의 단편은 FcRn에 대한 결합 기능을 보유한 단쇄 항체, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, Fab 단편, F(ab)2단편, Fd, scFv, 도메인 항체, 이중특이항체들, 미니바디, 스캡, IgD 항체, IgE 항체, IgM 항체, IgG1 항체, IgG2 항체, IgG3 항체, IgG4 항체, 항체 불변영역의 유도체들, 단백질 스캐폴드(protein scaffolds)에 기초한 인공항체 등이 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니며, FcRn에 대한 결합 기능이 유지되는 한, 본 발명에 따른 어떠한 형태의 항체의 단편도 본 발명에 따른 항체와 동일한 특성을 나타낼 것이라는 점은 통상의 기술자에게는 자명한 것이다.
또한 본 발명의 항체의 특성이 유지되는 한, 가변영역 내에서의 변이가 일어난 항체도 본 발명의 권리범위에 포함된다. 그러한 예로서 가변영역에서의 아미노산의 보존적 치환(conservative substitution)이 일어난 항체를 들 수 있다. 보존적 치환은 원래의 아미노산 서열과 유사한 특성을 가지는 다른 아미노산 잔기로의 치환을 의미하는데, 예를 들어 라이신, 아르기닌, 히스티딘은 염기 곁사슬을 가지고 있어 유사한 특성을 가지고, 아스파라틱산과 글루타믹산은 산 곁사슬을 가진다는 점에서 유사한 특성을 가진다. 또한, 글라이신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판은 비전하 극성 곁사슬을 가진다는 점에서 특성이 유사하며, 알라닌, 발린, 루신, 트레오닌, 아이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌은 비극성 곁사슬을 가지고 있다는 점에서, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘은 방향족 곁사슬을 가지고 있다는 점에서 유사한 특성을 가진다. 따라서, 상기와 같이 유사한 특성을 가지는 그룹 내에서의 아미노산 치환이 일어나더라도 별다른 특성 변화를 보이지 않을 것이라는 점은 통상의 기술자에게는 자명한 것이므로, 본 발명에 따른 항체의 특성이 유지되는 한, 가변영역 내에서의 보존적 치환에 의한 변이가 일어난 항체도 본 발명의 권리범위에 포함된다.
또한 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편은 다른 물질과 접합된 복합체(conjugate)의 형태로도 이용가능하다. 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편과 접합하여 이용할 수 있는 물질로는 통상적으로 자가면역질환의 치료에 이용되는 치료제 및 FcRn의 활성을 저해할 수 있는 물질, 또는 혈액, 혈청, 림프, 또는 기타 조직의 순환계 내에서 이의 안정화 및/또는 유지를 향상시키는 모이어티 (moiety)와 물리적으로 연결된다. 가령, FcRn-결합 항체는 중합체, 예를 들면, 폴리알킬렌폴리알킬렌 산화물 또는 폴리에틸렌 산화물과 같은 비-항원성 중합체와 연결될 수 있다. 적절한 중합체는 중량에 의해 실질적으로 변할 것이다. 대략 200 내지 대략 35,000 (또는 대략 1,000 내지 대략 15,000, 그리고 2,000 내지 대략 12,500) 범위의 수평균분자량 (molecular number average weight)을 갖는 중합체가 이용될 수 있다. 가령, FcRn-결합 항체는 물 가용성 중합체, 예를 들면, 친수성 폴리비닐 중합체, 예를 들면, 폴리비닐알코올과 폴리비닐피롤리돈에 접합될 수 있다. 이런 중합체의 무제한적 목록에는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 또는 폴리프로필렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌화된 폴리올과 같은 폴리알킬렌 산화물의 동종중합체, 공중합체, 그리고 이들의 블록 공중합체 등이 대표적인 예이지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 단서로써 이들 블록 공중합체의 물 용해도 (water solubility)가 유지되어야 한다.
본 발명에서는 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 상기 약학적 조성물에는 약학적으로 허용가능한 통상적인 담체 및 부형제 등이 추가적으로 포함될 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 본 발명에 따른 항체 등의 유효성분과 양립 가능하여야 하며, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 한 성분 또는 둘 이상의 성분을 혼합하여 사용할 수 있고, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형으로 제제화 할 수 있다. 또한 산제, 정제, 캡슐제, 액제, 주사제, 연고제, 시럽제 등의 다양한 형태로도 제제화되어 제공될 수 있으며 단위-투여량 또는 다-투여량 용기, 예를 들면 밀봉된 앰플 및 병 등의 형태로 제공될 수도 있다.
상기 약학적 조성물은 IgG와 FcRn에 의해 매개되는 모든 자가면역 질환에 적용될 수 있는데, 대표적인 질환으로는 면역성 호중구 감소증, 길랑바레 신드롬, 간질, 자가면역 대뇌 뇌염, 아이삭 신드롬, 모반 신드롬, 심상성 천포창, 낙엽성 천포창, 수포성류 천포창, 후천성 표피 수포증, 임신성 유사수포창, 뮤코스 막 유사수포창, 항인지질 신드롬, 자가면역 빈혈, 자가면역 그래이브 병, 굿파스튜어 증후군, 중증근무력증, 다발성경화증, 류마티스성 관절염, 루프스 및 특발성 혈소판 감소성 자반증(ITP) 등이 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 본 발명에 따른 항체 또는 그러한 항체의 단편을 치료가 필요한 개체에 투여하는 것을 포함하는 자가면역성 또는 동종 면역성 상태를 완화하는 방법을 제공하며, 동시에 특정의 항 FcRn 요법도 제공한다.
본 발명에 따른 자가면역성 또는 동종 면역성 상태를 완화하는 방법 또는 항 FcRn 요법은 본 발명에 따른 약학적 조성물을 개체에 투여함으로써 달성될 수 있는데, 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여가 가능하며, 구체적으로는 예를 들면, 구강, 정맥 내, 근육 내, 동맥 내, 골수 내, 경막 내, 심장 내, 경피, 피하, 복강 내, 장관, 설하 또는 국소 투여가 가능하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명에 따른 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하며, 본 기술 분야의 통상의 전문가가 용이하게 결정할 수 있는데, 단회 또는 반복 투여 할 수 있다. 일반적으로 1~200 mg/kg, 보다 바람직한 것은 1~40 mg/kg을 자가면역성 또는 동종 면역성 증상을 가지는 환자에게 투여할 수 있고, 이러한 투여 계획은 바람직한 것은 혈청 내인성 IgG 농도를 치료전의 값의 75% 미만에 줄이도록 설계할 수 있으며, 환자의 상태 등을 감안하여 간헐적 또는 만성적(계속적) 투약 방침을 적용할 수 있다.
본 발명에서는 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편을 포함하는 진단용 조성물 및 이를 이용한 진단방법을 제공한다. 즉, 본 발명에 따른 FcRn에 결합하고 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편은 시험관 내와 생체 내 진단적 유용성을 갖는다.
한 측면에서, 본 발명에서는 시험관내 또는 생체내에서 FcRn의 존재를 검출하기 위한 방법을 제공한다.
시험관내 검출 방법은 예를 들어 (1) 샘플을 FcRn-결합 항체와 접촉시키는 단계; (2) FcRn-결합 항체와 샘플 사이에 복합체의 형성을 검출하는 단계; 및/또는 (3) 참고 샘플 (가령, 대조 샘플)을 항체와 접촉시키는 단계; (4) 참고 샘플에서와 비교하여 항체와 샘플 사이에 복합체의 형성의 정도를 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 대조 샘플 또는 개체와 비교하여 샘플 또는 개체 내에 복합체의 형성에서 변화, 예를 들면, 통계학적으로 유의한 변화는 샘플 내에 FcRn의 존재를 의미할 수 있다.
생체 내 검출 방법은 (1) FcRn-결합 항체를 개체에 투여하는 단계; (2) FcRn-결합 항체와 개체 사이에 복합체의 형성을 검출하는 단계를 포함할 수 있다. 검출은 복합체 형성의 위치 또는 시점을 결정하는 것을 포함할 수 있다. FcRn-결합 항체는 결합된 또는 결합되지 않은 항체의 검출을 용이하게 하는 검출가능 물질로 직접적으로 또는 간접적으로 표지화될 수 있다. 적절한 검출가능 물질에는 다양한 효소, 보철 그룹, 형광 물질, 발광 물질 및 방사성 물질이 포함된다. FcRn-결합 항체와 FcRn 사이에 복합체 형성은 FcRn에 결합된 항체 또는 결합되지 않은 항체를 측정하거나 가시화시킴으로써 검출될 수 있다. 전통적인 검출 분석, 예를 들면, 효소-연결된 면역흡착 분석 (ELISA), 방사면역분석(radioimmunoassay, RIA) 또는 조직 면역조직화학(tissue immunohistochemistry)이 이용될 수 있다. FcRn-결합 항체의 표지화에 더하여, FcRn의 존재는 검출가능 물질로 표지화된 기준 및 표지화되지 않은 FcRn-결합 항체를 이용한 경쟁 면역분석(competition immunoassay)에 의해 샘플 내에서 분석될 수 있다. 이러한 분석의 한 가지 실례에서, 생물학적 샘플, 표지화된 기준, 그리고 FcRn-결합 항체가 결합되고, 그리고 표지화되지 않은 항체에 결합된 표지화된 기준의 양이 측정된다. 샘플 내에 FcRn의 양은 FcRn-결합 항체에 결합된 표지화된 기준의 양에 반비례한다.
진단 목적으로의 사용을 위해 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편은 형광단 또는 발색단으로 표지화 될 수 있다. 항체 및 다른 단백질이 대략 310 nm까지의 파장을 갖는 광을 흡수하기 때문에, 형광 모이어티는 310 nm 초과, 바람직하게는 400 nm 초과의 파장에서 실질적인 흡수를 갖도록 선택되어야 한다. 다양한 적절한 형광 물질과 발색단은 형광 발색단 군으로 표지화 될 수 있다. 형광 발색단 군 중에서 일군의 형광물질은 크산텐(xanthene) 염료인데, 여기에는 플루오레세인과 로다민이 포함된다. 다른 군의 형광 화합물은 나프틸아민(naphthylamine)이다. 형광단 또는 발색단으로 일단 표지화되면, 항체는 예로써, 형광 검경 (가령, 공초점 또는 디컨볼루션(deconvolution, 검경)을 이용하여 샘플 내에서 FcRn의 존재 또는 국지화를 검출하는데 이용될 수 있다.
본 발명에 따른 항체 또는 그 단편을 이용한 FcRn의 존재 또는 국지화 여부는 하기와 같은 다양한 방법을 통해 검출이 가능하다.
조직학적 분석 : 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편은 라벨(가령, 정제 또는 에피토프 태그)과 함께 합성되거나, 또는 예로써, 라벨 또는 라벨-결합 군을 접합함으로써 검출가능하게 표지화 될 수 있다. 항체는 이후, 조직 표본, 예를 들면, 현미경 슬라이드 위에 놓인 조직의 고정된 절단면에 접촉된다. 결합을 위한 배양후, 조직 표본은 결합되지 않은 항체를 제거하기 위하여 세척된다. 이후, 조직 표본은 항체가 조직 표본에 결합되는 지를 확인하기위하여 예로써, 검경을 이용하여 분석된다. 당연히, 항체는 결합 시점에 표지화되지 않을 수 있다. 결합과 세척후, 항체는 검출이 가능하도록 표지화된다.
단백질 어레이 : 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편은 단백질 어레이에 고정되어 이용될 수 있다. 단백질 어레이는 예로써, 의학 샘플 (가령, 분리된 세포, 혈액, 혈청, 생검 등)을 선별하기 위한 진단 도구로서 이용될 수 있다. 당연히, 단백질 어레이는 예로써, FcRn 또는 기타 표적 분자에 결합하는 다른 리간드 역시 포함할 수 있다. 어레이용 폴리펩티드는 상업적으로 가용한 로봇 장치(가령, Genetic MicroSystems 또는 BioRobotics로부터)를 이용하여 고속으로 뿌려질 수 있다. 어레이 기질은 예로써, 니트로셀룰로오스, 플라스틱, 유리, 예를 들면, 표면-변형된 유리일 수 있다. 어레이는 또한, 다공성 매트릭스, 예를 들면, 아크릴아미드, 아가로즈, 또는 다른 중합체를 포함할 수 있다.
FACS (형광 활성화된 세포 분류) : 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편은 세포, 예를 들면, 샘플(가령, 환자 샘플) 내에 세포를 표지화 하는데 이용될 수 있다. 항체는 또한, 형광 화합물에 부착될 수 있다. 세포는 이후, 형광활성화된 세포 분류기(가령, Becton Dickinson) 를 이용하여 분류될 수 있다. 세포가 분류기를 통과할 때, 레이저 빔이 형광 화합물을 흥분시키고, 검출기가 통과하는 세포를 계수하고 형광을 검출함으로써 형광 화합물이 세포에 부착되는 지를 결정한다. 각 세포에 결합된 라벨의 양은 샘플을 특성화하기 위하여 정량되고 분석될 수 있다.
본 발명에 따른 생체 내에서의 FcRn 또는 FcRn-발현 조직의 존재는 in vivo 화상검출 방법을 통해 확인될 수 있다. 상기 방법은 (1) 개체 (가령, 자가면역 질환 환자)에, 검출가능 마커에 접합된 항-FcRn 항체를 투여하는 단계; (ii) FcRn-발현 조직 또는 세포에 대한 검출가능 마커를 검출하기 위한 수단에 상기 개체를 노출시키는 단계를 포함한다. 가령, 개체는 예로써, NMR 또는 다른 단층촬영 수단에 의해 화상 진찰된다. 진단적 화상 진찰에 유용한 라벨의 예로는 방사성 라벨, 형광 라벨, 양전자 방출 동위원소(positron emitting isotope), 화학발광물질, 발광효소 등이 있다. 방사성 표지화된 항체는 시험관내 진단 검사에도 이용될 수 있다. 동위원소-표지화된 항체의 특이적인 활성은 반감기, 방사성 라벨의 동위원소 순도 (isotopic purity), 그리고 라벨이 항체 내로 통합되는 방법에 좌우된다.
본 발명은 또한, FcRn에 결합하는 항체, 그리고 진단적 용도, 예를 들면, 시험관내에서, 예를 들면, 샘플, 예를 들면, 자가면역 질환 환자로부터 생검 또는 세포 내에서, 또는 생체 내에서, 예를 들면, 개체를 화상 진찰함으로써 FcRn을 검출하기 위한, FcRn-결합 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 용도에 대한 사용설명서를 포함하는 키트를 제공한다. 상기 키트는 적어도 하나의 추가적인 시약, 예를 들면, 라벨 또는 추가의 진단제를 더욱 포함할수 있다. 생체내 이용의 경우에, 항체는 제약학적 조성물로서 조제될 수 있다.
또한 본 발명에서는 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편의 가변영역을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 제공한다.
구체적으로 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편의 중쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 2 내지 144 사이에서 짝수번호로 이루어진 그룹(예를 들면, 2, 4, 66, 128 등)에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열, 서열번호 289 또는 서열번호 291 번에 기재된 아미노산 서열 에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 FcRn 특이적 항체의 중쇄 가변영역 중 어느 하나, 또는 그러한 중쇄 가변영역과 90%, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 중쇄 가변영역을 코딩하는 서열이며,
본 발명에 따른 항체 또는 그 단편의 경쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 146 내지 288에서 짝수 번호로 이루어진 그룹(예를 들면, 148, 196, 244, 266 등)에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열, 서열번호 290 또는 서열번호 292 번에 기재된 아미노산 서열 에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 FcRn 특이적 항체의 경쇄 가변영역 중 어느 하나, 또는 그러한 경쇄 가변영역과 90%, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 경쇄 가변영역을 코딩하는 서열이다.
바람직하게는 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편의 중쇄 가변영역을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 1 내지 143번 사이의 홀수번호로 이루어진 그룹(예를 들면, 1, 3, 87, 121 등)에서 선택되는 어느 하나, 또는 이와 90%, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지며, 경쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 145 내지 287번 사이의 홀수번호로 이루어진 그룹(예를 들면, 147, 193, 267, 283 등)에서 선택되는 어느 하나, 또는 이와 90%, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가진다.
보다 바람직하게는 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편의 중쇄 및 경쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은
(1) 서열번호 1 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열, 및 서열번호 145 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열;
(2) 서열번호 3 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열, 및 서열번호 147 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열;
(3) 서열번호 5 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열, 및 서열번호 149 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열;
(4) 서열번호 7 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열, 및 서열번호 151 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열;
(5) 서열번호 9 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열, 및 서열번호 153 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열;
(6) 서열번호 11 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열, 및 서열번호 155 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열;
(7 서열번호 13 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열, 및 서열번호 157 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열; 및
(8) 서열번호 15 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열, 및 서열번호 159 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열;
(9) 서열번호 17 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열, 및 서열번호 161 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열;
(10) 서열번호 19 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열, 및 서열번호 163 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열;
(11) 서열번호 21 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열, 및 서열번호 165 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열;
(12) 서열번호 23 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열, 및 서열번호 167 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열;
(13) 서열번호 25 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열, 및 서열번호 169 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열;
(14) 서열번호 27 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열, 및 서열번호 171 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열;
(15) 서열번호 29 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열, 및 서열번호 173 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열;
(16) 서열번호 31 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열, 및 서열번호 175 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열;
(17) 서열번호 33 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열, 및 서열번호 177 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열;
(18) 서열번호 35 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열, 및 서열번호 179 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열;
(19) 서열번호 37 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열, 및 서열번호 181 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열;
(20) 서열번호 39 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열, 및 서열번호 183 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열;
(21) 서열번호 41 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열, 및 서열번호 185 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열;
(22) 서열번호 43 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열, 및 서열번호 187 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열;
(23) 서열번호 45 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열, 및 서열번호 189 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열;
(24) 서열번호 47 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열, 및 서열번호 191 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열;
(25) 서열번호 49 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열, 및 서열번호 193 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열;
(26) 서열번호 51 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열, 및 서열번호 195 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열;
(27) 서열번호 53 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열, 및 서열번호 197 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열;
(28) 서열번호 55 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열, 및 서열번호 199 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열;
(29) 서열번호 57 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열, 및 서열번호 201 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열;
(30) 서열번호 59 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열, 및 서열번호 203 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열;
(31) 서열번호 61 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열, 및 서열번호 205 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열;
(32) 서열번호 63 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열, 및 서열번호 207 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열;
(33) 서열번호 65 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열, 및 서열번호 209 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열;
(34) 서열번호 67 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열, 및 서열번호 211 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열;
(35) 서열번호 69 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열, 및 서열번호 213 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열;
(36) 서열번호 71 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열, 및 서열번호 215 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열;
(37) 서열번호 73 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열, 및 서열번호 217 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열;
(38) 서열번호 75 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열, 및 서열번호 219 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열;
(39) 서열번호 77 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열, 및 서열번호 221 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열;
(40) 서열번호 79 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열, 및 서열번호 223 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열;
(41) 서열번호 81 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열, 및 서열번호 225 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열;
(42) 서열번호 83 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열, 및 서열번호 227 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열;
(43) 서열번호 85 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열, 및 서열번호 229 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열;
(44) 서열번호 87 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열, 및 서열번호 231 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열;
(45) 서열번호 89 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열, 및 서열번호 233 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열;
(46) 서열번호 91 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열, 및 서열번호 235 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열;
(47) 서열번호 93 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열, 및 서열번호 237 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열;
(48) 서열번호 95 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열, 및 서열번호 239 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열;
(49) 서열번호 97 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열, 및 서열번호 241 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열;
(50) 서열번호 99 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열, 및 서열번호 243 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열;
(51) 서열번호 101 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열, 및 서열번호 245 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열;
(52) 서열번호 103 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열, 및 서열번호 247 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열;
(53) 서열번호 105 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열, 및 서열번호 249 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열;
(54) 서열번호 107 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열, 및 서열번호 251 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열;
(55) 서열번호 109 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열, 및 서열번호 253 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열;
(56) 서열번호 111 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열, 및 서열번호 255 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열;
(57) 서열번호 113 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열, 및 서열번호 257 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열;
(58) 서열번호 115 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열, 및 서열번호 259 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열;
(59) 서열번호 117 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열, 및 서열번호 261 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열;
(60) 서열번호 119 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열, 및 서열번호 263 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열;
(61) 서열번호 121 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열, 및 서열번호 265 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열;
(62) 서열번호 123 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열, 및 서열번호 267 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열;
(63) 서열번호 125 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열, 및 서열번호 269 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열;
(64) 서열번호 127 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열, 및 서열번호 271 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열;
(65) 서열번호 129 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열, 및 서열번호 273 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열;
(66) 서열번호 131 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열, 및 서열번호 275 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열;
(67) 서열번호 133 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열, 및 서열번호 277 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열;
(68) 서열번호 135 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열, 및 서열번호 279 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열;
(69) 서열번호 137 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열, 및 서열번호 281 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열;
(70) 서열번호 139 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열, 및 서열번호 283 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열;
(71) 서열번호 141 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열, 및 서열번호 285 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열; 및
(72) 서열번호 143 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열, 및 서열번호 287 또는 이와 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상의 서열상동성을 가지는 서열;
에서 선택될 수 있다.
본 발명은 상기 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 벡터 및 이를 포함하는 숙주세포, 그리고 상기 재조합 벡터 또는 숙주세포를 이용하여 본 발명에 따른 FcRn에 특이적으로 결합하는 항체를 제조하는 방법을 제공한다. 특히 유전자 재조합 방법으로 발현 및 정제하여 제조하는 것이 바람직한데, 구체적으로 본 발명에 따른 FcRn에 특이적으로 결합하는 항체를 코딩하는 가변영역을 각각 따로, 또는 하나의 숙주세포에서 동시에 발현시켜서 제조하는 것이 바람직하다.
본 발명에서 "재조합 벡터"란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 발현 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다. 본 발명에서 "작동가능하게 연결된(operably linked)"는 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 말한다. 재조합 벡터와의 작동적 연결은 본 발명이 속하는 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용하여 용이하게 수행할 수 있다
본 발명에서 사용될 수 있는 적합한 발현 벡터는 프로모터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서(enhancer) 같은 발현 조절 엘리먼트 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열을 포함할 수 있다. 개시 코돈 및 종결 코돈은 일반적으로 면역원성 표적 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 일부로 간주되며, 유전자 작제물이 투여되었을 때 개체에서 반드시 작용을 나타내야 하며 코딩 서열과 인프레임(in frame)에 있어야 한다. 일반 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 원핵세포에는 lac, tac, T3 및 T7 프로모터가 있으나 이로 제한되지는 않는다. 진핵세포에는 원숭이 바이러스 40(SV40), 마우스 유방 종양 바이러스(MMTV) 프로모터, 사람 면역 결핍 바이러스(HIV), 예를 들면 HIV의 긴 말단 반복부(LTR) 프로모터, 몰로니 바이러스, 시토메갈로바이러스(CMV), 엡스타인 바 바이러스(EBV), 로우스 사코마 바이러스(RSV) 프로모터뿐만 아니라, -액틴 프로모터, 사람 헤로글로빈, 사람 근육 크레아틴, 사람 메탈로티오네인 유래의 프로모터가 있으나 이것으로 제한되지는 않는다. 상기 발현 벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택성 마커를 포함할 수 있다. 선택마커는 벡터로 형질감염된 세포를 선별하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있다. 선택제(selective agent)가 처리된 환경에서 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하므로 형질 감염된 세포가 선별 가능하다. 또한, 벡터는 복제가능한 발현벡터인 경우, 복제가 개시되는 특정 핵산 서열인 복제원점(replication origin)을 포함할 수 있다. 재조합 발현 벡터로는 플라스미드, 바이러스, 코즈미드 등 다양한 형태의 벡터를 사용할 수 있다. 재조합 벡터의 종류는 원핵세포 및 진핵세포의 각종 숙주세포에서 원하는 유전자를 발현하고 원하는 단백질을 생산하는 기능을 하는 한 특별히 한정되지 않지만, 강력한 활성을 나타내는 프로모터와 강한 발현력을 보유하면서 자연 상태와 유사한 형태의 외래 단백질을 대량으로 생산할 수 있는 벡터가 바람직하다.
본 발명에 따른 항체 또는 항체 단편을 발현시키기 위해 다양한 발현 숙주/벡터의 조합이 이용될 수 있다. 진핵숙주에 적합한 발현 벡터로는 SV40, 소 유두종바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스(adeno-associated virus), 시토메갈로바이러스 및 레트로바이러스로부터 유래된 발현 조절 서열 등이 사용될 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니다. 세균 숙주에 사용할 수 있는 발현 벡터에는 pET, pRSET, pBluescript, pGEX2T, pUC벡터, col E1, pCR1, pBR322, pMB9 및 이들의 유도체와 같이 대장균(Escherichia coli)에서 얻어지는 세균성 플라스미드, RP4와 같이 보다 넓은 숙주 범위를 갖는 플라스미드, gt10과 gt11, NM989와 같은 매우 다양한 파지 람다(phage lambda) 유도체로 예시될 수 있는 파지 DNA, 및 M13과 필라멘트성 단일가닥의 DNA 파지와 같은 기타 다른 DNA 파지가 포함된다. 효모 세포에 유용한 발현 벡터는 2m플라스미드 및 그의 유도체이다. 곤충 세포에 유용한 벡터는 pVL941이다.
상기 재조합 벡터는 숙주세포에 삽입되어 형질감염체를 형성하는데, 적합한 숙주세포는 대장균, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스 속 (Streptomyces sp.), 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis) 또는 스타필로코쿠스 속(Staphylococcus sp.)과 같은 원핵 세포일 수 있다. 또한, 아스페르길러스 속(Aspergillus sp.)과 같은 진균, 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마세스 속(Schizosaccharomyces sp.) 및 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa)와 같은 효모, 그 밖의 하등진핵 세포, 및 곤충으로부터의 세포와 같은 고등 진핵생물의 세포와 같은 진핵 세포일 수 있다.
또한 상기 숙주세포는 바람직하게는 식물, 포유동물로부터 유래할 수 있는데, 원숭이 신장 세포7(COS7 : monkey kidney cells) 세포, NSO 세포, SP2/0, 차이니즈 햄스터 난소(CHO : chinese hamster ovary) 세포, W138, 어린 햄스터 신장(BHK : baby hamster kidney)세포, MDCK, 골수종 세포주, HuT 78 세포 및 HEK293 세포 등이 이용가능하며, 이에 한정되지 않는다. 특히 바람직하게는 CHO 세포이다.
본 발명에서 숙주세포로의 형질감염 또는 형질전환"은 핵산을 유기체, 세포, 조직 또는 기관에 도입하는 어떤 방법도 포함되며 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주 세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 이런 방법에는 전기충격 유전자 전달법(electroporation), 원형질 융합, 인산 칼슘(CaPO4)침전, 염화 칼슘(CaCl2)침전, 실리콘 카바이드 섬유 이용한 교반, 아그로 박테리아 매개된 형질감염, PEG, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질감염 방법 등이 포함되나 이에 제한되지 않는다.
재조합 벡터가 발현되는 형질 감염체를 영양배지에서 배양함으로써 본 발명에 따른 FcRn 특이적 항체를 대량으로 생산할 수 있으며, 배지와 배양조건은 숙주 세포에 따라 관용되는 것을 적당히 선택 이용할 수 있다. 배양시 세포의 생육과 단백질의 대량 생산에 적합하도록 온도, 배지의 pH 및 배양시간 등의 조건들을 적절하게 조절할 수 있다. 상기와 같이 재조합적으로 생산된 항체 또는 항체 단편은 배지 또는 세포 분해물로부터 회수될 수 있으며, 통상적인 생화학 분리 기술에 의해서 분리, 정제가 가능하다(Sambrook et al., Molecular Cloning: A laborarory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989); Deuscher, M., Guide to Protein Purification Methods Enzymology, Vol. 182. Academic Press. Inc., San Diego, CA(1990)). 이에는 전기영동, 원심분리, 겔여과, 침전, 투석, 크로마토그래피(이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 면역흡착 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피 등), 등전점 포커싱 및 이의 다양한 변화 및 복합 방법 등이 이용가능하지만 이에 한정되지 않으며, 특히 프로테인 A(Protein A)를 이용하여 분리, 정제하는 것이 바람직하다.
본 발명에서 제공되는 IgG에 고친화성을 갖는 수용체인 FcRn에 특이적인 인간 항체는 높은 친화도(affinity) 및 특이성(specificity)을 가지고 있으며, 면역원성으로 인한 문제가 거의 없고, FcRn에 IgG 등과 비경합적으로 결합하여 혈중 내 병인성 자가항체(auto-antibody)의 양을 감소시키는 특성을 가지고 있어 자가면역질환의 치료 및 진단에 매우 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 인간 FcRn 중 FcRn에만 결합하고 2m에는 결합하지 않는 항체 가변 영역(variable domain)의 선별결과를 나타내는 도면으로, 인간항체 cDNA 라이브러리로 제작된 phage를 FcRn(heavy chain), 2m, -Myc이 결합된 96-웰 플레이트(well plate)에 처리하여 ELISA 방법에 의해 pH6.0과 pH7.4에서 FcRn(heavy chain)에는 결합하고 2m에는 결합하지 않는 파지(phage)를 패닝(panning)한 결과를 나타낸다.
도 2는 선별(hit)된 항체의 세포 표면(cell surface) 인간 FcRn(hFcRn)에 대한 결합(binding)능을 나타내는 도면으로, 세포표면에 존재하는 인간 FcRn에 결합하는 선별된 8종의 항체를 인간 FcRn이 과발현되는 HEK293 세포에 처리하여 pH 6.0과 pH7.4에서 세포표면 FcRn에 결합하는 항체를 확인한 결과이다. 항체와 FcRn과의 결합은 항체를 각 pH에서 세포에 처리한 후 Alexa488 표지(labeled)된 항-인간 염소 항체(anti-human goat antibody)를 사용하여 형광 활성화 세포 분류기(Flurescent activated cell sorter, FACS) 분석을 통해 확인하였으며, 선별된 항체의 세포표면 결합능에 대한 결과는 인간 IgG1(hIgG1)의 MFI를 기준으로 상대적인 값으로 표현하였다.
도 3은 세포표면 인간 FcRn에 결합하는 선별된 항체가 인간 FcRn에 대한 인간 IgG의 결합을 저해할 수 있는지를 세포수준에서 관찰한 결과를 나타내는 도면으로, 인간 FcRn이 과발현되는 HEK293 세포에 결합하는 것이 확인된 8종의 선별된 항체 및 표지되지 않은 인간 IgG1 250 nM, 500 nM 및 1000 nM을 처리하여 Alexa488 표지된 인간 IgG1의 세포표면 결합능 감소로 저해능력을 확인하였다.
도 4는 인간 FcRn에 결합하는 항체가 다른 종의 FcRn에도 결합하는지 여부를 마우스(mouse), 랫(rat) 및 원숭이(monkey)에 대한 교차반응성(cross-reactivity)을 통해 확인한 결과를 나타내는 도면으로, 마우스, 랫, 원숭이 FcRn이 과발현되는 세포주 NIH3T3L1, Rat-2, Cos7 세포 각각에 각 종의 IgG 항체를 처리하고, 각 종의 항체를 인지하는 FITC 표지된 항-마우스, 항-랫, 항-인간 염소 항체를 처리하여 세포표면에 결합된 각 종의 항체 형광값을 FACS로 분석한 결과이다. 형광의 세기는 인간 IgG1의 MFI를 기준으로 3종의 선별된 항체, 항-마우스, 항-랫 FcRn 항체 및 사이노몰구스(cynomolgus) IgG 항체의 MFI 값을 상대적인 비율로 나타내었다.
도 5는 인간 FcRn이 발현되는 형질감염 마우스(transgenic mouse)인 Tg276(hFcRn+/+, h2m+/+, mFcRn-/-, m2m-/-)에서 선별된 항체인 HL161_1A, HL161_11G 항체가 hIgG1의 이화작용(catabolism)에 미치는 영향을 확인한 결과를 나타내는 도면으로, 5 mg/kg의 바이오티닐레이트(Biotinylated)된 인간 IgG1을 Tg276 마우스에 복강주사(IP injection)하고, 주사 24, 48, 72, 96 시간 후 10 mg/kg의 인간 IgG1, HL161_1A, HL161_11H 또는 PBS를 복강주사하여 수득한 결과이다. 시료채취는 Biotin-IgG의 투여 후 6, 12, 24, 48, 72, 96, 120, 168시간 후에 진행하였으며, 24, 48, 72, 96 시간에는 약물 투여전 채혈을 하여 ELISA 방법으로 Biotin-IgG의 잔존량을 확인하였다. 결과는 6시간 채혈 샘플의 잔존량을 100%로 하여 각 시간대의 잔존량을 상대적인 비율로 나타내었다.
도 6은 친화도 개선(Affinity maturation)을 위하여 HL161-1A 및 HL161-11H의 scFV 형태의 항체 단편을 코딩하는 유전자를 클로닝한 pComb3X 벡터(vector)의 모식도이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다.
Part I. FcRn 특이적 인간 항체의 개발
실시예 1. 수용성( soluble ) FcRn 발현벡터 제작
FcRn은 막간 고정된(transmembrane anchored) -중쇄(heavy chain, FcRn)와 쇄(2m)가 비공유결합(non-covalently)으로 연결된 이종이형체 단백질(heterodimeric protein)이다. 따라서 수용성 FcRn의 발현벡터 제작은 다위치 게이트웨이 시스템(multisite gateway system)을 이용하여 두 가지 유전자를 하나의 발현 벡터로 제작하고자 하였다. 인간 성장 호르몬(human growth hormone)의 신호서열을 가진 FcRn과 2m 유전자에 각각 FcRn 5말단 Nhe/3말단 Xho 이며, 2m 5말단 Nhe/3말단 Xba의 제한효소 서열을 부가한 표 1에 기재된 프라이머(primer)를 사용 PCR 방법으로 유전자 증폭 후 증폭 산물을 pcDNA3.1(+) 벡터에 클로닝 하였다.
구체적으로, 한국생명공학연구원로부터 구입한 클론(clone) (FcRn : hMU008093/B2m : hMU005156)으로부터 플라스미드(plasmid) DNA를 추출하여 사용하였다. 2 l 200 ng 주형(template), 2 l 10 pmole N-프라이머, 2 l 10 pmole C-프라이머, 25 l 2X 솔전트 혼합물(Solgent mixture), 19 l 증류수를 넣어 50 l의 반응 용액을 만들었다.
PCR 반응은 1차 변성 95 2분, 2차변성 95 20초, 프라이머 접합 60 40초, 신장 반응 72 1분 과정 중 2차 변성에서 신장 반응까지 25회 반복하여 진행시킨 다음 최종 효소반응을 72 5분으로 진행하였다. hGH 신호서열 증폭도 같은 조성으로 진행하였으며, 매회 PCR 반응이 끝나면 아가로스 젤(agarose gel) 상의 PCR 밴드로부터 DNA 추출하여 그 다음 PCR 반응의 주형으로 사용하였다. hGH 리더(leader) FcRn 유전자 증폭 산물은 Nhe 및 Xho 효소로, hGH 리더 2m 유전자 증폭 산물은 Nhe 및 Xba 효소로 37에서 4시간 이상, pcDNA3.1(+) 벡터도 Nhe/Xho과 Nhe/Xba효소로 각각 37에서 4시간 이상 처리후에 전기영동 하였다. 아가로스 젤 상에서 크기가 확인된 DNA 절편 밴드는 아가로스 젤 추출 키트(agarose gel extraction kit)를 사용하여 DNA 절편을 회수하였다. 해당 DNA 절편과 벡터 절편은 1:5의 비율로 총 10 ul가 되도록 혼합하여 10 l NEB 리가제 버퍼(ligase buffer), 1 l 리가제를 첨가하여 실온에서 2시간 인큐베이션(incubation)하였다. 라이게이션 혼합물(Ligation mixture)에서 5 l 를 DH5 컴피턴트 세포(competent cell)에 넣어 42에서 1분간 열충격(heat shock) 처리하여 형질전환하고 앰피실린(ampicillin)이 포함된 LB 고체 배지에서 정치 배양하여 콜로니(colony)를 확보하였다. 이 콜로니를 앰피실린이 포함된 LB 액체 배지에서 37 24시간 배양한 후 플라스미드 DNA를 분리하여 DNA 염기서열 분석을 통해 천연 리더 FcRn, hGH 리더 FcRn, 천연 리더 2m, hGH 리더 2m 유전자 각각이 pcDNA3.1(+) 삽입되었음을 확인하였다.
Jump-InTM패스트 게이트웨이 클로닝 키트(fast gateway cloning kit)를 이용하여 제조사의 사용방법에 따라 pcDNA3.1(+) 벡터에 클로닝된 두 가지의 플라스미드 DNA를 주형으로 하여 5 말단 및 3말단에 attB 부위(site)가 삽입된 PCR 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. 이 과정을 통해 pJTITMFastDEST벡터에는 hGH 리더 FcRn/2m이 삽입된 최종 발현벡터가 제작되었다. 제작된 발현벡터는 유전자 분석을 통해 염기서열을 확인 하였다.
Part I. FcRn 특이적 인간 항체의 개발
실시예 1. 수용성(soluble) FcRn 발현벡터 제작
FcRn은 막간 고정된(transmembrane anchored) -중쇄(heavy chain, FcRn)와 쇄(2m)가 비공유결합(non-covalently)으로 연결된 이종이형체 단백질(heterodimeric protein)이다. 따라서 수용성 FcRn의 발현벡터 제작은 다위치 게이트웨이 시스템(multisite gateway system)을 이용하여 두 가지 유전자를 하나의 발현 벡터로 제작하고자 하였다. 인간 성장 호르몬(human growth hormone)의 신호서열을 가진 FcRn과 2m 유전자에 각각 FcRn 5말단 Nhe/3말단 Xho 이며, 2m 5말단 Nhe/3말단 Xba의 제한효소 서열을 부가한 표 1에 기재된 프라이머(primer)를 사용 PCR 방법으로 유전자 증폭 후 증폭 산물을 pcDNA3.1(+) 벡터에 클로닝 하였다.
구체적으로, 한국생명공학연구원로부터 구입한 클론(clone) (FcRn : hMU008093/B2m : hMU005156)으로부터 플라스미드(plasmid) DNA를 추출하여 사용하였다. 2 l 200 ng 주형(template), 2 l 10 pmole N-프라이머, 2 l 10 pmole C-프라이머, 25 l 2X 솔전트 혼합물(Solgent mixture), 19 l 증류수를 넣어 50 l의 반응 용액을 만들었다.
PCR 반응은 1차 변성 95 2분, 2차변성 95 20초, 프라이머 접합 60 40초, 신장 반응 72 1분 과정 중 2차 변성에서 신장 반응까지 25회 반복하여 진행시킨 다음 최종 효소반응을 72 5분으로 진행하였다. hGH 신호서열 증폭도 같은 조성으로 진행하였으며, 매회 PCR 반응이 끝나면 아가로스 젤(agarose gel) 상의 PCR 밴드로부터 DNA 추출하여 그 다음 PCR 반응의 주형으로 사용하였다. hGH 리더(leader) FcRn 유전자 증폭 산물은 Nhe 및 Xho 효소로, hGH 리더 2m 유전자 증폭 산물은 Nhe 및 Xba 효소로 37에서 4시간 이상, pcDNA3.1(+) 벡터도 Nhe/Xho과 Nhe/Xba효소로 각각 37에서 4시간 이상 처리후에 전기영동 하였다. 아가로스 젤 상에서 크기가 확인된 DNA 절편 밴드는 아가로스 젤 추출 키트(agarose gel extraction kit)를 사용하여 DNA 절편을 회수하였다. 해당 DNA 절편과 벡터 절편은 1:5의 비율로 총 10 ul가 되도록 혼합하여 10 l NEB 리가제 버퍼(ligase buffer), 1 l 리가제를 첨가하여 실온에서 2시간 인큐베이션(incubation)하였다. 라이게이션 혼합물(Ligation mixture)에서 5 l 를 DH5 컴피턴트 세포(competent cell)에 넣어 42에서 1분간 열충격(heat shock) 처리하여 형질전환하고 앰피실린(ampicillin)이 포함된 LB 고체 배지에서 정치 배양하여 콜로니(colony)를 확보하였다. 이 콜로니를 앰피실린이 포함된 LB 액체 배지에서 37 24시간 배양한 후 플라스미드 DNA를 분리하여 DNA 염기서열 분석을 통해 천연 리더 FcRn, hGH 리더 FcRn, 천연 리더 2m, hGH 리더 2m 유전자 각각이 pcDNA3.1(+) 삽입되었음을 확인하였다.
Jump-InTM패스트 게이트웨이 클로닝 키트(fast gateway cloning kit)를 이용하여 제조사의 사용방법에 따라 pcDNA3.1(+) 벡터에 클로닝된 두 가지의 플라스미드 DNA를 주형으로 하여 5 말단 및 3말단에 attB 부위(site)가 삽입된 PCR 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. 이 과정을 통해 pJTITMFastDEST벡터에는 hGH 리더 FcRn/2m이 삽입된 최종 발현벡터가 제작되었다. 제작된 발현벡터는 유전자 분석을 통해 염기서열을 확인하였다.
벡터제작에 사용된 프라이머 서열
Forward-primer Reverse-primer
Common primer Leader sequence 1st 5-CTCTGCCTGCCCTGGCTTCAAGAGGGCAGTGCC-3
2nd 5-TGGCTTTTGGCCTGCTCTGCCTGCCCTGGCTTCAAG-3
3rd 5-GGACGTCCCTGCTCCTGGCTTTTGGCCTGCTCTGCC-3
4th 5-ACCATGGCTACAGGCTCCCGGACGTCCCTGCTCCTGGCT-3
Human FcRn Soluble FcRn FcRn 5-TTC AAG AGG GCA GTG CCG CAG AAA GCC ACC TCT CCC TC-3 5-GCT CGA GTC AGG CGG TGG CTG GAA TC-3
2M 5-TTC AAG AGG GCA GTG CCA TCC AGC GTA CTC CAA AGA TT-3 5-GTC TAG ATT ACA TGT CTC GAT CCC ACT T-3
Full length FcRn FcRn 5-GGC TAG CAT GGG GGT CCC GCG-3 5-GCT CGA GTC AGG CGG TGG CTG GAA TC-3
2M 5-GGC TAG CAT GTC TCG CTC CGT GGC C-3 5-GTC TAG ATT ACA TGT CTC GAT CCC ACT T-3
Mouse
FcRn		 Full length FcRn FcRn 5-GGG TAC CAT GGG GAT GCC ACT GCC-3 5-GCT CGA GTC AGG AAG TGG CTG GAA A-3
2M 5-GGG TAC CAT GGC TCG CTC GGT GAC-3 5-GCT CGA GTC ACA TGT CTC GAT CCC A-3
Rat
FcRn		 Full length FcRn FcRn 5-GGG TAC CAT GGG GAT GTC CCA GCC-3 5-GCT CGA GTC AGG AAG TGG CCG GAA A-3
2M 5-GGG TAC CAT GGC TCG CTC GGT GAC-3 5-GCT CGA GTT ACA TGT CTC GGT CCC AG-3
Monkey FcRn Full length FcRn FcRn 5-GGG ATC CAT GAG GGT CCC GCG G-3 5-GCT CGA GTC AGG CAG TGG CTG GG-3
2M 5-GGG TAC CAT GTC TCC CTC AGT GGC-3 5-GCT CGA GTT ACA TGT CTC GAT CCC A-3
Common primer pJTITMFASTDEST vector FcRn 5-GGG GAC AAG TTT GTA CAA AAA AGC AGG CTC CGT TGA CAT TGA TTA TTG ACT AGT T-3 5-GGG GAC AAC TTT TGT ATA CAA AGT TGT CCA TAG AGC CCA CCG CAT CCC CAG-3
2M 5-GGG GAC AAC TTT GTA TAC AAA AGT TGC CGT TGA CAT TGA TTA TTG ACT AGT T-3 5-GGG GAC CAC TTT GTA CAA GAA AGC TGG GTA CCA TAG AGC CCA CCG CAT CCC CAG-3
실시예 2. 수용성 FcRn 발현 세포주 제작
형질감염(transfection)에 사용할 플라스미드 DNA는 높은 농도와 순도를 가져야 하므로 QIAGEN 플라스미드 정제(plasmid purification)를 진행하여 준비하였다. 유전자 서열 분석을 통해 확인 hGH leader FcRn pJTITMFastDEST 벡터의 박테리아 클론(bacterial clone)을 앰피실린이 포함된 100 ml LB 플라스크(flask)에 접종하였다. 박테리아 세포를 3600 rpm으로 15분간 원심분리하여 회수하였다. 배지(media) 제거 후, 10 ml P1 용액을 혼합한 뒤 보텍싱(vortexing)을 통해 펠릿(pellet)을 완전히 풀어준 후, 10 ml P2 용액을 첨가하여 부드럽게 5회 인버팅(inverting)하여 실온에서 5분간 인큐베이션하였다. 그 다음 10 ml P3 용액을 첨가하여 5회 인버팅 한 뒤 ice에서 30분 인큐베이션하였다. 인큐베이션이 끝나면 4 15,000 rpm으로 30분간 원심분리하였다. 상등액(Supernatant)을 새로운 50 ml 원심분리용 튜브(centrifuge tube)에 옮긴 뒤, 추가로 15분간 원심분리하였다. 10 ml QBT 용액으로 평형화(equilibrium)시킨 컬럼(column)에 상등액을 로딩하였다. 중력에 의해 용액의 로딩이 끝나면 30 ml QC 용액으로 2회 세척(washing)하였다. 컬럼 밑에 50 ml 원심분리용 튜브를 위치시킨 뒤, 15 ml QF 용액으로 용출(elution)하였다. 용출(eluent) 용액에 10.5 ml 이소프로판올(isopropanol) 용액을 혼합하여 4 15,000 rpm 30분간 원심분리하였다. DNA 펠릿을 육안으로 확인 후 조심스럽게 상등액을 제거해주고 5 ml 70% 에탄올을 첨가하여 15분간 원심분리한 후, 펠릿이 떨어지지 않게 상등액을 제거한 뒤 LAR 수(LAR water) 150 l로 펠릿을 녹였다. 펠릿이 다 녹으면 0.22 m 필터로 여과시켰다. 나노드롭(Nanodrop) 기기를 이용하여 DNA 농도를 확인하며, 순도는 A260 값이 0.1~1.0 사이면 형질감염용 DNA로 사용할 수 있다.
형질감염 과정 24시간 전에 6~7 X 105 cells/ml로 접종하여 준비하였다. 24시간이 지나면 세포 생존도(cell viability) 및 세포수를 측정하였다. 세포의 클럼프(clump)를 제거하기 위해 측정된 부피만큼 50 ml 튜브에 옮겨 20에서 30초간 보텍싱 해준다. 총 28 ml의 배지에 3 X 107viable cell이 되도록 새로운 플라스크에 옮겨준다.
hGH 리더 서열(leader sequence)을 가진 FcRn DEST 벡터와 phiC31 인테그라제(integrase) 벡터 각각 20 g을 OptiMEM 배지 1 ml에 희석하였다. 이어서 293 펙틴(Fectin) 80 g을 OptiMEM배지 1 ml에 희석 후, 실온에서 5분간 방치하였다. 방치 시간이 5분 이상이 되면 펙틴의 활성이 감소하므로 오랜 시간 방치하지 않도록 하였다. 방치 시간이 끝나면 각 1 ml의 희석 용액을 혼합하여 DNA와 펙틴이 복합체(complex)를 이룰 수 있도록 실온에서 30분간 방치하였다. 혼합액의 방치 시간이 끝나면 3 X 107viablecells이 들어있는 플라스크에 넣어주었다. 8% CO2,37 인큐베이터 안의 오비탈 진탕기(orbital shaker)에 플라스크를 장착 후, 125rpm으로 진탕(shaking)하였다. 형질감염 진행 24시간 후에 신선한(fresh) 293 배지로 배지를 교환하여 배양하였다.
FcRn 발현벡터가 크로모좀에 영구히 통합(integration)된 세포를 선택적으로 선별하기 위한 과정을 통해 통합 되지 않은 세포를 선택적으로 죽임으로써, 세포수 대비 발현량을 증대시킬 수 있었다. 형질감염 48시간 후에 Hygromycin B를 첨가하여 선별(selection)을 시작하였다. 3일 배양에 1회로 배지 교환 및 항생제 처리를 진행하였고, 시간에 따른 세포 생존도 및 세포수를 계수(counting)하여 분석하여 발현세포주를 제작하였다.
제작된 FcRn 안정된 세포주(stable cell line)의 발현 확인은 FcRn과 2m에 대한 1차 항체(primary antibody)를 사용하여 웨스턴 블라팅(western blotting) 분석으로 진행하였다. 정량분석은 상업적으로 판매되고 있는 인간 2-마이그로클로불린(human 2-microglobulin)을 스탠다드(standard)로 사용하였으며 이미지(image) 분석을 통해 결과를 분석하였다.
FcRn 안정된 세포주 배양 과정 중의 배지를 채취(sampling)하여, 15,000rpm에서 10분간 원심분리하였다. 20 l의 상층액을 옮겨 5 X 환원성 샘플 로딩 염료(reducing sample loading dye) 4 l를 넣어 95에서 5분간 방치하였다. 이렇게 준비된 샘플을 12% NuPAGE Bis-Tris gel에 12 l를 로딩하였다. 인간 2-마이그로클로불린 스탠다드 물질은 5 ng 및 10 ng으로 로딩하였다. PAGE gel은 250 volt에서 35분간 런닝(running)하였으며, 30 volt에서 90분간 PVDF 멤브레인(membrane)으로 트랜스퍼(transfer)하였다. 블로킹(Blocking)는 10% 스킴 밀크(skim milk)로 1시간 진행하였다. FcRn 및 2m에 대한 1차 항체는 각각 TBST 용액에 1:1,000로 희석하여 실온에서 1시간 인큐베이션하였으며, 2차 항체(secondary antibody)는 TBST 용액에 1:5,000으로 희석하여 실온에서 30분간 인큐베이션하였다. 이후 TBST용액으로 30분 이상 세척하였다. ECL solution A와 B를 1:1로 혼합하여 멤브레인에 뿌린 뒤, 1분간 반응시켰다. 매 10초씩 수동 증가분(manual increasement)으로 발색시키고, 결과는 이미지 분석으로 진행하였다.
실시예 3. 수용성 FcRn 발현 및 정제
제작된 안정된 세포주로부터 발현하는 FcRn은 배지로 분비되는 형태이다. 안정된 세포주의 배양액으로부터 수용성 FcRn을 확보하기 위한 시기를 결정하기 위한 실험을 진행하였다. 30X104cell/ml과 60X104cells/ml의 30 ml 플라스크를 준비하여, 세포 접종 날짜부터 7일간 샘플을 수집하였다. 샘플은 WB(western blotting)으로 분석하였으며 접종 후 발현이 최대로 나타나는 날짜를 샘플 배지(sample media) 확보 시기로 결정지었다. 세포 접종 후, 배양이 끝나면 배지는 4 3,600rpm으로 10분간 원심분리하였다. 세포 펠릿이 떨어지지 않도록 배지 상등액(supernatant media)만 수집한 뒤, 0.22 m 필터(filter)를 사용하여 여과하였다. 확보한 샘플 800 ml ~ 1,000 ml를 정제하기 위해서 버퍼 교환(buffer change) 및 농축(concentration) 과정을 UF(ultra filtration)로 진행하였다. 먼저 필터안의 NaOH를 제거하기 위해 약 2 L 증류수를 흘리고, 충분히 증류수로 세척 후, 사용하고자 하는 버퍼인 20 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl pH 6.0 버퍼 200 ml 이상을 흘려주었다. 이 때, 공급원(feed reservoir)에 넣어주는 버퍼의 pH와 투과액(permeate)의 pH를 측정 및 비교함으로써 필터내의 NaOH 제거 정도를 확인할 수 있다. 투과액의 pH가 pH 6.0으로 동등해지면 샘플을 공급원에 주입하여 200 ml로 농축하였다. 배지 샘플의 버퍼를 20 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl pH 6.0 버퍼로 바꿔주기 위하여 약 10배 이상인 2 L 정도를 여과시켰다. 압력 센서는 feed/inlet인 P1에 연결하여 사용하며 수동모드(manual mode)로 작동시켰다. 막간 압력(Trans-membrane pressure) (TMP)는 0.15 ~ 0.20 사이가 되게 하며, 0.5 이상이 되지 않게 하였다. 버퍼 교환이 끝나면 200 ml의 샘플 배지를 50 ml로 농축시켰다. 농축된 sample은 4 3,600rpm으로 15분간 원심분리 후, 상등액만 옮겨준다.
UF를 통해 준비된 약 50 ml의 시료는 IgG Sepharose 6 fast flow를 이용한 어피니티 크로마토그래피(affinity chromatography)를 통해 정제하였다. IgG Sepharose 6 fast flow는 XK16 컬럼에 충진하여 8 ml의 컬럼 부피(column volume)로 사용하였고, 선속도 150 cm/hr (5ml/min)로 어피니티 크로마토그래피를 진행하였다. 2 ml/min 유속으로 농축된 50 ml 시료를 주입한 후, 같은 유속으로 세척 버퍼(washing buffer) (20 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl pH 5.8)를 약 5 CV 이상 흘려주어 기준선(baseline)이 회복되는 시점까지 진행하였다. 그 후, 용출버퍼(50 mM Tris-Cl, pH8.0)를 4 ml/min의 유속으로 흘려주며, 2 ml 씩 분획하여 시료를 수집하였다. Bradford 정량 방법을 이용하여 단백질 농도를 측정하였으며, 전기영동 후 쿠마시 염색(Coomassie staining)을 통해 순도 분석을 진행하였다.
실시예 4. 파지 디스플레이(phage display) 방법에 의한 폴리파지 (polyphage) 및 모노 파지(monophage) 선별
분리정제된 shFcRn(수용성(soluble) human FcRn)을 항원으로 사용하여 인간 항체 cDNA 라이브러리로부터 pH 6.0에서 pH 7.4 범위내에서 pH에 비의존적으로 FcRn chain에는 결합하고 2m에는 결합하지 않는 폴리파지를 선별하였고(도 1 참조) 그 중 8개의 모노파지(monophage)를 선별 유전자 분석을 수행하였다. 자세한 방법은 다음과 같다.
2.7x1010의 다양성을 가진 라이브러리를 30 에 16시간 배양하여, PEG (polyethyleneglycol)로 농축한 다음, PBS 완충용액에 준비하였다. shFcRn 항원으로 3차까지 패닝(panning)을 수행하여, 3차에서 항원에 대한 파아지의 콜로니 타이터(colony titer)가 10~100배 정도 증폭됨을 확인하였고, 3차 다클론 파아지 항체군에서 단일클론 파아지 항체군을 준비하여 항원에 대한 각각의 결합능을 확인하여 일차 선별하였고, 핑커 프린팅(finger priniting)과 서열분석을 통해 단일클론 파아지 항체를 얻었다. 라이브러리 세포(library cell)에서부터 3차 패닝하여 수득된 세포에 헬퍼 파지(helper phage)를 감염하여 배양한 다음 상층액에 존재 하는 poly ScFv-phage들을 면역-플레이트(immuno-plate)를 사용하여 ELSIA를 수행하였다. 그 결과, 항원에 대한 결합능이 3차 폴리 ScFv-파지에서 증강(enrichment)됨을 확인하였다 (도 1 참조). BstN1 에 의한 핑거 프린팅으로 확인된 모노파지 클론(monophage clone)들 각각의 서열 분석을 하기 위해 모노 클론 세포(mono clone cell)의 DNA 분리를 수행하여 DNA를 얻어 서열 분석 결과를 보고, 선별된 항체의 VH와 VL의 CDR 영역(region)을 확인하였고 이들 항체와 점라인(germ line) 항체군의 유사성을 NCBI의 웹페이지(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)의 Ig BLAST 프로그램을 이용, 조사하여 그 결과 8종의 shFcRn에 특이적인 파지 항체를 선별하여 수득할 수 있었다. 선별된 8종 항체의 가변영역 서열 및 이를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 표 2 및 표 3에 기재되어 있다. 또한, 각 가변영역에서의 CDR 서열은 표 4에 기재되어 있다.
선별된 항체의 중쇄 및 경쇄 가변영역의 아미노산 서열
항체 명 중쇄 가변영역 서열 경쇄 가변영역 서열
서열번호 아미노산 서열 서열번호 아미노산 서열
HL161-1A 2 QVQLVQSGGG LVQPGRSLRL SCAASGFSFG EYGMHWVRQA PGKGLEWVSG VSWNSGSIAY ADSVRGRFTI SRDNSKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCARGR SMDVWGQGTT VTVSS 146 NFMLTQPASV SGSPGQTITI SCTGSSSDVG GYNYVSWYQQ HPGKAPQLII YDVTKRPSGV SNRFSGSKSG NSASLTISGL QAEDEADYYC SSYSSSTFYV FGTGTKVTVL
HL161-2A 4 QMQLVQSGAE VKKPGSSVKV SCKASGGTFN NYAVSWVRQA PGQGLEWMGR IIPILGIANY AQTFQGRVTI TADKSTTTAY MELSSLRSED TAVYYCARDR YGMDVWGQGT TVTVSS 148 QLVLTQPPST SETPGQRVTI SCSGSSSNIG SNYVYWYQQL PGTAPKLLIY RNNQRPSGVP DRFSGSKSGT SASLAISGLR SEDEADYYCA SWDDSLSGVV FGGGTKLTVL
HL161-2D 6 QVQLVESGGG LVQPGRSLRL SCTASGFTFG DYAMSWVRQA PGKGLEWVGF IRSKAYGGTT EYAASVKGRF TISRDDSKSI AYLQMNSLRA EDTAVYYCAR EGLFLPLGGF DLWGLGTMVT VSS 150 NFMLTQPHSV SESPGKTVTI SCTRSSGSIA ANYVHWYQQR PGSPPTTVIY NDNQRPSGVP DRFSGSIDRS SNSASLTISG LKTEDEADYY CQSYDSTTYA FGGGTKLTVL
HL161-6C 8 QVQLVESGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT SYYMHWVRQA PGQGLEWMGI INPSGGSTSY AQKFQGRVTM TRDTSTSTVY MELSSLRSED TAVYYCARGG GAFDIWGQGT MVTVSS 152 DIQMTQSPSS VSASVGDRVT ITCRASQGIS NWVAWYQQKP GKAPKLLIYA ASSLQSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFAIYYCQQ GHSFPYTFGQ GTKVEIK
HL161-9F 10 QVQLVESGGG LVQSGRSLRL SCTASGFTFG DYAMSWVRQA PGKGLEWVGF IRSKAYGGTT EYAASVKGRF TISRDDSKSI AYLQMNSLRA EDTAVYYCAR EGLFLPLGGF DLWGLGTMVT VSS 154 NFMLTQPHSV SESPGKTVTI SCTRSSGSIA ANYVHWYQQR PGSPPTTVIY NDNQRPSGVP DRFSGSIDRS SNSASLTISG LKTEDEADYY CQSYDSTTYA FGGGTKLTVL
HL161 10E 12 QVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFRFS NFAMTWVRQA PGKGLEWVST LSGSGGSIHH ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAKGP LRGQPAYLDP WGQGTLVTVS S 156 SYELTQPLSV SMSPGQTARI TCSGDALSKQ YASWYQLKPG QAPVVVMYKD TERPSGIPDR FSGSSSGTTV TLTISGVQAE DEADYYCQSI TDKSGTDVIF GGGTKLTVL
HL161-11G 14 QMQLVESGGG VVQPGRSLRL SCVGSGFNFN SYGIHWVRQA PGKGLEWVGG IFYDGSQVKY ADSVKGRVSI SRDNSKNTAY LQMNSLRAED TAVYYCARRN LLDYWGQGTV VTVSS 158 NFMLTQPASV SGSPGQSITI SCTGSSSDVG GYNYVSWYQQ HPGKAPQLII YDVTKRPSGV SNRFSGSKSG NSASLTISGL QAEDEADYYC SSYSSSTFYV FGTGTKVTVL
HL161-11H 16 QMQLVESGGG LVQPGRSLRL SCAASGFTFS SYAMHWVRQA PGKGLEWVAV ISYDGSNKYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRSED TAVYYCSRGS GGRDAFDVWG QGTMITVSS 160 DIQMTQSPST LSASVGDRVT ITCRASQSIS SRLAWYQQKP GKAPKLLIYK ASSLETGVPS RFSGSGSGTE FTLTISSLQP DDFATYYCQQ TNSFPLTFGG GTKVEIK
수득된 항체의 중쇄 및 경쇄 가변영역의 폴리뉴클레오티드 서열
항체 명 중쇄 가변영역 서열 경쇄 가변영역 서열
서열번호 폴리뉴클레오티드 서열 서열번호 폴리뉴클레오티드 서열
HL161-1A 1 CAGGTGCAGC TGGTGCAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGCAGGTC CCTGAGACTC TCCTGTGCAG CCTCTGGTTT CAGTTTTGGT GAATATGGCA TGCACTGGGT CCGGCAAGCT CCAGGGAAGG GCCTGGAGTG GGTCTCAGGT GTTAGTTGGA ACAGTGGTAG CATTGCCTAT GCGGACTCTG TGAGGGGCCG ATTCACCATC TCCAGAGACA ACAGCAAAAA CTCCCTGTAT CTGCAAATGA ACAGTCTGAG AGCCGAGGAC ACGGCCGTGT ATTACTGTGC GAGAGGTAGA AGTATGGACG TCTGGGGCCAA GGGACCACG GTCACCGTCT CCTCA 145 AATTTTATGC TGACTCAGCC CGCCTCCGTG TCTGGGTCTC CTGGACAGAC GATCACCATC TCCTGCACTG GAAGCAGCAG CGACGTTGGT GGTTATAACT ATGTCTCCTG GTACCAACAG CACCCAGGCA AAGCCCCCCA ACTCATCATT TATGATGTCA CTAAGCGGCC CTCAGGGGTT TCTAATCGCT TCTCCGGCTC CAAGTCTGGC AACTCGGCCT CCCTGACCAT CTCTGGACTC CAGGCTGAGG ACGAGGCTGA TTATTACTGC AGCTCATACA GCAGCAGCAC TTTTTACGTC TTCGGAACTG GGACCAAGGT CACCGTCCTA
HL161-2A 3 CAGATGCAGC TGGTGCAGTC TGGGGCTGAG GTGAAGAAGC CTGGGTCCTC GGTGAAGGTC TCCTGCAAGG CTTCTGGAGG CACCTTCAAC AACTATGCTG TCAGCTGGGT GCGACAGGCC CCTGGACAAG GGCTTGAGTG GATGGGAAGG ATCATCCCTA TCCTTGGTAT AGCAAACTAC GCACAGACAT TCCAGGGCAG AGTCACGATT ACCGCGGACA AATCCACGAC CACAGCCTAC ATGGAGCTGA GCAGCCTGAG ATCTGAGGAC ACGGCCGTGT ATTACTGTGC AAGAGATCGT TACGGTATGG ACGTCTGGGG CCAAGGGACC ACGGTCACCG TCTCCTCA 147 CAGCTCGTGC TGACTCAGCC ACCCTCAACG TCTGAGACCC CCGGGCAGAG GTCACCATC TCTTGTTCTG GAAGCAGCTC CAACATCGGA AGTAATTATG TATACTGGTA CCAGCAACTC CCAGGAACGG CCCCCAAACT CCTCATCTAT AGGAATAATC AGCGGCCCTC AGGGGTCCCT GACCGATTCT CTGGCTCCAA GTCTGGCACT TCAGCCTCCC TGGCCATCAG TGGGCTCCGG TCCGAGGATG AGGCTGATTA TTACTGTGCA TCATGGGATG ACAGCCTGAG TGGTGTGGTT TTCGGCGGAG GGACCAAGCT GACCGTCCTA
HL161-2D 5 CAGGTGCAGC TGGTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CAGGGCGGTC CCTGAGACTC TCCTGTACAG CTTCTGGATT CACCTTTGGT GATTATGCTA TGAGCTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GGCTGGAGTG GGTAGGTTTC ATTAGAAGCA AAGCTTATGG TGGGACAACA GAATACGCCG CGTCTGTGAA AGGCAGATTC ACCATCTCAA GAGATGATTC CAAAAGCATC GCCTATCTGC AAATGAACAG TCTGAGAGCC GAGGACACGG CCGTGTATTA CTGTGCGAGA GAGGGGCTGT TCCTGCCCCT GGGAGGTTTT GATTTATGGG GCCTAGGGAC AATGGTCACC GTCTCCTCA 149 AATTTTATGC TGACTCAGCC CCACTCTGTG TCGGAGTCTC CGGGGAAGAC GGTCACCATC TCCTGCACCC GCAGCAGTGG CAGCATTGCC GCCAACTATG TGCACTGGTA CCAACAGCGC CCGGGCAGTC CCCCCACCAC TGTCATCTAT AACGATAACC AAAGACCCTC TGGAGTCCCT GATCGGTTCT CTGGGTCCAT CGACAGGTCC TCCAACTCTG CCTCCCTCAC CATCTCTGGA CTGAAGACTG AGGACGAGGC TGACTACTAC TGTCAGTCCT ACGATAGTAC CACTTATGCA TTCGGCGGAG GGACCAAGCT GACCGTCCTA
HL161-6C 7 CAGGTGCAGC TGGTGGAGTC TGGGGCTGAG GTGAAGAAGC CTGGGGCCTC AGTGAAGGTT TCCTGCAAGG CATCTGGATA CACCTTCACC AGCTACTATA TGCACTGGGT GCGACAGGCC CCTGGACAAG GGCTTGAGTG GATGGGAATA ATCAACCCTA GTGGTGGTAG CACAAGCTAC GCACAGAAGT TCCAGGGCAG AGTCACCATG ACCAGGGACA CGTCCACGAG CACAGTCTAC ATGGAGCTGA GCAGCCTGAG ATCTGAGGAC ACGGCCGTGT ATTACTGTGC AAGAGGGGGG GGGGCTTTTG ATATCTGGGG CCAAGGGACA ATGGTCACCG TCTCCTCA 151 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCTTCC GTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CAGAGTCACC ATCACTTGTC GGGCGAGTCA GGGTATCAGC AACTGGGTAG CCTGGTATCA GCAGAAACCA GGCAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATGCT GCATCCAGTT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA AGGTTCAGCG GCAGTGGATC TGGGACAGAC TTCACTCTCA CCATCAGCAG CCTGCAGCCT GAAGATTTTG CAATTTACTA TTGTCAACAG GGTCACAGTT TCCCGTACAC TTTTGGCCAA GGGACCAAGG TGGAAATCAA A
HL161-9F 9 CAGGTGCAGC TGGTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGT CAGGGCGGTC CCTGAGACTC TCCTGTACAG CTTCTGGATT CACCTTTGGT GATTATGCTA TGAGCTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GGCTGGAGTG GGTAGGTTTC ATTAGAAGCA AAGCTTATGG TGGGACAACA GAATACGCCG CGTCTGTGAA AGGCAGATTC ACCATCTCAA GAGATGATTC CAAAAGCATC GCCTATCTGC AAATGAACAG TCTGAGAGCC GAGGACACGG CCGTGTATTA CTGTGCGAGA GAGGGGCTGT TCCTGCCCCT GGGAGGTTTT GATTTATGGG GCCTAGGGAC AATGGTCACC GTCTCCTCA 153 AATTTTATGC TGACTCAGCC CCACTCTGTG TCGGAGTCTC CGGGGAAGAC GGTCACCATC TCCTGCACCC GCAGCAGTGG CAGCATTGCC GCCAACTATG TGCACTGGTA CCAACAGCGC CCGGGCAGTC CCCCCACCAC TGTCATCTAT AACGATAACC AAAGACCCTC TGGAGTCCCT GATCGGTTCT CTGGGTCCAT CGACAGGTCC TCCAACTCTG CCTCCCTCAC CATCTCTGGA CTGAAGACTG AGGACGAGGC TGACTACTAC TGTCAGTCCT ACGATAGTAC CACTTATGCA TTCGGCGGAG GGACCAAGCT GACCGTCCTA
HL161 10E 11 CAGGTGCAGC TGGTGGAGTC TGGGGGAGGC TTAGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGAGACTC TCCTGTGCAG CCTCTGGCTT CAGATTCAGC AACTTTGCCA TGACCTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GGCTGGAGTG GGTCTCAACT CTTAGTGGTA GTGGTGGTAG TATACACCAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG ATTCACCATC TCCAGAGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGTCTGAG AGCCGAGGAC ACGGCCGTGT ATTACTGTGC GAAAGGGCCC TTGAGGGGAC AGCCGGCCTA CCTTGACCCC TGGGGCCAGG GAACCCTGGT CACCGTCTCC TCA 155 TCCTATGAGC TGACACAGCC ACTCTCGGTG TCAATGTCCC CAGGACAAAC GGCCAGGATC ACCTGTTCTG GAGATGCTTT GTCAAAGCAA TATGCTTCTT GGTACCAGCT GAAGCCAGGC CAGGCCCCTG TGGTGGTGAT GTATAAAGAC ACTGAGAGGC CCTCAGGGAT CCCTGACCGA TTCTCTGGCT CCAGCTCCGG GACAACAGTC ACGTTGACCA TCAGTGGAGT CCAGGCAGAA GACGAGGCTG ATTATTACTG TCAATCAATA ACAGACAAGA GTGGTACTGA TGTGATCTTC GGCGGAGGGA CCAAGCTGAC CGTCCTA
HL161-11G 13 CAGATGCAGC TGGTGGAGTC GGGGGGAGGC GTGGTCCAGC CTGGGAGGTC TCTGAGACTC TCCTGTGTAG GGTCTGGATT CAACTTCAAC AGTTATGGCA TACACTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGCAAGG GGCTGGAGTG GGTGGGAGGA ATATTTTATG ATGGAAGTCA AGTAAAGTAT GCAGACTCCG TGAAGGGCCG AGTCTCCATC TATGCCATGA ATTCCAAGAA CACAGCGTAT CTGCAAATGA ACAGTCTGAG AGCCGAGGAC ACGGCCGTGT ATTACTGTGC GCGACGAAAC CTCCTGGACT ACTGGGGCCA GGGAACGGTG GTCACCGTCT CCTCA 157 AATTTTATGC TGACTCAGCC CGCCTCCGTG TCTGGGTCCC CTGGACAGTC GATCACCATC TCCTGCACTG GAAGCAGCAG CGACGTTGGT GGTTATAACT ATGTCTCCTG GTACCAACAG CACCCAGGCA AAGCCCCCCA ACTCATCATT TATGATGTCA CTAAGCGGCC CTCAGGGGTT TCTAATCGAT TCTCCGGCTC CAAGTCTGGC AACTCGGCCT CCCTGACCAT CTCTGGACTC CAGGCTGAGG ACGAGGCTGA TTATTACTGC AGCTCATACA GCAGCAGCAC TTTTTACGTC TTCGGAACTG GGACCAAGGT CACCGTCCTA
HL161-11H 15 CAGATGCAGC TGGTAGAGTC TGGGGGAGGT TTGGTACAGC CGGGCAGGTC CCTGAGACTC TCCTGTGCAG CCTCTGGATT CACCTTCAGT AGCTATGCTA TGCACTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGCAAGG GGCTGGAGTG GGTGGCAGTT ATATCATATG ATGGAAGCAA TAAATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG ATTCACCATC TCCAGAGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGAG ATCTGAGGAC ACGGCCGTGT ATTACTGTGC GAGAGGTAGT GGTGGTCGTG ACGCTTTTGA TGTCTGGGGC CAAGGAACAA TGATCACCGT CTCCTCA 159 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCTTCCACC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CAGAGTCACC ATCACTTGCC GGGCCAGTCA GAGTATTAGT AGCCGGTTGG CCTGGTATCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATAAG GCATCTAGCT TAGAAACTGG GGTCCCATCA AGGTTCAGCG GCAGTGGATC TGGGACAGAA TTCACTCTCA CCATCAGCAG CCTGCAGCCT GATGATTTTG CAACTTACTA TTGTCAACAG ACGAACAGTT TCCCTCTCAC TTTCGGCGGA GGGACCAAGG TGGAGATCAA A
선별된 항체의 중쇄 및 경쇄 가변영역의 CDR 서열
항체 중쇄 가변영역 CDR 경쇄 가변영역 CDR
서열
번호		 CDR1 CDR2 CDR3 서열
번호		 CDR1 CDR2 CDR3
HL161-1A 2 EYGMH GVSWNSGSIAYADSVRG GRSMDV 146 GPLRGQPAYLDP DVTKRPS SSYSSSTFYV
HL161-2A 4 NYAVS RIIPILGIANYAQTFQG DRYGMDV 148 SGSSSNIGSNYVY RNNQRPS ASWDDSLSGVV
HL161-2D 6 DYAMS FIRSKAYGGTTEYAASVKG EGLFLPLGGFDL 150 TRSSGSIAANYVH NDNQRPS QSYDSTTYAFGGGTKLTVLG
HL161-6C 8 SYYMH IINPSGGSTSYAQKFQG GGGAFDI 152 RASQGISNWVA AASSLQS QQGHSFPYT
HL161-9F 10 DYAMS FIRSKAYGGTTEYAASVKG EGLFLPLGGFDL 154 TRSSGSIAANYVH NDNQRPS QSYDSTTYA
HL161 10E 12 NFAMT TLSGSGGSIHHADSVKG GPLRGQPAYLDP 156 TRSSGSIAANYVH DNQRPS QSYDSTTYA
HL161-11G 14 SYGIH GIFYDGSQVKYADSVKG RNLLDY 158 TGSSSDVGGYNYVS DVTKRPS SSYSSSTFYV
HL161-11H 16 SYAMH VISYDGSNKYYADSVKG GSGGRDAFDV 160 RASQSISSRLA KASSLET QQTNSFPLT
실시예 5. 인간항체 제작 및 생산
실시예 5. 인간항체 제작 및 생산
선별된 단클론 scFv 파지로부터 중쇄(heavy chain)와 경쇄(light cahin)의 가변영역(variable region)을 각각 PCR 증폭(amplification)한 다음, 인간항체발현용 pNATAB 벡터에 클로닝을 하였다. 중쇄 발현용 pNATAB 벡터에는 Fc 유전자(gene)가, 경쇄 발현용 pNATAB 벡터에는 경쇄 불변영역(light chain constant region)이 이미 구축(construction)되어 있어 클로닝된 가변영역 유전자와 연결되어 온전한 인간 IgG(whole human IgG) 형태로 발현되었다. 인간항체는 중쇄와 경쇄을 발현하는 2 종류의 플라스미드 DNA를 293E 세포에 일시적 형질감염(transient transfection)시켜 배지로 분비(secretion)된 항체를 프로테인 A 컬럼(protein A column)을 이용하여 정제함으로써 수득하였으며, 자세한 생산방법은 다음과 같다.
형질감염 전날, 5x106수의 293E 세포를 100mm 배양접시에 접종하였다. 컨플루언스(confluence)가 90 % 이상 된 것을 확인한 다음, 형질감염(transfection)을 진행하였다. 중쇄와 경쇄 플라스미드 DNA를 각각 5 g씩 준비한 다음 500 l 무혈청(serum free) DMEM 배지에 넣어주었다. 플라스미드 DNA가 들어있는 배지에 형질감염 시약(transfection reagent)인 폴리에틸렌이민(Polyethylenimine) (polyscience, cat#. 23966) 20 g를 추가로 넣어준 다음 파이펫으로 잘 섞은 후, 실온에서 15분간 인큐베이션하였다. 그리고 나서 DNA와 형질감염 시약 혼합물(trasfection reagent mixture)을 293E 세포가 자라고 있는 배지에 넣어주었다. 다음날, 새로운 무혈청 배지로 배지를 교환한 다음, 이틀 간격으로 배지를 교환해 주면서 배지를 회수(harvest)하였다. 항체가 발현된 배지는 펠리콘 3 필터(Pellicon 3 filter) (Millipore, cat#. P3C030C01)를 이용하여 농축한 다음, AKTA 정제 시스템(AKTA purifier system)에서 Hi-Trap 프로테인 A FF 컬럼(protein A FF column) (GE healthcare, cat#. 17-5079-01)을 사용하여 인간 항체를 정제하였다. 100 mM 글리신(Glycine)-HCl (pH3.3) 버퍼로 이용하여 용출 된 항체는 PBS로 투석(dialysis)한 후, 280 nm 파장 에서 흡광도를 측정하는 방법으로 정량하였다.
실시예 6. SPR 을 통한 항체의 결합력 측정
SPR을 통한 항체의 결합력은 shFcRn를 리간드로 Proteon GLC chip(Bio-Rad)에 고정화(immobilization)하여 친화도(affinity)를 측정하는 방법으로 진행하였다.
FcRn에 결합하는 anti-FcRn 161 항체의 KD를 결정하기 위해 Proteon XPR36 (Bio-Rad) SPR 기기를 이용한 분석이 수행되었다. 리간드와 분석대상(analyte)의 분석은 Proteon GLC chip을 사용하였으며 상호반응(interaction)은 pH 6.0 및 pH 7.4에서 각각 분석하였다. 리간드의 고정화는 1X EDAC(EDC)과 1X Surfo-NHS를 1:1로 섞어 5 분간 주입시켜 활성화(activation)하였다. 리간드는 10 mM 소듐 아세테이트(sodium acetate), pH 4.5에 shFcRn을 25 g/ml로 희석하여, 30 l/min 유속(flow rate)으로 5분간 주입하였다. 비활성화(deactivation)는 에탄올아민(Ethanolamine) HCl을 30 l/min으로 유속으로 5 분 진행하여 shFcRn이 1200~1500 RU 정도 고정화된 것을 확인할 수 있었다. 고정화된 칩에 분석대상(analyte) 항체를 30 l/min 유속으로 흘려준다. 분석대상 항체는 pH 6.0 또는 pH 7.4인 0.05% Tween 20/PBS에 희석된 분석대상 항체를 100 nM, 50 nM, 20 nM, 10 nM, 5 nM, 2.5 nM로 희석하여 주입시켰다. 분석대상 항체의 결합시간(association time)은 240초, 해리시간(dissociation time)은 600 초였다. 칩의 재생(regeneration)은 10 mM Glycine, pH 2.5를 100 l/min 유속으로 18초간 흘려주었다. 분석대상의 총 6가지 농도로부터 나온 센소그램(sensorgram)을 토대로 키네틱스(kinetics) 분석을 진행하였다. 키네틱스 분석은 Proteon XPR36 software를 사용하였다. SPR 분석 결과로 나온 항체의 키네틱 파라미터(kinetic parameter)는 표 5에 나타내었다.
gene)가, 경쇄 발현용 pNATAB 벡터에는 경쇄 불변영역(light chain constant region)이 이미 구축(construction)되어 있어 클로닝된 가변영역 유전자와 연결되어 온전한 인간 IgG(whole human IgG) 형태로 발현되었다. 인간항체는 중쇄와 경쇄을 발현하는 2 종류의 플라스미드 DNA를 293E 세포에 일시적 형질감염(transient transfection)시켜 배지로 분비(secretion)된 항체를 프로테인 A 컬럼(protein A column)을 이용하여 정제함으로써 수득하였으며, 자세한 생산방법은 다음과 같다.
형질감염 전날, 5x106수의 293E 세포를 100mm 배양접시에 접종하였다. 컨플루언스(confluence)가 90 % 이상 된 것을 확인한 다음, 형질감염(transfection)을 진행하였다. 중쇄와 경쇄 플라스미드 DNA를 각각 5 g씩 준비한 다음 500 l 무혈청(serum free) DMEM 배지에 넣어주었다. 플라스미드 DNA가 들어있는 배지에 형질감염 시약(transfection reagent)인 폴리에틸렌이민(Polyethylenimine) (polyscience, cat#. 23966) 20 g를 추가로 넣어준 다음 파이펫으로 잘 섞은 후, 실온에서 15분간 인큐베이션하였다. 그리고 나서 DNA와 형질감염 시약 혼합물(trasfection reagent mixture)을 293E 세포가 자라고 있는 배지에 넣어주었다. 다음날, 새로운 무혈청 배지로 배지를 교환한 다음, 이틀 간격으로 배지를 교환해 주면서 배지를 회수(harvest)하였다. 항체가 발현된 배지는 펠리콘 3 필터(Pellicon 3 filter) (Millipore, cat#. P3C030C01)를 이용하여 농축한 다음, AKTA 정제 시스템(AKTA purifier system)에서 Hi-Trap 프로테인 A FF 컬럼(protein A FF column) (GE healthcare, cat#. 17-5079-01)을 사용하여 인간 항체를 정제하였다. 100 mM 글리신(Glycine)-HCl (pH3.3) 버퍼로 이용하여 용출 된 항체는 PBS로 투석(dialysis)한 후, 280 nm 파장 에서 흡광도를 측정하는 방법으로 정량하였다.
실시예 6. SPR을 통한 항체의 결합력 측정
SPR을 통한 항체의 결합력은 shFcRn를 리간드로 Proteon GLC chip(Bio-Rad)에 고정화(immobilization)하여 친화도(affinity)를 측정하는 방법으로 진행하였다.
FcRn에 결합하는 anti-FcRn 161 항체의 KD를 결정하기 위해 Proteon XPR36 (Bio-Rad) SPR 기기를 이용한 분석이 수행되었다. 리간드와 분석대상(analyte)의 분석은 Proteon GLC chip을 사용하였으며 상호반응(interaction)은 pH 6.0 및 pH 7.4에서 각각 분석하였다. 리간드의 고정화는 1X EDAC(EDC)과 1X Surfo-NHS를 1:1로 섞어 5 분간 주입시켜 활성화(activation)하였다. 리간드는 10 mM 소듐 아세테이트(sodium acetate), pH 4.5에 shFcRn을 25 g/ml로 희석하여, 30 l/min 유속(flow rate)으로 5분간 주입하였다. 비활성화(deactivation)는 에탄올아민(Ethanolamine) HCl을 30 l/min으로 유속으로 5 분 진행하여 shFcRn이 1200~1500 RU 정도 고정화된 것을 확인할 수 있었다. 고정화된 칩에 분석대상(analyte) 항체를 30 l/min 유속으로 흘려준다. 분석대상 항체는 pH 6.0 또는 pH 7.4인 0.05% Tween 20/PBS에 희석된 분석대상 항체를 100 nM, 50 nM, 20 nM, 10 nM, 5 nM, 2.5 nM로 희석하여 주입시켰다. 분석대상 항체의 결합시간(association time)은 240초, 해리시간(dissociation time)은 600 초였다. 칩의 재생(regeneration)은 10 mM Glycine, pH 2.5를 100 l/min 유속으로 18초간 흘려주었다. 분석대상의 총 6가지 농도로부터 나온 센소그램(sensorgram)을 토대로 키네틱스(kinetics) 분석을 진행하였다. 키네틱스 분석은 Proteon XPR36 software를 사용하였다. SPR 분석 결과로 나온 항체의 키네틱 파라미터(kinetic parameter)는 표 5에 나타내었다.
FcRn 고정화 SPR 분석결과
항체 shFcRn 고정화
SPR (pH6.0) SPR (pH7.4)
kon (M-1s-1) koff (s-1) KD (M) kon (M-1s-1) koff (s-1) KD (M)
HL161-1A 4.0106 3.210-3 8.010-10 1.1106 9.310-3 8.510-9
HL161-2A 6.9105 1.110-3 1.610-9 4.2105 6.710-4 1.610-9
HL161-2D 6.9105 6.810-4 9.810-10 3.8105 1.710-3 4.510-9
HL161-6C 1.0106 1.910-3 1.910-9 4.7105 3.110-3 6.610-9
HL161-9F 7.5105 7.010-4 9.310-10 4.5105 1.610-3 3.610-9
HL161-10E 1.2106 4.610-3 3.810-9 3.1105 8.210-3 2.610-8
HL161-11G 1.2106 1.910-4 1.610-10 5.2105 1.210-4 2.310-10
HL161-11H 9.7105 3.410-4 3.510-10 5.0105 4.510-4 9.010-10
hIgG1 3.2105 4.610-4 1.410-9 No binding No binding No binding
실시예 7. 전장( Full length ) FcRn 발현벡터 제작
8종의 항체가 인간 세포 표면에 존재하는 hFcRn에의 결합과 이를 통한 IgG Fc와의 상호작용을 저해하는지를 알아보기 위해 인간 FcRn이 세포 표면에 발현되는 세포주와 원숭이, 마우스 및 랫 각각의 FcRn과의 교차반응성을 조사하기 위해 각종의 FcRn이 각종의 세포 표면에 과발현하는 세포주 제작을 위한 발현벡터를 제작하였다.
1) 인간 FcRn
한국생명공학연구소로부터 구입한 클론(FcRn : hMU008093 / B2m : hMU005156)으로부터 플라스미드 DNA를 추출하여 사용하였다. 2 l 200 ng template, 2 l 10 pmole N-프라이머 2 l 10 pmole C-프라이머, 25 l 2X 솔전트 혼합물(Solgent mixture), 19 l 증류수를 넣어 50 l의 반응 용액을 만들었다. 실험에 사용한 프라이머의 서열은 표 1에 기재되어 있다. PCR 반응은 1차 변성 95 2분, 2차변성 95 20초, 프라이머 접합 60 40초, 신장 반응 72 1분 과정 중 2차 변성에서 신장 반응까지 25회 반복하여 진행시킨 다음 최종 효소반응을 72 5분 진행하였다. FcRn 유전자 증폭 산물은 Nhe 및 Xho 효소로, 2m 유전자 증폭 산물은 Nhe 및 Xba 효소로 37에서 4시간 이상, pcDNA3.1(+) 벡터도 Nhe/Xho과 Nhe/Xba효소로 각각 37에서 4시간 이상 처리후에 전기영동 하였다. 아가로스 젤 상에서 크기가 확인된 DNA 절편 밴드는 아가로스 젤 추출 키트(agarose gel extraction kit)를 사용하여 DNA 절편을 회수하였다. 해당 DNA 절편과 벡터 절편은 1:5의 비율로 총 10 l가 되도록 혼합하여 10 l NEB 리가제 버퍼, 1 l 리가제를 첨가하여 실온에서 2시간 인큐베이션하였다. 라이게이션 혼합물(ligation mixture)에서 5 l를 DH5 컴피턴트 세포(competent cell)에 넣어 42에서 1분간 열 충격 처리하여 형질전환하고 앰피실린이 포함된 LB 고체 배지에서 정치 배양하여 콜로니를 확보하였다. 이 콜로니를 앰피실린이 포함된 LB 액체 배지에서 37 24시간 배양한 후 플라스미드 DNA를 분리하여 DNA 염기서열 분석을 통해 FcRn / 2m 유전자 각각이 pcDNA3.1(+) 삽입되었음을 확인하였다.
Jump-InTM 패스트 게이트웨이 클로닝 키트(fast gateway cloning kit)를 이용하여 제조사의 사용방법에 따라 pcDNA3.1(+) 벡터에 클로닝된 두 가지의 플라스미드 DNA를 주형으로 하여 5 말단 및 3말단에 attB 부위를 넣은 PCR 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. 이 과정을 통해 pJTITMFastDEST벡터에는 hGH 리더 FcRn/2m이 삽입된 최종 발현벡터가 제작되었다. 제작된 발현벡터는 유전자 분석을 통해 염기서열을 확인 하였다
마우스, 랫, 원숭이 전장 FcRn 발현벡터 제작
마우스, 랫, 원숭이의 cDNA 라이브러리를 바이오체인(BioChain)으로부터 구입하여 사용하였다. 마우스 cDNA(C1334149), 랫 cDNA (C1434149), 원숭이 cDNA (C1534150-cy)를 주형으로 사용하였다. 1 l 주형, 표 1에 기재된 2 l 10 pmole 각 종의 N-프라이머, 2 l 10 pmole C-프라이머, 25 l 2X 솔전트 혼합물, 20 l 증류수를 넣어 50 l의 반응 용액을 만들었다. 실험에 사용된 프라이머 염기서열은 표 1에 기재되어 있다. PCR 반응은 1차 변성 95 2분, 2차변성 95 20초, 프라이머 접합 56 40초, 신장 반응 72 1분 과정 중 2차 변성에서 신장 반응까지 25회 반복하여 진행시킨 다음 최종 효소반응을 72 5분으로 진행하였다. FcRn 및 2m 유전자 증폭 산물은 Kpn 및 Xho 효소로 37에서 4시간 이상, pcDNA3.1(+) 벡터도 Kpn/Xho 효소로 각각 37에서 4시간 이상 처리 후에 전기영동 하였다. 아가로스 젤 상에서 크기가 확인된 DNA 절편 밴드는 아가로스 젤 추출 키트를 사용하여 DNA 절편을 회수하였다. 해당 DNA 절편과 벡터 절편은 1:5의 비율로 총 10 ul가 되도록 혼합하여 10 l NEB 리가제 버퍼, 1 l 리가제 를 첨가하여 실온에서 2시간 인큐베이션하였다. 라이게이션 혼합물에서 5 l를 DH5 컴피턴트 세포에 넣어 42에서 1분간 열충격 처리하여 형질전환하고 앰피실린이 포함된 LB 고체 배지에서 정치 배양하여 콜로니를 확보하였다. 이 콜로니를 앰피실린이 포함된 LB 액체 배지에서 37 24시간 배양한 후 플라스미드 DNA를 분리하여 DNA 염기서열 분석을 통해 각 종의 FcRn/2m 유전자 각각이 pcDNA3.1(+) 삽입되었음을 확인하였다. Jump-InTM패스트 게이트웨이 클로닝 키트를 이용하여 제조사의 사용방법에 따라 pcDNA3.1(+) 벡터에 클로닝된 두 가지의 플라스미드 DNA를 주형으로 하여 5 말단 및 3말단에 attB 부위를 넣은 PCR 프라이머로 이용하여 PCR을 수행하였다. 이 과정을 통해 pJTITMFastDEST 벡터에는 hGH 리더를 가지는 각 종의 FcRn/2m이 삽입된 최종 발현벡터가 제작되었다. 제작된 발현벡터는 유전자 분석을 통해 염기서열을 확인하였다.
실시예 8. 전장 FcRn 발현 세포주 제작
형질감염에 사용할 플라스미드 DNA는 높은 농도와 순도를 가져야 하므로 QIAGEN 플라스미드 정제(plasmid purification)을 진행하여 준비하였다. 유전자 서열 분석을 통해 확인 hGH 리더 FcRn pJTITMFastDEST벡터의 박테리아 클론을 앰피실린이 포함된 100 ml LB 플라스크에 접종하였다. 박테리아 세포를 3600rpm으로 15분간 원심분리하여 회수하였다. 배지 제거 후, 10 ml P1 용액을 혼합한 뒤 보텍싱을 통해 펠릿을 완전히 풀어준다. 10ml P2 용액을 첨가하여 부드럽게 5회 인버팅하여 실온에서 5분간 인큐베이션하였다. 그 다음 10 ml P3 용액을 첨가하여 5회 인버팅한 뒤 얼음에서 30분 인큐베이션하였다. 인큐베이션이 끝나면 4 15,000rpm으로 30분간 원심분리하였다. 상등액을 새로운 50 ml 원심분리 튜브 에 옮긴 뒤, 추가로 15분간 원심분리하였다. 10 ml QBT 용액으로 평형화(equilibrium)시킨 컬럼에 상등액을 로딩하였다. 중력에 의해 용액의 로딩이 끝나면 30 ml QC 용액으로 2회 세척하였다. 컬럼 밑에 50 ml 원심분리 튜브를 위치시킨 뒤, 15 ml QF 용액으로 용출하였다. 용출 용액에 10.5 ml 이소프로판올 용액을 혼합하여 4 15,000rpm 30분간 원심분리하였다. DNA 펠릿을 육안으로 확인 후 조심스럽게 상등액을 제거해주고 5ml 70% 에탄올을 첨가하여 15분간 원심분리하였다. 펠릿이 떨어지지 않게 상등액을 제거한 뒤 LAR 수(LAR water) 150 l로 펠릿을 녹여준다. 펠릿이 다 녹으면 0.22 m 필터로 여과시켜 주었다. 나노드롭 기기를 이용DNA 농도를 확인하며, 순도는 A260 값이 0.1~1.0 사이의 DNA를 형질감염용으로 사용하였다.
인간, 랫, 마우스 및 원숭이 FcRn을 발현하는 세포주는 각각 다음과 같다. 인간은 HEK293 세포, 마우스는 3T3L1 세포, 랫은 Rat-2 피브로블라스트(fibroblast) 세포, 원숭이는 COS-7 세포주를 사용하였다. 각 세포주는 형질감염 과정 24시간 전에 T75 플라스크에 80% 컨플루언트(confluent)하게 되도록 접종하였다. 24시간이 지나면 신선한 배지로 교체해 주었다.
각 종의 FcRn DEST 벡터와 phiC31 Integrase 벡터 각각 5 g을 OptiMEM배지 500 l에 희석하였다. 이어서 리포펙타민(Lipofectamine) 2000 20 l을 OptiMEM 배지 500 l에 희석 후, 실온에서 5분간 방치하였다. 방치 시간이 끝나면 각 500 l의 희석 용액을 혼합하여 DNA와 리포펙타민이 복합체(complex)를 이룰 수 있도록 실온에서 30분간 방치하였다. 혼합액의 방치 시간이 끝나면 세포가 들어있는 플라스크에 넣어주었다. 5% CO2,37 인큐베이터 안에서 6시간 배양 후, 신선한 10 % FBS/DMEM 배지로 교환하여 다시 배양하였다.
FcRn 발현벡터가 크로모좀(chromosome)에 영구히 통합(integration)된 세포를 선택적으로 골라내기 위해 다음의 과정을 수행하였다. 이 과정을 통해 통합되지 않은 세포를 선택적으로 죽임으로써, 세포수 대비 발현량을 증대시킬 수 있다. 형질감염 48시간 후에 하이그로마이신(Hygromycin) B를 첨가하여 선별을 시작하였다. 3일 배양에 1회 배지 교환 및 항생제 처리를 진행하였고, 시간에 따라 형성된 콜로니를 떼어내어 배양을 진행하였다. 이렇게 전체적으로 선별된 세포군으로부터 클론 선별(clonal selection)을 통해 단일 클론으로 형성된 안정화된 세포주를 구축하였다.
선별된 안정화된 세포주 구축 확인은 FACS 분석을 통해 진행하였다. 인간 FcRn 안정화된 세포주는 Alexa488이 표지된 hIgG1을 pH 6.0에서 결합시켜 개체수(population)의 변화(shift)를 통해 확인하였다. 마찬가지로 원숭이 안정화된 세포주도 Alexa488이 표지된 사이노몰구스 원숭이(Cynomolgus monkey) IgG1을 pH 6.0에서 결합시켜 개체수의 변화를 통해 확인하였다. 마우스 FcRn 안정화된 세포주는 pH 6.0에서 마우스 IgG1을 1시간 동안 결합시킨 뒤, FITC 표지된 항-마우스 IgG1을 사용하여 결합되어있는 마우스 IgG1의 양을 FACS로 측정하였다. 이에 따라 개체수의 변화를 확인하였다. 랫 FcRn 안정화된 세포주는 항-랫 FcRn 마우스 항체를 pH 7.4에서 1시간 동안 결합시킨 뒤, FITC 표지된 항-Rat IgG 항체를 사용하여 결합되어 있는 랫 IgG의 양을 FACS로 측정하여 개체수의 변화를 확인하였다.
실시예 9. FACS 를 이용한 항체의 FcRn 결합 분석
인간 FcRn을 발현하는 HEK293 안정화 세포를 대상으로 FcRn에 대한 pH별 결합 정도를 FACS 시스템을 사용하여 분석하였다. 100,000개의 HEK293 안정화 세포를 PBS에 세척하고 탁상용 마이크로 원심분리기에서 4500rpm으로 5분 동안 원심분리하여 펠릿으로 만들었다. pH 6.0 또는 pH 7.4 PBS/10 mM EDTA 100 l에 항체 1 g을 첨가하였다. 100 l의 항체 용액으로 펠릿을 재현탁시켜 얼음위에서 60분 동안 배양시켰다. 이들 세포는 pH별 완충액 150 l로 1회 세척시킨 후 펠릿으로 만들었다. Alexa488이 표지된 항 인간항체 염소 항체(1 mg/ml)를 pH별 완충액에 1/20으로 희석한 후, 100 l로 펠릿을 재현탁시킨 후, 얼음위에서 60분 동안 배양시켰다. 이들 세포는 pH별 완충액 150 l로 1회 세척시켜 펠릿으로 만든 후, pH별 완충에 150 l로 재현탁 시켜 FACS 분석용 튜브에 옮겨준다. 이들 세포는 BD FACSDivaTM v6.1.3 소프트웨어 (BD Bioscience)를 이용한 FACS로 분석되었다. 결과는 평균 형광 강도(Mean Fluorescence Intensity: MFI)로서 표시되었다(도 2 참조). 8종의 선별된 항체 중 HL161-1A, HL161-11G, HL161-11H가 비교물질인 IgG1 보다 강하게 결합하여 세포 표면 hFcRn에 결합한 것을 확인하였다.
실시예 10. FACS 를 이용한 항체의 블로킹 기능 분석
세포 표면 hFcRn에 대한 결합능이 확인된 8종의 를 세포 표면에 hFcRn이 발현되는 HEK293 세포에 처리하고, Alexa-Fluo-488 형광표지된 hIgG1의 결합이 감소되는 것으로 항체의 블로킹 기능을 확인하였다. 분석과정을 자세히 설명하면 다음과 같다.
1) Alexa-Fluor-488로 인간 IgG1의 표지화
인간 IgG1 (Calbiochem, cat#.400120)은 제조업체의 제안된 프로토콜에 따라 Alexa Fluor 488 단백질 표지화 키트 (Molecular Probed/Invitrogen, Carlsbad, CA)로 표지화되었다. 구체적으로, 50 l의 1 M 중탄산나트륨, pH 9.0이 PBS에서 500 l의 2 mg/ml IgG 용액에 첨가되었다. 상기 단백질 용액은 이후 Alexa-Fluor-488 숙신이미딜 에스테르 (건성분말)에 첨가되고 실온에서 교반상태로 1시간 동안 배양시켰다. 상기 단백질은 키트 성분 칼럼 (Bio-Rad Biogel P-30 Fine 크기 배제 정제 수지)를 이용한 크기-배제 크로마토그래피(size-exclusion chromatography)로 정제되었다. 샘플은 칼럼에 적하되고 PBS로 용리되었다. 가장 먼저 착색된 띠는 표지화된 단백질을 포함하고 있다. 표지화 정도는 A280(280 nm에서의 흡광도와 A494(494 nm에서의 흡광도)에서, 용리된 IgG의 흡광도(Absorbance)를 측정함으로써 결정되었다. 단백질 몰 농도는 아래의 공식을 이용하여 결정되었다.
(M)=[A280 (A494 x 0.11)x희석 인자]/203,000
이에 더하여 단백질 몰(mole) 당 염료의 몰을 도출하는 이용된 공식은 아래와 같았다.
(M)=A494 x 희석인자 / 71,000 x 단백질 농도
전형적으로 IgG 몰단 4~5 몰의 Alexa-Fluor-488이 통합되었다.
2) FcRn 발현 세포를 이용한 세포 경합 분석
인간 FcRn을 발현하는 HEK293 안정화 세포를 대상으로 FcRn에 대한 항체의 블로킹 정도를 FACS를 이용하여 분석하였다. 항체는 결합 완충액 (PBS pH 6.0, 10 mM EDTA)에 희석하여 2,000 nM, 400 nM, 80 nM 농도로 50 l로 만들어 튜브에 분주하였다. 여기에 1uM Alexa488이 표지화된 hIgG1(pH 6.0)을 10 l씩 각 튜브에 첨가시켰다. HEK293 안정화 세포는 결합 완충액에 2,500,000/ml이 되도록 희석한 후, 세포현탁액 40 l를 항체와 표지항체가 첨가된 튜브에 첨가하였다. 따라서 최종 부피 100 l 안에 100,000개의 세포와 100 nM의 표지항체, 1000 nM, 500 nM, 250 nM 경합항체가 존재하도록 하였다. 이들 세포는 pH 6.0 완충액 150 l로 1회 세척시켜 펠릿으로 만든 후, pH별 완충에 150 l로 재현탁 시켜 FACS 분석용 튜브에 옮겨준다. 이들 세포는 BD FACSDivaTM v6.1.3 소프트웨어(BD Bioscience)를 이용한 FACS로 분석되었다. 결과는 평균 형광 강도 (MFI)로서 표시되었다.
실험군의 MFI는 세포만을 통해 측정된 MFI 값(background signal)을 빼준 후 처리하였다. 대조 튜브 (Alexa Fluor 488 단독, 그리고 경합이자 없음)의 MFI를 100%로 환산하여 경합이자 포함 튜브의 MFI의 백분율을 환산하였다.
인간 IgG1의 경합이자 포함 튜브의 MFI 보다 낮은 경우에 경합항체의 경합률이 높은 것으로 판단하였다. 도 3의 결과를 참조하여 살펴보면 HL161-1A, HL161-11G, HL161-11H는 블로킹 기능을 하는 것으로 확인되었다.
실시예 11. FACS 를 이용한 교차반응성 확인
블로킹 기능을 갖는 3종의 인간 항체가 다른종의 FcRn에 결합하여 각 종의 IgG가 FcRn에 결합하는 것을 블로킹할 수 있는지를 보기위해 각 종별 교차반응성을 확인 하였다. 자세한 실험내용은 다음과 같다.
1) 마우스 FcRn에 대한 교차반응성 확인
마우스 FcRn을 안정하게 발현하는 3T3-L1 세포를 10 % FCS DMEM 배지에서 배양한 다음, 트립신(trypsin)을 처리하여 배양 플레이트(culture plate)에서 떼어내었다. 콜드 바인딩 버퍼(Cold binding buffer) (PBS, pH 6.0 10 mM EDTA)로 3번의 세척 과정을 거친 후, 세포수를 105/ml이 되도록 바인딩 버퍼로 희석하여 세포를 준비하였다. 1.5 ml 튜브에 104개의 세포가 들어가도록 100 l씩 분주한 다음, 분주된 세포에 HL161 항체 (1 mg/ml) 1 l 넣어 주었다. 이후 얼음 위에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 실험의 컨트롤 항체로 마우스 FcRn에 결합하는 토끼 항체 (Santacruz, sc-66893)와 인간 IgG (Abcam, cat#. 409120)를 1 l씩 사용하였다. 4, 4000rpm 조건으로 5분동안 원심분리하여 세포를 회수한 다음, 바인딩 버퍼로 1회 세척한 다음, 100 l 바인딩 버퍼로 세포를 재현탁(resuspension)하였다. FITC 형광물질이 결합된 2차 항체로 항-인간 IgG 염소 항체 (Invitrogen, Cat#. A11013)를 1 l씩 세포에 넣어 주었다. 항-마우스 FcRn 토끼 항체의 실험의 경우는 항-토끼 항체를 1시간 동안 얼음 위에서 인큐베이션한 다음, 4, 700g 조건으로 5분동안 원심분리하여 세포를 회수한 다음, 바인딩 버퍼로 1회 세척 후, 최종적으로 400 ul 바인딩 버퍼에 세포를 재현탁한 다음, FACS 분석하여 마우스 FcRn에 대한 HL161 항체들의 교차반응성을 확인하였다(도 4 참조). pH 7.4의 조건은 바인딩 버퍼의 pH를 7.4로 유지하여 pH 6.0 바인딩 버퍼를 사용한 실험과정과 동일하게 진행하였다. 각 항체의 마우스 FcRn에 대한 결합 정도는 인간 IgG를 기준으로 상대적인 MFI로 나타내었다. pH 6.0과 pH 7.4 두 조건 모두에서 HL161 항체인 HL161-1A와 hl161-11G는 마우스 FcRn에 결합하였지만, HL161-11H는 결합하지 않았다(도 4 참조)
2) 랫 FcRn에 대한 교차 반응성 확인
랫 FcRn을 안정하게 발현하는 랫 피브로블라스트 인 Rat-2 (KCTC #. AC28203) 세포를 10 % FBS DMEM 배지에서 배양한 다음, 트립신을 처리하여 배양 플레이트 에서 떼어내었다. 콜드 바인딩 버퍼(PBS pH 6.0, 10 mM EDTA)로 3번의 세척 과정을 거친 후, 세포수를 105/ml이 되도록 바인딩 버퍼로 희석하여 세포를 준비하였다. 1.5 ml 튜브에 104세포가 들어가도록 100 l씩 분주한 다음, 분주된 세포에 HL161 항체 (1 mg/ml) 1 l 넣어 주었다. 이후 얼음 위에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 실험의 컨트롤 항체로 랫 FcRn에 결합하는 마우스 1G3 항체와 인간 IgG (Abcam, cat#. 409120)를 1 l씩 사용하였다. 1G3 항체는 마우스 하이브리도마 세포 (ATCC #. CRL2434)로부터 생산된 것을 정제하여 사용하였다. 4, 4000rpm 조건으로 5분 동안 원심분리하여 세포를 회수하여 바인딩 버퍼로 1회 세척한 다음, 100 l 바인딩 버퍼로 세포를 재현탁하였다. FITC 형광물질이 결합된 2차 항체로 항-인간 IgG 염소 항체 (Invitrogen, cat#. A11013)를 1 l씩 세포에 넣어 주었다. 항-랫 FcRn 마우스 항체를 처리한 실험의 경우는 항-마우스 IgG 염소 항체 (Invitrogen, cat#. A11001) 1시간 동안 얼음 위에서 인큐베이션한 다음, 4, 4000rmp 조건으로 5분 동안 원심분리하여 세포를 회수한 다음, 바인딩 버퍼로 1회 세척 후, 최종적으로 400 l 바인딩 버퍼에 세포를 재현탁한 다음, FACS 분석하여 마우스 FcRn에 대한 HL161 항체들의 교차반응성을 확인하였다(도 4 참조). pH 7.4의 조건은 바인딩 버퍼의 pH를 7.4로 유지하여 pH6.0 바인딩 버퍼를 사용한 실험과정과 동일하게 진행하였다. 각 항체의 랫 FcRn에 대한 결합 정도는 인간 IgG를 기준으로 상대적인 MFI로 나타내었다. pH 6.0과 pH7.4 두 조건 모두에서 HL161 항체인 HL161-1A와 HL161-11G는 랫 FcRn에 결합하였지만, HL161-11H는 결합하지 않았다(도 4 참조).
3) 원숭이 FcRn에 대한 교차 반응성 확인
원숭이 FcRn을 안정하게 발현하는 Cos7 세포를 10 % FBS DMEM 배지에서 배양한 다음, 트립신을 처리하여 배양 플레이트에서 떼어내었다. 콜드 바인딩 버퍼 (PBS pH 6.0, 10 mM EDTA)로 3번의 세척 과정을 거친 후, 세포수를 105/ml이 되도록 바인딩 버퍼로 희석하여 세포를 준비하였다. 1.5 ml 튜브에 104세포가 들어가도록 100 l씩 분주한 다음, 분주된 세포에 HL161 항체 (1 mg/ml) 1 l 넣어주었다. 이후 얼음 위에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 실험의 컨트롤 항체로 사이노몰구스 원숭이 IgG (Equitech-Bio Inc, cat#. SLCM66 0100)와 인간 IgG (Abcam, cat#. 409120)를 1 g 씩 사용하였다. 4, 700g 조건으로 5분 동안 원심분리하여 세포를 회수한 다음, 바인딩 버퍼로 1회 세척한 다음, 100 l 바인딩 버퍼로 세포를 재현탁였다. FITC 형광물질이 결합된 2차 항체인 항-인간 IgG 염소 항체 (Invitrogen, cat#. A11013)를 1 l씩 세포에 넣어 준 다음, 1시간 동안 얼음 위에서 인큐베이션하였다. 이후, 4, 700g 조건으로 5분 동안 원심분리하여 세포를 회수한 다음, 바인딩 버퍼로 1회 세척 후, 최종적으로 400 l 바인딩 버퍼에 세포를 재현탁한 다음, FACS 분석하여 마우스 FcRn에 대한 HL161 항체들의 교차반응성을 확인하였다(도 4 참조). pH 7.4의 조건은 바인딩 버퍼의 pH를 7.4로 유지하여 pH 6.0 바인딩 버퍼를 사용한 실험과정과 동일하게 진행하였다. 각 항체의 원숭이 FcRn에 대한 결합 정도는 인간 IgG를 기준으로 상대적인 MFI로 나타내었다. pH 6.0과 pH 7.4 두 조건 모두에서 HL161 항체인 HL161-1A와 HL161-11G 그리고 HL161-11H는 원숭이 FcRn에 결합하였다(도 4 참조).
실시예 12. mFcRn -/- hFCRN 형질전환 276 마우스에서 인간 항체의 효력시험
FACS 분석에 의해 hFcRn에 결합하여 hIgG1의 결합을 블로킹하는 3종의 인간항체 중 2종을 골라 hFcRn이 발현되는 Tg276(hFcRn+/+, h2m+/+, mFcRn-/-, m2m-/-) 마우스(Jackson Laboratory)에 인간 IgG를 주사한 후 HL161_1A와 HL161_11H 및 인간 IgG를 투여하여 인간 IgG의 이화작용(catabolism)에 영향을 주는지 알아보았다. HL161 후보물질 2종(HL161_1A와 HL161_11H), 및 인간 IgG(Greencross, IVglobulinS)를 1 mg/mL로 조제하여 4일 투여를 위해 분주하여 보관하였고 전달체(vehicle)로 pH 7.4의 PBS (Phosphate buffered saline) 을 사용하였다. hFcRn Tg276 마우스는 약 7일간 적응시켜서 사용하였으며, 물과 사료는 자유롭게 섭취하도록 하였고, 온도(23 2 ), 습도(55 5%) 및 명암주기(12시간)는 자동으로 조절되도록 하였다. 각 군마다 3마리로 실험을 진행하였으며, 전달체군은 1 마리로 실험을 진행하였다. 인간 IgG을 추적물질(tracer)로 사용하기 위해 비오틴(Biotin)이 접합된 hIgG를 kit(Pierce, Cat#. 21327)를 사용하여 제조하였다. 제조자의 프로토콜을 따라 제조하였고 제조된 비오틴-IgG를 5 mg/kg의 용량으로 복강주사하였다. 약물의 투여는 비오틴-IgG의 투여 후 24, 48, 72, 96시간 후에 10 mg/kg의 용량으로 복강주사하였다. 채혈은 포란액(Isoflurane, JW pharmaceutical)을 이용하여 가볍게 마취시킨 후, 헤파린 처리된 마이크로-헤마토그리트 튜브(Heparinized Micro-hematocrit capillary tube)(Fisher)를 사용하여, 안와정맥총에서 채혈을 진행하였다. 비오틴-IgG의 투여 후 6, 12, 24, 48, 72, 96, 120, 168시간 후에 진행하였으며, 24, 48, 72, 96 시간에는 채혈 진행 후 약물을 투여하였다. 0.1 mL의 전혈을 에펜도르프 튜브(Eppendorf tube)에 받은 후 바로 원심분리기로 혈장을 분리하여 분석 전까지 딥 프리저(Deep freezer)(Thermo)에 -70 상태로 보관하였다.
채혈된 혈액속 비오틴-hIgG1 양은 다음과 같이 ELISA 방법에 의해 분석되었다. 96 웰 플레이트(Costar, Cat. No: 2592)에 1.0 g/ml 농도가 되도록 100 l 뉴트라비딘(Neutravidin)(Pierce, 31000)를 주입한 후, 4에서 16시간 고정화하였다. 버퍼 A(Buffer A) (0.05 % Tween-20, 10 mM PBS, pH 7.4)을 이용하여 3회 플레이트를 세척 후, 1% BSA가 포함된 PBS (pH 7.4) 용액으로 2시간 상온에서 반응시켰다. 버퍼 A를 이용하여 3회 플레이트를 세척한 후, 1 g/ml 에 해당하도록 0.5 % BSA가 포함된 PBS(pH 7.4) 용액으로 뉴트라비딘 플레이트를 제조하였다. 각 웰에 버퍼 B(Buffer B) (100 mM MES, 150 mM NaCl, 0.5 % BSA IgG-free, 0.05 % Tween-20, pH 6.0)를 이용하여 혈액 시료를 500배 에서 1000배 범위로 순차적 희석(serial dilution)을 진행하여 각 150 l씩 플레이트에 주입하였다. 주입된 시료는 상온에서 1시간 반응시켰다. 버퍼 A를 이용하여 3회 플레이트를 세척한 후 HRP가 접합된 항 인간 IgG 염소항체를 1nM로 제조한 후 200 l씩 주입하여 37도에서 2시간 반응시켰다. 얼음을 이용하여 냉각된(Ice cold) 버퍼 B를 사용하여 3회 플레이트를 세척 후, 기질 용액인 3,3,5,5-테트라메틸벤지딘(tetramethylbenzidine, RnD, Cat. No: DY999)를 100 l 주입한 후 상온에서 15분 반응시켰다. 1.0 M 황산 용액(삼전, Cat. No: S2129) 50 l를 주입하여 반응을 중지한 후, 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
6시간 (마우스에서 비오틴-IgG의 대략적인 Tmax이자, 비오틴-IgG의 이화작용이 일어나기 전 시간) 경과 후의 비오틴-IgG의 농도를 100%로 고정하고, 나머지 시간의 농도를 %로 표시한 결과는 도 5에 도시되어 있다.
전달체군의 반감기는 97.55시간이었으며, IVIG 효과를 보기 위한 hIgG군의 반감기는 75시간이었다. HL161의 두 후보물질인 HL161-1A와 HL161-11H의 반감기는 각각 72, 57시간이었다. HL161-1A의 경우 전달체군에 비해 반감기가 25시간 이상 짧아졌으나, hIgG군과 유사한 반감기를 보였다. HL161-11H의 경우 전달체군에 비하여 반감기가 40시간 이상 짧아졌으며, hIgG군에 비해서도 약 20시간 가량이 짧아졌다. 이를 통해 hFcRn에 pH 비의존적, Fc 비경합적인 항체가 내인성 항체의 이화작용 증가에 효력이 있다는 것을 확인하였다.
Part II. 친화도 개선(Affinity Maturation)을 통한 FcRn 특이적 인간 항체의 최적화
실시예 13. 친화도 개선을 통한 후보 항체의 최적화
13.1 1차 친화도 개선
분리정제된 shFcRn(수용성(soluble) human FcRn)을 항원으로 사용하여 상기 실시예 1 내지 12를 통하여 가장 효과가 좋다고 판단된 HL161-1A 및 HL161-11H를 친화도 개선을 위한 항체로 선정하고, 상기 HL161-1A 및 HL161-11H의 아미노산 서열이 인간 점라인(germline)에서 많이 발견되는 아미노산 서열로 변경된 1Ag 및 11Hg를 기초로 1차 친화도 개선을 수행하였다. 상기 1Ag 및 11Hg는 하기 표 6 및 7에 기재된 가변영역 서열 및 CDR 서열을 가진다.
단된 HL161-1A 및 HL161-11H를 친화도 개선을 위한 항체로 선정하고, 상기 HL161-1A 및 HL161-11H의 아미노산 서열이 인간 점라인(germline)에서 많이 발견되는 아미노산 서열로 변경된 1Ag 및 11Hg를 기초로 1차 친화도 개선을 수행하였다. 상기 1Ag 및 11Hg는 하기 표 6 및 7에 기재된 가변영역 서열 및 CDR 서열을 가진다.
1 Ag 및 11 Hg 의 가변영역 서열
클론명 중쇄 가변영역 경쇄 가변영역
서열번호 아미노산 서열 서열번호 아미노산 서열
1Ag 289 EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDEYGMHWVRQAPGKGLEWVSGVSWNSGSIAYADSVRGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKGRSMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 290 QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGSSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVTKRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYSSSTFYVFGTGTKVTVLGRSVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
11Hg 291 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYAMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGSGGRDAFDVWGQGTMITVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 292 DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSRLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLETGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQTNSFPLTFGGGTKVEIKRSVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
1 Ag 및 11 Hg 의 CDR 서열
클론명 중쇄 가변영역 경쇄 가변영역
서열번호 CDR1 CDR2 CDR3 서열번호 CDR1 CDR2 CDR3
1Ag 289 EYGMH GVSWNSGSIAYADSVRG GRSMDV 290 TGSSSDVGGYNYVS DVTKRPS SSYSSSTFYV
11Hg 291 SYAMH VISYDGSNKYYADSVKG GSGGRDAFDV 292 RASQSISSRLA KASSLET QQTNSFPLT
친화도 개선을 위해, scFv 형태의 라이브러리(scFv format library)로부터 pH 6.0에서 pH 7.4 범위 내에서 pH에 비의존적으로 결합하는 항체를 선별하여 유전자 분석을 수행한 후, 25개의 특이적인 항체를 분리 정제한 다음, SPR을 통한 항체의 결합력을 측정하여 결합력과 특이성이 향상된 항체를 2차 친화도 개선을 위한 주형으로 선별하였다. 자세한 방법은 다음과 같다.
(1) 라이브러리 구축
1Ag와 11Hg의 CDR-H3는 랜덤화 과정에서 항원에 대한 결합 활성이나 표면 단백질 변화를 최소화하기 위하여 하나의 위치에 포화 랜덤화(saturated randomization)를 진행하였으며, 일부 자주 나오는 잔기의 경우는 변경하지 않거나 제한적으로 랜덤화를 진행하였으며, CDR-L3의 경우는 인간 점라인(germline) 항체 유전자를 분석하여 각 위치에서 자주 나오는 아미노산을 포함 할 수 있도록 랜덤화를 진행 하였다. 랜덤화된 부위에 대한 올리고뉴클레오타이드를 합성하여 PCR 방법으로 랜덤호된(randomized) scFv 유전자를 확보하고, pComb3X 벡터에 Sfi-I 제한효소를 이용하여 라이게이션 한 후 E. coli ER2537 균주에 전기천공법으로 형질전환을 수행하여 1Ag에 대하여 8.0x106 및 11Hg에 대하여 5.0x106의 다양성을 가진 라이브러리를 구축하였다(도 6 참조).
(2) 패닝(Panning)
패닝 전략은 pH 6.0에서 항원과 강하게 결합하고 (low KD) pH7.4에서 잘 떨어지지 않는 (low Koff)클론 선별을 목표로 항원으로 Biotinylated hFcRn (100 ng)과 hFcRn을 발현하는 HEK293 세포(60-mm, 80% confluence)를 사용하였다. HEK293-hFcRn 세포를 이용하는 경우에는 3.7% 포름알데하이드를 고정한 후에 패닝을 진행하였고 1Ag는 고정된 수용성 세포(soluble cell)를 사용하였으며 11Hg의 경우는 고정된 부착 세포(adhesion cell)을 사용하였다. Koff 향상을 위하여 세척 조건에서 시간을 증가하고 shFcRn를 첨가하였다. 단백질을 이용하는 경우에는 첫 번째 라운드(1st round)를 제외하고는 24시간 동안 shFcRn을 첨가하여 세척하였고, 세포를 이용하는 경우에는 15회 세척(약 2시간)을 진행하였다. 패닝을 진행함에 따라서 아웃풋 티터(output titer)가 증가하는 것을 통하여 증강(enrichment) 되었다고 판단하였다.
(3) ELISA 및 Dot-blot 스크리닝
ELISA 및 dot-blot 스크리닝을 위하여 각 콜로니를 0.15 mL SB 배지를 이용하여 배양하고 1 mM IPTG로 밤새 유도(overnight induction)시킨 후, 0.1 mL의 TES를 이용하여 페리플라스믹(periplasmic) 추출물을 확보하였다. ELISA는 30 ng, 10 ng, 5 ng의 수용성 hFcRn을 직접 코팅하여 페리플라스믹 추출물을 결합시키고 anti-HA-HRP를 결합 후 TMB 시약을 이용하여 수행하였다. Dot-blot의 경우 페리플라스믹 추출물을 1:3~1:5로 PBS를 이용하여 희석 시킨 후, 1 mL를 니트로셀룰로스 멤브레인에 dotting 후 anti-HA-HRP를 결합시키고 AbSignal (Abclon, Korea)을 이용하여 확인하였다. 이 때, ELISA와 수치 비교를 위하여 parental scFv의 페리플라스믹 추출물을 1:2로 순차 희석하여 표준으로 사용하였다. 높은 친화도를 가지는 바인더(high affinity binder)의 선별은 parental scFv의 dot-blot과 ELISA 수치를 기준으로 하여 parental scFv보다 발현량이 적으면서 ELISA 수치가 높은 클론을 선별하였다. 1Ag의 경우 855개의 Strategy-1의 4th 아웃풋 콜로니, 1425개의 Strategy-2의 3rd 아웃풋 콜로니, 855개의 Strategy-2의 5th 아웃풋 콜로니를 대상으로 ELISA 및 dot-blot 스크리닝을 진행하였다. pH 7.4와 pH 6.0에서 높은 친화도를 가지는 바인더를 선별하기 위하여 3개 농도의 shFcRn을 대상으로 한 ELISA를 통해 scFv level을 비교하였다. 그 결과 Strategy-1의 4th 아웃풋에서 40개의 콜로니가, Strategy-2의 3rd 아웃풋에서 41개의 콜로니가, Strategy-2의 5th 아웃풋에서 40개의 콜로니가 선별되었다.
(4) 염기서열 분석
1Ag를 기초로 한 라이브러리에서 선별된 121개의 콜로니를 대상으로 서열 분석을 진행하여 74개의 고유 서열 클론을 확보하였다. 이들 중 30 종의 추정되는(putative) 글리코실레이션 사이트가 없는 클론을 확보하였다.
11Hg를 기초로 한 라이브러리에서 선별된 88개 콜로니를 대상으로 서열 분석을 진행하여 37개의 고유 클론을 확보하였다. 이들 중 25개의 추정되는 글리코실레이션 사이트가 없는 클론을 확보하였다.
(5) 개선된 친화도를 갖는 1Ag 및 11Hg 유래 후보 항체 정제
ELISA, cELISA 및 SPR Koff를 측정을 수행하기 위해 scFv를 정제하였다. 20~50 mL의 SB 배지를 이용하여 배양 후 1 mM IPTG를 이용하여 밤새 유도(overnight induction)시킨 후 후, 1:5~1:8 부피의 TES 버퍼(buffer)를 이용하여 페리플라스믹 추출물을 확보하였다. scFv 정제는 Ni-NTA를 이용한 친화성 크로마토그래피를 통한 정제를 진행하였다. Koff 측정을 위하여 1Ag 유래의 17개 클론 및 11Hg 유래의 8개 클론이 정제되었다.
(6) ELISA 및 SPR을 통한 결합력 측정
ELISA 평가는 pH 6.0 조건과 pH 7.4 조건에서 평가하며, 모든 버퍼 및 샘플은 pH6.0 과 pH 7.4로 맞추어 진행하였다. shFcRn을 PBS로 희석하여 2 g/mL (pH 6.0 or pH 7.4)이 되도록 만든 후 96 웰 플레이트(well plate)에 웰 당 100 L를 넣고 상온에서 2시간 코팅 하였다 (또는 4에서 O/N 코팅 한다). 세척 버퍼(wash buffer) (pH 6.0 or pH 7.4)로 3회 세척 후 용액이 웰에 남지 않도록 흡입한 뒤 블로킹 버퍼 200 L (pH 6.0 or pH 7.4)를 각 웰에 넣은 후 2시간 동안 상온에서 블로킹 시켰다. 블로킹이 끝나면 세척 버퍼로 3번 세척하고 1Ag 유래 변이체(variant)의 경우는 100 ng/mL, 11Hg 유래 변이체(variant)의 경우는 150 ng/mL의 scFv 용액을 각각 100 L 씩 96 웰 플레이트에 첨가하여 2시간 배양시켰다. 그 뒤 세척 버퍼로 3번 세척하고 shFcRn에 결합한 항체를 검출하기 위해서 항-HA-HRP 항체(anti-HA-HRP antibody) (1:2,000, pH 6.0 or pH 7.4)를 넣어준 뒤 2시간 동안 상온에서 배양시켰다. 웰을 세척 버퍼 (pH 6.0 or pH 7.4)로 3번 세척 후 TMB 용액 100 L를 각 웰에 넣어 주고 상온에서 10분 반응 시켰다. 10분 후 정지 용액(stop solution) (H2SO4 solution) 50L를 넣어주어 반응을 정지시킨 후 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
scFv의 Koff 값(rate) 분석은 Biorad-XPR36 장비를 사용하여 메뉴얼을 따라 측정하였다. shFcRn을 GLC 칩에 고정시키고, 여기에 scFv를 한 농도로 첨가하여 Sensorgram 결과를 확보하였다. 리간드인 shFcRn를 2000RU 이상으로 고정화 한 후 부분적으로 정제된 scFv를 400 nM injection sensogram을 얻은 후 Proteon manager program을 이용 Koff를 분석하여 표 8과 표 9에 정리하였다.

(1) 라이브러리 구축
1Ag와 11Hg의 CDR-H3는 랜덤화 과정에서 항원에 대한 결합 활성이나 표면 단백질 변화를 최소화하기 위하여 하나의 위치에 포화 랜덤화(saturated randomization)를 진행하였으며, 일부 자주 나오는 잔기의 경우는 변경하지 않거나 제한적으로 랜덤화를 진행하였으며, CDR-L3의 경우는 인간 점라인(germline) 항체 유전자를 분석하여 각 위치에서 자주 나오는 아미노산을 포함 할 수 있도록 랜덤화를 진행 하였다. 랜덤화된 부위에 대한 올리고뉴클레오타이드를 합성하여 PCR 방법으로 랜덤호된(randomized) scFv 유전자를 확보하고, pComb3X 벡터에 Sfi-I 제한효소를 이용하여 라이게이션 한 후 E. coli ER2537 균주에 전기천공법으로 형질전환을 수행하여 1Ag에 대하여 8.0x106 및 11Hg에 대하여 5.0x106의 다양성을 가진 라이브러리를 구축하였다(도 6 참조).
(2) 패닝(Panning)
패닝 전략은 pH 6.0에서 항원과 강하게 결합하고 (low KD) pH7.4에서 잘 떨어지지 않는 (low Koff)클론 선별을 목표로 항원으로 Biotinylated hFcRn (100 ng)과 hFcRn을 발현하는 HEK293 세포(60-mm, 80% confluence)를 사용하였다. HEK293-hFcRn 세포를 이용하는 경우에는 3.7% 포름알데하이드를 고정한 후에 패닝을 진행하였고 1Ag는 고정된 수용성 세포(soluble cell)를 사용하였으며 11Hg의 경우는 고정된 부착 세포(adhesion cell)을 사용하였다. Koff 향상을 위하여 세척 조건에서 시간을 증가하고 shFcRn를 첨가하였다. 단백질을 이용하는 경우에는 첫 번째 라운드(1st round)를 제외하고는 24시간 동안 shFcRn을 첨가하여 세척하였고, 세포를 이용하는 경우에는 15회 세척(약 2시간)을 진행하였다. 패닝을 진행함에 따라서 아웃풋 티터(output titer)가 증가하는 것을 통하여 증강(enrichment) 되었다고 판단하였다.
(3) ELISA 및 Dot-blot 스크리닝
ELISA 및 dot-blot 스크리닝을 위하여 각 콜로니를 0.15 mL SB 배지를 이용하여 배양하고 1 mM IPTG로 밤새 유도(overnight induction)시킨 후, 0.1 mL의 TES를 이용하여 페리플라스믹(periplasmic) 추출물을 확보하였다. ELISA는 30 ng, 10 ng, 5 ng의 수용성 hFcRn을 직접 코팅하여 페리플라스믹 추출물을 결합시키고 anti-HA-HRP를 결합 후 TMB 시약을 이용하여 수행하였다. Dot-blot의 경우 페리플라스믹 추출물을 1:3~1:5로 PBS를 이용하여 희석 시킨 후, 1 mL를 니트로셀룰로스 멤브레인에 dotting 후 anti-HA-HRP를 결합시키고 AbSignal (Abclon, Korea)을 이용하여 확인하였다. 이 때, ELISA와 수치 비교를 위하여 parental scFv의 페리플라스믹 추출물을 1:2로 순차 희석하여 표준으로 사용하였다. 높은 친화도를 가지는 바인더(high affinity binder)의 선별은 parental scFv의 dot-blot과 ELISA 수치를 기준으로 하여 parental scFv보다 발현량이 적으면서 ELISA 수치가 높은 클론을 선별하였다. 1Ag의 경우 855개의 Strategy-1의 4th 아웃풋 콜로니, 1425개의 Strategy-2의 3rd 아웃풋 콜로니, 855개의 Strategy-2의 5th 아웃풋 콜로니를 대상으로 ELISA 및 dot-blot 스크리닝을 진행하였다. pH 7.4와 pH 6.0에서 높은 친화도를 가지는 바인더를 선별하기 위하여 3개 농도의 shFcRn을 대상으로 한 ELISA를 통해 scFv level을 비교하였다. 그 결과 Strategy-1의 4th 아웃풋에서 40개의 콜로니가, Strategy-2의 3rd 아웃풋에서 41개의 콜로니가, Strategy-2의 5th 아웃풋에서 40개의 콜로니가 선별되었다.
(4) 염기서열 분석
1Ag를 기초로 한 라이브러리에서 선별된 121개의 콜로니를 대상으로 서열 분석을 진행하여 74개의 고유 서열 클론을 확보하였다. 이들 중 30 종의 추정되는(putative) 글리코실레이션 사이트가 없는 클론을 확보하였다.
11Hg를 기초로 한 라이브러리에서 선별된 88개 콜로니를 대상으로 서열 분석을 진행하여 37개의 고유 클론을 확보하였다. 이들 중 25개의 추정되는 글리코실레이션 사이트가 없는 클론을 확보하였다.
(5) 개선된 친화도를 갖는 1Ag 및 11Hg 유래 후보 항체 정제
ELISA, cELISA 및 SPR Koff를 측정을 수행하기 위해 scFv를 정제하였다. 20~50 mL의 SB 배지를 이용하여 배양 후 1 mM IPTG를 이용하여 밤새 유도(overnight induction)시킨 후 후, 1:5~1:8 부피의 TES 버퍼(buffer)를 이용하여 페리플라스믹 추출물을 확보하였다. scFv 정제는 Ni-NTA를 이용한 친화성 크로마토그래피를 통한 정제를 진행하였다. Koff 측정을 위하여 1Ag 유래의 17개 클론 및 11Hg 유래의 8개 클론이 정제되었다.
(6) ELISA 및 SPR을 통한 결합력 측정
ELISA 평가는 pH 6.0 조건과 pH 7.4 조건에서 평가하며, 모든 버퍼 및 샘플은 pH6.0 과 pH 7.4로 맞추어 진행하였다. shFcRn을 PBS로 희석하여 2 g/mL (pH 6.0 or pH 7.4)이 되도록 만든 후 96 웰 플레이트(well plate)에 웰 당 100 L를 넣고 상온에서 2시간 코팅 하였다 (또는 4에서 O/N 코팅 한다). 세척 버퍼(wash buffer) (pH 6.0 or pH 7.4)로 3회 세척 후 용액이 웰에 남지 않도록 흡입한 뒤 블로킹 버퍼 200 L (pH 6.0 or pH 7.4)를 각 웰에 넣은 후 2시간 동안 상온에서 블로킹 시켰다. 블로킹이 끝나면 세척 버퍼로 3번 세척하고 1Ag 유래 변이체(variant)의 경우는 100 ng/mL, 11Hg 유래 변이체(variant)의 경우는 150 ng/mL의 scFv 용액을 각각 100 L 씩 96 웰 플레이트에 첨가하여 2시간 배양시켰다. 그 뒤 세척 버퍼로 3번 세척하고 shFcRn에 결합한 항체를 검출하기 위해서 항-HA-HRP 항체(anti-HA-HRP antibody) (1:2,000, pH 6.0 or pH 7.4)를 넣어준 뒤 2시간 동안 상온에서 배양시켰다. 웰을 세척 버퍼 (pH 6.0 or pH 7.4)로 3번 세척 후 TMB 용액 100 L를 각 웰에 넣어 주고 상온에서 10분 반응 시켰다. 10분 후 정지 용액(stop solution) (H2SO4 solution) 50L를 넣어주어 반응을 정지시킨 후 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
scFv의 Koff 값(rate) 분석은 Biorad-XPR36 장비를 사용하여 메뉴얼을 따라 측정하였다. shFcRn을 GLC 칩에 고정시키고, 여기에 scFv를 한 농도로 첨가하여 Sensorgram 결과를 확보하였다. 리간드인 shFcRn를 2000RU 이상으로 고정화 한 후 부분적으로 정제된 scFv를 400 nM injection sensogram을 얻은 후 Proteon manager program을 이용 Koff를 분석하여 표 8과 표 9에 정리하였다.
1Ag CDR-3 무작위 돌연변이에 의한 ELISA 및 SPR 결과
클론 명 scFv
ELISA (OD450) SPR Koff 값
(pH6.0) (pH7.4) (pH6.0) (pH7.4)
B04 0.22 0.08 3.41E-04 3.10E-04
1Ag (parent) 0.35 0.38 2.22E-04 2.12E-04
A11-A01 1.31 0.86 1.49E-04 2.13E-03
A11-C07 3.50 2.40 3.93E-04 2.48E-03
A11-G06 1.48 0.99 2.25E-04 4.96E-04
A11-A02 0.93 0.80 1.69E-04 8.50E-04
A12-A03 0.60 0.86 3.43E-04 4.81E-04
A12-A05 0.87 0.56 6.57E-05 3.07E-04
A12-B02 1.06 0.74 1.29E-04 3.07E-04
A12-B03 1.03 0.86 1.58E-04 6.07E-04
A12-B04 ND ND 2.73E-04 3.46E-03
A12-C01 0.59 0.46 2.93E-04 3.52E-04
A12-C04 0.95 0.71 2.88E-04 3.62E-04
A12-C09 1.63 1.30 1.77E-04 9.09E-04
A12-D02 0.64 0.60 1.61E-04 4.70E-04
A12-D04 0.42 0.44 8.51E-05 8.79E-04
A12-D05 1.21 1.16 1.31E-04 9.64E-04
A12-E01 1.71 1.05 5.99E-05 1.15E-03
A12-E04 1.59 1.29 1.32E-04 1.37E-03
A12-E05 2.06 1.80 2.16E-04 2.22E-03
A12-F02 2.17 2.40 3.05E-04 2.25E-04
A12-F05 0.43 0.42 1.29E-04 4.92E-04
A12-F08 1.08 0.74 1.08E-04 9.31E-04
A12-G05 0.68 0.50 7.01E-05 3.72E-04
A12-G07 0.74 0.71 1.05E-04 5.89E-04
A12-G08 0.74 0.64 1.33E-04 4.01E-04
A12-H01 0.49 0.40 3.38E-04 3.31E-04
A12-H04 2.26 1.57 2.20E-04 2.35E-03
A12-H06 1.13 0.99 2.76E-04 5.72E-04
A12-H08 0.93 0.84 2.44E-04 4.79E-04
A12-H09 1.26 1.30 3.88E-04 2.54E-04
A12-H51 0.59 0.68 2.72E-05 1.12E-03
11 Hg CDR -3 무작위 돌연변이에 의한 친화도 개선 결과
클론 명 scFv
ELISA ( OD450 ) SPR K off 값
( pH6 .0) ( pH7 .4) ( pH6 .0) ( pH7 .4)
B04 0.32 0.15 3.41E-04 3.10E-04
11Hg (parent) 0.24 0.42 4.34E-04 4.33E-04
H11-A02 0.29 0.36 2.29E-04 4.18E-04
H11-A03 0.38 0.68 2.44E-04 4.17E-04
H11-A05 0.27 0.27 3.45E-04 3.38E-04
H11-A07 0.22 0.70 2.17E-04 5.52E-04
H11-B03 0.28 0.39 4.30E-04 7.81E-04
H11-B04 0.16 0.09 5.43E-04 5.46E-04
H11-B07 0.21 0.45 6.99E-04 6.04E-04
H11-B08 0.19 0.12 1.15E-03 6.57E-04
H11-D07 0.33 0.47 1.60E-04 1.15E-03
H11-D08 0.20 0.62 3.81E-04 5.97E-04
H11-E03 0.17 0.07 3.65E-04 5.13E-04
H11-E05 0.23 0.20 5.46E-04 7.02E-04
H11-E08 0.20 0.80 2.59E-04 5.15E-04
H11-F04 0.18 0.21 9.02E-04 5.93E-04
H11-H05 0.15 0.04 3.01E-04 4.52E-04
H11-H06 0.15 0.09 5.25E-04 5.45E-04
H12-A01 0.26 0.36 4.57E-04 4.23E-04
H12-A09 0.21 0.54 1.50E-04 6.34E-04
H12-A11 0.22 0.24 3.72E-04 5.54E-04
H12-A12 0.14 0.11 2.62E-04 5.27E-04
H12-B01 0.22 0.12 3.24E-04 4.46E-04
H12-B09 0.26 0.49 2.96E-04 3.81E-04
H12-B11 0.15 0.58 3.63E-04 4.54E-04
H12-C09 0.16 0.16 2.83E-04 4.35E-04
H12-C10 ND ND ND 3.31E-03
H12-D12 0.17 0.12 5.90E-04 6.79E-04
H12-E12 ND ND 2.57E-04 3.72E-04
H12-F09 0.40 0.58 1.40E-03 4.18E-04
H12-F10 ND ND 2.39E-04 4.48E-04
상기 표 8 및 표 9에 기재된 바와 같이 CDR-3 랜덤 뮤테이션을 클론 중 ELISA와 SPR 시험(test)을 통해 1Ag 유래 클론 중 주형 대비 친화도가 증가한 A11-C07, A11-G06, A12-C09, A12-D55, A12-E01, A12-E04, A12-F02, A12-H04 8종을 2차 친화도 개선을 위한 주형으로 선정하였고 11Hg 유래 클론의 경우 주형 대비 친화도가 증가한 것이 없어 클론 중 2차 친화도 개선을 위한 주형으로 선정하지 않았다.
실시예 13.2 2차 친화도 개선
분리정제된 shFcRn(수용성(soluble) human FcRn)을 항원으로 사용하여 실시예 13-1을 통하여 선별된 1Ag의 주형 항체 및 11Hg의 2차 친화도 개선을 위한 scFv 형태 라이브러리로부터 pH 6.0에서 pH 7.4 범위 내에서 pH에 비의존적으로 결합하는 항체를 선별하여 유전자 분석을 수행한 후, 특이적인 항체들을 분리 정제한 다음, SPR을 통한 항체의 결합력을 측정하여 56종의 최적화된 완전 인간 항체를 선별하였다. 자세한 방법은 다음과 같다.
(1) 라이브러리의 구축
1Ag의 경우 CDR-3 랜덤화를 통해 친화도가 개선된 8개 클론 (A11-C07, A11-G06, A12-C09, A12-D55, A12-E01, A12-E04, A12-F02, A12-H04)의 CDR-1 및 CDR-2를 랜덤화한 서브 라이브러리(sub-library)를 구축하였고 11Hg의 경우 CDR-L3는 주형 서열을 유지하고 CDR-H3의 3개 위치 및 CDR-1/2를 랜덤화한 서브 라이브러리를 구축하였다.
인간 항체 서열의 분석을 통해 CDR-1 및 CDR-2의 각 아미노산 위치에 나오는 아미노산을 분석하여 이와 유사한 정도의 다양성을 갖도록 랜덤화하였다. 랜덤화된 부위에 대한 올리고뉴클레오타이드를 합성하여 PCR 방법으로 랜덤화된 scFv 유전자를 확보하고, pComb3X 벡터에 Sfi-I 제한효소를 이용하여 라이게이션하였다. 이후 E. coli ER2537 균주에 전기천공법으로 형질전환을 수행하여 1.0x107개의 형질전환체를 얻었다. 83개 콜로니를 대상으로 염기서열을 분석한 결과 29개 콜로니가 정상적인 scFv 서열을 갖고 있어 최종 서브 라이브러리의 다양성은 1Ag 유래가 3.5x106, 11Hg 유래가 1.3x107으로 확인되었다.
(2) Panning
패닝 전략은 pH 6.0에서 항원과 강하게 결합하고 (low KD),pH7.4에서 잘 떨어지지 않는 낮은 Koff 값을 가지는 클론 선별을 목표로 항원으로 Biotinylated hFcRn (biotin-hFcRn)과 hFcRn을 발현하는 HEK293 세포(293-hFcRn)를 사용하였다. HEK293-hFcRn 세포를 이용하는 경우에는 Trypsin-EDTA를 이용하여 단일 세포(single cell) 상태로 만들고 3.7% 포름알데하이드(formaldehyde)로 고정(fixation)한 후에 패닝을 진행하였다.
(2-a) 1Ag 서브 라이브러리 패닝
표 10의 방법에 따라 패닝을 진행하였다. Strategy-1 및 3의 경우에는 biotin-shFcRn (100 ng) 만을 사용하였으며, Strategy-4 및 5의 경우에는 1차와 2차에서는 biotin-hFcRn을 3차와 4차에서는 293-hFcRn (1.0x106 cells)을 사용하였다. 그리고 Strategy-3, -4, -5에서는 결합 시에 soluble parental IgG를 경쟁제로 사용하였다. 결합은 phage titration kit를 이용하여 정량 후 1.0x1012 파지를 사용하여 pH 6.0에서 상온에서 2시간 동안 진행되었고 Koff 향상을 위하여 세척 조건(wash condition)에서 시간을 증가하고 shFcRn를 첨가하여 진행하였다. 결합 후에 PBS-T를 이용하여 10회 세척를 통하여 결합되지 않은 파지(unbound phage)를 제거하고 shFcRn이 있는 PBS-T를 이용하여 37에서 20시간동안 회전시키며 배양하였다. 이후 다시 PBS-T를 이용하여 10회 세척하고 100mM TEA (triethylamine)를 이용하여 파지를 용출하였다. 서브 라이브러리로부터 파지를 얻고 정량 후 ELISA를 진행한 결과 ELISA 신호가 주형에 비하여 낮지 않다고 판단하여 1차부터 parental IgG를 결합 시 경쟁제로 사용하였다.
실시예 13.2 2차 친화도 개선
분리정제된 shFcRn(수용성(soluble) human FcRn)을 항원으로 사용하여 실시예 13-1을 통하여 선별된 1Ag의 주형 항체 및 11Hg의 2차 친화도 개선을 위한 scFv 형태 라이브러리로부터 pH 6.0에서 pH 7.4 범위 내에서 pH에 비의존적으로 결합하는 항체를 선별하여 유전자 분석을 수행한 후, 특이적인 항체들을 분리 정제한 다음, SPR을 통한 항체의 결합력을 측정하여 56종의 최적화된 완전 인간 항체를 선별하였다. 자세한 방법은 다음과 같다.
(1) 라이브러리의 구축
1Ag의 경우 CDR-3 랜덤화를 통해 친화도가 개선된 8개 클론 (A11-C07, A11-G06, A12-C09, A12-D55, A12-E01, A12-E04, A12-F02, A12-H04)의 CDR-1 및 CDR-2를 랜덤화한 서브 라이브러리(sub-library)를 구축하였고 11Hg의 경우 CDR-L3는 주형 서열을 유지하고 CDR-H3의 3개 위치 및 CDR-1/2를 랜덤화한 서브 라이브러리를 구축하였다.
인간 항체 서열의 분석을 통해 CDR-1 및 CDR-2의 각 아미노산 위치에 나오는 아미노산을 분석하여 이와 유사한 정도의 다양성을 갖도록 랜덤화하였다. 랜덤화된 부위에 대한 올리고뉴클레오타이드를 합성하여 PCR 방법으로 랜덤화된 scFv 유전자를 확보하고, pComb3X 벡터에 Sfi-I 제한효소를 이용하여 라이게이션하였다. 이후 E. coli ER2537 균주에 전기천공법으로 형질전환을 수행하여 1.0x107개의 형질전환체를 얻었다. 83개 콜로니를 대상으로 염기서열을 분석한 결과 29개 콜로니가 정상적인 scFv 서열을 갖고 있어 최종 서브 라이브러리의 다양성은 1Ag 유래가 3.5x106, 11Hg 유래가 1.3x107으로 확인되었다.
(2) Panning
패닝 전략은 pH 6.0에서 항원과 강하게 결합하고 (low KD),pH7.4에서 잘 떨어지지 않는 낮은 Koff 값을 가지는 클론 선별을 목표로 항원으로 Biotinylated hFcRn (biotin-hFcRn)과 hFcRn을 발현하는 HEK293 세포(293-hFcRn)를 사용하였다. HEK293-hFcRn 세포를 이용하는 경우에는 Trypsin-EDTA를 이용하여 단일 세포(single cell) 상태로 만들고 3.7% 포름알데하이드(formaldehyde)로 고정(fixation)한 후에 패닝을 진행하였다.
(2-a) 1Ag 서브 라이브러리 패닝
표 10의 방법에 따라 패닝을 진행하였다. Strategy-1 및 3의 경우에는 biotin-shFcRn (100 ng) 만을 사용하였으며, Strategy-4 및 5의 경우에는 1차와 2차에서는 biotin-hFcRn을 3차와 4차에서는 293-hFcRn (1.0x106 cells)을 사용하였다. 그리고 Strategy-3, -4, -5에서는 결합 시에 soluble parental IgG를 경쟁제로 사용하였다. 결합은 phage titration kit를 이용하여 정량 후 1.0x1012 파지를 사용하여 pH 6.0에서 상온에서 2시간 동안 진행되었고 Koff 향상을 위하여 세척 조건(wash condition)에서 시간을 증가하고 shFcRn를 첨가하여 진행하였다. 결합 후에 PBS-T를 이용하여 10회 세척를 통하여 결합되지 않은 파지(unbound phage)를 제거하고 shFcRn이 있는 PBS-T를 이용하여 37에서 20시간동안 회전시키며 배양하였다. 이후 다시 PBS-T를 이용하여 10회 세척하고 100mM TEA (triethylamine)를 이용하여 파지를 용출하였다. 서브 라이브러리로부터 파지를 얻고 정량 후 ELISA를 진행한 결과 ELISA 신호가 주형에 비하여 낮지 않다고 판단하여 1차부터 parental IgG를 결합 시 경쟁제로 사용하였다.
1 Ag 서브 라이브러리의 패닝 전략
Strategy Step Factor 1stRound 2ndRound 3rdRound 4thRound
Strategy-1 Binding Antigen Biotin-hFcRn Biotin-hFcRn Biotin-hFcRn Biotin-hFcRn
Competitor - - - -
pH 6.0 6.0 6.0 6.0
Wash Competitor shFcRn shFcRn shFcRn shFcRn
pH 7.4 7.4 7.4 7.4
Strategy-3 Binding Antigen Biotin-hFcRn Biotin-hFcRn Biotin-hFcRn Biotin-hFcRn
Competitor IgG IgG IgG IgG
pH 6.0 6.0 6.0 6.0
Wash Competitor shFcRn shFcRn shFcRn shFcRn
pH 7.4 7.4 7.4 7.4
Strategy-4 Binding Antigen Biotin-hFcRn Biotin-hFcRn 293-hFcRn 293-hFcRn
Competitor IgG IgG IgG IgG
pH 6.0 6.0 6.0 6.0
Wash Competitor shFcRn shFcRn shFcRn shFcRn
pH 7.4 7.4 7.4 7.4
Strategy-5 Binding Antigen Biotin-hFcRn Biotin-hFcRn 293-hFcRn 293-hFcRn
Competitor IgG IgG - -
pH 6.0 6.0 6.0 6.0
Wash Competitor shFcRn shFcRn shFcRn shFcRn
pH 7.4 7.4 7.4 7.4
아웃풋 파지를 얻어 phage titration kit로 정량 후 동량의 파지를 이용하여 ELISA를 진행하였다. Strategy-1, -3, -4의 4차 아웃풋 콜로니 중에서 무작위로 95개 콜로니를 대상으로 ELISA 활성을 확인한 결과, 모든 strategy에서 90%의 콜로니들이 결합 활성을 갖고 있음을 확인하였다.
(2-b) 11Hg 서브 라이브러리 패닝
표 11의 방법에 따라 패닝을 진행하였다. Strategy-1 및 3의 경우에는 biotin-shFcRn (100 ng) 만을 사용하였으며, Strategy-4 및 5의 경우에는 1차와 2차에서는 biotin-hFcRn을 3차와 4차에서는 293-hFcRn (1.0x106 cells)을 사용하였다. 그리고 Strategy-3, -4, -5에서는 결합 시에 soluble parental IgG를 경쟁제로 사용하였다. 결합은 phage titration kit를 이용하여 정량 후 1.0x1012 파지를 사용하여 pH 6.0에서 상온에서 2시간 동안 진행되었다. Koff 향상을 위하여 세척 조건에서 시간을 증가시키고 shFcRn를 첨가하는 전략을 선택하여 진행하였다. 결합 후에 PBS-T를 이용하여 10회 세척을 통하여 결합되지 않은 파지를 제거하고 shFcRn이 있는 PBS-T를 이용하여 37에서 20시간동안 회전시키면서 배양하였다. 이후 다시 PBS-T를 이용하여 10회 세척하고 100mM TEA (triethylamine)를 이용하여 파지를 용출하였다. 서브 라이브러리로부터 파지를 얻고 정량 후 ELISA를 진행한 결과 ELISA 신호가 낮았기 때문에 Strategy-3, -4, -5의 1차에서는 parental IgG를 경쟁제로 사
용하지 않고 2차부터 사용하였다.
11 Hg 서브 라이브러리의 패닝 전략
Strategy Step Factor 1stRound 2ndRound 3rdRound 4thRound
Strategy-1 Binding Antigen Biotin-hFcRn Biotin-hFcRn Biotin-hFcRn Biotin-hFcRn
Competitor - - - -
pH 6.0 6.0 6.0 6.0
Wash Competitor shFcRn shFcRn shFcRn shFcRn
pH 7.4 7.4 7.4 7.4
Strategy-3 Binding Antigen Biotin-hFcRn Biotin-hFcRn Biotin-hFcRn Biotin-hFcRn
Competitor - IgG IgG IgG
pH 6.0 6.0 6.0 6.0
Wash Competitor shFcRn shFcRn shFcRn shFcRn
pH 7.4 7.4 7.4 7.4
Strategy-4 Binding Antigen Biotin-hFcRn Biotin-hFcRn 293-hFcRn 293-hFcRn
Competitor - IgG IgG IgG
pH 6.0 6.0 6.0 6.0
Wash Competitor shFcRn shFcRn shFcRn shFcRn
pH 7.4 7.4 7.4 7.4
Strategy-5 Binding Antigen Biotin-hFcRn Biotin-hFcRn 293-hFcRn 293-hFcRn
Competitor - IgG - -
pH 6.0 6.0 6.0 6.0
Wash Competitor shFcRn shFcRn shFcRn shFcRn
pH 7.4 7.4 7.4 7.4
아웃풋 파지를 얻어 phage titration kit로 정량 후 동량의 phage를 이용하여 ELISA를 진행하였다. Biotin-hFcRn을 항원으로 사용한 strategy-1과 -3의 경우에는 ELISA-positive ratio가 80% 정도로 나와 Strategy-1과 -3은 패닝의 결과 콜로니를 이용하여 ELISA 스크리닝을 수행하였다
(3) ELISA 스크리닝
페리플리스믹 추출물에 있는 scFv를 HA를 인지하는 ELISA 방법으로 정량하고 동량의 scFv를 이용하여 ELISA 진행 후 주형 scFv보다 흡광도 값이 높은 클론을 선별하는 방법을 사용하였다.
(3-a) 1Ag 클론 스크리닝
Strategy-1과 -3에서 각각 280개의 콜로니를 0.15 mL SB 배지를 이용하여 배양하고 1 mM IPTG로 밤새 유도시킨 후, 0.1 mL의 TES를 이용하여 페리플라스믹 추출물을 확보하였다. ELISA 방법으로 페리플라스믹 추출물에 있는 scFv를 정량하고, scFv를 최종 1000 ng/mL, 3000 ng/mL이 되게 PBS-T (pH 7.4 혹은 pH 6.0)로 희석하고 shFcRn을 1 g/mL의 농도로 코팅하여 ELISA를 수행하였다.
ELISA 진행 결과 pH 7.4과 pH 6.0에서 주형 scFv보다 흡광도가 높은 콜로니를 선별하였다. pH 6.0에서 주형보다 높은 클론은 대부분 pH 7.4에서도 주형보다 높은 경향을 보였다. 전체 456개 콜로니의 ELISA 값을 바탕으로 pH 7.4에서 주형대비 ELISA 신호가 높은 상위 200개 콜로니에 대해서 염기서열 분석 진행. 77개의 고유 서열을 갖는 클론을 선별하였다. 분석된 77개 클론은 모두 동일한 H-CDR3 서열(A11-C07)을 갖고 있었으며, L-CDR3의 서열은 주형 클론들로 다양하게 나왔다.
(3-b) 11Hg 유래 클론 스크리닝
1Ag 유래 클론 ELISA 스크리닝과 동일한 방법으로 11Hg 유래 클론 스크리닝을 수행하였다. ELISA 진행 결과 pH 7.4에서 주형 scFv보다 흡광도가 높은 콜로니의 수는 456개 중 64개로 14.0%이며, pH 6.0에서 주형 scFv보다 흡광도가 높은 콜로니의 수는 32개로 7.0%였다. 전체 456개 콜로니의 ELISA 값을 바탕으로 pH 7.4에서 주형 대비 ELISA 신호의 fold 기준으로 랭킹하고 상위 50개 콜로니에 대해서 염기서열 분석 진행 한 결과 10종의 고유 서열 클론을 확보하였다.
(4) 향상된 1Ag 및 11Hg 유래 후보 항체 정제
(4-a) 1Ag 유래 클론 정제
77개 고유 클론들 중 putative N-글리코실레이션 사이트(주형에서 유래)가 있는 29개 클론을 제외한 48개 클론에 대한 scFv를 페리플라스믹 추출물에서 정제하였다. 100~400 mL의 SB 배지를 이용하여 배양 후 1 mM IPTG를 이용하여 밤새 유도시킨후, 1:5 부피의 TES 버퍼를 이용하여 페리플라스믹 추출물을 확보. Ni-NTA 레진을 이용하여 scFv 정제 후 PBS로 농축 및 버퍼 교체를 수행하였다. 브래드포드 어세이를 이용하여 정량 후 각 scFv의 1 g을 SDS-PAGE를 이용하여 분리하고 쿠마시 블루 염색을 통하여 농도 및 순도를 확인하였다.
(4-b) 11Hg 유래 클론 정제
10개 고유 클론들 중 7개 클론 및 1Ag, 11Hg, H11-B04에 대한 scFv를 상기 1Ag 정제 방법과 동일하게 페리플라스믹 추출물에서 정제하였다.
(5) ELISA 및 SPR을 통한 결합력 측정
기존 실시예를 따라 진행하여 측정한 값을 표 12 및 표 13에 정리하였다.
1 Ag CDR -1, -2 돌연변이에 의한 친화도 개선 결과
클론명 부분 정제된 scFv
ELISA (배) k off 값 (배)
pH 6.0 pH 7.4 pH 6.0 pH 7.4
Two state Two state
kd1 kd1
B04 1.7 1.5 10.7 33.7
1Ag 1.0 1.0 1.0 1.0
A23-3H04 25.4 25.8 27.3 11.6
A21-4C03 21.8 18.8 41.6 14.6
A24-1G10 18.0 26.2 37.7 16.7
A24-1F07 17.5 24.7 29.2 16.5
A21-4B10 17.4 25.9 36.3 19.9
A21-4G04 17.1 24.0 11.2 5.7
A23-3H05 15.0 20.1 20.9 10.0
A21-3A09 14.2 25.2 18.8 10.8
A21-4B06 13.7 17.4 7.2 3.8
A24-1B05 12.8 20.8 26.2 11.6
A23-3A08 11.1 24.0 32.6 18.3
A21-4C08 10.5 19.6 12.1 6.9
A23-4D09 10.4 15.5 24.1 10.5
A23-3D03 10.1 19.8 21.3 9.3
A21-4B03 9.1 16.1 11.2 6.7
A21-3D10 8.5 18.3 19.5 13.1
A21-3A10 7.9 25.6 23.3 14.5
A21-4H04 7.2 23.8 11.8 8.1
A21-4F11 5.7 19.6 13.1 5.9
A23-3G05 5.5 25.0 53.2 22.7
A23-3A10 5.0 15.9 9.3 5.4
A25-1H04 5.0 20.4 47.0 2.6
A23-3B06 4.8 22.8 41.8 10.5
A23-4A09 4.7 17.1 28.4 7.2
A25-1D09 4.5 26.6 42.1 43.0
A21-4E10 4.0 24.3 21.9 12.0
A23-3C04 3.8 20.3 24.8 7.7
A23-3G06 3.1 6.0 12.9 4.6
A24-1E09 3.1 14.8 11.2 5.9
A23-3F03 3.1 20.7 17.9 11.2
A21-4F07 2.9 16.2 8.7 4.1
A24-1A03 2.8 11.5 5.9 3.8
A24-1H11 2.7 21.7 19.5 10.5
A21-3D09 2.5 16.9 11.8 7.2
A24-1D10 2.3 18.6 32.6 8.9
A21-4B04 2.3 9.3 24.5 8.0
A23-4C12 2.2 23.8 16.7 9.5
A21-4G06 2.1 17.3 9.4 5.4
A23-3E04 2.0 12.9 10.4 5.4
A24-1C09 2.0 13.1 5.1 2.8
A24-1C04 2.0 8.9 3.4 2.9
A25-1H10 1.9 15.1 11.9 6.5
A21-4D08 1.6 5.5 9.0 4.8
A24-1D08 1.4 9.4 5.9 5.0
A24-1A08 1.4 4.1 5.1 2.3
A21-4A07 1.3 9.1 7.0 3.9
A24-1B09 1.2 9.6 5.8 3.7
A24-1E07 1.2 3.3 4.8 2.2
11 Hg CDR -1, -2 돌연변이에 의한 친화도 개선 결과
클론명 부분 정제된 scFv
ELISA (배) k off 값 (배)
pH 6.0 pH 7.4 pH 6.0 pH 7.4
Two state Two state
kd1 kd1
H11-B04 1.3 1.6 1.372 9.611
11Hg 1.0 1.0 1.000 1.000
H21-3A07 1.0 4.2 1.075 1.499
H21-4D11 0.7 3.6 0.001 0.000
H21-3C11 1.9 10.9 1.363 1.468
H21-3A09 0.7 0.2 0.174 0.002
H21-4H04 0.9 5.7 0.893 1.233
H23-3D08 3.7 7.0 2.891 1.893
H21-4D09 ND ND NA NA
H24-1D11 1.0 1.0 NA NA
상기 1차 및 2차 친화도 개선을 통하여 선별한 FcRn에 대하여 결합력과 특이성이 더욱 향상된 항체의 가변영역의 아미노산 서열 및 이를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 표 14 및 표 15에 기재되어 있다. 또한, 각 가변영역에서의 CDR 서열은 표 16 및 표 17에 기재되어 있다
선별된 항체의 중쇄 및 경쇄 가변영역의 아미노산 서열
항체명 중쇄 가변영역 경쇄 가변영역
서열번호 아미노산 서열 서열번호 아미노산 서열
A11-C07 18 EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDEYGMHWVRQAPGKGLEWVSGVSWNSGSIAYADSVRGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKGRYSDVWGQGTTVTVSS 162 QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGSSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVTKRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYASYSSNTFYVFGTGTKVTVLG
A11-G06 20 EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDEYGMHWVRQAPGKGLEWVSGVSWNSGSIAYADSVRGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKGRLMDVWGQGTTVTVSS 164 QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGSSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVTKRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYGSYNNNTFYVFGTGTKVTVLG
A12-C09 22 EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDEYGMHWVRQAPGKGLEWVSGVSWNSGSIAYADSVRGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKGRTMDVWGQGTTVTVSS 166 QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGSSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVTKRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYGSYSSNTFYVFGTGTKVTVLG
A12-E05 24 EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDEYGMHWVRQAPGKGLEWVSGVSWNSGSIAYADSVRGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKGRILDVWGQGTTVTVSS 168 QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGSSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVTKRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYGSYNNSTFYVFGTGTKVTVLG
A12-E01 26 EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDEYGMHWVRQAPGKGLEWVSGVSWNSGSIAYADSVRGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKSRSMDVWGQGTTVTVSS 170 QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGSSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVTKRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYGSYSNNNFYVFGTGTKVTVLG
A12-E04 28 EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDEYGMHWVRQAPGKGLEWVSGVSWNSGSIAYADSVRGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKGRLFDVWGQGTTVTVSS 172 QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGSSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVTKRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYGSYSNSNFYVFGTGTKVTVLG
A12-F02 30 EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDEYGMHWVRQAPGKGLEWVSGVSWNSGSIAYADSVRGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKGRYLDVWGQGTTVTVSS 174 QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGSSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVTKRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYGSYDSNTFYVFGTGTKVTVLG
A12-H04 32 EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDEYGMHWVRQAPGKGLEWVSGVSWNSGSIAYADSVRGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKGRLLDVWGQGTTVTVSS 176 QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGSSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVTKRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYGAYSNTNFYVFGTGTKVTVLG
A23-3H04 34 EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDTYGMNWVRQAPGKGLEWVSGISYNGGTTAYADSVRGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKGRSMDVWGQGTTVTVSS 178 QSALTQPASVSGSPGQSITISCGGSSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVNKRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCGSYDSNTFYVFGTGTKVTVLG
A21-4C03 36 EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDAYGMNWVRQAPGKGLEWVSGISYNSGTIAYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKGRSMDVWGQGTTVTVSS 180 QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGSSSDIGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSDRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCGSYSSNTFYVFGTGTKVTVLG
A24-1G10 38 EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDAYGMHWVRQAPGKGLEWVSGISYNSGTKAYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKGRSMDVWGQGTTVTVSS 182 QSALTQPASVSGSPGQSITISCGGSSSNIGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVNKRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCASYSNSNFYVFGTGTKVTVLG
A24-1F07 40 EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDAYGMHWVRQAPGKGLEWVSGVSYNSGTTAYADSVRGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKGRSMDVWGQGTTVTVSS 184 QSALTQPASVSGSPGQSITISCSGSSSNVGSYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVTKRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCGSYSNSNFYVFGTGTKVTVLG
A21-4B10 42 EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDEYGMHWVRQAPGKGLEWVSGISYNSGNKAYADSVRGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKGRSMDVWGQGTTVTVSS 186 QSALTQPASVSGSPGQSITISCSGSSSNIGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSKRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCGSYDSNTFYVFGTGTKVTVLG
A21-4G04 44 EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDSYGMHWVRQAPGKGLEWVSGISYNGGNTAYADSVRGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKGRSMDVWGQGTTVTVSS 188 QSALTQPASVSGSPGQSITISCSGSSSNIGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVNERPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCGSYSNNNFYVFGTGTKVTVLG
A23-3H05 46 EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDAYGMNWVRQAPGKGLEWVSGISYNSGTIAYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKGRSMDVWGQGTTVTVSS 190 QSALTQPASVSGSPGQSITISCGGSSSNVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCGSYSNSNFYVFGTGTKVTVLG
A21-3A09 48 EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDNYGMNWVRQAPGKGLEWVSGISYNSGTKAYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKGRSMDVWGQGTTVTVSS 192 QSALTQPASVSGSPGQSITISCSGSSSDIGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVNKRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCASYSSNTFYVFGTGTKVTVLG
A21-4B06 50 EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDSYGMHWVRQAPGKGLEWVSGISYNGGSKAYADSVRGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKGRSMDVWGQGTTVTVSS 194 QSALTQPASVSGSPGQSITISCSGSSSNIGSYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVTDRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCGSYSSNTFYVFGTGTKVTVLG
A24-1B05 52 EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDKYGMNWVRQAPGKGLEWVSGISYNSGNTAYADSVRGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKGRSMDVWGQGTTVTVSS 196 QSALTQPASVSGSPGQSITISCAGSSSDIGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSKRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCGSYDSNTFYVFGTGTKVTVLG
A23-3A08 54 EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDAYGMHWVRQAPGKGLEWVSGISYNSGTTAYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKGRSMDVWGQGTTVTVSS 198 QSALTQPASVSGSPGQSITISCAGSSSNIGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSKRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCGSYSNSNFYVFGTGTKVTVLG
A21-4C08 56 EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDTYGMHWVRQAPGKGLEWVSGISYNAGNKAYADSVRGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKGRSMDVWGQGTTVTVSS 200 QSALTQPASVSGSPGQSITISCSGSSSNVGSYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVNNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCGSYSSNTFYVFGTGTKVTVLG
A23-4D09 58 EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDAYGMHWVRQAPGKGLEWVSGVSYDAGNTAYADSVRGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKGRSMDVWGQGTTVTVSS 202 QSALTQPASVSGSPGQSITISCSGSSSNIGSYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVTDRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCGSYSSNTFYVFGTGTKVTVLG
A23-3D03 60 EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDAYGMNWVRQAPGKGLEWVSGISYNAGSTAYADSVRGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKGRSMDVWGQGTTVTVSS 204 QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGSSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVTNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCGSYDSNTFYVFGTGTKVTVLG
A21-1B03 62 EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDAYGMNWVRQAPGKGLEWVSGISYNAGNKAYADSVRGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKGRSMDVWGQGTTVTVSS 206 QSALTQPASVSGSPGQSITISCSGSSSNIGSYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVNKRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCASYSSNTFYVFGTGTKVTVLG
A21-3D10 64 EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDNYGMHWVRQAPGKGLEWVSGISYDAGTTAYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKGRSMDVWGQGTTVTVSS 208 QSALTQPASVSGSPGQSITISCGGTSSNIGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVTNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCGSYSNTNFYVFGTGTKVTVLG
A21-3A10 66 EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDAYGMHWVRQAPGKGLEWVSGISYNAGNKAYADSVRGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKGRSMDVWGQGTTVTVSS 210 QSALTQPASVSGSPGQSITISCAGSSSNIGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSKRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCGSYSNSNFYVFGTGTKVTVLG
A21-4H04 68 EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDSYGMHWVRQAPGKGLEWVSGISYNSGNKAYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKGRSMDVWGQGTTVTVSS 212 QSALTQPASVSGSPGQSITISCSGTSSDIGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSKRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCGSYSNNNFYVFGTGTKVTVLG
A21-4F11 70 EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDAYGMNWVRQAPGKGLEWVSGISYNGGTKAYADSVRGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKGRSMDVWGQGTTVTVSS 214 QSALTQPASVSGSPGQSITISCGGTSSNIGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVNDRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCASYSSNTFYVFGTGTKVTVLG
A23-3G05 72 EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDTYGMHWVRQAPGKGLEWVSGISYNSGTIAYADSVRGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKGRSMDVWGQGTTVTVSS 216 QSALTQPASVSGSPGQSITISCAGSSSNIGSYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCGSYDSNTFYVFGTGTKVTVLG
A23-3A10 74 EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDKYGMHWVRQAPGKGLEWVSGISYNAGSKAYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKGRSMDVWGQGTTVTVSS 218 QSALTQPASVSGSPGQSITISCAGSSSNIGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSDRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCGSYDSNTFYVFGTGTKVTVLG
A25-1H04 76 EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDAYGMNWVRQAPGKGLEWVSGISYNSGNTAYADSVRGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKGRSMDVWGQGTTVTVSS 220 QSALTQPASVSGSPGQSITISCAGSSSDIGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSERPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCGSYDSNTFYVFGTGTKVTVLG
A23-3B06 78 EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDAYGMHWVRQAPGKGLEWVSGISYNSGSKAYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKGRSMDVWGQGTTVTVSS 222 QSALTQPASVSGSPGQSITISCSGSSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSERPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCGSYDSNTFYVFGTGTKVTVLG
A23-4A09 80 EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDNYGMNWVRQAPGKGLEWVSGISYDSGNKAYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKGRSMDVWGQGTTVTVSS 224 QSALTQPASVSGSPGQSITISCGGSSSNIGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVTKRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCASYSSNTFYVFGTGTKVTVLG
A25-1D09 82 EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDAYGMHWVRQAPGKGLEWVSGISYNGGTIAYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKGRSMDVWGQGTTVTVSS 226 QSALTQPASVSGSPGQSITISCGGTSSDVGSYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVNKRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCGSYSNSNFYVFGTGTKVTVLG
A21-4E10 84 EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDAYGMNWVRQAPGKGLEWVSGVSYNAGNKAYADSVRGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKGRSMDVWGQGTTVTVSS 228 QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGSSSNVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSKRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCGSYSSNTFYVFGTGTKVTVLG
A23-3C04 86 EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDTYGMHWVRQAPGKGLEWVSGISYDSGTTAYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKGRSMDVWGQGTTVTVSS 230 QSALTQPASVSGSPGQSITISCSGTSSDIGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVTEPPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCASYSSNTFYVFGTGTKVTVLG
A23-3G06 88 EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDAYGMNWVRQAPGKGLEWVSGISYNSGNIAYADSVRGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKGRSMDVWGQGTTVTVSS 232 QSALTQPASVSGSPGQSITISCAGTSSNIGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVNDRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCGSYDSNTFYVFGTGTKVTVLG
A24-1E09 90 EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDKYGMHWVRQAPGKGLEWVSGVSYNAGTTAYADSVRGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKGRSMDVWGQGTTVTVSS 234 QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGSSSNIGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVTNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCGSYSNSNFYVFGTGTKVTVLG
A23-3F03 92 EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDTYGMHWVRQAPGKGLEWVSGISYNSGNIAYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKGRSMDVWGQGTTVTVSS 236 QSALTQPASVSGSPGQSITISCGGSSSNIGSYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVTKRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCGSYDSNTFYVFGTGTKVTVLG
A21-4F07 94 EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDAYGMNWVRQAPGKGLEWVSGISYNAGNKAYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKGRSMDVWGQGTTVTVSS 238 QSALTQPASVSGSPGQSITISCSGTSSNVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSDRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCGSYSNSNFYVFGTGTKVTVLG
A24-1A03 96 EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDAYGMNWVRQAPGKGLEWVSGISYNAGNTAYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKGRSMDVWGQGTTVTVSS 240 QSALTQPASVSGSPGQSITISCGGSSSNVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSKRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCGSYSNSNFYVFGTGTKVTVLG
A24-1H11 98 EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDAYGMHWVRQAPGKGLEWVSGISYNSGTTAYADSVRGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKGRSMDVWGQGTTVTVSS 242 QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGSSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYEVNKRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCASYSSNTFYVFGTGTKVTVLG
A21-3D09 100 EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDNYGMNWVRQAPGKGLEWVSGISYNSGTKAYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKGRSMDVWGQGTTVTVSS 244 QSALTQPASVSGSPGQSITISCSGTSSNVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVNKRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCGSYSNSNFYVFGTGTKVTVLG
A24-1D10 102 EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDNYGMHWVRQAPGKGLEWVSGISYNSGNKAYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKGRSMDVWGQGTTVTVSS 246 QSALTQPASVSGSPGQSITISCSGSSSDIGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVTDRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCGSYSNNNFYVFGTGTKVTVLG
A21-4B04 104 EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDAYGMHWVRQAPGKGLEWVSGISYDAGNIAYADSVRGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKGRSMDVWGQGTTVTVSS 248 QSALTQPASVSGSPGQSITISCAGTSSNIGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCASYSSNTFYVFGTGTKVTVLG
A23-4C12 106 EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDAYGMNWVRQAPGKGLEWVSGVSYNSGNKAYADSVRGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKGRSMDVWGQGTTVTVSS 250 QSALTQPASVSGSPGQSITISCSGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVTKRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCGSYSSNTFYVFGTGTKVTVLG
A21-4G06 108 EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDTYGMNWVRQAPGKGLEWVSGISYNAGTKAYADSVRGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKGRSMDVWGQGTTVTVSS 252 QSALTQPASVSGSPGQSITISCAGSSSNVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVTKRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCGSYSNSNFYVFGTGTKVTVLG
A23-3E04 110 EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDEYGMHWVRQAPGKGLEWVSGVSWNSGSIAYADSVRGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKGRSMDVWGQGTTVTVSS 254 QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGSSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVTKRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYSSSTFYVFGTGTKVTVLG
A24-1C09 112 EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDAYGMNWVRQAPGKGLEWVSGISYNGGNKAYADSVRGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKGRSMDVWGQGTTVTVSS 256 QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSNVGSYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVNDRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCGSYDSNTFYVFGTGTKVTVLG
A24-1C04 114 EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDGYGMHWVRQAPGKGLEWVSGISYNSGSTAYADSVRGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKGRSMDVWGQGTTVTVSS 258 QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSNIGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVTKRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCGSYSNSNFYVFGTGTKVTVLG
A25-1H10 116 EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDAYGMHWVRQAPGKGLEWVSGVSYNAGTTAYADSVRGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKGRSMDVWGQGTTVTVSS 260 QSALTQPASVSGSPGQSITISCGGSSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYEVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCGSYSNSNFYVFGTGTKVTVLG
A21-4D08 118 EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDTYGMHWVRQAPGKGLEWVSGVSYNSGNKAYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKGRSMDVWGQGTTVTVSS 262 QSALTQPASVSGSPGQSITISCGGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVNDRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCGSYSNNNFYVFGTGTKVTVLG
A24-1D08 120 EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDNYGMHWVRQAPGKGLEWVSGISYNSGNTGYADSVRGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKGRSMDVWGQGTTVTVSS 264 QSALTQPASVSGSPGQSITISCAGSSSNVVSYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVNKRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCGSYDSNTFYVFGTGTKVTVLG
A24-1A08 122 EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDAYGMHWVRQAPGKGLEWVSGISYDAGNTAYADSVRGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKGRSMDVWGQGTTVTVSS 266 QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGSSSNIGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYEVNNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCASYSSNTFYVFGTGTKVTVLG
A21-4A07 124 EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDTYGMHWVRQAPGKGLEWVSGVSYNSGSKAYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKGRSMDVWGQGTTVTVSS 268 QSALTQPASVSGSPGQSITISCAGSSSNIGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVNDRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCGSYSNSNFYVFGTGTKVTVLG
A24-1B09 126 EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDRYGMHWVRQAPGKGLEWVSGVSYDGGTTAYADSVRGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKGRSMDVWGQGTTVTVSS 270 QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSNIGSYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVNKRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCGSYDSNTFYVFGTGTKVTVLG
A24-1E07 128 EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDEYGMHWVRQAPGKGLEWVSGISYDAGSTAYADSVRGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKGRSMDVWGQGTTVTVSS 272 QSALTQPASVSGSPGQSITISCAGSSSNVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYEVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCGSYDSNTFYVFGTGTKVTVLG
H21-3A07 130 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSNYYMNWVRQAPGKGLEWVTVSYDSGNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGSRRDAFDVWGQGTMVTVSSA 274 DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISNRLAWYQQKPGKAPKLLIYKASNLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQTNSFPLTFGGGTKVEIKRTV
H21-4D11 132 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSNYAMNWVRQAPGKGLEWVIISYDSSSKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGSGKRDAFDVWGQGTMVTVSSA 276 DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCQASQGISNRLAWYQQKPGKAPKLLIYKASNLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQTNSFPLTFGGGTKVEIKRTV
H21-3C11 134 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSNYAMHWVRQAPGKGLEWVVVSYDGGNIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGSGRRDAFDVWGQGTMVTVSSA 278 DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISNRLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQTNSFPLTFGGGTKVEIKRTV
H21-3A09 136 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSNYDIHWVRQAPGKGLEWVVVSYDGSNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGSGKRDAFDVWGQGTMVTVSSA 280 DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISNRLAWYQQKPGKAPKLLIYKASNLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQTNSFPLTFGGGTKVEIKRTV
H21-4H04 138 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYAIHWVRQAPGKGLEWVVVSYDGGSKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGSGRRDAFDVWGQGTMVTVSSA 282 DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCQASQSISSRLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQTNSFPLTFGGGTKVEIKRTV
H23-3D08 140 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSDYDMHWVRQAPGKGLEWVVISYDGGSKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGSGQRDAFDVWGQGTMVTVSSA 284 DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCQASQGISNRLAWYQQKPGKAPKLLIYKASNLETGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQTNSFPLTFGGGTKVEIKRTV
H21-4D09 142 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSNYYINWVRQAPGKGLEWVSVSYDGGSIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGSGRRDAFDVWGQGTMVTVSSA 286 DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCQASQGIRNRLAWYQQKPGKAPKLLIYKASNLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQTNSFPLTFGGGTKVEIKRTV
H24-1D11 144 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYAMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGSGGRDAFDVWGQGTMVTVSSA 288 DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSRLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLETGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQTNSFPLTFGGGTKVEIKRTV
수득된 항체의 중쇄 및 경쇄 가변영역의 폴리뉴클레오티드 서열
항체명 중쇄 가변영역 경쇄 가변영역
서열번호 염기서열 서열번호 염기서열
A11-C07 17 GAAGTGCAGCTGGTCGAGAGTGGGGGAGGCTTGGTACAACCTGGAAGATCCCTTAGACTCTCTTGCGCAGCAAGCGGGTTCACCTTTGACGAATATGGCATGCACTGGGTGAGACAGGCTCCAGGGAAGGGTCTGGAGTGGGTGTCTGGCGTTTCATGGAATTCTGGTAGCATTGCGTACGCTGACTCTGTGAGAGGCAGATTCACTATCTCCAGAGATAACGCCAAAAACAGCTTATACCTGCAGATGAATTCACTGAGAGCCGAGGACACAGCCCTGTACTATTGTGCTAGAGGAAGATATTCGGATGTGTGGGGCCAGGGAACTACAGTTACCGTCTCCTCA 161 CAGTCTGCACTTACTCAGCCAGCCAGTGTGTCTGGGAGTCCTGGACAGTCGATCACCATTTCCTGCACGGGATCAAGTAGCGATGTGGGTGGCTATAATTATGTGTCCTGGTACCAGCAGCACCCAGGCAAGGCCCCCAAACTGATGATTTACGACGTAACAAAGCGCCCCTCAGGGGTCTCCAATCGCTTTTCTGGCAGTAAAAGCGGAAACACAGCCTCCCTGACTATCAGCGGCCTCCAAGCTGAAGACGAGGCTGATTATTATTGTGCTTCTTACTCTAGCAACACTTTTTACGTTTTCGGAACCGGGACAAAGGTGACCGTCTTGGGC
A11-G06 19 GAAGTGCAGCTGGTCGAGAGTGGGGGAGGCTTGGTACAACCTGGAAGATCCCTTAGACTCTCTTGCGCAGCAAGCGGGTTCACCTTTGACGAATATGGCATGCACTGGGTGAGACAGGCTCCAGGGAAGGGTCTGGAGTGGGTGTCTGGCGTTTCATGGAATTCTGGTAGCATTGCGTACGCTGACTCTGTGAGAGGCAGATTCACTATCTCCAGAGATAACGCCAAAAACAGCTTATACCTGCAGATGAATTCACTGAGAGCCGAGGACACAGCCCTGTACTATTGTGCTAAAGGAAGAATGTTGGATGTGTGGGGCCAGGGAACTACAGTTACCGTCTCCTCA 163 CAGTCTGCACTTACTCAGCCAGCCAGTGTGTCTGGGAGTCCTGGACAGTCGATCACCATTTCCTGCACGGGATCAAGTAGCGATGTGGGTGGCTATAATTATGTGTCCTGGTACCAGCAGCACCCAGGCAAGGCCCCCAAACTGATGATTTACGACGTAACAAAGCGCCCCTCAGGGGTCTCCAATCGCTTTTCTGGCAGTAAAAGCGGAAACACAGCCTCCCTGACTATCAGCGGCCTCCAAGCTGAAGACGAGGCTGATTATTATTGTGGTTCTTACAATAACAACACTTTTTACGTTTTCGGAACCGGGACAAAGGTGACCGTCTTGGGC
A12-C09 21 GAAGTGCAGCTGGTCGAGAGTGGGGGAGGCTTGGTACAACCTGGAAGATCCCTTAGACTCTCTTGCGCAGCAAGCGGGTTCACCTTTGACGAATATGGCATGCACTGGGTGAGACAGGCTCCAGGGAAGGGTCTGGAGTGGGTGTCTGGCGTTTCATGGAATTCTGGTAGCATTGCGTACGCTGACTCTGTGAGAGGCAGATTCACTATCTCCAGAGATAACGCCAAAAACAGCTTATACCTGCAGATGAATTCACTGAGAGCCGAGGACACAGCCCTGTACTATTGTGCTAAAGGAAGAACGATGGATGTGTGGGGCCAGGGAACTACAGTTACCGTCTCCTCA 165 CAGTCTGCACTTACTCAGCCAGCCAGTGTGTCTGGGAGTCCTGGACAGTCGATCACCATTTCCTGCACGGGATCAAGTAGCGATGTGGGTGGCTATAATTATGTGTCCTGGTACCAGCAGCACCCAGGCAAGGCCCCCAAACTGATGATTTACGACGTAACAAAGCGCCCCTCAGGGGTCTCCAATCGCTTTTCTGGCAGTAAAAGCGGAAACACAGCCTCCCTGACTATCAGCGGCCTCCAAGCTGAAGACGAGGCTGATTATTATTGTGGTTCTTACTCTAGCAACACTTTTTACGTTTTCGGAACCGGGACAAAGGTGACCGTCTTGGGC
A12-E05 23 GAAGTGCAGCTGGTCGAGAGTGGGGGAGGCTTGGTACAACCTGGAAGATCCCTTAGACTCTCTTGCGCAGCAAGCGGGTTCACCTTTGACGAATATGGCATGCACTGGGTGAGACAGGCTCCAGGGAAGGGTCTGGAGTGGGTGTCTGGCGTTTCATGGAATTCTGGTAGCATTGCGTACGCTGACTCTGTGAGAGGCAGATTCACTATCTCCAGAGATAACGCCAAAAACAGCTTATACCTGCAGATGAATTCACTGAGAGCCGAGGACACAGCCCTGTACTATTGTGCTAGAGGAAGAATGATCGATGTGTGGGGCCAGGGAACTACAGTTACCGTCTCCTCA 167 CAGTCTGCACTTACTCAGCCAGCCAGTGCGTCTGGGAGTCCTGGACAGTCGATCACCATTTCCTGCACGGGATCAAGTAGCGATGTGGGTGGCTATAATTATGTGTCCTGGTACCAGCAGCACCCAGGCAAGGCCCCCAAACTGATGATTTACGACGTAACAAAGCGCCCCTCAGGGGTCTCCAATCGCTTTTCTGGCAGTAAAAGCGGAAACACAGCCTCCCTGACTATCAGCGGCCTCCAAGCTGAAGACGAGGCTGATTATTATTGTGGTTCTTACAATAGCAACACTTTTTACGTTTTCGGAACCGGGACAAAGGTGACCGTCTTGGGC
A12-E01 25 GAAGTGCAGCTGGTCGAGAGTGGGGGAGGCTTGGTACAACCTGCAAGATCCCTTAGACTCTCTTGCGCAGCAAGCGGGTTCACCTTTGACGAATATGGCATGCACTGGGTGAGACAGGCTCCAGGGAAGGGTCTGGAGTGGGTGTCTGGCGTTTCATGGAATTCTGGTAGCATTGCGTACGCTGACTCTGTGAGAGGCAGATTCACTATCTCCAGAGATAACGCCAAAAACAGCTTATACCTGCAGATGAATTCACTGAGAGCCGAGGACACAGCCCTGTACTATTGTGCTAAAGGAAGACTTTTGGATGTGTGGGGCCAGGGAACTACAGTTACCGTCTCCTCA 169 CAGTCTGCACTTACTCAGCCAGCCAGTGTGTCTGGGAGTCCTGGACAGTCGATCACCATTTCCTGCACGGGATCAAGTAGCGATGTGGGTGGCTATAATTATGTGTCCTGGTACCAGCAGCACCCAGGCAAGGCCCCCAAACTGATGATTTACGACGTAACAAAGCGCCCCTCAGGGGTCTCCAATCGCTTTTCTGGCAGTAAAAGCGGAAACACAGCCTCCCTGACTATCAGCGGCCTCCAAGCTGAAGACGAGGCTGATTATTATTGTTCTTCTTACTCTAACAACACTTTTTACGTTTTCGGAACCGGGACAAAGGTGACCGTCTTGGGC
A12-E04 27 GAAGTGCAGCTGGTCGAGAGTGGGGGAGGCTTGGTACAACCTGGAAGATCCCTTAGACTCTCTTGCGCAGCAAGCGGGTTCACCTTTGACGAATATGGCATGCACTGGGTGAGACAGGCTCCAGGGAAGGGTCTGGAGTGGGTGTCTGGCGTTTCATGGAATTCTGGTAGCATTGCGTACGCTGACTCTGTGAGAGGCAGATTCACTATCTCCAGAGATAACGCCAAAAACAGCTTATACCTGCAGATGAATTCACTGAGAGCCGAGGACACAGCCCTGTACTATTGTGCTAAAGGAAGAATGATGGATGTGTGGGGCCAGGGAACTACAGTTACCGTCTCCTCA 171 CAGTCTGCACTTACTCAGCCAGCCAGTGTGTCTGGGAGTCCTGGACAGTCGATCACCATTTCCTGCACGGGATCAAGTAGCGATGTGGGTGGCTATAATTATGTGTCCTGGTACCAGCAGCACCCAGGCAAGGCCCCCAAACTGATGATTTACGACGTAACAAAGCGCCCCTCAGGGGTCTCCAATCGCTTTTCTGGCAGTAAAAGCGGAAACACAGCCTCCCTGACTATCAGCGGCCTCCAAGCTGAAGACGAGGCTGATTATTATTGTGCTTCTTACAATAACTCCACTTTTTACGTTTTCGGAACCGGGACAAAGGTGACCGTCTTGGGC
A12-F02 29 GAAGTGCAGCTGGTCGAGAGTGGGGGAGGCTTGGTACAACCTGGAAGATCCCTTAGACTCTCTTGCGCAGCAAGCGGGTTCACCTTTGACGAATATGGCATGCACTGGGTGAGACAGGCTCCAGGGAAGGGTCTGGAGTGGGTGTCTGGCGTTTCATGGAATTCTGGTAGCATTGCGTACGCTGACTCTGTGAGAGGCAGATTCACTATCTCCAGAGATAACGCCAAAAACAGCTTATACCTGCAGATGAATTCACTGAGAGCCGAGGACACAGCCCTGTACTATTGTGCTAAAGGAAGATATTTGGATGTGTGGGGCCAGGGAACTACAGTTACCGTCTCCTCA 173 CAGTCTGCACTTACTCAGCCAGCCAGTGTGTCTGGGAGTCCTGGACAGTCGATCACCATTTCCTGCACGGGATCAAGTAGCGATGTGGGTGGCTATAATTATGTGTCCTGGTACCAGCAGCACCCAGGCAAGGCCCCCAAACTGATGATTTACGACGTAACAAAGCGCCCCTCAGGGGTCTCCAATCGCTTTTCTGGCAGTAAAAGCGGAAACACAGCCTCCCTGACTATCAGCGGCCTCCAAGCTGAAGACGAGGCTGATTATTATTGTGGTTCTTACGATAGCAACACTTTTTACGTTTTCGGAACCGGGACAAAGGTGACCGTCTTGGGC
A12-H04 31 GAAGTGCAGCTGGTCGAGAGTGGGGGAGGCTTGGTACAACCTGGAAGATCCCTTAGACTCTCTTGCGCAGCAAGCGGGTTCACCTTTGACGAATATGGCATGCACTGGGTGAGACAGGCTCCAGGGAAGGGTCTGGAGTGGGTGTCTGGCGTTTCATGGAATTCTGGTAGCATTGCGTACGCTGACTCTGTGAGAGGCAGATTCACTATCTCCAGAGATAACGCCAAAAACAGCTTATACCTGCAGATGAATTCACTGAGAGCCGAGGACACAGCCCTGTACTATTGTGCTAAAGGAAGACTTTTGGATGTGTGGGGCCAGGGAACTACAGTTACCGTCTCCTCA 175 CAGTCTGCACTTACTCAGCCAGCCAGTGTGTCTGGGAGTCCTGGACAGTCGATCACCATTTCCTGCACGGGATCAAGTAGCGATGTGGGTGGCTATAATTATGTGTCCTGGTACCAGCAGCACCCAGGCAAGGCCCCCAAACTGATGATTTACGACGTAACAAAGCGCCCCTCAGGGGTCTCCAATCGCTTTTCTGGCAGTAAAAGCGGAAACACAGCCTCCCTGACTATCAGCGGCCTCCAGGCTGAAGACGAGGCTGATTATTATTGTGGTGCTTACTCTAACACCAATTTTTACGTTTTCGGAACCGGGACAAAGGTGACCGTCTTGGGC
A23-3H04 33 GAAGTGCAGCTGGTCGAGAGTGGGGGAGGCTTGGTACAACCTGGAAGATCCCTTAGACTCTCTTGCGCAGCAAGCGGGTTCACCTTTGACACCTATGGGATGAACTGGTGAGACAGGCTCCAGGGAGGGTCTGGAGTGGGTGTCTGGCATTTCATATAATGGTGGTACCACAGCGTACGCTGACTCTGTGAGAGGCAGATTCACTATCTCCAGAGATAACGCCAAAAACAGCTTATACCTGCAGATGAATTCACTGAGAGCCGAGACACAGCCCTGTACTATTTGCTAGAGGAAGATATTCGGATGTGTGGGGCCAGGGAACTACAGTTACCGTCTCCTCA 177 CAGTCTGCACTTACTCAGCCAGCCAGTGTGTCTGGGAGTCCTGGACAGTCGATCACCATTTCCTGCGGCGGATCAAGTAGCGATGTCGGTGGCTATAATTATGTGTCCTGGTACCAGCAGCACCCAGGCAAGGCCCCCAAACTGATGATTTACGACGTTAACAAGCGCCCCTCAGGGGTCTCCAATCGCTTTTCTGGCAGTAAAAGCGGAAACACAGCCTCCCTGACTATCAGCGGCCTCCAAGCTGAAGACGAGGCTGATTATTATTGTGGTTCTTACGATAGCAACACTTTTTACGTTTTCGGAACCGGGACAAAGGTGACCGTCTTGGGC
A21-4C03 35 GAAGTGCAGCTGGTCGAGAGTGGGGAGGCTTGGTACAACCTGGAAGATCCCTTAGACTCTCTTGCGCAGCAAGCGGGTTCACCTTTGACGCATATGGGATGAACGGGTGAGACAGGCTCCAGGAAGGGTCTGGAGTGGGTGTCTGGCATTTCATATAATTCTGGTACCATAGCGTACGCTGACTCTGTGAAAGGCAGATTCACTATCTCCAGAGATAACGCCAAAAACAGCTTATACCTGCAGATGAATTCACTGAGAGCCGGGACACAGCCCTGTACTATTGTGCTAGAGGAAGATATTCGGATGTGTGGGGCCAGGGAACTACAGTTACCGTCTCCTCA 179 CAGTCTGCACTTACTCAGCCAGCCAGTGTGTCTGGGAGTCCTGGACAGTCGATCACCATTTCCTGCACCGGATCAAGTAGCGATATCGGTGGCTATAATTATGTGTCCTGGTACCAGCAGCACCCAGGCAAGGCCCCCAAACTGATGATTTACGACGTTAGCGATCGCCCCTCAGGGGTCTCCAATCGCTTTTCTGGCAGTAAAAGCGGAAACACAGCCTCCCTGACTATCAGCGGCCTCCAAGCTGAAGACGAGGCTGATTATTATTGTGGTTCTTACTCTAGCAACACTTTTTACGTTTTCGGAACCGGGACAAAGGTGACCGTCTTGGGC
A24-1G10 37 GAAGTGCAGCTGGTCGAGAGTGGGGGGGCTTGGTACAACCTGGAAGATCCCTTAGACTCTCTTGCGCAGCAAGCGGGTTCACCTTTGACGCCTATGGGATGCACTGGTGAGACAGGCTCCAGGGAAGGGTCTGGAGTGGGTGTCTGGCATTTCATATAATTCTGGTACCAAAGCGTACGCTGACTCTGTGAAAGGCAGATTCACTATCTCCAGAGATAACGCCAAAAACAGCTTATACCTGCAGATGAATTCACTGAGAGCCGAGACACAGCCCTGTACTATTTGCTAGAGGAAGATATTCGGATGTGTGGGGCCAGGGAACTACAGTTACCGTCTCCTCA 181 CAGTCTGCACTTACTCAGCCAGCCAGTGTGTCTGGGAGTCCTGGACAGTCGATCACCATTTCCTGCGGCGGATCAAGTAGCAATATCGGTGGCTATAATTATGTGTCCTGGTACCAGCAGCACCCAGGCAAGGCCCCCAAACTGATGATTTACGACGTTAACAAGCGCCCCTCAGGGGTCTCCAATCGCTTTTCTGGCAGTAAAAGCGGAAACACAGCCTCCCTGACTATCAGCGGCCTCCAAGCTGAAGACGAGGCTGATTATTATTGTGCTTCTTACTCTAACTCCAATTTTTACGTTTTCGGAACCGGGACAAAGGTGACCGTCTTGGGC
A24-1F07 39 GAAGTGCAGCTGGTCGAGAGTGGGGAGGCTTGGTACAACCTGgAAGATCCCTTAGACTCTCTTGCGCAGCAAGCGGGTTCACCTTTGACGCCTATGGGATGCATGGGTGAGACAGGCTCCAGGAAGGGTCTGGAGTGGGTGTCTGGCGTTTCATATAATTCTGGTACCACAGCGTACGCTGACTCTGTGAGAGGCAGATTCACTATCTCCAGAGATAACGCCAAAAACAGCTTATACCTGCAGATGAATTCACTGAGAGCCAGGACACAGCCCTGTACTATTGTGCTAGAGGAAGATATTCGGATGTGTGGGGCCAGGGACTACAGTTACCGTCTCCTCA 183 CAGTCTGCACTTACTCAGCCAGCCAGTGTGTCTGGGAGTCCTGGACAGTCGATCACCATTTCCTGCAGCGGATCAAGTAGCAATGTCGGTAGCTATAATTATGTGTCCTGGTACCAGCAGCACCCAGGCAAGGCCCCCAAACTGATGATTTACGACGTTACCAAGCGCCCCTCAGGGGTCTCCAATCGCTTTTCTGGCAGTAAAAGCGGAAACACAGCCTCCCTGACTATCAGCGGCCTCCAAGCTGAAGACGAGGCTGATTATTATTGTGGTTCTTACTCTAACTCCAATTTTTACGTTTTCGGAACCGGGACAAAGGTGACCGTCTTGGGC
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H23-3D08 139 CAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGCGGAGGTGTGGTCCAACCTGGAAGGTCTCTGAGACTCTCCTGCGCAGACTCTGGCTTTACATTCAGTGACTACGACATGCATTGGGTCAGACAGGCTCCAGGAAAAGGCTTGGAGTGGGTGGCCGTTATTTCTTACGATGGCGGCAGCAAATACTATGCAGATTCTGTGAAAGGGCGATTCACCATTTCCAGAGACAACTCTAAGAACACTCTTTATCTGCAGATGAATAGCCTGAGAGCTGAAGACACTGCCGTTTACTATTGTGCGAGGGGGAGTGGGCAGCGGGATGCTTTTGACGTGTGGGGCCAGGGCACAATGGTCACCGTATCATCA 283 GACATCCAGATGACCCAGTCTCCTTCCACCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGTCAAGCTAGTCAGGGTATTAGTAACCGGTTGGCTTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATAAGGCATCTAACTTAGAAACTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAATTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGATGATTTTGCAACTTACTATTGTCAACAGACGAACAGTTTCCCTCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA
H21-4D09 141 CAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGCGGAGGTGTGGTCCAACCTGGAAGGTCTCTGAGACTCTCCTGCGCAGCCTCTGGCTTTACATTCAGTAACTACTACATTAATTGGGTCAGACAGGCTCCAGGAAAAGGCTTGGAGTGGGTGGCCAGTGTTTCTTACGATGGCGGCAGCATATACTATGCAGATTCTGTGAAAGGGCGATTCACCATTTCCAGAGACAACTCTAAGAACACTCTTTATCTGCAGATGAATAGCCTGAGAGCTGAAGACACTGCCGTTTACTATTGTGCGAGGGGGAGTGGGAGGCGGGATGCTTTTGACGTGTGGGGCCAGGGCACAATGGTCACCGTATCATCA 285 GACATCCAGATGACCCAGTCTCCTTCCACCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGTCAAGCTAGTCAGGGTATTCGTAACCGGTTGGCTTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATAAGGCATCTAACTTACAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAATTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGATGATTTTGCAACTTACTATTGTCAACAGACGAACAGTTTCCCTCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA
H24-1D11 143 CAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGCGGAGGTGTGGTCCAACCTGGAAGGTCTCTGAGACTCTCCTGCGCAGCCTCTGGCTTTACATTCAGTAGCTACGCCATGCACTGGGTCAGACAGGCTCCAGGAAAAGGCTTGGAGTGGGTGGCCGTTATCTCTTACGATGGTAGCAATAAGTACTATGCAGATTCTGTGAAAGGGCGATTCACCATTTCCAGAGACAACTCTAAGAACACTCTTTATCTGCAGATGAATAGCCTGAGAGCTGAAGACACTGCCGTTTACTATTGTGCGAGGGGGAGTGGGGGACGGGATGCTTTTGACGTGTGGGGCCAGGGCACAATGGTCACCGTATCATCA 287 GACATCCAGATGACCCAGTCTCCTTCCACCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCCAGTCAGAGTATTAGTAGCCGGTTGGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATAAGGCATCTAGCTTAGAAACTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAATTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGATGATTTTGCAACTTACTATTGTCAACAGACGAACAGTTTCCCTCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA
선별된 항체의 중쇄 및 경쇄 가변영역의 CDR3 서열
클론명 중쇄 가변 영역 경쇄 가변영역
서열번호 CDR1 CDR2 CDR3 서열번호 CDR1 CDR2 CDR3
A11-C07 18 EYGMH GVSWNSGSIAYADSVRG GRYSDV 162 TGSSSDVGGYNYVS DVTKRPS ASYSSNTFYV
A11-G06 20 EYGMH GVSWNSGSIAYADSVRG GRMLDV 164 TGSSSDVGGYNYVS DVTKRPS GSYNNNTFYV
A12-C09 22 EYGMH GVSWNSGSIAYADSVRG GRTMDV 166 TGSSSDVGGYNYVS DVTKRPS GSYSSNTFYV
A12-E05 24 EYGMH GVSWNSGSIAYADSVRG GRSLDV 168 TGSSSDVGGYNYVS DVTKRPS ASYSSNTFYV
A12-E01 26 EYGMH GVSWNSGSIAYADSVRG GRLLDV 170 TGSSSDVGGYNYVS DVTKRPS GSYSNNNFYV
A12-E04 28 EYGMH GVSWNSGSIAYADSVRG GRLFDV 172 TGSSSDVGGYNYVS DVTKRPS GSYSNSNFYV
A12-F02 30 EYGMH GVSWNSGSIAYADSVRG GRYLDV 174 TGSSSDVGGYNYVS DVTKRPS GSYDSNTFYV
A12-H04 32 EYGMH GVSWNSGSIAYADSVRG GRLLDV 176 TGSSSDVGGYNYVS DVTKRPS GAYSNTNFYV
선별된 항체의 중쇄 및 경쇄 가변영역의 CDR 서열
클론명 중쇄 가변영역 경쇄 가변영역
서열번호 CDR1 CDR2 CDR3 서열번호 CDR1 CDR2 CDR3
A23-3H04 34 TYGMN GISYNGGTTAYADSVRG GRYSDV 178 GGSSSDVGGYNYVS DVNKRPS GSYDSNTFYV
A24-1G10 38 AYGMH GISYNSGTKAYADSVKG GRYSDV 182 GGSSSNIGGYNYVS DVNKRPS ASYSNSNFYV
A24-1F07 40 AYGMH GVSYNSGTTAYADSVRG GRYSDV 184 SGSSSNVGSYNYVS DVTKRPS GSYSNSNFYV
A21-4B10 42 EYGMH GISYNSGNKAYADSVRG GRYSDV 186 SGSSSNIGGYNYVS DVSKRPS GSYDSNTFYV
A21-4G04 44 SYGMH GISYNGGNTAYADSVRG GRYSDV 188 SGSSSNIGGYNYVS DVNERPS GSYSNNNFYV
A23-3H05 46 AYGMN GISYNSGTIAYADSVKG GRYSDV 190 GGSSSNVGGYNYVS DVSNRPS GSYSNSNFYV
A21-3A09 48 NYGMN GISYNSGTKAYADSVKG GRYSDV 192 SGSSSDIGGYNYVS DVNKRPS ASYSSNTFYV
A21-4B06 50 SYGMH GISYNGGSKAYADSVRG GRYSDV 194 SGSSSNIGSYNYVS DVTDRPS GSYSSNTFYV
A24-1B05 52 KYGMN GISYNSGNTAYADSVRG GRYSDV 196 AGSSSDIGGYNYVS DVSKRPS GSYDSNTFYV
A23-3A08 54 AYGMH GISYNSGTTAYADSVKG GRYSDV 198 AGSSSNIGGYNYVS DVSKRPS GSYSNSNFYV
A21-4C08 56 TYGMH GISYNAGNKAYADSVRG GRYSDV 200 SGSSSNVGSYNYVS DVNNRPS GSYSSNTFYV
A23-4D09 58 AYGMH GVSYDAGNTAYADSVRG GRYSDV 202 SGSSSNIGSYNYVS DVTDRPS GSYSSNTFYV
A23-3D03 60 AYGMN GISYNAGSTAYADSVRG GRYSDV 204 TGSSSDVGGYNYVS DVTNRPS GSYDSNTFYV
A21-4B03 62 AYGMN GISYNAGNKAYADSVRG GRYSDV 206 SGSSSNIGSYNYVS DVNKRPS ASYSSNTFYV
A21-3D10 64 NYGMH GISYDAGTTAYADSVKG GRYSDV 208 GGTSSNIGGYNYVS DVTNRPS GSYSNTNFYV
A21-3A10 66 AYGMH GISYNAGNKAYADSVRG GRYSDV 210 AGSSSNIGGYNYVS DVSKRPS GSYSNSNFYV
A21-4H04 68 SYGMH GISYNSGNKAYADSVKG GRYSDV 212 SGTSSDIGGYNYVS DVSKRPS GSYSNNNFYV
A21-4F11 70 AYGMN GISYNGGTKAYADSVRG GRYSDV 214 GGTSSNIGGYNYVS DVNDRPS ASYSSNTFYV
A23-3G05 72 TYGMH GISYNSGTIAYADSVRG GRYSDV 216 AGSSSNIGSYNYVS DVSNRPS GSYDSNTFYV
A23-3A10 74 KYGMH GISYNAGSKAYADSVKG GRYSDV 218 AGSSSNIGGYNYVS DVSDRPS GSYDSNTFYV
A25-1H04 76 AYGMN GISYNSGNTAYADSVRG GRYSDV 220 AGSSSDIGGYNYVS DVSERPS GSYDSNTFYV
A23-3B06 78 AYGMH GISYNSGSKAYADSVKG GRYSDV 222 SGSSSDVGGYNYVS DVSERPS GSYDSNTFYV
A23-4A09 80 NYGMN GISYDSGNKAYADSVKG GRYSDV 224 GGSSSNIGGYNYVS DVTKRPS ASYSSNTFYV
A25-1D09 82 AYGMH GISYNGGTIAYADSVKG GRYSDV 226 GGTSSDVGSYNYVS DVNKRPS GSYSNSNFYV
A21-4E10 84 AYGMN GVSYNAGNKAYADSVRG GRYSDV 228 TGSSSNVGGYNYVS DVSKRPS GSYSSNTFYV
A23-3C04 86 TYGMH GISYDSGTTAYADSVKG GRYSDV 230 SGTSSDIGGYNYVS DVTEPPS ASYSSNTFYV
A23-3G06 88 AYGMN GISYNSGNIAYADSVRG GRYSDV 232 AGTSSNIGGYNYVS DVNDRPS GSYDSNTFYV
A24-1E09 90 KYGMH GVSYNAGTTAYADSVRG GRYSDV 234 TGSSSNIGGYNYVS DVTNRPS GSYSNSNFYV
A23-3F03 92 TYGMH GISYNSGNIAYADSVKG GRYSDV 236 GGSSSNIGSYNYVS DVTKRPS GSYDSNTFYV
A21-4F07 94 AYGMN GISYNAGNKAYADSVKG GRYSDV 238 SGTSSNVGGYNYVS DVSDRPS GSYSNSNFYV
A24-1A03 96 AYGMN GISYNAGNTAYADSVKG GRYSDV 240 GGSSSNVGGYNYVS DVSKRPS GSYSNSNFYV
A24-1H11 98 AYGMH GISYNSGTTAYADSVRG GRYSDV 242 TGSSSDVGGYNYVS EVNKRPS ASYSSNTFYV
A21-3D09 100 NYGMN GISYNSGTKAYADSVKG GRYSDV 244 SGTSSNVGGYNYVS DVNKRPS GSYSNSNFYV
A24-1D10 102 NYGMH GISYNSGNKAYADSVKG GRYSDV 246 SGSSSDIGGYNYVS DVTDRPS GSYSNNNFYV
A21-4B04 104 AYGMH GISYDAGNIAYADSVRG GRYSDV 248 AGTSSNIGGYNYVS DVSNRPS ASYSSNTFYV
A23-4C12 106 AYGMN GVSYNSGNKAYADSVRG GRYSDV 250 SGTSSDVGGYNYVS DVTKRPS GSYSSNTFYV
A21-4G06 108 TYGMN GISYNAGTKAYADSVRG GRYSDV 252 AGSSSNVGGYNYVS DVTKRPS GSYSNSNFYV
A23-3E04 110 KYGMH GISYNAGTTAYADSVKG GRYSDV 254 TGSSSDVGGYNYVS DVTDRPS GSYSNSNFYV
A24-1C09 112 AYGMN GISYNGGNKAYADSVRG GRYSDV 256 TGTSSNVGSYNYVS DVNDRPS GSYDSNTFYV
A24-1C04 114 GYGMH GISYNSGSTAYADSVRG GRYSDV 258 TGTSSNIGGYNYVS DVTKRPS GSYSNSNFYV
A25-1H10 116 AYGMH GVSYNAGTTAYADSVRG GRYSDV 260 GGSSSDVGGYNYVS EVSNRPS GSYSNSNFYV
A21-4D08 118 TYGMH GVSYNSGNKAYADSVKG GRYSDV 262 GGTSSDVGGYNYVS DVNDRPS GSYSNNNFYV
A24-1D08 120 NYGMH GISYNSGNTGYADSVRG GRYSDV 264 AGSSSNVVSYNYVS DVNKRPS GSYDSNTFYV
A24-1A08 122 AYGMH GISYDAGNTAYADSVRG GRYSDV 266 TGSSSNIGGYNYVS EVNNRPS ASYSSNTFYV
A21-4A07 124 TYGMH GVSYNSGSKAYADSVKG GRYSDV 268 AGSSSNIGGYNYVS DVNDRPS GSYSNSNFYV
A24-1B09 126 RYGMH GVSYDGGTTAYADSVRG GRYSDV 270 TGTSSNIGSYNYVS DVNKRPS GSYDSNTFYV
A24-1E07 128 EYGMH GISYDAGSTAYADSVRG GRYSDV 272 AGSSSNVGGYNYVS EVSNRPS GSYDSNTFYV
H21-3A07 130 NYYMN TVSYDSGNKYYADSVKG GS-RRDAFDV 274 RASQSISNRLA KASNLES QQTNSFPLT
H21-4D11 132 NYAMN IISYDSSSKYYADSVKG GSGKRDAFDV 276 QASQGISNRLA KASNLQS QQTNSFPLT
H21-3C11 134 NYAMH VVSYDGGNIYYADSVKG GSGRRDAFDV 278 RASQSISNRLA KASSLQS QQTNSFPLT
H21-3A09 136 NYDIH VVSYDGSNTYYADSVKG GSGKRDAFDV 280 RASQSISNRLA KASNLQS QQTNSFPLT
H21-4H04 138 SYAIH VVSYDGGSKYYADSVKG GSGRRDAFDV 282 QASQSISSRLA KASSLQS QQTNSFPLT
H23-3D08 140 DYDMH VISYDGGSKYYADSVKG GSGQRDAFDV 284 QASQGISNRLA KASNLET QQTNSFPLT
H21-4D09 142 NYYIN SVSYDGGSIYYADSVKG GSGRRDAFDV 286 QASQGIRNRLA KASNLQS QQTNSFPLT
H24-1D11 144 SYAMH VISYDGSNKYYADSVKG GSGGRDAFDV 288 RASQSISSRLA KASSLET QQTNSFPLT
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술 하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Hanall Biopharma Co., Ltd. <120> FcRn specific human antibody and composition for treatment of autoimmune diseases <130> P13-B152 <160> 292 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 345 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HL161-1A heavy <400> 1 caggtgcagc tggtgcagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggcaggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggttt cagttttggt gaatatggca tgcactgggt ccggcaagct 120 ccagggaagg gcctggagtg ggtctcaggt gttagttgga acagtggtag cattgcctat 180 gcggactctg tgaggggccg attcaccatc tccagagaca acagcaaaaa ctccctgtat 240 ctgcaaatga acagtctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gagaggtaga 300 agtatggacg tctggggcca agggaccacg gtcaccgtct cctca 345 <210> 2 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HL161-1A heavy <400> 2 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Gly Glu Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Val Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Ala Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Arg Ser Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 3 <211> 348 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HL161-2A heavy <400> 3 cagatgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggagg caccttcaac aactatgctg tcagctgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggaagg atcatcccta tccttggtat agcaaactac 180 gcacagacat tccagggcag agtcacgatt accgcggaca aatccacgac cacagcctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc aagagatcgt 300 tacggtatgg acgtctgggg ccaagggacc acggtcaccg tctcctca 348 <210> 4 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HL161-2A heavy <400> 4 Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Asn Asn Tyr 20 25 30 Ala Val Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Ile Pro Ile Leu Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Thr Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Thr Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Arg Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 5 <211> 369 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HL161-2D heavy <400> 5 caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc cagggcggtc cctgagactc 60 tcctgtacag cttctggatt cacctttggt gattatgcta tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtaggtttc attagaagca aagcttatgg tgggacaaca 180 gaatacgccg cgtctgtgaa aggcagattc accatctcaa gagatgattc caaaagcatc 240 gcctatctgc aaatgaacag tctgagagcc gaggacacgg ccgtgtatta ctgtgcgaga 300 gaggggctgt tcctgcccct gggaggtttt gatttatggg gcctagggac aatggtcacc 360 gtctcctca 369 <210> 6 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HL161-2D heavy <400> 6 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Asp Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Phe Ile Arg Ser Lys Ala Tyr Gly Gly Thr Thr Glu Tyr Ala Ala 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ile 65 70 75 80 Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg Glu Gly Leu Phe Leu Pro Leu Gly Gly Phe Asp Leu 100 105 110 Trp Gly Leu Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 7 <211> 348 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HL161-6C heavy <400> 7 caggtgcagc tggtggagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60 tcctgcaagg catctggata caccttcacc agctactata tgcactgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggaata atcaacccta gtggtggtag cacaagctac 180 gcacagaagt tccagggcag agtcaccatg accagggaca cgtccacgag cacagtctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc aagagggggg 300 ggggcttttg atatctgggg ccaagggaca atggtcaccg tctcctca 348 <210> 8 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HL161-6C heavy <400> 8 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 9 <211> 369 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HL161-9F heavy <400> 9 caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagt cagggcggtc cctgagactc 60 tcctgtacag cttctggatt cacctttggt gattatgcta tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtaggtttc attagaagca aagcttatgg tgggacaaca 180 gaatacgccg cgtctgtgaa aggcagattc accatctcaa gagatgattc caaaagcatc 240 gcctatctgc aaatgaacag tctgagagcc gaggacacgg ccgtgtatta ctgtgcgaga 300 gaggggctgt tcctgcccct gggaggtttt gatttatggg gcctagggac aatggtcacc 360 gtctcctca 369 <210> 10 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HL161-9F heavy <400> 10 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ser Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Asp Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Phe Ile Arg Ser Lys Ala Tyr Gly Gly Thr Thr Glu Tyr Ala Ala 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ile 65 70 75 80 Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg Glu Gly Leu Phe Leu Pro Leu Gly Gly Phe Asp Leu 100 105 110 Trp Gly Leu Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 11 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HL161 10E heavy <400> 11 caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttagtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggctt cagattcagc aactttgcca tgacctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcaact cttagtggta gtggtggtag tatacaccac 180 gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagtctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gaaagggccc 300 ttgaggggac agccggccta ccttgacccc tggggccagg gaaccctggt caccgtctcc 360 tca 363 <210> 12 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HL161 10E heavy <400> 12 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Arg Phe Ser Asn Phe 20 25 30 Ala Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Thr Leu Ser Gly Ser Gly Gly Ser Ile His His Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Gly Pro Leu Arg Gly Gln Pro Ala Tyr Leu Asp Pro Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 13 <211> 345 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HL161-11G heavy <400> 13 cagatgcagc tggtggagtc ggggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc tctgagactc 60 tcctgtgtag ggtctggatt caacttcaac agttatggca tacactgggt ccgccaggct 120 ccaggcaagg ggctggagtg ggtgggagga atattttatg atggaagtca agtaaagtat 180 gcagactccg tgaagggccg agtctccatc tatgccatga attccaagaa cacagcgtat 240 ctgcaaatga acagtctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gcgacgaaac 300 ctcctggact actggggcca gggaacggtg gtcaccgtct cctca 345 <210> 14 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HL161-11G heavy <400> 14 Gln Met Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Gly Ser Gly Phe Asn Phe Asn Ser Tyr 20 25 30 Gly Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Gly Ile Phe Tyr Asp Gly Ser Gln Val Lys Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Val Ser Ile Ser Arg Asp Asn 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240 ctgcagatga attcactgag agccgaggac acagccctgt actattgtgc tagaggaaga 300 tattcggatg tgtggggcca gggaactaca gttaccgtct cctca 345 <210> 56 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A21-4C08 heavy <400> 56 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Thr Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Ser Tyr Asn Ala Gly Asn Lys Ala Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Gly Arg Ser Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 57 <211> 345 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A23-4D09 heavy <400> 57 gaagtgcagc tggtcgagag tgggggaggc ttggtacaac ctggaagatc ccttagactc 60 tcttgcgcag caagcgggtt cacctttgac gcctatggga tgcactgggt gagacaggct 120 ccagggaagg 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Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Arg 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Lys Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Asn Ser Phe Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val 100 105 110 <210> 281 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H21-4H04 light <400> 281 gacatccaga tgacccagtc tccttccacc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgtc aagctagtca gagtattagt agccggttgg cttggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctataag gcatctagct tacaaagtgg ggtcccatca 180 aggttcagcg gcggtggatc tgggacagaa ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240 gatgattttg caacttacta ttgtcaacag acgaacagtt tccctctcac tttcggcgga 300 gggaccaagg tggagatcaa a 321 <210> 282 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H21-4H04 light <400> 282 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Arg 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Asn Ser Phe Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val 100 105 110 <210> 283 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H23-3D08 light <400> 283 gacatccaga tgacccagtc tccttccacc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgtc aagctagtca gggtattagt aaccggttgg cttggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctataag gcatctaact tagaaactgg ggtcccatca 180 aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240 gatgattttg caacttacta ttgtcaacag acgaacagtt tccctctcac tttcggcgga 300 gggaccaagg tggagatcaa a 321 <210> 284 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H23-3D08 light <400> 284 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Arg 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Lys Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Asn Ser Phe Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val 100 105 110 <210> 285 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H21-4D09 light <400> 285 gacatccaga tgacccagtc tccttccacc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgtc aagctagtca gggtattcgt aaccggttgg cttggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctataag gcatctaact tacaaagtgg ggtcccatca 180 aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240 gatgattttg caacttacta ttgtcaacag acgaacagtt tccctctcac tttcggcgga 300 gggaccaagg tggagatcaa a 321 <210> 286 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H21-4D09 light <400> 286 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Arg 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Lys Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Asn Ser Phe Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val 100 105 110 <210> 287 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H24-1D11 light <400> 287 gacatccaga tgacccagtc tccttccacc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggccagtca gagtattagt agccggttgg cctggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctataag gcatctagct tagaaactgg ggtcccatca 180 aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240 gatgattttg caacttacta ttgtcaacag acgaacagtt tccctctcac tttcggcgga 300 gggaccaagg tggagatcaa a 321 <210> 288 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H24-1D11 light <400> 288 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Arg 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Asn Ser Phe Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val 100 105 110 <210> 289 <211> 445 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Germline 1Ag Heavy chain <400> 289 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Glu Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Val Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Ala Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Gly Arg Ser Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 115 120 125 Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val 130 135 140 Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala 145 150 155 160 Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly 165 170 175 Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly 180 185 190 Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys 195 200 205 Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys 210 215 220 Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu 225 230 235 240 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 245 250 255 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys 260 265 270 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 275 280 285 Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 290 295 300 Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 305 310 315 320 Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 325 330 335 Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 340 345 350 Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 355 360 365 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 370 375 380 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 385 390 395 400 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 405 410 415 Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 420 425 430 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 290 <211> 218 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Germline 1Ag Light chain <400> 290 Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr 20 25 30 Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Met Ile Tyr Asp Val Thr Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Ser Ser Ser 85 90 95 Thr Phe Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Arg 100 105 110 Ser Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 115 120 125 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 130 135 140 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 145 150 155 160 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 165 170 175 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 180 185 190 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 195 200 205 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 291 <211> 449 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Germline 11Hg Heavy chain <400> 291 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ser Gly Gly Arg Asp Ala Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Met Ile Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 210 215 220 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 225 230 235 240 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 245 250 255 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 260 265 270 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 275 280 285 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 290 295 300 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 325 330 335 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 340 345 350 Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 355 360 365 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445 Lys <210> 292 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Germline 11Hg Light chain <400> 292 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Arg 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Asn Ser Phe Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Ser Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210

Claims (27)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 다음의 표에 기재된 중쇄 가변영역 CDR1, CDR2 및 CDR3; 및 경쇄 가변영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 FcRn 특이적 항체, 또는 그러한 항체의 항원 결합 단편에 있어서,
    서열번호 2의 중쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3, 서열번호 146의 경쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3;
    서열번호 14의 중쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3, 서열번호 158의 경쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3;
    서열번호 16의 중쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3, 서열번호 160의 경쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3;
    서열번호 289의 중쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3, 서열번호 290의 경쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3;
    서열번호 291의 중쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3, 서열번호 292의 경쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3;
    서열번호 18의 중쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3, 서열번호 162의 경쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3;
    서열번호 20의 중쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3, 서열번호 164의 경쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3;
    서열번호 22의 중쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3, 서열번호 166의 경쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3;
    서열번호 24의 중쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3, 서열번호 168의 경쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3;
    서열번호 26의 중쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3, 서열번호 170의 경쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3;
    서열번호 28의 중쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3, 서열번호 172의 경쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3;
    서열번호 30의 중쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3, 서열번호 174의 경쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3;
    서열번호 32의 중쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3, 서열번호 176의 경쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3;
    서열번호 34의 중쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3, 서열번호 178의 경쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3;
    서열번호 38의 중쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3, 서열번호 182의 경쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3;
    서열번호 40의 중쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3, 서열번호 184의 경쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3;
    서열번호 42의 중쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3, 서열번호 186의 경쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3;
    서열번호 44의 중쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3, 서열번호 188의 경쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3;
    서열번호 46의 중쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3, 서열번호 190의 경쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3;
    서열번호 48의 중쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3, 서열번호 192의 경쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3;
    서열번호 50의 중쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3, 서열번호 194의 경쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3;
    서열번호 52의 중쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3, 서열번호 196의 경쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3;
    서열번호 54의 중쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3, 서열번호 198의 경쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3;
    서열번호 56의 중쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3, 서열번호 200의 경쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3;
    서열번호 58의 중쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3, 서열번호 202의 경쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3;
    서열번호 60의 중쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3, 서열번호 204의 경쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3;
    서열번호 62의 중쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3, 서열번호 206의 경쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3;
    서열번호 64의 중쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3, 서열번호 208의 경쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3;
    서열번호 66의 중쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3, 서열번호 210의 경쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3;
    서열번호 68의 중쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3, 서열번호 212의 경쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3;
    서열번호 70의 중쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3, 서열번호 214의 경쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3;
    서열번호 72의 중쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3, 서열번호 216의 경쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3;
    서열번호 74의 중쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3, 서열번호 218의 경쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3;
    서열번호 76의 중쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3, 서열번호 220의 경쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3;
    서열번호 78의 중쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3, 서열번호 222의 경쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3;
    서열번호 80의 중쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3, 서열번호 224의 경쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3;
    서열번호 82의 중쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3, 서열번호 226의 경쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3;
    서열번호 84의 중쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3, 서열번호 228의 경쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3;
    서열번호 86의 중쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3, 서열번호 230의 경쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3;
    서열번호 88의 중쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3, 서열번호 232의 경쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3;
    서열번호 90의 중쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3, 서열번호 234의 경쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3;
    서열번호 92의 중쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3, 서열번호 236의 경쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3;
    서열번호 94의 중쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3, 서열번호 238의 경쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3;
    서열번호 96의 중쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3, 서열번호 240의 경쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3;
    서열번호 98의 중쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3, 서열번호 242의 경쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3;
    서열번호 100의 중쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3, 서열번호 244의 경쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3;
    서열번호 102의 중쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3, 서열번호 246의 경쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3;
    서열번호 104의 중쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3, 서열번호 248의 경쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3;
    서열번호 106의 중쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3, 서열번호 250의 경쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3;
    서열번호 108의 중쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3, 서열번호 252의 경쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3;
    서열번호 110의 중쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3, 서열번호 254의 경쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3;
    서열번호 112의 중쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3, 서열번호 256의 경쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3;
    서열번호 114의 중쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3, 서열번호 258의 경쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3;
    서열번호 116의 중쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3, 서열번호 260의 경쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3;
    서열번호 118의 중쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3, 서열번호 262의 경쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3;
    서열번호 120의 중쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3, 서열번호 264의 경쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3;
    서열번호 122의 중쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3, 서열번호 266의 경쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3;
    서열번호 124의 중쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3, 서열번호 268의 경쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3;
    서열번호 126의 중쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3, 서열번호 270의 경쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3;
    서열번호 128의 중쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3, 서열번호 272의 경쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3;
    서열번호 130의 중쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3, 서열번호 274의 경쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3;
    서열번호 132의 중쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3, 서열번호 276의 경쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3;
    서열번호 134의 중쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3, 서열번호 278의 경쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3;
    서열번호 136의 중쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3, 서열번호 280의 경쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3;
    서열번호 138의 중쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3, 서열번호 282의 경쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3;
    서열번호 140의 중쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3, 서열번호 284의 경쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3;
    서열번호 142의 중쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3, 서열번호 286의 경쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3; 또는
    서열번호 144의 중쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3, 서열번호 288의 경쇄 가변영역에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는
    FcRn 특이적 항체, 또는 그러한 항체의 항원 결합 단편.
    Figure 112017095333803-pat00007

    Figure 112017095333803-pat00008

    Figure 112017095333803-pat00009

    Figure 112017095333803-pat00010

    Figure 112017095333803-pat00011

    Figure 112017095333803-pat00012
  6. 하기 (1) 내지 (69)에서 선택된 가변영역을 포함하는 FcRn 특이적 항체, 또는 그러한 항체의 항원 결합 단편.
    (1) 서열번호 2의 중쇄 가변영역과 서열번호 146의 경쇄 가변영역;
    (2) 서열번호 14의 중쇄 가변영역과 서열번호 158의 경쇄 가변영역;
    (3) 서열번호 16의 중쇄 가변영역과 서열번호 160의 경쇄 가변영역;
    (4) 서열번호 18의 중쇄 가변영역과 서열번호 162의 경쇄 가변영역;
    (5) 서열번호 20의 중쇄 가변영역과 서열번호 164의 경쇄 가변영역;
    (6) 서열번호 22의 중쇄 가변영역과 서열번호 166의 경쇄 가변영역;
    (7) 서열번호 24의 중쇄 가변영역과 서열번호 168의 경쇄 가변영역;
    (8) 서열번호 26의 중쇄 가변영역과 서열번호 170의 경쇄 가변영역;
    (9) 서열번호 28의 중쇄 가변영역과 서열번호 172의 경쇄 가변영역;
    (10) 서열번호 30의 중쇄 가변영역과 서열번호 174의 경쇄 가변영역;
    (11) 서열번호 32의 중쇄 가변영역과 서열번호 176의 경쇄 가변영역;
    (12) 서열번호 34의 중쇄 가변영역과 서열번호 178의 경쇄 가변영역;
    (13) 서열번호 36의 중쇄 가변영역과 서열번호 180의 경쇄 가변영역;
    (14) 서열번호 38의 중쇄 가변영역과 서열번호 182의 경쇄 가변영역;
    (15) 서열번호 40의 중쇄 가변영역과 서열번호 184의 경쇄 가변영역;
    (16) 서열번호 42의 중쇄 가변영역과 서열번호 186의 경쇄 가변영역;
    (17) 서열번호 44의 중쇄 가변영역과 서열번호 188의 경쇄 가변영역;
    (18) 서열번호 46의 중쇄 가변영역과 서열번호 190의 경쇄 가변영역;
    (19) 서열번호 48의 중쇄 가변영역과 서열번호 192의 경쇄 가변영역;
    (20) 서열번호 50의 중쇄 가변영역과 서열번호 194의 경쇄 가변영역;
    (21) 서열번호 52의 중쇄 가변영역과 서열번호 196의 경쇄 가변영역;
    (22) 서열번호 54의 중쇄 가변영역과 서열번호 198의 경쇄 가변영역;
    (23) 서열번호 56의 중쇄 가변영역과 서열번호 200의 경쇄 가변영역;
    (24) 서열번호 58의 중쇄 가변영역과 서열번호 202의 경쇄 가변영역;
    (25) 서열번호 60의 중쇄 가변영역과 서열번호 204의 경쇄 가변영역;
    (26) 서열번호 62의 중쇄 가변영역과 서열번호 206의 경쇄 가변영역;
    (27) 서열번호 64의 중쇄 가변영역과 서열번호 208의 경쇄 가변영역;
    (28) 서열번호 66의 중쇄 가변영역과 서열번호 210의 경쇄 가변영역;
    (29) 서열번호 68의 중쇄 가변영역과 서열번호 212의 경쇄 가변영역;
    (30) 서열번호 70의 중쇄 가변영역과 서열번호 214의 경쇄 가변영역;
    (31) 서열번호 72의 중쇄 가변영역과 서열번호 216의 경쇄 가변영역;
    (32) 서열번호 74의 중쇄 가변영역과 서열번호 218의 경쇄 가변영역;
    (33) 서열번호 76의 중쇄 가변영역과 서열번호 220의 경쇄 가변영역;
    (34) 서열번호 78의 중쇄 가변영역과 서열번호 222의 경쇄 가변영역;
    (35) 서열번호 80의 중쇄 가변영역과 서열번호 224의 경쇄 가변영역;
    (36) 서열번호 82의 중쇄 가변영역과 서열번호 226의 경쇄 가변영역;
    (37) 서열번호 84의 중쇄 가변영역과 서열번호 228의 경쇄 가변영역;
    (38) 서열번호 86의 중쇄 가변영역과 서열번호 230의 경쇄 가변영역;
    (39) 서열번호 88의 중쇄 가변영역과 서열번호 232의 경쇄 가변영역;
    (40) 서열번호 90의 중쇄 가변영역과 서열번호 234의 경쇄 가변영역;
    (41) 서열번호 92의 중쇄 가변영역과 서열번호 236의 경쇄 가변영역;
    (42) 서열번호 94의 중쇄 가변영역과 서열번호 238의 경쇄 가변영역;
    (43) 서열번호 96의 중쇄 가변영역과 서열번호 240의 경쇄 가변영역;
    (44) 서열번호 98의 중쇄 가변영역과 서열번호 242의 경쇄 가변영역;
    (45) 서열번호 100의 중쇄 가변영역과 서열번호 244의 경쇄 가변영역;
    (46) 서열번호 102의 중쇄 가변영역과 서열번호 246의 경쇄 가변영역;
    (47) 서열번호 104의 중쇄 가변영역과 서열번호 248의 경쇄 가변영역;
    (48) 서열번호 106의 중쇄 가변영역과 서열번호 250의 경쇄 가변영역;
    (49) 서열번호 108의 중쇄 가변영역과 서열번호 252의 경쇄 가변영역;
    (50) 서열번호 110의 중쇄 가변영역과 서열번호 254의 경쇄 가변영역;
    (51) 서열번호 112의 중쇄 가변영역과 서열번호 256의 경쇄 가변영역;
    (52) 서열번호 114의 중쇄 가변영역과 서열번호 258의 경쇄 가변영역;
    (53) 서열번호 116의 중쇄 가변영역과 서열번호 260의 경쇄 가변영역;
    (54) 서열번호 118의 중쇄 가변영역과 서열번호 262의 경쇄 가변영역;
    (55) 서열번호 120의 중쇄 가변영역과 서열번호 264의 경쇄 가변영역;
    (56) 서열번호 122의 중쇄 가변영역과 서열번호 266의 경쇄 가변영역;
    (57) 서열번호 124의 중쇄 가변영역과 서열번호 268의 경쇄 가변영역;
    (58) 서열번호 126의 중쇄 가변영역과 서열번호 270의 경쇄 가변영역;
    (59) 서열번호 128의 중쇄 가변영역과 서열번호 272의 경쇄 가변영역;
    (60) 서열번호 130의 중쇄 가변영역과 서열번호 274의 경쇄 가변영역;
    (61) 서열번호 132의 중쇄 가변영역과 서열번호 276의 경쇄 가변영역;
    (62) 서열번호 134의 중쇄 가변영역과 서열번호 278의 경쇄 가변영역;
    (63) 서열번호 136의 중쇄 가변영역과 서열번호 280의 경쇄 가변영역;
    (64) 서열번호 138의 중쇄 가변영역과 서열번호 282의 경쇄 가변영역;
    (65) 서열번호 140의 중쇄 가변영역과 서열번호 284의 경쇄 가변영역;
    (66) 서열번호 142의 중쇄 가변영역과 서열번호 286의 경쇄 가변영역;
    (67) 서열번호 144의 중쇄 가변영역과 서열번호 288의 경쇄 가변영역;
    (68) 서열번호 289의 중쇄 가변영역과 서열번호 290의 경쇄 가변영역; 및
    (69) 서열번호 291의 중쇄 가변영역과 서열번호 292의 경쇄 가변영역.
  7. 삭제
  8. 제5항에 있어서,
    상기 항체 또는 항체의 항원 결합 단편은 FcRn에 대한 결합 기능을 보유한 단쇄 항체, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, Fab 단편, F(ab)2단편, Fd, scFv, 도메인 항체, 이중특이항체들, 미니바디, 스캡, IgD 항체, IgE 항체, IgM 항체, IgG1 항체, IgG2 항체, IgG3 항체, IgG4 항체, 항체 불변영역의 유도체들, 및 단백질 스캐폴드(protein scaffolds)에 기초한 인공항체에서 선택된 것임을 특징으로 하는 FcRn -특이적 항체 또는 그러한 항체의 항원 결합 단편.
  9. 제5항에 따른 분리된 항체, 또는 그러한 항체의 항원 결합 단편; 및 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 자가면역질환 치료용 약학조성물.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 자가면역질환은 면역성 호중구 감소증, 길랑바레 신드롬, 간질, 자가면역 대뇌 뇌염, 아이삭 신드롬, 모반 신드롬, 심상성 천포창, 낙엽성 천포창, 수포성류 천포창, 후천성 표피 수포증, 임신성 유사수포창, 뮤코스 막 유사수포창, 항인지질 신드롬, 자가면역 빈혈, 자가면역 그래이브 병, 굿파스튜어 증후군, 중증근무력증, 다발성경화증, 류마티스성 관절염, 루프스 및 특발성 혈소판 감소성 자반증(idiopathic thrombocytopenic purpura, ITP) 에서 선택되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 제5항에 따른 FcRn 특이적 항체, 또는 그러한 항체의 항원 결합 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  14. 제13항에 있어서,
    하기 폴리뉴클레오티드 서열에서 선택되는 것을 특징으로 하는 FcRn 특이적 항체, 또는 그러한 항체의 항원 결합 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드.
    (1) 서열번호 1의 중쇄 가변영역을 인코딩하는 서열, 및 서열번호 145의 경쇄 가변영역을 인코딩하는 서열;
    (2) 서열번호 13의 중쇄 가변영역을 인코딩하는 서열, 및 서열번호 157의 경쇄 가변영역을 인코딩하는 서열;
    (3) 서열번호 15의 중쇄 가변영역을 인코딩하는 서열, 및 서열번호 159의 경쇄 가변영역을 인코딩하는 서열;
    (4) 서열번호 17 의 중쇄 가변영역을 인코딩하는 서열, 및 서열번호 161의 경쇄 가변영역을 인코딩하는 서열;
    (5) 서열번호 19 의 중쇄 가변영역을 인코딩하는 서열, 및 서열번호 163의 경쇄 가변영역을 인코딩하는 서열;
    (6) 서열번호 21의 중쇄 가변영역을 인코딩하는 서열, 및 서열번호 165의 경쇄 가변영역을 인코딩하는 서열;
    (7) 서열번호 23의 중쇄 가변영역을 인코딩하는 서열, 및 서열번호 167의 경쇄 가변영역을 인코딩하는 서열;
    (8) 서열번호 25의 중쇄 가변영역을 인코딩하는 서열, 및 서열번호 169의 경쇄 가변영역을 인코딩하는 서열;
    (9) 서열번호 27의 중쇄 가변영역을 인코딩하는 서열, 및 서열번호 171의 경쇄 가변영역을 인코딩하는 서열;
    (10) 서열번호 29의 중쇄 가변영역을 인코딩하는 서열, 및 서열번호 173의 경쇄 가변영역을 인코딩하는 서열;
    (11) 서열번호 31의 중쇄 가변영역을 인코딩하는 서열, 및 서열번호 175의 경쇄 가변영역을 인코딩하는 서열;
    (12) 서열번호 33의 중쇄 가변영역을 인코딩하는 서열, 및 서열번호 177의 경쇄 가변영역을 인코딩하는 서열;
    (13) 서열번호 35의 중쇄 가변영역을 인코딩하는 서열, 및 서열번호 179의 경쇄 가변영역을 인코딩하는 서열;
    (14) 서열번호 37의 중쇄 가변영역을 인코딩하는 서열, 및 서열번호 181의 경쇄 가변영역을 인코딩하는 서열;
    (15) 서열번호 39의 중쇄 가변영역을 인코딩하는 서열, 및 서열번호 183의 경쇄 가변영역을 인코딩하는 서열;
    (16) 서열번호 41의 중쇄 가변영역을 인코딩하는 서열, 및 서열번호 185의 경쇄 가변영역을 인코딩하는 서열;
    (17) 서열번호 43의 중쇄 가변영역을 인코딩하는 서열, 및 서열번호 187의 경쇄 가변영역을 인코딩하는 서열;
    (18) 서열번호 45의 중쇄 가변영역을 인코딩하는 서열, 및 서열번호 189의 경쇄 가변영역을 인코딩하는 서열;
    (19) 서열번호 47의 중쇄 가변영역을 인코딩하는 서열, 및 서열번호 191의 경쇄 가변영역을 인코딩하는 서열;
    (20) 서열번호 49의 중쇄 가변영역을 인코딩하는 서열, 및 서열번호 193의 경쇄 가변영역을 인코딩하는 서열;
    (21) 서열번호 51의 중쇄 가변영역을 인코딩하는 서열, 및 서열번호 195의 경쇄 가변영역을 인코딩하는 서열;
    (22) 서열번호 53의 중쇄 가변영역을 인코딩하는 서열, 및 서열번호 197의 경쇄 가변영역을 인코딩하는 서열;
    (23) 서열번호 55의 중쇄 가변영역을 인코딩하는 서열, 및 서열번호 199의 경쇄 가변영역을 인코딩하는 서열;
    (24) 서열번호 57의 중쇄 가변영역을 인코딩하는 서열, 및 서열번호 201의 경쇄 가변영역을 인코딩하는 서열;
    (25) 서열번호 59의 중쇄 가변영역을 인코딩하는 서열, 및 서열번호 203의 경쇄 가변영역을 인코딩하는 서열;
    (26) 서열번호 61의 중쇄 가변영역을 인코딩하는 서열, 및 서열번호 205의 경쇄 가변영역을 인코딩하는 서열;
    (27) 서열번호 63의 중쇄 가변영역을 인코딩하는 서열, 및 서열번호 207의 경쇄 가변영역을 인코딩하는 서열;
    (28) 서열번호 65의 중쇄 가변영역을 인코딩하는 서열, 및 서열번호 209의 경쇄 가변영역을 인코딩하는 서열;
    (29) 서열번호 67의 중쇄 가변영역을 인코딩하는 서열, 및 서열번호 211의 경쇄 가변영역을 인코딩하는 서열;
    (30) 서열번호 69의 중쇄 가변영역을 인코딩하는 서열, 및 서열번호 213의 경쇄 가변영역을 인코딩하는 서열;
    (31) 서열번호 71의 중쇄 가변영역을 인코딩하는 서열, 및 서열번호 215의 경쇄 가변영역을 인코딩하는 서열;
    (32) 서열번호 73의 중쇄 가변영역을 인코딩하는 서열, 및 서열번호 217의 경쇄 가변영역을 인코딩하는 서열;
    (33) 서열번호 75의 중쇄 가변영역을 인코딩하는 서열, 및 서열번호 219의 경쇄 가변영역을 인코딩하는 서열;
    (34) 서열번호 77의 중쇄 가변영역을 인코딩하는 서열, 및 서열번호 221의 경쇄 가변영역을 인코딩하는 서열;
    (35) 서열번호 79의 중쇄 가변영역을 인코딩하는 서열, 및 서열번호 223의 경쇄 가변영역을 인코딩하는 서열;
    (36) 서열번호 81의 중쇄 가변영역을 인코딩하는 서열, 및 서열번호 225의 경쇄 가변영역을 인코딩하는 서열;
    (37) 서열번호 83의 중쇄 가변영역을 인코딩하는 서열, 및 서열번호 227의 경쇄 가변영역을 인코딩하는 서열;
    (38) 서열번호 85의 중쇄 가변영역을 인코딩하는 서열, 및 서열번호 229의 경쇄 가변영역을 인코딩하는 서열;
    (39) 서열번호 87의 중쇄 가변영역을 인코딩하는 서열, 및 서열번호 231의 경쇄 가변영역을 인코딩하는 서열;
    (40) 서열번호 89의 중쇄 가변영역을 인코딩하는 서열, 및 서열번호 233의 경쇄 가변영역을 인코딩하는 서열;
    (41) 서열번호 91의 중쇄 가변영역을 인코딩하는 서열, 및 서열번호 235의 경쇄 가변영역을 인코딩하는 서열;
    (42) 서열번호 93의 중쇄 가변영역을 인코딩하는 서열, 및 서열번호 237의 경쇄 가변영역을 인코딩하는 서열;
    (43) 서열번호 95의 중쇄 가변영역을 인코딩하는 서열, 및 서열번호 239의 경쇄 가변영역을 인코딩하는 서열;
    (44) 서열번호 97의 중쇄 가변영역을 인코딩하는 서열, 및 서열번호 241의 경쇄 가변영역을 인코딩하는 서열;
    (45) 서열번호 99의 중쇄 가변영역을 인코딩하는 서열, 및 서열번호 243의 경쇄 가변영역을 인코딩하는 서열;
    (46) 서열번호 101의 중쇄 가변영역을 인코딩하는 서열, 및 서열번호 245의 경쇄 가변영역을 인코딩하는 서열;
    (47) 서열번호 103의 중쇄 가변영역을 인코딩하는 서열, 및 서열번호 247의 경쇄 가변영역을 인코딩하는 서열;
    (48) 서열번호 105의 중쇄 가변영역을 인코딩하는 서열, 및 서열번호 249의 경쇄 가변영역을 인코딩하는 서열;
    (49) 서열번호 107의 중쇄 가변영역을 인코딩하는 서열, 및 서열번호 251의 경쇄 가변영역을 인코딩하는 서열;
    (50) 서열번호 109의 중쇄 가변영역을 인코딩하는 서열, 및 서열번호 253의 경쇄 가변영역을 인코딩하는 서열;
    (51) 서열번호 111의 중쇄 가변영역을 인코딩하는 서열, 및 서열번호 255의 경쇄 가변영역을 인코딩하는 서열;
    (52) 서열번호 113의 중쇄 가변영역을 인코딩하는 서열, 및 서열번호 257의 경쇄 가변영역을 인코딩하는 서열;
    (53) 서열번호 115의 중쇄 가변영역을 인코딩하는 서열, 및 서열번호 259의 경쇄 가변영역을 인코딩하는 서열;
    (54) 서열번호 117의 중쇄 가변영역을 인코딩하는 서열, 및 서열번호 261의 경쇄 가변영역을 인코딩하는 서열;
    (55) 서열번호 119의 중쇄 가변영역을 인코딩하는 서열, 및 서열번호 263의 경쇄 가변영역을 인코딩하는 서열;
    (56) 서열번호 121의 중쇄 가변영역을 인코딩하는 서열, 및 서열번호 265의 경쇄 가변영역을 인코딩하는 서열;
    (57) 서열번호 123의 중쇄 가변영역을 인코딩하는 서열, 및 서열번호 267의 경쇄 가변영역을 인코딩하는 서열;
    (58) 서열번호 125의 중쇄 가변영역을 인코딩하는 서열, 및 서열번호 269의 경쇄 가변영역을 인코딩하는 서열;
    (59) 서열번호 127의 중쇄 가변영역을 인코딩하는 서열, 및 서열번호 271의 경쇄 가변영역을 인코딩하는 서열;
    (60) 서열번호 129의 중쇄 가변영역을 인코딩하는 서열, 및 서열번호 273의 경쇄 가변영역을 인코딩하는 서열;
    (61) 서열번호 131의 중쇄 가변영역을 인코딩하는 서열, 및 서열번호 275의 경쇄 가변영역을 인코딩하는 서열;
    (62) 서열번호 133의 중쇄 가변영역을 인코딩하는 서열, 및 서열번호 277의 경쇄 가변영역을 인코딩하는 서열;
    (63) 서열번호 135의 중쇄 가변영역을 인코딩하는 서열, 및 서열번호 279의 경쇄 가변영역을 인코딩하는 서열;
    (64) 서열번호 137의 중쇄 가변영역을 인코딩하는 서열, 및 서열번호 281의 경쇄 가변영역을 인코딩하는 서열;
    (65) 서열번호 139의 중쇄 가변영역을 인코딩하는 서열, 및 서열번호 283의 경쇄 가변영역을 인코딩하는 서열;
    (66) 서열번호 141의 중쇄 가변영역을 인코딩하는 서열, 및 서열번호 285의 경쇄 가변영역을 인코딩하는 서열; 및
    (67) 서열번호 143의 중쇄 가변영역을 인코딩하는 서열, 및 서열번호 287의 경쇄 가변영역을 인코딩하는 서열.
  15. 제13항에 따른 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터.
  16. 제15항의 재조합 발현 벡터로 형질전환된 숙주세포.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 숙주세포는 동물세포, 식물세포, 효모, 대장균, 곤충세포에서 선택된 것임을 특징으로 하는 숙주세포.
  18. 제16항에 있어서,
    상기 형질전환된 숙주 세포는 원숭이 신장 세포7(COS7 : monkey kidney cells) 세포, NSO 세포, SP2/0 세포, 차이니즈 햄스터 난소(CHO : chinese hamster ovary) 세포, W138, 어린 햄스터 신장(BHK : baby hamster kidney) 세포, MDCK, 골수종 세포주, HuT 78 세포 및 HEK293 세포, 대장균, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.), 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis) 또는 스타필로코쿠스 속(Staphylococcus sp.), 아스페르길러스 속(Aspergillus sp.), 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마세스 속(Schizosaccharomyces sp.) 및 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa)에서 선택됨을 특징으로 하는 숙주세포.
  19. 제16항의 숙주세포를 배양하는 단계를 포함하는 FcRn 특이적 항체, 그러한 항체의 항원 결합 단편의 생산 방법.
  20. 제5항에 따른 분리된 항체, 또는 그러한 항체의 항원 결합 단편을 포함하는 자가면역질환 진단용 조성물.
  21. 제20항에 있어서,
    상기 자가면역질환은 면역성 호중구 감소증, 길랑바레 신드롬, 간질, 자가면역 대뇌 뇌염, 아이삭 신드롬, 모반 신드롬, 심상성 천포창, 낙엽성 천포창, 수포성류 천포창, 후천성 표피 수포증, 임신성 유사수포창, 뮤코스 막 유사수포창, 항인지질 신드롬, 자가면역 빈혈, 자가면역 그래이브 병, 굿파스튜어 증후군, 중증근무력증, 다발성경화증, 류마티스성 관절염, 루프스 및 특발성 혈소판 감소성 자반증(idiopathic thrombocytopenic purpura, ITP) 에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  22. 제5항에 따른 분리된 항체, 또는 그러한 항체의 항원 결합 단편을 포함하는 FcRn 검출용 조성물.
  23. 제5항에 따른 분리된 항체, 또는 그러한 항체의 항원 결합 단편을 이용한 시험관 내 FcRn 검출 방법.

  24. 삭제
  25. 제23항에 있어서,
    상기 항체 또는 그러한 항체의 항원 결합 단편은 검출 가능한 물질을 이용하여 표지(labeling)되어 있는 것을 특징으로 하는 FcRn 검출 방법.
  26. 제25항에 있어서,
    상기 표지는 효소, 보철 그룹, 형광 물질, 발광 물질 및 방사성 물질에서 선택된 하나의 물질을 이용하여 이루어진 것을 특징으로 하는 FcRn 검출 방법.
  27. 제23항에 있어서,
    효소-연결된 면역흡착분석법(ELISA), 방사면역분석법(raioimmunoassay, RIA), 조직 면역조직화학법(tissue immunhistochemistry) 및 경쟁 면역분석(competition immunoassay)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 방법을 이용하는 것을 특징으로 하는 FcRn 검출 방법.



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