JPS6098982A - ポリアミン測定用酵素の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は発酵法によるアセチルボリアミンデアセチラー
ゼおよびポリアミンオキシダーゼの製造法に関する。更
に詳細にはポリアミンまたはアセチルポリアミン含有培
地にミクロコツカス属に属する微生物を培養してアセチ
ルホリアミンデアセチラーゼおよびポリアミンオキシダ
ーゼの両酵素を同時に培養蓄ｈ１せしめ、得られた培養
物からアセチルボリアミンデアセチラーゼおよびポリア
ミンオキシダーゼの両酵素を製造する方法に関する。

アセチルボリアミンデアセチラーゼはアセチルブトレツ
シン、アセチルスペルミン、アセチルスペルミジンなど
のアセチルポリアミンのアセチル結合を加水分解し遊離
のポリアミンを生成せしめる酵素である。

ポリアミンオキシダーゼは各種ポリアミンを酸化分解し
、各種アルデヒド、アンモニアおよび過酸化水素を生成
せしめる酵素である。

近年、医薬界においては体液、特に血液、鞭中における
ポリアミンの含量と癌疾患との関係が多く研究され、そ
れに従ってポリアミンの測定法として電気泳動法、薄層
クロマトグラフィー法、ガスクロマトグラフィー法、ア
ミノ酸アナライザー法、高速液体クロマトグラフィー法
、酵素法などが開発されている。しかしなからこれらの
測定法は試料を除張白、加水分解および抽出等の繋帷か
つ長時間を要する前処理後、各測定法に供するという欠
点を有している。その理由は体液、血γｎおよび尿中の
ポリアミンはほとんど大部分かアセチル結合体すなわち
アセチルポリアミンとして存在しており、上記各測定法
の場合はこのアセチルポリアミンを遊離の状態にして測
定に供する必要があるからである。

臨床検査上からはより適切で、より迅速でｎ１１便な測
定法が要望されており、そのためアセチ）レポリアミン
のアセチル結合の加水分解および遊離のポリアミンの測
定について酵素の応用が活発に研究されている。

アセチルボリアミンデアセチラーゼは自然界特に高等動
物の臓器などに広く存在しており、従来は牛やラットの
肝臓を給源として研究されてきた。また、ポリアミンオ
キシダーゼは動・植物を問わず自然界に広く存在してお
り、特に近年は微生物の培養による各柿ポリアミンオキ
シダーゼの開発かなされている。

アセチルボリアミンデアセチラーゼによるアセチルポリ
アミンの加水分解による′Ｉｆｆ、離ポリアミン化とポ
リアミンオキシダーゼによる退団［ボ　・リアミンの酸
化分解の組合せを行なうことは、アセチルポリアミンの
より簡便な測定法の提供を意味する。ポリアミンオキシ
ダーゼの作用によって生成する過酸化水素の定量はすて
番と公知の比色定量法を用いることによって極めて容易
であり、アセチルボリアミンデアセチラーゼとポリアミ
ンオキシダーゼの両酵素を組合せることはアセチルポリ
アミンの測定に非常な利益を提供するものである。

本発明者らは微生物によるアセチルポリアミンの測定に
利用される酵素の工業生産を目的として、広く自然界よ
りアセチルポリアミンを酸化分解する酵素の生産菌を検
索し、その菌株の中から京都府福知山市内の土壇中より
アセチルポリアミンを酸化分解する酵素を多量に生産す
るミクロフッカス属細菌を見出し、本国を液体培♀ｔし
その菌体およびｉｆ″ｉ液を精製することにより、効率
よく、高純度のアセチルポリアミン酢化酵素を製造する
方法をｍ　立したのである。そして、この酵素の詳細な
研究の結果二種類の酵素が混合していることを発見した
。

その一つはアセチルプトレッシンなどのアセチルポリア
ミンを加水分解し遊離のプトレッシンと酢酸を生成する
酵素、すなわちアセチルボリアミンデアセチラーゼであ
り、他の一つはブトレッジ／゛などポリアミンを酸化し
てアルデヒドとアンモニアと過酸化水素を生成するポリ
アミンオキシダーゼであることが見出された。このよう
な作用の二種類の酵素が、一つの種類の微生物によって
生産されることは今まで全く知られていない。

体液中のアセチルプトレッシンなどのポリアミンの測定
にアセチルボリアミンデアセチラーゼと微生物を給源と
したプトレッシンオキシダーゼなどのポリアミンオキシ
ダーゼを併用して、作用させてアセチルプトレッシンな
どの定量を行なうことは知られているかこのような場合
に、極めて好都合なアセチルボリアミンデアセチラーゼ
とポリアミンオキシダーゼを同時に生産する微生物の存
在を明らかにしたのは本発明者らが初めてである。

本発明は、上記の二種類の酵素を唯一種の微生物の培養
によって同時に生産することを初めて可能にしたもので
あり、これは本発明による酵素を安価に社会に提供でき
ることを示しており、その価値は大きいものである。

本発明で使用される菌株は、酵素生産誘導物質としてポ
リアミンまたはアセチルポリアミンを含有する液体培地
で培養することにより、アセチルボリアミンデアセチラ
ーゼとポリアミンオキシダーゼを菌体内に蓄積するが、
培養終了後、菌体を集め、この菌体を破砕して酵素を抽
出し、粗酵素液を得ることができ、更に精製し、乾燥す
ることによって酵素粉末を得ることも可能である。

すなわち、本菌を適当な培地、例えは適当な炭＊源、窒
素源、無機塩類と酵素生産誘導に必要なポリアミンまた
はアセチルポリアミンおよび有機促進物質を含む培地中
で培養するか、ここで炭素源としてはグルコース、可溶
性澱粉などが用いられる。窒素源としては脱脂大豆抽出
物、酊１セエキス、ポリペプトン、肉エキスなどの有機
窒素源が有効である。無機塩類としてはリン酸２カリウ
ム、硫酸マグネシウム、硫酸第１鉄、食塩などが用いら
れる。酵素生蛇１４＞芦物質トシてはプトレッシン、ス
ペルミン、スペルミジンなどポリアミン、またはアセチ
ルプトレッシン、アセチルスペルミンなどアセチルポリ
アミンが用いられる。添加竜は０．０２〜０．５重量％
、好ましくは０．０５〜０．２重ｌｔｔ％カダ有勿Ｊで
ある。有機促進物質としては酵母エキス、肉エキス、コ
ーンスチーブリーカーなと力く良むへ〇培地のｐＨは６
〜９、好ましくは７〜８とし、通気攪拌などの好気的培
養を２０〜３７°Ｃ１好ましくは２７〜３３℃で行なう
。培養時間（ま条ｆトによって異なるか酵素生舘歓か最
ｇｌこ達する時１１３を選べば良く、通常は１６〜３６
時間である。

上記の方法で得られた培養物中から、アセチルボリアミ
ンデアセチラーゼおよびボＩＪアミンオキシダーゼの両
酵素を抽出、精製する方法番よ次のようにして行なう。

培養終了後、培養物中からｒ過またＣよ遠心分離などの
方法により菌体を集菌し、この湿菌体を溶媒として適量
の水、好ましく番よリン酸緩衝液などの緩衝液に分散懸
濁し、好ましくζま３０゛Ｃ以下でリゾチームによる溶
菌、グイノミ１１による磨砕、超Ｈ波による破砕などの
処Ｂにを単独にまたは組合せることによって容易に菌体
内力）らアセチルボリアミンデアセチラーゼおよびポリ
アミンオキシダーゼが同時に溶媒中に抽出されるので、
これを粗酵素液として採取する。

更にこの粗酵素液から硫安分画、アセトン・アルコール
分画を行なうことによって粗酵素を得ることができる。

更に高度に精製された酵素標品を得るにはＤＥｉＡＫセ
ルロース等を用いるイオン交換クロマトグラフィ、ゲル
ｅ過など公知の蛋白質、酵素の精製手段を応用すること
１とよって上記両酵素を含む精製酵素を得ること力ｆで
きる。

また、得られた各酵素液は通常の乾燥方法番とよって乾
燥粉末とすることも可能であり、適当な担体に公知の方
法により固定化することにより固定化Ｍ繁とすることも
できる。

本発明は上記精製工程におしｚで分−１等の条件を変え
ることによってアセチルΔｆｌＪアミンデアセチラーゼ
とｌリアミンオキシタ゛−ゼの両酵素をそれぞれ単独に
分離、分Δ１１することも可ｆ１にであり、それぞれ単
一の酵素剤としてｖＪ造する方法も含むものである。本
発明しこよるアセチルポリアミンデアセチラーゼおよび
ボ１ノアミンオキシダーゼを含む酵素を体液中のボ１ノ
アミン含量の測定に供するには上記の粗酵素液、ｍ、ｔ
　Ｎ！　”ｖ　。

精製酵素、酵素乾燥粉末、固定イヒｌＩｉ琴牽力（使用
でき、また上述した如くして単一イヒされたそれぞれの
酵素を再び混合して使用すること力（Ｔ３丁能でいずれ
も実用上は問題はなｌ／１゜ 本発明のアセチルボリアミンデアセチラーゼおよびポリ
アミンオキシダーゼの両６ＩＡ生−〉θ能を有するミク
ロコツカス１３１こ屈１−るｌａ　ｎ＝物として本発明
者らが分離した菌松；の菌学的刺ミ質を記述する。

ａ）杉　陣 （１）球菌（１，０〜１．５μｍ） （２）双連または四辻 （３）連動性なし、鞭毛なし く４）胞子なし く５）ダラム染色：陽性 （６）抗酸性：陰性 ｂ）生育状態 （２）肉汁寒天斜面培養：生育良好。糸状で光沢あり。

Ｃ）生理的性質 （１）硝酸塩の超元　：陰　性 （２）脱室反応　：陰性 （３）Ｍ、Ｒテスト　：陰　性 （４）Ｖ、Ｐテスト　：陰　性 （５）インドールの生成：陰　性 （６）硫化水素の生成　：陽　性 （７）澱粉の加水分解　：陰　性 （８）クエン酸の利用　：陽　性 （９）＠機窒素源の利）Ｈ：硝酸塩、アンモニウム塩と
もに陽性（１０色素の生成　：陰性 （１１）ウレアーゼ　：陽性 （１２）オキシダーゼ　二陽　性 （１３）カタラーゼ　：＃、性 （１４）生　育ｐＨ：　６．Ｑ　〜９．０（１５）生育
温度　＝２０〜３７６Ｃ （１６）　Ｍ素に対する態度：好気性 （１７）ｏ　−Ｆテスト　：糖を分解しない（１８）糖
類からのガスの生成：陰　性（１９）糖類からの酸の生
成：（ト）は陽性、←）は陰性Ｌ−アルビノース（−）
　Ｄ−キシロース　←）Ｄ−グルコース　←）　Ｄ−マ
ンノース　←）Ｄ−フラクトース（→　マルトース　（
→シュークロース　←）　ラクトース　←）トレハロー
ス　←）Ｄ−ソルビトール（→Ｄ−マンニトール←）　
イノシトール　←）グルセリン　←）　スターチ　←） Ｄ−ガラクトース←） 以上記載の諸性質をバージエイのマニュアル・オブ・デ
ターミネイティブ・バクテリオロジー、第８版（１９７
４年）の分類より検索すると本菌株はミクロコツカス・
ルテウスと同定されるべき微生物であると認め、ここに
本菌株をミクロコツカス・ルテウスに−１１と命名した
。な゛　お本菌株は工業技術院微生物工業技術研究所に
微工研閑寄第７３　（ｌ　０号（ＦＩＲＭ　Ｐ−７３０
０）として寄託されている。

以下に本発明によって得られるアセチルボリアミンデア
セチラーゼの諸性質を記述する。

（１）作用および基質特異性 本酵素はアセチルプトレッシンに作用してアセチル結合
を加水分解し、プトレッシンおよび酢酸を生成する。ア
セチルスペルミン、アセデルスペルミジンにはほとんど
作用しない。各アセチルスペルミンに対する基質特異性
を相対活性で示した。

アセチルスペルミジン　３．５ アセチルスペルミン　２６１ （２）力価測定法 本酵素の力価測定は以下のようにして行なう。

（反応液組成） ０．５Ｍトリスバッファー（ｐＨ８，０）　１．０ｒｒ
ｒ１４−アミノアンチピリン（４ｑ／ｙ）溶液　０．１
ｍｌフェノール（ＩＯＷ／ｍｅ）溶液　０１ｍ１パーオ
キシダーゼ（１２０単位／−）溶液　０．０５−アセチ
ルプトレッシン（２ｖ／ｍ／）溶液　２．０ｍｌ上記組
成の反応液３．３−を３７℃で５分間保温した後、本発
明のアセチルボリアミンデアセチラーゼ酵素液を０．５
−加えて３７℃で反応させ、５０５ｎｍの吸光良の単位
時間当りの増加を測定する。力価の表示は６０分間に１
マイクロモルのプトレッシンを生成する酵素量を１単位
とした。

（３）至適ｐＨ 本酵素は第１図に示す如く、至適ｐＨは８〜９にある。

（４）至適温度 本酵素は第２図に示す如く、至適温度は３０〜４０℃に
ある。

（５）安定性 本酵素のｐＨ安定性は第３図に示す如く、７〜９で安定
である。温度安定性は＋！８４図に示す如く、４０℃ま
で安定である。

（６）　Ｋｍ値 本１＋ｉｆ＋素のアセチルプトレッシンに対するＫｍ値
は０゜５ｍＭであった。

（７）阻害剤および金属イオンの影響 本酵素の１Ｓ１４害剤および金属イオンの影輯を調べた
結果を第１表に示す。なお酵繁活性は無添加の場合を１
００％として相対活性で示した。

第１表 次に本発明によって得られるポリアミンオキシダーゼの
諸性質を記述する。

（１）作用詔よひ基質特異性 本酵素はプトレッシンに作用してアンモニアと過酸化水
素を生成する。スペルミジン、スペルミン、カダベリン
にはほとんど作用しない。また、アセチルプトレッシン
、アセチルスペルミジン、アセチルスペルミンなどアセ
チルポリアミンには作用しない。各ポリアミンに対する
基質特異性を相対活性で示した。

プトレッシン　１００ スペルミジン　４．１ スペルミン　２．３ カダベリン　０ リジン　０ （２）力価測定法 本酵素の力価測定は以下のようにして行なう。

（反応液組成） ０．５Ｍ）リスバラｙｒ　−（１１）Ｈ８，０）　１．
０−４−アミノアンチピリン（４〜／＋ｄ）溶液　０．
１−フェノール（１０岬／−）溶液　０．１−パーオキ
シダーゼ（６０単位／−）溶液　０．１−プトレッシン
（２ｓｖ／ｍｇ）溶液　２．０−上記組成の反応液３．
３−を３７℃で５分間保温した後、本発明のポリアミン
オキシダーゼ酵素液を０．５−加えて１７℃で反応させ
、５０５ｎｍの吸光度の単位時間当りの増加を測定する
。

力価の表示は６０分間に１マイクロモルの過酸化水素を
生成する酵素量を１単位とした。

（３）至適ｐＨ 本酵素は第５図に示す如く、至適ｐＨは８〜９にあ、る
。

（４）至適温度 本酵素は第６図に示す如く、至適流用は３０〜５０℃に
ある。

（５）安定性 本酵素のｐＨ安定性は第７図に示す如く、６〜９で安定
である。温度安定性は第８図に示す如く、５０℃まで安
定である。

（６）Ｋｍ値 本酵素のプトレッシンに対するＫｍ値はＯ６２ｍＭであ
った。

（７）阻害剤および金属イオンの影弊 本酵素の阻害剤および金属イオンの影響をＷパ４べた結
果を第２表に示す。なｋｒ４１素活性は無添加の場合を
１００％として相対活性で示した。

上記の如き性質を有した本発ＩＷＪのアセチルボリアミ
ンデアセチラーゼとｄＣリアミンオキシダーゼを使用し
て、アセチルプトレッシンの定量を行なうことができる
。その具体的な方法について以下参考例で説明する。

参考例（酵素試液組成） ０．５Ｍトリス／”７７７　（ｐＨ８，０）　１．０肩
／４−アミノアンチピリン（４キ／−）溶液　０１Ｆｇ
パーオキシダーゼ（６０単位／−）溶液　ｏ、　ｉ　ｙ
フェノール（ｉｏ−ｙ、”＊）溶液　０．１が本発明の
ポリアミンオキシダーゼＣ２０Ｍ’−ｍｌｎｅ）　０．
２５ｒｄ上記組成の本発明のアセチルボリアミンデアセ
チラーゼおよびポリアミンオキシダーゼを含む酵素試液
に各濃度のアセチルプトレッシン溶液を２．〇−加え、
３７℃で６０分間反応後、５０５ｎｍの吸光度を測定し
た。この結果は第９図に示したようにアセチルプトレッ
シンの濃度（μｍ）と５０５ｎｍの吸光度に直線関係か
紹められ、本発明のアセチルボリアミンデアセチラーゼ
とポリアミンオキシダーゼを使用して、アセチルプトレ
ッシンの定量を行なうことができることが認められる。

本発明を以下の実施例によって詳述するが、これによっ
て本発明は限定されるものではない。

百分率は重量による。

実施例　１ ポリペプトン０．５％、酵母エキス０．０５％、食ｍＯ
，１％、アセチルプトレッシン０．０５％、ｐＨ７，０
からなる培地２０１を含む３０を容ジャーファーメンタ
−（２０Ｏｒ、ｐ、ｍ　）に本発明のミクロコツカス・
ルテウスに−１１を植菌し、３０℃、２４時間、通気攪
拌＠善後、培養液をシャープレス型遠心分１ｉｆｌｔ　
＃Ｉ４１ζよって集閑し７、得られた湿菌体１６０Ｆを
酵素給源とした。この菌体を１／１００Ｍリン酸バッフ
ァー（１）Ｈ７，０）１６００−に分散！Ｍし、ダイノ
ミルにて２５℃以下Ｉζ冷却しながら磨砕した。磨砕液
を遠心分離によって清澄化しアセチルボリアミンチアセ
チラーゼ５０６００単位、ポリアミンオキシダーゼ１１
０３００単位の粗酵素液を得た。次いて１／１００　Ｍ
リン酬バッファー（ｐＨ７，０）にて平＆（ｌたＤＥＡ
Ｉ−セルロース（ファルマシア社製）のカラム（充填＠
　２０００　ｍｌ　）をＩＲ過させて両酵素を吸着させ
、次いで同上バッファーで洗浄後、０．４Ｍ食塩を含む
同上バッファーで両酵素を溶出した。溶出液は限外１過
法によって脱塩濃縮し、凍結乾燥をＴｊない、２．１７
の乾燥粉末を得た。この粉末はアセチルボリアミンチア
セチラーゼ３５４００単位、およびポリアミンオキシダ
ーゼ７６２００　ｌｉｔ位を含むＭＬＩＣであった。

実施例　２ 実施例１に示した培地のうちアセチルプトレッシンの代
りにプトレッシンを使用した他は実施例と同様に行ない
、アセチルボリアミンデアセチラーセ２６０００単位お
よびポリアミンオキシダーゼ８９４００単位を含む酵素
が得られた。

実施例　３ 実施例１に示した同じ培養方法によって得られた抽出液
のＤＩ！ｔＡ１１！−セルロースのカラムの′操作にお
いて、０．４Ｍ食塩を含む同上バッファーで溶出する代
りに、０〜ＩＭまでの食塩濃度勾配溶出法により吸着さ
れた蛋白質を溶出すると０．２〜０．２５Ｍ食塩１７１
４！度の溶出区分と０．３〜０．４Ｍ食塩哨度の溶出区
分に分かれ、前者がポリアミンオキシダーゼ（９０５０
０単位）、後者がアセチルボリアミンデアセチラーゼ（
３９１００単位）であった。それぞれを限外濾過法によ
って脱塩濃縮し、凍結乾燥を行ない、１．２ｚのポリア
ミンオキシダーゼ粉末（７０９００単位）と１．４１の
アセチルボリアミンデアセチラーゼ粉末（２９７００単
位）を得た。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明によるアセチルボリアミンデアセチラー
ゼのｐＨ活性曲線を、第２図は温度活性曲線を、第３図
はｐＨ安定曲線を、第４図は温度安定曲線を示す。第５
図は本発明によるポリアミンオキシダーゼのｐＨ活性曲
線を、第６図は温度活性曲線を、第７図はｐＨ安定曲線
を、第８図は温度安定曲線を示す。第９図は本発明の酵
素剤を使用して、アセチルプトレッシンｐ度と反応液の
５０５ｎｍの吸光度の直線関係を示したものである。 特訂出軸人　ナガセ生化学工業株式会社第１図　第２図 第３図　第４図 第５図　第６図 う； ヤ （６ ア江ケル７トレルン　ｗＭ）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、　ミクロコツカス属に屈し、アセチルボリアミンデ
   アセチラーゼおよびポリアミンオキシダーゼの両酵素の
   生産能を有する微生物を栄養培地ζこ培養し、培養物中
   にアセチルボリアミンデアセチラーゼおよびポリアミン
   オキシダーゼの両酵素を同時に蓄積せしめ、これらを採
   取することを特徴とするアセチルポリアミンデアセチラ
   ーゼおよびポリアミンオキシダーゼの製造法。 ２、　ミクロコツカス属に属し、アセチルボリアミンデ
   アセチラーゼ生産能を有する微生物を栄養培地に培養し
   、培養物中にアセチルボリアミンデアセチラーゼを蓄積
   せしめ、これを採取することを特徴とするアセチルボリ
   アミンデアセチラーゼの製造法。 ３、　ミクロコツカス・ルテウスに−１１を栄養培地に
   培養し、培養物中にポリアミンオキシダーゼを蓄積せし
   め、これを採取することを特徴とするポリアミンオキシ
   ダーゼの製造法。 ４、栄養培地がポリアミンまたはアセチルポリアミンを
   ０．０２〜０．５重班％添加した培地・である特許請求
   の範囲第１項、第２項または第３項記載の製造法。 ５、微生物としてミクロコツカス・ルテウスに−１１を
   使用する特許請求の範囲第１項、学、２項または第４項
   記載の１＃造法。