JPH08143597A - Human neurotensin receptor protein, its production and use - Google Patents

Human neurotensin receptor protein, its production and use

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JPH08143597A
JPH08143597A JP6289882A JP28988294A JPH08143597A JP H08143597 A JPH08143597 A JP H08143597A JP 6289882 A JP6289882 A JP 6289882A JP 28988294 A JP28988294 A JP 28988294A JP H08143597 A JPH08143597 A JP H08143597A
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JP
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neurotensin receptor
receptor protein
human neurotensin
human
cells
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Japanese (ja)
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Haruo Onda
治夫 音田
Kazuhiro Oogi
和宏 大儀
Kuniji Hinuma
州司 日沼
Yoshinori Masuo
好則 増尾
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Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Original Assignee
Takeda Chemical Industries Ltd
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Abstract

PURPOSE: To obtain a new human neurotensin receptor protein having a specific amino acid sequence, useful for e.g. screening human neurotensin receptor agonists or antagonists, thus to be used for e.g. developing preventive/therapeutic agents for depression, dementia, obnubilation, etc. CONSTITUTION: This new protein has an amino acid sequence including an amino acid sequence of the formula. This protein is used for e.g. screening human neurotensin receptor agonists or antagonists, being useful for the early development of preventive/therapeutic agents as agonists for Parkinson's disease, depression, dementia, hyperkinetic syndrome and obnubilation, and as antagonists for enteritis, pancreatltls, ulcer, stomach cancer, enterocarcinoma, insanity etc. This protein is obtained by making a cDNA library by using mRNAs extracted from human colon cancer culture cells, screening the library with a probe and then by manifesting the resultant human neurotensin receptor gene in host cells.

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【0001】[0001]

【産業上の利用分野】本発明は、ヒト・ニューロテンシ
ンレセプター蛋白質、ヒト・ニューロテンシンレセプタ
ー蛋白質の部分ペプチド、ヒト・ニューロテンシンレセ
プター蛋白質をコードするDNA、該DNAを保持する
ベクター、該ベクター保持する形質転換体、ヒト・ニュ
ーロテンシンレセプター蛋白質の製造法、ヒト・ニュー
ロテンシンレセプター蛋白質を用いるヒト・ニューロテ
ンシンレセプターアゴニスト/アンタゴニストのスクリ
ーニング方法、該スクリーニング用キット、該スクリー
ニング方法で得られるアゴニストまたはアンタゴニス
ト、および該アゴニストまたはアンタゴニストを含有す
る医薬組成物に関する。
The present invention relates to a human neurotensin receptor protein, a partial peptide of the human neurotensin receptor protein, a DNA encoding the human neurotensin receptor protein, a vector containing the DNA, and a vector containing the vector. Transformant, method for producing human neurotensin receptor protein, method for screening human neurotensin receptor agonist / antagonist using human neurotensin receptor protein, said screening kit, agonist or antagonist obtained by said screening method, and It relates to a pharmaceutical composition containing the agonist or antagonist.

【0002】[0002]

【従来の技術】ニューロテンシンは、最初、ウシ視床下
部から単離されたアミノ酸13個からなるペプチドで
〔Caraway, R. and Leeman, S.E. ジャーナル・オブ・
バイオロジカル・ケミストリー(J. Biol. Chem.) 24
8, 6854-6861 (1973)〕、当初はその強力な血圧降下作
用と腸管作用とからホルモンとしての側面が強調された
〔Berelowlts, M. et al. ジャーナル・オブ・ニューロ
ケミストリー(J. Neurochem.) 31, 751-753 (1978),
Carraway, R. and Leeman, S.E. ジャーナル・オブ・バ
イオロジカル・ケミストリー(J. Biol. Chem.) 250,
1907-1911 (1975)〕。しかし、中枢神経系におけるニュ
ーロテンシンの局在が明らかにされ〔Kobayashi, R.M.
et al. ブレイン・リサーチ(Brain Res.) 122, 578-5
81 (1977)〕、さらに、単一ニューロンに対する興奮性
〔Miletic, V. and Randic, M. ブレイン・リサーチ(B
rain Res.) 169, 600-604 (1979)〕あるいは抑制性〔M
aCarthy, P.S. et al. ゼネラル・ファルマコロジー(G
en. Pharmacol.) 10, 331-333 (1979)〕の作用があるこ
とが知られるに至り、神経伝達物質としての可能性が示
唆されてきている。また、黒質や腹側被蓋野(A9,A
10)に存在するドーパミン作動性神経にはニューロテ
ンシンが共存することが知られており〔Hokfelt,T. et
al. ジャーナル・オブ・コンパラティブ・ニューロロジ
ー(J. Comparative Neurology) 222, 543-559 (198
4)〕、ニューロテンシンによるドーパミンニューロンの
制御という点で注目される。
BACKGROUND OF THE INVENTION Neurotensin is a peptide consisting of 13 amino acids originally isolated from the bovine hypothalamus [Caraway, R. and Leeman, SE Journal of.
Biological Chemistry (J. Biol. Chem.) 24
8, 6854-6861 (1973)], and its strong hypotensive action and intestinal action emphasized the hormone aspect [Berelowlts, M. et al. Journal of Neurochemistry (J. Neurochem. ) 31, 751-753 (1978),
Carraway, R. and Leeman, SE Journal of Biological Chemistry (J. Biol. Chem.) 250,
1907-1911 (1975)]. However, the localization of neurotensin in the central nervous system has been clarified [Kobayashi, RM
et al. Brain Research (Brain Res.) 122, 578-5
81 (1977)], and excitability to a single neuron [Miletic, V. and Randic, M. Brain Research (B
rain Res.) 169, 600-604 (1979)] or inhibition [M
aCarthy, PS et al. General Pharmacology (G
en. Pharmacol.) 10, 331-333 (1979)], and its potential as a neurotransmitter has been suggested. In addition, substantia nigra and ventral tegmental area (A9, A
It is known that neurotensin coexists with the dopaminergic nerve present in 10) [Hokfelt, T. et.
al. Journal of Comparative Neurology 222, 543-559 (198)
4)], It is noted that neurotensin controls dopamine neurons.

【0003】最近、ニューロテンシンはNGFなどの成
長因子と同様に、そのレセプターを介して細胞内に取り
込まれ神経軸索内を逆行性に神経細胞体に向けて輸送さ
れることが示された〔Castel, M.N. et al. ジャーナ
ル・オブ・ニューロケミストリー(J. Neurochem.)56,
1816-1818 (1991),Castel, M.N. et al. ニューロサイ
エンス(Neuroscience) 36, 425-430 (1990)〕。また、
ニューロテンシンは神経栄養因子または維持因子として
機能するという報告がなされ、注目されている。その一
方、ニューロテンシンレセプター蛋白質は、放射性リガ
ンドを用いたバインディングオートラジオグラフィー等
により、中枢神経系では、中脳黒質や腹側被蓋野、対角
帯核に存在することがわかっている〔Moyse, E. et al.
ニューロサイエンス(Neuroscience)22, 525-536 (19
87)〕。特に、黒質-線条体系に存在するドーパミン作動
性神経にはニューロテンシン結合部位が存在し〔Masuo,
Y. et al. ブレイン・リサーチ(Brain Res.) 510, 20
3-210 (1990)〕、これらのレセプターを介して、ニュー
ロテンシンによるドーパミン作動性神経の賦活作用が惹
起されるものと考えられている。また、末梢では十二指
腸、小腸、結腸などの腸管に存在しており、水分、電解
質の分泌に関与しているとされている。最近、種々のヒ
ト大腸癌由来の細胞で非常に多くのニューロテンシンレ
セプター蛋白質が発現していることが判明し〔Maoret,
J.-J. et al. バイオケミカル・アンド・バイオフィジ
カル・リサーチ・コミュニケーションズ(Biochem. Bio
phys. Res. Commun.) 203, 465-471 (1994)〕、それと
ともに、ニューロテンシンがある種の大腸癌の生育を促
進することも報告された〔Yoshinaga, K. et al.サージ
ェイン・オンコロジー(Surg. Oncol.) 1, 127-134 (199
2)〕。これらのことより、ニューロテンシンの作用を増
強あるいは遮断する薬剤の開発は様々な疾病に有効であ
ると考えられる。
Recently, it has been shown that, like growth factors such as NGF, neurotensin is taken up into the cell through its receptor and is retrogradely transported to the nerve cell body in the nerve axon [. Castel, MN et al. Journal of Neurochemistry (J. Neurochem.) 56,
1816-1818 (1991), Castel, MN et al. Neuroscience 36, 425-430 (1990)]. Also,
It has been reported that neurotensin functions as a neurotrophic factor or a maintenance factor, and has received attention. On the other hand, the neurotensin receptor protein has been shown to be present in the substantia nigra, ventral tegmental area and diagonal zone nucleus in the central nervous system by binding autoradiography using radioligands [Moyse , E. et al.
Neuroscience 22, 525-536 (19
87)]. In particular, the dopaminergic nerves in the substantia nigra-striatum have neurotensin-binding sites [Masuo,
Y. et al. Brain Res. 510, 20
3-210 (1990)], it is considered that neurotensin activates dopaminergic nerve activation activity through these receptors. In the periphery, it is present in the intestinal tracts such as the duodenum, small intestine, and colon, and is said to be involved in the secretion of water and electrolytes. Recently, it was revealed that a large number of neurotensin receptor proteins are expressed in various human colorectal cancer-derived cells [Maoret,
J.-J. et al. Biochemical and Biophysical Research Communications (Biochem. Bio
Phys. Res. Commun.) 203, 465-471 (1994)], and it was also reported that neurotensin promotes the growth of some colorectal cancers [Yoshinaga, K. et al. Surgeon Oncology. (Surg. Oncol.) 1, 127-134 (199
2)]. From these, it is considered that the development of a drug that enhances or blocks the action of neurotensin is effective for various diseases.

【0004】一般に、ある生理活性物質のアゴニストや
アンタゴニストを開発する場合、該生理活性物質が特異
的に結合するレセプターと親和性の高い化合物の探索が
行われている。ニューロテンシンレセプター蛋白質とし
ては、現在、ウシあるいはラットの全脳膜画分が用いら
れているが、動物種が異なるために、その膜画分に対し
て高親和性であった化合物が、ヒトのニューロテンシン
レセプターに対しても高親和性であるという保証は得ら
れない。また、ヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白
質として、ヒト colon adenocarcinoma HT-29細胞
の膜画分が用いられているが、この細胞はニューロテン
シンレセプターの発現量が少ない上に、その他VIPレ
セプターなど多くのレセプターを発現しているために、
純粋な形でのヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質
ではなく、アゴニストおよびアンタゴニストのスクリー
ニングには不適切である。ラット・ニューロテンシンレ
セプター蛋白質cDNAは既にクローニングされてお
り、COS細胞での発現が報告されているが〔Tanaka
K. et al. ニューロン(Neuron)4巻, 847-854頁 (199
0)〕、ラット・ニューロテンシンレセプター蛋白質を用
いてスクリーニングされたアゴニスト/アンタゴニスト
が、ヒトに対しても効果があるという保証はない。
In general, when developing an agonist or an antagonist of a physiologically active substance, a compound having a high affinity with a receptor to which the physiologically active substance specifically binds is searched for. As the neurotensin receptor protein, the whole brain membrane fraction of bovine or rat is currently used. However, since the animal species are different, the compound having high affinity for the membrane fraction is There is no guarantee that it will have a high affinity for the neurotensin receptor. As a human neurotensin receptor protein, a membrane fraction of human colon adenocarcinoma HT-29 cells is used. This cell has a low expression level of neurotensin receptor and many other receptors such as VIP receptor. Because it is expressed,
Not suitable for screening agonists and antagonists, but not the human neurotensin receptor protein in pure form. The rat neurotensin receptor protein cDNA has been cloned and its expression in COS cells has been reported [Tanaka
K. et al. Neuron 4, 847-854 (199)
0)], there is no guarantee that an agonist / antagonist screened using the rat neurotensin receptor protein will also be effective in humans.

【0005】ヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質
cDNAも既にクローニングされており、COS-7細
胞での発現も報告されているが〔Vita, N. et al. フェ
ブス・レター(FEBS Lett.) 317巻, 139-142頁 (199
3)〕、ヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質の発現
量が低く、また一過性の発現であるために、スクリーニ
ングには不適切であると考えられる。このように、従来
の方法で製造されたヒト・ニューロテンシンレセプター
蛋白質は、スクリーニングに用いるためのレセプター標
品としては不十分であった。したがって、より実用的な
・ニューロテンシンレセプター蛋白質の製造方法の確立
が望まれていた。ヒト・ニューロテンシンレセプター蛋
白質を使用してヒト・ニューロテンシンレセプターのア
ゴニスト/アンタゴニストをスクリーニングすることが
できれば、実験動物を用いることの欠点(例えば、種が
異なることにより、ヒトに対して効果を発揮できない化
合物が得られる可能性があることなど)を克服すること
ができ、ヒトに対して有効な医薬の開発が効率よく行え
るようになると期待される。
The human neurotensin receptor protein cDNA has also been cloned and its expression in COS-7 cells has been reported [Vita, N. et al. FEBS Lett. 317, 139]. -142 pages (199
3)], the expression level of the human neurotensin receptor protein is low and the expression is transient, so that it is considered unsuitable for screening. As described above, the human neurotensin receptor protein produced by the conventional method has been insufficient as a receptor preparation for use in screening. Therefore, it has been desired to establish a more practical method for producing a neurotensin receptor protein. If human neurotensin receptor proteins can be used to screen for human neurotensin receptor agonists / antagonists, the disadvantages of using laboratory animals (eg, due to different species cannot exert effects on humans) It is expected that the possibility of obtaining a compound) can be overcome and the effective drug development for humans can be efficiently performed.

【0006】[0006]

【発明が解決しようとする課題】本発明は、ヒト・ニュ
ーロテンシンレセプター蛋白質、ヒト・ニューロテンシ
ンレセプター蛋白質の部分ペプチド、ヒト・ニューロテ
ンシンレセプター蛋白質をコードするDNA、該DNA
を保持するベクター、該ベクターを保持する形質転換
体、ヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質の製造
法、ヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質を用いる
ヒト・ニューロテンシンレセプターアゴニスト/アンタ
ゴニストのスクリーニング方法、該スクリーニング用キ
ット、該スクリーニング方法で得られるアゴニストまた
はアンタゴニスト、および該アゴニストまたはアンタゴ
ニストを含有する医薬組成物を提供することを目的とす
る。
DISCLOSURE OF THE INVENTION The present invention provides a human neurotensin receptor protein, a partial peptide of the human neurotensin receptor protein, a DNA encoding the human neurotensin receptor protein, and the DNA.
Carrying a vector, a transformant carrying the vector, a method for producing a human neurotensin receptor protein, a method for screening a human neurotensin receptor agonist / antagonist using the human neurotensin receptor protein, the screening kit, It is an object to provide an agonist or antagonist obtained by the screening method, and a pharmaceutical composition containing the agonist or antagonist.

【0007】[0007]

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の課
題に鑑み、鋭意研究した結果、公知のラット・ニューロ
テンシンレセプター蛋白質のアミノ酸配列と同一のアミ
ノ酸配列を有するが、公知のヒト・ニューロテンシンレ
セプター蛋白質とは異なるアミノ酸配列を有する新規な
ヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質をコードする
DNAをクローニングすることに成功した。公知のヒト
・ニューロテンシンレセプター蛋白質のアミノ酸配列の
第200番目のアミノ酸がThrであるのに対して、本
発明のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質のアミ
ノ酸配列(配列番号:1および図1)の第200番目の
アミノ酸はAlaである。また、公知のヒト・ニューロ
テンシンレセプター蛋白質をコードするDNAの塩基配
列のうち、該ヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質
の第63番目および第200番目のアミノ酸をコードす
る塩基配列がそれぞれ63Lys(AAA)および200
hr(ACG)であるのに対して、本発明のヒト・ニュ
ーロテンシンレセプター蛋白質をコードするDNAの塩
基配列のうち、該ヒト・ニューロテンシンレセプター蛋
白質の第63番目および第200番目のアミノ酸をコー
ドする塩基配列がそれぞれ63Lys(AAG)および
200Ala(GCG)である。
Means for Solving the Problems The inventors of the present invention have conducted extensive studies in view of the above problems, and as a result, have the same amino acid sequence as the amino acid sequence of a known rat neurotensin receptor protein. We have succeeded in cloning a DNA encoding a novel human neurotensin receptor protein having an amino acid sequence different from that of the neurotensin receptor protein. The 200th amino acid of the known amino acid sequence of human neurotensin receptor protein is Thr, while the 200th amino acid of the human neurotensin receptor protein of the present invention (SEQ ID NO: 1 and FIG. 1). The amino acid at position th is Ala. Further, among the nucleotide sequences of DNAs encoding known human neurotensin receptor proteins, the nucleotide sequences encoding the 63rd and 200th amino acids of the human neurotensin receptor protein are 63 Lys (AAA) and 200 T
In contrast to hr (ACG), it encodes the 63rd and 200th amino acids of the human neurotensin receptor protein of the nucleotide sequence of the DNA encoding the human neurotensin receptor protein of the present invention. The base sequences are 63 Lys (AAG) and
200 Ala (GCG).

【0008】さらに、本発明者らは、公知のヒト・ニュ
ーロテンシンレセプター蛋白質を発現しているCOS-
7細胞(Vita, N. et al. フェブス・レター(FEBS Let
t.) 317巻, 139-142頁 (1993))に比べて、本発明のの
ヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質をはるかに大
量に発現する細胞株を製造することに成功した。そし
て、該細胞株または本発明のヒト・ニューロテンシンレ
セプター蛋白質もしくはその部分ペプチドを用いること
により効率よく確実にヒト・ニューロテンシンレセプタ
ーアゴニスト/アンタゴニストをスクリーニングできる
ことを見いだした。本発明者らは、これらの知見に基づ
いてさらに研究を重ねた結果、本発明を完成するに至っ
た。
Furthermore, the present inventors have found that COS- which expresses a known human neurotensin receptor protein.
7 cells (Vita, N. et al. Febs Letter (FEBS Let
t.) 317, pp. 139-142 (1993)), it succeeded in producing a cell line which expresses the human neurotensin receptor protein of the present invention in a much larger amount. Then, they have found that a human neurotensin receptor agonist / antagonist can be screened efficiently and reliably by using the cell line or the human neurotensin receptor protein of the present invention or a partial peptide thereof. The present inventors have completed the present invention as a result of further research based on these findings.

【0009】すなわち、本発明は、(1)配列番号:1
で表わされるアミノ酸配列を含有することを特徴とする
ヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質またはその
塩、(2)第(1)項記載のヒト・ニューロテンシンレ
セプター蛋白質の部分ペプチドまたはその塩、(3)第
(1)項記載のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白
質をコードするDNAを含有するDNA、(4)配列番
号:2で表わされる塩基配列を有する第(3)項記載の
DNA、(5)第(3)項記載のDNAを含有するベク
ター、(6)第(5)項記載のベクターを保持する形質
転換体、(7)第(6)項記載の形質転換体を、ヒト・
ニューロテンシンレセプター蛋白質をコードするDNA
の発現が可能な条件下で培養することを特徴とする第
(1)項記載のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白
質の製造法、(8)第(1)項記載のヒト・ニューロテ
ンシンレセプター蛋白質を含有する細胞またはその細胞
膜画分、(9)第(1)項記載のヒト・ニューロテンシ
ンレセプター蛋白質もしくはその塩、第(2)項記載の
部分ペプチドもしくはその塩、または第(8)項記載の
細胞もしくはその細胞膜画分を用いることを特徴とする
ヒト・ニューロテンシンレセプターアゴニストまたはア
ンタゴニストのスクリーニング方法、
That is, the present invention provides (1) SEQ ID NO: 1
A human neurotensin receptor protein or a salt thereof, which comprises the amino acid sequence represented by: (2) a partial peptide of the human neurotensin receptor protein or a salt thereof according to (1), (3) DNA containing DNA encoding the human neurotensin receptor protein according to item (1), (4) DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2, (5) item (3) (6) A vector containing the DNA described in (6), a transformant carrying the vector described in (5) above, and a transformant described in (7) above (6).
DNA encoding neurotensin receptor protein
The method for producing a human neurotensin receptor protein according to item (1), which comprises culturing under conditions that allow expression of the protein, and (8) containing the human neurotensin receptor protein according to item (1) Cells or cell membrane fractions thereof, (9) the human neurotensin receptor protein or salt thereof according to item (1), the partial peptide or salt thereof according to item (2), or the cell according to item (8). Alternatively, a method for screening a human neurotensin receptor agonist or antagonist characterized by using a cell membrane fraction thereof,

【0010】(10)第(1)項記載のヒト・ニューロ
テンシンレセプター蛋白質もしくはその塩、第(2)項
記載の部分ペプチドもしくはその塩、または第(8)項
記載の細胞もしくはその細胞膜画分を含有することを特
徴とするヒト・ニューロテンシンレセプターアゴニスト
またはアンタゴニストのスクリーニング用キット、(1
1)第(9)項記載のスクリーニング方法または第(1
0)項記載のスクリーニング用キットを用いて得られる
ヒト・ニューロテンシンレセプターアゴニスト、(1
2)第(9)項記載のスクリーニング方法または第(1
0)項記載のスクリーニング用キットを用いて得られる
ヒト・ニューロテンシンレセプターアンタゴニスト、
(13)第(11)項記載のヒト・ニューロテンシンレ
セプターアゴニストを含有することを特徴とするパーキ
ンソン病、鬱病、痴呆症、多動児性症候群もしくは意識
障害の予防・治療剤または拒食性誘発剤、(14)第
(12)項記載のヒト・ニューロテンシンレセプターア
ンタゴニストを含有することを特徴とする逆行性食道
炎、腸炎、すい炎、潰瘍、胃癌、腸癌、精神病、ハンチ
ントン病もしくは躁病の予防・治療剤、抗不安剤または
催眠鎮静剤、(15)第(1)項記載のヒト・ニューロ
テンシンレセプター蛋白質もしくはその塩または請求項
2記載の部分ペプチドもしくはその塩に対する抗体を提
供する。
(10) The human neurotensin receptor protein or salt thereof according to item (1), the partial peptide or salt thereof according to item (2), or the cell or cell membrane fraction thereof according to item (8). A kit for screening a human neurotensin receptor agonist or antagonist, comprising: (1
1) The screening method according to item (9) or item (1)
Human neurotensin receptor agonist obtained by using the screening kit according to item (0), (1
2) The screening method according to item (9) or item (1)
0) A human neurotensin receptor antagonist obtained by using the screening kit according to item 0),
(13) A prophylactic / therapeutic agent or an anorexia-inducing agent for Parkinson's disease, depression, dementia, hyperactivity syndrome or consciousness disorder, which comprises the human neurotensin receptor agonist according to (11) , (14) Prevention of retrograde esophagitis, enteritis, pancreatitis, ulcer, gastric cancer, intestinal cancer, psychosis, Huntington's disease or mania, which comprises the human neurotensin receptor antagonist according to (12) A therapeutic agent, an anxiolytic agent or a hypnotic sedative agent, and (15) the human neurotensin receptor protein according to item (1) or a salt thereof or the antibody against the partial peptide according to claim 2 or a salt thereof.

【0011】より具体的には、本発明は、(16)部分
ペプチドが、第(1)項記載のヒト・ニューロテンシン
レセプター蛋白質分子のうち細胞膜の外に露出している
部分ペプチドである第(2)項記載の部分ペプチド、
(17)ベクターがpTS861で標示されるヒト・ニ
ューロテンシンレセプター蛋白質の発現ベクターである
第(5)項記載のベクター、(18)形質転換体がCH
O細胞である第(6)項記載の形質転換体、(19)C
HO細胞がCHO/pTS861-1-2E6またはCH
O/pTS861-24-2C5で標示されるCHO細胞
である第(16)項記載のCHO細胞、(20)細胞が
CHO/pTS861-1-2E6またはCHO/pTS
861-24-2C5で標示されるCHO細胞である第
(8)項記載の細胞またはその細胞膜画分、
More specifically, in the present invention, the (16) partial peptide is a partial peptide of the human neurotensin receptor protein molecule described in (1), which is exposed outside the cell membrane. 2) the partial peptide according to item
(17) The vector according to item (5), wherein the vector is an expression vector for human neurotensin receptor protein designated by pTS861, and (18) the transformant is CH.
The transformant according to item (6), which is an O cell, (19) C.
HO cells are CHO / pTS861-1-2E6 or CH
The CHO cell according to item (16), which is a CHO cell represented by O / pTS861-24-2C5, and (20) the cell is CHO / pTS861-1-2E6 or CHO / pTS.
The cell or cell membrane fraction thereof according to item (8), which is a CHO cell represented by 861-24-2C5.

【0012】(21)(i)第(1)項記載のヒト・ニ
ューロテンシンレセプター蛋白質もしくはその塩、また
は第(2)項記載の部分ペプチドもしくはその塩に、ニ
ューロテンシンを接触させた場合と(ii)第(1)項記
載のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質もしくは
その塩、または第(2)項記載の部分ペプチドもしくは
その塩に、ニューロテンシンおよび試験化合物を接触さ
せた場合との比較を行なうことを特徴とする第(9)項
記載のヒト・ニューロテンシンレセプターアゴニストま
たはアンタゴニストのスクリーニング方法、(22)
(i)標識したニューロテンシンを第(1)項記載のヒ
ト・ニューロテンシンレセプター蛋白質もしくはその
塩、または第(2)項記載の部分ペプチドもしくはその
塩に接触させた場合と、(ii)標識したニューロテンシ
ンおよび試験化合物を第(1)項記載のヒト・ニューロ
テンシンレセプター蛋白質もしくはその塩、または第
(2)項記載の部分ペプチドもしくはその塩に接触させ
た場合における、標識したニューロテンシンの該ヒト・
ニューロテンシンレセプター蛋白質、その部分ペプチド
またはそれらの塩に対する結合量を測定し、比較するこ
とを特徴とする第(9)項記載のヒト・ニューロテンシ
ンレセプターアゴニストまたはアンタゴニストのスクリ
ーニング方法、(23)(i)標識したニューロテンシ
ンを、第(8)項記載の細胞またはその細胞膜画分に接
触させた場合と、(ii)標識したニューロテンシンおよ
び試験化合物を第(8)項記載の細胞またはその細胞膜
画分に接触させた場合との比較を行なうことを特徴とす
る第(9)項記載のヒト・ニューロテンシンレセプター
アゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング方
法、
(21) (i) When human neurotensin receptor protein or the salt thereof described in (1) or the partial peptide or salt thereof described in (2) is contacted with neurotensin, ii) To compare with the case where the human neurotensin receptor protein or its salt described in (1) or the partial peptide or its salt described in (2) is contacted with neurotensin and a test compound. (22) A method for screening a human neurotensin receptor agonist or antagonist according to (9),
(I) labeled neurotensin is contacted with the human neurotensin receptor protein or salt thereof according to item (1), or the partial peptide or salt thereof according to item (2), and (ii) labeled Labeled neurotensin in the case where the neurotensin and the test compound are contacted with the human neurotensin receptor protein or its salt according to (1) or the partial peptide or its salt according to (2)・
(23) (i) A method for screening a human neurotensin receptor agonist or antagonist, which comprises measuring and comparing the amount of binding to a neurotensin receptor protein, a partial peptide thereof or a salt thereof. ) Contacting the labeled neurotensin with the cell or the cell membrane fraction thereof according to item (8), and (ii) labeling the neurotensin and the test compound with the cell or cell membrane fraction according to item (8) And a method for screening a human neurotensin receptor agonist or antagonist according to item (9), characterized in that it is compared with the case of contacting

【0013】(24)(i)標識したニューロテンシン
を、第(8)項記載の細胞またはその細胞膜画分に接触
させた場合と、(ii)標識したニューロテンシンおよび
試験化合物を第(8)項記載の細胞またはその細胞膜画
分に接触させた場合における、標識したニューロテンシ
ンの該細胞またはその細胞膜画分に対する結合量を測定
し、比較することを特徴とする第(9)項記載のヒト・
ニューロテンシンレセプターアゴニストまたはアンタゴ
ニストのスクリーニング方法、(25)(i)ニューロ
テンシンを、第(8)項記載の細胞またはその細胞膜画
分に接触させた場合と、(ii)ニューロテンシンおよび
試験化合物を第(8)項記載の細胞またはその細胞膜画
分に接触させた場合における、組換え型ヒト・ニューロ
テンシンレセプターを介した細胞刺激活性(例えば、ド
ーパミンの遊離、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊
離、細胞内Ca2+濃度の変動、細胞内cAMP生成、細
胞内cGMP生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電
位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、c−fosの活性
化、pHの低下、細胞遊走活性などを促進する活性また
は抑制する活性など)を測定し、比較することを特徴と
する第(9)項記載のヒト・ニューロテンシンレセプタ
ーアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング方
法、(26)第(3)項記載のDNAを含有することを
特徴とするニューロテンシンレセプター蛋白質欠損症の
予防・治療剤、および(27)ニューロテンシンレセプ
ター蛋白質欠損症がパーキンソン病である第(24)項
記載の予防・治療剤を提供する。
(24) (i) The labeled neurotensin is brought into contact with the cell or the cell membrane fraction thereof described in (8), and (ii) the labeled neurotensin and the test compound are added to the (8) Item 9. The human according to Item (9), wherein the amount of labeled neurotensin bound to the cell or the cell membrane fraction thereof when contacted with the cell or the cell membrane fraction thereof is measured and compared.・
A method for screening a neurotensin receptor agonist or antagonist, (25) (i) when the neurotensin is contacted with the cell or the cell membrane fraction thereof, and (ii) the neurotensin and the test compound are Recombinant human neurotensin receptor-mediated cell-stimulating activity (eg, dopamine release, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca) when contacted with the cell or the cell membrane fraction thereof described in (8). 2+ concentration fluctuation, intracellular cAMP generation, intracellular cGMP generation, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, c-fos activation, pH decrease, cell migration activity, etc. are promoted. (9) Item (9), characterized in that the activity or suppressing activity) is measured and compared. Method for screening human neurotensin receptor agonist or antagonist, (26) Prophylactic / therapeutic agent for neurotensin receptor protein deficiency comprising the DNA according to item (3), and (27) Neurotensin receptor The preventive / therapeutic agent according to item (24), wherein the protein deficiency is Parkinson's disease.

【0014】本発明のヒト・ニューロテンシンレセプタ
ー蛋白質としては、ヒトのあらゆる組織(例えば、胃、
下垂体、膵臓、脳(全脳、中脳黒質など)、腎臓、肝
臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋
肉、肺、消化管、血管、心臓など)または細胞などに由
来するヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質であっ
て、配列番号:1で表わされるアミノ酸配列と実質的に
同一のアミノ酸配列を含有するものであれば何なるもの
であってもよい。すなわち、本発明のヒト・ニューロテ
ンシンレセプター蛋白質としては、配列番号:1で表わ
されるアミノ酸配列を含有する蛋白質などの他に、配列
番号:1で表わされるアミノ酸配列と約90〜99.9
%の相同性を有するアミノ酸配列を含有し、配列番号:
1で表わされるアミノ酸配列を含有する蛋白質と実質的
に同質の活性を有する蛋白質などが挙げられる。実質的
に同質の活性としては、例えばリガンド結合活性、シグ
ナル情報伝達などが挙げられる。実質的に同質とは、リ
ガンド結合活性などが性質的に同質であることを示す。
したがって、リガンド結合活性の強さなどの強弱、レセ
プター蛋白質の分子量などの量的要素は異なっていても
よい。
The human neurotensin receptor protein of the present invention includes all human tissues (for example, stomach,
Derived from pituitary gland, pancreas, brain (whole brain, substantia nigra, etc.), kidney, liver, gonad, thyroid, gallbladder, bone marrow, adrenal gland, skin, muscle, lung, digestive tract, blood vessel, heart, etc.) or cells Any human neurotensin receptor protein may be used, so long as it contains an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. That is, as the human neurotensin receptor protein of the present invention, in addition to the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and the like, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and about 90 to 99.9 are contained.
Contains an amino acid sequence with% homology, SEQ ID NO:
Examples thereof include a protein having substantially the same activity as the protein containing the amino acid sequence represented by 1. Examples of substantially the same activity include ligand binding activity and signal transduction. "Substantially the same quality" means that the ligand binding activity and the like are qualitatively the same.
Therefore, strength and weakness such as strength of ligand binding activity and quantitative factors such as molecular weight of receptor protein may be different.

【0015】より具体的には、本発明のヒト・ニューロ
テンシンレセプター蛋白質としては、配列番号:1で表
わされるアミノ酸配列を含有することを特徴とするヒト
由来のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質などが
挙げられる。また、本発明のヒト・ニューロテンシンレ
セプター蛋白質としては、配列番号:1で表わされるア
ミノ酸配列中の1または2個以上のアミノ酸が欠失した
アミノ酸配列、配列番号:1で表わされるアミノ酸配列
に1または2個以上のアミノ酸が付加したアミノ酸配
列、配列番号:1で表わされるアミノ酸配列中の1また
は2個以上のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミ
ノ酸配列を含有する蛋白質なども挙げられる。さらに、
本発明のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質に
は、N末端のMetが保護基(例えば、ホルミル基、アセ
チル基などのC1-6アシル基など)で保護されているも
の、GluのN端側が生体内で切断され、該Gluがピ
ログルタミン化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖が適
当な保護基(例えば、ホルミル基、アセチル基などのC
1-6アシル基など)で保護されているもの、あるいは糖
鎖が結合したいわゆる糖蛋白質などの複合蛋白質なども
含まれる。
More specifically, examples of the human neurotensin receptor protein of the present invention include human-derived human neurotensin receptor protein characterized by containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. To be The human neurotensin receptor protein of the present invention has an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 in which one or more amino acids are deleted, or an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 Alternatively, an amino acid sequence in which two or more amino acids are added, a protein containing an amino acid sequence in which one or two or more amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 are replaced with other amino acids, and the like are also included. further,
In the human neurotensin receptor protein of the present invention, Met at the N-terminus is protected by a protecting group (for example, C 1-6 acyl group such as formyl group and acetyl group), and the N-terminal side of Glu is produced. Those which have been cleaved in the body and whose Glu has been converted to pyroglutamine, and the side chains of amino acids in the molecule have suitable protecting groups (for example, C such as formyl group and acetyl group).
1-6 acyl groups, etc.), or complex proteins such as so-called glycoproteins to which sugar chains are bound.

【0016】ただし、配列番号:1で表わされるアミノ
酸配列の第200番目のAlaがThrに置換されたア
ミノ酸配列を有するヒト・ニューロテンシンレセプター
蛋白質〔Vita, N. et al. フェブス・レター(FEBS Let
t.) 317, 139-142 (1993)〕は本発明のヒト・ニューロ
テンシンレセプター蛋白質の範囲から除かれる。本発明
のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質の塩として
は、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好まし
い。この様な塩としては、例えば無機酸(例えば、塩
酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸)との塩、あるいは有機
酸(例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マ
レイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚
酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン
酸)との塩などが用いられる。本発明のヒト・ニューロ
テンシンレセプター蛋白質またはその塩は、温血動物の
組織または細胞から自体公知の蛋白質の精製方法によっ
て製造することもできるし、後述するヒト・ニューロテ
ンシンレセプター蛋白質をコードするDNAを含有する
形質転換体を培養することによっても製造することがで
きる。また、後述のペプチド合成法に準じて製造するこ
ともできる。
However, a human neurotensin receptor protein [Vita, N. et al. Febs Letter (FEBS Let) having an amino acid sequence in which the 200th Ala of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is replaced with Thr.
t.) 317, 139-142 (1993)] is excluded from the scope of the human neurotensin receptor protein of the present invention. As the salt of the human neurotensin receptor protein of the present invention, a physiologically acceptable acid addition salt is particularly preferable. Examples of such salts include salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid), or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid). , Tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid) and the like. The human neurotensin receptor protein of the present invention or a salt thereof can be produced from a tissue or cell of a warm-blooded animal by a method of protein purification known per se, or a DNA encoding the human neurotensin receptor protein described below can be prepared. It can also be produced by culturing the transformant containing it. It can also be produced according to the peptide synthesis method described below.

【0017】本発明のヒト・ニューロテンシンレセプタ
ー蛋白質の部分ペプチドとしては、例えば、本発明のヒ
ト・ニューロテンシンレセプター蛋白質分子のうち、細
胞膜の外に露出している部位などが用いられる。具体的
には、本発明のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白
質の疎水性プロット解析において細胞外領域(親水性
(Hydrophilic)部位)であると分析された部分を含む
ペプチドである。また、疎水性(Hydrophobic)部位を
一部に含むペプチドも同様に用いることができる。個々
のドメインを個別に含むペプチドも用い得るが、複数の
ドメインを同時に含む部分のペプチドでも良い。本発明
のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質の部分ペプ
チドの塩としては、とりわけ生理学的に許容される酸付
加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば無機酸
(例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸)との塩、
あるいは有機酸(例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、
フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、
リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼ
ンスルホン酸)との塩などが用いられる。
As the partial peptide of the human neurotensin receptor protein of the present invention, for example, a portion of the human neurotensin receptor protein molecule of the present invention which is exposed outside the cell membrane is used. Specifically, it is a peptide containing a portion analyzed as an extracellular region (hydrophilic site) in the hydrophobicity plot analysis of the human neurotensin receptor protein of the present invention. Further, a peptide partially containing a hydrophobic (Hydrophobic) site can also be used. A peptide containing each domain individually may be used, but a peptide of a part containing a plurality of domains at the same time may be used. As the salt of the partial peptide of the human neurotensin receptor protein of the present invention, a physiologically acceptable acid addition salt is particularly preferable. Examples of such salts include salts with inorganic acids (for example, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid),
Alternatively, organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid,
Fumaric acid, maleic acid, succinic acid, tartaric acid, citric acid,
Malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid) and the like salts are used.

【0018】本発明のヒト・ニューロテンシンレセプタ
ー蛋白質の部分ペプチドまたはその塩は、自体公知のペ
プチドの合成法に従って、あるいは本発明のヒト・ニュ
ーロテンシンレセプター蛋白質を適当なペプチダーゼで
切断することによって製造することができる。ペプチド
の合成法としては、例えば固相合成法、液相合成法のい
ずれによっても良い。すなわち、本発明の蛋白質を構成
し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮
合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離す
ることにより目的のペプチドを製造することができる。
公知の縮合方法や保護基の脱離としてはたとえば、以下
の〜に記載された方法が挙げられる。 M. Bodanszky および M.A. Ondetti、ペプチド シン
セシス (Peptide Synthesis), Interscience Publisher
s, New York (1966年) SchroederおよびLuebke、ザ ペプチド(The Peptide),
Academic Press, New York (1965年) 泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、 丸善(株)
(1975年) 矢島治明 および榊原俊平、生化学実験講座 1、 タン
パク質の化学IV、 205、(1977年) 矢島治明監修、続医薬品の開発 第14巻 ペプチド合成
広川書店 また、反応後は通常の精製法、たとえば、溶媒抽出・蒸
留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィ
ー・再結晶などを組み合わせて本発明のタンパク質を精
製単離することができる。上記方法で得られる蛋白質が
遊離体である場合は、公知の方法によって適当な塩に変
換することができるし、逆に塩で得られた場合は、公知
の方法によって遊離体に変換することができる。
The partial peptide of the human neurotensin receptor protein of the present invention or a salt thereof is produced according to a method known per se for peptide synthesis, or by cleaving the human neurotensin receptor protein of the present invention with an appropriate peptidase. be able to. The peptide synthesis method may be either a solid phase synthesis method or a liquid phase synthesis method. That is, the target peptide can be produced by condensing a partial peptide or amino acid that can form the protein of the present invention with the remaining portion and removing the protecting group when the product has a protecting group.
Examples of known condensation methods and elimination of protective groups include the methods described in the following (1) to (3). M. Bodanszky and MA Ondetti, Peptide Synthesis, Interscience Publisher
s, New York (1966) Schroeder and Luebke, The Peptide,
Academic Press, New York (1965) Nobuo Izumiya et al., Fundamentals and experiments of peptide synthesis, Maruzen Co., Ltd.
(1975) Haruaki Yajima and Shunpei Sakakibara, Laboratory for Biochemistry 1, Protein Chemistry IV, 205, (1977) Supervised by Haruaki Yajima, Development of Pharmaceuticals Volume 14 Peptide Synthesis Hirokawa Shoten The protein of the present invention can be purified and isolated by a combination of purification methods such as solvent extraction, distillation, column chromatography, liquid chromatography, recrystallization and the like. When the protein obtained by the above method is a free form, it can be converted into an appropriate salt by a known method, and conversely, when it is obtained with a salt, it can be converted into a free form by a known method. it can.

【0019】本発明のヒト・ニューロテンシンレセプタ
ー蛋白質をコードするDNAとしては、本発明の配列番
号:1のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を
含有するヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質(た
だし、配列番号:1で表わされるアミノ酸配列の第20
0番目のAlaがThrに置換されたアミノ酸配列を有
するヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質〔Vita,
N. et al. フェブス・レター(FEBS Lett.) 317, 139-1
42 (1993)〕を除く)をコードする塩基配列を含有する
ものであればいかなるものであってもよい。また、ゲノ
ムDNA、組織・細胞由来のcDNA、合成DNAのい
ずれでもよい。ライブラリーに使用するベクターはバク
テリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミド
などいずれであってもよい。また、組織・細胞よりmR
NA画分を調製したものを用いて直接Reverse Transcri
ptase Polymerase Chain Reaction(以下、RT-PCR
法と略称する。)によって増幅することもできる。より
具体的には、配列番号:1のアミノ酸配列を含有するヒ
ト・ニューロテンシンレセプター蛋白質をコードするD
NAとしては、配列番号:2で表わされる塩基配列を有
するDNAなどが用いられる。クローン化されたヒト・
ニューロテンシンレセプター蛋白質をコードするDNA
は目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消
化したり、リンカーを付加したりして使用することがで
きる。該DNAはその5’末端側に翻訳開始コドンとし
てのATGを有し、また3’末端側には翻訳終止コドン
としてのTAA、TGAまたはTAGを有していてもよ
い。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当
な合成DNAアダプターを用いて付加することもでき
る。
As the DNA encoding the human neurotensin receptor protein of the present invention, a human neurotensin receptor protein containing an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 of the present invention (provided that the sequence is No. 20 of the amino acid sequence represented by 1
Human neurotensin receptor protein having an amino acid sequence in which 0th Ala is replaced by Thr [Vita,
N. et al. FEBS Lett. 317, 139-1
42 (1993)]). Further, it may be any of genomic DNA, tissue / cell-derived cDNA, and synthetic DNA. The vector used for the library may be any of bacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like. In addition, from tissue / cell, mR
Direct reverse transcribing using prepared NA fraction
ptase Polymerase Chain Reaction (hereinafter RT-PCR
Abbreviated as law. ). More specifically, D encoding a human neurotensin receptor protein containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1
As NA, DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 or the like is used. Cloned human
DNA encoding neurotensin receptor protein
Can be used as it is, or if desired, after digestion with a restriction enzyme or addition of a linker. The DNA may have ATG as a translation initiation codon at the 5′-terminal side and TAA, TGA or TAG as a translation termination codon at the 3′-terminal side. These translation initiation codon and translation termination codon can be added using an appropriate synthetic DNA adaptor.

【0020】本発明のヒト・ニューロテンシンレセプタ
ー蛋白質DNAを含有するベクター(特に、発現プラス
ミド)は、例えば、(イ)本発明のヒト・ニューロテン
シンレセプター蛋白質をコードするDNAから目的とす
るDNA断片を切り出し、(ロ)該DNA断片を適当な
発現プラスミド中のプロモーターの下流に連結すること
により製造することができる。ベクターとしては、大腸
菌由来のプラスミド(例、pBR322,pBR32
5,pUC12,pUC13)、枯草菌由来のプラスミ
ド(例、pUB110,pTP5,pC194)、酵母
由来プラスミド(例、pSH19,pSH15)、λフ
ァージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス,ワ
クシニアウイルス,バキュロウイルスなどの動物ウイル
スなどが用いられる。本発明で用いられるプロモーター
としては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切な
プロモーターであればいかなるものでもよい。形質転換
する際の宿主がエシェリヒア属菌である場合は、trp プ
ロモーター、lac プロモーター、recAプロモーター、
λPLプロモーター、lpp プロモーターなどが、宿主が
バチルス属菌である場合は、SPO1プロモーター、S
PO2プロモーター、penPプロモーターなど、宿主が
酵母である場合は、PHO5プロモーター、PGKプロ
モーター、GAPプロモーター、ADHプロモーターな
どが好ましい。
The vector (particularly an expression plasmid) containing the human neurotensin receptor protein DNA of the present invention includes, for example, (a) a DNA fragment of interest from the DNA encoding the human neurotensin receptor protein of the present invention. It can be produced by cutting out and (b) ligating the DNA fragment downstream of the promoter in an appropriate expression plasmid. As the vector, a plasmid derived from Escherichia coli (eg, pBR322, pBR32
5, pUC12, pUC13), a plasmid derived from Bacillus subtilis (eg, pUB110, pTP5, pC194), a plasmid derived from yeast (eg, pSH19, pSH15), bacteriophage such as λ phage, retrovirus, vaccinia virus, baculovirus, etc. Animal viruses are used. The promoter used in the present invention may be any promoter as long as it is appropriate for the host used for gene expression. When the host for transformation is Escherichia, the trp promoter, lac promoter, recA promoter,
λP L promoter, lpp promoter, etc., when the host is a Bacillus genus, SPO1 promoter, S
When the host is yeast such as PO2 promoter and penP promoter, PHO5 promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH promoter and the like are preferable.

【0021】宿主が動物細胞である場合には、SV40
由来のプロモーター、レトロウイルスのプロモーター、
メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモ
ーター、サイトメガロウイルス(CMV)プロモータ
ー、SRαプロモーターなどがそれぞれ利用できる。な
お、発現にエンハンサーの利用も効果的である。また、
必要に応じて、宿主に合ったシグナル配列を、ヒト・ニ
ューロテンシンレセプター蛋白質のN端末側に付加す
る。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、アルカリフ
ォスファターゼ・シグナル配列、OmpA・シグナル配列
などが、宿主がバチルス属菌である場合は、α−アミラ
ーゼ・シグナル配列、サブチリシン・シグナル配列など
が、宿主が酵母である場合は、メイテイングファクター
α・シグナル配列、インベルターゼ・シグナル配列な
ど、宿主が動物細胞である場合には、例えばインシュリ
ン・シグナル配列、α−インターフェロン・シグナル配
列、抗体分子・シグナル配列などがそれぞれ利用でき
る。
When the host is an animal cell, SV40
Origin promoter, retrovirus promoter,
Metallothionein promoter, heat shock promoter, cytomegalovirus (CMV) promoter, SRα promoter, etc. can be used respectively. The use of enhancers for expression is also effective. Also,
If necessary, a signal sequence suitable for the host is added to the N-terminal side of human neurotensin receptor protein. When the host is a bacterium of the genus Escherichia, alkaline phosphatase signal sequence, OmpA signal sequence, etc., when the host is a bacterium of the genus Bacillus, α-amylase signal sequence, subtilisin signal sequence, etc., the host is yeast When the host is an animal cell, for example, an insulin signal sequence, an α-interferon signal sequence, an antibody molecule / signal sequence, etc., respectively. Available.

【0022】さらに、本発明のヒト・ニューロテンシン
レセプター蛋白質DNAを含有するベクターのうち、発
現プラスミドの好ましい構築方法を以下に示す。プラス
ミドとしては、pAKKO 1.11(pA1-11と表
記する場合もある)、pRc/CMV、pRc/RSV
などが用いられ、なかでもpAKKO1.11(pA1-
11)などが好ましい。プロモーターとしては、宿主と
なる細胞で効率よく機能するものであれば何でもよく、
SV40初期プロモーター、CMVプロモーター、HS
V-TKプロモーター、SRαプロモーター、RSVプ
ロモーターなどが挙げられ、なかでもCMVプロモータ
ー、SRαプロモーターなどが好ましく、特にSRαプ
ロモーターが好ましい。発現プラスミドには、以上の他
にエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリA付加
シグナル、選択マーカー等を含有しているものを用いる
のが好ましい。選択マーカーとしては、ジヒドロ葉酸還
元酵素(以下、dhfrと略称する場合がある)遺伝
子、ネオマイシンリン酸転移酵素(以下、neo遺伝子
と略称する場合がある)などが挙げらる。dhfr遺伝
子はメソトレキセート(MTX)耐性を与え、neo遺
伝子はG−418耐性を与える。特に、dhfr遺伝子
が欠損しているCHO細胞を用いて、dhfr遺伝子を
選択マーカーとして使用する場合、チミジンを含まない
培地によっても選択できる。
Further, among the vectors containing the human neurotensin receptor protein DNA of the present invention, a preferred method for constructing an expression plasmid will be shown below. As plasmids, pAKKO 1.11 (sometimes referred to as pA1-11), pRc / CMV, pRc / RSV
Etc. are used, among which pAKKO1.11 (pA1-
11) and the like are preferable. As the promoter, any promoter can be used so long as it functions efficiently in the host cell,
SV40 early promoter, CMV promoter, HS
Examples thereof include V-TK promoter, SRα promoter, RSV promoter, etc. Among them, CMV promoter, SRα promoter and the like are preferable, and SRα promoter is particularly preferable. It is preferable to use an expression plasmid containing an enhancer, a splicing signal, a poly A addition signal, a selection marker and the like in addition to the above. Examples of the selectable marker include dihydrofolate reductase (hereinafter sometimes abbreviated as dhfr) gene, neomycin phosphotransferase (hereinafter sometimes referred to as neo gene), and the like. The dhfr gene confers methotrexate (MTX) resistance and the neo gene confers G-418 resistance. In particular, when the dhfr gene is used as a selection marker using CHO cells deficient in the dhfr gene, selection can be performed using a thymidine-free medium.

【0023】本発明のヒト・ニューロテンシンレセプタ
ー蛋白質をコードするDNAを保持する好ましい発現プ
ラスミドとしては、具体的には、ヒト・ニューロテンシ
ンレセプター蛋白質をコードするDNAの上流に前記の
プロモーター(特に、SRαプロモーターなど)を挿入
し、好ましくはヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白
質をコードするDNAの下流にSV初期遺伝子ポリA付
加シグナルを挿入し、さらにそのポリA付加シグナルの
下流にdhfr遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子などを
挿入したものなどが好ましい。より具体的には、例えば
ヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質DNAの上流
にSRαプロモーターを挿入し、ヒト・ニューロテンシ
ンレセプター蛋白質をコードするDNAの下流にSV初
期遺伝子ポリA付加シグナルを挿入し、その下流にdh
fr遺伝子を挿入し、さらにその下流にアンピシリン耐
性遺伝子を挿入したpTS861で標示される発現プラ
スミド〔図4〕などが好適である。このようにして作製
したヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質DNAを
含有する発現プラスミドを宿主細胞に導入することによ
って、ヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質をコー
ドするDNAを高発現できる細胞を作製することができ
る。
As a preferred expression plasmid carrying the DNA encoding the human neurotensin receptor protein of the present invention, specifically, the above promoter (particularly SRα) is provided upstream of the DNA encoding the human neurotensin receptor protein. Promoter), preferably the SV early gene poly A addition signal is inserted downstream of the DNA encoding the human neurotensin receptor protein, and the dhfr gene, ampicillin resistance gene, etc. are inserted downstream of the poly A addition signal. Those inserted are preferable. More specifically, for example, the SRα promoter is inserted upstream of the human neurotensin receptor protein DNA, the SV early gene poly A addition signal is inserted downstream of the DNA encoding the human neurotensin receptor protein, and the downstream thereof is inserted. dh
An expression plasmid designated by pTS861 in which the fr gene has been inserted, and an ampicillin resistance gene has been inserted further downstream thereof (FIG. 4) and the like are preferable. By introducing the expression plasmid containing the thus-produced human neurotensin receptor protein DNA into a host cell, a cell capable of highly expressing the DNA encoding the human neurotensin receptor protein can be produced.

【0024】本発明のヒト・ニューロテンシンレセプタ
ー蛋白質DNAを含有するベクターを導入する宿主細胞
としては、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、
酵母、昆虫、動物細胞などが用いられる。エシェリヒア
属菌、バチルス属菌の具体例としては、エシェリヒア・
コリ(Escherichia coli)K12・DH1〔プロシージ
ングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サ
イエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー(Proc. Natl.
Acad. Sci. USA),60巻,160(1968)〕,
JM103〔ヌクイレック・アシッズ・リサーチ,(Nu
cleic Acids Research),9巻,309(1981)〕,
JA221〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオ
ロジー(Journal ofMolecular Biology)〕,120
巻,517(1978)〕,HB101〔ジャーナル・オ
ブ・モレキュラー・バイオロジー,41巻,459(1
969)〕,C600〔ジェネティックス(Genetic
s),39巻,440(1954)〕などが用いられる。
バチルス属菌としては、たとえばバチルス・サチルス
(Bacillus subtilis)MI114〔ジーン,24巻,
255(1983)〕,207−21〔ジャーナル・オブ
・バイオケミストリー(Journal of Biochemistry),
95巻,87(1984)〕などが用いられる。酵母とし
ては、たとえばサッカロマイセス セレビシエ(Saccar
omyces cerevisiae)AH22,AH22R-,NA87
−11A,DKD−5D,20B−12などが用いられ
る。
The host cells into which the vector containing the human neurotensin receptor protein DNA of the present invention is introduced are, for example, Escherichia spp, Bacillus spp,
Yeast, insects, animal cells, etc. are used. Specific examples of Escherichia and Bacillus include Escherichia
Escherichia coli K12 DH1 [Proc. Natl. Proc. Of the National Academy of Sciences of the USA]
Acad. Sci. USA), 60, 160 (1968)],
JM103 [Nukuirek Acids Research, (Nu
cleic Acids Research), Volume 9, 309 (1981)],
JA221 [Journal of Molecular Biology], 120
Vol. 517 (1978)], HB101 [Journal of Molecular Biology, Vol. 41, 459 (1)
969]], C600 [Genetic (Genetic
s), 39 volumes, 440 (1954)] and the like.
Examples of the bacterium of the genus Bacillus include Bacillus subtilis MI114 [Gene, 24,
255 (1983)], 207-21 [Journal of Biochemistry],
95, 87 (1984)] and the like. Examples of yeast include Saccharomyces cerevisiae (Saccar
omyces cerevisiae) AH22, AH22R -, NA87
-11A, DKD-5D, 20B-12, etc. are used.

【0025】昆虫としては、例えばカイコの幼虫などが
用いられる〔前田ら、ネイチャー(Nature),315
巻,592(1985)〕。動物細胞としては、たとえば
サル細胞COS−7,Vero細胞,チャイニーズハム
スター細胞CHO,dhfr遺伝子欠損チャイニーズハ
ムスター細胞CHO(dhfr-CHO細胞),ヒトF
L細胞,293細胞,L細胞,ミエローマ細胞,C12
7細胞,Balb/c3T3細胞,Sp−2/O細胞な
どが用いられる。エシェリヒア属菌を形質転換するに
は、たとえばプロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル
・アカデミー・オブ・サイエンジイズ・オブ・ザ・ユー
エスエー(Proc. Natl. Acad. Sci. USA),69
巻,2110(1972)やジーン(Gene),17巻,1
07(1982)などに記載の方法に従って行なわれる。
バチルス属菌を形質転換するには、たとえばモレキュラ
ー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス(Molecula
r & General Genetics),168巻,111(197
9)などに記載の方法に従って行われる。酵母を形質転
換するには、たとえばプロシージングズ・オブ・ザ・ナ
ショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・
ザ・ユーエスエー(Proc. Natl.Acad. Sci. USA),
75巻,1929(1978)に記載の方法に従って行な
われる。昆虫細胞を形質転換するには、たとえばバイオ
/テクノロジー(Bio/Technology),6, 47-55(1988))
などに記載の方法に従って行なわれる。動物細胞を形質
転換するには、たとえばヴィロロジー(Virology),5
2巻,456(1973)に記載の方法に従って行なわれ
る。
As the insects, for example, silkworm larvae are used [Maeda et al., Nature, 315].
Vol., 592 (1985)]. Examples of animal cells include monkey cells COS-7, Vero cells, Chinese hamster cells CHO, dhfr gene-deficient Chinese hamster cells CHO (dhfr - CHO cells), human F
L cell, 293 cell, L cell, myeloma cell, C12
7 cells, Balb / c3T3 cells, Sp-2 / O cells and the like are used. For transformation of Escherichia, for example, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69.
Volume, 2110 (1972) and Gene, Volume 17, 1
07 (1982) and the like.
Transformations of Bacillus include, for example, Molecular and General Genetics (Molecula).
r & General Genetics), 168, 111 (197)
It is performed according to the method described in 9) or the like. To transform yeast, for example, the Procedures of the National Academy of Sciences of
The USA (Proc. Natl. Acad. Sci. USA),
Vol. 75, 1929 (1978). For transforming insect cells, for example, Bio / Technology, 6, 47-55 (1988))
And the like. For transforming animal cells, for example, Virology, 5
Volume 2, 456 (1973).

【0026】以上の宿主細胞の中でも、本発明のヒト・
ニューロテンシンレセプター蛋白質DNAを含有する発
現プラスミドの宿主細胞としては、特に、動物細胞など
が好ましく、例えば293細胞、CHO細胞、L細胞、
ミエローマ細胞、C127細胞、Balb/c3T3細
胞、Sp-2/O細胞などが挙げられ、なかでもCHO
細胞またはSp-2/O細胞などが好ましく、特にCH
O細胞などが好適である。さらに、CHO細胞のなかで
も、dhfr遺伝子が欠損しているCHO細胞(以下、
CHO(dhfr-)細胞と略称する場合がある)、C
HO K−1細胞などが好ましい。発現プラスミド中に
選択マーカーとしてdhfr遺伝子が挿入されている場
合は、CHO(dhfr-)細胞などが好適である。発
現プラスミドと宿主細胞の組み合わせとしては、適宜好
ましい組み合わせを選択することができるが、例えば、
pTS861で標示される発現プラスミド〔図4〕の宿
主細胞としては、例えばCHO(dhfr-)細胞など
が好適である。この発現プラスミドの動物細胞への導入
方法としては、公知の方法、例えばリン酸カルシウム法
〔Graham, F. L. and van der Eb, A. J. ヴィロロジー
(Virology) 52, 456-467 (1973)〕、電気穿孔法〔Neuma
nn, E. et al. エンボ・ジャーナル(EMBO J.) 1, 841-8
45 (1982)〕等が用いられる。以上のようにして、ヒト
・ニューロテンシンレセプター蛋白質DNAを含有する
ベクターで形質転換された形質転換体が得られる。ま
た、ヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質DNAを
含有する発現プラスミドで形質転換された形質転換体
は、ヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質を製造す
ることができる。
Among the above host cells, the human
As the host cell of the expression plasmid containing the neurotensin receptor protein DNA, animal cells and the like are particularly preferable, and examples thereof include 293 cells, CHO cells, L cells,
Examples include myeloma cells, C127 cells, Balb / c3T3 cells, Sp-2 / O cells, among which CHO
Cells or Sp-2 / O cells are preferred, and especially CH
O cells and the like are preferable. Furthermore, among CHO cells, CHO cells lacking the dhfr gene (hereinafter,
CHO (dhfr ) cell), C
HOK-1 cells and the like are preferred. When the dhfr gene is inserted as a selection marker in the expression plasmid, CHO (dhfr ) cells and the like are suitable. As the combination of the expression plasmid and the host cell, a preferable combination can be appropriately selected, for example,
Suitable host cells for the expression plasmid [FIG. 4] designated by pTS861 are, for example, CHO (dhfr ) cells. As a method for introducing this expression plasmid into animal cells, known methods such as calcium phosphate method [Graham, FL and van der Eb, AJ Virology
(Virology) 52, 456-467 (1973)], electroporation (Neuma
nn, E. et al. EMBO J., 1, 841-8
45 (1982)] and the like are used. As described above, a transformant transformed with the vector containing the human neurotensin receptor protein DNA is obtained. In addition, a transformant transformed with an expression plasmid containing human neurotensin receptor protein DNA can produce human neurotensin receptor protein.

【0027】ヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質
を高発現できる細胞は、前述の発現プラスミドが染色体
に組込まれた細胞をクローン選択によって選択すること
によって得ることができる。具体的には、まず、上記の
選択マーカーを指標として形質転換体を選択する。さら
に、このようにして選択マーカーを用いて得られた形質
転換体に対して、繰り返しクローン選択を行うことによ
り、ヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質の高発現
能を安定に有する細胞株を得ることができる。また、d
hfr遺伝子を選択マーカーとして用いた場合、メソト
レキセート(MTX)の濃度を漸次上げて培養して耐性
細胞を選択することにより、導入遺伝子を細胞内で増幅
することにより、さらに高発現の細胞株を得ることもで
きる。なお、宿主としてCHO(dhfr-)細胞を用
いた場合であっても、例えばpTS861で標示される
発現プラスミドにはdhfr遺伝子が導入されているの
で〔図4〕、pTS861で標示される発現プラスミド
を含有するCHO(dhfr-)細胞は、結果として、
dhfr遺伝子を有していることになる。本願明細書に
おいては、dhfr遺伝子を含有する発現プラスミド
(例えば、pTS861など)をCHO(dhfr-
細胞に含有せしめて得られるCHO細胞を「CHO(d
hfr+)細胞」と表記する場合がある。
The cells capable of highly expressing the human neurotensin receptor protein can be obtained by clonally selecting the cells in which the above-mentioned expression plasmid has been integrated into the chromosome. Specifically, first, a transformant is selected using the above selection marker as an index. Furthermore, by repeatedly carrying out clone selection on the transformant obtained using the selectable marker in this manner, a cell line stably having a high expression level of human neurotensin receptor protein can be obtained. . Also, d
When the hfr gene is used as a selection marker, by gradually increasing the concentration of methotrexate (MTX) and culturing to select resistant cells, the transgene is amplified in the cells to obtain a cell line with higher expression. You can also Even when CHO (dhfr ) cells are used as the host, for example, since the dhfr gene has been introduced into the expression plasmid designated by pTS861 [FIG. 4], the expression plasmid designated by pTS861 should be used. The CHO (dhfr ) cells containing, as a result,
It has a dhfr gene. In the present specification, an expression plasmid containing the dhfr gene (eg, pTS861) is CHO (dhfr )
The CHO cells obtained by including them in the cells are referred to as "CHO (d
hfr + ) cells ".

【0028】本発明において、ヒト・ニューロテンシン
レセプター蛋白質DNAを高発現できる形質転換体とし
ては、例えば、後述する実施例2で得られるpTS86
1で標示される発現プラスミドをCHO(dhfr-
細胞に含有せしめて得られるCHO(dhfr+)細胞
などが挙げられる。具体的には、CHO/pTS861
-1-2E6で標示されるCHO(dhfr+)細胞、C
HO/pTS861-24-2C5で標示されるCHO
(dhfr+)細胞などが挙げられる。これらのCHO
(dhfr+)細胞は、公知のヒト・ニューロテンシン
レセプター蛋白質を発現するCOS-7細胞〔Vita, N.
et al. フェブス・レター(FEBS Lett.) 317, 139-142
(1993)〕に比べて、大量のヒト・ニューロテンシンレセ
プター蛋白質を発現することができ、さらには、天然の
ヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質を含有する組
織(例えば、ヒトadenocarcinomaHT−29細胞など)
に比べて、約10〜100倍、好ましくは約100倍の
レセプター活性(例えば、リガンド結合活性など)を有
するものである。したがって、これらのCHO(dhf
+)細胞は、後述するヒト・ニューロテンシンレセプ
ターアゴニスト/アンタゴニストのスクリーニング方法
に有効なものである。
In the present invention, the transformant capable of highly expressing human neurotensin receptor protein DNA is, for example, pTS86 obtained in Example 2 described later.
The expression plasmid indicated by 1 was CHO (dhfr )
Examples thereof include CHO (dhfr + ) cells obtained by containing them in cells. Specifically, CHO / pTS861
-1-2E6 labeled CHO (dhfr + ) cells, C
CHO indicated by HO / pTS861-24-2C5
(Dhfr + ) cells and the like. These CHO
(Dhfr + ) cells are COS-7 cells expressing a known human neurotensin receptor protein [Vita, N.
et al. FEBS Lett. 317, 139-142
(1993)], a tissue capable of expressing a large amount of human neurotensin receptor protein and further containing a natural human neurotensin receptor protein (eg, human adenocarcinoma HT-29 cells)
It has a receptor activity (for example, ligand binding activity) about 10 to 100 times, preferably about 100 times that of the above. Therefore, these CHO (dhf
r + ) cells are effective for the screening method for human neurotensin receptor agonist / antagonist described later.

【0029】本発明のヒト・ニューロテンシンレセプタ
ー蛋白質および本発明のヒト・ニューロテンシンレセプ
ター蛋白質を含有する細胞は、本発明のヒト・ニューロ
テンシンレセプター蛋白質DNAを含有するベクター
(特に、発現プラスミド)を含有する形質転換体を、ヒ
ト・ニューロテンシンレセプター蛋白質をコードするD
NAの発現が可能な条件下で培養することによっても製
造することができる。宿主細胞がエシェリヒア属菌、バ
チルス属菌である形質転換体を培養する際、培養に使用
される培地としては液体培地が適当であり、その中には
該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物そ
の他が含有せしめられる。炭素源としては、たとえばグ
ルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒
素源としては、たとえばアンモニウム塩類、硝酸塩類、
コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキ
ス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物
質、無機物としてはたとえば塩化カルシウム、リン酸二
水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどが挙げられる。
また、酵母、ビタミン類、生長促進因子などを添加して
もよい。培地のpHは約5〜8が望ましい。エシェリヒ
ア属菌を培養する際の培地としては、例えばグルコー
ス、カザミノ酸を含むM9培地〔ミラー(Miller),ジ
ャーナル・オブ・エクスペリメンツ・イン・モレキュラ
ー・ジェネティックス(Journal of Experiments in Mo
lecular Genetics),431−433,Cold Spring Ha
rbor Laboratory, New York 1972〕が好ましい。こ
こに必要によりプロモーターを効率よく働かせるため
に、たとえば3β−インドリル アクリル酸のような薬
剤を加えることができる。
The human neurotensin receptor protein of the present invention and cells containing the human neurotensin receptor protein of the present invention contain a vector (particularly, an expression plasmid) containing the human neurotensin receptor protein DNA of the present invention. To a human neurotensin receptor protein encoding D
It can also be produced by culturing under conditions in which NA can be expressed. When culturing a transformant whose host cell is a bacterium of the genus Escherichia or Bacillus, a liquid medium is suitable as a medium used for the culture, and among them, a carbon source necessary for the growth of the transformant. , Nitrogen sources, inorganic substances, etc. are included. Examples of the carbon source include glucose, dextrin, soluble starch and sucrose, and examples of the nitrogen source include ammonium salts, nitrates,
Inorganic or organic substances such as corn steep liquor, peptone, casein, meat extract, soybean meal, and potato extract, examples of the inorganic substance include calcium chloride, sodium dihydrogen phosphate, magnesium chloride and the like.
In addition, yeast, vitamins, growth promoting factors and the like may be added. The pH of the medium is preferably about 5-8. As a medium for culturing Escherichia, for example, M9 medium containing glucose and casamino acid [Miller, Journal of Experiments in Molar Genetics (Journal of Experiments in Mo
lecular Genetics), 431-433, Cold Spring Ha
rbor Laboratory, New York 1972] is preferred. If necessary, a drug such as 3β-indolylacrylic acid can be added to the promoter so as to work efficiently.

【0030】宿主細胞がエシェリヒア属菌の場合、培養
は通常約15〜43℃で約3〜24時間行い、必要によ
り、通気や撹拌を加えることもできる。宿主細胞がバチ
ルス属菌の場合、培養は通常約30〜40℃で約6〜2
4時間行ない、必要により通気や撹拌を加えることもで
きる。宿主細胞が酵母である形質転換体を培養する際、
培地としては、たとえばバークホールダー(Burkholde
r)最小培地〔Bostian, K. L. ら、「プロシージングズ
・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエン
シイズ・オブ・ザ・ユーエスエー(Proc. Natl. Acad.
Sci. USA),77巻,4505(1980)〕や0.5
%カザミノ酸を含有するSD培地〔Bitter, G. A. ら、
「プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ
ー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー
(Proc. Natl. Acad. Sci. USA),81巻,533
0(1984)〕が挙げられる。培地のpHは約5〜8
に調整するのが好ましい。培養は通常約20℃〜35℃
で約24〜72時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加
える。宿主細胞が昆虫である形質転換体を培養する際、
培地としては、Grace's Insect Medium(Grace, T.C.
C.,ネイチャー(Nature),195,788(1962))に非働化し
た10%ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用
いられる。培地のpHは約6.2〜6.4に調整するの
が好ましい。培養は通常約27℃で約3〜5日間行い、
必要に応じて通気や撹拌を加える。
When the host cell is a bacterium of the genus Escherichia, the culture is usually carried out at about 15 to 43 ° C. for about 3 to 24 hours, and if necessary, aeration and stirring can be added. When the host cell is a bacterium of the genus Bacillus, the culture is usually performed at about 30 to 40 ° C for about 6 to 2
It is performed for 4 hours, and aeration and stirring can be added if necessary. When culturing a transformant whose host cell is yeast,
Examples of the medium include Burkholder.
r) Minimal medium [Bostian, KL, et al., "Proc. Natl. Acad., Proc. of the National Academy of Sciences of the USA.
Sci. USA), 77, 4505 (1980)] and 0.5.
SD medium containing% casamino acid [Bitter, GA et al.
"Proc. Natl. Acad. Sci. USA", Vol. 81, 533. "Procedures of the National Academy of Sciences of the USA".
0 (1984)]. The pH of the medium is about 5-8
It is preferable to adjust Cultivation is usually about 20 ° C to 35 ° C
For about 24 to 72 hours, and aeration and stirring are added if necessary. When culturing a transformant whose host cell is an insect,
Grace's Insect Medium (Grace, TC
C., Nature, 195, 788 (1962)) to which appropriate additives such as inactivated 10% bovine serum are added. The pH of the medium is preferably adjusted to about 6.2 to 6.4. Culturing is usually performed at about 27 ° C for about 3 to 5 days,
Add aeration and agitation as needed.

【0031】宿主細胞が動物細胞である形質転換体を培
養する際、培地としては、たとえば約0.5〜20%の
胎児牛血清を含むMEM培地〔サイエンス(Seienc
e),122巻,501(1952)〕,DMEM培地
〔ヴィロロジー(Virology),8巻,396(195
9)〕,RPMI 1640培地〔ジャーナル・オブ・ザ
・アメリカン・メディカル・アソシエーション(The Jo
unal of the American MedicalAssociation)199
巻,519(1967)〕,199培地〔プロシージング
・オブ・ザ・ソサイエティ・フォー・ザ・バイオロジカ
ル・メディスン(Proceeding of the Society for the
Biological Medicine),73巻,1(1950)〕,α-
MEM培地などが用いられる。特に、CHO(dhfr
-)細胞およびdhfr選択マーカー遺伝子を用いる場
合、チミジンをほとんど含まない透析ウシ胎児血清を含
むDMEM培地あるいはα-MEM培地を用いるのが好
ましい。pHは約6〜8であるのが好ましい。培養は通
常約30℃〜40℃で約15〜200時間行い、必要に
応じて培地の交換、通気、撹拌などを加える。このよう
にして、ヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質をコ
ードするDNAを含有するベクター(特に、発現プラス
ミド)を保持する形質転換体からヒト・ニューロテンシ
ンレセプター蛋白質を含有する細胞を製造することがで
きる。上記した本発明のヒト・ニューロテンシンレセプ
ター蛋白質を含有する細胞の培養物からヒト・ニューロ
テンシンレセプター蛋白質またはその部分ペプチドを分
離精製するには、例えば下記の方法により行なうことが
できる。
When culturing a transformant in which the host cell is an animal cell, the medium is, for example, MEM medium containing about 0.5 to 20% fetal bovine serum [Science (Seienc
e), 122, 501 (1952)], DMEM medium [Virology, 8, 396 (195).
9)], RPMI 1640 medium [The Journal of the American Medical Association (The Jo
unal of the American Medical Association) 199
Vol. 5, 519 (1967)], 199 medium [Proceeding of the Society for the Society for the Society for the Society for the
Biological Medicine), 73, 1 (1950)], α-
A MEM medium or the like is used. In particular, CHO (dhfr
- ) When cells and dhfr selectable marker gene are used, it is preferable to use DMEM medium or α-MEM medium containing dialyzed fetal bovine serum containing almost no thymidine. The pH is preferably about 6-8. Culturing is usually carried out at about 30 to 40 ° C. for about 15 to 200 hours, and if necessary, medium exchange, aeration, stirring, etc. are added. In this manner, cells containing the human neurotensin receptor protein can be produced from the transformants carrying the vector (particularly, the expression plasmid) containing the DNA encoding the human neurotensin receptor protein. The human neurotensin receptor protein or its partial peptide can be separated and purified from the culture of cells containing the human neurotensin receptor protein of the present invention described above, for example, by the following method.

【0031】まず、ヒト・ニューロテンシンレセプター
蛋白質を培養菌体あるいは細胞から抽出するに際して
は、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、こ
れを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび
/または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊
したのち、遠心分離やろ過によりヒト・ニューロテンシ
ンレセプター蛋白質の粗抽出液を得る方法などが適宜用
い得る。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジンなどのたん
ぱく変性剤や、トリトンX−100(登録商標。以下、
TMと省略することがある。)などの界面活性剤が含ま
れていてもよい。これらの公知の分離、精製法として
は、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透
析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびSDS−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差
を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの
荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラ
フィーなどの特異的新和性を利用する方法、逆相高速液
体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方
法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法
などが用いられる。かくして得られるヒト・ニューロテ
ンシンレセプター蛋白質が遊離体で得られた場合には、
自体公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に
変換することができ、逆に塩で得られた場合には自体公
知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊離体また
は他の塩に変換することができる。
First, when the human neurotensin receptor protein is extracted from the cultured bacterial cells or cells, after the culture, the bacterial cells or cells are collected by a known method, suspended in a suitable buffer solution, ultrasonicated, After disrupting the cells or cells by lysozyme and / or freeze-thawing, a method of obtaining a crude extract of human neurotensin receptor protein by centrifugation or filtration can be appropriately used. A protein denaturing agent such as urea or guanidine hydrochloride or Triton X-100 (registered trademark.
Sometimes abbreviated as TM. ) Or the like may be included. These known separation and purification methods include methods utilizing solubility such as salting out and solvent precipitation, dialysis, ultrafiltration, gel filtration, and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, and the like. Method using difference in charge, method using charge difference such as ion exchange chromatography, method using specific novelty such as affinity chromatography, use of difference in hydrophobicity such as reversed-phase high-performance liquid chromatography And a method utilizing the difference in isoelectric points such as isoelectric focusing. When the human neurotensin receptor protein thus obtained is obtained in a free form,
The salt can be converted into a salt by a method known per se or a method analogous thereto, and conversely, when a salt is obtained, it can be converted into a free form or another salt by a method known per se or a method analogous thereto.

【0032】なお、組換え体が産生するヒト・ニューロ
テンシンレセプター蛋白質を、精製前または精製後に適
当な蛋白修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾
を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去することもで
きる。蛋白修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キ
モトリプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ、プロテ
インキナーゼ、グリコシダーゼなどが用いられる。かく
して生成するヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質
の活性は標識したニューロテンシンなどとの結合実験お
よび特異抗体を用いたエンザイムイムノアッセイなどに
より測定することができる。なお、上記の手法におい
て、本発明のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質
をコードするDNAに代えて、公知のヒト・ニューロテ
ンシンレセプター蛋白質をコードするDNA〔Vita, N.
et al. フェブス・レター(FEBS Lett.) 317,139-142
(1993)〕を用いることによって、組換え型ヒト・ニュー
ロテンシンレセプター蛋白質を高発現する細胞や組換え
型ヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質を単離する
ことができる。公知のヒト・ニューロテンシンレセプタ
ー蛋白質はCOS-7で発現されているが〔Vita, N. et
al. フェブス・レター(FEBS Lett.) 317, 139-142 (1
993)〕、一般にCOS-7での発現量は少ない。しか
し、本発明の発現プラスミドの構築方法に従えば、本発
明のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質を高発現
する細胞(特に、CHO細胞)だけでなく、公知のヒト
・ニューロテンシンレセプター蛋白質を高発現する細胞
(特に、CHO細胞)を製造することができる。
Incidentally, the human neurotensin receptor protein produced by the recombinant is treated with an appropriate protein-modifying enzyme before or after purification to arbitrarily modify or partially remove the polypeptide. You can also Examples of the protein-modifying enzyme include trypsin, chymotrypsin, arginyl endopeptidase, protein kinase, glycosidase and the like. The activity of the human neurotensin receptor protein thus produced can be measured by a binding experiment with a labeled neurotensin or the like and an enzyme immunoassay using a specific antibody. In the above method, in place of the DNA encoding the human neurotensin receptor protein of the present invention, a DNA encoding a known human neurotensin receptor protein [Vita, N.
et al. FEBS Lett. 317,139-142
(1993)], cells that highly express the recombinant human neurotensin receptor protein or recombinant human neurotensin receptor protein can be isolated. A known human neurotensin receptor protein is expressed in COS-7 [Vita, N. et.
al. FEBS Lett. 317, 139-142 (1
993)], the expression level in COS-7 is generally small. However, according to the method of constructing the expression plasmid of the present invention, not only cells (particularly CHO cells) that highly express the human neurotensin receptor protein of the present invention but also well-known human neurotensin receptor protein are highly expressed. Cells (especially CHO cells) can be produced.

【0033】本発明のヒト・ニューロテンシンレセプタ
ー蛋白質を含有する細胞の細胞膜画分は、上記のヒト・
ニューロテンシンレセプター蛋白質を含有する細胞を破
砕した後、それ自体公知の方法で得られる細胞膜が多く
含まれる画分のことをいう。細胞の破砕方法としては、
例えば、Potter−Elvehjem型ホモジナイザーで細胞を押
し潰す方法、ワーリングブレンダーやポリトロン(Kine
matica社製)による破砕、超音波による破砕、フレンチ
プレスなどで加圧しながら細胞を細いノズルから噴出さ
せることによる破砕などが挙げられる。細胞膜の分画に
は、分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法などの遠心力
による分画法が主として用いられる。例えば、細胞破砕
液を低速(500rpm〜3000rpm)で短時間
(通常、約1分〜10分)遠心し、上清をさらに高速
(15000rpm〜30000rpm)で通常30分
〜2時間遠心し、得られる沈澱を膜画分とする。該膜画
分中には、発現したヒト・ニューロテンシンレセプター
蛋白質と細胞由来のリン脂質や膜蛋白質などの膜成分が
多く含まれる。本発明のヒト・ニューロテンシンレセプ
ター蛋白質を含有する細胞やその細胞膜画分中のヒト・
ニューロテンシンレセプター蛋白質の量は、1細胞当た
り103〜108分子であるのが好ましく、105〜107
分子であるのが好適である。なお、発現量が多いほど膜
画分当たりのリガンド結合活性(比活性)が高くなり、
高感度なスクリーニング系の構築が可能になるばかりで
なく、同一ロットで大量の試料を測定できるようにな
る。
The cell membrane fraction of cells containing the human neurotensin receptor protein of the present invention is the human
It refers to a fraction containing a large amount of cell membranes obtained by a method known per se after disrupting cells containing the neurotensin receptor protein. As a method of crushing cells,
For example, a method of crushing cells with a Potter-Elvehjem type homogenizer, a Waring blender or a polytron (Kine
matica), ultrasonic crushing, crushing by ejecting cells from a thin nozzle while pressurizing with a French press, etc. For the fractionation of the cell membrane, a fractionation method by centrifugal force such as a fractionation centrifugation method or a density gradient centrifugation method is mainly used. For example, the cell lysate is centrifuged at low speed (500 rpm to 3000 rpm) for a short time (usually about 1 minute to 10 minutes), and the supernatant is further centrifuged at high speed (15000 rpm to 30000 rpm) for usually 30 minutes to 2 hours to obtain The precipitate is used as the membrane fraction. The membrane fraction is rich in the expressed human neurotensin receptor protein and membrane components such as cell-derived phospholipids and membrane proteins. The cells containing the human neurotensin receptor protein of the present invention or humans in the cell membrane fraction thereof.
The amount of neurotensin receptor protein is preferably 10 3 to 10 8 molecules per cell, and 10 5 to 10 7
It is preferably a molecule. The higher the expression level, the higher the ligand binding activity (specific activity) per membrane fraction,
Not only will it be possible to construct a highly sensitive screening system, but it will also be possible to measure a large number of samples in the same lot.

【0034】本発明のヒト・ニューロテンシンレセプタ
ー蛋白質、ヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質の
部分ペプチドおよびヒト・ニューロテンシンレセプター
蛋白質をコードするDNAは、抗体および抗血清の入
手、組換え型レセプター蛋白質の発現系の構築、同
発現系を用いたレセプター結合アッセイ系の開発と医薬
品候補化合物のスクリーニング、構造的に類似したリ
ガンド・レセプターとの比較にもとづいたドラッグデザ
インの実施、遺伝子診断におけるプローブ、PCRプ
ライマーの作製、遺伝子治療などに用いることができ
る。特に、本発明のヒト・ニューロテンシンレセプター
蛋白質の発現系を用いたレセプター結合アッセイ系によ
って、ヒトに特異的なヒト・ニューロテンシンレセプタ
ーアゴニストまたはアンタゴニストをスクリーニングす
ることができ、該アゴニストまたはアンタゴニストをニ
ューロテンシンに起因する各種疾病の予防・治療剤など
として使用することができる。本発明のヒト・ニューロ
テンシンレセプター蛋白質、ヒト・ニューロテンシンレ
セプター蛋白質部分ペプチド、ヒト・ニューロテンシン
レセプター蛋白質をコードするDNA用途について、以
下により具体的に説明する。
The human neurotensin receptor protein of the present invention, the partial peptide of the human neurotensin receptor protein, and the DNA encoding the human neurotensin receptor protein are available as an antibody and antiserum, and a recombinant receptor protein expression system. , Development of a receptor binding assay system using the same expression system, screening of drug candidate compounds, drug design based on comparison with structurally similar ligands and receptors, preparation of probes and PCR primers for gene diagnosis , Gene therapy, etc. In particular, human-specific human neurotensin receptor agonists or antagonists can be screened by a receptor binding assay system using the expression system of the human neurotensin receptor protein of the present invention, and the agonist or antagonist can be used as a neurotensin receptor. It can be used as a prophylactic / therapeutic agent for various diseases caused by. The use of the DNA encoding the human neurotensin receptor protein, the human neurotensin receptor protein partial peptide, or the human neurotensin receptor protein of the present invention will be described in more detail below.

【0035】(1)ヒト・ニューロテンシンレセプター
アゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング方法 本発明のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質もし
くはその塩、本発明のヒト・ニューロテンシンレセプタ
ー蛋白質の部分ペプチドもしくはその塩、または本発明
のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質を含有する
細胞またはその細胞膜画分は、ヒト・ニューロテンシン
レセプターアゴニストまたはアンタゴニストのスクリー
ニングに有用である。すなわち、本発明は、本発明のヒ
ト・ニューロテンシンレセプター蛋白質もしくはその
塩、本発明のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質
の部分ペプチドもしくはその塩、または本発明のヒト・
ニューロテンシンレセプター蛋白質を含有する細胞また
はその細胞膜画分を用いることを特徴とするヒト・ニュ
ーロテンシンレセプターアゴニストまたはアンタゴニス
トのスクリーニング方法を提供する。
(1) Method for Screening Human Neurotensin Receptor Agonist or Antagonist The human neurotensin receptor protein of the present invention or a salt thereof, a partial peptide of the human neurotensin receptor protein of the present invention or a salt thereof, or the present invention A cell containing the human neurotensin receptor protein or a cell membrane fraction thereof is useful for screening a human neurotensin receptor agonist or antagonist. That is, the present invention provides the human neurotensin receptor protein of the present invention or a salt thereof, the partial peptide of the human neurotensin receptor protein of the present invention or a salt thereof, or the human neurotensin receptor protein of the present invention.
Provided is a method for screening a human neurotensin receptor agonist or antagonist, which comprises using a cell containing a neurotensin receptor protein or a cell membrane fraction thereof.

【0036】より具体的には、本発明は、 (I)(i)本発明のヒト・ニューロテンシンレセプタ
ー蛋白質、その部分ペプチドまたはそれらの塩に、ニュ
ーロテンシンを接触させた場合と(ii)本発明のヒト・
ニューロテンシンレセプター蛋白質、その部分ペプチド
またはそれらの塩に、ニューロテンシンおよび試験化合
物を接触させた場合との比較を行なうことを特徴とする
ヒト・ニューロテンシンレセプターアゴニストまたはア
ンタゴニストのスクリーニング方法、および (II)(i)本発明のヒト・ニューロテンシンレセプタ
ー蛋白質を含有する細胞またはその細胞膜画分に、ニュ
ーロテンシンを接触させた場合と(ii)本発明のヒト・
ニューロテンシンレセプター蛋白質を含有する細胞また
はその細胞膜画分に、ニューロテンシンおよび試験化合
物を接触させた場合との比較を行なうことを特徴とする
ヒト・ニューロテンシンレセプターアゴニストまたはア
ンタゴニストのスクリーニング方法を提供する。
More specifically, the present invention relates to (I) (i) the case where the human neurotensin receptor protein of the present invention, a partial peptide thereof or a salt thereof is contacted with neurotensin, and (ii) the present invention. Invention human
A method for screening a human neurotensin receptor agonist or antagonist, which comprises comparing a neurotensin receptor protein, a partial peptide thereof or a salt thereof with that in contact with neurotensin and a test compound, and (II) (I) when a cell containing the human neurotensin receptor protein of the present invention or a cell membrane fraction thereof is contacted with neurotensin; and (ii) the human neurotensin receptor protein of the present invention
Disclosed is a method for screening a human neurotensin receptor agonist or antagonist, which comprises performing a comparison with a case where a cell containing a neurotensin receptor protein or a cell membrane fraction thereof is contacted with a neurotensin and a test compound.

【0037】具体的には、本発明のスクリーニング方法
(I)および(II)においては、(i)と(ii)の場合
における、例えば該ヒト・ニューロテンシンレセプター
蛋白質、その部分ペプチドもしくはそれらの塩、または
ヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質を含有するC
HO細胞もしくはその細胞膜画分に対するニューロテン
シンの結合量、細胞刺激活性などを測定して、比較する
ことを特徴とするものである。より具体的には、本発明
は、 (Ia)(i)標識したニューロテンシンを、本発明の
ヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質、その部分ペ
プチドまたはそれらの塩に接触させた場合と、(ii)標
識したヒト・ニューロテンシンおよび試験化合物を、本
発明のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質、その
部分ペプチドまたはそれらの塩に接触させた場合におけ
る、標識したニューロテンシンの該レセプター蛋白質、
その部分ペプチドまたはそれらの塩に対する結合量を測
定し、比較することを特徴とするヒト・ニューロテンシ
ンレセプターアゴニストまたはアンタゴニストのスクリ
ーニング方法、
Specifically, in the screening methods (I) and (II) of the present invention, for example, in the case of (i) and (ii), for example, the human neurotensin receptor protein, a partial peptide thereof or a salt thereof is used. , Or C containing the human neurotensin receptor protein
It is characterized in that the binding amount of neurotensin to HO cells or the cell membrane fraction thereof, cell stimulating activity, etc. are measured and compared. More specifically, the present invention provides (Ia) (i) labeled neurotensin in contact with the human neurotensin receptor protein of the present invention, a partial peptide thereof or a salt thereof, and (ii) labeled Labeled human neurotensin and the test compound are contacted with the human neurotensin receptor protein of the present invention, a partial peptide thereof or a salt thereof, the labeled neurotensin receptor protein,
A method for screening a human neurotensin receptor agonist or antagonist, which comprises measuring the amount of binding to a partial peptide or a salt thereof and comparing the amounts.

【0038】(IIa)(i)標識したニューロテンシン
を、本発明のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質
を含有する細胞またはその細胞膜画分に接触させた場合
と、(ii)標識したニューロテンシンおよび試験化合物
を、本発明のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質
を含有する細胞またはその細胞膜画分に接触させた場合
における、標識したニューロテンシンの該細胞またはそ
の細胞膜画分に対する結合量を測定し、比較することを
特徴とするヒト・ニューロテンシンレセプターアゴニス
トまたはアンタゴニストのスクリーニング方法、および (IIb)(i)ニューロテンシンを、本発明のヒト・ニ
ューロテンシンレセプター蛋白質を含有する細胞または
その細胞膜画分に接触させた場合と、(ii)ニューロテ
ンシンおよび試験化合物を、本発明のヒト・ニューロテ
ンシンレセプター蛋白質を含有する細胞またはその細胞
膜画分に接触させた場合における、ヒト・ニューロテン
シンレセプターを介した細胞刺激活性(例えば、ドーパ
ミンの遊離、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、
細胞内Ca2+濃度の変動、細胞内cAMP生成、細胞内
cGMP生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変
動、細胞内蛋白質のリン酸化、c−fosの活性化、p
Hの低下、細胞の遊走活性などを促進する活性または抑
制する活性など)を測定し、比較することを特徴とする
ヒト・ニューロテンシンレセプターアゴニストまたはア
ンタゴニストのスクリーニング方法を提供する。
(IIa) (i) When labeled neurotensin is contacted with cells containing the human neurotensin receptor protein of the present invention or a cell membrane fraction thereof, and (ii) labeled neurotensin and a test compound Is contacted with a cell containing the human neurotensin receptor protein of the present invention or a cell membrane fraction thereof, the binding amount of labeled neurotensin to the cell or cell membrane fraction thereof is measured and compared. A method for screening a human neurotensin receptor agonist or antagonist, and (IIb) (i) contacting a cell containing a human neurotensin receptor protein of the present invention or a cell membrane fraction thereof with , (Ii) Neurotensin and testing When a substance is contacted with cells containing the human neurotensin receptor protein of the present invention or a cell membrane fraction thereof, cell stimulating activity via human neurotensin receptor (for example, dopamine release, arachidonic acid release, Acetylcholine release,
Fluctuation of intracellular Ca 2+ concentration, intracellular cAMP production, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, c-fos activation, p
The present invention provides a method for screening human neurotensin receptor agonists or antagonists, which comprises measuring and comparing H reduction, activity promoting or suppressing cell migration activity and the like).

【0039】上記の(Ia)または(IIa)のスクリー
ニング方法において、ヒト・ニューロテンシンレセプタ
ー蛋白質に結合して、ニューロテンシンとヒト・ニュー
ロテンシンレセプター蛋白質との結合を阻害する化合物
がヒト・ニューロテンシンレセプターアゴニストまたは
アンタゴニストとして選択できる。さらに、上記(II
b)のスクリーニング方法において、ヒト・ニューロテ
ンシンレセプターに結合し、該レセプターを介して細胞
刺激活性(例えば、ドーパミンの遊離、アラキドン酸遊
離、アセチルコリン遊離、細胞内Ca2+濃度の変動、細
胞内cAMP生成、細胞内cGMP生成、イノシトール
リン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸
化、c−fosの活性化、pHの低下、細胞の遊走活性
などを促進する活性または抑制する活性など)を有する
化合物をヒト・ニューロテンシンレセプターアゴニスト
として選択することができる。一方、上記の(Ia)ま
たは(IIa)のスクリーニング方法において、ニューロ
テンシンとヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質と
の結合を阻害する活性が認められた試験化合物の中で、
該細胞刺激活性を有しない化合物をヒト・ニューロテン
シンレセプターアンタゴニストとして選択することがで
きる。
In the above screening method (Ia) or (IIa), the compound that binds to the human neurotensin receptor protein and inhibits the binding between neurotensin and the human neurotensin receptor protein is the human neurotensin receptor. It can be selected as an agonist or an antagonist. In addition, (II
In the screening method of b), it binds to a human neurotensin receptor and cell-stimulating activity (eg, dopamine release, arachidonic acid release, acetylcholine release, fluctuation of intracellular Ca 2+ concentration, intracellular cAMP) via the receptor. Production, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, c-fos activation, pH lowering, activity promoting or suppressing cell migration activity, etc.) The compound having can be selected as a human neurotensin receptor agonist. On the other hand, in the above-mentioned screening method (Ia) or (IIa), among the test compounds found to have the activity of inhibiting the binding between neurotensin and human neurotensin receptor protein,
A compound having no cell stimulating activity can be selected as a human neurotensin receptor antagonist.

【0040】本発明のヒト・ニューロテンシンレセプタ
ー蛋白質を含有する細胞が得られる以前は、ヒト・ニュ
ーロテンシンレセプター蛋白質を高発現できる細胞がな
かったため、ニューロテンシンレセプターアゴニストま
たはアンタゴニストを効率良くスクリーニングすること
ができなかった。本発明のスクリーニング方法の具体的
な説明を以下にする。リガンドとして使用するニューロ
テンシンとしては、市販のものなどを用いることができ
る。また、ニューロテンシンの代わりに、公知のニュー
ロテンシンレセプターアゴニストやアンタゴニストなど
を使用することもできる。標識したニューロテンシンと
しては、例えば、〔3H〕、〔125I〕、〔14C〕などで
標識したニューロテンシンなどを用いることができ、さ
らには、〔3H〕、〔125I〕、〔14C〕などで標識した
公知のニューロテンシンアゴニストやアンタゴニストな
どを用いることもできる。例えば、〔125I〕で標識さ
れたニューロテンシン(アマシャム社)などが好適であ
る。試験化合物としては、例えばペプチド、タンパク、
非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽
出液、植物抽出液、動物組織抽出液などが挙げられ、こ
れら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化
合物であってもよい。
Before the cells containing the human neurotensin receptor protein of the present invention were obtained, there were no cells capable of highly expressing the human neurotensin receptor protein. Therefore, it is possible to efficiently screen for neurotensin receptor agonists or antagonists. could not. A detailed description of the screening method of the present invention is given below. As the neurotensin used as a ligand, a commercially available one or the like can be used. Further, known neurotensin receptor agonists or antagonists can be used instead of neurotensin. As the labeled neurotensin, for example, neurotensin labeled with [ 3 H], [ 125 I], [ 14 C] or the like can be used, and further, [ 3 H], [ 125 I], [ 125 I], Known neurotensin agonists or antagonists labeled with 14 C] or the like can also be used. For example, [ 125 I] -labeled neurotensin (Amersham) and the like are preferable. Examples of test compounds include peptides, proteins,
Examples include non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, etc. These compounds may be novel compounds or known compounds. .

【0041】具体的には、上記の(1a)または(2
a)のスクリーニング方法を実施するには、まず、本発
明のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質を含有す
る細胞またはその細胞膜画分、あるいはヒト・ニューロ
テンシンレセプター蛋白質またはその部分ペプチドを、
スクリーニングに適したバッファーに懸濁することによ
りレセプター標品を調製する。バッファーには、pH約
4〜10(望ましくは、pH約6〜8)のリン酸バッフ
ァー、トリス−塩酸バッファーなどの、ニューロテンシ
ンとレセプターとの結合を阻害しないバッファーであれ
ばいずれでもよい。また、非特異的結合を低減させる目
的で、CHAPS、Tween−80TM(花王−アトラ
ス社)、ジギトニン、デオキシコレートなどの界面活性
剤をバッファーに加えることもできる。さらに、プロテ
アーゼによるレセプターやリガンドの分解を抑える目的
で、PMSF、ロイペプチン、バシトラシン、アプロチ
ニン、E−64(ペプチド研究所製)、ペプスタチンな
どのプロテアーゼ阻害剤を添加することもできる。そし
て、試験化合物を同バッファーに懸濁した10-4M〜1
-10Mの試験化合物溶液を反応チューブに入れ、そし
て、0.01ml〜10mlの該レセプター溶液を添加
する。
Specifically, the above (1a) or (2
In order to carry out the screening method of a), first, cells containing the human neurotensin receptor protein of the present invention or a cell membrane fraction thereof, or human neurotensin receptor protein or its partial peptide are
Prepare a receptor preparation by suspending it in a buffer suitable for screening. The buffer may be any buffer that does not inhibit the binding between neurotensin and the receptor, such as a phosphate buffer having a pH of about 4 to 10 (desirably, a pH of about 6 to 8) and a Tris-hydrochloric acid buffer. Further, for the purpose of reducing non-specific binding, a surfactant such as CHAPS, Tween-80 (Kao-Atlas), digitonin and deoxycholate can be added to the buffer. In addition, protease inhibitors such as PMSF, leupeptin, bacitracin, aprotinin, E-64 (manufactured by Peptide Laboratories), pepstatin and the like can be added for the purpose of suppressing the decomposition of the receptor and ligand by protease. Then, the test compound was suspended in the same buffer at 10 −4 M to 1
A 0 -10 M test compound solution is placed in the reaction tube and 0.01 ml to 10 ml of the receptor solution is added.

【0042】さらに、一定量(例えば、2000Ci/
mmolの場合、約10000cpm〜1000000
cpm)の標識したニューロテンシン(例えば、〔125
I〕ニューロテンシン)を添加する。非特異的結合量
(NSB)を知るために大過剰の未標識のニューロテン
シンを加えた反応チューブも用意する。反応は0℃から
50℃、望ましくは4℃から37℃で20分から24時
間、望ましくは30分から3時間行なう。反応後、ガラ
ス繊維濾紙等で濾過し、適量の同バッファーで洗浄した
後、ガラス繊維濾紙に残存する放射活性(例えば、〔
125I〕の量)を液体シンチレーションカウンターまた
はγ−カウンターで測定する。濾過には、マニホールド
やセルハーベスターを用いることができるが、セルハー
ベスターを用いることが効率を上げるために望ましい。
拮抗する物質がない場合のカウント(B0)から非特異的
結合量(NSB)を引いたカウント(B0−NSB)を
100%とした時、特異的結合量(B−NSB)が、例
えばカウント(B0−NSB)の50%以下になる試験
化合物をアゴニストまたはアンタゴニスト候補化合物と
して選択することができる。
Furthermore, a fixed amount (for example, 2000 Ci /
In the case of mmol, about 10,000 cpm to 1,000,000
cpm) labeled neurotensin (eg [ 125
I] Neurotensin) is added. A reaction tube containing a large excess of unlabeled neurotensin is also prepared in order to know the non-specific binding amount (NSB). The reaction is carried out at 0 ° C to 50 ° C, preferably 4 ° C to 37 ° C for 20 minutes to 24 hours, preferably 30 minutes to 3 hours. After the reaction, the mixture is filtered with glass fiber filter paper or the like, washed with an appropriate amount of the same buffer, and then the radioactivity remaining in the glass fiber filter paper (for example, [(
The amount of 125 I]) is measured with a liquid scintillation counter or a γ-counter. A manifold or a cell harvester can be used for filtration, but it is preferable to use a cell harvester in order to increase efficiency.
When the count (B 0 -NSB) obtained by subtracting the nonspecific binding amount (NSB) from the count (B 0 ) when there is no substance to be antagonized is 100%, the specific binding amount (B-NSB) is, for example, Test compounds that give 50% or less of the count (B 0 -NSB) can be selected as agonist or antagonist candidate compounds.

【0043】具体的には、次のような手順で操作を行な
う。 (i)50mM Tris-HCl、5mM MgCl2
500μM オルトフェナントロリン、200μM バシ
トラシン、0.2% BSA、pH7.4の反応バッフ
ァーを作製する。 (ii)反応バッファーに試験化合物を懸濁した試験化合
物溶液2μlを氷上で反応チューブに入れる。試験化合
物の最終濃度を100μMに調製する。 (iii)−80℃で凍結乾燥してあるヒト・ニューロテ
ンシンレセプター蛋白質を含有する細胞膜画分を室温に
戻し、軽くボルテックスした後、適当な濃度に希釈し、
細胞膜画分溶液を調製する(例えば、1.5mgタンパ
ク/ml(ウシ脳膜画分)、100μgタンパク/ml
(ヒトadenocarcinomaHT−29細胞膜画分)など)。
この細胞膜画分溶液をcell strainerに通した後、反応
チューブに分注器で200μl分中する。 (iv)反応バッファーに希釈した〔125I〕ニューロテ
ンシン(IM-163、アマシャム社)を2μlずつ氷
上で反応チューブに入れる。 (v)25℃で90分間反応を行なう。 (vi)マニホールドを使用し、B/F分離を行なう。こ
の時に使用するフィルター(GF/F、ワットマン社)
はあらかじめPEI液(20mM Tris-HCl、
0.3% ポリエチレンイミド)、pH7.4)に1時
間以上浸しておく。 (vii)フィルターをγ−カウンターでカウントする。
特異的結合を40〜50%以上阻害した化合物を±、5
0%以上阻害した化合物を+と評価する。
Specifically, the operation is performed in the following procedure. (I) 50 mM Tris-HCl, 5 mM MgCl 2 ,
Make a reaction buffer of 500 μM orthophenanthroline, 200 μM bacitracin, 0.2% BSA, pH 7.4. (Ii) 2 μl of a test compound solution prepared by suspending a test compound in a reaction buffer is put in a reaction tube on ice. The final concentration of test compound is adjusted to 100 μM. (Iii) The cell membrane fraction containing human neurotensin receptor protein freeze-dried at −80 ° C. is returned to room temperature, vortexed lightly, and then diluted to an appropriate concentration,
Prepare a cell membrane fraction solution (eg, 1.5 mg protein / ml (bovine brain membrane fraction), 100 μg protein / ml)
(Human adenocarcinoma HT-29 cell membrane fraction) and the like).
After passing this cell membrane fraction solution through a cell strainer, 200 μl of the solution is placed in a reaction tube with a dispenser. (Iv) [ 125 I] Neurotensin (IM-163, Amersham Co.) diluted in reaction buffer (2 μl) is put in a reaction tube on ice. (V) Perform the reaction at 25 ° C. for 90 minutes. (Vi) Perform B / F separation using a manifold. Filter used at this time (GF / F, Whatman)
Is a PEI solution (20 mM Tris-HCl,
Soak for 1 hour or more in 0.3% polyethylene imide), pH 7.4). (Vii) Count the filter with a γ-counter.
Compounds that inhibited specific binding by 40 to 50% or more were ± 5
Compounds that inhibit 0% or more are evaluated as +.

【0044】また、上記(2b)のスクリーニング方法
を実施するためには、ヒト・ニューロテンシンレセプタ
ー蛋白質を介する細胞刺激活性(例えば、ドーパミンの
遊離、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内
Ca2+濃度の変動、細胞内cAMP生成、細胞内cGM
P生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細
胞内蛋白質のリン酸化、c−fos活性化、pHの低
下、細胞の遊走活性などを促進する活性または抑制する
活性など)を公知の方法または市販の測定用キットを用
いて測定することができる。具体的には、まず、ヒト・
ニューロテンシンレセプター蛋白質を含有する細胞をマ
ルチウェルプレート等に培養する。スクリーニングを行
なうにあたっては前もって新鮮な培地あるいは細胞に毒
性を示さない適当なバッファーに交換し、試験化合物な
どを添加して一定時間インキュベートした後、細胞を抽
出あるいは上清液を回収して、生成した産物をそれぞれ
の方法に従って定量する。細胞刺激活性の指標とする物
質(例えば、アラキドン酸など)の生成が、細胞が含有
する分解酵素によって検定困難な場合は、該分解酵素に
対する阻害剤を添加してアッセイを行なってもよい。ま
た、cAMP産生抑制などの活性については、フォルス
コリンなどで細胞の基礎的産生量を増大させておいた細
胞に対する産生抑制作用として検出することができる。
Further, in order to carry out the screening method of the above (2b), cell stimulating activity mediated by human neurotensin receptor protein (eg, dopamine release, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ concentration) Fluctuation, intracellular cAMP production, intracellular cGM
P production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, c-fos activation, pH decrease, activity promoting or suppressing cell migration activity, etc.) by known methods or commercially available It can be measured using the measurement kit. Specifically, first,
Cells containing the neurotensin receptor protein are cultured in a multiwell plate or the like. For screening, the medium was exchanged with a fresh medium or an appropriate buffer that did not show toxicity to cells in advance, and after adding a test compound or the like and incubating for a certain period of time, cells were extracted or supernatant was collected to generate The product is quantified according to the respective method. When the production of a substance that serves as an index of cell stimulating activity (for example, arachidonic acid) is difficult to assay by the degrading enzyme contained in the cell, an inhibitor for the degrading enzyme may be added to the assay. Further, the activity of suppressing cAMP production and the like can be detected as a production suppressing action on cells in which the basic production amount of cells has been increased by forskolin or the like.

【0045】本発明のスクリーニング用キットは、本発
明のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質もしくは
その塩、本発明のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋
白質の部分ペプチドもしくはその塩、または本発明のヒ
ト・ニューロテンシンレセプター蛋白質を含有する細胞
もしくはその細胞膜画分を含有するものである。本発明
のスクリーニング用キットの例としては、次のものが挙
げられる。 〔スクリーニング用試薬〕 測定用緩衝液および洗浄用緩衝液 0.01%のウシ血清アルブミン、1mM オルソフェナ
ントロリン、20mMHEPESを加えたDMEM培地
を水酸化ナトリウムでpH7.0に調製したもの。孔径
0.22μmのフィルターで濾過滅菌し、4℃で保存す
るか、あるいは用時調製しても良い。 ヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質標品 ヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質を含有する細
胞を、12穴プレートに5×105個/穴で継代し、3
7℃、5%CO2、95%airでコンフルエントにな
るまで培養したもの。 標識ニューロテンシン 市販の〔3H〕、〔125I〕、〔14C〕などで標識したニ
ューロテンシン 溶液の状態のものを4℃あるいは−20℃にて保存し、
用時に測定用緩衝液にて1μMに希釈する。 ニューロテンシン標準液 ニューロテンシンを滅菌水で10-4Mとなるように溶解
し、−20℃で保存する。
The screening kit of the present invention comprises the human neurotensin receptor protein of the present invention or a salt thereof, a partial peptide of the human neurotensin receptor protein of the present invention or a salt thereof, or the human neurotensin receptor protein of the present invention. Cells containing or a cell membrane fraction thereof. Examples of the screening kit of the present invention include the following. [Screening Reagent] Measurement Buffer and Washing Buffer A DMEM medium containing 0.01% bovine serum albumin, 1 mM orthophenanthroline and 20 mM HEPES, adjusted to pH 7.0 with sodium hydroxide. It may be sterilized by filtration with a filter having a pore size of 0.22 μm and stored at 4 ° C., or may be prepared before use. Human Neurotensin Receptor Protein Standard Preparation Human neurotensin receptor protein-containing cells were subcultured on a 12-well plate at 5 × 10 5 cells / well and 3
Cultured at 7 ° C., 5% CO 2 , 95% air until confluent. Labeled neurotensin A commercially available neurotensin solution labeled with [ 3 H], [ 125 I], [ 14 C] or the like is stored at 4 ° C or -20 ° C,
When using, dilute to 1 μM with measurement buffer. Neurotensin standard solution Neurotensin is dissolved in sterilized water to 10 −4 M and stored at −20 ° C.

【0046】〔測定法〕 12穴組織培養用プレートにて培養したヒト・ニュー
ロテンシンレセプター蛋白質を含有する細胞を、測定用
緩衝液1mlで1〜2回程度洗浄した後、4℃に冷やし
た測定用緩衝液1mlを加えて4℃で10分間保温し
た。 測定用緩衝液を吸い出した後、4℃に冷やした10-3
〜10-10Mの試験化合物溶液を5μl加えた後、50
0pM標識ニューロテンシンを含む測定用緩衝液を0.
5ml加え、4℃で3時間反応させる。非特異的結合量
を知るためには試験化合物と共に1μMのニューロテン
シンを加えておく。 反応液を除去し、4℃に冷やした1mlの洗浄用緩衝
液で3回洗浄する。細胞に結合した標識ニューロテンシ
ンを0.5mlの0.2N NaOHではがした後、γ-
カウンターで放射活性を測定し、Percent of Maximum B
inding(PMB)を次の式〔数1〕で求める。
[Measurement method] Cells containing human neurotensin receptor protein cultured in a 12-well tissue culture plate were washed with 1 ml of the measurement buffer about 1 to 2 times and then cooled to 4 ° C. 1 ml of buffer solution was added and kept at 4 ° C. for 10 minutes. After sucking out the measurement buffer, cool it to 4 ℃ 10 -3
After adding 5 μl of a test compound solution of -10 -10 M,
A measurement buffer containing 0 pM labeled neurotensin was added to a concentration of 0.
Add 5 ml and react at 4 ° C. for 3 hours. To determine the amount of non-specific binding, 1 μM neurotensin was added together with the test compound. The reaction solution is removed, and the well is washed 3 times with 1 ml of a washing buffer cooled to 4 ° C. Labeled neurotensin bound to cells was stripped with 0.5 ml of 0.2N NaOH, and then γ-
Measure radioactivity with a counter and measure Percent of Maximum B
The inding (PMB) is calculated by the following formula [Equation 1].

【数1】 PMB:Percent of Maximum Binding B :検体を加えた時の値 NSB:Non-specific Binding(非特異的結合量) B0 :最大結合量[Equation 1] PMB: Percent of Maximum Binding B: Value when a sample is added NSB: Non-specific Binding B 0 : Maximum binding amount

【0047】なお、上記のスクリーニング方法およびス
クリーニング用キットにおいては、本発明のヒト・ニュ
ーロテンシンレセプター蛋白質、その部分ペプチドおよ
び本発明のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質を
含有する細胞もしくはその細胞膜画分の代わりに、公知
のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質DNA〔Vi
ta, N. et al. フェブス・レター(FEBS Lett.) 317, 1
39-142 (1993)〕などのDNAから製造した組換え型ヒ
ト・ニューロテンシンレセプター蛋白質、その部分ペプ
チドまたは組換え型ヒト。ニューロテンシンレセプター
蛋白質を含有する細胞もしくはその細胞膜画分を用いる
こともできる。
In the above screening method and screening kit, a cell containing the human neurotensin receptor protein of the present invention, a partial peptide thereof and the human neurotensin receptor protein of the present invention or a cell membrane fraction thereof is used instead. In addition, known human neurotensin receptor protein DNA [Vi
ta, N. et al. FEBS Lett. 317, 1
39-142 (1993)] and the like, a recombinant human neurotensin receptor protein produced from DNA, a partial peptide thereof or a recombinant human. A cell containing a neurotensin receptor protein or a cell membrane fraction thereof can also be used.

【0049】本発明のスクリーニング方法またはスクリ
ーニング用キットを用いることによって、ニューロテン
シンと本発明のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白
質との結合を阻害する性質を有する化合物、具体的に
は、ニューロテンシンレセプターを介して細胞刺激活性
を有する化合物またはその塩(いわゆる、ヒト・ニュー
ロテンシンレセプターアゴニスト)、あるいは該細胞刺
激活性を有しない化合物またはその塩(いわゆる、ヒト
・ニューロテンシンレセプターアンタゴニスト)を見い
出すことができる。ヒト・ニューロテンシンレセプター
アゴニストは、ニューロテンシンが有する生理活性の全
部または一部を有しているので、該生理活性に応じて安
全で低毒性な医薬組成物として有用である。一方、ヒト
・ニューロテンシンレセプターアンタゴニストは、ニュ
ーロテンシンが有する生理活性の全部または一部を抑制
することができるので、該生理活性を抑制する安全で低
毒性な医薬組成物として有用である。具体的には、ヒト
・ニューロテンシンレセプターアゴニストはパーキンソ
ン病、鬱病、痴呆症、多動児性症候群もしくは意識障害
の予防・治療剤、拒食性誘発剤などとして有用であり、
ヒト・ニューロテンシンレセプターアンタゴニストは逆
行性食道炎、腸炎、すい炎、潰瘍、胃癌、腸癌、精神
病、ハンチントン病もしくは躁病の予防・治療剤、抗不
安剤、催眠鎮静剤などとして有用である。
By using the screening method or the screening kit of the present invention, a compound having the property of inhibiting the binding between the neurotensin and the human neurotensin receptor protein of the present invention, specifically, via the neurotensin receptor Thus, a compound having a cell stimulating activity or a salt thereof (so-called human neurotensin receptor agonist) or a compound having no cell stimulating activity or a salt thereof (so-called human neurotensin receptor antagonist) can be found. The human neurotensin receptor agonist has all or part of the physiological activity possessed by neurotensin, and is therefore useful as a safe and low-toxic pharmaceutical composition depending on the physiological activity. On the other hand, a human neurotensin receptor antagonist can suppress all or part of the physiological activity of neurotensin, and is therefore useful as a safe and low-toxic pharmaceutical composition for suppressing the physiological activity. Specifically, human neurotensin receptor agonist is useful as a prophylactic / therapeutic agent for Parkinson's disease, depression, dementia, hyperactive childhood syndrome or consciousness disorder, an anorexic inducer, and the like,
The human neurotensin receptor antagonist is useful as a prophylactic / therapeutic agent for anterograde esophagitis, enteritis, pancreatitis, ulcer, gastric cancer, intestinal cancer, psychosis, Huntington's disease or mania, anxiolytic, hypnotic sedative and the like.

【0050】本発明のスクリーニング方法またはスクリ
ーニング用キットを用いて得られるアゴニストまたはア
ンタゴニストを上述の医薬組成物として使用する場合、
常套手段に従って実施することができる。例えば、必要
に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル
剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは
水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性
溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使
用できる。例えば、該化合物またはその塩を生理学的に
認められる担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、
安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製薬実施
に要求される単位用量形態で混和することによって製造
することができる。これら製剤における有効成分量は指
示された範囲の適当な容量が得られるようにするもので
ある。錠剤、カプセル剤などに混和することができる添
加剤としては、例えばゼラチン、コーンスターチ、トラ
ガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロー
スのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギ
ン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムの
ような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような
甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのよ
うな香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセル
である場合には、前記タイプの材料にさらに油脂のよう
な液状担体を含有することができる。注射のための無菌
組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻
油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解また
は懸濁させるなどの通常の製剤実施にしたがって処方す
ることができる。
When the agonist or antagonist obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention is used as the above-mentioned pharmaceutical composition,
It can be carried out in a conventional manner. For example, orally as tablets, capsules, elixirs, microcapsules, etc., optionally sugar-coated, or aseptic solution with water or other pharmaceutically acceptable liquid, or suspension It can be used parenterally in the form of injections such as. For example, a physiologically acceptable carrier, flavoring agent, excipient, vehicle, preservative, or the like of the compound or a salt thereof,
It can be prepared by mixing with stabilizers, binders and the like in a unit dose form generally required for accepted pharmaceutical practice. The amount of active ingredient in these preparations is such that a suitable amount within the indicated range can be obtained. Additives that can be mixed with tablets, capsules, etc. include, for example, gelatin, corn starch, tragacanth, binders such as gum arabic, excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, alginic acid, etc. Puffing agents, lubricating agents such as magnesium stearate, sweetening agents such as sucrose, lactose or saccharin, flavoring agents such as peppermint, red oil or cherry are used. When the unit dosage form is a capsule, a liquid carrier such as fat may be included in addition to materials of the above type. Sterile compositions for injection can be formulated according to conventional pharmaceutical practices such as dissolving or suspending the active substance in a vehicle such as water for injection, naturally occurring vegetable oils such as sesame oil, coconut oil, etc. .

【0051】注射用の水溶液としては、例えば、生理食
塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液(例え
ば、D−ソルビトール、D−マンニトール、塩化ナトリ
ウムなど)などがあげられ、適当な溶解補助剤、たとえ
ばアルコール(たとえばエタノール)、ポリアルコール
(たとえばプロピレングリコール、ポリエチレングリコ
ール)、非イオン性界面活性剤(たとえばポリソルベー
ト80(TM)、HCO−50)などと併用してもよ
い。油性液としてはゴマ油、大豆油などがあげられ、溶
解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール
などと併用してもよい。また、緩衝剤(例えば、リン酸
塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液)、無痛化剤(例え
ば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど)、安
定剤(例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリ
コールなど)、保存剤(例えば、ベンジルアルコール、
フェノールなど)、酸化防止剤などと配合してもよい。
調整された注射液は通常、適当なアンプルに充填され
る。このようにして得られる製剤は安全で低毒性である
ので、例えば温血哺乳動物(例えば、ラット、ウサギ、
ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サル、ヒトなど、特
にヒト)に対して投与することができる。該アゴニスト
またはアンタゴニストの投与量は、症状などにより差異
はあるが、経口投与の場合、一般的に成人(60kgと
して)においては、一日につき約0.1〜100mg、
好ましくは約1.0〜50mg、より好ましくは約1.
0〜20mgである。非経口的に投与する場合は、その
1回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法など
によっても異なるが、たとえば注射剤の形では通常成人
(60kgとして)においては、一日につき約0.01
〜30mg程度、好ましくは約0.1〜20mg程度、
より好ましくは約0.1〜10mg程度を静脈注射によ
り投与するのが好都合である。他の動物の場合も、60
kg当たりに換算した量を投与することができる。
Examples of the aqueous solution for injection include physiological saline, isotonic solution containing glucose and other adjuvants (for example, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.) and the like. You may use together with adjuvants, such as alcohol (for example, ethanol), polyalcohol (for example, propylene glycol, polyethylene glycol), a nonionic surfactant (for example, polysorbate 80 (TM), HCO-50) and the like. Examples of the oily liquid include sesame oil and soybean oil, which may be used in combination with solubilizing agents such as benzyl benzoate and benzyl alcohol. In addition, buffers (eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer), soothing agents (eg, benzalkonium chloride, procaine hydrochloride, etc.), stabilizers (eg, human serum albumin, polyethylene glycol, etc.), preservation Agents (eg, benzyl alcohol,
(Eg, phenol), antioxidant, etc.
The adjusted injection solution is usually filled in a suitable ampoule. Since the preparation thus obtained is safe and has low toxicity, for example, warm-blooded mammals (for example, rat, rabbit,
It can be administered to sheep, pigs, cows, cats, dogs, monkeys, humans, etc., especially humans). The dose of the agonist or antagonist varies depending on the symptoms, but in the case of oral administration, it is generally about 0.1 to 100 mg per day for an adult (as 60 kg),
Preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.
It is 0 to 20 mg. In the case of parenteral administration, the single dose varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, etc., but in the case of an injection, for example, in an adult (60 kg), the daily dose is about 1 day. 0.01
~ 30 mg, preferably about 0.1-20 mg,
More preferably, about 0.1 to 10 mg is conveniently administered by intravenous injection. 60 for other animals
An amount converted per kg can be administered.

【0052】(2)ニューロテンシンレセプター蛋白質
欠乏症の予防・治療剤 本発明のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質をコ
ードするDNAは、ニューロテンシンレセプター蛋白質
欠乏症の予防・治療剤として使用することができる。例
えば、生体内において本発明のヒト・ニューロテンシン
レセプター蛋白質が減少しているためにニューロテンシ
ンの生理作用が期待できない患者がいる場合に、(イ)
本発明のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質をコ
ードするDNAを該患者に投与し、生体内で該ヒト・ニ
ューロテンシンレセプター蛋白質発現させることによっ
て、あるいは(ロ)脳細胞などに本発明のヒト・ニュー
ロテンシンレセプター蛋白質をコードするDNAを挿入
し、該ヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質を発現
させた後に、該脳細胞を該患者に移植することなどによ
って、該患者の脳細胞におけるヒト・ニューロテンシン
レセプター蛋白質の量を増加させ、ニューロテンシンの
作用を充分に発揮させることができる。したがって、本
発明のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質をコー
ドするDNAは、安全で低毒性な本発明のニューロテン
シンレセプター蛋白質欠乏症(例えば、パーキンソン病
など)の予防・治療剤などとして用いることができる。
(2) Preventive / therapeutic agent for neurotensin receptor protein deficiency The DNA encoding the human neurotensin receptor protein of the present invention can be used as a preventive / therapeutic agent for neurotensin receptor protein deficiency. For example, in the case where there is a patient in whom the physiological action of neurotensin cannot be expected because the human neurotensin receptor protein of the present invention is reduced in vivo, (a)
The DNA encoding the human neurotensin receptor protein of the present invention is administered to the patient, and the human neurotensin receptor protein is expressed in vivo, or (b) human neurotensin of the present invention in brain cells or the like. The amount of human neurotensin receptor protein in the brain cells of the patient by inserting the DNA encoding the receptor protein, expressing the human neurotensin receptor protein, and then transplanting the brain cells into the patient. And the action of neurotensin can be fully exerted. Therefore, the DNA encoding the human neurotensin receptor protein of the present invention can be used as a safe and less toxic prophylactic / therapeutic agent for the neurotensin receptor protein deficiency (for example, Parkinson's disease).

【0053】本発明のDNAを上記の予防・治療剤とし
て使用する場合は、該DNAを単独あるいはレトロウイ
ルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイル
スアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベク
ターに挿入した後、常套手段に従って実施することがで
きる。例えば、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセ
ル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経
口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し
得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の
形で非経口的に使用できる。例えば、本発明のDNAを
生理学的に認められる担体、香味剤、賦形剤、ベヒク
ル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認めら
れた製剤実施に要求される単位用量形態で混和すること
によって製造することができる。これら製剤における有
効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるよう
にするものである。
When the DNA of the present invention is used as the above-mentioned prophylactic / therapeutic agent, the DNA is inserted into an appropriate vector such as a retrovirus vector, an adenovirus vector or an adenovirus associated virus vector, and then the conventional method is used. It can be carried out according to the means. For example, orally as tablets, capsules, elixirs, microcapsules, etc., optionally sugar-coated, or aseptic solution with water or other pharmaceutically acceptable liquid, or suspension It can be used parenterally in the form of injections such as. For example, the DNA of the present invention is admixed with physiologically acceptable carriers, flavoring agents, excipients, vehicles, preservatives, stabilizers, binders and the like in a unit dose form generally required for the implementation of the formulation. Can be manufactured by. The amount of active ingredient in these preparations is such that a suitable amount within the indicated range can be obtained.

【0054】錠剤、カプセル剤などに混和することがで
きる添加剤としては、例えばゼラチン、コーンスター
チ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性
セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチ
ン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグ
ネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリ
ンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチ
ェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態
がカプセルである場合には、前記タイプの材料にさらに
油脂のような液状担体を含有することができる。注射の
ための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性
物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油など
を溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施にしたが
って処方することができる。注射用の水性液としては生
理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液(例
えば、D−ソルビトール、D−マンニトール、塩化ナト
リウムなど)などがあげられ、適当な溶解補助剤、たと
えばアルコール(たとえばエタノール)、ポリアルコー
ル(たとえばプロピレングリコール、ポリエチレングリ
コール)、非イオン性界面活性剤(たとえばポリソルベ
ート80(TM)、HCO−50)などと併用してもよ
い。油性液としてはゴマ油、大豆油などがあげられ、溶
解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール
などと併用してもよい。
Additives which can be mixed with tablets, capsules and the like include, for example, gelatin, corn starch, tragacanth, binders such as gum arabic, excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, alginic acid and the like. Such as a leavening agent, a lubricant such as magnesium stearate, a sweetener such as sucrose, lactose or saccharin, and a flavoring agent such as peppermint, red oil or cherry. When the unit dosage form is a capsule, a liquid carrier such as fat may be included in addition to materials of the above type. Sterile compositions for injection can be formulated according to conventional pharmaceutical practices such as dissolving or suspending the active substance in a vehicle such as water for injection, naturally occurring vegetable oils such as sesame oil, coconut oil, etc. . Examples of the aqueous solution for injection include physiological saline, isotonic solution containing glucose and other adjuvants (eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.), and a suitable solubilizing agent such as alcohol. (Eg ethanol), polyalcohol (eg propylene glycol, polyethylene glycol), nonionic surfactant (eg polysorbate 80 (TM), HCO-50) and the like may be used in combination. Examples of the oily liquid include sesame oil and soybean oil, which may be used in combination with solubilizing agents such as benzyl benzoate and benzyl alcohol.

【0055】また、緩衝剤(例えば、リン酸塩緩衝液、
酢酸ナトリウム緩衝液)、無痛化剤(例えば、塩化ベン
ザルコニウム、塩酸プロカインなど)、安定剤(例え
ば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールな
ど)、保存剤(例えば、ベンジルアルコール、フェノー
ルなど)、酸化防止剤などと配合してもよい。調整され
た注射液は通常、適当なアンプルに充填される。このよ
うにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例え
ば温血哺乳動物(例えば、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブ
タ、ウシ、ネコ、イヌ、サル、ヒトなど、特にヒト)に
対して投与することができる。該DNAの投与量は、症
状などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に
成人(60kgとして)においては、一日につき約0.
1mg〜100mg、好ましくは約1.0〜50mg、
より好ましくは約1.0〜20mgである。非経口的に
投与する場合は、その1回投与量は投与対象、対象臓
器、症状、投与方法などによっても異なるが、たとえば
注射剤の形では通常成人(60kgとして)において
は、一日につき約0.01〜30mg程度、好ましくは
約0.1〜20mg程度、より好ましくは約0.1〜1
0mg程度を静脈注射により投与するのが好都合であ
る。他の動物の場合も、60kg当たりに換算した量を
投与することができる。
Also, a buffering agent (eg, phosphate buffer,
Sodium acetate buffer), soothing agent (eg benzalkonium chloride, procaine hydrochloride etc.), stabilizer (eg human serum albumin, polyethylene glycol etc.), preservative (eg benzyl alcohol, phenol etc.), antioxidant You may mix with an agent etc. The adjusted injection solution is usually filled in a suitable ampoule. Since the preparation thus obtained is safe and has low toxicity, it can be administered to, for example, warm-blooded mammals (eg, rat, rabbit, sheep, pig, cow, cat, dog, monkey, human, especially human). can do. Although the dose of the DNA varies depending on the symptoms and the like, in the case of oral administration, it is generally about 0.
1 mg to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg,
More preferably, it is about 1.0 to 20 mg. In the case of parenteral administration, the single dose varies depending on the administration subject, target organs, symptoms, administration method, etc., but in the case of an injection, for example, in an adult (60 kg), the daily dose is about 1 day. 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 1
It is convenient to administer about 0 mg intravenously. In the case of other animals, the dose converted per 60 kg can be administered.

【0056】(3)ニューロテンシンの定量法 本発明のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質もし
くはその塩、または本発明の部分ペプチドまたはその塩
は、ニューロテンシンに対して結合性を有しているの
で、生体内におけるニューロテンシン濃度を感度良く定
量することができる。すなわち、本発明は、本発明のヒ
ト・ニューロテンシンレセプター蛋白質もしくはその塩
または本発明の部分ペプチドまたはその塩と、被検体と
を接触させることを特徴とする被検体中のニューロテン
シン濃度の定量法を提供する。本発明の定量法は、例え
ば競合法と組み合わせることによって用いることができ
る。具体的には、例えば、以下のまたはなどに記載
の方法あるいはそれに準じる方法に従って用いることが
できる。 入江寛編「ラジオイムノアッセイ」(講談社、昭和4
9年発行) 入江寛編「続ラジオイムノアッセイ」(講談社、昭和
54年発行) さらに、本発明のニューロテンシンの定量法は、ニュー
ロテンシン濃度の増減に起因する疾病(例えば、パーキ
ンソン病、鬱病、痴呆症、多動児性症候群、意識障害、
拒食症、逆行性食道炎、腸炎、すい炎、潰瘍、胃癌、腸
癌、精神病、ハンチントン病、躁病、不安など)の診断
方法としても使用できる。
(3) Method for quantifying neurotensin The human neurotensin receptor protein of the present invention or a salt thereof, or the partial peptide of the present invention or a salt thereof has a binding property to neurotensin, The concentration of neurotensin in the body can be quantified with high sensitivity. That is, the present invention provides a method for quantifying a neurotensin concentration in a subject, which comprises contacting the subject with the human neurotensin receptor protein of the present invention or a salt thereof or the partial peptide of the present invention or a salt thereof. I will provide a. The quantification method of the present invention can be used, for example, in combination with a competitive method. Specifically, for example, it can be used according to the method described below or the like or a method similar thereto. Hiroshi Irie "Radioimmunoassay" (Kodansha, Showa 4
(Published in 1997) edited by Hiroshi Irie "Radioimmunoassay" (Kodansha, published in 1979) Furthermore, the method for quantifying neurotensin of the present invention is a disease caused by an increase or decrease in neurotensin concentration (for example, Parkinson's disease, depression, dementia). , Hyperactive childhood syndrome, consciousness disorder,
Anorexia nervosa, retrograde esophagitis, enteritis, pancreatitis, ulcer, gastric cancer, intestinal cancer, psychosis, Huntington's disease, mania, anxiety, etc.).

【0057】(4)本発明のヒト・ニューロテンシンレ
セプター蛋白質もしくはその塩または本発明のヒト・ニ
ューロテンシンレセプター蛋白質の部分ペプチドもしく
はその塩に対する抗体または抗血清の製造 本発明のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質もし
くはその塩または本発明のヒト・ニューロテンシンレセ
プター蛋白質の部分ペプチドもしくはその塩に対する抗
体(例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗
体)または抗血清は、本発明のヒト・ニューロテンシン
レセプター蛋白質もしくはその塩または本発明のヒト・
ニューロテンシンレセプター蛋白質の部分ペプチドもし
くはその塩を抗原として用い、自体公知の抗体または抗
血清の製造法に従って製造することができる。例えば、
モノクローナル抗体は、後述の方法に従って製造するこ
とができる。 〔モノクローナル抗体の作製〕 (a)モノクロナール抗体産生細胞の作製 本発明のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質もし
くはその塩または本発明のヒト・ニューロテンシンレセ
プター蛋白質の部分ペプチドもしくはその塩(以下、ヒ
ト・ニューロテンシンレセプターと略称する場合があ
る)は、温血動物に対して投与により抗体産生が可能な
部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与され
る。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイ
ントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投
与してもよい。投与は通常2〜6週毎に1回ずつ、計2
〜10回程度行われる。用いられる温血動物としては、
たとえばサル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラ
ット、ヒツジ、ヤギ、ニワトリがあげられるが、マウス
およびラットが好ましく用いられる。
(4) Production of human neurotensin receptor protein of the present invention or a salt thereof, an antibody against a partial peptide of human neurotensin receptor protein of the present invention or a salt thereof, or antiserum Human neurotensin receptor protein of the present invention Alternatively, an antibody (for example, a polyclonal antibody, a monoclonal antibody) or an antiserum to a salt thereof, a partial peptide of the human neurotensin receptor protein of the present invention or a salt thereof is used as the human neurotensin receptor protein of the present invention or a salt thereof or the present invention. The human
Using a partial peptide of the neurotensin receptor protein or a salt thereof as an antigen, it can be produced according to a method known per se for producing an antibody or antiserum. For example,
The monoclonal antibody can be produced according to the method described below. [Preparation of Monoclonal Antibody] (a) Preparation of Monoclonal Antibody-Producing Cell Human neurotensin receptor protein of the present invention or a salt thereof, or partial peptide of human neurotensin receptor protein of the present invention or a salt thereof (hereinafter referred to as human neuron (In some cases, abbreviated as tensin receptor), it is administered to warm-blooded animals at a site where antibody production can be performed by administration, or itself or with a carrier or diluent. Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered to enhance the antibody-producing ability upon administration. Administration is usually once every 2 to 6 weeks for a total of 2
It is performed about 10 times. The warm-blooded animals used are:
Examples thereof include monkeys, rabbits, dogs, guinea pigs, mice, rats, sheep, goats, and chickens, and mice and rats are preferably used.

【0058】モノクローナル抗体産生細胞の作製に際し
ては、抗原を免疫された温血動物、たとえばマウスから
抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の2〜5日後
に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体
産生細胞を骨髄腫細胞と融合させることにより、モノク
ローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することができ
る。抗血清中の抗体価の測定は、例えば後記の標識化ヒ
ト・ニューロテンシンレセプターと抗血清とを反応させ
たのち、抗体に結合した標識剤の活性を測定することに
よりなされる。融合操作は既知の方法、たとえばケーラ
ーとミルスタインの方法〔ネイチャー(Nature)、256、
495 (1975)〕に従い実施できる。融合促進剤としてはポ
リエチレングリコール(PEG)やセンダイウィルスな
どが挙げられるが、好ましくはPEGが用いられる。骨
髄腫細胞としてはたとえばNS−1、P3U1、SP2
/0、AP−1などがあげられるが、P3U1が好まし
く用いられる。用いられる抗体産生細胞(脾臓細胞)数
と骨髄腫細胞数との好ましい比率は1:1〜20:1程
度であり、PEG(好ましくはPEG1000〜PEG
6000)が10〜80%程度の濃度で添加され、20
〜40℃、好ましくは30〜37℃で1〜10分間イン
キュベートすることにより効率よく細胞融合を実施でき
る。
In the preparation of monoclonal antibody-producing cells, warm-blooded animals immunized with an antigen, for example, an individual with an antibody titer was selected from mice, and spleens or lymph nodes were collected 2 to 5 days after the final immunization. By fusing the antibody-producing cells contained therein with myeloma cells, a monoclonal antibody-producing hybridoma can be prepared. The antibody titer in the antiserum is measured, for example, by reacting the labeled human neurotensin receptor described below with the antiserum and then measuring the activity of the labeling agent bound to the antibody. The fusion operation is a known method, for example, the method of Koehler and Milstein [Nature, 256,
495 (1975)]. Examples of the fusion promoter include polyethylene glycol (PEG) and Sendai virus, but PEG is preferably used. Examples of myeloma cells include NS-1, P3U1, SP2
/ 0, AP-1 and the like, but P3U1 is preferably used. The preferred ratio of the number of antibody-producing cells (spleen cells) to the number of myeloma cells used is about 1: 1 to 20: 1, and PEG (preferably PEG1000 to PEG) is used.
6000) is added at a concentration of about 10-80%,
Cell fusion can be efficiently carried out by incubating at -40 ° C, preferably 30-37 ° C for 1-10 minutes.

【0059】抗ヒト・ニューロテンシンレセプター抗体
産生ハイブリドーマのスクリーニングには種々の方法が
使用できるが、たとえばヒト・ニューロテンシンレセプ
ター抗原を直接あるいは担体とともに吸着させた固相
(例、マイクロプレート)にハイブリドーマ培養上清を
添加し、次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グ
ロブリン抗体(細胞融合に用いられる細胞がマウスの場
合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる)または
プロテインAを加え、固相に結合した抗ヒト・ニューロ
テンシンレセプターモノクローナル抗体を検出する方
法、抗免疫グロブリン抗体またはプロテインAを吸着さ
せた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、放射性物
質や酵素などで標識したヒト・ニューロテンシンレセプ
ターを加え、固相に結合した抗ヒト・ニューロテンシン
レセプターモノクローナル抗体を検出する方法などがあ
げられる。抗ヒト・ニューロテンシンレセプターモノク
ローナル抗体の選別は、自体公知あるいはそれに準じる
方法に従って行なうことができる。通常HAT(ヒポキ
サンチン、アミノプテリン、チミジン)を添加した動物
細胞用培地で行なわれる。選別および育種用培地として
は、ハイビリドーマが生育できるものならばどのような
培地を用いても良い。例えば、1〜20%、好ましくは
10〜20%の牛胎児血清を含むRPMI 1640培
地、1〜10%の牛胎児血清を含むGIT培地(和光純
薬工業(株))あるいはハイブリドーマ培養用無血清培
地(SFM−101、日水製薬(株))などを用いるこ
とができる。培養温度は、通常20〜40℃、好ましく
は約37℃である。培養時間は、通常5日〜3週間、好
ましくは1週間〜2週間である。培養は、通常5%炭酸
ガス下で行なわれる。ハイブリドーマ培養上清の抗体価
は、上記の抗血清中の抗ヒト・ニューロテンシンレセプ
ター抗体価の測定と同様にして測定できる。
Various methods can be used for screening the anti-human neurotensin receptor antibody-producing hybridoma. For example, the hybridoma culture is carried out on a solid phase (eg, a microplate) in which the human neurotensin receptor antigen is directly or adsorbed with a carrier. The supernatant is added, and then an anti-immunoglobulin antibody labeled with a radioactive substance or an enzyme (if the cells used for cell fusion is a mouse, an anti-mouse immunoglobulin antibody is used) or protein A is added to the solid phase. Method for detecting bound anti-human neurotensin receptor monoclonal antibody, human neurotensin receptor labeled with radioactive substance or enzyme by adding hybridoma culture supernatant to a solid phase on which anti-immunoglobulin antibody or protein A is adsorbed And bind to the solid phase. A method of detecting an anti-human neurotensin receptor monoclonal antibodies and the like. The anti-human neurotensin receptor monoclonal antibody can be selected according to a method known per se or a method analogous thereto. It is usually carried out in a medium for animal cells supplemented with HAT (hypoxanthine, aminopterin, thymidine). As a medium for selection and breeding, any medium can be used as long as it can grow a hybridoma. For example, RPMI 1640 medium containing 1 to 20%, preferably 10 to 20% fetal bovine serum, GIT medium containing 1 to 10% fetal bovine serum (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) or serum-free for hybridoma culture. A culture medium (SFM-101, Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) or the like can be used. The culture temperature is usually 20 to 40 ° C, preferably about 37 ° C. Cultivation time is usually 5 days to 3 weeks, preferably 1 week to 2 weeks. Culturing is usually performed under 5% carbon dioxide gas. The antibody titer of the hybridoma culture supernatant can be measured in the same manner as the above-mentioned measurement of the anti-human neurotensin receptor antibody titer in the antiserum.

【0060】(b)モノクロナール抗体の精製 抗ヒト・ニューロテンシンレセプターモノクローナル抗
体の分離精製は通常のポリクローナル抗体の分離精製と
同様に免疫グロブリンの分離精製法〔例、塩析法、アル
コール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換
体(例、DEAE)による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ
過法、抗原結合固相あるいはプロテインAあるいはプロ
テインGなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結
合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕に従って行わ
れる。以上の(1)および(2)の方法に従って製造さ
せる本発明のヒト・ニューロテンシンレセプター抗体
は、ヒト・ニューロテンシンレセプターを特異的に認識
することができるので、被検液中のヒト・ニューロテン
シンレセプターの定量、特にサンドイッチ免疫測定法に
よる定量などに使用することができる。すなわち、本発
明は、例えば、(i)本発明のヒト・ニューロテンシン
レセプターに反応する抗体と、被検液および標識化ヒト
・ニューロテンシンレセプターとを競合的に反応させ、
該抗体に結合した標識化ヒト・ニューロテンシンレセプ
ターの割合を測定することを特徴とする被検液中のヒト
・ニューロテンシンレセプターの定量法、(2)被検液
と担体上に不溶化した抗体および標識化された抗体とを
同時あるいは連続的に反応させたのち、不溶化担体上の
標識剤の活性を測定することを特徴とする被検液中のヒ
ト・ニューロテンシンレセプターの定量法において、一
方の抗体がヒト・ニューロテンシンレセプターのN端部
を認識する抗体で、他方の抗体がヒト・ニューロテンシ
ンレセプターのC端部に反応する抗体であることを特徴
とする被検液中のヒト・ニューロテンシンレセプターの
定量法を提供する。
(B) Purification of monoclonal antibody The isolation and purification of the anti-human neurotensin receptor monoclonal antibody is carried out in the same manner as the usual isolation and purification of a polyclonal antibody [eg, salting out, alcohol precipitation, Isoelectric focusing method, electrophoresis method, adsorption / desorption method using ion exchanger (eg, DEAE), ultracentrifugation method, gel filtration method, antigen-binding solid phase or active antibody such as protein A or protein G Specific purification method of collecting and dissociating the bond to obtain an antibody]. Since the human neurotensin receptor antibody of the present invention produced according to the above methods (1) and (2) can specifically recognize the human neurotensin receptor, human neurotensin in a test solution is It can be used for quantification of a receptor, particularly by a sandwich immunoassay. That is, the present invention provides, for example, (i) an antibody that reacts with the human neurotensin receptor of the present invention, a test solution and a labeled human neurotensin receptor in a competitive reaction,
A method for quantifying human neurotensin receptor in a test solution, which comprises measuring the proportion of labeled human neurotensin receptor bound to the antibody, (2) an antibody insolubilized on the test solution and a carrier, and In the method for quantifying human neurotensin receptor in a test solution, the activity of the labeling agent on the insolubilized carrier is measured after simultaneous or continuous reaction with a labeled antibody, Human neurotensin in a test solution, wherein the antibody is an antibody that recognizes the N-terminal portion of the human neurotensin receptor and the other antibody is an antibody that reacts with the C-terminal portion of the human neurotensin receptor A method for quantifying a receptor is provided.

【0061】本発明のヒト・ニューロテンシンレセプタ
ーを認識するモノクローナル抗体(以下、抗ヒト・ニュ
ーロテンシンレセプター抗体と称する場合がある)を用
いてヒト・ニューロテンシンレセプターの測定を行なえ
るほか、組織染色等による検出を行なうこともできる。
これらの目的には、抗体分子そのものを用いてもよく、
また、抗体分子のF(ab')2 、Fab'、あるいはFa
b画分を用いてもよい。本発明の抗体を用いる測定法
は、 特に制限されるべきものではなく、被測定液中の
抗原量(例えばヒト・ニューロテンシンレセプター量)
に対応した抗体、抗原もしくは抗体−抗原複合体の量を
化学的または物理的手段により検出し、これを既知量の
抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出す
る測定法であれば、いずれの測定法を用いてもよい。例
えば、ネフロメトリー、競合法、イムノメトリック法お
よびサンドイッチ法が好適に用いられるが、感度、特異
性の点で、後述するサンドイッチ法を用いるのが特に好
ましい。標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤と
しては、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質な
どが挙げられる。放射性同位元素としては、例えば〔
125I〕、〔131I〕、〔3H〕、〔14C〕などが、上記
酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、
例えばβ−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、ア
ルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸
脱水素酵素等が、蛍光物質としては、フルオレスカミ
ン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが、発光物
質としては、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェ
リン、ルシゲニンなどがそれぞれ挙げられる。さらに、
抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビオチン−アビジ
ン系を用いることもできる。
The human neurotensin receptor can be assayed using the monoclonal antibody of the present invention that recognizes the human neurotensin receptor (hereinafter sometimes referred to as anti-human neurotensin receptor antibody), and tissue staining, etc. Can also be detected.
For these purposes, the antibody molecule itself may be used,
In addition, F (ab ′) 2 , Fab ′, or Fa of the antibody molecule
Fraction b may be used. The measurement method using the antibody of the present invention is not particularly limited, and the amount of antigen in the liquid to be measured (eg, human neurotensin receptor amount)
If the measurement method is to detect the amount of the antibody, antigen or antibody-antigen complex corresponding to the above by chemical or physical means and calculate this from a standard curve prepared using a standard solution containing a known amount of antigen, Any of the measurement methods may be used. For example, nephrometry, competitive method, immunometric method and sandwich method are preferably used, but from the viewpoint of sensitivity and specificity, the sandwich method described later is particularly preferably used. Examples of the labeling agent used in the measurement method using a labeling substance include radioisotopes, enzymes, fluorescent substances, luminescent substances and the like. Examples of radioactive isotopes include [
125 I], [ 131 I], [ 3 H], [ 14 C] and the like are preferable as the above-mentioned enzyme, which is stable and has a large specific activity.
For example, β-galactosidase, β-glucosidase, alkaline phosphatase, peroxidase, malate dehydrogenase and the like, as the fluorescent substance, fluorescamine, fluorescein isothiocyanate and the like, and as the luminescent substance, luminol, luminol derivative, luciferin. , Lucigenin and the like. further,
The biotin-avidin system can also be used for binding the antibody or antigen to the labeling agent.

【0062】抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、物
理吸着を用いてもよく、また通常蛋白質あるいは酵素等
を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を用いる
方法でもよい。担体としては、アガロース、デキストラ
ン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポリスチレン、ポ
リアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、あるいはガ
ラス等が挙げられる。サンドイッチ法においては不溶化
した抗ヒト・ニューロテンシンレセプター抗体に被検液
を反応させ(1次反応)、さらに標識化抗ヒト・ニュー
ロテンシンレセプター抗体を反応させ(2次反応)たの
ち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することにより
被検液中のヒト・ニューロテンシンレセプター量を定量
することができる。1次反応と2次反応は逆の順序に行
っても、また、同時に行なってもよいし時間をずらして
行なってもよい。標識化剤および不溶化の方法は前記の
それらに準じることができる。また、サンドイッチ法に
よる免疫測定法において、固相用抗体あるいは標識用抗
体に用いられる抗体は必ずしも1種類である必要はな
く、測定感度を向上させる等の目的で2種類以上の抗体
の混合物を用いてもよい。本発明のサンドイッチ法によ
るヒト・ニューロテンシンレセプターの測定法において
は、1次反応と2次反応に用いられる抗ヒト・ニューロ
テンシンレセプター抗体はヒト・ニューロテンシンレセ
プターの結合する部位が相異なる抗体が好ましく用いら
れる。即ち、1次反応および2次反応に用いられる抗体
は、例えば、2次反応で用いられる抗体が、ヒト・ニュ
ーロテンシンレセプターのC端部を認識する場合、1次
反応で用いられる抗体は、好ましくはC端部以外、例え
ばN端部を認識する抗体が用いられる。
For the insolubilization of an antigen or an antibody, physical adsorption may be used, or a method using a chemical bond which is usually used for insolubilizing or immobilizing proteins or enzymes. Examples of the carrier include insoluble polysaccharides such as agarose, dextran and cellulose, synthetic resins such as polystyrene, polyacrylamide and silicon, and glass. In the sandwich method, the insolubilized anti-human neurotensin receptor antibody is reacted with the test solution (first reaction), and further the labeled anti-human neurotensin receptor antibody is reacted (second reaction), and then on the insolubilized carrier. The amount of human neurotensin receptor in the test solution can be quantified by measuring the activity of the labeling agent. The primary reaction and the secondary reaction may be carried out in the reverse order, may be carried out simultaneously, or may be carried out at different times. The labeling agent and the method of insolubilization can be the same as those described above. Further, in the immunoassay method by the sandwich method, the antibody used for the solid phase antibody or the labeling antibody does not necessarily have to be one type, and a mixture of two or more types of antibodies may be used for the purpose of improving the measurement sensitivity. May be. In the method for measuring human neurotensin receptor by the sandwich method of the present invention, the anti-human neurotensin receptor antibodies used in the primary reaction and the secondary reaction are preferably antibodies having different binding sites for human neurotensin receptors. Used. That is, the antibody used in the primary reaction and the secondary reaction is preferably, for example, when the antibody used in the secondary reaction recognizes the C-terminal portion of the human neurotensin receptor, the antibody used in the primary reaction is preferably An antibody that recognizes an N-terminal other than the C-terminal is used.

【0063】本発明のヒト・ニューロテンシンレセプタ
ー抗体をサンドイッチ法以外の測定システム、例えば、
競合法、イムノメトリック法あるいはネフロメトリーな
どに用いることができる。競合法では、被検液中の抗原
と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応させたのち、
未反応の標識抗原と(F)と抗体と結合した標識抗原
(B)とを分離し(B/F分離)、B,Fいずれかの標
識量を測定し、被検液中の抗原量を定量する。本反応法
には、抗体として可溶性抗体を用い、B/F分離をポリ
エチレングリコール、前記抗体に対する第2抗体などを
用いる液相法、および、第1抗体として固相化抗体を用
いるか、あるいは、第1抗体は可溶性のものを用い第2
抗体として固相化抗体を用いる固相化法とが用いられ
る。イムノメトリック法では、被検液中の抗原と固相化
抗原とを一定量の標識化抗体に対して競合反応させた後
固相と液相を分離するか、あるいは、被検液中の抗原と
過剰量の標識化抗体とを反応させ、次に固相化抗原を加
え未反応の標識化抗体を固相に結合させたのち、固相と
液相を分離する。次に、いずれかの相の標識量を測定し
被検液中の抗原量を定量する。また、ネフロメトリーで
は、ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果生じた
不溶性の沈降物の量を測定する。被検液中の抗原量僅か
であり、少量の沈降物しか得られない場合にもレーザー
の散乱を利用するレーザーネフロメトリーなどが好適に
用いられる。
The human neurotensin receptor antibody of the present invention may be assayed by a measuring system other than the sandwich method, for example,
It can be used for competitive methods, immunometric methods, nephrometry, and the like. In the competitive method, after the antigen in the test liquid and the labeled antigen are reacted competitively with the antibody,
The unreacted labeled antigen, (F) and the labeled antigen (B) bound to the antibody are separated (B / F separation), the labeled amount of either B or F is measured, and the amount of antigen in the test solution is determined. Quantify. In this reaction method, a soluble antibody is used as an antibody, B / F separation is performed by a liquid phase method using polyethylene glycol, a second antibody against the antibody, or the like, and a solid-phased antibody is used as the first antibody, or The first antibody should be soluble and the second
A solid phase immobilization method using a solid phase immobilization antibody as an antibody is used. In the immunometric method, the antigen in the test liquid and the solid-phased antigen are competitively reacted with a fixed amount of the labeled antibody and then the solid phase and the liquid phase are separated, or the antigen in the test liquid is separated. After reacting with an excess amount of the labeled antibody and then adding the immobilized antigen to bind the unreacted labeled antibody to the solid phase, the solid phase and the liquid phase are separated. Next, the labeled amount of either phase is measured to quantify the amount of antigen in the test liquid. In nephrometry, the amount of insoluble precipitate produced as a result of the antigen-antibody reaction in the gel or in the solution is measured. Even when the amount of antigen in the test liquid is small and only a small amount of precipitate is obtained, laser nephrometry utilizing laser scattering is preferably used.

【0064】これら個々の免疫学的測定法を本発明の測
定方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の
設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の
条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えてヒト
・ニューロテンシンレセプターの測定系を構築すればよ
い。これらの一般的な技術手段の詳細については、総
説、成書などを参照することができる〔例えば、入江
寛編「ラジオイムノアッセイ〕(講談社、昭和49年発
行)、入江 寛編「続ラジオイムノアッセイ〕(講談
社、昭和54年発行)、石川栄治ら編「酵素免疫測定
法」(医学書院、昭和53年発行)、石川栄治ら編「酵
素免疫測定法」(第2版)(医学書院、昭和57年発
行)、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」(第3版)(医
学書院、昭和62年発行)、「Methods in ENZYMOLOGY」
Vol. 70(Immunochemical Techniques(Part A))、 同書
Vol. 73(Immunochemical Techniques(Part B))、 同書
Vol. 74(Immunochemical Techniques(Part C))、 同書
Vol. 84(Immunochemical Techniques(Part D:Selected
Immunoassays))、 同書 Vol. 92(Immunochemical Tech
niques(Part E:Monoclonal Antibodies and General Im
munoassay Methods))、 同書Vol. 121(Immunochemical
Techniques(Part I:Hybridoma Technology and Monoclo
nal Antibodies))(以上、アカデミックプレス社発行)な
ど参照〕。以上のように、本発明のヒト・ニューロテン
シンレセプター抗体を用いることによって、ヒト・ニュ
ーロテンシンレセプターを感度良く定量することができ
る。
In applying these individual immunological assay methods to the assay method of the present invention, it is not necessary to set special conditions, operations and the like. The measurement system for the human neurotensin receptor may be constructed by adding ordinary technical consideration to those skilled in the art to ordinary conditions and operating methods in each method. For details of these general technical means, reference can be made to reviews, books, etc. [eg Irie
Hiroshi "Radioimmunoassay" (Kodansha, published in 1974), Hiroshi Irie "Radioimmunoassay" (Kodansha, published in 1979), Eiji Ishikawa et al., "Enzyme Immunoassay" (Medical Shoin, published in 1978) ), Eiji Ishikawa et al. “Enzyme Immunoassay” (second edition) (Medical Shoin, 1982 issue), Eiji Ishikawa et al. “Enzyme Immunoassay” (3rd edition) (Medicine Shoin, 1987 issue) ), "Methods in ENZYMOLOGY"
Vol. 70 (Immunochemical Techniques (Part A)), ibid
Vol. 73 (Immunochemical Techniques (Part B)), ibid.
Vol. 74 (Immunochemical Techniques (Part C)), ibid.
Vol. 84 (Immunochemical Techniques (Part D: Selected
Immunoassays)), Vol. 92 (Immunochemical Tech)
niques (Part E: Monoclonal Antibodies and General Im
munoassay Methods)), ibid Vol. 121 (Immunochemical
Techniques (Part I: Hybridoma Technology and Monoclo
nal Antibodies)) (above, issued by Academic Press) etc.). As described above, by using the human neurotensin receptor antibody of the present invention, the human neurotensin receptor can be quantified with high sensitivity.

【0065】本明細書および図面において、塩基やアミ
ノ酸などを略号で表示する場合、IUPAC−IUB
Commission on Biochemical Nomenclature による略号
あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであ
り、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体
があり得る場合は、特に明示しなければL体を示すもの
とする。 DNA :デオキシリボ核酸 cDNA :相補的デオキシリボ核酸 A :アデニン T :チミン G :グアニン C :シトシン RNA :リボ核酸 mRNA :メッセンジャーリボ核酸 dATP :デオキシアデノシン三リン酸 dTTP :デオキシチミジン三リン酸 dGTP :デオキシグアノシン三リン酸 dCTP :デオキシシチジン三リン酸
In the present specification and drawings, when an abbreviation is used for a base or amino acid, IUPAC-IUB is used.
It is based on the abbreviations by the Commission on Biochemical Nomenclature or the abbreviations commonly used in this field, and examples are given below. When amino acids may have optical isomers, the L form is shown unless otherwise specified. DNA: deoxyribonucleic acid cDNA: complementary deoxyribonucleic acid A: adenine T: thymine G: guanine C: cytosine RNA: ribonucleic acid mRNA: messenger ribonucleic acid dATP: deoxyadenosine triphosphate dTTP: deoxythymidine triphosphate dGTP: deoxyguanosine Phosphoric acid dCTP: Deoxycytidine triphosphate

【0066】 ATP :アデノシン三リン酸 EDTA :エチレンジアミン四酢酸 SDS :ドデシル硫酸ナトリウム EIA :エンザイムイムノアッセイ Gly :グリシン Ala :アラニン Val :バリン Leu :ロイシン Ile :イソロイシン Ser :セリン Thr :スレオニン Cys :システイン Met :メチオニン Glu :グルタミン酸 Asp :アスパラギン酸ATP: adenosine triphosphate EDTA: ethylenediaminetetraacetic acid SDS: sodium dodecyl sulfate EIA: enzyme immunoassay Gly: glycine Ala: alanine Val: valine Leu: leucine Ile: isoleucine Ser: serine thynin: threon: threon: threon: threon: threon: threon: threon: threon: threon Glu: Glutamic acid Asp: Aspartic acid

【0067】 Lys :リジン Arg :アルギニン His :ヒスチジン Phe :フェニルアラニン Tyr :チロシン Trp :トリプトファン Pro :プロリン Asn :アスパラギン Gln :グルタミン pGlu :ピログルタミン酸 Me :メチル基 Et :エチル基 Bu :ブチル基 Ph :フェニル基 TC :チアゾリジン−4(R)−カルボキ
サミド基
Lys: lysine Arg: arginine His: histidine Phe: phenylalanine Tyr: tyrosine Trp: tryptophan Pro: proline Asn: asparagine Gln: glutamine pGlu: pyroglutamic acid Me: phenyl group: P: ethyl group: phenyl group Et: phenyl group Et: TC: thiazolidine-4 (R) -carboxamide group

【0068】本願明細書の配列表の配列番号は、以下の
配列を示す。 〔配列番号:1〕本発明のヒト・ニューロテンシンレセ
プター蛋白質のアミノ酸配列を示す。 〔配列番号:2〕本発明のヒト・ニューロテンシンレセ
プター蛋白質をコードするDNAの塩基配列を示す。 〔配列番号:3〕本発明のヒト・ニューロテンシンレセ
プター蛋白質をコードするcDNAのスクリーニングに
使用した合成DNA 〔配列番号:4〕本発明のヒト・ニューロテンシンレセ
プター蛋白質をコードするcDNAのスクリーニングに
使用した合成DNA
The sequence numbers in the sequence listing in this specification show the following sequences. [SEQ ID NO: 1] This shows the amino acid sequence of the human neurotensin receptor protein of the present invention. [SEQ ID NO: 2] This shows the base sequence of DNA encoding the human neurotensin receptor protein of the present invention. [SEQ ID NO: 3] Synthetic DNA used for screening cDNA encoding human neurotensin receptor protein of the present invention [SEQ ID NO: 4] Used for screening cDNA encoding human neurotensin receptor protein of the present invention Synthetic DNA

【0069】後述の実施例2で得られたプラスミドpT
S861を保持する形質転換体エシェリヒア コリ(Es
cherichia coli) DH10B/pTS861は、平成6
年11月24日から通商産業省工業技術院生命工学工業
技術研究所(NIBH)に寄託番号FERM BP−
4898として寄託されている。また、後述の実施例3
で得られたプラスミドpTS861を保持する形質転換
体CHO/pTS861-1-2E6は、平成6年11月
24日から通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究
所(NIBH)に寄託番号FERM BP− 4899
として寄託されている。
Plasmid pT obtained in Example 2 described below
The transformant Escherichia coli carrying S861 (Es
cherichia coli) DH10B / pTS861 is
Deposit number FERM BP- from the Ministry of International Trade and Industry, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (NIBH)
Deposited as 4898. In addition, Example 3 described later
The transformant CHO / pTS861-1-2E6 carrying the plasmid pTS861 obtained in (1) was deposited with the deposit number FERM BP- at the Institute of Biotechnology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (NIBH) from November 24, 1994. 4899
Has been deposited as.

【0070】[0070]

【実施例】以下に、実施例を挙げて本発明をさらに具体
的に説明するが、本発明がそれに限定されるものではな
い。なお、大腸菌を用いての遺伝子操作法は、成書(Ma
niatisら、モレキュラー・クローニング〔Molecular Cl
oning〕、Cold Spring Harbor Laboratory、1989年)に
記載されている方法に従った。
EXAMPLES The present invention will be described in more detail below with reference to examples, but the present invention is not limited thereto. The gene manipulation method using E. coli is described in
niatis et al., Molecular cloning [Molecular Cl
oning], Cold Spring Harbor Laboratory, 1989).

【0071】[0071]

【実施例1】ヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質
cDNAのクローニングヒト colon adenocarcinoma H
T-29細胞を10%ウシ胎児血清を含む高グルコース
DMEM培地を用いて37℃、95% air/5%CO2
条件下で培養し、ほぼコンフルエントになったところ
で、グアニジン-イソチオシアネート法によって全RN
Aを調製した。ここで得られた全RNAからオリゴ(d
T)セルロースカラムによってポリA+RNA画分を調
製した。このポリA+RNA10μgをランダムヘキサ
マーと逆転写酵素を用いて first strand DNAを合成
した後、E. coli DNA polymerase I、RNase
Hを用いて second strand DNAを合成し、ポリA+
NAから二本鎖cDNAを得た。この二本鎖DNAをT
4 DNA polymerase で処理し末端を平滑化した後、
EcoRIアダプターを付加した。この両末端にEco
RIアダプターが付加された二本鎖DNAをゲル濾過に
よって、約400bp以下のcDNAを除去した後、T
4 polynucleotide kinase を用いてEcoRIアダプ
ターにリン酸基を導入した。次に、このcDNAをλg
t11 EcoRIアームに組み込んだ後、in vitro パ
ッケージングを行ない、全体で約3×106pfuのH
T-29細胞のcDNAライブラリーを作製した。この
cDNAライブラリーのλファージを大腸菌Y1090
株に感染させた後、軟寒天プレート上に約1×104
ラークずつまき、42℃で一晩インキュベートしてプラ
ークを形成させた。プラークをニトロセルロースフィル
ター上に移した後、変性溶液〔0.5N 水酸化ナトリウ
ム,1.5M 塩化ナトリウム〕、中和溶液〔0.5M ト
リス-塩酸(pH 7.0), 1.5M 塩化ナトリウム〕、
3×SSC〔20×SSC=3M 塩化ナトリウム, 0.
3M クエン酸ナトリウム〕で順次処理し、風乾後80
℃で3時間焼き付けを行ない、ファージDNAをニトロ
セルロースフィルター上に固定した。
Example 1 Cloning of human neurotensin receptor protein cDNA Human colon adenocarcinoma H
T-29 cells were cultured in a high glucose DMEM medium containing 10% fetal bovine serum at 37 ° C and 95% air / 5% CO 2.
After culturing under the conditions and becoming almost confluent, the total RN was analyzed by the guanidine-isothiocyanate method.
A was prepared. From the total RNA obtained here, oligo (d
T) Poly A + RNA fraction was prepared by cellulose column. 10 μg of this poly A + RNA was used to synthesize first strand DNA using random hexamer and reverse transcriptase, and then E. coli DNA polymerase I, RNase
Second strand DNA was synthesized using H and poly A + R
Double-stranded cDNA was obtained from NA. This double-stranded DNA is
4 After treatment with DNA polymerase to blunt the ends,
An EcoRI adapter was added. Eco at both ends
The double-stranded DNA to which the RI adapter was added was removed by gel filtration to remove cDNA of about 400 bp or less, and then T
A phosphate group was introduced into the EcoRI adapter using 4 polynucleotide kinase. Next, this cDNA is λg
After assembling into t11 EcoRI arm, in vitro packaging was performed, and the total H of about 3 × 10 6 pfu was obtained.
A cDNA library of T-29 cells was prepared. The λ phage of this cDNA library was transformed into E. coli Y1090.
After infection with the strain, approximately 1 × 10 4 plaques were plated on soft agar plates and incubated at 42 ° C. overnight to form plaques. After transferring the plaques onto a nitrocellulose filter, denaturing solution [0.5N sodium hydroxide, 1.5M sodium chloride], neutralizing solution [0.5M Tris-hydrochloric acid (pH 7.0), 1.5M sodium chloride] ],
3 × SSC [20 × SSC = 3M sodium chloride, 0.
3M sodium citrate] and dried in air for 80
The phage DNA was fixed on a nitrocellulose filter by baking at 3 ° C for 3 hours.

【0072】一方、プローブとして用いるために公知の
ヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質cDNA〔Vi
ta, N. et al. フェブス・レター(FEBS Lett.) 317,
139-142 (1993)〕の塩基配列に基づき合成オリゴヌクレ
オチドおよびを合成した。は5'−CGGACA
GAGCCGCGGGACTCCAGCGCCCACC
ATGCGCCTCA−3'(配列番号:3)であり、
−30〜+10(翻訳開始部位を+1とする。)センス
配列を含む合成オリゴヌクレオチドである。は5'−
TCCTCCTGGACACGTTCCGGGGCGC
ACAGC−3'(配列番号:4)であり+1258〜
+1287のアンチセンス配列を含む合成オリゴヌクレ
オチドである。これらおよびの合成オリゴヌクレオ
チドを、〔γ-32P〕ATPとT4 polynucleotide kin
ase を用いることによって標識した。ファージDNAを
固定したフィルターを,両方の合成オリゴヌクレオ
チド標識プローブを含むハイブリダイゼーション用緩衝
液〔2×SSC, 10× Denhardt's液, 150μg/m
l熱変性サケ精子DNA, 670μg/ml酵母RN
A〕中58℃でハイブリダイゼーションを行なった。フ
ィルターは最終的に2×SSC,0.1% SDS液中5
5℃で洗浄後、オートラジオグラムをとってプローブと
ハイブリダイゼーションするプラークを検索した。
On the other hand, a known human neurotensin receptor protein cDNA [Vi [Vi
ta, N. et al. FEBS Lett. 317,
139-142 (1993)] based on the nucleotide sequence of synthetic oligonucleotides and. Is 5'-CGGACA
GAGCCGCGGGGACTCCAGCGCCCACC
ATGCGCCTCA-3 ′ (SEQ ID NO: 3),
-30 to +10 (translation initiation site is +1) A synthetic oligonucleotide containing a sense sequence. Is 5'-
TCCTCCTGGACACGTTCCGGGGCGC
ACAGC-3 '(SEQ ID NO: 4) and + 1258-
Synthetic oligonucleotide containing +1287 antisense sequence. These and the synthetic oligonucleotides of these were prepared using [γ- 32 P] ATP and T4 polynucleotide kin.
Labeled by using ase. The filter on which the phage DNA was immobilized was used as a hybridization buffer containing both synthetic oligonucleotide-labeled probes [2 x SSC, 10 x Denhardt's solution, 150 µg / m
l Heat-denatured salmon sperm DNA, 670 μg / ml yeast RN
Hybridization was carried out in A] at 58 ° C. The filter was finally 5x in 2xSSC, 0.1% SDS solution.
After washing at 5 ° C., an autoradiogram was taken to search for plaques that hybridize with the probe.

【0073】この方法により得られたファージクローン
λhNTR84からファージDNAを抽出した後、制限
酵素EcoRIで消化してcDNA断片を切り出し、p
UC118プラスミドのEcoRI部位に挿入してph
NTR84-14を得た。挿入されているcDNA断片
の塩基配列を〔α-32P〕dCTPを用いて通常の方法
で決定したところ、このcDNA断片は配列番号:2で
表わされる塩基配列を有する2141bpから成ること
がわかった。報告されているヒト・ニューロテンシンレ
セプター蛋白質cDNAの塩基配列〔Vita, N. et al.
フェブス・レター(FEBS Lett.) 317, 139-142 (199
3)〕と比較すると3カ所の塩基置換が見られた。1カ所
は〔図2〕の第360番目の塩基T→A、2カ所目は
〔図2〕の第920番目のA→G、3カ所目は〔図2〕
の第1329番目の塩基A→Gであった。このうち、2
カ所目と3カ所目の塩基置換は翻訳領域の中にあり、2
カ所目の置換はサイレントな変異63Lys(AAA)→
63Lys(AAG)であったが、3カ所目の変異はアミ
ノ酸置換を伴うもの200Thr(ACG)→200Ala
(GCG)であった〔配列番号:1および図1〕。以上
のようにして、ヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白
質cDNA断片を含むプラスミドphNTR84-14
を得た。
Phage DNA was extracted from the phage clone λhNTR84 obtained by this method and then digested with a restriction enzyme EcoRI to cut out a cDNA fragment.
Ph at the EcoRI site of the UC118 plasmid
NTR84-14 was obtained. The nucleotide sequence of the inserted cDNA fragment was determined by an ordinary method using [α- 32 P] dCTP, and it was found that this cDNA fragment consisted of 2141 bp having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2. . Reported nucleotide sequence of human neurotensin receptor protein cDNA [Vita, N. et al.
FEBS Lett. 317, 139-142 (199
3)], three base substitutions were found. The first position is the base T → A at the 360th position in [Fig. 2], the second position is the A → G position at 920th in [Fig. 2], and the third position is [Fig. 2].
Was the 1329th base A → G. Of these, 2
The base substitutions at position 3 and 3 are in the translation region, and
Substitution at position 6 is silent mutation 63 Lys (AAA) →
It was 63 Lys (AAG), but the third mutation was accompanied by amino acid substitution 200 Thr (ACG) → 200 Ala
(GCG) [SEQ ID NO: 1 and FIG. 1]. As described above, the plasmid phNTR84-14 containing the human neurotensin receptor protein cDNA fragment
I got

【0074】[0074]

【実施例2】ヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質
cDNAの発現プラスミドの構築 実施例1で得たヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白
質cDNA断片を含むプラスミドphNTR84-14
から、〔図3〕のようにしてヒト・ニューロテンシンレ
セプター蛋白質cDNA発現プラスミドを作製した。ま
ず、phNTR84-14を制限酵素SacIIで消化
し、得られた約440bpのDNA断片をT4 DNA
polymerase 処理を行って平滑末端化した後、EcoR
Iリンカーを付加した。次に、このDNA断片をEco
RIで消化した後、pUC119プラスミドのEcoR
I部位に導入し、ヒト・ニューロテンシンレセプター蛋
白質cDNAの翻訳領域のN末端部分をサブクローニン
グした。次に、DNAメチラーゼ欠損株の大腸菌SCS
110(dam-,dcm-)から取得したヒト・ニュー
ロテンシンレセプター蛋白質cDNA断片を含むプラス
ミドphNTR84-14を制限酵素StuIで消化し
た後、XbaIリンカーを付加し、次に、XbaI、M
luIの二重消化を行ない、ヒト・ニューロテンシンレ
セプター蛋白質cDNAの翻訳領域のC末端部分を含む
約1.4kbp DNA断片を得た。
Example 2 Construction of Expression Plasmid for Human Neurotensin Receptor Protein cDNA cDNA The plasmid phNTR84-14 containing the human neurotensin receptor protein cDNA fragment obtained in Example 1
From the above, a human neurotensin receptor protein cDNA expression plasmid was prepared as shown in FIG. First, phNTR84-14 was digested with a restriction enzyme SacII, and the obtained DNA fragment of about 440 bp was digested with T4 DNA.
After blunting with polymerase, EcoR
I linker was added. Next, this DNA fragment is Eco
After digestion with RI, EcoR of pUC119 plasmid
It was introduced into the I site, and the N-terminal portion of the translation region of human neurotensin receptor protein cDNA was subcloned. Next, a DNA methylase-deficient strain of Escherichia coli SCS
The plasmid phNTR84-14 containing the human neurotensin receptor protein cDNA fragment obtained from 110 (dam , dcm ) was digested with the restriction enzyme StuI, XbaI linker was added, and then XbaI and M were added.
Double digestion of luI was carried out to obtain an about 1.4 kbp DNA fragment containing the C-terminal portion of the translation region of human neurotensin receptor protein cDNA.

【0075】このヒト・ニューロテンシンレセプター蛋
白質cDNAの翻訳領域のC末端部分を含む約1.4k
bp XbaI、MluI断片を、上記で得たヒト・ニ
ューロテンシンレセプター蛋白質cDNAの翻訳領域の
N末端部分をサブクローニングしたプラスミドのXba
I、MluI部位に導入し、ヒト・ニューロテンシンレ
セプター蛋白質cDNAのほぼ翻訳領域のみをサブクロ
ーニングしたプラスミドpTS858を得た。さらに、
翻訳領域のN末端部分にSalI部位を導入するため
に、pTS858をEcoRI、HindIIIの二重消
化したDNA断片をpGEM9Zf(-)のEcoRI、
HindIII部位に導入したプラスミドpTS859を
得た。
Approximately 1.4 k containing the C-terminal portion of the translation region of this human neurotensin receptor protein cDNA
bp XbaI, MluI fragment was subcloned into the N-terminal portion of the translation region of the human neurotensin receptor protein cDNA obtained above to obtain a plasmid Xba
A plasmid pTS858 was obtained by subcloning almost the translation region of the human neurotensin receptor protein cDNA by introducing into the I and MluI sites. further,
In order to introduce a SalI site into the N-terminal portion of the translation region, pTS858 was EcoRI, HindIII double digested DNA fragment was pGEM9Zf (-) EcoRI,
A plasmid pTS859 introduced into the HindIII site was obtained.

【0076】発現ベクターとしてはpAKKO 1.11
(図3ではpA1-11と表記されている)を用いた。
pAKKO 1.11は次のようにして構築した。特開平
5−076385公報に記載のpTB1417からHi
ndIIIおよびClaI処理によってSRαプロモータ
ーおよびpolyA付加シグナルを含む1.4kbのD
NA断片を得た。また、pTB348(Naruo, K. et a
l. バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサ
ーチ・コミュニケーションズ(Biochem. Biophys. Res.
Commun.)128, 256-264(1985))からClaIおよびS
alI処理によりジヒドロ葉酸還元酵素(dhfr)遺
伝子を含む4.5kbのDNA断片を得た。これらのD
NA断片をT4ポリメラーゼ処理により末端を平滑末端
にした後、T4ライゲースにより連結し、pAKKO
1.11プラスミドを構築した。プラスミドpTS85
9をSalI消化して得られた約1.4kbpのヒト・
ニューロテンシンレセプター蛋白質cDNAの翻訳領域
を含むSalI DNA断片をpAKKO 1.11のS
alI部位に順方向に導入し、ヒト・ニューロテンシン
レセプター蛋白質cDNA発現プラスミドpTS861
を得た。この発現プラスミドpTS861を大腸菌に形
質転換し、形質転換体 エシェリヒア コリ(Escherich
ia coli)DH10B/pTS861を得た。
As an expression vector, pAKKO 1.11
(Indicated as pA1-11 in FIG. 3) was used.
pAKKO 1.11 was constructed as follows. From pTB1417 described in JP-A-5-076385 to Hi
1.4 kb D containing SRα promoter and polyA addition signal by ndIII and ClaI treatment
An NA fragment was obtained. In addition, pTB348 (Naruo, K. et a
l. Biochemical and Biophysical Research Communications (Biochem. Biophys. Res.
Commun.) 128, 256-264 (1985)) to ClaI and S
By treatment with alI, a 4.5 kb DNA fragment containing the dihydrofolate reductase (dhfr) gene was obtained. These D
The NA fragment was treated with T4 polymerase to make the ends blunt, and then ligated with T4 ligase to prepare pAKKO.
The 1.11 plasmid was constructed. Plasmid pTS85
Human of about 1.4 kbp obtained by digesting 9 with SalI
A SalI DNA fragment containing the translation region of the neurotensin receptor protein cDNA was added to pAKKO 1.11 S.
Human neurotensin receptor protein cDNA expression plasmid pTS861 introduced in the forward direction into the aI1 site
I got Escherichia coli was transformed with this expression plasmid pTS861 and transformed into Escherichia coli (Escherichia coli).
ia coli) DH10B / pTS861 was obtained.

【0077】[0077]

【実施例3】ヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質
cDNAのCHO(dhfr-)細胞での発現 CHO(dhfr-)細胞5×104〜1×106細胞を
段階的に細胞数を変えて直径10cmのシャーレに4枚ま
き、10%ウシ胎児血清を含むハムF12培地で24時
間培養した。この細胞に、実施例1で得たヒト・ニュー
ロテンシンレセプター蛋白質cDNA発現プラスミドp
TS861 1.5μgをリン酸カルシウム法を用いてト
ランスフェクションを行なった。トランスフェクション
後24時間後に10%透析ウシ胎児血清を含むDMEM
培地に培地を交換してプラスミドが染色体に組み込まれ
た細胞を選択した。選択された細胞のコロニーをクロー
ニングした後、さらに、限界希釈法によって単一細胞か
らクローニングし、ヒト・ニューロテンシンレセプター
蛋白質を安定に高発現する細胞株CHO/pTS861
-1-2E6、CHO/pTS861-24-2C5の2ク
ローンを得た。
Example 3 Expression of Human Neurotensin Receptor Protein cDNA in CHO (dhfr ) Cells CHO (dhfr ) cells 5 × 10 4 to 1 × 10 6 cells having a diameter of 10 cm were gradually changed. Four pieces were spread on a petri dish and cultured in Ham's F12 medium containing 10% fetal bovine serum for 24 hours. Into these cells, the human neurotensin receptor protein cDNA expression plasmid p obtained in Example 1 was added.
1.5 μg of TS861 was transfected using the calcium phosphate method. DMEM containing 10% dialyzed fetal bovine serum 24 hours after transfection
The medium was exchanged with a medium and cells in which the plasmid was integrated into the chromosome were selected. A cell line CHO / pTS861 that stably expresses a human neurotensin receptor protein after cloning selected colonies of cells and then cloning from a single cell by limiting dilution method.
Two clones of -1-2E6 and CHO / pTS861-24-2C5 were obtained.

【0078】[0078]

【実施例4】ヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質
活性の測定 ヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質発現細胞を1
2穴プレートにまき、10%透析ウシ胎児血清を含むD
MEM培地を用いて37℃、95% air/5%CO2
件下でコンフルエントになるまで培養し、結合実験を行
う前日に培地交換を行なった。〔125I〕ニューロテン
シンに対する結合実験は以下のようにして行った。ま
ず、細胞を37℃に暖めた結合測定用緩衝液(0.1%
BSA,1mM オルソフェナントロリン,20mM H
EPESを含むDMEM培地を水酸化ナトリウムを用い
てpH7.4にあわせたもの)1mlで1回洗浄した後、
4℃に冷やした結合測定用緩衝液1mlを加えて4℃で1
0分保温した。この結合測定用緩衝液を吸い出した後、
4℃に冷やした500pM〔125I〕ニューロテンシン
を含む結合測定用緩衝液0.5mlを加え、4℃で3時間
結合反応を行なった。反応終了後、結合測定用緩衝液を
除き、4℃に冷やした1mlのPBS緩衝液で3回洗浄し
た。細胞に結合した〔125I〕ニューロテンシンの量
は、0.2N 水酸化ナトリウムで細胞をはがした後、γ
-カウンターで測定し、これを総結合量とした。また、
結合反応時に1μMの非標識ニューロテンシンを加えて
同様の操作を行い、細胞に結合した〔125I〕ニューロ
テンシンの量を非特異的結合量とした。結果を、〔表
1〕に示す。
[Example 4] Measurement of human neurotensin receptor protein activity One cell expressing human neurotensin receptor protein was used.
Spread on a 2-well plate, D containing 10% dialyzed fetal bovine serum
The cells were cultured in MEM medium at 37 ° C. under 95% air / 5% CO 2 conditions until confluent, and the medium was exchanged the day before the binding experiment. The binding experiment for [ 125 I] neurotensin was performed as follows. First, the binding assay buffer (0.1%
BSA, 1 mM orthophenanthroline, 20 mM H
DMEM medium containing EPES adjusted to pH 7.4 with sodium hydroxide) washed once with 1 ml,
Add 1 ml of binding assay buffer cooled to 4 ° C and add 1 ml at 4 ° C.
It was kept warm for 0 minutes. After sucking out this binding measurement buffer,
0.5 ml of a binding assay buffer containing 500 pM [ 125 I] neurotensin cooled to 4 ° C. was added, and the binding reaction was carried out at 4 ° C. for 3 hours. After the reaction was completed, the binding measurement buffer was removed and the plate was washed 3 times with 1 ml of PBS buffer cooled to 4 ° C. The amount of [ 125 I] neurotensin bound to the cells was determined by γ after the cells were detached with 0.2N sodium hydroxide.
-Measured with a counter and used as the total binding amount. Also,
At the time of the binding reaction, 1 μM of unlabeled neurotensin was added and the same operation was performed, and the amount of [ 125 I] neurotensin bound to the cells was defined as the nonspecific binding amount. The results are shown in [Table 1].

【0079】[0079]

【表1】 〔表1〕から、本発明のヒト・ニューロテンシンレセプ
ター蛋白質を安定に高発現する細胞株CHO/pTS8
61-1-2E6およびCHO/pTS861-24-2C
5が、リガンドであるニューロテンシンと特異的に結合
できることが確認された。
[Table 1] From [Table 1], the cell line CHO / pTS8 that stably and highly expresses the human neurotensin receptor protein of the present invention.
61-1-2E6 and CHO / pTS861-24-2C
It was confirmed that 5 can specifically bind to the ligand neurotensin.

【0080】[0080]

【発明の効果】本発明のヒト・ニューロテンシンレセプ
ター蛋白質は、公知のヒト・ニューロテンシンレセプタ
ー蛋白質のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有す
る新規な蛋白質である。また、本発明のヒト・ニューロ
テンシンレセプター蛋白質を含有する発現ベクターを保
持する細胞(特に、CHO細胞)は、公知のヒト・ニュ
ーロテンシンレセプター蛋白質を含有するCOS-7細
胞に比べて、はるかに大量のヒト・ニューロテンシンレ
セプター蛋白質を発現することができる。本発明のヒト
・ニューロテンシンレセプター蛋白質、その部分ペプチ
ドまたはヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質を含
有する細胞もしくはその細胞膜画分は、ヒト・ニューロ
テンシンレセプターアゴニストまたはアンタゴニストを
効率良くスクリーニングすることができる。本発明のス
クリーニング方法によれば、アゴニストまたはアンタゴ
ニストを有利に選択することができるので、例えば、パ
ーキンソン病、鬱病、痴呆症、多動児性症候群もしくは
意識障害の予防・治療剤、拒食性誘発剤、抗不安剤、催
眠鎮静剤、または逆行性食道炎、腸炎、すい炎、潰瘍、
胃癌、腸癌、精神病、ハンチントン病もしくは躁病の予
防・治療剤などの医薬品を早期に開発することができ
る。
The human neurotensin receptor protein of the present invention is a novel protein having an amino acid sequence different from the amino acid sequence of the known human neurotensin receptor protein. In addition, the cells carrying the expression vector containing the human neurotensin receptor protein of the present invention (particularly, CHO cells) are much larger than the known COS-7 cells containing the human neurotensin receptor protein. Can express the human neurotensin receptor protein. The human neurotensin receptor protein of the present invention, a partial peptide thereof, or a cell containing the human neurotensin receptor protein or a cell membrane fraction thereof can be efficiently screened for a human neurotensin receptor agonist or antagonist. According to the screening method of the present invention, an agonist or an antagonist can be advantageously selected, and therefore, for example, a prophylactic / therapeutic agent for Parkinson's disease, depression, dementia, hyperactive childhood syndrome or consciousness disorder, an anorexic inducer , Anxiolytics, hypnotics, or retrograde esophagitis, enteritis, pancreatitis, ulcers,
It is possible to early develop a drug such as a prophylactic / therapeutic agent for gastric cancer, intestinal cancer, psychosis, Huntington's disease or mania.

【0081】[0081]

【配列表】[Sequence list]

【配列番号:1】 配列の長さ:418 配列の型:アミノ酸 トポロジー:直鎖状 配列の種類:ペプチド 配列 Met Arg Leu Asn Ser Ser Ala Pro Gly Thr Pro Gly Thr Pro Ala Ala 1 5 10 15 Asp Pro Phe Gln Arg Ala Gln Ala Gly Leu Glu Glu Ala Leu Leu Ala 20 25 30 Pro Gly Phe Gly Asn Ala Ser Gly Asn Ala Ser Glu Arg Val Leu Ala 35 40 45 Ala Pro Ser Ser Glu Leu Asp Val Asn Thr Asp Ile Tyr Ser Lys Val 50 55 60 Leu Val Thr Ala Val Tyr Leu Ala Leu Phe Val Val Gly Thr Val Gly 65 70 75 80 Asn Thr Val Thr Ala Phe Thr Leu Ala Arg Lys Lys Ser Leu Gln Ser 85 90 95 Leu Gln Ser Thr Val His Tyr His Leu Gly Ser Leu Ala Leu Ser Asp 100 105 110 Leu Leu Thr Leu Leu Leu Ala Met Pro Val Glu Leu Tyr Asn Phe Ile 115 120 125 Trp Val His His Pro Trp Ala Phe Gly Asp Ala Gly Cys Arg Gly Tyr 130 135 140 Tyr Phe Leu Arg Asp Ala Cys Thr Tyr Ala Thr Ala Leu Asn Val Ala 145 150 155 160 Ser Leu Ser Val Glu Arg Tyr Leu Ala Ile Cys His Pro Phe Lys Ala 165 170 175 Lys Thr Leu Met Ser Arg Ser Arg Thr Lys Lys Phe Ile Ser Ala Ile 180 185 190 Trp Leu Ala Ser Ala Leu Leu Ala Val Pro Met Leu Phe Thr Met Gly 195 200 205 Glu Gln Asn Arg Ser Ala Asp Gly Gln His Ala Gly Gly Leu Val Cys 210 215 220 Thr Pro Thr Ile His Thr Ala Thr Val Lys Val Val Ile Gln Val Asn 225 230 235 240 Thr Phe Met Ser Phe Ile Phe Pro Met Val Val Ile Ser Val Leu Asn 245 250 255 Thr Ile Ile Ala Asn Lys Leu Thr Val Met Val Arg Gln Ala Ala Glu 260 265 270 Gln Gly Gln Val Cys Thr Val Gly Gly Glu His Ser Thr Phe Ser Met 275 280 285 Ala Ile Glu Pro Gly Arg Val Gln Ala Leu Arg His Gly Val Arg Val 290 295 300 Leu Arg Ala Val Val Ile Ala Phe Val Val Cys Trp Leu Pro Tyr His 305 310 315 320 Val Arg Arg Leu Met Phe Cys Tyr Ile Ser Asp Glu Gln Trp Thr Pro 325 330 335 Phe Leu Tyr Asp Phe Tyr His Tyr Phe Tyr Met Val Thr Asn Ala Leu 340 345 350 Phe Tyr Val Ser Ser Thr Ile Asn Pro Ile Leu Tyr Asn Leu Val Ser 355 360 365 Ala Asn Phe Arg His Ile Phe Leu Ala Thr Leu Ala Cys Leu Cys Pro 370 375 380 Val Trp Arg Arg Arg Arg Lys Arg Pro Ala Phe Ser Arg Lys Ala Asp 385 390 395 400 Ser Val Ser Ser Asn His Thr Leu Ser Ser Asn Ala Thr Arg Glu Thr 405 410 415 Leu Tyr [SEQ ID NO: 1] Sequence length: 418 Sequence type: Amino acid Topology: Linear Sequence type: Peptide sequence Met Arg Leu Asn Ser Ser Ala Pro Gly Thr Pro Gly Thr Pro Ala Ala 1 5 10 15 Asp Pro Phe Gln Arg Ala Gln Ala Gly Leu Glu Glu Ala Leu Leu Ala 20 25 30 Pro Gly Phe Gly Asn Ala Ser Gly Asn Ala Ser Glu Arg Val Leu Ala 35 40 45 Ala Pro Ser Ser Glu Leu Asp Val Asn Thr Asp Ile Tyr Ser Lys Val 50 55 60 Leu Val Thr Ala Val Tyr Leu Ala Leu Phe Val Val Gly Thr Val Gly 65 70 75 80 Asn Thr Val Thr Ala Phe Thr Leu Ala Arg Lys Lys Ser Leu Gln Ser 85 90 95 Leu Gln Ser Thr Val His Tyr His Leu Gly Ser Leu Ala Leu Ser Asp 100 105 110 Leu Leu Thr Leu Leu Leu Ala Met Pro Val Glu Leu Tyr Asn Phe Ile 115 120 125 Trp Val His His Pro Trp Ala Phe Gly Asp Ala Gly Cys Arg Gly Tyr 130 135 140 Tyr Phe Leu Arg Asp Ala Cys Thr Tyr Ala Thr Ala Leu Asn Val Ala 145 150 155 160 Ser Leu Ser Val Glu Arg Tyr Leu Ala Ile Cys His Pro Phe Lys Ala 165 170 175 Lys Thr Leu Met Ser Arg Se r Arg Thr Lys Lys Phe Ile Ser Ala Ile 180 185 190 Trp Leu Ala Ser Ala Leu Leu Ala Val Pro Met Leu Phe Thr Met Gly 195 200 205 Glu Gln Asn Arg Ser Ala Asp Gly Gln His Ala Gly Gly Leu Val Cys 210 215 220 Thr Pro Thr Ile His Thr Ala Thr Val Lys Val Val Ile Gln Val Asn 225 230 235 240 Thr Phe Met Ser Phe Ile Phe Pro Met Val Val Ile Ser Val Leu Asn 245 250 255 Thr Ile Ile Ala Asn Lys Leu Thr Val Met Val Arg Gln Ala Ala Glu 260 265 270 Gln Gly Gln Val Cys Thr Val Gly Gly Glu His Ser Thr Phe Ser Met 275 280 285 Ala Ile Glu Pro Gly Arg Val Gln Ala Leu Arg His Gly Val Arg Val 290 295 300 Leu Arg Ala Val Val Ile Ala Phe Val Val Cys Trp Leu Pro Tyr His 305 310 315 320 Val Arg Arg Leu Met Phe Cys Tyr Ile Ser Asp Glu Gln Trp Thr Pro 325 330 335 Phe Leu Tyr Asp Phe Tyr His Tyr Phe Tyr Met Val Thr Asn Ala Leu 340 345 350 Phe Tyr Val Ser Ser Thr Ile Asn Pro Ile Leu Tyr Asn Leu Val Ser 355 360 365 Ala Asn Phe Arg His Ile Phe Leu Ala Thr Leu Ala Cys Leu Cys Pro 370 375 380 Val Trp Arg Arg Arg Arg Lys Ar g Pro Ala Phe Ser Arg Lys Ala Asp 385 390 395 400 Ser Val Ser Ser Asn His Thr Leu Ser Ser Asn Ala Thr Arg Glu Thr 405 410 415 Leu Tyr

【0082】[0082]

【配列番号:2】 配列の長さ:1254 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:cDNA 特徴を決定した方法:S 配列 ATGCGCCTCA ACAGCTCCGC GCCGGGAACC CCGGGCACGC CGGCCGCCGA CCCCTTCCAG 60 CGGGCGCAGG CCGGACTGGA GGAGGCGCTG CTGGCCCCGG GCTTCGGCAA CGCTTCGGGC 120 AACGCGTCGG AGCGCGTCCT GGCGGCACCC AGCAGCGAGC TGGACGTGAA CACCGACATC 180 TACTCCAAGG TGCTGGTGAC CGCCGTGTAC CTGGCGCTCT TCGTGGTGGG CACGGTGGGC 240 AACACGGTGA CGGCGTTCAC GCTGGCGCGG AAGAAGTCGC TGCAGAGCCT GCAGAGCACG 300 GTGCATTACC ACCTGGGCAG CCTGGCGCTG TCCGACCTGC TCACCCTGCT GCTGGCCATG 360 CCCGTGGAGC TGTACAACTT CATCTGGGTG CACCACCCCT GGGCCTTCGG CGACGCCGGC 420 TGCCGCGGCT ACTACTTCCT GCGCGACGCC TGCACCTACG CCACGGCCCT CAACGTGGCC 480 AGCCTGAGTG TGGAGCGCTA CCTGGCCATC TGCCACCCCT TCAAGGCCAA GACCCTCATG 540 TCCCGAAGCC GCACCAAGAA GTTCATCAGC GCCATCTGGC TCGCCTCGGC CCTGCTGGCG 600 GTGCCTATGC TGTTCACCAT GGGCGAGCAG AACCGCAGCG CCGACGGCCA GCACGCCGGC 660 GGCCTGGTGT GCACCCCCAC CATCCACACT GCCACCGTCA AGGTCGTCAT ACAGGTCAAC 720 ACCTTCATGT CCTTCATATT CCCCATGGTG GTCATCTCGG TCCTGAACAC CATCATCGCC 780 AACAAGCTGA CCGTCATGGT ACGCCAGGCG GCCGAGCAGG GCCAAGTGTG CACGGTCGGG 840 GGCGAGCACA GCACATTCAG CATGGCCATC GAGCCTGGCA GGGTCCAGGC CCTGCGGCAC 900 GGCGTGCGCG TCCTACGTGC AGTGGTCATC GCCTTTGTGG TCTGCTGGCT GCCCTACCAC 960 GTGCGGCGCC TCATGTTCTG CTACATCTCG GATGAGCAGT GGACTCCGTT CCTCTATGAC 1020 TTCTACCACT ACTTCTACAT GGTGACCAAC GCACTCTTCT ACGTCAGCTC CACCATCAAC 1080 CCCATCCTGT ACAACCTCGT CTCTGCCAAC TTCCGCCACA TCTTCCTGGC CACACTGGCC 1140 TGCCTCTGCC CGGTGTGGCG GCGCAGGAGG AAGAGGCCAG CCTTCTCGAG GAAGGCCGAC 1200 AGCGTGTCCA GCAACCACAC CCTCTCCAGC AATGCCACCC GCGAGACGCT GTAC 1254[SEQ ID NO: 2] Sequence length: 1254 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Double stranded Topology: Linear Sequence type: cDNA Characterization method: S sequence ATGCGCCTCA ACAGCTCCGC GCCGGGAACC CCGGGCACGC CGGCCGCCGA CCCCTTCCAG 60 CGGGCGCAGG CCGGACTGGA GGAGGCGCTG CTGGCCCCGG GCTTCGGCAA CGCTTCGGGC 120 AACGCGTCGG AGCGCGTCCT GGCGGCACCC AGCAGCGAGC TGGACGTGAA CACCGACATC 180 TACTCCAAGG TGCTGGTGAC CGCCGTGTAC CTGGCGCTCT TCGTGGTGGG CACGGTGGGC 240 AACACGGTGA CGGCGTTCAC GCTGGCGCGG AAGAAGTCGC TGCAGAGCCT GCAGAGCACG 300 GTGCATTACC ACCTGGGCAG CCTGGCGCTG TCCGACCTGC TCACCCTGCT GCTGGCCATG 360 CCCGTGGAGC TGTACAACTT CATCTGGGTG CACCACCCCT GGGCCTTCGG CGACGCCGGC 420 TGCCGCGGCT ACTACTTCCT GCGCGACGCC TGCACCTACG CCACGGCCCT CAACGTGGCC 480 AGCCTGAGTG TGGAGCGCTA CCTGGCCATC TGCCACCCCT TCAAGGCCAA GACCCTCATG 540 TCCCGAAGCC GCACCAAGAA GTTCATCAGC GCCATCTGGC TCGCCTCGGC CCTGCTGGCG 600 GTGCCTATGC TGTTCACCAT GGGCGAGCAG AACCGCAGCG CCGACGGCCA GCACGCCGGC 660 GGCCTGGTCATCCCCCCCCGCGCGC660 T GCCACCGTCA AGGTCGTCAT ACAGGTCAAC 720 ACCTTCATGT CCTTCATATT CCCCATGGTG GTCATCTCGG TCCTGAACAC CATCATCGCC 780 AACAAGCTGA CCGTCATGGT ACGCCAGGCG GCCGAGCAGG GCCAAGTGTG CACGGTCGGG 840 GGCGAGCACA GCACATTCAG CATGGCCATC GAGCCTGGCA GGGTCCAGGC CCTGCGGCAC 900 GGCGTGCGCG TCCTACGTGC AGTGGTCATC GCCTTTGTGG TCTGCTGGCT GCCCTACCAC 960 GTGCGGCGCC TCATGTTCTG CTACATCTCG GATGAGCAGT GGACTCCGTT CCTCTATGAC 1020 TTCTACCACT ACTTCTACAT GGTGACCAAC GCACTCTTCT ACGTCAGCTC CACCATCAAC 1080 CCCATCCTGT ACAACCTCGT CTCTGCCAAC TTCCGCCACA TCTTCCTGGC CACACTGGCC 1140 TGCCTCTGCC CGGTGTGGCG GCGCAGGAGG AAGAGGCCAG CCTTCTCGAG GAAGGCCGAC 1200 AGCGTGTCCA GCAACCACAC CCTCTCCAGC AATGCCACCC GCGAGACGCT GTAC 1254

【0083】[0083]

【配列番号:3】 配列の長さ:41 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:合成DNA 配列 CGGACAGAGC CGCGGGACTC CAGCGCCCAC CATGCGCCTC A 41[SEQ ID NO: 3] Sequence length: 41 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Single strand Topology: Linear Sequence type: Synthetic DNA Sequence CGGACAGAGC CGCGGGACTC CAGCGCCCAC CATGCGCCTC A 41

【0084】[0084]

【配列番号:4】 配列の長さ:31 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:合成DNA 配列 TCCTCCTGGA CACGTTCCG GGGCGCACAG C 31[SEQ ID NO: 4] Sequence length: 31 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Single strand Topology: Linear Sequence type: Synthetic DNA Sequence TCCTCCTGGA CACGTTCCG GGGCGCACAG C 31

【0085】[0085]

【図面の簡単な説明】[Brief description of drawings]

【図1】本発明のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋
白質のアミノ酸配列を示す。
FIG. 1 shows the amino acid sequence of the human neurotensin receptor protein of the present invention.

【0086】[0086]

【図2】本発明のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋
白質をコードするDNAの塩基配列を示す。図中の第7
32番目から第1988番目までの塩基配列がヒト・ニ
ューロテンシンレセプター蛋白質をコードする部分であ
る。
FIG. 2 shows the nucleotide sequence of DNA encoding the human neurotensin receptor protein of the present invention. 7th in the figure
The nucleotide sequence from the 32nd position to the 1988th position is a portion encoding the human neurotensin receptor protein.

【0087】[0087]

【図3】ヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質cD
NAを保持する発現プラスミドpTS861の構築図を
示す。発現プラスミドpTS861の斜線部分はヒト・
ニューロテンシンレセプター蛋白質cDNAを示し、D
HFRはdhfr遺伝子を示し、Amprはアンピシリ
ン耐性遺伝子を示す。
FIG. 3: Human neurotensin receptor protein cd
The construction drawing of the expression plasmid pTS861 carrying NA is shown. The hatched portion of the expression plasmid pTS861 is human.
Shows the neurotensin receptor protein cDNA, D
HFR indicates the dhfr gene, and Amp r indicates the ampicillin resistance gene.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 A61K 45/00 AAK AAM AAN ACJ ADU AED C07K 16/28 C12N 1/19 8828−4B 1/21 8828−4B 5/10 15/09 C12P 21/02 C 9282−4B G01N 33/53 S 33/566 // A61K 39/395 D 9281−4B C12N 15/00 A ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (51) Int.Cl. 6 Identification code Internal reference number FI Technical indication location A61K 45/00 AAK AAM AAN ACJ ADU AED C07K 16/28 C12N 1/19 8828-4B 1/21 8828 -4B 5/10 15/09 C12P 21/02 C 9282-4B G01N 33/53 S 33/566 // A61K 39/395 D 9281-4B C12N 15/00 A

Claims (15)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項1】配列番号:1で表わされるアミノ酸配列を
含有することを特徴とするヒト・ニューロテンシンレセ
プター蛋白質またはその塩。
1. A human neurotensin receptor protein or a salt thereof, which comprises the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
【請求項2】請求項1記載のヒト・ニューロテンシンレ
セプター蛋白質の部分ペプチドまたはその塩。
2. A partial peptide of the human neurotensin receptor protein according to claim 1, or a salt thereof.
【請求項3】請求項1記載のヒト・ニューロテンシンレ
セプター蛋白質をコードするDNAを含有するDNA。
3. A DNA containing the DNA encoding the human neurotensin receptor protein according to claim 1.
【請求項4】配列番号:2で表わされる塩基配列を有す
る請求項3記載のDNA。
4. The DNA according to claim 3, which has the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2.
【請求項5】請求項3記載のDNAを含有するベクタ
ー。
5. A vector containing the DNA according to claim 3.
【請求項6】請求項5記載のベクターを保持する形質転
換体。
6. A transformant carrying the vector according to claim 5.
【請求項7】請求項6記載の形質転換体を、ヒト・ニュ
ーロテンシンレセプター蛋白質をコードするDNAの発
現が可能な条件下で培養することを特徴とする請求項1
記載のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質の製造
法。
7. The transformant according to claim 6 is cultivated under conditions capable of expressing a DNA encoding a human neurotensin receptor protein.
A method for producing the described human neurotensin receptor protein.
【請求項8】請求項1記載のヒト・ニューロテンシンレ
セプター蛋白質を含有する細胞またはその細胞膜画分。
8. A cell containing the human neurotensin receptor protein according to claim 1 or a cell membrane fraction thereof.
【請求項9】請求項1記載のヒト・ニューロテンシンレ
セプター蛋白質もしくはその塩、請求項2記載の部分ペ
プチドもしくはその塩、または請求項8記載の細胞もし
くはその細胞膜画分を用いることを特徴とするヒト・ニ
ューロテンシンレセプターアゴニストまたはアンタゴニ
ストのスクリーニング方法。
9. The human neurotensin receptor protein according to claim 1 or a salt thereof, the partial peptide according to claim 2 or a salt thereof, or the cell according to claim 8 or a cell membrane fraction thereof. A method for screening a human neurotensin receptor agonist or antagonist.
【請求項10】請求項1記載のヒト・ニューロテンシン
レセプター蛋白質もしくはその塩、請求項2記載の部分
ペプチドもしくはその塩、または請求項8記載の細胞も
しくはその細胞膜画分を含有することを特徴とするヒト
・ニューロテンシンレセプターアゴニストまたはアンタ
ゴニストのスクリーニング用キット。
10. A human neurotensin receptor protein or a salt thereof according to claim 1, a partial peptide or a salt thereof according to claim 2, or a cell or a cell membrane fraction thereof according to claim 8. A kit for screening a human neurotensin receptor agonist or antagonist.
【請求項11】請求項9記載のスクリーニング方法また
は請求項10記載のスクリーニング用キットを用いて得
られるヒト・ニューロテンシンレセプターアゴニスト。
11. A human neurotensin receptor agonist obtained by using the screening method according to claim 9 or the screening kit according to claim 10.
【請求項12】請求項9記載のスクリーニング方法また
は請求項10記載のスクリーニング用キットを用いて得
られるヒト・ニューロテンシンレセプターアンタゴニス
ト。
12. A human neurotensin receptor antagonist obtained by using the screening method according to claim 9 or the screening kit according to claim 10.
【請求項13】請求項11記載のヒト・ニューロテンシ
ンレセプターアゴニストを含有することを特徴とするパ
ーキンソン病、鬱病、痴呆症、多動児性症候群もしくは
意識障害の予防・治療剤または拒食性誘発剤。
13. A preventive / therapeutic agent or an anorexic inducer for Parkinson's disease, depression, dementia, hyperactive childhood syndrome or consciousness disorder, which comprises the human neurotensin receptor agonist according to claim 11. .
【請求項14】請求項12記載のヒト・ニューロテンシ
ンレセプターアンタゴニストを含有することを特徴とす
る逆行性食道炎、腸炎、すい炎、潰瘍、胃癌、腸癌、精
神病、ハンチントン病もしくは躁病の予防・治療剤、抗
不安剤または催眠鎮静剤。
14. Prevention of retrograde esophagitis, enteritis, pancreatitis, ulcer, gastric cancer, intestinal cancer, psychosis, Huntington's disease or mania, which comprises the human neurotensin receptor antagonist according to claim 12. A therapeutic, anxiolytic or hypnotic sedative.
【請求項15】請求項1記載のヒト・ニューロテンシン
レセプター蛋白質もしくはその塩または請求項2記載の
部分ペプチドもしくはその塩に対する抗体。
15. An antibody against the human neurotensin receptor protein according to claim 1 or a salt thereof or the partial peptide according to claim 2 or a salt thereof.
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