JPH11196887A - Production of organic acid by phosphoenolpyruvic acid carboxylase gene recombinant microbe - Google Patents

Production of organic acid by phosphoenolpyruvic acid carboxylase gene recombinant microbe

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JPH11196887A
JPH11196887A JP10020360A JP2036098A JPH11196887A JP H11196887 A JPH11196887 A JP H11196887A JP 10020360 A JP10020360 A JP 10020360A JP 2036098 A JP2036098 A JP 2036098A JP H11196887 A JPH11196887 A JP H11196887A
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JP
Japan
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leu
dna
plasmid
glu
acid
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JP10020360A
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Japanese (ja)
Inventor
Miki Kobayashi
幹 小林
Makoto Goto
誠 後藤
Masato Terasawa
真人 寺沢
Hideaki Yugawa
英明 湯川
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Mitsubishi Chemical Corp
Original Assignee
Mitsubishi Chemical Corp
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Publication date
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Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To obtain an organic acid in a high yield by effecting aerobic Coryne type bacteria recombined with a phosphoenolpyruvic acid carboxylase gene anaerobically to an organic material in a solution containing (bi)carbonate ion, CO2 , or the like. SOLUTION: The method for producing an organic acid comprises effecting an aerobic Coryne type bacterium (e.g. Brevibacterium flavum) recombined with a phosphoenolypyruvic acid carboxylase gene originated from a microorganism such as Rhodopseudomonas paulustris and Brevibacterium flavum or a plant such as a soybean and a corn, or their preparations anaerobically to an organic material in a solution containing (bi)carbonate ion, CO2 , or the like, to produce an organic acid such as succinic acid in a high efficiency and a high yield.

Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【0001】[0001]

【発明の属する技術分野】本発明は、ホスホエノールピ
ルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子で組み換えた好気性コ
リネ型細菌またはその調製物を用いた有機酸の製造方法
に関する。
TECHNICAL FIELD The present invention relates to a method for producing an organic acid using an aerobic coryneform bacterium recombinant with a phosphoenolpyruvate carboxylase gene or a preparation thereof.

【0002】[0002]

【従来の技術】ホスホエノールピルビン酸カルボキシラ
ーゼ(以下これを「PEPC」と略称することがある)
は、解糖系の代謝中間化合物であるホスホエノールピル
ビン酸に二酸化炭素(重炭酸イオン)を固定することに
よりオキザロ酢酸を生成し、トリカルボン酸(TCA)
サイクルに4炭素(C4)化合物を補充する生理的役割
を果たすとされている。
2. Description of the Related Art Phosphoenolpyruvate carboxylase (hereinafter sometimes abbreviated as "PEPC").
Produces oxaloacetic acid by immobilizing carbon dioxide (bicarbonate ion) on phosphoenolpyruvate, a glycolytic metabolic intermediate compound, to produce tricarboxylic acid (TCA).
It is believed to play a physiological role in replenishing the cycle with four carbon (C 4 ) compounds.

【0003】ホスホエノールピルビン酸カルボキシラー
ゼは大部分の細菌、原生動物、すべての植物において存
在が確認されている。該酵素をコードする遺伝子に関し
ては、高等植物に関し多数研究されているものの、細菌
に関しては、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli
由来の遺伝子[J.Biochem., 95, 909-916, (1984)参
照]、ブレビバクテリウム・フラバム(Brevibacterium
flavum)由来の遺伝子[特開平8−66189号公
報]、コリネバクテリアム・グルタミカム(Corynebact
erium glutamicum)由来の遺伝子[Gene, 77, 237-251,
(1989)]、放線菌(Streptomyces coelicolor)由来の遺伝
子[Biochem.J., 293, 131-136, (1993)]、好熱性細菌(T
hermus sp.)由来の遺伝子[J.Biochem., 118, 319-324,
(1995)]、及び光合成細菌(Rhodopseudomonas palustri
s)由来の遺伝子[J.Bacteriol., 179,4942-4945, (199
7)参照]が単離されているのみである。
[0003] Phosphoenolpyruvate carboxylase has been identified in most bacteria, protozoa and all plants. Although a large number of studies have been made on genes encoding the enzyme in higher plants, bacteria have been studied on Escherichia coli .
Derived genes [see J. Biochem., 95, 909-916, (1984)], Brevibacterium
flavum ) [Japanese Unexamined Patent Publication (Kokai) No. 8-66189], Corynebacterium glutamicum ( Corynebact)
erium glutamicum ) [Gene, 77, 237-251,
(1989)], a gene derived from actinomycetes ( Streptomyces coelicolor ) [Biochem. J., 293, 131-136, (1993)], a thermophilic bacterium ( T
hermus sp.) [J. Biochem., 118, 319-324,
(1995)], and photosynthetic bacteria ( Rhodopseudomonas palustri
s ) [J. Bacteriol., 179,4942-4945, (199
7) is only isolated.

【0004】TCAサイクルは、アミノ酸等各種有用物
質生合成系において重要な代謝経路である。該遺伝子を
利用することにより、TCAサイクルへの物質供給が強
化され、オキザロ酢酸から生合成されるアミノ酸(アス
パラギン酸、スレオニン等)の生産能の増強が期待され
ている。
The TCA cycle is an important metabolic pathway in the biosynthesis system of various useful substances such as amino acids. By utilizing this gene, the supply of substances to the TCA cycle is strengthened, and it is expected that the ability to produce amino acids (aspartic acid, threonine, etc.) biosynthesized from oxaloacetic acid will be enhanced.

【0005】また、エシェリヒア・コリ由来のPEPC
に関しては、該酵素の反応機構等の基礎的研究が精力的
に行われているものの、本発明者らが知る限り工業的観
点からの利用については、オキザロ酢酸から生合成され
るアミノ酸(アスパラギン酸、スレオニン等)の製造法
[特公平7−83714号公報、特開平9−12187
2号公報]を除き、殆ど検討されていない。
Also, PEPC derived from Escherichia coli
With regard to, although basic research such as the reaction mechanism of the enzyme has been energetically conducted, as far as the present inventors know, from the industrial point of view, amino acids biosynthesized from oxaloacetic acid (aspartic acid) , Threonine, etc. [JP-B-7-83714, JP-A-9-12187]
No. 2] has not been studied.

【0006】すなわち、PEPC遺伝子を増強した好気
性コリネ型細菌を用いて、オキザロ酢酸からTCAサイ
クルを逆行してリンゴ酸、フマール酸、コハク酸等を生
成させる効率のよい製造方法は知られていなかった。
[0006] That is, there is no known efficient production method for producing malic acid, fumaric acid, succinic acid and the like by reversing the TCA cycle from oxaloacetic acid using aerobic coryneform bacterium with enhanced PEPC gene. Was.

【0007】[0007]

【発明が解決しようとする課題】そのため、本発明の目
的は、PEPC遺伝子で組み換えた好気性コリネ型細菌
を用いてリンゴ酸、フマール酸、コハク酸等の有機酸の
製造方法を提供することである。
SUMMARY OF THE INVENTION Accordingly, an object of the present invention is to provide a method for producing an organic acid such as malic acid, fumaric acid, and succinic acid using an aerobic coryneform bacterium recombinant with the PEPC gene. is there.

【0008】[0008]

【課題を解決するための手段】そこで、本発明者等は、
好気性コリネ型細菌を用いてこれらの有機酸を生産する
方法について検討したところ、好気性コリネ型細菌ある
いはその調製物を、炭酸イオンもしくは重炭酸イオン又
は二酸化炭素ガスを含有する反応液中で嫌気的に有機原
料に作用させることにより、これらの有機酸を効率よく
生産することが可能であることを見いだし、さらに好気
性コリネ型細菌をPEPC遺伝子で組み換えることによ
り、PEPC活性を増強し、CO2をホスホエノールピ
ルビン酸に取り込ませる能力を増強した菌体を用いるこ
とにより、これら有機酸の生産性が著しく向上すること
を見いだし、本発明を完成した。
Means for Solving the Problems Accordingly, the present inventors have
The method of producing these organic acids using aerobic coryneform bacteria was studied.Aerobic coryneform bacteria or their preparations were anaerobically digested in a reaction solution containing carbonate ions or bicarbonate ions or carbon dioxide gas. It has been found that these organic acids can be efficiently produced by chemically acting on organic raw materials, and furthermore, the aerobic coryneform bacterium is recombined with the PEPC gene to enhance the PEPC activity, The present inventors have found that the productivity of these organic acids is remarkably improved by using cells having enhanced ability to incorporate 2 into phosphoenolpyruvate, thereby completing the present invention.

【0009】即ち、本発明の要旨は、ホスホエノールピ
ルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子で組み換えた好気性コ
リネ型細菌あるいはその調製物を、炭酸イオンもしくは
重炭酸イオンまたは二酸化炭素ガスを含有する反応液中
で嫌気的に有機原料に作用させ、有機酸を生成させるこ
とを特徴とする有機酸の製造方法に関する。
That is, the gist of the present invention is that an aerobic coryneform bacterium or a preparation thereof modified with a phosphoenolpyruvate carboxylase gene is anaerobically digested in a reaction solution containing carbonate ions or bicarbonate ions or carbon dioxide gas. The present invention relates to a method for producing an organic acid, wherein the method is applied to an organic raw material to produce an organic acid.

【0010】上記方法において、反応液に炭酸イオンも
しくは重炭酸イオンまたは二酸化炭素ガスを含有させる
方法としては、炭酸もしくは重炭酸またはそれらの塩を
反応液に添加する方法、または反応液に二酸化炭素ガス
を供給する方法が挙げられる。
[0010] In the above method, the method of adding carbonate ion or bicarbonate ion or carbon dioxide gas to the reaction solution includes adding carbonic acid or bicarbonate or a salt thereof to the reaction solution, or adding carbon dioxide gas or carbon dioxide gas to the reaction solution. Is supplied.

【0011】上記ホスホエノールピルビン酸カルボキシ
ラーゼ遺伝子としては、微生物または植物由来の遺伝子
が挙げられる。上記ホスホエノールピルビン酸カルボキ
シラーゼ遺伝子としては、ロドシュードモナス パルス
トリス(Rhodopseudomonas palustris)、ブレビバクテ
リウム・フラバム(Brevibacterium flavum)、ストレ
プトマイセス・コエリカラー(Streptomyces coelicolo
r)、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces c
erevisiae)、アナベナ・バリアビリス(Anabaena vari
abilis)、アナシクティス・ニジュランス(Anacystis
nidulans)、フラベリア・アウストララシカ(Flaveria
australasica)、フラベリア・プリングレイ( Flaver
ia pringlei)、フラベリア・トリネビア(Flaveria tr
inervia)、アロエ・アルボレセンス(Aloe arborescen
s)、ブラシカ・ナプス(Brassica napus)、ソラヌム
・ツベロサム(Solanum tuberosum)、メセムブリアン
セサム・クリスタリウム(Mesembryanthemum crystalli
um)、ソルガム・ブルガレ(Sorghum vulgare)、ニコ
チアナ・タバクム(Nicotiana tabacum)、ダイズ又は
トウモロコシ由来の遺伝子が挙げられる。
[0011] Examples of the phosphoenolpyruvate carboxylase gene include genes derived from microorganisms or plants. Examples of the phosphoenolpyruvate carboxylase gene include Rhodopseudomonas palustris, Brevibacterium flavum, and Streptomyces coelicolo.
r), Saccharomyces c
erevisiae), Anabaena vari
abilis), Anacystis
nidulans), Flaveria australasian deer (Flaveria)
australasica), Flaverian pudding gray (Flaver
ia pringlei), Flaveria trinevia (Flaveria tr)
inervia), Aloe arborescen
s), Brassica napus, Solanum tuberosum, Mesembryanthemum crystalli
um), sorghum vulgare, Nicotiana tabacum, soybean or maize.

【0012】上記好気性コリネ型細菌としては、ブレビ
バクテリウム・フラバム(Brevibacterium flavum) が挙
げられる。また、ブレビバクテリウム・フラバムのとし
ては、ブレビバクテリウム・フラバム MJ-233が挙げら
れる。
The aerobic coryneform bacterium includes Brevibacterium flavum. Examples of Brevibacterium flavum include Brevibacterium flavum MJ-233.

【0013】[0013]

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に使用されるPEPC遺伝子は、既にその塩基配
列が決定されている遺伝子を、もしくは、通常の方法に
よりPEPC活性を有するタンパク質をコードするDN
A断片を細菌、原生動物、植物等の染色体より単離し、
塩基配列を決定したものを使用することができる。ま
た、塩基配列が決定された後には、その配列にしたがっ
て合成した遺伝子を使用することもできる。
DESCRIPTION OF THE PREFERRED EMBODIMENTS The present invention will be described below in detail.
The PEPC gene used in the present invention may be a gene whose base sequence has already been determined, or a DN encoding a protein having PEPC activity by a conventional method.
A fragment is isolated from chromosomes of bacteria, protozoa, plants, etc.,
Those whose nucleotide sequences have been determined can be used. After the nucleotide sequence is determined, a gene synthesized according to the sequence can be used.

【0014】本発明のPEPC遺伝子を含むDNA断片
は、細菌、原生動物、植物由来の染色体上に存在してい
る。これらの供給生物からPEPC遺伝子を調製するた
めの基本操作を、好気性コリネ型細菌である、ブレビバ
クテリウム・フラバムMJ-233由来のものを一例として述
べれば次のとおりである。
The DNA fragment containing the PEPC gene of the present invention is present on chromosomes derived from bacteria, protozoa and plants. The basic operation for preparing the PEPC gene from these supply organisms will be described below, taking as an example the one derived from Brevibacterium flavum MJ-233, which is an aerobic coryneform bacterium.

【0015】PEPC遺伝子は、上記ブレビバクテリウ
ム・フラバムMJ-233株の染色体上に存在し、この染色体
由来のDNAバンクから以下に述べるハイブリダイゼー
ション法によりPEPC遺伝子を分離・取得することが
できる。
The PEPC gene is present on the chromosome of Brevibacterium flavum strain MJ-233, and the PEPC gene can be isolated and obtained from a DNA bank derived from this chromosome by the hybridization method described below.

【0016】先ず、ブレビバクテリウム・フラバムMJ-2
33株の培養物から染色体DNAを抽出する。この染色体
DNAを適当な制限酵素、例えばSau3AIを用いて
部分分解する。
First, Brevibacterium flavum MJ-2
Chromosomal DNA is extracted from cultures of 33 strains. This chromosomal DNA is partially digested with an appropriate restriction enzyme, for example, Sau3AI.

【0017】得られる様々なDNA断片をプラスミドベ
クター、例えばpUC118(宝酒造製)に挿入し、ラ
イブラリーを作製する。このプラスミドライブラリーを
用いてエシェリヒア・コリ 例えば、JM109(宝酒
造製)を形質転換することによりコロニーを形成させ
る。次いで、このコロニーのDNAをニトロセルロース
膜に移し取り、公知の各種PEPC遺伝子において保存
されている領域、例えばエシェリヒア・コリ由来のPE
PC遺伝子[J.Biochem.,95, 909-916,(1984)]、及び
トウモロコシ由来のPEPC遺伝子[Plant. Mol. Bio
l.,12, 579-589,(1989)]の共通領域配列である後記配
列表の配列番号1及び配列番号2に示す塩基配列を有す
る合成オリゴヌクレオチドをプローブとして用いた、コ
ロニーハイブリダイゼーションを行う。
The obtained various DNA fragments are inserted into a plasmid vector, for example, pUC118 (Takara Shuzo) to prepare a library. Using this plasmid library, a colony is formed by transforming Escherichia coli, for example, JM109 (Takara Shuzo). Next, the DNA of this colony was transferred to a nitrocellulose membrane, and a region conserved in various known PEPC genes, for example, PE derived from Escherichia coli.
PC gene [J. Biochem., 95, 909-916, (1984)] and maize-derived PEPC gene [Plant. Mol. Bio
l., 12, 579-589, (1989)], colony hybridization is performed using, as a probe, a synthetic oligonucleotide having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 in the Sequence Listing below. .

【0018】こうして、ベクターに挿入されたブレビバ
クテリウム・フラバムMJ-233株の染色体由来のDNA断
片がPEPC遺伝子を含むことを確認することができ
る。ハイブリダイゼーション陽性のコロニーからプラス
ミドDNAを抽出し、挿入断片を制限酵素SalIで切
り出すことで本発明のDNA断片を取得することができ
る。
Thus, it can be confirmed that the DNA fragment derived from the chromosome of Brevibacterium flavum strain MJ-233 inserted into the vector contains the PEPC gene. The DNA fragment of the present invention can be obtained by extracting plasmid DNA from a hybridization-positive colony and cutting out the inserted fragment with the restriction enzyme SalI.

【0019】このようにして得られるDNA断片の1つ
は、上記ブレビバクテリウム・フラバムMJ-233株染色体
DNAを 制限酵素SalIの完全分解により切断して
得られる大きさが約3.3kbのDNA断片を挙げるこ
とができる。
One of the thus obtained DNA fragments is a DNA of about 3.3 kb in size obtained by cutting the chromosomal DNA of the above Brevibacterium flavum strain MJ-233 by complete digestion of the restriction enzyme SalI. Fragments can be mentioned.

【0020】本明細書における「切断断片の大きさ」及
びプラスミドの大きさは、アガロースゲル電気泳動を用
いる場合には、エシェリヒア・コリのラムダ・ファージ
(λphage)のDNAを制限酵素HindIIIで切
断して得られる分子量既知のDNA断片の同一アガロー
スゲル上での泳動距離で描かれる標準線に基づき、ま
た、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いる場合に
は、エシェリヒア・コリのファイ・エックス174ファ
ージ(φX174 phage)のDNAを制限酵素H
aeIIIで切断して得られる分子量既知のDNA断片の
同一ポリアクリルアミドゲル上での泳動距離で描かれる
標準線に基づき、切断DNA断片またはプラスミドの各
DNA断片の大きさを算出することができる。尚、各D
NA断片の大きさの決定において、1kb以上の断片の
大きさについては、1%アガロースゲル電気泳動によっ
て得られる結果を採用し、約0.1kbから1kb未満
の断片の大きさについては4%ポリアクリルアミドゲル
電気泳動によって得られる結果を採用した。
In the present specification, the "size of the cut fragment" and the size of the plasmid are determined by digesting the DNA of lambda phage (λphage) of Escherichia coli with the restriction enzyme HindIII when agarose gel electrophoresis is used. In the case of using polyacrylamide gel electrophoresis, based on the standard line drawn by the migration distance of the obtained DNA fragment having a known molecular weight on the same agarose gel, when using polyacrylamide gel electrophoresis, Phi X 174 phage (φX174 phage) of Escherichia coli ) To the restriction enzyme H
The size of the cleaved DNA fragment or each DNA fragment of the plasmid can be calculated based on the standard line drawn by the migration distance of the DNA fragment of known molecular weight obtained by cleaving with aeIII on the same polyacrylamide gel. In addition, each D
In the determination of the size of the NA fragment, the results obtained by 1% agarose gel electrophoresis were adopted for the size of the fragment of 1 kb or more, and the size of the fragment of about 0.1 kb to less than 1 kb was used for the size of the fragment of about 0.1 kb or less. The results obtained by acrylamide gel electrophoresis were employed.

【0021】上記PEPC遺伝子を包含する本発明に用
いるDNA断片は、天然のブレビバクテリウム・フラバ
ムMJ-233染色体DNAから分離されたもののみならず、
通常用いられるDNA合成装置、例えばアプライド・バ
イオシステムズ(Applied Biosystems)社製394DNA
/RNAシンセサイザーを用いて合成されたものであっ
てもよい。
The DNA fragment used in the present invention containing the PEPC gene is not limited to the one isolated from natural Brevibacterium flavum MJ-233 chromosomal DNA,
A commonly used DNA synthesizer, for example, 394 DNA manufactured by Applied Biosystems
/ RNA synthesized using an RNA synthesizer.

【0022】また、前記の如くブレビバクテリウム・フ
ラバムMJ-233の染色体DNAから取得されるPEPC遺
伝子は、コードされるPEPCの機能、すなわち二酸化
炭素固定に関与する性質を実質的に損なうことがない限
り、塩基配列の一部の塩基が他の塩基と置換されていて
もよく、又は削除されていてもよく、或いは新たに塩基
が挿入されていてもよく、さらに塩基配列の一部が転位
されているものであってもよく、これらの誘導体のいず
れもが、本発明に用いることができる。
As described above, the PEPC gene obtained from the chromosomal DNA of Brevibacterium flavum MJ-233 does not substantially impair the function of the encoded PEPC, that is, the property involved in carbon dioxide fixation. As long as some bases of the base sequence may be substituted with other bases, or may be deleted, or a new base may be inserted, and further a part of the base sequence may be rearranged. Any of these derivatives can be used in the present invention.

【0023】また、ブレビバクテリウム・フラバムMJ-2
33以外のブレビバクテリウム・フラバムの菌株、または
他の微生物もしくは植物由来のPEPC遺伝子を使用す
ることもできる。特に、以下に示す微生物または植物由
来のPEPC遺伝子は、その配列が既知(括弧内に文献
を示す)であり、上記と同様にしてハイブリダイゼーン
ションにより、あるいはPCR法によりそのORF部分
を増幅することによって、取得することができる。得ら
れた遺伝子は、後記実施例3(B)作製のベクターのt
acプロモーター下流に挿入することができる。挿入し
たプラスミドを実施例3(D)の方法に従って好気性コ
リネ型細菌を形質転換し、有機酸の製造に使用すること
ができる。
Also, Brevibacterium flavum MJ-2
Brevibacterium flavum strains other than 33 or PEPC genes from other microorganisms or plants can also be used. In particular, the sequence of the microorganism or plant-derived PEPC gene shown below is known (the document is shown in parentheses), and the ORF portion is amplified by hybridization or PCR as described above. By doing so, it can be obtained. The obtained gene was used for the vector t prepared in Example 3 (B) described later.
It can be inserted downstream of the ac promoter. The inserted plasmid can be used to produce an organic acid by transforming aerobic coryneform bacteria according to the method of Example 3 (D).

【0024】ロドシュードモナス パルストリス(J.Ba
cteriol.,179,4942-4945,(1997))、ストレプトマイセ
ス・コエリカラー(Biochem.J.,293,131-136,(199
3))、サッカロマイセス・セレビシエ(Nature,387,May
29 suppl.)、アナベナ・バリアビリス(J.Gen.Microb
iol.,138,685-691,(1992))、アナシクティス・ニジュ
ランス(Gene,38,265-269,(1985))、フラベリア・アウ
ストララシカ、フラベリア・プリングレイ、フラベリア
・トリネビア(以上、Mol.Gen.Genet.,234,275-284,(19
92))、アロエ・アルボレセンス(Plant Cell Physio
l.,37,881-888,(1996))、アブラナ(ブラシカ・ナプ
ス)(Biosci.Biotechnol.Biochem.,58,950-953,(199
4))、ソラヌム・ツベロサム(Plant Mol.Biol.,23,881
-888,1993)、マツバギク(メセムブリアンセサム・ク
リスタリウム)(Nuc.Acid Res.,17,6743-6746,(198
9))、モロコシ(ソルガム・ブルガレ)(Gene,99,87-9
4,(1991))、タバコ(ニコチアナ・タバクム、Plant Mo
l.Biol.,17,535-539,(1991))、ダイズ(Plant Mol.Bio
l.,20,743-747,(1992))、トウモロコシ(Eur.J.Bioche
m.,181,593-598,(1989))。
Rhodoseudomonas pulse tris (J. Ba
cteriol., 179,4942-4945, (1997)), Streptomyces coelicolor (Biochem. J., 293, 131-136, (199)
3)), Saccharomyces cerevisiae (Nature, 387, May)
29 suppl.), Anabena variabilis (J.Gen.Microb
iol., 138, 685-691, (1992)), Anasictis nidulans (Gene, 38, 265-269, (1985)), Flaveria australasian deer, Flaverian puddingley, Flavelian trinebia (all Mol. Gen. Genet., 234, 275). -284, (19
92)), Aloe Arboresens (Plant Cell Physio
l., 37, 881-888, (1996)), oilseed rape (Brassica naps) (Biosci. Biotechnol. Biochem., 58, 950-953, (199)
4)), Solanum Tuberosam (Plant Mol. Biol., 23,881)
-888,1993), Matsubagiku (Mesembrian Sesam Cristalium) (Nuc. Acid Res., 17,6743-6746, (198
9)), sorghum (Sorghum Bulgare) (Gene, 99, 87-9)
4, (1991)), tobacco (Nicotian tabacum, Plant Mo
l. Biol., 17,535-539, (1991)), soybean (Plant Mol. Bio
l., 20,743-747, (1992)), corn (Eur. J. Bioche
m., 181, 593-598, (1989)).

【0025】PEPC遺伝子を含むDNA断片は、適当
な発現プラスミド、例えばpUC118(宝酒造製)へ
挿入し、適当な宿主微生物、例えばエシェリヒア・コリ
JM109(宝酒造製)へ導入することにより発現させ
ることができる。発現したPEPC遺伝子産物であるホ
スホエノールピルビン酸カルボキシラーゼの確認は、該
形質転換体から粗酵素液を抽出し、Teraokaらの方法[H.
Teraoka and K.Izui,Biochem., 13, 5121 (1974)]によ
り直接PEPC活性を測定し、非形質転換株から抽出し
た粗酵素液のPEPC活性と比較することにより、ある
いはPEPC遺伝子欠損変異株への上記発現プラスミド
の導入による相補試験[Mol.Gen.Genet.,218, 330 (198
9)]により確認することができる。
The DNA fragment containing the PEPC gene can be expressed by inserting it into an appropriate expression plasmid, for example, pUC118 (Takara Shuzo) and introducing it into an appropriate host microorganism, for example, Escherichia coli JM109 (Takara Shuzo). . Confirmation of the expressed PEPC gene product, phosphoenolpyruvate carboxylase, was carried out by extracting a crude enzyme solution from the transformant and using the method of Teraoka et al. [H.
Teraoka and K. Izui, Biochem., 13, 5121 (1974)] to measure the PEPC activity directly and compare it with the PEPC activity of the crude enzyme solution extracted from the non-transformed strain, or to the PEPC gene-deficient mutant. Of the above expression plasmid [Mol. Gen. Genet., 218, 330 (198
9)].

【0026】PEPC遺伝子を含むDNA断片は、適当
なプラスミド、例えばコリネ型細菌内でプラスミドの複
製増殖機能を司る遺伝子を少なくとも含むプラスミドベ
クターに導入することにより、コリネ型細菌内でPEP
Cの高発現可能な組換えプラスミドを得ることができ
る。
The DNA fragment containing the PEPC gene is introduced into an appropriate plasmid, for example, a plasmid vector containing at least a gene responsible for the replication and replication function of the plasmid in the coryneform bacterium, so that the PEP can be introduced into the coryneform bacterium.
A recombinant plasmid capable of high expression of C can be obtained.

【0027】ここで、上記組み換えプラスミドにおい
て、PEPC遺伝子を発現させるためのプロモーターは
ブレビバクテリウム属細菌が保有するプロモーターであ
ることができるが、それに限られるものではなく、コリ
ネ型細菌内でPEPC遺伝子の転写を開始させるための
塩基配列であればいかなるプロモーターであっても良
い。
Here, in the above-mentioned recombinant plasmid, the promoter for expressing the PEPC gene may be a promoter possessed by a bacterium belonging to the genus Brevibacterium, but is not limited thereto. Any promoter may be used as long as it is a base sequence for initiating the transcription of E. coli.

【0028】PEPC遺伝子を導入することができるプ
ラスミドベクターとしては、コリネ型細菌内での複製増
殖機能を司る遺伝子を少なくとも含むものであれば特に
制限されない。その具体例としては、例えば、特開平3
−210184号公報に記載のプラスミドpCRY3
0;特開平2−72876号公報及び米国特許5,18
5,262号明細書に記載のプラスミドpCRY21、
pCRY2KE、pCRY2KX、pCRY31、pC
RY3KE及びpCRY3KX;特開平1−19168
6号公報に記載のプラスミドpCRY2およびpCRY
3;特開昭58−67679号公報に記載のpAM33
0;特開昭58−77895号公報に記載のpHM15
19;特開昭58−192900号公報に記載のpAJ
655、pAJ611及びpAJ1844;特開昭57
−134500号公報に記載のpCG1;特開昭58−
35197号公報に記載のpCG2;特開昭57−18
3799号公報に記載のpCG4およびpCG11等を
挙げることができる。
[0028] The plasmid vector into which the PEPC gene can be introduced is not particularly limited as long as it contains at least a gene that controls the replication and propagation function in coryneform bacteria. Specific examples thereof include, for example,
Plasmid pCRY3 described in JP-A-210184
0; JP-A-2-72876 and US Pat.
Plasmid pCRY21 described in US Pat. No. 5,262,
pCRY2KE, pCRY2KX, pCRY31, pC
RY3KE and pCRY3KX; JP-A-1-19168
6 plasmids pCRY2 and pCRY
3: pAM33 described in JP-A-58-67679
0; pHM15 described in JP-A-58-77895.
19; pAJ described in JP-A-58-192900
655, pAJ611 and pAJ1844;
PCG1 described in JP-A-134500;
PCG2 described in JP-A-35197;
Examples include pCG4 and pCG11 described in 3799 gazette.

【0029】それらの中でもコリネ型細菌の宿主−ベク
ター系で用いられるプラスミドベクターとしては、コリ
ネ型細菌内でプラスミドの複製増殖機能を司る遺伝子と
コリネ型細菌内でプラスミドの安定化機能を司る遺伝子
とを有するものが好ましく、例えば、プラスミドpCR
Y30、pCRY21、pCRY2KE、pCRY2K
X、pCRY31、pCRY3KEおよびpCRY3K
X等が好適に使用される。
Among them, the plasmid vectors used in the coryneform bacterium host-vector system include a gene responsible for the replication and propagation function of the plasmid in the coryneform bacterium and a gene responsible for the plasmid stabilization function in the coryneform bacterium. Are preferred, for example, plasmid pCR
Y30, pCRY21, pCRY2KE, pCRY2K
X, pCRY31, pCRY3KE and pCRY3K
X and the like are preferably used.

【0030】PEPC遺伝子を好気性コリネ型細菌内で
複製可能なプラスミドベクターの適当な部位に挿入して
得られる組み換えベクターで、コリネ型細菌、例えばブ
レビバクテリウム フラバム(Brevibacterium flavum)M
J-233-AB-41(FERM BP−1498)を形質転換
することにより、本発明で用いるPEPC遺伝子で組み
換えられた好気性コリネ型細菌が得られる。
A recombinant vector obtained by inserting the PEPC gene into an appropriate site of a plasmid vector capable of replicating in aerobic coryneform bacteria, which is a coryneform bacterium such as Brevibacterium flavum M
By transforming J-233-AB-41 (FERM BP-1498), an aerobic coryneform bacterium recombinant with the PEPC gene used in the present invention can be obtained.

【0031】本発明に用いられるPEPC遺伝子で組み
換えられた好気性コリネ型細菌又はその調製物とは、通
常の好気的条件で増殖可能なコリネ型細菌またはその調
製物であれば特に限定されるものではないが、例えば、
ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、アース
ロバクター属等のコリネ型細菌またはその調製物が挙げ
られる。これらのうち、特にブレビバクテリウム フラ
バム(Brevibacteriumflavum)MJ−233(FERM
BP−1497), 同MJ−233−AB−41(F
ERM BP−1498)、ブレビバクテリウム アン
モニアゲネス (Brevibacterium ammoniagenes)ATC
C6872、コリネバクテリウム グルタミカム(Cory
nebacterium glutamicum)ATCC31831、ブレビ
バクテリウム ラクトファーメンタム(Brevibacterium
lactofermentum)ATCC13869等のコリネ型細
菌またはその調製物が好適に用いられる。
The aerobic coryneform bacterium recombined with the PEPC gene or its preparation used in the present invention is not particularly limited as long as it is a coryneform bacterium or a preparation thereof which can grow under ordinary aerobic conditions. Not something, for example
Coryneform bacteria such as Brevibacterium, Corynebacterium and Arthrobacter, or preparations thereof. Among these, in particular, Brevibacterium flavum MJ-233 (FERM)
BP-1497) and MJ-233-AB-41 (F
ERM BP-1498), Brevibacterium ammoniagenes ATC
C6872, Corynebacterium glutamicum (Cory
nebacterium glutamicum) ATCC 31831, Brevibacterium lactofermentum (Brevibacterium)
Lactofermentum) ATCC 13869 or a preparation thereof is preferably used.

【0032】好気性コリネ型細菌を本発明の方法に用い
るためには、まず菌体を通常の好気的な条件で培養した
後用いることができる。培養に用いる培地は、通常微生
物の培養に用いられる培地を用いることができる。例え
ば、硫酸アンモニウム、リン酸カリウム、硫酸マグネシ
ウム等の無機塩からなる組成に、肉エキス、酵母エキ
ス、ペプトン等の天然栄養源を添加した一般的な培地を
用いる事ができる。
In order to use an aerobic coryneform bacterium in the method of the present invention, the cells can be used after culturing the cells under ordinary aerobic conditions. As a medium used for the culture, a medium usually used for culturing a microorganism can be used. For example, a general medium in which a natural nutrient such as meat extract, yeast extract, and peptone is added to a composition comprising inorganic salts such as ammonium sulfate, potassium phosphate, and magnesium sulfate can be used.

【0033】培養後の菌体は、遠心分離、膜分離等によ
って回収し、菌体をそのまま又は調製物として次に示す
反応に用いられる。ここでいう調製物とは、例えば、菌
体をアクリルアミド、カラギーナン等で固定化した固定
化菌体、菌体を破砕した破砕物、その遠心分離上清、ま
たその上清を硫安処理等で部分精製したPEPC活性を
有する画分等を指す。
The cells after the culture are recovered by centrifugation, membrane separation, etc., and the cells are used as they are or as a preparation in the following reactions. As used herein, the term "preparation" refers to, for example, immobilized cells obtained by immobilizing cells with acrylamide, carrageenan, etc., crushed cells obtained by crushing cells, centrifuged supernatant thereof, and partial treatment of the supernatant by ammonium sulfate treatment. Refers to purified fractions having PEPC activity.

【0034】反応液には、水、緩衝液、培地等が用いら
れるが、適当な無機塩を含有した培地が最も好ましい。
反応液には、例えばグルコース、エタノール等の有機原
料と炭酸イオン、重炭酸イオンまたは二酸化炭素ガスを
含有させ、嫌気的条件で反応させることが特徴である。
この場合の、有機原料としては、特に限定されることな
く、目的とする有機酸に応じて選択可能であり、一般的
な有機原料から選択できる。具体的には、安価であり、
目的の有機酸の生成速度の速いグルコースやエタノール
が好適に用いられる。この場合、グルコースの添加濃度
は、0.5g/l〜500g/lが好ましく、エタノー
ルの添加濃度は、0.5g/l〜30g/lが好まし
い。
As the reaction solution, water, a buffer, a medium and the like are used, and a medium containing a suitable inorganic salt is most preferable.
The reaction liquid is characterized by containing an organic raw material such as glucose or ethanol and carbonate ion, bicarbonate ion or carbon dioxide gas and reacting under anaerobic conditions.
In this case, the organic raw material is not particularly limited and can be selected according to the target organic acid, and can be selected from general organic raw materials. Specifically, it is inexpensive,
Glucose or ethanol, which has a high production rate of the target organic acid, is preferably used. In this case, the added concentration of glucose is preferably 0.5 g / l to 500 g / l, and the added concentration of ethanol is preferably 0.5 g / l to 30 g / l.

【0035】炭酸イオン、重炭酸イオンは、1mM〜5
00mM、好ましくは2〜300mM、さらに好ましく
は3〜200mMの濃度で添加する。二酸化炭素ガスを
含有させる場合は、溶液1L当たり50mg〜25g、
好ましくは100mg〜15g、さらに好ましくは15
0mg〜10gの二酸化炭素ガスを含有させる。
Carbonate and bicarbonate ions are 1 mM to 5 mM.
It is added at a concentration of 00 mM, preferably 2 to 300 mM, more preferably 3 to 200 mM. When carbon dioxide gas is contained, 50 mg to 25 g per liter of the solution,
Preferably 100 mg to 15 g, more preferably 15 mg
It contains 0 mg to 10 g of carbon dioxide gas.

【0036】また、嫌気的条件とは、溶液中の溶存酸素
濃度を低く抑えて反応させることを指す。この場合、溶
存酸素濃度として0〜2ppm、好ましくは0〜1pp
m、さらに好ましくは0〜0.5ppmで反応させるこ
とが望ましい。そのための方法としては、例えば容器を
密閉して無通気で反応させる、窒素ガス等の不活性ガス
を供給して反応させる、二酸化炭素ガス含有の不活性ガ
スを通気する等の方法を用いることができる。
The anaerobic condition means that the reaction is carried out while keeping the dissolved oxygen concentration in the solution low. In this case, the dissolved oxygen concentration is 0 to 2 ppm, preferably 0 to 1 pp.
m, more preferably 0 to 0.5 ppm. As a method therefor, for example, it is possible to use a method in which the container is sealed and reacted without ventilation, a method in which an inert gas such as nitrogen gas is supplied and reacted, or a method in which an inert gas containing carbon dioxide gas is ventilated. it can.

【0037】反応の温度は、通常15℃〜45℃、好ま
しくは25℃〜37℃で行う。pHは、5〜9、好まし
くは6〜8の範囲で行う。反応は、通常5時間から12
0時間行う。反応に用いる菌体の量は、とくに規定され
ないが、1g/l〜700g/l、好ましくは10g/
l〜500g/lさらに好ましくは20g/l〜400
g/lが用いられる。菌体の調製物を用いる場合は、上
記の量の菌体量に相当する量を用いることが好ましい。
The reaction is usually carried out at a temperature of 15 ° C. to 45 ° C., preferably 25 ° C. to 37 ° C. The pH is in the range of 5-9, preferably 6-8. The reaction is usually performed for 5 hours to 12 hours.
Perform for 0 hours. The amount of the cells used for the reaction is not particularly limited, but is from 1 g / l to 700 g / l, preferably 10 g / l.
1 to 500 g / l, more preferably 20 g / l to 400
g / l is used. When a preparation of bacterial cells is used, it is preferable to use an amount corresponding to the above amount of bacterial cells.

【0038】以上の様な方法で製造した有機酸は、必要
に応じて、反応液から通常の分離、精製方法で分離、精
製することができる。具体的には、限外ろ過膜分離、遠
心分離等により菌体及びその調製物と分離した後、カラ
ム法、晶析法等の公知の方法で精製し、乾燥させる事に
より、結晶として採取する方法等が挙げられる。
The organic acid produced by the above method can be separated and purified from the reaction solution by a usual separation and purification method, if necessary. Specifically, after separation from microbial cells and its preparation by ultrafiltration membrane separation, centrifugation, etc., purification is performed by a known method such as a column method or a crystallization method, and the crystals are collected by drying. Method and the like.

【0039】本発明で、製造の対象となる有機酸として
は、特に限定されるものではないが、本発明の効果から
は、酸素含有雰囲気で、好気性コリネ細菌又はその調製
物で効率的に製造できない化合物が特に好ましい。
In the present invention, the organic acid to be produced is not particularly limited. However, from the effects of the present invention, it is possible to efficiently use the aerobic coryneform bacterium or its preparation in an oxygen-containing atmosphere. Compounds which cannot be prepared are particularly preferred.

【0040】具体的には、有機カルボン酸が挙げられ、
より具体的にはコハク酸、リンゴ酸、フマル酸等が挙げ
られる。
Specific examples include organic carboxylic acids,
More specifically, succinic acid, malic acid, fumaric acid and the like can be mentioned.

【0041】以上に本発明を説明してきたが、下記の実
施例により更に具体的に説明する。しかしながら、実施
例は本発明の具体的な認識を得る一助とみなすべきのも
のであり、本発明の範囲を限定するものではないことを
理解すべきである。
The present invention has been described above, and will be described more specifically with reference to the following examples. It should be understood, however, that the examples are to be construed as helpful in obtaining a specific understanding of the invention and are not intended to limit the scope of the invention.

【0042】[0042]

【実施例】〔実施例1〕ブレビバクテリウム・フラバム
MJ-233株由来のPEPC遺伝子を含むDNA断片のク
ローン化 (A)ブレビバクテリウム・フラバム MJ-233株の全D
NAの抽出:A培地1L[組成: 尿素:4g、(NH
42SO4:14g,KH2PO4:0.5g、K2HPO
4:0.5g, MgSO4・7H2O:0.5g,FeS
4・7H2O:20mg,MnSO4・nH2O:20m
g、D−ビオチン:200μg、塩酸チアミン:100
μg、酵母エキス1g、カザミノ酸1g及び蒸留水:1
000ml(pH6.6)]にブレビバクテリウム・フ
ラバム MJ-233株を白金耳を用いて植菌し、を対数増殖
期後期まで30℃で培養し、菌体を集めた。
EXAMPLES [Example 1] Brevibacterium flavum
Cloning of DNA fragment containing PEPC gene derived from MJ-233 strain (A) Brevibacterium flavum All D of MJ-233 strain
Extraction of NA: 1 L of A medium [composition: urea: 4 g, (NH
4 ) 2 SO 4 : 14 g, KH 2 PO 4 : 0.5 g, K 2 HPO
4 : 0.5 g, MgSO 4 .7H 2 O: 0.5 g, FeS
O 4 · 7H 2 O: 20mg , MnSO 4 · nH 2 O: 20m
g, D-biotin: 200 μg, thiamine hydrochloride: 100
μg, yeast extract 1 g, casamino acid 1 g and distilled water: 1
000 ml (pH 6.6)] of Brevibacterium flavum strain MJ-233 using a platinum loop, and cultured at 30 ° C. until the late logarithmic growth phase to collect the cells.

【0043】ブレビバクテリウム・フラバム MJ-233
は、1975年4月28日に、通商産業省工業技術院生
命工学工業技術研究所(日本国茨城県つくば市東1丁目
1番3号、郵便番号305)に受託番号FERM P−30
68として寄託され、1981年5月1日にブダペスト
条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERMB
P−1497が付与されている。
Brevibacterium flavum MJ-233
On April 28, 1975, the accession number FERM P-30 was sent to the Institute of Biotechnology and Industrial Technology, the Ministry of International Trade and Industry, 1-3-1 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japan.
No. 68 and transferred to an international deposit under the Budapest Treaty on May 1, 1981, with accession number FERMB.
P-1497 has been assigned.

【0044】得られた菌体を10mg/mlの濃度にな
るよう、10mg/ml リゾチーム、10mM Na
Cl、20mMトリス緩衝液(pH8.0)及び1mM
EDTA・2Naの各成分を含有する溶液15ml
(各成分の濃度は最終濃度である)に懸濁した。次にプ
ロテナーゼKを最終濃度が100μg/mlになるよう
に添加し、37℃で1時間保温した。さらにドデシル硫
酸ナトリウム(SDS)を最終濃度が0.5%になるよ
うに添加し、50℃で6時間保温して溶菌した。この溶
菌液に、等量のフェノール/クロロホルム溶液を添加
し、室温で10分間ゆるやかに振盪した後、全量を遠心
分離(5,000×g, 20分間,10〜12℃)し、
上清画分を分取した。この上清に酢酸ナトリウムを0.
3Mとなるよう添加した後、2倍量のエタノールをゆっ
くりと加えた。水層とエタノール層の間に存在するDN
Aをガラス棒でまきとり、70%エタノールで洗浄した
後、風乾した。得られたDNAに10mMトリス緩衝液
(pH7.5)−1mMEDTA・2Na溶液5mlを
加え、4℃で一晩静置し、以後の実験に用いた。
The obtained bacterial cells were adjusted to a concentration of 10 mg / ml with 10 mg / ml lysozyme and 10 mM Na.
Cl, 20 mM Tris buffer (pH 8.0) and 1 mM
15ml of solution containing each component of EDTA ・ 2Na
(The concentration of each component is the final concentration). Next, proteinase K was added to a final concentration of 100 μg / ml, and the mixture was kept at 37 ° C. for 1 hour. Further, sodium dodecyl sulfate (SDS) was added to a final concentration of 0.5%, and the mixture was incubated at 50 ° C. for 6 hours to lyse the cells. To this lysate, an equal amount of a phenol / chloroform solution was added, and the mixture was gently shaken at room temperature for 10 minutes, followed by centrifugation (5,000 × g, 20 minutes, 10 to 12 ° C.).
The supernatant fraction was collected. Sodium acetate was added to the supernatant at 0.
After addition to 3 M, 2 volumes of ethanol were slowly added. DN existing between water layer and ethanol layer
A was wiped off with a glass rod, washed with 70% ethanol, and air-dried. To the obtained DNA was added 5 ml of a 10 mM Tris buffer (pH 7.5) -1 mM EDTA · 2Na solution, and the mixture was allowed to stand at 4 ° C. overnight, and used for the subsequent experiments.

【0045】(B)ブレビバクテリウム・フラバム MJ-
233株株由来のPEPC遺伝子を含むDNA断片のクロ
ーン化及び組換え体の創製 上記(A)項で得たブレビバクテリウム・フラバム MJ-
233の全DNA溶液の90μlを制限酵素SalI 50
U(units)を用い、37℃で1時間反応させ完全
分解した。このSalI分解DNAに、クローニングベ
クターpUC118(宝酒造製)を制限酵素SalIで
切断した後脱リン酸化処理したものを混合し、50mM
トリス緩衝液(pH7.6)、10mMジチオスレイト
ール、1mM ATP、10mM MgCl2 、及びT
4DNAリガーゼ1Uの各成分を添加し(各成分の濃度
は最終濃度である)、4℃で15時間反応させ、両者を
結合させた。
(B) Brevibacterium flavum MJ-
Cloning of DNA fragment containing PEPC gene derived from 233 strains and creation of recombinants Brevibacterium flavum MJ- obtained in section (A) above
90 μl of the total DNA solution of 233 was subjected to restriction enzyme SalI 50
U (units) was used and reacted at 37 ° C. for 1 hour to completely decompose. This SalI-degraded DNA was mixed with a cloning vector pUC118 (manufactured by Takara Shuzo) which had been cut with the restriction enzyme SalI and then dephosphorylated, and mixed with 50 mM
Tris buffer (pH 7.6), 10 mM dithiothreitol, 1 mM ATP, 10 mM MgCl2, and T
Each component of 1 U of 4DNA ligase was added (the concentration of each component was the final concentration), and the mixture was reacted at 4 ° C. for 15 hours to bind both components.

【0046】得られたプラスミド混液を用い、塩化カル
シウム法〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロ
ジー(J. Molecul. Biol. )、53、159(1970)〕によ
りエシェリヒア・コリJM109(宝酒造製)を形質転
換し、アンピシリン 50mgを含む培地〔トリプトン
10g、酵母エキス 5g、NaCl 5g及び寒天16
gを蒸留水1Lに溶解〕に塗抹した。
The resulting plasmid mixture was used to transform Escherichia coli JM109 (Takara Shuzo) by the calcium chloride method [Journal of Molecular Biology (J. Molecul. Biol.), 53, 159 (1970)]. After conversion, a medium containing 50 mg of ampicillin [tryptone
10 g, yeast extract 5 g, NaCl 5 g and agar 16
g in 1 L of distilled water].

【0047】この培地上の生育株を常法〔モレキュラー
・クローニング(Molecular cloning)、Cold Spring Ha
rbor Laboratory Press(1989)〕により液体培養し、
培養液よりプラスミドDNAを抽出し、該プラスミド
を、制限酵素SalIにより切断し、0.7%アガロー
スゲルを用いて電気泳動を行った。このアガロースゲル
よりDNAをナイロン膜上に移し取り、エシェリヒア・
コリ及びトウモロコシ由来PEPC遺伝子の共通領域を
プローブとしてサザンハイブリダイゼーションを行っ
た。用いたプローブは、
The strain grown on this medium is subjected to a conventional method [Molecular cloning, Cold Spring Ha
rbor Laboratory Press (1989)]
Plasmid DNA was extracted from the culture solution, the plasmid was cut with a restriction enzyme SalI, and electrophoresis was performed using a 0.7% agarose gel. The DNA was transferred from this agarose gel onto a nylon membrane, and
Southern hybridization was performed using, as a probe, a common region of the PEPC gene derived from Escherichia coli and maize. The probe used was

【0048】エシェリヒア・コリ、トウモロコシ由来の
PEPC遺伝子から推定されるアミノ酸配列のうち特に
相同性の高い領域に注目し、そのアミノ酸配列(配列番
号3及び配列番号4)より推定される混合オリゴヌクレ
オチドプローブ(配列番号1及び配列番号2)を用い
た。このオリゴヌクレオチドは、アプライド・バイオシ
ステムズ(Applied Biosystems)社製394型DNA/
RNAシンセサイザーを用いて合成した。なお、プロー
ブの合成にあたっては、混合の度合いが著しくなりすぎ
ぬようにデオキシイノシンを用いた。
A mixed oligonucleotide probe deduced from the amino acid sequence (SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4) focusing on a region having a particularly high homology among the amino acid sequences deduced from the PEPC gene derived from Escherichia coli and maize (SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2) were used. This oligonucleotide was obtained from Applied Biosystems 394 DNA /
It was synthesized using an RNA synthesizer. In synthesizing the probe, deoxyinosine was used so that the degree of mixing did not become excessive.

【0049】合成した上記オリゴヌクレオチドプローブ
をT4ポリヌクレオチドキナーゼ(宝酒造製)を用いる
手法〔アナリティカル・バイオケミストリー(Anal. Bi
ochem.)、158 、307 〜315 (1986)〕で、5’末端リン
酸基を〔γ-32P〕ATPでラジオアイソトープラベル
した。サザンハイブリダイゼーションは、常法〔モレキ
ュラー・クローニング(Molecular Cloning ) 、 Cold
Spring Harbor Laboratory Press (1989)〕に従って行
った。
A method using T4 polynucleotide kinase (manufactured by Takara Shuzo) [Analytical Biochemistry (Anal. Bi.)
ochem.), 158, 307-315 (1986)], and the 5 'terminal phosphate group was radioisotope labeled with [γ- 32 P] ATP. Southern hybridization can be performed by a conventional method (Molecular Cloning, Cold
Spring Harbor Laboratory Press (1989)].

【0050】この結果、制限酵素SalI分解物の大き
さが約3.3kbのDNA断片のみ上記プローブとハイ
ブリダイズすることが判明し、該DNA断片中にPEP
C遺伝子が含まれることが明らかとなった。この大きさ
が約3.3kbのDNA断片を保有する本プラスミドを
pUC118−ppcと命名した。
As a result, it was found that only a DNA fragment having a size of about 3.3 kb of the digestion product of restriction enzyme SalI hybridized with the above probe, and PEP was contained in the DNA fragment.
It was revealed that the C gene was included. This plasmid having a DNA fragment of about 3.3 kb in size was designated as pUC118-ppc.

【0051】以上によりPEPC遺伝子DNAを含む大
きさが約3.3kbのDNA断片(SalI断片)を得
ることができた。
Thus, a DNA fragment (SalI fragment) having a size of about 3.3 kb and containing the PEPC gene DNA was obtained.

【0052】(C)PEPC遺伝子の塩基配列の決定 上記(C)で得られた挿入DNA断片を制限酵素Sau
3AIを用いて37℃で処理して部分分解した。また、
pUC118ベクター(宝酒造製)を制限酵素BamH
Iで完全に分解した。得られたベクターDNA断片と部
分分解DNA断片とを混合し、この混合液に、それぞれ
最終濃度が、50mM トリス−塩酸緩衝液(pH7.
9),10mM MgCl2 ,20mM ジチオスレイ
トール,1mM ATP,T4DNAリガーゼ 1un
it/50μlとなるように各成分を添加し、ベクター
DNA断片と部分分解DNA断片とを結合させた。
(C) Determination of the base sequence of PEPC gene The inserted DNA fragment obtained in the above (C) was digested with the restriction enzyme Sau.
Treatment at 37 ° C. with 3AI partially decomposed. Also,
The pUC118 vector (Takara Shuzo) was replaced with the restriction enzyme BamH.
I completely decomposed. The obtained vector DNA fragment and the partially degraded DNA fragment are mixed, and the final concentration of each mixture is 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.0).
9), 10 mM MgCl 2 , 20 mM dithiothreitol, 1 mM ATP, T4 DNA ligase 1un
Each component was added to make it / 50 μl to bind the vector DNA fragment and the partially degraded DNA fragment.

【0053】同様に(C)で得られた挿入DNA断片を
制限酵素TacIを用いて37℃で処理して部分分解し
た。また、pUC118ベクター(宝酒造製)を制限酵
素AccIで完全に分解した。得られたベクターDNA
断片と部分分解DNA断片とを混合し、この混合液に、
それぞれ最終濃度が、50mM トリス−塩酸緩衝液
(pH7.9),10mM MgCl2 ,20mM ジ
チオスレイトール,1mM ATP,T4DNAリガー
ゼ 1unit/50μlとなるように各成分を添加
し、ベクターDNA断片と部分分解DNA断片とを結合
させた。
Similarly, the inserted DNA fragment obtained in (C) was partially digested by treatment with a restriction enzyme TacI at 37 ° C. The pUC118 vector (Takara Shuzo) was completely digested with the restriction enzyme AccI. Obtained vector DNA
The fragment and the partially degraded DNA fragment are mixed, and
Each component was added to a final concentration of 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.9), 10 mM MgCl 2 , 20 mM dithiothreitol, 1 mM ATP, T4 DNA ligase 1 unit / 50 μl, and the vector DNA fragment was partially digested. The DNA fragment was ligated.

【0054】ついで、常法[J. Mol. Biol., 53, 159(1
970)参照]に従って、得られた溶液を各々用いて大腸菌
JM109(宝酒造製)を形質転換した。得られた形質
転換菌を選択培地[組成:トリプトン 10g,酵母エ
キス 5g,NaCl 5g,寒天 15g,アンピシリ
ン 50mgを蒸留水に溶解して1Lとする]に塗抹
し、37℃で16時間培養した。
Then, a conventional method [J. Mol. Biol., 53, 159 (1
970)], Escherichia coli JM109 (Takara Shuzo) was transformed using each of the obtained solutions. The obtained transformant was spread on a selection medium [composition: 10 g of tryptone, 5 g of yeast extract, 5 g of NaCl, 15 g of agar, and 50 mg of ampicillin in distilled water to make 1 L], and cultured at 37 ° C for 16 hours.

【0055】選択培地上に生育した菌株を、アンピシリ
ンを最終濃度で50μg/ml含有するL培養液[トリプト
ン 10g,酵母エキス 5g,NaCl 5gを蒸留水
に溶解して1Lとする]に植菌し、これを37℃で7時
間培養した。培養液を4℃で10分間8,000×gの
遠心分離にかけて菌体を回収した。回収した菌体からア
ルカリ−SDS法[T. Maniatis, E. F. Fritsch, J. S
ambrook, Molecular cloning, p.90-91(1982)参照]に
よりプラスミドを抽出した。
The strain grown on the selection medium was inoculated into an L culture containing ampicillin at a final concentration of 50 μg / ml [10 g of tryptone, 5 g of yeast extract, and 5 g of NaCl dissolved in distilled water to make 1 L]. This was cultured at 37 ° C. for 7 hours. The culture was centrifuged at 8,000 × g for 10 minutes at 4 ° C. to collect the cells. From the recovered cells, an alkali-SDS method [T. Maniatis, EF Fritsch, J. S.
Ambrook, Molecular cloning, p. 90-91 (1982)].

【0056】抽出したプラスミドDNAを用いて、ベク
ターpUC118に挿入されたDNA断片の塩基配列を
決定した。pUC118に挿入されたDNA断片の塩基
配列の決定には、パーキン・エルマー社製のダイプライ
マーサイクルシーケンスキットを用いて行った。そし
て、これらの決定された個々の配列の連結を、パーキン
・エルマー社製のシークエンス解析ソフト オートアッ
センブラー(Autoassembler)を用いて行
った。その結果、上記(B)で得られた3.3kbの挿
入SalIDNA断片には、既知のエシェリヒア・コリ
由来のPEPCタンパク質と高い相同性を持つタンパク
質をコードする遺伝子(配列番号5記載に記載するオー
プン・リーディング・フレーム)を含有していることが
判明した。
Using the extracted plasmid DNA, the nucleotide sequence of the DNA fragment inserted into the vector pUC118 was determined. The base sequence of the DNA fragment inserted into pUC118 was determined using a dye primer cycle sequence kit manufactured by Perkin-Elmer. Then, these determined individual sequences were linked using a sequence analysis software Autoassembler (Autoassembler) manufactured by Perkin-Elmer. As a result, the inserted SalI DNA fragment of 3.3 kb obtained in the above (B) contains a gene encoding a protein having a high homology with a known PEPC protein derived from Escherichia coli (open DNA described in SEQ ID NO: 5).・ Leading frame).

【0057】〔実施例2〕PEPC遺伝子DNAの発現
の確認 実施例1の(B)項で得られたPEPC遺伝子を含む約
3.3kbのDNA断片が挿入されたプラスミドpUC
118−ppcを用い、塩化カルシウム法によりPEP
C遺伝子欠損変異株であるエシェリヒア・コリCGSC
#3594株[Genetics, 51, 167 (1965)]を形質転換
し、アンピシリン 50μg/mlを含む最少培地[組
成:KH2PO4 2g, K2HPO4 7g, (NH4)2SO4 1g, MgSO4・7H2O
0.1g, L-スレオニン 50mg, L-ロイシン 50mg, L-ヒス
チジン 50mg, L-アルギニン 50mg,チアミン塩酸塩 10m
g, グルコース 2g, 寒天 15g, 蒸留水 1L]に塗末し、
相補試験を行った。同時に対照として挿入遺伝子を含ま
ないプラスミドpUC118を用いて、同様に上記欠損
変異株を形質転換した。
Example 2 Confirmation of Expression of PEPC Gene DNA Plasmid pUC into which an approximately 3.3 kb DNA fragment containing the PEPC gene obtained in section (B) of Example 1 was inserted
PEP by 118-ppc by calcium chloride method
Escherichia coli CGSC, a C gene-deficient mutant
# 3594 strain [Genetics, 51, 167 (1965 )] was transformed, minimal medium [composition containing ampicillin 50μg / ml: KH 2 PO 4 2g, K 2 HPO 4 7g, (NH 4) 2 SO 4 1g, MgSO 4 · 7H 2 O
0.1g, L-threonine 50mg, L-leucine 50mg, L-histidine 50mg, L-arginine 50mg, thiamine hydrochloride 10m
g, glucose 2g, agar 15g, distilled water 1L]
A complementation test was performed. At the same time, the above-described deletion mutant was similarly transformed using a plasmid pUC118 containing no inserted gene as a control.

【0058】その結果、上記約3.3kbのDNA断片
を含むプラスミドが導入された形質転換体のみが培地上
に生育することが観察され、PEPC遺伝子が発現して
いることが確認された。
As a result, it was observed that only the transformant into which the plasmid containing the above-mentioned DNA fragment of about 3.3 kb was introduced grows on the medium, and it was confirmed that the PEPC gene was expressed.

【0059】〔実施例3〕PEPC遺伝子によるコリネ
型細菌組み換え体の作製 (A)シャトルベクターの構築 特開平3−210184号公報に記載のプラスミドpC
RY30内に存在する、コリネ型細菌内でのプラスミド
の安定化に必要な領域の配列をもとに、下記の1対のプ
ライマーを、アプライド・バイオシステムズ(Applied
Biosystems)社製「394 DNA/RNAシンセサイ
ザー(synthesizer)」を用いて合成した。
[Example 3] Preparation of recombinant coryneform bacterium using PEPC gene (A) Construction of shuttle vector Plasmid pC described in JP-A-3-210184
Based on the sequence of the region required for stabilizing the plasmid in coryneform bacteria present in RY30, the following pair of primers was used to apply Applied Biosystems (Applied Biosystems).
Biosystems, Inc. "394 DNA / RNA synthesizer" (synthesizer).

【0060】(a−1)5'-TTT CTC GAG CGC ATT ACC T
CC TTG CTA CTG-3'(配列番号6) (b−1)5'-TTT GAA TTC GAT ATC AAG CTT GCA CAT C
AA-3'(配列番号7)
(A-1) 5'-TTT CTC GAG CGC ATT ACC T
CC TTG CTA CTG-3 '(SEQ ID NO: 6) (b-1) 5'-TTT GAA TTC GAT ATC AAG CTT GCA CAT C
AA-3 '(SEQ ID NO: 7)

【0061】上記プラスミドpCRY30は、次のよう
にして構築されたプラスミドである。ブレビバクテリウ
ム・スタチオニス(Brevibacterium s
tationis) IFO12144(工業技術院生
命工学工業技術研究所にFERM BP−2515の受
託番号で寄託されている)からプラスミドpBY503
(このプラスミドの詳細については特開平1−9578
5号公報参照)DNAを抽出し、制限酵素XhoIで大
きさが約4.0kbのプラスミドの複製増殖機能を司る
遺伝子を含むDNA断片(複製領域)を切り出し、制限
酵素EcoRIおよびKpnIで大きさが約2.1kb
のプラスミドの安定化機能を司る遺伝子を含むDNA断
片(安定化領域)を切り出す。これらの両DNA断片を
プラスミドpHSG298(宝酒造製)のEcoRI−
KpnI部位及びSalI部位にそれぞれ組み込むこと
により、プラスミドベクターpCRY30を調製するこ
とができる。
The above plasmid pCRY30 is a plasmid constructed as follows. Brevibacterium s stationis
plasmid pBY503 from IFO12144 (deposited with the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology under the accession number FERM BP-2515).
(For details of this plasmid, see JP-A-1-9578.
No. 5) DNA was extracted, a DNA fragment (replication region) containing a gene responsible for the replication growth function of a plasmid having a size of about 4.0 kb was cut out with a restriction enzyme XhoI, and the size was cut with restriction enzymes EcoRI and KpnI. About 2.1kb
A DNA fragment (stabilizing region) containing the gene responsible for the stabilizing function of the plasmid is cut out. Both of these DNA fragments were ligated with the plasmid pHSG298 (Takara Shuzo) using EcoRI-
Plasmid vector pCRY30 can be prepared by incorporating it into the KpnI site and the SalI site, respectively.

【0062】実際のPCRは、パーキンエルマーシータ
ス社製の「DNAサーマルサイクラー」を用い、反応試
薬として、レコンビナント・タックDNA・ポリメラー
ゼ・タカラ・タック(Recombinant TaqDNA Polymerase
TaKaRa Taq)(宝酒造製)を用いて下記の条件で行っ
た。
The actual PCR was performed using "DNA Thermal Cycler" manufactured by Perkin Elmer Cetus, and using Recombinant Taq DNA Polymerase as a reaction reagent.
TaKaRa Taq) (manufactured by Takara Shuzo) under the following conditions.

【0063】 反応液: (10×)PCR緩衝液 10μl 1.25mM dNTP混合液 16μl 鋳型DNA 10μl(DNA 含有量 1μM以下) 上記記載のa−1,b−1プライマー 各々1μl(最終濃度0.25μM ) レコンビナント・タックDNA・ポリメラーゼ 0.5μl 滅菌蒸留水 61.5μl 以上を混合し、この100μlの反応液をPCRにかけ
た。
Reaction solution: (10 ×) PCR buffer 10 μl 1.25 mM dNTP mixture 16 μl template DNA 10 μl (DNA content 1 μM or less) 1 μl each of the above-mentioned a-1 and b-1 primers (final concentration 0.25 μM) ) 0.5 μl of recombinant tack DNA polymerase and 61.5 μl of sterile distilled water were mixed, and 100 μl of the reaction solution was subjected to PCR.

【0064】PCRサイクル: デナチュレーション過程:94℃ 60秒 アニーリング過程 :52℃ 60秒 エクステンション過程 :72℃ 120秒PCR cycle: Denaturation process: 60 seconds at 94 ° C. Annealing process: 60 seconds at 52 ° C. Extension process: 120 seconds at 72 ° C.

【0065】以上を1サイクルとし、25サイクル行っ
た。上記で生成した反応液10μlを0.8%アガロー
スゲルにより電気泳動を行い、約1.1kbのDNA断
片が検出できた。
The above was regarded as one cycle, and 25 cycles were performed. 10 μl of the reaction solution produced above was subjected to electrophoresis on a 0.8% agarose gel, and a DNA fragment of about 1.1 kb was detected.

【0066】上記で増幅産物を確認できた反応液 10
μl、プラスミドpBluescriptIISK+
1μlを、各々制限酵素EcoRIおよびXhoIで完
全に切断し、70℃で10分間処理させることにより制
限酵素を失活させた後、両者を混合し、これに、T4 D
NAリガーゼ10×緩衝液 1μl、T4 DNAリガー
ゼ1unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10μl
にして、15℃で3時間反応させ、結合させた。
The reaction solution 10 in which the amplification product was confirmed above
μl, plasmid pBluescriptIISK +
1 μl was completely digested with restriction enzymes EcoRI and XhoI, respectively, and treated at 70 ° C. for 10 minutes to inactivate the restriction enzymes. Then, both were mixed, and T4D was added thereto.
Add 1 μl of NA ligase 10 × buffer, 1 unit of T4 DNA ligase, and add 10 μl of sterile distilled water.
And allowed to react at 15 ° C. for 3 hours for binding.

【0067】得られたプラスミド混液を用い、塩化カル
シウム法〔Journal of MolecularBiology, 53, 159(197
0)〕によりエシェリヒア・コリJM109(宝酒造製)
を形質転換し、アンピシリン 50mgを含む培地〔ト
リプトン 10g、イーストエキストラクト 5g、Na
Cl 5g及び寒天 16gを蒸留水1Lに溶解〕に塗抹
した。
Using the resulting plasmid mixture, the calcium chloride method [Journal of Molecular Biology, 53, 159 (197
0)] by Escherichia coli JM109 (Takara Shuzo)
And a medium containing 50 mg of ampicillin [10 g of tryptone, 5 g of yeast extract,
Dissolve 5 g of Cl and 16 g of agar in 1 L of distilled water].

【0068】この培地上の生育株を常法により液体培養
し、培養液よりプラスミドDNAを抽出し、該プラスミ
ドを制限酵素(EcoRI,XhoI)により切断し、
挿入断片を確認した。この結果、プラスミドpBlue
scriptIISK+の長さ3.0kbのDNA断片
に加え、長さ1.1kbの挿入DNA断片が認められ
た。本プラスミドをpBSparと命名した。
The strain grown on this medium was subjected to liquid culture by a conventional method, a plasmid DNA was extracted from the culture, and the plasmid was cut with restriction enzymes (EcoRI, XhoI).
The insert was confirmed. As a result, the plasmid pBlue
In addition to the 3.0 kb long DNA fragment of the scriptIISK +, an inserted DNA fragment of 1.1 kb in length was observed. This plasmid was designated as pBSpar.

【0069】米国特許5,185,262号明細書記載
のプラスミドpCRY31内に存在する、コリネ型細菌
内でのプラスミドの複製に必要な領域の配列をもとに、
下記の1対のプライマーを、アプライド・バイオシステ
ムズ(Applied Biosystems)社製「394 DNA/R
NAシンセサイザー(synthesizer )」を用いて合成し
た。
Based on the sequence of the region required for plasmid replication in coryneform bacteria, which is present in plasmid pCRY31 described in US Pat. No. 5,185,262,
The following pair of primers was applied to Applied Biosystems' “394 DNA / R
The synthesis was carried out using an "NA synthesizer".

【0070】(a−2)5'-TTT GGT ACC GAC TTA GAT A
AA GGT CTA-3'(配列番号8) (b−2)5'-TTT CTC GAG TGC TGG TAA AAC AAC TTT-
3'(配列番号9)
(A-2) 5'-TTT GGT ACC GAC TTA GAT A
AA GGT CTA-3 '(SEQ ID NO: 8) (b-2) 5'-TTT CTC GAG TGC TGG TAA AAC AAC TTT-
3 '(SEQ ID NO: 9)

【0071】上記プラスミドpCRY31は、次のよう
にして構築されたプラスミドである。前記pBY503
由来の複製領域とプラスミドpHSG398(宝酒造
製)とを連結したプラスミドpCRY3(このプラスミ
ドを保持するブレビバクテリウム・フラバム MJ233 GE1
02は、FERM BP−2513として工業技術院生命
工学工業技術研究所に寄託されている)をKpnIで部
分分解してDNA断片を得る。一方、pBY503をブ
レビバクテリウム・ラクトファーメンタムIFO121
44(FERM BP−2515)から調製し、Kpn
Iで完全分解し、約7kbのDNA断片を精製する。こ
れらのDNA断片を連結し、各種制限酵素で切断したと
きに下記表に示す切断パターンを示すプラスミドを選択
することによって、pCRY31が得られる。
The above plasmid pCRY31 is a plasmid constructed as follows. The pBY503
Plasmid pCRY3 (Brevibacterium flavum MJ233 GE1 carrying this plasmid) in which a replication region of origin and plasmid pHSG398 (Takara Shuzo) are linked.
02 is deposited as FERM BP-2513 with the National Institute of Biotechnology and Industrial Technology) with KpnI to obtain a DNA fragment. On the other hand, pBY503 was replaced with Brevibacterium lactofermentum IFO121.
44 (FERM BP-2515), and Kpn
The DNA fragment is completely digested with I, and a DNA fragment of about 7 kb is purified. These DNA fragments are ligated and pCRY31 can be obtained by selecting a plasmid that shows the cleavage pattern shown in the following table when digested with various restriction enzymes.

【0072】[0072]

【表1】 ────────────────────── 制限酵素 認識部位数 断片の長さ(kb) ────────────────────── KpnI 3 7.0, 6.0, 2.2 SauI 2 10.0, 5.2 PstI 2 13.0, 2.2 BamHI 1 15.2 ──────────────────────[Table 1] 数 Number of recognition sites for restriction enzymes Length of fragment (kb) ──────────── ────────── KpnI 3 7.0, 6.0, 2.2 SauI 2 10.0, 5.2 PstI 2 13.0, 2.2 BamHI 1 15.2 ──────────────────── ──

【0073】実際のPCRは、パーキンエルマーシータ
ス社製の「DNAサーマルサイクラー」を用い、反応試
薬として、レコンビナント・タックDNA・ポリメラー
ゼ・タカラ・タック(Recombinant TaqDNA Polymerase
TaKaRa Taq)(宝酒造製)を用いて下記の条件で行っ
た。
The actual PCR was performed using "DNA Thermal Cycler" manufactured by Perkin Elmer Cetus, and using Recombinant Taq DNA Polymerase as a reaction reagent.
TaKaRa Taq) (manufactured by Takara Shuzo) under the following conditions.

【0074】 反応液: (10×)PCR緩衝液 10μl 1.25mM dNTP混合液 16μl 鋳型DNA 10μl(DNA 含有量 1μM以下) 上記記載のa−2,b−2プライマー 各々1μl(最終濃度0.25μM ) レコンビナント・タックDNA・ポリメラーゼ 0.5μl 滅菌蒸留水 61.5μl 以上を混合し、この100μlの反応液をPCRにかけ
た。
Reaction solution: (10 ×) PCR buffer 10 μl 1.25 mM dNTP mixture 16 μl Template DNA 10 μl (DNA content 1 μM or less) 1 μl each of the above-mentioned a-2 and b-2 primers (final concentration 0.25 μM) ) 0.5 μl of recombinant tack DNA polymerase and 61.5 μl of sterile distilled water were mixed, and 100 μl of the reaction solution was subjected to PCR.

【0075】PCRサイクル: デナチュレーション過程:94℃ 60秒 アニーリング過程 :52℃ 60秒 エクステンション過程 :72℃ 120秒PCR cycle: Denaturation step: 94 ° C. for 60 seconds Annealing step: 52 ° C. for 60 seconds Extension step: 72 ° C. for 120 seconds

【0076】以上を1サイクルとし、25サイクル行っ
た。上記で生成した反応液10μlを0.8%アガロー
スゲルにより電気泳動を行い、約1.8kbのDNA断
片が検出できた。
The above was regarded as one cycle, and 25 cycles were performed. 10 μl of the reaction solution generated above was subjected to electrophoresis on a 0.8% agarose gel, and a DNA fragment of about 1.8 kb was detected.

【0077】上記で増幅産物を確認できた反応液10μ
l、プラスミドpBSpar 1μlを各々制限酵素X
hoIおよびKpnIで完全に切断し、70℃10分処
理させることにより制限酵素を失活させた後、両者を混
合し、T4 DNAリガーゼ10×)緩衝液 1μl、T
4 DNAリガーゼ1unitの各成分を添加し、滅菌蒸
留水で10μlにして、15℃で3時間反応させ、結合
させた。
The reaction solution (10 μm) in which the amplification product was confirmed above
l, 1 μl of plasmid pBSpar was added to each restriction enzyme X
After complete digestion with hoI and KpnI and treatment at 70 ° C. for 10 minutes to inactivate the restriction enzymes, the two were mixed and 1 μl of T4 DNA ligase buffer (1 μl,
4 Each component of 1 unit of DNA ligase was added, adjusted to 10 μl with sterilized distilled water, reacted at 15 ° C. for 3 hours, and bound.

【0078】得られたプラスミド混液を用い、塩化カル
シウム法〔Journal of MolecularBiology、53、15
9(1970)〕によりエシェリヒア・コリJM109
(宝酒造製)を形質転換し、アンピシリン 50mgを
含む培地〔トリプトン 10g、イーストエキストラク
ト 5g、NaCl 5g及び寒天 16gを蒸留水1L
に溶解〕に塗抹した。
Using the resulting plasmid mixture, the calcium chloride method [Journal of Molecular Biology, 53, 15
9 (1970)] by Escherichia coli JM109
(Manufactured by Takara Shuzo), and a medium containing 50 mg of ampicillin [10 g of tryptone, 5 g of yeast extract, 5 g of NaCl, and 16 g of agar was added to 1 L of distilled water.
Dissolved in).

【0079】この培地上の生育株を常法により液体培養
し、培養液よりプラスミドDNAを抽出し、該プラスミ
ドを制限酵素(XhoI,KpnI)により切断し、挿
入断片を確認した。この結果、プラスミドpBSpar
の長さ4.1kbのDNA断片に加え、長さ1.8kb
の挿入DNA断片が認められた。本プラスミドをpBS
par−repと命名した。
The strain grown on this medium was subjected to liquid culture by a conventional method, plasmid DNA was extracted from the culture solution, and the plasmid was cut with restriction enzymes (XhoI, KpnI) to confirm the inserted fragment. As a result, plasmid pBSpar
In addition to a 4.1 kb long DNA fragment, a 1.8 kb long
Of the inserted DNA fragment was observed. Transfer this plasmid to pBS
It was named par-rep.

【0080】上記で作製したプラスミドpBSpar−
rep 1μl、pHSG298(宝酒造社製) 1μl
を各々制限酵素KpnIおよびEcoRIで完全に切断
し、70℃で10分処理させることにより制限酵素を失
活させた後、両者を混合し、これに、T4 DNAリガー
ゼ10×緩衝液 1μl、T4 DNAリガーゼ1uni
tの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10μlにして、1
5℃で3時間反応させ、結合させた。
The plasmid pBSpar-
rep 1μl, pHSG298 (Takara Shuzo) 1μl
Was completely cleaved with restriction enzymes KpnI and EcoRI, respectively, and treated at 70 ° C. for 10 minutes to inactivate the restriction enzymes. Then, the two were mixed, and 1 μl of T4 DNA ligase 10 × buffer, 1 μl of T4 DNA Ligase 1uni
t), add 10 μl with sterile distilled water, and add 1
The reaction was allowed to proceed at 5 ° C. for 3 hours for binding.

【0081】得られたプラスミド混液を用い、塩化カル
シウム法〔Journal of MolecularBiology、53、15
9(1970)〕によりエシェリヒア・コリJM109
(宝酒造製)を形質転換し、カナマイシン 50mgを
含む培地〔トリプトン 10g、イーストエキストラク
ト 5g、NaCl 5g及び寒天 16gを蒸留水1L
に溶解〕に塗抹した。
Using the resulting plasmid mixture, the calcium chloride method [Journal of Molecular Biology, 53, 15
9 (1970)] by Escherichia coli JM109
(Manufactured by Takara Shuzo), and a medium containing 50 mg of kanamycin [10 g of tryptone, 5 g of yeast extract, 5 g of NaCl and 16 g of agar were mixed with 1 L of distilled water.
Dissolved in).

【0082】この培地上の生育株を常法により液体培養
し、培養液よりプラスミドDNAを抽出し、該プラスミ
ドを制限酵素により切断し、挿入断片を確認した。この
結果、プラスミドpHSG298の長さ2.6kbのD
NA断片に加え、長さ2.9kbの挿入DNA断片が認
められた。本プラスミドをpHSG298par−re
pと命名した。
The strain grown on this medium was subjected to liquid culture by a conventional method, plasmid DNA was extracted from the culture, and the plasmid was cut with restriction enzymes to confirm the inserted fragment. This resulted in a plasmid pHSG298 with a 2.6 kb D
In addition to the NA fragment, an inserted DNA fragment of 2.9 kb in length was observed. This plasmid was transferred to pHSG298par-re.
It was named p.

【0083】(B)tacプロモーターの挿入 tacプロモーターを含有するプラスミドpTrc99
A(ファルマシア社製)を鋳型としたPCR法により、
tacプロモーター断片を増幅させるべく、下記の1対
のプライマーを、アプライド・バイオシステムズ(Appl
ied Biosystems)社製「394 DNA/RNAシンセ
サイザー(synthesizer )」を用いて合成した。
(B) Insertion of tac promoter Plasmid pTrc99 containing tac promoter
A (manufactured by Pharmacia) as a template by PCR
In order to amplify the tac promoter fragment, the following pair of primers were applied to Applied Biosystems (Appl.
It was synthesized using "394 DNA / RNA synthesizer" (ied Biosystems).

【0084】 (a−3)5'-TTT GGT ACC GAT AGC TTA CTC CCC ATC CCC-3'(配列番号10) (b−3)5'-TTT GGA TCC CAA CAT ATG AAC ACC TCC TTT TTA TCC GCT CAC AAT TCC ACA CAT-3'(配列番号11)(A-3) 5′-TTT GGT ACC GAT AGC TTA CTC CCC ATC CCC-3 ′ (SEQ ID NO: 10) (b-3) 5′-TTT GGA TCC CAA CAT ATG AAC ACC TCC TTT TTA TCC GCT CAC AAT TCC ACA CAT-3 '(SEQ ID NO: 11)

【0085】実際のPCRは、パーキンエルマーシータ
ス社製の「DNAサーマルサイクラー」を用い、反応試
薬として、レコンビナント・タックDNA・ポリメラー
ゼ・タカラ・タック(Recombinant TaqDNA Polymerase
TaKaRa Taq)(宝酒造製)を用いて下記の条件で行っ
た。
The actual PCR was carried out using "DNA Thermal Cycler" manufactured by Perkin Elmer Cetas, and using Recombinant Taq DNA Polymerase as a reaction reagent.
TaKaRa Taq) (manufactured by Takara Shuzo) under the following conditions.

【0086】 反応液: (10×)PCR緩衝液 10μl 1.25mM dNTP混合液 16μl 鋳型DNA 10μl(DNA 含有量 1μM以下) 上記記載のa−3,b−3プライマー 各々1μl(最終濃度0.25μM ) レコンビナント・タックDNA・ポリメラーゼ 0.5μl 滅菌蒸留水 61.5μl 以上を混合し、この100μlの反応液をPCRにかけ
た。
Reaction solution: (10 ×) PCR buffer 10 μl 1.25 mM dNTP mixture 16 μl Template DNA 10 μl (DNA content 1 μM or less) 1 μl each of the above-mentioned a-3 and b-3 primers (final concentration 0.25 μM) ) 0.5 μl of recombinant tack DNA polymerase and 61.5 μl of sterile distilled water were mixed, and 100 μl of the reaction solution was subjected to PCR.

【0087】PCRサイクル: デナチュレーション過程:94℃ 60秒 アニーリング過程 :52℃ 60秒 エクステンション過程 :72℃ 120秒PCR cycle: Denaturation process: 60 seconds at 94 ° C. Annealing process: 60 seconds at 52 ° C. Extension process: 120 seconds at 72 ° C.

【0088】以上を1サイクルとし、25サイクル行っ
た。上記で生成した反応液10μlを3%アガロースゲ
ルにより電気泳動を行い、約100bpのDNA断片が
検出できた。
The above was regarded as one cycle, and 25 cycles were performed. 10 μl of the reaction solution generated above was subjected to electrophoresis using a 3% agarose gel, and a DNA fragment of about 100 bp was detected.

【0089】上記で増幅産物を確認できた反応液10μ
l、上記(A)で作製したプラスミドpHSG298p
ar−rep 5μlを各々制限酵素BamHIおよび
KpnIで完全に切断し、70℃で10分処理させるこ
とにより制限酵素を失活させた後、両者を混合し、これ
に、T4 DNAリガーゼ10×緩衝液 1μl、T4DN
Aリガーゼ1unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で
10μlにして、15℃で3時間反応させ、結合させ
た。
The reaction solution (10 μm) in which the amplification product was confirmed above
1, plasmid pHSG298p prepared in (A) above
5 μl of ar-rep was completely digested with restriction enzymes BamHI and KpnI, respectively, and treated at 70 ° C. for 10 minutes to inactivate the restriction enzymes. Then, both were mixed, and T4 DNA ligase 10 × buffer was added thereto. 1 μl, T4DN
Each unit of 1 unit of A ligase was added, adjusted to 10 μl with sterile distilled water, reacted at 15 ° C. for 3 hours, and bound.

【0090】得られたプラスミド混液を用い、塩化カル
シウム法〔Journal of MolecularBiology、53、15
9(1970)〕によりエシェリヒア・コリJM109
(宝酒造製)を形質転換し、カナマイシン 50mgを
含む培地〔トリプトン 10g、イーストエキストラク
ト 5g、NaCl 5g及び寒天 16gを蒸留水1
Lに溶解〕に塗抹した。
Using the obtained plasmid mixture, the calcium chloride method [Journal of Molecular Biology, 53, 15
9 (1970)] by Escherichia coli JM109
(Manufactured by Takara Shuzo), and a medium containing 50 mg of kanamycin [10 g of tryptone, 5 g of yeast extract, 5 g of NaCl, and 16 g of agar were distilled water 1
L).

【0091】この培地上の生育株を常法により液体培養
し、培養液よりプラスミドDNAを抽出し、該プラスミ
ドを制限酵素により切断し、挿入断片を確認した。この
結果、上記(A)作製のプラスミドの長さ5.5kbの
DNA断片に加え、長さ0.1kbの挿入DNA断片が
認められた。このプラスミドをpHSG298tacと
命名した。
The strain grown on this medium was subjected to liquid culture by a conventional method, plasmid DNA was extracted from the culture solution, the plasmid was cut with restriction enzymes, and the inserted fragment was confirmed. As a result, an inserted DNA fragment of 0.1 kb in length was observed in addition to the 5.5 kb DNA fragment of the plasmid prepared in (A) above. This plasmid was named pHSG298tac.

【0092】(C)PEPC遺伝子のシャトルベクター
への挿入 PEPC遺伝子を含有するプラスミド(上記実施例1
(B))を鋳型としたPCR法により、PEPC遺伝子
ORF部分を増幅させるべく、下記の1対のプライマー
を、アプライド・バイオシステムズ(Applied Biosyste
ms)社製「394DNA/RNAシンセサイザー(synt
hesizer )」を用いて合成した。
(C) Insertion of PEPC Gene into Shuttle Vector A plasmid containing the PEPC gene (see Example 1 above)
(B)) The following pair of primers was used to amplify the ORF portion of the PEPC gene by PCR using the template as a template, using Applied Biosystems (Applied Biosystems).
ms) “394 DNA / RNA Synthesizer (synt
hesizer) ".

【0093】(a−4)5'-TTT CAT ATG ACT GAT TTT T
TA CGC GAT -3'(配列番号12) (b−4)5'-TTT CCT GCA GGC TAG CCG GAG TTG CGC A
GT GCA -3'(配列番号13)
(A-4) 5'-TTT CAT ATG ACT GAT TTT T
TA CGC GAT -3 '(SEQ ID NO: 12) (b-4) 5'-TTT CCT GCA GGC TAG CCG GAG TTG CGC A
GT GCA -3 '(SEQ ID NO: 13)

【0094】実際のPCRは、パーキンエルマーシータ
ス社製の「DNAサーマルサイクラー」を用い、反応試
薬として、レコンビナント・タックDNA・ポリメラー
ゼ・タカラ・タック(Recombinant TaqDNA Polymerase
TaKaRa Taq)(宝酒造製)を用いて下記の条件で行っ
た。
The actual PCR was performed using "DNA Thermal Cycler" manufactured by Perkin Elmer Cetus, and using Recombinant Taq DNA Polymerase as a reaction reagent.
TaKaRa Taq) (manufactured by Takara Shuzo) under the following conditions.

【0095】 反応液: (10×)PCR緩衝液 10μl 1.25mM dNTP混合液 16μl 鋳型DNA 10μl(DNA 含有量 1μM以下) 上記記載のa−4,b−4プライマー 各々1μl(最終濃度0.25μM ) レコンビナント・タックDNA・ポリメラーゼ 0.5μl 滅菌蒸留水 61.5μl 以上を混合し、この100μlの反応液をPCRにかけ
た。
Reaction solution: (10 ×) PCR buffer 10 μl 1.25 mM dNTP mixture 16 μl Template DNA 10 μl (DNA content 1 μM or less) 1 μl each of the above a-4 and b-4 primers (final concentration 0.25 μM) ) 0.5 μl of recombinant tack DNA polymerase and 61.5 μl of sterile distilled water were mixed, and 100 μl of the reaction solution was subjected to PCR.

【0096】PCRサイクル: デナチュレーション過程:94℃ 60秒 アニーリング過程 :52℃ 60秒 エクステンション過程 :72℃ 120秒PCR cycle: Denaturation step: 94 ° C. for 60 seconds Annealing step: 52 ° C. for 60 seconds Extension step: 72 ° C. for 120 seconds

【0097】以上を1サイクルとし、25サイクル行っ
た。上記で生成した反応液10μlを0.8%アガロー
スゲルにより電気泳動を行い、約2.8kbのDNA断
片が検出できた。
The above was regarded as one cycle, and 25 cycles were performed. 10 μl of the reaction solution generated above was subjected to electrophoresis on a 0.8% agarose gel, and a DNA fragment of about 2.8 kb was detected.

【0098】上記で増幅産物を確認できた反応液10μ
l、上記(B)で作製したプラスミドpHSG298t
ac 5μlを各々制限酵素BglII、SseIまたは
BamHI、SseIで各々切断し、70℃で10分処
理させることにより制限酵素を失活させた後、両者を混
合し、これに、T4 DNAリガーゼ10×緩衝液 1μ
l、T4 DNAリガーゼ1unitの各成分を添加し、
滅菌蒸留水で10μlにして、15℃で3時間反応さ
せ、結合させた。
The reaction solution (10 μm) in which the amplification product was confirmed above
1, the plasmid pHSG298t prepared in the above (B)
After 5 μl of each ac was cleaved with restriction enzymes BglII and SseI or BamHI and SseI, and treated at 70 ° C. for 10 minutes to inactivate the restriction enzymes, the two were mixed, and T4 DNA ligase 10 × buffer was added. Liquid 1μ
l, add each component of 1 unit of T4 DNA ligase,
The mixture was made up to 10 μl with sterile distilled water, reacted at 15 ° C. for 3 hours, and bound.

【0099】得られたプラスミド混液を用い、塩化カル
シウム法〔Journal of MolecularBiology, 53, 159(197
0)〕によりエシェリヒア・コリJM109(宝酒造製)
を形質転換し、カナマイシン 50mgを含む培地〔ト
リプトン 10g、イーストエキストラクト 5g、Na
Cl 5g及び寒天 16gを蒸留水1Lに溶解〕に塗抹
した。
Using the resulting plasmid mixture, the calcium chloride method [Journal of Molecular Biology, 53, 159 (197
0)] by Escherichia coli JM109 (Takara Shuzo)
And a medium containing 50 mg of kanamycin [10 g of tryptone, 5 g of yeast extract,
Dissolve 5 g of Cl and 16 g of agar in 1 L of distilled water].

【0100】この培地上の生育株を常法により液体培養
し、培養液よりプラスミドDNAを抽出し、該プラスミ
ドを制限酵素(SseI,NdeI)により切断し、挿
入断片を確認した。この結果、上記(B)作製のプラス
ミドの長さ5.6kbのDNA断片に加え、長さ2.8
kbの挿入DNA断片が認められた。このプラスミドを
pPEPC1と命名した。
The strain grown on this medium was subjected to liquid culture by a conventional method, plasmid DNA was extracted from the culture solution, and the plasmid was cut with restriction enzymes (SseI, NdeI) to confirm the inserted fragment. As a result, in addition to the 5.6 kb DNA fragment prepared in the above (B), the plasmid 2.8
A kb inserted DNA fragment was observed. This plasmid was named pPEPC1.

【0101】(D)ブレビバクテリウム・フラバム MJ-
233-AB-41株の形質転換 本プラスミドを米国特許第5,185,262号明細書
記載の方法に従って、ブレビバクテリウム・フラバム M
J-233-AB-41(FERM BP−1498)に導入し
た。
(D) Brevibacterium flavum MJ-
Transformation of strain 233-AB-41 This plasmid was transformed with Brevibacterium flavum M according to the method described in US Pat. No. 5,185,262.
It was introduced into J-233-AB-41 (FERM BP-1498).

【0102】ブレビバクテリウム・フラバムMJ−23
3−AB−41は、1976年11月17日に、通商産
業省工業技術院生命工学工業技術研究所(日本国茨城県
つくば市東1丁目1番3号、郵便番号305)に受託番号F
ERM P−3812として寄託され、1981年5月
1日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受
託番号FERM BP−1498が付与されている。
Brevibacterium flavum MJ-23
3-AB-41 was obtained on November 17, 1976 by the Ministry of International Trade and Industry at the Institute of Biotechnology and Industrial Technology (1-3-1 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japan, Postal Code 305).
Deposited as ERM P-3812, transferred to an international deposit under the Budapest Treaty on May 1, 1981, and given the accession number FERM BP-1498.

【0103】〔実施例4〕有機酸の製造(I) 尿素:4g、(NH42SO4:14g,KH2PO4
0.5g、K2HPO4:0.5g, MgSO4・7H2
O:0.5g,FeSO4・7H2O:20mg,MnS
4・nH2O:20mg、D−ビオチン:200μg、
塩酸チアミン:100μg、酵母エキス1g、カザミノ
酸1g及び蒸留水:1000ml(pH6.6)の培地
を100mlずつ500ml容の三角フラスコに分注
し、120℃、15分間滅菌処理したものに、滅菌済み
50%グルコース水溶液4mlを加え、上記pPEPC
1プラスミドを導入し形質転換させたブレビバクテリウ
ム・フラバム MJ−233−AB−41菌株を植菌
し、33℃にて24時間振とう培養した(好気的培
養)。培養終了後、遠心分離(8000g、20分)により菌
体を回収した。得られた菌体全量を以下の反応に供試し
た。
Example 4 Production of Organic Acid (I) Urea: 4 g, (NH 4 ) 2 SO 4 : 14 g, KH 2 PO 4 :
0.5g, K 2 HPO 4: 0.5g , MgSO 4 · 7H 2
O: 0.5 g, FeSO 4 .7H 2 O: 20 mg, MnS
O 4 .nH 2 O: 20 mg, D-biotin: 200 μg,
100 ml of thiamine hydrochloride, 1 g of yeast extract, 1 g of casamino acid and 1000 ml of distilled water (pH 6.6) were dispensed in 100 ml portions into 500 ml Erlenmeyer flasks, sterilized at 120 ° C. for 15 minutes, and sterilized. 4 ml of a 50% glucose aqueous solution was added, and the above pPEPC was added.
Brevibacterium flavum MJ-233-AB-41 strain into which 1 plasmid was introduced and transformed was inoculated, and cultured with shaking at 33 ° C for 24 hours (aerobic culture). After completion of the culture, the cells were collected by centrifugation (8000 g, 20 minutes). The total amount of the obtained cells was subjected to the following reaction.

【0104】(NH42SO4:23g,KH2PO4
0.5g、K2HPO4:0.5g,MgSO4・7H
2O:0.5g,FeSO4・7H2O:20mg,Mn
SO4・nH2O:20mg、D−ビオチン:200μ
g、塩酸チアミン:100μg、炭酸ナトリウム20g
/L、蒸留水:1000mlの培地を2L容のジャーフ
ァーメンターに入れ、上記菌体とグルコース50%液1
20mlを添加し、密閉した状態で(溶存酸素濃度0.
1ppm)、これを30℃にて24時間ゆるく(200rpm)
攪拌し、反応させた。得られた培養液を遠心分離(80
00rpm、15分、4℃)して得られた上清液を分析
したところ、乳酸が29.5g/L、酢酸が4.5g/
L、コハク酸が15g/L、リンゴ酸が0.9g/L生
成していた。
(NH 4 ) 2 SO 4 : 23 g, KH 2 PO 4 :
0.5g, K 2 HPO 4: 0.5g , MgSO 4 · 7H
2 O: 0.5g, FeSO 4 · 7H 2 O: 20mg, Mn
SO 4 .nH 2 O: 20 mg, D-biotin: 200 μ
g, thiamine hydrochloride: 100 μg, sodium carbonate 20 g
/ L, distilled water: 1000 ml of a medium is placed in a 2 L jar fermenter, and the above cells and a 50% glucose solution 1
20 ml was added, and in a sealed state (dissolved oxygen concentration: 0.
1 ppm), loosen it at 30 ° C for 24 hours (200 rpm)
Stir and react. The obtained culture solution is centrifuged (80
The resulting supernatant was analyzed after 2 min of lactic acid and 4.5 g of acetic acid.
L and succinic acid were produced at 15 g / L and malic acid at 0.9 g / L.

【0105】〔実施例5〕有機酸の製造(II) 実施例4と同様に培養した菌体を、以下の反応に供試し
た。
Example 5 Production of Organic Acid (II) Cells cultured in the same manner as in Example 4 were subjected to the following reaction.

【0106】(NH42SO4:23g,KH2PO4
0.5g、K2HPO4:0.5g,MgSO4・7H
2O:0.5g,FeSO4・7H2O:20mg,Mn
SO4・nH2O:20mg、D−ビオチン:200μ
g、塩酸チアミン:100μg、蒸留水:1000ml
の培地を2L容のジャーファーメンターに入れ、上記菌
体とグルコース50%液120mlを添加し、ここに1
0%二酸化炭素ガス(90%窒素ガス)を0.1vvmの速度
で供給しながら30℃にて24時間ゆるく(200rpm)攪拌
し、反応させた。得られた培養液を遠心分離(8000
rpm、15分、4℃)して得られた上清液を分析した
ところ、乳酸が28g/L、酢酸が3.5g/L、コハ
ク酸が16g/L、リンゴ酸が1.0g/L生成してい
た。
(NH 4 ) 2 SO 4 : 23 g, KH 2 PO 4 :
0.5g, K 2 HPO 4: 0.5g , MgSO 4 · 7H
2 O: 0.5g, FeSO 4 · 7H 2 O: 20mg, Mn
SO 4 .nH 2 O: 20 mg, D-biotin: 200 μ
g, thiamine hydrochloride: 100 μg, distilled water: 1000 ml
Was placed in a 2 L jar fermenter, and the above cells and 120 ml of a 50% glucose solution were added thereto.
While supplying 0% carbon dioxide gas (90% nitrogen gas) at a rate of 0.1 vvm, the mixture was agitated loosely (200 rpm) at 30 ° C. for 24 hours to cause a reaction. The obtained culture solution is centrifuged (8000).
(15 min, 4 ° C.), the resulting supernatant was analyzed to find that lactic acid was 28 g / L, acetic acid was 3.5 g / L, succinic acid was 16 g / L, and malic acid was 1.0 g / L. Had been generated.

【0107】〔比較例1〕形質転換してないブレビバク
テリウム・フラバム MJ−233−AB−41株を用
いた以外は、実施例4と同様に行った。
Comparative Example 1 The procedure was as in Example 4, except that the untransformed Brevibacterium flavum MJ-233-AB-41 strain was used.

【0108】尿素:4g、(NH42SO4:14g,
KH2PO4:0.5g、K2HPO4:0.5g, Mg
SO4・7H2O:0.5g,FeSO4・7H2O:20
mg,MnSO4・nH2O:20mg、D−ビオチン:
200μg、塩酸チアミン:100μg、酵母エキス1
g、カザミノ酸1g及び蒸留水:1000ml(pH
6.6)の培地を100mlずつ500ml容の三角フ
ラスコに分注し、120℃、15分間滅菌処理したもの
に滅菌済み50%グルコース水溶液4mlを加え、ブレ
ビバクテリウム フラバム MJ−233−AB−41
菌株を植菌し、33℃にて24時間振とう培養した(好
気的培養)。培養終了後、遠心分離(8000g、20分)に
より菌体を回収した。得られた菌体全量を以下の反応に
供試した。
Urea: 4 g, (NH 4 ) 2 SO 4 : 14 g,
KH 2 PO 4 : 0.5 g, K 2 HPO 4 : 0.5 g, Mg
SO 4 · 7H 2 O: 0.5g , FeSO 4 · 7H 2 O: 20
mg, MnSO 4 .nH 2 O: 20 mg, D-biotin:
200 μg, thiamine hydrochloride: 100 μg, yeast extract 1
g, casamino acid 1 g and distilled water: 1000 ml (pH
The medium of 6.6) was dispensed in 100 ml aliquots into 500 ml Erlenmeyer flasks, sterilized at 120 ° C. for 15 minutes, and added with 4 ml of a sterilized 50% glucose aqueous solution, and Brevibacterium flavum MJ-233-AB-41 was added.
The strain was inoculated and shake-cultured at 33 ° C. for 24 hours (aerobic culture). After completion of the culture, the cells were collected by centrifugation (8000 g, 20 minutes). The total amount of the obtained cells was subjected to the following reaction.

【0109】(NH42SO4:23g,KH2PO4
0.5g、K2HPO4:0.5g,MgSO4・7H
2O:0.5g,FeSO4・7H2O:20mg,Mn
SO4・nH2O:20mg、D−ビオチン:200μ
g、塩酸チアミン:100μg、炭酸ナトリウム20g
/L、蒸留水:1000mlの培地を2L容のジャーフ
ァーメンターに入れ、上記菌体とグルコース50%液1
20mlを添加し、密閉した状態で(溶存酸素濃度0.
1ppm)、これを30℃にて24時間ゆるく(200rpm)
攪拌し、反応させた。得られた培養液を遠心分離(80
00rpm、15分、4℃)して得られた上清液を分析
したところ、乳酸が33.5g/L、酢酸が5g/L、
コハク酸が10g/L、リンゴ酸が0.5g/L生成し
ていた。
(NH 4 ) 2 SO 4 : 23 g, KH 2 PO 4 :
0.5g, K 2 HPO 4: 0.5g , MgSO 4 · 7H
2 O: 0.5g, FeSO 4 · 7H 2 O: 20mg, Mn
SO 4 .nH 2 O: 20 mg, D-biotin: 200 μ
g, thiamine hydrochloride: 100 μg, sodium carbonate 20 g
/ L, distilled water: 1000 ml of a medium is placed in a 2 L jar fermenter, and the above cells and a 50% glucose solution 1
20 ml was added, and in a sealed state (dissolved oxygen concentration: 0.
1 ppm), loosen it at 30 ° C for 24 hours (200 rpm)
Stir and react. The obtained culture solution is centrifuged (80
(00 rpm, 15 minutes, 4 ° C.), and the resulting supernatant was analyzed. Lactic acid was 33.5 g / L, acetic acid was 5 g / L,
10 g / L of succinic acid and 0.5 g / L of malic acid were produced.

【0110】〔比較例2〕炭酸イオンを添加しない以外
は、実施例4と同様に行った。(NH42SO4:23
g,KH2PO4:0.5g、K2HPO4:0.5g,M
gSO4・7H2O:0.5g,FeSO4・7H2O:2
0mg,MnSO4・nH2O:20mg、D−ビオチ
ン:200μg、塩酸チアミン:100μg、蒸留水:
1000mlの培地を2L容のジャーファーメンターに
入れ、実施例4と同様に培養した菌体とグルコース50
%液120mlを添加し、密閉した状態で(溶存酸素濃
度0.1ppm)、30℃で24時間ゆるく(200rpm)攪
拌し、反応させた。得られた培養液を遠心分離(800
0rpm、15分、4℃)して得られた上清液を分析し
たところ、乳酸が14g/L、酢酸が3.5g/L、コ
ハク酸が2.4g/L、リンゴ酸が0.5g/L生成し
ていた。
Comparative Example 2 The same operation as in Example 4 was carried out except that no carbonate ion was added. (NH 4 ) 2 SO 4 : 23
g, KH 2 PO 4 : 0.5 g, K 2 HPO 4 : 0.5 g, M
gSO 4 · 7H 2 O: 0.5g , FeSO 4 · 7H 2 O: 2
0 mg, MnSO 4 .nH 2 O: 20 mg, D-biotin: 200 μg, thiamine hydrochloride: 100 μg, distilled water:
1000 ml of the medium was placed in a 2 L jar fermenter, and the cells were cultured in the same manner as in Example 4 with 50 g of glucose.
% Solution was added thereto, and the mixture was stirred and loosely (200 rpm) at 30 ° C. for 24 hours in a sealed state (dissolved oxygen concentration: 0.1 ppm) to react. The obtained culture solution is centrifuged (800
(0 rpm, 15 minutes, 4 ° C.), and the supernatant obtained was analyzed. Lactic acid was 14 g / L, acetic acid was 3.5 g / L, succinic acid was 2.4 g / L, and malic acid was 0.5 g. / L was generated.

【0111】〔実施例6〕 ロドシュードモナス・パル
ストリス由来のPEPC遺伝子を用いた有機酸の製造 ロドシュードモナス・パルストリス由来のPEPC遺伝
子はその配列が既知(GenBank Acession No. D89668,
J.Bacteriol., 179, 4942-4945 (1997))であるため、
実施例1(A)に示したように菌体を培養し、染色体D
NAを調製し、これをPCRの鋳型として用いて、実施
例3(D)で使用したプライマー(a−4,b−4)の
代わりに、次の2つのプライマー(a−5,b−5)に
より、PEPCをコードする遺伝子部分を増幅させるこ
とができる。以下、実施例3(D)と同様の手法で、ロ
ドシュードモナス・パルストリス由来のPEPC遺伝子
で組み換えた好気性コリネ型細菌を得ることができる。
Example 6 Production of Organic Acid Using PEPC Gene Derived from Rhodopseudomonas pulstris The sequence of the PEPC gene derived from Rhodopseudomonas pulstris is known (GenBank Accession No. D89668,
J. Bacteriol., 179, 4942-4945 (1997))
The cells were cultured as shown in Example 1 (A),
NA was prepared and used as a template for PCR. The following two primers (a-5, b-5) were used instead of the primers (a-4, b-4) used in Example 3 (D). ) Allows the gene portion encoding PEPC to be amplified. Hereinafter, an aerobic coryneform bacterium recombined with the PEPC gene derived from Rhodopseudomonas pulstris can be obtained in the same manner as in Example 3 (D).

【0112】(a−5)5'-TTT CAT ATG TCG TCG TTG A
AC CTG -3'(配列番号14) (b−5)5'-TTT CCT GCA GGT CAC CCG CTA TTC CGC A
GC -3'(配列番号15)
(A-5) 5'-TTT CAT ATG TCG TCG TTG A
AC CTG -3 '(SEQ ID NO: 14) (b-5) 5'-TTT CCT GCA GGT CAC CCG CTA TTC CGC A
GC -3 '(SEQ ID NO: 15)

【0113】得られたコリネ型細菌を実施例4の方法に
従って培養したところ、コハク酸が14.5g/L生成
していた。
When the obtained coryneform bacterium was cultured according to the method of Example 4, succinic acid was produced at 14.5 g / L.

【0114】〔実施例7〕アナシスティス・ニジュラン
ス由来PEPC遺伝子を用いた有機酸の製造 アナシスティス・ニジュランス由来のPEPC遺伝子は
その配列が既知(GenBank Acession No. M11198, Gene,
38, 265-269 (1985))であるため、実施例1(A)に
示したように菌体を培養し、染色体DNAを調製し、こ
れをPCRの鋳型として用いて、実施例3(D)で使用
したプライマー(a−4,b−4)の代わりに、次の2
つのプライマー(a−6,b−6)を用いて、PEPC
をコードする遺伝子部分を増幅させることができる。以
下、実施例3(D)と同様の手法で、アナシスティス・
ニジュランス由来のPEPC遺伝子で組み換えた好気性
コリネ型細菌を得ることができる。
Example 7 Production of Organic Acid Using PEPC Gene Derived from Anasistis nidulans The sequence of PEPC gene derived from Anasistis nidulans was known (GenBank Accession No. M11198, Gene,
38, 265-269 (1985)), cells were cultured and chromosomal DNA was prepared as shown in Example 1 (A), and this was used as a template for PCR. )) In place of the primers (a-4, b-4) used in
PEPC using two primers (a-6, b-6)
Can be amplified. Hereinafter, in the same manner as in Example 3 (D),
An aerobic coryneform bacterium recombinant with the PEPC gene derived from Nidurans can be obtained.

【0115】(a−6)5'-TTT CAT ATG GCT CGC TGT A
TC TCT -3'(配列番号16) (b−6)5'-TTT CCT GCA GGT CAA CCT GTA TTG CGC A
TG -3'(配列番号17)
(A-6) 5'-TTT CAT ATG GCT CGC TGT A
TC TCT -3 '(SEQ ID NO: 16) (b-6) 5'-TTT CCT GCA GGT CAA CCT GTA TTG CGC A
TG-3 '(SEQ ID NO: 17)

【0116】得られたコリネ型細菌を実施例4の方法に
従って培養したところ、コハク酸が13.5g/L生成
していた。
When the obtained coryneform bacterium was cultured according to the method of Example 4, succinic acid was produced at 13.5 g / L.

【0117】〔実施例8〕ニコチアナ・タバクム由来P
EPC遺伝子を用いた有機酸の製造 ニコチアナ・タバクム由来のPEPC遺伝子はその配列
が既知(GenBank Acession No. X59016, Plant Mol. Bi
ol., 17, 535-539 (1991))であるため、実施例1
(A)に示したように菌体を培養し、染色体DNAを調
製し、これをPCRの鋳型として用いて、実施例3
(D)で使用したプライマー(a−4,b−4)の代わ
りに、次の2つのプライマー(a−7,b−7)を用い
て、PEPCをコードする遺伝子部分を増幅させること
ができる。以下、実施例3(D)と同様の手法で、Nico
tiana tabacum由来のPEPC遺伝子で組み換えた好気
性コリネ型細菌を得ることができる。
Example 8 P from Nicotiana tabacum
Production of organic acid using EPC gene The sequence of the PEPC gene derived from Nicotiana tabacum is known (GenBank Accession No. X59016, Plant Mol. Bi
ol., 17, 535-539 (1991)).
Cells were cultured as shown in (A) to prepare chromosomal DNA, which was used as a template for PCR.
In place of the primer (a-4, b-4) used in (D), the following two primers (a-7, b-7) can be used to amplify the gene portion encoding PEPC. . Thereafter, the same method as in Example 3 (D) was used to
An aerobic coryneform bacterium recombinant with the PEPC gene derived from tiana tabacum can be obtained.

【0118】(a−7)5'-TTT CAT ATG GCG ACA CGG A
GT TTG -3'(配列番号18) (b−7)5'-TTT CCT GCA GGT TAA CCG GTA TTC TGC A
GT -3'(配列番号19)
(A-7) 5'-TTT CAT ATG GCG ACA CGG A
GT TTG -3 '(SEQ ID NO: 18) (b-7) 5'-TTT CCT GCA GGT TAA CCG GTA TTC TGC A
GT -3 '(SEQ ID NO: 19)

【0119】得られたコリネ型細菌を実施例4の方法に
従って培養したところ、コハク酸が13.0g/L生成
していた。尚、実施例6〜8では、乳酸や酢酸の生成量
は減少していた。
When the obtained coryneform bacterium was cultured according to the method of Example 4, succinic acid was produced at 13.0 g / L. In Examples 6 to 8, the amounts of lactic acid and acetic acid produced decreased.

【0120】[0120]

【発明の効果】本発明の方法によれば、効率よく、かつ
高収率でコハク酸等の有機酸を製造することができ
る。
According to the method of the present invention, an organic acid such as succinic acid can be produced efficiently and in high yield.

【0121】[0121]

【配列表】[Sequence list]

配列番号:1 配列の長さ:23 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸(合成ヌクレオチド) 配列の特徴 その他の情報:Nはデオキシイノシンを示す。 配列: GTNCTNACNG CNCAYCCNAC NGA 23 SEQ ID NO: 1 Sequence length: 23 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Single stranded Topology: Linear Sequence type: Other nucleic acids (synthetic nucleotides) Sequence characteristics Other information: N is deoxyinosine Show. Array: GTNCTNACNG CNCAYCCNAC NGA 23

【0122】配列番号:2 配列の長さ:17 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸(合成ヌクレオチド) 配列の特徴 その他の情報:Nはデオキシイノシンを示す。 配列: TCNTGGATGG GNGGNGA 17SEQ ID NO: 2 Sequence length: 17 Sequence type: nucleic acid Number of strands: single-stranded Topology: linear Sequence type: other nucleic acid (synthetic nucleotide) Sequence characteristics Other information: N 1 shows deoxyinosine. Sequence: TCNTGGATGG GNGGNGA 17

【0123】配列番号:3 配列の長さ:8 配列の型:アミノ酸 トポロジー:直鎖状 配列の種類:ペプチド 配列: Val Leu Thr Ala His Pro Thr Glu 1 5SEQ ID NO: 3 Sequence length: 8 Sequence type: amino acid Topology: linear Sequence type: peptide Sequence: Val Leu Thr Ala His Pro Thr Glu 15

【0124】配列番号:4 配列の長さ:6 配列の型:アミノ酸 トポロジー:直鎖状 配列の種類:ペプチド 配列: Ser Trp Met Gly Gly Asp 1 5SEQ ID NO: 4 Sequence length: 6 Sequence type: amino acid Topology: linear Sequence type: peptide Sequence: Ser Trp Met Gly Gly Asp 15

【0125】配列番号:5 配列の長さ:2760 配列の型:核酸 鎖の数:2本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:Genomic DNA 起源 生物名:ブレビバクテリウム・フラバム(Brevibacteri
um flavum) 株名:MJ−233 配列の特徴 特徴を表す記号:CDS 存在位置:1..2760 特徴を決定した方法:E 配列 ATG ACT GAT TTT TTA CGC GAT GAC ATC AGG TTC CTC GGT CGA ATC CTC 48 Met Thr Asp Phe Leu Arg Asp Asp Ile Arg Phe Leu Gly Arg Ile Leu 1 5 10 15 GGT GAG GTA ATT GCG GAA CAA GAA GGC CAG GAG GTT TAT GAA CTG GTC 96 Gly Glu Val Ile Ala Glu Gln Glu Gly Gln Glu Val Tyr Glu Leu Val 20 25 30 GAA CAA GCG CGC CTG ACT TCT TTT GAT ATC GCC AAG GGC AAC GCC GAA 144 Glu Gln Ala Arg Leu Thr Ser Phe Asp Ile Ala Lys Gly Asn Ala Glu 35 40 45 ATG GAT AGC CTG GTT CAG GTT TTC GAC GGC ATT ACT CCA GCC AAG GCA 192 Met Asp Ser Leu Val Gln Val Phe Asp Gly Ile Thr Pro Ala Lys Ala 50 55 60 ACA CCG ATT GCT CGC GCA TTT TCC CAC TTC GCT CTG CTG GCT AAC CTG 240 Thr Pro Ile Ala Arg Ala Phe Ser His Phe Ala Leu Leu Ala Asn Leu 65 70 75 80 GCG GAA GAC CTC CAC GAT GAA GAG CTT CGT GAA CAG GCT CTC GAT GCA 288 Ala Glu Asp Leu His Asp Glu Glu Leu Arg Glu Gln Ala Leu Asp Ala 85 90 95 GGC GAC ACC CCT CCG GAC AGC ACT CTT GAT GCC ACC TGG CTG AAA CTC 336 Gly Asp Thr Pro Pro Asp Ser Thr Leu Asp Ala Thr Trp Leu Lys Leu 100 105 110 AAT GAG GGC AAT GTT GGC GCA GAA GCT GTG GCG GAT GTG TTG CGT AAT 384 Asn Glu Gly Asn Val Gly Ala Glu Ala Val Ala Asp Val Leu Arg Asn 115 120 125 GCT GAG GTG GCG CCA GTT CTG ACT GCG CAC CCA ACT GAG ACT CGC CGC 432 Ala Glu Val Ala Pro Val Leu Thr Ala His Pro Thr Glu Thr Arg Arg 130 135 140 CGC ACT GTT TTT GAT GCG CAA AAG TGG ATC ACC ACC CAC ATG CGT GAA 480 Arg Thr Val Phe Asp Ala Gln Lys Trp Ile Thr Thr His Met Arg Glu 145 150 155 160 CGC CAC GCT TTG CAG TCT GCG GAG CCA ACC GCT CGT ACG CAA AGC AAG 528 Arg His Ala Leu Gln Ser Ala Glu Pro Thr Ala Arg Thr Gln Ser Lys 165 170 175 TTG GAT GAG ATC GAA AAG AAC ATC CGC CGT CGC ATC ACC ATT TTG TGG 576 Leu Asp Glu Ile Glu Lys Asn Ile Arg Arg Arg Ile Thr Ile Leu Trp 180 185 190 CAG ACC GCG TTG ATT CGT GTG GCC CGC CCA CGT ATC GAG GAC GAG ATC 624 Gln Thr Ala Leu Ile Arg Val Ala Arg Pro Arg Ile Glu Asp Glu Ile 195 200 205 GAA GTA GGG CTG CGC TAC TAC AAG CTG AGC CTT TTG GAA GAG ATT CCA 672 Glu Val Gly Leu Arg Tyr Tyr Lys Leu Ser Leu Leu Glu Glu Ile Pro 210 215 220 CGT ATC AAC CGT GAT GTG GCT GTT GAG CTT CGT GAG CGT TTC GGC GAG 720 Arg Ile Asn Arg Asp Val Ala Val Glu Leu Arg Glu Arg Phe Gly Glu 225 230 235 240 GAT GTT CCT TTG AAG CCC GTG GTC AAG CCA GGT TCC TGG ATT GGT GGA 768 Asp Val Pro Leu Lys Pro Val Val Lys Pro Gly Ser Trp Ile Gly Gly 245 250 255 GAC CAC GAC GGT AAC CCT TAT GTC ACC GCG GAA ACA GTT GAG TAT TCC 816 Asp His Asp Gly Asn Pro Tyr Val Thr Ala Glu Thr Val Glu Tyr Ser 260 265 270 ACT CCA CGC GCT GCG GAA ACC GTG CTC AAG TAC TAT GCA CGC CAG CTG 864 Thr Pro Arg Ala Ala Glu Thr Val Leu Lys Tyr Tyr Ala Arg Gln Leu 275 280 285 CAT TCC CTC GAG CAT GAG CTC AGC CTG TCG GAC CGC ATG AAT AAG GTC 912 His Ser Leu Glu His Glu Leu Ser Leu Ser Asp Arg Met Asn Lys Val 290 295 300 ACC CCG CAG CTG CTT GCG CTG GCA GAT GCC GGG CAC AAC GAC GTG CCA 960 Thr Pro Gln Leu Leu Ala Leu Ala Asp Ala Gly His Asn Asp Val Pro 305 310 315 320 AGC CGC GTG GAT GAG CCT TAT CGA CGC GCC GTC CAT GGC GTT CGC GGA 1008 Ser Arg Val Asp Glu Pro Tyr Arg Arg Ala Val His Gly Val Arg Gly 325 330 335 CGT ATC CTC GCG ACG ACG GCT GAG CTG ATC GGC GAG GAC GCC GTT GAG 1056 Arg Ile Leu Ala Thr Thr Ala Glu Leu Ile Gly Glu Asp Ala Val Glu 340 345 350 GGC GTG TGG TTC AAG GTC TTT ACT CCA TAC GCA TCC CCG GAA GAA TTC 1104 Gly Val Trp Phe Lys Val Phe Thr Pro Tyr Ala Ser Pro Glu Glu Phe 355 360 365 TTA AAC GAT GCG TTA ACC ATC GAT CAT TCT CTG CGT GAA TCC AAT GAC 1152 Leu Asn Asp Ala Leu Thr Ile Asp His Ser Leu Arg Glu Ser Asn Asp 370 375 380 ACT CTC ATC GCC GAT GAT CGT TTG TCT GTG CTG ATT TCT GCC ATC GAG 1200 Thr Leu Ile Ala Asp Asp Arg Leu Ser Val Leu Ile Ser Ala Ile Glu 385 390 395 400 AGC TTC GGA TTC AAC CTC TAC TCA CTG GAT CTG CGC CAG AAC TCT GAG 1248 Ser Phe Gly Phe Asn Leu Tyr Ser Leu Asp Leu Arg Gln Asn Ser Glu 405 410 415 AGC TAC GAA GAC GTA CTC ACA GAG CTT TTC GAG CGT GCC CAA GTC ACC 1296 Ser Tyr Glu Asp Val Leu Thr Glu Leu Phe Glu Arg Ala Gln Val Thr 420 425 430 GCA AAC TAC CGC GAG CTG TCT GAA GAG GAG AAG CTT GAG GTG CTG CTG 1344 Ala Asn Tyr Arg Glu Leu Ser Glu Glu Glu Lys Leu Glu Val Leu Leu 435 440 445 AAG GAA CTG CGC AGC CCT CGT CCG TTG ATC CCG CAC GGT TCA GAT GAA 1392 Lys Glu Leu Arg Ser Pro Arg Pro Leu Ile Pro His Gly Ser Asp Glu 450 455 460 TAC AGC GAG GTC ACC GAC CGC GAG CTC GGT ATC TTC CGC ACC GCG TCG 1440 Tyr Ser Glu Val Thr Asp Arg Glu Leu Gly Ile Phe Arg Thr Ala Ser 465 470 475 480 GAA GCT GTC AAG AAA TTC GGC CCA CGC ATG GTG CCT CAC TGC ATC ATT 1488 Glu Ala Val Lys Lys Phe Gly Pro Arg Met Val Pro His Cys Ile Ile 485 490 495 TCC ATG ACA TCA TCG GTC ACC GAT GTG CTC GAG CCG ATG GTG TTG CTC 1536 Ser Met Thr Ser Ser Val Thr Asp Val Leu Glu Pro Met Val Leu Leu 500 505 510 AAA GAA TTC GGC CTC ATC GCG GCC AAC GGC GAC AAT CCA CGC GGC ACC 1584 Lys Glu Phe Gly Leu Ile Ala Ala Asn Gly Asp Asn Pro Arg Gly Thr 515 520 525 GTC GAT GTC ATC CCA CTG TTC GAA ACC ATC GAA GAC CTT CGA GCC GGC 1632 Val Asp Val Ile Pro Leu Phe Glu Thr Ile Glu Asp Leu Arg Ala Gly 530 535 540 GCC GGA ATC CTC GGC GAA CTG TGG AAA ATT GAT CTC TAC CGC AAC TAC 1680 Ala Gly Ile Leu Gly Glu Leu Trp Lys Ile Asp Leu Tyr Arg Asn Tyr 545 550 555 560 CTC CTG CAG CGC GAC AAC GTC CAG GAA GTC ATG CTC GGC TAC TCC GAT 1728 Leu Leu Gln Arg Asp Asn Val Gln Glu Val Met Leu Gly Tyr Ser Asp 565 570 575 TCC AAC AAG GAT GGC GGA TAT TTC TCC GCA AAC TGG GCG CTT TAC GAC 1776 Ser Asn Lys Asp Gly Gly Tyr Phe Ser Ala Asn Trp Ala Leu Tyr Asp 580 585 590 GCG GAA CTG CAG CTT GTC GAA CTA TGC CGA TCA GCC GGG GTC AAC GTT 1824 Ala Glu Leu Gln Leu Val Glu Leu Cys Arg Ser Ala Gly Val Asn Val 595 600 605 CGC CTG TTC CAC GGC CGC GGT GGC ACC GTT GGA CGT GGT GGC GGA CCT 1872 Arg Leu Phe His Gly Arg Gly Gly Thr Val Gly Arg Gly Gly Gly Pro 610 615 620 TCC TAC GAT GCG ATT CTT GCC CAG CCC AAG GGG GCT GTC CAA GGT TCC 1920 Ser Tyr Asp Ala Ile Leu Ala Gln Pro Lys Gly Ala Val Gln Gly Ser 625 630 635 640 GTG CGC ATC ACC GAG CAG GGC GAA ATC ATC TCA GCT AAG TAC GGC AAC 1968 Val Arg Ile Thr Glu Gln Gly Glu Ile Ile Ser Ala Lys Tyr Gly Asn 645 650 655 CCT GAA ACT GCG CGC CGA AAC CTC GAG GCA CTG GTC TCA GCC ACG CTT 2016 Pro Glu Thr Ala Arg Arg Asn Leu Glu Ala Leu Val Ser Ala Thr Leu 660 665 670 GAG GCA TCG CTT CTC GAC GTC TCT GAA CTC ACC GAT CAC CAA CGC GCG 2064 Glu Ala Ser Leu Leu Asp Val Ser Glu Leu Thr Asp His Gln Arg Ala 675 680 685 TAT GAC ATC ATG AGT GAG ATC TCT GAG CTC AGC CTG AAG AAG TAC ACC 2112 Tyr Asp Ile Met Ser Glu Ile Ser Glu Leu Ser Leu Lys Lys Tyr Thr 690 695 700 TCC TTG GTG CAC GAG GAT CAA GGC TTC ATC GAT TAC TTC ACC CAA TCC 2160 Ser Leu Val His Glu Asp Gln Gly Phe Ile Asp Tyr Phe Thr Gln Ser 705 710 715 720 ACA ACA CTG CAG GAG ATC GGA TCC CTC AAC ATC GGA TCC AGG CCT TCC 2208 Thr Thr Leu Gln Glu Ile Gly Ser Leu Asn Ile Gly Ser Arg Pro Ser 725 730 735 TCA CGC AAG CAA ACT TCC TCT GTG GAA GAT TTG CGA GCC ATC CCA TGG 2256 Ser Arg Lys Gln Thr Ser Ser Val Glu Asp Leu Arg Ala Ile Pro Trp 740 745 750 GTT CTT AGC TGG TCA CAG TCT CGT GTG ATG CTG CCA GGA TGG TTT GGT 2304 Val Leu Ser Trp Ser Gln Ser Arg Val Met Leu Pro Gly Trp Phe Gly 755 760 765 GTC GGA ACG GCA CTT GAA CAG TGG ATT GGA GAA GGG GAG CAA GCT ACC 2352 Val Gly Thr Ala Leu Glu Gln Trp Ile Gly Glu Gly Glu Gln Ala Thr 770 775 780 CAG CGC ATC GCC GAG CTG CAA ACA CTC AAC GAG TCC TGG CCA TTT TTC 2400 Gln Arg Ile Ala Glu Leu Gln Thr Leu Asn Glu Ser Trp Pro Phe Phe 785 790 795 800 ACC TCA GTG TTG GAC AAC ATG GCT CAG GTG ATG TCC AAG GCA GAG CTG 2448 Thr Ser Val Leu Asp Asn Met Ala Gln Val Met Ser Lys Ala Glu Leu 805 810 815 CGT TTG GCA AAG CTC TAT GCA GAC CTC ATC CCA GAT AGG GAA GTC GCC 2496 Arg Leu Ala Lys Leu Tyr Ala Asp Leu Ile Pro Asp Arg Glu Val Ala 820 825 830 GAG CGC GTC TAT TCC GTC ATC CAC GAG GAA TAT TTC CTG ACT AAA AAG 2544 Glu Arg Val Tyr Ser Val Ile His Glu Glu Tyr Phe Leu Thr Lys Lys 835 840 845 ATG TTC TGC GTG ATC ACC GGC TCC GAT GAT CTC CTT GAT GAC AAC CCA 2592 Met Phe Cys Val Ile Thr Gly Ser Asp Asp Leu Leu Asp Asp Asn Pro 850 855 860 CTT CTG GCA CGC TCT GTC CAG CGT CGT TAC CCC TAC CTG CTT CCA CTC 2640 Leu Leu Ala Arg Ser Val Gln Arg Arg Tyr Pro Tyr Leu Leu Pro Leu 865 870 875 880 AAT GTG ATC CAG GTA GAG ATG ATG CGA CGC TAC CGA AAA GGC GAC CAA 2688 Asn Val Ile Gln Val Glu Met Met Arg Arg Tyr Arg Lys Gly Asp Gln 885 890 895 AGC GAG CAA GTG TCC CGC AAT ATT CAG CTG ACA ATG AAC GGT CTT TCC 2736 Ser Glu Gln Val Ser Arg Asn Ile Gln Leu Thr Met Asn Gly Leu Ser 900 905 910 ACT GCA CTG CGC AAC TCC GGC TAG 2760 Thr Ala Leu Arg Asn Ser Gly 915
SEQ ID NO: 5 Sequence length: 2760 Sequence type: nucleic acid Number of strands: double-stranded Topology: linear Sequence type: Genomic DNA Origin Organism: Brevibacacteri
um flavum) Strain name: MJ-233 Sequence characteristics Symbol indicating characteristics: CDS Location: 1.2.760 Method for determining characteristics: E sequence ATG ACT GAT TTT TTA CGC GAT GAC ATC AGG TTC CTC GGT CGA ATC CTC 48 Met Thr Asp Phe Leu Arg Asp Asp Ile Arg Phe Leu Gly Arg Ile Leu 1 5 10 15 GGT GAG GTA ATT GCG GAA CAA GAA GGC CAG GAG GTT TAT GAA CTG GTC 96 Gly Glu Val Ile Ala Glu Gln Glu Gly Gln Glu Val Tyr Glu Leu Val 20 25 30 GAA CAA GCG CGC CTG ACT TCT TTT GAT ATC GCC AAG GGC AAC GCC GAA 144 Glu Gln Ala Arg Leu Thr Ser Phe Asp Ile Ala Lys Gly Asn Ala Glu 35 40 45 ATG GAT AGC CTG GTT CAG GTT TTC GAC GGC ATT ACT CCA GCC AAG GCA 192 Met Asp Ser Leu Val Gln Val Phe Asp Gly Ile Thr Pro Ala Lys Ala 50 55 60 ACA CCG ATT GCT CGC GCA TTT TCC CAC TTC GCT CTG CTG GCT AAC CTG 240 Thr Pro Ile Ala Arg Ala Phe Ser His Phe Ala Leu Leu Ala Asn Leu 65 70 75 80 GCG GAA GAC CTC CAC GAT GAA GAG CTT CGT GAA CAG GCT CTC GAT GCA 288 Ala Glu Asp Leu His Asp Glu Glu Leu Arg Glu Gln Ala Leu Asp Ala 85 90 95 GGC GAC ACC CCT CCG GAC AGC ACT CTT GAT GCC ACC TGG CTG AAA CTC 336 Gly Asp Thr Pro Pro Asp Ser Thr Leu Asp Ala Thr Trp Leu Lys Leu 100 105 110 AAT GAG GGC AAT GTT GGC GCA GAA GCT GTG GCG GAT GTG TTG CGT AAT 384 Asn Glu Gly Asn Val Gly Ala Glu Ala Val Ala Asp Val Leu Arg Asn 115 120 125 GCT GAG GTG GCG CCA GTT CTG ACT GCG CAC CCA ACT GAG ACT CGC CGC 432 Ala Glu Val Ala Pro Val Leu Thr Ala His Pro Thr Glu Thr Arg Arg 130 135 140 CGC ACT GTT TTT GAT GCG CAA AAG TGG ATC ACC ACC CAC ATG CGT GAA 480 Arg Thr Val Phe Asp Ala Gln Lys Trp Ile Thr Thr His Met Arg Glu 145 150 155 160 CGC CAC GCT TTG CAG TCT GCG GAG CCA ACC GCT CGT ACG CAA AGC AAG 528 Arg His Ala Leu Gln Ser Ala Glu Pro Thr Ala Arg Thr Gln Ser Lys 165 170 175 TTG GAT GAG ATC GAA AAG AAC ATC CGC CGT CGC ATC ACC ATT TTG TGG 576 Leu Asp Glu Ile Glu Lys Asn Ile Arg Arg Arg Ile Thr Ile Leu Trp 180 185 190 CAG ACC GCG TTG ATT CGT GTG GCC CGC CCA CGT ATC GAG GAC GAG ATC 624 Gln Thr Ala Leu Ile Arg Val Ala Arg Pro Arg Ile Glu Asp Glu I le 195 200 205 GAA GTA GGG CTG CGC TAC TAC AAG CTG AGC CTT TTG GAA GAG ATT CCA 672 Glu Val Gly Leu Arg Tyr Tyr Lys Leu Ser Leu Leu Glu Glu Ile Pro 210 215 220 CGT ATC AAC CGT GAT GTG GCT GTT GAG CTT CGT GAG CGT TTC GGC GAG 720 Arg Ile Asn Arg Asp Val Ala Val Glu Leu Arg Glu Arg Phe Gly Glu 225 230 235 240 GAT GTT CCT TTG AAG CCC GTG GTC AAG CCA GGT TCC TGG ATT GGT GGA 768 Asp Val Pro Leu Lys Pro Val Val Lys Pro Gly Ser Trp Ile Gly Gly 245 250 255 GAC CAC GAC GGT AAC CCT TAT GTC ACC GCG GAA ACA GTT GAG TAT TCC 816 Asp His Asp Gly Asn Pro Tyr Val Thr Ala Glu Thr Val Glu Tyr Ser 260 265 270 ACT CCA CGC GCT GCG GAA ACC GTG CTC AAG TAC TAT GCA CGC CAG CTG 864 Thr Pro Arg Ala Ala Glu Thr Val Leu Lys Tyr Tyr Ala Arg Gln Leu 275 280 285 CAT TCC CTC GAG CAT GAG CTC AGC CTG TCG GAC CGC ATG AAT AAG GTC 912 His Ser Leu Glu His Glu Leu Ser Leu Ser Asp Arg Met Asn Lys Val 290 295 300 ACC CCG CAG CTG CTT GCG CTG GCA GAT GCC GGG CAC AAC GAC GTG CCA 960 Thr Pro Gln Leu Leu Ala Leu Ala Asp Ala Gly His A sn Asp Val Pro 305 310 315 320 AGC CGC GTG GAT GAG CCT TAT CGA CGC GCC GTC CAT GGC GTT CGC GGA 1008 Ser Arg Val Asp Glu Pro Tyr Arg Arg Ala Val His Gly Val Arg Gly 325 330 335 CGT ATC CTC GCG ACG ACG GCT GAG CTG ATC GGC GAG GAC GCC GTT GAG 1056 Arg Ile Leu Ala Thr Thr Ala Glu Leu Ile Gly Glu Asp Ala Val Glu 340 345 350 GGC GTG TGG TTC AAG GTC TTT ACT CCA TAC GCA TCC CCG GAA GAA TTC 1104 Gly Val Trp Phe Lys Val Phe Thr Pro Tyr Ala Ser Pro Glu Glu Phe 355 360 365 TTA AAC GAT GCG TTA ACC ATC GAT CAT TCT CTG CGT GAA TCC AAT GAC 1152 Leu Asn Asp Ala Leu Thr Ile Asp His Ser Leu Arg Glu Ser Asn Asp 370 375 380 ACT CTC ATC GCC GAT GAT CGT TTG TCT GTG CTG ATT TCT GCC ATC GAG 1200 Thr Leu Ile Ala Asp Asp Arg Leu Ser Val Leu Ile Ser Ala Ile Glu 385 390 395 400 400 AGC TTC GGA TTC AAC CTC TAC TCA CTG GAT CTG CGC CAG AAC TCT GAG 1248 Ser Phe Gly Phe Asn Leu Tyr Ser Leu Asp Leu Arg Gln Asn Ser Glu 405 410 415 AGC TAC GAA GAC GTA CTC ACA GAG CTT TTC GAG CGT GCC CAA GTC ACC 1296 Ser Tyr Glu Asp Val Leu Th r Glu Leu Phe Glu Arg Ala Gln Val Thr 420 425 430 GCA AAC TAC CGC GAG CTG TCT GAA GAG GAG AAG CTT GAG GTG CTG CTG 1344 Ala Asn Tyr Arg Glu Leu Ser Glu Glu Glu Lys Leu Glu Val Leu Leu 435 440 445 AAG GAA CTG CGC AGC CCT CGT CCG TTG ATC CCG CAC GGT TCA GAT GAA 1392 Lys Glu Leu Arg Ser Pro Arg Pro Leu Ile Pro His Gly Ser Asp Glu 450 455 460 TAC AGC GAG GTC GTC ACC GAC CGC GAG CTC GGT ATC TTC CGC ACC GCG TCG 1440 Tyr Ser Glu Val Thr Asp Arg Glu Leu Gly Ile Phe Arg Thr Ala Ser 465 470 475 480 GAA GCT GTC AAG AAA TTC GGC CCA CGC ATG GTG CCT CAC TGC ATC ATT 1488 Glu Ala Val Lys Lys Phe Gly Pro Arg Met Val Pro His Cys Ile Ile 485 490 495 TCC ATG ACA TCA TCG GTC ACC GAT GTG CTC GAG CCG ATG GTG TTG CTC 1536 Ser Met Thr Ser Ser Val Thr Asp Val Leu Glu Pro Met Val Leu Leu 500 505 510 AAA GAA TTC GGC CTC ATC GCG GCC AAC GGC GAC AAT CCA CGC GGC ACC 1584 Lys Glu Phe Gly Leu Ile Ala Ala Asn Gly Asp Asn Pro Arg Gly Thr 515 520 525 GTC GAT GTC ATC CCA CTG TTC GAA ACC ATC GAA GAC CTT CGA GCC GGC 1632 Val Asp Val Ile Pro Leu Phe Glu Thr Ile Glu Asp Leu Arg Ala Gly 530 535 540 GCC GGA ATC CTC GGC GAA CTG TGG AAA ATT GAT CTC TAC CGC AAC TAC 1680 Ala Gly Ile Leu Gly Glu Leu Trp Lys Ile Asp Leu Tyr Arg Asn Tyr 545 550 555 560 CTC CTG CAG CGC GAC AAC GTC CAG GAA GTC ATG CTC GGC TAC TCC GAT 1728 Leu Leu Gln Arg Asp Asn Val Gln Glu Val Met Leu Gly Tyr Ser Asp 565 570 575 575 TCC AAC AAG GAT GGC GGA TAT TTC TCC GCA AAC TGG GCG CTT TAC GAC 1776 Ser Asn Lys Asp Gly Gly Tyr Phe Ser Ala Asn Trp Ala Leu Tyr Asp 580 585 590 GCG GAA CTG CAG CTT GTC GAA CTA TGC CGA TCA GCC GGG GTC AAC GTT 1824 Ala Glu Leu Gln Leu Val Leu Cys Arg Ser Ala Gly Val Asn Val 595 600 605 CGC CTG TTC CAC GGC CGC GGT GGC ACC GTT GGA CGT GGT GGC GGA CCT 1872 Arg Leu Phe His Gly Arg Gly Gly Thr Val Gly Arg Gly Gly Gly Pro 610 615 620 620 TCC TAC GAT GCG ATT CTT GCC CAG CCC AAG GGG GCT GTC CAA GGT TCC 1920 Ser Tyr Asp Ala Ile Leu Ala Gln Pro Lys Gly Ala Val Gln Gly Ser 625 630 635 635 640 GTG CGC ATC ACC GAG CAG GGC GAA ATC ATC TCA GCT AAG T AC GGC AAC 1968 Val Arg Ile Thr Glu Gln Gly Glu Ile Ile Ser Ala Lys Tyr Gly Asn 645 650 655 CCT GAA ACT GCG CGC CGA AAC CTC GAG GCA CTG GTC TCA GCC ACG CTT 2016 Pro Glu Thr Ala Arg Arg Asn Leu Glu Ala Leu Val Ser Ala Thr Leu 660 665 670 GAG GCA TCG CTT CTC GAC GTC TCT GAA CTC ACC GAT CAC CAA CGC GCG 2064 Glu Ala Ser Leu Leu Asp Val Ser Glu Leu Thr Asp His Gln Arg Ala 675 680 685 TAT GAC ATC ATG AGT GAG ATC TCT GAG CTC AGC CTG AAG AAG TAC ACC 2112 Tyr Asp Ile Met Ser Glu Ile Ser Glu Leu Ser Leu Lys Lys Tyr Thr 690 695 700 TCC TTG GTG CAC GAG GAT CAA GGC TTC ATC GAT TAC TTC ACC CAA TCC 2160 Ser Leu Val His Glu Asp Gln Gly Phe Ile Asp Tyr Phe Thr Gln Ser 705 710 715 715 720 ACA ACA CTG CAG GAG ATC GGA TCC CTC AAC ATC GGA TCC AGG CCT TCC 2208 Thr Thr Leu Gln Glu Ile Gly Ser Leu Asn Ile Gly Ser Arg Pro Ser 725 730 735 TCA CGC AAG CAA ACT TCC TCT GTG GAA GAT TTG CGA GCC ATC CCA TGG 2256 Ser Arg Lys Gln Thr Ser Ser Val Glu Asp Leu Arg Ala Ile Pro Trp 740 745 750 GTT CTT AGC TGG TCA CAG TCT CGT GT G ATG CTG CCA GGA TGG TTT GGT 2304 Val Leu Ser Trp Ser Gln Ser Arg Val Met Leu Pro Gly Trp Phe Gly 755 760 765 GTC GGA ACG GCA CTT GAA CAG TGG ATT GGA GAA GGG GAG CAA GCT ACC 2352 Val Gly Thr Ala Leu Glu Gln Trp Ile Gly Glu Gly Glu Gln Ala Thr 770 775 780 CAG CGC ATC GCC GAG CTG CAA ACA CTC AAC GAG TCC TGG CCA TTT TTC 2400 Gln Arg Ile Ala Glu Leu Gln Thr Leu Asn Glu Ser Trp Pro Phe Phe Phe 785 790 795 800 ACC TCA GTG TTG GAC AAC ATG GCT CAG GTG ATG TCC AAG GCA GAG CTG 2448 Thr Ser Val Leu Asp Asn Met Ala Gln Val Met Ser Lys Ala Glu Leu 805 810 815 CGT TTG GCA AAG CTC TAT GCA GAC CTC ATC CCA GAT AGG GAA GTC GCC 2496 Arg Leu Ala Lys Leu Tyr Ala Asp Leu Ile Pro Asp Arg Glu Val Ala 820 825 830 GAG CGC GTC TAT TCC GTC ATC CAC GAG GAA TAT TTC CTG ACT AAA AAG 2544 Glu Arg Val Tyr Ser Val Ile His Glu Glu Tyr Phe Leu Thr Lys Lys 835 840 845 ATG TTC TGC GTG ATC ACC GGC TCC GAT GAT CTC CTT GAT GAC AAC CCA 2592 Met Phe Cys Val Ile Thr Gly Ser Asp Asp Leu Leu Asp Asp Asn Pro 850 855 860 860 CTT CTG GCA CGC TCT GTC CAG CGT CGT TAC CCC TAC CTG CTT CCA CTC 2640 Leu Leu Ala Arg Ser Val Gln Arg Arg Tyr Pro Tyr Leu Leu Pro Leu 865 870 875 880 AAT GTG ATC CAG GTA GAG ATG ATG CGA CGC TAC CGA AAA GGC GAC CAA688 Asn Val Ile Gln Val Glu Met Met Arg Arg Tyr Arg Lys Gly Asp Gln 885 890 895 AGC GAG CAA GTG TCC CGC AAT ATT CAG CTG ACA ATG AAC GGT CTT TCC 2736 Ser Glu Gln Val Ser Arg Asn Ile Gln Leu Thr Met Asn Gly Leu Ser 900 905 910 ACT GCA CTG CGC AAC TCC GGC TAG 2760 Thr Ala Leu Arg Asn Ser Gly 915

【0126】配列番号:6 配列の長さ:30 鎖の数:一本鎖 配列の型:核酸 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸(合成DNA) 配列 TTTCTCGAGC GCATTACCTC CTTGCTACTG 30SEQ ID NO: 6 Sequence length: 30 Number of strands: single-stranded Sequence type: nucleic acid Topology: linear Sequence type: other nucleic acid (synthetic DNA) Sequence TTTCTCGAGC GCATTACCTC CTTGCTACTG 30

【0127】配列番号:7 配列の長さ:30 鎖の数:一本鎖 配列の型:核酸 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸(合成DNA) 配列 TTTGAATTCG ATATCAAGCT TGCACATCAA 30SEQ ID NO: 7 Sequence length: 30 Number of chains: single-stranded Sequence type: nucleic acid Topology: linear Sequence type: other nucleic acid (synthetic DNA) Sequence TTTGAATTCG ATATCAAGCT TGCACATCAA 30

【0128】配列番号:8 配列の長さ:27 鎖の数:一本鎖 配列の型:核酸 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸(合成DNA) 配列 TTTGGTACCG ACTTAGATAA AGGTCTA 27SEQ ID NO: 8 Sequence length: 27 Number of chains: single-stranded Sequence type: nucleic acid Topology: linear Sequence type: other nucleic acid (synthetic DNA) Sequence TTTGGTACCG ACTTAGATAA AGGTCTA 27

【0129】配列番号:9 配列の長さ:27 鎖の数:一本鎖 配列の型:核酸 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸(合成DNA) 配列 TTTCTCGAGT GCTGGTAAAA CAACTTT 27SEQ ID NO: 9 Sequence length: 27 Number of chains: single-stranded Sequence type: nucleic acid Topology: linear Sequence type: other nucleic acid (synthetic DNA) Sequence TTTCTCGAGT GCTGGTAAAA CAACTTT 27

【0130】配列番号:10 配列の長さ:30 鎖の数:一本鎖 配列の型:核酸 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸(合成DNA) 配列 TTTGGTACCG ATAGCTTACT CCCCATCCCC 30SEQ ID NO: 10 Sequence length: 30 Number of chains: single-stranded Sequence type: nucleic acid Topology: linear Sequence type: other nucleic acid (synthetic DNA) Sequence TTTGGTACCG ATAGCTTACT CCCCATCCCC 30

【0131】配列番号:11 配列の長さ:54 鎖の数:一本鎖 配列の型:核酸 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸(合成DNA) 配列 TTTGGATCCC AACATATGAA CACCTCCTTT TTATCCGCTC ACAATTCCAC ACAT 54SEQ ID NO: 11 Sequence length: 54 Number of chains: single-stranded Sequence type: nucleic acid Topology: linear Sequence type: other nucleic acid (synthetic DNA) Sequence TTTGGATCCC AACATATGAA CACCTCCTTT TTATCCGCTC ACAATTCCAC ACAT 54

【0132】配列番号:12 配列の長さ:27 鎖の数:一本鎖 配列の型:核酸 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸(合成DNA) 配列 TTTCATATGA CTGATTTTTT ACGCGAT 27SEQ ID NO: 12 Sequence length: 27 Number of chains: single-stranded Sequence type: nucleic acid Topology: linear Sequence type: other nucleic acid (synthetic DNA) Sequence TTTCATATGA CTGATTTTTT ACGCGAT 27

【0133】配列番号:13 配列の長さ:33 鎖の数:一本鎖 配列の型:核酸 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸(合成DNA) 配列 TTTCCTGCAG GCTAGCCGGA GTTGCGCAGT GCA 33SEQ ID NO: 13 Sequence length: 33 Number of chains: single-stranded Sequence type: nucleic acid Topology: linear Sequence type: other nucleic acid (synthetic DNA) Sequence TTTCCTGCAG GCTAGCCGGA GTTGCGCAGT GCA 33

【0134】配列番号:14 配列の長さ:24 鎖の数:一本鎖 配列の型:核酸 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸(合成DNA) 配列 TTTCATATGT CGTCGTTGAA CCTG 24SEQ ID NO: 14 Sequence length: 24 Number of chains: single-stranded Sequence type: nucleic acid Topology: linear Sequence type: other nucleic acid (synthetic DNA) Sequence TTTCATATGT CGTCGTTGAA CCTG 24

【0135】配列番号:15 配列の長さ:30 鎖の数:一本鎖 配列の型:核酸 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸(合成DNA) 配列 TTTCCTGCAG GTCACCCGCT ATTCCGCAGC 30SEQ ID NO: 15 Sequence length: 30 Number of chains: single-stranded Sequence type: nucleic acid Topology: linear Sequence type: other nucleic acid (synthetic DNA) Sequence TTTCCTGCAG GTCACCCGCT ATTCCGCAGC 30

【0136】配列番号:16 配列の長さ:24 鎖の数:一本鎖 配列の型:核酸 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸(合成DNA) 配列 TTTCATATGG CTCGCTGTAT CTCT 24SEQ ID NO: 16 Sequence length: 24 Number of chains: single-stranded Sequence type: nucleic acid Topology: linear Sequence type: other nucleic acid (synthetic DNA) Sequence TTTCATATGG CTCGCTGTAT CTCT 24

【0137】配列番号:17 配列の長さ:30 鎖の数:一本鎖 配列の型:核酸 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸(合成DNA) 配列 TTTCCTGCAG GTCAACCTGT ATTGCGCATG 30SEQ ID NO: 17 Sequence length: 30 Number of chains: single-stranded Sequence type: nucleic acid Topology: linear Sequence type: other nucleic acid (synthetic DNA) Sequence TTTCCTGCAG GTCAACCTGT ATTGCGCATG 30

【0138】配列番号:18 配列の長さ:24 鎖の数:一本鎖 配列の型:核酸 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸(合成DNA) 配列 TTTCATATGG CGACACGGAG TTTG 24SEQ ID NO: 18 Sequence length: 24 Number of chains: single-stranded Sequence type: nucleic acid Topology: linear Sequence type: other nucleic acid (synthetic DNA) Sequence TTTCATATGG CGACACGGAG TTTG 24

【0139】配列番号:19 配列の長さ:30 鎖の数:一本鎖 配列の型:核酸 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸(合成DNA) 配列 TTTCCTGCAG GTTAACCGGT ATTCTGCAGT 30SEQ ID NO: 19 Sequence length: 30 Number of chains: single-stranded Sequence type: nucleic acid Topology: linear Sequence type: other nucleic acid (synthetic DNA) Sequence TTTCCTGCAG GTTAACCGGT ATTCTGCAGT 30

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 FI (C12N 1/21 C12R 1:13) (C12N 15/09 ZNA C12R 1:13) (72)発明者 湯川 英明 茨城県稲敷郡阿見町中央八丁目3番1号 三菱化学株式会社筑波研究所内──────────────────────────────────────────────────の Continued on front page (51) Int.Cl. 6 Identification symbol FI (C12N 1/21 C12R 1:13) (C12N 15/09 ZNA C12R 1:13) (72) Inventor Hideaki Yukawa Inashiki-gun, Ibaraki 8-3-1 Chuo, Ami-cho, Tsukuba Research Laboratory, Mitsubishi Chemical Corporation

Claims (6)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項1】 ホスホエノールピルビン酸カルボキシラ
ーゼ遺伝子で組み換えた好気性コリネ型細菌あるいはそ
の調製物を、炭酸イオンもしくは重炭酸イオンまたは二
酸化炭素ガスを含有する反応液中で嫌気的に有機原料に
作用させ、有機酸を生成させることを特徴とする有機酸
の製造方法。
An aerobic coryneform bacterium or a preparation thereof recombinantly modified with a phosphoenolpyruvate carboxylase gene is anaerobically reacted with an organic raw material in a reaction solution containing carbonate ions, bicarbonate ions or carbon dioxide gas. And a method for producing an organic acid.
【請求項2】 炭酸もしくは重炭酸またはそれらの塩を
反応液に添加すること、または反応液に二酸化炭素ガス
を供給することにより、炭酸イオンもしくは重炭酸イオ
ンまたは二酸化炭素ガスを反応液に含有させる請求項1
記載の方法。
2. Carbonic acid or bicarbonate or a salt thereof is added to a reaction solution, or carbon dioxide gas is supplied to the reaction solution, so that carbonate ion or bicarbonate ion or carbon dioxide gas is contained in the reaction solution. Claim 1
The described method.
【請求項3】 ホスホエノールピルビン酸カルボキシラ
ーゼ遺伝子が、微生物または植物由来である請求項1ま
たは2記載の方法。
3. The method according to claim 1, wherein the phosphoenolpyruvate carboxylase gene is derived from a microorganism or a plant.
【請求項4】 ホスホエノールピルビン酸カルボキシラ
ーゼ遺伝子が、ロドシュードモナス パルストリス(Rh
odopseudomonas palustris)、ブレビバクテリウム・フ
ラバム(Brevibacterium flavum)、ストレプトマイセ
ス・コエリカラー(Streptomyces coelicolor)、サッ
カロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisia
e)、アナベナ・バリアビリス(Anabaena variabili
s)、アナシクティス・ニジュランス(Anacystis nidul
ans)、フラベリア・アウストララシカ(Flaveria aust
ralasica)、フラベリア・プリングレイ( Flaveria pr
inglei)、フラベリア・トリネビア(Flaveria trinerv
ia)、アロエ・アルボレセンス(Aloe arborescens)、
ブラシカ・ナプス(Brassica napus)、ソラヌム・ツベ
ロサム(Solanum tuberosum)、メセムブリアンセサム
・クリスタリウム(Mesembryanthemum crystallium)、
ソルガム・ブルガレ(Sorghum vulgare)、ニコチアナ
・タバクム(Nicotiana tabacum)、ダイズ又はトウモ
ロコシ由来の遺伝子である請求項3記載の方法。
4. The method according to claim 1, wherein the phosphoenolpyruvate carboxylase gene is Rhodopseudomonas pulse tris (Rh
odopseudomonas palustris, Brevibacterium flavum, Streptomyces coelicolor, Saccharomyces cerevisia
e), Anabaena variabili
s), Anacystis nidul
ans), Flaveria aust
ralasica), Flaveria prg
inglei), Flaveria trinerv
ia), Aloe arborescens,
Brassica napus, Solanum tuberosum, Mesembryanthemum crystallium,
The method according to claim 3, which is a gene derived from Sorghum vulgare, Nicotiana tabacum, soybean or corn.
【請求項5】 好気性コリネ型細菌が、ブレビバクテリ
ウム・フラバム(Brevibacterium flavum) である請求項
1〜4のいずれか一項に記載の方法。
5. The method according to claim 1, wherein the aerobic coryneform bacterium is Brevibacterium flavum.
【請求項6】 ブレビバクテリウム・フラバムが、ブレ
ビバクテリウム・フラバム MJ-233-AB-41である請求項
5記載の方法。
6. The method according to claim 5, wherein the Brevibacterium flavum is Brevibacterium flavum MJ-233-AB-41.
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