KR101427180B1 - OsCTR1 gene from rice for increasing drought stress resistance of plant and uses thereof - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 식물의 가뭄 스트레스 내성을 증가시키는 벼 유래의 OsCTR1 유전자 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 벼 유래 OsCTR1(Oryza sativa chloroplast proteins targeting RING E3 ligase 1) 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시키는 단계를 포함하는 식물의 환경 스트레스에 대한 내성을 조절하는 방법, 상기 OsCTR1 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계를 포함하는 식물의 환경 스트레스에 대한 내성이 조절된 형질전환 식물체의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 환경 스트레스에 대한 내성이 조절된 형질전환 식물체 및 이의 종자 및 상기 OsCTR1 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 유효성분으로 함유하는 식물체의 환경 스트레스 내성 조절용 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to rice-derived OsCTR1 gene and its use for increasing drought stress tolerance of a plant, and more particularly, to a rice-derived OsCTR1 gene ( Oryza the sativa chloroplast proteins targeting RING E3 ligase 1) a plant cell by a method for controlling the resistance to environmental stress in plants, the recombinant vector containing the gene comprising the step of transforming a plant cell, a recombinant vector including the OsCTR1 gene A method for producing a transgenic plant having a tolerance to environmental stress, comprising the step of transforming, a transgenic plant having a tolerance to environmental stress produced by the method, a seed thereof, and the OsCTR1 gene To a composition for controlling environmental stress tolerance of a plant containing a recombinant vector as an active ingredient.
식물의 병 저항성 반응 또는 환경적 스트레스에 대한 내성을 가지는 식물의 방어관련 기작 연구는 지금까지 알려져 있지 않은 생체 내 기작을 규명하는 과학 기술적 가치를 지닌다. 또한 식물방어관련 유전자의 정보는 작물의 분자적 유전육종의 직접적 재료로서 제공될 수 있을 뿐 아니라 전통적 유전육종에도 사용될 수 있는 장점을 지니고 있다.Studies on the defense mechanism of plants with resistance to plant disease resistance or environmental stress have technological value to identify in vivo mechanisms not yet known. In addition, information on plant defense genes can be used not only as a direct material for molecular genetic breeding of crops, but also for traditional genetic breeding.
환경친화적 식량생산의 측면에서 병 방어 관련 다양한 유전자, 또는 이들 형질을 이용한 작물 육종은 경제적으로 중요한 병원체, 잡초, 그리고 환경적 스트레스에 의한 손실을 최소화함으로써 식량생산비용을 줄일 수 있으며, 고품질의 식량을 제공하여 농산물의 경쟁력 회복에 기여함과 동시에 신품종의 개발과 연관된 다양한 산업의 활성화에 기여한다.In terms of environmentally friendly food production, various genes related to disease defenses, or crop breeding using these traits, can reduce food production costs by minimizing losses caused by economically important pathogens, weeds, and environmental stresses, Contributing to the recovery of agricultural products' competitiveness and contributing to the revitalization of various industries associated with the development of new varieties.
환경 스트레스는 식물의 성장을 저해하고 많은 중요한 농업 분야에서 수확물의 생산성을 제한하는 요소로서 수분 스트레스, 저온 스트레스, 염해 스트레스, 산화 스트레스 등이 있다. 특히 수분 스트레스는 탈수, 고염도 및 저온과 같은 외부환경에 의해 유발되며, 식물의 생장을 저해하는 환경 스트레스에 있어서 가장 가혹한 스트레스 중의 하나이다.Environmental stresses are water stress, cold stress, salt stress, and oxidative stress, which inhibit plant growth and limit the productivity of crops in many important agricultural fields. Particularly, water stress is caused by external environment such as dehydration, high saltiness and low temperature, and is one of the most severe stresses in environmental stress which inhibits plant growth.
식물은 이러한 수분 스트레스에 대한 방어 기작을 가지고 있어서 생육에 부적합한 환경에 처하게 되면 그들의 형태를 조절하거나 생리적 대사과정을 조절함으로써 환경에 적응하여 생존하고자 하는 경향이 있다. 지금까지 수분 스트레스에 관여하는 다수의 유전자들이 분리되었다.Plants have a defense mechanism against such water stress, and when they are in an environment unsuitable for growth, they tend to adjust to their environment or adjust their physiological metabolic processes to survive in the environment. So far, many genes involved in water stress have been isolated.
한국등록특허 제0792169호에는 '전사인자 AtMYB44의 유전자 전이를 통한 광엽화, 개화지연 및 환경 스트레스 저항성이 강화된 식물체'가 개시되어 있고, 한국등록특허 제0742194호에서는 '환경 스트레스 저항성 조절 유전자를 이용하여 식물체의 환경 스트레스 저항성을 증가시키는 방법'이 개시되어 있으나, 본 발명에서와 같이 식물의 가뭄 스트레스 내성을 증가시키는 벼 유래의 OsCTR1 유전자 및 이의 용도에 관해서는 밝혀진 바가 없다.Korean Patent No. 0792169 discloses a plant having enhanced photosensitization, delayed flowering and resistance to environmental stress through gene transfer of the transcription factor AtMYB44, and Korean Patent No. 0742194 discloses a plant having an environmental stress resistance regulatory gene Discloses a method for increasing environmental stress resistance of a plant. However, as described in the present invention, the OsCTR1 gene derived from rice and its use for increasing the drought stress tolerance of a plant has not been disclosed.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자는 벼 유래의 OsCTR1 유전자가 가뭄 스트레스에서 강하게 발현이 유도되고, 세포 내 세포질 및 엽록체에 위치하며, 엽록체에 위치하는 단백질들과 주로 상호작용하는 것을 확인하였고, OsCTR1 유전자가 과발현된 애기장대 식물체에서 가뭄 스트레스 조건에서 대조군에 비해 저항성을 보여 OsCTR1이 환경 스트레스에 중요한 유전자임을 증명함으로써, 본 발명을 완성하였다.DISCLOSURE OF THE INVENTION The present invention has been made in view of the above needs, and the present inventors have found that the OsCTR1 gene derived from rice is strongly induced in drought stress, is located in cytoplasm and chloroplasts of intracellular cells and mainly interacts with proteins located in chloroplasts And OsCTR1 gene was overexpressed in the Arabidopsis thaliana plants, and showed that OsCTR1 is an important gene for environmental stress. Thus, the present invention has been completed.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 벼 유래 OsCTR1(Oryza sativa chloroplast proteins targeting RING E3 ligase 1) 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시키는 단계를 포함하는 식물의 환경 스트레스에 대한 내성을 조절하는 방법을 제공한다.In order to solve the above-mentioned problems, the present invention relates to a method for producing rice from OsCTR1 ( Oryza sativa chloroplast proteins targeting RING E3 ligase 1) a method for regulating tolerance to environmental stress of a plant comprising transforming a recombinant vector containing the gene into a plant cell.
또한, 본 발명은 상기 OsCTR1 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계를 포함하는 환경 스트레스에 대한 내성이 조절된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a method for producing a transgenic plant having resistance to environmental stress, which comprises transforming a plant cell with a recombinant vector comprising the OsCTR1 gene.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 환경 스트레스에 대한 내성이 조절된 형질전환 식물체를 제공한다.In addition, the present invention provides a transgenic plant having the tolerance to environmental stress produced by the above method.
또한, 본 발명은 상기 식물체의 종자를 제공한다.The present invention also provides a seed of the plant.
또한, 본 발명은 상기 OsCTR1 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 유효성분으로 함유하는 식물체의 환경 스트레스 내성 조절용 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides the above OsCTR1 A composition for controlling environmental stress tolerance of a plant containing a recombinant vector containing a gene as an active ingredient.
본 발명을 통해 OsCTR1 유전자 과발현 식물체에서는 가뭄 스트레스 처리 시 대조군에 비해 강한 저항성을 보이는 것을 확인하였다. 따라서 환경 스트레스에 대해 저항성이 강한 형질전환 식물체의 개발을 위해 OsCTR1 유전자는 유용할 것으로 기대된다.Through the present invention, it was confirmed that OsCTR1 gene-overexpressing plants showed a stronger resistance to drought stress treatment than the control group. Therefore, the OsCTR1 gene is expected to be useful for the development of transgenic plants resistant to environmental stress.
또한, OsCTR1의 분자생화학적 분석으로 세포 내 위치와 상호작용 단백질과의 결합 및 기능 등을 규명함으로써, 관련 분야에 기초지식으로 유용하게 제공될 수 있다.In addition, it is possible to provide OsCTR1 as a basic knowledge in related fields by analyzing the intracellular location and interaction protein with OsCTR1.
도 1은 벼 식물체의 뿌리, 줄기, 잎 및 원추화서(panicle) 및 수상화서(spike) 등의 조직들을 이용하여 OsCTR1 유전자의 발현 양상을 RT-PCR법으로 분석한 결과이다. A) 식물체의 다른 조직들 간 그리고 다른 발달 과정 중에 있어 OsCTR1 유전자의 발현 양상을 확인한 것으로 각 조직별 그리고 각 발달 과정 단계별로 유전자의 발현 양상에 차이가 있는 것을 보여주는 그림이다. Stage I은 영양생장기 단계, Stage II는 생식생장기 단계. B) 비생물학적 스트레스와 식물 호르몬 처리에 따른 OsCTR1 유전자의 발현 양상을 확인한 것으로 탈수 스트레스와 식물 호르몬 처리시에 OsCTR1 유전자의 발현 유도가 확인된 것을 보여주는 그림이다. C는 대조군, T는 스트레스 처리군.
도 2는 OsCTR1 유전자의 과발현을 유도한 형질전환 애기장대 식물체 중 독립적인 3개체에 대한 OsCTR1 유전자 발현 수준을 RT-PCR법으로 조사한 결과이다. WT는 야생형 애기장대, 35S:EYFP는 OsCTR1 유전자를 포함하지 않은 재조합 벡터로 형질전환된 애기장대, 35S:OSCTR1-EYFP #1, 4, 5는 형질전환 애기장대.
도 3은 OsCTR1 유전자를 과발현하는 형질전환 애기장대(35S:OSCTR1-EYFP #1, 4, 5)의 ABA 감수성(sensitivity)을 알아보기 위해서 1 μM ABA를 함유한 배지에서 배양한 결과로 비형질전환(35S:EYFP) 애기장대와 비교해 OsCTR1 유전자를 과발현하는 형질전환 애기장대의 ABA 감수성이 높은 것으로 확인되었다. 바 크기는 1㎝.
도 4는 OsCTR1 유전자를 과발현하는 형질전환 및 비형질전환 애기장대의 ABA호르몬에 관한 표현형 분석을 나타낸 그림이다. A) ABA 처리 농도별 발아율을 확인한 것으로 형질전환 식물체의 발아율이 비형질전환체에 비해 낮은 발아율을 보이는 것을 나타내는 그림이며, B) 역시 동일 조건에서 떡잎 녹화율을 확인한 결과로서 형질전환 애기장대의 녹화율이 대조군에 비해 낮은 것을 확인하였다.
도 5는 형질전환 애기장대(35S:OSCTR1-EYFP #1, 4) 두 개체 및 비형질전환 애기장대의 ABA 농도별 기공개폐 정도를 확인한 결과로 ABA 호르몬을 각각 1, 10 μM 의 농도로 처리한 후 광학 현미경으로 기공개폐 정도를 비교한 사진과 그래프이다.
도 6은 형질전환 및 비형질전환 애기장대의 잎을 자연건조하면서 관찰한 결과이다. A)는 수분유출에 따른 무게변화를 측정한 것으로서 형질전환 식물체의 보습성이 향상되었음을 나타내는 그림이며, B)는 이 상태에서 24시간, 48시간 경과 후의 잎의 형태 변화 상태를 보여주는 사진이다.
도 7은 형질전환 및 비형질전환 애기장대 잎에서의 과산화수소(H2O2) 축적을 측정한 것으로, 탈수 처리 후 90분 및 180분 후의 잎에서 과산화수소의 생성 정도를 조직화학적 염색법을 이용하여 분석한 사진이다.
도 8은 2주 성장한 형질전환 및 비형질전환 애기장대에 10일간 수분공급을 중단하고 식물체의 가뭄 스트레스에 대한 저항성을 조사한 결과를 보여주는 사진과 수분 재공급 3일 후의 생존율을 보여주는 그림이다.FIG. 1 shows the results of analysis of the expression pattern of OsCTR1 gene by RT-PCR using tissues such as roots, stems, leaves, and panicles and spikes of rice plants. A) The expression pattern of OsCTR1 gene in different tissues and other developmental stages of the plant was confirmed, showing that there is a difference in the expression pattern of genes in each tissue and each stage of development. Stage I is a nutritional growth stage, Stage II is a reproductive stage. B) it is an illustration showing that the abiotic stress and to confirm the expression pattern of the gene according to OsCTR1 dehydration stress and plant hormone treatment plant expression induction of the gene OsCTR1 during hormone treatment is confirmed. C is a control group and T is a stress-treated group.
Figure 2 is a OsCTR1 results of testing the gene expression level for an independent third object of the transgenic Arabidopsis thaliana plants by inducing over-expression of OsCTR1 gene by RT-PCR method. WT is a wild-type Arabidopsis; 35S: EYFP is a transgenic Arabidopsis transformed with a recombinant vector not containing the OsCTR1 gene; 35S: OSCTR1-EYFP # 1, 4, 5 are transgenic Arabidopsis thaliana.
FIG. 3 shows the ABA sensitivity of transformed Arabidopsis thaliana 35S (OSCTR1-EYFP # 1, 4, 5) overexpressing the OsCTR1 gene. As a result of culturing in a medium containing 1 μM ABA, (35S: EYFP) Arabidopsis thaliana, the transgenic Arabidopsis overexpressing OsCTR1 gene was found to be highly susceptible to ABA. The bar size is 1 cm.
FIG. 4 is a diagram showing a phenotypic analysis of the transgenic and non-transformed Arabidopsis thaliana ABA hormone overexpressing the OsCTR1 gene. A) The germination rate of each ABA treatment concentration was confirmed. The germination rate of the transgenic plants was lower than that of the non-transgenic plants. B) Was lower than that of the control group.
FIG. 5 shows the results obtained by examining the degree of pore opening and closing of each of the transgenic Arabidopsis thaliana (35S: OSCTR1-EYFP # 1, 4) and non-transformed Arabidopsis thaliana by ABA concentration and treating ABA hormone at a concentration of 1, 10 μM This is a photograph and a graph comparing the degree of pore opening and closing by an optical microscope.
FIG. 6 shows the result of observation of the leaves of transgenic and non-transformed Arabidopsis thaliana during natural drying. A) is a measurement of the weight change due to water spillage, which shows that the transgenic plants have improved moisturizing properties, and B) is a photograph showing the leaf shape changes after 24 hours and 48 hours in this state.
FIG. 7 shows the results of measurement of hydrogen peroxide (H 2 O 2 ) accumulation in transformed and non-transformed Arabidopsis thaliana leaves. The degree of hydrogen peroxide production in the
FIG. 8 is a photograph showing the result of stopping water supply for 10 days in transgenic and non-transformed Arabidopsis thaliana grown for 2 weeks and resistance to drought stress of the plant and showing the survival rate after 3 days of water supply.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 벼 유래 OsCTR1(Oryza sativa chloroplast proteins targeting RING E3 ligase 1) 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시키는 단계를 포함하는 식물의 환경 스트레스에 대한 내성을 조절하는 방법을 제공한다. In order to accomplish the object of the present invention, the present invention provides a method for producing a plant resistant to environmental stress, comprising the step of transforming plant cells with a recombinant vector comprising OsCTR1 ( Oryza sativa chloroplast proteins targeting RING E3 ligase 1) The method comprising the steps of:
본 발명의 일 구현 예에 따른 상기 방법은 벼 유래 OsCTR1 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 과발현시켜 식물의 환경 스트레스에 대한 내성을 증가시키는 것을 특징으로 하나, 이에 제한되지 않는다.The method according to one embodiment of the present invention is characterized in that rice-derived OsCTR1 The present invention is characterized by overexpressing a recombinant vector containing a gene in a plant cell to increase tolerance to environmental stress of the plant, but is not limited thereto.
본 발명에서 "환경 스트레스"란 식물체의 성장 또는 생산성을 저하시키는 외부적인 요인을 말하며 크게 생물학적 스트레스(biotic stress)와 비생물학적 스트레스(abiotic stress)로 대별된다. 생물학적 스트레스로는 대표적으로 병원균을 들 수 있으며 비생물학적 스트레스로는 고농도의 염, 건조, 저온, 고온 및 산화 스트레스 등이 포함된다. "환경 스트레스 내성"이란 상기와 같은 환경 스트레스에 의한 식물체의 성장 저하 또는 생산성의 저하가 억제되거나 지연되는 형질을 말한다.In the present invention, "environmental stress" refers to an external factor that lowers the growth or productivity of a plant, and is roughly divided into biotic stress and abiotic stress. Examples of biological stresses include pathogens. Abiotic stresses include high concentrations of salt, drying, low temperature, high temperature, and oxidative stress. The term " environmental stress tolerance "refers to a trait that suppresses or delays plant growth or productivity deterioration due to environmental stress.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 환경 스트레스는 가뭄 스트레스일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In the method according to an embodiment of the present invention, the environmental stress may be, but is not limited to, drought stress.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 OsCTR1 유전자는 바람직하게는 서열번호 1의 염기서열로 이루어질 수 있다. 또한, 상기 염기 서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.In the method according to one embodiment of the present invention, the OsCTR1 gene may preferably consist of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1. In addition, homologues of the nucleotide sequences are included within the scope of the present invention. Specifically, the gene has a nucleotide sequence having a sequence homology of 70% or more, more preferably 80% or more, still more preferably 90% or more, and most preferably 95% or more, with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 . "% Of sequence homology to polynucleotides" is ascertained by comparing the comparison region with two optimally aligned sequences, and a portion of the polynucleotide sequence in the comparison region is the reference sequence for the optimal alignment of the two sequences (I. E., A gap) relative to the < / RTI >
용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포내 재도입된 것이다.The term "recombinant" refers to a cell in which a cell replicates a heterologous nucleic acid, expresses the nucleic acid, or expresses a protein encoded by a peptide, heterologous peptide or heterologous nucleic acid. The recombinant cell can express a gene or a gene fragment that is not found in the natural form of the cell in one of the sense or antisense form. In addition, the recombinant cell can express a gene found in a cell in its natural state, but the gene has been modified and reintroduced intracellularly by an artificial means.
본 발명에서, 상기 OsCTR1 유전자 서열은 재조합 발현 벡터 내로 삽입될 수 있다. 용어 "재조합 발현 벡터"는 세균 플라스미드, 파아지, 효모 플라스미드, 식물 세포 바이러스, 포유동물 세포 바이러스, 또는 다른 벡터를 의미한다. 대체로, 임의의 플라스미드 및 벡터는 숙주 내에서 복제 및 안정화할 수 있다면 사용될 수 있다.In the present invention, the OsCTR1 The gene sequence may be inserted into a recombinant expression vector. The term "recombinant expression vector" means a bacterial plasmid, a phage, a yeast plasmid, a plant cell virus, a mammalian cell virus, or other vector. In principle, any plasmid and vector can be used if it can replicate and stabilize within the host.
OsCTR1 유전자 서열 및 적당한 전사/번역 조절 신호를 포함하는 발현 벡터는 당업자에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 DNA 서열은 mRNA 합성을 이끌기 위해 발현 벡터 내의 적당한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다. 또한 발현 벡터는 번역 개시 부위로서 리보좀 결합 부위 및 전사 터미네이터를 포함할 수 있다.Expression vectors containing OsCTR1 gene sequences and appropriate transcription / translation control signals can be constructed by methods known to those skilled in the art. Such methods include in vitro recombinant DNA technology, DNA synthesis techniques, and in vivo recombination techniques. The DNA sequence can be effectively linked to appropriate promoters in the expression vector to drive mRNA synthesis. The expression vector may also include a ribosome binding site and a transcription terminator as a translation initiation site.
본 발명의 재조합 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.A preferred example of the recombinant vector of the present invention is a Ti-plasmid vector capable of transferring a so-called T-region to a plant cell when present in a suitable host, such as Agrobacterium tumefaciens. Other types of Ti-plasmid vectors (see
발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 것이다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자, aadA 유전자 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.The expression vector will preferably comprise one or more selectable markers. The marker is typically a nucleic acid sequence having a property that can be selected by a chemical method, and includes all genes capable of distinguishing a transformed cell from a non-transformed cell. Examples include herbicide resistance genes such as glyphosate or phosphinothricin, antibiotics such as kanamycin, G418, Bleomycin, hygromycin, chloramphenicol, Resistant gene, aadA gene, and the like, but are not limited thereto.
본 발명의 재조합 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS, 히스톤 프로모터, Clp 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "구성적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 구성적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 구성적 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.In the recombinant vector of the present invention, the promoter may be
본 발명의 재조합 벡터에서, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터, 대장균의 rrnB1/B2 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.In the recombinant vector of the present invention, conventional terminators can be used. Examples thereof include nopaline synthase (NOS), rice α-amylase RAmy1 A terminator, phaseoline terminator, Agrobacterium tumefaciens ( Agrobacterium tumefaciens ) Terminator of the Octopine gene, and the rrnB1 / B2 terminator of E. coli, but the present invention is not limited thereto. Regarding the need for terminators, it is generally known that such regions increase the certainty and efficiency of transcription in plant cells. Therefore, the use of a terminator is highly desirable in the context of the present invention.
본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충세포, 사람세포(예컨대, CHO 세포주(Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물세포 등이 이용될 수 있다. 숙주세포는 바람직하게는 식물세포이다.When the vector of the present invention is transformed into eukaryotic cells, yeast ( Saccharomyce cerevisiae), and the like insect cells, human cells (e.g., CHO cells (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN and MDCK cell lines) and plant cell may be used. The host cell is preferably a plant cell.
본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은 미세주입법, 칼슘포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법, DEAE-덱스트란 처리법, 및 유전자 밤바드먼트 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있다.The method of delivering the vector of the present invention into a host cell can be carried out by injecting a vector into a host cell by microinjection, calcium phosphate precipitation, electroporation, liposome-mediated transfection, DEAE-dextran treatment, can do.
또한, 본 발명은 벼 유래 OsCTR1 ( Oryza sativa chloroplast proteins targeting RING E3 ligase 1) 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및 상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 환경 스트레스에 대한 내성이 조절된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다. The present invention also relates to a method for producing rice from OsCTR1 ( Oryza sativa chloroplast proteins targeting a plant cell with a recombinant vector containing the RING E3 ligase 1) gene; And regenerating the plant from the transformed plant cell. The present invention also provides a method for producing a transgenic plant having a tolerance to environmental stress.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법은 벼 유래 OsCTR1 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 과발현시켜 식물의 환경 스트레스에 대한 내성을 증가시키는 것을 특징으로 하나, 이에 제한되지 않는다.The method according to one embodiment of the present invention is characterized by overexpression of a recombinant vector comprising a rice-derived OsCTR1 gene in a plant cell to increase tolerance to environmental stress of the plant, but is not limited thereto.
바람직하게는, 상기 OsCTR1 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어질 수 있다. Preferably, the OsCTR1 gene comprises the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 환경 스트레스는 가뭄 스트레스일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In the method according to an embodiment of the present invention, the environmental stress may be, but is not limited to, drought stress.
본 발명의 방법은 본 발명에 따른 재조합 벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계를 포함하는데, 상기 형질전환은 예를 들면, 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefiaciens)에 의해 매개 될 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 상기 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함한다. 형질전환 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다.The method of the invention comprises the step of transforming a plant cell with a recombinant vector according to the present invention, the transformant is, for example, Agrobacterium tyumeo Pacific Enschede may be mediated by (Agrobacterium tumefiaciens). In addition, the method of the present invention comprises regenerating a transgenic plant from the transformed plant cell. Any of the methods known in the art can be used for regeneration of transgenic plants from transgenic plant cells.
형질전환된 식물세포는 전식물로 재분화되어야 한다. 캘러스 또는 원형질체 배양으로부터 성숙한 식물의 재분화를 위한 기술은 수많은 여러 가지 종에 대해서 당업계에 주지되어 있다(Handbook of Plant Cell Culture, 1-5권, 1983-1989 Momillan, N.Y.).Transformed plant cells must be regenerated into whole plants. Techniques for the regeneration of mature plants from callus or protoplast cultures are well known in the art for a number of different species (Handbook of Plant Cell Culture, Vol. 1-5, 1983-1989, Momillan, N. Y.).
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 환경 스트레스에 대한 내성이 조절된 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공한다. In addition, the present invention provides transgenic plants and seeds thereof, which are prepared by the above method and whose tolerance to environmental stress is regulated.
바람직하게는, 상기 형질전환 식물체 및 이의 종자는 환경 스트레스에 대한 내성이 증가된 형질전환 식물체 및 이의 종자이다. Preferably, the transgenic plants and their seeds are transgenic plants and their seeds with increased resistance to environmental stress.
상기 식물체는 애기장대, 감자, 가지, 담배, 고추, 토마토, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 고구마, 샐러리, 당근, 미나리, 파슬리, 배추, 양배추, 갓무, 수박, 참외, 오이, 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩, 완두 등의 쌍자엽 식물 또는 벼, 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 사탕수수, 귀리, 양파 등의 단자엽 식물일 수 있으며, 바람직하게는 쌍자엽 식물이며, 더욱 바람직하게는 애기장대 식물체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.The plant may be selected from the group consisting of Arabidopsis, potato, eggplant, tobacco, red pepper, tomato, burdock, cilantro, lettuce, bellflower, spinach, modern sweet potato, celery, carrot, parsley, parsley, cabbage, cabbage, It may be a dicotyledonous plant such as squash, poultry, strawberry, soybean, mung bean, kidney bean or pea or a monocotyledon such as rice, barley, wheat, rye, corn, sorghum, oats and onion, But is not limited thereto.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진, 벼 유래 OsCTR1 (Oryza sativa chloroplast proteins targeting RING E3 ligase 1) 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 유효성분으로 함유하는, 식물체의 환경 스트레스 내성 조절용 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 유효성분으로 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 OsCTR1 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 함유하며, 상기 유전자를 식물체에 형질전환시킴으로써 식물체의 환경 스트레스 내성, 바람직하게는 가뭄 스트레스 내성을 증가시킬 수 있는 것이다.
The present invention also provides a method for producing a rice-derived OsCTR1 (RING E3 ligase 1) gene of Oryza sativa chloroplast proteins as an active ingredient. The present invention also provides a composition for controlling environmental stress tolerance of a plant. The above composition comprises OsCTR1 having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 as an active ingredient The present invention provides a recombinant vector containing a gene, which can increase environmental stress tolerance, preferably drought stress tolerance, of a plant by transforming the gene into a plant.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described in detail by way of examples. However, the following examples are illustrative of the present invention, and the present invention is not limited to the following examples.
실시예Example 1: 벼 1: rice OsCTR1OsCTR1 유전자의 기관별 및 발달 시기별 발현특성 분석 Analysis of gene expression by organ and developmental stage
벼 식물체(품종: 동안벼)의 기관 및 발달시기에 따른 OsCTR1 유전자의 발현 양상을 확인하기 위해 초기 및 후기 영양 생장기 단계의 뿌리, 줄기 및 잎 기관을 채취하고, 생식 생장기 단계의 원추화서(panicle)와 수상화서(spike)를 수집하여 RT-PCR을 수행하였다. OsCTR1 유전자 특이적 프라이머는 Primer-BLAST(NCBI, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)를 이용하여 제작하였고, 정방향 프라이머 5'-ACATCTCCAAGATGCTGTGC-3'(서열번호 2), 역방향 프라이머 5'-AGCATGGCAGAGAACCAGAT-3'(서열번호 3)을 사용하였다. 그 결과 벼의 뿌리에서는 OsCTR1 유전자의 발현이 전혀 관찰되지 않았고, 줄기에서는 후기 영양 생장기 단계에서, 잎에서는 후기 영양 생장기와 생식 생장기 단계에서 OsCTR1 유전자의 발현이 확인되었다. 그리고 원추화서 발달이 진행될수록 OsCTR1 유전자의 발현이 증가되고 더욱 분화된 수상화서에서도 OsCTR1 유전자의 발현이 관찰되었다. Os18S - rRNA는 전기영동 실험에서 동량의 RNA를 비교하였음을 증명하기 위하여 각 레인별로 그 양을 관찰한 것으로 사용한 프라이머는 정방향 프라이머 5'-ATGATAACTCGACGGATCGC-3'(서열번호 4) 및 역방향 프라이머 5'-CTTGGATGTGGTAGCCGTTT-3'(서열번호 5)였다(도 1a).
In order to confirm the expression pattern of OsCTR1 gene according to the organ and developmental stage of the rice plant (breed: during rice), the roots, stem and leaf organ of the early and late nutritive stage were collected, And spike were collected and RT-PCR was performed. The OsCTR1 gene-specific primer was prepared using Primer-BLAST (NCBI, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/) and the forward primer 5'-ACATCTCCAAGATGCTGTGC-3 ' No. 2), reverse primer 5'-AGCATGGCAGAGAACCAGAT-3 '(SEQ ID NO: 3) was used. As a result, the expression of OsCTR1 gene was not observed in the root of rice, and the expression of OsCTR1 gene was confirmed in postnatal growth stage in the stem, and in the postnatal growth stage and reproductive growth stage in the leaves . The expression of OsCTR1 gene was increased as the development of conidia progressed, and the expression of OsCTR1 gene was also observed in further differentiated aquatic plants. In order to verify that the same amount of RNA was compared in the electrophoresis experiment, the amount of Os18S - rRNA was observed for each lane. The primer used was a forward primer 5'-ATGATAACTCGACGGATCGC-3 '(SEQ ID NO: 4) and a reverse primer 5'- CTTGGATGTGGTAGCCGTTT-3 '(SEQ ID NO: 5) (FIG. 1A).
실시예Example 2: 다양한 환경 스트레스 처리에 의한 2: by various environmental stress treatment OsCTR1OsCTR1 유전자의 발현특성 분석Characterization of gene expression
OsCTR1 유전자 발현이 다양한 환경 스트레스 처리에 반응하는 정도를 분석하기 위해 식물체에 비생물학적 및 생물학적 스트레스인 탈수, 열(45℃), 저온(4℃), 0.1 mM ABA, 1 mM 살리실산 및 0.1 mM 자스몬산 처리를 하였다. 각 스트레스 처리는 종자 발아 후 2주된 벼(품종: 동안벼) 유식물체를 대상으로 처리하고, 처리 후 0, 1, 6, 12, 24, 48인 시간대별로 잎을 수집한 후 RT-PCR에 사용하였다. OsbZIP23, OsHsp90 -1, OsLIP19 , OsSalT , OsPR1b , OsPBZ1 유전자는 탈수, 열, 저온, ABA, 살리실산 및 자스몬산 처리에 대한 양성 대조군으로 사용하였으며, Os18S -rRNA는 전기영동 실험에서 동량의 RNA를 비교하였음을 증명하기 위하여 각 레인별로 그 양을 관찰한 것이다. 유전자 증폭을 위해 사용한 프라이머는 OsbZIP23 정방향 프라이머 5'-CTCTGATCCCTCGTTGCGTTA-3'(서열번호 6) 및 역방향 프라이머 5'-CAACACCCCAGCACCAAACT-3'(서열번호 7), OsHsp90 -1 정방향 프라이머 5'-CTACGTGCGCCGCGTCTTCA-3'(서열번호 8) 및 역방향 프라이머 5'-CGGCTCGAACGACCTCTTCCTCT-3'(서열번호 9), OsLIP19 정방향 프라이머 5'-AGCCCCTCGGGTTGGTCGAA-3'(서열번호 10) 및 역방향 프라이머 5'-AGAAGGAGTGGGAACGGCGG-3'(서열번호 11), OsSalT 정방향 프라이머 5'-GGTCCGTGGGGCGGAAATGG-3'(서열번호 12) 및 역방향 프라이머 5'-ACTGGGCCATGGGTTCCAGA-3'(서열번호 13), OsPR1b 정방향 프라이머 5'-CCTGGGACACGAGCGTGCAG-'3(서열번호 14) 및 역방향 프라이머 5'-TCGCTCTTCTCGCCCACCCA-'3(서열번호 15), OsPBZ1 정방향 프라이머 5'-TGAGGTCGAGGGGGATGGCG-'3(서열번호 16) 및 역방향 프라이머 5'-CGGCGGCCTCGATCTTCGTC-3'(서열번호 17)였다. OsCTR1 In order to analyze the extent to which gene expression responds to various environmental stress treatments, plants were exposed to the following abiotic and biological stresses: dehydration, heat (45 ° C), low temperature (4 ° C), 0.1 mM ABA, 1 mM salicylic acid and 0.1 mM jasmonic acid treatment Respectively. Each stress treatment was applied to 2-week-old rice seedlings (seeds: rice) during seed germination, leaves were collected at 0, 1, 6, 12, 24 and 48 hours after treatment and then used for RT-PCR Respectively. OsbZIP23, OsHsp90-1 , OsLIP19 , OsSalT , OsPR1b and OsPBZ1 genes were used as a positive control for dehydration, heat, low temperature, ABA, salicylic acid and jasmonic acid treatment. Os18S- rRNA was compared with the same amount of RNA in the electrophoresis experiment The amount of each lane was observed. The primers used for gene amplification were OsbZIP23 forward primer 5'-CTCTGATCCCTCGTTGCGTTA-3 '(SEQ ID NO: 6) and Reverse primer 5'-CAACACCCCAGCACCAAACT-3 '(SEQ ID NO: 7), OsHsp90 -1 forward primer 5'-CTACGTGCGCCGCGTCTTCA-3' (SEQ ID NO: 8) and reverse primer 5'-CGGCTCGAACGACCTCTTCCTCT-3 '(SEQ ID NO: 9), OsLIP19 (SEQ ID NO: 10), reverse primer 5'-AGAAGGAGTGGGAACGGCGG-3 '(SEQ ID NO: 11), OsSalT (SEQ ID NO: 12) and reverse primer 5'-ACTGGGCCATGGGTTCCAGA-3 '(SEQ ID NO: 13), OsPR1b The forward primer 5'-CCTGGGACACGAGCGTGCAG -'3 (SEQ ID NO: 14) and the reverse primer 5'-TCGCTCTTCTCGCCCACCCA -'3 (SEQ ID NO: 15), OsPBZ1 The forward primer 5'-TGAGGTCGAGGGGGATGGCG-3 (SEQ ID NO: 16) and the reverse primer 5'-CGGCGGCCTCGATCTTCGTC-3 '(SEQ ID NO: 17).
그 결과 비생물학적 스트레스 중 열이나 저온 스트레스 처리에서는 양성 대조군 유전자의 발현은 확인되었으나, OsCTR1 유전자의 발현은 확인되지 않았고, 탈수 스트레스 처리에서만 12시간에서 48시간까지 OsCTR1 유전자의 발현이 유도된 것을 확인할 수 있었다. 또한 ABA, 살리실산 그리고 자스몬산을 처리한 벼의 잎에서도 OsCTR1 유전자의 발현이 유도된 것을 확인할 수 있었다(도 1b).
As a result, expression of positive control gene was confirmed in heat or cold stress treatment during abiotic stress, but expression of OsCTR1 gene was not confirmed, and it was confirmed that expression of OsCTR1 gene was induced in dehydration stress treatment only from 12 hours to 48 hours there was. In addition, OsCTR1 gene expression was induced in the leaves of rice treated with ABA, salicylic acid and jasmonic acid (FIG. 1B).
실시예Example 3: 3: OsCTR1OsCTR1 유전자를 과발현하는 애기장대 형질전환 실험 Arabidopsis transfection experiments overexpressing genes
OsCTR1 유전자를 과발현하는 형질전환 애기장대를 제조하기 위하여, 유전자의 항시 발현을 유도하는 CaMV35S 프로모터에 OsCTR1 유전자를 융합하고, DNA 구조물을 아그로박테리움 투머파시엔스 GV3101 (Agrobacterium tumefaciens GV3101)에 형질전환하고, 꽃대침지법(floral dip transformation)에 따라 애기장대 식물체 형질전환을 유도하였다. 이들 식물체에서 얻은 종자를 카나마이신이 함유된 배지에서 발아시켜 카나마이신 저항성 식물체를 선발하였으며, 제 3 세대 종자를 대상으로 실험을 하였다. 이들 형질전환 애기장대에 삽입된 목적유전자를 확인하기 위해 RT-PCR 분석을 실시하였다. 이 유전자는 벼에서 분리한 것으로 원래 애기장대에 존재하지 않으므로 비형질전환체(WT, 35S:EYFP)에서 검출되지 않았으며, 형질전환체(35S:OsCTR1-EYFP #1, 4, 5)에서는 OsCTR1 유전자가 확인되었다(도 2).
For the production of transgenic Arabidopsis thaliana overexpressing OsCTR1 gene, and fused genes OsCTR1 the CaMV35S promoter to drive expression of a gene at all times, the DNA construct Agrobacterium tumeo Pacific Enschede GV3101 (Agrobacterium tumefaciens GV3101) and induced Arabidopsis plant transformation according to floral dip transformation. The seeds obtained from these plants were germinated in kanamycin-containing medium to select kanamycin-resistant plants and tested for third generation seeds. RT-PCR analysis was performed to identify the target gene inserted in these transgenic Arabidopsis thaliana. The gene to be isolated from rice original does not exist in the Arabidopsis thaliana non-transformant (WT, 35S: EYFP) has not been detected in, transformants: The (35S OsCTR1-
실시예Example 4: 4: OsCTR1OsCTR1 유전자 발현량 변화에 따른 형질전환 애기장대의 표현형 관찰 Phenotyping of transgenic Arabidopsis thaliana with changes in gene expression
벼에서 OsCTR1의 발현이 ABA 처리에 의해 유도된다는 점으로 미루어 볼 때, OsCTR1은 ABA에 의존하여(ABA-dependent) 작용이 활성화되는 유전자임을 알 수 있었다. OsCTR1 유전자의 과발현체가 환경 스트레스 관련 식물 호르몬인 ABA에 어떻게 반응하는지 확인하기 위해 0.5, 1 μM ABA를 포함한 MS 배지에서 발아율을 관찰하였다. ABA를 포함하지 않은 배지에서는 비형질전환체 및 OsCTR1 유전자 과발현체의 발아 및 생장에 차이가 없었으나, 0.5, 1 μM ABA를 포함한 배지에서는 OsCTR1 유전자의 과발현체가 ABA에 대하여 감수성이 높은(hypersensitve) 것으로 확인되었다(도 3). The expression of OsCTR1 in rice was induced by ABA treatment, suggesting that OsCTR1 is a gene whose ABA-dependent action is activated by ABA. To determine how the overexpressed OsCTR1 gene responds to environmental stress-related plant hormone ABA, germination rates were observed on MS medium containing 0.5 and 1 μM ABA. In the media containing no ABA, there was no difference in germination and growth of the transgenic and OsCTR1 transgenic overexpressants. However, in medium containing 0.5 and 1 μM ABA, the overexpressor of OsCTR1 gene was hypersensitized to ABA (Fig. 3).
그리고 OsCTR1 유전자의 과발현체를 0.5, 1 μM ABA를 포함한 MS 배지에서 떡잎 녹화율을 관찰하였다. ABA를 포함하지 않은 배지에서는 비형질전환체 및 OsCTR1 유전자 과발현체의 떡잎 녹화율에 차이가 없었으나, 0.5, 1 μM ABA를 포함한 배지에서는 OsCTR1 유전자 과발현체가 ABA에 대하여 감수성이 높은(hypersensitve) 것으로 확인되었다(도 4).Overexpression of OsCTR1 gene was observed in MS medium containing 0.5 and 1 μM ABA. In the media containing no ABA, there was no difference in the rate of cotyledon overgrowth of the non-transformant and OsCTR1 gene transcript. However, in the medium containing 0.5 and 1 μM ABA, OsCTR1 gene overexpressor was hypersensitized to ABA (Fig. 4).
그리고 OsCTR1 유전자의 과발현 애기장대 잎의 기공 개도 크기를 관찰하였다. ABA를 포함하지 않은 배지에서는 비형질전환체 및 OsCTR1 유전자 과발현체의 평균 기공 개도 크기에 차이가 없었으나, 0.5, 1 μM ABA를 포함한 배지에서는 OsCTR1 유전자 과발현체가 ABA에 대하여 감수성이 높은(hypersensitve) 것으로 확인되었다(도 5).
The pore opening size of overexpressed Arabidopsis leaf of OsCTR1 gene was observed. In the medium containing no ABA, there was no difference in the mean pore opening size of the non-transformant and the OsCTR1 gene overexpressing medium, but in the medium containing 0.5 and 1 μM ABA, the OsCTR1 gene overexpressing substance was hypersensitized to ABA (Fig. 5).
실시예Example 5: 5: OsCTR1OsCTR1 유전자 형질전환 애기장대의 탈수 스트레스 저항성 실험 Degeneration stress resistance experiment of transgenic Arabidopsis thaliana
먼저 OsCTR1 유전자 과발현 애기장대 잎의 수분 손실 정도를 비형질전환 애기장대의 잎과 비교하였다. 2주 키운 식물체의 로제타 잎들을 떼어내어 자연 건조 시키면서 최대 6시간까지 매 30분 마다 무게를 측정하며 수분 감소율을 측정하였다. 그 결과 OsCTR1 유전자 과발현 애기장대의 잎이 비형질전환 애기장대의 잎에 비해 수분 손실이 적은 것으로 나타났으며(도 6A), 떼어낸 잎의 모양도 비형질전환체의 잎보다 더 오랫동안 원래의 모양을 유지하는 것을 볼 수 있었다(도 6B).First, the water loss of the OsCTR1 gene overexpressed Arabidopsis leaf was compared with that of the untranslated Arabidopsis leaf. Rosa leaves of two - week - old plants were removed and naturally dried, and weight loss was measured every 30 minutes for up to 6 hours. As a result, OsCTR1 gene overexpressed Arabidopsis leaves showed less water loss than non-transformed Arabidopsis leaves (Fig. 6A), and the shape of the removed leaves was longer than that of untransformed leaves (Fig. 6B).
그리고 대조군에 비해 높은 탈수 스트레스 저항성을 보인 OsCTR1 유전자 과발현 애기장대 잎의 과산화수소 축적 정도를 조직화학적 염색법을 통해 측정하였다. 탈수 처리 후 90분 및 180분 후의 형질전환 및 비형질전환 애기장대 잎을 1 ㎎ ·㎖-1 농도의 3,3'-디아미노벤지딘(diaminobenzidine) 용액에 4시간 동안 담궈 둔 후, 표백 용액(에탄올:아세트산:글리세롤 3:1:1)에 옮겨 담은 후 95℃에서 15분 동안 끓인 후 염색된 정도를 관찰하였다. 그 결과 형질전환 애기장대 잎에서 탈수가 진행될수록 더 많은 과산화수소의 축적을 확인할 수 있었다(도 7).
The degree of accumulation of hydrogen peroxide in the overexpressed Arabidopsis thaliana leaf, OsCTR1 gene, which showed higher dehydration stress resistance than the control, was measured by histochemical staining. The transformed and untransformed Arabidopsis leaves at 90 and 180 minutes after dehydration treatment were immersed in a solution of 3, 3'-diaminobenzidine at a concentration of 1 mg / ml- 1 for 4 hours, Ethanol: acetic acid: glycerol 3: 1: 1), boiled at 95 ° C for 15 minutes, and then stained. As a result, the accumulation of hydrogen peroxide was confirmed as the dehydration progressed in the transgenic Arabidopsis leaves (FIG. 7).
실시예Example 6: 6: OsCTR1OsCTR1 유전자 형질전환 애기장대의 가뭄 저항성 실험 Drought tolerance test of gene transgenic Arabidopsis thaliana
OsCTR1 유전자 과다 발현 애기장대가 가뭄 스트레스에 저항성을 보이는지 확인하기 위해 가뭄 저항성 실험을 수행하였다. 2 주 동안 온실에서 키운 형질전환 애기장대와 비형질전환 애기장대를 10일 동안 물을 주지 않음으로써 가뭄 스트레스 조건을 준 결과, OsCTR1 형질전환 애기장대가 비형질전환 애기장대보다 가뭄 스트레스에 저항성을 나타내었고, 물을 다시 주어 회복되는 정도를 3일 후에 확인한 결과 대조군인 비형질전환 애기장대는 18%의 생존율만 보인 반면, OsCTR1 유전자 과발현 형질전환 애기장대들은 74%에서 95%까지 높은 생존율을 보여주었다(도 8). OsCTR1 Drought tolerance experiments were conducted to determine whether the overexpressed Arabidopsis thaliana was resistant to drought stress. As a result of drought stress condition by not watering the transgenic Arabidopsis thaliana grown in the greenhouse for 2 weeks and non-transgenic Arabidopsis thaliana for 10 days, the OsCTR1 transgenic Arabidopsis thalamus was more resistant to drought stress than the untranslated Arabidopsis thaliana . After 3 days of recovery, the control group, the non-transgenic Arabidopsis thaliana, showed a survival rate of 18%, while the OsCTR1 transgenic transgenic Arabidopsis thalamus showed a high survival rate of 74% to 95% (Fig. 8).
<110> KNU-Industry Cooperation Foundation <120> OsCTR1 gene from rice for increasing drought stress resistance of plant and uses thereof <130> PN13085 <160> 17 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 348 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 1 atgagctacc tcctctccta catctccaag atgctgtgca tcaagattcc gtcggaggcg 60 aggcaagcca gcgaggacgg cggcagcggt ggcctgacgg agtgctccgt ctgtctctcc 120 aggatccgtg tcggcgaggc gacgaggcgt ctgccctgcc ggcatgcgtt ccaccgggac 180 tgcgtcgacc ggtggctcct ctcatgcagg cggacgtgcc cgctttgccg ggtttacgtc 240 gtcgtcgacg gtaacaagcc aggggtggca gcgaagcaca ccggcgagcc gccgctcgct 300 gaagacatgg tgatctggtt ctctgccatg ctcgtccctg gattctga 348 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 acatctccaa gatgctgtgc 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 agcatggcag agaaccagat 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 atgataactc gacggatcgc 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 cttggatgtg gtagccgttt 20 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 ctctgatccc tcgttgcgtt a 21 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 caacacccca gcaccaaact 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 ctacgtgcgc cgcgtcttca 20 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 cggctcgaac gacctcttcc tct 23 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 agcccctcgg gttggtcgaa 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 agaaggagtg ggaacggcgg 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 ggtccgtggg gcggaaatgg 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 actgggccat gggttccaga 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 cctgggacac gagcgtgcag 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 tcgctcttct cgcccaccca 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 tgaggtcgag ggggatggcg 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 cggcggcctc gatcttcgtc 20 <110> KNU-Industry Cooperation Foundation <120> OsCTR1 gene from rice for increasing drought stress resistance of plant and uses thereof <130> PN13085 <160> 17 <170> Kopatentin 2.0 <210> 1 <211> 348 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 1 atgagctacc tcctctccta catctccaag atgctgtgca tcaagattcc gtcggaggcg 60 aggcaagcca gcgaggacgg cggcagcggt ggcctgacgg agtgctccgt ctgtctctcc 120 aggatccgtg tcggcgaggc gacgaggcgt ctgccctgcc ggcatgcgtt ccaccgggac 180 tgcgtcgacc ggtggctcct ctcatgcagg cggacgtgcc cgctttgccg ggtttacgtc 240 gtcgtcgacg gtaacaagcc aggggtggca gcgaagcaca ccggcgagcc gccgctcgct 300 gaagacatgg tgatctggtt ctctgccatg ctcgtccctg gattctga 348 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 acatctccaa gatgctgtgc 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 agcatggcag agaaccagat 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 atgataactc gacggatcgc 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 cttggatgtg gtagccgttt 20 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 ctctgatccc tcgttgcgtt a 21 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 caacacccca gcaccaaact 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 ctacgtgcgc cgcgtcttca 20 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 cggctcgaac gacctcttcc tct 23 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 agcccctcgg gttggtcgaa 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 agaaggagtg ggaacggcgg 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 ggtccgtggg gcggaaatgg 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 actgggccat gggttccaga 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 cctgggacac gagcgtgcag 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 tcgctcttct cgcccaccca 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 tgaggtcgag ggggatggcg 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 cggcggcctc gatcttcgtc 20
Claims (13)
상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 가뭄 스트레스에 대한 내성이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법. Transposing a plant cell with a recombinant vector comprising a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and containing OsCTR1 ( Oryza sativa chloroplast proteins targeting RING E3 ligase 1) gene, and overexpressing the OsCTR1 gene; And
And regenerating the plant from the transgenic plant cell. ≪ RTI ID = 0.0 > 21. < / RTI >
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