JPH1080274A - 核移行シグナルを結合したテトラサイクリン・トランスアクチベーター - Google Patents
核移行シグナルを結合したテトラサイクリン・トランスアクチベーターInfo
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- JPH1080274A JPH1080274A JP8257451A JP25745196A JPH1080274A JP H1080274 A JPH1080274 A JP H1080274A JP 8257451 A JP8257451 A JP 8257451A JP 25745196 A JP25745196 A JP 25745196A JP H1080274 A JPH1080274 A JP H1080274A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 動物細胞における遺伝子の発現を厳密に制御
できる発現系の提供。 【解決手段】 核移行シグナル（ＮＬＳ）遺伝子および
テトラサイクリン・トランスアクチベーター（ｔＴＡ）
遺伝子を組み込んだ組み換え遺伝子、ならびにかかる遺
伝子を含むウイルスおよびそのウイルスにより感染され
た動物細胞。
できる発現系の提供。 【解決手段】 核移行シグナル（ＮＬＳ）遺伝子および
テトラサイクリン・トランスアクチベーター（ｔＴＡ）
遺伝子を組み込んだ組み換え遺伝子、ならびにかかる遺
伝子を含むウイルスおよびそのウイルスにより感染され
た動物細胞。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、動物細胞における
遺伝子の発現系に関し、より具体的には、導入遺伝子の
発現を厳密に制御できる遺伝子の組み合わせ体、および
その使用に関する。
遺伝子の発現系に関し、より具体的には、導入遺伝子の
発現を厳密に制御できる遺伝子の組み合わせ体、および
その使用に関する。
【０００２】
【従来の技術】細胞の増殖に不可欠の成分以外の物質
は、必要な時に誘導的に合成されることが多い。この為
外来の遺伝子を動物細胞に導入して細胞にある一定のタ
ンパク質を産生させる場合、導入した遺伝子が恒常的に
発現してタンパク質が合成されると、その結果、外来遺
伝子を導入した細胞の増殖に影響したり、また細胞に対
して毒性を示すことがある。
は、必要な時に誘導的に合成されることが多い。この為
外来の遺伝子を動物細胞に導入して細胞にある一定のタ
ンパク質を産生させる場合、導入した遺伝子が恒常的に
発現してタンパク質が合成されると、その結果、外来遺
伝子を導入した細胞の増殖に影響したり、また細胞に対
して毒性を示すことがある。
【０００３】これらの問題点を解決する目的で、メタロ
チオネイン遺伝子（E.K．Mayo ら、Cell ２９巻、９９
−１０８頁、１９８２年)、熱ショック遺伝子（L.Nouer
ら、「Heat Shock Response」L.Nouer 編、ＣＲＣ出
版）およびいくつかのホルモン遺伝子等（F.Lee ら、Na
ture ２９４巻、２２８−２３２頁、１９８１年）等の
真核細胞の誘導型のプロモーターが用いられている。し
かしながら、これら真核細胞由来のプロモーターでは非
誘導時にも僅かながらも導入された遺伝子が発現して少
量のタンパク質が産生されている。また、原核細胞のｌ
ａｃ遺伝子の誘導型プロモーターが動物細胞でも働くこ
とが報告されている（M.Hu ら、Cell ４８巻、５５５−
５６６頁、１９８７年）が、これも目的の遺伝子産物の
産生を厳密に制御するには不十分である。
チオネイン遺伝子（E.K．Mayo ら、Cell ２９巻、９９
−１０８頁、１９８２年)、熱ショック遺伝子（L.Nouer
ら、「Heat Shock Response」L.Nouer 編、ＣＲＣ出
版）およびいくつかのホルモン遺伝子等（F.Lee ら、Na
ture ２９４巻、２２８−２３２頁、１９８１年）等の
真核細胞の誘導型のプロモーターが用いられている。し
かしながら、これら真核細胞由来のプロモーターでは非
誘導時にも僅かながらも導入された遺伝子が発現して少
量のタンパク質が産生されている。また、原核細胞のｌ
ａｃ遺伝子の誘導型プロモーターが動物細胞でも働くこ
とが報告されている（M.Hu ら、Cell ４８巻、５５５−
５６６頁、１９８７年）が、これも目的の遺伝子産物の
産生を厳密に制御するには不十分である。
【０００４】ｌａｃ遺伝子以外の原核細胞由来の遺伝子
発現系として、Bujard らが開発したテトラサイクリン
により制御されるテトラサイクリン・トランスアクチベ
ータ（ｔＴＡ）をコードする遺伝子（以下、ｔＴＡ遺伝
子ともいう）を用いたテトラサイクリン・レプレッサー
（ｔｅｔＲ）／テトラサイクリン・オペレーター（ｔｅ
ｔＯ）遺伝子発現系が報告されている。ｔｅｔＲと結合
したｔＴＡはテトラサイクリン存在下ではｔｅｔＯに結
合出来ず、遺伝子の発現が起こらない。一方、テトラサ
イクリン非存在下ではｔＴＡはｔｅｔＯに結合でき、遺
伝子の発現が起こる。この様にｔＴＡを用いるとテトラ
サイクリンの有無により遺伝子発現のスイッチのオン／
オフ（ＯＮ／ＯＦＦ）を調節することができる。
発現系として、Bujard らが開発したテトラサイクリン
により制御されるテトラサイクリン・トランスアクチベ
ータ（ｔＴＡ）をコードする遺伝子（以下、ｔＴＡ遺伝
子ともいう）を用いたテトラサイクリン・レプレッサー
（ｔｅｔＲ）／テトラサイクリン・オペレーター（ｔｅ
ｔＯ）遺伝子発現系が報告されている。ｔｅｔＲと結合
したｔＴＡはテトラサイクリン存在下ではｔｅｔＯに結
合出来ず、遺伝子の発現が起こらない。一方、テトラサ
イクリン非存在下ではｔＴＡはｔｅｔＯに結合でき、遺
伝子の発現が起こる。この様にｔＴＡを用いるとテトラ
サイクリンの有無により遺伝子発現のスイッチのオン／
オフ（ＯＮ／ＯＦＦ）を調節することができる。
【０００５】しかしながら、現状ではテトラサイクリン
を添加して導入遺伝子の発現を抑制した場合でも、非抑
制時の０.０１％程度の導入遺伝子の発現が認められ、
完全には発現が抑制されていない（M.Gossen ら、Proce
edings of National Academyof Science, USA ８９巻、
５５４７−５５５１頁、１９９２年）。以上のように現
状では、動物細胞に導入した遺伝子の発現を厳密に制御
出来る系は報告されていない。
を添加して導入遺伝子の発現を抑制した場合でも、非抑
制時の０.０１％程度の導入遺伝子の発現が認められ、
完全には発現が抑制されていない（M.Gossen ら、Proce
edings of National Academyof Science, USA ８９巻、
５５４７−５５５１頁、１９９２年）。以上のように現
状では、動物細胞に導入した遺伝子の発現を厳密に制御
出来る系は報告されていない。
【０００６】他方、従来レトロウイルスベクターを産生
するパッケージング（Packaging）細胞株を作製するに
は、レトロウイルスの複製に必須のｇａｇ、ｐｏｌ、ｅ
ｎｖ等の遺伝子のうち少なくとも一つを細胞に導入して
おくことが必要であった。この場合、導入したベクター
遺伝子が細胞の染色体に組み込まれる位置により、不必
要な時にも発現が完全に押さえられなかったり（Leakin
ess）、必要な時に発現量が低かったりすることがよく
起こる。そのため、遺伝子導入後に、優秀なパッケージ
ング細胞株を選択するのに多大な労力を要する。その
上、レトロウイルスの外皮タンパク質を変化させてレト
ロウイルスの感染特異性を変化させることは、個々のウ
イルスの外被タンパク質をコードする遺伝子毎に目的の
遺伝子を組み込んだベクター遺伝子作製する必要があっ
た。そのため、個々のベクターを作製することは非常に
手間がかかる作業であった。
するパッケージング（Packaging）細胞株を作製するに
は、レトロウイルスの複製に必須のｇａｇ、ｐｏｌ、ｅ
ｎｖ等の遺伝子のうち少なくとも一つを細胞に導入して
おくことが必要であった。この場合、導入したベクター
遺伝子が細胞の染色体に組み込まれる位置により、不必
要な時にも発現が完全に押さえられなかったり（Leakin
ess）、必要な時に発現量が低かったりすることがよく
起こる。そのため、遺伝子導入後に、優秀なパッケージ
ング細胞株を選択するのに多大な労力を要する。その
上、レトロウイルスの外皮タンパク質を変化させてレト
ロウイルスの感染特異性を変化させることは、個々のウ
イルスの外被タンパク質をコードする遺伝子毎に目的の
遺伝子を組み込んだベクター遺伝子作製する必要があっ
た。そのため、個々のベクターを作製することは非常に
手間がかかる作業であった。
【０００７】
【発明が解決すべき課題】従って、本発明の目的の一つ
は、導入した遺伝子の発現が非誘導時には全く起らない
かほとんど認められず、遺伝子導入された細胞の増殖に
影響を及ぼさないが、誘導時には導入された遺伝子が発
現して目的のタンパク質を産生することのできる遺伝子
の発現系を提供することにある。
は、導入した遺伝子の発現が非誘導時には全く起らない
かほとんど認められず、遺伝子導入された細胞の増殖に
影響を及ぼさないが、誘導時には導入された遺伝子が発
現して目的のタンパク質を産生することのできる遺伝子
の発現系を提供することにある。
【０００８】本発明のもう一つの目的は、従来のパッケ
ージング細胞株に変わるプソイドタイプ（Pseudotype）
のレトロウイルス・ベクター産生系を容易に構築できる
手段を提供することにある。
ージング細胞株に変わるプソイドタイプ（Pseudotype）
のレトロウイルス・ベクター産生系を容易に構築できる
手段を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明者は、種々検討し
た結果、Bujard らのテトラサイクリンによる遺伝子発
現系に核移行シグナルであるＮＬＳ（Nuclear Localiza
tion Signal）遺伝子を組み込むことにより上記目的が
達成できることを見い出した。すなわち、概述すれば、
ＮＬＳ遺伝子およびテトラサイクリン・トランスアクチ
ベーター（ｔＴＡ）をコードする遺伝子（ｔＴＡ遺伝
子）を組み合わせて含んでなり、さらにプロモーター遺
伝子が組み込まれた遺伝子を含むウイルスは、テトラサ
イクリンの非存在下で増強された遺伝子の発現を示す
が、テトラサイクリンの存在下では、遺伝子の発現が実
質的に１００％抑制されることを見い出した。
た結果、Bujard らのテトラサイクリンによる遺伝子発
現系に核移行シグナルであるＮＬＳ（Nuclear Localiza
tion Signal）遺伝子を組み込むことにより上記目的が
達成できることを見い出した。すなわち、概述すれば、
ＮＬＳ遺伝子およびテトラサイクリン・トランスアクチ
ベーター（ｔＴＡ）をコードする遺伝子（ｔＴＡ遺伝
子）を組み合わせて含んでなり、さらにプロモーター遺
伝子が組み込まれた遺伝子を含むウイルスは、テトラサ
イクリンの非存在下で増強された遺伝子の発現を示す
が、テトラサイクリンの存在下では、遺伝子の発現が実
質的に１００％抑制されることを見い出した。
【００１０】従って、本発明によれば、上記目的を達成
する手段として、ＮＬＳ遺伝子およびｔＴＡ遺伝子を含
んでなる遺伝子が提供される。本発明の目的を達成する
ための好ましい態様としては、上記ＮＬＳ遺伝子および
ｔＴＡ遺伝子はインフレームの状態、すなわちそれらの
遺伝子産物であるタンパク質が所期の作用を奏するよう
に組み込まれている遺伝子が挙げられる。これらの遺伝
子は、それらの遺伝子産物が所期の作用を奏する限り、
それぞれが組み込まれている位置は限定されない。
する手段として、ＮＬＳ遺伝子およびｔＴＡ遺伝子を含
んでなる遺伝子が提供される。本発明の目的を達成する
ための好ましい態様としては、上記ＮＬＳ遺伝子および
ｔＴＡ遺伝子はインフレームの状態、すなわちそれらの
遺伝子産物であるタンパク質が所期の作用を奏するよう
に組み込まれている遺伝子が挙げられる。これらの遺伝
子は、それらの遺伝子産物が所期の作用を奏する限り、
それぞれが組み込まれている位置は限定されない。
【００１１】また、これらの遺伝子を発現するために必
須である、プロモーター遺伝子がさらに組み込まれた遺
伝子も提供される。通常、プロモーターは、前記ＮＬＳ
遺伝子およびｔＴＡ遺伝子の上流に位置するように組み
込むのがよい。本発明に従えば、上記ＮＬＳ遺伝子およ
びｔＴＡ遺伝子が発現できるプロモーターであれば、そ
の起源および種類を問うことなく使用することができ
る。しかし、限定されるものでないが、本発明の目的
上、都合よく使用できるＮＬＳ遺伝子としては、ＳＶウ
イルスのラージ（large）Ｔタンパク質（または抗原）
に由来するものが、挙げられ、一方プロモーターとして
は、サイトメガロウイルスのＣＭプロモーター、サイト
メガロウイルスのエンハンサーとマウスモロニー白血病
ウイルスのプロモーターを結合したＲxプロモーター、
サイトメガロウイルスのエンハンサーとβ−アクチンの
プロモーターを結合したＣＡプロモーターおよびテトラ
サイクリン遺伝子のＴｅｔプロモーター等を挙げること
ができる。
須である、プロモーター遺伝子がさらに組み込まれた遺
伝子も提供される。通常、プロモーターは、前記ＮＬＳ
遺伝子およびｔＴＡ遺伝子の上流に位置するように組み
込むのがよい。本発明に従えば、上記ＮＬＳ遺伝子およ
びｔＴＡ遺伝子が発現できるプロモーターであれば、そ
の起源および種類を問うことなく使用することができ
る。しかし、限定されるものでないが、本発明の目的
上、都合よく使用できるＮＬＳ遺伝子としては、ＳＶウ
イルスのラージ（large）Ｔタンパク質（または抗原）
に由来するものが、挙げられ、一方プロモーターとして
は、サイトメガロウイルスのＣＭプロモーター、サイト
メガロウイルスのエンハンサーとマウスモロニー白血病
ウイルスのプロモーターを結合したＲxプロモーター、
サイトメガロウイルスのエンハンサーとβ−アクチンの
プロモーターを結合したＣＡプロモーターおよびテトラ
サイクリン遺伝子のＴｅｔプロモーター等を挙げること
ができる。
【００１２】本発明に従えば、上記組み換え遺伝子は、
外来のタンパク質をコードする遺伝子がさらに組み込ま
れていてもよい。詳細には後述するように、本発明の組
み換え遺伝子は、テトラサイクリンの存否によって、そ
の発現を厳密に制御できるので、例えばかかる遺伝子を
含む細胞の増殖に際し、上記の組み込まれた遺伝子のい
ずれかの発現が悪影響を及ぼす場合であっても、その発
現を実質的に１００％抑制することが可能であるだけで
なく、その発現を増強できる場合もある。
外来のタンパク質をコードする遺伝子がさらに組み込ま
れていてもよい。詳細には後述するように、本発明の組
み換え遺伝子は、テトラサイクリンの存否によって、そ
の発現を厳密に制御できるので、例えばかかる遺伝子を
含む細胞の増殖に際し、上記の組み込まれた遺伝子のい
ずれかの発現が悪影響を及ぼす場合であっても、その発
現を実質的に１００％抑制することが可能であるだけで
なく、その発現を増強できる場合もある。
【００１３】したがって、いずれかの目的で特定のタン
パク質を産生する場合に好適な発現系が提供される。そ
のため、本発明にいう外来のタンパク質は、それぞれの
目的に応じていかなるタンパク質であってもよい。限定
されるものでないが、かかる外来のタンパク質の例とし
ては、ウイルスの外被タンパク質、ホルモン、サイトカ
イン、ならびにホルモンおよびサイトカインのレセプタ
ー等を挙げることができる。
パク質を産生する場合に好適な発現系が提供される。そ
のため、本発明にいう外来のタンパク質は、それぞれの
目的に応じていかなるタンパク質であってもよい。限定
されるものでないが、かかる外来のタンパク質の例とし
ては、ウイルスの外被タンパク質、ホルモン、サイトカ
イン、ならびにホルモンおよびサイトカインのレセプタ
ー等を挙げることができる。
【００１４】以上のような組み換え遺伝子は、都合よく
は、ある一定のベクターに担持させ、プラスミドの形態
で使用するのがよい。本発明に従うプラスミドの具体的
なものとしては、後述する実施例で、その代表例を挙げ
るが、当業者がこれらの代表例から容易に想定できるプ
ラスミドはすべて本発明の範囲内に入るものである。ま
た、本発明によれば、上記組み換え遺伝子を含むウイル
スも提供される。本発明の目的上、好ましいウイルス
は、宿主ウイルスとしてアデノウイルスを用いたもので
ある。アデノウイルスは、その宿主が哺乳類であるマス
トアデノウイルスおよび鳥類であるアビアデノウイルス
のどちらも都合よく使用できるが、より好ましいのは前
者である。
は、ある一定のベクターに担持させ、プラスミドの形態
で使用するのがよい。本発明に従うプラスミドの具体的
なものとしては、後述する実施例で、その代表例を挙げ
るが、当業者がこれらの代表例から容易に想定できるプ
ラスミドはすべて本発明の範囲内に入るものである。ま
た、本発明によれば、上記組み換え遺伝子を含むウイル
スも提供される。本発明の目的上、好ましいウイルス
は、宿主ウイルスとしてアデノウイルスを用いたもので
ある。アデノウイルスは、その宿主が哺乳類であるマス
トアデノウイルスおよび鳥類であるアビアデノウイルス
のどちらも都合よく使用できるが、より好ましいのは前
者である。
【００１５】なお、ＮＬＳ遺伝子、ｔＴＡ遺伝子および
外来の遺伝子は、プロモーターの下流に組み込まれてい
ることが好ましい。
外来の遺伝子は、プロモーターの下流に組み込まれてい
ることが好ましい。
【００１６】本発明によれば、上記ウイルスでトランス
フェクション（感染）した動物細胞も提供される。好ま
しい動物細胞としては、本発明に従うマストアデノウイ
ルスによって感染された哺乳動物細胞、具体的には、ヒ
トメラノーマ細胞株であるＡ３７５（ＡＴＣＣ ＣＲＬ
−１６１９）、ヒト脳腫瘍細胞株であるＴ９８（ＡＴＣ
Ｃ ＣＲＬ−１６９０）、Ａ１７２（ＡＴＣＣ ＣＲＬ
−１６２０）、Ｕ３７３（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−１７）や
マウス３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１６３）を挙げ
ることができる。こうして得られる細胞を増殖させるこ
とにより、例えば、外来のタンパク質の産生を効率よく
行うことができる。
フェクション（感染）した動物細胞も提供される。好ま
しい動物細胞としては、本発明に従うマストアデノウイ
ルスによって感染された哺乳動物細胞、具体的には、ヒ
トメラノーマ細胞株であるＡ３７５（ＡＴＣＣ ＣＲＬ
−１６１９）、ヒト脳腫瘍細胞株であるＴ９８（ＡＴＣ
Ｃ ＣＲＬ−１６９０）、Ａ１７２（ＡＴＣＣ ＣＲＬ
−１６２０）、Ｕ３７３（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−１７）や
マウス３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１６３）を挙げ
ることができる。こうして得られる細胞を増殖させるこ
とにより、例えば、外来のタンパク質の産生を効率よく
行うことができる。
【００１７】以上の本発明の各主題は、具体的には、後
述の実施例または次の一連の操作に準じて得ることがで
きる。
述の実施例または次の一連の操作に準じて得ることがで
きる。
【００１８】例えば、まず、テトラサイクリン・トラン
スアクティベーター（ｔＴＡ）をサイトメガロウイルス
のプロモーター（ＣＭプロモーター、M.Gossen ら、Pro
ceedings of National Academy of Science, USA ８９
巻、５５４７−５５５１頁、１９９２年参照）の下流に
結合させた組み換えアデノウイルスを作製する。また、
ｔＴＡ遺伝子発現の活性化能を検出するためのレポータ
ー（Reporter）遺伝子であるｌａｃＺ遺伝子をテトラサ
イクリンにより制御可能なテトラサイクリン・プロモー
ター（Ｔｅｔプロモーター、M.Gossen ら、Proceedings
of National Academy of Science, USA ８９巻、５５
４７−５５５１頁、１９９２年参照）の下流に結合した
組み換えアデノウイルスを作製する。これら二種類のア
デノウイルスを動物細胞に同時に共感染（Cotransfecti
on）させて遺伝子導入を行う。その際コントロールとし
てｔＴＡ単独（Bujard らと同じ系）とｔＴＡに核移行
シグナル（ＮＬＳ）を付加したＮｔＴＡの二種類の組み
換えアデノウイルスを作製し、両者のテトラサイクリン
存在下での遺伝子発現の抑制能とテトラサイクリン非存
在下での遺伝子発現の誘導能を比較検討する。その結
果、テトラサイクリン非存在下のｔＴＡの系でｌａｃＺ
遺伝子の発現が３０％程度であるのに対して、ＮｔＴＡ
の系では８０％以上と２.７倍以上の遺伝子発現の増強
が認められる。
スアクティベーター（ｔＴＡ）をサイトメガロウイルス
のプロモーター（ＣＭプロモーター、M.Gossen ら、Pro
ceedings of National Academy of Science, USA ８９
巻、５５４７−５５５１頁、１９９２年参照）の下流に
結合させた組み換えアデノウイルスを作製する。また、
ｔＴＡ遺伝子発現の活性化能を検出するためのレポータ
ー（Reporter）遺伝子であるｌａｃＺ遺伝子をテトラサ
イクリンにより制御可能なテトラサイクリン・プロモー
ター（Ｔｅｔプロモーター、M.Gossen ら、Proceedings
of National Academy of Science, USA ８９巻、５５
４７−５５５１頁、１９９２年参照）の下流に結合した
組み換えアデノウイルスを作製する。これら二種類のア
デノウイルスを動物細胞に同時に共感染（Cotransfecti
on）させて遺伝子導入を行う。その際コントロールとし
てｔＴＡ単独（Bujard らと同じ系）とｔＴＡに核移行
シグナル（ＮＬＳ）を付加したＮｔＴＡの二種類の組み
換えアデノウイルスを作製し、両者のテトラサイクリン
存在下での遺伝子発現の抑制能とテトラサイクリン非存
在下での遺伝子発現の誘導能を比較検討する。その結
果、テトラサイクリン非存在下のｔＴＡの系でｌａｃＺ
遺伝子の発現が３０％程度であるのに対して、ＮｔＴＡ
の系では８０％以上と２.７倍以上の遺伝子発現の増強
が認められる。
【００１９】一方、テトラサイクリン存在下のＮｔＴＡ
を用いた系では遺伝子の発現が１００％抑制されるのに
対して、ｔＴＡを用いた系では５０％程度の遺伝子発現
抑制が認められるにすぎない。 以上のような、操作を
経て、当業者であれば、それぞれの組み換え遺伝子の作
用を確認することにより、本発明に到ることができるで
あろう。
を用いた系では遺伝子の発現が１００％抑制されるのに
対して、ｔＴＡを用いた系では５０％程度の遺伝子発現
抑制が認められるにすぎない。 以上のような、操作を
経て、当業者であれば、それぞれの組み換え遺伝子の作
用を確認することにより、本発明に到ることができるで
あろう。
【００２０】さらに本発明によれば、上記ウイルスの他
のウイルスとの組み合わせ使用も提供される。例えば、
適当なプロモーターおよびＮｔＴＡが組み込まれた遺伝
子を含むアデノウイルス（第１のウイルスという）は、
レトロウイルスの複製に関与するｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子
がテトラサイクリンにより制御可能なテトラサイクリン
・プロモーター（Ｔｅｔプロモーター）の下流に組み込
まれている遺伝子を含む組み換えアデノウイルス（第２
のウイルスという）およびレトロウイルスの外被タンパ
ク質をコードする遺伝子がＴｅｔプロモーターの下流に
組み込まれている遺伝子を含む組み換えアデノウイルス
（第３のウイルスという）と組み合わせて使用すること
により、別異の用途を提供する。
のウイルスとの組み合わせ使用も提供される。例えば、
適当なプロモーターおよびＮｔＴＡが組み込まれた遺伝
子を含むアデノウイルス（第１のウイルスという）は、
レトロウイルスの複製に関与するｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子
がテトラサイクリンにより制御可能なテトラサイクリン
・プロモーター（Ｔｅｔプロモーター）の下流に組み込
まれている遺伝子を含む組み換えアデノウイルス（第２
のウイルスという）およびレトロウイルスの外被タンパ
ク質をコードする遺伝子がＴｅｔプロモーターの下流に
組み込まれている遺伝子を含む組み換えアデノウイルス
（第３のウイルスという）と組み合わせて使用すること
により、別異の用途を提供する。
【００２１】例えば、上記ウイルス群により、動物細胞
を感染することにより、レトロウイルスの高発現系が提
供できる。また、特定の動物細胞に第１、２および３の
ウイルスを共感染し、他方、第１および第２のウイルス
を共感染し、それぞれの細胞における遺伝子の導入効率
を検出し、後者細胞での前記導入効率が前者の細胞のそ
れと同様に（若干効率が低下する場合も含む）認められ
る場合には、感染に用いられた細胞は、いずれかのレト
ロウイルスによって感染されていたことが推測できる。
従って、本発明によれば、動物細胞がレトロウイルスに
よって感染されているか否かを検出することもできる。
を感染することにより、レトロウイルスの高発現系が提
供できる。また、特定の動物細胞に第１、２および３の
ウイルスを共感染し、他方、第１および第２のウイルス
を共感染し、それぞれの細胞における遺伝子の導入効率
を検出し、後者細胞での前記導入効率が前者の細胞のそ
れと同様に（若干効率が低下する場合も含む）認められ
る場合には、感染に用いられた細胞は、いずれかのレト
ロウイルスによって感染されていたことが推測できる。
従って、本発明によれば、動物細胞がレトロウイルスに
よって感染されているか否かを検出することもできる。
【００２２】
【実施例】以下、具体例を挙げ本発明をさらに詳細に説
明する。
明する。
【００２３】実施例１ プラスミドｐＵＨＤ１５−１（M.Gossen ら、Proceedin
gs of National Academy of Science, USA ８９巻、５
５４７−５５５１頁、１９９２年参照）をＸｈｏＩとＨ
ｉｎｄＩＩＩで切断し、２.３ｋｂのＣＭｔＴＡ断片を
作製した。この断片の末端を平滑（Blunt end）化した
後、プラスミドｐＡｘｃｗのＳｗａＩ（制限酵素Ｓｗａ
Ｉはベーリンガー・マンハイム社より購入した、特記し
ないかぎり、他の制限酵素は全てニューイングランド・
バイオ・ラボ社より購入した）部位に挿入してコスミド
ｐＡｘＣＭｔＴＡを作製し、さらに斎藤らの方法（S.Mi
yake ら、Proceedings of National Academy of Scienc
e, USA、９３巻、１３２０−１３２４頁、１９９６）に
従ってこのコスミドとヒトアデノウイルス５型のＤＮＡ
−ＴＰＣ（ターミナル・ペプチド・コンプレックス）と
をヒト２９３細胞（ATCC CRL−１５７３）へトランス
フェクトすることにより組み換えアデノウイルス（Ａｘ
ＣＭｔＴＡ）を作製した（図１参照）。
gs of National Academy of Science, USA ８９巻、５
５４７−５５５１頁、１９９２年参照）をＸｈｏＩとＨ
ｉｎｄＩＩＩで切断し、２.３ｋｂのＣＭｔＴＡ断片を
作製した。この断片の末端を平滑（Blunt end）化した
後、プラスミドｐＡｘｃｗのＳｗａＩ（制限酵素Ｓｗａ
Ｉはベーリンガー・マンハイム社より購入した、特記し
ないかぎり、他の制限酵素は全てニューイングランド・
バイオ・ラボ社より購入した）部位に挿入してコスミド
ｐＡｘＣＭｔＴＡを作製し、さらに斎藤らの方法（S.Mi
yake ら、Proceedings of National Academy of Scienc
e, USA、９３巻、１３２０−１３２４頁、１９９６）に
従ってこのコスミドとヒトアデノウイルス５型のＤＮＡ
−ＴＰＣ（ターミナル・ペプチド・コンプレックス）と
をヒト２９３細胞（ATCC CRL−１５７３）へトランス
フェクトすることにより組み換えアデノウイルス（Ａｘ
ＣＭｔＴＡ）を作製した（図１参照）。
【００２４】ｔＴＡ遺伝子はｐＵＨＤ１５−１をＸｂａ
Ｉで切断後 Blunt end 化し、次いでＢａｍＨＩで切断
することにより約１ｋｂのフラグメントとして切り出し
た。また、ｐＲｘ・ｎＺｐＡ遺伝子はプラスミドｐＲｘ
ＬａｃＺ（Dr.Wakimoto［（財）癌研究会癌化学療法セ
ンター］より入手）のＬａｃＺ配列の５’末端側に合成
したＸＲ３０−ＰＫ配列（---CC ATG GAT AAA GCT GAA
TTT CTC GAA GCT CCTAAG AAG AAA CGT AAG GTA GAA GA
T CCT AGG AAT TC---、D.Kalderon ら、Cell３９巻、
頁４９９−５０９、１９８４年参照）を付加してプラス
ミドｐＲｘ・ｎＺを作製した後、プラスミドｐＲｘ・ｎ
ＺをＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断して得た３’末
端のＬＴＲ断片をプラスミドｐＵＨＤ１５−１由来の約
４７０ｂｐのＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断して得
た断片であるＳＶ４０のｐｏｌｙ（Ａ）配列と置き換え
て作製した。ｐＲｘＮｔＴＡはプラスミドｐＲｘ・ｎＺ
ｐＡをＥｃｏＲＩで切断後 Blunt end 化し、さらにＢ
ａｍＨＩで切断した部位に先のｔＴＡ遺伝子をつなぐこ
とによって作製した。このプラスミドでは、ＸＲ３０−
ＰＫの核内移行シグナル（ＮＬＳ）がｔＴＡ遺伝子のコ
ード化するタンパク質のＮ末端にフレームを合せるよう
にｔＴＡ遺伝子へ結合されている。
Ｉで切断後 Blunt end 化し、次いでＢａｍＨＩで切断
することにより約１ｋｂのフラグメントとして切り出し
た。また、ｐＲｘ・ｎＺｐＡ遺伝子はプラスミドｐＲｘ
ＬａｃＺ（Dr.Wakimoto［（財）癌研究会癌化学療法セ
ンター］より入手）のＬａｃＺ配列の５’末端側に合成
したＸＲ３０−ＰＫ配列（---CC ATG GAT AAA GCT GAA
TTT CTC GAA GCT CCTAAG AAG AAA CGT AAG GTA GAA GA
T CCT AGG AAT TC---、D.Kalderon ら、Cell３９巻、
頁４９９−５０９、１９８４年参照）を付加してプラス
ミドｐＲｘ・ｎＺを作製した後、プラスミドｐＲｘ・ｎ
ＺをＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断して得た３’末
端のＬＴＲ断片をプラスミドｐＵＨＤ１５−１由来の約
４７０ｂｐのＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断して得
た断片であるＳＶ４０のｐｏｌｙ（Ａ）配列と置き換え
て作製した。ｐＲｘＮｔＴＡはプラスミドｐＲｘ・ｎＺ
ｐＡをＥｃｏＲＩで切断後 Blunt end 化し、さらにＢ
ａｍＨＩで切断した部位に先のｔＴＡ遺伝子をつなぐこ
とによって作製した。このプラスミドでは、ＸＲ３０−
ＰＫの核内移行シグナル（ＮＬＳ）がｔＴＡ遺伝子のコ
ード化するタンパク質のＮ末端にフレームを合せるよう
にｔＴＡ遺伝子へ結合されている。
【００２５】プラスミドｐＴｅｔＺはプラスミドｐＲｘ
・ｎＺ（Dr.Wakimoto（上記）より入手）をＸｂａＩと
ＢａｍＨＩで切断して得た約３.１ｋｂのＮＬＳ−ｌａ
ｃＺ断片をプラスミドｐＵＨＤ１０−３（M.Gossen
ら、Proceedings of National Academy of Science, US
A ８９巻、５５４７−５５５１頁、１９９２年参照）の
ＸｂａＩとＢａｍＨＩ部位に挿入して作製した。このｐ
ＴｅｔＺをＸｈｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断後、Ｔ４
ＤＮＡ ポリメラーゼ（ニューイングランド・バイオ・
ラボ社より購入)により Blunt end にした。この約４.
１ｋｂの断片を前述のような斎藤らの方法によりｐＡｘ
ｃｗのＳｗａＩ部位に挿入してｌａｃＺ遺伝子を挿入し
た組み換えアデノウイルス（ＡｘＴｅｔＺ）を作製した
（図１参照）。
・ｎＺ（Dr.Wakimoto（上記）より入手）をＸｂａＩと
ＢａｍＨＩで切断して得た約３.１ｋｂのＮＬＳ−ｌａ
ｃＺ断片をプラスミドｐＵＨＤ１０−３（M.Gossen
ら、Proceedings of National Academy of Science, US
A ８９巻、５５４７−５５５１頁、１９９２年参照）の
ＸｂａＩとＢａｍＨＩ部位に挿入して作製した。このｐ
ＴｅｔＺをＸｈｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断後、Ｔ４
ＤＮＡ ポリメラーゼ（ニューイングランド・バイオ・
ラボ社より購入)により Blunt end にした。この約４.
１ｋｂの断片を前述のような斎藤らの方法によりｐＡｘ
ｃｗのＳｗａＩ部位に挿入してｌａｃＺ遺伝子を挿入し
た組み換えアデノウイルス（ＡｘＴｅｔＺ）を作製した
（図１参照）。
【００２６】プラスミドｐＴｅｔＮｔＴＡはプラスミド
ｐＲｘＮｔＴＡをＮｃｏＩとＢａｍＨＩで切断した約
１.１ｋｂの断片をプラスミドｐＴｅｔＺのＮｃｏＩと
ＢａｍＨＩの切断部位に挿入して作製した。プラスミド
ｐＣＭＮｔＴＡは、プラスミドｐＵＨＤ１５−１からＥ
ｃｏＲＩで切断した後、Blunt end 化し、さらにＸｈｏ
Ｉで切断して得た０.７７ｋｂのＣＭプロモーター断片
を先に作製したプラスミドｐＴｅｔＮｔＴＡのＫｐｎＩ
切断後 Blunt end 化した後、ＸｈｏＩで切断した部位
へクローニングすることにより作製した。ＣＭＮｔＴＡ
遺伝子を発現する組み換えアデノウイルス（ＡｘＣＭＮ
ｔＴＡ）は、ＣＭＮｔＴＡ遺伝子をＸｈｏＩとＨｉｎｄ
ＩＩＩで切断して２.３ｋｂのフラグメントとして切り
出し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで Blunt end 化し、コ
スミドｐＡｘｃｗのＳｗａＩ部位へクローニングしてコ
スミドｐＡｘＣＭＮｔＴＡを作製した後、前述のような
斎藤らの方法により作製した（図１参照）。
ｐＲｘＮｔＴＡをＮｃｏＩとＢａｍＨＩで切断した約
１.１ｋｂの断片をプラスミドｐＴｅｔＺのＮｃｏＩと
ＢａｍＨＩの切断部位に挿入して作製した。プラスミド
ｐＣＭＮｔＴＡは、プラスミドｐＵＨＤ１５−１からＥ
ｃｏＲＩで切断した後、Blunt end 化し、さらにＸｈｏ
Ｉで切断して得た０.７７ｋｂのＣＭプロモーター断片
を先に作製したプラスミドｐＴｅｔＮｔＴＡのＫｐｎＩ
切断後 Blunt end 化した後、ＸｈｏＩで切断した部位
へクローニングすることにより作製した。ＣＭＮｔＴＡ
遺伝子を発現する組み換えアデノウイルス（ＡｘＣＭＮ
ｔＴＡ）は、ＣＭＮｔＴＡ遺伝子をＸｈｏＩとＨｉｎｄ
ＩＩＩで切断して２.３ｋｂのフラグメントとして切り
出し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで Blunt end 化し、コ
スミドｐＡｘｃｗのＳｗａＩ部位へクローニングしてコ
スミドｐＡｘＣＭＮｔＴＡを作製した後、前述のような
斎藤らの方法により作製した（図１参照）。
【００２７】作製した組み換えアデノウイルスＡｘＣＭ
ｔＴＡと組み換えアデノウイルスＡｘＣＭＮｔＴＡをＭ
ＯＩ＝１０から１２５０の範囲でＨｅＬａ細胞に感染さ
せたところ、ＭＯＩ＝２５０でテトラサイクリン非存在
下でＮｔＴＡを担持するアデノウイルスを用いた系の方
が、ｔＴＡを担持するアデノウイルスを用いた系より約
２.７倍の遺伝子発現が認められた。また、テトラサイ
クリン存在下ではＮｔＴＡを担持するアデノウイルスを
用いた系では遺伝子発現が完全に抑制されていたのに対
して、ｔＴＡを担持するアデノウイルスを用いた系では
５０％程度の抑制しか認められなかった（図２参照）。
ｔＴＡと組み換えアデノウイルスＡｘＣＭＮｔＴＡをＭ
ＯＩ＝１０から１２５０の範囲でＨｅＬａ細胞に感染さ
せたところ、ＭＯＩ＝２５０でテトラサイクリン非存在
下でＮｔＴＡを担持するアデノウイルスを用いた系の方
が、ｔＴＡを担持するアデノウイルスを用いた系より約
２.７倍の遺伝子発現が認められた。また、テトラサイ
クリン存在下ではＮｔＴＡを担持するアデノウイルスを
用いた系では遺伝子発現が完全に抑制されていたのに対
して、ｔＴＡを担持するアデノウイルスを用いた系では
５０％程度の抑制しか認められなかった（図２参照）。
【００２８】実施例２ プラスミドｐＣＡＮｔＴＡの作製は、まずプラスミドｐ
ＣＡＧＧＳ（H.Niwaら、Gene １０８巻、１９３−２０
０頁、１９９１年参照）をＳａｌＩとＨｉｎｄＩＩＩで
切断後 Blunt end 化した後、ＣｌａＩリンカーを結合
させてプラスミドｐＣＡｃｃを作製し、次いでこのプラ
スミドｐＣＡｃｃをＥｃｏＲＩで切断後 Blunt end 化
した部位にプラスミドｐＴｅｔＮｔＴＡをＫｐｎＩとＨ
ｉｎｄＩＩＩで切断後 Blunt end 化した約１.５ｋｂの
断片を挿入により行った。プラスミドｐＣＡＮｔＴＡを
ＣｌａＩで切断した約２.７ｋｂの断片を前述の斎藤ら
の方法によりプラスミドｐＡｘｃｗのＣｌａＩ部位に挿
入して組み換えアデノウイルスＡｘＣＡＮｔＴＡを作製
した（図１参照）。
ＣＡＧＧＳ（H.Niwaら、Gene １０８巻、１９３−２０
０頁、１９９１年参照）をＳａｌＩとＨｉｎｄＩＩＩで
切断後 Blunt end 化した後、ＣｌａＩリンカーを結合
させてプラスミドｐＣＡｃｃを作製し、次いでこのプラ
スミドｐＣＡｃｃをＥｃｏＲＩで切断後 Blunt end 化
した部位にプラスミドｐＴｅｔＮｔＴＡをＫｐｎＩとＨ
ｉｎｄＩＩＩで切断後 Blunt end 化した約１.５ｋｂの
断片を挿入により行った。プラスミドｐＣＡＮｔＴＡを
ＣｌａＩで切断した約２.７ｋｂの断片を前述の斎藤ら
の方法によりプラスミドｐＡｘｃｗのＣｌａＩ部位に挿
入して組み換えアデノウイルスＡｘＣＡＮｔＴＡを作製
した（図１参照）。
【００２９】プラスミドｐＵＨＤ１５−１をＸｂａＩで
切断後 Blunt end 化した後、さらにＢａｍＨＩで切断
した約１ｋｂのｔＴＡ断片を作製した。このｔＴＡ断片
を実施例１で作製したプラスミドｐＲｘ・ｎＺｐＡのＥ
ｃｏＲＩ切断後 Blunt end 化し、さらにＢａｍＨＩで
切断した部位に挿入してプラスミドｐＲｘＮｔＴＡを作
製した。プラスミドｐＲｘＮｔＴＡをＸｈｏＩとＨｉｎ
ｄＩＩＩで切断し Bluntend 化した約３.６ｋｂの断片
を前述のような斎藤らの方法によりプラスミドｐＡｘｃ
ｗのＳｗａＩ部位に挿入して組み換えアデノウイルスＡ
ｘＲｘＮｔＴＡを作製した（図１参照）。
切断後 Blunt end 化した後、さらにＢａｍＨＩで切断
した約１ｋｂのｔＴＡ断片を作製した。このｔＴＡ断片
を実施例１で作製したプラスミドｐＲｘ・ｎＺｐＡのＥ
ｃｏＲＩ切断後 Blunt end 化し、さらにＢａｍＨＩで
切断した部位に挿入してプラスミドｐＲｘＮｔＴＡを作
製した。プラスミドｐＲｘＮｔＴＡをＸｈｏＩとＨｉｎ
ｄＩＩＩで切断し Bluntend 化した約３.６ｋｂの断片
を前述のような斎藤らの方法によりプラスミドｐＡｘｃ
ｗのＳｗａＩ部位に挿入して組み換えアデノウイルスＡ
ｘＲｘＮｔＴＡを作製した（図１参照）。
【００３０】プラスミドｐＲｘＮｔＴＡをＮｃｏＩとＢ
ａｍＨＩで切断した約１.１ｋｂの断片を実施例1で作製
したプラスミドｐＴｅｔＺのＮｃｏＩとＢａｍＨＩの切
断部位に挿入してｐＴｅｔＮｔＴＡを作製し、前述のよ
うな斎藤らの方法によりこれからｐＡｘｃｗのＳｗａＩ
部位に挿入することにより組み換えアデノウイルスＡｘ
ＴｅｔＮｔＴＡを作製した（図１参照）。作製した組み
換えアデノウイルスＡｘＣＡＮｔＴＡ、ＡｘＣＭＮｔＴ
Ａ、ＡｘＲｘＮｔＴＡとＡｘＴｅｔＮｔＴＡをＭＯＩ＝
２５０でＨｅＬａ細胞に感染させたところ、テトラサイ
クリン非存在下でＣＡプロモーターを用いた系では８
５.５％の遺伝子発現が認められ、ＣＭプロモーターを
用いると８２.７の遺伝子発現が認められ、Ｒｘプロモ
ーターを用いた系では８２.４％の遺伝子発現が認めら
れ、Ｔｅｔプロモーターを用いた系では３９.９％の遺
伝子発現が認められた。また、テトラサイクリン存在下
では四者とも遺伝子発現が完全に抑制されていた。この
結果と実施例１の結果をまとめると表１のようにＣＡ、
ＣＭおよびＲｘの各プロモーターはほぼ同等の遺伝子発
現活性を示したが、Ｔｅｔプロモーターは約半分の遺伝
子発現活性しか示さなかった。しかしながら、ＮｔＴＡ
を用いた系はいずれもＣＭｔＴＡを用いた系よりも遺伝
子発現活性は高かった（図３参照）。
ａｍＨＩで切断した約１.１ｋｂの断片を実施例1で作製
したプラスミドｐＴｅｔＺのＮｃｏＩとＢａｍＨＩの切
断部位に挿入してｐＴｅｔＮｔＴＡを作製し、前述のよ
うな斎藤らの方法によりこれからｐＡｘｃｗのＳｗａＩ
部位に挿入することにより組み換えアデノウイルスＡｘ
ＴｅｔＮｔＴＡを作製した（図１参照）。作製した組み
換えアデノウイルスＡｘＣＡＮｔＴＡ、ＡｘＣＭＮｔＴ
Ａ、ＡｘＲｘＮｔＴＡとＡｘＴｅｔＮｔＴＡをＭＯＩ＝
２５０でＨｅＬａ細胞に感染させたところ、テトラサイ
クリン非存在下でＣＡプロモーターを用いた系では８
５.５％の遺伝子発現が認められ、ＣＭプロモーターを
用いると８２.７の遺伝子発現が認められ、Ｒｘプロモ
ーターを用いた系では８２.４％の遺伝子発現が認めら
れ、Ｔｅｔプロモーターを用いた系では３９.９％の遺
伝子発現が認められた。また、テトラサイクリン存在下
では四者とも遺伝子発現が完全に抑制されていた。この
結果と実施例１の結果をまとめると表１のようにＣＡ、
ＣＭおよびＲｘの各プロモーターはほぼ同等の遺伝子発
現活性を示したが、Ｔｅｔプロモーターは約半分の遺伝
子発現活性しか示さなかった。しかしながら、ＮｔＴＡ
を用いた系はいずれもＣＭｔＴＡを用いた系よりも遺伝
子発現活性は高かった（図３参照）。
【００３１】表１：核移行シグナル（ＮＬＳ）および種々のプロモーターによる導入遺伝子の 発現効率の比較 遺伝子発現系 AxCANtTA AxCMNtTA AxRxNtTA AxTetNtTA AxCMtTA 発現効率(％） 85.5 82.7 82.4 39.9 29.2 作製した各アデノウイルスを用いて遺伝子導入した各細
胞のテトラサイクリン存在下での遺伝子発現はＮｔＴＡ
を用いた系ではテトラサイクリン１μｇ／ｍｌ以上の濃
度で完全に抑制されているのに対して、ｔＴＡの系では
テトラサイクリン１００μｇ／ｍｌの濃度でも完全に抑
制されていない。また、テトラサイクリン非存在下では
ＣＭＮｔＴＡ、ＣＡＮｔＴＡおよびＲｘＮｔＴＡの系で
は８０％以上の導入遺伝子の発現効率が認められるが、
ＣＭｔＴＡの系では約２５％の発現効率しか認められな
かった（図４参照）。
胞のテトラサイクリン存在下での遺伝子発現はＮｔＴＡ
を用いた系ではテトラサイクリン１μｇ／ｍｌ以上の濃
度で完全に抑制されているのに対して、ｔＴＡの系では
テトラサイクリン１００μｇ／ｍｌの濃度でも完全に抑
制されていない。また、テトラサイクリン非存在下では
ＣＭＮｔＴＡ、ＣＡＮｔＴＡおよびＲｘＮｔＴＡの系で
は８０％以上の導入遺伝子の発現効率が認められるが、
ＣＭｔＴＡの系では約２５％の発現効率しか認められな
かった（図４参照）。
【００３２】実施例３ 実施例１で作製した組み換えアデノウイルスＡｘＣＭｔ
ＴＡまたはＡｘＣＭＮｔＴＡとＡｘＴｅｔＺをＨｅＬａ
細胞に共感染させた後、テトラサイクリン存在下または
非存在下で培養した後にβ−Ｇａｌ染色を行ったとこ
ろ、ｔＴＡ（ＡｘＣＭｔＴＡとＡｘＴｅｔＺ）の系では
テトラサイクリン非存在下では総細胞数の約３０％の細
胞しか染色されなっかたが、ＮｔＴＡ（ＡｘＣＭＮｔＴ
ＡとＡｘＴｅＴｚ）の系では総細胞数のほぼ１００％の
細胞が染色された。また、テトラサイクリン存在下では
ＮｔＴＡの系では全く染色されず完全にβ−Ｇａｌの発
現が抑制されているのに対して、ｔＴＡの系では一部
（１５％）の細胞が染色されβ−Ｇａｌの発現は５０％
程度しか抑制されていなかった（図５および６参照）。 実施例４ プラスミドｐＳＫＩＩ＋ＶＳＶＧは、プラスミドｐＬＧ
ＲＮＬ（N.Emi ら、Journal of Virology ６５巻、１２
０２−１２０７頁、１９９１年参照）をＢａｍＨＩで切
断した約１.６ｋｂの断片を用いて作製した。プラスミ
ドｐＴｅｔＶＳＶＧは、プラスミドｐＳＫＩＩ＋ＶＳＶ
ＧをＢａｍＨＩで切断した約１.６ｋｂの断片をプラス
ミドｐＵＨＤ１０−３のＢａｍＨＩ部位に挿入して作製
した。プラスミドｐＴｅｔＶＳＶＧをＸｈｏＩとＨｉｎ
ｄＩＩＩで切断した後 Blunt end化した約２.４ｋｂの
断片を斎藤らの方法によりラスミドｐＡｘｃｗのＳｗａ
Ｉ部位に挿入して組み換えアデノウイルスＡｘＴｅｔＶ
ＳＶＧを作製した（図１参照）。
ＴＡまたはＡｘＣＭＮｔＴＡとＡｘＴｅｔＺをＨｅＬａ
細胞に共感染させた後、テトラサイクリン存在下または
非存在下で培養した後にβ−Ｇａｌ染色を行ったとこ
ろ、ｔＴＡ（ＡｘＣＭｔＴＡとＡｘＴｅｔＺ）の系では
テトラサイクリン非存在下では総細胞数の約３０％の細
胞しか染色されなっかたが、ＮｔＴＡ（ＡｘＣＭＮｔＴ
ＡとＡｘＴｅＴｚ）の系では総細胞数のほぼ１００％の
細胞が染色された。また、テトラサイクリン存在下では
ＮｔＴＡの系では全く染色されず完全にβ−Ｇａｌの発
現が抑制されているのに対して、ｔＴＡの系では一部
（１５％）の細胞が染色されβ−Ｇａｌの発現は５０％
程度しか抑制されていなかった（図５および６参照）。 実施例４ プラスミドｐＳＫＩＩ＋ＶＳＶＧは、プラスミドｐＬＧ
ＲＮＬ（N.Emi ら、Journal of Virology ６５巻、１２
０２−１２０７頁、１９９１年参照）をＢａｍＨＩで切
断した約１.６ｋｂの断片を用いて作製した。プラスミ
ドｐＴｅｔＶＳＶＧは、プラスミドｐＳＫＩＩ＋ＶＳＶ
ＧをＢａｍＨＩで切断した約１.６ｋｂの断片をプラス
ミドｐＵＨＤ１０−３のＢａｍＨＩ部位に挿入して作製
した。プラスミドｐＴｅｔＶＳＶＧをＸｈｏＩとＨｉｎ
ｄＩＩＩで切断した後 Blunt end化した約２.４ｋｂの
断片を斎藤らの方法によりラスミドｐＡｘｃｗのＳｗａ
Ｉ部位に挿入して組み換えアデノウイルスＡｘＴｅｔＶ
ＳＶＧを作製した（図１参照）。
【００３３】作製した組み換えアデノウイルスＡｘＴｅ
ｔＶＳＶＧとＡｘＲｘＮｔＴＡの両者をＨｅＬａ細胞に
共感染させ、ＶＳＶＧに対するモノクローナル抗体（ク
ローン Ｐ５Ｄ４，Sigma ＃Ｖ５５０７) を用いて免疫
染色を行ったところ、ほぼ１００％の細胞でＶＳＶＧ遺
伝子産物の発現が認められた。これに反し、上記組み換
えアデノウイルスのいずれか１種をＨｅＬａ細胞に感染
させた場合には、いずれもＶＳＶＧ遺伝子産物の発現は
認められなかった。
ｔＶＳＶＧとＡｘＲｘＮｔＴＡの両者をＨｅＬａ細胞に
共感染させ、ＶＳＶＧに対するモノクローナル抗体（ク
ローン Ｐ５Ｄ４，Sigma ＃Ｖ５５０７) を用いて免疫
染色を行ったところ、ほぼ１００％の細胞でＶＳＶＧ遺
伝子産物の発現が認められた。これに反し、上記組み換
えアデノウイルスのいずれか１種をＨｅＬａ細胞に感染
させた場合には、いずれもＶＳＶＧ遺伝子産物の発現は
認められなかった。
【００３４】実施例５ レトロウイルス・ベクターの産生効率をモニターするこ
とを目的に、レポーター遺伝子ｌａｃＺを発現するレト
ロウイルス・ベクターＭＦＧｌａｃＺ（Dranoff ら、Pr
oceedings of National Academy of Science, USA ９０
巻、３５３９−３５４３頁、１９９３年参照）をＡ３７
５，Ｕ３７３，Ｔ９８Ｇ，Ａ１７２などのヒト培養細胞
へ感染させ、それぞれＡ３７５／Ｚ，Ｕ３７３／Ｚ，Ｔ
９８Ｇ／Ｚ，Ａ１７２／Ｚなどの遺伝子導入細胞株を得
た。ｌａｃＺ遺伝子導入効率は、フローサイトメーター
によるｌａｃＺの発現検出、並びにＸ−ｇａｌ 染色に
よる検出を並用して評価した。Ａ３７５，Ｕ３７３，Ａ
１７２，Ｔ９８Ｇともに５０％〜１００％の高い効率で
ｌａｃＺ遺伝子の遺伝子導入株が得られた。
とを目的に、レポーター遺伝子ｌａｃＺを発現するレト
ロウイルス・ベクターＭＦＧｌａｃＺ（Dranoff ら、Pr
oceedings of National Academy of Science, USA ９０
巻、３５３９−３５４３頁、１９９３年参照）をＡ３７
５，Ｕ３７３，Ｔ９８Ｇ，Ａ１７２などのヒト培養細胞
へ感染させ、それぞれＡ３７５／Ｚ，Ｕ３７３／Ｚ，Ｔ
９８Ｇ／Ｚ，Ａ１７２／Ｚなどの遺伝子導入細胞株を得
た。ｌａｃＺ遺伝子導入効率は、フローサイトメーター
によるｌａｃＺの発現検出、並びにＸ−ｇａｌ 染色に
よる検出を並用して評価した。Ａ３７５，Ｕ３７３，Ａ
１７２，Ｔ９８Ｇともに５０％〜１００％の高い効率で
ｌａｃＺ遺伝子の遺伝子導入株が得られた。
【００３５】プラスミドｐＴｅｔＧＰは、ＭｏＭＬＶ
（Schnich ら、Nature ２９３巻、５４３−５４８頁、
１９８１年参照）の５３０７ｂｐのｇａｇ−ｐｏｌ遺伝
子を、ｎｔ５６３（ＨｉｎｄＩＩＩ)からｎｔ５８７０
（ＳｃａＩ）まででＨｉｎｄＩＩＩ／ＳｃａＩにより切
り出したものと、ＴｅｔプロモーターをＸｈｏＩで切断
後 Blunt end 化し、さらにＥｃｏＲＩで切り出したも
のとを、ｐＣＡｃｃのＳｐｅＩとＢｇｌＩＩ部位へクロ
ーニングすることによって作製した。（ただし、実際に
はＭｏＭＬＶのｇａｇ−ｐｏｌをフラグメントに分けて
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫＩＩへサブクローニング
し、さらにｐＣＡｃｃへサブクローニングしてｐＣＡ・
ＧＰをつくり、これのＣＡプロモーターをＴｅｔプロモ
ーターに入れかえるという、複数のステップでｐＴｅｔ
ＧＰが作製されている。）コスミドｐＡｘＴｅｔＧＰ
は、ｐＴｅｔＧＰのからＣｌａＩへクローニングして作
製した。さらに、コスミドｐＡｘＴｅｔＧＰとＡｄ５・
ＤＮＡ−ＴＰＣを２９３細胞へ共感染して、組み換えア
デノウイルスＡｘＴｅｔＧＰを作製した。
（Schnich ら、Nature ２９３巻、５４３−５４８頁、
１９８１年参照）の５３０７ｂｐのｇａｇ−ｐｏｌ遺伝
子を、ｎｔ５６３（ＨｉｎｄＩＩＩ)からｎｔ５８７０
（ＳｃａＩ）まででＨｉｎｄＩＩＩ／ＳｃａＩにより切
り出したものと、ＴｅｔプロモーターをＸｈｏＩで切断
後 Blunt end 化し、さらにＥｃｏＲＩで切り出したも
のとを、ｐＣＡｃｃのＳｐｅＩとＢｇｌＩＩ部位へクロ
ーニングすることによって作製した。（ただし、実際に
はＭｏＭＬＶのｇａｇ−ｐｏｌをフラグメントに分けて
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫＩＩへサブクローニング
し、さらにｐＣＡｃｃへサブクローニングしてｐＣＡ・
ＧＰをつくり、これのＣＡプロモーターをＴｅｔプロモ
ーターに入れかえるという、複数のステップでｐＴｅｔ
ＧＰが作製されている。）コスミドｐＡｘＴｅｔＧＰ
は、ｐＴｅｔＧＰのからＣｌａＩへクローニングして作
製した。さらに、コスミドｐＡｘＴｅｔＧＰとＡｄ５・
ＤＮＡ−ＴＰＣを２９３細胞へ共感染して、組み換えア
デノウイルスＡｘＴｅｔＧＰを作製した。
【００３６】作製した組み換えアデノウイルスＡｘＴｅ
ｔＶＳＶＧ、ＡｘＴｅｔＧＰおよびＡｘＣＡＮｔＴＡの
三者ないしはそれらの何れかを先に作製したＡ３７５／
Ｚ細胞、Ｔ９８／Ｚ細胞、Ａ１７２／Ｚ細胞およびＵ３
７３／Ｚ細胞に共感染させ、２日後にレトロウイルスが
含まれていると思われる培養上清を回収した。このレト
ロウイルスを含くんでいると思われる培養上清を用い
て、モニター細胞（ＮＩＨ ３Ｔ３など）に８μｇ／ｍ
ｌポリブリーン（Polybrene <Sigma>）存在下で感染を
行い、２日後にＸ−ｇａｌ染色を行いレトロウイルスに
よる感染効率を算出して、表２にまとめる。この結果、
Ａ３７５／Ｚ細胞、Ｔ９８／Ｚ細胞およびＵ３７３／Ｚ
細胞から１０5〜１０6ｐｆｕ／ｍｌの高タイターのＬａ
ｃＺ遺伝子を組み込んだ Pseudotype のレトロウイルス
が回収できることが示された。一方、Ａ１７２／Ｚ細胞
のレトロウイルス産生能は低かった。この方法を用いる
とレトロウイルス産生能の高い細胞株を容易に選択する
ことが出来る。また、Ａ３７５／Ｚ細胞はアデノウイル
スＡｘＴｅｔＶＳＶＧを同時に感染させなくてもレトロ
ウイルスが産生された。このことはＡ３７５細胞がレト
ロウイルスの複製に必要なｅｎｖ様蛋白の遺伝子をすで
に細胞内に有していることを示す。
ｔＶＳＶＧ、ＡｘＴｅｔＧＰおよびＡｘＣＡＮｔＴＡの
三者ないしはそれらの何れかを先に作製したＡ３７５／
Ｚ細胞、Ｔ９８／Ｚ細胞、Ａ１７２／Ｚ細胞およびＵ３
７３／Ｚ細胞に共感染させ、２日後にレトロウイルスが
含まれていると思われる培養上清を回収した。このレト
ロウイルスを含くんでいると思われる培養上清を用い
て、モニター細胞（ＮＩＨ ３Ｔ３など）に８μｇ／ｍ
ｌポリブリーン（Polybrene <Sigma>）存在下で感染を
行い、２日後にＸ−ｇａｌ染色を行いレトロウイルスに
よる感染効率を算出して、表２にまとめる。この結果、
Ａ３７５／Ｚ細胞、Ｔ９８／Ｚ細胞およびＵ３７３／Ｚ
細胞から１０5〜１０6ｐｆｕ／ｍｌの高タイターのＬａ
ｃＺ遺伝子を組み込んだ Pseudotype のレトロウイルス
が回収できることが示された。一方、Ａ１７２／Ｚ細胞
のレトロウイルス産生能は低かった。この方法を用いる
とレトロウイルス産生能の高い細胞株を容易に選択する
ことが出来る。また、Ａ３７５／Ｚ細胞はアデノウイル
スＡｘＴｅｔＶＳＶＧを同時に感染させなくてもレトロ
ウイルスが産生された。このことはＡ３７５細胞がレト
ロウイルスの複製に必要なｅｎｖ様蛋白の遺伝子をすで
に細胞内に有していることを示す。
【００３７】表２：ＶＳＶＧシュードタイプレトロウイルス遺伝子導入効率 遺伝子導入効率（％） A375/Z T98/Z A172/Z U373/Z MOCK 0 0 0 0 TetVSVG単独 0 0 0 0 TetGP単独 0 0 0 0 CANtTA単独 0 0 0 0 TetVSVG+TetGP 0 0 2/0* 0 TetVSVG+CANtTA 3 0 0 0 TetGP+CANtTA 42.0±6.66 0.83±0.983 1.5±0.84 2.0±0.89 CANtTA+TetVSVG+TetGP 71.3±5.92 38.7±5.85 5.3±2.80 46.8±6.94 *２枚のプレートのうち１枚のみ遺伝子発現が認められた
【図１】本発明による組み換え遺伝子を公知の遺伝子と
比較しながら、遺伝子翻訳単位に基づき略図的に示す。
なお図中の略号は、それぞれ下記の意味を有する。 ＣＭ：サイトメガロウイルス・プロモーター ＣＡ：サイトメガロウイルス・エンハンサーとβ−アク
チン・プロモーターとを結合したプロモーター Ｒｘ：サイトメガロウイルス・エンハンサーとマウスモ
ロニー白血病ウイルス・プロモーターとを結合したプロ
モーター Ｔｅｔ：テトラサイクリン・プロモーター ｔＴＡ：テトラサイクリン・トランスアクチベーター ＮＬＳ：核移行シグナル ｐＡ：ポリＡシグナル
比較しながら、遺伝子翻訳単位に基づき略図的に示す。
なお図中の略号は、それぞれ下記の意味を有する。 ＣＭ：サイトメガロウイルス・プロモーター ＣＡ：サイトメガロウイルス・エンハンサーとβ−アク
チン・プロモーターとを結合したプロモーター Ｒｘ：サイトメガロウイルス・エンハンサーとマウスモ
ロニー白血病ウイルス・プロモーターとを結合したプロ
モーター Ｔｅｔ：テトラサイクリン・プロモーター ｔＴＡ：テトラサイクリン・トランスアクチベーター ＮＬＳ：核移行シグナル ｐＡ：ポリＡシグナル
【図２】本発明の組み換え遺伝子の発現系と公知の Buj
ard らによる遺伝子発現系の発現効率を対比して示すグ
ラフである。グラフ中、丸印はＣＭＮｔＴＡ（本発明）
に従う結果であり、四角はＣＭｔＴＡ（比較）に従う結
果である。それぞれ白ぬき印は、テトラサイクリン非存
在下での発現効率を示し、黒塗り印はテトラサイクリン
存在下での発現効率を示す。
ard らによる遺伝子発現系の発現効率を対比して示すグ
ラフである。グラフ中、丸印はＣＭＮｔＴＡ（本発明）
に従う結果であり、四角はＣＭｔＴＡ（比較）に従う結
果である。それぞれ白ぬき印は、テトラサイクリン非存
在下での発現効率を示し、黒塗り印はテトラサイクリン
存在下での発現効率を示す。
【図３】本発明の遺伝子発現系におけるプロモーターの
種類による遺伝子の発現効率の変動を示すグラフであ
る。グラフ中、それぞれ丸印はＣＡプロモーター、四角
印はＲｘプロモーターおよび三角印はＴｅｔプロモータ
ーによるＮｔＴＡの導入遺伝子の発現効率を示す。なお
白ぬき印はテトラサイクリン非存在下を、黒塗り印はテ
トラサイクリン存在下を示す。
種類による遺伝子の発現効率の変動を示すグラフであ
る。グラフ中、それぞれ丸印はＣＡプロモーター、四角
印はＲｘプロモーターおよび三角印はＴｅｔプロモータ
ーによるＮｔＴＡの導入遺伝子の発現効率を示す。なお
白ぬき印はテトラサイクリン非存在下を、黒塗り印はテ
トラサイクリン存在下を示す。
【図４】本発明による遺伝子発現系（ＣＭＮｔＴＡ：逆
三角印；ＣＡＮｔＴＡ：横向き三角印；ＴｅｔＮｔＴ
Ａ：三角印；ＲｘＮｔＴＡ：四角印）と比較例（tetＺ
単独：ひし形；ＣＭｔＴＡ：丸印）とのテトラサイクリ
ン濃度変化に伴う遺伝子の発現効率の変動を示すグラフ
である。
三角印；ＣＡＮｔＴＡ：横向き三角印；ＴｅｔＮｔＴ
Ａ：三角印；ＲｘＮｔＴＡ：四角印）と比較例（tetＺ
単独：ひし形；ＣＭｔＴＡ：丸印）とのテトラサイクリ
ン濃度変化に伴う遺伝子の発現効率の変動を示すグラフ
である。
【図５】比較例の遺伝子発現系（それぞれ感染細胞）に
おけるlacＺ遺伝子の発現状態を示すβ−Ｇａｌ染色を
行った細胞（生物）の形態を示す図に代わる電子顕微鏡
写真である。それぞれ、ａおよびｂはＴｅｔＺ単独（比
較）、ｃおよびｄはＣＭｔＴＡ（比較）に対応し、それ
ぞれ前者（ａ、ｃ）はテトラサイクリン非存在下で、一
方後者（ｂ、ｄ）はテトラサイクリン存在下での培養細
胞である。
おけるlacＺ遺伝子の発現状態を示すβ−Ｇａｌ染色を
行った細胞（生物）の形態を示す図に代わる電子顕微鏡
写真である。それぞれ、ａおよびｂはＴｅｔＺ単独（比
較）、ｃおよびｄはＣＭｔＴＡ（比較）に対応し、それ
ぞれ前者（ａ、ｃ）はテトラサイクリン非存在下で、一
方後者（ｂ、ｄ）はテトラサイクリン存在下での培養細
胞である。
【図６】本発明による遺伝子発現系（それぞれ感染細
胞）におけるlacＺ遺伝子の発現状態を示すβ−Ｇａｌ
染色を行った細胞（生物）の形態を示す図に代わる電子
顕微鏡写真である。それぞれ、ｅおよびｆはＣＭＮｔＴ
Ａ、ｇおよびｈはＣＡＮｔＴＡ、ｉおよびｊはＲｘＮｔ
ＴＡ、ならびにｋおよびｌはＴｅｔＮｔＴＡに対応し、
それぞれ前者（ｅ、ｇ、ｉ、ｋ）はテトラサイクリン非
存在下で、一方後者（ｆ、ｈ、ｊ、ｌ）はテトラサイク
リン存在下での培養細胞である。
胞）におけるlacＺ遺伝子の発現状態を示すβ−Ｇａｌ
染色を行った細胞（生物）の形態を示す図に代わる電子
顕微鏡写真である。それぞれ、ｅおよびｆはＣＭＮｔＴ
Ａ、ｇおよびｈはＣＡＮｔＴＡ、ｉおよびｊはＲｘＮｔ
ＴＡ、ならびにｋおよびｌはＴｅｔＮｔＴＡに対応し、
それぞれ前者（ｅ、ｇ、ｉ、ｋ）はテトラサイクリン非
存在下で、一方後者（ｆ、ｈ、ｊ、ｌ）はテトラサイク
リン存在下での培養細胞である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 7/00 Ｃ１２Ｒ 1:92）
Claims (18)
- 【請求項１】 核移行シグナル（ＮＬＳ）遺伝子および
テトラサイクリン・トランスアクチベーター（ｔＴＡ）
遺伝子を含んでなる組み換え遺伝子。 - 【請求項２】 前記ＮＬＳ遺伝子とｔＴＡ遺伝子がイン
フレームの状態で組み込まれた請求項１記載の組み換え
遺伝子。 - 【請求項３】 ＮＬＳ遺伝子がＳＶ４０ウイルスのラー
ジＴタンパク質に由来する請求項１記載の組み換え遺伝
子。 - 【請求項４】 プロモーター遺伝子をさらに含んでなる
請求項１〜３のいずれかに記載の組み換え遺伝子。 - 【請求項５】 プロモーター遺伝子が、サイトメガロウ
イルスのＣＭプロモーター、サイトメガロウイルスのエ
ンハンサーとマウスモロニー白血病ウイルスのプロモー
ターを結合したＲｘプロモーター、サイトメガロウイル
スのエンハンサーとベーター・アクチンのプロモーター
を結合したＣＡプロモーターおよびテトラサイクリン遺
伝子のＴｅｔプロモーターからなる群より選ばれる請求
項４記載の組み換え遺伝子。 - 【請求項６】 外来のタンパク質をコードする遺伝子を
さらに担持する請求項５記載の組み換え遺伝子。 - 【請求項７】 外来のタンパク質がウイルスの外被タン
パク質、ホルモン、サイトカイン、ならびにホルモンお
よびサイトカインのレセプターからなる群より選ばれる
少なくとも１種である請求項６記載の組み換え遺伝子。 - 【請求項８】 請求項１〜７のいずれかに記載の組み換
え遺伝子を担持するプラスミド。 - 【請求項９】 請求項８記載のプラスミドを含むウイル
ス。 - 【請求項１０】 宿主ウイルスがアデノウイルスである
請求項８記載のウイルス。 - 【請求項１１】 インフレームの状態で組み込まれたＮ
ＬＳ遺伝子およびｔＴＡ遺伝子が前記プロモーターの下
流に組み込まれている組み換え遺伝子を含む請求項１０
記載のウイルス。 - 【請求項１２】 請求項９〜１１のいずれかに記載のウ
イルスでトランスフェクションされた動物細胞。 - 【請求項１３】 トランスフェクションされる細胞が哺
乳動物の腫瘍細胞である請求項１２記載の動物細胞。 - 【請求項１４】 請求項１１記載のウイルスを、レトロ
ウイルスの複製に関与するｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子がテト
ラサイクリンにより制御可能なテトラサイクリン・プロ
モーター（Ｔｅｔプロモーター）の下流に組み込まれて
いる組み換え遺伝子を含む組み換えアデノウイルスおよ
びレトロウイルスの外被タンパク質をコードする遺伝子
がＴｅｔプロモーターの下流に組み込まれている組み換
え遺伝子を含む組み換えアデノウイルスと組み合わせた
ウイルス群。 - 【請求項１５】 前記レトロウイルスの外被タンパク質
が、水疱性口内炎ウイルスの膜貫通型タンパク質である
請求項１４記載のウイルス群。 - 【請求項１６】 請求項１４または１５に記載のウイル
ス群で共感染された動物細胞。 - 【請求項１７】 請求項１４または１５に記載のウイル
ス群で動物細胞を共感染させ、こうして得られる動物細
胞を増殖することを特徴とするレトロウイルスの産生方
法。 - 【請求項１８】 請求項１４または１５に記載のウイル
ス群の１種以上で、レトロウイルスに感染されている疑
いのある動物細胞をそれぞれ共感染し、レトロウイルス
の産生する傾向を検出することを特徴とする動物細胞の
レトロウイルスによる感染状態を検出するための方法。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8257451A JPH1080274A (ja) | 1996-09-06 | 1996-09-06 | 核移行シグナルを結合したテトラサイクリン・トランスアクチベーター |
| PCT/JP1997/003109 WO1998010084A1 (en) | 1996-09-06 | 1997-09-04 | Tetracycline transactivator having a nuclear localization signal joined thereto |
| AU41348/97A AU4134897A (en) | 1996-09-06 | 1997-09-04 | Tetracycline transactivator having a nuclear localization signal joined thereto |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8257451A JPH1080274A (ja) | 1996-09-06 | 1996-09-06 | 核移行シグナルを結合したテトラサイクリン・トランスアクチベーター |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1080274A true JPH1080274A (ja) | 1998-03-31 |
Family
ID=17306531
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8257451A Pending JPH1080274A (ja) | 1996-09-06 | 1996-09-06 | 核移行シグナルを結合したテトラサイクリン・トランスアクチベーター |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH1080274A (ja) |
| AU (1) | AU4134897A (ja) |
| WO (1) | WO1998010084A1 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2018019698A (ja) * | 2012-10-23 | 2018-02-08 | ツールゲン インコーポレイテッド | 標的ｄｎａに特異的なガイドｒｎａおよびｃａｓタンパク質コード核酸またはｃａｓタンパク質を含む、標的ｄｎａを切断するための組成物、ならびにその使用 |
| JP2020501533A (ja) * | 2016-11-24 | 2020-01-23 | ケンブリッジ エンタープライズ リミテド | 制御可能な転写 |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9175309B2 (en) | 2001-09-29 | 2015-11-03 | Industry-University Cooperation Foundation Hanyang University | Recombinant adenovirus with enhanced therapeutic effect and pharmaceutical composition comprising said recombinant adenovirus |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5512421A (en) * | 1991-02-19 | 1996-04-30 | The Regents Of The University Of California | Generation, concentration and efficient transfer of VSV-G pseudotyped retroviral vectors |
| JPH09500526A (ja) * | 1993-06-14 | 1997-01-21 | ベーアーエスエフ アクツィエンゲゼルシャフト | テトラサイクリン反応性プロモーターによる真核細胞の遺伝子発現の厳密な制御 |
| US5580766A (en) * | 1994-01-14 | 1996-12-03 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | Retroviral vector particles for transducing non-proliferating cells |
| US5891718A (en) * | 1996-03-27 | 1999-04-06 | Vical Incorporated | Tetracycline inducible/repressible systems |
-
1996
- 1996-09-06 JP JP8257451A patent/JPH1080274A/ja active Pending
-
1997
- 1997-09-04 AU AU41348/97A patent/AU4134897A/en not_active Abandoned
- 1997-09-04 WO PCT/JP1997/003109 patent/WO1998010084A1/en active Application Filing
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2018019698A (ja) * | 2012-10-23 | 2018-02-08 | ツールゲン インコーポレイテッド | 標的ｄｎａに特異的なガイドｒｎａおよびｃａｓタンパク質コード核酸またはｃａｓタンパク質を含む、標的ｄｎａを切断するための組成物、ならびにその使用 |
| JP2020078303A (ja) * | 2012-10-23 | 2020-05-28 | ツールゲン インコーポレイテッド | 標的ｄｎａに特異的なガイドｒｎａおよびｃａｓタンパク質コード核酸またはｃａｓタンパク質を含む、標的ｄｎａを切断するための組成物、ならびにその使用 |
| US10851380B2 (en) | 2012-10-23 | 2020-12-01 | Toolgen Incorporated | Methods for cleaving a target DNA using a guide RNA specific for the target DNA and Cas protein-encoding nucleic acid or Cas protein |
| JP2020501533A (ja) * | 2016-11-24 | 2020-01-23 | ケンブリッジ エンタープライズ リミテド | 制御可能な転写 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU4134897A (en) | 1998-03-26 |
| WO1998010084A1 (en) | 1998-03-12 |
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