JPH08224063A - タンパクゲル化組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 供給量、コスト精製の容易さなどいずれの面
からも問題なく、しかも反応にＣａ²⁺を必要としないな
ど実用性の高いトランスグルタミナーゼをタンパクに作
用させて得られるタンパクゲル化組成物の提供。 【解決手段】 微生物由来の、Ｃａ²⁺非依存性の新規ト
ランスグルタミナーゼによるタンパクのゲル化。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、微生物由来の新規
なトランスグルタミナーゼをタンパクに作用せしめて得
られるタンパクゲル化組成物に関する。

【０００２】トランスグルタミナーゼは、ペプチド鎖内
にあるグルタミン残基のγ−カルボキシアミド基のアシ
ル転移反応を触媒する酵素である。

【０００３】このトランスグルタミナーゼは、アシル受
容体としてタンパク質中のリジン残基のε−アミノ基が
作用すると、分子内及び分子間にε−（γ−Ｇlu）−Ｌ
ys架橋結合が形成される。また水がアシル受容体として
機能するときは、グルタミン残基が脱アミド化されグル
タミン酸残基になる反応を進行させる酵素である。

【０００４】また、この新規トランスグルタミナーゼを
利用して製造される本発明のタンパクゲル化組成物は、
従来のゲル状食品、ゲル状化粧料をはじめとしてヨーグ
ルト、ゼリー、チーズ、ゲル状化粧料などとして用いら
れる。

【０００５】更に、本発明のゲル化組成物は、未加熱で
製造でき、熱に安定なゲルであるため、マイクロカプセ
ルの素材、固定化酵素等の担体などとしても広範囲に用
いることができるものである。

【０００６】

【従来の技術】トランスグルタミナーゼはこれまで動物
由来のものが知られている。例えばモルモットの肝臓
［Connellan et al., ジャーナル・オブ・バイオロジカ
ル・ケミストリー(Journal of Biological Chemistry)
246 巻４号1093〜1098頁(1971)］及び哺乳動物の臓器、
血液に広く分布し［Folk et al.,アドバンセス・イン・
エンザイモロジー（Advances in Enzymology）38巻 109
〜191 頁(1973)、Folk etal.,アドバンセス・イン・プ
ロテイン・ケミストリー（Advances in Protein Chemis
try)31巻１〜133 頁(1977)］、その酵素の特徴も研究さ
れている。

【０００７】しかし、現時点では微生物由来のトランス
グルタミナーゼについては報告されていない。また、動
物由来のトランスグルタミナーゼを用いるタンパク質の
ゲル化組成物の製造法については本発明者等が既に研究
を行なっている（特開昭58−149645号）。

【０００８】しかし、この動物由来のトランスグルタミ
ナーゼの産業への利用、特にタンパク質のゲル化組成物
の製造法には以下に述べるような欠点がある。

【０００９】動物由来のトランスグルタミナーゼは安価
にまた大量に入手するのが困難である。また、ゲル化さ
せるのには、この高価な酵素が基質タンパク質１ｇあた
り、１ユニット以上必要でかつ、基質タンパク濃度が
2.0重量％以上必要であるという制限があること、更に
は、この動物由来のトランスグルタミナーゼはカルシウ
ム（Ｃａ²⁺）依存性である為に用途が制限される。

【００１０】以上のような欠点を有する為に、動物由来
のトランスグルタミナーゼを用いるタンパクゲル化組成
物の製造についての実用化は困難であるのが現状であ
る。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】従来トランスグルタミ
ナーゼの供給は動物に由来しているため実用性を考慮し
た場合、供給量、供給費用、保存費用、精製の困難さ等
の種々の面から不利であり、このままでは産業上の利用
への可能性はほとんど考えられなかった。

【００１２】従って、本発明の課題は、供給量、コスト
の面、精製の容易さ等のいずれの面からも問題はなく、
しかも反応にＣａ²⁺を必要としない点等、実用性の高い
微生物由来の新規トランスグルタミナーゼをタンパクに
作用させて得られるタンパクゲル化組成物の提供にあ
る。

【００１３】

【課題を解決するための手段】これまで動物由来の酵素
が検討されてきたが実用性に欠けるため、本発明者等は
給源を微生物に求め広く検索を行った結果、ストレプト
ベルチシリウム属などの微生物にＣａ²⁺非存在下でもペ
プチド鎖内のグルタミン残基のγ−カルボキシアミド基
のアシル転移反応を触媒する従来にない新規なトランス
グルタミナーゼの産生能があることが分かった。また、
この酵素を用いることにより、タンパク質濃度 1.0重量
％以上のタンパク含有溶液又はスラリーをゲル化させて
タンパクゲル化組成物を製造できることを見い出し、本
発明を完成するに至った。

【００１４】すなわち、本発明は、微生物由来の、Ｃａ
²⁺非依存性の、ペプチド鎖内のグルタミン残基のγ−カ
ルボキシアミド基のアシル転移反応を触媒する新規トラ
ンスグルタミナーゼを添加して作用せしめて、タンパク
質濃度１重量％以上のタンパク含有溶液又はスラリーを
ゲル化させて得られたことを特徴とするタンパクゲル化
組成物の製造法に関する。

【００１５】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。

【００１６】本発明のタンパクゲル化組成物の製造に使
用する新規酵素を産生する微生物であるストレプトベル
チシリウム属の菌を具体的に示すと、ストレプトベルチ
シリウム・グリセオカルネウム(Streptoverticillium g
riseocarneum) ＩＦＯ 12776，ストレプトベルチシリウ
ム・シナモネウム・サブ・エスピー・シナモネウム(Str
eptoverticillium cinnamoneum sub sp. cinnamoneum)
ＩＦＯ 12852，ストレプトベルチシリウム・モバラエン
ス（Streptoverticillium mobaraense）ＩＦＯ13819等
があげられる。

【００１７】これら微生物を培養し、本発明に係わる新
規トランスグルタミナーゼ（以後ＢＴＧase と記す）を
取得するための培養法及び精製法等は、次の通りであ
る。

【００１８】すなわち、その培養形態としては液体培
養、固体培養いずれも可能であるが、工業的には深部通
気撹拌培養を行うのが有利である。

【００１９】又、使用する栄養培地の培養源としては一
般に微生物培養に用いられる炭素源、窒素源、無機塩及
びその他の微量栄養源の他、ストレプトベルチシリウム
属に属する微生物の利用出来る栄養源であれば全て使用
出来る。培地の炭素源としてはブドウ糖、ショ糖、可溶
性デンプン「ラスターゲン」（商品名）、グリセリン、
デキストリン、澱粉等の他、脂肪酸、油脂、有機酸など
が単独で又は組合せて用いられる。窒素源としては無機
窒素源、有機窒素源のいずれも使用可能であり、無機栄
養源としては硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、尿
素、硝酸ソーダ、塩化アンモニウム等が挙げられる。
又、有機窒素源としては大豆、米、トウモロコシ、小麦
などの粉、糠、脱脂粕をはじめコーンスティープリカ
ー、ペプトン、肉エキス、カゼイン、アミノ酸、酵母エ
キス等が挙げられる。無機塩及び微量栄養素としてはリ
ン酸、マグネシウム、カリウム、鉄、カルシウム、亜鉛
等の塩類の他ビタミン、非イオン界面活性剤、消泡剤等
の菌の生育やＢＴＧase の生産を促進するものであれば
必要に応じて使用出来る。

【００２０】培養は好気的条件で、培養温度は菌が発育
しＢＴＧase が産生する範囲であれば良く、好ましくは
25〜35℃である。培養時間は条件により異なるがＢＴＧ
aseが最も産生される時間まで培養すれば良く、通常２
〜４日程度である。

【００２１】ＢＴＧase は液体培養では培養液中に溶解
されており、培養終了後培養液より固形分を除いた培養
ろ液より採取される。培養ろ液よりＢＴＧase を精製す
るには通常酵素精製に用いられるあらゆる方法が使用出
来る。例えば、エタノール、アセトン、イソプロピルア
ルコール等の有機溶媒による処理、硫安、食塩等による
塩析、透析、限外ろ過法、イオン交換クロマトグラフィ
ー、吸着クロマトグラフィー、ゲルろ過、吸着剤、等電
点分画等の方法が使用出来る。又、これらの方法を適当
に組合せる事によりＢＴＧase の精製度が上る場合は適
宜組合せて行う事が出来る。

【００２２】こうしてこれらの方法によって得られた酵
素液に安定化剤として各種の塩類、糖類、蛋白質、脂
質、界面活性剤等を加え或いは加えることなく、限外ろ
過濃縮、逆浸透濃縮、減圧乾燥、凍結乾燥、噴霧乾燥の
方法を施すことにより液状又は固形の精製ＢＴＧase を
得ることが出来る。

【００２３】ＢＴＧase の活性測定はベンジルオキシカ
ルボニル−Ｌ−グルタミニルグリシンとヒドロキシルア
ミンを基質としてＣａ²⁺存在下または非存在下で反応を
行い、生成したヒドロキサム酸をトリクロロ酢酸存在下
で鉄錯体を形成させ 525nmの吸収を測定し、ヒドロキサ
ム酸の量を検量線より求め活性を算出する（ヒドロキサ
メート法）。

【００２４】ＢＴＧase 活性は特に記載しないかぎり以
下に記載する方法により測定した。

【００２５】

【表１】

【００２６】酵素液の0.05mlに試薬Ａ 0.5mlを加えて混
合し37℃で10分間反応後、試薬Ｂ 0.5mlを加えて反応停
止とＦｅ錯体の形成を行った後 525nmの吸光度を測定す
る。対照としてあらかじめ熱失活させた酵素液を用いて
同様に反応させたものの吸光度を測定し、酵素液との吸
光度差を求める。別に酵素液のかわりにＬ−グルタミン
酸γ−モノヒドロキサム酸を用いて検量線を作成し、前
記吸光度差より生成されたヒドロキサム酸の量を求め、
１分間に１μモルのヒドロキサム酸を生成する酵素活性
を１単位とした。

【００２７】このようにして得られる精製ＢＴＧase の
酵素化学的性質を以下に述べる。尚、ストレプトベルチ
シリウム属内の菌株の種類によりＢＴＧase の酵素化学
的性質について若干の相違点がみられるので、それぞれ
の菌株の生産するＢＴＧase、即ちストレプトベルチシ
リウム・モバラエンス（Streptoverticillium mobaraen
se）ＩＦＯ13819 のトランスグルタミナーゼ（ＢＴＧ−
１と命名）、ストレプトベルチシリウム・グリセオカル
ネウム（Streptoverticillium griseocarneum)ＩＦＯ 1
2776のトランスグルタミナーゼ（ＢＴＧ−２と命名）、
ストレプトベルチシリウム・シナモネウム・サブ・エス
ピー・シナモネウム（Streptoverticillium cinnamoneu
m sub sp. cinnamoneum)ＩＦＯ 12852のトランスグルタ
ミナーゼ（ＢＴＧ−３と命名）についての酵素化学的性
質を記載するとともに、それを包含したものをＢＴＧas
e の酵素化学的性質とする。

【００２８】a) 至適pH：６〜７ 基質としてベンジルオキシカルボニル−Ｌ−グルタミニ
ルグリシンとヒドロキシルアミンを使用し、37℃、10分
反応で作用至適pH範囲を求めた。尚、ＢＴＧ−１の至適
pHは６〜７にあり、ＢＴＧ−２の至適pHは６〜７付近に
あり、ＢＴＧ−３の至適pHは６〜７付近にある（図１、
図５及び図９参照）。

【００２９】b) 至適温度：45〜55℃ 基質としてベンジルオキシカルボニル−Ｌ−グルタミニ
ルグリシンとヒドロキシルアミンを使用し、pH６、10分
反応での作用至適温度範囲を求めた。尚、ＢＴＧ−１の
至適温度は55℃付近であり、ＢＴＧ−２の至適温度は45
℃付近であり、ＢＴＧ−３の至適温度は45℃付近にある
（図２、図６及び図10参照）。

【００３０】c) pH安定性：pH５〜９ 37℃、10分間処理でのpH安定性を求めた。尚、ＢＴＧ−
１はpH５〜９で安定であり、ＢＴＧ−２はpH５〜９で安
定であり、ＢＴＧ−３はpH６〜９で安定である（図３、
図７及び図11参照）。

【００３１】d) 温度安定性 pH７で10分間処理での温度安定範囲を求めた。40℃では
80％以上、50℃では50〜80％の活性がそれぞれ残存し
た。尚、ＢＴＧ−１は40℃では88％活性が残存し、50℃
では74％活性が残存し、ＢＴＧ−２は40℃では86％活性
が残存し、50℃では56％活性が残存し、ＢＴＧ−３は40
℃で80％活性が残存し、50℃では53％活性が残存する
（図４、図８及び図12参照）。

【００３２】e) 基質特異性 ＢＴＧase の各種合成基質とヒドロキシルアミンとの反
応を調べた。

【００３３】合成基質がベンジルオキシカルボニルアス
パラギニルグリシン、ベンジルオキシカルボニルグルタ
ミン、グリシルグルタミニルグリシンの場合反応しな
い。

【００３４】しかし、合成基質がベンジルオキシカルボ
ニルグルタミニルグリシンの場合の反応性は最も高い。
この時の各種合成基質濃度は５mMとした。

【００３５】結果は表−１に示される。なお、表−１中
のＣＢＺはベンジルオキシカルボニル基の略であり、Ｇ
lnはグルタミル基の略であり、Ｇlyはグリシル基の略で
あり、Ａsnはアスパラギニル基の略である。

【００３６】

【表２】

【００３７】f) 金属イオンの影響 活性測定系に１mM濃度になるように各種金属イオンを加
えて影響を調べた。なお、ここでいう活性測定系は、前
述のハイドロキサメート法において、カルシウム非存在
下の系を用いた（下記表−２におけるＮｏｎｅ）。

【００３８】結果は表−２に示される。ＢＴＧase はＣ
ｕ²⁺及びＺｎ²⁺により活性が阻害される。

【００３９】

【表３】

【００４０】g) 阻害剤の影響 各阻害剤を１mMになるように加え、25℃、30分放置後、
活性を測定した。

【００４１】結果は表−３に示される。ＢＴＧase はパ
ラクロロマーキュリー安息香酸（ＰＣＭＢと略する）、
Ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＭと略する）及びモノヨー
ド酢酸により活性が阻害される。

【００４２】

【表４】

【００４３】表−３中ＰＭＳＦはフェニルメチルスルホ
ニルフルオライドの略である。

【００４４】h) 等電点： 8.9〜9.9 アンホライン等電点電気泳動により求めた。尚、ＢＴＧ
−１の等電点（pI）は９付近であり、ＢＴＧ−２の等電
点（pI）は 9.7付近であり、ＢＴＧ−３の等電点（pI）
は 9.8付近である。

【００４５】i) 分子量：約38,000〜約41,000 ＳＤＳディスク電気泳動法より求めた。尚、ＢＴＧ−１
の分子量は約38,000であり、ＢＴＧ−２の分子量は約4
1,000であり、ＢＴＧ−３の分子量は約41,000である。

【００４６】次に、ＢＴＧase とモルモット肝由来のト
ランスグルタミナーゼ（以後ＭＴＧase と記す）との性
質を比較する。尚、ＭＴＧase は特開昭58−149645号に
記載された方法で調製した。

【００４７】表−４には各酵素化学的性質の比較を、表
−５にはＣａ²⁺の活性に及ぼす影響を示す。表−４及び
表−５より明らかのように従来主として研究されている
ＭＴＧase とストレプトベルチシリウム属由来のＢＴＧ
ase とでは酵素化学的性質において種々の差が見られ、
特に温度安定性、分子量、等電点、基質特異性に差が見
られる。また、Ｃａ²⁺の存在下及び非存在下のいずれに
おいても本発明のＢＴＧase は作用する点等でも明らか
な差が見られる。従って、本発明のＢＴＧaseはＭＴＧa
se とはその性質を明らかに異にするものであり、新規
トランスグルタミナーゼである。因みに、本発明に係わ
る新規トランスグルタミナーゼは、Ｃａ²⁺の存在下及び
非存在下のいずれにおいてもヨードアセトアミドにより
活性阻害を受ける。

【００４８】

【表５】

【００４９】

【表６】

【００５０】次にＢＴＧase を用いるタンパクゲル化組
成物の製法について述べる。

【００５１】ＢＴＧase は、適宜なタンパクゲル化剤の
形態で用いることができ、その調製法には、有効成分と
して先に説明した新規トランスグルタミナーゼを使用す
ることを除いては特別の制限はなく、従って、既に知ら
れている同種の酵素製剤の調製手段を適宜採用してタン
パクゲル化剤を調製することができる。例えば、ＢＴＧ
ａｓｅにデキストリン、炭酸カルシウム、乳糖、ソルビ
トール、マルチトールなどの賦形剤、希釈剤等を適宜添
加配合して粉体、顆粒などの固体状に、また液体状に製
剤化できる。

【００５２】次に、ＢＴＧase を用いて行なうタンパク
ゲル化方法について説明する。

【００５３】まず、基質となるタンパク質は、リジン残
基及びグルタミン残基を有し、上述の酵素の触媒をうけ
るものであれば、その起源、性状に制約されるものでは
なく、植物性タンパク質、動物性タンパク質、微生物タ
ンパク質、藻類タンパク質などいかなるものでも使用で
きる。植物性タンパク質としては特にその種類は限定し
ないが、例えば油糧種子の脱脂物及びそれらより分離し
たタンパク質などを挙げることができる。また、動物性
タンパク質としては、特にその種類は限定しないが、た
とえば乳タンパク、ゼラチン、コラーゲン、血清アルブ
ミン等を例示することができる。

【００５４】また、本発明に用いる蛋白質としては前記
以外にもプロテアーゼなどで部分的に切断したタンパク
質、合成ペプチドおよび各種の化学修飾したタンパク質
でも、グルタミン残基、リジン残基を有する条件が満た
されれば、この酵素の基質とすることができる。

【００５５】これらのタンパク質の１重量％以上、好ま
しくは３重量％以上の溶液又はスラリーであれば、ＢＴ
Ｇase の添加により高粘性物、あるいはゲル状物が形成
され、１重量％以下であれば、溶液状又は沈殿状の架橋
高分子化物が得られる。このように、本発明に従ってタ
ンパク質の溶液又はスラリーにＢＴＧase を作用させる
と、高粘性物またはゲル状物が形成される。そこで、本
明細書においてまた本発明に関して、文脈上別異に解さ
れない限り、タンパクゲル化組成物は広義に定義され、
いわゆる典型的なゲル化物のみならず、それ程にゲル化
していない高粘性化物をも包含するものと定義する。同
様に文脈上別異に解されない限り、ゲル化は狭義のいわ
ゆるゲル化および高粘性化を包含するものと定義する。

【００５６】ＢＴＧase はタンパク１ｇに対して0.01〜
2000ユニット添加、好ましくは 0.1〜200 ユニット添
加、反応溶液のpHは４〜10、好ましくは５〜８に調整
し、５〜80℃、好ましくは40〜60℃で10秒〜24時間、好
ましくは10分〜２時間インキュベートすると架橋高分子
化物ないしはゲル状物を得ることができる。このよう
に、本発明に係わるＢＴＧase は低い酵素濃度でゲル化
できる（基質タンパク質１ｇあたり0.01ユニット以上あ
ればよい）、及び低い基質濃度で使用できる（基質タン
パク質濃度１重量％以上であればよい）等の特徴を有す
る新規な酵素である。

【００５７】このＢＴＧase 処理により十分なゲル化組
成物が得られるが、更に必要により反応終了後のゲル化
組成物を60〜200 ℃で１分間〜24時間加熱処理すること
により更に強固なゲル化組成物が得られる。前記タンパ
ク含有溶液又はスラリーは、単にタンパクと水との混合
物に限らず、タンパク、水および油脂を混合した水中油
型又は油中水型エマルジョンであってもよく、各種塩
類、澱粉、少糖類、多糖類、香料、保湿剤、着色料など
もＢＴＧase による架橋高分子化及びゲル化を阻害しな
い範囲で適宜選択して添加することができる。

【００５８】またタンパク質の種類と量を調整すること
によって架橋高分子化物の架橋度を変えることができ、
これにより、生成するゲル化組成物の物性及び含水量を
目的と用途に応じて変えることができる。

【００５９】

【実施例】以下に本発明の実施例について述べる。

【００６０】実施例１（ＢＴＧase の作成（その１）） ストレプトベルチシリウム・モバラエンス（Streptover
ticillium mobaraense）ＩＦＯ13819 を培地組成ポリペ
プトン 0.2％、グルコース 0.5％、リン酸二カリウム
0.2％、硫酸マグネシウム 0.1％からなる水性培地（pH
７） 200mlに接種し30℃、48時間培養し、得られた種培
養液をポリペプトン 2.0％、「ラスターゲン」 2.0％、
リン酸二カリウム 0.2％、硫酸マグネシウム 0.1％、酵
母エキス 0.2％、消泡剤としてポリオキシアルキレング
リコールの「アデカノール」（商品名、旭電化社製品）
0.05％からなる培地20Ｌ（pH７）に加え30℃で３日間培
養後ろ過し、培養液18.5Ｌ得た。このものの活性は0.35
ユニット／mlであった。

【００６１】培養液を塩酸でpH6.5 に調製し、予め0.05
Ｍリン酸緩衝液（pH6.5)で平衡化しておいたメタアクリ
ル酸系ポーラス型陽イオン交換樹脂の「アンバーライト
ＣＧ−５０」（商品名、ローム・アンド・ハース社製
品）のカラムに通した。この操作でトランスグルタミナ
ーゼは吸着された。さらに同緩衝液で不純蛋白質を洗い
流した後、さらに0.05〜 0.5Ｍの同緩衝液の濃度勾配を
つくり、通液して溶出液を分画回収し、比活性の高い分
画を集めた。

【００６２】電導度を10ms以下になるように希釈後「ブ
ルーセファロースＣＬ−６Ｂ」（商品名、ファルマシア
・ファインケミカル社製）のカラムに通した。この操作
でトランスグルタミナーゼは吸着された。更に0.05Ｍリ
ン酸緩衝液（pH７）で不純蛋白質を洗い流した後、０〜
１Ｍの食塩濃度勾配をつくり通液して溶出液を回収し比
活性の高い画分を集めた。

【００６３】限外濾過膜の「ＡＩＬ1010」（商品名、旭
化成工業(株)製）を使い濃縮し、 0.5Ｍの食塩を含む0.
05Ｍリン酸緩衝液（pH７）を用いて平衡化させた。

【００６４】得られた濃縮液を同緩衝液で予め平衡化し
ておいた「セファデックスＧ−75」（商品名、ファルマ
シア・ファインケミカル社製）を含むカラムに通し、同
緩衝液を流して溶出液を分画した。

【００６５】この結果活性画分は単一のピークとして溶
出された。このものの比活性は培養ろ液に対し 625倍で
あり、回収率は47％であった。

【００６６】実施例２（ＢＴＧase の作成（その２）） 実施例１と同様にしてストレプトベルチシリウム・グリ
セオカルネウム（Streptoverticillium griseocarneum)
ＩＦＯ 12776を30℃で３日間培養後ろ過し培養液19Ｌを
得た。このものの活性は0.28ｕ／mlであった実施例１と
同様な方法で酵素を生成してＳＤＳディスク電気泳動で
単一の酵素を得た。

【００６７】実施例３（ＢＴＧase の作成（その３）） 実施例１と同様にしてストレプトベルチシリウム・シナ
モネウム・サブ・エスピー・シナモネウム(Streptovert
icillium cinnamoneum sub sp. cinnamoneum)ＩＦＯ 12
852を30℃で３日培養後ろ過し、培養液18.5Ｌを得た。
このものの酵素活性は 0.5ｕ／mlであった。

【００６８】実施例１と同様な方法で酵素を精製してＳ
ＤＳディスク電気泳動で単一の酵素を得た。

【００６９】 実施例４（タンパクゲル化組成物（その１）） （１）特開昭58-149645 号の実施例１に記載された方法
により調製または購入した食品タンパク類、すなわち
(i) α_S1−カゼイン、(ii)Ｎａ−カゼイネート、(iii)
大豆11Ｓグロブリン、(iv)大豆７Ｓグロブリン、(v) 分
離状大豆タンパク「アジプロンＳ−２」（商品名、味の
素(株)製）、(vi)水抽出大豆タンパク、(vii) 酸沈澱大
豆タンパク、(viii)大豆タンパク粒子、(ix)大豆タンパ
クミセル、(x) ゼラチンの各５及び10重量％の水溶液ま
たは懸濁液５mlに、実施例１で調製したＢＴＧase （凍
結乾燥品、比活性2.50ｕ／mg protein) をタンパク１mg
当り0.02ｕ加え、55℃、１時間振盪インキュベートし
た。

【００７０】室温放置後、サンプルの入った試験管を倒
置し、流れ落ちるかどうかでゲル化を判定した。結果は
表−６に示した。

【００７１】（２）ＢＴＧase の基質とするためウサギ
ミオシンを次のように調製した。

【００７２】Perry の方法（Perry, S.V. (1975), “Me
thods in Enzymology ” vol.2,pp.582-588, AcademicP
ress, New York）に従い、ウサギの骨格筋25ｇより３倍
量の0.45Ｍ ＫＣｌ、５mM ＡＴＰ−ＭｇＣｌ₂ 、50mM
リン酸緩衝液（pH 6.4）中で０℃、30分間ミオシンを抽
出し、以下希釈沈殿によって集め 0.5Ｍ ＫＣｌ、20mM
Tris-maleate(pH7.5)溶液に透析し、10⁵ ×ｇで60分間
遠心分離した上清を精製ミオシンとして使用した。

【００７３】タンパク濃度は 1.5％であった。これに上
記(1）と同様の条件でＢＴＧase を添加しゲル化能を調
べた。結果は表−６に示した。

【００７４】（３）ＢＴＧase の基質とするためエビミ
オシンを次のように調製した。

【００７５】新鮮（生）甘えび（体長約５cm）の皮をむ
きエビ屈曲筋肉をとり出し、ミンチ後、氷水洗浄し、更
に冷却下0.1mM ＤＴＴ、0.1mM ＰＭＳＦ存在下でホモジ
ナイズし、遠心分離でアクトミオシンを抽出分離した。
更に10⁵ ×ｇで60分間超遠心操作によりアクチンを除き
ミオシンに富んだ画分を得た。更に希釈沈殿／超遠心操
作を繰り返し、エビ精製ミオシンを得た。この精製ミオ
シンはＣａ−ＡＴＰase 活性がなくアクチンとの結合能
も消失していることから、変性ミオシンであることがわ
かった。

【００７６】このタンパク濃度 3.6％の変性エビミオシ
ン溶液５ml（緩衝液、 0.5Ｍ ＫＣｌ、５mM ＣａＣｌ
₂ 、25mM Tris-ＨＣｌ（pH7.5 ）５mM ＤＴＴ）に対し
3.6ｕのＢＴＧase （実施例１と同様の方法で調製）を
添加し、35℃の水浴中に浸漬することによって反応を開
始し、最大35分間反応させた。

【００７７】以上のゲル化能の実験結果をまとめると表
−６のようになった。

【００７８】尚、比較例として、ＭＴＧase によるゲル
化能試験結果も示した。尚、ＭＴＧase の添加量は基質
たんぱく質１mg当り 0.1ｕとした。

【００７９】

【表７】

【００８０】 実施例５（タンパクゲル化組成物（その２）） ゼラチン（新田ゼラチン製）に５及び10重量％溶液とな
るように 0.1Ｍトリス−ＨＣｌbuffer（pH7.6)を加え、
60℃、３分で完全にゼラチンを溶解し、実施例４（１）
におけると同じＢＴＧase を0.02ｕ／mgタンパク質加え
よく撹拌後37℃、１時間反応させた後、沸とう水浴中に
10分間加熱した直後の状態を観察した。

【００８１】尚、ＢＴＧase を添加しない以外は全く同
一の処理をしたものを対照とした。結果は表−７に示し
た。

【００８２】

【表８】

【００８３】 実施例６（タンパクゲル化組成物（その３）） ＢＴＧase の基質とするため、絹蛋白質水溶液を以下の
方法で調製した。脱脂ずみの絹糸2.33ｇを 9.3Ｍ臭化リ
チウム（ＬｉＢｒ）溶液 100mlに加え、40℃で一晩撹拌
すると絹糸は可溶化した。この溶液に対し吸引濾過、対
水透析を行い粗絹蛋白質水溶液（約２重量％）を得た。

【００８４】予め試験管内に最終濃度が0.01ｕ、0.02
ｕ、0.04ｕ／mgタンパク質となるように実施例４（１）
におけると同じＢＴＧase を入れておき、シェアリング
によるゲル化をさけるため静かに絹蛋白質水溶液を加え
た。対照としてＢＴＧase 未添加のものも用意した。

【００８５】各々の試験管を室温で一晩放置後試験管内
の試料の状態を観察し表−８の結果を得た。

【００８６】

【表９】

【００８７】 実施例７（タンパクゲル化組成物（その４）） 市販牛乳（粗タンパク 2.9％）を約５倍（粗タンパク1
4.5％）に減圧濃縮して得た濃縮牛乳１Ｌ（リットル）
に対して、実施例４(1) に示したと同じＢＴＧase を２
ｕ加えて撹拌し、55℃、30分インキュベートした。生じ
たゲル状物を80〜95℃、20分加温し残存酵素を失活させ
た後、冷却するとプリン状のゲル食品を得た。

【００８８】要すれば、10％程度まで砂糖を添加しても
同様のゲル状物を得ることができた。

【００８９】 実施例８（タンパクゲル化組成物（その５）） 市販牛乳（粗タンパク 2.9％、油脂 3.2％、水分89％）
を約５倍に減圧濃縮し、濃縮牛乳（約10Ｌ）とし、これ
に30％のグルコノデルタラクトン溶液 100mlを加え、速
やかに混合した後、pH6.0 以上であることを確認してか
ら、実施例４（１）に示したと同じＢＴＧase を 100ｕ
加えて、撹拌し、45℃、45分間インキュベーター中に静
置してゲル化させた。かかる後にゲルを壊わさないよう
にゲルを80〜95℃迄加熱し、ＢＴＧase の失活とグルコ
ノデルタラクトンのグルコン酸への分解を行ない、ゲル
のpHを４〜５に調整した。そして冷却後、カード状のゲ
ルを約８cm角にカッティングし、酸塩法で２％程度の塩
濃度にしてPen. caseicolum （ペニシリウム・カゼイコ
ラム）のスターターを接種し、15℃、３週間、RH85％で
熟成させ、チーズを得た。

【００９０】尚、グルコノデルタラクトンを用いない場
合は、乳酸菌（Lactobacillus acidphillus,ラクトバチ
ルス・アシドフィラス）を添加し、ＢＴＧase でゲル化
後、40℃で２〜５時間発酵させても同じようなチーズが
得られた。

【００９１】本法で得られるチーズは、高価な子牛のレ
ンネットを使用せずに製造することができ、またその物
性は、かなりしなやかな弾性をもつ品質の良いものであ
った。

【００９２】 実施例９（タンパクゲル化組成物（その６）） 実施例８の濃縮乳（１Ｌ）を５℃前後に冷却して、Stre
ptococuss thermophillus （ストレプトコッカス・サー
モフィラス）からなるスターター（５％程度）をすばや
く添加混合し、更に実施例４（１）におけると同様のＢ
ＴＧase を１ｕ（約0.01ｕ／ｇタンパク質に相当）加え
て撹拌し、35℃、１時間インキューベーターの中で静置
ゲル化させた。次にゲル温度を50℃とし、この温度に40
分間保持し、S.thermophillus によって酸を生成せしめ
かつフレーバーを増加せしめた後、更に75〜85℃に加温
せしめＢＴＧase を失活させた。

【００９３】冷却すると軽い酸味を持つ品質の優れたヨ
ーグルト様食品が得られた。

【００９４】 実施例10（タンパクゲル化組成物（その７）） 市販豆乳（明治乳業 (株) 製「サングロー豆乳」、粗タ
ンパク 3.1％）を約 2.5倍に減圧濃縮し、更に20℃以下
に冷却して得られた濃縮豆乳（粗タンパク７．７５％）
１Ｌに対し、実施例４（１）に示したと同様のＢＴＧａ
ｓｅ を４ｕ（0.05ｕ／ｇタンパク質に相当）加えてプ
ラスチック容器に充填し、フタをしシールした後、55℃
の湯浴中で30分加温し、酵素反応させゲル化した。しか
る後に高周波誘電加熱装置（電子レンジ、2450メガヘル
ツ、波長12cm）を用いて加熱した。

【００９５】通常の絹ごし豆腐、木綿豆腐と比較すると
しなやかで、型くずれしない品質の良い豆腐様ゲルがで
きた。

【００９６】 実施例11（タンパクゲル化組成物（その８）） 丸大豆 6.5kgを20kg位の水に浸漬し、常温で１晩充分吸
水膨潤させたものを、水を加えながら磨砕機ですりつぶ
し「ご」を得た。これに更に水を25kg加え、ごを薄め少
量の消泡剤を添加し煮釜に移し、スチームを吹き込んで
加熱した。加熱条件は５分かけて 100℃まで上げ、３〜
５分保つ方法がよい。煮込み後おから絞り機でおからを
除き濃厚豆乳（粗タンパク 7.0％、油分 8.1％、水分75
％）30kg得た。

【００９７】これに実施例４(1) に示したと同じＢＴＧ
ase を 200ｕ(0.1ｕ／ｇタンパク質に相当) 加えて直ち
にケーシングチューブ（塩化ビニリデンチューブ）に充
填し、37℃、30分湯浴中で加熱した。次に90℃以上の湯
浴中に移し、加熱（30〜60分）し、流水中で豆腐様ゲル
を得た。

【００９８】 実施例12（タンパクゲル化組成物（その９）） 表−９のレシピーでカマボコを試作し、レオメーター
（不動工業 (株) 製）による物性測定と官能評価（ｎ＝
10）を実施した。なお、ＢＴＧase は実施例４（１）に
おけると同様のものを使用したが、その添加量はすり身
乾物１ｇに対して20ｕであり、酵素反応はＢＴＧase 無
添加のコントロールのすわり工程と同様に34℃、２時間
とし、反応終了後85℃、30分間加熱して製品とした。

【００９９】

【表１０】

【０１００】物性測定および官能評価の結果を表−10及
び11に示す。

【０１０１】

【表１１】

【０１０２】

【表１２】

【０１０３】以上のようにＢＴＧase を添加して試作し
たカマボコは筋原線維蛋白質の間にε−（γ−Ｇlu）Ｌ
ys架橋が生成するためコントロールに比べて破断強度が
増し、好ましい食感となることがわかった。

【０１０４】 実施例13（タンパクゲル化組成物（その10）） 表−12のレシピーでソーセージを試作し、レオナー（
(株) 山電製）による物性測定と官能評価（ｎ＝10）を
実施した。なお、ＢＴＧase は実施例４（１）における
と同様のものを使用したが、その添加量は豚肉乾物１ｇ
に対して１ｕであり、酵素反応は55℃、２時間とし、反
応終了後、80℃、30分間加熱して製品とした。尚、ＢＴ
Ｇase を添加しないものをコントロールとした。

【０１０５】

【表１３】

【０１０６】物性測定および官能評価の結果を表−13及
び14に示す。

【０１０７】

【表１４】

【０１０８】

【表１５】

【０１０９】以上のようにＢＴＧase を添加して試作し
たソーセージは、ＢＴＧase のゲル形成能によりコント
ロールに比べて粘弾性に富んだ歯ごたえの好ましい食感
となることがわかった。

【０１１０】実施例14（高粘性化物（その１）） 表−15のレシピーでホイッピング・クリームを試作し、
絞り出し特性を評価した。なお、ＢＴＧase は実施例４
（１）におけると同様のものを使用したが、その添加量
はカゼイン・ナトリウム乾物１ｇに対して１ｕであり、
ホイップ操作は万能混合撹拌機（ (株) 三栄製作所製）
を用い、７〜９℃で実施した。尚、ＢＴＧase 無添加の
ものをコントロールとした。

【０１１１】

【表１６】

【０１１２】それぞれのホイッピング・クリームを用い
てガラス板上に花柄を描いて状態を観察したところ、Ｂ
ＴＧase を添加したホイッピング・クリームでは画線の
鋭い造花が可能となった。

【０１１３】 実施例１５（タンパクゲル化組成物（その11）） 表−16のレシピーでアイスクリームを試作し室温に置い
た時の形態変化を観察し、メルトダウン耐性を評価し
た。

【０１１４】なお、ＢＴＧase は実施例４（１）におけ
ると同様のものを使用したが、その添加量は脱脂粉乳乾
物１ｇに対して25ｕであり、酵素反応はアイスクリーム
ミックスの殺菌工程（68℃、30分間）で実施した。殺菌
後、５℃で一晩エージングさせたアイスクリームミック
スをアイスクフリーザー（三菱重工 (株) 製）を用い、
品温−２〜４℃でオーバーラン90％までフリージングを
行い、コーンに充填後、−40℃で硬化させ製品とした。

【０１１５】尚、ＢＴＧase を添加しない以外は全く同
様の操作を行って試作したアイスクリームをコントロー
ルとした。

【０１１６】

【表１７】

【０１１７】コントロールは室温静置後15分で形崩れし
てしまったが、ＢＴＧase を添加したアイスクリームは
30分以上も形崩れを起こさず、しかもコントロールと同
様、滑らかな口ざわりをしていた。

【０１１８】 実施例16（タンパクゲル化組成物（その12）） 試験管内に所要量の牛皮由来アテロコラーゲン粉末（高
研 (株) 製）をとり、0.1Ｍ Tris-ＨＣｌバッファー（p
H7.5)２mlを加え、55℃の水浴中に15分間保持した後撹
拌することにより３〜10％アテロコラーゲン溶液を調製
した。高濃度溶液が冷却によるゲル化をおこさないうち
に実施例４（１）におけると同様のＢＴＧase を0.05ｕ
／mgタンパク質となるよう添加し、55℃で60分間インキ
ュベートした。全体のコントロールとしてＢＴＧase を
添加しない10％アテロコラーゲン溶液についても同様に
インキュベートした。インキュベート終了直後、室温で
60分放置後、更にその後 100℃の水浴中に15分保持後に
試験管内の様子を観察した。 その結果を表−17に示し
た。

【０１１９】

【表１８】

【０１２０】 実施例17（タンパクゲル化組成物（その13）） 生オキアミ凍結肉（大洋漁業 (株) 製）１kgをフローズ
ンカッターにより細砕し、これに食塩30ｇ、ソルビトー
ル（味の素 (株) 製） 100ｇ、新ねり味（味の素 (株)
製）50ｇ、みりん40ｇ、黒レイショ澱粉50ｇを加えさら
に2000ｕのＢＴＧase （実施例４（１）におけると同様
のもの）を 300mlの冷水に可溶化後加えて、ステファン
社製カッターにて約６分混練した。混練直後の温度は５
〜６℃に制御した。

【０１２１】このオキアミ肉ペーストを塩化ビニリデン
製のケーシングチューブ（クレハ化学 (株) 製）に充填
し、50℃にて、１時間インキュベート後、沸とう湯浴中
で25時間加熱した。加熱後流水中で冷却した後、物性測
定をした。即ちサンプルを厚さ３cmに切断し、直径７mm
の球形プランジャーを使用して、不動工業社製レオメー
ターにて測定を行ない、破断強度を求めた。尚、コント
ロールは、ＢＴＧaseを予め、高温加熱変性して失活せ
しめたものを用い、同様の方法で調製した。

【０１２２】その結果を表−18に示した。

【０１２３】

【表１９】

【０１２４】すなわち、ＢＴＧase を加えたオキシアミ
肉のかまぼこ試作品はＢＴＧase を予め失活したコント
ロール区よりも格段に高い破断強度を示すことが認めら
れた。

【０１２５】

【発明の効果】本発明に係わる微生物由来のＢＴＧase
は安価に供給され、かつ精製も容易であるので実用性が
大である。そして、このＢＴＧase を用いることによ
り、カルシウム非存在下で又カルシウム存在下でも酵素
（ＢＴＧase)濃度及び基質濃度が非常に低いところで品
質の優れたゲル化組成物を製造できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明のＢＴＧ−１の至適pH曲線を示すもので
ある。

【図２】本発明のＢＴＧ−１の至適温度曲線を示すもの
である。

【図３】本発明のＢＴＧ−１のpH安定曲線を示すもので
ある。

【図４】本発明のＢＴＧ−１の温度安定曲線を示すもの
である。

【図５】本発明のＢＴＧ−２の至適pH曲線を示すもので
ある。

【図６】本発明のＢＴＧ−２の至適温度曲線を示すもの
である。

【図７】本発明のＢＴＧ−２のpH安定曲線を示すもので
ある。

【図８】本発明のＢＴＧ−２の温度安定曲線を示すもの
である。

【図９】本発明のＢＴＧ−３の至適pH曲線を示すもので
ある。

【図１０】本発明のＢＴＧ−３の至適温度曲線を示すも
のである。

【図１１】本発明のＢＴＧ−３のpH安定曲線を示すもの
である。

【図１２】本発明のＢＴＧ−３の温度安定曲線を示すも
のである。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ａ２３Ｃ 9/12 Ａ２３Ｃ 9/12 9/154 9/154 11/10 11/10 Ａ２３Ｇ 9/02 Ａ２３Ｇ 9/02 Ａ２３Ｌ 1/19 Ａ２３Ｌ 1/19 1/317 1/317 Ａ 1/325 １０１ 1/325 １０１Ｄ １０１Ｂ １０２ １０２Ｚ (72)発明者 田中 晴生 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１ 味の 素株式会社中央研究所内 (72)発明者 内尾 良輔 東京都中央区京橋１−５−８ 味の素株式 会社内 (72)発明者 松浦 明 愛知県春日井市松本町539−２ (72)発明者 安藤 裕康 愛知県江南市古知野町千丸221 (72)発明者 梅田 幸一 岐阜県羽島郡笠松町北及字北山1984−25

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 微生物由来の、Ｃａ²⁺非依存性の、ペプ
   チド鎖内のグルタミン残基のγ−カルボキシアミド基の
   アシル転移反応を触媒する新規トランスグルタミナーゼ
   を添加して作用せしめて、タンパク質濃度１重量％以上
   のタンパク含有溶液又はスラリーをゲル化させて得られ
   たことを特徴とするタンパクゲル化組成物。
2. 【請求項２】 新規トランスグルタミナーゼがタンパク
   含有溶液又はスラリー中のタンパク質１ｇに対して０．
   ０１〜２０００ユニット添加使用されたことを特徴とす
   る特許請求の範囲第１項記載のタンパクゲル化組成物。
3. 【請求項３】 新規トランスグルタミナーゼが微生物由
   来の、ヒドロキサメート法により測定したときにＣａ²⁺
   非依存性の、ペプチド鎖内のグルタミン残基のγ−カル
   ボキシアミド基のアシル転移反応を触媒するものである
   ことを特徴とする請求項１または２記載のタンパクゲル
   化組成物。