JPH10505754A - Ｃｎｓ機能及び機能障害インビトロモデル - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 増殖した多能性幹細胞及びそのプロゲニーを、神経の発達及び機能の研究並びに新規な治療剤及び他の生物学的薬剤のＣＮＳ効果の測定のためのＣＮＳモデルシステムを作成するために使用する。神経幹細胞は、出生前及び出生直後の個体の少量の正常または疾病に罹患したＣＮＳ組織から得られる。本発明は、多様性を制限するためにクローン的に誘導される大量の組織を比較的少量のＣＮＳ組織から得ることを可能にする。本発明は、ＣＮＳモデルシステム及び神経細胞、星状膠細胞及び乏突起膠細胞を含むＣＮＳ細胞の多型を含む神経幹細胞の分化したプロゲニーについて述べる。このモデルを使用して、神経学的または他の生物学的薬剤の効果並びに正常または疾病にに罹患したドナーの多能性幹細胞及び幹細胞由来プロゲニーにおける遺伝子発現の分析を行ってもよい。

Description

【発明の詳細な説明】 ＣＮＳ機能及び機能障害インビトロモデル発明の背景 成熟ヒト神経系は、発達時期において、神経管内にある少量の前駆体から発生 する何兆個もの細胞から成る。中枢神経系（ＣＮＳ）の発達経路及び機能障害に よる成体哺乳類ＣＮＳに生じる変化の研究は、哺乳類ＣＮＳの複雑さのために困 難であった。所定の条件下における比較的単純なＣＮＳモデルを使用して、その ような問題をより十分に研究することができる。 一般に、培養ＣＮＳ細胞の研究には２種類の方法がとられていた。一つは一次 神経培養の使用によるものであり、もう一つは神経細胞株を使用する方法である 。一次哺乳類神経培養は、原料が胎児または出生後間もない動物から得られたも のである場合には、ほとんど全ての脳領域から発生させることが可能である。一 般に、神経細胞、星状膠細胞、または乏突起膠細胞のいずれかが豊富である、三 種類の培養を得ることが可能である。一次ＣＮＳ培養は、神経機能の多くのメカ ニズムの発見に有用であることが知られ、発達及び成熟細胞において外から与え る薬剤の影響を研究するために使用されている。一次ＣＮＳ培養は非常に多くの 利点を有するが、欠点が二つある。第一に、第一神経細胞の抑制された増殖能の ために、新しい培養を幾つかの異なる動物から発生させなければならない。組織 を、同一の脳領域から発達の同一段階で得るには、通常細心の注意を必要とする が、同一の一次培養を得るのはほとんど不可能である。従って、培養間には多様 性がかなりの割合で存在する。 第二の一次培養の欠点は、組織を胎児または出生後間もない動物から得なけれ ばならないということである。もし、一次培養が定期的に行われるとすると、原 料を大量に入手する必要がでてくる。これは、ある種（例えば齧歯類）の動物か ら一次培養を発生させる場合には通常問題ないが、ある場合（例えば霊長類）に は問題である。制限された供給と倫理上の問題から、霊長類（ヒト及びヒトでな い場合の両者を含む）からの一次細胞の培養は実際的ではない。 一次神経細胞の制限された増殖能のため、神経機能、機能障害及び薬剤の設計 ／スクリーニングの研究のための大量の均一細胞の発生は行われていなかった。 そのため、ＣＮＳ機能のインビトロ研究のための大量のプロゲニー(progeny)を 発生し得る均一細胞の増殖が、細胞系を使用して研究された。神経細胞系の発生 は、二種類のカテゴリーに分類することができる。即ち、１）自然発生ガン、及 び２）慣習的にデザインされた(custom-designed)細胞系、である。 自然発生ガンのうち、神経生物学において恐らく最も研究された細胞系は、神 経成長因子（ＮＧＦ）に応答して交感神経様神経細胞に分化することができるラ ットクロム親和細胞腫(pheochromocytoma)（ＰＣ１２）細胞である。これらの細 胞は、成長因子に応答して神経の発達及び変化（分子及び細胞）のメカニズムを 研究するのに有用なモデルであることが判明した。神経芽細胞腫及びグリオーム 細胞腫が、神経細胞及びグリア細胞機能を研究するために使用された(Lies，et al.，1987; Nister et al.，1988)。胚腫瘍(embryonal carcinoma)(ＥＣ) 細胞 は、胎児生殖細胞の奇形腫瘍から誘導され、多数の非神経細胞型に分化する能力 を有し (例えば、Ｐ１９細胞、Jones-Villeneuve et al.，1982)、幾つかの系は 神経細胞に分化する能力を有する(McBurney et al.，1988)。ＣＮＳ神経前駆細 胞に相似する表現型を有するヒト奇形腫瘍−由来細胞系（NTera 2/cl.D1）は、 レチノイン酸の存在下において分化するように誘導することができる。しかし、 分化した細胞は神経細胞表現型に限定される[Pleasure and Lee（1993），J．Ne urosci．Res．35: 585-602]。細胞系のこれらの型は、外与薬剤が細胞の生存ま たは機能に与える効果をスクリーニングするための多数の細胞を発生することが 可能であるが、その不滅化(immortalization)のため、アポトーシス（例えば、 哺乳類細胞の自然にプログラムされた死）の研究への使用には適していない。さ らに、これらの細胞系の型数の限定、発生することができる表現型数の限定及び これらの不滅化の未知の性質（これは細胞の機能に不特定の方法で影響しえる） により、これらの細胞系の型は、神経機能のインビトロモデル及び新規な治療法 の発見のための理想のものとはならない。 他の自然発生細胞系へのアプローチは、細胞の遺伝子的作成(make-up)を変化 させる発癌遺伝子を挿入し、それにより細胞を無制限に増殖させるように誘導す ることにより、一次細胞を意図的に不滅化する方法である。このアプローチは多 数のグループにより、多数の興味ある神経細胞系を発生するのに使用されてきた (Bartlett et al.，1988; Frederiksen et al.，1988; Trotter et al.，1989; Ryder et al., 1889; Murphy et al.,1991; Almazan and McKay, 1992)。これら の細胞系は、細胞の決定及び分化の間に起こる決定(decision)の研究、及び外与 薬剤の効果の試験に有効であることがわかったが、幾つかの欠点を有している。 第一に、細胞の増殖状態を変化させる発癌遺伝子の添加は、細胞の他の性質に影 響を与え得る（発癌遺伝子は、細胞周期の調整以外に細胞内で他の役割を果し得 る）。これはAlmazan 及びMcKay(1992)の研究においてよく示されており、また （通常の視神経乏突起膠細胞前駆体がすることができる）II型の星状膠細胞に分 化することができない視神経からの乏突起膠細胞前駆体の不滅化も記載されてい る。筆者らは星状膠細胞に分化するように細胞能を変化させ得る不滅化抗体の存 在を示唆している。 意図的に不滅化した細胞の使用による他の欠点は、神経系が何兆個もの細胞か ら成り、かつ何千もの異なる細胞型の可能性があり、各々が固有パターンの遺伝 子発現及び環境に対する応答の固有の型を示していることに起因する。慣習的に デザインされた(custom-designed) 細胞系は、単一の前駆細胞の不滅化及びその クローン的な拡張の結果である。一種の神経細胞型の大量の供給を行うことがで きるが、このアプローチは異なる細胞型間の細胞相互作用を考慮にいれない。さ らに、所定の脳領域からの細胞を不滅化することは可能であるが、どの細胞が発 癌遺伝子により変化を受けるかについてコントロールできないため、目的の細胞 の不滅化は不可能である。そのため、慣習的にデザインされた細胞系は、自然発 生腫瘍に対して２、３の利点を与えるが、幾つかの欠点を有しており、ＣＮＳ機 能及び機能障害を理解するには理想的ではない。 本願発明の要約 ＣＮＳの発達及び機能の研究並びにＣＮＳ機能障害の可能性のある治療薬剤の 効果の測定における使用のために、大量の遺伝的に改変されていない神経細胞を 提供する従来技術の方法に伴う欠点のため、これらの目的に使用可能な改良され たＣＮＳモデルシステムが求められている。 従って、本願発明の目的は、神経の発達及び機能の研究並びに新規な治療薬及 び他の生物学的な薬剤のＣＮＳ効果の測定のためのＣＮＳモデルシステムを提供 することにある。本願発明の目的は、そのようなＣＮＳシステムにより、ヒトを 含みかつ成体を含む広範な年齢範囲に及ぶ様々な種から得られる比較的少量の原 料から大量の細胞を産生させることを可能にすることである。 本願発明の目的は、自然発生腫瘍ではなく、または無制限の増殖を誘導するた めに発癌遺伝子の挿入により意図的に不滅化した細胞ではない細胞を含むＣＮＳ モデルシステムを提供することであり、それにより細胞の正常な機能における遺 伝的改変の影響へのいかなる疑問点も除去することができる。 他の目的は、細胞がクローン的に誘導され、従って、モデルの一つの使用から 次の使用において(from one use of the model to the next use)変化の度合い が低い細胞集団であるようなＣＮＳモデルシステムを提供することである。 本願発明の他の目的は、目的によって添加または除去することができる、外因 性シグナル分子または分子の組み合わせに応答して細胞が増殖するＣＮＳモデル システムを提供することである。 他の目的は、増殖した細胞が未分化状態で維持され、及び望む時に、哺乳類Ｃ ＮＳの３種類の主な細胞型（神経細胞、星状膠細胞、及び乏突起膠細胞）に分化 させることができる、ＣＮＳモデルシステムを提供することである。 本願発明の目的は、ＣＮＳ細胞の分化及び機能を複数の細胞型からなるシステ ム内でコントロールして研究することができる（インビボでおこる状況と同様で ある）、ＣＮＳモデルシステムを提供することである。 本願発明のさらなる目的は、ＣＮＳ幹細胞が、成体を含む出生前及び出生直後 の個体から産生することができ、個体ベースで試験を行うことを可能とする、Ｃ ＮＳモデルシステムを提供することである。 本願発明の目的は、ＣＮＳ幹細胞内及び正常ドナーの幹細胞−由来プロゲニー 内並びに神経学的な疾患を患った患者の細胞内での遺伝子発現の分析を可能とす ることである。 さらに本願発明の目的及び特徴は、下記の詳細な記載及び特許請求の範囲から 当業者らに明らかであろう。 一つの実施態様において、本願発明の目的は、神経学的または他の生物学的な 薬剤または神経学的及び／または他の生物学的な薬剤の組み合わせの、神経細胞 への効果をスクリーニングする方法により達せられ、該方法は、少なくとも一種 の多能性幹細胞を含む哺乳類の神経組織を分離すること、該分離多能性幹細胞を 、幹細胞−産生前駆細胞の培養を得るために幹細胞を増殖する少なくとも一種の 成長因子を含む培養とを接触させること、前駆細胞を生物学的な薬剤または薬剤 の組み合わせと混合すること、及び該前駆細胞への生物学的薬剤の効果を測定す ることを含む。他の態様において、幹細胞を生物学的な薬剤の存在下に増殖し、 幹細胞及びその増殖に対する生物学的な薬剤の効果を測定した。 本願発明の他の態様において、哺乳類の神経組織は、神経学的な疾患または障 害を患っているヒトドナーから得られたものである。 本願発明のさらなる態様では、生物学的な薬剤または薬剤の組み合わせの存在 下において、増殖した前駆細胞は分化するように誘導される。さらに、他の態様 においては、幹細胞−産生プロゲニーは、生物学的な薬剤の添加の前に分化する ように誘導される。 図面の簡単な説明 図１．上皮成長因子（ＥＧＦ）応答細胞の増殖：２日後、インビトロにおいて ＥＧＦ−応答細胞は増殖を開始する（図１Ａ）。４日後、インビトロにおいて細 胞の小さな塊（クラスター）が現れる（図１Ｂ）。継続して増殖する細胞の塊は 大きくなり(grow in size)（図１Ｃ）、基質 (substrate)を持ち上げ、懸濁液中 に浮かぶ（図１Ｄ）。この段階において、浮かんでいる球体は容易に除去するこ とができ、単一の細胞に分離することができ、及びＥＧＦ存在下に、増殖を再度 始めることがきる（棒線：５０μｍ）。 図２．単−ＥＧＦ−産生球体由来の細胞の、神経細胞、星状膠細胞、及び乏突 起膠細胞への分化：タンパク（ＭＡＰ−２）、グリア繊維状酸性タンパク（ＧＦ ＡＰ）及び０４（細胞表面抗体）を伴う微小管に対する抗体を伴う三重ラベル免 疫細胞化学を、神経細胞（図２Ｂ）、星状膠細胞（図２Ｃ）及び乏突起膠 細胞（図２Ｄ）の存在を、一次培養から誘導した単−ＥＧＦ−産生球体(図２Ａ) から検出するのに使用した（棒線：５０μｍ）。 図３．線条体の星状膠細胞と共培養を行った神経球体(neurospheres)のラベリ ング：星状膠細胞のフィーダー層上に成育した８日後の神経球体の相コントラス トが図３Ａに示されている。神経球体細胞のBrd-Uラベル化は、ほとんど全ての 細胞がBrd-Uを取り込んだことを示している(図３Ｂ)。フィーダー層細胞の相コ ントラストストは図３Ｃに示されている。フィーダー層細胞のＧＦＡＰラベル化 は、フィーダー層の大半の細胞が星状膠細胞であることを示している（ＧＦＡＰ −ＩＲ）（図３Ｄ）。分化が起こった後は、Brd-Uラベル化神経細胞（図３Ｅ及 び図３Ｇ）は、神経ペプチドＹ（ＮＰＹ）（図３Ｆ）またはソマトスタチン（図 ３Ｈ）並びにグルタメート及びメセンケファリン（図には示されていない）のよ うな他の神経伝達物質に対して免疫反応性である。 図４．脳由来神経栄養性因子(Brain-derived Neurotrophic Factor)(ＢＤＮＦ )存在下における神経球体から産生される神経細胞数の増加：インビトロで１０ 日後における(ＤＩＶ)、単一のＥＧＦ応答幹細胞−産生神経球体からの神経細胞 の平均数の定量化は、ＢＤＮＦが存在しない場合には、一つの神経球体当たり11 .46±1.21個の神経細胞が産生されたことを示した。ＢＤＮＦ（１０ｎｇ／ｍｌ ）が培地に存在した場合には、有意に（ｐ＜0.5）多数の神経細胞が確認された （一つの神経球体当たり22.34±2.33個の神経細胞）。 図５．ＢＤＮＦの存在下における増強された神経細胞外殖プロセス：１０ＤＩ ＶにおけるＢＤＮＦの非存在下（図５Ａ）及びＢＤＮＦの存在下（図５Ｂ）にお いて成育した神経球体を固定し、γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）の抗血清による間 接的な免疫細胞化学により処理を行った。ＢＤＮＦの存在下に成育した神経細胞 の大多数は長い神経突起を伸長し、かつＢＤＮＦ非処理神経球体と比較して、長 大で複雑な分岐パターンを示した。 図６．神経球体内の選択的細胞個体群によるＢＤＮＦへの応答：即時−初期(i mmediate-early)遺伝子産物であるシー−フォス(c-fos)の間接的免疫細胞化学か ら、増加したc-fos免疫反応性をアッセイすることにより、単一クローン由来神 経球体内の殆ど全ての細胞がＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）刺激に対して応答性 であることが明らかである（図６Ａ）。核抗原c-fosへの抗血清及び神経細胞特 異的抗原β−チューブリンに対する抗体による二重ラベル免疫細胞化学は、ＢＤ ＮＦに６０分間接触させると、主にβチューブリン抗血清により決定された神経 細胞個体群内に、c-fosの選択的発現を起こすことを示している（図６Ｂ及び６ Ｃ）。 図７．ＥＧＦ−産生神経球体の増殖における塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦ ＧＦ）及び骨形態発生タンパク（Bone Morphogenic Protein）２（ＢＭＰ−２） の効果：１４日後の胚性マウスの線条体から単離した細胞を９６ウェルプレート 内に、25,000細胞／ｍｌの密度で、ＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ、ＥＧＦ＋ｂＦＧＦ （各２０ｎｇ／ｍｌ）、ＥＧＦ＋ＢＭＰ−２（各々２０及び１０ｎｇ／ｍｌ）存 在下にプレートした。１０ＤＩＶ後、ＥＧＦ処理培養の定量化を行ったところ、 １ウェル中23±1.33神経球体が産生した（ｎ＝８）ことを示した。ｂＦＧＦによ り増強されたＥＧＦ刺激による増殖により、１ウェル中54.5±2.17神経球体に増 加した（ｎ＝８）。一方、ＢＭＰ−２はＥＧＦに応答する幹細胞の増殖を阻害し た（ｎ＝８）。 図８．未分化及び分化幹細胞−由来プロゲニーにおける成長因子転写物の検出 を示すＵＶ透過法により視覚化したエチジウムアガロースゲル：各パネルの第一 レーンは１ｋｂの標準分子量ラダー（ladder）を示している。Ｃでラベルされた 第二のレーンは、ｃＤＮＡテンプレートが存在しないＰＣＲを示すネガティブコ ントロールである。Ｕでラベルされた第三のレーンは、未分化の神経球体のＲＴ −ＰＣＲである。Ｄでラベルされた第四のレーンは、分化した幹細胞由来プロゲ ニーのＲＴ−ＰＣＲである。上皮成長因子受容体、繊維芽細胞成長因子受容体及 び白血病抑制因子受容体の存在は、それぞれＥＧＦ−Ｒ、ＦＧＦ−Ｒ及びＬＩＦ −Ｒにより示される。 図９．ｂＦＧＦ−産生神経細胞の電気生理学的性質：パッチレコーディング(p atch recording)前の二極形態(bipolar morphology)を示す推定神経細胞のデジ タル画像が図９Ａに示されている。図９Ｂは同じ神経細胞の、パッチ電極を停止 する前の５−カルボキシフルオレセインで満たした蛍光デジタル画像を示してい る。図９Ｃは、図９Ａ及び図９Ｂに示されるｂＦＧＦ−産生神経細胞における、 電流注入により引き起こされた勾配のついた作用ポテンシャル(graded action p otential）を示す。 発明の詳細な説明 中枢神経系（ＣＮＳ）の神経幹細胞（ここでは“ＣＮＳ幹細胞”と呼ぶ）が報 告されており、その可能性のある使用が記載されている（Reynolds and Weiss,S cience 255:1707[1992]; Reynolds et al.，J．Neurosci．12:4565[1992]; Reyn olds and Weiss，Restorative Neurology and Neuroscience 4:208[1992]; Reyn olds and Weiss，Neuronal Cell Death and Repair，ed．Cuello[1993];）。“ 幹細胞”という用語は、胚組織、幼年組織、または成体組織から得ることができ る比較的静止の未分化の細胞を意味し、大量のプロゲニーの産生と共に増殖及び 自己保存が可能なものである。神経幹細胞の有用性は次の出願特許に記載されて いる(U.S.S.N．08/270,412; 07/961,813; 08/221,655; 08/010,829;及び08/149, 508）。他の哺乳類組織において見いだされる幹細胞と同様に、ＣＮＳ幹細胞は 幹細胞の重要な性質である自己保存を示す。細胞内での自己保存とは、細胞がそ のクローンを産生することができ、そのため、延長した期間を越えて表現型を維 持できることを意味する。 幹細胞プロゲニー（stem cell progeny）という用語はここでは、“前駆細胞 ”を意味し、二種類の型の細胞からなる。即ち、ａ）新しい幹細胞、及びｂ）機 能細胞に分化することができる前駆細胞、である。 “前駆細胞(progenitor cell)”という用語はここでは、ＣＮＳ幹細胞から誘 導された未分化の細胞を意味する。前駆細胞は制限された増殖能を有し、自己更 新をすることはできない。これは分化の特定経路に関連し、適当な条件において 、ＣＮＳ内に存在する異なる細胞型に分化する；これらは神経細胞及びグリア細 胞を含む。グリア細胞型は星状膠細胞及び乏突起膠細胞を含む。 “乏突起膠細胞(oligodendrocyte)”という用語は、中枢神経系（ＣＮＳ）に おいて軸索を取り囲むミエリンを形成する、分化したグリア細胞を意味する。乏 突起膠細胞はガラクトセレブロシド（＋）、ミエリン塩基性タンパク（＋）及び グリア繊維芽細胞産生タンパク(−)〔ＧｌａＣ（＋）、ＭＢＰ（＋）、ＧＦＡＰ （−）〕である。“星状膠細胞(astrocyte)”という用語は、フラットな原形質 ／繊維芽細胞一様の形態を有することができ、または星状突起を有する形態を示 す、ＧＦＡＰ（＋）、ＧａｌＣ（−）及びＭＢＰ（−）である分化したグリア細 胞を意味する。“神経細胞”という用語は、神経細胞特異的エノラーゼ（＋）、 神経フィラメント（＋）、微小管を伴うタンパク（＋）、Ｔａｕ−１（＋）、ま たはβ−チューブリン (＋)〔ＮＳＥ (＋)、ＮＦ (＋)、ＭＡＰ−２ (＋)、Ｔａ ｕ−１ (＋)またはβ−Ｔｕｂ (＋)〕の表現型を有する分化した神経細胞を意味 する。従って、この明細書において“神経幹細胞”または“ＣＮＳ幹細胞”とい う用語は、増殖してより多くの多能性幹細胞並びに神経細胞、星状膠細胞及び乏 突起膠細胞に分化する前駆細胞を産生することのできる多能性幹細胞を意味する 。 神経幹細胞は、下記の実施例１及び上記に記載した出願特許に記載された方法 で、哺乳類ＣＮＳからインビトロにおいて、単離及び培養することができる。簡 単に述べると、哺乳類（例えば、ヒト、サル、ラット、マウス等）組織から得ら れた幹細胞を、所定の血清を含まない培地で少なくとも一種の成長因子の存在下 に成育させる。“成長因子”という用語はタンパク、ペプチドまたは幹細胞及び ／または前駆細胞に対して成長、増殖、分化または異化作用を有する他の分子を 意味する。増殖を誘導するために使用されてもよい成長因子としては、細胞を増 殖する全ての因子が挙げられ、細胞表面の受容体に結合して細胞の成長−誘導ま たは生存効果を及ぼす全ての分子が挙げられる。そのような因子としては、酸性 及び塩基性繊維芽細胞成長因子（ａＦＧＦ及びＦＧＦ−２として知られるｂＦＧ Ｆ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、チロトロピン放出ホルモン（ＴＲＨ） 、上皮成長因子（ＥＧＦ）、ＥＧＦ−様リガンド、アンフィレグリン(amphiregu lin)、トランスフォーミング成長因子アルファ（ＴＧＦα）、脳由来神経栄養性 因子（ＢＤＮＦ）、繊毛(cillary)栄養性因子（ＣＮＴＦ）、グリア細胞由来栄 養性因子（ＧＤＮＦ）、インスリン−様成長因子（ＩＧＦ−１）等が挙げられる 。好ましい成長因子はＥＧＦである。また、ｂＦＧＦまたはＥＧＦ及びbＦＧＦ の組み合わせも好ましい。増殖の促進以外の細胞における調整作用を有する、幹 細胞及び前駆細胞の発達を調整するために使用される成長因子としては、トラン スフォーミング成長因子ベータ（ＴＧＦβ）、レチノイン酸、アク チビン(activin)、骨形態発生タンパク（ＢＭＰ）、繊毛栄養性因子（ＣＮＴＦ ）及びマクロファージ炎症性タンパク（ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＭＩＰ− ２）が挙げられる。 成長因子存在下において、多能性幹細胞は分断されるように誘導され、ここで “神経球体”と呼んでいる未分化の細胞のクラスターを生じる。神経球体は第一 に多能性幹細胞及び前駆細胞からなる。一まとめにして、神経球体の細胞をここ では“前駆細胞”と呼ぶ。インビトロにおいて、前駆細胞は典型的には神経球体 の形状で成育するが、培養の条件及び技術によって異なる成育パターンを示して もよい。第一に、神経球体細胞はＧＦＡＰ、ＮＦ、ＮＳＥまたはＭＢＰに対して 免疫反応性ではない。しかし、細胞は、未分化ＣＮＳ細胞において見いだされる 中間フィラメントタンパクである、ネスチン (＋)表現型である。ネスチンマー カーは、レーンダール等(Lehndahl et al.，Cell 60: 585-595(1990))により報 告された。神経球体細胞のプロゲニーから分化し得る細胞型を伴う成熟表現型は ネスチン表現型に対して陰性であり、優位である。 ＥＧＦ等のようなマイトジェンの継続的な存在下において、神経球体内の前駆 細胞は継続して分裂し、神経球体のサイズ及び未分化細胞〔ネスチン (＋)、Ｇ ＦＡＰ（−）、ＮＦ (−)、ＮＳＥ (−)、ＭＢＰ (−)〕の数が増加する。 この段階において、細胞は非接着性であり、及び神経球体のフリー−フローティ ングクラスター(free-floating clusters)を形成する傾向にある。６〜７ＤＩＶ 後、神経球体細胞は解離することができる。ほとんど全ての細胞が組織培養基に 付着する。成長因子の継続した存在下において、幹細胞は分裂を始め、クローン 性由来細胞からなる新しいフリー−フローティング神経球体を形成する基体を持 ち上げる(lift off)。従って、この増殖、解離及び増殖の再開始の方法を使用し て、無制限数のクローン由来前駆細胞をインビトロで発生させることができる。 マイトジェン成長因子の除去によって、幹細胞の増殖は停止する。未分化の細 胞の球体は、ポリオルニチン処理プラスチックまたはガラスからなるような基体 に接着することができ、そこで細胞は神経細胞及びグリア細胞に分化し始める。 このように、成長因子は、増殖限度をコントロールする目的によって添加または 除去することができる外因性シグナル分子として作用する。 マイトジェン成長因子を除去すると、成長因子応答幹細胞プロゲニーはフィー ダー層上で共培養することができる。繊維芽細胞、神経細胞、星状膠細胞、乏突 起膠細胞、癌細胞系、遺伝子的改変細胞系または生物活性な性質の如何なる細胞 または基体(substrate)のような、フィーダー層の多くの型を使用してもよい。 フィーダー層は一般により広範な表現型を生産する。この例として、フィーダー 層は、結合する両方の膜の基体及び起源並びに幹細胞−産生プロゲニーの分化を 誘導及び改変する溶解因子として作用する。ポリ−Ｌ−オルニチンのようなより 不活性の物質と比較して、例えば、星状膠細胞フィーダー層は、７ＤＩＶにおけ る間接的な免疫細胞化学法により決定されるように、より広範な神経細胞表現型 を誘導する。１％胎児ウシ血清を含むポリ−Ｌ−オルニチン被膜化基体上で分化 した場合には、神経細胞表現型はほとんどＧＡＢＡergicまたはSubstance Pergi cである。星状膠細胞フィーダー層上で分化した場合には、ＧＡＢＡergicまたは Substance Pergic神経細胞に加えて、ソマトスタチン、神経ペプチドＹ（ＮＰＹ ）、グルタメート及びメット−エンケファリン（met-enkephalin）含有神経細胞 が存在する。星状膠細胞は、線条体、皮質及び脊髄のような様々な脳領域から得 られる組織から誘導することができる。 成長因子を一旦除去したならば、培地は0.5−1.0％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）の ような血清を含んでいてもよい。血清は、特に分化細胞が低密度で成育する場合 に、分化のプロセスを支持し、かつ細胞の生存を増強する傾向にある。 成長因子を除去し、細胞を分化及び生存を支持する条件に置いた後１〜３日以 内に、ほとんどまたは全ての前駆細胞はネスチンに対する免疫応答性を喪失し、 神経細胞、星状膠細胞または乏突起膠細胞に特異的な抗原を発現し始める。神経 細胞の同定は、ＮＳＥ、ＮＦ、β-tub、ＮｅｕＮ（核抗原）、ＭＡＰ−２及び神 経細胞特異的タンパクＴａｕ−１に対する免疫反応性を用いて確認した。星状膠 細胞及び乏突起膠細胞は、ＧＦＡＰ及びＧａｌｃ各々に対する免疫反応性を用い て同定した。神経細胞または星状膠細胞に特異的な抗原を発現しない細胞は、乏 突起膠細胞に特異的なマーカーを、一時的に(in a correct temporal fashion) 発現し始める。即ち、細胞は最初にＯ４（細胞表面抗原）、Ｇａｌｃ（ミエリン グリコリピッド）及び最後にＭＢＰに対して免疫反応性となる。これらの細胞は また、特徴的な乏突起膠細胞形態を有している。 神経細胞はまた、その特異的な神経伝達物質表現型とその形態分析に基づいて 同定することができる。単一、二重または三重ラベル化した免疫蛍光法及び免疫 パーオキシダーゼ法を使用して、分化した神経球体培養を神経伝達物質の発現に ついて、またはある場合においては神経伝達物質の合成に関与する酵素について 分析することができる。または、in situハイブリダイゼーション組織化学（法 ）を、ペプチド神経伝達物質に特異的なｃＤＮＡまたはＲＮＡプローブまたは神 経伝達物質合成酵素ｍＲＮＡを使用して行うことができる。特異的表現型の同定 を増強するためにこれらの技術と免疫細胞化学法とを組み合わせることが可能で ある。もし必要な場合には、上記に述べた抗体及び分子プローブを、細胞同定の ために、ウエスタンまたはノザンブロット法にそれぞれ適用することが可能であ る。 胚ＣＮＳの領域からＥＧＦ−応答性幹細胞を単離することが可能であることに 加えて、ＣＮＳ幹細胞はまた、様々な幼若及び成体ＣＮＳ領域から、定常のバイ オプシー法を使用して単離することができる。上記バイオプシー法としては、脊 髄円錐、頸部、胸部及び腰部脊髄、脳幹、視床下部及び線条体を含む。これらの それぞれのケースにおいて、単離されたＣＮＳ幹細胞は自己保存を示し、神経細 胞、星状膠細胞及び乏突起膠細胞に分化する大量の前駆細胞を産生する。このよ うに、多能性幹細胞は成体哺乳類ＣＮＳの複数の領域に存在する。ＣＮＳ幹細胞 はまた、機能障害ＣＮＳ組織（例えばアルツハイマー症、パーキンソン病または ダウン症候群に罹患した組織）から単離することができる。 上記に述べた前駆細胞は、神経細胞への生物学的薬剤の効果を測定する方法に おいて使用することができる。“生物学的薬剤”という用語は、ウィルス、タン パク、ペプチド、アミノ酸、リピッド、炭化水素化合物、核酸、ヌクレオチド、 薬剤、プロドラッグまたは他の物質で、神経細胞に効果を有する（その効果が危 険であるか、有用であるかまたはその他の場合でも）ような薬剤である。神経細 胞に有用な生物学的薬剤をここでは“神経系薬剤(neurological agents)”と呼 び、この用語は、ＣＮＳ細胞の増殖、生存、分化及び／または機能または神経系 疾病または障害に非常に有効である可能性のある生物学的または薬学的に活性な 全ての物質を含む。例えば、この用語は、特定の神経伝達物質、神経伝達物質受 容体、成長因子、成長因子受容体等及びこれらの薬剤の合成に使用される酵素を 含んでもよい。 神経細胞に対して可能性のある生物学的薬剤の効果を測定するために、ＣＮＳ 疾病または障害に罹患するホストから得られた多機能幹細胞由来の前駆細胞の培 養、または正常組織から得られる培養を使用することができる。培養の選択は、 試験される薬剤及び達成すべき効果に依存する。目的のドナー組織から細胞が得 られたならば、これらは成長因子の存在下においてインビトロで増殖される。 生物学的薬剤の、幹細胞及び前駆細胞の増殖及び生存における効果は、実施例 １に従って成育させた細胞を使用して測定される。例えば、これらの方法を使用 して、移植目的のための大量の細胞の産生に有用である前駆細胞の増殖能を増加 させる生物学的薬剤のスクリーニングを行うことが可能である。また、前駆細胞 の増殖を抑制する生物学的薬剤のスクリーニングを行うことも可能である。これ らの研究において、前駆細胞を目的の生物学的薬剤の存在下に置き、その増殖の 割合をアッセイする（実施例４）。生物学的薬剤またはその組み合わせの、前駆 細胞及びそのプロゲニーの分化及び生存における効果を測定することができる（ 実施例３）。スクリーニングを行う前に、分化をすでに誘導した神経細胞のスク リーニングを行うことが可能である。また、分化する前に前駆細胞に適用するこ とにより、分化プロセスにおける生物学的薬剤の効果を測定することも可能であ る。一般に、生物学的薬剤は、溶解して、各投与量における薬剤の効果を測定す るために様々な濃度で培地に添加される。培地は、薬剤の濃度を一定に維持する ように２、３日毎に薬剤を補充してもよい。 これらのスクリーニング法を使用して、幹細胞及び前駆細胞の増殖並びに前駆 細胞の分化または分化したＣＮＳ細胞の生存及び機能における効果を試験するこ とにより、出生前及び出生直後のＣＮＳ細胞における薬剤の副作用の可能性をス クリーニングすることが可能である。増殖した前駆細胞を典型的には約５〜１０ ×１０⁶細胞／ｍｌの密度でプレート(plate)する。特定の分化した細胞型または 特定の細胞の構成(make-up)における生物学的薬剤の効果を試験することが望ま しい場合には、分化の後に得られたグリア細胞に対する神経細胞の割合を異なる 細胞型を分離することにより操作することができる。例えば、Ｏ４抗体（ベー リンガーマンハイムから入手可能である）は乏突起膠細胞及びその前駆体に結合 する。選り分け(panning)工程を使用して、乏突起膠細胞を分離する。ＲＡＮ２ 抗体を使用して結合工程の後、星状膠細胞を選別することができる（ＡＴＣＣか ら入手可能である）。破傷風毒素（ベーリンガーマンハイムから入手可能である ）を神経細胞の選択に使用することができる。分化の期間に使用される培地に添 加される栄養因子を変化させることにより、表現型の比率を意図的に変化させる ことが可能である。そのような栄養因子としてはＥＧＦ、ＦＧＦ、ＢＤＮＦ、Ｃ ＮＴＦ、ＴＧＦα、ＧＤＮＦ等が挙げられる。例えば、出願中の米国特許出願(U .S.Ser.No.08/221,655)に記載されているように、ＦＧＦは神経細胞の比率を増 加させ、及びＣＮＴＦは乏突起膠細胞の比率を増加させる。異なるＣＮＳ領域か ら得られたグリア細胞層上の培養の成育は、上記に述べたように、分化の工程に も影響する。出願中の米国特許出願(U.S.Ser.No.08/482,079)に記載される方法 を使用してドーパミン様神経細胞が豊富な培養を得ることもできる。これらの培 養は、ドーパミン様細胞の機能及び生存に影響を与える生物学的薬剤を試験する ために使用することができる。培養条件はまた、コリン作動性神経細胞の数を増 加するために使用することができる。分化した培養は、少なくとも１ヶ月は生存 する（表現型はそのまま残存する）。 アルツハイマー症、パーキンソン病、ダウン症候群等に罹患した患者由来の異 常ＣＮＳ組織から得られた培養は、異常組織における生物学的薬剤の効果を試験 するために使用することができる。例えば、パーキンソン病に罹患した患者から 得られた培養はドーパミン作動性細胞の誘導試験に使用できる。アルツハイマー 病またはダウン症候群の患者から得られた培養は、これらの患者において異常に 高いアミロイド前駆プロテイン（ＡＰＰ）レベルへの生物学的薬剤の影響を測定 するために使用することができる。さらに、コリン作動性関連障害であるアルツ ハイマー病の患者から得られた組織は、コリン作動性神経細胞の誘導における生 物学的薬剤の効果を試験するために使用することができる。 生物学的薬剤の効果を時間間隔をおいてモニターし、発現された表現型の比率 （神経細胞：グリア細胞、または神経伝達物質または他のマーカー）、細胞生存 度（cell viability）、増殖、遺伝子発現における改変、及び／またはアポトー シスの限度のような基準に関する培養のコントロールに関連した重要な差異をベ ースとして評価する。細胞の物理的性質は、細胞及び神経突起の形態及び成育を 顕微鏡で観察することにより分析することができる。酵素、受容体及び他の細胞 表面分子のようなタンパク或いは神経伝達物質、アミノ酸、神経ペプチド及び生 体アミンの新規なまたは増加したレベルの発現の誘導を、そのような分子のレベ ルの改変を同定し得る既知の当業技術によって分析することができる。これらの 技術としては、そのような分子に対する抗体を使用した免疫組織化学または生化 学的分析を含む。そのような生化学的分析としては、タンパクアッセイ、酵素的 アッセイ、受容体結合アッセイ、酵素−結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、電 気泳動法、高速液体クロマトグラフィー法（ＨＰＬＣ）、ウェスタンブロット法 及びラジオイムノ法（ＲＩＡ）が挙げられる。ノザンブロット及びポリメラーゼ 鎖反応（ＰＣＲ）のような核酸分析法は、これらの分子またはこれらの分子を合 成する酵素をコードするｍＲＮＡのレベルを測定するために使用することができ る。ゲノミックＤＮＡを、標準の方法を用いて定量化し、アポトーシスの兆候で あるＤＮＡラダリング(laddering)の範囲を分析することができる（例えば、酵 素特異的ＤＮＡ分断）。 幹細胞の増殖並びに幹細胞プロゲニーの増殖、分化及び生存、及び／または生 物学的薬剤への応答に関する因子を、既知の当業技術を用いて、発達の異なる段 階における幹細胞または幹細胞プロゲニーからのｃＤＮＡライブラリーを構築す ることにより単離することができる。一つの発達段階における細胞からのライブ ラリーを、発達の異なる段階の細胞のそれと比較して、発達の期間における遺伝 子発現の過程を決定し、様々な生物学的薬剤の効果またはＣＮＳ細胞における遺 伝子発現を改変する新しい生物学的薬剤を明らかにする。ライブラリーが機能障 害組織から得られた場合には、遺伝子的因子は、正常組織由来と機能障害組織由 来のライブラリーを比較することにより機能障害の原因における役割を同定して もよい。この情報を障害治療の治療法設計に使用することができる。さらに、プ ローブを様々な遺伝的障害の診断における使用または発達における特定の段階の 神経細胞の同定における使用のために同定することができる。 電気生理学的分析を、生物学的薬剤の神経細胞特性（例えば静止膜電位、誘発 電位、電流の方向及びイオン的性質並びにイオンチャンネルの動力学）における 効果を決定するために使用することができる。これらの測定は、細胞外単一ユニ ット電圧記録、細胞内電圧記録、電圧固定(voltage clamping)及びパッチクラン プ(patch clamping)を含む当業技術を使用して行うことができる。また、電圧感 受性色素、及びイオン感受性電極を使用してもよい。 本願発明のより完全な理解のために、以下の実施例を記載する。これらの実施 例が単に例示する目的のためのものであって、本願発明の観点を制限するもので はないことは理解されるべきである。 実施例１ 前駆細胞の増殖 １４日の胚（Ｅ１４）ＣＤ₁アルビノマウス（チャールズリバー）を断頭し、 脳及び線条体(striata)を無菌方法を用いて除去した。組織を、口焼きしたパス ツールピペットを用いて、血清を含まない、ダルベコ改質イーグルス培地（ＤＥ ＭＥ）及びＦ−１２栄養混合物（ギブコ）の１：１混合物からなる培地に機械的 に分離した。細胞を８００r.p.mで５分間遠心分離を行い、上澄み液を吸引し、 細胞を計測するために、再びＤＭＥＭ／Ｆ−１２に懸濁した。 細胞を血清を含まず、グルコース（0.6％）、グルタミン（２ｍＭ）、炭酸水 素ナトリウム（３ｍＭ）、ＨＥＰＥＳ（４−〔２−ヒドロキシエチル〕−１−ピ ペラジンエタンスルホン酸）バッファー（５ｍＭ）及びインスリン（２５μｇ／ ｍｌ）、トランスフェリン（１００μｇ／ｍｌ）、プロゲステロン（２０ｎＭ） 、プトレスシン（６０μＭ）及びセレニウムクロリド(３０ｎＭ)(グルタミン〔 ギブコ〕を除き全てシグマから得られる)を含む所定のホルモン混合物及び塩混 合物（血清を置換する）を含むＤＭＥＭ／Ｆ−１２（１：１）からなる培地（以 下“完全培地”と呼ぶ）に懸濁した。さらに、培地は、１６〜２０ｎｇ／ｍｌの ＥＧＦ(マウスの下顎腺から精製したもの、コラボレイティブリサーチ(Collabor ative Reserach))またはＴＧＦα（ヒト組み換え体、ギブコ）を含有した。細胞 は0.2×１０⁶細胞／ｍｌの密度で７５cm²の組織培養フラスコ（コーニング）内 に、前処理した物質は何も加えず、プレートし、３７℃、湿度１００ ％、９５％空気／５％ＣＯ₂の条件下のインキュベーター内においた。 細胞が、インビトロにおいて最初の４８時間以内及び３〜４日（ＤＩＶ）後迄 に増殖した時、それらは神経球体として知られる小さなクラスターを形成してお り、これは４〜６ＤＩＶの間に基質を持ち上げた（図１）。神経球体は未分化の 前駆細胞（例えば、幹細胞及び前駆細胞(progenitor cell)）を含む。 ７ＤＩＶ後、神経球体を除去し、４００r.p.m.で２〜５分間遠心分離を行い、 ペレットを、口焼きしたガラス製のパスツールピペットを使用して機械的に個々 の細胞に２ｍｌの完全培地中に分離した。１×１０⁶個の細胞を２０ｍｌのＥＧ Ｆ含有完全培地を含んだ７５cm²の組織培養フラスコ内に再度プレートした。幹 細胞の増殖及び新しい神経球体の形成が再び始まった。この工程を６〜８日毎に 繰り返すことができる。 実施例２ 神経球体の分化 神経球体を以下の方法を用いて分化した。以下のパラダイムを使用することに より、神経細胞、星状膠細胞及び乏突起膠細胞が産生される。しかし、特定の成 長因子または成長因子の組み合わせは分化の後に得られる表現型の比率を改変す る。さらに、グリアフィーダー層の使用は得られる表現型の比率に影響を与える ことができる。以下の各パラダイムにおいて使用される神経球体は実施例１に述 べられたように産生された。使用される全ての神経球体は分化の前に少なくとも 一回継代(pass)された。 パラダイム１…神経球体の迅速な分化 第一の継代の後６〜８日後に、神経球体を除去し、４００r.p.m.で遠心分離を 行った。ＥＧＦ−含有上澄み液を除去し、ＥＧＦを含まず、１％胎児ウシ血清（ ＦＢＳ）を含む完全培地内にペレットを懸濁した。 神経球体（およそ0.5-1.0×１０⁶細胞／ウェル）を、２４ウェルヌクロン（Nu clon）（1.0ｍｌ／ウェル）培養皿内のポリ−Ｌ−オルニチン被膜化（１５μｇ ／ｍｌ）カバーガラス上にプレートした。２４時間培養後、カバーガラスを、0. 5％ＦＢＳを含む完全培地を含有する１２ウェル(コスター(Costar))培養皿に移 動した。培地を４〜７日毎に変えた。この分化方法を“迅速分化パラダイム” またはＲＤＰと呼ぶ。 パラダイム２…解離した神経球体の分化 第一の継代の後６〜８日後に、神経球体を除去し、４００r.p.m.で遠心分離を 行った。ＥＧＦ−含有培地を除去し、ＥＧＦを含まず、１％ＦＢＳを含む完全培 地内にペレットを懸濁した。神経球体を機械的に、口焼きしたガラス製のパスツ ールピペットを使用して単一の細胞に分離し、８００r.p.m.で５分間遠心分離を 行った。0.5×１０⁶〜1.0×１０⁶個の細胞を、２４ウェルヌクロン(Nuclon)（1. 0ｍｌ／ウェル）培養皿内のポリ−Ｌ−オルニチン被膜化（１５μｇ／ｍｌ）カ バーガラス上にプレートした。ＥＧＦを含まない、１％ＦＢＳを含む培地を４〜 ７日毎に変えた。 パラダイム３…単一神経球体の分化 神経球体をＥＧＦがフリーとなるように、継続的にＥＧＦを含まない培地を取 り替えることにより洗浄した。各々の神経球体を、２４ウェルプレート内のポリ −Ｌ−オルニチン被膜化（１５μｇ／ｍｌ）カバーガラス上にプレートした。使 用された培地は、１％ＦＢＳを含む完全培地かまたは含まない完全培地であった 。培地を４〜７日毎に変化させた。三重ラベル免疫細胞化学により、全ての３種 類の神経細胞型（即ち、神経細胞、星状膠細胞及び乏突起膠細胞）は、単一の神 経球体からクローン的に誘導されることが明らかになった（図２）。 パラダイム４…単一解離神経球体の分化 神経球体をＥＧＦがフリーとなるように、継続的にＥＧＦを含まない培地を取 り替えることにより洗浄した。単一の神経球体を、0.5ｍｌのエッペンドルフ遠 沈管内に分離し、全ての細胞をポリ−Ｌ−オルニチン被膜化３５ｍｍ培養皿内に プレートした。１％ＦＢＳを含む完全培地かまたは含まない完全培地を使用した 。 パラダイム５…線条体星状膠細胞と共に培養した神経球体の分化 実施例１に記載した線条体細胞由来の神経球体を５−ブロモデオキシウリジン （ＢｒｄＵ）でラベル化し、ＥＧＦを含まないように洗浄した。星状膠細胞フィ ーダー層が出生直後のマウス（0-24時間）の線条体組織から産生され、２４ウェ ル培養皿内のポリ−Ｌ−オルニチン被膜化カバーガラス上にプレートした。星状 膠細胞が融合性である場合には、解離または無傷神経球体を各星状膠細胞層上に 置いた。完全培地を最初の２４時間後に変え、次に４８時間毎に変えた。星状膠 細胞フィーダー層上で分化した場合には、ＧＡＢＡergic及びSubstance Pergic 神経細胞に加えて、ソマトスタチン、ＮＰＹ、グルタメート及びメセンケファリ ン−含有神経細胞が存在した（図３）。 実施例３ 様々な効果に対する薬剤または他の生物学的薬剤のスクリーニングＡ．ＢＤＮＦの神経細胞及びグリア細胞の分化及び生存における効果 前駆細胞を実施例１に記載したように増殖させ、実施例２に記載のパラダイム ３を用いて分化した。ＥＧＦ産生細胞をプレートする際に、ＢＤＮＦを１０ｎｇ ／ｍｌの濃度で添加した。インビトロにおいて３、７、１４及び２１日後（ＤＩ Ｖ）に細胞の間接的な免疫細胞化学を行った。ＢｒｄＵラベル化を前駆細胞の増 殖をモニターするために使用した。ＢＤＮＦの神経細胞、乏突起膠細胞及び星状 膠細胞に対する効果を、神経細胞（ＭＡＰ−２、ＮＳＥ、ＮＦ）、乏突起膠細胞 （Ｏ４、ＧａｌＣ、ＭＢＰ）または星状膠細胞（ＧＦＡＰ）上で見られる抗原を 認識する抗体を用いて培養をプローブ(probing)することによりアッセイした。 細胞の生存を各時間点の免疫反応細胞の数を計測することにより測定し、及び形 態学的観察を行った。ＢＤＮＦは、コントロール条件下における観測数に対して 、有意に神経細胞の分化及び生存を増加させた（図４）。星状膠細胞及び乏突起 膠細胞数はコントロールの値から有意に変化しなかった。Ｂ．ＢＤＮＦの神経表現型の分化における効果 Ａ部に記載される方法に従いＢＤＮＦにより処理された細胞を、神経伝達物質 または神経伝達物質の合成に関与する酵素を認識する抗体によりプローブした。 これらはチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）、コリンアセチルトランスフェラー ゼ（ＣｈＡＴ）、サブスタンスＰ、ＧＡＢＡ、ソマトスタチン及びグルタメート を含む。コントロール及びＢＤＮＦ−処理培養条件の両方において、試験を行っ た神経細胞はサブスタンスＰ及びＧＡＢＡの存在に対し陽性であった（図５）。 個数が増加すると同時に、ＢＤＮＦ内で成育した神経細胞は、コントロール実施 例と比較して神経突起の伸長及び分岐において劇的に増加を示した（図６）。Ｃ．成長因子応答細胞の同定 成長因子処理に応答性の細胞を、実施例２のパラダイム３の記載に従い、かつ ＩＤＩＶにおいておよそ１００ｎｇ／ｍｌのＢＤＮＦを添加することによってＥ ＧＦ産生プロゲニーを分化して同定した。神経細胞（ＭＡＰ−２、ＮＳＥ、ＮＦ ）、乏突起膠細胞（Ｏ４、ＧａｌＣ、ＭＢＰ）または星状膠細胞（ＧＦＡＰ）を 認識する抗体をｃ−ｆｏｓ及び／または他の即時−初期(immediate early)遺伝 子を認識する抗体と組み合わせて使用した。ＢＤＮＦへの接触は、神経細胞内の ｃ−ｆｏｓの発現における選択的増加を起こす（図６）。Ｄ．増殖及び分化の間のマーカー及び調整因子の発現におけるＢＤＮＦの効果 Ａ部に記載される方法に従いＢＤＮＦにより処理された細胞を、実施例５に記 載されるようにＦＧＦ−Ｒ１の発現の分析、または実施例６に記載されるように 他のマーカーまたは調整因子の発現の分析を行った。Ｅ．分化の間における、神経細胞の電気生理学的性質へのＢＤＮＦ投与の効果 Ａ部に記載の方法に従い、分化の間にＢＤＮＦ処理を行った神経細胞を実施例 ７に記載されたようにその電気生理学的性質の測定を行った。Ｆ．成長因子産生幹細胞プロゲニーの増殖、分化及び生存におけるクロルプロマ ジンの影響 精神病の治療に広く使用されるクロルプロマジンを上記の実施例３Ａ〜３Ｅに おけるＢＤＮＦの代わりに、１０ｎｇ／ｍｌ〜１０００ｎｇ／ｍｌの濃度で使用 する。薬剤の様々な濃度における、幹細胞の増殖及び幹細胞プロゲニーの分化及 び生存に対する効果を計測する。遺伝子発現の変化及び分化した神経細胞の電気 生理学的性質を測定する。Ｇ．ドーパミン様細胞の分化及び生存におけるデプレニルの影響 一次培養を実施例１に記載の方法に従い調製する。細胞を分化しドーパミン様 神経細胞の数を増加させる。単一の未解離６日後の一次産生神経球体を、ラット Ｂ−４９グリア細胞系誘導調製培地（７５％）＋２０ｎｇ／ｍｌＦＧＦ−２を含 む完全培地中のポリ−Ｌ−オルニチン被膜化カバーガラス上にプレートし、３７ ℃、湿度１００％、９５％空気／５％ＣＯ₂という条件下で培養した。パーキン ソン病の治療に使用されるデプレニルを、１ｎｇ／ｍｌ〜１０００ｎｇ／ｍｌの 濃度で、分化の始め及び／または一度分化が起こった段階で培養に加える。生存 するドーパミン様細胞数を間隔をおいて計測し、コントロール培養と比較する。 さらに、神経伝達物質発現を測定する生化学的アッセイ及び核酸分析を行う。 実施例４ 幹細胞増殖アッセイ 一次細胞をＥ１４マウスから得て、実施例１の記載に従い調製した。ＥＧＦ、 ＥＧＦ及びＦＧＦ、またはＦＧＦ及びＢＭＰ−２のいずれかを、各成長因子２０ ｎｇ／ｍｌの濃度において、完全培地に加えた（ただし、ＢＭＰ−２は１０ｎｇ ／ｍｌの濃度で加えた。）。細胞を、調製した成長因子含有培地の一つで、25,0 00細胞／ウェルの濃度となるように希釈した。２００μｌの細胞／培地の混合物 を前処理をしていない９６−ウェルプレース(Nuclon)の各ウェル内ピペットで加 えた。細胞を実施例１の記載と同じ条件下で培養した。 ８−１０ＤＩＶ後に神経球体数を計測し、結果を表に示した。図７に示される ように、ＥＧＦ及びＦＧＦの組み合わせの存在下成育した細胞は、ＥＧＦのみの 存在下において成育した細胞よりも有意に多数の神経球体を産生した。ＥＧＦ及 びＢＭＰ−２の組み合わせは神経球体の発達を阻害した。 実施例５ 逆転写−ポリメラーゼ鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）による、未分化及び分化幹細胞− 由来プロゲニーにおける受容体及び成長因子発現の比較 神経球体を実施例１の記載に従い産生し、幾つかを実施例２のパラダイム１に 従い分化した。未分化または分化神経球体由来のＲＮＡをChomzynski及びSacchi (Anal.Biochem．162:156-159(1987))のグアニジニウムチオシアネート酸フェノ ール法に従い単離した。相補性ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）をオリゴｄＴをプライマーと して逆転写酵素を使用して全ＲＮＡから合成した。遺伝子特異的プライマーを設 計して合成し、及びこれらのプライマーをＰＣＲ法において使用して異なる成長 因子及び成長因子受容体に対するｃＤＮＡを増幅した。増幅した物質を分子量マ ーカーと共にアガロースゲル上で展開し、ＰＣＲ生成物が目的のサイズであるか どうか確認した。一方、ＰＣＲフラグメントの同定は制限酵素分析及び配列決定 法によって確認した（Arcellana-Panlilio，Methods Enzymol．225: 303-328(19 93)）。図８は、ＵＶ照射により視覚化したエチジウム染色アガロースゲルの写 真であり、未分化及び分化幹細胞由来プロゲニーにおける三種類の成長因子受容 体転写物、即ちＥＧＦ−Ｒ、ＦＧＦ−Ｒ及びＬＩＦ−Ｒの検出を示している。表 １は分析されたプライマーセット及び未分化及び分化細胞の結果を示している。 実施例６ 神経幹細胞増殖及び分化に関連する新規なマーカー及び調整因子の単離 ＣＤ₁アルビノマウス(Charles River)由来のＣＮＳ組織を使用して実施例１の 記載に従い神経球体を産生した。この神経球体の幾つかを実施例２における迅速 分化パラダイムに従い分化させ、神経細胞、星状膠細胞及び乏突起膠細胞が豊富 な培養を生成した。全ＲＮＡを未分化神経球体及び分化細胞培養から実施例５に 記載のグアニジニウムチオシアネート酸フェノール法を使用して、抽出した。メ ッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）をＵまたはＴのストレッチ(stretch)に対する ポリＡトラクト(tract)の親和性を利用して単離する。ｃＤＮＡから生成したｍ ＲＮＡの逆転写を、プラスミド[Rothstein et al.，Methods in Enzymology 225 : 587-610(1993)]またはラムダファージベクターのいずれかの一次ライブラリー を作成するために使用する。未分化または分化幹細胞由来プロゲニーのいずれか に特異的なｃＤＮＡを単離するために、一方のｃＤＮＡを、他由来のＲＮＡとハ イブリダイズし、逆も同様にする。各々のケースにおいて、ハイブリダイズして いない、従って培養型特異的なｃＤＮＡをサブトラクトされた(subtracted)ライ ブラリー[Lopez-Fernandez and del Mazo，Biotechniques 15(4): 654-658(1993 )]の構築に使用するか、または一次ライブラリーのスクリーニングに使用する。 幹細胞由来未分化細胞特異的及び分化細胞特異的ｃＤＮＡライブラリーは、Ｃ ＮＳ幹細胞増殖及び分化に関連する、新規なマーカー及び調整因子のためのクロ ーン源を提供する。特異的ｃＤＮＡを、同定または機能の手掛かりである特異的 配列モチーフを検出するために配列決定法により、及び既知の転写物に対する相 同性のデータベース検索により研究する。アガロース−ホルムアルデヒドゲル上 で電気泳動し、ナイロン膜に移動した様々なＲＮＡ試料に対してハイブリダイズ するｃＤＮＡの使用により、転写物のサイズ、比発生量、及び特異性の測定が可 能である。ｃＤＮＡ配列の全てまたは一部を、完全なｍＲＮＡ配列またはゲノミ ック配列情報のどちらかを得るために他のライブラリーのスクリーニングに使用 する。特異的なｃＤＮＡから産生された融合タンパクに対する抗体を、免疫細胞 化学またはウエスタンブロット法のどちらかにより、特定の細胞個体群に特異的 なタンパクを検出するために使用する。特異的遺伝子配列は、遺伝子発現をコン トロールする推定調整エレメントに特異的なタンパクを検出するために使用さ れる。これらの調整エレメントは、ベーターガラクトシダーゼのような外因性遺 伝子の発現をするために使用される。 実施例７ 成長因子応答幹細胞由来であり、生物学的薬剤に接触させた神経細胞の電気生理 学的分析 神経球体を実施例１に従い産生した。神経球体を実施例２のパラダイム２の記 載の技術を用いて解離した。クローン性誘導細胞を低密度でプレートしｂＦＧＦ の存在下において分化した。形態学的に神経細胞の外観を有する細胞の電気生理 学的性質を、Vescovi［Neuron，11: 951-966(1993)］らにより報告された方法に 従い測定した。全ての細胞電流クランプにおいて、平均静止電位及び入力抵抗は −62±9ｍＶ及び372±ＭΩであった。長方形電流閾上ステップ(rectangular sup rathreshold current steps）（〜１００ｐＡ）は、再生成電位応答を誘導し、 その応答における振幅及び時間コースは刺激に依存性（図９）であった。電気生 理学的実験の後、細胞形態を５−カルボキシフルオレセインの誘導により視覚化 した。 実施例８ 薬剤または他の生物学的薬剤の、神経的障害に罹患する患者から得られた組織由 来の成長因子−応答性幹細胞プロゲニーにおける効果のスクリーニング ハンチントン病の患者からのバイオプシー（生検）から得られるＣＮＳ組織由 来のＥＧＦ−応答性幹細胞プロゲニーに対するＢＤＮＦの効果を実施例３のＡ〜 Ｅに記載の方法を使用して測定する。ＢＤＮＦはＧＡＢＡergic 神経細胞の可能 性のある分化因子であり、広範囲の神経細胞の外殖を促進する（図５Ｂ）。ハン チントン病は線条体からのＧＡＢＡergic神経細胞（他の中で）の喪失により特 徴付けられる。 実施例９ 成長因子によるアミロイド前駆タンパク（ＡＰＰ）の調整 ＣＮＳ組織をダウン症候群胎児から得て、神経球体を実施例１に記載の方法に 従い産生して継代し、目的の数の細胞を得る。細胞を実施例２に記載されたいず れかのパラダイムを使用して分化する。プレートする際に、ＣＮＴＦ、ＢＭＰ− ２、アクチビン、ＦＧＦ−２またはレチノイン酸を１０ｎｇ／ｍｌの濃度で実験 用ウェル内の培地に加え、２ｎｇ／ｍｌの濃度で毎日加える。３、７及び１４Ｄ ＩＶ後にＡＰＰｍＲＮＡの及びタンパクのレベルを測定した。ノザンブロット分 析のため、ＲＮＡをグアニジウムイソチオシアネート／セシウムクロリド法[Goo dison et al., J. Neuropathol. Exp. Neurol. 52(3): 192-198(1993)]を用いて ＲＮＡを抽出する。ノザンブロットを行って、ＡＰＰ_KPIのプロテアーゼ抑制ド メインをコードするヒトｃＤＮＡまたはＡＰＰ₆₉₅に特異的な３０塩基対オリゴ ヌクレオチドプローブを用いて探査を行う。ウエスタンブロット分析のため、細 胞をLaemmliバッファー内でホモジナイズし、煮沸を行いＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル に載せる。ゲルをイムノブロットし、１：１０００に希釈した抗ＡＰＰを用いて 探査する。ＡＰＰｍＲＮＡ及びタンパク発現のレベルをコントロール培養と比較 する。 実施例１０ 増殖した神経幹細胞プロゲニーの使用による細胞自滅(apoptotic)イベントの分 析Ａ．自然発生的細胞自滅の分析 増殖マウス神経球体を実施例１に記載の方法を用いて調整し、３、５、７、９ 、１２及び１５日後の培養を収穫した。マウス神経球体を実施例２、パラダイム １の方法を用いて分化し、１、４、７、１０、１３及び１６日後の培養を収穫し た。細胞を１ｍｌのＤＮＡｚｏｌ試薬（ギブコ／ＢＲＬ）で分解し、及びゲノミ ックＤＮＡを、５００μｌのエタノールで沈殿させた後、溶液からプールした。 ゲノミックＤＮＡを２６０ｎｍにおける光学濃度により定量化した。アポトーシ スを示すＤＮＡラダリング (laddering)の範囲を、２５０ｎｇのＤＮＡを５０μ ｌ１００ｍＭカリウムカコダイレート(cacodylate)(ｐＨ7.2)、２ｍＭＣｏＣｌ₂ 、0.2ｍＭＤＴＴ、５０μＣｉ〔α³²Ｐ〕ｄＡＴＰ及び２５ユニット末端デオキ シヌクレオチジルトランスフェラーゼ中に溶解することにより、検出した。反応 を６０分間、３７℃で培養した。放射線活性な生成物を２％ゲル電気泳動及びオ ートラジオグラフィーにより分析した。増殖及び分化した神経球体培養の形態学 的及び生化学的分析は、自然発生的アポトーシスに実際に関係する細胞の数が培 養 の日数が進むにつれて２０％より低い範囲から５０％より高い範囲に及ぶことを 示している。Ｂ．神経幹細胞培養における可能性のあるアポトーシス調整のＲＴ−ＰＣＲ分析 既知の推定アポトーシス調整分子の活性をＲＴ−ＰＣＲ分析により確認した。 マウスの神経幹細胞培養の増殖及び分化したプロゲニーを実施例１及び２の方法 を用いて調製した。既知の推定アポトーシス調節ｍＲＮＡ転写物の逆転写−ＰＣ Ｒ分析を行った。細胞を１ｍｌＲＮＡｚｏｌ試薬（ギブコ／ＢＲＬ）内で分解し 、有機相及ぴ水相を0.2体積のクロロホルムを添加することにより分離し、同体 積のイソプロパノールを添加して固形化することにより水相から全ＲＮＡを分離 した。ＲＮＡを２６０及び２８０ｎｍにおける光学濃度によって定量化した。0. 5μｌ逆転写生成物のポリメラーゼ鎖反応分析を、２５μｌ２０ｍＭトリス−Ｈ Ｃｌ（ｐＨ8.0）、５０ｍＭＫＣｌ、0.2ｍＭｄＮＴＰ、1.5mMMgＣｌ₂、0.5μＭ プライマー及び1.25ユニットtaqポリメラーゼ中で行った。典型的なサイクリン グ(cycling)パラメーターは、９４℃３０秒間、６０℃３０秒間及び７２℃１分 間の３０サイクル繰り返しであった。成長因子、成長因子受容体、転写因子、Ｂ ｃｌ−２タンパクファミリーメンバー及びプロテアーゼのインターロイキン変換 酵素ファミリーのメンバーを含む、神経細胞のアポトーシスの３０を越える可能 性のある調節剤の分析を行った。各タンパクファミリーの分化して発現されたメ ンバーが検出された。Ｃ．神経細胞アポトーシスの未知の潜在的調節剤の検出及びクローニング 神経細胞のアポトーシスの未知の転写物潜在的調節剤の活性をｍＲＮＡのフィ ンガープリンティング法により確認した。マウス神経幹細胞培養の増殖及び分化 プロゲニーを調製し、上記に述べたように収穫し、未知の推定アポトーシス調節 分子のｍＲＮＡフィンガープリンティング分析を行った。細胞を１ｍｌＲＮＡｚ ｏｌ試薬（ギブコ／ＢＲＬ）内で分解し、有機及び水相を0.2体積のクロロホル ムを添加することにより分離し、同体積のイソプロパノールを添加して固形化す ることにより水相から全ＲＮＡを分離した。ＲＮＡを２６０及び２８０ｎｍにお ける光学濃度によって定量化した。逆転写及びポリメラーゼ鎖反応分析を上記に 述べたように行った。逆転写生成物を８％アクリルアミド配列決定ゲル上で分離 し、オートラジオグラフィーにより分析を行った。分化して発現したバンドをゲ ルから切断し、再増幅及び配列決定を行った。Ｄ．抗アポトーシス化合物の高スルーアウトアッセイ（throughout assay）のた めの遺伝学的改変幹細胞の確立 ヒト及びマウス神経幹細胞を、潜在的抗アポトーシス治療化合物のための高ス ルーアウトアッセイシステムを提供するために、遺伝的に改変する。多数の直接 形質移入技術を使用して、アポトーシス調節分子プロモーター（Ｂｃｌ−２、Ｉ ＣＥ及びＮｕｒ−７７）により駆動される（driven）細胞形質（緑色蛍光タンパ ク（ＧＦＰ）または分泌（分泌アルカリフォスファターゼ（ＳＥＡＰ））マーカ ータンパク含有ＤＮＡ構築物は安定に、マウス及びヒト神経幹細胞内にトランス フォームされる。形質転換のため、リポフェクタミン(ＢＲＬ)を使用して、細胞 を３５−ｍｍ培養プレートにつき２〜３×１０⁶細胞の割合で接種し、２００μ ｌＤＮＡ−リポソーム複合体（２００μｌ培地中３μｇＤＮＡ、２０μｌリポフ ェクタミン（ＢＲＬ））と共に３７℃で１２時間培養した。神経細胞のアポトー シスにおける様々な化合物の効果を、蛍光（ＧＦＰ）または分泌アルカリホスフ ァターゼ活性（ＳＥＡＰ）による既知のアポトーシス調節遺伝子プロモーターの コントロール下におけるマーカー遺伝子の発現に対する化合物の適用効果により 確認した。 全ての文献及び出願中の特許出願をここに参考として記載する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，Ｍ Ｋ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 レイノルズ ブレント カナダ アルバータ ティ２エヌ １エッ クス９ カルガリー エイ ストリート 235−11

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．以下の工程を含む、神経前駆細胞への少なくとも一種の生物学的薬剤の効果 を測定する方法。 (a) 少なくとも一種の多能性幹細胞を含む哺乳類神経組織を分離する工程、 (b) 該多能性幹細胞を少なくとも一種の成長因子を含む培地内で増殖させ、増 殖した前駆細胞の培養を得る工程、 (c) 該増殖前駆細胞を該生物学的薬剤に接触させる工程、及び (d) 該前駆細胞への該生物学的薬剤の効果を測定する工程。 ２．該成長因子がＥＧＦ、ｂＦＧＦまたはＥＧＦ及びｂＦＧＦの組み合わせから なる群から選択される、請求項１に記載の方法。 ３．該培地が限定される、請求項１に記載の方法。 ４．該哺乳類神経組織が出生直後の哺乳類から得られる、請求項１に記載の方法 。 ５．該哺乳類神経組織がヒトドナーから得られる、請求項１に記載の方法。 ６．該ヒトが神経学的疾患または障害に罹患している、請求項５に記載の方法。 ７．該生物学的薬剤が該神経学的疾患または障害のための潜在的治療薬剤である 、請求項６に記載の方法。 ８．該神経学的疾患または障害がアルツハイマー病、パーキンソン病及びダウン 症候群からなる群から選択される、請求項７に記載の方法。 ９．該工程(d)の効果を、該生物学的薬剤と接触させた工程(c)の増殖させた前駆 細胞の遺伝子ライブラリーと、該生物学的薬剤と接触させていない工程(b)の増 殖させた前駆細胞の遺伝子ライブラリーとを比較することにより測定する、請求 項１または６に記載の方法。 10．以下の工程を含む、神経細胞の分化における少なくとも一種の生物学的薬剤 の効果を測定する方法。 (a) 少なくとも一種の多能性幹細胞を含む哺乳類神経組織を分離する工程、 (b) 該多能性幹細胞を少なくとも一種の成長因子を含む第一培地内で増殖させ 、増殖した前駆細胞の培養を得る工程、 (c) 第二培地内で該生物学的薬剤の存在下に該増殖前駆細胞の分化を誘導する 工程、 (d) 該前駆細胞の分化への該生物学的薬剤の効果を測定する工程。 11．該成長因子がＥＧＦ、ｂＦＧＦまたはＥＧＦ及びｂＦＧＦの組み合わせから なる群から選択される、請求項１０に記載の方法。 12．該第一培地が限定される、請求項１０に記載の方法。 13．該哺乳類神経組織が幼体または成体から得られる、請求項１０に記載の方法 。 14．該哺乳類神経組織がヒトドナーから得られる、請求項１０に記載の方法。 15．該ヒトが神経学的疾患または障害に罹患している、請求項１６に記載の方法 。 16．該生物学的薬剤が該神経学的疾患または障害のための潜在的治療薬剤である 、請求項１６に記載の方法。 17．該神経学的疾患または障害がアルツハイマー病、パーキンソン病及びダウン 症候群からなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。 18．該工程(d)の効果を、該生物学的薬剤と接触させた工程(c)の増殖させた前駆 細胞の遺伝子ライブラリーと、該生物学的薬剤と接触させていない工程(b)の増 殖させた前駆細胞の遺伝子ライブラリーとを比較することにより測定する、請求 項１０または１５に記載の方法。 19．栄養因子の存在下に該増殖前駆細胞の分化を誘導し、該分化細胞の表現型を 操作する、請求項１０に記載の方法。 20．該第二培地がグリアフィーダー細胞相を含む、請求項１０に記載の方法。 21．以下の工程を含む、分化した神経細胞への少なくとも一種の生物学的薬剤の 効果を測定する方法。 (a) 少なくとも一種の多能性幹細胞を含む哺乳類神経組織を分離する工程、 (b) 該多能性幹細胞を少なくとも一種の成長因子を含む第一培地内で増殖させ 、増殖した前駆細胞の培養を得る工程、 (c) 第二培地内で該増殖前駆細胞の分化を誘導し、分化した神経細胞の培養を 得る工程、 (d) 該分化神経細胞を生物学的薬剤と接触させる工程、及び (e) 該分化神経細胞への該生物学的薬剤の効果を測定する工程。 22．該成長因子がＥＧＦ、ｂＦＧＦまたはＥＧＦ及びｂＦＧＦの組み合わせから なる群から選択される、請求項２１に記載の方法。 23．該第一培地が限定される、請求項２２に記載の方法。 24．該哺乳類神経組織が幼体または成体から得られる、請求項２１に記載の方法 。 25．該哺乳類神経組織がヒトドナーから得られる、請求項２１に記載の方法。 26．該ヒトが神経学的疾患または障害に罹患している、請求項２５に記載の方法 。 27．該生物学的薬剤が該神経学的疾患または障害のための潜在的治療薬剤である 、請求項２６に記載の方法。 28．該神経学的疾患または障害がアルツハイマー病、パーキンソン病及びダウン 症候群からなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。 29．該工程(e)の効果を、該生物学的薬剤と接触させた工程(d)の分化させた神経 細胞の遺伝子ライブラリーと、該生物学的薬剤と接触させていない工程(c)の分 化させた神経細胞の遺伝子ライブラリーとを比較することにより測定する、請求 項２１または２６に記載の方法。 30．栄養因子の存在下に該増殖前駆細胞の分化を誘導し、該分化細胞の表現型を 操作する、請求項２１に記載の方法。 31．該第二培地がグリアフィーダー細胞相を含む、請求項２１に記載の方法。 32．神経細胞から調製されるｃＤＮＡライブラリー。 33．該神経細胞が神経幹細胞である、請求項３２に記載のｃＤＮＡライブラリー 。 34．該神経細胞が前駆細胞である、請求項３２に記載のｃＤＮＡライブラリー。 35．該神経細胞が神経細胞、星状膠細胞及び乏突起膠細胞からなる群から選択さ れる分化細胞である、請求項３２に記載のｃＤＮＡライブラリー。 36．該神経細胞が神経学的疾患または障害に罹患しているヒト由来のものである 、請求項３２に記載のｃＤＮＡライブラリー。