JPH11508264A

JPH11508264A - 抗ウィルス剤としてのビフラバノイドおよびその誘導体

Info

Publication number: JPH11508264A
Application number: JP9503972A
Authority: JP
Inventors: リン、ユー−メーイ; ティー．フラヴァン、マイクル; シュール、ラルフ; イー．ゼンバウアー、デイヴィッド; ザーオ、ジェン−スィアン
Original assignee: メディケムリサーチインコーポレイテッド
Priority date: 1995-06-23
Filing date: 1996-06-21
Publication date: 1999-07-21
Also published as: US5773462A; EP0833631A1; WO1997000679A1; AU707798B2; ATE227569T1; CA2225341A1; AU6288096A; MX9710258A; US5948918A; DE69624813T2; DE69624813D1; EP0833631B1

Abstract

(57)【要約】実質的に精製された抗ウィルス性ビフラバノイド、すなわちロブスタフラボン、ヒノキフラボン、アメントフラボン、アガシスフラボン、フォルケンシフラボン、モレロフラボン、ルスフラバノン、サクセダネアフラバノン、ＧＢ−１ａおよびＧＢ−２ａが提供される。抗ウィルス性ビフラバノイド誘導体およびその塩型、たとえばロブスタフラボンテトラ硫酸カリウム塩、並びにこれらの製造方法も開示される。抗ウィルス性ビフラバノイド、その誘導体もしくは塩を含む医薬組成物も提供される。さらに植物材料から実質的に純粋なロブスタフラボンを得る改良方法も開示される。本発明のビフラバノイド化合物、その誘導体もしくは塩はたとえばインフルエンザ（たとえばインフルエンザＡおよびＢ）；肝炎（たとえばＢ型肝炎）；ヒト免疫不全症ウィルス（たとえばＨＩＶ−１）；ヘルペスウィルス（ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２）；水痘ウィルス（ＶＺＶ）；並びに麻疹のようなウィルス作用因子により引き起こされるウィルス感染の処置および／または予防方法に使用することができる。

Description

【発明の詳細な説明】抗ウィルス剤としてのビフラバノイドおよびその誘導体参照この出願は、１９９５年６月２３日付け出願の米国特許出願第６０／０００４６５号の部分継続出願である。発明の技術分野本発明は、実質的に純粋な抗ウィルス性ビフラバノイド、すなわちロブスタフラボン、ビフラバノイド誘導体およびその塩、たとえばエステル、エーテル、アミン、サルフェート、酸化エチレンアダクトおよび酸塩、並びにこれを含有する医薬組成物に関するものである。さらに本発明は、植物材料から実質的に純粋なロブスタフラボンを抽出するための方法にも関するものである。さらに本発明は、たとえばＢ型肝炎、インフルエンザＡおよびＢ、並びにＨＩＶのようなウィルス感染の予防および／または処置方法にも関するものである。発明の背景人間および他の哺乳動物にて感染病におけるウィルス、すなわち重要な病因源は寸法、形状、化学組成、宿主範囲および宿主に対する作用において著しく相違する種々の感染作用群である。数１０年にわたる研究の後、たとえばＢ型肝炎、インフルエンザＡおよびＢ、並びにＨＩＶのようなウィルスにより引き起こされる病気の処置および／または予防に、極く限られた数の抗ウィルス剤が入手できるようになった。宿主に対するその毒性作用のため、多くの抗ウィルス剤は局部使用に限られる。したがって、広スペクトルの抗ウィルス活性を有すると共に宿主に対する毒性が減少した安全かつ効果的な抗ウィルス剤についてニーズが存在する。ＡＩＤＳの原因としてのヒト免疫不全症ウィルス（ＨＩＶ）を同定して^(36.46 ⁾ 以来、ＨＩＶ感染の安全かつ効果的な処置に関する研究が世界中の薬物発見グループの主たる注目点となっている。ＨＩＶの分子プロセスに対する検討は、薬物設計のための多数の巨大分子標的、たとえばＨＩＶ−１逆転写酵素（ＨＩＶ− ＲＴ）、プロテアーゼおよびインテグラーゼ酵素、並びに制御蛋白質（たとえばＴＡＴおよびＲＥＶ）を同定している。他の標的は、ウィルスの付着および融合を促進する酵素である。ＨＩＶ−ＲＴはＨＩＶの生命サイクルにて必須の酵素であり、ＨＩＶコード化された一本鎖ＲＮＡから二本鎖ＤＮＡへの転写を触媒する。さらにＨＩＶ−ＲＴのＲＮＡ−依存性ＤＮＡポリメラーゼ機能は哺乳動物メタボリズムにて同様なプロセスを持たず、したがって化学療法剤のための適する標的である。Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）は全ての年令の人に感染する。これは最も急速に伝染する性的伝染病の１種であり、さらに注射針の共用により或いは人間の粘膜が感染者の血液、精液、腟分泌物または唾液に露呈される挙動によっても伝染しうる。初期の病状は殆ど致命的でないが、肝炎に罹患した人間と接触した者の１０％は、寿命にわたり感染して、たとえば肝硬変および肝臓癌のような重大かつ長期の肝臓病を発現する高い危険性をもたらし、重大な合併症または死亡をもたらしうる⁽¹⁾。世界保険機構はＨＢＶを第９位の主たる死亡原因として挙げている。約３億の人間が世界中にて臨床的にＨＢＶで慢性感染しており、米国では１００万人が存在すると推定される。ザ・センター・フォア・ディジーズ・コントロールは、３０万件以上の新たな急性ＨＢＶ感染の病例が毎年米国にて生じ、肝硬変に基づき４千人の死亡および肝細胞癌に基づき千名の死亡が生ずると推定する⁽²⁾ 。最高割合のＨＢＶ感染は東南アジア、南太平洋諸島、サブサハラアフリカ、アラスカ、アマゾン、バハイ、ハイチおよびドミニカ共和国で生じ、人口の約２０％が慢性感染している⁽³⁾。Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）感染は現在では最も重要な慢性ウィルス感染であるが、安全かつ有効な療法は現在でも可能ではない。ＨＢＶキャリヤのための主たる療法選択はα−インターフェロンであって、活発なウィルス複製を抑制することができる。しかしながら最も成功した研究においてさえ、慎重に選択された患者群における反応割合でも僅か４０％を越えない^(5,6)。インターフェロンの失敗につき挙げられる理由の１つは、肝臓におけるウィルススーパーコイルＤＮＡの持続性である⁽⁷⁾。たとえばヌクレオシド同族体のような多くの有望な抗ウィルス剤の臨床的開発は、その非特異性人体分布が顕著な毒性副作用をもたらすため阻害される。しかしながら最近、新規なヌクレオシド同族体、すなわち２′，３′−ジデオキシ−３′−チアシチジン（３ＴＣ）が見出され、極く僅かな副作用にてＨＢＶ複製に対し極めて有力であることがと判明した^(8-10)。インフルエンザは発熱、悪寒および一般的な病気感覚、並びに筋肉における疼痛を特徴とするウィルス感染であって呼吸気管、頭部および腹部における腫れの徴候が変化する。インフルエンザは群Ａ、ＢおよびＣ₄として分類される数種類のミクソウィルスによって引き起こされる。これらインフルエンザウィルスは一般に同様な徴候をもたらすが、抗原的には完全に無関係であって、１種類による感染は他の種類に対し免疫性を付与しない。インフルエンザは世界中で波状的流行病として生ずる傾向を有し、インフルエンザＡは２〜３年のサイクルで発生する傾向があり、さらにインフルエンザＢは４〜５年のサイクルで生ずる。インフルエンザは近代的医薬により殆ど抑制されない数種の一般的な感染病の１種である。その年間の流行は、しばしば破滅的流行病となる。たとえば２千万人以上を死亡させると共に恐らくその人数の１００倍に影響を与えた１９１８年のインフルエンザ流行が、これまで記録されたうち最も致命的な疫病であった。その後、より程度の低い２種の他の流行病が存在し、いわゆる１９５７年のアジア型インフルエンザおよび１９６８年の香港型インフルエンザであった。これら流行病は全て、人間集団が殆ど耐性を持たず、従来存在するインフルエンザウィルスワクチンが無効の新種類のインフルエンザウィルスの出現を特徴とした。さらに、各流行病の間でインフルエンザウィルスは徐々に抗原変化を受けて、新たな感染に対する免疫の耐性のレベルを低下させる⁽⁴⁾。現在流通しているＡ型およびＢ型ウィルスの死滅株を含有する抗インフルエンザワクチンも入手しうるが、感染の予防には僅か６０〜７０％の成功率である。標準的インフルエンザワクチンは、新たなウィルスの変種に対処すべく毎年再設計せねばならない。さらに、付与される免疫性は短寿命である。インフルエンザの予防および処置にて現在効果的である唯一の薬剤はアマンタジン塩酸塩およびリマンタジン塩酸塩である^(11-13)。アマンタジンの臨床用途は過剰割合のＣＮＳ副作用により制限されている一方、リマンタジンは動物および人間の両者におけるＡ型インフルエンザに対し一層活性であり、より低い副作用を伴う^(14,15) 。これがインフルエンザＡの化学的予防法の選択薬物である。^(13,16,17)。しかしながら両薬物の臨床的有用性は、インフルエンザＡウィルスのみに対しての効果、重大なインフルエンザにおける不確定な治療効能があり、および或る種の処置患者における薬物耐性株発生の最近の知見により制限される。リバビリンも治療上活性であると報告されているが、これは開発の研究段階にある^(23,24)。ＨＢＶおよびインフルエンザの両感染を処置するための可能な療法の探索は若干成功を治めているが、ＨＩＶの治療剤は著しく制限される。さらにＨＢＶ、インフルエンザおよびＨＩＶに関する既知の安全かつ治療的な処置は存在しない。ＨＢＶにおいて薬物３ＴＣを例外とし、ヌクレオシド系の抗ウィルス剤の使用は恐らく細胞ミトコンドリアＤＮＡの交差抑制に基いて毒性をもたらす。明かに、交差抑制に関連した毒性を最小化しうるような新規な種類の抗ウィルス剤につきニーズが存在する。インフルエンザにおいて、アマンタジンおよびリマンタジンはインフルエンザＡウィルスに対してのみ若干有効であることが示されており、アマンタジンは過度の副作用を有する。最近、アマンタジンおよびリマンタジンに対し耐性である種類のインフルエンザＡが分離されている。したがって、インフルエンザＡおよびインフルエンザＢの両者に対し、並びにＨＢＶおよびＨＩＶに対し新規な種類の治療的抗ウィルス剤のニーズが存在する。発明の要点本発明は、実質的に精製された抗ウィルス性ビフラバノイド、その誘導体およびその塩、並びにこれらを含有する医薬組成物；実質的に純粋なロブスタフラボノンを植物材料から抽出する改良方法；抗ウィルス性ビフラバノイドからの誘導体および塩の製造方法；並びに抗ウィルス性ビフラバノイド、その誘導体および塩を用いるウィルス感染の処置および／または予防方法に関するものである。本発明は、ロブスタフラボン(robustaflavone)、ヒノキフラボン(hinokiflavo ne)、アメントフラボン(amentoflavone)、アガシスフラボン(agathisflavone)、モレロフラボン（morelloflavone)、フォルケンシフラボン(volkensiflavone)、ルスフラバノン(rhusflavanone)、サクセダネアフラバノン(succedaneaflavanon e)、ＧＢ−１ａおよびＧＢ−２ａを含む実質的に精製されたビフラバノイドを提供し、これらを含有する医薬組成物も開示される。式Ｉはこれらビフラバノイドの化学構造を示す。たとえばルス・サクセダネア(Rhus succedanea)およびガルシニア・マルチフロラ(Garcinia multiflora)のような各種の天然源から得られた植物材料から抽出しうる本発明のビフラバノイドは、ウィルス活性の抑制に有効であることが判明し、たとえばインフルエンザＡおよびＢ、Ｂ型肝炎、並びにＨＩＶ−１、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、ＶＺＶおよび麻疹のような広範囲のウィルス感染を処置および／または予防するための方法に使用することができる。ロブスタフラボンはインフルエンザＡおよびＢウィルス、Ｂ型肝炎、ＨＩＶ−１、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２の活性を効果的に抑制する。ヒノキフラボンおよびモレロフラボンは各種類のＨＩＶ−１に対し同様な活性を示した。抗ウィルス性ビフラバノイド誘導体およびその塩、並びにこれらを含有する医薬組成物も本発明に包含される。代表的誘導体はエーテル類（たとえばメチルエーテル）、エステル類、アミン類、酸化エチレンアダクトおよびポリマー（たとえばアペギニンのトライマーおよびテトラマー）を包含する。代表的塩は硫酸塩および酸塩を包含する。これら誘導体および塩の製造方法も提供される。たとえばロブスタフラボンの塩（たとえばロブスタフラボンテトラ硫酸カリウム塩）はＢ型肝炎の活性を効果的に抑制することが突き止められた。式Ｉはビフラバノイド誘導体の数種の例を示す。ロブスタフラボンを植物材料から抽出する改良方法も提供される。この方法によれば、向上した収率における実質的に純粋なロブスタフラボンを、トルエン／エタノール／ピリジンからなる特定の溶剤混液の使用により得ることができる。改良抽出法は従来報告された方法からベンゼンの使用を排除し、ピリジンを少容量だけ必要とする。最後に、抗ウィルス性ビフラバノイドを用いるウィルス感染の処置および／または予防方法についても記載する。代表的なウィルス感染はインフルエンザＡおよびＢウィルス、Ｂ型肝炎およびヒト免疫不全症ウィルス（ＨＩＶ−１）、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、ＺＶＺおよび麻疹を包含する。したがって本発明の目的は、実質的に精製された抗ウィルス性フラバノイド、すなわちロブスタフラボン、ヒノキフラボン、アメントフラボン、アガシスフラボン、モレロフラボン、ルスフラバノン、サクセダネアフラバノン、ＧＢ−１ａおよびＧＢ−２ａを提供することにある。本発明の他の目的は、ビフラバノイド、すなわちロブスタフラボン、ヒノキフラボン、アメントフラボン、アガシスフラボン、モレロフラボン、フォルケンシフラボン、ルスフラバノン、サクセダネアフラバノン、ＧＢ−１ａおよびＧＢ− ２ａの抗ウィルス性誘導体および塩型、並びにその製造方法を提供することにある。抗ウィルス性ビフラバノイド誘導体の代表例はロブスタフラボンテトラ硫酸カリウム塩を包含する。さらに本発明の他の目的は、たとえばロブスタフラボン、ヒノキフラボン、アメントフラボン、アガシスフラボン、モレロフラボン、フォルケンシフラボン、ルスフラバノン、サクセダネアフラバノン、ＧＢ−１ａ，ＧＢ−２ａ、その誘導体もしくはその塩のような少なくとも１種の抗ウィルス性ビフラバノイドを含む医薬組成物を提供することにある。さらに本発明の目的は、実質的に純粋なロブスタフラボンを従来の方法よりも一層高収率にて得るための改良方法を提供することにある。さらに本発明の他の目的は、抗ウィルス有効量のビフラバノイドを投与することを含むウィルス感染の処置および／または予防方法を提供することにある。代表的なウィルス感染は、たとえばインフルエンザ（たとえばインフルエンザＡおよびＢ）；肝炎（たとえばＢ型肝炎）；ヒト免疫不全症ウィルス（たとえばＨＩＶ−１）；ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、ＺＶＺおよび麻疹のようなウィルス源によって引き起こされる。本発明のこれらおよび他の目的は、以下の詳細な説明から明かとなるであろう。式Ｉアメントフラボン(1)、アガシスフラボン(2）、ロブスタフラボン(3)、ヒノキフラボン(4)、Ｒ＝Ｈロブスタフラボンテトラ硫酸Ｋ−塩(17)、Ｒ＝ＳＯ₃Ｋフォルケンシフラボン(5)、モレロフラポン(7)、Ｒ＝ＨＲ₁＝Ｒ₂＝Ｈ、フォルケンシフラボンＲ₃＝ＯＨヘキサメチルエーテル(6)、モレロフラボンヘプタＲ＝ＣＨ₃ メチルエーテル(8) Ｒ₁＝Ｒ₂＝ＣＨ₃ Ｒ₃＝ＯＣＨ₃ ルスフラバノン(9)、サクセダネアフラバノン(11) 、Ｒ＝ＨＲ＝Ｈルスフラバノンヘキササクセダネアフラバノンアセテート(10) ヘキサアセテート(12) Ｒ＝ＣＯＣＨ₃ Ｒ＝ＣＯＣＨ₃ ＧＢ−１ａ(13)、Ｒ₁＝Ｒ₂＝Ｒ₃＝ＨＧＢ−１ａヘキサメチルエーテル(14)、Ｒ₁＝Ｒ₂＝ＣＨ₃、Ｒ₃＝ＨＧＢ−１ａグリコシド（１６）、Ｒ₁＝Ｒ₃＝Ｈ、Ｒ₂＝ＧＬｃＧＢ−２ａ(16)、Ｒ₁＝Ｒ₂＝Ｈ、Ｒ₃＝ＯＨ図面の説明第１図は、実施例１０に記載したインフルエンザＡウィルス感染マウスにおける平均動脈酸素飽和（平均ＳａＯ₂（％））に対するＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）におけるロブスタフラボンでの処置の効果を示す。第２図は、実施例１０に記載したインフルエンザＡウィルス感染マウスにおける平均肺尺度（mean lung scores）に対するＤＭＳＯにおけるロブスタフラボンでの処置の効果を示す。第３図は、実施例１０に記載したインフルエンザＡウィルス感染マウスにおける平均肺重量に対するＤＭＳＯにおけるロブスタフラボンでの処置の効果を示す。第４図は、実施例１０に記載したインフルエンザＡウィルス感染マウスにおける平均ウィルスタイターに対するＤＭＳＯにおけるロブスタフラボンでの処置の効果を示す。第５図は、実施例１０に記載したインフルエンザＡウィルス感染マウスにおける平均動脈酸素飽和（平均ＳａＯ₂（％））に対するＣＭＣにおけるロブスタフラボンでの処置の効果を示す。第６図は、実施例１０に記載したインフルエンザＡウィルス感染マウスにおける平均肺尺度に対するＣＭＣにおけるロブスタフラボンでの処置の効果を示す。第７図は、実施例１０に記載したインフルエンザＡウィルス感染マウスにおける平均肺重量に対するＣＭＣにおけるロブスタフラボンでの処置の効果を示す。第８図は、実施例１０に記載したインフルエンザＡウィルス感染マウスにおける平均ウィルスタイターに対するＣＭＣにおけるロブスタフラボンでの処置の効果を示す。発明の詳細な説明本明細書で引用する引例および特許公報を全て参考のためその全体をここに引用する。本発明の具体例において実質的に純粋なビフラバノイド、すなわちロブスタフラボン、ヒノキフラボン、アメントフラボン、アガシスフラボン、モレロフラボン、フォルケンシフラボン、ルスフラバノン、サクセダネアフラバノン、ＧＢ− １ａおよびＧＢ−２ａ、前記ビフラバノイドの誘導体および塩、並びにこれらを含有する医薬組成物が開示される。ビフラバノイドを抽出および単離する方法は以前報告されている^{(28,37,39,40,53-55)}。さらに、これらビフラバノイドの数種に関する、たとえば酢酸塩^(37,38)およびメチルエーテル^(39,40)のような誘導体の製造方法も報告されている。ビフラバノイド誘導体の代表的な製造方法を後記実施例に示す。本出願人は、これらビフラバノイド（特にロブスタフラボン）が、たとえばインフルエンザＡおよびＢ、Ｂ型肝炎、並びにＨＩＶ−１、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、ＶＺＶおよび麻疹のようなウィルスの１つもしくはそれ以上の活性を抑制の際に驚くほど効果的であったことを確認した。最初のビフラバノイド（すなわちビフラボン）がフルカワにより１９２９年にギンクゴ・ビロバＬ（ginkgo biloba L）から黄色色素として分離されて以来、約１００種のビフラバノイドが現在まniで分離されている^(44,45,61)。たとえばギンクゲチン(ginkgetin)のような数種のビフラバノイドの生物学的活性が報告されている。たとえば末梢血管拡張活性、抗ブラジキニン活性および抗痙攣活性が観察されている^(48,62)。ガルシニコリンはラット肝細胞懸濁物にてＲＮＡ合成を剌激する⁽⁵⁷⁾。さらにアガシスフラボン、コラビロン、ＧＢ−１およびＧＢ −２は肝臓保護活性を有する^(33,49)。ヒノキフラボン、カヤフラボン、ビロベチン、ロフィロンＡ、ロフィライン酸およびソテツフラボンは、エプスタイン・バールウィルス（ＥＢＶ）のゲノム発現に対し抑制作用を示す^(51,52,60)。ＧＢ −１は軟属腫死滅活性を示す⁽⁶⁵⁾のに対し、ダフノドリンＡ、ダフノドリンＢおよびダフノドリンＤは抗微生物活性を有する⁽³⁴⁾。ヒノキフラボンはヒトマウスエピデルモイドカルシノーマ（ＫＢ）の組織培養細胞に対し細胞毒性を示す⁽⁵⁶⁾。アメントフラボンおよびモレロフラボンは脂質過酸化に対し抑制作用を示し^(41,59,66)、コラビロンは血糖降下作用を示した⁽⁵⁰⁾。しかしながら、これら引例はいずれもロブスタフラボン、ヒノキフラボン、モレロフラボン、アメントフラボン、アガシスフラボン、フォルケンシフラボン、ルスフラバノン、サクセダネアフラバノン、ＧＢ−１ａおよびＧＢ−２ａ（特にロブスタフラボンおよびそのテトラ硫酸カリウム塩）がインフルエンザ（たとえばインフルエンザＡおよびＢ）；肝炎（たとえばＢ型肝炎）；ヒト免疫不全症ウィルス（たとえばＨＩＶ−１）；ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、ＶＺＶおよび麻疹の少なくとも１種に対し抑制作用を有することを開示も示唆もしていない。本発明の他の例において、実質的に純粋なロブスタフラボンを天然源から抽出する改良方法も提供される。ロブスタフラボン、すなわち天然産ビフラバノイドがルス・サクセダネアの種子粒から従来分離、精製および同定されている⁽²⁵⁾。ロブスタフラボンの他の供給源は次のものを包含する：ルス・サクセダネアＬの種子粒⁽²⁵⁾；セラギネラ・レピドフィラの葉(Selaginella lepidophylla)⁽²⁷⁾；アナカルジウム・オシデンタレ(Anacardium occidentale)の葉⁽²⁸⁾；ポドカルプス・ネリイホリウスＤ．(Podocarpus neriifolius D Doa)ドアの葉および枝⁽²⁹⁾ ；セラギネラ・デンチクラタ(Selaginella denticu lata)⁽³⁰⁾；およびセラギネラ・ウイルデナウイ(Selaginella willdenowii)⁽³¹⁾ 。ワックス樹（wax tree）ルス・サクセダネアＬ（アナカルジアシー）の石果は、これらがジャパンワックスを生ずる点において極めて経済的に重要である。この種類に関する初期の研究は、木材におけるフスチン（fustin）およびフィセチン(fisetin)、葉におけるロイホリン(rhoifolin)、ワックスにおけるジャパン酸 (japanic acid)、並びに種子粒におけるエラジン酸(ellagic acid)、脂肪酸およびフラバノイドの存在を示している。ワックス樹の種子粒における生体色素の他の研究は８種類のビフラバノイドの分離をもたらし、そのうち４種は新規であった。種子粒のエタノール抽出物の濃縮はエラギン酸、すなわち生体色素Ａ（ヒノキフラボンおよびロブスタフラボン）、並びに生体色素Ｂ（アメントフラボン）のフラクションを生成するのに成功した。他の濃縮物は粗製黄色生体色素Ｃを与え、これはシリカゲルカラムクロマトグラフィーにかけるとフラクションＣ_I（ルスフラバノン、サクセダネアフラバノンおよびネオルスフラバノン）、Ｃ_II（ルスフラボン）、並びにＣ_III（アガシスフラボン）を与えた。実質的に純粋なロブスタフラボンを植物材料から抽出すると共に単離する従来の方法が報告された⁽⁵⁵⁾。しかしながら、この方法は多量のベンゼンおよびピリジンを使用し、ピリジンは大規模の抽出に使用するには望ましくなく、ロブスタフラボンの平凡な収率しか与えなかった。本出願人は、ベンゼンを排除すると共にピリジンの量を著しく減少させて、従来法と対比して、実質的に純粋なロブスタフラボンの量を少なくとも２倍生ぜしめる改良抽出法を見出した。本発明のこの例によれば、約１０〜３０：２〜１０：１、好ましくは約２０：５：１の範囲の容量比にてトルエン／エタノール／ギ酸を含む溶剤混液が有益であると判明した。この特定溶剤混液は大規模抽出に特に有用であると判明した。本発明の改良抽出法による抽出の例を以下に示す。さらに本発明の他の例においては、抗ウィルス有効量のビフラバノイド、たとえばロブスタフラボン、ヒノキフラボン、アメントフラボン、アガシスフラボン、モレロフラボン、フォルケンシフラボン、ルスフラバノン、サクセダネアフラバノン、ＧＢ−１ａおよびＧＢ−２ａを投与することからなる哺乳動物におけるウィルス感染の処置および／または予防方法が提供される。本発明を実施するには、ロブスタフラボンまたはその誘導体の投与が好適である。哺乳動物の例はヒト、霊長動物、ウシ、ヒツジ、ブタ、ネコ、イヌなどを包含する。ウィルスの例は限定はしないがＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、単純疱疹ウィルス（１型および２型）、（ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２）、水痘ウィルス（ＶＺＶ）、サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）、乳頭腫ウィルス、ＨＴＬＶ−１、ＨＴＬＶ−２、ネコ白血病ウィルス（ＦＬＶ）、鳥類肉腫ウィルス、たとえばラウス肉腫ウィルス（ＲＳＶ）、Ａ−Ｅ型肝炎、ウマ感染、インフルエンザウィルス、アルボウィルス、麻疹、耳下腺炎、風疹の各ウィルスを包含する。より好ましくは本発明の化合物は肝炎および／またはインフルエンザウィルスに感染したヒトを処置するのに使用される。好ましくは本発明の化合物は、ヒト免疫不全症ウィルスに露呈または感染されたヒト（すなわち処置を必要とする）を予防的または治療的に処置すべく使用される。抗ウィルス性ビフラバノイドおよびその誘導体は、非経口投与のための凍結乾燥粉末の溶液として処方することができる。粉末は、適する希釈剤または他の医薬上許容しうるキャリヤの添加により使用前に再編成することができる。この液体処方物は一般に緩衝等張性水溶液である。適する希釈剤の例は正常等張性塩水溶液、水中または緩衝酢酸ナトリウムもしくは緩衝酢酸アンモニウム溶液中の標準的５％デキストロースである。この種の処方物は非経口投与につき特に適しているが、経口投与にも使用することができる。たとえばポリビニルピロリドン、ゼラチン、ヒドロキシセルロース、アカシア、ポリエチレングリコール、マニトール、塩化ナトリウムもしくはクエン酸ナトリウムのような賦形薬を添加することが望ましい。代案として、本発明の化合物は経口投与用としてカプセル化、錠剤化することができ、或いはエマルジョン（水中油型もしくは油中水型）シロップとして作成することもできる。一般に医薬処方業界で知られた医薬上許容しうる固体もしくは液体キャリヤを添加して組成物を向上または安定化させることができ、或いは組成物の作成を容易化させることができる。固体キャリヤは澱粉（コーンもしくは馬鈴薯）、乳糖、硫酸カルシウム二水塩、テラアルバ、クロスカルメロースナトリウム、ステアリン酸マグネシウムまたはステアリン酸、タルク、ペクチン、アカシア、寒天、ゼラチン、マルトデキストリンおよびマイクロクリスタリンセルロース或いはコロイド状二酸化珪素を包含する。液体キャリヤはシロップ、落花生油、オリーブ油、コーン油、ゴマ油、塩水および水を包含する。さらにキャリヤはたとえばグリセリルモノステアレートもしくはグリセリルジステアレートのような持続放出物質を単独で或いはワックスと共に含むこともできる。固体キャリヤの量は変化するが、好ましくは単位投与物１個当たり約１０ｍｇ〜約１ｇである。ビフラバノイドもしくはその誘導体を投与するための投与量範囲は、感染の徴候を緩和させる所望の作用を発生する量である。たとえば、ここで用いるインフルエンザもしくは肝炎の感染に医薬上有効な量とは、抗ウィルス抗体の存在、培養可能なウィルスの存在および患者血清におけるウィルス抗原の存在などにより感染が証明される期間にわたり、循環ウィルスを抑制または阻止する量を維持するように投与される量を意味する。抗ウィルス抗体の存在は、たとえば標準ＥＬＩＳＡまたはウェスタン・ブロット分析の使用により決定することができる。一般に投与量は年令、感染の程度、体重およびたとえば免疫耐性のような対処表示と共に変化する。さらに投与量は化合物に伴いうる任意の悪副作用の存在によっても判定される。可能であれば、悪副作用を最小限に保つことが常に望ましい。当業者は、個々の患者における所望の有効濃度を得るべく使用される組成物の正確な処方の投与に適する量、方式および方法を容易に決定することができる。しかしながら、投与量は約０．００１ｍｇ／ｋｇ／１日〜約１５０ｍｇ／ｋｇ／１日の範囲で変化しうるが、好ましくは約１〜５０ｍｇ／ｋｇ／１日である。医薬組成物は他の医薬をビフラバノイドおよびその誘導体と共に含有して、ウィルス感染を処置（治療もしくは予防）することができる。たとえば他の医薬は限定はしないが他の抗ウィルス性化合物（たとえばＡＺＴ、ｄｄＣ、ｄｄＩ、Ｄ４Ｔ、３ＴＣ、アシクロビル、ガンシクロビル、フッ素化ヌクレオシドおよび非ヌクレオシド類化合物、たとえばＴＩＢＯ誘導体、ネビラピン、サキナビル、α −インターフェロンおよび組換ＣＤ４）、免疫刺激剤（たとえば各種のインターロイキンおよびサイトキン）、免疫調整剤および抗生物質（たとえば抗細菌剤、抗菌剤、抗−ニウモシスティス剤）を包含する。以下実施例を示すが、これらは本発明の範囲を限定するものでない。これら実施例においては１１種のビフラバノイド、すなわちアメントフラボン（１）、アガシスフラボン（２）、ロブスタフラボン（３）、ヒノキフラボン（４）、フォルケンシフラボン（５）、モレロフラボン（７）、ルスフラバノン（９）、サクセダネアフラバノン（１１）、ＧＢ−１ａ（１３）、ＧＢ−１ａ７″−Ｏ−β−グルコシド（１５）およびＧＢ−２ａ（１６）（これらはルス・サクセダネアおよびガルシニア・マルチフロラから分離）、並びにそのメチルエーテル、酢酸塩および硫酸カリウム塩、フォルケンシフラボンヘキサメチルエーテル（６）、モレロフラボンヘプタメチルエーテル（８）、ルスフラバノンヘキサアセテート（１０）、サクセダネアフラバノンヘキサアセテート（１２）、ＧＢ−１ａヘキサメチルエーテル（１４）およびロブスタフラボンテトラ硫酸カリウム塩をその抗ウィルス活性につき評価した。ＨＩＶ−１ＲＴ、並びにヘルペスウィルス（ＨＳＶ−ＬＨＳＶ−２、ＨＣＭＶおよびＶＺＶ）および呼吸ウィルス（インフルエンザＡ、インフルエンザＢ、ＲＳＶ、パラインフルエンザ３、アデノウィルス５および麻疹）を含有する各種のウィルスに対する抑制活性を検討した。実施例１：ビフラバノイドの抽出および単離化合物の単離試験した化合物はフクオカ、日本国から得られるルス・サクセダネアの種子粒および台湾で集められたガルシニア・マルチフロラの芯材から単離した。アメントフラボン（１）⁽⁵³⁾、アガシスフラボン（２）⁽⁵⁴⁾、ロブスタフラボン（３）⁽⁵⁵⁾、ヒノキフラボン（４）⁽⁵⁵⁾、ルスフラバノン（９）⁽³⁷⁾およびサクセダネアフラバノン（１１）⁽²⁸⁾はルス・サクセダネアから単離した。ルスフラバノンヘキサアセテート（１０）およびサクセダネアフラバノンヘキサアセテート（１２）は、それぞれ化合物（９）および（１１）から直接作成した^(37,38) 。フォルケンシフラボン（５）、モレロフラボン（７）、ＧＢ−１ａ（１３）、ＧＢ−１ａグルコシド（１５）およびＧＢ−２ａ（１６）は、ガルシニア・マルチフロラから単離した（39,40）。フォルケンシフラボンヘキサメチルエーテル（６）、モレロフラボンヘキサメチルエーテル（８）およびＧＢ− １ａヘキサメチルエーテル（１４）は、それぞれ化合物（５）、（７）および（１３）から作成した^(39,40)。ロブスタフラボンテトラ硫酸カリウム塩（１７）はロブスタフラボン（３）から作成した。この実施例において、ロブスタフラボンを単離するための２種の方法を説明する。第１の方法においてはロブスタフラボンを、従来報告された方法(25)にしたがい展開溶剤としてベンゼン／ピリジン／ギ酸（２０：５：１）を用いる乾燥カラム法により単離した。ベンゼンおよび多量のピリジンの使用を排除するため改良法を開発し、ベンゼンおよびピリジンの代わりに他の溶剤を用いた。２０：５：１の比でトルエン／エタノール／ギ酸の溶剤混液を、乾燥カラム法における展開溶剤として使用した。ヒノキフラボンを乾燥カラムから完全に溶出させると共に、ロブスタフラボンをカラム中に保持させた。４：１の比におけるエタノールとピリジンとの混液を次いで使用して、ロブスタフラボンをカラムから溶出させた。ルス・サクセダネアからのビフラバノイドの抽出フクオカ、日本国から得られたルス・サクセダネアの種子（１６ｋｇ）を粗大に粉末化し、ベンゼンで脱脂した。脱脂された種子を沸騰９５％ＥｔＯＨ（１５０Ｌ）で徹底的に抽出した。ＥｔＯＨ抽出物を合して減圧濃縮した。濃縮中に際し得られた黄色色素を濾過して粗製色素Ａ（収率０．２％）および色素Ｂ（収率０．２％）を順次に得た。さらに濃縮して黄色生体色素Ｃ（約２％）を得た。色素Ａからロブスタフラボンの単離１０ｍＬのピリジンに溶解された１ｇの生体色素Ａを５ｇのシリカゲル（スタール型６０によるキーゼルゲル、メルク社）と混合し、減圧蒸発させてピリジンを除去した。乾燥して得られた黄色粉末をシリカゲルカラムの頂部に充填した（ＳｉＯ₂、１００ｇ、４×２０ｃｍ）。ベンゼン／ピリジン／ギ酸（４０：１０：２）の溶剤混液（４００ｍＬ）をカラムに通過させた。このカラムを７つのバンド（頂部から底部までバンド１〜７）にスライスした。ＥｔＯＡｃによる黄色バンド４の抽出、次いで抽出物の濃縮により黄色結晶（２００ｍｇ）、すなわちロブスタフラボンを得、これをピリジン−水から再結晶化させた（ｍ．ｐ．３５０〜３５２℃ （分解））。Ｍｇ−ＨＣｌ試験（橙赤色）、ＦｅＣｌ₃／ＥｔＯＨ試験（褐色）。分析値：Ｃ₃₀Ｈ₁₈Ｏ10・Ｈ₂Ｏに対する計算値：Ｃ 64.75 ；Ｈ 3.62 実測値：Ｃ 64.51 ；Ｈ 3.83 ロブスタフラボンを単離する改良法色素Ａ（１０ｇ）を５０ｍＬのピリジンに溶解させた。この溶液を２５ｇのシリカゲルに添加し、完全に混合した。ピリジンを回転蒸発器により減圧下で除去し、乾燥混合物を微細な粒子寸法まで磨砕した。粗多孔質シンターを備えると共にシンター上に濾過紙の円盤を設けた６００ｍＬのフリットフィルター漏斗に、２５０ｇのシリカゲルを添加した。次いで吸収された色素Ａを漏斗におけるシリカゲルの頂部に慎重に置いて展延させた。トルエン／エタノール／ギ酸（４０：１０：２）の溶剤系（２．５Ｌ）を漏斗に通過させてヒノキフラボンを除去した。溶出液を集め、濃縮して２．０１ｇの黄色固体を得、これはヒノキフラボンおよび微量のロブスタフラボンと同定された。フリット漏斗中にシリカゲルを１晩乾燥させた。吸収された色素Ａを含有する頂部層から残留シリカゲルを掻き取って、濾紙の円盤を有する粗多孔質のフリットフィルター漏斗に入れた。次いで、吸収された色素Ａを含有するシリカゲルをトルエン／エタノール／ギ酸（４０：１０：２）の混液（２．５Ｌ）により溶出させ、次いでエタノール／ピリジン（４：１）（４．５Ｌ）を使用した。最初の溶出溶液を濃縮して１．１ｇの黄色固体を得、これはロブスタフラボンとヒノキフラボンとの混合物と同定され、主成分はロブスタフラボンであった。第２溶出溶液（エタノール／ピリジン、４：１）を濃縮してロブスタフラボン（５．６５ｇ）を得た。ＴＬＣ、ＮＭＲ、ＭＳおよび元素分析はこれら知見を裏づける。ＮＭＲ（Ｈ−ＮＭＲ、¹³Ｃ−ＮＭＲ、ＣＯＳＹおよびＨＥＴＣＯＲＮＭＲ：第１表参照）。ロブスタフラボンの特性化ロブスタフラボンをピリジン／水から再結晶化させた（ｍｐ．３５０〜３５２ ℃（分解））。化合物はＭｇ−ＨＣｌ試験にて橙赤色を与えると共に、アルコール性ＦｅＣｌ₃により褐色を示した。ＩＲスペクトルは３２５０ｃｍ^-1 ^にて幅広ヒドロキシル吸収を示すと共に、１６５０ｃｍ^-1にて結合カルボニル吸収を示した。ＭｅＯＨにおけるＵＶスペクトルは347(log ε、4.38)、300(4.42)、275(4. 44)および255(4.71)nm の領域に４個の最大値を示し、ＮａＯＡｃもしくはＡｌＣｌ₃の添加に際し深色シフトを受けた。ＡｌＣｌ₃−ＭｅＯＨにおけるＵＶスペクトルはＨＣｌの添加に際し、ＡｌＣｌ₃−ＭｅＯＨでの試験と同様であり、５、７および４′位置にＯＨ基の存在を示すと共にｏ−ジヒドロキシル基が存在しないことを示した。ロブスタフラボンのＮＭＲスペクトル（６０ＭＨ₂）はδ13.53(s、1H)、13. 28(s、1H)および11.23-8.63(br、4H)に６個のＯＨ基を示し、１，４−二置換ベンゼン環における４個のプロトンがδ7.97(d、J=9 Hz、2H)および7.03(d、J=9 H z、2H)に出現し；１，３，４−三置換ベンゼン環におけて３個のプロトンがδ7. 87(d、J=9 Hz、１H)、7.94(dd、J=2 Hz、9 Hz、1H)および7.09(d、J=9 Hz、1H) に出現し；２個の芳香族プロトンが 6.23(1H)および6.52(1H)にメタ結合ダブレット(J=2 Hz)として出現し；３個の分離プロトンが66.83(ｓ)、6.80(s)および6.68(s)にそれぞれ出現した。上記の証拠は、化合物の構造がＣ３′−Ｃ６のインターフラボニル結合により結合された２個のアピゲニン単位で構成され、すなわちロブスタフラボン（アメントフラボンの異性体）で構成されることを示唆した。これはさらに、この酢酸塩およびメチルエーテルの検査によっても裏付けられた。ピリジン／Ａｃ₂Ｏによるアセチル化はロブスタフラボンヘキサアセテート（３ａ）を無色針状結晶として与えた（ｍ．ｐ．１９９〜２００℃）。乾燥アセトンにおけるＭｅ₂ＳＯ₄／Ｋ₂ＣＯ₃ によるメチル化は無色化合物、すなわちロブスタフラボンヘキサメチルエーテル（３ｂ）を与えた（ｍ．ｐ．３００〜３０５℃；Ｃ₃₆Ｈ₃₀Ｏ₁₀、Ｍ⁺ｍ／ｚ６２２）。化合物（３ｂ）に対するＥｕ（ｆｏｄ）₃の添加に基づく化学シフト（ｐｐｍ）の誘発変化はＳ−値によって示される(35)。ＭｅＯ−ＩＩ−５およびＭｅＯ−Ｉ−５のＳ値はそれぞれ１０．８５ｐｐｍ（最大）および２．１７ｐｐｍであったのに対しＨ−Ｉ−８は０．３４ｐｐｍであり、標準試料（ＴＣＬ、ＩＲ、ＮＭＲおよびＭＳ）と比較してヘキサ−ｏ−メチルロブスタフラボンとして特性化された構造（３ｂ）としてのＣＩＩ−３′−ＣＩ−６の結合の存在を示した。少量のヘキサ−ｏ−メチルロブスタフラボンの単離はロブスタフラボンを単離した時点で記録されたが、多量のロブスタフラボンの単離はまだ達成されていない。スペクトルにおける同じアルファベット記号を有する説明は逆転することもある。高解像ＣＩ質量スペクトルはＭ＋Ｈイオン、ｍ／ｚ５３９．０９６６３、Ｃ₃₀ Ｈ₁₉Ｏ₁₀を与え、これは５３９．０９７８２１５７２を必要とする。赤外スペクトルは幅広ヒドロキシル吸収を３２５０ｃｍ^-1にて示すと共に、共役カルボニル吸収を１６５０ｃｍ^-1にて示した。ＭｅＯＨにおけるＵＶスペクトルは345(log ε4.49)、300(4.42)、275(4.44)および255(4.71)nm の領域に４個の最大値を有し、ＮａＯＡｃもしくはＡｌＣｌ₃の添加に際し深色シフトを受けた。ＡｌＣｌ₃ −ＭｅＯＨにおけるＵＶスペクトルはＨＣｌの添加に際しＡｌＣｌ₃−ＭｅＯＨで得られたものと同様であり、５、７および４′位置におけるＯＨ基の存在し、ｏ−ジヒドロキシ基は存在しないことを示した(26)。ロブスタフラボンのＮＭＲ（３００ＭＨｚ）スペクトルはδ13.25(1H、s)、 13.02(1H、s)、10.83(1H、s)、10.40(1H、s)、10.4〜10.9(2H、br)に６個のＯＨ基と；δ7.98(2H、d、J=8.88 Hz、H- 2″′、 6″′)および6.96(2H、d、J=8. 88 Hz、H- 3″′、 5″′)に１，４−二置換ベンゼン環における４個のプロトンと；δ7.93(1H、dd、J=8.7 Hzおよび2.2Hz、H- 6′)、7.79(1H、d．J=2.2 Hz、H -2)および7.05（1H、d、J=8.7Hz、H- 5′)に１，３，４−三置換ベンゼン環における３個のプロトンと；δ6.84(1H、s、H-3’）、6.8（1H、ｓ、H-3’’)、6.65 (1H、s、H-8'')，6.49（1H,d、J=2.0 Hz、H-8)及び（1H、d、J=2 Hz、H-6）に５個の芳香族プロトンとを有した。実施例２：ｏ−アシルピフラバノイドを合成するための一般的手順手順１：２０％乾燥ピリジンを含有する無水ジクロルメタンにおけるビフラバノイドの溶液に、０℃または室温にて適する塩化アシルもしくは無水物を添加する。この混合物を１晩静置させ、揮発物を減圧蒸発させる。代案として、混合物を水中に注ぎ入れ、クロロホルムで抽出する。有機層を水およびブラインで洗浄し、無水硫酸ナトリウムで脱水し、次いで減圧濃縮する。残留物を調製用ＴＬＣまたはシリカゲルカラムでクロマトグラフ処理して生成物を得る(78)。手順２：アセテートの作成：ビフラバノイドを室温にてピリジン中で無水酢酸と１晩反応させる。反応混合物を氷水中に注ぎ入れる。沈殿物を濾過すると共に、冷１％塩酸および次いで水により清浄してビフラバノイドアセテートを得る(37)。ルスフラバノンヘキサアセテート：室温にて２０時間にわたるＡｃ₂Ｏ／ピリジンでのルスフラバノン（２００ｍｇ）のアセチル化によりヘキサアセテート（１１０ｍｇ）を微小針状結晶として得た（ｍ．ｐ．１３０〜１３１℃）。サクセダネアフラバノンヘキサアセテート：手順Ｎｏ．２によるサクセダネアフラバノンのアセチル化により、サクセダネアフラバノンヘキサアセテートを白色針状結晶として得た（ｍ．ｐ．２５２〜２５５℃）（ＣＨＣｌ₃−ＭｅＯＨから）実施例３：ビフラバノドエーテルを合成するための一般的手順ビフラバノイドアルキルエーテルの作成：ＤＭＦにおけるビフラバノイドとＡｇ₂Ｏ（触媒量）との混合物に、対応のハロゲン化アルキルを１０〜１２℃にて添加する。２．５〜４時間にわたり撹拌した後、反応混合物を冷蔵庫内に１晩保つ。触媒を濾過し、濾液を水およびブラインで洗浄し、次いで減圧濃縮する。残留物をシリカゲル上でのカラムクロマトグラフィーにより精製して生成物を得る(78)。ビフラバノイドメチルエーテルの作成：ビフラバノイドを無水アセトンに溶解し、炭酸カリウムとジメチル硫酸とを添加する。この溶液を４時間還流させる。沈殿物（炭酸カリウム）を濾過し、濾液を減圧濃縮する。残留物をクロロホルムに溶解し、ブラインで洗浄し、硫酸マグネシウムで脱水し、次いで減圧濃縮する。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより或いは調製用薄層クロマトグラフィーにより精製し、次いで酢酸エチル、エタノールもしくはクロロホルムで再結晶化させてビフラバノイドメチルエーテルを得る(37)。フォルケンシフラボンヘキサエチルエーテル（６）フォルケンシフラバノン（２００ｍｇ）を３０ｍＬの無水アセトンに溶解し、４ｇの炭酸カリウムと３ｍＬのジメチル硫酸とを添加した。この溶液を４時間にわたり還流させた。沈殿物（炭酸カリウム）を濾過し、濾液を減圧濃縮した。赤褐色の油状残留物を１５ｍＬのクロロホルムに溶解し、このクロロホルム溶液をブラインで２回、次いで水により洗浄した。クロロホルム層を硫酸マグネシウムで脱水し、減圧濃縮した。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、トルエンと酢酸エチルとの１：１の比における混液で溶出させた。溶出液を減圧濃縮し、残留物をメタノール／クロロホルムで再結晶化させて１３５ｍｇの白色結晶を得た（ｍ．ｐ．２５８〜２６０℃）。ＧＢ−１ａヘキサメチルエーテル（１４）ＧＢ−１ａ（２００ｍｇ）を上記の方法によりメチル化した。得られた粗メチルエーテルを調製用薄層クロマトグラフィーにより展開溶剤として酢酸エチルを用いて精製した。Ｒｆ０．３５におけるバンドを掻き取り、酢酸エチルで抽出した。酢酸エチル抽出物を減圧濃縮し、残留物をアセトンとヘキサンとの溶剤混液（１：１）から再結晶化させて白色固体（１８ｍｇ）を得た（ｍ．ｐ．１３２〜１３４℃）。実施例４：ビフラバノイドサルフェートを作成するめの一般的手順硫酸水素テトラブチルアンモニウム（ＴＢＳＨＳ）によるフラボンおよびフラバノンのジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＤＣ）−媒介エステル化は、反応温度および各試薬の量の調節によりモノ−、ジ−およびトリ−硫酸化生成物を生成させた。硫酸化は主としてフラバノドの骨格の７、４′および３の位置にて生じ、７＞４′＞３の順序で生じた(80)。ビフラバノイドをＴＢＡＨＳ（硫酸水素テトラブチルアンモニウム）およびＤＤＣ（ジシクロヘキシルカルボジイミド）によりピリジン中で調節量の各試薬および温度を用いて処理することにより、ビフラバノイドの部分硫酸エステルを作成する。反応生成物、すなわち硫酸エステルＴＢＡ−塩をゲル濾過より少量の副生物から分離する。硫酸エステルＴＢＡ−塩を、飽和メタノール性炭酸カリウムでの処理によりカリウム塩まで変換させる。得られたカリウム塩を、０〜５０％濃度勾配の水性メタノールを用いるセファデックスＧ− １０カラムでの反復クロマトグラフィーにより精製する(80)。ロブスタフラボンテトラ硫酸Ｋ−塩ピリジン（５ｍＬ）におけるロブスタフラボン（４６．１ｍｇ、０．０８６ｍＭ、１．０当量）の溶液を１，３−ジシクロヘキサカルボジイミド（ＤＣＣ）（５００ｍｇ、２．４２３ｍＭ、２８．１７当量）および硫酸水素テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡＨＳ）（９７．５ｍｇ、０．２８７ｍＭ、３．３４当量）により４℃（冷蔵庫内）で８６時間にわたり処理した。反応溶液をＭｅＯＨで希釈し、ジシクロヘキシル尿素沈殿物を濾過により除去した。上澄液をセファデックスＬＨ−２０（３ｇ、ＭｅＯＨ中）でクロマトグラフ処理し、ＭｅＯＨおよびＭｅＯＨ−アセトン（１：１）混液で溶出させた。ロブスタフラボンテトラサルフェートを含有する黄色フラクションを５ｍＬまで濃縮し、次いで１５ｍＬのＭｅＯＨにおける飽和Ｋ₂ＣＯ₃で処理した。ロブスタフラボンテトラ硫酸Ｋ−塩の沈殿物を濾過により回収し、ＭｅＯＨ（３ｍＬ×９）および水（３ｍＬ×５）で順次に洗浄した。ＭｅＯＨおよび水の洗液を別々に集めた。水の溶液を凍結乾燥して７２ｍｇのロブスタフラボン−７，４′，７″，４″′−テトラ硫酸Ｋ−塩を黄色粉末として得た。1H-NMR(DMSO，300MHz)δ6.56(1H、bs,H-6),7.19(1H,bs, H-8),6.78(1H,s,H-3),7.75(1H,dd,J=9.0,2.0Hz,H-6'),7.87(1H,d,J=9.0 Hz,H-5' ),8.31(1H,d,J=2.0Hz,H-2'),6.85(1H、s,H-8),6.75(1H,s,H-3''),7.33(2H,d,J=9. 0Hz,H-3'''、5''')、7.94(2H、d,J=9.0Hz,H-2'',,6,,,).)実施例５：ビフラバノイド酸塩を作成するための一般的手順ビフラバノイドと適する酸無水物と適する触媒（たとえば４−ジメチルアミノピリジン）との乾燥混合物を乾燥ピリジンに溶解させる。この溶液を標準法により仕上処理して、ビフラバノイド酸アダクトを生成させる。ビフラバノイド酸は、飽和メタノール性炭酸カリウムでの処理によりカリウム塩まで変換させることができる(79)。実施例６：ビフラバノイドの抗ウィルスＨＢＶ活性この実施例においては、ロブスタフラボンおよび関連ビフラバノイドをＢ型肝炎（ＨＢＶ）抗ウィルス活性および細胞毒性活性につきスクリーニングした。抗ウィルスＨＢＶ分析２．２．１５細胞の培養物におけるＨＢＶ複製の抑制を、２４−ウェル組織培養プレートに接種されて融合するまで増殖させた慢性ＨＢＶ−産生性ヒト肝臓細胞を用いて分析した。試験化合物を連続して９日間にわたり毎日添加した。培地を集めて処理の０日、３日、６日および９日後おける細胞外（ビリオン）ＨＢＶＤＮＡの分析のために貯蔵した。処理した細胞を、細胞内ＨＢＶゲノム型の分析につき処理の９日後に２４時間にわたり溶解させた。ＨＢＶＤＮＡ（細胞外および細胞内の両ＤＮＡ）の全レベルおよびＨＢＶ複製（細胞内ＤＮＡ）の相対割合を定量的に分析した。この分析は、ブロットハイブリッド化技術および［³² Ｐ］標識ＨＢＶ−特異性プローブを用いて行った。ＨＢＶＤＮＡレベルを、全てニトロセルロース膜に施された既知量のＨＢＶＤＮＡ標準（ゲルもしくはスロットブロット）と比較して測定した。ニトロセルロース膜から直接にハイブリッド化ブローブの放射能壊変を測定するＡＭＢＩＳβスキャナーを定量分析につき用いた。多重分析により発生した標準曲線を用いて、βスキャナーにより行われたＣＰＭ測定を標的ＨＢＶＤＮＡの相対レベルと相関させた。培地中に放出されたＨＢＶビリオンＤＮＡのレベルをスロットブロットハイブリッド化法により分析した。次いでＨＢＶＤＮＡレベルを０日におけるものと比較して、試験化合物の作用を判定した。既知の陽性薬物を各試験にて試験化合物と並行的に評価した。この薬物は２ ′，３′−ジデオキシシトシン（２′，３′−ｄｄＣ）とした。データを５０％有効（ウィルス抑制）濃度（ＥＣ₅₀）として現した。ウィルス収率を１ｌｏｇ 10だけ抑制するような試験薬物濃度である９０％有効濃度（ＥＣ₉₀₎をこれらデータから決定した。各試験化合物の抗ウィルス活性を選択指数（ＳＩ）として現し、これはＣＣ₅₀もしくはＣＣ₉₀（すなわち処理細胞の５０％もしくは９０％を死滅させる化合物の濃度）をＥＣ₅₀により割算した数値である。一般に１０もしくはそれ以上のＳＩは陽性の抗ウィルス活性を示すが、たとえば陽性比較につき低いＳＩのような他の因子も考慮に入れる。ＨＢＶ細胞毒性分析９６−ウェル平底組織培養プレートにて融合するまで増殖させると共に上記化合物で処理された２．２．１５細胞の培養物における試験化合物の毒性を、４種の濃度にてそれぞれ３反復の培養により３〜１０倍工程で分析した。未処理比較培養物を各プレートに維持した。各プレートにて、細胞を含有しないウェルを用いて光散乱につき補正した。毒性をニュートラルレッド染料の吸収阻止により測定し、これは処理の９日後における２４時間にわたる未処理細胞と比較した５１０ｎｍでの吸光度により測定する。ＨＶＢ核酸および蛋白質の分析培地におけるＨＢＶビリオンＤＮＡ、並びに細胞内ＨＢＶＲＩおよびＨＢＶＲＮＡレベルを定量ブロットハイブリッド化分析（それぞれドット、サウザンおよびノーザンブロット）により測定した(81,82)。核酸を前記手順により作成した。処理期間にわたる細胞１個当たり安定レベルに留まる積算ＨＢＶＤＮＡを用いて、各サウザンゲルレインに移行した細胞ＤＮＡを定量した(81,82)。ＨＢＶＲＮＡ分析についてはβ−アクチンＲＮＡのレベルを用いて、各ノーザンゲルレインに移行した細胞ＲＮＡを定量した。２．２．１５細胞の融合培養物におけるβ−アクチン特異性ＲＮＡの事前の検査は約１．０ｐｇのβ−アクチンＲＮＡ／μｇ未分画細胞ＲＮＡの定常状態レベルを示した(81)。未処理（比較）培養物に対するＥＣ₉₀値（ＨＢＶＤＮＡレベルの１０倍低下）を直線回帰により決定した(82)。比較につきＥＣ₉₀値を用いた。何故なら、この培養システムにおいては比較値の３倍内のＤＮＡレベルが一般に統計上有意でないからである (83)。ＨＢＶ蛋白質の数値は、上記したように行われる半定量的ＥＩＡにより測定した(83)。ＥＩＡ分析については試験試料を希釈し（２〜１０倍）、得られる分析値がＥＩＡ分析の直線動的範囲内となるようにした。陽性分析比較のシリーズ希釈物を用いる標準曲線をＥＩＡ分析の各群に含ませた。ＨＢＶ表面抗原（ＨＢｃＡｇ）、ｐｒｅＳ１蛋白質およびＨＢｃ抗原（ＨＢｃＡｇ）を細胞外産生物として放出させ、したがってオレゴヌクレオチドもしくはし２′，３′−ｄｄｃの最後の処理投与の２４時間後に得られた培地で分析した。ＨＢＶコア抗原（ＨＢｃＡｇ）は細胞内ウィルス蛋白であり、トリトン−Ｘ−１００溶解により生じた細胞抽出物で分析した(83)。ＨＢＶＲＮＡの培養物を６−ウェルプレートに維持し、ＨＢＶビリオンＤＮＡ分析のための培養物を９６−ウェルもしくは２４−ウェルのいずれかのプレートに維持し、他の全てのＨＢＶパラメータのための培養物を２４−ウェルプレートに維持した。これら試験にて用いた抗ウィルス剤の濃度は、細胞内ＨＢＶＤＮＡ複製中間体（ＨＢＶＲＩ）に対し個々の作用物質のＥＣ₅₀値に近似する。培養物を、示した作用物質で９日間にわたり標準手順を用いて処理した。示した数値は処理期間の終了時（「９日目」）における示したＨＢＶマーカーのレベルであり、処理期間の開始時点（「０日目」）における比較培養物での平均レベルの比率（±標準偏差（Ｓ．Ｄ．））として現す。表現の方法は、処理期間の過程にわたる未処理（比較）培養物におけるＨＢＶマーカーの変動分析を可能にする。ＨＢＶ核酸レベルを標準ブロットハイブリッド化（ドット、サウザンもしくはノーザン）により測定した。ＨＢＶ蛋白質レベルは、標準的な半定量ＥＩＡ法により測定した。ＨＢＶＲＮＡの培養物を６−ウェル培養プレートに維持した。２種類の主たるＨＢＶＲＮＡ転写物のそれぞれのレベルを別途に示す。２．１ｋｂ転写物はＨＢａＡｇをコードすると思われる。他の全てのＨＢＶマーカーのための培養物は２４−ウェル培養プレートに維持した。各処理につき、４種の別々の培養物の全部を０日目および９日目の両者にて各ＨＢＶマーカーの分析につき用いた。結果第１表および第３表は、ロブスタフラボンが比較薬物２′，３′−ｄｄＣと比較してＢ型肝炎ウィルスに対し極めて効果的な抗−ＨＢＶ剤であるという証拠を示す。これら結果から、ロブスタフラボンは０．２５μＭの有効平均濃度（ＥＣ₅₀ ）および１５３の平均選択指数（ＣＣ₅₀／ＥＣ₉₀）にて印象的なインビトロ活性を示し、これは１．４μＭの有効平均ＥＣ₅₀および２′，３′−ｄｄＣにつき３１の平均ＳＩと対比的であった。さらに、ＨＢＶ複製中間体（ＲＩ）（細胞内ＤＮＡ）の相対割合の測定も、比較薬物２′，３′−ｄｄＣと比ベロブスタフラボンの有効性を示す。ロブスタフラボンは０．６μＭの有効ＥＣ₅₀と８０のＳＩとを示し、これは２′，３′−ｄｄＣにつき２．４μＭのＥＣおよび２４のＳＩと対比的であった。フォルケンシフラボンヘキシメチルエーテル（６）、ルスフラバノンアセテート（１０）およびサクセダネアフラバノンヘキサアセテート（１２）は中庸の抗−ＨＢＶ活性を示したのに対し、アメントフラボン（１）、アガシスフラボン、ヒノキフラボン（４）、フォルケンシフラボン（５）、ルスフラバノン（９）およびサクセダネアフラバノンは殆どまたは全く抗−ＨＢＶ活性を示さなかった。要約して、ＨＢＶＤＮＡ（細胞外および細胞内の両ＤＮＡ）の全レベル、並びにＨＢＶ複製中間体（ＲＩ）（細胞内ＤＮＡ）の相対割合の測定は、ＨＢＶに対するロブスタフラボンの有効性を明かに示す。註＊：陽性薬物比較；＊１：５０％有効投与量；＊２：９０％有効投与量（ＥＣ90）；＊３：選択指数：ＣＣ50／ＥＣ50。実施例７：ビフラバノイドの抗−呼吸ウィルス活性この実施例においては、ロブスタフラボンおよび関連ビフラバノイドを呼吸（インフルエンザＡおよびＢ、ＲＳＶ、パラインフルエンザ３、アデノウィルス５、および麻疹）抗ウィルスおよび細胞毒性の活性につきスクリーニングした。抗−呼吸ウィルス分析呼吸ウィルスに対する抗ウィルス活性に関する主たるスクリーニングで使用したウィルスは次の通りである：（１）インフルエンザＡおよびＢ−ウィルス株：Ａ／テキサス／３６／９１（Ｈ１Ｎ１）（供給源：センター・フォア・ディジーズ・コントロール（ＣＤＣ）；Ａ／ベイジング／２／９２（Ｈ３Ｎ２）（供給源：ＣＤＣ）；Ｂ／パナマ／４５／９０（供給源：ＣＤＣ）；Ａ／ＮＷＳ／３３（Ｈ１Ｎ１）（供給源：アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション［ＡＴＣＣ］）。（Ａ／ＮＷＳ／３３だけはトリプシンの存在下で試験する）。細胞ライン：マジン・ダルビーイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞。（２）呼吸合胞ウィルス− ウィルス株：ユタ８９（供給源：ユタ州ダイグゴノスティック・ラボラトリー、細胞ライン：アフリカミドリザル腎臓（ＭＡ−１０４）細胞。（３）パラインフルエンザ型３ウィルス−ウィルス株：Ｃ２４３（供給源：ＡＴＣＣ）；細胞ライン：アフリカミドリザル腎臓（ＭＡ−１０４）細胞。（４）麻疹ウィルス−ウィルス株：ＣＣ（供給源：ペンシルバニア州立大学）；細胞ライン：アフリカミドリザル腎臓（ＢＳＣ−１）細胞。（５）アデノウィルス型５−ウィルス株；アデノイド７５（供給源；ＡＴＣＣ）；細胞ライン：ヒト肺癌（Ａ５４９）細胞。試験化合物を連続的な活性および細胞毒性につき分析した。３種の方法を抗ウィルス活性の分析につき用いた：（１）ウィルス細胞病理作用（ＣＰＥ）の抑制；（２）ニュートラルレッド（ＮＲ）染料吸収の増加、および（３）ウィルス収率の低下。細胞毒性を確認する方法は肉眼観察、ニュートラルレッド吸収および生存細胞計数とした(32)。ウィルス細胞変性作用（ＣＰＥ）の抑制ＣＰＥの試験を９６−ウェル平底マイクロプレートで行い、全ての新規な試験化合物の初期抗ウィルス評価につき使用した。このＣＰＥ抑制試験においては各試験化合物の７種の半分ｌｏｇ₁₀希釈物を細胞単層を含有する４個のカップに添加した。次いで５分間以内にウィルスを添加し、プレートを密封し、３７℃で培養し、未処理の感染比較が３〜４＋ＣＰＥを発生した時点（約７２時間）でＣＰＥを顕微鏡で読んだ。既知の陽性薬物を各試験にて試験薬物と並行評価した。この薬物はインフルエンザ、麻疹、呼吸合胞ウィルスおよびパラインフルエンザウィルスにつきリバビリンとし、アデノウィルスにつき（Ｓ）−１−（３−ヒドロキシ−２−ホスホニルメトキシプロピル）アデニン（ＨＰＭＰＡ）とした。データを５０％有効（ウィルス抑制）濃度（ＥＣ₅₀）として現した。ニュートラルレッド（ＮＲ）染料吸収の増加ＮＲ染料吸収の増加試験を行って初期試験で見られたＣＰＥ抑制を実証すると共に、ＣＰＥを測定した後に同じ９６−ウェルのマイクロプレートを用いる。ニュートラルレッド染料を媒体に添加し、ウィルスにより損傷されなかった細胞はより多量の染料を吸収し、これをコンピュータ化マイクロプレート自動読取装置で読取った。ＥＣ₅₀値をこの染料吸収から決定した。ウィルス収率の低下ＣＰＥ抑制およびＮＲ吸収により活性であると考えられた化合物をＣＰＥ抑制を用いて再試験すると共に、同じプレートを用いてウィルス収率の低下に対する作用を凍結および解凍された各カップからの溶出物をウィルスタイターにつき感受性細胞の単層への一連希釈により分析して決定した。これら細胞におけるＣＰＥの発現は感染性ウィルスの存在を示唆した。初期試験におけると同様に、既知の活性薬物（リバビリン）を陽性比較として並行試験した。ウィルス収率を１ｌｏｇ₁₀だけ抑制するような試験薬物濃度である９０％有効濃度（ＥＣ₉₀）をこれらデータから決定した。細胞毒性分析これら分析は肉眼観察、ニュートラルレッド染料吸収および生存細胞計数で構成する。肉眼観察：ＣＰＥ抑制試験においては、試験化合物の各濃度で処理された未感染細胞の２種のウェルを、感染された処理ウェルと並行して設けた。ＣＰＥを顕微鏡観察すると同時に、毒性比較細胞を同じプレートで行われる正常な比較細胞と対比して細胞外観における変化につき顕微鏡検査した。これら変化には観察された細胞毒性の程度（たとえば増大、粒状化、ラグ縁部を有する細胞、濁り外観、丸み、ウェル表面からの剥離または他の変化）に対応する名称を付与した。これら変化にはＴ（１００％毒性）、Ｐｖｈ（部分毒性−極めて重度８０％）、Ｐｈ（部分毒性−重度６０％）、Ｐ（部分毒性−４０％）、Ｐｓｉ（部分毒性−僅か２０％）または０（毒性なし、０％）の記号を、観察された細胞毒性の程度に応じて付与した。５０％細胞抑制（細胞毒性）濃度（ＩＣ₅₀）をデータの回帰分析により決定した。ニュートラルレッド染料吸収：上記抗ウィルス試験のニュートラルレッド染料吸収面においては、２個の毒性比較ウェルにニュートラルレッド染料を加え、色強度の程度を分光光度法により測定した。次いでニュートラルレッドＩＣ₅₀を決定した。生存細胞計数：初期ＣＰＥおよびＮＲ試験にて顕著な抗ウィルス活性を有すると考えられた化合物を細胞増殖に対するその作用につき再試験した。この試験においては、１２ −ウェル組織培養プレートに細胞（ウェルにて約２０％融合となるのに充分に量）を接種すると共に、試験薬物の種々異なる濃度に露呈させて細胞を急速に分裂させた。次いでプレートをＣＯ₂培養装置にて３７℃で７２時間にわたり培養し、この時点で媒体−薬物溶液を取り出し、細胞を洗浄した。トリプシンを添加して細胞を除去し、次いでこれをクールター（coulter）細胞カウンタにより計数した。次いでＩＣ₅₀を、各薬物希釈における３回の別々のカンウト数の平均を用いて決定した。各試験化合物の抗ウィルス活性を選択指数（ＳＩ）として現し、これはＩＣ₅₀ もしくはＩＣ₉₀をＥＣ₅₀で割算した数値である。一般に１０もしくはそれ以上のＳＩは陽性の抗ウィルス活性を示すが、たとえば陽性比較に関する低いＳＩのような他の因子も考慮した。抗インフルエンザＡおよび抗インフルエンザＢ活性化合物１〜６および９〜１２をインフルエンザＡウィルス（株Ｈ１Ｎ１およびＨ３Ｎ２）並びにインフルエンザＢウィルスに対する抑制活性につきスクリーニングした。これら化合物につき、細胞変性作用の抑制（ＣＰＥ）およびニュートラルレッド吸収の両試験方法を検討した。それらの結果を第４〜６表に示す。第４〜６表に示した結果につき、選択指数（ＳＩ）はＩＣ₅₀（５０％細胞抑制（細胞毒性）濃度）としてＥＣ₅₀（５０％有効濃度）と比べて計算した。インフルエンザＡ第４表および第５表は、ロブスタフラボン（３）が比較薬物リバビリンと対比して２種のインフルエンザＡ株に対し顕著な抗ウィルス活性を有したというデータを示す。ロブスタフラボン（３）の有効濃度（ＥＣ₅₀）は両インフルエンザＡＨ１Ｎ１（第４表）およびＨ３Ｎ２（第５表）の両株につき１．９μｇ／ｍＬであり、これは比較薬物リバビリンにつき１．９および４．１μｇ／ｍＬと対比される。ロブスタフラボンのＩＣ₅₀値は、ＣＰＥ分析にてＨ１Ｎ１およびＨ３Ｎ２につきそれぞれ１８および３２μｇ／ｍＬであった。しかしながら、リバビリンの選択指数（ＳＩ）はインフルエンザ株Ｈ１Ｎ１およびＨ３Ｎ２に対し、それぞれ２９６および１３７であったのに対しロブスタフラボン（３）については９．５および１７であった。ロブスタフラボン（３）の有効ニュートラルレッド濃度（ＥＣ50）はインフルエンザＡ株Ｈ１Ｎ１およびＨ３Ｎ２につきそれぞれ２．０および１．８μｇ／ｍＬであり、ＩＣ₅₀値は〜３２および〜１００μｇ／ｍＬであった。これは、これら株につきそれぞれ１．４および５．７μｇ／ｍＬの有効ニュートラルレッド濃度を有するリバビリンと比較して好適であった。リバビリンに関するニュートラルレッド吸収のＳＩ値はインフルエンザＡ株Ｈ１Ｎ１およびＨ３Ｎ２に対しそれぞれ１３２および７０であったのに対し、ロブスタフラボン（３）では１６および５６であった。アメントフラボン（１）もインフルエンザＡの両株に対し顕著な抗ウィルス活性を示した。アメントフラボン（１）のＥＣ₅₀値はＣＰＥ抑制試験にてそれぞれ３．１および４．３μｇ／ｍＬであった。ＩＣ₅₀値は２２および＞１００μｇ／ｍＬであり、したがってインフルエンザＡ株Ｈ１Ｎ１およびＨ３Ｎ２につき７．１および＞２３のＳＩ値を有した。分析した他のビフラバノイドは不活性または毒性のいずれかであったが、ただしニュートラルレッド分析につき＞１８のＳＩ値を示したアガシスフラボンを例外とし、ＣＰＥ分析について僅か１であった。ルスフラボン（９）からルスフラボンヘキサアセテート（１０）へのアセチル化は、両分析にて両インフルエンザＡ株に対し活性および毒性の両者を僅かに増大させた。サクセダネアフラバノン（１１）のアセチル化は活性もしくは毒性を顕著には変化させず、フォルケンシフラボン（５）からフォルケンシフラボンヘキサメチルエーテル（６）へのメチル化は活性および毒性の両者における低下をＣＰＥ抑制分析およびニュートラルレッド分析の両者にて示した。第４表および第５表に示したように、これら３種の化合物に対する改変は活性および毒性における変化をもたらしたが、いずれもＳＩ値に顕著な変化を生ぜしめなかった。註＊：陽性比較薬物；＊１：５０％有効投与量；＊２：５０％細胞抑制（細胞毒性）濃度；＊３：選択指数：ＩＣ₅₀／ＥＣ₅₀ 註＊：陽性比較薬物；＊１：５０％有効投与量；＊２：５０％細胞抑制（細胞毒性）濃度；＊３：選択指数：ＩＣ₅₀／ＥＣ₅₀ インフルエンザＢ第６表は、ロブスタフラボンが、比較薬物リバビリンと対比してインフルエンザＢに対して顕著な抗ウィルス活性を有したことを示す。ロブスタフラボンの有効濃度（ＥＣ₅₀）は、リバビリンにつき１．５と比較して印象的に０．２３μｇ／ｍＬであった。リバビリンの選択指数（ＳＩ）はインフルエンザＢに対し＞６６７であったのに対し、ロブスタフラボンについては＜４３５であった。ロブスタフラボンの有効ニュートラルレッド濃度（ＥＣ₅₀）は０．２２μｇ／ｍＬであり、これは比較薬物リバビリンの０．４８μｇ／ｍＬと対比される。リバビリンに関するニュートラルレッド吸収のＳＩは２０８であり、これはロブスタフラボンの４５４と対比される。註＊：陽性比較薬物；＊１：５０％有効投与量；＊２：５０％細胞抑制（細胞毒性）濃度；＊３：選択指数：ＩＣ₅₀／ＥＣ₅₀ アメントフラボン（１）（Ｉ−３′〜ＩＩ−８ビアピゲニン）、フォルケンシフラボン（５）（ナリンゲニンＩ−３〜ＩＩ−８アピゲニン）、フォルケンシフラボンヘキサメチルエーテルおよびサクセダネアフラバノン（１１）（Ｉ−６〜ＩＩ −６ビナリンゲニン）もインフルエンザＢに対し好適な抗ウィルス活性を示すと共に、ＣＰＥ分析にてそれぞれ１７８、３４、３８および１５のＳＩ値を有した。アガシスフラボン（２）（Ｉ−６〜ＩＩ−８ビアピゲニン）およびルスフラバノン（９）（Ｉ−６〜ＩＩ−８ビナリンゲニン）は、インフルエンザＢウィルスに対し活性を示すと共にＣＰＥ分析につき５．６および９．３のＳＩ値を有した。しかしながらニュートラルレッド吸収試験において、これらビフラバノイドは顕著な活性を示さなかった。他の分析したビフラバノイドはいずれも顕著な活性に寄与しなかった。フォルケンシフラボン（５）からフォルケンシフバノンヘキサメチルエーテル（６）へのメチル化はより低い活性と低下した細胞毒性とをもたらした。これらビフラバノイドは全てパラインフルエンザ型３、呼吸合胞ウィルス、麻疹ウィルスおよびアデノウィルス型５ウィルスに対し第７表および第８表に示したように比較的不活性であったが、ただしアメントフラボン（１）およびルスフラバノン（９）を例外とし、これらは呼吸合胞ウィルスおよび麻疹ウィルスに対しそれぞれ僅かな活性を示した。実施例８：ビフラバノイドの抗−ＨＩＶウィルス活性本発明者等はルス・サクセダネアから分離されたビフラバノイド、すなわちアメントフラボン（１）、アガシスフラボン（２）、ロブスタフラボン（３）、ヒノキフラボン（４）、ルスフラバノン（９）、サクセダネアフラバノン（１１）、並びにガルシニア・マルチフロラから分離されたビフラバノイド、すなわちフォルケンシフラボン（５）、モレロフラボン（７）、ＧＢ−１ａ（１３）、ＧＢ −１ａ７″−Ｏ−β−グルコシド（１５）、ＧＢ−２ａ（１６）、並びにその硫酸カリウム塩、メチルエーテルおよびアセチル誘導体、すなわちフォルケンシフラボンヘキサアセテート（６）、モレロフラボンヘプタメチルエーテル（８）、ルスフラバノンヘキサアセテート（１０）、サクセダネアフラバノンヘキサアセテート（１２）、ＧＢ−１ａヘキサメチルエーテル（１４）およびロブスタフラボンテトラ硫酸カリウム塩（１７）の抗−ＨＩＶ−１ＲＴ活性を検討した。抗−ＨＩＶ−１ＲＴ分析ＨＩＶ−１ＲＴは、遺伝子工学処理されたプラスミドを用いて大腸菌の発現系で得られた６６−ｋＤａ組換酵素である。この酵素をほぼ均一となるまで精製した。合成ＤＮＡセグメントを用いて開始コドンおよび停止コドンをＨＩＶ−１ＲＴコード化配列に導入し、この配列は大腸菌における多量のＨＩＶ−１ＲＴの発現を可能にする。酵素はＲＴ分析にて活性であることが示され、ウィルス酵素とは区別しえなかった数種の既知の抗レトロウィルス剤（たとえばＡＺＴおよびスラミン）により抑制特性を示した。精製された組換酵素は、薬物スクリーニング分析にてウィルス酵素に代替しうるのに充分ウィルス酵素と類似した。全ての実験で用いた組換ＨＩＶ−１ＲＴ調製物は０．１１ｍｇ／ｍＬの蛋白質濃度と３７℃にて蛋白質１ｍｇ当たり１０分間につき組込まれる２３８ｎｍｏｌのＴＴＰの活性を有した。実験を行うに先立ち、酵素を分析で使用したと同様な緩衝液で１０倍希釈した。この分析混合物（最終容積１００μＬ）は次のものを含有した：５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ₂ 、０．５ｍＭのエチレングリコール−ビス−（β−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ′−四酢酸（ＥＧＴＡ）、５ｍＭのジチオスレイトール、０．３ｍＭのグルタチオン、２．５μｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン、４１μＭのポリＡ［Σ２６０（ｍＭ）＝７．８］、９．５μＭのオリゴ（ｄＴ）_12-18［Σ２６５（μＭ）＝５．６］、０．０５％のトリトンＸ−１００、２０μＭのＴＴＰおよび０．５μＣｉの［³Ｈ］ＴＴＰ。反応を１０μＬのＨＩＶ−１ＲＴの添加により開始させ、混合物を３７℃にて１時間培養した。反応を２５μＬの０．１ＭＥＧＴＡの添加に続く氷冷によって停止させた。次いで各反応混合物の１部（１００μＬ）を円形２．５ｃｍＤＥ−８１（ワットマン）フィルタ上に均一にスポットし、室温で１５分間保ち、次いで５％Ｎａ₂ＨＰＯ₄・７Ｈ₂Ｏ水溶液で４回洗浄した。これに続いて、さらに２回蒸留されたＨ₂Ｏで２回洗浄した。最後にフィルタを充分乾燥させ、非水性シンチレーション液にてシンチレーション計数にかけた。酵素抑制を試験するには、ＤＭＳＯ（１０μＬ）における試料の５種のシリーズ（ｓｅｒｉａｌ）希釈物を酵素（１０μＬ）の添加に先立ち反応混合物に添加した。使用した最終ＤＭＳＯ濃度は１０％とした。試験した純天然生産物および植物抽出物の最高濃度は２００μｇ／ｍＬとした。化合物もしくは抽出物なしに比較分析を行ったが、均等容積のＤＭＳＯを添加した。ファルガロニン塩化物を陽性比較物質として使用した。この化合物はファガラ・キサントキシロイデスＬａｍ（Fagara xanthoxyloidec Lam）から分離した。使用した他の陽性比較物質はスラミン（ＩＣ₅₀ １８μｇ／ｍＬ）およびダウノマイシン（ＩＣ₅₀ １２５μｇ／ｍＬ）とした。分析手順および全成分の濃度は上記と同一にした(47)。一次ヒトリンパ球における抗−ＨＩＶ−１ＲＴ分析細胞培養健康なＨＩＶ−１血清陰性のドナーおよびＢ型肝炎ウィルス血清陰性のドナーからのヒトＰＢＭ細胞をフィコール・ハイパック（Ficoll-Hypague）不連続濃度勾配遠心分離（１，０００×ｇ、３０分間）によって分離し、りん酸塩緩衝塩水（ｐＨ７．２、ＰＢＳ）で２回洗浄し、次いで３００×ｇでの１０分間にわたる遠心分離によりペレット化させた。感染の前に細胞を６μｇ／ｍＬの濃度におけるフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）によりＲＰＭＩ１６４０培地にて２〜３日間にわたり刺激し、１５％熱失活胎児ウシ血清と１．５ｍＭのＬ−グルタミンとペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）とストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）と４ｍＭの重炭酸ナトリウム緩衝剤とを補充した。ウィルスＨＩＶ−１（株ＬＡＶ−１）をＰ．フェオリノ博士（エモリー大学、アトランタ、ＧＡ）から入手した。このウィルスをＲＰＭＩ１６４０培地を用いてヒトＰＢＭ細胞で増殖させ、これにはＰＨＡもしくはフンギゾンを用いずに２６単位／ｍＬの組換インターロイキン−２（セタス・コーポレーション、エメリービル、ＣＡ）および７μｇ／ｍＬのＤＥＡＥ−デキストラン（ファルマシア社、ウプサラ、スエーデン国）を補充して上記したように行った（58）。ウィルスを細胞フリー培養上澄液から得ると共に、滴定して使用するまで−７０℃で貯槽した。ヒトＰＢＭ細胞におけるウィルス複製の抑制未感染ＰＨＡ−刺激ヒトＰＢＭ細胞に、適当なウィルスの希釈物をバルクで感染させた。接種物の平均逆転写酵素（ＲＴ）活性は約６０，０００ｄｐｍＲＴ活性／１０６細胞／１０ｍＬであった。これは、ＰＢＭ細胞における制限希釈法により約０．０１の感染多重性を示す。１時間の後、細胞を２５ｃｍ²フラスコ内に均一分配させて、約２×１０⁶細胞／ｍＬをそれぞれ含有する５ｍＬの懸濁物を得た。５ｍＬのＲＰＭＩ１６４０培地（上記のように補充）における最終濃度の２倍の試料を培養物に添加した。注射の後に培養物を加湿された５％ＣＯ2−９５％空気の培養装置に３７℃で６日間維持し、この時点で培養物を全て上澄液ＲＴ活性の測定につき試料採取した。事前の試験は、最大ＲＴレベルがこの時点で得られたことを示した。ＲＴ活性分析各培養物からの上澄液の１部（１ｍＬ）から３００×ｇにて１０分間にわたり細胞を除去した。ウィルス粒子を１２，０００ｒｐｍにて２時間にわたりジュワン冷凍微小遠心分離（ＭＲ１８２２型）によりペレット化させ、１００μＬのウィルス破壊用緩衝液（５０ｍＭ、トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、８００ｍＭのＮａＣｌ、２０％のグリセリン、０．５ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオライドおよび０．５％のトリトンＸ−１００）に懸濁させた。ＲＴ分析をスピラにより記載されたように９６−ウェルのマイクロタイタープレートで行った(69)。５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）と９ｍＭのＭｇＣｌ₂と５ｍＭのジチオスレイトールと４．７μｇ／ｍＬの（ｒＡ）ｎ（ｄＴ）１２−１８と１４０μＭのｄＡＰＴと０．２２μＭの［³Ｈ］ＴＴＰ（１７，３００ｃｐｍ／ｐモルに等しい比活性７８．０Ｃｉ／ミリモル；ＮＥＮリサーチ・プロダクツ社、ボストン、ＭＡ）とを含有する反応混合物を各ウェルに添加した。試料（２０μＬ）を反応混合物に添加し、次いでこれを３７℃にて２時間培養した。反応を、０．４５ｍＭのピロリン酸ナトリウムを含有する１００μＬの１０％トリクロル酢酸（ＴＣＡ）の添加により停止させた。沈澱した酸不溶性の核酸を、スカトロン半自動式ハーベスタ（セッティング９）によりガライフィルタに集めた。フィルタを５％ＴＣＡおよび７０％エタノールで洗浄し、乾燥させ、次いでシンチレーション小瓶に入れた。シンチレーション液（エコライト、ＩＣＮ社、アービン、ＣＡ）（４ｍＬ）を添加すると共に、各試料における放射能の量をベックマン液体シンチレーション分析装置（ＬＳ３８０１型）により測定した。その結果をｄｐｍ／初期清澄上澄液ｍＬとして示した。上記ＰＢＭ細胞における抗−ＨＩＶ分析の手順については公開されている(67,69)。ＰＢＭ細胞における細胞毒性試験各化合物を未感染ＰＨＡ−刺激ヒトＰＢＭ細胞にてその潜在的毒性作用につき評価した。細胞を薬物と共に或いは薬物なしに２４時間培養し、この時点で放射能標識されたチミジンを添加した。分析は上記と同様に行った(35)。或いは、細胞を従来記載されたヘマシトメータおよび／またはクールター・カウンタを用いて６日目に計数した(68)。メジアン効果法（Median-Effect Method）ＥＣ₅₀およびＩＣ₅₀値を、メジアン効果式(42)を用いるデータの分析により得た。これら数値を、市販プログラム(43)を用い投与量−効果データのコンピュータ発生メジアン効果プロットから得た。第９表に示した結果は、ヒノキフラボン（４）とロブスタフラボン（３）との両者がそれぞれ３５．２μｇ／ｍＬおよび３３．７μｇ／ｍＬのＩＣ₅₀（５０％抑制投与量）にてＨＩＶ−１ＲＴに対する同様な活性を示したことを示す。水溶性型のロブスタフラボン、ロブスタフラボンテトラ硫酸Ｋ−塩（１７）は２００μｇ／ｍＬの濃度にて９５．５％抑制を、１４４．４μｇ／ｍＬのＩＣ₅₀値で示した。アメントフラボン（１）、アガシスフラボン（２）、モレロフラボン（７）、ＧＢ−１ａ（１３）およびＧＢ−２ａ（１６）はＨＩＶ−１ＲＴに対し中庸の活性を、それぞれ６４．０μｇ／ｍＬ、５３．８μｇ／ｍＬ、６４．７μｇ／ｍＬ、１２７．８μｇ／ｍＬおよび９４．６ μｇ／ｍＬのＩＣ50値を有した。他のビフラバノイドはＨＩＶ−１ＲＴに対し僅かに活性または不活性のいずれかであった。両試験の結果を第９表に示す。ＨＩＶ−１ＲＴ酵素（ｐ６６／ｐ５１ヘテロダイマー）を用いる抑制活性試験の結果は、ビフラボン、すなわちＣ−ＣもしくはＣ−Ｏ−Ｃ結合のいずれかで結合した２個のアピゲニン単位が顕著な活性を示したことを示す。ロブスタフラボン（３）（Ｉ−６〜ＩＩ−３′結合により結合した２個のアピゲニン）およびヒノキフラボン（４）（Ｉ−６−Ｏ〜ＩＩ−４′結合）は同様な活性を示すと共に、それぞれ３５．２μｇ／ｍＬおよび３３．７μｇ／ｍＬの投与量にて５０％抑制（ＩＣ₅₀）を示した。アメントフラボン（１）（Ｉ−８〜ＩＩ−３′結合）およびアガシスフラボン（２）（Ｉ−６〜ＩＩ−８結合）のＩＣ₅₀値はそれぞれ６４．０μｇ／ｍＬおよび５３．８μｇ／ｍＬであった。Ｉ−３〜ＩＩ−８結合を介するフラバノン−フラボン単位で構成されたビフラバノイドは、中庸〜弱い活性を有し、すなわちモレロフラボン（７）（ナリンゲニン（narngenin）Ｉ−３〜ＩＩ−８ケルセチン（quercetin））は中庸の活性を、６４．７μｇ／ｍＬのＩＣ₅₀値にて示したのに対し、フォルケンシフラボン（５）（ナリンゲニンＩ−３〜ＩＩ〜８アピゲニン（apigenin））は弱い活性であった。Ｉ−３〜ＩＩ−８結合を介する２個のナリンゲニン単位またはナリンゲニン−エリオジクトールで構成されたビフラバノンは中庸の活性を示し、たとえばＧＢ−１ａ（１３）（ＩＣ₅₀ １２７．８μｇ／ｍＬ）およびＧＢ−２ａ（１６）（ＩＣ₅₀ ９４．６μｇ／ｍＬ）であった。Ｉ−６〜ＩＩ−８もしくはＩ−６〜ＩＩ−６結合を介し結合した２個のナリンゲニン単位で構成された、たとえばルスフラバノン（９）およびサクセダネアフラバノン（１１）のようなビフラバノンは完全に不活性であった。他の構造上の特徴は、本出願の研究において活性と関連する。ビフラバノイドのヒドロキシル基のメチル化は活性の低下をもたらした。たとえばモレロフラボンヘプタメチルエーテル（８）、フォルケンシフラボンヘキサメチルエーテル（６）およびＧＢ−１ａヘキサメチルエーテル（１４）は不活性であり、全てアルキル化前に中庸の活性を示した。ＧＢ−１ａ−７″−Ｏ−グルコシド（１５）が活性を示さなかったという事実は、７ ″−ヒドロキシル基が抗−ＨＩＶ−１ＲＴ活性につき特に重要であることを示した。ＨＩＶ−１ＲＴ酵素分析にて活性であると判定された６種のビフラバノイドを、ＨＩＶ−１（株ＬＡＶ）で感染したヒトＰＢＭ細胞にて試験した。これらの結果を第９表に示す。ロブスタフラボン（３）はＨＩＶ−１ＲＴ酵素分析にて顕著な抑制活性を示したが、ＨＩＶ−１で感染したＰＭＢ細胞につき分析にて不活性であると判明したことが観察された。しかしながら、全ての細胞分析にてモレロフラボン（７）は５．７（８．０）μｇ／ｍＬのＥＣ₅₀値（５０％有効投与量）にて強力な抑制活性を示した。モレロフラボンのみが抗−ＨＩＶ−１ＲＴ分析にて中庸の活性を有した（ＩＣ₅₀６４．７μｇ／ｍＬ；１１６．３μＭ）。これは、これらビフラバノイドの活性が種々異なる細胞メカニズムに依存しうることを示唆する。他の活性化合物はヒノキフラボン（４）およびＧＢ−１ａ（１３）であって、ヒトＰＢＭ細胞にてウィルス複製を抑制する良好な活性を示したが、未感染ＰＨＡ−刺激ヒトＰＢＭ細胞に対し高い毒性をも示した。ＰＢＭ細胞にて分析した他の化合物（アメントフラボン（１）およびアガシスフラボン（２））は抗ウィルス能力を持たないか或いは貧弱な選択性を示すと思われた。これらの結果から、Ｉ−３〜ＩＩ−８結合を介しフラバノン（ナリンゲニン）およびフラボン（ルテオリン）で構成されるビフラバノイドは最も有望な抗−ＨＩＶ−１ＲＴ活性を示すと結論された。従来、或る種のモノフラボノイドは抗−ＨＩＶ活性を示すと報告されている。バイカレイン（５，６，７−トリヒドロキシフラボン）、チリロシド（カエムプフェロール３−β−Ｄ（６″−ｐ−クマロイル）グルコシド）、ケルセチン（３，３′，４′，５，７−ペンタヒドロキシフラボン）、カエムプフェロール（３，４′，５，７−テトラヒドロキシフラボン）およびケルセタゲチン（３，３ ′，４′，５，７−ヘキサヒドロキシフラボン）はＨＩＶ−１逆転写酵素に対し抑制活性を示したのに対し、ルテオリン（３′，４′，５，７−テトラヒドロキシフラボン）およびアピゲニン（４′，５，７−トリヒドロキシフラボン）は中庸〜僅少の抑制を示すと共にナリンゲニン（４′，５，７−トリヒドロキシフラバノン）は完全に不活性であった(63,64,70)。このことは、フラバノイドピロン環（たとえばフラボン）の位置２と３との間の不飽和二重結合、並びに５、６および７位置（ビカレイン）または３、３′および４′位置（ケルセチン）に導入された３ヒドロキシル基の両者の存在はＲＴ活性の抑制につき前提条件であることを示した。本出願人の研究において、アピゲニンは中庸な活性を示すと共にナニンゲニンは僅かな抑制を示した。２個のアピゲニン単位で構成されるビフラバノイド（アメントフラボン（１）、アガシスフラボン（２）、ロブスタフラボン（３）およびヒノキフラボン（４））は顕著な活性を示した。Ｉ−３〜ＩＩ−８結合を介し結合したフラバノンおよびフラボン単位で構成されるビフラバノイド（モレロフラボン（７）およびビフラバノンＧＢ−１ａ（１３）およびＧＢ−２ａ（１６））は、中庸の活性を有し、２個のナクンゲニン単位の環Ａを介し結合されたビフラバノン（ルスフラバノン（９）およびサクセダネアフラバノン（１１））は不活性であった。この構造−活性の比較も、ビフラバノイドにおけるヒドロキシル基および少なくとも１個のフラバノン単位が活性につき必要とされることを示す。Ｉ−３〜１１−８結合も、ビフラバノンが活性を示すのに必要である。さらに結論は、従来活性であった化合物がヒドロキシル基をメチル化すれば不活性になる点である。実施例９：ビフラバノイドの抗−ヘルペスウィルス活性抗−ヘルペスウィルス分析：ヘルペスウィルスに対する抗ウィルス活性を一次スクリーニングすべく使用したウィルスは次のもので構成した：ヘルペスウィルス１（ＨＳＶ−１Ｅ−３７７株）、ヘルペスウィルス２（ＨＳＶ−２ＭＳ株）、サイトメガロウィルス（ＨＣＭＶＡＤ１６９株）、水痘ウィルス（ＶＺＶエレン株）およびエプスタイン・バールウィルス（ＥＢＶ）、Ｐ３ＨＲ−１によるラジもしくはダウジ細胞の過剰感染。ＨＳＶ、ＨＣＭＶおよびＶＺＶに関する細胞変性効果（ＣＰＥ）の抑制の分析は次のように行った：低継代ヒト包皮繊維芽細胞を９６ −ウェル組織細胞プレートに使用の２４時間前に、１０％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）が補充された０．１Ｌの最小必須培地（ＭＥＭ）における２．５×１０⁴細胞／ｍＬの細胞濃度にて接種した。次いで細胞を３７℃にてＣＯ₂培養装置で２４時間にわたり培養した。培養の後、培地を取出し、２％ＦＢＳを含有する１００ μＬのＭＥＭを第１列のみに添加した。第１列にて、１２５μＬの試験化合物を３反復ウェルで添加した。培地のみを細胞およびウィルス比較ウェルに添加した。第１列における試験化合物を残余のウェル全体で１：５にてシリーズ希釈し、これにはセタス・リキッド・ハンドリング・マシーンにより２５μＬを移した。化合物を希釈した後、１００μＬの適するウィルス濃厚物を各ウェルに添加したが、ただし１００μＬのＭＥＭを接種した細胞比較ウェルを除く。ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２の各分析については、用いたウィルス濃厚物を１ウェル当たり１０００ＰＦＵとした。ＣＭＶおよびＶＺＶの分析については、添加したウィルス濃度を１ウェル当たり２５００ＰＦＵとした。次いで各プレートをＣＯ₂培養装置にて３７℃でＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２については３日間、ＶＺＶについては１０日間、またはＣＭＶについては１４日間にわたり培養した。培養期間の後、培地を吸引し、細胞を０．１％結晶バイオレット溶液により３０分間にわたり染色した。次いで染色を除去し、プレートを水道水により過剰の全染色が除去されるまで洗浄した。プレートを２４時間にわたり乾燥させ、次いでスカトロン・プレート・リーダーで６２０ｎｍにておいて読取った。ＶＺＶプラーク減少分析使用の２日間前、ＨＦＦ細胞を６−ウェルのプレートに塗布し、５％ＣＯ₂雰囲気および９０％湿度にて３７℃で培養した。分析の当日、試験化合物を化合物の６種の濃度を用い２×ＭＥＭにて所望濃度の２倍で作成した。初期出発濃度は一般に２００μｇ／ｍＬ〜０．０６μｇ／ｍＬとした。ＶＺＶを１０％ＦＢＳを含有する２×ＭＥＭにて所望濃度まで希釈し、これは１ウェル当たり２０〜３０個のプラークを与える。次いで培地をウェルから吸引し、０．２ｍＬのウィルスを各ウェルに２反復で添加し、０．２ｍＬの培地を薬物毒性ウェルに添加した。次いでプレートを１５分間毎に振とうしながら１時間培養した。培養時間の後、平均等量の１％アガロースを等量の各試験化合物希釈物に添加した。これは、１００μｇ／ｍＬから始まって０．０３μｇ／ｍＬで終端する最終試験化合物濃度を与え、最終アガロースはオーバレイ濃度は０．５％であった。この試験化合物 −アガロース混合物を２ｍＬ容量の各ウェルに加えた。次いで各プレートを培養し、染色を除去し、プラークを倍率１０にて１０日間にわたりステレオマイクロスコープで計数し、その後に細胞をニュートラルレッド染料の１．５％溶液で染色した。３日目および６日目に、さらに１ｍＬの等量の２×ＭＥＭおよび１％アガロースを含む１ｍＬのオーバーレイを添加した。４〜６時間の培養時間の後、染色を除去し、倍率１０にてステレオマイクロスコープによりプラークを計数した。ヘルペスウィルス（ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、ＨＣＭＶ、ＶＺＶおよびＥＢＶ）これらビフラバノイドの抗−ヘルペスウィルス活性分析の結果を第１０表に示す。試験した化合物のうち、ロブスタフラボン（３）のみがＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２ウィルスに対し顕著な抑制活性を示した。活性値は、有効濃度（ＩＣ₅₀ ）および細胞の５０％がパソゲンを含まず或いは細胞の５０％が死滅する細胞毒性濃度（ＣＣ₅₀）によって測定する。ロブスタフラボン（３）の数値は８．６μ ｇ／ｍＬのＥＣ₅₀およびＣＣ₅₀＞１００μｇ／ｍＬであり、これは＞１１．６の選択指数をもたらす。ＨＳＶ−２に対するロブスタフラボン（３）の抗ウィルス活性は８．５μｇ／ｍＬのＥＣ₅₀値と＞１００μｇ／ｍＬのＣＣ₅₀と１１．８のＳＩとを与えた。他の結果は、ＨＳＶ−１に対して極く僅かな活性しか示さないアメントフラボン（１）を含む。フォルケンシフラボン（５）はＨＣＭＶおよびＶＺＶの両者に対し弱い抑制活性を示した。フォルケンシフラボン（５）からフォルケンシフラボンヘキサメチルエーチル（６）へのメチル化は活性の損失とＨＣＭＶに対する毒性の低下とを示したが、活性の増加およびＶＺＶに対する毒性をも示した。ルスフラバノン（９）からルスフラバノンヘキサアセテート（１０）へのアセチル化はＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２に対する活性および毒性を増大させた。サクセダネアフラバノン（１１）からサクセダネアフラバノンヘキサアセテート（１２）へのアセチル化は活性および毒性の両者につき僅かな低下をもたらし、ほぼ同等のＳＩ値を与えた。ＶＺＶに対する活性につき分析すると、アセチル化生成物（１２）は＜３から９．６まで増大したＳＩ値となった。実施例１０：ネズミインフルエンザモデルにおけるロブスタフラボンのインビボ評価この実施例においては、一連のインビボ実験を行ってロブスタフラボンがマウスにおける実験誘発インフルエンザウィルス感染に対し有効であるかどうかを判定した。この試験を開始するに先立ち、一連の予備実験を行ってマウスにおけるこの化合物の最大許容投与量を決定した。化合物が水性媒体に可溶性でないので、これを０．４％カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）（すなわち水不溶性化合物につき一般的に使用されるベヒクル）に懸濁させた。化合物がこの懸濁物にて高投与量で充分許容されると判明した場合、これが動物により充分吸収されたかどうかの問題を提起した。したがって化合物がより可溶性である他のベヒクルを用いて幾つかの試験を行った。これらベヒクルはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を包含した。材料および方法動物：雌１３〜１５ｇ特定パソゲンフリーＢＡＬＢ／ｃマウスをシモンセン・ラボラトリース（ギブロイ、ＣＡ）から入手した。これらを使用の２４時間前に検疫し、ウェイン・ラブ・ブロックスおよび水道水に維持した。感染の後、その飲料水は０．００６％のオキシテトラサイクリン（ファイザー社、ニューヨーク、ＮＹ）を含有して二次的細菌感染の可能性を抑制した。ウイルス：Ａ／ＮＷＳ／３３（Ｈ１Ｎ１）をＫ．Ｗ．コッホラン、ミシガン大学（アン・アンバー、ＭＩ）から入手した。ウィルスプールをＭＤＣＫ細胞で作成し、これをマウスで定量し、アンプル封入し、使用するまで−８０℃にて貯蔵した。化合物：ロブスタフラボンを室温にて使用するまで貯蔵した。陽性比較として使用したリバビリンはＩＣＮファーマスーチカルス社（コスタ・メサ、ＣＡ）から入手した。考慮したベヒクルはＤＭＳＯ（シグマ・ケミカル・カンパニー、セントルイス、ＭＯ）、ＤＭＦ（シグマ社）、ＰＥＧ分子量２００（アルドリッチ・ケミカル・カンパニー、ミルウォーキー、ＷＩ）、０．４％ＣＭＣ（シグマ社）および１−メチル−２−ピロリジノン（ＭＰＤ、アルドリッチ社）を包含した。動脈酸素飽和（ＳａＯ₂）測定：ＳａＯ₂を、オーメダ・ブロックス３７４０パルスオキシメータ（オーメダ社、ルイスビル、ＯＨ）を用いて測定した。耳クローブアタッチメントを用い、プローブを動物の太腿に置き、低速装置モードを選択した。各動物につき、３０秒間の安定化時間の後に読取りを行った。動脈酸素飽和に対するインフルエンザウィルスの作用を測定するこの装置の使用については本出願により記載されている(72)。肺ウィルス測定：各マウスの肺をホモゲナイズし、種々異なる希釈物をＭＤＣＫ細胞における感染性ウィルスにつき３反復で従来記載されているように分析した(73)。実験設計：１．ＣＭＣベヒクルにおけるロブスタフラボンの毒性測定：化合物を３７．５ｍｇ／ｍＬの濃度にて０．４％ＣＭＣに懸濁させて、５００ｍｇ／ｋｇ／１日の投与ブツ作成した。これを５日間にわたり毎日２匹のマウスに腹腔内注射した。マウスを秤量し、毎日死亡を記録した。２．１００％ＤＭＳＯにおけるロブスタフラボンの毒性測定：化合物を２５ｍｇ／ｍＬの濃度にてＤＭＳＯに溶解させ、その後の実験では１１．２５ｍｇ／ｍＬの濃度にして２５０および７５ｍｇ／ｋｇ／１日の投与物をそれぞれ作成した。より高い投与量を０．１ｍＬ／注射１回の容量にて５日間にわたり毎日２回マウスに腹腔内注射すると共に、０．０５ｍＬ／注射１回の容量にて５日間にわたり毎日注射した。比較としてマウスを同じ処理方式によりＤＭＳＯのみで０．１もしくは０．０５ｍＬ／注射１回の容量で処理した。体重増加および死亡率をひれら動物にて測定した。３．ＤＭＦおよびＰＥＧのみの毒性測定：１００％の濃度におけるＤＭＦおよびＰＥＧ２００を別々の群のマウスに５日間にわたり毎日マウスに０．０５ｍＬ／注射１回の容量にて腹腔内注射した。ここでも宿主体重およびマウスの死亡に対する作用を監視した。４．マウスにおけるインフルエンザウィルス感染に対するＣＭＣもしくはＤＭＳＯにおけるロブスタフラボンの作用：ＣＭＣでの試験においては、ロブスタフラボンを２００および１００ｍｇ／ｋｇ／１日の投与量にて使用し；ＤＭＳＯベヒクルを用いる場合は投与量を７５および３７．５ｍｇ／ｋｇ／１日とし、化合物を４時間の事前ウィルス露呈から開始して５日間にわたり毎日２回腹腔内投与した。各投与量でマウスを使用してＳａＯ₂および死亡に対する作用を監視した；追加群の同様に感染および処理されたマウスから３匹の動物を３日目、５日目、７日目および９日目に殺して肺尺度（０＝正常、４＝最大硬化）、重量およびウィルスタイター（titer）につき分析した。３〜４匹のマウスを毒性比較として使用し、これらを処理前に秤量し、再び処理終了の１８時間後にも秤量し、死亡を毎日記録した。塩水に溶解させたリバビリンを同じ処理方式で７５ｍｇ／ｋｇ／１日の投与量にて使用した。３組のウィルス比較を用いた：すなわち感染−未処理、感染−ＣＭＣ単独処理、および感染−ＤＭＳＯ単独処理。これら比較群のそれぞれにて２０匹の動物を使用してＳＯ₂および死亡を監視し、３匹の追加マウスを処理動物と並行して観察し、肺硬化およびウィルスタイターに対する作用を測定した。２組の正常比較を使用し、３匹のマウスよりなる１群を秤量すると共に毒性比較と並行して試験した。第２群の３匹のマウスを肺尺度および体重の比較のため３日目および９日目に殺した。統計評価：生存数の増加をイェーツ（Yates）補正でのカニ（chi）二乗解析を用いて評価した。平均生存時間の増加、ウィルスタイターおよびＳａＯ₂の差をｔ−試験(t −test）により解析した。肺硬化はランクづけ合計分析（ranked sum analysis ）により評価した。結果および検討各種のベヒクルに対する毒物学的作用：考慮したベヒクルでの各種実験の結果を第１１表に要約する。ＣＭＣが最も良好に許容され、次いでＤＭＳＯであった。ＤＭＦおよびＰＥＧ２００はマウスに対し致命的に毒性であった。１匹のマウスはＤＭＳＯでの腹腔内処理の４日目に直ちに死亡した。この動物は直ちに死亡したので、この死亡は腹腔内に投与した際の注射針による器官の浸透に基づいたものと思われる。０．０５ｍＬ容量のＤＭＳＯを用いると、動物はこのベヒクルに対し０．１ｍＬの場合よりも良好に許容しうると思われた。ＤＭＦは高度に致命的であり、両動物を２回の注射後に死亡させ、ＰＥＧ２００は極く僅かに良好であったが全マウスは３回の注射後に死亡した。上記データに基づきＣＭＣおよびＤＭＳＯの両者をロブスタフラボンの溶剤として使用し、後者を０．０５ｍＬの注射容量で使用した。マウスにおけるロブスタフラボンを用いる投与量範囲−測定試験：ベヒクルとしてＣＭＣを使用すると、ロブスタフラボンは極めて不溶性であって、緻密な黄色微粒子物質が処方物に見られた。５日間にわたり毎日２回腹腔内注射すると２００ｍｇ／ｋｇ／１日の投与量は充分良好に許容されると思われ、処置された動物はこの療法により生存したが５日間の処理期間にて０．１ｇの体重を損失した。この物質はＤＭＳＯに極めて可溶性であって、透明な溶液を形成した。５日間にわたり毎日２回腹腔内注射した２５０ｍｇ／ｋｇ／１日の投与量はマウスに対し致命的に毒性であり、全動物は処理の５日目に死亡し、６ｇの体重損失が見られた。この実験における注射容量は０．１ｍＬとし、実験を０．０５ｍＬの注射容量を用いて反復した場合は投与量を７５ｍｇ／ｋｇ／１日まで減少させた。この投与量にて全動物は生存したが、５日間の処理期間に際し２ｇの体重を損失した。ベヒクルとしてＣＭＣを使用したデータは、化合物が動物に良好には吸収されないことを示唆し、したがって抗ウィルス実験に２００および１００ｍｇ／ｋｇ／１日の投与量を使用することに決定した。ＤＭＳＯ試験は、７５ｍｇ／ｋｇ／１日が最大許容投与量に達しうることを示し、３７．５ｍｇ／ｋｇ／１日の投与量をインビボ抗ウィルス実験につき選択した。マウスにおけるインフルエンザＡウィルス感染に対するＤＭＳＯにおけるロブスタフラボンの作用：この実験の結果を第１２表、並びに第１〜４図に要約する。この抗ウィルス実験における７５ｍｇ／ｋｇ／１日の投与量はマウスに対し致命的に毒性であったことが判明し、３７．５ｍｇ／ｋｇ／１日の投与量は３匹の毒性比較マウスのうち２匹を死亡させた。この明らかな毒性に基づき、生存およびＳａＯ₂値に対する作用は確定的でなかった。この過度の毒性は初期に行った範囲測定試験と相関しなかったが、後者の試験にて顕著な体重損失が見られ、これは化合物が致命的毒性に近い投与量であったことを示唆する。肺尺度および肺重量に対する処理の作用を示す第２図および第３図は、肺尺度および体重を低下させるこの化合物の顕著な作用を示す。この作用は投与量依存性であり、ロブスタフラボンがマウスに対し充分許容される投与量でも見られるような顕著なインフルエンザ抑制作用を有することを示唆する。単独使用したＤＭＳＯはマウスに対し致命的でなかったが、ＤＭＳＯ単独で処理した感染動物は未処理感染比較よりもほぼ２日間早く死亡した（第１２表）。これは、ＤＭＳＯ注射が感染の増大をもたらしうることを示唆する。陽性比較として平行的に行ったリバビリンは、全評価パラメータを使用して感染の抑制に高度に活性であった。マウスにおけるインフルエンザＡウィルス感染に対するＣＭＣにおけるロブスタフラボンの作用：この試験の結果を第１３表および第５〜８図に示す。ロブスタフラボンはこの実験にて充分許容されると思われ、全毒性比較は生存すると共に宿主体重増加は並行的に観察した正常比較について見られる数値に達する。この療法は死亡を防げなかったが、投与量依存的に平均生存時間を増大させた。ＳａＯ₂レベルはこれら処理動物においても高く保たれた（第１３表、第５図）。この化合物での処理も、第６図および第７図に見られるように投与量依存的に肺硬化を抑制した。これらデータは次のことを示す：（１）ロブスタフラボンはインビボインフルエンザ感染に対し抑制的であり、（２）投与量依存作用が見られたので化合物の少なくとも部分的吸収が明かである。２種のフラボンがインフルエンザウィルス抑制作用を有すると従来報告されていることに注目することが適切である。５，７，８，４’−テトラヒドロキシフラボンは１９９２年(74)に、化合物を鼻腔内または経口ルートのいずれかで投与した際は感染マウスの肺にてウィルス増殖を予防すると報告された。関連８−メチルエーテル化合物、すなわち５，７，４′−トリヒドロキシ−８−メトキシフラボンも、鼻腔内投与した場合または腹腔内ルートにより同様に有効であった(7 4-77)。これら研究者による研究は、これら化合物がウィルス感染サイクルの早期段階で生ずるウィルスとエンドソーム／リソーム膜との融合を抑制することによりウィルス複製を減少させると共に、細胞表面からの後代ウィルスの出現を抑制しうることを示した(77,78)。これらフラボンのベヒクルはＮａ2ＣＯ3／塩水であった。結論：フラボン（すなわちロブスタフラボン）を２種のベヒクル（すなわち０．４％カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）および１００％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ））を用いてマウスにおけるインフルエンザＡ／ＮＷＳ／３３（Ｈ１Ｎ１）ウィルス感染に対し評価した。処理は４時間の事前ウィルス露呈から始め５日間にわたり毎日２回の腹腔内とした。ＤＭＳＯにおける化合物は、用いた２種の投与量（すなわち７５および３７．５ｍｇ／ｋｇ／１日）にてマウスに対し毒性であった。この毒性にも係わらず、肺硬化における顕著な減少が見られた。ＣＭＣにて使用した場合、使用した２００および１００ｍｇ／ｋｇ／１日の投与量は充分許容され、両者とも肺硬化を示すとともに動物の死亡に対する平均日数を遅延させた。註１：処理ｉ．ｐ．ｂｉｆ×５。２：初期体重と処理後の体重との間の最大差。註^a ：処理の開始時点における初期体重と毒性比較の最終処理の１８時間後における体重との差。 ^b ：２１日目またはその前に死亡したマウスの平均生存時間。 ^c：日数３〜１０の平均。 ^**：ＤＭＳＯ処理比較と対比したＰ＜０．０１註^a：処理の開始時点における初期体重と毒性比較の最終処理の１８時間後における体重との差。 ^b：２１日目またはその前に死亡したマウスの平均生存時間。 ^c：日数３〜１０の平均。 ^**：ＣＭＣ処理比較と対比したＰ＜０．０１。結論：これらの結果は、ロブスタフラボンおよびロブスタフラボンテトラ硫酸カリウム塩が極めて有効な抗ＨＢＶ剤であったことを示す。さらにロブスタフラボンはインフルエンザＡおよびインフルエンザＢウィルスに対し強力な抑制作用をも示した。ヒノキフラボンおよびロブスタフラボンの両者はＨＩＶ−１ＲＴに対し同様な活性を示し、それぞれ３５．２μｇ／ｍＬおよび３３．７μｇ／ｍＬのＩＣ₅₀値を与えた。アメントフラボン、アガシスフラボン、モレロフラボン、ＧＢ−１ａおよびＧＢ−２ａはＨＩＶ−１ＲＴに対し中庸な活性を有し、それぞれ６４．０μｇ／ｍＬ、５３．８μｇ／ｍＬ、６４．７μｇ／ｍＬ、１２７．８ μｇ／ｍＬおよび９４．６μｇ／ｍＬのＩＣ₅₀値を示した。さらにモレロフラボンもＨＩＶ−１（フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）刺激ヒト末梢血液単核（ＰＢＭ）細胞における株ＬＡＶ）に対し５．７μＭのＥＣ₅₀値および約１０のＳＩ値（選択指数）にて顕著な抗ウィルス活性を示した。他のビフラバノイドは僅かに活性であったか、或いはこれらウィルスおよびＨＩＶ−１ＲＴに対し不活性であった。アメントフラボン（１）、アガシスフラボン（２）、フォルケンシフラバノン（５）、フォルケンシフラボンヘキサメチルエーテル（６）、ルスフラバノン（９）およびサクセダネアフラボン（１１）はインフルエンザＢウィルスに対し抑制活性を示し、それぞれ１７８、５．６、３４、〜３８、９．３および１５の選択指数（ＳＩ）を示した。アメントフラボン（１）およびアガシスフラボン（２）も抗インフルエンザＡ活性を示した。ロブスタフラボン（３）はＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２の両者に対し中庸の抑制活性を示した。ルスフラバノン（９）はＨＳＶ−２に対し活性であったが、サクセダネアフラバノンヘキサアセテート（１２）はＶＺＶに対し中庸の活性であった。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者シュール、ラルフアメリカ合衆国 60561 イリノイ州ダリアンセヴンティスストリート 521 (72)発明者ゼンバウアー、デイヴィッドイー. アメリカ合衆国 60302 イリノイ州オークパークウエストスーペリアストリート 56 (72)発明者ザーオ、ジェン−スィアンアメリカ合衆国 60517 イリノイ州ウッドリッジウォーターベリーコート 8108

Claims

【特許請求の範囲】１．少なくとも１種の抗ウィルス有効量のビフラバノイドを投与することを特徴とするウィルス感染の処置または予防方法。２．前記ビフラバノイドが、ロブスタフラボン、ヒノキフラボン、アメントフラボン、アガシスフラボン、フォルケンシフラボン、ルスフラバノン、サクセダネアフラバノン、モレロフラボン、ＧＢ−１ａ、ＧＢ−２ａ、その誘導体もしくはその塩よりなる群から選択される請求の範囲第１項に記載の方法。３．前記ビフラバノイドがロブスタフラボンである請求の範囲第２項に記載の方法。４．前記誘導体もしくは塩がアルキルエーテル、エステル、酸アダクト、アミンおよびサルフェートからなる請求の範囲第２項に記載の方法。５．前記ロブスタフラボン塩がロブスタフラボンテトラ硫酸カリウム塩である請求の範囲第４項に記載の方法。６．前記ウィルス感染がインフルエンザウィルスによるものである請求の範囲第１項に記載の方法。７．前記インフルエンザウィルスがインフルエンザＡもしくはインフルエンザＢウィルスである請求の範囲第６項に記載の方法。８．前記ウィルス感染が肝炎ウィルスによるものである請求の範囲第１項に記載の方法。９．前記肝炎ウィルスがＢ型肝炎ウィルスである請求の範囲第８項に記載の方法。１０．前記ウィルス感染がヘルペスウィルスによるものである請求の範囲第１項に記載の方法。１１．前記ヘルペスウィルスがＨＳＶ−１もしくはＨＳＶ−２ウィルスである請求の範囲第１０項に記載の方法。１２．前記ウィルス感染が水痘ウィルス（ＶＺＶ）によるものである請求の範囲第１項に記載の方法。１３．前記ウィルス感染が呼吸ウィルスによるものである請求の範囲第１２項に記載の方法。１４．前記呼吸ウィルスが麻疹ウィルスである請求の範囲第１３項に記載の方法。１５．ウィルス感染がレトロウィルスによるものである請求の範囲第１項に記載の方法。１６．レトロウィルスがヒト免疫不全症ウィルス（ＨＩＶ）である請求の範囲第１５項に記載の方法。１７．ヒト免疫不全症ウィルス（ＨＩＶ）がＨＩＶ−１である請求の範囲第１６項に記載の方法。１８．実質的に純度の高いロブスタフラボンを植物ルス・サクセダネアから単離する方法であって、ルス・サクセダネアの植物材料から得られた粗製の黄色色素抽出物からトルエン／エタノール／ギ酸の溶剤混液でロブスタフラボンを単離すると共に抽出することを特徴とする実質的に精製されたロブスタフラボンの単離方法。１９．（ａ）ルス・サクセダネアからの粗製の黄色生体色素抽出物を供給し；（ｂ）抽出物をシリカゲルに吸着させ；（ｃ）シリカゲルをトルエン／エタノール／ギ酸の溶剤混液で洗浄すると共にシリカゲルを乾燥させ；（ｄ）シリカゲルをトルエン／エタノール／ギ酸の第１溶剤混液で溶出させて、非ロブスタフラボンビフラバノイドを除去し；（ｅ）シリカゲルをエタノール／ピリジンの第２溶剤混液で溶出させて、実質的に純度高いロブスタフラボンを得る工程をさらに含む請求の範囲第８項に記載の方法。２０．前記トルエン／エタノール／ギ酸が約１０〜３０：２〜１０：１の容量比である請求の範囲第１９項に記載の方法。２１．前記トルエン／エタノール／ギ酸が約２０：５：１の容量比である請求の範囲第２０に記載の方法。２２．前記エタノール／ピリジンが約３〜５：１の容量比である請求の範囲第１９項に記載の方法。２３．前記エタノール／ピリジンが約４：１の容量比である請求の範囲第２２項に記載の方法。２４．前記植物材料がルス・サクセダネアの種子、葉、茎、小枝、果樹、花、木部、樹皮もしくは根よりなる請求の範囲第１９項に記載の方法。２５．前記植物材料がルス・サクセダネアの種子粒である請求の範囲第２４項に記載の方法。２６．医薬上許容しうるキャリヤと、ロブスタフラボン、ヒノキフラボン、アメントフラボン、アガシスフラボン、フォルケンシフラボン、ルスフラバノン、サクセダネアフラバノン、モレロフラボン、ＧＢ−１ａ、ＧＢ−２ａ、その誘導体もしくはその塩よりなる群から選択される少なくとも１種の抗ウィルス有効量のビフラバノイドとからなることを特徴とするウィルス感染を処置および／または予防するための医薬組成物。２７．前記ビフラバノイドがロブスタフラボンである請求の範囲第２６項に記載の組成物。２８．前記誘導体もしくは塩がアルキルエーテル、エステル、酸アダクト、アミンおよびサルフェートを含む請求の範囲第２６項に記載の組成物。２９．前記誘導体もしくは塩がロブスタフラボン塩である請求の範囲第２８項に記載の組成物。３０．前記ロブスタフラボン塩がロブスタフラボンテトラ硫酸カリウム塩である請求の範囲第２９項に記載の組成物。３１．前記ウィルス感染がインフルエンザウィルスによるものである請求の範囲第２６項に記載の組成物。３２．前記インフルエンザウィルスがインフルエンザＡもしくはインフルエンザＢウィルスである請求の範囲第３１項に記載の組成物。３３．前記ウィルス感染が肝炎ウィルスによるものである請求の範囲第２６項に記載の組成物。３４．前記肝炎ウィルスがＢ型肝炎ウィルスである請求の範囲第３３項に記載の組成物。３５．前記ウィルス感染がヘルペスウィルスによるものである請求の範囲第２６項に記載の組成物。３６．前記ヘルペスウィルスがＨＳＶ−１もしくはＨＳＶ−２ウィルスである請求の範囲第３５項に記載の組成物。３７．前記ウィルス感染が水痘ウィルス（ＶＺＶ）によるものである請求の範囲第２６項に記載の組成物。３８．前記ウィルス感染が呼吸ウィルスによるものである請求の範囲第２６項に記載の組成物。３９．前記呼吸ウィルスが麻疹ウィルスである請求の範囲第３８項に記載の組成物。４０．ウィルス感染がレトロウィルスによるものである請求の範囲第２６項に記載の組成物。４１．レトロウィルスがヒト免疫不全症ウィルス（ＨＩＶ）である請求の範囲第２６項に記載の組成物。４２．前記ヒト免疫不全症ウィルス（ＨＩＶ）がＨＩＶ−１である請求の範囲第４１項に記載の組成物。４３．ロブスタフラボンテトラ硫酸カリウム塩。