JPH03500963A

JPH03500963A - 変更７／７ａ因子

Info

Publication number: JPH03500963A
Application number: JP63505496A
Authority: JP
Inventors: ニコライセン，エルス　マリー; ビヨルン，セーレン　エリク; ビベルク，フィン　クリストフ; ウッドベリー，リチャード
Original assignee: ノボ‐ノルディスク　アクティーゼルスカブ; ザイモジェネティクス，インコーポレイティド
Priority date: 1987-06-25
Filing date: 1988-06-24
Publication date: 1991-03-07
Also published as: DK161097B; DK323587D0; EP0370036B1; DK653989D0; DK161097C; ATE76900T1; DE3871798D1; CA1339815C; WO1988010295A1; EP0370036A1; DK653989A; DE3871798T2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】変更■／■ａ因子技術分野本発明は変更■／■ａ因子、この変更因子を暗号化するＤＮＡ配列およびこれらの製造方法に関する。

背景技術 ■ａ囚子は、Ｘ因子および／まなはＸ因子を活性化することにより血液凝集に関与するセリンプロテアーゼである。

■ａ因子はその前駆体である■因子から作られ、これは肝臓で合成され血液へ分泌されここで単鎖の糖タンパク質（Ｍ　ｗ＝ｓｏ、ｏｏｏ＞とじて循環している。■因子はインビトロでＸａ因子、ＸＩＩａ因子、ＩＸａ因子またはトロンビンにより二本鎖型■ａ因子へ変換される９組織因子およびカルシウムイオンの存在下に、■ａ因子はインビボで制限されたタンパク質加水分解によりＸ因子をＸａ因子へ変換すると信じられている。

続いて後者の酵素がＶａ因子、カルシウムイオンおよびリン脂質の存在下にプロトロンビンをトロンビンへ変換する。

■ａ因子はまた組織因子およびカルシウムの存在下にＸ因子をｆｆａ因子へ変換するであろう。

■因子は血漿から精製されそしてブローゼ（Ｂｒｏｚｅ）とマジェルス（Ｍａｊｅｒｕｓ）、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　２５５　（４）　：　１２４２ −１２４７゜１９８０およびヘドナー（Ｈｅｄｎｅｒ）とキジール（ｋｉｓｉｅｌ）、　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ。

Ｉｎｖｅｓｔ、７１　：　１８３６−１８４１に記載された方法により■ａ因子へ活性化される。

■３田子はまた組換ＤＮＡ技術により適当な培地中で■ａ因子を暗号化するＤＮＡ列でトランスフェクションし外哺乳動物細胞を培養し、生産したタンパク質を単離しそして前記タンパク質を活性化して■ａ因子とすることによっても作られる（ヨーロッパ特許出願第８６３０２８５５　、１参！＞。

ヒト■因子を暗号化するｃＤＮＡ配列は特徴的である（ハーゲンらＷａｇｅｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、八ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、８３：２４１２−２４１６．１９８６）、　ｃＤＮＡから推論されるアミノ酸配列は■ 因子がアミノ酸６０または３８のプレプロ−リーダー配列で合成されることを示している。血漿中を循環する成熟した■因子はアミノ酸残基４０６からなる。活性タンパク質のアミノ酸配列分析およびｃＤＮＡから推論されるアミノ酸配列は ■因子がアルギニン（１５２）とイ、ソロイシン（１５３）の間の単ペプチド結合を開裂することにより■ａ因子へ変換することを示している。この結果、軽いＭ（アミノ酸残基１５２）と重い鎖（アミノ酸残基２５４）からなり１つのジスルフィド結合により一緒に保たれた二本鎖の分子が形成される。軽い鎖はγ−カルボキシグルタミン酸（Ｃ１ｍ）領域と２つの潜在的表皮増殖因子領域を含み、一方重い鎖は分子のセリンプロテアーゼ部分を含む。

■ａ因子は■因子に対する阻害を発現する患者に対する治療（ヘドナー、ニー、　Ｈｅｄｎｅｒ、　Ｕ、およびキジール、ダブリュＫ１５ｉｅｌ、　Ｈ，、Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、、７１　：　１８３６−１８４１．１９８３）ならびにたとえば血小板欠乏症、７オンビルプラント病および重い組織傷害の併発が一般に存在する他の病気を含む血小板疾患のような血液病にかかった患者の治療にも使用されうる（ヨーロッパ特許出願第８６３０９１９７．１号参照）。

本発明者らの観察によれば、■ａ因子はタンパク質加水分解開裂により凝固活性を有しない幾つかの分解生成物になりやすいタンパク質であることが見出されている。タンパク質の加水分解開裂は回収過程の異なった段階および貯蔵の間にも生じうる０分解生成物は、血漿から誘導される■ａ因子ならびに組換ＤＮＡ技術により作られる■ａ因子の両方に対し見られた。分解は、■因子を■ａ因子へ活性化する前、すなわち■因子の生産および単離の間、活性化工程の間または活性化生成物の単離、精製および／または貯蔵の間に起きる。

分解生成物は不活性分子のため、■ａ因子製剤におけるこれらの発生は最終製剤のより低い特定活性を導びく、さらに、分解生成物の量および性質は１つの生成物バッチから他のものに変化しこれが生物学的に活性な■ａ因子の可変含有量を有する製剤の原因である。

不活性な分解生成物を含む■ａ因子製剤は上述のようにタンパク質物質のすべてまたは一部が活性である製剤と比較して低い特異活性を有する。したがって、より高い特異活性を有する製剤と比較して治療または予防効果を得そして維持するためにより高いそしてより多数の投与が必要である。

いが、適切な投与量の計算を混乱させ困難にする。

最後に、最終製剤における非生理学的分解生成物の含有は患者の免疫系の引金となる０次いで再投与の結果アレルギー反応を起こし、これは重い場合致死原因となる。患者はよた■ａ因子に対し高い抗体力価を発現しこれにより次の治療が困難になりそして効果が上がらなくなる。したがって、インビトロにおけるタンパク質加水分解を受ける傾向のより少ない■ａ因子製剤がより満足すべきものであり、もしかすると■ａ因子治療により有効であろう。

■ａ因子はたぶん、他の循環タンパク質のように酵素分解により血流から除去されるであろう、この調節方法の初期段階において、生物学的に活性な酵素は１つまたは数個の感受性ペプチド結合で開裂して不活性分解分子を生ずる。インビボにおける酵素加水分解を最も受けやすいペプチド結合が、■ａ因子の生産、精製および／または貯蔵の間に加水分解されることが最もしばしば観察される不安定なペプチド結合と同一であることは大いに考えられることである。　（ジョージジェイ、ブロッツェ、ジュニア、　Ｃｅｏｒｇｅ　Ｊ、　Ｂｒｏｚｅ、　Ｊｒ、、スコツト　ヒックマン　５ｃｏｔ　Ｈｉｃｈｍａｎおよびジョセフ　ビイ。

メレチッヒ　Ｊｏｓｅｐｈ　Ｐ、　Ｍｉｌｅｔｉｃｈ、　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　７６（１９８５）９３７−９４６）。

■因子は１７のリシン（位置１８　、３２　、３８　、６２　、８５　、１０９　、１３７゜１４３　、１４８　、１５７　、１６１　、１９７　、１９９　、３１６　、３３７　、３４１　、３８９）および２４のアルギニン（位置９　、１５　、２８　、３６　、７９　、１１０　、１１３，１４４゜１５２　、２０２　、２２３　、２２４　、２４７　、２６６　、２７１　、２７７　、２９０　、３０４　、３１５゜３５３　、３７９　、３９２　、３９６　、４０２）残基を含み、原則としてすべてがタンパク質加水分解を受けるがしかし通常はこれら残基の幾つかが開裂部位として“活性”ではない。

循環する■ａ因子の正確な半減期は知られていないが、主な結果は静脈内投与すると■ａ因子前凝固活性が血流から直ちに明らかになることを示している（ウーラ　ヘドナー　［１１１ａＨｅｄｎｅｒおよびウォルター　キジール　Ｗａｉｔｅｒ　ｋｉｓｉｅｌ、　Ｊ。

Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　７１（１９８３）１８３６−１８４１）。

患者の治療および寿命は天然■ａ因子の観察された短かいインビボ半減期により影響されるというほどではない、比較的高い投与量と投与回数が所望の治療または予防効果を得そして維持するために必要である。結果として適切な投与規則を得るのが困難でそして頻繁な静脈内投与の必要性が患者の暮らし方に制限を加えるであろう。

したがって、当該技術において、生産、精製および貯蔵の間高濃度であっても安定でありそしてさらに天然または組換体■ａ因子よりも長い半減期と血液からの低いクリアランスを有する■ａ因子製剤についての必要性が存在する０本発明は特定の突変因子■／■ａを提供することによりこの必要性を満足するものである。

本発明の記載最も広い観点において本発明は分子における特定部位でのタンパク質加水分解開裂に対し安定である変更■／■ａ因子を提供するものである。

より詳しくは、本発明は天然因子■／■ａに゛おける１つ以上のタンパク質加水分解−感受性ペプチド結合をタンパク質加水分解により安定なペプチド結合で置換した変更■／■ａ因子を提供するものである。

本発明によれば、天然ヒト因子■／■ａ分子における特定位置で変更することにより達成される。このような変更は特定のアミノ酸残基の除去または１つ以上のアミノ酸残基を異なったアミノ酸残基で置換することを含む、たとえばトリプシン様タンパク質加水分解開裂は、特定の＾ｒｇおよび／またはＬｙｓ残基のＣ− 末端におけるペプチド結合を安定化すること、および／または特定の＾「ｇおよび／もしくはＬｙｓ残基を他のアミノ酸残基で置き換えること、および／または特定の＾ｒｇおよび／もしくはＬｙｓ残基を除去することにより防止される。

開裂が観察されたヒト■因子分子内でのトリプシン様開裂部位の例は次のようである：（ｉ）　リジン（３８）−ロイシン（３９）（ｉｉ）　リシン（３２）−アスパラギン酸（３３）（ｉｉ）　リジン（１４３）−アルギニン（１４４）（ｉＶ）　アルギニン（２９０）−グリシン（２９１）（ｖ）　アルギニン（３１５）− リシン（３１６）（ｖｉ　）　リジン（３１６）−バリン（３１７）、（ｖｉｉ）　リシン（３４１）−グリシン（３４２）、（ｖ＋”ｉ）　アルギニン（３９２）−七リン（３９３）、（ｉＸ’）　アルギニン（３９６）−プロリン（３９７）および（ｘ）　アルギニン（４０２）−アラニン（４０３）数少ないキモトリプシン様開裂もまた（ｘｉ）　イソロイシン（４２）および（趙）　チロシン（４４）の後で観察された。

これらのうちで開裂部位（ｉ）、　（ｉｉ＞、　（ｉｖ）および（ｖ）がタンパク質加水分解を最も受けやすいものの１つであることが見出され、一方残りは量的に重要性が低い、■／■ａ因子の安定化を考えた場合、得られた変更■因子がその活性を維持していることが重要な見地である。これは、本発明によれば変更されるべき範囲における天然■／■ａ因子の配列を関連タンパク質たとえば■因子、Ｘ因子、■因子、およびプロティンＣにおける相当する配列と比較することにより得られる。主な開裂部位付近の同様な配列を以下に示す：■因子　ＥＥＡＲＥＩＦに０＾ＥＲＴＫＬＦＩＩＩＩｓＹＸ因子ＥＥＡＲＥＶＦＥＤＳＤＫＴＮＥＦＨＮＫＹ■因子　ＥＥＡＲＥＶＦＫＮＴＥＲＴＴＥＦＷＫＱＹ７”　Ｄ　ティ：ｙ　ＣＥＥＡＫｆＪＦＱＮＶＤＤＴＬＡＦＷＳＫＨ■因子ＬＶＳＧＩＩＩＣ：ＱＬ−−−−−−−ＬＤＲＧＡＴＡＬＥＬＸ因子ＩＶＳＧＦにＲＴ−−−−− −−ＨＥＫＧＲＱＳＴＲＬ■因子ＹＶＳ（ＪＩＧＲＶ−−−−−−−ＦＨＫＧＲＳＡＬＶＬフロティ：ｙ　ＣＬＶＴＧＷＧＹＨ−−−−−−−ＳＳＲＥＫＥＡＫＲＮ■因子ＣＬＱＱＳＲＫＶＧＤＳＰＮＩＴＥＹＭＦＣＡＧＹＳ−ＤＣＳＫ−ＤＳＣＫＧＤＳＧＧＰＨＸ因子　Ｃ−−−−−ＫＬＳＳＳＦＩＩＴＱＮＭＦＣＡＣＹＤ−ＴＫＱＥ−ＤＡＣＱＧＤＳＧＧＰＨ■因子　ＣＬＲ−ＳＴＫＦＴ−−−− ＩＹＮＮＭＦＣＡＧＦＨ−ＥＧＣＲ−ＤＳＣＱＧＤＳＧＧＰＨフロティアＣＣ３ＥＶＨ５ＮＨ−−−−−ＶＳＥＷＩ、ＣＡＧＩＬ−ＤＧＲＱ−ＤＡＣＥＧＤＳＧＧＰＨしたがって、本発明の目的は、リシン、アルギニン、イソロイシンおよびチロシン残基（ｉ）　リシンク３８）（ｉｉ）　リジン（３２）（宙）　リジン（１４３）＜ｉｖ）　アルギニン（２９０）（マ）　アルギニン（３１５）（ｖｉ）　リシン（３１６）（ｖｉ）　リジン（３４１）（偏）　アルギニン（３９２）（ｉｘ　）　アルギニン（３９６）（ｘ）　アルギニン（４０２）（ｘｉ）　イソロイシン（４２）および（趙）チロシン＜４４）の１つ、それ以上またはすべてを置換または欠失することにより安定化することからなる変更■／■ａ因子を提供することである。

本発明の好ましい実施態様において、位置（３２）　、　（３８）　。

（２９０）および（３１５）におけるアミノ酸残基の１つ、それ以上またはすべてを置換または欠失することにより安定化される。

本発明によれば３２番目のＬｙｓ（ｉｉ）および／または３８番目のＬｙｓ（ｉ）は他のアミノ酸残基により置き換えられる。　Ｌｙｓ（３８）はＴｈｒ　、＾ｓｐ　、　Ｌｅｕ　、　Ｇｌｙ　、＾Ｉａ　、　Ｓｅｒ　、＾ｓｎまたはＨｉｓにより置き換えることが好ましくそしてＬｙｓ　（３２）はＧｌｎ　、　Ｇｌｕ　、　Ｈｉｓ。

Ｇｌｙ　、　Ｔｈｒ　、八ＩａまたはＳｅｒにより置き換えることが好ましい。

また２９０９０番目ｒｇ（ｉｖ）は他のアミノ酸残基たとえばｃｒｙ　。

＾１ａ　、　Ｓｅｒ　、　ＴｈｒまたはＬｙｓにより置き換えられ、Ｓｅｒ　、八！ａまたはＧｌｙにより置き換えることが好ましい。

＾ｒｇ（３１５）　（ｖ　）はＧｌｙ　、　Ｔｈｒ　、＾Ｉａ　、　ＳｅｒまたはＧｌｎにより置き換えられるのが好ましい。

さらにＬｙｓ（３４１）（ｖｉ　）はＧｌｕ　、　Ｇｉｎ　、　Ｇｌｙ　、　Ｔｈｒ　、＾１ａまたはＳｅｔ、好ましくはＧｌｕまたはＧｌｎにより置き換えられるのが好ましい。

上述の＾ｒｇそれぞれのＬｙｓを他のアミノ酸残基で置換することに加え、＾ｒｇまたはＬｙｓアミノ酸残基の除去もまたタンパク質加水分解開裂を避けるために考慮される。さらに、このような＾ｒｇまたはＬｙｓ残基のＮ−またはＣ−末端のいずれかにおけるアミノ酸残基の１つ以上が、タンパク質加水分解に感受性のあるペプチド配合における安定化効果を示す別のアミノ酸残基により置換されてもよい、このような変型の例は、Ｌｙｓまたは＾ｒｇのＣ−末端に連結したアミノ酸残基のＰｒｏによる置換である。４２番目（ｘｉ）と４４番目（ｘｉ）でのタンパク質加水分解開裂を避けるために、Ｉｌｅ　（４２）および／またはＴｙｒ　（４４）が＾ｓｎ　、　Ｓｅｒ　、＾ＩａまたはＧｉｎにより置換されうる。

本発明は上述の置換および欠失のいずれかの組合せを含むことを意図する。

本発明の他の目的は以下の詳細な説明および添付の図面を参照すると明らかになるであろう。

図面の簡単な説明第１図は、■因子に関して１文字記号により与えられるアミノ酸配列とその仮の構造であり、第２図はプラスミドｐＦＷ１０−３／６の構築であり、第３図はプラスミドｐＦＭ６０−３７６の構築であり、第４図はプラスミドｐＦＷＸ−３／６の構築である。

定義本発明の説明の前に、ここで使用される特定用語の定義を説明することがこの理解のために有用である。

相補的ＤＮＡすなわちｃＤＮ＾：　ｍＤＮＡ鋳型またはこれら分子のクローンに存在する配列から酵素的に合成されるＤＮＡ分子または配列。

ＤＮＡ構築：天然産生遺伝子から不完全な形で単離されるかまたは他に天然には存在しないような方法で組合わせたかまたは並置されたＤＮＡ断片を含むように変性された一本鎖または二本鎖のＤＮＡ分子またはその分子のクローン。

プラスミドまたはベクター：宿主細胞へ挿入したときその複製をもたらす遺伝情報を含むＤＮＡ構築。プラスミドは一般に宿主細胞において発現されるべき少なくとも１つの遺伝子配列、ならびにプロモーターおよび転写開始部位を含みこのような遺伝子発現を助長する機能をコードする配列を含む。

これは線状または閉じた環状分子である。ここで使用されるように、用語発現ベクターは、興味のあるタンパク質またはポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に使用可能に連結した転写プロモーターおよびターミネータ−を含むプラスミドまたはベクターを意味するものである０発現ベクターはさらに選択可能なマーカー、エンハンサ−、ポリアデニル化シグナル等を含む他の要素を含有してもよく、これは選択される特定の宿主細胞により一部決定されるであろう。

生物学的活性：生物学的関係（すなわち、微生物中またはインビトロ複製物中）において分子により行なわれる単一機能または一連の機能、タンパク質の生物学的活性は触媒活性またはエフェクター活性に分けられうる。凝固因子の触媒活性は一般に前駆体の特異的開裂を介して他の因子を活性化することを含む、エフェクター活性は生物学的に活性な分子とカルシウムまたは他の小さい分子を特異的に結合しタンパク質のような巨大分子または細胞にすることを含む、エフェクター活性は生理学的条件下でしばしば触媒活性を増加し、またはこれに欠くことができない、幾つかの場合、触媒活性およびエフェクター活性はタンパク質の同じ領域内に存在する。

■ａ因子について、生物学的活性は外部経路を介して血液凝固と調停することにより特徴ずけられる。■ａ因子はＸ因子を活性化してＸａ因子とし、これが次いでプロトロンビンをトロンビンへ転化しこれにより繊維凝集の形成が開始される。

本発明による変更■ａ因子は実質的に天然■ａ因子とほとんど同じ生物学的活性を有する。

本出願で使用される“■／■ａ因子”は不活性形（■因子）もしくは活性形（■ ａ因子）のいずれがまたはこれらの混合物からなる生成物を意味する。“変更■ ／■ａ因子”は、１つ以上のアミノ酸残基の置換または欠失により■／■ａ因子がら誘導される生物学的に活性な分子を意味する。

本発明による変更が遺伝子発現レベルで行なわれるため■因子の分子に導入される変性もまた活性化生成物（■ａ因子）において見られる。

上記定義における“■／■ａ因子”は天然のヒト■／■ａ因子のアミノ酸配列を有するタンパク質を含む、これはまたこれらのタンパク質が実質的に■ａ因子の活性を維持する限りは若干変更されたアミノ酸配列たとえばＮ末端アミノ酸欠失または追加を含む変更したＮ−末端を有するタンパク質を含む。

上記定義において“■因子”はまた存在しそして一方から他方へ生じうる天然の対立遺伝子の変化を含む、またグリコジル化または他の翻訳後変更の程度および位置は、選択される宿主細胞および宿主細胞環境の性質に応じて変化しうる。

ここで使用される■／■ａ因子のアミノ酸配列の番号系は、第１図から明らかである。ここでＮ末端アラニンは隘１でありＣ末端プロリンは患４０６である。

アミノ酸に使用される３文字または１文字記号は当該分野で通常使用されているものである：すなわち、アスパラギン酸　＾ｓｐ　Ｄグルタミン酸　Ｇｌｕ　Ｅフェニルアラニン　Ｐｈｅ　Ｆグリシン　Ｇｌｙ　にヒスチジン　Ｈｉｓ　Ｈイソロイシン　Ｉｌｅ　、　１メチオニン　Ｍｅｔ　Ｍアスパラギン　＾ｓｎ　Ｎプロリン　Ｐｒｏ　Ｐグルタミン　Ｇｌｎ　Ｑアルギニン　＾ｒｇ　Ｒセリン　Ｓｅｒ　Ｓトレオニン　Ｔｈｒ　Ｔバリン　Ｖａｌ　Ｖトリプトファン　Ｔｒｐ　ｔｉ＋チロシン　Ｔｙｒ　Ｙ γ−カルボキシグルタミン酸　Ｇｌａ　Ｙ本発明を実施するための最良の態様 ■因子ｃＤＮＡにおいてオリゴヌクレオチド−指向部位特異的突然変異誘発によりアミノ酸変化を導びくことが好まし゛い、大腸菌細胞スクリーニング後突然変異した■因子遺伝子を単離し適当な発現ベクターへ再クローンする０次いで発現ベクターを適当な宿主細胞へトランスフェクトし、適当な培地で培養すると変更 ■因子を発現し、そして分泌し、これは培養基から回収後に公知手段により相当する変更した■ａ因子へ転化される。

様々な宿主細胞が使用可能であり、たとえば哺乳動物細胞、酵母および他の真菌およびバクテリアを含む。しかしながら、哺乳動物細胞が好ましい、特に好ましい哺乳動物細胞系はＢＨＫＭ胞系ｔＫ−ｔｓ１３（ウエヒター　ＷａｅｃｈｔｅｒとバッセルガＢａｓｓｅｒｇａ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７９：　１１０６−１１１０゜１．９８２　）である。これらの宿主の各々においてクローン遺伝子を発現する方法は当該技術で公知であり、たとえばヨーロッパ公開特許出願箱２００，４２１号（哺乳動物細胞における■および■因子の発現）、ヨーロッパ公開特許出願箱１９１．６０６号（バクテリア細胞におけるプロティンＣの発現）およびヨーロッパ公開特許出願箱１６７．４２０号（酵母における■因子の発現）を参照せよ。

培養された哺乳動物細胞において本発明による変更■因子の発現に対し、クローンされた変更■因子配列を含む発現ベクターを適当なトランスフェクション技術により、たとえばリン酸カルシウム仲介トランスフェクションで細胞へ導入する（グラハム　（：ｒａｈａｍとファンデルニブ　Ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ。

Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　５２　：　４５６−４６７、１９７３　：ウィグラーら一１ｇ１ｅｒ　ｅｔ　ａｌ。

による変更、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７７　：　３５６７−３５７０．　’１９８０）　、エレクトロポレーショントランスフェクション法も８４１−８４５．１９８２）　、　ＤＮＡ−リン酸カルシウム沈でん物が形成され、そしてこの洗でん物が細胞へ施こされる。細胞の一部がＤＮＡを取り込み数日の間で細胞内部にこれを維持する。

細胞の少量部分がＤＮＡを宿主細胞のゲノムへ融は込ませる。

これらの複合体は選択可能なフェノタイプ（Ｍ択可能なマーカー）を授ける遺伝子とコトランスフェクションすることにより同定される。好ましい選択可能なマーカーはマウスジヒドロホレートレダクターゼ（ＤＨＰＲ）遺伝子であり、これは薬剤メトトレキセート（１４ＴＸ）に対する細胞耐性を付与する。宿主細胞がＤＮＡを取り込んだ後、適当な方法で選択可能なマーカーを表現している細胞の集落を選択するために薬剤選択を行なう。

トランスフェクトした細胞により作られる変更■因子はクエン酸バリウムへ吸着することにより細胞培養基から除かれる。使用済みの培地をクエン酸ナトリウムと塩化バリウムと混合し、沈でん物を集める０次いで沈でん物質を適当な凝固因子の存在について分析する。さらに免疫吸着法により精製を行なう、免疫吸着カラムは高特異性モノクローナル抗体からなるものが好ましい、これに代わって、クエン酸バリウム沈でん物質の精製をさらに一般的な生化学的方法または高性能液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）により行なってもよい。

−重鎖の変更■因子から活性な二本鎖変更■ａ因子への転化はへドナーおよびキジールにより記載されているように（Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　７１　：　１８３６−１８４１．１９８３）■ａ因子を用いて、または他のトリプシン様特異性を有するプロテアーゼ（キジールおよびフジカワ、Ｂｅｈｒｉｎｇ　Ｉｎ５ｔ、　Ｍｉｔｔ、）３：２９−４２、１９８３＞を用いて達成される。これに代わり、変更■因子は、たとえばモノＱ■　（ファルマシア　ファイヤー　ケミカルズ）のようなイオン交換クロマトグラフィカラムまたはその他にこれを通すことにより活性化される（ボジョールらＢｊｏｅｒｏ　ｅｔ　ａｊ！、、Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅｓ、　２６９．１９８６年９月、ｐ５６４−５６５）。

次の例は説明のために示されるものであって限定するためではない。

例材料および方法制限酵素はベセスダ　リサーチラボラトリイーズ＜ＢＲＬ）、ニューイングランド　バイオラボス　およびストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）から得られそして特記しない限り製作者に指示されるように使用され、オリゴヌクレオチドは調節された多孔性ガラス支持体上でホスホロアミダイトケミストリイを用いて自動ＤＮＡ合成機中で合成された（ニス、エル、ビューケージ　Ｓ、　Ｌ、　Ｂｅａｕｃａｇｅおよびエム、エッチ、カルーサーズり記載されているように形質転換したくモレキュラー　クローニングＭｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　：＾Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｕｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　１９８２）、１代表的な変更■因子は、オリゴヌクレオチド指示突然変異誘発によりアミノ酸阻３２をＬｙｓからＧｌｎへ変えそしてアミノ酸ＦｋＬ３８をＬｙｓからＴｈｒへ変えることにより調製された。

これらの変化を備えたオリゴヌクレオチドは次の配列である：１　）　Ｂｇｌ　ＩＩ　Ｌｙｓ（３２）Ｇｌｕ　Ｇｌｎこれは、ヌクレオチドの２２８番においてアミノ酸を変化させることなくＢｇｌＩＩ部位を破壊する変化と２３５番においてアミノ酸Ｌｙｓ　（３２）をＧｌｎへ変化することを備えた２７量体である。

Ｉ［）　Ｌｙｓ（３８）Ｔｈｒこれは、ヌクレオチドの２５４番においてアミノ酸Ｌｙｓ（３８＞をＴｈｒへ変化させた２１量体である。

別の代表的変更■因子は、オリゴヌクレオチド指示突然変異誘発によりアミノ酸１’ｋ　２９０を＾ｒｇからＳｅｒへ変えそしてアミノ酸隘３１５を＾ｒｇからＳｅｒへ変えることにより調製される。

これらの変化を有するオリゴヌクレオチドは次の配列のものである：Ｓｅｒこれは、ヌクレオチド１００９番においてアミノ酸＾ｒｇ（２９０）をＳｅｒへ変化させた２７量体である。

Ｓｅｒこれは、ヌクレオチド１０８４番および１０８６番においてアミノ酸＾ｒｇ（３１５）をＳｅｒへ変化させた２６量体である。

例ＩＬｙｓ（３２）をＧｉｎに替えた変更■ａ因子（因子■ａ　（Ｇｌｎ（３２））の製造再りローニング■因子ｃＤＮ＾３８個のアミノ酸長さのリーダーを有する■因子ｃＤＮ＾（ベルフナ−クー。エル、ら　Ｂｅｒｋｎｅｒ　Ｋ、Ｌ、　ｅｔａｌ、、Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＢａｒ　ｂｏｒ　ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　ｏｎ　Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、、　Ｖｏｌ、　Ｌｌ。

５３１−５４１．１９８６）をｐＧＥｌ’１３ベクター（プロメガ　バイオチクＰｒｏｍｅｇａ　Ｂｉｏｔｅｃ）のＥｃｏＲＩ位置にクローン化し、そして大腸菌ＭＣ１１０６１（ｄａ”）またはＭＣ１０００（ｄａａ＋−）バクテリア菌株中で増殖する。

短時間で、プラスミドＦＶＩＩ　（５６５＋２４６３）／　ｐＤＫをＥｃｏＲＩで切断し、■因子ｃＤＮ＾をＥｃｏＲＩ切断ｐＧＥ１４３と連結する。プラスミドＦＶ１１　（５６５＋２４６３）／ｐＤＸ　（１）構築はヨーロッハ特許出願第８６３０２８５５．１号に記載されている。プラスミドはまたアメリカンタイプカルチャーコレクション（＾ＴＴＣＮｉ４０２０５）に寄託されている。

小スケールおよび大スケールのＤＮＡ標品は、たとえばマニアタイスらによるＭｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、＾ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｕｒ　１９８２に記載されているように調製される。これらプラスミド標本の１つはｐＦＷ　１Ｏ−３／６と称する。ｐＦｌｌｌ　１０−３／６の構築は第２図に示される。

５′−ホスフェート基のオリゴヌクレオチドへの追加標識化または非標識化のいずれかのホスフェート基のオリゴヌクレオチドへの追加は記載されたように（マニアタイスら、同上）行なわれた。

二本鎖プラスミドＤＮＡを用いたオリゴヌクレオチド指示特定部位　突然変異誘発特定部位の突然変異誘発反応は、モリナガらＭｏｒｉｎａｇａ　ｅｔ。

ａｌ、　１９８４年（ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯにＹ　ｖｏｌ、２．　ｐ６３６）の方法を変更することにより行なわれた。　ＦＶＩＩ　ｃＤＮ＾を含むプラスミドｐＦｌｌ１１０−３／６をＢｇｌ　Ｉ　、プラスミドにおける唯一の部位で消化する。この開裂はアシピシリン耐性を破壊する第３図および第４図に示された断片ａ）を生じる。断片ａ）はアガロースゲルからの電気的溶出によりＭ製され、上述のマニアティスらが記載したようにウシ腸管アルカリホスファターゼ（ＣＩ八へ）で処理。

する。

ｐＦＷ　１０−３／６の別のサンプルをＢａ５ｓＨＩｆおよびＳａｃ　ＩＩで消化してＦＶＩＩ　ｃＤＮＡにおける５７ｓｂｐのウィンドウを有する第３図の断片ｂ）を生ずる。断片ｂ）を電気泳動後アガロースゲルから電気的溶出により精製する。

断片ａ）およびｂ）をさらに数回フェノール抽出、フェノール／クロロホルム（１：　１　、　Ｖ／Ｖ）およびクロロホルム／イソアミルアルコール（２４：１、ｖ／ｖ）抽出により精製し、０．３Ｍ　Ｎａ−アセテートおよび７０％（ｖ／ｖ）エタノールで沈でんさせ、そしてＴ　Ｅ　（１０１ＭＭ　）リス、１　ｌＩＩＭ　ＥＤＴＡ　ｐＨ７，６）に溶かす。

次いで、断片ａ）およびｂ）の両方０．１〜０．１５ｐｍｏｌをエッペンドルフ管（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ　ｔｕｂｅ）中でホスホリル化合成オリゴヌクレオチドｌ　）２５ｐｍｏ！とともに混合する。

次いで、５Ｘポリメラーゼ−リガーゼ緩衝液（０，５Ｍ　ＮａＣｊ２゜３３ｍＭ　）　！ＪスＨＣｊ！　ｐＨ７，５，４０ｉｎＭ　ＭｇＣＬ、　５ｍＭ　２−ＭＥ）　１０ｕ１を添加する。

最終混合物からサンプル１５μｌを除きそしてゲル電気泳動でマーカーとして後で使用するまで水中に貯蔵する。残りの混合物を沸とう水浴中で４分間インキュベートしＤＮＡ断片を変性する。インキュベーション後、混合物を漸次冷却する。

再度アニーリングするとベテロ二重鎖が形成されアガロースゲル電気泳動を用いると正しい突然変異を有する新規環状ＤＮＡの形成が上記からの非加熱サンプルと比較することにより示される。

４つのデオキシリボヌクレオシドトリホスフェート（各々２．５ｍＭ）１０μｍ、　２０＋ｓＨＡＴＰ　３μり、　ＤＮＡポリメラーゼＩ　（５０／μＮ）のフレノウフラグメント１μにおよびＴ４　ＤＮ＾リガーゼ（ＩＯＵ／μｍ）１μｌをペテロ二重鎖（最終審！４０μｍ）の混合物（２０μＮ）へ加える。最終混合物は一晩１２℃にてインキュベートする。

大腸菌ＭＣ１０６１およびＭＣ１０００のインキュベーション混合物を用いた形質転換の結果アンピシリン耐性形質転換体が得られる。突然変異体ＦＶＩＩ遺伝子を有する形質転換体は５′−３２ｐ−ラベル化２７量体と２１量体合成オリゴヌクレオチドとのコロニーハイブリダイゼーション（マニアティスら）により選択される。

再形質転換後プラスミドＤＮＡを選択したコロニーから精製し、分析しそして配列くマクサム−ギルバート法およびジデオキシ法）して合成オリゴヌクレオチドにより起こされる突然変異を変化させる。

Ｌｙｓ（３２）がＧｌｎで替えられた突然変異■因子遺伝子を有するプラスミドｐＦＮ　６０−３／６の構築を第３図に示す。

ｐＦＷ　６０−３／６をＥｃｏＲＩで消化し、ＥｃｏＲＩ　−ＥｃｏＲＩ■因子断片をＥｃｏＲＩ’ｔｔ片ｐＤｘフラスミトへ連結しテフラスミドＦＶＩＩ　（５６５＋　２４６３）／ｐＤＸにおけると同じ方向に■因子（Ｇｉｎ　３２）遺伝子を有するプラスミドｐＦＷ　７８−３／６が得られる１次いでプラスミドｐＦＩｌｌ　７８−３／６を、上述の一般的方法にしたがってＢＨＫｔｋ−Ｌｓ１３細胞へトランスフェクトする。

次いで細胞により作られた変更■因子をクエン酸バリウムとともに沈でんさせ、免疫吸着により精製し；活性化してビョルンら（上述）により記載したようにイオン交換クロマトグラフィカラムにこれを通すことにより活性化して変更■ａ因子とする。

活性試験活性化天然■ａ因子のように、活性化変更■ａ因子は一段階凝固分析において凝固期間を短かくする。活性化変更■ａ因子は、３９０ｗｈＨＮａＣ１と５ｍＭＥＤＴ＾からなるｐＨ８，５の１０１９Ｍトリス−ＨＣＩＭ街液中はぼ０．９ｖａｇ７’ａｌの濃度でインキュベーションする。減少サンプルのＳＯＳ　−ＰＡＧＥにより分解をモニターし、そしてかなりの分解が生じたときはアリコートを回収しＨＰＬＣカラムへ施こす、調製用クロマトグラフィは主に、アミノ酸配列のためのサンプルからトリスをそのまま排除しそしてカラムからともに溶出する分解した変更■ａ因子を排除することが仕事である。Ｎ−末端アミノ酸配列は、グルタミン残基嵐３２とアスパラギン酸残基陽３３の間のペプチド結合の加水分解が起きないことを表わしている。対照的に、活性化天然■ａ因子に対応研究で行なったように同じ処理および分析を行なった場合リシン残基阻３２に重大な分解が見られた。

例２Ｌｙｓ（３８）がＴｈｒと替えられた変更■ａ因子（■ａ因子（Ｔｈｒ３８））の製造 ■）の代わりに合成オリゴヌクレオチド■）を使用した以外は例１の方法を続けると突然変異■因子遺伝子を有する発現プラスミドが得られる。

次いでこのプラスミドをＢＨＫｔｋ−ｔｓ１３ａｌ胞へトランスフェクトし、■ 因子（Ｔｈｒ３８）を細胞上澄から回収し活性化して上述のような■ａ因子（Ｔｈｒ３８）とする。

例３Ｌｙｓ（３２）およびＬｙｓ（３８）がそれぞれＧｉｎおよびＴｈｒで替えられた変更■ａ因子（■ｄ因子（Ｇｔｎ３２．　Ｔｈｒ３８））の製造オリゴヌクレオチド■）および■）の両方とも１２．５ｐｍｏｌを特定部位突然変異誘発反応に使用することだけを除いて例１の方法を行なうと、突然変異■因子遺伝子を有する発現プラスミドが得られる。

次いでこのプラスミドをＢＨＫｔｋ−ｔｓ１３細胞へトランスフェクションし、 ■因子（ＧＩｎ３２．丁ｈｒ３８）を細胞上澄から回収し活性化して上述したように■ａ因子（Ｃ１ｎ３２．　Ｔｈｒ３８）とする。

例４Ａｒｇ（２９０）をＳｅｒに替えた変更■ａ囚子（■ｄ因子５ｅｒ（２９０））の製造。

Ａｒｇ（２９０）をＳｅｒに替えた突然変異■因子遺伝子を有するプラスミドｐＦＨ八−３／６の構築を第４図に示す。

プラスミドｐＦＮ　１０−８／６を使用して例１の断片ａ）を作る；そしてｐＦＷ　ｔｏ−３／６の別のサンプルを、ＦＶＩＩ　ｃＤＮＡにおいて１３６６ｂｐのウィンドウを有する第４図に示す断片ｂ）を生ずるＳａｃ　ｎとＤｒａ　ｍで消化する。

次いで断片ｂ）およびａ）を例１に記載したように処理するがただしオリゴヌクレオチド■）をＩ）の代わ゛りに使用する。

ｐＦＷ＾−３／６をＩｌ、ｃｏＲＩで消化し、そしてＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＴ■ 因子断片をＥｃｏＲ１切断ｐＤＸプラスミドへ連結するとプラスミドＦＶ１１（５６５＋２４６３）／ｐＤＸと同じ方向で■（Ｓｅｒ２９０）遺伝子を有するプラスミドｐＦＭ　Ｘ−３／６が得られる０次いでプラス、ミドｐＦ１４Ｘ−３／６を上記した一般的方法にしたがってＢＨＫｔｋ−ｔｓｆ３細胞へトランスフェクションする。

次いで細胞により作られる変更■因子をクエン酸バリウムとともに沈でんし：免疫吸着により精製し；そしてビョルンら（上述）が記載したようにイオン交換クロマトグラフィカラムに通過させることにより変更■ａ因子を活性化＾ｒｇ（３１５）をＳｅｒに替えた変更■ａ因子（■因子（Ｓｅｒ３１５））の製造。

合成オリゴヌクレオチド■）を■）に替えること以外は例４の方法を行なうことにより、変更■因子遺伝子を有する発現プラスミドが得られる。

次いでこのプラスミドをＢＨＫｔｋ−ｔｓ１３細胞へトランスフェクションし、 ■因子（Ｓｅｒ３１５）を細胞上澄から回収し記載したように■ａ因子（Ｓｅｒ３１５）へ活性化する。

例６３つの活性タンパク質開裂部位の測定幾つかの活性開裂部位を固定するために、組換体■因子の列分析を行なう。結果を次の第１表に示す。

このサンプルにおいて４つのＮ−末端は、Ｌｅｕ−３９（カラム１）　、Ｇｌｙ −２９１（カラム３）および１ｙｓ−３１６（カラム４）がタンパク質加水分解開裂に相当しそして１ｉｅ−１５３（カラム２）が　Ｆ■のＦＶＩａへの活性化に相当するものと考えられる。

浄￥１！（内存に変更なし）ＦＩＧ、　２浄餐Ｔ（内存ｊこ変Ｅ：’　しンＦ＋ｃ、　３浄書（内９に変；なし〉ＦＩＧ、４補正書の翻訳文提出書（特許法第１８４条（唄−１−弁）平成１年１２月２５日特許庁長官　吉　１）文　毅　殿１　特許出願の表示Ｐ　ＣＴ／ＤＫ８　Ｂ１０　Ｏ１０３２発明の名称変更■／■ａ因子３　特許出願人住所　デンマーク国、デーコー−２８８０バグスバエルト。

ノボ　アレ（番地なし）４代理人浄書（内容に変更なし）　請求の範囲１．１つ、それ以上またはすべてのりシン、アルギニン、イソロイシンおよびチロシン残基（ｉ　）　Ｌｙｓ（３８）（ｉｉ　）　Ｌｙｓ（３２）（ｉｉｉ）　Ｌｙｓ（１４３）（ｉｖ）　Ａｒｇ（２９０）（ｖ）　Ａｒｇ（３１５）（ｖｉ　）　Ｌｙｓ（３１６）（ｖｉｉ）　Ｌｙｓ（３４１）（脩）　Ａｒｇ（３９８）（ｉｘ）　Ａｒｇ（３９６）（ｘ）　八ｒｇ（４０２）（ｘｉ　）　Ｉ　Ｉｅ（４２）（ｘｉ）　Ｔｙｒ（４４）が置換されおよび／または欠失している変更■／■ａ因子。

２、アミノ酸残基（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｖ＞または（ｖ）の１つ、それ以上またはすべてが置換されまたは欠失している請求項１に記載の変更■／■ａ因子。

３、Ｌｙｓ（３８）がＴｈｒ、＾ｓｐ　、　Ｌｅｕ　、　Ｇｌｙ　、＾ｌａ　、　Ｓｅｒ　、＾ｓｎまたはＨｉｓで置き換えられた請求項１または２に記載の変更■／■ａ因子。

４、Ｌｙｓ（３８）がＴｈｒで置き換えられた請求項３に記載の変更■／■ａ因子。

】！７）５、Ｌｙｓ（３２）がＧｉｎ　、　Ｇｌｕ　、　Ｈｉｓ　、　Ｇｌｙ　、　Ｔｈｒ　、八ｌａまたはＳｅｒで置き換えられた請求項１または２に記載の変更■／ ■ｄ因子。

■／■ａ因子。

７、Ａｒｇ（２９０）がｃｒｙ　、＾ｌａ　、　Ｓｅｒ　、　ＴｈｒまたはＬｙｓで置き換えられた請求項１または２に記載の変更■／■ａ因子。

８、Ｌｙｓ（３８）がＳｅｒ　、＾１ａまたはｃｒｙで置き換えられた請求項１または２に記載の変更■／■ａ因子。

９、Ａｒｇ（３１５）がＧｌｙ　、　Ｔｈｒ　、　Ｓｅｒ　、＾１ａまたはＧｌｎで置き換えられた請求項１または２に記載の変更■／■ａ因子。

１０、Ｌｙｓ（３４１）がＧｌｕ　、　Ｇｌｎ　、　Ｔｈｒ　、　Ｓｅｒ　、＾ＩａまたはＧｌｙ、好ましくはＧｌｕまたはＧｌｎで置き換えられた請求項１まなは２に記載の変更■／■ａ因子。

１１、ｌ１ｅ（４２）が＾ｓｎ　、　Ｓｅｒ　、＾ＩａまたはＧｌｎで置き換えられた請求項１に記載の変更■／■ａ因子。

１２、Ｔｙｒ（４４）が＾ｓｎ　、　Ｓｅｒ　、＾１ａまたはＧｌｎで置き換えられた請求項１に記載の変更■／■ａ因子。

１３、請求項３〜１２のいずれかに記載の置換基のいがなる組合せをも含む請求項１または２に記載の変更■／■ａ因子。

Ｘ４．　Ｌｙｓ（３８）がＴｈｒで置き換えられ、Ｌｙｓ（３２）がＧｌｎで置き換えられた請求項１まなは２に記載の変更■／■ａ因子。

１５、請求項１〜１４のいずれかに記載の変更■／■ａ因子をエンコードするＤＮＡ配列。

１６、請求項１５に記載のＤＮＡ配列を含む発現ベクター。

１７、形質転換して請求項１〜１４のいずれかに記載の変更■／■ａ因子を作る細胞。

１８、■因子の発現をエンコードする遺伝子が天然の■因子におけるリシン、アルギニン、イソロイシンおよびチロシン残基（ｉ　）　Ｌｙｓ（３８）＜ｉｉ　）　Ｌｙｓ（３２）（ｉｉｉ　）　Ｌｙｓ（１４３）（ｉｖ）　Ａｒｇ（２９０）（Ｖ）　八ｒｇ（３１５）（Ｖｉ）　Ｌｙｓ（３１６）（翰）　Ｌｙｓ（３４１）（ｖｉｉｉ）　Ａｒｇ（３９８）（ｉｘ）　Ａｒｇ（３９６）（Ｘ）　Ａｒｇ（４０２）（ｘｉ　）　Ｉ　１ｅ（４２）（ｘｉ）　Ｔｙｒ（４４）の発現の原因であるコドンの１つ、それ以上またはすべてで突然変異を起こされ、前記アミノ酸残基の１つ、それ以上またはすべてを置換または欠失した変更■ 因子を発現しうる変異した遺伝子を生じ、前記変異遺伝子を発現しうる適当な宿主へ前記変異遺伝子を挿入し、前記宿主を適当な増殖培地中で培養しこれにより変更■／■ａ因子を発現し、次いでこれを単離し場合により活性化して変更■ａ因子生成物を生ずることからなる変更■／■ａ因子の製造方法。

１９、製造された変更■／■ａ因子においてアミノ酸残基（ｉ＞、　（ｉｉ＞、　（ｉｖ）および（ｖ）の１つ、それ以上またはすべてが置換されまたは欠失している請求項１８に記載の方法。

２０、製造された変更■／■ａ因子においてＬｙｓ（３８）がＴｈｒ　。

＾ｓｐ　、　Ｌｅｕ　、　Ｇｌｙ　、＾Ｉａ　、　Ｓｅｒ　、＾ｓｎまたは旧Ｓで置き換えられた請求項１８または１９に記載の方法。

２１、製造された変更■／■ａ因子においてＬｙｓ（３８）がＴｈｒで置き換えられた請求項２０に記載の方法。

２２、製造された変更■／■ａ因子においてＬｙｓ　（３２）がＧｉｎ　。

Ｇｌ’ｕ　、　Ｈｉｓ　、　Ｇｌｙ　、　Ｔｈｒ　、＾ｌａまたはＳｅｒで置き換えられた請求項１８または１９に記載の方法。

２３、製造された変更■／■ｄ因子においてＬｙｓ（３２）がＧｉｎで置き換えられた請求項２２に記載の方法。

２４、製造された変更■／■ａ因子において＾ｒｇ（２９０）がＧｌｙ。

＾１ａ、・Ｓｅｒ　、　ＴｈｒまたはＬｙｓで置き換えられた請求項１８または１９に記載の方法。

２５、製造された変更■／■ａ因子においてＬｙｓ（３８）がＳｅｒ　。

＾１ｍまたはＧｌｙで置き換えられた請求項１８または１９に記載の方法。

２６、製造された変更■／■ａ因子において＾ｒｇ（３１５）がＧｌｙ。

Ｔｈｒ　、　Ｓｅｒ　、＾ＩａまたはＧｌｎで置き換えられた請求項１８または１９に記載の方法。

２７、製造された変更■／■ｄ因子においてＬｙｓ（３４１）がにＩｕ。

Ｇｌｎ　、　Ｔｈｒ　、　Ｓｅｒ　、＾１ａまたはＧｌｙ好ましくはＧｌｕまたはＧｌｎで置き換えられた請求項１８に記載の方法。

２８、製造された変更■／■ａ因子においてＨ！ｅ（４２）が＾ｓｎ。

Ｓｅｒ　、Δ１ａまたはＧｌｎで置き換えられた請求項１８に記載の方法。

２９、製造された変更■／■ｄ因子においてＴｙｒ（４４）が＾ｓｎ。

Ｓｅｒ　、＾１ａまたはＧｌｎで置き換えられた請求項１８に記載の方法。

３０、製造された変更■／■ａ因子において請求項２０〜２９のいずれかに記載された置換基のいずれかの組合せが存在する請求項１８に記載の方法。

３１、製造された変更■／■ｄ因子においてＬｙｓ（３８）がＴｈｒで置き換えられそしてＬｙｓ（３２）がＧｉｎで置き換えられた請求項１８または１９に記載の方法。

手続補正書（方式）％式％１、事件の表示ＰＣＴ／ＤＫ８８１００１０３２、発明の名称変更■／■ａ因子３、補正をする者事件との関係　特許出願人名称　ノボ−ノルディスク　アクティーゼルスカブ４、代理人住所　〒１０５東京都港区虎ノ門−丁目８番１０号静光虎ノ門ビル　電話５０４ −０７２１５、補正命令の日付６、補正の対象（１）　明細書及び請求の範囲の翻訳文（２）図面翻訳文７、補正の内容（１）明細書、請求の範囲の翻訳文の浄書（内容に変更なし）（２）図面翻訳文の浄書（内容に変更なし）８、　添付書類の目録（１）明細書及び請求の範囲の翻訳文　各１通（２）図面翻訳文　１通手続補正書（方式）平成２年　１７月　６日

Claims

【特許請求の範囲】

１．１つ、それ以上またはすべてのリシン、アルギニン、イソロイシンおよびチロシン残基（ｉ）リシン（３８）（ｉｉ）リシン（３２）（ｉｉｉ）リシン（１４３）（ｉｖ）アルギニン（２９０）（ｖ）アルギニン（３１５）（ｖｉ）リシン（３１６）（ｖｉｉ）リシン（３４１）（ｖｉｉｉ）アルギニン（３９２）（ｉｘ）アルギニン（３９６）（ｘ）アルギニン（４０２）（ｘｉ）イソロイシン（４２）および（ｘｉｉ）チロシン（４４）が置換されおよび／または欠失している変更ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子。
２．１つ、それ以上またはすべてのアミノ酸残基（ｉ），（ｉｉ），（ｉｖ）または（ｖ）が置換されるかまたは欠失する請求項１に記載の変更ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子。
３．Ｌｙｓ（３８）がＴｈｒ，Ａｓｐ，Ｌｅｕ，Ｃｌｙ，Ａｌａ，Ｓｅｒ，ＡｓｎまたはＨｉｓで置き換えられた請求項１または２に記載の変更ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子。
４．Ｌｙｓ（３８）がＴｈｒで置き換えられた請求項３に記載の変更ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子。
５．Ｌｙｓ（３２）がＣｌｎ，Ｃｌｕ，Ｈｉｓ，Ｇｌｙ，Ｔｈｒ，ＡｌａまたはＳｅｒで置き換えられた請求項１または２に記載の変更ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子。
６．Ｌｙｓ（３２）がＧｌｎで置き換えられた請求項５に記載の変更ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子。
７．Ａｒｇ（２９０）がＣｌｙ，Ａｌａ，Ｓｅｒ，ＴｈｒまたはＬｙｓで置き換えられた請求項１または２に記載の変更ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子。
８．Ｌｙｓ（３８）がＳｅｒ，ＡｌａまたはＧｌｙで置き換えられた請求項７に記載の変更ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子。
９．Ａｒｇ（３１５）がＣｌｙ，Ｔｈｒ，Ａｌａ，ＳｅｒまたはＣｌｎで置き換えられた請求項１または２に記載の変更ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子。
１０．Ｌｙｓ（３４１）がＧｌｕ，Ｃｌｎ，Ｃｌｙ，Ｔｈｒ，ＡｌａまたはＳｅｒ、好ましくはＧｌｕまたはＧｌｎで置き換えられた請求項１または２に記載の変更ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子。
１１．Ａｓｎ，Ｓｅｒ，ＡｌａまたはＧｌｎがＩｌｅ（４２）で置換された請求項１または２に記載の変更ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子。
１２．Ａｓｎ，Ｓｅｒ．ＡｌａまたはＧｌｎがＴｙｒ（４４）で置換された請求項１または２に記載の変更ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子。
１３．請求項３ないし１２のいずれかの置換物のいかなる組合わせからなる請求項１または２に記載の変更ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子。
１４．Ｌｙｓ（３８）がＴｈｒで置き換えられそしてＬｙｓ（３２）がＧｌｎで置き換えられた変更ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子。
１５．請求項１〜１４のいずれかによる変更因子ＶＩＩをエンコードするＤＮＡ配列。
１６．請求項１５によるＤＮＡ配列を含む発現ベクター。
１７．請求項１〜１４のいずれかによる変更ＶＩＩ因子を生産するために形質転換された細胞。
１８．変更ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子をコードするＤＮＡ配列を含む発現ベクターで形質転換した細胞を適当な培地中で培養し、前記ＤＮＡ配列によりエンコードされる変更ＶＩＩ因子を単離し、場合により活性化して変更ＶＩＩａ因子を生じさせることからなる変更ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子の製造方法。