JPWO2005035562A1

JPWO2005035562A1 - Novel cell growth promoter

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Publication number: JPWO2005035562A1
Application number: JP2005514627A
Authority: JP
Inventors: 伸弥山中
Original assignee: Sumitomo Dainippon Pharma Co Ltd
Current assignee: Sumitomo Pharma Co Ltd
Priority date: 2003-10-07
Filing date: 2004-10-05
Publication date: 2007-11-22
Also published as: WO2005035562A1

Abstract

細胞、特に胚性幹細胞や体性幹細胞の増殖を促進する剤を提供する。本発明のタンパク質導入ドメインおよびＥＲａｓタンパク質を含んでいることを特徴とする融合タンパク質あるいは化学的結合体を用いることによって細胞、特に胚性幹細胞や体性幹細胞の増殖を促進することができる。本発明の細胞増殖促進剤は、可逆的に調整をすることができるため、遺伝子導入法に比べてより臨床応用が可能である。Provided is an agent that promotes proliferation of cells, particularly embryonic stem cells and somatic stem cells. By using a fusion protein or a chemical conjugate characterized in that it contains the protein transduction domain and ERas protein of the present invention, proliferation of cells, particularly embryonic stem cells and somatic stem cells, can be promoted. Since the cell growth promoter of the present invention can be reversibly adjusted, clinical application is possible compared to gene transfer methods.

Description

本発明は細胞増殖促進剤に関するものである。具体的には、胚性幹細胞や体性幹細胞の細胞増殖促進剤を提供するものである。 The present invention relates to a cell growth promoter. Specifically, the present invention provides an agent for promoting cell growth of embryonic stem cells or somatic stem cells.

胚性幹細胞（ＥＳ細胞）や体性幹細胞（組織幹細胞）などの幹細胞は神経疾患、糖尿病、白血病などに対する移植療法の資源として期待されている。ＥＳ細胞は受精卵（胚盤胞）の内部細胞塊に由来し、分化多能性を有することから特に価値が高い。マウスＥＳ細胞は白血病阻害因子（ＬＩＦ）により分化多能性を維持することができる。しかしヒトおよびサルのＥＳ細胞はＬＩＦ存在下でも、分化多能性を完全に維持しつつ増殖させることが難しい。一方体性幹細胞は受精卵を利用しないためＥＳ細胞のような倫理的問題が無いという長所を持つ。しかし体性幹細胞はＥＳ細胞よりも増殖が悪く、十分な細胞数を得ることが難しい。そのため、これらＥＳ細胞や体性幹細胞の増殖促進物質が望まれている。
本発明者は、ＥＳ細胞で特異的に発現する遺伝子群ＥＣＡＴ（ＥＳｃｅｌｌａｓｓｏｃｉａｔｅｄｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ）を同定し、その機能を解析してきた（ＷＯ０２／０９７０９０Ａ１）。これまでに、ＥＣＡＴ４（Ｎａｎｏｇ）はホメオボックス転写因子であり、ＮａｎｏｇをＥＳ細胞で過剰に発現させるとＬＩＦ非依存的に分化多能性を維持できること（Ｃｅｌｌ，１１３，６３１−６４２（２００３））、およびＥＣＡＴ５（ＥＲａｓ）は恒常活性型のＲａｓ蛋白質であり、ＥＲａｓはＰＩ３キナーゼの活性化を介してＥＳ細胞の増殖を促進していること（Ｎａｔｕｒｅ，４２３，５４１−５４５（２００３））などが明らかとなっている。ＥＲａｓはＥＳ細胞だけでなくＮＩＨ３Ｔ３細胞やマウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）に対しても強い増殖促進を示す。Stem cells such as embryonic stem cells (ES cells) and somatic stem cells (tissue stem cells) are expected as resources for transplantation therapy for neurological diseases, diabetes, leukemia and the like. ES cells are particularly valuable because they are derived from the inner cell mass of fertilized eggs (blastocysts) and have pluripotency. Mouse ES cells can maintain pluripotency by leukemia inhibitory factor (LIF). However, human and monkey ES cells are difficult to proliferate while maintaining full pluripotency even in the presence of LIF. On the other hand, somatic stem cells do not use fertilized eggs, and thus have the advantage of not having ethical problems like ES cells. However, somatic stem cells proliferate worse than ES cells, and it is difficult to obtain a sufficient number of cells. Therefore, a proliferation promoting substance for these ES cells and somatic stem cells is desired.
The present inventor has identified a gene group ECAT (ES cell associated transscript) that is specifically expressed in ES cells and analyzed its function (WO 02/097090 A1). So far, ECAT4 (Nanog) is a homeobox transcription factor, and if Nanog is overexpressed in ES cells, it can maintain pluripotency in a LIF-independent manner (Cell, 113, 631-642 (2003)). And ECAT5 (ERas) is a constitutively active Ras protein, and ERas promotes the proliferation of ES cells through the activation of PI3 kinase (Nature, 423, 541-545 (2003)) It is clear. ERas shows strong growth promotion not only for ES cells but also for NIH3T3 cells and mouse embryo fibroblasts (MEF).

本発明は、可逆的な細胞増殖促進剤、特に胚性幹細胞（ＥＳ細胞）や体性幹細胞の可逆的な細胞増殖促進剤を提供することを目的とする。
現在、多分化能を維持したままＥＳ細胞や体性幹細胞を大量生産することは極めて困難であり、未だ達成されていない。また遺伝子導入は、リポフェクション法やレトロウイルスベクター法などの公知の方法により達成できるが、（ｉ）高い導入効率を得ることが難しい、（ｉｉ）導入された遺伝子は染色体に取り込まれるが染色体のどこに組み込まれるか不明で不可逆的であるため癌化するリスクが高い、（ｉｉｉ）操作が煩雑なために多数の細胞を一度に処理しにくい、などの様々な課題がある。したがって臨床応用を考えると、細胞増殖に関与する遺伝子を遺伝子導入して細胞を増殖させることは現実的ではない。
そのため、本発明は遺伝子導入によらない臨床応用可能な細胞増殖促進剤を提供することを目的とする。
本発明者は、上記の問題点を解決すべく鋭意検討し、ＥＲａｓ（ＥＣＡＴ５）タンパク質にＨＩＶ由来のＴＡＴペプチドを組み合わせた融合タンパク質を培地に添加することによって、該融合タンパク質が細胞に取り込まれて細胞増殖が促進されることを見出した。なお、培地から融合蛋白質を除去すると、細胞内に取り込まれた蛋白質が分解されるとともに反応は停止するため、本発明における細胞増殖促進作用は可逆的である。
これらの知見から、本発明者は、ＥＲａｓタンパク質を細胞に取り込ませることによって細胞増殖を可逆的に促進させることができ、特に、多分化能を保ったまま培養して増殖させるのが困難な胚性幹細胞や体性幹細胞を増殖させるのに有用であると考え、本発明を完成するに至った。
即ち本発明の要旨は、以下のとおりである。
〔１〕タンパク質導入ドメインおよびＥＲａｓタンパク質を含んでいることを特徴とする融合タンパク質、
〔２〕Ｒａｓタンパク質がヒト、サル、ウシまたはマウス由来のものである、上記〔１〕記載の融合タンパク質、
〔３〕タンパク質導入ドメインが、ＨＩＶＴＡＴ、アンテナペデイア・ホメオドメイン（Ａｎｔｏｎｎａｐｅｄｉａｈｏｍｅｏｄｏｍａｉｎ）、ＨＳＶＶＰ２２またはこれらのうちいずれかのフラグメントである、上記〔１〕または〔２〕記載の融合タンパク質、
〔４〕タンパク質導入ドメインが、ＨＩＶＲｅｖのフラグメント、ｆｌｏｃｋｈｏｕｓｅｖｉｒｕｓＣｏａｔ（ＦＨＶＣｏａｔ）のフラグメント、ｂｒｏｍｅｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓＧａｇ（ＢＭＶＧａｇ）のフラグメント、ｈｕｍａｎＴｃｅｌｌｌｅｕｋｅｍｉａｖｉｒｕｓ−ＩＩＲｅＸ（ＨＴＬＶ−ＩＩＲｅＸ）のフラグメント、ｃｏｗｐｅａｃｈｌｏｒｏｔｉｃｍｏｔｔｌｅｖｉｒｕｓＧａｇ（ＣＣＭＶＧａｇ）のフラグメント、Ｐ２２Ｎのフラグメント、λＮのフラグメント、φ２１Ｎのフラグメント、酵母ＰＲＰ６のフラグメント、またはオリゴアルギニンからなるペプチドである、上記〔１〕または〔２〕記載の融合タンパク質、
〔５〕タンパク質導入ドメインが、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）またはこれらのうちいずれかのフラグメントである、上記〔１〕または〔２〕記載の融合タンパク質、
〔６〕上記〔１〕〜〔５〕いずれか記載の融合タンパク質をコードする塩基配列を含有する核酸、
〔７〕上記〔６〕記載の核酸を含有する発現ベクター、
〔８〕上記〔７〕記載の発現ベクターを含有する細胞、
〔９〕上記〔８〕記載の細胞を、融合タンパク質の発現可能な条件下で培養することを特徴とする、上記〔１〕〜〔５〕いずれか記載の融合タンパク質の製造方法、
〔１０〕ビスフォスフォネート化合物、グルコース−６−リン酸、Ｐ糖タンパク質に結合活性を持つ化合物またはアルギニンを有する分岐型ペプチドと、ＥＲａｓタンパク質との化学的結合体、
〔１１〕上記〔１〕〜〔５〕いずれか記載の融合タンパク質または上記〔１０〕記載の化学的結合体を有効成分として含有する細胞増殖促進剤、
〔１２〕Ｎａｎｏｇタンパク質をさらに含有する、上記〔１１〕記載の細胞増殖促進剤、〔１３〕細胞が胚性幹細胞または体性幹細胞である、上記〔１１〕または〔１２〕記載の細胞増殖促進剤、
〔１４〕上記〔１〕〜〔５〕いずれか記載の融合タンパク質または上記〔１０〕記載の化学的結合体と細胞とを接触させる工程を含む、細胞増殖促進方法、
〔１５〕Ｎａｎｏｇタンパク質をさらに接触させる、上記〔１４〕記載の細胞増殖促進方法、
〔１６〕細胞が胚性幹細胞または体性幹細胞である、上記〔１４〕または〔１５〕記載の細胞増殖促進方法、
〔１７〕ピノサイトーシスで上記〔１〕〜〔５〕いずれか記載の融合タンパク質または上記〔１０〕記載の化学的結合体を細胞内に取り込ませる工程を含む、上記〔１４〕〜〔１６〕いずれか記載の細胞増殖促進方法、
〔１８〕上記〔１〕〜〔５〕いずれか記載の融合タンパク質または上記〔１０〕の化学的結合体を含有する細胞。An object of the present invention is to provide a reversible cell growth promoter, particularly an embryonic stem cell (ES cell) or a somatic stem cell reversible cell growth promoter.
Currently, mass production of ES cells and somatic stem cells while maintaining pluripotency is extremely difficult and has not yet been achieved. In addition, gene transfer can be achieved by a known method such as lipofection method or retroviral vector method, but (i) it is difficult to obtain high transfer efficiency. (Ii) The transferred gene is incorporated into the chromosome, but where on the chromosome. There are various problems such as high risk of canceration because it is unknown whether it is incorporated or irreversible, and (iii) it is difficult to process a large number of cells at once due to complicated operations. Therefore, considering clinical application, it is not realistic to introduce a gene involved in cell proliferation to proliferate cells.
Therefore, an object of the present invention is to provide a cell growth promoter that can be applied clinically without using gene transfer.
The present inventor has intensively studied to solve the above problems, and by adding a fusion protein in which an HIV-derived TAT peptide is combined with an ERas (ECAT5) protein to the medium, the fusion protein is taken into cells. It has been found that cell proliferation is promoted. When the fusion protein is removed from the medium, the protein taken into the cell is decomposed and the reaction is stopped, so that the cell growth promoting action in the present invention is reversible.
From these findings, the present inventor can reversibly promote cell proliferation by incorporating ERas protein into cells, and in particular, embryos that are difficult to grow and grow while maintaining pluripotency. It was considered useful for proliferating sex stem cells and somatic stem cells, and the present invention was completed.
That is, the gist of the present invention is as follows.
[1] a fusion protein comprising a protein transduction domain and an ERas protein,
[2] The fusion protein according to [1] above, wherein the Ras protein is derived from human, monkey, cow or mouse,
[3] The fusion protein according to [1] or [2] above, wherein the protein transduction domain is HIV TAT, Antennapedia homeodomain, HSV VP22, or a fragment thereof.
[4] The protein transduction domain is a fragment of HIV Rev, a fragment of virus house Coat (FHV Coat), a fragment of brome mosaic virus Gag (BMV Gag), or human T cell leukemia virus II-II ReX XH The fragment according to the above [1] or [2], which is a fragment, a fragment of a cowpea chlorotic virus virus (CCMV Gag), a fragment of P22N, a fragment of λN, a fragment of φ21N, a fragment of yeast PRP6, or an oligoarginine Fusion protein,
[5] The fusion protein according to [1] or [2] above, wherein the protein transduction domain is fibroblast growth factor (FGF), hepatocyte growth factor (HGF), or a fragment thereof.
[6] A nucleic acid containing a base sequence encoding the fusion protein according to any one of [1] to [5] above,
[7] An expression vector containing the nucleic acid according to [6] above,
[8] A cell containing the expression vector according to [7] above,
[9] The method for producing a fusion protein according to any one of [1] to [5] above, wherein the cell according to [8] is cultured under conditions capable of expressing the fusion protein,
[10] A chemical conjugate of a bisphosphonate compound, glucose-6-phosphate, a compound having binding activity to P-glycoprotein or a branched peptide having arginine and an ERas protein,
[11] A cell growth promoter comprising as an active ingredient the fusion protein according to any one of [1] to [5] or the chemical conjugate according to [10],
[12] The cell growth promoter according to [11], further containing a Nanog protein, [13] the cell growth promoter according to [11] or [12], wherein the cells are embryonic stem cells or somatic stem cells. ,
[14] A method for promoting cell proliferation, comprising the step of bringing a cell into contact with the fusion protein according to any one of [1] to [5] above or the chemical conjugate according to [10] above,
[15] The method for promoting cell proliferation according to the above [14], further comprising contacting with Nanog protein,
[16] The method for promoting cell proliferation according to [14] or [15] above, wherein the cell is an embryonic stem cell or a somatic stem cell,
[17] The above [14] to [16], comprising the step of incorporating the fusion protein according to any of [1] to [5] or the chemical conjugate according to [10] into a cell by pinocytosis. Any one of the methods for promoting cell proliferation,
[18] A cell containing the fusion protein according to any one of [1] to [5] or the chemical conjugate of [10] above.

図１は、融合タンパク質の例で、ＥＲａｓタンパク質のＮ末端にＨＩＶ由来のＴＡＴペプチドを融合させたものを示している。これらのタンパク質は大腸菌内やＣｅｌｌＦｒｅｅ合成系で合成、精製することができる。
図２は、ＴＡＴ−ＥＲａｓタンパク質による細胞増殖促進作用を示している。FIG. 1 shows an example of a fusion protein in which an HIV-derived TAT peptide is fused to the N-terminus of the ERas protein. These proteins can be synthesized and purified in E. coli or the Cell Free synthesis system.
FIG. 2 shows the cell growth promoting action by the TAT-ERas protein.

本発明において「融合タンパク質」とは、タンパク質導入ドメインとＥＲａｓタンパク質を含んでいる融合タンパク質であり、細胞に取り込まれることにより細胞増殖活性の亢進が認められるものであればよい。この融合タンパク質を細胞に取り込ませることにより、細胞、特に胚性幹細胞や体性幹細胞などの培養の効率性と経済性の向上が期待できる。
融合タンパク質における２つのドメインの融合はいずれの可能な位置でもよく、タンパク質導入ドメインはＥＲａｓタンパク質のＮ末端またはＣ末端のいずれに融合してもよいが、好ましくはＥＲａｓタンパク質のＮ末端に融合する。
タンパク質導入ドメインは、公知の方法で融合することができ、例えば、直接的な化学結合により、あるいはリンカー分子を介して、ＥＲａｓタンパク質に融合してもよい。かかる場合、リンカー分子は、２つのドメインを連結させることのできるいずれの２価の化学構造物であってもよい。本発明の好ましいリンカー分子は短いペプチド、例えば、１〜２０個のアミノ酸残基、好ましくは１〜１０個のアミノ酸残基を有するものである。融合タンパク質は公知の遺伝子工学的な手法を用いて作製することもできる。
本明細書において「タンパク質」には、特定のアミノ酸配列（配列番号：２，４，６または８）で示されるタンパク質だけでなく、これらと生物学的機能が同等であることを限度として、その同族体（ホモログやスプライスバリアント）、変異体、誘導体などが包含される。ここでホモログとしては、ヒトのタンパク質に対応するマウスやラットなど他生物種のタンパク質が例示でき、これらはＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅ／）により同定された遺伝子の塩基配列から演繹的に同定することができる。また変異体には、天然に存在するアレル変異体、天然に存在しない変異体、及び人為的に欠失、置換、付加および挿入されることによって改変されたアミノ酸配列を有する変異体が包含される。なお、上記変異体としては、変異のないタンパク質と、少なくとも７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９５％、さらにより好ましくは９７％相同なものを挙げることができる。
従って、本明細書において「ＥＲａｓタンパク質」は、特に言及しない限り、特定アミノ酸配列（配列番号２，４，６または８）で示されるＥＲａｓタンパク質やその同族体、変異体、誘導体などを包含する趣旨で用いられる。具体的には、配列番号：２に記載のアミノ酸配列を有するマウスＥＲａｓタンパク質、配列番号：４に記載のアミノ酸配列を有するヒトＥＲａｓタンパク質、配列番号：６に記載のアミノ酸配列を有するサルＥＲａｓタンパク質、配列番号：８に記載のアミノ酸配列を有するウシＥＲａｓタンパク質、およびラットホモログなどが包含される。ここで配列番号２に示すタンパク質は、マウス由来のＥＲａｓ遺伝子によってコードされるタンパク質である。配列番号４に示すタンパク質は、ヒト由来のＥＲａｓ遺伝子によってコードされるタンパク質である。配列番号６に示すタンパク質は、サル由来のＥＲａｓ遺伝子によってコードされるタンパク質である。配列番号８に示すタンパク質は、ウシ由来のＥＲａｓ遺伝子によってコードされるタンパク質である。
ＥＲａｓタンパク質には、配列番号２，４，６または８に示す各アミノ酸配列を有するタンパク質のみならず、その相同物も包含される。該相同物としては、上記各アミノ酸配列において、１もしくは複数（通常数個）のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、且つもとのアミノ酸配列のＥＲａｓタンパク質と実質的に同等の活性を有するタンパク質を挙げることができる。
ここで実質的に同等の活性とは、該タンパク質を発現させた細胞の細胞増殖が促進される、あるいは該タンパク質を取り込ませた細胞の細胞増殖が促進されるという性質を示す。このようなＥＲａｓタンパク質の性質は、公知の方法（Ｎａｔｕｒｅ，４２３，５４１−５４５（２００３））などにより容易に測定することができる。
なお、タンパク質におけるアミノ酸の変異数および変異部位は、その活性が保持される限り制限はない。活性を消失することなくアミノ酸残基が、どのように、何個置換、挿入あるいは欠失されればよいかを決定する指標は、当業者に周知のコンピュータプログラム、例えばＤＮＡＳｔａｒｓｏｆｔｗａｒｅを用いて見出すことができる。例えば変異数は、典型的には、全アミノ酸の１０％以内であり、好ましくは全アミノ酸の５％以内であり、さらに好ましくは全アミノ酸の１％以内である。また置換されるアミノ酸は、置換後に得られるタンパク質がＥＲａｓタンパク質の活性を保持している限り、特に制限されない。この置換されるアミノ酸は、タンパク質の構造保持の観点から、アミノ酸の極性、電荷、可溶性、疎水性、親水性、両親媒性などにおいて置換前のアミノ酸と似た性質を有するアミノ酸であることが好ましい。例えば、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、ＰｈｅおよびＴｒｐは互いに非極性アミノ酸に分類されるアミノ酸であり、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ、ＡｓｎおよびＧｌｎは互いに非荷電性アミノ酸に分類されるアミノ酸であり、ＡｓｐおよびＧｌｕは互いに酸性アミノ酸に分類されるアミノ酸であり、またＬｙｓ、ＡｒｇおよびＨｉｓは互いに塩基性アミノ酸に分類されるアミノ酸である。ゆえに、これらを指標として同群に属するアミノ酸を適宜選択することができる。
ＥＲａｓタンパク質は、後述するＥＲａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する形質転換体を培養することによって製造することができる。
本発明において「タンパク質導入ドメイン」とは、タンパク質を導入することができる、またはタンパク質導入を補助することのできるものであればよく、何ら限定されない。例えば、（ｉ）公知であるＨＩＶＴＡＴ、アンテナペデイア・ホメオドメイン（Ａｎｔｏｎｎａｐｅｄｉａｈｏｍｅｏｄｏｍａｉｎ）、ＨＳＶＶＰ２２またはこれらのうちいずれかのフラグメント、（ｉｉ）ＨＩＶＲｅｖのフラグメント、ｆｌｏｃｋｈｏｕｓｅｖｉｒｕｓＣｏａｔ（ＦＨＶＣｏａｔ）のフラグメント、ｂｒｏｍｅｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓＧａｇ（ＢＭＶＧａｇ）のフラグメント、ｈｕｍａｎＴｃｅｌｌｌｅｕｋｅｍｉａ−ＩＩＲｅＸ（ＨＴＬＶ−ＩＩＲｅＸ）のフラグメント、ｃｏｗｐｅａｃｈｌｏｒｔｉｃｍｏｔｔｌｅｖｉｒｕｓＧａｇ（ＣＣＭＶＧａｇ）のフラグメント、Ｐ２２Ｎのフラグメント、λＮのフラグメント、φ２１Ｎのフラグメントまたは酵母ＰＲＰ６のフラグメント、（ｉｉｉ）オリゴアルギニンを有するペプチド、（ｉｖ）ｃｅｌｌｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇｐｅｐｔｉｄｅｓ（ＣＰＰ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）またはこれらのうちいずれかのフラグメント、などを挙げることができる。
前記（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれかのタンパク質導入ドメインを用いることによって、広範囲な細胞にＥＲａｓを細胞内に取り込ませることができる。また、目的細胞において特異的に発現するレセプターと結合する物質をタンパク質導入ドメインとして用いることによって組織あるいは細胞特異的な取り込みが可能となるため、前記（ｉｖ）のタンパク質導入ドメインを用いれば、対応するレセプターが発現した組織あるいは細胞特異的にＥＲａｓを細胞内に取り込ませることができる。
前記（ｉ）のタンパク質導入ドメインであるＨＩＶＴＡＴ、アンテナペデイア・ホメオドメイン（Ａｎｔｏｎｎａｐｅｄｉａｈｏｍｅｏｄｏｍａｉｎ）、ＨＳＶＶＰ２２には、ＨＩＶ由来のＴＡＴ（ＧｒｅｅｎａｎｄＬｏｅｗｎｓｔｅｉｎ，Ｃｅｌｌ，５６（６），１１７９−８８（１９８８）、ＦｒａｎｋｅｌａｎｄＰａｂｏ，Ｃｅｌｌ，５５（６），１１８９−９３（１９８８））、ショウジョウバエ由来のアンテナペディア蛋白（Ｖｉｖｅｓｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，２７２（２５），１６０１０−７（１９９７））、ＨＳＶ由来のＶＰ２２（ＥｌｌｉｏｔｔａｎｄＯ’Ｈａｒｅ，Ｃｅｌｌ，８８（２），２２３−３３（１９９７））のみならず、その機能が同等であることを限度として、その同族体（ホモログやスプライスバリアント）、変異体などが包含される。なお、変異体としては、変異のないタンパク質と少なくとも７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９５％、さらにより好ましくは９７％相同なものを挙げることができる。
更に前記（ｉ）のタンパク質導入ドメインは、ＨＩＶＴＡＴのフラグメント、アンテナペデイア・ホメオドメインのフラグメントまたはＨＳＶＶＰ２２のフラグメントであり、且つタンパク質導入機能またはタンパク質導入を補助する機能を有するものも包含する。該フラグメントの長さは、タンパク質導入またはタンパク質導入を補助する機能を有するのであればよく、何ら限定はされない。
ＨＩＶＴＡＴ、アンテナペデイア・ホメオドメインおよびＨＳＶＶＰ２２は、細胞膜を貫通する能力を有する蛋白トランスダクションドメイン（以下、「ＰＴＤ」という）が同定されているため、タンパク質導入ドメインであるＨＩＶＴＡＴのフラグメント、アンテナペデイア・ホメオドメインのフラグメントおよびＨＳＶＶＰ２２のフラグメントには、これらのＰＴＤからなるフラグメントも包含される。異種蛋白とＰＴＤを融合することにより、培養細胞中に導入することができることは公知であり、その作製方法も知られている（Ｆａｗｅｌｌｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１（２），６６４−８（１９９４）、ＥｌｌｉｏｔｔａｎｄＯ’Ｈａｒｅ（１９９７），Ｐｈｅｌａｎｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈ．１６，４４０−４４３（１９９８）およびＤｉｌｂｅｒｅｔａｌ．，ＧｅｎｅＴｈｅｒ．，６（１），１２−２１（１９９９）、特許番号第２７０２２８５号）。ＨＩＶＴＡＴのＰＴＤについては、ＨＩＶＴＡＴ蛋白由来の１１アミノ酸のＰＴＤに融合したβ−ガラクトシダーゼ蛋白が、生きたマウスのすべての組織に浸潤してすべての単一細胞に到達できることが報告されている（Ｓｃｈｗａｒｚｅｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８５（５４３３），１５６９−７２（１９９９））。
ＨＩＶＴＡＴのフラグメントとしては、具体的には、前記の公知文献等に記載されているものを挙げることができるが、好ましくは特許番号第２７０２２８５号に記載のＨＩＶＴＡＴフラグメントであり、更に好ましくは配列番号１３で示される配列を含有するペプチドが挙げられる。配列番号１３で示される配列を含有するペプチドとしては、例えば、配列番号１７に示されるアミノ酸配列を有するＨＩＶＴＡＴ−（４８−６０）ペプチドが挙げられる。
アルギニンに富む塩基性ペプチドは細胞膜透過能を有しており、ＨＩＶＴＡＴのフラグメントは分子中央部を全てアルギニンに置換しても（配列番号１６）、該フラグメント（ペプチド）は細胞膜透過能を有することが知られているため（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６，５８３６−５８４０（２００１））、ＨＩＶＴＡＴのフラグメント、アンテナペデイア・ホメオドメインのフラグメントおよびＨＳＶＶＰ２２のフラグメントは、複数個のアミノ酸がアルギニンに置換されていてもよく、置換後のフラグメントがタンパク質導入機能またはタンパク質導入を補助する機能を有していれば、本発明のタンパク質導入ドメインに含まれる。
前記（ｉｉ）のタンパク質導入ドメインであるＨＩＶＲｅｖのフラグメント、ｆｌｏｃｋｈｏｕｓｅｖｉｒｕｓＣｏａｔ（ＦＨＶＣｏａｔ）のフラグメント、ｂｒｏｍｅｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓＧａｇ（ＢＭＶＧａｇ）のフラグメント、ｈｕｍａｎＴｃｅｌｌｌｅｕｋｅｍｉａｖｉｒｕｓ−ＩＩＲｅＸ（ＨＴＬＶ−ＩＩＲｅＸ）のフラグメント、ｃｏｗｐｅａｃｈｌｏｒｏｔｉｃｍｏｔｔｌｅｖｉｒｕｓＧａｇ（ＣＣＭＶＧａｇ）のフラグメント、Ｐ２２Ｎのフラグメント、λＮのフラグメント、φ２１Ｎのフラグメントおよび酵母ＰＲＰ６のフラグメントは、タンパク質導入機能またはタンパク質導入を補助する機能を有するものであればよく、何ら限定されない。これらのフラグメントは、細胞膜透過能を有することが知られている（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６，５８３６−５８４０（２００１））。例えば、ＨＩＶＲｅｖのフラグメントとしてはＨＩＶＲｅｖ−（３４−５０）ペプチド（配列番号１８）、ＦＨＶＣｏａｔのフラグメントとしてはＦＨＶＣｏａｔ−（３５−４９）ペプチド（配列番号１９）、ＢＭＶＧａｇのフラグメントとしてはＢＭＶＧａｇ−（７−２５）ペプチド（配列番号２０）、ＨＴＬＶ−ＩＩＲｅＸのフラグメントとしてはＨＴＬＶ−ＩＩＲｅｘ−（４−１６）ペプチド（配列番号２１）、ＣＣＭＶＧａｇのフラグメントとしてはＣＣＭＶＧａｇ−（７−２５）ペプチド（配列番号２２）、Ｐ２２ＮのフラグメントとしてはＰ２２Ｎ−（１４−３０）ペプチド（配列番号２３）、λＮのフラグメントとしてはλＮ−（１−２２）ペプチド（配列番号２４）、φ２１Ｎのフラグメントとしてはφ２１Ｎ−（１２−２９）ペプチド（配列番号２５）、酵母ＰＲＰ６のフラグメントとしては酵母ＰＲＰ６−（１２９−１４４）ペプチド（配列番号２６）の全部または一部を有するフラグメントが挙げられる。また、これらのフラグメントの配列において複数個のアミノ酸がアルギニンに置換されてもよく、置換後のフラグメントがタンパク質導入機能またはタンパク質導入を補助する機能を有していれば、本発明のタンパク質導入ドメインに含まれる。
前記（ｉｉｉ）のタンパク質導入ドメインであるオリゴアルギニンからなるペプチドは、タンパク質導入機能またはタンパク質導入を補助する機能を有していればよく、何ら限定されない。オリゴアルギニンおよびオリゴアルギニンを有するペプチドが細胞膜透過能を有することは公知であるため（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６，５８３６−５８４０（２００１）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７７（４），２４３７−２７４３（２００２））、例えば、これらの文献に挙げられている細胞膜透過能を有するペプチドをタンパク質導入ドメインとして用いることができる。オリゴアルギニンを有するペプチドは、オリゴアルギニン（ｎ＝５〜９）を有するペプチドが好ましく、オリゴアルギニン（ｎ＝６〜８）を有するペプチドが更に好ましい。
前記（ｉｖ）のタンパク質導入ドメインである、「線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）またはこれらのうちいずれかのフラグメント」とは、公知のＦＧＦタンパク質、公知のＨＧＦタンパク質またはこれらのうちいずれかのフラグメントであり、対応するレセプター発現細胞にタンパク質を導入する機能またはタンパク質導入を補助する機能を有するものであればよく、何ら限定されない。線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）のフラグメントとの結合体が細胞内に取り込まれることは公知である（Ｒｏｊａｓ，Ｍ．ｅｔａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１６，３７０−３７５（１９９８）、Ｌｉｎ，Ｙ．Ｚ．ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０，１４２５５−１４２５８（１９９５））。従って、これらの文献に報告されているＦＧＦフラグメントをタンパク質導入ドメインとして用いることができる。ＦＧＦのフラグメントとしては、例えば、配列番号１５に記載のアミノ酸配列を含有するフラグメントを挙げることができる。
本発明には、前記の本発明融合タンパク質をコードする塩基配列を含有する核酸も含まれる。
ここで「核酸」とは、「ＲＮＡ」または「ＤＮＡ」が含まれ、その長さによって特に制限されるものではない。「ＤＮＡ」とは、特に言及しない限り、ヒトゲノムＤＮＡを含む２本鎖ＤＮＡ、ｃＤＮＡを含む１本鎖ＤＮＡ（正鎖）並びに該正鎖と相補的な配列を有する１本鎖ＤＮＡ（相補鎖）、およびこれらの断片のいずれもが含まれる。「ＲＮＡ」とは、１本鎖ＲＮＡのみならず、それに相補的な配列を有する１本鎖ＲＮＡ、さらにはそれらから構成される２本鎖ＲＮＡを包含する趣旨で用いられる。なお、核酸は機能領域の別を問うものではなく、例えば発現制御領域、コード領域、エキソン、またはイントロンを含むことができるため、上記ＤＮＡには、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、及び合成ＤＮＡのいずれもが含まれ、上記ＲＮＡには、ｔｏｔａｌＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、及び合成のＲＮＡのいずれもが含まれる。
本発明の融合タンパク質をコードする塩基配列を含有する核酸は、前記ＥＲａｓタンパク質をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドとタンパク質導入ドメインをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有する。
タンパク質導入ドメインがＨＩＶＴＡＴフラグメントである場合は、本発明の融合タンパク質をコードする塩基配列を含有する核酸は、具体的には、例えば
（ａ）配列番号：２記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドと配列番号：１３記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含有する核酸、
（ｂ）配列番号：４記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドと配列番号：１３記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含有する核酸、
（ｃ）配列番号：６記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドと配列番号：１３記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含有する核酸、
（ｄ）配列番号：８記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドと配列番号：１３記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含有する核酸、
（ｅ）配列番号：１記載の塩基配列と配列番号：１１または１２記載の塩基配列を含有する核酸、
（ｆ）配列番号：３記載の塩基配列と配列番号：１１または１２記載の塩基配列を含有する核酸、
（ｇ）配列番号：５記載の塩基配列と配列番号：１１または１２記載の塩基配列を含有する核酸、
（ｈ）配列番号：７記載の塩基配列と配列番号：１１または１２記載の塩基配列を含有する核酸、
（ｉ）配列番号：１記載の塩基配列の第１７８番目のヌクレオチドから第８５８番目までのヌクレオチドで示される塩基配列と配列番号：１１または１２記載の塩基配列を含有する核酸、
（ｊ）配列番号：３記載の塩基配列の第２５２番目のヌクレオチドから第９５０番目までのヌクレオチドで示される塩基配列と配列番号：１１または１２記載の塩基配列を含有する核酸、
（ｋ）配列番号：５記載の塩基配列の第１番目のヌクレオチドから第６９９番目までのヌクレオチドで示される塩基配列と配列番号：１１または１２記載の塩基配列を含有する核酸、
（ｌ）配列番号：７記載の塩基配列の第１１６番目のヌクレオチドから第８１７番目までのヌクレオチドで示される塩基配列と配列番号：１１または１２記載の塩基配列を含有する核酸、
（ｍ）配列番号：１０記載のアミノ酸配列をコードする核酸、
（ｎ）配列番号：１４記載のアミノ酸配列をコードする核酸、
（ｏ）配列番号：９記載の塩基配列を含有する核酸、
（ｐ）配列番号：９記載の塩基配列からなる核酸、
またはこれら（ａ）〜（ｐ）の核酸と実質的に同一の塩基配列を含有する核酸が挙げられる。
これら配列番号：１，３，５または７に記載の塩基配列を含有するポリヌクレオチドは、本明細書の配列表の配列番号：１，３，５または７に開示されている塩基配列の適当な部分をハイブリダイゼーションのプローブあるいはＰＣＲのプライマーに用いて、例えばＥＳ細胞由来のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることなどによりクローニングすることができる。該クローニングは、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ２ｎｄＥｄｔ．ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ（１９８９）等の基本書に従い、当業者ならば容易に行うことができる。
また前記（ａ）〜（ｐ）のいずれかの核酸と実質的に同一の塩基配列を含有する核酸とは、具体的には、
（ｑ）前記（ａ）〜（ｐ）のいずれかの核酸の相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸、
（ｒ）前記（ａ）〜（ｐ）のいずれかの核酸との配列同一性を示す塩基配列を含有する核酸、
（ｓ）前記（ａ）〜（ｐ）のいずれかの核酸によりコードされるタンパク質において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードする核酸、
などが挙げられる。
ここで前記（ａ）〜（ｐ）のいずれかの核酸の相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸とは、例えば前記（ａ）〜（ｐ）のいずれかの核酸の塩基配列と約４０％以上、好ましくは約６０％以上、より好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の配列同一性を有する塩基配列を含有する核酸が挙げられる。具体的には、前記（ａ）〜（ｐ）のいずれかの核酸の部分配列などが挙げられる。
ハイブリダイゼーションは、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ２ｎｄＥｄｔ．ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ（１９８９）等の基本書に記載の方法に従って行うことができる。また市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行うことができる。
「ストリンジェントな条件」とは、例えば、６×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣは、３３３ｍＭＳｏｄｉｕｍｃｉｔｒａｔｅ、３３３ｍＭＮａＣｌを示す）、０．５％ＳＤＳおよび５０％ホルムアミドを含む溶液中で４２℃にてハイブリダイズさせる条件、または６×ＳＳＣを含む（５０％ホルムアミドは含まない）溶液中で６５℃にてハイブリダイズさせる条件などが挙げられる。またハイブリダイゼーション後の洗浄の条件としては、０．１×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳの溶液中で６８℃にて洗浄するような条件が挙げられる。
前記（ａ）〜（ｐ）のいずれかの核酸との配列同一性を示す塩基配列を含有する核酸とは、例えば前記（ａ）〜（ｐ）のいずれかの核酸の塩基配列と約４０％以上、好ましくは約６０％以上、より好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の配列同一性を示す塩基配列を含有する核酸が挙げられる。具体的には、前記（ａ）〜（ｐ）のいずれかの核酸の部分配列などが挙げられる。このような配列同一性を有する核酸は、前述のハイブリダイゼーション反応やＰＣＲ反応により、または後述する核酸の改変（欠失、付加、置換）反応により作製することができる。
前記（ａ）〜（ｐ）のいずれかの核酸によりコードされるタンパク質において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードする核酸とは、人為的に作製したいわゆる改変タンパク質や、生体内に存在するアレル変異対等のタンパク質をコードする核酸を意味する。
ここでタンパク質におけるアミノ酸の変異数や変異部位は、本発明の核酸によりコードされるタンパク質の活性（細胞増殖促進活性）が保持される限り制限はない。このように活性を喪失することなくアミノ酸残基が、どのように、何個欠失、置換及び／又は付加されればよいかを決定する指標は、当業者に周知のコンピュータプログラム、例えばＤＮＡＳｔａｒｓｏｆｔｗａｒｅを用いて見出すことができる。例えば変異数は、典型的には、全アミノ酸の１０％以内であり、好ましくは全アミノ酸の５％以内であり、さらに好ましくは全アミノ酸の１％以内である。また置換されるアミノ酸は、タンパク質の構造保持の観点から、残基の極性、電荷、可溶性、疎水性、親水性並びに両親媒性など、置換前のアミノ酸と似た性質を有するアミノ酸であることが好ましい。例えば、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ及びＴｒｐは互いに非極性アミノ酸に分類されるアミノ酸であり、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ及びＧｌｎは互いに非荷電性アミノ酸に分類されるアミノ酸であり、Ａｓｐ及びＧｌｕは互いに酸性アミノ酸に分類されるアミノ酸であり、またＬｙｓ、Ａｒｇ及びＨｉｓは互いに塩基性アミノ酸に分類されるアミノ酸である。ゆえに、これらを指標として同群に属するアミノ酸を適宜選択することができる。
この改変タンパク質をコードする核酸は、例えば、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ２ｎｄＥｄｔ．ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ（１９８９）等の基本書に記載の種々の方法、例えば部位特異的変異誘発やＰＣＲ法等によって製造することができる。また市販のキットを用いて、Ｇａｐｐｅｄｄｕｐｌｅｘ法やＫｕｎｋｅｌ法などの公知の方法に従って製造することもできる。
以上のような、前記（ａ）〜（ｐ）のいずれかの核酸と実質的に同一の塩基配列を含有する本発明の核酸は、当該核酸によりコードされるタンパク質が、細胞内への導入が可能であり、導入された後は配列番号：２，４，６または８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質であることが好ましい。ここで実質的に同質の活性とは、本発明の核酸によりコードされるタンパク質を発現させた細胞は細胞増殖が促進されるという性質、あるいは当該タンパク質を取り込んだ細胞の細胞増殖が促進するという性質を指す。当該活性およびその測定については、公知の方法にて実施することができる。
本発明の核酸が２本鎖の場合、前記本発明の核酸を発現ベクターに挿入することにより、本発明のタンパク質を発現するための組換え発現ベクターを作製することができる。
ここで用いる発現ベクターとしては、用いる宿主や目的等に応じて適宜選択することができ、プラスミド、ファージベクター、ウイルスベクター等が挙げられる。
例えば、宿主が大腸菌の場合、ベクターとしては、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＢＲ３２２、ｐＣＲ３等のプラスミドベクター、λＺＡＰＩＩ、λｇｔ１１などのファージベクターが挙げられる。宿主が酵母の場合、ベクターとしては、ｐＹＥＳ２、ｐＹＥＵｒａ３などが挙げられる。宿主が昆虫細胞の場合には、ｐＡｃＳＧＨｉｓＮＴ−Ａなどが挙げられる。宿主が動物細胞の場合には、ｐＣＥＰ４、ｐＫＣＲ、ｐＣＤＭ８、ｐＧＬ２、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐＲｃ／ＣＭＶなどのプラスミドベクターや、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクターなどのウイルスベクターが挙げられる。
前記ベクターは、発現誘導可能なプロモーター、シグナル配列をコードする遺伝子、選択用マーカー遺伝子、ターミネーターなどの因子を適宜有していても良い。
また、単離精製が容易になるように、チオレドキシン、Ｈｉｓタグ、あるいはＧＳＴ（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）等との融合タンパク質として発現する配列が付加されていても良い。この場合、宿主細胞内で機能する適切なプロモーター（ｌａｃ、ｔａｃ、ｔｒｃ、ｔｒｐ、ＣＭＶ、ＳＶ４０初期プロモーターなど）を有するＧＳＴ融合タンパクベクター（ｐＧＥＸ４Ｔなど）や、Ｍｙｃ、Ｈｉｓなどのタグ配列を有するベクター（ｐｃＤＮＡ３．１／Ｍｙｃ−Ｈｉｓなど）、さらにはチオレドキシンおよびＨｉｓタグとの融合タンパク質を発現するベクター（ｐＥＴ３２ａ）などを用いることができる。
前記で作製された発現ベクターで宿主を形質転換することにより、当該発現ベクターを含有する形質転換細胞を作製することができる。
ここで用いられる宿主としては、大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞などが挙げられる。大腸菌としては、Ｅ．ｃｏｌｉＫ−１２系統のＨＢ１０１株、Ｃ６００株、ＪＭ１０９株、ＤＨ５α株、ＡＤ４９４（ＤＥ３）株などが挙げられる。また酵母としては、サッカロミセス・セルビジエなどが挙げられる。動物細胞としては、Ｌ９２９細胞、ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細胞、Ｃ１２７細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、Ｈｅｌａ細胞、２９３−ＥＢＮＡ細胞などが挙げられる。昆虫細胞としてはｓｆ９などが挙げられる。
宿主細胞への発現ベクターの導入方法としては、前記宿主細胞に適合した通常の導入方法を用いれば良い。具体的にはリン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、エレクトロポレーション法、遺伝子導入用リピッド（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ；Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社）を用いる方法などが挙げられる。導入後、選択マーカーを含む通常の培地にて培養することにより、前記発現ベクターが宿主細胞中に導入された形質転換細胞を選択することができる。
以上のようにして得られた形質転換細胞を好適な条件下で培養し続けることにより、本発明のタンパク質を製造することができる。得られたタンパク質は、一般的な生化学的精製手段により、さらに単離・精製することができる。ここで精製手段としては、塩析、イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー等が挙げられる。また本発明のタンパク質を、前述のチオレドキシンやＨｉｓタグ、ＧＳＴ等との融合タンパク質として発現させた場合は、これら融合タンパク質やタグの性質を利用した精製法により単離・精製することができる。
なお、実施例に示すように、これらの融合タンパク質は、試験管内で合成、精製することもできる。
本発明の「化学的結合体」とは、ＥＲａｓタンパク質を、ビスフォスフォネート化合物、グルコース−６−リン酸、Ｐ糖タンパク質に結合活性を持つ化合物（たとえばＢＣＲＰインヒビター）またはアルギニンを有する分岐型ペプチドと化学的に結合して得られる結合体のことである。
「ビスフォスフォネート化合物」とは、例えば、エチドロネート、アレンドロネート、リセドロネート、インカドロネート、パミドロネート等の公知の化合物を挙げることができる。ビスフォスフォネート化合物は骨芽細胞に選択的に取り込まれるため、この公知の性質を利用したビスフォスフォネート化合物との結合体が報告されている（Ｃａｌｃｉｆ．ＴｉｓｓｕｅＩｎｔ．，５９，１６８−１７３（１９９６）、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，４，１３７５−１３８０（１９９５））。そのため、ＥＲａｓタンパク質にビスフォスフォネート化合物を化学的に結合させた化学的結合体は骨芽細胞に将来分化していく間質系幹細胞特異的に取り込まれる。
「グルコース−６−リン酸」は公知の物質であり、ＥＲａｓタンパク質とグルコース−６−リン酸を化学的に結合させた化学的結合体は肝細胞および膵細胞に将来分化していく前駆細胞特異的に取り込まれる。
「Ｐ糖タンパク質に結合活性を持つ化合物」とは、例えばＢＣＲＰインヒビターを挙げることができる。具体的には、例えば、ＢＣＲＰインヒビターであるＧＦ１２０９１８などを挙げることができる。Ｐ糖タンパク質に結合活性を持つ化合物とＮａｎｏｇタンパク質と化学的に結合させることにより、化学的結合体はＳＰ細胞と呼ばれる各種体性幹細胞特異的に取り込まれる。
「アルギニンを有する分岐型ペプチド」とは、例えば、文献Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４１，７９２５−７９３０，（２００２）に記載されているような細胞膜透過能をもつ８個程度のアルギニンを有する分岐型ペプチドのことであり、具体的には、該文献の（Ｒ_２）_４ペプチドや（ＲＧ_３Ｒ）_４ペプチドなどが挙げられる。
ＥＲａｓタンパク質は前記のように作製することができる。精製されたＥＲａｓタンパク質と上記物質の化学的結合体は公知の方法に従って化学的に結合させて作製することができる。例えば、アミノ基を持つリンカーをつけることで酸アミド結合など公知の方法に従って化学的に結合させることによって作製することができる。
本発明の「細胞増殖促進剤」とは、上記の本発明の融合タンパク質あるいは化学的結合体のうち少なくとも１つを含有する剤のことであり、細胞に取り込まれることによって該細胞の増殖を促進する。
ここで細胞は、特に限定されないが、哺乳動物細胞を挙げることができる。哺乳動物細胞とは、ヒト、サル、ウシ、ラットやマウス等の哺乳動物の組織・臓器細胞またはこれら由来の細胞であって、個体の細胞、個体から取り出した初代細胞、または培養細胞のいずれでもよい。好ましくは、市販の培養細胞（ＡＴＣＣ社など）、胚性幹細胞や体性幹細胞などの幹細胞を挙げることができ、より好ましくはヒト胚性幹細胞やヒト体性幹細胞である。
また、マウスＥＳ細胞にＮａｎｏｇタンパク質を強制発現させるとＬＩＦなしでも万能性を維持したまま継代することができるため（Ｃｅｌｌ，１１３，６３１−６４２（２００３））、本発明の細胞増殖促進剤は本発明の融合タンパク質あるいは化学的結合体だけでなく、Ｎａｎｏｇ（ＥＣＡＴ４）タンパク質も含有されていてもよい。
本発明の「Ｎａｎｏｇタンパク質」とは、Ｎａｎｏｇタンパク質のみに限定されず、本発明の融合タンパク質や化学的結合体と同様に、細胞内に取り込まれやすくした態様のものも包含される。本発明のＮａｎｏｇタンパク質は、そのアミノ酸配列および塩基配列が公知であるため（ＷＯ０２／０９７０９０Ａ１）、前記のＥＲａｓタンパク質、融合タンパク質、あるいは化学的結合体と同様の方法にて作製することができる。
本発明の細胞増殖促進剤を作用させるには、当該剤を直接体内に導入するｉｎｖｉｖｏ法、ヒトからある種の細胞を採取し、体外で該細胞に添加してその細胞を体内に戻すｅｘｖｉｖｏ法、および培養細胞に添加するｉｎｖｉｔｒｏ法がある。
投与方法としては、ｅｘｖｉｖｏ法またはｉｎｖｉｔｒｏ法であれば、細胞を培養している培養液中に添加、あるいは細胞に直接添加すればよい。添加量は、細胞の種類、細胞数等により適宜調整することができるが、細胞毒性が認められず細胞増殖促進活性が認められればよい。製剤中の本発明の融合タンパク質または結合体の添加量は通常培地に０．０００１μＭ〜１０００μＭ、好ましくは０．０００１μＭ〜１０μＭ、より好ましくは０．０００１μＭ〜１μＭであり、これを１〜数日に１回添加するのが好ましい。
また、ｉｎｖｉｖｏ法の投与方法としては、皮下投与、皮内投与、筋肉内投与、静脈内投与などが挙げられる。製剤中の本発明の融合タンパク質または結合体の投与量は、治療目的の疾患、患者の年齢、体重などにより適宜調整することができるが、通常０．０００１ｍｇ〜１０００ｍｇ、好ましくは０．００１ｍｇ〜１００ｍｇ、より好ましくは０．０１ｍｇ〜１０ｍｇであり、これを１〜数日に１回投与するのが好ましい。
細胞増殖促進剤の有効成分である本発明の融合タンパク質あるいは結合体は、そのままもしくは自体公知の薬学的に許容される担体（賦形剤、増量剤、結合剤、滑沢剤などが含まれる）、慣用の添加剤などと混合して試薬あるいは医薬組成物として調製することができ、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）または培地等を含むものであってもよい。当該医薬組成物は、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤、注射剤、点滴剤、外用剤、坐剤などに調整することができる。
本発明の「細胞増殖促進方法」とは、本発明の融合タンパク質あるいは化学的結合体のいずれかを細胞に接触させることにより、細胞増殖を促進する方法である。具体的には、例えば、本発明の細胞増殖促進剤を細胞培養培地中に添加して細胞に接触させ、細胞に取り込ませることによって細胞増殖を促進する方法のことである。
本発明の細胞増殖促進方法は、本発明の融合タンパク質あるいは化学的結合体のいずれかを細胞と接触させた後に、細胞のピノサイトーシス（飲作用）により取り込まれ、細胞の増殖が促進される方法であってもよい。細胞のピノサイトーシスを利用した取り込み（導入）は、例えば、市販のキットであるＩｎｆｌｕｘ（登録商標）ＰｉｎｏｃｙｔｉｃＣｅｌｌ−ＬｏａｄｉｎｇＲｅａｇｅｎｔ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅ社）を用いることによって実施することができる。
本発明の細胞増殖促進方法は、本発明の融合タンパク質あるいは化学的結合体だけでなく、さらに前記Ｎａｎｏｇタンパク質を接触させる工程を加えることもできる。
細胞は、特に限定されないが、哺乳動物細胞を挙げることができる。哺乳動物細胞とは、ヒト、サル、ウシ、ラットやマウス等の哺乳動物の組織・臓器細胞またはこれら由来の細胞であって、個体の細胞、個体から取り出した初代細胞、または培養細胞のいずれでもよい。好ましくは、市販の培養細胞（ＡＴＣＣ社など）、胚性幹細胞や体性幹細胞などの幹細胞を挙げることができ、より好ましくはヒト胚性幹細胞やヒト体性幹細胞である。
前記の細胞増殖促進剤あるいは細胞増殖促進方法により、本発明の融合タンパク質あるいは化学的結合体を含有する細胞を作製することができる。In the present invention, the “fusion protein” is a fusion protein containing a protein transduction domain and an ERas protein, and may be any protein that enhances cell proliferation activity when incorporated into cells. By incorporating this fusion protein into cells, it is expected to improve the efficiency and economy of culturing cells, particularly embryonic stem cells and somatic stem cells.
The fusion of the two domains in the fusion protein may be at any possible position, and the protein transduction domain may be fused to either the N-terminus or C-terminus of the ERas protein, but is preferably fused to the N-terminus of the ERas protein.
The protein transduction domain can be fused by a known method, for example, it may be fused to the ERas protein by direct chemical bond or via a linker molecule. In such a case, the linker molecule may be any divalent chemical structure capable of linking two domains. Preferred linker molecules of the invention are short peptides, such as those having 1-20 amino acid residues, preferably 1-10 amino acid residues. The fusion protein can also be prepared using a known genetic engineering technique.
As used herein, the term “protein” includes not only a protein represented by a specific amino acid sequence (SEQ ID NO: 2, 4, 6 or 8), but also its biological function is limited to the same. Homologues (homologs and splice variants), mutants, derivatives and the like are included. Here, examples of homologs include proteins of other species such as mice and rats corresponding to human proteins, and these were identified by HomoLoGene (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/HomoloGene/). It can be identified a priori from the base sequence of the gene. Variants also include naturally occurring allelic variants, non-naturally occurring variants, and variants having amino acid sequences modified by artificial deletions, substitutions, additions and insertions. . Examples of the mutant include those that are at least 70%, preferably 80%, more preferably 95%, and still more preferably 97% homologous to a protein having no mutation.
Therefore, in the present specification, “ERas protein” includes Eras protein represented by a specific amino acid sequence (SEQ ID NO: 2, 4, 6 or 8), its homologues, mutants, derivatives and the like, unless otherwise specified. Used in Specifically, mouse ERas protein having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2, human ERas protein having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4, monkey ERas protein having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6 A bovine ERas protein having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 8 and a rat homolog are included. Here, the protein shown in SEQ ID NO: 2 is a protein encoded by the mouse-derived ERas gene. The protein shown in SEQ ID NO: 4 is a protein encoded by a human-derived ERas gene. The protein shown in SEQ ID NO: 6 is a protein encoded by the monkey-derived ERas gene. The protein shown in SEQ ID NO: 8 is a protein encoded by the bovine Eras gene.
The ERas protein includes not only a protein having each amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, 4, 6 or 8, but also homologues thereof. The homologue consists of an amino acid sequence in which one or more (usually several) amino acids are deleted, substituted or added in each of the above amino acid sequences, and is substantially equivalent to the ERas protein of the original amino acid sequence. Can be mentioned.
Here, the substantially equivalent activity indicates a property that cell growth of cells expressing the protein is promoted or cell growth of cells incorporating the protein is promoted. Such properties of ERas protein can be easily measured by a known method (Nature, 423, 541-545 (2003)).
The number of amino acid mutations and mutation sites in the protein are not limited as long as the activity is maintained. Indicators that determine how many amino acid residues need to be substituted, inserted or deleted without loss of activity are found using computer programs well known to those skilled in the art, such as DNA Star software. be able to. For example, the number of mutations is typically within 10% of all amino acids, preferably within 5% of all amino acids, and more preferably within 1% of all amino acids. The amino acid to be substituted is not particularly limited as long as the protein obtained after the substitution retains the activity of the ERas protein. The amino acid to be substituted is preferably an amino acid having properties similar to the amino acid before substitution in terms of amino acid polarity, charge, solubility, hydrophobicity, hydrophilicity, amphiphilicity, etc. from the viewpoint of maintaining the structure of the protein. . For example, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Met, Phe and Trp are amino acids classified as non-polar amino acids, and Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn and Gln are mutually uncharged amino acids. Asp and Glu are amino acids that are classified as acidic amino acids, and Lys, Arg, and His are amino acids that are classified as basic amino acids. Therefore, amino acids belonging to the same group can be appropriately selected using these as indices.
The ERas protein can be produced by culturing a transformant containing a polynucleotide encoding the ERas protein described later.
In the present invention, the “protein introduction domain” is not particularly limited as long as it is capable of introducing a protein or assisting protein introduction. For example, (i) a known HIV TAT, Antennapedia homeodomain, HSV VP22 or any fragment thereof, (ii) a fragment of HIV Rev, a block house virus Coat (FHV Coat) Fragment, fragment of brome mosaic virus Gag (BMV Gag), fragment of human T cell leukemia-II ReX (HTLV-II ReX), fragment of cowpea motley mottle virus Gag (NCM21, CCMV Pag) Or a fragment of yeast PRP6, (iii) oligo Peptides with Ginin, and the like, (iv) cell penetrating peptides (CPP), fibroblast growth factor (FGF), hepatocyte growth factor (HGF) or any fragment of these.
By using the protein transduction domain of any one of (i) to (iii) above, ERas can be taken into a wide range of cells. In addition, since a tissue or cell-specific uptake can be achieved by using a substance that binds to a receptor that is specifically expressed in a target cell as a protein transduction domain, the use of the protein transduction domain of (iv) above corresponds. ERas can be incorporated into cells in a tissue-specific or cell-specific manner where the receptor is expressed.
HIV TAT, which is the protein transduction domain of (i), Antennapedia homeodomain, and HSV VP22, include TAT derived from HIV (Green and Loewstein, Cell, 56 (6), 1179-88 (1988). ), Frankel and Pabo, Cell, 55 (6), 1189-93 (1988)), Drosophila-derived antennapedia protein (Vives et al., J. Biol. Chem, 272 (25), 16010-7 (1997). ), VP22 derived from HSV (Elliot and O'Hare, Cell, 88 (2), 223-33 (1997)), and its homologues (homologue and Price variants), such variants. Examples of mutants include those that are at least 70%, preferably 80%, more preferably 95%, and even more preferably 97% homologous to a protein without mutation.
Further, the protein transduction domain (i) includes a fragment of HIV TAT, a fragment of the antennapedia homeodomain or a fragment of HSV VP22, and also has a protein transduction function or a function of assisting protein transduction. The length of the fragment is not particularly limited as long as it has a function of assisting protein introduction or protein introduction.
Since HIV TAT, antenna pediae homeodomain and HSV VP22 have been identified as protein transduction domains (hereinafter referred to as “PTDs”) having the ability to penetrate the cell membrane, fragments of HIV TAT, a protein transduction domain, The fragments of the antenna pediae homeodomain and the fragment of HSV VP22 also include fragments comprising these PTDs. It is known that it can be introduced into cultured cells by fusing a heterologous protein and PTD, and its production method is also known (Fawell et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91 ( 2), 664-8 (1994), Elliot and O'Hare (1997), Phelan et al., Nature Biotech. 16, 440-443 (1998) and Dilber et al., Gene Ther., 6 (1), 12-21 (1999), Patent No. 2702285). Regarding PTD of HIV TAT, β-galactosidase protein fused to 11 amino acid PTD derived from HIV TAT protein has been reported to infiltrate all tissues of living mice and reach all single cells ( Schwarze et al., Science, 285 (5433), 1569-72 (1999)).
Specific examples of the fragment of HIV TAT include those described in the above-mentioned publicly known literatures, but the HIV TAT fragment described in Patent No. 2702285 is preferred, and the sequence is more preferred. Peptides containing the sequence shown by No. 13 are mentioned. Examples of the peptide containing the sequence represented by SEQ ID NO: 13 include HIV TAT- (48-60) peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 17.
The basic peptide rich in arginine has cell membrane permeability, and even if the HIV TAT fragment substitutes arginine for the entire center of the molecule (SEQ ID NO: 16), the fragment (peptide) has cell membrane permeability. (J. Biol. Chem., 276, 5836-5840 (2001)), the HIV TAT fragment, the antennapedia homeodomain fragment, and the HSV VP22 fragment consist of multiple amino acids arginine. If the fragment after substitution has a protein introduction function or a function to assist protein introduction, it is included in the protein introduction domain of the present invention.
Fragment of HIV Rev which is the protein transduction domain of (ii), fragment of flock house virus Coat (FHV Coat), fragment of brome mosaic virus Gag (BMV Gag), human T cell leukemiaVIIHXReVXHReVX ) Fragments, cowpea chlorotic virus Gag (CCMV Gag) fragment, P22 N fragment, λN fragment, φ21N fragment and yeast PRP6 fragment should have a protein introduction function or a function to assist protein introduction. What is necessary is not limited at all. These fragments are known to have cell membrane permeability (J. Biol. Chem., 276, 5836-5840 (2001)). For example, HIV Rev- (34-50) peptide (SEQ ID NO: 18) as HIV Rev fragment, FHV Coat- (35-49) peptide (SEQ ID NO: 19) as FHV Coat fragment, and BMV Gag fragment as FMV Coat fragment BMV Gag- (7-25) peptide (SEQ ID NO: 20), HTLV-II ReX fragment as HTLV-II Rex- (4-16) peptide (SEQ ID NO: 21), CCMV Gag fragment as CCMV Gag- ( 7-25) Peptide (SEQ ID NO: 22), P22 N fragment as P22 N- (14-30) peptide (SEQ ID NO: 23), λN fragment as λN- (1-22) peptide (SEQ ID NO: 24) , The fragment of φ21N is φ21N- (1 -29) peptide (SEQ ID NO: 25), as a fragment of the yeast PRP6 include fragments having all or part of the yeast PRP6- (129-144) peptide (SEQ ID NO: 26). Further, in the sequence of these fragments, a plurality of amino acids may be substituted with arginine, and if the substituted fragment has a protein introduction function or a function for assisting protein introduction, the protein introduction domain of the present invention may be used. included.
The peptide consisting of oligoarginine which is the protein introduction domain of (iii) is not limited at all as long as it has a protein introduction function or a function for assisting protein introduction. Since it is known that oligoarginine and peptides having oligoarginine have cell membrane permeability (J. Biol. Chem., 276, 5836-5840 (2001), J. Biol. Chem., 277 (4), 2437). -2743 (2002)), for example, peptides having cell membrane permeability mentioned in these documents can be used as the protein transduction domain. The peptide having oligoarginine is preferably a peptide having oligoarginine (n = 5 to 9), and more preferably a peptide having oligoarginine (n = 6 to 8).
The protein transduction domain of (iv), “fibroblast growth factor (FGF), hepatocyte growth factor (HGF) or any fragment thereof” refers to a known FGF protein, a known HGF protein, or Any fragment of these may be used as long as it has a function of introducing a protein into a corresponding receptor-expressing cell or a function of assisting protein introduction, and is not limited at all. It is known that conjugates with fragments of fibroblast growth factor (FGF) are taken up into cells (Rojas, M. et al., Nat. Biotechnol., 16, 370-375 (1998), Lin, YZ et al., J. Biol. Chem. 270, 14255-14258 (1995)). Therefore, the FGF fragment reported in these documents can be used as a protein transduction domain. Examples of FGF fragments include a fragment containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 15.
The present invention also includes a nucleic acid containing a base sequence encoding the aforementioned fusion protein of the present invention.
Here, the “nucleic acid” includes “RNA” or “DNA” and is not particularly limited by the length thereof. Unless otherwise specified, “DNA” refers to double-stranded DNA including human genomic DNA, single-stranded DNA including cDNA (positive strand), and single-stranded DNA having a sequence complementary to the positive strand (complementary strand). , And any of these fragments. “RNA” is used to include not only single-stranded RNA but also single-stranded RNA having a sequence complementary thereto, and further double-stranded RNA composed thereof. It should be noted that the nucleic acid is not limited to the functional region, and can include, for example, an expression control region, a coding region, an exon, or an intron. Therefore, the DNA includes any of cDNA, genomic DNA, and synthetic DNA. The RNA includes total RNA, mRNA, rRNA, and synthetic RNA.
The nucleic acid containing the base sequence encoding the fusion protein of the present invention contains a polynucleotide consisting of the base sequence encoding the ERas protein and a polynucleotide consisting of the base sequence encoding the protein transduction domain.
When the protein transduction domain is an HIV TAT fragment, a nucleic acid containing a base sequence encoding the fusion protein of the present invention specifically includes, for example,
(A) a nucleic acid containing a polynucleotide encoding the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 and a polynucleotide encoding the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 13;
(B) a nucleic acid containing a polynucleotide encoding the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4 and a polynucleotide encoding the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 13;
(C) a nucleic acid comprising a polynucleotide encoding the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6 and a polynucleotide encoding the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 13;
(D) a nucleic acid containing a polynucleotide encoding the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 8 and a polynucleotide encoding the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 13;
(E) a nucleic acid comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 11 or 12,
(F) a nucleic acid comprising the base sequence described in SEQ ID NO: 3 and the base sequence described in SEQ ID NO: 11 or 12,
(G) a nucleic acid containing the base sequence described in SEQ ID NO: 5 and the base sequence described in SEQ ID NO: 11 or 12,
(H) a nucleic acid comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 7 and the base sequence set forth in SEQ ID NO: 11 or 12,
(I) a nucleic acid comprising the base sequence represented by nucleotides from the 178th nucleotide to the 858th nucleotide of the base sequence described in SEQ ID NO: 1 and the base sequence described in SEQ ID NO: 11 or 12,
(J) a nucleic acid containing the base sequence represented by nucleotides from the 252nd nucleotide to the 950th nucleotide of the base sequence described in SEQ ID NO: 3 and the base sequence described in SEQ ID NO: 11 or 12,
(K) a nucleic acid comprising the base sequence represented by nucleotides from the first nucleotide to the 699th nucleotide of the base sequence described in SEQ ID NO: 5 and the base sequence described in SEQ ID NO: 11 or 12,
(L) a nucleic acid comprising the base sequence represented by the 116th to 817th nucleotides of the base sequence described in SEQ ID NO: 7 and the base sequence described in SEQ ID NO: 11 or 12,
(M) a nucleic acid encoding the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 10;
(N) a nucleic acid encoding the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 14;
(O) a nucleic acid containing the base sequence set forth in SEQ ID NO: 9;
(P) a nucleic acid comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 9;
Or the nucleic acid containing the substantially same base sequence as the nucleic acid of these (a)-(p) is mentioned.
These polynucleotides containing the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1, 3, 5 or 7 are suitable for the nucleotide sequence disclosed in SEQ ID NO: 1, 3, 5 or 7 in the sequence listing of the present specification. The portion can be cloned, for example, by screening a cDNA library derived from ES cells using the probe for hybridization or a primer for PCR. The cloning can be performed, for example, in Molecular Cloning 2nd Edt. A person skilled in the art can easily carry out according to a basic book such as Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989).
In addition, the nucleic acid containing substantially the same base sequence as any of the nucleic acids (a) to (p) above specifically includes:
(Q) a nucleic acid that hybridizes under stringent conditions to the complementary strand of the nucleic acid of any one of (a) to (p) above,
(R) a nucleic acid containing a base sequence exhibiting sequence identity with any of the nucleic acids of (a) to (p) above,
(S) a nucleic acid encoding a protein containing an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, substituted and / or added in the protein encoded by any of the nucleic acids of (a) to (p) above,
Etc.
Here, the nucleic acid hybridizing under stringent conditions to the complementary strand of any of the nucleic acids (a) to (p) is, for example, the base of the nucleic acid of any of the above (a) to (p) About 40% or more, preferably about 60% or more, more preferably about 70% or more, more preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more of the sequence. And a nucleic acid containing the nucleotide sequence. Specifically, a partial sequence of the nucleic acid of any one of (a) to (p) above can be mentioned.
Hybridization is a method known per se or a method analogous thereto, for example, Molecular Cloning 2nd Edt. It can be performed according to a method described in a basic book such as Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). Moreover, when using a commercially available library, it can carry out according to the method as described in an attached instruction manual.
“Stringent conditions” means, for example, hybridization at 42 ° C. in a solution containing 6 × SSC (20 × SSC represents 333 mM Sodium citrate, 333 mM NaCl), 0.5% SDS and 50% formamide. And conditions for hybridization at 65 ° C. in a solution containing 6 × SSC (not containing 50% formamide). The conditions for washing after hybridization include washing at 68 ° C. in a solution of 0.1 × SSC and 0.5% SDS.
The nucleic acid containing a base sequence showing sequence identity with any one of the nucleic acids (a) to (p) is, for example, about 40% of the base sequence of any one of the nucleic acids (a) to (p) Or more, preferably about 60% or more, more preferably about 70% or more, more preferably about 80% or more, still more preferably about 90% or more, most preferably about 95% or more. Nucleic acid to be used. Specifically, a partial sequence of the nucleic acid of any one of (a) to (p) above can be mentioned. Nucleic acids having such sequence identity can be prepared by the aforementioned hybridization reaction or PCR reaction, or by a nucleic acid modification (deletion, addition, substitution) reaction described later.
A nucleic acid encoding a protein containing an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, substituted and / or added in the protein encoded by any of the nucleic acids (a) to (p) above is artificially Means a nucleic acid encoding a protein such as a so-called modified protein or an allelic variant present in the living body.
Here, the number of amino acid mutations and mutation sites in the protein are not limited as long as the activity of the protein encoded by the nucleic acid of the present invention (cell growth promoting activity) is retained. An indicator for determining how and how many amino acid residues need to be deleted, substituted and / or added without loss of activity in this way is a computer program well known to those skilled in the art, such as DNA Star. It can be found using software. For example, the number of mutations is typically within 10% of all amino acids, preferably within 5% of all amino acids, and more preferably within 1% of all amino acids. In addition, from the viewpoint of maintaining the structure of the protein, the amino acid to be substituted may be an amino acid having properties similar to the amino acid before substitution, such as residue polarity, charge, solubility, hydrophobicity, hydrophilicity, and amphiphilicity. preferable. For example, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Met, Phe and Trp are amino acids classified as nonpolar amino acids, and Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn and Gln are mutually non-charged amino acids. Asp and Glu are amino acids that are classified as acidic amino acids, and Lys, Arg, and His are amino acids that are classified as basic amino acids. Therefore, amino acids belonging to the same group can be appropriately selected using these as indices.
Nucleic acids encoding this modified protein are described in, for example, Molecular Cloning 2nd Edt. It can be produced by various methods described in basic books such as Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), such as site-directed mutagenesis and PCR. Moreover, it can also manufacture in accordance with well-known methods, such as Gapped duplex method and Kunkel method, using a commercially available kit.
As described above, the nucleic acid of the present invention containing substantially the same base sequence as any of the nucleic acids (a) to (p) described above is such that the protein encoded by the nucleic acid can be introduced into cells. It is preferably a protein that has substantially the same quality of activity as the protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2, 4, 6 or 8 after being introduced. Here, substantially the same quality of activity means that a cell expressing a protein encoded by the nucleic acid of the present invention has a property that cell growth is promoted, or a cell that has incorporated the protein promotes cell growth. Point to. The activity and the measurement thereof can be performed by a known method.
When the nucleic acid of the present invention is double-stranded, a recombinant expression vector for expressing the protein of the present invention can be prepared by inserting the nucleic acid of the present invention into an expression vector.
The expression vector used here can be appropriately selected according to the host to be used, the purpose, etc., and includes plasmids, phage vectors, virus vectors and the like.
For example, when the host is E. coli, examples of the vector include plasmid vectors such as pUC118, pUC119, pBR322, and pCR3, and phage vectors such as λZAPII and λgt11. When the host is yeast, examples of the vector include pYES2, pYEUra3, and the like. When the host is an insect cell, pAcSGHisNT-A and the like can be mentioned. When the host is an animal cell, plasmid vectors such as pCEP4, pKCR, pCDM8, pGL2, pcDNA3.1, pRc / RSV, pRc / CMV, and viral vectors such as retrovirus vectors, adenovirus vectors, and adeno-associated virus vectors Is mentioned.
The vector may appropriately have factors such as a promoter capable of inducing expression, a gene encoding a signal sequence, a selection marker gene, and a terminator.
Further, a sequence expressed as a fusion protein with thioredoxin, His tag, GST (glutathione S-transferase) or the like may be added so that isolation and purification can be facilitated. In this case, a GST fusion protein vector (such as pGEX4T) having an appropriate promoter (such as lac, tac, trc, trp, CMV, SV40 early promoter) that functions in the host cell, or a vector having a tag sequence such as Myc, His, etc. (E.g. pcDNA3.1 / Myc-His), a vector (pET32a) expressing a fusion protein with thioredoxin and His tag can be used.
By transforming the host with the expression vector prepared above, a transformed cell containing the expression vector can be prepared.
Examples of the host used here include Escherichia coli, yeast, insect cells, animal cells and the like. Examples of E. coli include E. coli. E. coli K-12 strain HB101 strain, C600 strain, JM109 strain, DH5α strain, AD494 (DE3) strain, and the like. Examples of yeast include Saccharomyces cerevisiae. Examples of animal cells include L929 cells, BALB / c3T3 cells, C127 cells, CHO cells, COS cells, Vero cells, Hela cells, and 293-EBNA cells. Insect cells include sf9.
As a method for introducing the expression vector into the host cell, a normal method suitable for the host cell may be used. Specific examples include a calcium phosphate method, a DEAE-dextran method, an electroporation method, and a method using a lipid for gene transfer (Lipofectamine, Lipofectin; Gibco-BRL). After the introduction, a transformed cell in which the expression vector is introduced into the host cell can be selected by culturing in a normal medium containing a selection marker.
The protein of the present invention can be produced by continuing to culture the transformed cells obtained as described above under suitable conditions. The obtained protein can be further isolated and purified by general biochemical purification means. Examples of the purification means include salting out, ion exchange chromatography, adsorption chromatography, affinity chromatography, gel filtration chromatography and the like. In addition, when the protein of the present invention is expressed as a fusion protein with the aforementioned thioredoxin, His tag, GST or the like, it can be isolated and purified by a purification method utilizing the properties of these fusion protein and tag.
As shown in the examples, these fusion proteins can be synthesized and purified in vitro.
The “chemical conjugate” of the present invention refers to a branched peptide having Eras protein, a compound having a binding activity to bisphosphonate compound, glucose-6-phosphate, P-glycoprotein (for example, BCRP inhibitor) or arginine. It is a conjugate obtained by chemically binding to.
Examples of the “bisphosphonate compound” include known compounds such as etidronate, alendronate, risedronate, incadronate, and pamidronate. Since bisphosphonate compounds are selectively taken up into osteoblasts, conjugates with bisphosphonate compounds utilizing this known property have been reported (Calcif. Tissue Int., 59, 168-173). (1996), Bioorg. Med. Chem. Lett., 4, 1375-1380 (1995)). Therefore, a chemical conjugate obtained by chemically binding a bisphosphonate compound to the ERas protein is taken up specifically by stromal stem cells that will be differentiated into osteoblasts in the future.
“Glucose-6-phosphate” is a known substance, and a chemical conjugate obtained by chemically binding Eras protein and glucose-6-phosphate is specific to progenitor cells that will differentiate into hepatocytes and pancreatic cells in the future. Is captured.
Examples of the “compound having binding activity to P glycoprotein” include BCRP inhibitors. Specific examples include GF120918, which is a BCRP inhibitor. By chemically binding a compound having binding activity to P-glycoprotein and Nanog protein, the chemical conjugate is specifically taken up by various somatic stem cells called SP cells.
The “branched peptide having arginine” refers to a branched peptide having about 8 arginines having cell membrane permeability as described in, for example, the document Biochemistry, 41, 7925-7930, (2002). Yes, specifically, (R ₂ ) ₄ Peptides and (RG ₃ R) ₄ Peptide etc. are mentioned.
ERas protein can be produced as described above. The purified ERas protein and the chemical conjugate of the above substance can be prepared by chemically binding them according to a known method. For example, it can be produced by attaching a linker having an amino group and chemically bonding according to a known method such as an acid amide bond.
The “cell growth promoting agent” of the present invention is an agent containing at least one of the above-mentioned fusion protein or chemical conjugate of the present invention, and promotes the proliferation of the cell by being taken up by the cell. To do.
Here, the cells are not particularly limited, but may include mammalian cells. Mammalian cells are tissue / organ cells of mammals such as humans, monkeys, cows, rats and mice, or cells derived therefrom, and any of individual cells, primary cells removed from individuals, or cultured cells can be used. Good. Preferred examples include commercially available cultured cells (such as ATCC) and stem cells such as embryonic stem cells and somatic stem cells, and more preferred are human embryonic stem cells and human somatic stem cells.
In addition, if Nanog protein is forcibly expressed in mouse ES cells, it can be passaged without maintaining LIF while maintaining universality (Cell, 113, 631-642 (2003)). In addition to the fusion protein or chemical conjugate of the present invention, Nanog (ECAT4) protein may also be contained.
The “Nanog protein” of the present invention is not limited to the Nanog protein, and includes those having an aspect that is easily taken up into cells, like the fusion protein and chemical conjugate of the present invention. The Nanog protein of the present invention has a known amino acid sequence and base sequence (WO 02/097090 A1), and therefore can be produced by the same method as the above-mentioned ERas protein, fusion protein, or chemical conjugate. .
In order to make the cell growth promoting agent of the present invention act, an in vivo method in which the agent is directly introduced into the body, a certain type of cell is collected from a human, added to the cell outside the body, and the cell is returned to the body ex There are a vivo method and an in vitro method of adding to cultured cells.
As an administration method, if it is an ex vivo method or an in vitro method, it may be added to the culture medium in which the cells are cultured or added directly to the cells. The amount added can be appropriately adjusted depending on the type of cells, the number of cells, etc., but it is sufficient that no cell toxicity is observed and cell growth promoting activity is recognized. The addition amount of the fusion protein or conjugate of the present invention in the preparation is usually 0.0001 μM to 1000 μM, preferably 0.0001 μM to 10 μM, more preferably 0.0001 μM to 1 μM in the medium, It is preferable to add once.
Examples of the in vivo administration method include subcutaneous administration, intradermal administration, intramuscular administration, intravenous administration and the like. The dose of the fusion protein or conjugate of the present invention in the preparation can be appropriately adjusted depending on the disease to be treated, the age, weight, etc. of the patient, but is usually 0.0001 mg to 1000 mg, preferably 0.001 mg to 100 mg. More preferably, the dose is 0.01 mg to 10 mg, which is preferably administered once to several days.
The fusion protein or conjugate of the present invention, which is an active ingredient of a cell growth promoter, is used as it is or a pharmaceutically acceptable carrier known per se (including excipients, extenders, binders, lubricants, etc.) These can be prepared as a reagent or a pharmaceutical composition by mixing with conventional additives and the like, and may contain physiological saline, phosphate buffered saline (PBS), a medium, or the like. The pharmaceutical composition can be adjusted to tablets, pills, capsules, powders, granules, syrups, injections, drops, external preparations, suppositories, and the like.
The “cell proliferation promoting method” of the present invention is a method of promoting cell proliferation by bringing the fusion protein or chemical conjugate of the present invention into contact with cells. Specifically, for example, it is a method of promoting cell growth by adding the cell growth promoting agent of the present invention to a cell culture medium, bringing it into contact with the cell, and incorporating it into the cell.
In the cell growth promotion method of the present invention, either the fusion protein of the present invention or a chemical conjugate is brought into contact with a cell, and then taken up by cell pinocytosis (promoting action) to promote cell proliferation. It may be a method. Uptake (introduction) using cell pinocytosis can be carried out by using, for example, a commercially available kit, Influx (registered trademark) Pinotic Cell-Loading Reagent (Molecular Probe).
The cell growth promotion method of the present invention can include a step of contacting not only the fusion protein or chemical conjugate of the present invention but also the Nanog protein.
Although a cell is not specifically limited, A mammalian cell can be mentioned. Mammalian cells are tissue / organ cells of mammals such as humans, monkeys, cows, rats and mice, or cells derived therefrom, and any of individual cells, primary cells removed from individuals, or cultured cells can be used. Good. Preferred examples include commercially available cultured cells (such as ATCC) and stem cells such as embryonic stem cells and somatic stem cells, and more preferred are human embryonic stem cells and human somatic stem cells.
Cells containing the fusion protein or chemical conjugate of the present invention can be prepared by the above-described cell growth promoter or cell growth promotion method.

以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。
［実施例１］
（１）ＴＡＴ−ＥＲａｓ発現ベクターの構築
オリゴＤＮＡのＴＡＴ−Ｓ（配列番号１１）とＴＡＴ−ＡＳ（配列番号１２）を９４度で１分間変性の後、徐々に室温に戻し２本鎖ＤＮＡを作製した。これをｐＣＤＮＡ３．１のＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩ部位にライゲーションした（ｐＣＤＮＡ３．１−ＴＡＴ）。このｐＣＤＮＡ３．１−ＴＡＴのＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＶ部位にＧａｔｅｗａｙｒｆＢＣａｓｅｔｔｅを挿入してｐＣＤＮＡ３．１−ＴＡＴ−ＧＷを作製した。ｐＣＤＮＡ３．１−ＴＡＴ−ＧＷとｐＥｎｔｅｒ−ｍＥＲａｓでＬＲ組み換え反応（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を行い、ｐＣＤＮＡ３．１−ＴＡＴ−ＥＲａｓ（図１）を作製した。ＴＡＴ−ＥＲａｓのＤＮＡ配列は配列番号９に、アミノ酸配列は配列番号１０で示されている。
（２）ＴＡＴ−ＥＲａｓタンパク質の合成と精製
融合タンパク質の合成と精製は、ＰｕｒｅＧｅｎｅシステムを用いてｉｎｖｉｔｒｏにおいて行った。
（３）ＴＡＴ−ＥＲａｓタンパク質による細胞増殖促進
マウス１２．５日胚よりマウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）を単離した。ＭＥＦは１０％牛胎児血清を含むＤＭＥＭ中で培養した。ここにＴＡＴ−ＥＲａｓタンパク質を加えると増殖が有意に促進された（図２）。一方、ＥＲａｓのＣ末端のＣＡＡＸモチーフを欠失し膜局在できなくしたＴＡＴ−ＥＲａｓ−ΔＣを加えても細胞増殖促進は認められなかった。
［実施例２］
（１）ＴＡＴ−ＥＲａｓ発現ベクターの構築
オリゴＤＮＡのＴＡＴ−Ｓ（配列番号１１）とＴＡＴ−ＡＳ（配列番号１２）を９４度で１分間変性の後、徐々に室温に戻し２本鎖ＤＮＡを作製する。これをｐＣＤＮＡ３．１のＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩ部位にライゲーションする（ｐＣＤＮＡ３．１−ＴＡＴ）。このｐＣＤＮＡ３．１−ＴＡＴのＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＶ部位にＧａｔｅｗａｙｒｆＢＣａｓｅｔｔｅを挿入してｐＣＤＮＡ３．１−ＴＡＴ−ＧＷを作製する。ｐＣＤＮＡ３．１−ＴＡＴ−ＧＷとｐＥｎｔｅｒ−ｍＥＲａｓでＬＲ組み換え反応（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を行い、実施例１と同様に、ｐＣＤＮＡ３．１−ＴＡＴ−ＥＲａｓを作製する。ＴＡＴ−ＥＲａｓのＥＲａｓは、マウスＥＲａｓではなくヒトＥＲａｓを用いるため、作製されるＴＡＴ−ＥＲａｓのアミノ酸配列は配列番号１４に示されている。
（２）ＴＡＴ−ＥＲａｓタンパク質の合成と精製
融合タンパク質の合成と精製は、実施例１と同様に、ＰｕｒｅＧｅｎｅシステムを用いてｉｎｖｉｔｒｏにおいて行う。
（３）ＴＡＴ−ＥＲａｓタンパク質による細胞増殖促進
ヒト胚性幹細胞（ＥＳ細胞）およびヒト体性幹細胞を常法により培養する。細胞に、実施例１または実施例２で作製したＴＡＴ−ＥＲａｓタンパク質を加えることにより、いずれの細胞についても細胞増殖が有意に促進されることが観察される。EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention concretely, this invention is not limited at all by these Examples.
[Example 1]
(1) Construction of TAT-ERas expression vector The oligo DNAs TAT-S (SEQ ID NO: 11) and TAT-AS (SEQ ID NO: 12) were denatured at 94 ° C for 1 minute, gradually returned to room temperature, and double-stranded DNA was Produced. This was ligated to the HindIII / BamHI site of pCDNA3.1 (pCDNA3.1-TAT). Gateway rfB cassette was inserted into the BamHI / EcoRV site of this pCDNA3.1-TAT to prepare pCDNA3.1-TAT-GW. LR recombination reaction (Invitrogen) was performed with pCDNA3.1-TAT-GW and pEnter-mERas to prepare pCDNA3.1-TAT-ERas (FIG. 1). The DNA sequence of TAT-ERas is shown in SEQ ID NO: 9, and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 10.
(2) Synthesis and purification of TAT-ERas protein The synthesis and purification of the fusion protein was performed in vitro using the PureGene system.
(3) Promotion of cell growth by TAT-ERas protein Mouse embryonic fibroblasts (MEF) were isolated from mouse 12.5 day embryos. MEF was cultured in DMEM containing 10% fetal calf serum. When TAT-ERas protein was added here, proliferation was significantly promoted (FIG. 2). On the other hand, even when TAT-ERas-ΔC, which lacks the CAAX motif at the C-terminal of ERas and was unable to localize to the membrane, cell proliferation was not promoted.
[Example 2]
(1) Construction of TAT-ERas expression vector The oligo DNAs TAT-S (SEQ ID NO: 11) and TAT-AS (SEQ ID NO: 12) were denatured at 94 ° C for 1 minute, gradually returned to room temperature, and double-stranded DNA was Make it. This is ligated to the HindIII / BamHI site of pCDNA3.1 (pCDNA3.1-TAT). The Gateway rfB cassette is inserted into the BamHI / EcoRV site of this pCDNA3.1-TAT to prepare pCDNA3.1-TAT-GW. LR recombination reaction (Invitrogen) is performed with pCDNA3.1-TAT-GW and pEnter-mERas, and pCDNA3.1-TAT-ERas is produced in the same manner as in Example 1. Since ETAs of TAT-ERas use human ERas instead of mouse ERas, the amino acid sequence of TAT-ERas produced is shown in SEQ ID NO: 14.
(2) Synthesis and purification of TAT-ERas protein The synthesis and purification of the fusion protein are performed in vitro using the PureGene system in the same manner as in Example 1.
(3) Promotion of cell proliferation by TAT-ERas protein Human embryonic stem cells (ES cells) and human somatic stem cells are cultured by a conventional method. It is observed that by adding the TAT-ERas protein produced in Example 1 or Example 2 to the cells, cell proliferation is significantly promoted for any of the cells.

本発明により、細胞、特に胚性幹細胞や体性幹細胞の増殖を促進することができる融合タンパク質、または化学的結合体を提供することができる。本発明の細胞増殖促進剤は、多能性を維持させたまま増殖させることが困難な胚性幹細胞や体性幹細胞にも用いることができる。また本発明の細胞増殖促進剤は、多数の細胞を一度に簡便に処理することができるだけでなく、可逆的に調整をすることができるため、遺伝子導入法に比べてより臨床応用が可能である。 According to the present invention, it is possible to provide a fusion protein or a chemical conjugate capable of promoting the proliferation of cells, particularly embryonic stem cells and somatic stem cells. The cell growth promoter of the present invention can also be used for embryonic stem cells and somatic stem cells that are difficult to grow while maintaining pluripotency. In addition, the cell growth promoter of the present invention can not only easily handle a large number of cells at once, but also can be reversibly adjusted, and thus can be more clinically applied than gene transfer methods. .

配列番号：１１に記載の塩基配列はＴＡＴ−Ｓである。
配列番号：１２に記載の塩基配列はＴＡＴ−ＡＳである。
配列番号：１３に記載のアミノ酸配列はＨＩＶＴＡＴペプチドである。
配列番号：１５に記載のアミノ酸配列はＦＧＦフラグメントである。
配列番号：１６に記載のアミノ酸配列は置換後のＨＩＶＴＡＴペプチドである。
配列番号：１７に記載のアミノ酸配列はＨＩＶＴＡＴペプチドである。
配列番号：１８に記載のアミノ酸配列はＨＩＶＲｅｖ−（３４−５０）ペプチドである。
配列番号：１９に記載のアミノ酸配列はＦＨＶＣｏａｔ−（３５−４９）ペプチドである。
配列番号：２０に記載のアミノ酸配列はＢＭＶＧａｇ−（７−２５）ペプチドである。
配列番号：２１に記載のアミノ酸配列はＨＴＬＶ−ＩＩＲｅｘ−（４−１６）ペプチドである。
配列番号：２２に記載のアミノ酸配列はＣＣＭＶＧａｇ−（７−２５）ペプチドである。
配列番号：２３に記載のアミノ酸配列はＰ２２Ｎ−（１４−３０）ペプチドである。
配列番号：２４に記載のアミノ酸配列はλＮ−（１−２２）ペプチドである。
配列番号：２５に記載のアミノ酸配列はφ２１Ｎ−（１２−２９）ペプチドである。
配列番号：２６に記載のアミノ酸配列は酵母ＰＲＰ６−（１２９−１４４）ペプチドである。The base sequence described in SEQ ID NO: 11 is TAT-S.
The base sequence set forth in SEQ ID NO: 12 is TAT-AS.
The amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 13 is an HIV TAT peptide.
The amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 15 is an FGF fragment.
The amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 16 is the HIV TAT peptide after substitution.
The amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 17 is an HIV TAT peptide.
The amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 18 is HIV Rev- (34-50) peptide.
The amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 19 is the FHV Coat- (35-49) peptide.
The amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 20 is BMV Gag- (7-25) peptide.
The amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 21 is an HTLV-II Rex- (4-16) peptide.
The amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 22 is CCMV Gag- (7-25) peptide.
The amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 23 is P22 N- (14-30) peptide.
The amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 24 is a λN- (1-22) peptide.
The amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 25 is the φ21N- (12-29) peptide.
The amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 26 is the yeast PRP6- (129-144) peptide.

Claims

A fusion protein comprising a protein transduction domain and an ERas protein.

The fusion protein according to claim 1, wherein the ERas protein is derived from human, monkey, bovine or mouse.

The fusion protein according to claim 1 or 2, wherein the protein transduction domain is HIV TAT, Antennapedia homeodomain, HSV VP22, or a fragment thereof.

The fusion protein according to claim 1 or 2, wherein the protein transduction domain is a peptide consisting of a fragment of HIV Rev, a fragment of FHV Coat, a fragment of BMV Gag, a fragment of HTLV-II Rex, or an oligoarginine.

The fusion protein according to claim 1 or 2, wherein the protein transduction domain is fibroblast growth factor (FGF), hepatocyte growth factor (HGF) or a fragment thereof.

A nucleic acid comprising a base sequence encoding the fusion protein according to any one of claims 1 to 5.

An expression vector containing the nucleic acid according to claim 6.

A cell containing the expression vector according to claim 7.

The method for producing a fusion protein according to any one of claims 1 to 5, wherein the cell according to claim 8 is cultured under conditions capable of expressing the fusion protein.

A chemical conjugate of ERas protein with a bisphosphonate compound, glucose-6-phosphate, a compound having binding activity to P-glycoprotein, or a branched peptide having arginine.

A cell growth promoter comprising the fusion protein according to any one of claims 1 to 5 or the chemical conjugate according to claim 10 as an active ingredient.

The cell growth promoter according to claim 11, further comprising a Nanog protein.

The cell growth promoter according to claim 11 or 12, wherein the cells are embryonic stem cells or somatic stem cells.

A method for promoting cell growth, comprising a step of contacting the fusion protein according to any one of claims 1 to 5 or the chemical conjugate according to claim 10 with a cell.

The method for promoting cell proliferation according to claim 14, further comprising contacting with Nanog protein.

The method for promoting cell proliferation according to claim 14 or 15, wherein the cells are embryonic stem cells or somatic stem cells.

A cell containing the fusion protein according to any one of claims 1 to 5 or the chemical conjugate according to claim 10.