KR100459808B1 - Novel antibiotic peptide derived from ribosomal protein L1 of Helicobacter pylori and use thereof - Google Patents

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Abstract

본 발명은 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori) 균이 생산하는 리보좀 단백질 L1(ribosomal protein L1, RPL1)의 아미노말단(amino-terminal) 부위를 다른 아미노산으로 치환시켜 합성한 항생 펩타이드 및 그의 용도에 관한 것으로, 구체적으로 RPL1 단백질의 아미노말단 부위 중 양친화성(amphipathic)을 갖고 항생활성을 나타내는 펩타이드인 HP (2-20)의 친수성 부위를 다른 아미노산으로 치환시켜 소수성 영역을 증가시키는 양친화성 구조로 합성한서열번호 2로 기재되는 항생 펩타이드 및 그의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 항생 펩타이드 및 그의 유도체는 세포독성이 없고 탁월한 항균, 항진균 및 항암 활성을 나타내므로 인체에 안전한 항생제 및 항암제로 유용하게 사용될 수 있다.The present invention relates to an antibiotic peptide synthesized by substituting an amino-terminal region of ribosomal protein L1 (RPL1) produced by Helicobacter pylori bacteria with other amino acids, and specifically, a use thereof. SEQ ID NO: 2 synthesized with an amphipathic structure that increases the hydrophobic region by substituting the hydrophilic region of HP (2-20), an amphiphilic peptide having an affinity among the amino terminal regions of the RPL1 protein, with another amino acid. It relates to an antibiotic peptide described herein and its use. Antibiotic peptides and derivatives thereof of the present invention have no cytotoxicity and exhibit excellent antibacterial, antifungal and anticancer activity, and thus can be usefully used as antibiotics and anticancer agents that are safe for humans.

Description

헬리코박터 파이로리균의 리보좀 단백질 L1 유래의 새로운 항생 펩타이드 및 그의 용도{Novel antibiotic peptide derived from ribosomal protein L1 of Helicobacter pylori and use thereof}Novel antibiotic peptide derived from ribosomal protein L1 of Helicobacter pylori and use according to Helicobacter pylori bacteria

본 발명은 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori)균이 생산하는 리보좀 단백질 L1(ribosomal protein L1, 이하 "RPL1"이라 약칭함)의 아미노말단 부위를 다른 아미노산으로 치환시켜 합성한 항생 펩타이드 및 그의 용도에 관한 것으로,구체적으로 RPL1 단백질의 아미노말단 부위 중 양친화성을 갖고 항생활성을 나타내는 펩타이드인 HP (2-20)의 친수성 부위를 다른 아미노산으로 치환시켜 소수성 영역을 증가시키는 양친화성 구조로 합성한서열번호 2로 기재되는 항생 펩타이드 및 그의 용도에 관한 것이다.The present invention relates to an antibiotic peptide synthesized by substituting the amino terminal portion of ribosomal protein L1 (hereinafter, referred to as "RPL1") produced by Helicobacter pylori with other amino acids, and its use Specifically, as described in SEQ ID NO: 2 synthesized with an amphiphilic structure that increases the hydrophobic region by substituting the hydrophilic region of HP (2-20), a peptide having an affinity and anti-activity among the amino terminal portions of the RPL1 protein, with another amino acid. Antimicrobial peptides and their use.

세균의 감염은 인간의 질병에서 가장 흔하고 치명적인 원인 중의 하나인데, 불행하게도 항생제의 남용으로 인하여 세균의 항생제 저항성(resistance)이 야기되었다. 실제로, 세균이 새로운 항생제에 저항성을 나타내는 속도는 새로운 항생제의 유사체가 개발되는 속도보다 훨씬 더 빨리 일어난다. 예를 들면, 생명에 위협을 가할 수 있는 엔테로코쿠스 패칼리스(Enterococcus faecalis), 마이코박테리움 투버쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis)및 슈도모나스 애루기노사(Pseudomonas aeruginosa)등의 세균 종들은 지금까지 알려진 모든 항생제에 대한 저항력을 키워왔다(Stuart B. Levy,Scientific American, 46-53, 1998).Bacterial infections are one of the most common and fatal causes of human disease. Unfortunately, the abuse of antibiotics has resulted in antibiotic resistance of bacteria. Indeed, the rate at which bacteria are resistant to new antibiotics occurs much faster than the rate at which new antibiotic analogs are developed. For example, bacterial species such as Enterococcus faecalis , Mycobacterium tuberculosis, and Pseudomonas aeruginosa, which can pose a life threat, are all known. It has developed resistance to antibiotics (Stuart B. Levy, Scientific American , 46-53, 1998).

항생제에 대한 내성(tolerance)은 항생제에 대한 저항성(resistance)과는 구별되는 현상인데, 1970년대에 뉴모코커스(Pneumococcus sp.)에서 최초로 발견이 되었으며 페니실린의 작용 기작에 대한 중요한 단서를 제공하였다(Tomasz et al.,Nature, 227, 138-140, 1970). 내성을 보이는 종은 통상적인 농도의 항생제 존재하에서는 성장을 멈추지만 결과적으로 죽지는 않는다. 내성은 항생제가 세포벽 합성 효소를 저해할 때 오토라이신(autolysin) 등과 같은 세균의 자가분해(autolytic) 효소의 활성이 일어나지 않기 때문에 생기는데, 이러한 사실은 페니실린이 내인성 가수분해 효소(endogenous hydrolytic enzyme)를 활성화시킴으로써 세균을 죽이며 세균은 또한 이들의 활성을 억제해서 항생제 치료시에도 생존하는 결과를 나타내게 된다.Tolerance to antibiotics is a distinct phenomenon from antibiotic resistance, first discovered in Pneumococcus sp. In the 1970s and providing an important clue to the mechanism of action of penicillin (Tomasz et al., Nature , 227, 138-140, 1970). Tolerant species stop growing in the presence of the usual concentration of antibiotics but do not die as a result. Resistance is due to the fact that when antibiotics inhibit cell wall synthase, the activity of bacterial autolytic enzymes, such as autolysin, does not occur, which is why penicillin activates endogenous hydrolytic enzymes. By killing bacteria, bacteria also inhibit their activity, resulting in survival during antibiotic therapy.

세균이 항생제에 대한 내성을 가지는 것은 임상적으로 대단히 중요한데, 내성 세균을 박멸하는 것이 불가능하게 되면 임상적인 감염에서 항생제 치료의 효용이 떨어지기 때문이다(Handwerger and Tomasz,Rev. Infec. Dis., 7, 368-386, 1985). 아울러, 내성이 생기는 것은 항생제에 대한 저항성이 생기게 되는 선행조건이라고 간주되는데 이것은 항생제 치료에도 불구하고 살아남는 균주가 생기기 때문이다. 이러한 균주는 항생제에 저항성을 가지는 새로운 유전 요소를 획득해서 항생제의 존재 하에서도 계속 성장하게 된다. 실제적으로 모든 저항성을 보이는 세균들은 내성도 가지고 있는 것으로 알려져 있으므로(Liu and Tomasz,J. Infect. Dis., 152, 365-372, 1985), 이러한 항생제 저항성을 가지는 세균을 죽일 수 있는 신규한 항생제의 개발이 필요하다.It is clinically very important for bacteria to be resistant to antibiotics, because the inability to eradicate resistant bacteria can reduce the effectiveness of antibiotic therapy in clinical infections (Handwerger and Tomasz, Rev. Infec. Dis. , 7 , 368-386, 1985). In addition, developing resistance is considered a prerequisite for resistance to antibiotics, because the resulting strains survive. These strains acquire new genetic elements that are resistant to antibiotics and continue to grow even in the presence of antibiotics. Practically all resistant bacteria are known to have resistance (Liu and Tomasz, J. Infect. Dis. , 152, 365-372, 1985), so that new antibiotics that can kill these antibiotic resistant bacteria Need development

작용기작의 측면에서 내성은 크게 두가지 경로로 이루어지는데, 첫 번째는 모든 세균에 있어서 성장속도가 감소할 때 일어나는 외형적(phenotypic) 내성이며(Tuomanen E.,Revs. Infect. Dis., 3, S279-S291, 1986), 두 번째는 특정 세균에서 일어나는 돌연변이에 의한 유전적인 내성이다. 두가지 경우 모두에 있어서 기본적인 현상은 오토라이신 활성의 하부조절(down regulation)이 일어난다는 것인데, 이러한 하부조절은 외부자극에 대한 외형적인 내성일 경우에는 일시적이며, 세포 용혈을 조절하는 경로의 변화를 야기하는 돌연변이가 일어난 유전적인 내성의 경우에는 영구적이다. 명백하게, 가장 간단한 유전적인 내성의 경우는 오토라이신 효소에 결손이 일어나는 것인데 확실하지 않은 여러 가지 이유로 인해서 이러한 자살 효소의 결손에 의해 내성을 가지는 균주가 임상적으로 발견된 적은 없으며, 오히려 임상적인 내성은 오토라이신의 활성을 조절함으로써 이루어진다(Tuomanen et al.,J. infect. Dis., 158, 36-43, 1988).In terms of mechanisms of action, resistance consists of two main pathways: the first is the phenotypic resistance that occurs when growth rate decreases in all bacteria (Tuomanen E., Revs. Infect. Dis. , 3, S279). -S291, 1986), the second is genetic resistance by mutations in certain bacteria. In both cases, the basic phenomenon is that down regulation of autolysine activity occurs, which is transient when it is externally resistant to external stimuli and causes changes in the pathways that regulate cellular hemolysis. It is permanent in the case of genetic resistance to which mutations have occurred. Obviously, the simplest case of genetic resistance is a defect in the autolysine enzyme, which has not been clinically found to be resistant to the deficiency of this suicide enzyme for a variety of uncertain reasons. By modulating the activity of autolysine (Tuomanen et al., J. infect. Dis. , 158, 36-43, 1988).

상기에서 살펴본 바와 같이, 항생제에 저항성을 나타내는 세균들과 싸우기 위하여 새로운 항생제의 개발이 필요하며, 아울러 오토라이신 활성과는 독립적으로 작용하는 새로운 항생제의 개발이 필요하다. 또한, 그러한 새로운 항생제를 세균의 감염과 염증치료에 효과적으로 치료하기 위한 약학적 조성물을 제공하는 것이 필요하다.As discussed above, new antibiotics are needed to fight antibiotics resistant bacteria, and new antibiotics that act independently of autolysine activity are required. There is also a need to provide pharmaceutical compositions for the effective treatment of such new antibiotics for the treatment of bacterial infections and inflammation.

한편, 세균은 펩타이드나 작은 유기물 분자들을 합성해서 이웃하는 세균을 죽일 수 있는데, 이러한 박테리오신(bacteriocin)들은 구조적으로 세부류로 분류된다. 첫 번째는 란티바이오틱스(lantibiotics)이며 두 번째는 비란티바이오틱스(nonlantibiotics)이고 세 번째는 신호 펩타이드(signal peptide)에 의해 분비되는 것들이다(Cintas et al.,J. Bad., 180, 1988-1994, 1998). 곤충을 포함하는 동물들 역시 자연적으로 생성되는 펩타이드 항생제를 생산하는데(Bevins et al.,Ann. Rev. Biochem., 59, 395-414, 1990), 상기의 항생제는 구조적으로 세 개의 그룹으로 나누어진다. 첫 번째는 시스테인이 풍부한(cysteine-rich) β-쉬트(sheet) 펩타이드이고, 두 번째는 α-회전형(helical)의 양친화성 분자이며, 세 번째는 프롤린이 풍부한(proline-rich) 펩타이드이다(Mayasaki et al.,Int. J. Antimicrob. Agents, 9, 269-280, 1998). 이들 항균 펩타이드들은 숙주방어 및 선천적 면역계에 있어서 중요한 역할을 담당하는 것으로 알려져 있다(Boman, H. G.,Cell, 65:205, 1991; Boman, H. G.,Annu. Rev. Microbiol., 13:61, 1995). 이러한 항균 펩타이드들은 아미노산 서열에 따라 다양한 구조를 갖는데, 이들 구조 중 가장 많은 것은 곤충에서 발견된 항균 펩타이드인 세크로핀(cecropin)과 같이 시스테인(cysteine) 잔기가 없고 양친화성 알파 나선형을 형성하는 구조이다.On the other hand, bacteria can kill neighboring bacteria by synthesizing peptides or small organic molecules, and these bacteriocins are structurally classified. The first is lantibiotics, the second is nonlantibiotics and the third is secreted by signal peptides (Cintas et al.,J. Bad., 180, 1988-1994, 1998). Animals, including insects, also produce naturally occurring peptide antibiotics (Bevins et al.,Ann. Rev. Biochem., 59, 395-414, 1990). The antibiotics are structurally divided into three groups. The first is a cysteine-rich β-sheet peptide, the second is an α-helical amphiphilic molecule, and the third is a proline-rich peptide ( Mayasaki et al.,Int. J. Antimicrob. Agents, 9, 269-280, 1998). These antimicrobial peptides are known to play an important role in host defense and the innate immune system (Boman, H. G.,Cell, 65: 205, 1991; Boman, H. G.,Annu. Rev. Microbiol., 13:61, 1995). These antimicrobial peptides have a variety of structures depending on the amino acid sequence, the most of these structures are free of cysteine residues such as cecropin, an antimicrobial peptide found in insects, and form an amphiphilic alpha helical. .

지난 세기 동안 소화성 궤양은 스트레스와 위산 과다생성에 의한다는 생각이 우세하였으나, 최근에 이러한 소화성 궤양이 헬리코박터 파일로리균에 의한 것이라고 밝혀지면서(Blaser, MJ.,Trends Microbiol., 1, 255-260, 1991) 이에 대한 관심이 집중되고 있다. 헬리코박터 파일로리균은 그람 음성균에 속하고 성장속도가 매우 느린 나선모양과 편모를 가지는 혐기성 미생물이다. 헬리코박터 파일로리균이 생산하는 많은 단백질 중 RPL1이라는 단백질은 230개의 아미노산으로 구성되어 있으며, 상기 단백질의 아미노말단 부위는 세크로핀과 그 구조가 유사하다는 것이 밝혀져 있는데 특히 8개의 아미노산이 동일한 것으로 알려져 있다. 헬리코박터 파일로리의 RPL1 아미노말단부위는 완벽한 양친화성 나선모양 구조를가지는데(Putsep, K. et al.,Nature, 398, 671-672, 1999), 이러한 양친화성 펩타이드는 세포막의 지질 성분과 유사한 구조를 지니므로 미생물의 세포막 지질과 결합함으로써 미생물의 세포막을 파괴하거나, 세포막의 전위에 영향을 주어 이를 변화시킴으로써 미생물을 파괴한다는 작용 기작이 보고되어 있다. 이외에도 헬리코박터 파일러리균의 RPL1 단백질의 아미노말단 부위 역시 항균활성을 가진다는 보고가 있다(Putsep K. et al.,Nature, 398, 671-672, 1999).The idea that peptic ulcers are predominantly caused by stress and gastric acid overproduction in the last century, but recently it has been found that these peptic ulcers are caused by Helicobacter pylori (Blaser, MJ.,Trends Microbiol., 1, 255-260, 1991). Helicobacter pylori is an anaerobic microorganism belonging to gram-negative bacteria and having a very slow-growing spiral and flagella. Of the many proteins produced by Helicobacter pylori, the RPL1 protein is composed of 230 amino acids, and the amino-terminal portion of the protein has been found to be similar in structure to cecropin, and in particular, eight amino acids are known to be identical. The RPL1 amino terminus of Helicobacter pylori has a perfect amphiphilic helix structure (Putsep, K. et al.,Nature, 398, 671-672, 1999), these amphiphilic peptides have a structure similar to the lipid component of the cell membrane, so that they bind to the cell membrane lipids of the microorganisms and destroy the cell membranes of the microorganisms or affect the potential of the cell membranes to change them. The mechanism of action of destroying has been reported. In addition, the amino terminal region of the RPL1 protein of Helicobacter pylori also has antimicrobial activity (Putsep K. et al.,Nature, 398, 671-672, 1999).

이에 본 발명자들은 양친화성을 갖는 헬리코박터 파일로리균의 RPL1 단백질의 아미노말단 부위 중 특정 부위 서열과 상기 서열 중 일부를 다른 아미노산으로 치환시킴으로써 소수성 부위를 증가시키는 양친화성 구조로 펩타이드 유도체를 설계하고 합성하였으며, 이와 같이 합성된 펩타이드 유도체의 항균, 항진균, 항암활성 및 세포 독성(용혈활성)을 확인하여 상기 펩타이드 유도체가 항생제 및 항암제로 이용될 수 있는 항생 펩타이드임을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.Accordingly, the present inventors designed and synthesized peptide derivatives with an amphipathic structure that increases the hydrophobic region by substituting a specific site sequence among the amino terminal sites of the RPL1 protein of Helicobacter pylori having amphiphile with other amino acids, By confirming the antimicrobial, antifungal, anticancer activity and cytotoxicity (hemolytic activity) of the peptide derivatives thus synthesized, the present invention was completed by revealing that the peptide derivative is an antibiotic peptide that can be used as an antibiotic and an anticancer agent.

본 발명의 목적은 항생제 및 항암제로 이용할 수 있는 세포독성이 없고 우수한 항균, 항진균 및 항암활성을 나타내는 항생 펩타이드 및 그의 유도체를 제공하는 것이다.It is an object of the present invention to provide an antibiotic peptide and derivatives thereof which are non-cytotoxic and exhibit excellent antibacterial, antifungal and anticancer activity which can be used as antibiotics and anticancer agents.

도 1은 본 발명의 리보좀 단백질 L1(ribosomal protein L1)의 아미노말단 HP (2-20) 펩타이드 유래의 유사체 펩타이드를 설계한 도해(diagram)를 나타낸 것이고, 1 shows a diagram of a design of an analog peptide derived from an amino terminal HP (2-20) peptide of ribosomal protein L1 of the present invention,

도 2는 본 발명의 항생 펩타이드를 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균체에 처리한 다음 LB 아가(agar) 배지에 도말하여 생균수를 확인한 사진이고, 2 is a photograph showing the number of viable cells by treating the antibiotic peptide of the present invention to Bacillus subtilis cells and then smearing on LB agar medium.

A : 대조군(no treatment)A: no treatment

B : HP (2-20)B: HP (2-20)

C :서열번호 2로 기재되는 항생 펩타이드C: antibiotic peptide set forth in SEQ ID NO: 2

도 3은 본 발명의 항생 펩타이드를 대장균(Escherichia coli) 균체에 처리한 다음 LB 아가 배지에 도말하여 생균수를 확인한 사진이고, 3 is a photograph showing the number of viable cells by treating the antibiotic peptide of the present invention to Escherichia coli cells and then smearing on LB agar medium.

A : 대조군(no treatment)A: no treatment

B : HP (2-20)B: HP (2-20)

C :서열번호 2로 기재되는 항생 펩타이드C: antibiotic peptide set forth in SEQ ID NO: 2

도 4는 본 발명의 항생 펩타이드를 캔디다 알비칸스(Candida albicans) 균체에 처리한 다음 PDB 아가 배지에 도말하여 생균수를 확인한 사진이고, 4 is a photograph showing the number of living cells by treating the antibiotic peptide of the present invention to Candida albicans cells and then spreading on PDB agar medium.

A : HP (2-20)A: HP (2-20)

B : 멜리틴(Melittin)B: Melittin

C :서열번호 2로 기재되는 항생 펩타이드C: antibiotic peptide set forth in SEQ ID NO: 2

도 5는 본 발명의 항생 펩타이드의 세포에 대한 항암활성을 나타낸 그래프이다. 5 is a graph showing the anticancer activity of cells of the antibiotic peptide of the present invention.

A : AML-2/WT에 대한 항암활성A: anticancer activity against AML-2 / WT

B : SNU 638에 대한 항암활성B: anticancer activity against SNU 638

C : SNU 668에 대한 항암활성C: anticancer activity against SNU 668

●: HP(2-20)●: HP (2-20)

○:서열번호 2로 기재되는 항생 펩타이드○: antibiotic peptide set forth in SEQ ID NO: 2

▼: 멜리틴▼: melittin

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori) 균이 생산하는 RPL1 단백질의 아미노말단(amino-terminal) 부위를 다른 아미노산으로 치환시켜 합성한 항생 펩타이드 및 그의 유도체를 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides an antibiotic peptide and derivatives thereof synthesized by replacing the amino-terminal region of the RPL1 protein produced by the Helicobacter pylori bacteria with other amino acids.

또한, 본 발명은 상기의 항생 펩타이드 및 그의 유도체를 항균, 항진균 및 항암용으로 사용하는 용도를 제공한다.In addition, the present invention provides a use of the antibiotic peptide and its derivatives for antibacterial, antifungal and anticancer.

아울러, 본 발명은 상기의 항생 펩타이드 및 그의 유도체를 유효성분으로 하는 항균, 항진균 및 항암용 약학적 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a pharmaceutical composition for antimicrobial, antifungal and anticancer activity using the antibiotic peptide and derivatives thereof as an active ingredient.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명은 헬리코박터 파일로리균이 생산하는 RPL1 단백질의 아미노말단 부위를 다른 아미노산으로 치환시켜 합성한 항생 펩타이드 및 그의 유도체를 제공한다.The present invention provides an antibiotic peptide and derivatives thereof synthesized by substituting the amino terminal portion of the RPL1 protein produced by Helicobacter pylori with other amino acids.

본 발명은 헬리코박터 파일로리 유래 RPL1 단백질의 아미노 말단 부위 중 양친화성을 갖고 항생 활성을 나타내는 펩타이드인 HP(2-20)의 친수성 부위를 다른 아미노산으로 치환시켜 소수성 영역을 증가시킴으로써 양친화성 구조를 갖는 항생 펩타이드를 합성하였다.The present invention provides an antibiotic peptide having an amphiphilic structure by increasing the hydrophobic region by substituting the hydrophilic region of HP (2-20), which is a peptide having an affinity and antibiotic activity, in the amino terminal region of the Helicobacter pylori-derived RPL1 protein with another amino acid. Was synthesized.

상기 항생 펩타이드를 합성하기 위하여, 본 발명자들은 Fmoc 아미노기 보호 용기를 이용한 메리필드(Merrifield)의 액상 고상법을 사용하였으며(Merrifield, RB.,J. Am. Chem. Soc., 85, 2149, 1963)서열번호 1로 기재되는 HP (2-20) 펩타이드의 17번째 아미노산인 글루타민과 19번째 아미노산인 아스파라긴산을 각각 트립토판으로 치환한서열번호 2로 기재되는 항생 펩타이드를 제조하였다(도 1참조). 이와 같이 제조된 항생 펩타이드를 분리·정제하고 그 순도를 확인한 결과 95% 이상의 순도를 나타내었으며, MALDI(Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization) 질량 분석법을 이용하여 얻은 분자량이 아미노산 서열로부터 계산하여 얻은 분자량과 일치하므로 정확한 아미노산 서열을 가지는 항생 펩타이드가 합성되었음을 확인하였다.In order to synthesize the antibiotic peptide, the inventors used a liquid phase solidification method of Merrifield using a Fmoc amino group protective container (Merrifield, RB., J. Am. Chem. Soc. , 85, 2149, 1963). antibiotic peptides described in HP (2-20) 17 amino acid glutamine is the 19th amino acid is substituted with an aspartic acid, respectively tryptophan SEQ ID NO: 2 of the peptide described in SEQ ID NO: 1 was prepared (see Fig. 1). The antibiotic peptide thus prepared was isolated and purified, and its purity was found to be 95% or higher. The molecular weight obtained using the Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization (MALDI) mass spectrometry was consistent with the molecular weight obtained from the amino acid sequence. Therefore, it was confirmed that the antibiotic peptide having the correct amino acid sequence was synthesized.

서열번호 2로 기재되는 아미노산으로 구성된 본 발명의 항생 펩타이드는서열번호 1로 기재되는 HP (2-20) 펩타이드의 17번째 아미노산인 글루타민과 19번째 아미노산인 아스파라긴산을 트립토판 이외의 다른 소수성 아미노산으로 치환할 수 있으며, 바람직하게는 알라닌, 이소루이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 발린 및 루이신으로 치환할 수 있다.Antimicrobial peptides of the present invention consists of an amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 is to be substituted for the 17th amino acids of the HP (2-20) peptide described in SEQ ID NO: 1, glutamine and aspartic acid to the 19th amino acid, another hydrophobic amino acid other than tryptophan And preferably substituted with alanine, isoleucine, methionine, phenylalanine, proline, valine and leucine.

또한, 본 발명의 항생 펩타이드는 HP (2-20) 펩타이드의 특정 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시켜 소수성 부위가 증가되는 양친화성 구조로 합성할 수 있으며, 바람직하게는 8번째 아미노산인 아르기닌과 10번째 아미노산인 글루탐산 및 20번째 아미노산인 리신을 상기에 기술한 소수성의 다른 아미노산으로 치환시켜 합성할 수 있다.In addition, the antibiotic peptide of the present invention can be synthesized with an amphiphilic structure in which the hydrophobic region is increased by substituting specific amino acids of HP (2-20) peptides with other amino acids. It can be synthesized by substituting phosphorous acid and lysine, the 20th amino acid, with other hydrophobic amino acids described above.

또한, 본 발명은 상기의 항생 펩타이드 및 그의 유도체를 항균, 항진균 및 항암용으로 사용하는 용도를 제공한다.In addition, the present invention provides a use of the antibiotic peptide and its derivatives for antibacterial, antifungal and anticancer.

우선, 본 발명의 항생 펩타이드가 상기 용도로 사용될 수 있는지 확인하기위하여 본 발명자들은 본 발명에서 합성한 항생 펩타이드의 항균 활성을 측정하였다. 항균 활성은 균체가 분열되지 않는 펩타이드의 최소 농도인 생육 최소저해농도(minimal inhibitory concentration, 이하 "MIC"라 약칭함)를 측정하여 관찰하였다.First, in order to confirm whether the antibiotic peptide of the present invention can be used for the above purposes, the present inventors measured the antimicrobial activity of the antibiotic peptide synthesized in the present invention. Antimicrobial activity was observed by measuring the minimal inhibitory concentration (hereinafter, abbreviated as "MIC"), which is the minimum concentration of peptides that do not divide cells.

그람 양성균으로써 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)와 스태필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)를, 그람 음성균으로써 대장균(Escherichia coli)과 프로테우스 불가리스(Proteus vulgaris)를 사용하였으며,서열번호 2로 기재되는 본 발명의 항생 펩타이드와 양성 대조군으로 멜리틴(Melittin)을 사용하여 각 균주의 MIC 값을 측정한 결과, 본 발명의 항생 펩타이드는 HP (2-20) 펩타이드에 비해 균주에 따라 10배 이상의 높은 항균 활성을 나타내었으며, 양성 대조군으로 사용한 멜리틴과 비슷한 항균활성을 나타냄을 확인하였다(표 1참조).As Gram-positive bacteria Bacillus subtilis (Bacillus subtilis) and Stability Philo nose kusu aureus (Staphylococcus aureus) for, by Gram-negative bacteria was used for E. coli (Escherichia coli) and Proteus vulgaris (Proteus vulgaris), described in SEQ ID NO: 2 As a result of measuring the MIC value of each strain using melittin as the antibiotic peptide of the present invention and a positive control, the antibiotic peptide of the present invention is 10 times higher antibacterial activity depending on the strain than the HP (2-20) peptide. It showed activity, and showed similar antimicrobial activity as melittin used as a positive control (see Table 1 ).

또한, 대장균과B. 서브틸리스를 대상으로 본 발명의 항생 펩타이드의 항균활성을 LB 아가 배지에서 확인한 결과, 본 발명의 항생 펩타이드는 HP (2-20) 펩타이드에 비해 탁월한 항균 활성을 나타냄을 확인하였다(도 2도 3참조).In addition, E. coli and B. As a result of confirming the antimicrobial activity of the antibiotic peptide of the present invention in LB agar medium for subtilis, it was confirmed that the antibiotic peptide of the present invention exhibited excellent antimicrobial activity compared to the HP (2-20) peptide ( FIG. 2 and FIG. 3 ).

본 발명의 항생 펩타이드의 항진균 활성을 측정하기 위하여, 본 발명자들은 병원성 진균인 캔디다 알비칸스(Candida albicans), 트리코스포론 베이겔라이(Trichosporon beigelii) 및 사카로마이세스 세르비지애(Saccharomyces cerevisiae)를 대상으로 각 균주의 MIC 값을 MTT 분석법으로 측정한 결과, 본 발명의서열번호 2로 기재되는 항생 펩타이드는 HP (2-20) 펩타이드에 비해 4배 이상의높은 항진균 활성을 나타내었으며, 양성 대조군으로 사용한 멜리틴과 비슷한 항진균 활성을 나타내었다(표 2참조).In order to measure the antifungal activity of the antibiotic peptides of the present invention, the present inventors have identified the pathogenic fungi Candida albicans , Trichosporon beigelii and Saccharomyces cerevisiae . As a result of measuring the MIC value of each strain by MTT assay, the antibiotic peptide described in SEQ ID NO: 2 of the present invention showed more than four times higher antifungal activity than the HP (2-20) peptide, and was used as a positive control. It showed antifungal activity similar to melittin (see Table 2 ).

또한, 상기 균주를 대상으로 본 발명의 항생 펩타이드의 항진균 활성을 PDB 아가 플레이트에서 확인한 결과, 본 발명의서열번호 2로 기재되는 항생 펩타이드는 HP (2-20) 펩타이드에 비해 탁월한 항진균 활성을 나타냄을 확인하였다(도 4참조).In addition, as a result of confirming the antifungal activity of the antibiotic peptide of the present invention in the PDB agar plate against the strain, the antibiotic peptide described in SEQ ID NO: 2 of the present invention shows excellent antifungal activity compared to the HP (2-20) peptide It was confirmed (see FIG. 4 ).

또한, 본 발명자들은 본 발명의 항생 펩타이드가 암세포에 대한 항암 활성을 나타내는지 확인하기 위하여, 백혈병 세포주인 AML-2/WT와 위암 세포주인 SNU 638 및 SNU 668을 대상으로 항암 활성을 측정한 결과, HP (2-20)은 항암 활성이 나타나지 않았으나서열번호 2로 기재되는 본 발명의 항생 펩타이드와 양성 대조군으로 사용한 멜리틴의 경우에는 강한 항암활성을 나타내었다(도 5참조).In addition, the present inventors measured anticancer activity in leukemia cell lines AML-2 / WT and gastric cancer cell lines SNU 638 and SNU 668 to determine whether the antibiotic peptide of the present invention exhibits anticancer activity against cancer cells. HP (2-20) did not show anticancer activity, but the antimicrobial peptide of the present invention described in SEQ ID NO: 2 and melittin used as a positive control showed strong anticancer activity (see FIG. 5 ).

아울러, 본 발명자들은 본 발명의 펩타이드가 세포독성을 나타내는지를 확인하기 위하여 펩타이드의 적혈구 파괴능을 조사한 결과, HP (2-20)과 본 발명의서열번호 2로 기재되는 항생 펩타이드는 세포독성을 거의 나타내지 않는 반면에 양성 대조군으로 사용한 벌독인 멜리틴은 세포 독성이 매우 높게 나타남을 알 수 있었다(표 3참조).In addition, the present inventors examined the erythrocyte destructive ability of the peptide to confirm whether the peptide of the present invention exhibits cytotoxicity, the antibiotic peptide described in HP (2-20) and SEQ ID NO: 2 of the present invention is almost cytotoxic On the other hand, melittin, a bee venom used as a positive control, was found to be highly cytotoxic (see Table 3 ).

상기의 결과로부터, 본 발명의서열번호 2로 기재되는 항생 펩타이드는 탁월한 항균, 항진균 및 항암 효과를 나타낼 뿐만 아니라 세포독성이 없기 때문에 인체에 안전한 항균, 항진균 및 항암제로 유용하게 사용될 수 있다.From the above results, the antibiotic peptide described in SEQ ID NO: 2 of the present invention not only exhibits excellent antibacterial, antifungal and anticancer effects, but also can be usefully used as a safe antibacterial, antifungal and anticancer agent for humans because it is not cytotoxic.

아울러, 본 발명은 상기의 항생 펩타이드 및 그의 유도체를 유효성분으로 하는 항균, 항진균 및 항암용 약학적 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a pharmaceutical composition for antimicrobial, antifungal and anticancer activity using the antibiotic peptide and derivatives thereof as an active ingredient.

상기서열번호 2로 기재되는 항생 펩타이드 및 그의 유도체는 임상투여시에 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품제제의 형태로 사용될 수 있다.The antibiotic peptide described in SEQ ID NO: 2 and its derivatives can be administered parenterally during clinical administration and can be used in the form of general pharmaceutical preparations.

즉, 본 발명의서열번호 2로 기재되는 항생 펩타이드 및 그의 유도체는 실제로 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용 될 수 있다.That is, the antibiotic peptide described in SEQ ID NO: 2 of the present invention and derivatives thereof may be administered in various parenteral formulations, and when formulated, fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrating agents, surfactants, etc., which are commonly used It is prepared using diluent or excipient. Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized preparations, suppositories. As the non-aqueous solvent and the suspension solvent, propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate, and the like can be used. As a suppository base, witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin butter, glycerogelatin and the like can be used.

또한, 상기서열번호 2로 기재되는 항생 펩타이드 및 그의 유도체는 생리식염수 또는 유기용매와 같이 약제로 허용된 여러 전달체(carrier)와 혼합하여 사용될 수 있고, 안정성이나 흡수성을 증가시키기 위하여 글루코스, 수크로스 또는 덱스트란과 같은 카보하이드레이트, 아스코르브 산(ascorbic acid) 또는 글루타치온과 같은 항산화제(antioxidants), 킬레이팅 물질(chelating agents), 저분자 단백질 또는 다른 안정화제(stabilizers)들이 약제로 사용될 수 있다.In addition, the antibiotic peptide described in SEQ ID NO: 2 and derivatives thereof may be used in admixture with various carriers accepted as a medicament such as physiological saline or an organic solvent, and glucose, sucrose or Carbohydrates such as dextran, ascorbic acid or antioxidants such as glutathione, chelating agents, small molecule proteins or other stabilizers can be used as medicaments.

상기서열번호 2로 기재되는 항생 펩타이드 및 그의 유도체의 유효용량은 0.1 내지 2 ㎎/㎏이고, 바람직하기로는 0.5 내지 1 ㎎/㎏ 이며, 하루 1 내지 3회 투여될 수 있다.The effective dose of the antibiotic peptide described in SEQ ID NO: 2 and derivatives thereof is 0.1 to 2 mg / kg, preferably 0.5 to 1 mg / kg, and may be administered 1 to 3 times a day.

본 발명의 약학적 조성물에서서열번호 2로 기재되는 항생 펩타이드 및 그의 유도체의 총 유효량은 거환(bolus) 형태 혹은 상대적으로 짧은 기간 동안 확산(infusion) 등에 의해 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)이 장기간 투여되는 분활 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 상기서열번호 2로 기재되는 항생 펩타이드 및 그의 유도체의 농도는 약의 투여 경로 및 치료 횟수 뿐만 아니라 환자의 나이 및 건강상태 등 다양한 요인들을 고려하여 환자의 유효 투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 이 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 상기서열번호 2로 기재되는 항생 펩타이드 및 그의 유도체의 약학적 조성물로서의 특정한 용도에 따른 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다.The total effective amount of the antibiotic peptide and its derivatives set forth in SEQ ID NO: 2 in the pharmaceutical composition of the present invention is administered to the patient in a single dose by bolus form or by infusion for a relatively short period of time. Multiple doses may be administered by a fractionated treatment protocol with long term administration. Since the concentration of the antibiotic peptide and its derivative described in SEQ ID NO: 2 is determined by the effective dose of the patient in consideration of various factors such as the age and health of the patient as well as the route of administration and the number of treatment of the drug, when considering this point One of ordinary skill in the art will be able to determine the appropriate effective dosage for the particular use of the antibiotic peptide and its derivatives set forth in SEQ ID NO: 2 as pharmaceutical compositions.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail by way of examples.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.However, the following examples are merely to illustrate the invention, but the content of the present invention is not limited to the following examples.

<실시예 1> 펩타이드의 합성 및 분리정제Example 1 Synthesis and Separation of Peptides

본 발명자들은 소수성 영역이 증가되어 양친화성 구조를 갖는 항생 펩타이드를 합성하기 위하여, 헬리코박터 파일로리 유래 RPL1 단백질의 아미노말단 부위 중서열번호 1로 기재되는 HP(2-20) 펩타이드의 친수성 부위를 소수성 아미노산으로 치환시켰다. 구체적으로,서열번호 1로 기재되는 HP (2-20) 펩타이드의 17번째 아미노산인 글루타민과 19번째 아미노산인 아스파라긴산을 각각 트립토판으로 치환한서열번호 2로 기재되는 항생 펩타이드를 제조하였다. 펩타이드 합성 방법은 Fmoc(9-fluorenylmethoxycarbonyl)를 아미노기 보호 용기를 이용한 메리필드(Merrifield)의 액상 고상법을 사용하였다(Merrifield, RB.,J. Am. Chem. Soc., 85, 2149, 1963)(도 1).In order to synthesize an antibiotic peptide having an amphiphilic structure with an increased hydrophobic region, the present inventors have used the hydrophilic portion of the HP (2-20) peptide described in SEQ ID NO: 1 as a hydrophobic amino acid in the amino terminal portion of the RPL1 protein derived from Helicobacter pylori. Substituted. Specifically, an antibiotic peptide described in SEQ ID NO: 2 in which glutamine, the 17th amino acid, and 19th amino acid, asparagine, of the HP (2-20) peptide described in SEQ ID NO: 1 was substituted with tryptophan, respectively, was prepared. Peptide synthesis was performed using Mermofield's liquid phase solid phase method using Fmoc (9-fluorenylmethoxycarbonyl) as an amino group protecting vessel (Merrifield, RB., J. Am. Chem. Soc. , 85, 2149, 1963) ( 1 ).

구체적으로, 본 발명에서 설계한 펩타이드의 카르복실말단이 -NH2형태인 펩타이드는 Rink Amide MBHA-Resin을 출발물질로 사용하였으며, 카르복실말단이 -OH 형태의 펩타이드는 Fmoc-아미노산-Wang Resin을 출발물질로 사용하였다. Fmoc-아미노산의 커플링(coupling)에 의한 펩타이드 사슬(chain)의 연장은 DCC(N-hydroxybenzo triazole (HOBt)-dicyclo-hexycarbodiimide)법에 의해 실시하였다. 각 펩타이드의 아미노말단의 Fmoc-아미노산을 커플링 시킨 후, 20% NMP(piperidine /N-methyl pyrolidone) 용액으로 Fmoc기를 제거하고 NMP 및 DCM(dichoromethane)으로 여러번 세척한 다음 질소 가스로 건조시켰다. 여기에 TFA(trifluoroaceticacid)-phenol-thioanisole-H2O-triisopropylsilane(85: 5: 5: 2.5: 2.5, vol./vol.) 용액을 가하고 2 내지 3시간 반응시켜 보호기의 제거 및 레진으로부터 펩타이드를 분리시킨 후, 디에틸 에테르(diethylether)로 펩타이드를 침전시켰다. 상기의 방법으로 얻은 크루드(crude) 펩타이드는 0.05% TFA가 포함된 아세토니트릴 농도구배(acetonitrle gradient)에서 정제형 역상(reverse phase, RP)-HPLC 칼럼(Delta Pak, C18300Å, 15, 19.0mm ×30 cm, Waters)을 이용하여 정제하였다. 합성 펩타이드를 6 N HCl을 이용하여 110℃에서 가수분해한 후 잔사를 감압농축하고 0.02 N HCl에 녹여서 아미노산 분석기(Hitachi 8500 A)로 아미노산 조성을 측정하였다.Specifically, the peptide having the carboxyl terminus of -NH 2 form of the peptide designed in the present invention used Rink Amide MBHA-Resin as a starting material, and the carboxyl terminus of the -OH type peptide was Fmoc-amino acid-Wang Resin. Used as starting material. The extension of the peptide chain by the coupling of Fmoc-amino acids was carried out by DCC (N-hydroxybenzo triazole (HOBt) -dicyclo-hexycarbodiimide) method. After coupling the Fmoc-amino acid at the amino terminal of each peptide, the Fmoc group was removed with 20% NMP (piperidine / N-methyl pyrolidone) solution, washed several times with NMP and DCM (dichoromethane) and dried with nitrogen gas. A solution of trifluoroacetic acid (TFA) -phenol-thioanisole-H 2 O-triisopropylsilane (85: 5: 5: 2.5: 2.5, vol./vol.) Was added thereto and reacted for 2 to 3 hours to remove the protecting group and to remove the peptide from the resin. After separation, the peptide was precipitated with diethylether. Crude peptides obtained by the above method were purified by reverse phase (RP) -HPLC column (Delta Pak, C 18 300Å, 15, 19.0) in an acetonitrile gradient containing 0.05% TFA. mm x 30 cm, Waters). The synthetic peptide was hydrolyzed at 110 ° C. using 6 N HCl, and the residue was concentrated under reduced pressure and dissolved in 0.02 N HCl to measure amino acid composition using an amino acid analyzer (Hitachi 8500 A).

상기의 방법으로 조성된 펩타이드의 순도를 확인한 결과 95% 이상의 순도를 나타내었으며, MALDI 질량 분석법(Hill, et al .,Rapid Commun. Mass Spectrometry, 5, 395, 1991)을 이용하여 얻은 분자량이 아미노산 서열로부터 계산하여 얻은 분자량과 일치하므로 정확한 아미노산 서열을 가지는 항생 펩타이드가 합성되었음을 확인하였다.As a result of confirming the purity of the peptide prepared by the above method, the purity was more than 95%, and the molecular weight obtained using MALDI mass spectrometry (Hill, et al., Rapid Commun. Mass Spectrometry , 5, 395, 1991) is amino acid sequence. It was confirmed that the antibiotic peptide having the correct amino acid sequence was synthesized because it is consistent with the molecular weight obtained from the calculation.

<실시예 2> 항생 펩타이드의 항균활성 측정Example 2 Antibacterial Activity of Antibiotic Peptides

<2-1> 생육 최소저해농도 측정<2-1> Measurement of growth minimum inhibition concentration

상기 실시예 1에서 제조된 항생 펩타이드의 항균 활성을 측정하기 위하여, 먼저 본 발명자들은 균체가 분열되지 않는 펩타이드의 최소 농도인 MIC 값을 측정하였다.In order to measure the antimicrobial activity of the antibiotic peptide prepared in Example 1, the present inventors first measured the MIC value, which is the minimum concentration of the peptide cells are not cleaved.

본 발명자들은 항균 활성 측정을 위하여 그람 양성균으로써 바실러스 서브틸리스(KCTC 1918)와 스태필로코쿠스 아우레우스(KCTC 1621)를, 그람 음성균으로써 대장균(KCTC 1682)과 프로테우스 불가리스(KCTC 2433)를 생명공학연구소 유전자은행으로부터 분양받아 사용하였으며, 각 균주를 LB 배지(1% 박토 트립톤, 0.5% 박토 이스트 추출물, 1% 염화나트륨)에서 중간-로그 상(mid-log phase)까지 배양한 다음 1% 박토 펩톤 배지로 1×104세포/100 ㎕의 균체 농도로 희석하여 마이크로 타이트레이트 플레이트에 접종하였다. 실시예 1에서 합성한 항생 펩타이드와 양성 대조군으로 사용한 멜리틴(Melittin)을 각각 25 μM/웰(well) 부터 1/2배씩 희석하여 플레이트에 첨가한 후 37℃에서 6시간 동안 배양하였고, 마이크로 타이트레이트 플레이트 판독기를 이용하여 620 nm의 파장에서 흡광도를 측정하여 각 균주의 MIC 값을 결정하였으며, 그 결과를 하기표 1에 나타내었다.We measured Bacillus subtilis (KCTC 1918) and Staphylococcus aureus (KCTC 1621) as Gram-positive bacteria and Escherichia coli (KCTC 1682) and Proteus vulgaris (KCTC 2433) as Gram-negative bacteria. Each strain was incubated in LB medium (1% Bakto tryptone, 0.5% Bakto yeast extract, 1% sodium chloride) to the mid-log phase and then 1% Bakto. Diluted to a cell concentration of 1 × 10 4 cells / 100 μl in peptone medium and inoculated into micro titrate plates. The antibiotic peptide synthesized in Example 1 and melittin, which were used as a positive control, were diluted 1/2 fold from 25 μM / well, respectively, and added to the plate, followed by incubation at 37 ° C. for 6 hours, and microtight. The absorbance was measured at a wavelength of 620 nm using a rate plate reader to determine the MIC value of each strain, and the results are shown in Table 1 below.

그람 양성균 및 그람 음성균에 대한 항생 펩타이드의 항균 활성 측정Antimicrobial Activity of Antibiotic Peptide against Gram-positive and Gram-negative Bacteria 펩타이드Peptide 생육 최소저해농도 (μM)Growth Inhibitory Concentration (μM) 그람 양성균Gram-positive bacteria 그람 음성균Gram-negative bacteria B. 서브틸리스 B. Subtilis S. 아우레우스 S. Aureus 대장균Escherichia coli P. 불가리스 P. Bulgarias HP (2-20)HP (2-20) 3.123.12 12.512.5 12.512.5 6.256.25 서열번호 2의 항생 펩타이드Antibiotic Peptides of SEQ ID NO: 2 0.390.39 0.780.78 1.561.56 0.390.39 멜리틴Melittin 0.190.19 0.780.78 1.561.56 1.561.56

그 결과, 본 발명의서열번호 2로 기재되는 항생 펩타이드는 HP (2-20) 펩타이드에 비해 균주에 따라 10배 이상의 높은 항균 활성을 나타내었으며, 양성 대조군으로 사용한 멜리틴과는 비슷한 항균활성을 나타냄을 확인하였다. 구체적으로, 본 발명의 항생 펩타이드는 그람 양성 및 그람 음성균 모두에서 우수한 항균 활성을 나타내었고, 특히P. 불가리스에서는 HP (2-20) 펩타이드와 멜리틴보다 항균 활성 효과가 탁월하였다.As a result, the antibiotic peptide set forth in SEQ ID NO: 2 of the present invention showed more than 10 times higher antimicrobial activity according to strain than HP (2-20) peptide, and showed similar antimicrobial activity as melittin used as a positive control. It was confirmed. Specifically, the antibiotic peptide of the present invention showed excellent antimicrobial activity in both Gram-positive and Gram-negative bacteria, in particular P. In Bulgaria, antibacterial activity was superior to HP (2-20) peptide and melittin.

<2-2> 항균 활성의 가시화<2-2> Visualization of Antimicrobial Activity

또한, 본 발명의 항생 펩타이드의 항균활성을 배지상에서 가시화하기 위하여, 대장균과B. 서브틸리스를 LB 배지(1% 박토 트립톤, 0.5% 이스트 추출물, 1% 염화나트륨)에 접종하여 미드-로그 상까지 배양하였다. 4×105세포의 대장균과B. 서브틸리스에 각각 4 μM과 1 μM 농도의 항생 펩타이드를 섞은 후, 37℃에서 2시간 동안 배양하고 배양액을 LB 플레이트에 도말하여 균주를 가시화시켰다.In addition, in order to visualize the antimicrobial activity of the antibiotic peptide of the present invention on the medium, E. coli and B. Subtilis was inoculated in LB medium (1% bacto tryptone, 0.5% yeast extract, 1% sodium chloride) and incubated until mid-log phase. Escherichia coli and B of 4 × 10 5 cells. Antimicrobial peptides at 4 μM and 1 μM concentrations were mixed in the subtilis, and then incubated at 37 ° C. for 2 hours, and the culture was plated on LB plates to visualize the strains.

그 결과, 그람 양성균인B. 서브틸리스균에 아무것도 처리하지 않은 양성대조군에서는 많은 수의 콜로니(colony)를 발견할 수 있었고(도 2의 A) HP (2-20)을 첨가한 경우에도 균이 조금 자랐으나(도 2의 B) 본 발명의 항생 펩타이드를 첨가한 경우에는 균의 성장이 완전히 억제되어 콜로니가 보이지 않음을 확인하였다(도 2의 C). 또한, 그람 음성균인 대장균에 아무것도 처리하지 않은 양성대조군에서는 많은 수의 콜로니(colony)를 발견할 수 있었고(도 3의 A) HP (2-20)을 첨가한 경우에도 균이 자랐으나(도 3의 B), 본 발명의 항생 펩타이드를 첨가한 경우에는 균의 성장이 완전히 억제되어 콜로니가 보이지 않음을 확인하였다(도 3의 C).As a result, B. Gram-positive bacteria. In the positive control group treated with nothing in the subtilis bacteria, a large number of colonies were found (A in FIG. 2 ) and even when HP (2-20) was added, the bacteria grew slightly (B in FIG. 2 ) . When the antibiotic peptide of the present invention was added, it was confirmed that the growth of the bacteria was completely inhibited and colonies were not seen ( FIG . 2C). In addition, a large number of colonies were found in the positive control group treated with E. coli, which is Gram-negative bacteria (A in FIG. 3 ), and even when HP (2-20) was added ( FIG. 3). B), when the antibiotic peptide of the present invention was added, it was confirmed that the growth of the bacteria was completely inhibited and colonies were not seen ( FIG . 3C).

상기의 결과로부터, 본 발명의 항생 펩타이드는 HP (2-20) 펩타이드에 비해 탁월한 항균 활성을 나타냄을 확인하였다.From the above results, it was confirmed that the antibiotic peptide of the present invention shows excellent antimicrobial activity compared to the HP (2-20) peptide.

<실시예 3> 항생 펩타이드의 항진균 활성 측정Example 3 Determination of Antifungal Activity of Antibiotic Peptides

<3-1> MTT 분석<3-1> MTT analysis

본 발명의 항생 펩타이드의 항진균 활성을 측정하기 위하여, 본 발명자들은 병원성 진균인 캔디다 알비칸스(TIMM 1768), 트리코스포론 베이겔라이(KCTC 7707) 및 사카로마이세스 세르비지애(KCTC 7296)를 대상으로 MTT 분석을 수행하였다. 구체적으로, 96-웰 플레이트에 각종 진균을 포함한 PDB 배지(20% 포테이토 인퓨전 프럼, 2% 박토 덱스트로즈) 100 ㎕씩을 분주하고 본 발명의 항생 펩타이드를 각각 50 μM/웰(well)부터 1/2배씩 희석하여 플레이트에 첨가하여 다시 배양한 후, 5 ㎎/㎖ 농도의 MTT 용액(3-[4,5-dimethyl-2-thiazolyl]-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide) 10 ㎕를 모든 웰에 첨가하여 다시 5-6시간 배양하였다. 그 후, 살아 있는 세포의 미토콘드리아 효소에 의해 생성된 포르마잔(formazan)을 0.04 N HCl-이소프로판올(isopropanol) 용액 100 ㎕로 잘 용해시킨 후 ELISA 판독기(reader)를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하여 발색되는 정도로 MIC 값을 측정하였고, 그 결과를 하기표 2에 나타내었다.In order to determine the antifungal activity of the antibiotic peptides of the present invention, the present inventors have determined the pathogenic fungi Candida albicans (TIMM 1768), Tricosporone Beiglai (KCTC 7707) and Saccharomyces cerbiziae (KCTC 7296). MTT analysis was performed on the subjects. Specifically, 100 μl of PDB medium (20% potato infusion frum, 2% bactodextrose) containing various fungi was dispensed in a 96-well plate and 50 μM / well of the antibiotic peptide of the present invention was added to 1 / After diluting twice, adding to the plate and incubating again, 10 μl of MTT solution (3- [4,5-dimethyl-2-thiazolyl] -2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide) at a concentration of 5 mg / ml was added. Add to all wells and incubated again 5-6 hours. Subsequently, formazan produced by mitochondrial enzymes in living cells was well dissolved with 100 μl of 0.04 N HCl-isopropanol solution, and then absorbance was measured at 570 nm using an ELISA reader. The MIC value was measured to the extent of color development, and the results are shown in Table 2 below.

항생 펩타이드의 항진균 활성 측정Determination of Antifungal Activity of Antibiotic Peptides 펩타이드Peptide 생육 최소저해농도 (μM)Growth Inhibitory Concentration (μM) C. 알비칸스 C. Albicans S. 세르비지애 S. Serbian T. 베이겔라이 T. Beigeilai HP (2-20)HP (2-20) 25.025.0 25.025.0 12.5∼25.012.5-25.0 서열번호 2의 항생 펩타이드Antibiotic Peptides of SEQ ID NO: 2 6.256.25 3.12∼6.253.12-6.25 3.123.12 멜리틴Melittin 3.123.12 3.123.12 3.12∼6.253.12-6.25

그 결과, 본 발명의서열번호 2로 기재되는 항생 펩타이드의 항진균 활성을 HP (2-20) 펩타이드와 비교하였을 때C. 알비칸스의 경우에는 HP (2-20) 펩타이드보다 4배 정도의 높은 항진균 활성을 보였고S. 세르비지애와T. 베이겔라이의 경우에는 4 내지 8배 정도의 높은 항진균 활성을 나타내었으며, 양성 대조군으로 사용한 멜리틴과 비슷한 정도의 항진균 활성을 나타냄을 확인하였다.As a result, as compared to the antifungal activity of the antimicrobial peptides described in SEQ ID NO: 2 of the present invention and HP (2-20) peptide C. For albicans it has showed a high antifungal activity of 4 times that of HP (2-20) peptide S. Serbia and T. In case of Beiglai, it showed high antifungal activity of about 4 to 8 times, and showed antifungal activity similar to that of melittin used as a positive control.

<3-2> 항진균 활성의 가시화<3-2> Visualization of Antifungal Activity

또한, 본 발명의 항생 펩타이드의 항진균 활성을 가시화하기 위하여,C. 알비칸스 균주를 PDB 배지에서 배양하여 얻은 2×103세포와 20 μM의 항생 펩타이드를 섞은 후 28℃에서 3시간 동안 배양한 다음, 배양액을 PDB 아가 플레이트에 도말하여 균주를 가시화시켰다.In addition, to visualize the antifungal activity of the antibiotic peptides of the present invention, C. 2 × 10 3 cells obtained by culturing Albicans strains in PDB medium and 20 μM of antibiotic peptide were mixed and incubated at 28 ° C. for 3 hours, and then the cultures were plated on PDB agar plates to visualize the strains.

그 결과,C. 알비칸스 균주에 HP (2-20)을 첨가한 플레이트에서는 많은 수의 콜로니를 발견할 수 있었으나(도 4의 A) 양성 대조군인 멜리틴과 본 발명의 항생펩타이드를 첨가한 경우에는 균의 성장이 완전히 억제되어 콜로니가 보이지 않음을 확인하였다(도 4의 B 및도 4의 C).As a result, C. On the plate added with HP (2-20) to the albicans strain, a large number of colonies could be found (A in FIG. 4 ) . However, when the melittin, which is a positive control, and the antibiotic peptide of the present invention, the growth of bacteria was completely inhibited colony was confirmed to have not shown (B and C in Fig. 4 in Fig. 4).

상기의 결과로부터, 본 발명의 항생 펩타이드는 HP (2-20) 펩타이드에 비해 탁월한 항진균 활성을 나타내며 양성 대조군으로 사용한 멜리틴과 비슷한 항진균 활성을 나타냄을 확인하였다.From the above results, it was confirmed that the antibiotic peptide of the present invention exhibited superior antifungal activity compared to HP (2-20) peptide and similar antifungal activity as melittin used as a positive control.

<실시예 4> 항생 펩타이드의 항암 활성 측정Example 4 Anticancer Activity of Antibiotic Peptides

본 발명의 항생 펩타이드의 항암 활성을 측정하기 위하여, 본 발명자들은 백혈병 세포주인 AML-2/WT와 위암 세포주인 SNU 638 및 SNU 668를 대상으로 MTT 분석을 수행하였다. 우선 2×105세포/㎖ 농도의 AML-2/WT 세포주와 5×104세포/㎖ 농도의 SNU 638 및 SNU 668 세포주 90 ㎕씩을 96-웰 플레이트에 분주하였다. 이때 음성 대조군으로는 배양액만을 넣은 것을 사용하였다. 플레이트를 잘 흔든 후 3일간 CO2배양기에서 배양하고 살아 있는 세포의 미토콘드리아 효소에 의해 생성된 포르마잔을 0.04 N HCl-이소프로판올 용액 100 ㎕로 잘 녹여서 ELISA 판독기를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 항생 펩타이드를 처리한 웰의 흡광도 값을 항생 펩타이드를 처리하지 않는 대조군 세포가 들어 있는 흡광도 값으로 나눈 백분율로 본 발명의 항생 펩타이드의 항암 활성도를 나타내었다.In order to measure the anticancer activity of the antibiotic peptide of the present invention, the present inventors performed MTT analysis on AML-2 / WT, a leukemia cell line, and SNU 638 and SNU 668, a gastric cancer cell line. First, 90 ml of AML-2 / WT cell line at 2 × 10 5 cells / ml and SNU 638 and SNU 668 cell lines at 5 × 10 4 cells / ml were dispensed into 96-well plates. At this time, only the culture solution was used as a negative control. The plate was shaken well and incubated in a CO 2 incubator for 3 days, and the formazan produced by the mitochondrial enzyme of living cells was dissolved in 100 μl of 0.04 N HCl-isopropanol solution, and the absorbance was measured at 540 nm using an ELISA reader. The anti-cancer activity of the antibiotic peptide of the present invention was shown as a percentage obtained by dividing the absorbance value of the well treated with antibiotic peptide by the absorbance value containing control cells not treated with antibiotic peptide.

그 결과,도 5에서 볼 수 있는 바와 같이 HP (2-20)은 실험한 모든 세포주에 대해서 항암 활성이 나타나지 않았다. 본 발명의 항생 펩타이드는 1 μM 농도까지는 항암 활성을 나타내지 않았으나 농도가 증가할수록 급격한 항암 활성을 나타내어 10 μM 이상의 농도에서는 암세포의 성장을 완전히 억제하였고, 양성 대조군으로 사용한 멜리틴과 비슷한 정도의 강한 항암활성을 나타냄을 확인하였다.As a result, as shown in Figure 5 HP (2-20) did not show anti-cancer activity against all the cell lines tested. Antibiotic peptide of the present invention did not show anticancer activity up to 1 μM concentration, but showed a rapid anticancer activity as the concentration was increased, completely inhibited the growth of cancer cells at a concentration of 10 μM or more, strong anticancer activity similar to the melittin used as a positive control It was confirmed that it represents.

<실시예 5> 항생 펩타이드의 세포 독성 측정Example 5 Cytotoxicity of Antibiotic Peptides

본 발명의 항생 펩타이드가 세포독성을 나타내는지를 확인하기 위하여, 본 발명자들은 항생 펩타이드의 적혈구 파괴능을 조사하였다.In order to confirm whether the antibiotic peptide of the present invention is cytotoxic, the present inventors examined the erythrocyte destructive capacity of the antibiotic peptide.

사람의 적혈구를 8%의 농도가 되도록 인산염 완충용액(PBS, pH 7.0)으로 희석하고 여기에 12.5 μM/웰 부터 1/2의 농도로 항생 펩타이드를 연속적으로 희석하여 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 후, 1,000 g로 원심분리하여 그 상등액 속에 포함된 헤모글로빈 양을 414 nm 파장에서 흡광도를 측정하여 조사하였다. 세포 파괴 정도를 조사하기 위하여 1% 트리톤-X100을 첨가하여 흡광도를 측정하였고, 1% 트리톤 X-100의 세포 파괴능을 100%로 하여 이를 각 항생 펩타이드의 적혈구 파괴능과 비교하여 하기수학식 1에 따라 계산하였다.Human red blood cells were diluted with phosphate buffer (PBS, pH 7.0) to 8% concentration, and antibiotic peptides were continuously diluted at 12.5 μM / well to 1/2 concentration and reacted at 37 ° C for 1 hour. Then, the amount of hemoglobin contained in the supernatant by centrifugation at 1,000 g was investigated by measuring the absorbance at 414 nm wavelength. In order to investigate the degree of cell destruction was measured for absorbance by the addition of 1% Triton -X100, 1% Triton, compared to the cell death function of X-100 to make 100% of red blood cells and this destruction function of each antimicrobial peptide expression (1) Calculated according to.

상기 식에서, 흡광도 A는 414 nm 파장에서 펩타이드 용액의 흡광도, 흡광도 B는 414 nm 파장에서 PBS의 흡광도 및 흡광도 C는 414 nm 파장에서 1% 트리톤 X-100의 흡광도를 나타낸다.In the above formula, absorbance A is the absorbance of the peptide solution at 414 nm wavelength, absorbance B is the absorbance of PBS at 414 nm wavelength and absorbance C is the absorbance of 1% Triton X-100 at 414 nm wavelength.

상기 식에 의한 적혈구 파괴능의 결과를 하기표 3에 나타내었다.The results of erythrocyte destructive ability according to the above formula are shown in Table 3 below.

항생 펩타이드의 세포 독성 측정Cytotoxicity of Antibiotic Peptides 펩타이드Peptide % 적혈구 파괴능 (μM)% Erythrocyte destructive capacity (μM) 12.512.5 6.256.25 3.1253.125 1.561.56 0.780.78 0.390.39 0.1950.195 0.0970.097 HP (2-20)HP (2-20) 00 00 00 00 00 00 00 00 서열번호 2의 항생 펩타이드Antibiotic Peptides of SEQ ID NO: 2 00 00 00 00 00 00 00 00 멜리틴Melittin 100100 100100 9595 9393 3131 00 00 00

그 결과, 본 발명의 HP (2-20)과서열번호 2로 기재되는 항생 펩타이드는 세포독성을 거의 나타내지 않는 반면에 양성 대조군으로 사용한 벌독인 멜리틴은 세포 독성이 매우 높게 나타남을 알 수 있었다.As a result, the antibiotic peptide described in HP (2-20) and SEQ ID NO: 2 of the present invention showed little cytotoxicity, whereas melittin, a bee venom used as a positive control, showed very high cytotoxicity.

<실시예 6> 랫트에 대한 비경구투여 급성 독성실험Example 6 Acute Toxicity of Parenteral Administration in Rats

6주령의 특정병원체부재(SPF) SD계 랫트를 사용하여 급성독성실험을 실시하였다. 군당 2 마리씩의 동물에 본 발명의서열번호 2로 기재되는 항생 펩타이드를 0.5% 메틸셀룰로즈 용액에 현탁하여 1 g/㎏/15 ㎖의 용량으로 단회 비경구투여하였다. 시험물질 투여후 동물의 폐사여부, 임상증상, 체중변화를 관찰하고 혈액학적 검사와 혈액생화학적검사를 실시하였으며, 부검하여 육안으로 복강장기와 흉강장기의 이상여부를 관찰하였다. 시험결과, 시험물질을 투여한 모든 동물에서 특기할 만한 임상증상이나 폐사된 동물은 없었으며, 체중변화, 혈액검사, 혈액생화학 검사, 부검소견 등에서도 독성변화는 관찰되지 않았다. 이상의 결과 실험된 본 발명의 항생 펩타이드는 랫트에서 5 ㎎/㎏까지 독성변화를 나타내지 않으며 비경구투여 최소치사량(LD50)은 10 ㎎/㎏ 이상인 안전한 물질로 판단되었다.Acute toxicity test was performed using 6-week-old SPF SD rats. Two animals per group were suspended parenterally with an antibiotic peptide set forth in SEQ ID NO: 2 of the present invention in 0.5% methylcellulose solution at a dose of 1 g / kg / 15 ml. After administration of the test substance, mortality, clinical symptoms, and changes in body weight were observed. Hematological and hematological examinations were performed. Necropsy was performed to observe abdominal and thoracic organ abnormalities. As a result, there were no clinical symptoms or deaths in all animals treated with the test substance, and no toxicity change was observed in weight change, blood test, blood biochemistry test, autopsy findings, etc. As a result, the antibiotic peptide of the present invention tested did not show a toxicity change in rats up to 5 mg / kg and the parenteral administration minimum dose (LD 50 ) was determined to be a safe substance of 10 mg / kg or more.

상기의 결과로부터, 본 발명의서열번호 2로 기재되는 항생 펩타이드는 그람 양성균 및 그람 음성균 모두에서 탁월한 항균작용을 나타내었고 진균에 대해서도 높은 항진균 활성을 나타내었으며 암세포에 대한 항암 작용이 우수하고 또한 세포독성을 나타내지 않으므로, 인체에 안전한 항생제 및 항암제로 유용하게 사용될 수 있다.From the above results, the antibiotic peptide described in SEQ ID NO: 2 of the present invention showed excellent antimicrobial activity in both Gram-positive bacteria and Gram-negative bacteria, high antifungal activity against fungi, and excellent anti-cancer activity against cancer cells and cytotoxicity. Since it does not represent, it can be usefully used as a safe antibiotic and anticancer agent for the human body.

<110> HAHM, Kyung-Soo LEE, Dong Gun <120> Novel antibiotic peptide derived from ribosomal protein L1 of Helicobacter pylori and use thereof <160> 2 <170> KopatentIn 1.55 <210> 1 <211> 19 <212> PRT <213> Helicobacter pylori <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> 2-20 amino acid sequence of RPL1 protein from amino-terminal end <400> 1 Ala Lys Lys Val Phe Lys Arg Leu Glu Lys Leu Phe Ser Lys Ile Gln 1 5 10 15 Asn Asp Lys <210> 2 <211> 19 <212> PRT <213> Helicobacter pylori <400> 2 Ala Lys Lys Val Phe Lys Arg Leu Glu Lys Leu Phe Ser Lys Ile Trp 1 5 10 15 Asn Trp Lys<110> HAHM, Kyung-Soo LEE, Dong Gun <120> Novel antibiotic peptide derived from ribosomal protein L1 of Helicobacter pylori and use approximately <160> 2 <170> KopatentIn 1.55 <210> 1 <211> 19 <212> PRT <213> Helicobacter pylori <220> <221> PEPTIDE <222> (1) .. (19) 2-20 amino acid sequence of RPL1 protein from amino-terminal end <400> 1 Ala Lys Lys Val Phe Lys Arg Leu Glu Lys Leu Phe Ser Lys Ile Gln 1 5 10 15 Asn Asp Lys <210> 2 <211> 19 <212> PRT <213> Helicobacter pylori <400> 2 Ala Lys Lys Val Phe Lys Arg Leu Glu Lys Leu Phe Ser Lys Ile Trp 1 5 10 15 Asn Trp Lys

Claims (9)

서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 펩타이드 HP (2-20)의 17번째 아미노산인 글루타민과 19번째 아미노산인 아스파라긴산을 각각 소수성 아미노산인 트립토판으로 치환시킴으로써 소수성 부위가 증가된 양친화성 구조를 가지는 것을 특징으로 하는,서열번호 2기재의 항생 펩타이드.Characterized by having an amphiphilic structure with increased hydrophobic sites by substituting glutamine, the 17th amino acid, and asparagine, the 19th amino acid, of tryptophan, the peptide HP (2-20), having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 An antibiotic peptide according to SEQ ID NO: 2 . 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 제 1항의 항생 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항균 및 항진균용 약학적 조성물.Antimicrobial and antifungal pharmaceutical composition comprising the antibiotic peptide of claim 1 as an active ingredient. 제 1항의 항생 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항암용 약학적 조성물.A pharmaceutical composition for anticancer comprising the antibiotic peptide of claim 1 as an active ingredient. 삭제delete
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