JPH0577397B2

JPH0577397B2 -

Info

Publication number: JPH0577397B2
Application number: JP63247371A
Authority: JP
Inventors: Sumio Kitahata; Osamu Tanaka; Shigeru Watano; Hiroshi Suzuki; Hiroshi Ishikawa
Original assignee: Hokkaido Sugar Co Ltd; Osaka City
Current assignee: Hokkaido Sugar Co Ltd; Osaka City
Priority date: 1988-10-03
Filing date: 1988-10-03
Publication date: 1993-10-26
Also published as: JPH02131592A

Description

【発明の詳細な説明】

（産業上の利用分野）この発明は、新規な甘味料の製造方法に関し、
更に詳しくはステビオール配糖体であるステビオ
サイドまたはルブソサイドのβ−ガラクトース転
移酵素による転移反応において、19位のCOOH
にエステル結合するβ−グルコシル基（以下、19
位のグルコシル基と記す）にガラクトースを優先
的に転移させ、更に第二段のα−グルコシル転移
反応により、13位のOHにエーテル結合するβ−
グルコシル基（以下、13位のグルコシル基と記
す）に選択的にグルコースを転移させる新規な甘
味料の製造方法、更に第三段のβ−ガラクトシダ
ーゼの加水分解反応により、19位の糖鎖の末端ガ
ラクトシル基をはずした甘味料の新規な製造方法
に関するものである。（従来の技術）近年、人工甘味料であるサツカリン、ズルチ
ン、チクロ等が安全性の点から一般食品への使用
が禁止、または規制される傾向にある。一方では、近年砂糖の採りすぎによる健康上の
影響が問題にされはじめたことから、それ等の問
題がより少ない天然甘味料の開発が熱望されてい
る。これに対して、南米パラグアイ原産のキク科植
物であるステビアから得られるステビオサイド及
び中国南部、広西、広東地方に野生するバラ科、
キイチゴ属の灌木、甘葉懸鈎子の葉から得られる
ルブソサイドは、下記の構造式（）及び（）
に示すように、ステビオール配糖体であるが、こ
れらは砂糖と異なり、低カロリーの甘味料であ
り、しかも甘味度は砂糖の約114〜145倍と高く、
砂糖に替わる甘味料として注目されている。

【化】

【化】（式中β−gluc：β−グルコシル基）ところが、上記ステビオール配糖体であるステ
ビオサイド、ルブソサイドの甘味質には苦味、嫌
味があり、更に残味が長く尾を引くという欠点が
あるため、αまたはβ−グルコシル転移酵素でグ
ルコシル化することにより、これらの欠点を改善
した製品が生産されているが、未だ充分な成果を
収めるには至つていない。ステビオサイドの甘味度、甘味質の改良法につ
いては、数多くの研究報告並びに特開昭54−5070
号など数多くの特許出願がなされている。またルブソサイドについては、サイクロデキス
トリンを添加することにより甘味質を改善する方
法が提案されている（特願昭58−71867号）。更に、ルブソサイドにバシラス・メガテリウム
（Bacillus megaterium）が生産するサイクロデ
キストリングカノトランスフエラーゼ（以下、
CGTaseと記す）を用い、澱粉を糖供与体とし
て、酵素転移を行なうことにより甘味質を改善す
る方法も提案されている。（発明が解決しようとする問題点）しかし、上述のルブソサイドにCGTaseを用い
て澱粉を糖供与体として酵素転移させる方法につ
いては、味質の充分な改善が行なわれず、またス
テビオサイドについても同様である。これらの原因については、上述の反応において
はルブソサイドの13位または19位のグルコシル基
にグルコースが１〜３分子それぞれ一方に転移す
るもの、また両方に転移するもの等の混合物が生
成するが、このうち13位のグルコシル基にグルコ
ースが１〜３分子転移したものは、甘味度、味質
共に改良されるが、13位のグルコシル基より、19
位のグルコシル基により多くのグルコースが転移
した生成物は、甘味度、味質が低下すること等が
1984年にAgri.、Biol.、chem.48(10)2483〜2488に
報告されている。即ち、上述の反応の結果得られた転移生成物は
味質が改善されたもの、逆に悪くなつたものの混
合物であるので、その味質は充分な改善に至らな
いのである。 13位のグルコシル基が転移した生成物のみを単
離すれば、良質の甘味料となることは明らかであ
るが、分離が容易でなく、仮に分離しても高価と
なり、実用的ではなくなることから、現在、混合
物として市販されている。一方、ステビオール配糖体の19位のグルコシル
基を化学的方法によりガラクトシル基に置換させ
て得られた合成ステビオール配糖体を受容体と
し、これにCGTaseを作用させ、13位のグルコシ
ル基にグルコースを選択的に転移させた場合の甘
味度、味質の改善についての研究報告がなされて
いる（日本薬学会大会講演要旨集、6E15 ２−４
昭和63年３月10日発行）。しかし、この方法においてはステビオール配糖
体の19位のグルコシル基を化学的方法によりガラ
クトシル基に置換させてステビオール配糖体を合
成しているが、一般にステビオール配糖体の19位
のグルコシル基を外すと、甘味度乃至味質が低下
する傾向が見られる。またこの方法においては反
応中に触媒としてAgなどの重金属を使用するた
め、甘味料などの食品添加物として使用する場
合、人体への影響等が問題となる。（問題点を解決するための手段）そこで、この発明ではステビオール配糖体の19
位のグルコシル基を外すことなく、酵素法による
新たな甘味料の製造方法を提案するものである。具体的には、本願第１発明はステビオール配糖
体であるステビオサイドまたはルブソサイドとβ
−ガラクトシル糖化合物とを含有する水溶液また
は懸濁液にβ−ガラクトシル転移酵素を作用させ
ることによつて各々の19位のグルコシル基に優先
的にガラクトースを転移させる第一段酵素反応、
更にその転移反応液を加熱し、β−ガラクトシル
転移酵素を失活させた後、α−グルコシル糖化合
物を加え、α−グルコシル転移酵素を作用させて
13位のグルコシル基に選択的にグルコースを転移
させる第二段酵素反応から成り立つている。更に、本願第２発明においては味質を改良する
手段として、第二段酵素反応液を加熱し、α−グ
ルコシル転移酵素を失活させ、基質となるβ−ガ
ラクトシル・α−グルコシルスデビオサイドまた
はβ−ガラクトシル・α−グルコシルルブソサイ
ド溶液にβ−ガラクトシダーゼを作用させ、19位
の糖鎖のβ−ガラクトシル基を分解してはずし、
α−グルコシルステビオサイドまたはα−グルコ
シルルブソサイドとする第三段酵素反応を行なわ
せるものである。この発明の第一段酵素反応に用いるβ−ガラク
トシル糖化合物（以下、GA糖供与体と記す）
は、ラクトース、β−ガラクタン等が使用される
が、β−ガラクタンの分解物であるオリゴマーで
もよい。 β−ガラクトシル転移酵素は、GA糖供与体と
ステビオサイドまたはルブソサイドを含有する水
溶液または懸濁液に作用させるとき、GA糖供与
体を分解し、そのガラクトースをステビオサイド
またはルブソサイドの19位のグルコシル基に優先
的に転移させ、β−ガラクトシルステビオサイド
またはβ−ガラクトシルルブソサイドを生成する
ものであれば何れも使用可能である。このようなβ−ガラクトシル転移酵素は、植物
の種子に存在するほか、例えばバシラス・サーキ
ユランス（Bacillus circulans）、エシエリキア・
コリ（Escherichia coli）、ラクトバシラス・ビ
フイズス（Lactobacillus bifidus）等の細菌およ
びロドツルラ・ミヌタ（Rhodotorula minuta）、
ロドツルラ・ラクトサ（Rhodotorula lactosa）
等の酵母により生産されることが知られている。反応に用いるステビオサイドまたはルブソサイ
ドとβ−ガラクトシル糖化合物とを含有する水溶
液または懸濁液は、ステビオサイドまたはルブソ
サイドの濃度が約１〜40％（Ｗ／Ｗ）、GA糖供
与体の濃度が約0.5〜50％（Ｗ／Ｗ）とし、且つ
ステビオサイドまたはルブソサイドに対するGA
糖供与体の比率は使用するGA糖供与体によつて
異なるが、0.1〜50倍の範囲とし、好ましくは0.5
〜２倍の範囲とする。また、第１段酵素反応の使用酵素活性量は反応
時間と密接な関係があり、通常は５〜120時間、
好ましくは５〜48時間で反応が終了する酵素活性
量にすればよいが、これに限定されるものでな
い。更に、反応液のPHと温度は通常PH４〜８、温度
20〜70℃が適当であり、このような条件下で第一
段酵素反応を行なわせ、ステビオサイドまたはル
ブソサイドの19位のグルコシル基に優先的にガラ
クトースを転移させる。この発明の第二段酵素反応に用いる受容体であ
るガラクトース転移生成物は第一段酵素反応液を
加熱し、酵素を失活させた反応液でもよいが、さ
らに精製分画したβ−ガラクトシルステビオサイ
ドまたはβ−ガラクトシルルブソサイドであるこ
とが好ましい。 α−グルコシル糖化合物（以下、GL糖供与体
と記す）は澱粉糊化物、澱粉部分分解物等のα−
グルカンが使用される。また、α−グルコシル転移酵素はGL糖供与体
と第一段酵素反応にて得られる転移生成物、β−
ガラクトシルステビオサイドまたはβ−ガラクト
シルルブソサイドを含有する水溶液または懸濁液
に作用させるとき、GL等供与体を分解し、その
グルコースを受容体の13位のグルコシル基に選択
的に転移させ、β−ガラクトシル・α−グルコシ
ルステビオサイドまたはβ−ガラクトシル・α−
グルコシルルブソサイドを生成するものであれば
使用できる。このようなα−グルコシル転移酵素としては、
グルコシル基が受容体となり得るが、ガラクトシ
ル基は受容体となり得ない酵素、例えばバシラ
ス・マセランス（Bacillus macerans）、バシラ
ス・メガテリウム（Bacillus megaterium）、バ
シラス・サーキユランス（Bacillus
ciruculans）、バシラス・ステアロサーモフイル
ス（Bacillus stearothermophilus）等の生産す
るCGTaseまたはビール酵母等の生産するα−グ
ルコシダーゼ等を使用することができる。第二段酵素反応系において、第一段酵素反応液
に対するGL糖供与体の比率は、第一段酵素反応
液の精製度、使用するGL糖供与体によつても異
なるが、一般には0.1〜50倍の範囲、好ましくは
１〜５倍の範囲である。第二段酵素反応のPHと温度は、通常PH４〜８、
温度20〜70℃が適当であり、使用酵素活性量は反
応時間と密接な関係があり、通常は５〜120時間、
好ましくは５〜48時間で反応が終了する酵素活性
量にすれば良いが、これらに限定されるものでは
ない。このような条件下に第二段酵素反応を行なわせ
てβ−ガラクトシルステビオサイドまたはβ−ガ
ラクトシルルブソサイドの13位のグルコシル基に
グルコースを選択的に転移させる。この発明の第三段酵素反応に用いる基質は、第
二段酵素反応液を加熱し、酵素を矢活させた反応
液そのものか、またはさらに精製分画したβ−ガ
ラクトシル・α−グルコシルステビオサイドまた
はβ−ガラクトシル・α−グルコシルルブソサイ
ドでもよい。ここでβ−ガラクトシダーゼは、第一段酵素反
応に用いる前記β−ガラクトシル転移酵素を使用
することができる。また第三段酵素反応のPH及び反応温度は、通常
PH４〜８、温度20〜70℃が適当であり、このよう
な条件下に反応を行なわせ、β−ガラクトシル・
α−グルコシルステビオサイドまたはβ−ガラク
トシル・α−グルコシルルブソサイドの19位のグ
ルコシル基に転移させたβ−ガラクトシル基を外
す。なお、第一段、第二段、第三段の酵素反応に
使用する各酵素の調製方法としては、該微生物の
固体培養および液体培養の何れを使用してもよい
が、最近では殆ど液体培養で行なわれている。その培養液は通常、不溶物を除去した培養上澄
液を酵素として使用するか、菌体内酵素である場
合は分離した菌体をそのまま使用するか、抽出し
て利用すればよい。また必要に応じて、上記抽出
液をさらに精製して用いてもよい。植物起源のβ−ガラクトシル転移酵素を使用す
る場合は公知の方法により抽出精製すればよく、
目的に応じて粗製、精製品の何れかを選択すれば
よい。また、これら各酵素は上記のごとく調製す
るのではなく、市販されている酵素剤を用いるこ
ともできる。（発明の効果）以上のような方法により、得られた第二段酵素
反応液を、吸着樹脂（商品名：ダイヤイオンHP
−20三菱化成社製）によるカラムクロマトおよび
シリカゲルクロマトにかけ分画、分取した後、そ
れ等画分について、ステビオール配等体の13位の
水酸基にエーテル結合しているグルコシル基は分
解されないが、19位のカルボキシル基にエステル
結合しているグルコシル基を、選択的にアルカリ
分解して、グルコシル基を遊離させる方法、即ち
ヨウ化カリウム、2.6−ルチジン、メタノール液
に溶解後、８時間還流下に19位のエステル結合を
選択的にアルカリ分解する方法（引用文献、大谷
等、Tetrahedron lett.、25、4537'84）により得
られた酸性配糖体の解析、更にグルコアミラーゼ
による分解試験、及び¹³C−NMRによる構造解
析の結果、下記構造式（）及び（）に示すよ
うなβ−ガラクトシル・α−グルコシルステビオ
サイドおよびβ−ガラクトシル・α−グルコシル
ルブソサイドであることを確認した。

【化】

【化】（式中β−gluc：β−グルコシル基、α−gluc：
α−グルコシル基、β−gal：β−ガラクトシル
基、ｎ：１〜４の任意の整数）上記のようにして得られた転移反応生成物の
内、ｎ＝２のβ−ガラクトシル、α−グルコシル
ステビオサイドの甘味度は、原体のステビオサイ
ドの約２倍となり、ｎ＝２のβ−ガラクトシル、
α−グルコシルルブソサイドにおいては約2.7倍
となつた。また味質についても各々原体と比べて改善され
ることをパネル試験により確認した。更に第三段酵素反応にて、19位の糖鎖の末端ガ
ラクトシル基を分解してはずしたα−グルコシル
ステビオサイドおよびα−グルコシルルブソサイ
ドは、より味質が改善されることをパネル試験に
より確認した。またこの発明においては酵素法により製造し、
前述の合成法のように反応中に触媒として重金属
を使用しないため、各転移生成物を甘味料などの
食品添加物として使用しても人体への影響も皆無
である。したがつて、このようにして得られた各転移生
成物の反応液は、そのまま甘味料として使用でき
るが、必要に応じて酵素を失活させて濾過後、そ
の溶液をイオン交換樹脂、例えばＨ型強酸性カチ
オン交換樹脂およびOH型弱塩基性アニオン交換
樹脂を用いて脱塩し、濃縮してシラツプ状の甘味
料とするか、またはこの濃縮液を乾燥して粉末状
の甘味料とすることもできる。（実施例）以下、実施例を挙げて、この発明を具体的に説
明する。実施例１乾燥したステビアの葉から抽出精製した純度97
％のステビオサイド10ｇ、ラクトース10ｇを50ｍ
Ｍリン酸緩衝液（PH6.0）50mlに加えて加熱溶解
後、同緩衝液にて100mlとした。その後、β−ガ
ラクトシル転移酵素としてラクターゼ（大和化成
社製）を0.02ｇ添加し、40℃にて24時間反応させ
た。反応後に酵素を加熱、失活させた反応液を吸
着樹脂に吸着させた後、60％メタノールで溶出
し、未反応ステビオサイドと転移反応生成物を分
取した。更に、この転移反応生成物をシリカゲル
クロマトおよび液体クロマト法により分画、分取
した。未転移ステビオサイド以外に得られた画分(A)〜
(C)の３点について、それぞれ元素分析、¹³C−
NMRによる解析、更にはヨウ化リチウム、2.6−
ルチジン、メタノール液に溶解後、８時間還流下
にエステル結合を選択的にアルカリ分解して得ら
れた酸性配糖体を薄層クロマトグラフイー
（TLC）で分析する方法を用いて構造を調べた。元素分析、及び¹³C−NMRによる分析の結果、
(A)〜(C)はいずれもステビオサイドにガラクトース
が１分子β−結合した構造であることが分かつ
た。次いで、アルカリ分解の結果、(A)からはステ
ビオールビオサイドが得られたことにより、ステ
ビオサイドの19位にガラクトシル基が転移結合し
ていることが分かつた。また、(B)からはステビオールトリオサイドが得
られることにより、ステビオサイドの13位にガラ
クトシル基が転移結合していることが分かつた。一方(C)からは、(A)の場合と同じく、ステビオサ
イドが得られることにより、ステビオサイドの19
位にガラクトシル基が転移していることが分かつ
た。しかしながら、(C)の高速液体クロマトグラフ
イーのリテンシヨンが(A)の場合とは異なることか
ら、その結合様式は(A)とは異なると推定した。 β−ガラクトシル基が転移した(A)の生成比率
は、86％とほぼ選択的に19位に転移した。なお、重水素化ピリジン溶液中で測定したβ−
ガラクトシル基が転移した(A)の¹³C−NMRのケ
ミカルシフトを下記第１表に示す。第１表 (A)の¹³C−NMRのケミカルシフ
ト（aglyconeの数値は省略） 13−G1c 19−G1c 19−Ga1 Ｃ−１ 99.7 95.7 105.7 ２ 75.2 73.7 72.6 ３ 78.0 78.9 75.4 ４ 72.3 71.1 70.3 ５ 78.0 78.8 77.0 ６ 63.1 69.5 62.3 次の第二段酵素反応は、上記19位にβ−ガラク
トシル基が転移したβ−ガラクトシルステビオサ
イド(A)粉末５ｇ、可溶性澱粉５ｇを50ｍＭ酢酸緩
衝液（PH5.4）50mlに加えて加熱溶解後、同緩衝
液にて100mlとした。その後粗CGTase（Bacillus
mace rans 起源）150単位を添加し、40℃にて
24時間反応させた。この反応液を加熱し、酵素を
失活させた後、この溶液を吸着樹脂に吸着させ
た。その後、60％メタノールで溶出し、未反応β
−ガラクトシルステビオサイドと転移生成物をシ
リカゲルクロマトおよび液体クロマトにより分
画、分取した。ここで、得られた画分A₁〜A₅に
ついては、¹³C−NMR解析、ヨウ化リチウム、2.6
−ルチジン、メタノール試薬を用いて、19位のエ
ステル結合を選択的に分解し、その分解した糖鎖
の解析、グルコアミラーゼによる分解試験の結
果、A₁は未反応のβ−ガラクトシルステビオサ
イドであり、A₂〜A₅迄はβ−ガラクトシルステ
ビオサイドの13位の糖鎖に選択的にグルコースが
α−１，４分子転移したものであることを確認し
た。なお、この転移生成物のｎ＝１または２のもの
の甘味度は、かなり増強され、味質も苦味、嫌味
がなくなり、まろやかな甘味に改善された。実施例２実施例１にて、得られたβ−ガラクトシル・α
−グルコシルステビオサイド４ｇを50ｍＭリン酸
緩衝液（PH6.0）50mlに加えて溶解し、同緩衝液
にて100mlとした後、β−ガラクトシダーゼとし
てラクターゼ（大和化成社製）を0.01ｇ添加し、
40℃にて５時間反応させた。反応後に酵素を加
熱、失活させた反応液について、ガラクトース定
量試薬を用いて調べ、ガラクトースの生成を確認
した。更に反応液をシリカゲルクロマト、及び液
体クロマト法により分画し、得られたステビオー
ル配糖体体をグルコアミラーゼにより分解してか
ら、高速液体クロマトグラフイーにより分析し、
グルコースとステビオサイドの生成を確認した。
即ち、分画したステビオール配糖体は、目的とし
たα−グルコシルステビオサイドであることが分
かつた。また、その回収率は70％であつた。このα−グルコシルステビオサイドの味質につ
いてパネル試験を行つた結果、基質のβ−ガラク
トシル・α−グルコシルステビオサイドよりさら
に味質が改善されたことを確認した。実施例３乾燥した甘葉懸鈎子から抽出精製した純度98％
のルブソサイドを受容体として使用する以外は実
施例１と同じく、二段反応を行つた。第一段反応後、反応液について実施例１と同じ
く処理して、同様な手法で解析し、確認したとこ
ろ、ルブソサイドの場合も、ステビオサイドと同
じく、ガラクトースの転移が行われ、転移生成物
のうち、19位のグルコシル基にガラクトースが転
移したβ−ガラクトシルルブソサイドは実施例１
とほぼ近い87％であつた。更に、第二段の酵素反応においては、反応後、
実施例１と同じく処理し、同様な手法で解析し、
確認したところやはり19位の糖鎖のガラクトシル
基にはグルコースの転移は認められず、13位のグ
ルコシル基のみにα−グルコースが１〜４分子転
移していることを確認した。実施例４実施例３にて得られたβ−ガラクトシル・α−
グルコシルルブソサイドを基質とする以外は実施
例２に同じく第三段反応を行つた。反応後に、酵
素を加熱失活した反応液について、実施例２と同
じく処理し、同様な手法で解析し、確認したとこ
ろ分解物は、19位のガラクトシル基がはずれたα
−グルコシルルブソサイドであつた。得られた分解物α−グルコシルルブソサイド画
分は72％であつた。得られた分解物の味質も、や
はり反応前のβ−ガラクトシル・α−グルコシル
ブソサイドより味質が改善されたことを確認し
た。実施例５ β−ガラクトシル転移酵素として、β−ガラク
トシダーゼ（ベーリンガー社製）を用いる以外
は、実施例３と同じく、二段酵素反応を行つた。
第一段反応後、反応液について実施例１と同じく
処理し、同様な手法で解析し、確認したところ、
この酵素の場合もルブソサイドにガラクトースの
転移が行われていた。この第一段酵素反応における転移生成物のう
ち、19位のグルコシル基に優先的にガラクトース
が転移したβ−ガラクトシルルブソサイドは実施
例３と同様にほぼ85％に近いものであつた。更に第二段酵素反応においては、反応後、実施
例１と同じく処理し、同様な手法で解析し、確認
したところ、やはり19位の糖鎖のガラクトスル基
にはグルコースの転移は認められず、13位のグル
コシル基に選択的にグルコースが１〜４分子転移
していることを確認した。

Claims

【特許請求の範囲】１ステビオール配糖体であるステビオサイドま
たはルブソサイドとβ−ガラクトシル糖化合物を
含む水溶液または懸濁液にβ−ガラクトシル転移
酵素を作用させてステビオール配糖体の19位の
COOHにエステル結合するβ−グルコシル基に
ガラクトースを優先的に転移させた後、β−ガラ
クトシル転移酵素を加熱失活させ、更にこの反応
液にα−グルコシル糖化合物を加えた水溶液また
は懸濁液にα−グルコシル転移酵素を作用させ
て、13位のOHにエーテル結合するβ−グルコシ
ル基にグルコースを選択的に転移させることを特
徴とする甘味料の製造方法。２第１項記載の方法により、甘味料を製造した
後、α−グルコシル転移酵素を加熱失活させ、更
にこの反応液にβ−ガラクトシダーゼを作用さ
せ、最初に19位のCOOHにエステル結合するβ
−グルコシル基に転移させたβ−ガラクトシル基
をはずすことを特徴とする甘味料の製造方法。