KR100368073B1 - Preparation of Peptides by Use of Human Glucagon Sequence as a Fusion Expression Partner - Google Patents

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KR100368073B1 KR10-1999-0007641A KR19990007641A KR100368073B1 KR 100368073 B1 KR100368073 B1 KR 100368073B1 KR 19990007641 A KR19990007641 A KR 19990007641A KR 100368073 B1 KR100368073 B1 KR 100368073B1
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Abstract

본 발명은 자가결합성이 강한 펩타이드를 융합파트너로 포함하는X G -L-Y형의 융합단백질을 이용하여 재조합 단백질 또는 펩타이드를 효과적으로 제조하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for effectively preparing a recombinant protein or peptide using a fusion protein of the X G -LY type comprising a strong self-binding peptide as a fusion partner.

X G : 융합파트너 (사람 글루카곤 단백질 또는 그 유사체의 전체 또는 부분의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드) X G : Fusion partner (polypeptide comprising amino acid sequence of all or part of human glucagon protein or analogue thereof)

L: 링커 (코돈을 맞추기 위한 배열 또는 펩타이드 절단효소의 인식 배열) L : linker (sequence for codon alignment or recognition sequence for peptide cleavage)

Y: 재조합 단백질 또는 펩타이드 Y : recombinant protein or peptide

보다 상세하게는, 사람 글루카곤 단백질 또는 그 유사체의 전체 또는 부분의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 융합파트너로 하는 융합단백질을 코딩하는 유전자, 유전자를 포함하는 벡터, 그 벡터로 형질전환된 미생물, 그리고 융합단백질의 제조방법에 관한 것으로서, 본 발명에 의하면 재조합 단백질의 세포내 생산수율과 응집체내의 순도를 극대화할 수 있을 뿐 아니라 분리된 응집체가 변성제 및 환원제 등을 사용하지 않고도 쉽게 수용성화될 수 있다.More specifically, a gene encoding a fusion protein comprising a polypeptide comprising an amino acid sequence of all or part of a human glucagon protein or an analog thereof as a fusion partner, a vector comprising the gene, a microorganism transformed with the vector, and The present invention relates to a method for preparing a fusion protein, and according to the present invention, it is possible to maximize the intracellular production yield and purity of the aggregate of the recombinant protein, and the separated aggregate can be easily water-soluble without using denaturing agent or reducing agent.

Description

융합파트너를 이용한 재조합 단백질의 제조방법{Preparation of Peptides by Use of Human Glucagon Sequence as a Fusion Expression Partner}Preparation method of recombinant protein using fusion partner {Preparation of Peptides by Use of Human Glucagon Sequence as a Fusion Expression Partner}

본 발명은 자가결합성이 강한 펩타이드를 융합파트너로 포함하는X G -L-Y형의 융합단백질을 이용하여 재조합 단백질 또는 펩타이드를 효과적으로 제조하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for effectively preparing a recombinant protein or peptide using a fusion protein of the X G -LY type comprising a strong self-binding peptide as a fusion partner.

X G : 융합파트너 (사람 글루카곤 단백질 또는 그 유사체의 전체 또는 부분의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드) X G : Fusion partner (polypeptide comprising amino acid sequence of all or part of human glucagon protein or analogue thereof)

L: 링커 (코돈을 맞추기 위한 배열 또는 펩타이드 절단 효소의 인식 배열) L : linker (sequence for codon alignment or recognition sequence for peptide cleavage enzyme)

Y: 재조합 단백질 또는 펩타이드 Y : recombinant protein or peptide

보다 상세하게는, 본 발명은 사람 글루카곤 단백질 또는 그 유사체의 전체 또는 부분의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 융합파트너로하는 융합단백질을 코딩하는 유전자, 유전자를 포함하는 벡터, 그 벡터로 형질전환된 미생물, 그리고 융합단백질의 제조방법에 관한 것이다.More specifically, the present invention provides a gene encoding a fusion protein comprising a polypeptide comprising an amino acid sequence of all or part of a human glucagon protein or an analog thereof as a fusion partner, a vector comprising the gene, and a vector transformed with the vector. It relates to a microorganism and a method for producing a fusion protein.

유전자 재조합 방법으로 사람 또는 동물장기에서 어렵게 얻어지던 여러 가지 중요한 단백질들을 미생물에서 생산하려면 목적 단백질의 유전자를 발현 벡터에 클로닝하여 재조합 발현벡터를 얻고 이를 적당한 숙주세포에 형질전환시켜 배양하여야 한다. 대장균은 다른 생물체에 비하여 그의 유전자와 대사체계에 대한 정보가 가장 많이 알려져 있어 유전자 재조합 기술에 의하여 유용한 외래 단백질을 생산하기 위한 숙주로 많이 이용되고 있다. 그러나 목적 단백질을 대장균에서 직접 발현시키는 경우, N-말단에 메티오닌(methionine)이 첨가된 형태로 만들어져 이를 천연형 단백질로 전환시키는 단계가 필요한데, 이는 목적단백질의 N-말단에 메티오닌이첨가된 상태로 인간이나 기타 동물에 적용되는 경우 면역 반응(immunogenecity)이 유발되거나, 구조가 불안정하여 본래의 단백질 기능을 수행하지 못하는 경우가 발생할 수 있기 때문이다. 또한, 발현되는 단백질이 항세균성 펩타이드 (antibacterial peptide)와 같이 매우 독성이 강한 경우 숙주의 성장을 저해하기도 하고, 분자량 10,000 이하의 작은 크기의 폴리펩타이드의 경우 숙주세포에 존재하는 단백질 분해효소에 의해 분해되어 안정적인 대량생산이 어렵게 된다.In order to produce a variety of important proteins that are difficult to obtain in human or animal organs by genetic recombination method in microorganisms, the gene of the target protein is cloned into an expression vector to obtain a recombinant expression vector and transformed into appropriate host cells and cultured. Escherichia coli has the most known information about its genes and metabolism compared to other organisms, and is used as a host for producing useful foreign proteins by genetic recombination technology. However, when the target protein is directly expressed in E. coli, it is necessary to make a form in which methionine is added to the N-terminus and convert it to a native protein, which is added to the N-terminus of the target protein. When applied to humans or other animals, the immune response (immunogenecity) may be induced or the structure may be unstable to perform the original protein function. In addition, when the expressed protein is highly toxic such as an antibacterial peptide, it may inhibit the growth of the host, and in the case of a polypeptide having a molecular weight of 10,000 or less, it is degraded by protease present in the host cell. As a result, stable mass production becomes difficult.

이러한 현상을 해결하기 위한 방법으로 목적 단백질의 N-말단에 적절한 융합파트너을 융합시켜 발현시키는 방법이 이용된다. 구체적으로는, 선택된 숙주에서 안정적으로 생산되는 것으로 알려진 수용성 단백질을 융합파트너로 이용하여 목적하는 폴리펩타이드를 생산하는 것이 그 한 방법이다. 지금까지 대장균에서 안정적으로 대량생산되는 것으로 알려진 수용성 단백질로는 베타-갈락토시다제(β-galactosidase), 말토오즈 결합단백질(maltose binding protein, 45 kDa), 글루타치온-에스-전달효소 (glutathione-S-transferase, 26 kDa) 등이 있다. 그러나 상기 단백질을 융합파트너로 이용하는 경우 이들 융합단백질은 친화 크로마토그래피(affinity chromatography) 등으로 용이하게 정제될 수 있는 장점이 있는 반면, 융합파트너가 제조하고자 하는 폴리펩타이드에 비해 상대적으로 크기가 커서 융합 부분의 크기에 따라 펩타이드의 수율이 현저히 떨어진다는 단점이 있다. 또한, 발현된 융합단백질이 세포 독성을 그대로 유지하는 경우 효과적인 제조방법으로 이용될 수 없다.As a method for solving this phenomenon, a method of fusion expressing an appropriate fusion partner at the N-terminus of the target protein is used. Specifically, one method is to produce a desired polypeptide using a water-soluble protein known to be stably produced in a selected host as a fusion partner. Soluble proteins known to be stably mass-produced in Escherichia coli up to now include beta-galactosidase (beta-galactosidase), maltose binding protein (45 kDa), and glutathione-S-transferase (glutathione-S). -transferase, 26 kDa). However, when using the protein as a fusion partner, these fusion proteins have an advantage that can be easily purified by affinity chromatography, etc., while the fusion partner is relatively large in size compared to the polypeptide to be prepared by the fusion partner According to the size of the peptide has a disadvantage in that the yield is significantly reduced. In addition, the expressed fusion protein can not be used as an effective production method when the cytotoxicity is maintained as it is.

또다른 방법으로는 융합파트너를 이용, 목적 폴리펩타이드를 세포 내에 불용성 응집체 (inclusion bodies)의 형태로 발현시키는 방법이 사용될 수 있다(Ulman, A. 1984, Gene 29, 27-31; Nilsson, B. et al. 1985, EMBO J. 4, 1075-1080; Di Guan et al. 1988, Gene 67, 21-30; La Vallie, E.R. et al. 1993, Bio/Technology 11, 187-193). 이 방법은 목적 재조합 단백질이 초기 분리과정에서 세포 배양액으로부터 용이하게 분리될 수 있다는 장점이 있으나, 응집체 형성 과정 중 발현된 폴리펩타이드(peptide)의 폴딩(folding) 중간체가 분자 상호간의 다이설파이드 결합 (intermolecular disulfide bond) 또는 소수성 상호작용(hydrophobic interaction)에 의해 숙주세포의 다른 단백질 불순물들(샤프론(chaperon), 라이보좀(ribosome), 초기인자 등)과 비선택적으로 결합함으로써 목적 폴리펩타이드의 응집체 내 순도가 떨어지는 단점이 있다(Anna Mituraki et al., 1989,Bio/Technol. 7, 690-697).Alternatively, a fusion partner can be used to express the desired polypeptide in the form of insoluble aggregates in cells (Ulman, A. 1984, Gene 29, 27-31; Nilsson, B.). et al. 1985, EMBO J. 4, 1075-1080; Di Guan et al. 1988, Gene 67, 21-30; La Vallie, ER et al. 1993, Bio / Technology 11, 187-193). This method has the advantage that the recombinant protein of interest can be easily separated from the cell culture during the initial separation process, but the intermediates of the folding of the polypeptide expressed during the formation of aggregates are intermolecular. Purity in aggregates of the desired polypeptide by non-selective binding with other protein impurities (chaperon, ribosome, early factor, etc.) of the host cell by disulfide bond or hydrophobic interaction. There is a downside (Anna Mituraki et al., 1989, Bio / Technol. 7 , 690-697).

단백질이 불용성 응집체로 생산될 경우 이로부터 활성형 단백질을 순수 분리해내기 위해서는 일반적으로 구아니딘-하이드로클로라이드(guanidine hydrochloride), 요소(urea) 등의 변성제 (denaturant)를 사용하여 용해시킨 후 희석을 통한 리폴딩 (refolding)과정을 거쳐야 한다. 다이설파이드 결합에 의해 생성된 응집체의 경우는 용해를 위해 환원제(reducing agent)까지 함께 사용하여 처리해야 할 뿐 아니라 리폴딩 공정에 아직까지 많은 문제점이 있어 생산수율을 감소시키는 주요 원인이 되기도 한다(Marston, F. A. O. 1986,Biochem. J.240, 1-12; Mitraki, A. and King, J. 1989,Bio/Technology7, 690-697).When the protein is produced as insoluble aggregates, in order to purely separate the active protein therefrom, it is generally dissolved using a denaturant such as guanidine hydrochloride or urea, followed by dilution through dilution. You have to go through the refolding process. In the case of aggregates produced by disulfide bonds, not only must they be treated together with a reducing agent for dissolution, but there are still many problems in the refolding process, which may be a major cause of reduced production yield (Marston FAO 1986, Biochem.J . 240, 1-12; Mitraki, A. and King, J. 1989, Bio / Technology 7, 690-697).

사람 글루카곤(glucagon)은 췌장의 랑겔한스 알파 세포 (α-cells of the islets of Langerhans)로부터 분비되어 인슐린과의 길항작용에 의해 혈액 내의 포도당 농도를 조절하는 호르몬으로, 저혈당 치료제 또는 내시경 및 X 선 진단보조제로 미국, 일본 등지에서 이미 상업화되어 있는 펩타이드 호르몬이다. 또한 글루카곤은 29개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드로 대장균 내에서 융합단백질의 형태로 높은 발현율을 가지고 안정적으로 생산되는 것으로 알려져 있다 (Shin et al. 1998, Appl. Microbiol. Biotechnol. 49, 364-370). 이처럼 글루카곤은 작은 펩타이드(3.5 kDa) 임에도 불구하고 X-ray 분석 결과 알파-나선구조 (α helix)를 이루고 있으며 안정한 상태를 유지하기 위하여 분자간의 강한 소수성 결합에 의해 스스로 올리고머 (oligomer)를 형성하고 있다(Sasaki, K. et al. 1975 Nature 257, 751-757). 따라서 소수성 자가결합성(hydrophobic self-association)이 강하면서도 작은 크기의 펩타이드인 글루카곤은 세포내 생산수율을 향상시키는 동시에 목적 단백질이 고순도로 포함된 응집체를 생산하기위한 융합파트너로서 매우 효과적으로 이용될 수 있다.Human glucagon is a hormone secreted from the pancreatic Langerhans alpha cells (α-cells of the islets of Langerhans) that regulates glucose levels in the blood by antagonism with insulin, a hypoglycemic drug or endoscopy and X-ray diagnosis As a supplement, it is a peptide hormone already commercialized in the United States and Japan. In addition, glucagon is a peptide consisting of 29 amino acids and is known to be stably produced in the form of a fusion protein in Escherichia coli (Shin et al. 1998, Appl. Microbiol. Biotechnol. 49, 364-370). Although glucagon is a small peptide (3.5 kDa), X-ray analysis shows alpha helix and forms oligomers by strong hydrophobic bonds between molecules in order to maintain a stable state. (Sasaki, K. et al. 1975 Nature 257, 751-757). Therefore, glucagon, a small-sized peptide with strong hydrophobic self-association, can be effectively used as a fusion partner to produce aggregates containing high purity of target protein while improving intracellular production yield. .

이에 본 발명자들은 재조합 대장균으로부터 외래 단백질을 불용성 응집체의 형태로 안정적으로 대량 생산하기 위해 자가결합성이 강한 사람 글루카곤 또는 그 유사체의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 N-말단의 융합파트너로 이용하여 재조합 단백질의 세포내 생산수율과 응집체내 순도를 극대화하는 제조방법을 개발함은 물론 분리된 응집체가 변성제 및 환원제 등을 전혀 사용하지 않고도 알칼리용액에서 쉽게 수용성화된다는 사실을 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.Accordingly, the present inventors recombined a polypeptide containing an amino acid sequence of human glucagon or an analog of strong self-combination as a fusion partner of N-terminal to stably mass-produce foreign proteins from recombinant E. coli in the form of insoluble aggregates. The present invention was completed by developing a method for maximizing intracellular production yield and purity of aggregates as well as finding that the aggregates are easily soluble in an alkaline solution without using any denaturing agent or reducing agent.

본 발명은 재조합 대장균으로부터 목적 단백질을 불용성 응집체의 형태로 생산하는데 있어, 배양액 내 생산 수율 및 응집체 내 목적 단백질의 순도를 높이며 생성된 불용성 응집체를 변성제나 환원제를 사용하지 않고도 활성단백질로 분리해 내는, 융합단백질의 형태로 재조합 단백질을 제조하는 방법을 제공함을 목적으로 한다.The present invention is to produce the target protein from the recombinant E. coli in the form of insoluble aggregates, to improve the production yield in the culture medium and the purity of the target protein in the aggregate and to separate the resulting insoluble aggregates into active proteins without using denaturing or reducing agents, It is an object of the present invention to provide a method for preparing a recombinant protein in the form of a fusion protein.

도 1은 발현 벡터 pT7IL-2의 제조과정을 나타낸 것이고, Figure 1 shows the manufacturing process of the expression vector pT7IL-2,

도 2는 발현 벡터 pT1GIL-2의 제조과정을 나타낸 것이며, Figure 2 shows the manufacturing process of the expression vector pT1GIL-2,

도 3은 발현 벡터 pT2GIL-2의 제조과정을 나타낸 것이고, Figure 3 shows the manufacturing process of the expression vector pT2GIL-2,

도 4는 발현 벡터 pG1IL-2의 제조과정을 나타낸 것이며, Figure 4 shows the manufacturing process of the expression vector pG1IL-2,

도 5는 발현 벡터 pG2IL-2의 제조과정을 나타낸 것이고, Figure 5 shows the manufacturing process of the expression vector pG2IL-2,

도 6은 발현 벡터 pG3IL-2의 제조과정을 나타낸 것이며, Figure 6 shows the manufacturing process of the expression vector pG3IL-2,

도 7은 각 발현 벡터로 형질전환된 대장균에서 생산되는 재조합 단백질의 세포내 발현율 (expression level, %)을 나타낸 것이고, Figure 7 shows the expression level (%) of the intracellular expression of recombinant protein produced in E. coli transformed with each expression vector,

도 8은 각 대장균 형질전환체의 배양액으로부터 회수된 불용성 침전체내에 포함된 재조합 단백질의 함량 (순도, %)을 나타낸 것이며, 8 shows the content (purity,%) of the recombinant protein contained in the insoluble precipitate recovered from the culture medium of each E. coli transformant,

도 9는 각 대장균 형질전환체의 배양액으로부터 회수된 융합단백질 침전체의 알칼리 용액에서의 용해도 (%)를 나타낸 것이고, 9 shows the solubility (%) in the alkaline solution of the fusion protein precipitate recovered from the culture medium of each E. coli transformant,

도 10은 각 대장균 형질전환체의 배양액으로부터 회수된 융합단백질 침전체를 비환원성 SDS-PAGE로 분리한 뒤, 웨스턴 블럿(Western blot)을 수행한 결과를나타낸 것이며, Figure 10 shows the result of performing Western blot after separating the fusion protein precipitate recovered from the culture medium of each E. coli transformant by non-reducing SDS-PAGE,

A)레인 1: 분자량 크기 마커A) lane 1: molecular weight size marker

레인 2: 발현 벡터 pT7IL-2로 형질전환된 대장균이 생산한 응집체Lane 2: aggregate produced by Escherichia coli transformed with the expression vector pT7IL-2

B)레인 1: 분자량 크기 마커B) lane 1: molecular weight size marker

레인 2: 발현 벡터 pT1GIL-2로 형질전환된 대장균이 생산한 응집체Lane 2: aggregate produced by Escherichia coli transformed with the expression vector pT1GIL-2

레인 3: 발현 벡터 pT2GIL-2로 형질전환된 대장균이 생산한 응집체Lane 3: aggregate produced by Escherichia coli transformed with the expression vector pT2GIL-2

레인 4: 발현 벡터 pG1IL-2로 형질전환된 대장균이 생산한 응집체Lane 4: aggregate produced by E. coli transformed with the expression vector pG1IL-2

레인 5: 발현 벡터 pG2IL-2로 형질전환된 대장균이 생산한 응집체Lane 5: aggregate produced by Escherichia coli transformed with the expression vector pG2IL-2

레인 6: 발현 벡터 pG3IL-2로 형질전환된 대장균이 생산한 응집체Lane 6: aggregate produced by Escherichia coli transformed with the expression vector pG3IL-2

도 11은 각 대장균 형질전환체의 배양액으로부터 회수된 융합단백질 침전체를 비환원성 SDS-PAGE로 분리한 뒤 수행한 웨스턴 블럿(Western blot) 분석결과로부터 동일 재조합 단백질 분자 간의 결합체가 차지하는 비율을 분석하여 나타낸 것이다. 11 is a ratio of the conjugates between the same recombinant protein molecules from the Western blot analysis performed after separating the fusion protein precipitate recovered from the culture medium of each E. coli transformant by non-reducing SDS-PAGE It is shown.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 자가결합성이 강한 사람 글루카곤 또는 그 유사체의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 융합파트너로 이용하여 목적 단백질을 대장균으로부터 고순도, 고수율로 제조하는 방법을 제공한다. 구체적으로 본 발명은 사람 글루카곤과 사람 종양괴사인자(human tumor necrosis factor) 유래의 이종(異種)의 펩타이드로 이루어진 혼성 폴리펩타이드를 융합파트너로 이용하거나, 사람 글루카곤의 아미노산 서열만이 1∼3 번 반복되는 폴리펩타이드를 융합파트너로 이용하여 재조합 단백질을 고순도의 불용성 응집체(inclusion body)의 형태로 대량생산하는 제조방법을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a method for producing a target protein from Escherichia coli with high purity and high yield using a polypeptide comprising an amino acid sequence of human glucagon or its analog having strong self-binding ability as a fusion partner. . Specifically, the present invention uses a hybrid polypeptide consisting of a heterologous peptide derived from human glucagon and human tumor necrosis factor as a fusion partner, or repeats only one to three amino acid sequences of human glucagon. Provided is a method for mass-producing a recombinant protein in the form of a high purity insoluble aggregate (inclusion body) using the polypeptide as a fusion partner.

융합파트너를 이루는 글루카곤은 전체 또는 일부의 아미노산 서열이 이용될 수 있으며, 나아가 일부분이 변형된 유사체를 사용하여도 동일한 효과를 거둘 수있다.The glucagon constituting the fusion partner may use all or part of an amino acid sequence, and furthermore, the same effect may be achieved by using an analog in which a part is modified.

글루카곤과 함께 융합파트너를 이루는 사람 종양괴사인자 또는 그 뮤테인은 전체 아미노산 서열 또는 그 일부분이 포함될 수 있으며, 이에 더하여 재조합 단백질의 분리를 용이하게 하기 위하여 폴리히스티딘 서열이 융합파트너에 포함될 수 있다.Human tumor necrosis factor or its mutein forming a fusion partner with glucagon may include the entire amino acid sequence or a portion thereof, and in addition, a polyhistidine sequence may be included in the fusion partner to facilitate separation of the recombinant protein.

또한 상기의 융합파트너 단백질에는 엔테로키나아제 절단부위가 포함된 펩타이드가 링커로 이용될 수 있다.In addition, a peptide containing an enterokinase cleavage site may be used as a linker in the fusion partner protein.

한편 본 발명은 상기 융합파트너를 포함하는 재조합 플라스미드를 이용하여 미생물에서 사람의 단백질 또는 그의 유사체를 얻는 방법을 제공한다. 특히 본 발명은 상기와 같은 방법으로 대량생산한 재조합 단백질의 불용성 응집체를 알칼리 용액으로 용해한 다음 pH를 다시 중성으로 복원함으로써 간단히 재조합 단백질을 재활성화하여 정제하는 방법을 제공한다.Meanwhile, the present invention provides a method for obtaining a human protein or an analog thereof from a microorganism using a recombinant plasmid including the fusion partner. In particular, the present invention provides a method of simply reactivating and purifying a recombinant protein by dissolving insoluble aggregates of the recombinant protein mass-produced in the above manner in an alkaline solution and then restoring the pH to neutral again.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명은 분자량 3.5 kDa의 펩타이드 호르몬이며 대장균 내에서 가용성 단백질로서 안정적으로 발현되는 사람 글루카곤을 이용하여 재조합 단백질을 융합단백질의 형태로 생산한다.The present invention produces a recombinant protein in the form of a fusion protein using human glucagon, which is a peptide hormone having a molecular weight of 3.5 kDa and stably expressed as a soluble protein in E. coli.

글루카곤은 29개의 아미노산으로 구성된 알파-나선구조를 가지고 있는 펩타이드로서 대장균 내에서 안정적으로 발현되는 펩타이드 호르몬이다. 더욱이 글루카곤은 특유의 알파-나선구조를 안정하게 유지하기 위해 소수성 결합에 의해 스스로 올리고머를 형성하는 자가결합성향이 강하므로 융합파트너로서 효과적으로 이용될 수 있다. 구체적으로 본 발명은서열목록 1의 아미노산 서열을 갖는 사람 글루카곤의 전체 또는 일부를 포함하는 폴리펩타이드를 융합파트너로 이용하여 재조합 단백질을 생산한다.Glucagon is a peptide with an alpha-helix structure consisting of 29 amino acids and is a peptide hormone stably expressed in Escherichia coli. Furthermore, glucagon can be effectively used as a fusion partner because it has a strong self-bonding tendency to form oligomers by hydrophobic bonds in order to maintain a unique alpha-helix structure. Specifically, the present invention produces a recombinant protein using a polypeptide including all or part of human glucagon having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 as a fusion partner.

더욱 상세하게는 본 발명은 아래와 같이서열목록 1의 글루카곤 아미노산 서열 (G 펩타이드)을 포함하는 다양한 펩타이드/폴리펩타이드를 융합파트너로 이용하여 재조합 단백질을 생산하는 제조방법을 제공한다.More specifically, the present invention provides a method for producing a recombinant protein using various peptides / polypeptides including the glucagon amino acid sequence (G peptide) of SEQ ID NO: 1 as a fusion partner as follows.

1) N-말단으로부터, [사람 종양괴사인자의 아미노산 서열 중 N-말단의 1번째에서 57번째의 아미노산으로 구성된 펩타이드 (T1 펩타이드)]-[G-펩타이드]-[폴리히스티딘 서열 (His6)]의 순으로 구성된 폴리펩타이드 (융합파트너 T1G)1) From N-terminus [peptide (T1 peptide) consisting of amino acids 1-57 of the N-terminus of human tumor necrosis factor (T1 peptide)]-[G-peptide]-[polyhistidine sequence (His6)] Polypeptides consisting of ( fusion partner T1G )

2) N-말단으로부터, [사람 종양괴사인자의 아미노산 서열 중 N-말단의 8번째에서 12번째의 아미노산으로 구성된 펩타이드 (T2 펩타이드)]-[폴리히스티딘 서열 (His10)]-[G 펩타이드]의 순으로 구성된 펩타이드 (융합파트너 T2G)2) From N-terminus of [peptide (T2 peptide) consisting of the 8th to 12th amino acids of N-terminus among amino acid sequences of human tumor necrosis factor]]-[polyhistidine sequence (His10)]-[G peptide] Peptide Consisting in Sequence ( Fusion Partner T2G )

3) N-말단으로부터, [G 펩타이드]-[폴리히스티딘 서열 (His6)]의 순으로 구성된 펩타이드 (융합파트너 G1)3) Peptide ( fusion partner G1 ) consisting of [G peptide]-[polyhistidine sequence (His6)] from N-terminus

4) N-말단으로부터, [G 펩타이드가 연속 2번 반복된 펩타이드 (G2 펩타이드)]-[폴리히스티딘 서열 (His6)]의 순으로 구성된 펩타이드 (융합파트너 G2)4) Peptide ( fusion partner G2 ) consisting of [peptide G peptide repeated twice (G2 peptide)]-[polyhistidine sequence (His6)] from N-terminus

5) N-말단으로부터, [G 펩타이드가 연속 3번 반복된 펩타이드 (G3 펩타이드)]-[폴리히스티딘 서열 (His6)]의 순으로 구성된 펩타이드 (융합파트너 G3)5) Peptide ( fusion partner G3 ) consisting of [peptide G repeats three times in a row (G3 peptide)]-[polyhistidine sequence (His6)] from the N-terminus

상기의 폴리히스티딘 서열은 금속 친화성 및 낮은 pH에서 히스티딘이 양전하를 띄는 성질을 이용하여 금속 킬레이트 수지 (metal chelating resin), 양이온 교환수지 등을 이용하여 융합단백질이 용이하게 정제되도록 한다.The polyhistidine sequence allows the fusion protein to be easily purified by using a metal chelating resin, a cation exchange resin, etc. by using a positive charge of histidine at a metal affinity and low pH.

본 발명에서는 사람 인터루킨-2(interleukine-2)를 모델단백질로 하여 상기 5가지 융합파트너들을 이용, 사람 인터루킨-2를 융합단백질의 형태로 고수율로 발현시키며 고순도의 단백질 응집체를 생산한다. 융합단백질을 생산하는 재조합 발현벡터의 제조방법을 구체적으로 살펴보면,In the present invention, human interleukin-2 is used as a model protein to express human interleukin-2 in the form of a fusion protein by using the above five fusion partners and produces high purity protein aggregates. Looking at the method of producing a recombinant expression vector to produce a fusion protein in detail,

1) 먼저, 사람 인터루킨-2를 코딩하는 유전자를 중합효소연쇄반응 (Polymerase Chain Reaction, PCR)으로 증폭하고,1) First, the gene encoding human interleukin-2 is amplified by polymerase chain reaction (PCR),

2) 준비된 DNA를 T7 프로모터를 포함하는 pT7-7 벡터에 삽입하여 상기 인터루킨-2를 생산할 수 있는 발현벡터 pT7IL-2를 제조하며,2) preparing the expression vector pT7IL-2 capable of producing the interleukin-2 by inserting the prepared DNA into the pT7-7 vector including the T7 promoter,

3) 다음, 상기 5가지 융합파트너 (T1G, T2G, G1, G2, G3) 각각의 C-말단 부분에 엔테로키나제(enterokinase) 절단 부위인 Asp Asp Asp Asp Lys(DDDDK, 이하 D4K라 한다)가 첨가된 폴리펩타이드를 코딩하는 염기 서열을 PCR로 증폭한 다음,3) Next, Asp Asp Asp Asp Lys (DDDDK, hereinafter referred to as D4K), which is an enterokinase cleavage site, is added to the C-terminal portion of each of the five fusion partners (T1G, T2G, G1, G2, and G3). PCR amplifies the nucleotide sequence encoding the polypeptide, and then

4) 상기 증폭된 DNA단편을 발현벡터 pT7IL-2내에 있는 인터루킨-2 유전자의5'-말단 부분에 삽입하여 인터루킨-2가 상기 D4K 서열을 포함하는 융합단백질로 발현된 후 분리정제 과정에서 엔테로키나제에 의한 절단으로 인터루킨-2 만이 분리되어 생산될 수 있는 벡터를 제조한다 (pT1GIL-2, pT2GIL-2, pGIL-2, pG2IL-2, pG3IL-2).4) The amplified DNA fragment was inserted into the 5'-terminal portion of the interleukin-2 gene in the expression vector pT7IL-2, whereby interleukin-2 was expressed as a fusion protein containing the D4K sequence, followed by enterokinase in the purification process. Cleavage by means of a vector produces a vector in which only interleukin-2 can be isolated and produced (pT1GIL-2, pT2GIL-2, pGIL-2, pG2IL-2, pG3IL-2).

이외에도 상기 융합파트너들 각각의 C-말단에 엔테로키나제 절단부위가 첨가된 폴리펩타이드 유전자를 코우딩하는 DNA를, lac, trp, tac, pL, T3, T7, SP6, SV40, λ(pL/pR) 등의 적당한 프로모터를 갖는 벡터에 직접 삽입하거나, 또는 이들 프로모터와 리보좀 결합부위를 갖는 DNA를 상기 폴리펩타이드(융합파트너-D4K) DNA와 결합시킨 후, 다양한 플라스미드에 삽입하여 벡터 시스템을 구축할 수 있다.In addition, DNA encoding the polypeptide gene having the enterokinase cleavage site added to the C-terminus of each of the fusion partners is lac, trp, tac, pL, T3, T7, SP6, SV40, λ (pL / pR). The vector system can be constructed by directly inserting into a vector having a suitable promoter, or by combining DNAs having these promoters with ribosome binding sites with the polypeptide (fusion partner-D4K) DNA, and then inserting them into various plasmids. .

이 벡터 DNA의 3' 말단쪽에 원하는 단백질 또는 펩타이드를 코딩하는 DNA를 삽입하여 발현벡터 시스템을 구축한 후, 그 발현벡터를 적당한 숙주에 도입하여 만들어진 형질전환체를 배양하여 융합단백질을 생산할 수 있다.After constructing the expression vector system by inserting the DNA encoding the desired protein or peptide into the 3 'end of the vector DNA, the fusion protein can be produced by culturing the transformant prepared by introducing the expression vector into a suitable host.

본 발명에서는 상기 인터루킨-2 융합단백질을 생산하는 발현 벡터들을 적당한 숙주에 하나한 (Hanahan, D. 1985,DNA Cloning1, 109-135, IRS press)의 방법으로 도입하여 형질전환체를 제조하였다.In the present invention, transformants were prepared by introducing the expression vectors producing the interleukin-2 fusion protein into a suitable host (Hanahan, D. 1985, DNA Cloning 1, 109-135, IRS press).

구체적으로 상기 발현벡터 pT1GIL-2, pT2GIL-2, pG1IL-2, pG2IL-2, pG3IL-2 등을 대장균 BL21(DE3) 균주에 형질전환시켜 얻은 대장균 형질전환체를 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소 유전자은행에 1998년 11월 13일자로 기탁하였다 (수탁번호: 순서대로 KCTC 0555BP, KCTC 0556BP, KCTC 0552BP, KCTC 0553BP, KCTC 0554BP).Specifically, the E. coli transformant obtained by transforming the expression vectors pT1GIL-2, pT2GIL-2, pG1IL-2, pG2IL-2, pG3IL-2 and the like into Escherichia coli BL21 (DE3) strains Deposited to GenBank on November 13, 1998 (Accession No .: KCTC 0555BP, KCTC 0556BP, KCTC 0552BP, KCTC 0553BP, KCTC 0554BP).

상기 형질전환된 재조합 대장균을 적당한 배양 조건에서 배양하여 인터루킨-2를 포함하는 융합단백질을 생산할 수 있다. 배양된 세포들은 라이소자임 소화(lysozyme digestion), 동결융해, 초음파 파쇄, 또는 프렌치 프래스 (French press) 등으로 처리한 후, 원심분리나 여과를 통해 상기 융합단백질을 함유하는 추출물을 얻는다. 상기 융합단백질은 추출물의 용해, 초여과, 투석, 이온교환 크로마토그래피, 겔 여과, 전기영동 그리고 친화성 크로마토그래피 등의 일반적인 정제방법을 통해 분리될 수 있다. 분리된 융합단백질을 적당량의 엔테로키나제로 처리하면 이로부터 인터루킨-2만을 얻을 수 있다.The transformed recombinant E. coli can be cultured under suitable culture conditions to produce a fusion protein comprising interleukin-2. The cultured cells are treated with lysozyme digestion, lyolysis, sonication, or French press, and then centrifuged or filtered to obtain extracts containing the fusion protein. The fusion protein can be separated by common purification methods such as dissolution of the extract, ultrafiltration, dialysis, ion exchange chromatography, gel filtration, electrophoresis and affinity chromatography. Treatment of the isolated fusion protein with an appropriate amount of enterokinase yields only interleukin-2 therefrom.

본 발명의 사람 글루카곤을 포함하는 융합파트너를 이용하여 인터루킨-2를 발현시키면 인터루킨-2 만을 직접 발현시킬 때 보다 발현율이 크게 향상되며 (대장균내 전체 단백질 총량의 50∼60%) 외래단백질이 훨씬 고순도 (응집체 구성 단백질 총량의 약 80%)로 포함된 불용성 응집체를 얻을 수 있다. 이 불용성 응집체는 일반적인 불용성 응집체와는 달리 알칼리성 용액에서 많은 양이 쉽게 용해되는데, 일반적인 불용성 응집체의 경우 변성제나 환원제에 녹인 다음 리폴딩(refolding)과정을 거쳐야 하는 것과는 달리 본 발명의 융합된 재조합 단백질은 알칼리 용해만으로 공정이 끝나기 때문에 리폴딩의 난점을 극복할 수 있다.When expressing interleukin-2 using a fusion partner containing human glucagon of the present invention, the expression rate is significantly improved (50 to 60% of the total protein in Escherichia coli), compared to the direct expression of only interleukin-2. (In about 80% of the total amount of aggregate constituent protein) can be obtained. Unlike insoluble aggregates, the insoluble aggregates are easily dissolved in a large amount in an alkaline solution.However, in the case of a general insoluble aggregate, the fused recombinant protein of the present invention has to be dissolved in a denaturant or reducing agent and then refolded. Alkaline dissolution alone completes the process and overcomes the difficulties of refolding.

이와 같은 특이한 현상은 N-말단의 융합파트너의 역할로 인해 응집체를 이루는 고순도의 재조합 단백질 대부분이 동일 분자들간의 소수성 상호작용에 의해 결합되어 있기 때문이다.This unique phenomenon is due to the role of the N-terminal fusion partner, most of the high-purity recombinant protein is aggregated by the hydrophobic interaction between the same molecules.

이하 실시예에 의하여 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to Examples.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것으로 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.However, the following examples are illustrative of the present invention, and the contents of the present invention are not limited by the examples.

실시예 1. 인터루킨-2를 직접 발현시키는 pT7IL-2 플라스미드의 제조Example 1 Preparation of pT7IL-2 Plasmid Directly Expressing Interleukin-2

인터루킨-2 유전자 및 인터루킨-2 융합단백질의 유전자들을 T7 프로모터 발현 시스템을 이용하여 대장균에서 대량 발현시키기 위해 유전자은행에서 얻은 인터루킨-2 생산균주 (KCTC 8258P)를 이용하였다. 이 균주에 들어있는 플라스미드 pNKM21은 천연형 인터루킨-2의 125번째 아미노산인 시스테인(Cysteine)이 세린(Serine)으로 치환되어있는 변형된 인터루킨-2 유전자를 가지고 있으며 이 유전자는 PL 프로모터에 의해 조절되고있다. 이 플라스미드에 들어있는 인터루킨-2 유전자를 주형으로 하여 133개의 아미노산 서열을 암호하는 인터루킨-2 유전자를 아래와 같은 시발체(primer)를 이용하여 PCR로 증폭하였다.The interleukin-2 producing strain (KCTC 8258P) obtained from the GenBank was used to mass express the genes of the interleukin-2 gene and the interleukin-2 fusion protein in E. coli using the T7 promoter expression system. Plasmid pNKM21 in this strain contains a modified interleukin-2 gene in which the cysteine, the 125th amino acid of native interleukin-2, is substituted with serine, which is regulated by the PL promoter. . Using the interleukin-2 gene contained in this plasmid as a template, the interleukin-2 gene encoding 133 amino acid sequences was amplified by PCR using the primers described below.

1) GCA CAT ATG GCA CCT ACT TCA AGT TCT (pNIL)1) GCA CAT ATG GCA CCT ACT TCA AGT TCT (pNIL)

2) GCA AAG CTT CTA TTA AGT TAG TGT TGA GAT GAT (pHIL)2) GCA AAG CTT CTA TTA AGT TAG TGT TGA GAT GAT (pHIL)

PCR은 DNA 중합효소반응용 완충용액(0.25mM dNTPs; 50mM KCl; 10mM (NH4)2SO4; 20mM Tris-HCl(pH8.8); 2mM MgSO4; 0.1% Triton X-100)에 주형 DNA 100ng, 각각의 시발체 50pmol을 넣은 다음 Taq DNA 중합효소를 이용하여 수행되었다. 반응 조건은 95℃/30sec (denaturation), 52℃/30sec (annealing), 72℃/60sec (elongation)로 총 30회 수행하였다(이하 기술되는 모든 PCR은 특별한 언급이 없는한 상기의 조건을 따른 것으로 한다). PCR이 종료된 다음 증폭된 DNA를 1% 아가로스 젤(agarose gel)을 이용하여 분석하였다. 증폭된 DNA를 퀴아젠 젤 추출 키트(Qiagen Gel extraction kit)를 이용하여 정제한 다음 제한효소 NdeI과 HindIII로 각각 처리하여 5' 말단에 NdeI 제한효소 부위와 3' 말단에 HindIII 제한효소 부위를 갖도록 하여 발현 플라스미드인 pT7-7의 NdeI과 HindIII 자리에 삽입하였다. 이렇게 만들어진 플라스미드를 pT7IL-2라고 명명하였다 (도 1참조).PCR was performed on DNA DNA in buffer (0.25 mM dNTPs; 50 mM KCl; 10 mM (NH 4 ) 2 SO 4 ; 20 mM Tris-HCl (pH 8.8); 2 mM MgSO 4 ; 0.1% Triton X-100). 100ng, 50 pmol of each primer was added and then performed using Taq DNA polymerase. The reaction conditions were performed 30 times in total at 95 ° C./30 sec (denaturation), 52 ° C./30 sec (annealing), and 72 ° C./60 sec (elongation) (all PCR described below was carried out according to the above conditions unless otherwise specified). do). After completion of PCR, the amplified DNA was analyzed using a 1% agarose gel. The amplified DNA was purified using Qiagen Gel extraction kit and treated with restriction enzymes NdeI and HindIII to have NdeI restriction enzyme sites at the 5 'end and HindIII restriction enzyme sites at the 3' end. The expression plasmid pT7-7 was inserted into the NdeI and HindIII sites. The resulting plasmid was named pT7IL-2 (see FIG. 1 ).

실시예 2. 사람 글루카곤 유전자를 융합파트너로 이용하는 인터루킨-2 발현 벡터의 제조Example 2. Preparation of Interleukin-2 Expression Vector Using Human Glucagon Gene as Fusion Partner

가. pT1GIL-2 플라스미드의 제조end. Preparation of pT1GIL-2 Plasmid

U937 세포주로부터 만들어진 사람 단핵세포 cDNA 라이브러리 (Clontech에서 구입)를 주형으로하여 PCR을 이용하여 T1 펩타이드(사람 종양괴사인자의 아미노산 서열 중 N-말단의 1번째에서 57번째의 아미노산으로 구성된 펩타이드)의 DNA를 증폭한 뒤 퀴아젠 젤 추출 키트(Qiagen Gel extraction kit)를 이용하여 정제하였다. 정제된 DNA를 BamHI과 NdeI으로 각각 처리하여 5' 말단에 NdeI 제한효소 부위와 3' 말단에 BamHI 제한효소 부위를 갖도록 하여 pT7-7 벡터의 NdeI과 BamHI 자리에 삽입하였다. 이렇게 만들어진 플라스미드를 pT7-T1 이라고 명명하였다.DNA of T1 peptide (peptide consisting of 1st to 57th amino acids of N-terminus among amino acid sequences of human tumor necrosis factor) by PCR using human mononuclear cDNA library (purchased from Clontech) made from U937 cell line as a template After amplification was purified using a Qiagen Gel extraction kit (Qiagen Gel extraction kit). The purified DNA was treated with BamHI and NdeI, respectively, to have an NdeI restriction enzyme site at the 5 'end and a BamHI restriction site at the 3' end, and inserted into the NdeI and BamHI sites of the pT7-7 vector. The resulting plasmid was named pT7-T1.

DNA 합성기(DNA synthesizer)로 제조된 글루카곤 유전자를 주형으로 하여 아래와 같은 시발체를 이용하여 PCR로 단편 1(fragment-1)을 증폭하였다.Using a glucagon gene prepared by a DNA synthesizer as a template, fragment 1 (fragment-1) was amplified by PCR using the following primer.

1) GCA GGA TCC GAC GAC GAC GAC AAA CAC TCT CAG GGT (BGD4K)1) GCA GGA TCC GAC GAC GAC GAC AAA CAC TCT CAG GGT (BGD4K)

2) TTT GTC GTC GTC GTC CTC GAG AGT GTT CAT CAG CCA (XGD4K)2) TTT GTC GTC GTC GTC CTC GAG AGT GTT CAT CAG CCA (XGD4K)

PCR이 종료된 다음 증폭된 DNA를 1% 아가로스 젤을 이용하여 분석하였으며 증폭된 DNA를 젤 추출 키트(Qiagen Gel extraction kit)를 이용하여 정제하였다.After completion of PCR, the amplified DNA was analyzed using 1% agarose gel, and the amplified DNA was purified using a Qiagen Gel extraction kit.

또한, 플라스미드 pT7IL-2에 들어있는 인터루킨-2 유전자를 주형으로 하여 아래와 같은 시발체를 이용하여 PCR로 단편 2(fragment-2)를 증폭하였다.In addition, fragment 2 (fragment-2) was amplified by PCR using the following primer, using the interleukin-2 gene contained in the plasmid pT7IL-2 as a template.

1) GAC GAC GAC GAC AAA GCA CCT ACT TCA AGT TCT (XID4K)1) GAC GAC GAC GAC AAA GCA CCT ACT TCA AGT TCT (XID4K)

2) GCA AAG CTT CTA TTA AGT TAG TGT TGA GAT GAT (HIL)2) GCA AAG CTT CTA TTA AGT TAG TGT TGA GAT GAT (HIL)

PCR이 종료된 다음 증폭된 DNA를 1% 아가로스 젤을 이용하여 분석하였으며 증폭된 DNA를 젤 추출 키트(Qiagen Gel extraction kit)를 이용하여 정제하였다.After completion of PCR, the amplified DNA was analyzed using 1% agarose gel, and the amplified DNA was purified using a Qiagen Gel extraction kit.

단편 1과 단편 2를 각각 주형으로 하여 아래와 같은 시발체를 이용하여 두 번째 PCR을 수행하였다.Fragment 1 and fragment 2 were used as templates, respectively, and a second PCR was performed using the primers described below.

1) GCA GGA TCC GAC GAC GAC GAC AAA CAC TCT CAG GGT (BGD4K)1) GCA GGA TCC GAC GAC GAC GAC AAA CAC TCT CAG GGT (BGD4K)

2) GCA AAG CTT CTA TTA AGT TAG TGT TGA GAT GAT (HIL)2) GCA AAG CTT CTA TTA AGT TAG TGT TGA GAT GAT (HIL)

PCR이 종료된 다음 증폭된 DNA를 1% 아가로스 젤을 이용하여 분석하였으며 증폭된 DNA를 젤 추출 키트를 이용하여 정제하였다. 정제된 DNA를 BamHI과 HindIII로 각각 처리하여 5' 말단에 BamHI 제한효소 부위와 3' 말단에 HindIII 제한효소 부위를 갖도록 하여 pT7-T1 벡터의 BamHI과 HindIII 자리에 삽입하였다. 이렇게 만들어진 플라스미드를 pT7-T1GIL-2라고 명명하였다.After PCR, the amplified DNA was analyzed using 1% agarose gel, and the amplified DNA was purified using a gel extraction kit. The purified DNA was treated with BamHI and HindIII, respectively, and inserted into BamHI and HindIII sites of the pT7-T1 vector to have a BamHI restriction site at the 5 'end and a HindIII restriction site at the 3' end. The resulting plasmid was named pT7-T1GIL-2.

플라스미드 pT7-T1GIL-2를 주형으로 하여 다음과 같은 시발체를 이용하여 PCR방법으로 XH6IL-2 단편을 증폭하였다.The plasmid pT7-T1GIL-2 as a template was used to amplify the XH6IL-2 fragment by PCR using the following primers.

1) GCA CTC GAG CAT CAT CAT CAT CAT CAT AGC AGC GAC GAC GAC GAC AAA GCA (XH6)1) GCA CTC GAG CAT CAT CAT CAT CAT AGC AGC GAC GAC GAC GAC AAA GCA (XH6)

2) GCA AAG CTT CTA TTA AGT TAG TGT TGA GAT GAT (HIL)2) GCA AAG CTT CTA TTA AGT TAG TGT TGA GAT GAT (HIL)

PCR이 종료된 다음 증폭된 DNA를 1% 아가로스 젤을 이용하여 분석하였으며 증폭된 DNA를 젤 추출 키트를 이용하여 정제하였다. 정제된 DNA를 XhoI과 HindIII로 각각 처리하여 5' 말단에 XhoI 제한효소 부위와 3' 말단에 HindIII 제한효소 부위를 갖도록하여 pT7-T1GIL-2 벡터의 XhoI과 HindIII 자리에 삽입하였다. 이렇게 만들어진 플라스미드를 pT1GIL-2라고 명명하였다 (도 2참조).After PCR, the amplified DNA was analyzed using 1% agarose gel, and the amplified DNA was purified using a gel extraction kit. The purified DNA was treated with XhoI and HindIII, respectively, and inserted at the XhoI and HindIII sites of the pT7-T1GIL-2 vector with XhoI restriction enzyme sites at the 5 'end and HindIII restriction enzyme sites at the 3' end. The resulting plasmid was named pT1GIL-2 (see FIG. 2 ).

나. pT2GIL-2 플라스미드의 제조I. Preparation of pT2GIL-2 Plasmid

아미노산 서열 Pro-Ser-Asp-Lys-Pro(사람 종양괴사인자의 아미노산 서열 중N-말단의 8번째에서 12번째의 아미노산으로 구성된 펩타이드)의 5' 말단에 NdeI 제한효소 부위와 3' 말단에 폴리히스티딘 서열 (His10) 및 BamHI 제한효소 부위를 첨가한 뒤 pT7-7 벡터의 NdeI과 BamHI 자리에 삽입하였다. 이렇게 만들어진 플라스미드를 pT7-T2 이라고 명명하였다.NdeI restriction enzyme site at the 5 'end of the amino acid sequence Pro-Ser-Asp-Lys-Pro (peptide consisting of the 8th to 12th amino acids of the N-terminal end of the amino acid sequence of human tumor necrosis factor) and poly at the 3' end The histidine sequence (His10) and the BamHI restriction site were added and inserted into the NdeI and BamHI sites of the pT7-7 vector. The resulting plasmid was named pT7-T2.

플라스미드 pT7-T1GIL-2에 들어있는 글루카곤이 융합된 인터루킨-2 융합단백질의 유전자를 주형으로 하여 다음과 같은 시발체를 이용하여 PCR 방법으로 GIL-2(BH) 단편을 증폭하였다.The GIL-2 (BH) fragment was amplified by PCR using the following primers as a template of the Glucagon-fused interleukin-2 fusion protein contained in the plasmid pT7-T1GIL-2.

1) GCA GGA TCC CAC TCT CAG GGT ACT TTC (GBAM)1) GCA GGA TCC CAC TCT CAG GGT ACT TTC (GBAM)

2) GCA AAG CTT CTA TTA AGT TAG TGT TGA GAT GAT (HIL)2) GCA AAG CTT CTA TTA AGT TAG TGT TGA GAT GAT (HIL)

PCR이 종료된 다음 증폭된 DNA를 1% 아가로스 젤을 이용하여 분석하였으며 증폭된 DNA를 젤 추출 키트를 이용하여 정제하였다. 정제된 DNA를 BamHI과 HindIII로 각각 처리하여 5' 말단에 BamHI 제한효소 부위와 3' 말단에 HindIII 제한효소 부위를 갖도록 하여 pT7-T2 벡터의 BamHI과 HindIII 자리에 삽입하였다. 이렇게 만들어진 플라스미드를 pT2GIL-2 라고 명명하였다 (도 3참조).After PCR, the amplified DNA was analyzed using 1% agarose gel, and the amplified DNA was purified using a gel extraction kit. The purified DNA was treated with BamHI and HindIII, respectively, to have a BamHI restriction site at the 5 'end and a HindIII restriction site at the 3' end, and then inserted into BamHI and HindIII sites of the pT7-T2 vector. The resulting plasmid was named pT2GIL-2 (see FIG. 3 ).

다. pG1IL-2 플라스미드의 제조All. Preparation of pG1IL-2 Plasmid

플라스미드 pT1GIL-2에 들어있는 글루카곤이 융합된 인터루킨-2 융합단백질의 유전자를 주형으로 하여 다음과 같은 시발체를 이용하여 PCR 방법으로 GH6IL-2(NH) 단편을 증폭하였다.The GH6IL-2 (NH) fragment was amplified by PCR using the following primers as a template of the Glucagon-fused interleukin-2 fusion protein contained in the plasmid pT1GIL-2.

1) GCA CAT ATG CAC TCT CAG GGT ACT (GNDE)1) GCA CAT ATG CAC TCT CAG GGT ACT (GNDE)

2) GCA AAG CTT CTA TTA AGT TAG TGT TGA GAT GAT (HIL)2) GCA AAG CTT CTA TTA AGT TAG TGT TGA GAT GAT (HIL)

PCR이 종료된 다음 증폭된 DNA를 1% 아가로스 젤을 이용하여 분석하였으며 증폭된 DNA를 젤 추출 키트를 이용하여 정제하였다. 정제된 DNA를 NdeI과 HindIII로 각각 처리하여 5' 말단에 NdeI 제한효소 부위와 3' 말단에 HindIII 제한효소 부위를 갖도록 하여 발현벡터인 pT7-7의 NdeI과 HindIII 자리에 삽입하였다. 이렇게 만들어진 플라스미드를 pG1IL-2 라고 명명하였다 (도 4참조).After PCR, the amplified DNA was analyzed using 1% agarose gel, and the amplified DNA was purified using a gel extraction kit. The purified DNA was treated with NdeI and HindIII, respectively, to have an NdeI restriction enzyme site at the 5 'end and a HindIII restriction enzyme site at the 3' end, and inserted into NdeI and HindIII sites of the expression vector pT7-7. The resulting plasmid was named pG1IL-2 (see FIG. 4 ).

라. pG2IL-2 플라스미드의 제조la. Preparation of pG2IL-2 Plasmid

플라스미드 pGIL-2에 들어있는 글루카곤이 융합된 인터루킨-2 융합단백질 유전자를 주형으로 하여 다음과 같은 시발체를 이용하여 PCR 방법으로 GH6IL-2(BH) 단편을 증폭하였다.The GH6IL-2 (BH) fragment was amplified by PCR using the following primers as a template using the Glucagon-fused interleukin-2 fusion protein gene in the plasmid pGIL-2.

1) GCA GGA TCC CAC TCT CAG GGT ACT TTC (GBAM)1) GCA GGA TCC CAC TCT CAG GGT ACT TTC (GBAM)

2) GCA AAG CTT CTA TTA AGT TAG TGT TGA GAT GAT (HIL)2) GCA AAG CTT CTA TTA AGT TAG TGT TGA GAT GAT (HIL)

PCR이 종료된 다음 증폭된 DNA를 1% 아가로스 젤을 이용하여 분석하였으며 증폭된 DNA를 젤 추출 키트를 이용하여 정제하였다. 정제된 DNA를 BamHI과 HindIII로 각각 처리하여 5' 말단에 BamHI 제한효소 부위와 3' 말단에 HindIII 제한효소 부위를 갖도록 하여 발현벡터인 pT7-7의 BamHI과 HindIII 자리에 삽입하였다. 이렇게 만들어진 플라스미드를 pGIL-2(BH)라고 명명하였다.After PCR, the amplified DNA was analyzed using 1% agarose gel, and the amplified DNA was purified using a gel extraction kit. The purified DNA was treated with BamHI and HindIII, respectively, to have the BamHI restriction site at the 5 'end and the HindIII restriction site at the 3' end, and inserted into the BamHI and HindIII sites of the expression vector pT7-7. The resulting plasmid was named pGIL-2 (BH).

DNA 합성기로 제조된 글루카곤 유전자를 주형으로 하여 다음과 같은 시발체를 이용하여 PCR 방법으로 G(NB) 단편을 증폭하였다.G (NB) fragments were amplified by PCR using a glucagon gene prepared with a DNA synthesizer as a template and the following primers.

1) GCA CAT ATG CAC TCT CAG GGT ACT (GNDE)1) GCA CAT ATG CAC TCT CAG GGT ACT (GNDE)

2) GCA GGA TCC AGT GTT CAT CAG CCA (GBAM-3)2) GCA GGA TCC AGT GTT CAT CAG CCA (GBAM-3)

PCR이 종료된 다음 증폭된 DNA를 1.5% 아가로스 젤을 이용하여 분석하였으며 증폭된 DNA를 젤 추출 키트를 이용하여 정제하였다. 정제된 DNA를 NdeI과 BamHI으로 각각 처리하여 5' 말단에 NdeI 제한효소 부위와 3' 말단에 BamHI 제한효소 부위를 갖도록 하여 상기 pGIL-2(BH) 벡터의 NdeI과 BamHI 자리에 삽입하였다. 이렇게 만들어진 플라스미드를 pG2IL-2라고 명명하였다 (도 5참조).After completion of PCR, the amplified DNA was analyzed using 1.5% agarose gel and the amplified DNA was purified using a gel extraction kit. The purified DNA was treated with NdeI and BamHI, respectively, to have an NdeI restriction enzyme site at the 5 'end and a BamHI restriction site at the 3' end, and inserted into the NdeI and BamHI sites of the pGIL-2 (BH) vector. The resulting plasmid was named pG2IL-2 (see FIG. 5 ).

마. pG3IL-2 플라스미드의 제조hemp. Preparation of pG3IL-2 Plasmid

플라스미드 pGIL-2에 들어있는 글루카곤 유전자를 주형으로 하여 다음과 같은 시발체를 이용하여 PCR 방법으로 G(EB) 단편을 증폭하였다.The G (EB) fragment was amplified by PCR using the glucagon gene contained in the plasmid pGIL-2 as a template.

1) GCA GAA TTC CAC TCT CAG GGT ACT (GECO)1) GCA GAA TTC CAC TCT CAG GGT ACT (GECO)

2) GCA GGA TCC AGT GTT CAT CAG CCA (GBAM-3)2) GCA GGA TCC AGT GTT CAT CAG CCA (GBAM-3)

PCR이 종료된 다음 증폭된 DNA를 1.5% 아가로스 젤을 이용하여 분석하였으며 증폭된 DNA를 젤 추출 키트를 이용하여 정제하였다. 정제된 DNA를 EcoRI과 BamHI으로 각각 처리하여 5' 말단에 EcoRI 제한효소 부위와 3' 말단에 BamHI 제한효소 부위를 갖도록 하여 상기 pGIL-2(BH) 벡터의 EcoRI과 BamHI 자리에 삽입하였다. 이렇게 만들어진 플라스미드를 pG2IL-2(EH)라고 명명하였다.After completion of PCR, the amplified DNA was analyzed using 1.5% agarose gel and the amplified DNA was purified using a gel extraction kit. The purified DNA was treated with EcoRI and BamHI, respectively, to have an EcoRI restriction enzyme site at the 5 'end and a BamHI restriction site at the 3' end, and then inserted into the EcoRI and BamHI sites of the pGIL-2 (BH) vector. The resulting plasmid was named pG2IL-2 (EH).

또한 플라스미드 pGIL-2에 들어있는 글루카곤 유전자를 주형으로 하여 다음과 같은 시발체를 이용하여 PCR 방법으로 G(NE) 단편을 증폭하였다.In addition, G (NE) fragments were amplified by PCR using the glucagon gene contained in the plasmid pGIL-2 as a template.

1) GCA CAT ATG CAC TCT CAG GGT ACT (GNDE)1) GCA CAT ATG CAC TCT CAG GGT ACT (GNDE)

2) GCA GAA TTC AGT GTT CAT CAG CCA (GECO-3)2) GCA GAA TTC AGT GTT CAT CAG CCA (GECO-3)

PCR이 종료된 다음 증폭된 DNA를 1.5% 아가로스 젤을 이용하여 분석하였으며 증폭된 DNA를 젤 추출 키트를 이용하여 정제하였다. 정제된 DNA를 NdeI과 EcoRI으로 각각 처리하여 5' 말단에 NdeI 제한효소 부위와 3' 말단에 EcoRI 제한효소 부위를 갖도록 하여 pG2IL-2(EH) 벡터의 NdeI과 EcoRI 자리에 삽입하였다. 이렇게 만들어진 플라스미드를 pG3IL-2라고 명명하였다 (도 6참조).After completion of PCR, the amplified DNA was analyzed using 1.5% agarose gel and the amplified DNA was purified using a gel extraction kit. The purified DNA was treated with NdeI and EcoRI, respectively, to have an NdeI restriction enzyme site at the 5 'end and an EcoRI restriction enzyme site at the 3' end, and then inserted into the NdeI and EcoRI sites of the pG2IL-2 (EH) vector. The resulting plasmid was named pG3IL-2 (see FIG. 6 ).

실시예 3. 대장균 형질전환체의 제조Example 3. Preparation of E. coli transformants

하나한이 기술한 방법에 의해 (Hanahan D. 1985, DNA Cloning 1, 109-135, IRS press) 상기 발현벡터 pT7IL-2, pT1GIL-2, pT2GIL-2, pG1IL-2, pG2IL-2, pG3IL-2 등으로 대장균 BL21(DE3) (Studier, F. A. and Moffatt, B. A. 1986, 189, 113-130)을 형질전환시킨 다음, 앰피실린(amphicillin)에 저항성이 있는 콜로니를 선별하였다.By the method described by Hanahan (Hanahan D. 1985, DNA Cloning 1, 109-135, IRS press) the expression vectors pT7IL-2, pT1GIL-2, pT2GIL-2, pG1IL-2, pG2IL-2, pG3IL- E. coli BL21 (DE3) (Studier, FA and Moffatt, BA 1986, 189, 113-130) were transformed with 2, and then colonies resistant to ampicillin were selected.

상기의 선별된 재조합 대장균을 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소 유전자은행에 1998년 11년 23일자로 기탁하였다 (수탁번호 : pT7IL-2는 KCTC 0555BP,pT2GIL-2는 KCTC 0556BP, pG1IL-2는 KCTC 0552BP, pG2IL-2는 KCTC 0553BP,pG3IL는 KCTC 0554BP).The selected recombinant E. coli was deposited with the Korea Institute of Science and Technology Biotechnology Research Institute Gene Bank on November 23, 1998. (Accession No .: pT7IL-2 is KCTC 0555BP, pT2GIL-2 is KCTC 0556BP, pG1IL-2 is KCTC 0552BP, pG2IL-2 is KCTC 0553BP, pG3IL is KCTC 0554BP).

실시예 4. 대장균 형질전환체의 배양 및 융합단백질의 생산Example 4 Culture of Escherichia Coli Transformant and Production of Fusion Protein

하루종일 배양된 종균 배양액의 일부를 본 배양 배지(LB 배지, +100mg/L 앰피실린)에 접종(1%)한 다음 37℃에서 200rpm으로 배양하였다. 배양액의 OD600가 0.4에 이르렀을 때에 IPTG(isopropylthio-β-D-galactoside)를 첨가 (0.5 mM)하여 재조합 유전자의 발현을 유도하였다. IPTG 첨가 후 동일한 조건으로 3-4시간 더 배양하였다.A part of the spawn culture cultured all day was inoculated (1%) in this culture medium (LB medium, +100 mg / L ampicillin) and then incubated at 37 ° C. at 200 rpm. When OD 600 of the culture reached 0.4, IPTG (isopropylthio-β-D-galactoside) was added (0.5 mM) to induce the expression of recombinant genes. After addition of IPTG, the cells were further incubated for 3-4 hours under the same conditions.

실시예 5. 고생산성 대장균 형질전환체의 선별Example 5 Selection of Highly Producible E. Coli Transformants

상기 각 발현 벡터로 대장균 BL21(DE3)를 형질전환시킨 다음 각각의 플레이트(plate)로부터 10개의 콜로니를 선별하였다. 선별된 콜로니를 종균배양한 후 이것의 일부를 LB 배지 (+100mg/L 앰피실린) 2ml에 접종(1%)한 다음 37℃에서 200rpm으로 배양하였다. 배양액의 OD600가 0.4에 이르렀을 때에 IPTG를 첨가(0.5mM)하여 재조합 유전자의 발현을 유도한 후 동일한 조건으로 3-4시간 더 배양하였다. 세포배양액을 6000rpm에서 원심분리하여 균체 침전물을 회수하였고, 회수된 균체 침전물을 증류수로 현탁한 다음 초음파 파쇄기(Branson Sonifier)를 이용하여 파쇄하였다. 파쇄액 내의 단백질을 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis) (14% Tris-Glycine gel)로 분리한 뒤, 농도계(Densitometer, Bio-Rad)를 이용하여 각 재조합 단백질의 발현율을 분석하였다. 분석결과 최대의 발현율을 보이는 콜로니를 LB 배지에서 접종하여 배양한 후 15% 글리세롤을 첨가하여 -70。C에서 보관하였다. 각 단백질의 발현율을 분석한 결과 모든 융합단백질의 발현율이 인터루킨-2를 직접 발현시킨 경우보다 월등히 높았으며, 특히 융합파트너 T2G와 G3을 이용한 경우가 높았는데 G3을 이용한 경우 발현율이 대장균 내 전체 단백질 총량의 60%를 상회하였다(도 7참조).E. coli BL21 (DE3) was transformed with each of the expression vectors, and 10 colonies were selected from each plate. Selected colonies were seeded and some of them were inoculated (1%) in 2 ml of LB medium (+100 mg / L ampicillin) and then incubated at 37 ° C. at 200 rpm. When the OD 600 of the culture reached 0.4, IPTG was added (0.5 mM) to induce the expression of the recombinant gene, followed by further incubation for 3-4 hours under the same conditions. The cell culture solution was centrifuged at 6000 rpm to recover the cell precipitate, and the recovered cell precipitate was suspended in distilled water and then crushed using an ultrasonic crusher (Branson Sonifier). Proteins in the lysate were separated by SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis) (14% Tris-Glycine gel), and then the expression rate of each recombinant protein was analyzed using a densitometer (Bio-Rad). Colonies showing the maximum expression rate were inoculated in LB medium and cultured, and then stored at -70 ° C with 15% glycerol. As a result of analyzing the expression rate of each protein, the expression rate of all fusion proteins was much higher than that of direct expression of interleukin-2, especially in the case of using fusion partners T2G and G3. Exceeded 60% of (see FIG. 7 ).

실시예 6 세포배양액으로부터 불용성 응집체의 분리Example 6 Isolation of Insoluble Aggregates from Cell Cultures

세포배양액을 6000rpm에서 원심분리하여 균체침전물을 회수하고 대장균체 침전물을 증류수로 현탁한 다음 초음파 파쇄기(Branson Sonifier)를 이용하여 파쇄하였다. 파쇄액을 5000g에서 10분간 원심분리한 후 상등액과 침전물을 각각 SDS-PAGE (14% Tris-Glycine gel)로 분석하여 회수여부를 확인하였다. 단백질 응집체는 0.5% TritonX-100으로 2회 세척한 후 필요한 분석을 수행하였다.The cell culture solution was centrifuged at 6000 rpm to recover the cell precipitate, and the coliform precipitate was suspended in distilled water and then crushed using an ultrasonic crusher (Branson Sonifier). After centrifugation of the crushed solution at 5000g for 10 minutes, the supernatant and precipitates were analyzed by SDS-PAGE (14% Tris-Glycine gel) to confirm their recovery. Protein aggregates were washed twice with 0.5% TritonX-100 and the necessary assays were performed.

실시예 7. 사람 글루카곤 유사 유전자를 융합파트너로 이용하는 인터루킨-2 발현벡터의 제조 및 형질전환체에 의한 융합단백질 발현Example 7 Preparation of Interleukin-2 Expression Vector Using Human Glucagon-Like Gene as Fusion Partner and Expression of Fusion Protein by Transformant

글루카곤 서열의 일부(6Phe->6Lys;10Tyr->10Lys;13Tyr->13Lys)를 변형시킴으로써 글루카곤 유사체가 IL-2의 발현에 미치는 영향을 조사하였다. 글루카곤 유사체가 융합된 IL-2 재조합체(GK3IL-2)의 제조 방법은 다음과 같다. 각각서열목록 2서열목록 3의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드 GK3-1과 GK3-2를 주형으로 프라이머 GNDE와 GXHO를 이용하여 PCR 방법으로 증폭하였다.The effect of glucagon analogues on IL-2 expression was examined by modifying a portion of the glucagon sequence ( 6 Phe-> 6 Lys; 10 Tyr-> 10 Lys; 13 Tyr-> 13 Lys). The preparation method of IL-2 recombinant (GK3IL-2) fused with glucagon analogue is as follows. Oligonucleotides GK3-1 and GK3-2 having base sequences of SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3 , respectively, were amplified by PCR using primers GNDE and GXHO as templates.

1) GCA CAT ATG CAC TCT CAG GGT ACT (GNDE)1) GCA CAT ATG CAC TCT CAG GGT ACT (GNDE)

2) GAC CTC GAG AGT GTT CAT CAG CCA (GXHO)2) GAC CTC GAG AGT GTT CAT CAG CCA (GXHO)

PCR이 종료된 다음 증폭된 DNA를 2% 아가로스 젤을 이용하여 분석하였으며 증폭된 DNA를 퀴아젠 젤 추출 키트를 이용하여 정제하였다. 정제된 DNA를 NdeI과 XhoI으로 각각 처리하여 5' 말단에 NdeI 제한효소 부위와 3' 말단에 XhoI 제한효소 부위를 갖도록 하여 발현 벡터인 pIL-2(NX)의 NdeI과 XhoI 자리에 삽입하였다. 이렇게 만들어진 플라스미드를 pGK3IL-2 라고 명명하였다. pIL-2(NX)벡터는 pG3IL-2 벡터를 NdeI과 XhoI로 처리하여 G3 서열을 제거한 벡터이다.After completion of PCR, the amplified DNA was analyzed using 2% agarose gel and the amplified DNA was purified using the Qiagen gel extraction kit. The purified DNA was treated with NdeI and XhoI, respectively, to have an NdeI restriction enzyme site at the 5 'end and an XhoI restriction enzyme site at the 3' end, and inserted into the NdeI and XhoI sites of the expression vector pIL-2 (NX). The resulting plasmid was named pGK3IL-2. The pIL-2 (NX) vector is a vector obtained by removing the G3 sequence by treating the pG3IL-2 vector with NdeI and XhoI.

유사 글루카곤이 융합된 IL-2 재조합체 (GK3IL-2)의 발현 수준을 상기 실시예와 동일한 방법을 이용, 조사하여 그 발현 수준을 G1IL-2의 경우와 비교하였다. 그 결과는표 1에 나타낸 바와 같이 특정 유사 글루카곤이 융합된 경우에도 높은 발현수준을 보이고 있다.The expression level of the pseudo-glucagon fused IL-2 recombinant (GK3IL-2) was investigated using the same method as in the above example, and the expression level thereof was compared with that of G1IL-2. As a result, as shown in Table 1 , even when a certain similar glucagon is fused, it shows a high expression level.

GIL-2GIL-2 GK3IL-2GK3IL-2 발현 수준 (%)Expression level (%) 25.0225.02 32.8932.89

실험예 1. 발현된 재조합단백질의 순도Experimental Example 1. Purity of Recombinant Protein Expressed

상기 실시예 5에서 선별된 고생산성 대장균주를 각각 종균배양을 거쳐 100ml의 LB 배지 (+100 mg/l 앰피실린)에서 배양하였다. 배양액의 OD600이 0.4에 이르렀을 때에 IPTG를 첨가 (0.5mM)하여 재조합 유전자의 발현을 유도한 후 동일한 조건으로 3-4시간 더 배양하였다. 상기 실시예 6의 방법으로 세포 배양액으로부터 생산된 불용성 단백질 응집체를 회수하였다. 회수된 각 응집체를 0.5% 트리톤X-100(TritonX-100)으로 2회 세척한 후 SDS-PAGE (14% Tris-Glycine gel)로 분석하고 농도계(Bio-Rad)를 이용하여 각 응집체 내 재조합 단백질의 순도를 분석하였다.The highly productive E. coli strains selected in Example 5 were each cultured in 100 ml of LB medium (+100 mg / l ampicillin) after spawning. When the OD 600 of the culture reached 0.4, IPTG was added (0.5 mM) to induce the expression of the recombinant gene, followed by further incubation for 3-4 hours under the same conditions. The insoluble protein aggregate produced from the cell culture was recovered by the method of Example 6. Each recovered aggregate was washed twice with 0.5% TritonX-100, analyzed by SDS-PAGE (14% Tris-Glycine gel), and the recombinant protein in each aggregate using a bio-rad. The purity of was analyzed.

그 결과 융합파트너 없이 인터루킨-2가 직접 발현된 경우는 응집체 내 순도가 약 40%에 불과했으나 상기 5 가지 융합파트너와 함께 발현된 경우는 응집체 내 재조합 단백질의 순도가 월등히 증가하였다 (도 8참조). 특히 융합파트너 G3를 이용한 경우는 순도가 약 80% 가까이 증가했음을 확인하였다.As a result, when the interleukin-2 was directly expressed without the fusion partner, the purity in the aggregate was only about 40%, but when expressed with the five fusion partners, the purity of the recombinant protein in the aggregate was significantly increased (see FIG. 8 ). . In particular, when using the fusion partner G3 was confirmed that the purity increased by about 80%.

실험예 2. 응집체의 용해 (solubilization) 특성Experimental Example 2 Solubilization Characteristics of Aggregates

각 재조합 균주로부터 얻은 불용성 단백질을 동결건조 방법으로 건조하고 각각의 불용성 단백질을 pH 12의 알칼리성 용액에 농도가 50 mg/ml 되도록 현탁한 다음, 같은 pH 12 용액을 이용하여 순차적으로 2배씩 희석하면서 각 불용성 단백질의 용해도를 조사하였다. 각 단계마다 원심분리 (5000 g, 10분)를 통하여 시료를 상등액과 침전물로 분리한 다음 각각을 브래드포드(Bradford) 정량 방법을 이용하여 정량하고 아래와 같은 수식에 의해 용해도를 판정하였다. 침전물은 정량을 위하여 다량의 pH 12 용액에 다시 녹인 다음 정량하였다.The insoluble protein obtained from each recombinant strain was dried by lyophilization method, and each insoluble protein was suspended in an alkaline solution of pH 12 at a concentration of 50 mg / ml, and then diluted twice in sequence using the same pH 12 solution. The solubility of insoluble protein was investigated. After each step, the sample was separated into a supernatant and a precipitate by centrifugation (5000 g, 10 minutes), and each was quantified using a Bradford quantitative method, and the solubility was determined by the following formula. The precipitate was dissolved again in a large amount of pH 12 solution for quantification and then quantified.

도 9에서 보듯이 인터루킨-2를 직접 발현시켜 얻은 단백질 응집체에 비해 상기 융합파트너와 함께 발현시켜 얻은 단백질 응집체는 그 용해도가 훨씬 향상되었음을 알 수 있다. 특히 융합파트너 G3를 이용한 경우는 8 g/L 이상의 응집체 농도에서도 100%에 가까운 용해도를 보였다. 이와같이 변성제 또는 환원제를 전혀 이용하지 않고 단순히 pH 변화만으로 많은 양의 불용성 단백질 응집체를 용해시킬 수 있는 것은 본 발명에서 확인한 특이한 현상으로 분리정제과정에서 유용하게 이용될 수 있다. 또한 pH 12의 알칼리성 용액에서 쉽게 용해된 재조합 단백질은 용액의pH를 약 8까지 다시 내림으로 재활성화될 수 있다.As shown in Figure 9 it can be seen that the solubility of the protein aggregate obtained by expressing with the fusion partner compared to the protein aggregate obtained by directly expressing the interleukin-2. In particular, when using the fusion partner G3 showed solubility close to 100% even in the aggregate concentration of 8 g / L or more. As such, it is possible to dissolve a large amount of insoluble protein aggregates simply by changing the pH without using a denaturing agent or a reducing agent, which is a unique phenomenon identified in the present invention, and may be usefully used in the separation and purification process. In addition, recombinant proteins readily dissolved in alkaline solutions at pH 12 can be reactivated by lowering the pH of the solution back to about 8.

실험예 3. 응집체를 구성하는 단백질 분자 상호간의 결합특성Experimental Example 3 Binding Properties Between Protein Molecules Constituting Aggregates

생성된 응집체 내 구성 단백질 간의 (같은 재조합 단백질 분자 간 또는 재조합 단백질과 다른 숙주 단백질 분자 간의) 결합특성을 알아보기 위하여 다음과 같은 웨스턴 블럿(Western blot) 분석을 수행하였다. 우선, 각 응집체 내 단백질들을 비환원성 SDS-PAGE (14% Tris-Glycine gel)로 분리한 뒤 웨스턴 블럿을 수행하였다. 1차 항체는 쥐에서 유래한 항인터루킨-2 단일항체 IgG1을 이용하였고, 2차 항체로는 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase) 효소가 부착된 염소 유래의 항마우스 항체 IgG가 사용되었다.도 10에서 보듯이, 인터루킨-2의 직접 발현 (direct expression)에 의해 생성된 단백질 응집체에서는 인터루킨-2가 주로 다른 숙주 단백질들과의 다이설파이드 결합에 의해 다양한 크기의 다량체 (multimer)를 형성하고 있으나 인터루킨-2 융합단백질의 경우는 대부분 재조합 단백질 동일 분자들 간의 소수성 상호작용에 의해 결합되어 있음을 알 수 있다.The following Western blot analysis was performed to determine the binding characteristics (between the same recombinant protein molecules or between recombinant proteins and other host protein molecules) between the constituent proteins in the resulting aggregates. First, proteins in each aggregate were separated by non-reducing SDS-PAGE (14% Tris-Glycine gel), followed by Western blot. The primary antibody was a mouse-derived anti-interleukin-2 monoantibody IgG1, and the secondary antibody was a goat-derived anti-mouse antibody IgG attached with an alkaline phosphatase enzyme. As shown in FIG. 10 , in protein aggregates produced by direct expression of interleukin-2, interleukin-2 forms multimers of various sizes mainly by disulfide bonds with other host proteins. However, in the case of interleukin-2 fusion protein, it can be seen that most of them are bound by hydrophobic interaction between the same molecules of recombinant protein.

농도계(Bio-Rad)를 이용하여 각 단백질 응집체에서 동일 재조합 단백질 분자 결합체 (hydrophobically-bound homologous multimer)가 차지하는 비율을 분석하여도 11에 나타내었다. 그 결과 인터루킨만을 생산하는 경우에는 동일 재조합 단백질간의 결합체가 약 32%에 불과하였으나, 본 발명의 융합단백질의 형태로 생산된 경우 동일 단백질간의 소수성 결합이 60%이상에서 많게는 90%이상에 달함을 알 수있었다. 이와같이 동일 단백질 간의 소수성 결합에 의해 생성된 응집체는 상기와 같이 정제과정에서 간단하게 해리될 수 있어 매우 유리하다.Bio-Rad was used to analyze the proportion of the same recombinant protein molecular complex (hydrophobically-bound homologous multimer) in each protein aggregate, and is shown in FIG. 11 . As a result, when only interleukin was produced, only about 32% of the conjugates between the same recombinant proteins were produced. However, when produced in the form of the fusion protein of the present invention, the hydrophobic bonds between the same proteins range from 60% to as much as 90% or more. Could. As such, aggregates produced by hydrophobic bonds between the same proteins can be easily dissociated in the purification process as described above, which is very advantageous.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명은 사람 글루카곤의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 융합파트너로 이용함으로써 재조합 단백질을 대장균 내에서 고수율로 발현시킬 수 있고, 동시에 생성된 불용성 응집체 내에서 재조합 단백질의 순도를 크게 향상시킬 수 있다.As described above, according to the present invention, by using a polypeptide comprising the amino acid sequence of human glucagon as a fusion partner, the recombinant protein can be expressed in high yield in Escherichia coli, and at the same time, the purity of the recombinant protein in the generated insoluble aggregates. Can greatly improve.

또한, 융합된 재조합 단백질 발현과 함께 생성된 응집체는 알칼리성 용액에서 많은 양이 쉽게 용해되어, 일반적으로 변성제나 환원제에 녹인 다음 리폴딩 과정을 거쳐야 되는 불용성 응집체와는 달리 알칼리 용해만으로 공정이 끝나기 때문에 리폴딩의 난점을 극복할 수 있다.In addition, aggregates produced with the expression of the fused recombinant protein are easily dissolved in large amounts in alkaline solutions, and in general, unlike insoluble aggregates, which must be dissolved in a denaturant or reducing agent and then refolded, the process is completed by alkaline dissolution alone. You can overcome the difficulties of folding.

Claims (13)

형질전환 미생물을 배양하여 폴리펩타이드를 제조함에 있어서, 자가 결합성이 강한 펩타이드를 융합파트너로 포함하는X G -L-Y형의 융합단백질을 이용한 재조합 단백질 또는 펩타이드의 제조방법.A method for producing a recombinant protein or peptide using an X G -LY type fusion protein comprising a peptide having strong self-binding as a fusion partner in culturing a polypeptide by culturing the transformed microorganism. X G : 융합파트너 (서열번호 1의 사람글루카곤 펩타이드, 또는 사람글루카곤 유사체 펩타이드) X G : fusion partner (human glucagon peptide, or human glucagon analog peptide of SEQ ID NO: 1) L: 링커 (절단효소의 인식 배열) L : linker (recognition sequence of cleavage enzyme) Y: 재조합 단백질 또는 펩타이드 Y : recombinant protein or peptide 삭제delete 제 1항에 있어서, 사람글루카곤 유사체6Phe→6Lys,10Tyr→10Lys,13Tyr→13Lys으로 변형된 것을 특징으로 하는 재조합 단백질 또는 펩타이드의 제조방법.The method of claim 1, wherein the human glucagon analogue 6 Phe → 6 Lys, 10 Tyr → 10 Lys, 13 Tyr → 13 Lys is modified. 제 1항에 있어서, 사람 종양괴사인자 또는 그 뮤테인의 아미노산 서열이 융합파트너에 더 포함되는 것을 특징으로 하는, 재조합 단백질 또는 펩타이드의 제조방법.The method of claim 1, wherein the amino acid sequence of the human tumor necrosis factor or its mutein is further included in the fusion partner. 제 1항에 있어서, 링커는 엔테로키나제가 인식할 수 있는 Asp Asp Asp Asp Lys (DDDDK, D4K) 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는, 재조합 단백질 또는 펩타이드의 제조방법.The method of claim 1, wherein the linker has an Asp Asp Asp Asp Lys (DDDDK, D4K) amino acid sequence that can be recognized by enterokinase. 제 1항에 있어서, 폴리히스티딘 서열이 융합파트너에 포함되는 것을 특징으로 하는, 재조합 단백질 또는 펩타이드의 제조방법.The method of claim 1, wherein the polyhistidine sequence is included in the fusion partner. 제 1항에 있어서, 재조합 단백질이 인터루킨-2 또는 그의 유사체인 것을 특징으로하는 재조합 단백질 또는 펩타이드의 제조방법.The method of claim 1, wherein the recombinant protein is interleukin-2 or an analog thereof. 제 7항에 있어서, 융합파트너와 결합한 사람 인터루킨-2 또는 그 유사체를 생산하는 대장균 형질전환체를 배양하여 세포를 파쇄하고 단백질 침전체를 얻어 알칼리 용액으로 용해한 다음 pH를 다시 중성조건으로 복원함으로써 재조합 단백질을 재활성화하여 정제하는 것을 특징으로 하는 재조합 단백질 또는 펩타이드의 제조방법.8. The method of claim 7, wherein the recombinant E. coli transformant, which produces human Interleukin-2 or its analogs, in combination with the fusion partner is cultured to disrupt cells, obtain protein precipitates, dissolve in alkaline solution, and restore the pH to neutral conditions. Method for producing a recombinant protein or peptide, characterized in that by reactivating and purifying the protein. 제 8항에 있어서, 정제과정 중 분리된 융합단백질을 엔테로키나제로 절단하여 사람 인터루킨-2 또는 그 유사체를 정제하는 제조방법.The method of claim 8, wherein the fusion protein isolated during purification is cleaved with enterokinase to purify human interleukin-2 or an analog thereof. 제 1항이 융합파트너, 링커, 재조합 단백질 또는 펩타이드의 유전자를 pT7-7 벡터에 삽입하여 제조되는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.The expression vector of claim 1 is prepared by inserting a gene of a fusion partner, a linker, a recombinant protein or a peptide into a pT7-7 vector. 제 10항에 있어서, 재조합 단백질은 인터루킨-2 또는 그 유사체인 것을 특징으로 하는 발현벡터.The expression vector of claim 10, wherein the recombinant protein is interleukin-2 or an analog thereof. 융합파트너가 사람 종양괴사인자의 아미노산 서열중 N-말단의 1번째에서 57번째의 아미노산으로 구성된 펩타이드 (T1 펩타이드)-[G-펩타이드]-[폴리히스티딘 서열(His6)]의 순으로 구성된 폴리펩타이드인 T1G이고 재조합 단백질이 IL-2인 발현벡터 pT1GIL-2 (미생물 수탁번호 KCTC 0555BP.),Polypeptide consisting of peptides (T1 peptide)-[G-peptide]-[polyhistidine sequence (His6)] consisting of the N-terminal 1st to 57th amino acids in the amino acid sequence of human tumor necrosis factor Expression vector pT1GIL-2 (microbial accession number KCTC 0555BP.), Which is T1G and recombinant protein is IL-2, 융합파트너가 사람 종양괴사인자의 아미노산 서열 중 N-말단의 8번째에서 12번째의 아미노산으로 구성된 펩타이드 (T2 펩타이드)-[폴리히스티딘 서열(His10)]-[G 펩타이드]의 순으로 구성된 펩타이드인 T2G이고 재조합 단백질이 IL-2인 발현벡터 pT2GIL-2 (미생물 수탁번호 KCTC 0556BP.),T2G, a peptide consisting of peptides consisting of the 8th to 12th amino acids at the N-terminus (T2 peptide)-[polyhistidine sequence (His10)]-[G peptide] in the amino acid sequence of human tumor necrosis factor Expression vector pT2GIL-2 (microbial accession number KCTC 0556BP.), Wherein the recombinant protein is IL-2; 융합파트너가 서열번호 1의 글루카곤 [G 펩타이드]-[폴리히스티딘 서열(His6)]의 순으로 구성된 펩타이드인 G1이고 재조합 단백질이 IL-2인 발현벡터 pG1IL-2 (미생물 수탁번호 KCTC 0552BP),Expression vector pG1IL-2 (microbial accession number KCTC 0552BP), wherein the fusion partner is G1, which is a peptide consisting of glucagon [G peptide]-[polyhistidine sequence (His6)] of SEQ ID NO: 1, and the recombinant protein is IL-2, 융합파트너가 글루카곤이 2번 반복되는 [G 펩타이드가 연속 2번 반복된 펩타이드 (G2 펩타이드)]-[폴리히스티딘 서열(His6)]의 순으로 구성된 펩타이드인 G2이고 재조합 단백질이 IL-2인 발현벡터 pG2IL-2 (미생물 수탁번호 KCTC 0553BP),Expression vector wherein the fusion partner is G2, and the recombinant protein is IL-2, which is a peptide consisting of [G peptide is repeated twice (G2 peptide)]-[polyhistidine sequence (His6)] in which glucagon is repeated twice pG2IL-2 (Microbial Accession No. KCTC 0553BP), 융합파트너가 글루카곤이 3번 반복되는 [G 펩타이드가 연속 3번 반복된 펩타이드 (G3 펩타이드)]-[폴리히스티딘 서열(His6)]의 순으로 구성된 펩타이드인 G3이고 재조합 단백질이 IL-2인 발현벡터 pG3IL-2 (미생물 수탁번호 KCTC 0554BP), 및Expression vector in which the fusion partner is G3 and the recombinant protein is IL-2, which is a peptide consisting of [G peptide is repeated three times (G3 peptide)]-[polyhistidine sequence (His6)] in which glucagon is repeated three times pG3IL-2 (Microbial Accession Number KCTC 0554BP), and 융합파트너가 GK3 글루카곤 유사체이고 재조합 단백질이 IL-2인 발현벡터 pGK3IL-2 (미생물 수탁번호 KCTC 0582BP)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 발현벡터.An expression vector selected from the group consisting of an expression vector pGK3IL-2 (microbial accession number KCTC 0582BP) wherein the fusion partner is a GK3 glucagon analogue and the recombinant protein is IL-2. 삭제delete
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100980457B1 (en) 2008-06-27 2010-09-07 한국생명공학연구원 Method for producing and purifying bioactive human interleukin-6 in Escherichia coli
WO2023229328A1 (en) * 2022-05-23 2023-11-30 주식회사 백스다임 Platform for expressing protein of interest using viral nucleocapsid

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20020003917A (en) * 2000-06-26 2002-01-16 복성해 Fusion protein of tag protein and human interleukin-16, gene encoding said fusion protein, expression vector containing said gene, e. coli transformed with said vector and process for producing human interleukin-16 using said e. coli
KR100384924B1 (en) * 2000-10-12 2003-05-22 이석근 The device and method for the regulation of gene expression with cyclic electromagnetic field
US20030219402A1 (en) * 2002-02-14 2003-11-27 Rutter William J. Chimeric molecules for cleavage in a treated host
KR100931027B1 (en) 2006-06-27 2009-12-10 한국생명공학연구원 Cysteine-tagged Protein shock Variant at the N-terminus
EP2370470B1 (en) 2008-12-04 2016-10-05 Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology Screening of abundantly secreted proteins and their use as fusion partners for the production of recombinant proteins

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH07108232B2 (en) * 1990-10-09 1995-11-22 エム・ディ・リサーチ株式会社 Method for producing peptide or protein
JP3531947B2 (en) * 1991-08-19 2004-05-31 第一サントリーファーマ株式会社 Method for producing peptide
US5686268A (en) * 1992-06-19 1997-11-11 Pfizer Inc. Fused proteins
US6033877A (en) * 1995-11-02 2000-03-07 Research Foundation Of State University Of New York Peptide expression and delivery system

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100980457B1 (en) 2008-06-27 2010-09-07 한국생명공학연구원 Method for producing and purifying bioactive human interleukin-6 in Escherichia coli
WO2023229328A1 (en) * 2022-05-23 2023-11-30 주식회사 백스다임 Platform for expressing protein of interest using viral nucleocapsid

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