JPS6069099A - インタ−フエロンの分離精製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 １９５６年の昔、ｌ５ａａｃｓおよびＬｉｎｄｅｍａｎ
ｎ両氏は細胞内ビールス増殖の間接的阻害剤としてイン
ターフェロンを発見した。その時以来、天然由来の多く
の種々のタイプのインターフェロンが同定されそしてそ
れらは特に種々の由来細胞によって以下のように特性づ
けされている。

白血球よシα−インターフェロン 繊維芽細胞よりβ−インターフェロンそしてリンパ球よ
りｒ−インターフェロン。

特定の細胞中において適当な刺状により誘導されるイン
ターフェロンは糖蛋白の化合物杯に属しており、そして
α−およびβ−インターフェロンは酸（ｐＨ２）に対し
て安定であり、そして１０９　ＩＵ／■で種物異的にそ
れらの完全な抗ビールス作用を示す。それぞれ１６５お
よび１６６のアミノ酸よりなる多数のα−およびβ−イ
ンターフェロンの一次構造は解明されている。

大腸菌のインターフェロン遺伝子の表現形を誘導する遺
伝子工学の分野における最も最近の研究は、天然インタ
ーフェロン中に検出されるグリコジルまたは多糖体側鎖
が蛋白質の生物学的活性に何も効果を有していないらし
いということを示した。更に天然伽蛋白から誘導された
抗体は、大腸菌からの非グリコジル化インターフェロン
に比）Ｎ　Ｌうる程度に結合することを示しうる。そし
てこれはインターフェロンの蛋白質構造の抗原決定成分
としての主たる作用を指摘する。

それらの治療上の溶在性の故に、インターフエロンは適
当な細胞培養から培養媒体を収穫することにより、また
はより最近では遺伝子工学径路によってインターフェロ
ンに対するＤＮＡベクトルコーディングをクローン化さ
せた酵母（イースト）および細菌（例えば大腸菌）の醗
酵によって、工業的に大規模で生産されている。

得られる粗製インターフェロン生成物（平均活性、蛋白
質ｉ　ｍｆ当り１０３〜１　ｏ’ｌ　ＩＵ）を単離およ
び精製するためには、一般にアフィニティーおよび吸着
クロマトグラフィー法が使用される。

これらｉｌ″ｊｉ１％い特異性をもってインターフェロ
ンが不動化疎水性リガンド、金属イオン、チオール、有
機水銀化合物、核朋、制御された孔度のガラスおよび抗
体に結合する特別の能力を利用している。しかしながら
種々の精製法にもかかわらず、それらを使用して得られ
るインターフェロンの収率および純度は人に関するイン
ターフェロンの臨床「ジ試みに２いて生ずる１；ｉｌ１
作用の原因に関する不確定性により示されるように満足
できないものに留まっている。すなわち壇ｒしい最適の
単離および８製法が要求されている。

市販の既存のバンクシリカゲルカラム上でのメタノール
、水および蟻酸混合物の１更用による高速液体クロマト
グラフィーによるある独のペプチドおよび蛋白質の８”
ＹＩ　ｍ法はｒ　Ｐｒｅｐ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ第
５巻第３９７〜４１２負［１９７５）に開示されている
。試験された収着媒中で１０μ以上の・１ム均粒子サイ
ズを有するシリカゲルはペプチドまたは蛋白質の分離に
対して不適当であることがＢＥＥ明された。

シリカゲル上でのインシュリンおよびインシュリン誘導
体のクロマトゲランイー的第５製法はヨーロッパ特許第
Ａ−８２，３５９号明細薔に記載されている。この方法
においては、ペプチド不純物およびより高分子量のペプ
チド（例えば酵素）はシリカゲル上に非常に強く吸着さ
れるので、分離を実施した後には吸層媒は再生されずに
捨てられる結果となる。

更にシリケート例えばベントナイト上での吸着によるイ
ンターフェロンの特異的富化はヨーロッパ特許第７１．
６４７号明細書に開示されている。

かくして適当な有機溶媒混合物の使用によって、インタ
ーフェロン（゛分子量１Ｂ、［ｌ［ｌＯ〜２２．［Ｉ　
Ｏ（］　）がカラムクロマトグラフィー用の市販のシリ
カゲル上で、非常に良好ガ移動特性を示し、その結果こ
のタイプのシリカゲルを充填したカラム上でインターフ
ェロン含有粗製混合物のクロマトグラフィー的分離およ
び精製を成功裡に実施可能であることは極めて篤ろくべ
きことであった。

すなわち本発明はインターフェロンのクロマトグラフィ
ー的分離および精製を実施するための混合有機移動相を
使用してシリカゲル上で分離およびオ青製させるべき１
勿質をクロマトグラフィーにかけることを包含する方法
に関する。

移動相としては、一方でインターフェロンそして一方で
は分離させるべき不純物力説λｇ層クロマトグラフィー
用の市販のシリカゲルプレート上で異ったＲｆ値を示す
ようなすべての冶媒混合物を使用することが可能である
。

例えば次の組成を有する混合移動相は適当であることが
証明されている。

ａ）ハロゲン化低級脂肪族炭化水素好ましくはハロゲン
化（０１〜Ｃ３）アルカン例えばクロロホルム、メチレ
ンクロリドまたは１，１．１−トリクロロエタン、 ｂ）メタノールおよび／ｆたはエタノール、Ｃ）　；ｉ
１Ｍ当な揚台にはエチレングリコールモノメチルエーテ
ル（メチルグリコール）および／まタハエチレンクリコ
ールモノエチルエーテル（エチルグリコールン、 ｄ）　水、 リ　好ましくは６個までの炭素原子を有する低級脂肪族
カルボン敏、例えば酢酸または蟻酸、および ｆ）アンモニアおよび／または好捷しくは揮発性の有様
アミン、好ましくは１２個までの炭素原子を有する第６
級脂肪族アミンまたは１０個までの炭素原子を有する第
６級複素環式アミン、例えばトリエチルアミン、Ｎ、Ｎ
−ジエチル−Ｎ−アリルアミン、Ｎ、Ｎ−ジインプロピ
ル−Ｎ−エチルアミン−＆ｆζはＮ−エチルモルホリ／
。

臥６級脂肪族アミンは特にアルキルアミンおよびアルケ
ニルアミンであるとＮ　解されるべきであり、そして第
６級複素環式アミンは特にビロール、ビロリン、ピロリ
ジン、ピペリジンおよびモルホリンのＮ−アルキル訪導
体であると理解されるべきである。

下記すなわち ａ）　５００〜８００容量部のハロゲン化低級脂肪族炭
化水素 ｂ）４００〜７００　’ｄ　置部のメタノールおよび／
またはエタノール、 ｃ）　１００〜３００谷幇部０水、 ｄ）０〜１５０　Ｂ　ｆｉｔ部のメチルグリコールおよ
び／またはエチルグリコール、 ｅ）　１〜２５答量部の低級月げ肪放カルボン１″役、
および ｆ）　１〜５重知二ηｂのアンモニア（これは当モル箪
の揮発性有慎アミンで全部または一部胤侯されていても
よい） よりなる混合移動相が好ましい。

壕だアンモニアまたはアミンをｅ）に記載のカルボン酸
の塩として使用することもまた可能である。

クロロホルムおよび／またはメチレンクロリド、メタノ
ール、水、メチルグリコール、酢酸、トリエチルアミン
および酢酸アンモニウムよりなる混合移動相が特に好ま
しく、そして特にａ）　３００〜８００容量部のクロロ
ホルムおよび／またけメチレンクロリド、 ｂ）４００〜７００谷値部のメタノール、ｃ）　１００
〜３００容量部の水、 ｄ）０〜１５０答ｆｉＬ部のエチレングリコールモノメ
チルエーテル、 ｅ）　１〜１５容箪部の酢酸、 ｆ）　３〜８容量部のトリエチルアミンおよび１〜１０
重九七部の自μ酸アンモニウム よりなるものが好ましい。

本発明の方法の卓越性は、予期せざることにインターフ
ェロンが溶液中に留まるような適当な有機＃動相系を使
用することによってシリカゲルへのインターフェロンの
吸着を特異的に阻止することに基づいている。すなわち
本発明の方法はインターフェロンとそれが細ｊ抱培ｆａ
　’ＩＫ、酵母（イースト）山・よひ＋Ｔｌ１ｌ　ｌ檜
〆肖化！１勿」、・」二び１１・所ｔ’１’ｒブロスか
ら得られｆｃｍ今に生ずる不純物との混合物の分離に対
して顕著に過当でるる。

インターフェロン含有粗製物質は符に遺伝子工学によっ
て修飾された細菌または酵母（イースト）の培養液およ
び訪轡＋＋！乳類細胞の培養上澄液である。

この方法は遺伝子工学により・鹸師芒れた大腸菌株の醗
酵からインターフェロンを分離させるために特に有利に
使用される。

すべての市場的に入手可能なシリカゲル例えは０，０４
〜０．２０ｍｍの粒子サイズ範囲を有する５１０２６０
メルク（ダルムシュタット）、または０．０３５〜０．
１０ｍｍの粒子サイズ範囲を有するクロマトグラフィー
級シリカゲルがカラム充填用として適当である。

連続的に数回使用した佼、カラム充填物には外来性蛋白
質がおる場合には不可逆的に負荷されているので、シリ
カゲルは捨てることができる。処理されたインターフェ
ロンに比べればこのコストは重要ではない。これから生
ずるその他の利点はシリカゲルカラムの分離性が一定に
良好に留まることである。更に例えば高価なカラム充填
物を頻繁に再生させた場合に回避しがたい蛋白質の混在
を除外させることができる。

例　１ 遺伝子工学的な取扱い後にインターフェロンを表現する
大腸―株の１０ノの蹟ｌｒ物からの（ヤ）融物を遠心さ
せそして透明な上パ１みを凍結乾燥させる。

この粗生成物の蛋白質合量はローリ−法によって５０チ
と測定される。細胞Ｊ′！ＩＩ殖抑制作用の低下によっ
て測定されたインターフェロン含量（ｒＪ、　Ｇｅｎ、
　Ｖｉｒｏｌ、Ｊ第６９巻第１２’５〜１３０頁（１９
７８））は３．５　Ｘ　１０９　ＩＦ　Ｕ／、９蛋白質
である。

この粗製物質２ｇを超音波浴中で５　ｍｌの移動相系（
６００−クロロホルム、５７０ｒｎｌメタノール、２０
０ｒｎｌ水、９ｇ酢酸アンモニウム、５．５　ｍｌ！　
トリエチルアミンおよび２ｄｌ！１１［）中に）ｍｊ　
ｉ蜀せしめた。濁った溶液を遠心させそして得られた透
明な上澄みを集めた。残漬を再ひ０．５−の酢酸を加え
た２ｍ７！の移動相で抽出し、セして遠心させる。合し
た透明な上澄みをシリカゲル６０（メルク社製品）の移
動相系中スラリーヲ充填させたカラム（５ｘ８Ｄｒ：ｍ
）に適用する。遠心後の不溶性沈殿を真空下に乾燥させ
る。得られる沈殿の重量ｔｏ３ｇ。このシリカゲルカラ
ムをポンプでわずかに大気圧以上の圧力下に移動相によ
って展開させる。通常の方法で２５４　ｎｍのフローＵ
Ｖスペクトロメーター中で溶出液を追跡する。カラムの
デッドボリュームの後、数分画で全インターフェロン活
性を含有するピークが出現する。

よ、り長い保持時間で更に生成物が溶出される。

それらはインターフェロン活性′を含有しておらない。

インターフェロンを含有する集められた浴出物を再蒸留
したバイロエン不宮の水でその容量の約２倍に希釈しそ
して次いでこの金賞を室温で真空下に約ｙ２まで睦縮す
る。この後容易にその残余の水性浴液を凍結乾燥させる
に光分な程度まで有磯浴媒を除去させる。凍結乾燥後の
我社１０１η（蛋白質含量、６０楚）、インターフェロ
ン油性２．０×１０８ＩＦ　Ｕ１ｍｇ厘白質。すなわち
アツセーの精度を計算に入れないでインターフェロンの
収率はカラムに適用された最初の量の約５０〜６０％と
なる。精製法をくりかえした後、この物質はＳＤＳ電気
泳動で約１８にドルトンのところに本質的に均質なバン
ドを示す。アミノば分析は理論値に相当する。生物学的
活性は８５×１０８　ＩＦ　Ｕ／■である。

例　２ センダイビールス訪与白血球の培誉液からのインターフ
ェロンを含有する凍結乾燥物質をインターフェロン精製
用の出発’１／Ｉ貿として使用した。この物質は６２％
の蛋白質および蛋白質１ｙｎｙ当’り２Ｘ１０”ＩＦＵ
ｋ言有していた。

１．６ｇの粗生成物を・し１」１のようにクロマトグラ
フィーにかけ、そしてインターフェロン含イＪ分Ｉｉｉ
］１を処理した。収量２〃Ｉ２゜５５％蛋白質含１ｔ（
。

１０８　ＩＦ　Ｕ／ｍｆ。

例　３ 大腸菌からのインターフェロン含有粗製物質２ｇを例１
におけるようにしてクロマトグラフィーにかけそして処
理する。使用された移動相は例１のクロロホルム景を同
量のメチレンクロリドで置換させた混合物である。イン
ターフェロン１５ηの収量。蛋白質常置４０饅。蛋白質
１７ノノ１；ｉ［当　り１０８ＩＦＵ　。

例　４ 大腸酊からのインターフェロンを含有する粗生成物２！
！を例１のようにしてクロマトグラフィーにかける。例
１における９ｙの酢取アンモニウムｋ　ｋ　２１１　Ｋ
減らす。インターフェロンの収量６ｙｙ０７０％蛋白賀
含虚。５Ｘ　１０８ＩＦ　Ｕ／〜蛋白蛋白

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）　分１ｌｌＩまたは精製させるべき物質を混合有機
   移動相を使用してクリカゲル上でクロマトグラフィー処
   理することを包含するインターフェロンヲクロマトグラ
   フイー的に分離および精製する方法。 ２）　クロマトグラフィーがシリカゲル充填カラム上で
   実施される前記特許請求の範囲編１狽記載の方法。 ３）クロマドグ２フイーが、 ａ）　ハロゲン化低級脂肪族炭化水素、ｂ）メタノール
   および／またはエタノール、Ｃ）適当な場合ににエチレ
   ングリコールモノメチルエーテルおよび／またはエチレ
   ングリコールモノメチルエーテル、 ｄ）水、 ｅ）低級脂肪族カルボン酸、および ｆ）アンモニアおよび／または有機アミンよりなる混合
   移動相を使用して実施される前記特許請求の範囲第１項
   記載の方法。 ４）クロマトグラフィーが ａ）３００〜８００容量部のハロゲン化低級脂肪族炭化
   水素、 ｂ）４００〜７００容量部のメタノールおよび／または
   エタノール、 ｃ）　１００〜５００容量部の水、 ｄ）　Ｏ〜１５０容童部のエチレングリコールモノメチ
   ルエーテルおよび／またはエチルエーテル、 ｅ）　１〜２５容量部の低級脂肪族カルボン酸および ｆ３　１〜５重量部のアンモニア（これは当モル愈の揮
   発性有機アミンで全部または一部置換されていてもよい
   ２ よりなる混合移動相を使用して実施される前記特許請求
   の範囲第１〜３項のいずれか一つに記載の方法。 ５）　クロマトグラフィーがクロロホルムおよび／また
   はメチレンクロリド、メタノール、水、エチレンクリコ
   ールモノメチルエーテルおよび適当な場合には酢酸、ト
   リエチルアミンおよび酢酸アンモニウムよりなる混合移
   動相を使用して実施される前記特許請求の範囲第１〜６
   項のいずれか一つに記載の方法。 ６）　クロマトグラフィーが ａ）３００〜８００谷量部のクロロホルムおよび／また
   はメチレンクロリド、 ｂ）４００〜７００容斂部のメタノール、ｃ）１００〜
   ３００谷量部の水、 ｄ）０〜ｂ ノメチルエーテル、 ｅ）　１〜１５容量部の酢酸、 ｆ）　３〜８容量部のトリエチルアミンおよび１〜１０
   重量部の酢酸アンモニウム よシなる混合移動相を使用して実施される前記特許請求
   の範囲第１〜５項のいずれか一つに記載の方法。 ７）　クロマトグラフィーが０．０３〜０．２ｍの粒子
   サイズを有するシリカゲル上で実施される前記特許請求
   の範囲第１〜６項のいずれが一つに記載の方法。 ８）インターフェロンが遺伝子工学により値卸された細
   菌または酵母（イースト）の培養物から分離されそして
   稍褒される前記特許請求の範囲第１〜７項のいずれが一
   つに記載の方法。 ９）インターフェロンが篩導哨乳類細胞の培養からの上
   澄みから分離されそして精製される前記特許請求の範囲
   第１〜７項のいずれか一つに記載の方法。