JPS63502962A - ウイルス特異的な永久増殖性組織細胞 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ７、前記単離細胞が選択されたウィルスに感染した組織源由来のものであり、そ して前記融合相手との融合により調製された前記細胞系がまた。該選択されたウ ィルスに感染している請求の範囲第４項に記載の細胞系。

８、選択された組織特異的ヒトウィルスに感染し得る。正常ヒトまたは非ヒト霊 長類の永久増殖性組繊細胞系の調製方法であって。

マウス骨髄腫細胞とヒトＢリンパ球とを融合させ、培養中にＨＬＡ表面抗原を安 定に産生ずる融合生成物を選抜することにより調製される融合相手を提供するこ と；該選抜された融合生成物を変異原で処理すること；およびＨＬ＾表面抗原を 産生ずる能力を保持するが、該融合相手とそのようなヒト細胞の融合により成功 裏に形成される生成物を増殖させる増殖培地で生存できない変異融合生成物を選 抜すること；選択されたウィルスに感染し得る２選択されたヒトまたは非ヒト霊 長類組織から単離された非リンパ法線ｉを得ること；該融合相手と得られた該非 リンパ球細胞とを融合させること；および 該選択されたウィルスに感染し得る融合生成物を選抜すること。

を包含する調製方法。

９、選択されたウィルスに感染した融合細胞の調製に用いられる請求の範囲第８ 項に記載の方法であって、前記選抜が。

選択された該ウィルスを該融合生成物へ導入すること；該選択されたウィルスに 感染したヒトまたは非ヒト霊長類の抗血清を提供すること；該抗血清を該融合生 成物と反応させること；およびそのような抗血清に存在するウィルス特異的抗体 を結合させる融合細胞を選抜すること。

を包含する方法。

１０、前記導入が、前記選択されたウィルスによる前記融合生成物への感染を包 含する請求の範囲第９項に記載の方法。

１１、前記融合生成物が非Ａ非Ｂ型またはＢ型肝炎ウィルスに感染し、そして提 供された前記抗血清が、それぞれ既知の非Ａ非Ｂ型またはＢ型肝炎ウィルス感染 したヒトまたはチンパンジーから得られる請求の範囲第１０項に記載の方法。

１２、前記導入が、前記選択されたウィルスに感染した１選択されたヒトまたは 非ヒト霊長類組織から単離された非リンパ球細胞を得ることを包含する請求の範 囲第９項に記載の方法。

１３、さらに（ａ）ウィルス因子の特異型に関連する細胞表面抗原を同定するこ と；および（ハ）該細胞表面抗原に対し特異的な抗体を調製すること；および（ Ｃ）該抗体を用いて、ウィルス感染細胞の表面に由来する可溶化ペプチド抗原を 単離すること。

を包含する請求の範囲第９項に記載の方法。

１４、前記抗原が非Ａ非Ｂ型またはＢ型肝炎ウィルスに感染した細胞から得られ る請求の範囲第１３項に記載の方法。

１５、さらに前記ウィルスに対するペプチドワクチン組成物として、前記可溶化 ペプチド抗原またはその一部を使用することを包含する請求の範囲第１３項に記 載の方法。

１６、ヒトの非リンパ球組繊細胞に感染し得る組織特異的ヒトウィルスによる感 染を、該感染細胞上に存在する細胞表面抗原に対して特異的な血清抗体の出現に より、検出する方法であって。

該組織特異的ヒトウィルスに感染し、そしてマウス骨髄腫細胞とヒトＢリンパ球 とを融合させることにより調製される融合相手を包含する。正常ヒトまたは非ヒ ト霊長類の永久増殖性組繊細胞由来の表面抗原を提供すること；培養中にＨＬ＾ 表面抗原の産生が持続することにより証明される安定なヒト染色体の保持を示す 融合生産物を選抜すること；そして、該融合相手と、該組織特異的ウィルスにイ ンビボで感染し得る。

ヒトまたは非ヒト霊長類の組織源から得られた単離細胞とを融合させること； ヒト患者の血液試料を該表面抗原と反応させること；および 該表面抗原に免疫特異的に結合される血清抗体の存在を検出すること。

を包含する方法。

１７、前記細胞表面抗原が、前記融合相手とヒト肝臓細胞とを融合させることに より形成され、非Ａ非Ｂ型ウィルスに感染した永久増殖性ヒト肝臓細胞に由来す る。非Ａ非Ｂ型ウィルス感染を検出するための請求の範囲第１６項に記載の方法 。

１８、ヒトウィルス因子に特異的に関連し、該ウィルス因子に感染したヒトまた は非ヒト霊長類の永久増殖性組繊細胞系に由来する細胞表面抗原であって。

該組繊細胞系が、マウス骨髄腫細胞とヒトＢリンパ球とを融合させ、そして培養 中に肛Ａ表面抗原の産生が持続することにより証明される安定なヒト染色体の保 持を示す融合生成物を選抜することにより調製される融合相手；および該融合相 手と９選択されたウィルスにインビボで感染し得る。ヒトまたは非ヒト霊長類の 組織源から得られた単離細胞とを融合させた細胞系を包含する。

細胞表面抗原。

１９、前記細胞表面抗原が、前記融合相手とヒト肝臓細胞とを融合させることに より形成され、非Ａ非Ｂ型ウィルスに感染した永久増殖性ヒト肝臓細胞に由来す る請求の範囲第１８項に記載の抗原。

明細書 ウィルス　−・な゛ １、発亙■分互 本発明は９組織特異的ウィルスが感染する。または感染可能なヒトまたはヒト以 外の霊長類の永久増殖性細胞、該細胞の調製法、およびウィルス特異的抗原およ び抗−抗原抗体の同定における該細胞の使用に関する。

２．１皿文藍 Ａｆｔｅｒ、Ｍ、Ｊ、ら、　Ｐｒｏ　Ｃ１１ｎ　Ｂｉｏｌ　Ｒｅｓ　１８２　ニ アＨＬ９８５）　。

Ｂｅｎ−Ｊｏｎａｔｈｏｎ＋Ｎ、ら、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚ　ｎ＋ｏｌｏ　 １０３　：２４９（１９８３）。

Ｂｏｎｅ、Ａ、Ｊ、ら、Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　１Ｂ（２）：１４Ｈ１９８２）　。

Ｂｒａｄｌｅｙ、Ｄ、Ｗ、＋　Ｐｒｏ　Ｃ１１ｎ　Ｂｉｏｌ　Ｒｅｓ　１８２　 ：８Ｎ１９８５）　＊Ｃ１ａｒｋ、Ｅ、Ａ、ら、Ｉｏ＋ｍｕｎｏ　ｅｎｅｔｉｃ ｓ　１８：５９９（１９８３）。

Ｃ１ａｒｒｉｓ、Ｂ、Ｊ、、　Ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ　Ｔｉ５ｓｕｅ　Ｒｅｓ　 １０（２）：１７３（１９８２）　＊Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ、Ａ、Ｌ、ら、　Ｊ 　Ｉｎｆｅｃｔ　Ｄｉｓ　１５１（４）：６３８（１９８５）。

Ｇｕｇｕｅｎ−Ｇｕｉｌｌｏｕｚｚｏ、Ｃ，ら、　”ｌ５ｏｌａｔｉｏｎ、Ｃｈ ａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ、ａｎｄＵｓｅ　ｏｆ　Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ ’（Ｈａｒｒｉｓ、Ｒ，Ａ、らｍＬ　ｐ、１０５．ＥｌｓｉｖｉｅｒＰｒｅｓｓ 　（１９８３）。

Ｈｏｏｆｎａｇｌｅ、Ｊ、Ｈ，ら、　Ｐｒｏ　Ｃ１１ｎ　Ｂｉｏｌ　Ｒｅｓ　１ ８麩６３（１９８５）。

Ｋａｔｏ、Ａ、Ｃ，ら、　Ｊ　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ　５（１０）：２７５０（１９ ８５）。

Ｋｎｏｗｌｅｓ、　Ｂ、Ｂ、ら、　Ａｄｖ　ｉｎ　Ｈｅ　ａｔ上ｔｉｓ　Ｒｅｓ 　（Ｃｈｉｓａｒｉ、Ｆ、Ｖ、ら［）。

ｐ、１９６．　Ｍａｓｏｎ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、ＮＹ（１９８４）。

Ｋｏｈｌｅｒ、Ｇ、ら、　Ｎａｔｕｒｅ２５６　：４９５（１９７５）。

Ｋｏｕｒｉ、Ｔ、ら、　５ｃａｎｄ　Ｊ　Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ　１３（３）：２ ４７（１９８４）。

Ｋｕｎｋｅｌ　＋　Ｌ、ら、　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ、ＵＳＡ　 （１９８５）ｅＫｒａｃｋ、Ｇ、ら、　’ｌ５ｏｌａｔｉｏｎ、Ｃｈａｒａｃｔ ｅｒｉｚａｔｉｏｎ、ａｎｄ　Ｕｓｅ　ｏｆ　Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ”。

同上、　Ｐ、３９１゜ Ｌｉａｎｇ、　Ｔ、ら、　Ｅｎｄｏｃｒｉｎ　旦５　（６）：２３１Ｈ１９８４ ）。

Ｌｏｕｇｈｌｉｎ＋Ｊ、Ｓ、ら、勧工り堕り吐ｏ１　２４６　（Ｐｔｌ）：Ｅ１ ４５（１９８４）Ｌｏｕｔｓ、Ｊ、Ｃ，ら、　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ　Ｌｅｔｔ　４ Ｈ３）：３１３（１９８３）　。

Ｐｏｎｔｅｎ、Ｊ、ら、　Ｊ　Ｃｅ１ｌ　Ｐｈ　ｓ　１１７　（３）：３４２（ １９８３）。

３、発ｊＩ旧１量 ヒトにおける多数の重大なウィルス性疾色あるいは擬似ウィルス性疾患について 、関心のあるウィルスまたはウィルス性因子を同定することは、困難であるかま たは不可能であることが明らかにされている。そしてそれ故、ウィルスの性質の 理解、およびウィルスによる感染の治療や予防のための診断および治療器具の開 発についての研究が制約されている。

多くのヒトの病原体ウィルスの同定および特徴付けが困難とされてきた理由の１ つは、ヒト宿主の他に、ウィルスを繁殖させるための系がないことである。この 問題は、輸血後の肝炎の主な原因である非Ａ非Ｂ型（ＮＡＮＢ）肝炎ウィルスの 場合に示される。病因となるＮＡＮＢウィルスまたはＮＡＮＢウィルス類は、チ ンパンジーの感染により直接に証明されている（Ｂｒａｄｌｅｙ。

Ａｌｔｅｒ、Ｈｏｏｆｎａｇｌｅ）。しかし、これまでチンパンジーが、ウィル ス研究のだめの唯一の実験動物系を保っている。適切な量のウィルス感染材料を 得ることの困難さや費用は、このウィルスについての研究をかなり制約している 。同様の問題が。

チンパンジーやマーモセットモンキーでは増殖できるが、安い実験動物または細 胞培養物では増殖できない、Ｂ型肝炎ウィルスにも起きている。

従来の細胞培養系は、いくつかのウィルス増殖に用いられ得るが、特に長い増殖 時間を伴う場合には、この方法はある細胞型に特異的な多くのウィルスについて は成功していない。

この制約の原因には、　ＮＡＮＢウィルスのような関心のあるウィルスの特異的 な標的である。肝細胞のような多くの正常ヒト細胞が培養で増殖できず、培養で 維持し得るのは通常１〜２週間の期間だけである。ということがある、多くのウ ィルスに対して、短期間培養での細胞が、感染性ウィルスを効果的に取り込まな いか、または細胞内でのウィルス増殖に必要とされる全培養時間が細胞生存期間 よりも長い。いずれにしても、培養されている正常ヒト細胞内でＮＡＮＢウィル スまたはＢ型肝炎ウィルスのような多数の重要なウィルスを増殖することはこれ まで不可能であった。

このように、培養で安定に生育し得るＵ織特異的ヒト細胞は、多くのヒト感染性 ウィルスに対して都合のよい、そしていくつかの場合には特異的な宿主を供給す る。これは、細胞感染に組織特異的表面抗原を必要とし、そしてまた比較的長い 潜伏時間を有するウィルスについて特に真実である。

ある正常ヒト細胞型を培養で増殖できることは、該細胞型の病気の原因と考えら れるウィルス因子を同定するための手段も供給する。アルツハイマー病や多発性 硬化症のような中枢神経系のいくつかの病気は、ウィルス起源であると考えられ る。そして、これらの病気の患者から得た中枢神経細胞の安定な培養物を生産で きることは、ウィルス特異的細胞表面抗原およびウィルスゲノムの研究と同定に 用いられ得る有益なウィルス感染材料源を提供する。

選択された正常細胞型由来の、安定な培養ヒト細胞またはヒト以外の霊長類細胞 はまた。特異的細胞型における代謝および薬剤効果を研究するのに有用である。

短期間培養の肝臓、膵臓、脳下垂体、および脳の組織由来の細胞を含む多くの組 織特異的細胞型における代謝活性が研究されている。これまで、これらの研究は 培養用の細胞を単離するのに必要とされる仕事量によって制限されており、大部 分の研究は細胞の有効性の理由から非ヒト細胞培養に限られていた。さらに、研 究期間は、細胞が生存可能な数週間以内に必然的に制限されている。このような 制約は、培養における安定な組織特異的細胞型に不適当である。さらに、この組 織特異的ウィルスの細胞感染能力は、感染性ウィルスへの薬剤効果の研究に新し い道を開くものである。

特に、ヒト細胞やヒト以外の霊長類細胞である。培養で安定な組織特異的細胞が 増殖できる潜在的利点があるので、この問題にかなりの努力が払われても驚くに 値しない。しかし。

これまでにこれらの努力はほとんど失敗している。肝臓上皮細胞を同時培養する ことによるような、培養肝細胞の培養期間を伸ばすための努力は、培養時間の限 られた増加を与えたにすぎない（Ｇｕｇｕｅｎ−Ｇｕｉｌｌｏｕｚｚｏ）　＊悪 性の肝組織由来の肝癌細胞のような、特異的なヒト組織と関連するいくつかの悪 性細胞は、培養で安定に増加することが可能である。しかし。

培養された悪性細胞は、ウィルス感染に必要な特異的な細胞受容体をしばしば欠 失していること、およびウィルスゲノムがしばしば悪性度に関連していること（ Ｋｎｏｗｌｅｓ）の両方の理由から１組織特異的ウィルスの宿主系として限定的 に用いられる。そしてそれ故、感染ウィルスの正体が確認されにくい。

細胞を、関連がある骨髄腫細胞と細胞融合することによって、安定な組織特異的 細胞を培養で生産する試みも行われている。この方法は、定められた選択条件下 で骨髄腫細胞と融合することにより、抗体を分泌するヒトリンパ球を永久増殖化 するために用いられる方法と類偵している。これまでこの技術の成功例は報告さ れていない。

４、主所夏蚕豆 培養において安定であり、そして組織特異的ヒト病原性ウィルスに感染されるか 感染され得る。ヒトおよびヒト以外の霊長類細胞を生産する方法を提供すること が、このように本発明の重要な目的である。

関連の目的は２選択された組織特異的ウィルスに感染されるかまたは感染され得 る。永久増殖性ヒトまたはヒト以外の霊長類細胞系を提供することである。

本発明の他の目的は、ウィルス特異的細胞表面抗原や、ウィルスゲノム材料およ び／またはウィルスワクチンの生産に有用なウィルス抗原のような抗原に対して 、特異的なモノクローナル抗体を同定し、これを得るためのウィルス感染した永 久増殖性細胞を用いる方法を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、ヒト細胞のウィルス感染で生産されるウィルス特異 的細胞表面抗原、およびウィルス因子に感染されたヒト血清中のウィルス特異的 抗体の存在を検出するための、抗原を用いる診断法を提供することである。

本発明は２選択された非リンパ性組織由来の永久増殖性化された。非リンパ性、 非悪性のヒト細胞またはヒト以外の霊長類細胞を包含する。この細胞は１選択さ れたヒトリンパ性組織由来のヒト細胞またはヒト以外の霊長類細胞と、マウス／ ヒトハイブリドーマの細胞融合で調製される。組織特異的細胞は、インビボで選 択されたウィルス因子で感染され得るか。

または感染されたもので１例えば、肝細胞、中枢神経系細胞および溝膜細胞を包 含し得る。細胞融合の相手方は、マウス骨髄腫細胞とヒ）Ｂリンパ球とを融合し 、培養でＨＬＡ表面抗原生産が継続されることによって実証されるような、安定 なヒト染色体の維持を示す融合生成物を選択することによって調製される。この 細胞融合の相手方は、成功したトリオーマ融合生成物のみが生育する条件下で９ 組織特異的細胞と融合される。

本発明の好ましい実施態様においては、細胞融合の相手方は、マウス骨髄腫細胞 とヒ）Ｂリンパ球を細胞融合し、培養で免疫グロブリンの分泌およびＨＬＡ表面 抗原産生を示す融合生成物を選択し、そして選択された融合生成物を変異原で処 理することにより調製される。変異処理した融合生成物は。

ＨＬＡ表面抗原産生能力を保持するが、免疫グロブリン分泌を示さず、そしてヒ ト細胞のような細胞と融合相手とを融合させることにより形成され、成功裏に得 られた生成物を生育させる増殖培地で生育できないものについて選択される。代 表的な融合の相手方はＡＴＣＣ番号ＨＢ８４６４の特徴を有する。

永久増殖性細胞系は９選択されたウィルスを感染させた場合、ウィルス特異的細 胞表面抗原を同定するために、このような抗原の供給源として用いられ得る。こ れらの抗原は、ウィルス特異的抗体の同定、および／またはウィルスゲノム材料 の同定（これはウィルス因子を検出するためのプローブとして、あるいは、ワク チンを目的とするウィルス抗原ペプチドを生産するために用いられ得る）に用い られ得る。

本発明のこれらおよび他の目的、および特徴は１本発明の以下の詳細な記述から より充分に明らかである。

光ユ少用狙星説亙 ■、定義 ここで用いられる“トリオーマ”は、３つの本来異なる細胞系起源の遺伝物質を 含有する細胞系を意味する。本出願の明細書に記載されている。これらのトリオ ーマは、ヒトまたはヒト以外の霊長類の細胞材料源由来の非リンパ性組繊細胞を 用いた。ネズミ骨髄腫／ヒトハイブリドーマの細胞融合から得られる。安定な永 久増殖性細胞である。

ネズミ骨髄腫／ヒトハイブリドーマ（“永久増殖性ハイブリドーマ°′または“ 融合の相手方″）は、ネズミ骨髄腫またはその他のネズミ腫瘍細胞と、正常（好 ましくは免疫されていない）被験者由来のヒトリンパ球細胞との細胞融合から得 られる。永久増殖性細胞系である。以下に記述するように。

慎重な選択および変異処理により、改善された染色体安定性を提供する永久増殖 性ハイブリドーマは、ヒトの細胞の特徴を有し、免疫グロブリンを分泌しないも のが得られる。

“非分泌性”ハイブリドーマは、連続的に増殖可能であり。

それゆえに永久増殖性であるが、免疫グロブリン分泌能力を欠くハイブリドーマ を意味する。

“ヒトの細胞の特徴をもつ”ハイブリドーマは、細胞表面で発現されるヒトＨＬ Ａ抗原を産生ずるような、検出可能なヒト由来染色体を保持するハイブリドーマ を意味する。

“組織特異的細胞”は、肝臓、中枢神経系または関節滑液のような選択された組 織または器官材料由来の、インビトロで組織特異的ウィルスに感染された。また は感染され得る。

非リンパ性ヒト細胞またはヒト以外の霊長類細胞を意味する。

“細胞系′°は２個々の細胞、採取された細胞、および該細胞系の細胞に由来す る細胞に限られた細胞を含有する培養物を包含するが、これらに限定はされない ２種々の実施態様を意味する。“由来”は、後代または子孫を意味する。さらに 。

貯蔵や移植の間に、核型に自然変異または誘導変異が起こされることが、当該分 野に公知である。それ故、細胞系由来の細胞は、先祖細胞または培養物と厳密に は同じではあり得ないことを意味する。そして、細胞系はこのような変異体も包 含することを意味する。

■、″″−なヒト　ニおよびヒトｐ　の　、のｆ　＋Ａ、　２１　の　１人の　 飛 永久増殖性ハイブリドーマをつくる細胞は、ネズミ骨髄腫細胞とヒ）Ｂリンパ球 細胞である。ネズミ骨髄腫細胞系は一般に有用であり、　Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｍ ａｒｙｌａｎｄのＮａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅｓｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ 　（ＮＩＨ）にあるアメリカン　タイプ　カルチャーコレクション（ＡＴＣＣ） から入手し得る。ヒトＢリンパ球細胞を正常個体の血液から従来法を用いて単離 する。このような方法には、密度勾配精製および標準ヒツジ赤血球のロゼツト形 成を用いたＴ細胞からのＢ細胞の分離が包含される。

Ｂ−里檄豊異呵豊凶 マウス／ヒト融合の相手方との細胞融合により永久増殖性化される組織特異的細 胞は、ヒトまたはヒト以外の霊長類から選択された非リンパ性組織由来の単離細 胞である。後者の材料は、マウス／ヒト融合の相手方との成功裏の細胞融合をさ せるヒトと系統発生的に類似である（Ｃ１ａｒｋ）、チンパンジーのような霊長 類を包含する。マウス／ヒト融合の相手方と永久増殖性チンパンジー細胞とを細 胞融合させ、そして永久増殖性化させる能力は、永久増殖性化したチノパンツー 細胞系の基礎を形成する。これは、“非ヒト霊長類のモノクローナル抗体および 方法”、特許出願第７６７、２１３号（１９８５年５月１日出願）に記載されて いる。

上記細胞を、関心のある選択されたウィルスで感染させた。

または感染可能である組織または器官から単離する。単離した細胞は、細胞が永 久増殖性化の相手方と細胞融合することにより、うまく永久増殖化されるまでの 短期間、所望の組織特異的特性をかなり損失することなく、培養において制限さ れた生存が可能でなければならない。

培養のための組繊細胞調製についての種々の方法が開発されており、これらの方 法は１本発明に従って永久増殖性マウス／ヒトハイブリドーマと細胞融合するだ めの、　＆Ｉｌ織特異的細胞を単離するのに一般に適している。特異的細胞型に ついての以下の細胞調製法は、適用可能な一般技術を説明する。

細胞培養のだめの、単離肝細胞の生産方法がいくつか報告されている（Ｗｒａｃ ｋ、Ｇｕｇｕｅｎ−Ｇｕｉｌｌｏｕｚｚｏ）。一般に、これらの方法は、コラゲ ナーゼ溶液で肝組織を潅流し、遊離細胞を放出させるために酵素消化した組織を 細か（切り刻み、布のメツシュを通して単離細胞を濾過することを包含する。コ ラゲナーゼ処理を包含しない細胞調製のより簡便な方法が２本発明の発明者らに より実施されている。この方法では、実施例２に記述したように、生育しない肝 組織のような単離組織を。

単一細胞がとおるすき間を有する摩砕ガラスホモゲナイザーで簡単にホモジナイ ズし、ホモジナイズした細胞を適切な培地で数回洗浄する。同様の方法が、膵臓 島細胞（Ｂｏｎｅ）　＋脳下垂体後葉細胞（Ｌｉａｎｇ、　Ｌｏｕｇｈｌｉｎ） 　＋および主要脳下垂体細胞（Ｂｅｎ−Ｊｏｎａ　ｔｈｏｎ）の短期間細胞培養 物を生産するのに用いられている。

細胞培養のための中枢神経系由来細胞の調製方法が、を髄神経単位（Ｋａ　ｔｏ ）　＋　ヒト大脳皮質からの神経単位（Ｌｏｕｉｓ）　、およびヒトダリア細胞 （Ｐｏｎ　ｔｅｎ）を包含する種々のＣＮＳ細胞型で示されている。上記で示し たように、永久増殖性神経細胞は。

ウィルス起源と考えられる神経障害の研究に主として用いられる。それ故９本発 明の方法に従って永久増殖化のために単離される神経系細胞は、典型的には研究 されている病気として明確に診断されている。ヒトまたはヒト以外の霊長類材料 に由来する。

マクロファージや繊維芽細胞を包含する。ヒト滑脱細胞の調製方法も報告されて いる（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｎ＋＋Ｋｏｕｒｔ、Ｃ１ａｒｒｉｓ）。滑脱細胞が、 関節炎におけるウィルス性の病因の研究に用いられる場合、該細胞はもちろん、 ウィルス関連性関節炎の条件を有すると考えられる患者から得られる。

Ｃ０履金土皿 ネズミーヒト非分泌ハイブリドーマと２本発明の永久増殖性化組繊細胞系を作成 するための細胞融合は、　ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎの改変した方法 により実施される。簡単に述べると。

マウス骨髄腫およびヒトリンパ球（永久増殖性化ハイブリドーマを作成するため ）、またはハイブリドーマおよび単離された組織特異的細胞（永久増殖性化組繊 細胞系を作成するため）を、適切な条件下で、ポリエチレングリコールのような 融合剤の存在下で結合させる。上記条件は例えば、室温から４０°Ｃの間（好ま しくは約３７°Ｃ）で、４０〜５０％ポリエチレングリコール（分子量１０００ 〜４０００　）である、細胞融合には約５〜１０分を必要とし９次いで該細胞を 遠心分離および選択する。

その他、永久増殖性化細胞の相手方と、ヒト非リンパ球組繊細胞とを融合したよ うな融合生成物は、公知の方法を用いた電気融合によりうまく生成し得る。

Ｄ、スフ１−ニング　法 細胞融合操作に引き続いて、所望のハイブリッドに選択的な増殖培地である細胞 融合培地から遠心分離された培養細胞を用いて、ハイブリダイズ生成物の選択を 行う。通常、永久増殖性化していない細胞は、いかなる培地においても繰り返し 移すと生存することができない。それゆえ、遠心分離した細胞は繰り返し培養す ると生存できない。一般に用いられている永久増殖生化したネズミ骨髄腫細胞の 系は、しかしながら、ＤＮＡを合成する能力を奪うことにより選択するある種の 選択培地では生育できない。本明細書に記載の２種類の非常に一般的に用いられ ている培地は、　“ヒボキサンチン−アミノプテリン−チミジン”または°“Ｈ ＡＴ　”培地、およびアザセリン−ヒボキサンチン培地、またはＡＨ’″培地あ る。

これらの選択培地は両方とも、新旦公過程が阻害される環境下では、ＤＮＡ合成 の“サルベージ（Ｓａｌｖａｇｅ）″経路を用いる正常細胞の能力を利用してい る。アミノプテリンは、正常細胞における２互生のプリンおよびピリミジンヌク レオチド合成の両方を阻害し、サルベージ経路にヒボキサンチンを要求する。ア ザセリンはプリン合成のみを阻害し、それゆえヒボキサンチンのみがサルベージ 経路に必要とされる。

ヒボキサンチンホスホリボシルトランスフヱラーゼ（ｔｌＰＲＴ）を必要とする サルベージ過程は、一般に通常用いられるネズミ骨髄腫細胞ではりｐ経路を保持 しているカリ、実施不可能である。アミノプテリン（ＨＡＴ培地中）、またはア ザセリン（ＡＨ培地中）は１両方ともＩ旦とＤＮＡ合成経路の阻害剤であるので 、ネズミ骨髄腫細胞は“ＨＡＴ　’″または“ＡＨ”培地中では生育不可能であ る。このように、ハイブリダイズした細胞のみがＨＡＴまたはＡＨ培地で繰り返 し移植し、成摸させても生存することができる。正常リンパ球は、永久増殖生化 されていないので生存することができず、繰り返しの移植で生き残らない、すな わち、ハイブリダイズしていない骨髄腫細胞は。

アミノプテリン、またはアザセリンによる。阻害を克服するためのヒポキサンチ ンの利用を可能にする。サルベージ経路を欠いているので、生存することができ ない。

Ｅ、　４　殖性ヒハイブリドーマ 永久増殖性化しているハイブリドーマを生産するのに用いられる選択方法は、安 定なヒト細胞の性質を示し、免疫グロブリン分泌を示さず、うまく永久増殖性化 した組繊細胞ハイブリッドを選択するのに用いられる定義された選択培地に対し て感受性を示す細胞を選択することを目的としている。簡単に述べると、マウス 骨髄腫とヒトリンパ球細胞との細胞融合混合物から遠心分離された細胞を希釈し 、マイクロタイクープレートに播種する。安定性とヒト細胞の性質に関連した分 析方法に基づいて行われる。成功したコロニーの選択により、スクリーニングが ＡＨまたはＨＡＴ培地で生育させることにより行われる。分析された多くのコロ ニーの中から、適当な期間、好ましくは６ケ月より長く（安定性の１つの基準） 。

上清液中に免疫グロブリンを生産し続けるものがいくつか選択される。ここで、 以下に記述したように、突然変異誘発に充分な数の細胞を得るために必要な２〜 ３ケ月に及ぶ培養期間は、また免疫グロブリン分泌の安定性を評価するための期 間としても役立ち得ることが認められた。このような免疫グロブリンの継続した 生産は、ヒトリンパ球の相手方により与えられた特質が失われていない（もちろ ん、融合しなかったリンパ球は生存していない）ことを示している。ヒト由来の 特質の保持は２細胞の表面にＨＬＡ抗原が存詮していることを分析することによ り調べられる。選択されたコロニーは、該コロニーの細胞表面でＨＬＡ抗原を発 現し続ける。そして２つの特性はいつも同一細胞に見出されるので、実際、継続 した免疫グロブリンの生産とＨＬＡ表面抗原は関連されているようである。

選択された細胞は９次いで、それらの免疫グロブリン分泌能力およびＨＡＴまた はＡＨ惑受性を与える能力を破壊するために、６−チオグアニンのような突然変 異原で処理される。これは、永久増殖性化した組織特異的細胞を与える後の細胞 融合、およびその後の融合の相手方からの免疫グロブリン分泌の寄与なしで、細 胞融合生成物をタンパク分泌に用いることを可能にする。突然変異を誘発された 細胞はまた。細胞表面での肛へ抗原発現の保持について選択される。

以下の実施例１は２本発明に従って霊長類トリオーマを生産するのに、一般に有 用である永久増殖性化したハイブリドーマの調製を述べている。５ＢＣ−Ｈ２Ｏ と命名された細胞系は。

実施例で述べられている選択された特性を有する。この細胞系は１９８３年１２ 月１３日またはその頃にＡＴＣＣに寄託され、寄託番号ＡＴＣＣＨＢ８４６４が 授与された。

Ｆ、゛　ヒヒトまたはジヒト雪　胞ス ■Ｃ項で概説されているような条件下で、上記のヒトまたは非ヒト霊長類組繊細 胞を細胞融合する。典型的には２組繊細胞を約１：１から１：５の間、好ましく は約１＝３の割合で、永久増殖性化ハイブリドーマ細胞と混合する。ここで。

１：１および５：１の割合でのような、かなり多数の組繊細胞を含有する細胞混 合物が可能であることが認められる。しかし９組繊細胞は通常得ることがかなり 難しいので、一般には、細胞融合混合物中で永久増殖性化している細胞を、過剰 に用いることが好ましい。細胞混合物は、洗浄により血清を除去し、細胞融合を 起こさせるためにポリエチレングリコールに再懸濁する。適当な時間インキュベ ートした後、細胞を洗浄し、培養培地に再懸濁し、マイクロタイターのウェルに 播種する。細胞融合していない組織特異的細胞は培養で生育が不可能であるので ９選択培地は、細胞融合していない永久増殖性化しているハイブリドーマ細胞を 区別する。　ＨＡＴまたはＡＨ培地のみが用いられ得る。結果として得られる細 胞融合生成物は、光学顕微鏡で観察されるような、成長している細胞のコロニー の存在に基づいて、このように簡単に選択される。

（以下余白） Ｇ、ハイ　１・・　゛　二の ＨＡＴまたはＡＨ培地で生育し得る能力に基づいたハイブリッド細胞の選抜に加 えて、ウィルス感染性の検討に先だって。

ハイブリッド細胞が、融合された組繊細胞型の選択された特性を有することを確 認することは、一般に有利である。肝臓のような分泌組織に由来する細胞の場合 には、ある便利な確認の分析は、１またはそれ以上の選択された組織特異的分泌 タンパクを分泌する能力に関して、ハイブリッド細胞を試験することを包含する 。この分析は、固相標識結合（ｒｅｐｏｒｔｅｒ−１ｉｎｋｅｄ）免疫分析によ り行われ得る。通常の固相分析法では。

選択タンパクに対して特異的な抗体で被覆した固体の表面は。

細胞培養物の上滑と反応し、支持体表面に上清タンパクを免疫特異的に結合させ る。ヒトおよび霊長類（特に、チンパンジー）における分泌タンパク間に構造上 密接な関係があるため、ヒト血清アルブミン（ＩＳＡ　）のような選択されたヒ ト分泌タンパクに特異的な抗体は、対応する非ヒト分泌タンパクのスクリーニン グにも用いられ得る。血清アルブミンのような種々のヒト分泌タンパクおよびペ プチドホルモンに対する精製ヤギ血清抗体またはウサギ血清抗体が市販されてい る。多（のヒト分泌タンパクに対するウサギモノクローナル抗体も入手し得る。

タンパク特異的抗体が市販されていない場合、この抗体は。

ウサギまたはヤギにおいて抗体を生じさせる従来の血清抗体技術により生産する ことができる。これらの手順には１通常。

動物に接種するために、純粋または、はとんど純粋なタンパクが必要である。多 （のヒト分泌タンパクを精製するための手順が報告されており、以下に引用付記 されている。あるいは、従来のモノクローナル抗体技術が９選択ヒトタンパクに 対する抗体を産生させるために用いられ得る。

細胞培地を支持体結合抗体と反応させ、抗体特異的分泌タンパクを結合させた後 、該支持体は、非特異的な結合タンパクを除去するために洗浄し９次いで関心の ある分泌タンパクにも特異的な可溶性標識結合（ｒｅｐｏｒｔｅｒ−１ａｂｅｌ ｅｄ）抗体と反応させる。可溶性抗体に結合させた標識（ｒｅｐｏｒｔｅｒ　１ ａｂｅｌ）は。

螢光体１発色団２酵素、または放射性同位体標識である。標識分子を用いて抗体 を標識する技術は、公知であり、典型的にはジ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド のような二官能性結合剤、あるいは可溶性カルボジイミドのような適当なカルボ キシル活性化剤またはアミン活性化剤を用いて、１またはそれ以上の標識分子を 抗体に結合させることを包含する。このような方法は、当業者に公知である。標 識された抗体は、支持体結合抗体のように、同種または異種の抗原決定基に特異 的であり得るが、いずれにしても、固体支持体上にある一次抗体への免疫特異的 な結合によって選択タンパクに結合することが可能でなければならない。細胞培 地中における選択タンパクの存在は、洗浄された支持体上に標識が存在すること によって確認される。以下の実施例■は、ヒト血清アルブミン（ＩＳＡ）　、補 体Ｃ３（Ｃ：Ｉ）、および永久増殖性肝臓から分泌されるヒトフィブロネクチン （ＨＦＮ）を検出するのに用いられる酵素結合免疫分析（ＥＬＩＳＡ　）につい て述べている。

一方、永久増殖化性細胞型が２分泌機能を有さない場合。

他の細胞特異的特性（例えば９表面抗原の存在、または細胞形態特性）は、ハイ ブリッド細胞系が、関心のある細胞系で構成されていることを確認するのに用い られ得る。細胞表面の抗原は、以下に詳しく説明されている手順に従って容易に 分析される。すなわち９選択された組織型抗原に特異的な抗体を調製し、適当な 標識で該抗体を標識し、該標識された抗体を細胞と反応させ、そして洗浄後に標 識の存在を検出することによって容易に分析される。

関心のあるタンパクを分泌する１またはそれ以上の成育可能なハイブリッド細胞 コロニーを確認した後、これら細胞は。

モノクローナル性を確認するためにサブクローン化される。

典型的には、サブクローニングは、親ハイブリッド細胞をウェルあたり約１個程 度の細胞になるように希釈し、そしてこれらの細胞を多穴マイクロタイタープレ ートに再度プレートする限定希釈技術によって行われる。次いで、所望の組織特 異的な性質を示すクローン集団が単離される。

本発明によって行われる実験および特に実施例■で報告されている実験は、ヒト 肝臓細胞のようなヒト非リンパ球組繊細胞が、少な（とも数ケ月間にわたる培養 中に継続的な複製が行なえるように、また同時に１またはそれ以上の肝臓特異的 タンパクの分泌のような組織特異的細胞機能を保持するように永久増殖化され得 る。この結果は９本発明者およびその同僚による初期の研究と一致する。このこ とは９分泌活性の減少をほとんど伴わずに、数年間までの期間にわたる培養中。

安定な細胞を生産するために、ここに述べられているマウス／ヒトの融合相手が 、ヒトおよび非ヒト霊長類リンパ球を永久増殖化し得ることを示している。リン パ球および非リンパ球細胞型の両方に対して、融合工程は、成功裏にハイブリッ ドが得られる効率が高く、そしてこれらのハイブリッドのうち。

組織特異的タンパクを分泌する活性があり、安定なハイブリッド細胞の割合が高 いのが特徴である。

リンパ球および非リンパ球細胞の両方に対して細胞融合の効率が高いことは、融 合相手を形成する際の選抜であって。

安定にヒト染色体を保持しているマウス／ヒトハイブリッドの最初の選抜に関連 しているように思われる。このことは。

継続する免疫グロブリン分泌およびＨＬＡ生産によって証拠付けられる。すなわ ち、融合相手は、ヒトとマウスの染色体の安定な配置に関して、予め選抜される 。この融合相手は、明らかにトリオーマ融合生成物における染色体の安定性に好 都合である。融合相手が、ヒトリンパ球、チンパンジーリンパ球、およびヒト肝 臓細胞のような様々な細胞と共に、安定な融合生成物を形成する能力は、ヒト細 胞の永久増殖化に関する方法の一般的な適用性を示している。

（以下余白） ００文−（）Ｅ弓昼別に比 本発明のある重要な局面によると、永久増殖性細胞は、ある種のヒトまたは非ヒ ト霊長類ウィルス、特に培養によって成育できないウィルスの感染可能な宿主と して用いられる。

ここで、融合された肝臓細胞のような親ハイブリッド組繊細胞は、コロニーの存 在によって選抜され１次いでこれら親細胞は、ウィルスによる感染能力について 分析される。典型的には、ウィルスの感染は、（ａ）活性のある既知のウィルス 源で細胞を感染させる工程、および（ロ）１週間から数週間にわたるインキュベ ーションの間に、ウィルス感染の有無について。

これら細胞を分析する工程によって検出される。初めは、ウィルスに感染しやす い親ハイブリッド細胞を同定するために。

融合させた細胞コロニーを含むトレイを２つ用意する。こうすることによって、 未感染の細胞ストックは、ウィルス感染細胞コロニーが同定された後でも利用し 得る。

ウィルスによって誘起される細胞の変化は、好ましくは永出される細胞変化であ る。ウィルス感染は、細胞溶解、多核化、または細胞凝集のような細胞変性効果 （ＣＰＥ　）によって特徴付けられる。ウィルスによって誘起される細胞応答の 他のタイプとしては、　ｐＨシフト、あるいは１またはそれ以上の細胞酵素の放 出というような代謝変化がある。これらのタイプの代謝変化は、どちらも適当な 指示色素または基質を用いて検出し得る。

最後に１本発明のある重要な実施例に従って、ウィルス感染は、ウィルス感染の 結果として発現されるウィルス特異的表面抗原または細胞内抗原、あるいは細胞 外抗原の存在によって決定され得る。一般に、細胞表面抗原は、従来の標識化抗 体技術によって容易に検出され得る。あるアプローチでは。

培養された細胞を、まずウィルスが感染したヒトまたは非ヒト霊長類からの血清 と反応させる。非特異的な結合物質を除去するために細胞を洗浄した後、これら の細胞は、標識された抗ヒト抗体、好ましくは螢光標識された抗体と共にインキ ュベートする０次いで、これら感染細胞は、細胞表面上の標識の存在によって簡 単に検出される。この方法は、実施例Ｖおよび■において、　ＮＡＮＢ肝炎ウィ ルスを感染させた永久増殖性細胞を検出することについて１例証されている。

感染したチンパンジー由来のＮＡＮＢウィルスで感染させ、ウィルス特異的細胞 表面抗原を示す、特異的肝臓ハイブリッド細胞は、アメリカン　タイプ　カルチ ャー　コレクションに寄託され、　ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ９０２７によって同定 される。感染したチンパンジー由来のＮＡＮＢで感染し得るハイブリッド肝臓細 胞は、ヒト血漿由来のＮＡＮＢ、および感染したヒト由来のＢ型肝炎ウィルスと も感染し得る。このことは、やはり実施例Ｖで述べられている。

（以下余白） ■、ウィルス感“バイブＩ・・　′　のＡ０文イ」≦優り１殖 上で述べ、そして実施例Ｖにおいて例証するように２本発明に従って形成される ハイブリッド細胞は、異なった方法では培養によって増殖し得ない組織特異的ウ ィルスに感染させられ、これらウィルスを増殖させるために用いられる。選択さ れたヒト感染ウィルスによってハイブリッド細胞を感染させ、そして該ハイブリ ッド細胞を培養するための一般的方法は、一般的には、上で概説され、そして実 施例Ｖで述べられる手順に従う。簡単には、ヒト、またはチンパンジーのような 他の感染した起源に由来する血漿を用いて、これら細胞を感染させ、そしてウィ ルス感染の後、培養時間の経過と共に起こるウィルス関連細胞の変化がモニター される。実施例Ｖにおけるように増殖させた２つの肝炎ウィルスの場合のように 、ウィルス特異的抗原の出現によって、ウィルス感染が特徴付けられる場合、該 ウィルス感染は、好ましくは抗原検出のための免疫学的方法によって行われる。

ウィルス感染および増殖の後、このウィルスは、必要に応じて、細胞からウィル ス粒子を放出させて精製するための従来の方法によって採集し得る。

これらの細胞の感染可能性および感染細胞系から未感染細胞系へのウィルス因子 の連続的な継代感染の可能性は、実施例■に例証されている。ここで、　ＮＡＮ Ｂウィルス因子に感染した２つの永久増殖性肝臓細胞系の各々は１通常の成育状 況下で培養され９次いで上清画分を放出させるための様々な手段の１つによって 溶解される。上清画分（または、マイトマイシン処理した細胞）を、未感染の永 久増殖性細胞系に加えたところ、新しく感染した細胞は、　ＮＡＮＢ特異的細胞 表面抗原を数週間にわたって形成した。全ての場合において、感染細胞は、感染 の１０週間以内に螢光免疫反応活性（表面抗原の出現）を示した。第２世代の感 染細胞系からの上清を、培養中の未感染細胞に同様に移し、感染した第３世代細 胞を得た。

Ｂ、ウィルス感仇に　゛　した　の白 土で示したように、ハイブリッド細胞のウィルス感染は。

そのウィルス感染に特異的である抗原の細胞発現をしばしば伴う、抗原は、細胞 内にあり、感染細胞の表面に結合し、および／または細胞外の型で発現されうる 。上で概説され、そして実施例Ｖにおいて例証されているウィルス特異的抗原の 存在を決定するための、ある一般的方法は、感染しているヒトまたは実験動物の 血清に由来する抗原と抗−抗原抗体との間の免疫特異的結合を包含する。この方 法は、もちろん感染した被験体中にこのような抗体が存在することに依存してい る。細胞表面抗原の場合、この分析法は、典型的には、血清を細胞と反応させる こと；非結合の血清成分を除去するために、これら細胞を洗浄すること；次いで これら細胞を、抗−抗原抗体と特異的に結合し得る標識された抗免疫グロブリン 抗体と反応させることを包含する。このアプローチは、実施例Ｖにおいて詳述さ れている。細胞内および細胞外抗原は。

上述の血清および無細胞系抗原調製物を使って、免疫沈降法またはオフテルロニ ー免疫拡散法を包含する従来の免疫分析法によって分析され得る０本発明によっ て行われる実験により、Ｂ型肝炎ウィルスに感染したハイブリッドの肝臓細胞は 。

Ｂ型肝炎表面抗原に対する明確な抗体調製物との免疫反応性を有するＢ型肝炎表 面抗原を発現することが示されている。

ＮＡＮＢウィルス因子による感染に応答したウィルス特異的表面抗原の検出およ び部分的分離は、実施例■において例証されている。ＲＯ２およびＲＳＩと名付 けられた２つのＮＡＮＢ惑染細感染、およびＧＬ４２４と名付けられた１つの未 感染細胞系を。

ＮＡＮＢ惑染個感染由来する抗体と特異的に反応する細胞膜抗体の存在について 検査した。その３つの細胞系の細胞膜両分を以下に記述する方法によって調製し 、そしてその３つの膜画分を従来の方法によってフィルター上にドツトプロット した。

これらのドツトプロットを、正常個体またはＮＡＮＢ感染個体のいずれかから得 たＩｇＧ抗体画分と反応させ５次いで螢光標識した抗ヒトＩｇＧ抗体の添加によ って結合する抗体について検査した。これらの結果は、実施例■の表４に与えら れている。

約１μｇ／ウェルと１０μｇ／ウェルの間の膜タンパク濃度では。

感染した細胞系の両方は、正常な画分よりもＮＡＮＢ（＋）　ＩｇＧ画分と高い 免疫反応活性を与えた。このことは、感染した個体に存在し、そしてその両分と 反応するＮＡＮＢ特異的抗体の存在に基づいて、抗原画分を用いることにより、 　ＮＡＮＢ感染について分析し得ることを示している。

より一般的には、この方法によって、感染に対するウィルス特異的抗体の応答を 誘発するウィルス因子のヒトへの感染を検出し得る。この方法は、ウィルス因子 、すなわち感染個体から得た抗体とのより高い免疫学的反応性を示す細胞表面抗 原を含んでいる両分を用いて感染させた永久増殖性組繊細胞から単離することを 包含する。この画分を血液試料（例えば、試験個体からの血清試料またはＩｇＧ 画分）と反応させ。

そして抗原への抗体の結合を検出する。典型的な分析手順は。

実施例■における方法によるものである。この方法では９分析物であるヒト血清 を細胞と反応させ、そして洗浄後、これら細胞を、標識した抗ヒト免疫グロブリ ン抗体にさらす。

この一般的アプローチは、中枢神経系細胞のような特定の永久増殖性細胞型にお けるウィルス感染の有無を検出することにも適している。このようなウィルス感 染は、ウィルスの病因学で疑われている。ここで、永久増殖性細胞は、細胞供与 体、またはこの疾患を有する他の個体から誘導された血清にさらす。細胞抗原の 存在は、上述のように、標識された第２の抗体によって決定された。全ての抗原 特異的試験におけるように、抗原の特異性は、永久増殖性の対照（未感染細胞） を含む適当な対照によって確証されなければならない。

（以下余白） Ｃ３イルス、・モノクロ−ル　の 細胞結合形または可溶化形のいずれかである。上述のウィルス特異的抗原は、ウ ィルス特異的なネズミのモノクローナル抗体（Ｍａｂ）を生産することにも有用 である。この方法は。

標準的なＭａｂ手順に従う。この手順においては、−匹のネズミに細胞、または 抗原を含む無細胞系材料を接種し、そして接種した動物より得たＢリンパ球を、 上で詳述したような隅台手順に従って、ネズミの骨髄腫細胞と隅台させる。成功 裏に得られた隅台生成物は、所望のＭａｂの存在について、マイクロタイターウ ェルを分析することによって決定し得る。そしてこれは、抗原に対して特異的な 血清抗体を検出するための方法に類似した分析技術を用いる。

ある応用として、これらのＭａｂは、ウィルス感染を診断するのに有用である。

このような感染は、感染した個体の血清中におけるウィルス関連抗原の存在によ って立証される。この分析は２例えば固相サンドイッチ型分析として行い得る。

この方法では、抗原は、はじめ固体支持体に結合したＭａｂと反応させ９次いで 標識された可溶性の抗−抗原Ｍａｂを、この抗原によって該支持体に結合させる 。

ＭａｂＯ別の応用は、ウィルス特異的抗原を精製することであり、従来のアフィ ニティークロマトグラフィー技術を用いて行われる。精製された抗原は２例えば この精製された抗原の既知のアミノ酸配列を基にして、抗ウイルスワクチンを設 計する際に有用である。

Ｄ、：　ウィルス゛　−の 本発明の重要な利点は、ハイブリッド細胞培養物で、比較的大量のウィルスゲノ ム材料を増殖させ得ることである。ゲノム材料は、自己複製するウィルスの型か 、あるいはウィルスゲノムがこの細胞ゲノム中に蓄積されている場合には、複製 細胞ＤＮＡの一部分とし存在し得る。いずれの場合にも、活性なウィルス遺伝子 の存在および同定は、（クンケルによって）報告されたＤＮＡ１法濃縮法（ｓｕ ｂｔｒａｃｔｉｏｎ　ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔｍｅｔｈｏｄ）　＋または適当な発 現系における抗原発現によって決定され得る。後者の方法は９例えば、ウィルス 感染細胞から単離したポリＡ　ＲＮＡのｃＤＮＡライブラリーを調製し、適切な りローニングベクターにライブラリー断片をクローニングし、宿主細菌、典型的 には細菌宿主細胞を該ベクターで形質転換し。

そして上述した抗−抗原抗体を用いて、該宿主による抗原の発現を検出すること によって行われる。

同定されたウィルスゲノム材料は、感染細胞におけるウィルスゲノムの存在およ び／または局在をさらに同定するためのプローブとして；個体からの血液または 組織試料におけるウィルスの存在を検出するための診断の道具として；あるいは ワクチンの目的に有用な抗原または抗原断片ペプチドを生産するための分子クロ ーニング手順において用いられ得る。

以下の実施例は１本発明の様々な局面を例証するものであって、決して本発明の 範囲を制限することを意図するもの゛ではない。

実方ＬＬＬ ′　ハイブリドーマ５ＢＣ−ｆ（２０の町すマウス骨髄腫細胞系５Ｐ２０１０８ Ａ２を、シカゴ大学のフランクツイツチから、永久増殖性の融合相手として用い るために得た。この細胞系は、自由に利用できて、そして制限なしに使用し得る 。他のマウス骨髄腫系も、容易に入手し得る。ヒト末梢Ｂリンパ球を１文献１１ 中に記述されている。フィコール〜ヒバーク濃度勾配によって、正常なヒト供与 体のヘパリン化した血液から単離した。これらの末梢Ｂリンパ球および骨髄腫細 胞を１：１の割合で混合し、　ＲＰＭＩ　１６４０培地（ギブコ）中で一度洗浄 し、そして１０分間２５０Ｘｇでベレット化した。

このベレットを、予め３７゛Ｃに温めた４０〜４５％（Ｖ／Ｖ）ポリエチレング リコール溶液２分子１１４３０〜１５７０（ＢＤＩ（ケミカルズ、プール、イギ リス）を含む、ｌｄのＲＰＭ　Ｉに穏やかに再懸濁した。

室温で２分後、この細胞懸濁液をＲＰＭＩで６　ｍｌに希釈し、５００×ｇで３ 分間遠心し、そして融合の開始から始めの８分間。

この細胞ペレットを１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含むＲＰＭＩで洗浄した 。このベレット化された細胞を９個々のクローンを得るのに適した希釈を用いて 、多穴トレイ中にプレートした。

コロニーは、２μｇ／ｄのアザセリンと１００μ門のヒボキサンチンを含むＡ） Ｉ選択培地上で成育させ、そして成功裏に得られたクローンは２文献６に記述さ れている分析法を用いて、免疫グロブリン産生について、およびＨＬＡ表面タン パクについて分析された。

免疫グロブリン産生に適しており、そしてＨＬＡ表面タンパクを絶えず産生ずる ハイブリッドクローンを選択した。

このクローンは、変異源６−チオグアニン（シグマ、セントルイス、　ＭＯ）の 他に、１０％ＦＣＳ、２　ｍＭのグルタミン、１００単位のペニシリン、および １００■／ｄのストレプトマイシンを含むイスコブ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ　ｍ ｅｄｉｕｍ）　（ＩＭＤＭ）（ギブコ）中に入れた。６−チオグアニンの濃度は 、約３０日間にわたって累進的に２　Ｘｌ０−’Ｍまで上昇した。得られた変異 体ハイブリッドをサブクローン化して、そしてそのクローンを免疫グロブリン分 泌に関して試験した。ＨＡＴ／ＡＨに対する感受性、および１０１Ｍのウアバイ ン対する抵抗性を有し、ＨＬＡ表面抗原を産生ずる能力を保持する非分泌型のサ ブクローンを選択した。

５ＢＣ−１（２０と名付けられたこの細胞系試料は、　ＡＴＣＣに寄託され。

寄託番号ＡＴＣＣＨＢ　８４６４を有する。このネズミーヒトハイブリドーマの 特徴には、ＨＡＴ培地およびＡＨ培地に対する感受性；１０−　’Ｍの濃度まで のウアバイン（シグマ）に対する抵抗性；免疫グロブリンの非分泌性；長期間に わたるヒト染色体の安定性；および肛Ａ表面タンパクの産生が含まれる。

実庭炎ニ ー監上上１１わ（社）電離 ヒト胎児肝臓組織を治療法産児から得て、そして２０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ） を含むイスコブ培地（ＩＭＤＭ）中に入れた。この組織は、単細胞クリアランス を有するグランドグラスホモゲナイザーを用いて、数回の穏やかなストロークに より１機械的に分散させた。これらの細胞は、ＦＣＳを含まないＩＭＤＭ培地中 で遠心して、３回洗浄した。

１旅■ｌ ｉ　・　胞の言。制 実施例■の単離肝細胞をＩＭＤＭに懸濁し、最終細胞濃度を約３Ｘ１０７細胞／ ｉｄとした。単離された細胞を、約３：１の細胞比でハイブリドーマ細胞系５Ｂ Ｃ−）１２０（実施例Ｉ）と混合した。

これらの細胞を、血清を含まないＩＭＤＭ中で３回洗浄し、２００×ｇで１０分 間遠心してベレット化し、そして予め３７°Ｃに温めた５５％ＩＭＤＭ　：　４ ５％ポリエチレングリコ−ル（Ｖ／Ｖ）　、分子量１４３０〜１５７０　（ＢＤ Ｈケミカルズ、プール、イギリス）のＩＩｄに穏やかに再懸濁した。

融合した細胞を、１０％ＦＣＳおよび１００μ台ヒボキサンチン。

１９μ門チミジンを含むＩＭＤＭ　（ＨＴ培地）中に再懸濁し、そしてｌＸｌ０ ’細胞／ウエルでマイクロタイターウェルに、およびｌＸｌ０’細胞／ウエルの 割合で２４六トレイ中に入れた。培養物は、６％ＣＯ□中、３７°Ｃにて、加湿 インキュベーターの中で成長させた。２４時間後、培地を、　８００ｎｍのアミ ノプテリンを含むＨＴ培地（ＨＡＴ培地）からなる選択培地に変更した。このＩ ＩＡＴ選択培地は、　ＨＴ培地に切り換える前に１４日間用いた。この時点で、 非隅台５ＢＣ−Ｈ２０ＩＬＩ胞および非隅台肝細胞は、トリプシンブルーを含有 させることによって立証されるように、　ｉｏ。

％死滅していた。

肝細胞と５ＢＣ−８２０隔金相手の隅台によって形成されたハイブリッド細胞は 、１２０マイクロタイターウエル中に４９個（グループＡ）および２４六トレイ の４８穴中に４５個（グループＢ）が観察された。そして、これは光学顕微鏡に よって観察されるコロニーの存在で立証された。ウェルまたはトレイニハ。

２個またはそれ以上の明確なコロニーを含むものもあった。

目視し得るコロニーを含むウェルまたはトレイは、ヒト血清アルブミン（ＩＳＡ ）　、補体ｃｓ　（Ｃ３）　、およびフィブロネクチン（ＨＦＮ）を分泌する能 力に関して試験した。これらは、培養培地中におけるこれら肝臓分泌タンパクの １またはそれ以上の存在によって立証した。これらタンパクの存在を検出するた めに使用された酵素結合免疫分析は、以下の実施例■に記述されている。グルー プＡの４５個の融合細胞コロニー、およびグループＢの４９個の融合細胞に対し て得られた結果を表■に示す、明らかに、いくつかの隅台細胞系は、１またはそ れ以上の肝臓タンパクを分泌する活性があり、そしてグループＡの５コロニーお よびグループＢの８コロニーが、３つのタンパク全てを分泌した。

これら２つのグループから選抜されたハイブリドーマは。

モノクローン性を確認するために、限定希釈によってクローン化された。ＯＳ＾ 、補体ｃ３．および１ｌＦＮを分泌し続ける多数、表」− 呈Ｉへイノ呈２玉ニー　−一裟λ−−フルフミン　１１ネト　フィブロネクチン 　Ｉλβλ３し２１ｊ三グループ　Ａ　４５／４８　８　１７　２０　５りＩＬ −ブ　Ｂ　４９／１２０　１４　２０　９　８実去直ｌ凹 の西 実施例■におけるグループＡおよびグループＢのコロニーから選抜されたハイブ リドーマは、モノクローン性を確認するために、限定希釈によりサブクロース化 し、そして柔組織の分泌タンパクについて再分析した。　Ｂ３．　Ｄ４．　Ｄ５ ．およびＤ８と名付けられた。４つの親ハイブリッド細胞系をサブクローン化し たところ、各親は、以下の表Ｈに示したように、多数のモノクローナルサブ細胞 系を与えた。サブクローナル細胞系の各々は、以下の酵素結合免疫分析により、 ＩＳＡ、　Ｃ，、および肝Ｎの細胞分泌について分析した。

ヒトアルブミン、補体ｃ３．およびフィブロネクチンに対して特異的なりギ抗ヒ ト抗体は、キャッペルラボズ（モールバーン、　ＰＡ）から得た。加湿チェンバ ー中、４°Ｃにて５０ｎ　Ｅ　／ウェルの１：１０００希釈（１μｓ／ａｄ）で 、−晩、３つの異なる抗血清のうちの１つを用いてマイクロタイタートレイを被 覆した、翌日、　１５０ｎｆの０．２％ゼラチン溶液を、各ウェルに加え、ウェ ル中の非特異的結合部位を飽和させるために室温で１時間放置した。次いで、こ れらトレイを、冷ＰＢＳ１０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０で４回洗浄した。

分析物および対照試料（５０μ２）を、これらトレイに加え。

室温で１時間インキュベートした。分析物試料は、増殖しているモノクローナル 培養物から得られた未希釈の培地であった。対照試料は、１　：２０．００００ に希釈されたヒト血漿（補体対照）、５μｇｉＩｒ１の精製したヒトフィブロネ クチン、および２５μｇ／ｄのヒト血清アルブミンを含んでいた。インキュベー ト後、これらトレイは、上述のＴｗｅｅｎ溶液で３回洗浄した。

ヒトＣ３＋　アルブミン、またはフィブロネクチンに対するベルオキターゼ結合 ヤギ抗体は、キャッベルラボズから得た。

約１μｇ／１ｎｌｌの抗体タンパクという最終希釈率で、ペルオキシダーゼ結合 抗体（５０μりを、各ウェルに加え、室温にて１時間インキュベートシ、結合抗 体を分析物の分泌タンパクへサンドウィッチ状に結合させた。上述のＴｗｅｅｎ 溶液で３回洗浄した後、基質混合液を加え、ペルオキシダーゼ酵素反応を室温で 約３０分間道行させ、１００μｌの１０％ＳＯ５を添加することによって反応を 停止させた。基質混合液は、１．２ｄの０．１Ｍクエン酸／ＨＣＩ緩衝液、　ｐ Ｈ４，２，４，８ｄの２．５ｍＭ　ＡＢＴＳ、および８０ｔｌｉ！、のＩＭＨ２ ０□溶液を混合することにより調製した。この混合液は、洗浄したトレイに加え る約３０分前に調製した。分析混合液／ＳＯ５溶液は、　４１５ｎｍまたは４０ ５ｎｍで測定した。表■の結果から明らかなように、親ハイブリッドＢ３．　Ｏ ４，およびＯ８（全てＨＦＮ分泌細胞）の各々は、ＨＦＮだけを分泌する能力を 有する多数のサブクローンを与えた。同様に親ハイブリッド細胞系Ｄ４は、３つ の肝臓タンパク全てを産生ずる活性を有し、多数サブクローンを与えたが、これ らサブクローンの各々は１分析された３つのタンパク全てを分泌する能力を有し た。

紅 凱二不グユヱ上歎　アルブミン　■生　フィブロネクチンＢ３　３　０　０　３ Ｄ４　９　２　３　９ Ｄ５　８　０　０　８ Ｄ８　３　０　０　３ （以下余白） 実去ｌ」■ ＮＡＮＢまたはＢ　１　二′ウィルスの永久１Ａｌ」ｌＪＬΣΔ盛染 実施例■に従って調製したハイブリッド肝臓細胞を５限定希釈法によりサブクロ ーン化し、そしてＨＦＮを分泌するサブクローンコロニーを単離した。そのハイ ブリッド細胞を２４個のウェルを有するトレーに１×１０ｂ細胞／ウエルの割合 でプレート（播種）１１次の３つの供給源（ａ）〜（Ｃ）のうちの１つからの血 漿１００μ２で覆った：　（ａ）ＮＡＮＢウィルス因子を含んでいることが知ら れているチンパンジー（２世代目のチンパンジーに継代感染していることから明 らかである）の血漿、Φ）輸血後に急性ＮＡＮＢ肝炎になったヒトからのヒト血 漿、および（Ｃ）Ｂ型肝炎ウィルスを含むことが知られているチンパンジー血漿 。

チンパンジー血清および細胞をインキュベートした後、　ＩＭＤＭおよび２０％ ＦＣ３を含む、増殖培地０．５ｄをそれぞれのウェルに加え、加湿した７％Ｃ（ ｈインキュベーター内で３７℃にて細胞を増殖させた。培養物には３〜４日ごと に増殖培地を加え。

毎週肝臓ハイブリッド細胞を採取し、　ＮＡＮＢまたはＢ型肝炎抗原の存在を調 べた。この分析方法において、ウェルから約１×１０７個の細胞含む培養物の一 部を採取し、２００Ｘｇで１０分間の遠心分離を行い、ペレット化した。　ＰＢ Ｓで細胞を３回洗浄した後、細胞を再び懸濁して２．５　Ｘ　１０”細胞／　ｍ ｌとし、そさせた。次に、乾燥した細胞にアセトンを加え１分間保持してスライ ドに固定させた。非特異的な結合を最小にするために、スライドを標準ヤギ血清 （１：１０）をともに、加湿した容器内にて室温で３０分間、あらかじめインキ ュベートしておいた。ＰＢＳで３回、蒸留水で１回洗浄した後、チノパンツ一群 （表３の左に示す）の１つから得た試験血清７０μｌをスライドに加えた。細胞 に非特異的に結合する傾向にある血清因子を除くため９各血清試料を未感染の肝 臓ハイブリッド細胞（血清１ｍ１当り１０７細胞）と前もって処理し、吸収させ た。

加えられた血清を含有するスライドを、湿った容器内で室温にて９０分間インキ ュベートし１次いで、　ＰＢＳで３回、そして蒸留水で１回洗浄した。

フルオレセインイソチオシアネートと結合したヤギ抗ヒトＩｇＧおよびＩｇＭ　 （ＦＩＴＣ結合抗体）は、市販品（Ｚｙｍｅｄ　Ｌａｂｓ）を入手し、そして最 終濃度が約１×１０７体／ｄになるようＰＢＳで希釈した。抗ＩｇＭまたは抗Ｉ ｇＧ　ＦＩＴＣ結合抗体（７０μりを洗浄した細胞に加え、スライドを３０分間 室温でインキュベートした。上記のようにＰＢＳと蒸留水とで洗浄した後、スラ イドにＰＢＳで希釈した５０％グリセロール−滴をマウントし。

螢光顕微鏡下で観察した。細胞を１弱い螢光を（＋）、中間の螢光を（＋＋）　 、強い螢光を（＋＋＋）というように観察して記録した。

最初の免疫螢光の徴候は、３つのウィルス源のすべてを用いた最初の細胞感染の 後、約４〜６週間で現れた。表３に示す結果は、　ＮＡＮＢ因子を含むことが知 られているチンパンジー血漿による感染６週間後に得られた。表４での右欄に見 られるように、特異的な免疫螢光はＮＡＮＢ感染動物からの血清だけに観察され 、他の既知血清には観察されなかった。その結果は次のことを示す：（ａ）肝臓 ハイブリッド細胞はＮＡＮＢウィルスに感染し得る；（ｂ）感染ハイブリッド細 胞は、既知のＮＡＮＢ感染チンパンジーからのＮＡＮＢ血清抗体に認識されるウ ィルス特異的表面抗原を表現する；および、（Ｃ）表面抗原表現のためには。

約４〜６週間のインキュベート期間が必要である。表■に示した結果は、抗Ｉｇ Ｇ抗体を用いて得られた。ＦＩＴＣ結合抗ＩｇＭ抗体では免疫螢光が観察されな かった。これは、チノパンツー抗ＩｇＧ抗体がＩｇＧ型抗体であるならば、当然 予想されることである。

ｌ１ 輸血後に急性ＮＡＮＢにかかったヒトから得られるヒト血漿によっても同様の結 果が得られた。６週間後には、感染した肝臓ハイブリッドはＮＡＮＢ惑染チ感染 ンジーからの血清と特異的な免疫螢光性を示したが、標準のチンパンジー血清と は示さなかった。

ＮＡＮＢ感染ハイブリッド細胞について、さらに細胞感染する能力のあるＮＡＮ Ｂウィルスが存在しているか否かを調べた。上記感染ハイブリッド細胞を１２週 間のインキユベートシ、ペレット化し、そしてＰＢＳで３回洗浄した。細胞をＰ ＢＳ中に約５×１０６細胞／−となるように再懸濁し、透明になるまで音波処理 を行った。上澄（０，５ｄ／ウエル）を未感染ハイブリッドに接種し、チンパン ジー血漿による細胞感染のために行った上述の方法で培養した。約４〜６週間の 連続培養の後、特異的な免疫螢光がチンパンジーＮＡＮＢ血清とで見られたが、 未感染チンパンジーからの血清とでは観察されなかった。

Ｂ型肝炎感染のヒトからの血漿で感染したハイブリッド肝臓細胞は、該ハイブリ ッド細胞培養物が感染した６週間後に。

Ｂ型肝炎表面抗原に対するヤギ抗血清と特異的な免疫螢光染色性を示した。さら に、このハイブリッド肝臓細胞はＢ型肝炎表面抗原を認識する市販のキットで認 識可能な肝炎抗原を分泌した。このことは、確実にＢ型肝炎ウィルスを増殖させ 。

特異的なり型肝炎抗原を分泌するハイブリッド細胞の能力を立証した。

某国Ｉ」Ｗ ＮＡＮＢウィルスによる゛　・な　゛感仇培養細胞のウィルス感染の１つの基準 は、感染した永久増殖性培養細胞からの未感染の永久増殖性培養細胞への感染性 因子の連続的な継代感染によるものである。この実施例は。

ＲＯＩおよびＲＳＩと定義されたＮＡＮＢ感染肝臓細胞からの未感染の細胞系Ｇ Ｌ４２４へのＮＡＮＢウィルス因子の連続的な継代感染を述べている。永久増殖 性細胞系はすべて、実施例■の方法により調製した。ＲＯ２細胞系はＮＡＮＢウ ィルス因子を含むことが知られているチンパンジー血漿を第２のチンパンジーに 継代感染させることにより生産され、それは実質的に実施例■で述べられている 。ＲＳＩ細胞系は、　ＮＡＮＢ肝炎で死亡したヒトの血清の感染により生産され た。

ＮＡＮＢウィルス因子による感染は継代感染において（実施例Ｖで述べたように ）、新たに感染した細胞とＮＡＮＢ特異的ヒトＩｇＧ抗体とを反応させること、 そしてフルオレセイン標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体と反応させることにより確認さ れた。抗体はＮＡＮＢ肝炎で死亡したヒトの血清から得られ、そして実施例Ｖで 分析されるように、チンパンジーＮＡＮＢ感染組織と特異的な反応性を存した。

抗体はＨＰＬＣにより従来の方法により調製した血清のＩｇＧ画分中に含有され ていた。

２つの感染細胞系からのウィルス因子を放出させる次の４つの方法を採用した： ａ、細胞をリン酸緩衝性食塩水（ＰＢＳ）で２度洗浄した。２度目の洗浄の後、 細胞ベレットを最小量の蒸留水（１〜２ｄ）に再懸濁させた。そして、細胞溶解 を調べるために細胞を顕微鏡的に観察した。溶解が９０〜１００％完了したとき に１等容量の２ＸＰＢＳを加え、溶解懸濁液を１５０Ｏｒｐｍで５分間遠心分離 した。上澄を、未感染のＧＬ４２４細胞の培養培地に加えた。

ｂ、感染した細胞を１００μｇ／ｌのマイトマイシンＣで２４時間処理した。Ｐ ＢＳで２度洗浄し、その細胞を未感染のＧＬ４２４細胞と共に共培養した。

Ｃ３感染細胞を水浴で冷却しながら１５秒間で２度音波処理を行った。細胞溶解 は顕微鏡的に確認した。細胞溶解懸濁液を上記（ａ）のようにペレット化し、上 澄を未感染のＧＬ４２４細胞の培養培地に加えた。

ｄ、感染細胞を２度凍結融解処理し９次に、未感染のＧＬ４２４細胞に上澄を加 える前に、上記（ａ）のようにペレット化を行った。

いずれの場合においても、感染にさらされた細胞は、上記ＮＡＮＢ特異的抗体へ の結合について９表面の免疫螢光により。

週ごとに観察された。４つの方法すべてにおいて、２つの感染細胞型の各々から の上澄み画分にさらしてｌＯ週間以内に。

ウィルス因子の伝達（免疫螢光活性により立証される）が示された。未感染のＧ Ｌ４２４細胞からの上澄にさらした標準のＧＬ４２４細胞には免疫螢光活性が観 察されなかった。

感染細胞からの水−溶解（ａ）上澄で感染したＧＬ４２４細胞は。

それら自身が水−溶解工程を受け、その上澄が未感染のＧＬ４２４細胞の培養培 地に加えられた。１０週間以内に免疫螢光を観察し、そのことにより第２世代か ら第３世代へのウィルス因子の継代感染が立証された。

実施炎■ ＮＡＮＢ　、　、　−一７、 この実施例において調べられた細胞系は、未感染細胞系のＧＬ４２４．および感 染細胞のＲＯ２およびＲ５Ｉである。ＲＯ２およびＲ３Ｉの両者の系共、　ＮＡ ＮＢ感染ヒト血清からのＩｇＧ抗体および螢光標識抗ヒト抗体と反応させたとき に、免疫螢光活性を示す。これに対して、未感染ＧＬ４２４系においては免疫螢 光活性は見られない。

感染細胞と未感染細胞における細胞の膜のちがいは１次のようにして調べられた ：まず第１には、ＲＯ２およびＲ５Ｉに対する。　ＮＡＮＢ血漿で汚染された生 細胞の膜上での、免疫螢光反応性が明白であるということ、および、第２には、 完全な状態のＧＬ４２４細胞およびＲＯ２細胞のトリプシン処理（表面タンパク を分解する）によって、　ＮＡＮＢ血清由血清由来１ｇ色疫螢光反応性が減少す るということ。プロテアーゼ処理により、非特異的なバックグラウンドの反応性 （ＧＬ４２４およびＲＯ２に見られる）および特異的反応性（Ｒ０２にみられる ）が減少した。

ＲＯ２の免疫反応性プロテアーゼ感受性から、ウィルス関連抗体はタンパク様の ものまたは、プロテアーゼ感受性部分の複合化したものであることがわかる。感 染系および未怒染系のタンパクの相違を証明するための第一の手段として、二次 元ゲル電気泳動が使用された。各泳動パターンにおいて約５００の個々のタンパ クが明らかになった。目視観察による分析により、そのパターンは同一であるよ うに見えた。

Ａ、　のプロトコル 上記のＧＬ４２４．　ＲＯ２，およびＲＳＩ細胞細胞対数増殖期に。

調製物当り、約ｌＸｌ０”個の細胞の割合で集めた。細胞はダルベツコＰＢＳで ３度洗浄した。ペレットをｌ　ｍＭ　ＣａＣ１ｚおよび１　ｍＭ　ＭｇＣ１ｚを 含む５ｍＭのトリスＨＣＩ　（ｐＨ７，４）の低張溶液５ｄに再懸濁させた。以 下の工程はすべて水中にて行った。細胞懸濁液をＤｏｕｎｃｅ組織ホモジナイザ ーに入れ、１０〜１５ストロークで破砕した。ホモジネートを顕微鏡で観察し、 はとんどの細胞が破砕したことを確認した。ホモシネ−ジョン後。

速やかにホモジネートして２Ｍスクロース（ｐＨ８）を加え。

スクロースの最終濃度を０．２５Ｍとした。プロテアーゼ阻害剤としてフェニル メチルスルホニルフルオライドを０．１００５％となるように加えた。

ホモジネートを１０００Ｘ６で２度遠心分離し、核、破砕されていない細胞、お よび大きなミトコンドリアを除去した。上澄液を８５０００ｘ　ｇで２時間遠心 分離した。得られたペレットをｌｄのトリス−ＨＣｌ／ＣａＣ１ｚ／ＭｇＣ１ｚ 緩衝液に再懸濁させた。

これを少量ずつ分けて一７０″Ｃで保存した。原形質膜および小細胞器官を含む この調製物は、以下に述べる膜の研究に使用された。

Ｂ、　百＼による　疫ド・・ドブロット膜調製物はまず、従来の５ＯＳ−ＰＡＧ Ｅ、およびＮＡＮＢ血漿由来のＩｇＧをプローブとしたウェスタンプロットの手 法を用いて調べられた。銀染色ゲル、またはＮＡＮＢＩｇＧをプローブとしたウ ェスタンプロットを用いても、３つの系においてタンパクの性質には、特異的な 相違は認められなかった。

免疫ドツトプロット法は、１個のウェル当り、約１００μｇ〜０．１μｇの濃度 範囲である不溶性膜調製物（ＧＬ４２４．　ＲＯ２およびＲＳＩ由来）を用いて 行われた。プロットは、１／８から１１５１２までの濃度に倍々希釈した。正常 のＩｇＧまたはＮＡＮＢ　ＩｇＧをプローブとして用いて行われた。ウェル１個 当りタンパク濃度が１μｇを越える濃度の膜および１１５１２を越える濃度のＩ ｇＧのすべての反応において、明らかな非特異的反応が認められた。免疫ドツト プロットのデータの結果を下記の表３に示す。

（以下余白） ｌ１ ＧＬ５２５／ＲＯ２／Ｒ５Ｉ膜の免疫ドツトプロット反応性ウェル当りの膜（μ ｇ） ａ　、　１１５１２　ＮＡＮＢ　ＩｇＧまたは正常１ｇＧをプローブとしたとき の免疫プロット法によるプロットの結果である。

ＲＯ２膜は、１μｇ／ウェルの濃度のときにＮＡＮＢ　ＩｇＧと反応性を有して いたが、コントロールのＧＬ４２４では反応性を有していなかった。３つの調製 物のすべてにおいて、膜濃度が１μｇ／ウェルであり、正常ＩｇＧが１１５１２ であるとき１区別できない低い量での反応性が明らかにされた。ドツトプロット 法での結果より、未怒染ＧＬ４２４に比較して、　ＮＡＮＢ惑染系感染２の免疫 反応性に相違があることが示される。これらの結果は、これら３つの細胞系のＮ ＡＮＢ血漿との免疫螢光反応性の相違により示される抗原的相違の発見を裏付け るものである。

代表的な実施態様および用途がここに述べられてきたが。

本発明がヒトおよび非ヒトの永久増殖性組繊細胞の広い範囲を包含することは明 らかであろう。この永久増殖性組繊細胞は、安定した細胞培養に使用され得、そ してヒト感染性の種々のウィルスに感染した。または感染し得る。

国際調査報告 Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ　ｔｏ　Ｆｏｒｍ　ＰＣＴ／ｒｓＡ／２１０．Ｐａｒｔ　 ＶＬＶ工、　０ＢＳＥＲＶＡＴＩＯＮＳ　ＷＨＥＲＥ　ＵＮＩＴＹ　ＯＦ　ＩＮ ＶＥＮＴＩＯＮ　Ｉｓ　ＬＡＣＫ工ＮＧＡセｔａｃｈｍｅｎセ　ｔｏ　Ｆｏｒｍ 　ＰＣＴ／ＩＳＡ／２１０．　Ｐａｒｔ　Ｖｌ、　１゜Ｔｅ１ｅｐｈｏｎｅ　ａ ｐｐｒｏｖａｌ：Ｒｅａｓｏｎｓ　ｆｏｒ　ｈｏｌｄｉｎｇ　１ａｃｋ　ｏｆ、 ｕｎｉｉｙ　ｏｆ　１ｎｖｅｎｔｉｏｎ：Ｔｉｍｅ　Ｌｉｍｆｔ　ｆｏｒ　Ｆｉ ｌｉｎ　ａ　ＰｒｏｔｅｓｔＡｔｔａｃｈｍｅｎセ　ｔｏ　Ｆｏｒｍ　ＰＣＴ／ ＩＳＡ／２１０．　Ｐａｒｔ　Ｈ。

ＩＬ　Ｆ工ＥＬＤＳ　５ＥＡＲＣＨＥＤ　５ＥＡＲＣＨ置’ｉＳ：ｈｅｐａｔｉ ｔｉｓ、ｔｒｉｏｍａ、ｈｙｂｒｉｄ、ｈｅｐａヒｏｃｙｔｅ、１ｉｖｅｒ　ｃ ｅｌｌ。

ｍｙｅｌｏｍａ、　ｆｕｓｉｏｎ、　ｖｉｒｕｓ、　ｈｅｐａｔｏｍａ−ｉ　１ ｙｍｐｈｏｃｙｔｅ、　ｎｏｎ−Ａ。

ｎｏｎ−Ｂ　ｈｅｐａｔｉセｉｓ、ａｒ、ｅｉｇｅｎ、ｃｕｌｔｕｒｅ、ｖｉｔ ｒｏ、ｃｅｌｌ　ｓｕｒｆａｃｅａｎｔｉｇｅｎ、１ｎｖｅｎヒｏｒｓ’　ｎａ ｍｅｓ。

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. １．組織特異的ヒトウイルスに感染し得る，正常ヒトまたは非ヒト霊長類の永久 増殖性組織細胞系であって，マウス骨髄腫細胞とヒトＢリンパ球とを融合させ， そして培養中にＨＬＡ表面抗原の産生が持続することにより証明される安定なヒ ト染色体の保持を示す融合生成物を選抜することにより調製される融合相手，お よび 該融合相手と，選択されたウイルスにインビボで感染し得る，ヒトまたは非ヒト 霊長類の組織源から得られた単離細胞とを融合させた細胞系， を包含する細胞系。
2. ２．前記融合相手が，マウス骨髄腫細胞とヒトＢリンパ球とを融合させ；培養中 に免疫グロブリン分泌およびＨＬＡ表面抗原産生を示す融合生成物を選抜し；該 選抜された融合生成物を変異原で処理し；そして，ＨＬＡ表面抗原を産生する能 力を保持するが，免疫グロブリンの分泌を示さず，および該融合相手とそのよう なヒト細胞の融合により成功裏に形成される生成物を増殖させる増殖培地で生存 できない変異生成物を選抜すること；により調製される請求の範囲第１項に記載 の細胞系。
3. ３．前記融合相手がＡＴＣＣＮｏ．ＨＢ８４６４の特性を有する請求の範囲第２ 項に記載の細胞系。
4. ４．前記ヒト細胞が肝細胞，関節滑液細胞，および中枢神経系細胞でなる群から 選択される請求の範囲第１項に記載の細胞系。
5. ５．前記ヒト細胞が非Ａ非Ｂ型またはＢ型肝炎ウイルスに感染した肝細胞である 請求の範囲第４項に記載の細胞系。
6. ６．ＡＴＣＣＮｏ．ＨＢ９０２７の特性を有する請求の範囲第５項に記載の細胞 系。
7. ７．前記単離細胞が選択されたウイルスに感染した組織源由来のものであり，そ して前記融合相手との融合により調製された前記細胞系がまた，該選択されたウ イルスに感染している請求の範囲第４項に記載の細胞系。
8. ８．選択された組織特異的ヒトウイルスに感染し得る，正常ヒトまたは非ヒト霊 長類の永久増殖性組織細胞系の調製方法であって， マウス骨髄腫細胞とヒトＢリンパ球とを融合させ，培養中にＨＬＡ表面抗原を安 定に産生する融合生成物を選抜することにより調製される融合相手を提供するこ と；該選抜された融合生成物を変異原で処理すること；およびＨＬＡ表面抗原を 産生する能力を保持するが，該融合相手とそのようなヒト細胞の融合により成功 裏に形成される生成物を増殖させる増殖培地で生存できない変異融合生成物を選 抜すること；選択されたウイルスに感染し得る，選択されたヒトまたは非ヒト霊 長類組織から単離された非リンパ球細胞を得ること；該融合相手と得られた該非 リンパ球細胞とを融合させること；および 該選択されたウイルスに感染し得る融合生成物を選抜すること， を包含する調製方法。
9. ９．選択されたウイルスに感染した融合細胞の調製に用いられる請求の範囲第８ 項に記載の方法であって，前記選抜が，選択された該ウイルスを該融合生成物へ 導入すること；該選択されたウイルスに感染したヒトまたは非ヒト霊長類の抗血 清を提供すること；該抗血清を該融合生成物と反応させること；およびそのよう な抗血清に存在するウイルス特異的抗体を結合させる融合細胞を選抜すること， を包含する方法。
10. １０．前記導入が，前記選択されたウイルスによる前記融合生成物への感染を包 含する請求の範囲第９項に記載の方法。
11. １１．前記融合生成物が非Ａ非Ｂ型またはＢ型肝炎ウイルスに感染し，そして提 供された前記抗血清が，それぞれ既知の非Ａ非Ｂ型またはＢ型肝炎ウイルス感染 したヒトまたはチンパンジーから得られる請求の範囲第１０項に記載の方法。
12. １２．前記導入が，前記選択されたウイルスに感染した，選択されたヒトまたは 非ヒト霊長類組織から単離された非リンパ球細胞を得ることを包含する請求の範 囲第９項に記載の方法。
13. １３．さらに（ａ）ウイルス因子の特異型に関連する細胞表面抗原を同定するこ と；および（ｂ）該細胞表面抗原に対し特異的な抗体を調製すること；および（ Ｃ）該抗体を用いて，ウイルス感染細胞の表面に由来する可溶化ペプチド抗原を 単離すること，を包含する請求の範囲第９項に記載の方法。
14. １４．前記抗原が非Ａ非Ｂ型またはＢ型肝炎ウイルスに感染した細胞から得られ る請求の範囲第１３項に記載の方法。
15. １５．さらに前記ウイルスに対するペプチドワクチン組成物として，前記可溶化 ペプチド抗原またはその一部を使用することを包含する請求の範囲第１３項に記 載の方法。
16. １６．ヒトの非リンパ球組織細胞に感染し得る組織特異的ヒトウイルスによる感 染を，該感染細胞上に存在する細胞表面抗原に対して特異的な血清抗体の出現に より，検出する方法であって， 該組織特異的ヒトウイルスに感染し，そしてマウス骨髄腫細胞とヒトＢリンパ球 とを融合させることにより調製される融合相手を包含する，正常ヒトまたは非ヒ ト霊長類の永久増殖性組織細胞由来の表面抗原を提供すること；培養中にＨＬＡ 表面抗原の産生が持続することにより証明される安定なヒト染色体の保持を示す 融合生産物を選抜すること；そして，該融合相手と，該組織特異的ウイルスにイ ンビボで感染し得る，ヒトまたは非ヒト霊長類の組織源から得られた単離細胞と を融合させること； ヒト患者の血液試料を該表面抗原と反応させること；および 該表面抗原に免疫特異的に結合される血清抗体の存在を検出すること， を包含する方法。
17. １７．前記細胞表面抗原が，前記融合相手とヒト肝臓細胞とを融合させることに より形成され，非Ａ非Ｂ型ウイルスに感染した永久増殖性ヒト肝臓細胞に由来す る，非Ａ非Ｂ型ウイルス感染を検出するための請求の範囲第１６項に記載の方法 。
18. １８．ヒトウイルス因子に特異的に関連し，該ウイルス因子に感染したヒトまた は非ヒト霊長類の永久増殖性組織細胞系に由来する細胞表面抗原であって， 該組織細胞系が，マウス骨髄腫細胞とヒトＢリンパ球とを融合させ，そして培養 中にＨＬＡ表面抗原の産生が持続することにより証明される安定なヒト染色体の 保持を示す融合生成物を選抜することにより調製される融合相手；および該融合 相手と，選択されたウイルスにインビボで感染し得る，ヒトまたは非ヒト霊長類 の組織源から得られた単離細胞とを融合させた細胞系を包含する， 細胞表面抗原。
19. １９．前記細胞表面抗原が，前記融合相手とヒト肝臓細胞とを融合させることに より形成され，非Ａ非Ｂ型ウイルスに感染した永久増殖性ヒト肝臓細胞に由来す る請求の範囲第１８項に記載の抗原。