JPH0341478B2

JPH0341478B2 -

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Publication number: JPH0341478B2
Application number: JP58015290A
Authority: JP
Priority date: 1983-01-31
Filing date: 1983-01-31
Publication date: 1991-06-24
Also published as: EP0134247A1; WO1984002912A1; JPS59141519A; EP0134247A4

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は制ガン作用を有する新規な蛋白質に関
する。カースウエル（Carswell）らは、バチルスカ
ルメツテイグエリン（Bacillus Calmette
Guerin，BCG）で感作したマウスに、14日目に
エンドトキシンを投与すると、２時間後にその血
清中に、Ｌ−細胞に対して細胞毒性を有する因子
が産生されることを見い出し、これをツーモア
ネクロシスフアクター（Tumor necrosis
factor.TNF）と名付けた〔Proc.Nat.Acad.Sci.，
USA，72巻，3666頁，1975年〕。グリーン
（Green）らは、上記物質を硫酸アンモニウムに
よる分画沈澱、ゲル過などにより部分精製し、
上記TNFの分子量が約150000であると報告した
〔Proc.Nat.Acad.Sci，，USA，73巻，381頁，
1976年〕。その後マテイウース（Matthews）ら
は、ウサギにBCGを投与し、２週間後にエンド
トキシンを投与して、TNFを産生し、精製して、
ゲル過法による分子量が39000で、ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動法（Polyacryl−amide
gel electrophoresis，PAGE）によつて67000で
あると報告した〔Br.J.Cancer，42巻，416頁，
1980年〕。更に原中らは、プロピオンバクテリウ
ムアクネス（Propionibacterium acnes）とエ
ンドトキシンを用いて、マウス及びウサギで
TNFを産生し、その分子量はゲル過法及び
PAGEにより39000であると報告した〔日本臨床、
40巻、1872頁、1982年〕。上記の如く、TNFはその生理活性から当初よ
り悪性腫瘍治療剤として期待されてきたが、これ
らはヒト以外の動物血清から製造され、工業的規
模での製造が困難であること、精製が困難である
こと、またヒト以外の動物に由来する蛋白成分で
あるため、抗原性の問題等があり、ヒトの治療上
の安全性等に問題があつた。しかして、ヒト培養
株化細胞から、同様の生理活性物質を製造する試
みがなされ、例えばアミノ（AMINO）らは、ヒ
ト培養株化リンパ系細胞Ｍ−7002又はＢ−7001に
アカインゲンマメレクチン（PHA）を作用させ
ることにより、マウスＬ−細胞に対して細胞毒性
作用を有する可溶性因子（HLTLCL）の誘導産
生を報告した〔The Journal of Immunology，
Vol.113，No.４，13 1334〜1345（1974）〕。該報告によれば、上記可溶性因子の分子量はゲ
ル過法で68000〜150000の範囲とされたが、未
だその本体を単離同定するには至つていない。本発明者らも上記Ｌ−細胞に対して細胞毒性を
有する物質の本体を究めるべく鋭意研究を重ねて
きた。その結果、ヒト由来の培養株化リンパ系細
胞から、上記生理活性を有し、しかも報告された
可溶性因子とは分子量において相違する別個の蛋
白質を単離精製することに成功し、これが制ガン
作用を有し、ヒトの治療上安全性の高いことを見
出しここに本発明に到達した。本発明の新規な蛋白質は、ヒト由来の培養株化
リンパ系細胞に、抗腫瘍物質誘導剤を作用させる
ことによつて誘導産出され、以下の特性を有する
ことにより特徴付けられる。 (1) 分子量ＡバイオゲルA1.5ｍを用いたゲル過法によ
る分子量バイオゲル（Biogel）A1.5ｍ（バイオ・ラド
社製、アメリカ）をカラム（16×1000mm、フアル
マシア社製、スエーデン）に充填し、0.04Mトリ
ス−塩酸／0.1％ドデシル硫酸ナトリウム
（SDS）／4M尿素／0.1M NaCl（PH7.8）の緩衝液
を用い、本発明物質試料200μｇ（蛋白量）を添
加し、ゲル過を行ない、試料の溶出位置より標
準分子量キツト〔フアルマシア社製、スエーデ
ン、マーカー；牛血清アルブミン（分子量
67000）、卵白アルブミン（分子量43000）、キモト
リプシノーゲンＡ（分子量25000）、リボヌクレア
ーゼ（分子量13700）〕から求めた標準曲線を用い
て分子量を算出した。尚上記蛋白量は、ブラツド
フオード（Bradford）の方法〔Anal.Biochem.，
72巻、248頁、1976年〕に準じてクーマジーブリ
リアントブル−Ｇ−250による色素結合法により
求めたものであり、以下同様である。その結果、本発明物質は、相対移動度が約1.37
に位置し、卵白アルブミンの前に溶出し、その分
子量は約55000であると認められる。Ｂ TSKゲルG3000SWを用いたゲル過法によ
る分子量フアルマシアFPLCシステム（フアルマシア社
製、スエーデン）にTSKゲルG3000SW（東洋曹
達社製）カラムを接続し、0.2M NaCl／0.1Mリ
ン酸ナトリウム（PH7.0）の緩衝液を用いて、本
発明物質試料100μｇ（蛋白量）を付加してゲル
過を行ない、高速液体クロマト用標準分子量キ
ツト〔オリエンタル酵母社製、マーカー；グルタ
ミン酸脱水素酵素（分子量290000）、エノラーゼ
（分子量67000）、アデニル酸キナーゼ（分子量
32000）、チトクロームＣ（分子量12300）〕を用い、
これらの溶出パターンより、本発明物質試料の分
子量を算出した。その結果、本発明物質の溶出時
間は、約40分であり、アデニル酸キナーゼの前に
溶出し、その分子量は約56000と算出される。Ｃ SDS／ポリアクリルアミドゲルを用いた電気
泳動法による分子量近藤らの方法〔生化学、44巻、304頁、1972年〕
に従い、リン酸ナトリウム／SDS（PH7.2）で、
SDS−ポリアクリルアミドゲルに、本発明物質試
料5μｇ（蛋白量）を付与し、40mAで７時間電気
泳動を行ない、標準分子量キツト〔フアルマシア
社製、スエーデン、マーカー；上記A.に同じ〕
を用いて、電気泳動パターンを記録し、これより
分子量曲線を作成し、試料の分子量を算出した。
その結果、本発明物質は、相対移動度が約0.41に
位置し、その分子量は約56000と算出される。 (2) 等電点等電点測定装置（バイオ・ラド社製、アメリ
カ）とアンホライン（Ampholine）ポリアクリ
ルアミドブレード（PH3.5〜9.5）（LKB社製、ア
メリカ）を使用し、標準等電点測定マーカーキツ
ト（フアルマシア社製、スエーデン）を使用し、
本発明物質の等電点を測定した。すなわち、紙
片に本発明物質試料約5μｇ（蛋白量）を吸収さ
せ、ゲル上にのせ、10W定電力にて、約２時間泳
動させ、電流が一定となつた時点で泳動を終了し
た。ゲルは１mm間隔で切り取り、緩衝液にて溶出
し、Ｌ−細胞に対する活性の測定に供した。等電
点は等電点マーカーを基準に算出した。その結
果、本発明物質の等電点はPH4.9±0.3と算出され
た。 (3) 溶解性、色及び性状本発明物質試料を３mg蛋白量／ml濃度に0.02M
トリス−塩酸緩衝液（PH7.8）に溶解した溶液は、
無色透明である。該溶液にアセトン又はエタノールを70V／Ｖ％
以上加えると沈澱を生ずる。また本発明物質の３mg蛋白量／ml水溶液は、弱
酸性を示す。 (4) 呈色反応ビユウレツト反応、フオリンローリー反応法、
ならびに塩酸加水分解後のニンヒドリン反応につ
いてペプチド結合ならびにアミノ酸の呈色反応
は、いずれも陽性である。また、本発明の蛋白質は、以下の生理活性を有
する点において特徴付けられる。 (a) Ｌ−細胞に対する細胞毒性作用前記カースウエル（Carswell）らの方法及び
クロスターガード（Kloster gaard）の方法
〔Mol.，Imm.，17巻、613頁、1980年〕に準じ
て、本発明物質のＬ−細胞殺細胞効果を評価し
た。すなわち、Ｌ−細胞を250単位／mlのペニシ
リンと125μｇ／mlのストレプトマイシンとを含
むイーグルスミニマルエツセンシヤルメデイ
ウム（MEM）培地に２×10⁵細胞／mlとなる濃
度で懸濁させ、このＬ−細胞懸濁液各0.1ml及び
適当濃度に希釈した本発明物質試料各0.1mlを、
96穴マイクロプレート（コースター社製、アメリ
カ）の各ウエルに入れ、これを５％炭酸ガス含有
空気中、37℃で48時間培養する。培養細胞をニユ
ートラルレツド（neutral red）で染色し、生
細胞数をタイターテツクマルチスキヤン（フロー
ラボラトリーズ社製、アメリカ）により比色定量
する。活性はＬ−細胞を80％殺す力を１単位と
し、これに試料の希釈倍数を乗ずる。その結果、本発明物質のＬ−細胞に対する細胞
毒性は、約3.5×10⁸単位／mg蛋白質以上であつ
た。 (b) メスＡ−ザルコーマ（Meth Ａ−sarcoma）
担ガンマウスによる抗腫瘍作用２×10⁵個メスＡ−ザルコーマ細胞を、
BALB／ｃマウス腹部皮内に移植し、７日後腫
瘍の大きさが直径７〜８mmとなつたマウスの尾静
脈より、上記Ｌ−細胞に対する細胞毒性作用測定
法 (a)で５×10³〜５×10⁴単位／mlに希釈した本発
明物質試料の0.2mlを注射し、48時間後、前記カ
ースウエルらの方法に準じて、以下の判定基準に
より抗腫瘍作用を判定した。（−）：変化なし（＋）：かすかな出血性壊死（）：中程度の出血性壊死（移植癌表面の真
ん中から50％以上にわたつて壊死）（）：顕著な出血性壊死（移植癌の中央部が
重度に壊死し、周囲の癌組織がわずかに残つ
た状態）得られた結果を下記第１表に示す。

【表】次に本発明の新規蛋白質を得る方法について記
述する。本発明の物質は、基本的には公知の方法に従
い、ヒト由来の培養株化リンパ系細胞に、抗腫瘍
物質誘導剤を作用させることによつて誘導され
る。ここで培養株化リンパ系細胞としては、特に
限定がなく、既に確立されている公知の各種リン
パ系細胞株、或いは正常のリンパ系細胞を各種の
ウイルス、薬剤、放射線等で処理し培養株化した
細胞株等を使用できる。その具体例としては、例
えばImmunol.Commun.，９(8)，p731〜734
（1980）、蛋白質核酸酵素、23巻、６号、291〜305
頁、及び生化学データーブツク、p829〜905、
株式会社東京化学同人、1980年６月23日発行に記
載のＴ−細胞系、Ｂ−細胞系、ミエロイド細胞
系、non−Ｔ細胞系及びnon−Ｂ細胞系等の各細
胞株を例示することができる。また上記培養株化リンパ系細胞に作用させる抗
腫瘍物質誘導剤としては、公知の各種ウイルス、
グラム陰性菌由来のエンドトキシン、植物由来の
レクチン、免疫賦活作用を有する物質等を使用す
ることができる。その代表例としては、例えば大
腸菌、緑膿菌、チフス菌等に由来するリポポリサ
ツカライド（LPS）等のグラム陰性菌由来のエン
ドトキシン；タチナタマメレクチン（コンカナバ
リンＡ，ConA）、ダイズマメレクチン（SBA）、
アカインゲンマメレクチン（PHA）等の植物由
来のレクチン；センダイウイルス（HVJ）等の
ウイルス及びバチルスカルメツテイグエリン
（BCG）、コリネバクテリウムパルバム
（Corynebacterium parvum）、プロピオンバク
テリウムアクネス（Propionibacterium
acnes）、ミコバクテリウムブチリカム
（Mycobacterium butyricum）、コリネバクテリ
ウムグラニユロサム（Corynebacterium
granulosum）、ストレプトコツカスピロジネス（Streptococcus pyrogenes）、プ
ラスモデイウム（Plasmodium）、ザイモザン
（Zymosan）、ノカルデイアアストロイデス
（Nocardia asteroides）、リステリアモノサイ
トジエネス（Lysteria monocytogenes）、グルカ
ン（glucan）、細胞膜骨格（cellwall skelton）、
デキストラン硫酸（dextran sulfate）、ムラミル
ジペプタイド（muramyldipeptide）、クレスチン
（呉羽工業社製）等の免疫賦活作用を有する物質
を例示することができ、これらは組合せて用いる
こともできる。上記培養株化リンパ系細胞は、抗腫瘍物質誘導
剤の処理に先立ち、必要に応じて適宜培養、増殖
させることができる。該培養条件としては、特に
制限はなく常法に従うことができる。例えば
RPMI−1640の培地、MEM培地等の通常の栄養
培地を牛胎児血清（FCS）等の血清補液で改質し
た培地中、インビトロで増殖させる方法、又はヒ
ト以外の哺乳動物に上記細胞を移植し、その体内
で増殖させる方法等を適宜採用できる。後者の方
法では、移植する動物は、ヒト細胞に対し免疫反
応を起こす場合があり、好ましくは幼弱期の動
物、200〜600レム程度の放射線処理、抗血清処
理、免疫抑制剤処理等により免疫を抑制した動
物、ヌードマウス等を使用するのがよい。上記の
如くして増殖されたヒト由来の培養株化細胞は、
これを前記栄養培地（通常PH6.5〜8.0）にて、細
胞濃度が１×10⁴〜１×10⁷個／ml程度に浮遊さ
せ、これに前記抗腫瘍物質誘導剤を作用させるこ
とにより、所望の本発明物質を誘導産生させるこ
とができる。抗腫瘍物質誘導剤による処理は、例
えばエンドトキシン及び免疫賦活作用を有する物
質の場合は、１〜100μｇ／ml程度の濃度で、レ
クチンの場合は、10〜500μｇ／ml程度の濃度で、
ウイルスの場合は、50〜5000HA／mlの程度の濃
度で加え、通常37℃下、１〜６目間インキユベー
トすればよい。かくして、その栄養培地中に本発
明物質が産生される（以下斯くして得られる液を
粗製溶液と言う）。上記で得た粗製溶液からの本発明物質の採取及
び分離精製は、得られる粗製溶液中に含有される
当該物質の性質を利用した物理化学的又は生化学
的手段に従い実施される。例えば塩析、クロマト
グラフイー、電気泳動法、抽出法、遠心分離法、
透析法等を適宜組合せることにより行なわれる。
より好ましくは、上記粗製溶液を次の工程に付す
ことにより実施される。 (1) 硫酸アンモニウム塩析 (2) ゲル過 (3) ハイドロキシアパタイトクロマトグラフイー (4) フアルマシアFPLCモノＱカラムクロマトグ
ラフイー (5) 硫酸アンモニウム塩析溶解クロマトグラフイ
ー (6) ゲル過以下に、これら工程の詳細を説明する。精製工程１粗製溶液に硫酸アンモニウム（以下「硫安」と
記す）を添加し、50〜80％飽和溶液を調製する。
この溶液を２時間〜一夜低温室（４℃）に放置
し、生理活性蛋白質を充分沈澱させる。次いで冷
却遠心分離機（日立製作所製）を使用し、10000
回転／分で10〜30分間遠心分離を行ない生理活性
を有する沈澱を集める。この段階での活性回収率
（前記Ｌ−細胞に対する細胞毒性活性測定法によ
る）は80〜100％であり、精製度は10〜20倍であ
る。精製工程２工程１で得られた沈澱を0.02Mトリス−塩酸
（PH7.8）／0.1M NaClの緩衝液に懸濁させる。こ
の懸濁液に２〜8Mの尿素を加え、不溶性物質を
10000回転／分で10〜30分間冷却遠心分離を行な
い、清澄な生理活性を有する上清液を得、これを
ゲル過に付す。ゲル過用担体としてはウルト
ロゲルAcA44，54（LKB社製、アメリカ）、ある
いはバイオゲルA1.5ｍ（バイオ・ラド社製、ア
メリカ）等が用いられる。ゲル過分画物につき、前記Ｌ−細胞に対する
細胞毒性活性測定を行ない、活性画分を集めて、
限外過膜YM10（アミコン社製、アメリカ）を
装着した限外過装置TCF−10（アミコン社製・
アメリカ）により限外過濃縮を行なう。但し、
濃縮は50〜80％飽和硫安沈殿法によつてもよい。
この方法による活性回収率は80〜100％であり、
精製度は20〜50倍である。精製工程３工程２で得られた生理活性画分の濃縮液を透析
用チユーブ（半井化学薬品社製）を用い、50〜
100倍量の0.02Mリン酸緩衝液（PH6.8）に対して
４℃で、数回外液を交換しながら、一夜透析す
る。透析液を冷却遠心分離機（４℃）で10000回
転／分、20〜30分間遠心分離を行ない、清澄な上
清を得る。次いでこの上清液をハイドロキシアパ
タイト（日本ケミカル社製）に吸着させ、0.02M
〜0.5Mリン酸緩衝液（PH6.8）で連続的濃度勾配
法に従い、もしくは段階的に濃度を上昇させて生
理活性区分を溶離する。得られた生理活性区分を
限外過濃縮、又は硫安塩析により濃縮する。こ
の方法による生理活性区分の回収率は40〜80％で
あり、精製度は約４〜10倍である。精製工程４精製工程３で得られた生理活性区分の濃縮液を
透析用チユーブに入れ、50〜100倍量の希薄なリ
ン酸、あるいはトリス緩衝液（PH7.0〜8.0）に対
して、４℃で一夜透析する。この透析液をフアル
マシアFPLCモノＱカラム（フアルマシア社製、
スエーデン）に吸着させ、緩衝液濃度、あるいは
NaCl濃度を連続的に上昇させて生理活性物質の
溶離を行なう。この工程での活性回収率は70〜90
％であり、精製度は約３〜10倍上昇する。精製工程５精製工程４における活性区分につき限外過濃
縮を行ない、硫安塩析溶解カラムクロマトグラフ
イーに付する。トーヨーパールSW50、55、また
は60（いずれも東洋曹達社製）をカラムに充填し、
フアルマシアFPLCシステム（フアルマシア社
製・スエーデン）を用い、カラム中で生理活性区
分を硫安塩析、次いで連続的に硫安濃度を下げて
活性区分を溶解分別する。この段階での活性回収
率は30〜70％であり、精製度は約３〜10倍であ
る。精製工程６精製工程５で得られた活性区分を濃縮し、バイ
オ・ゲルA1.5ｍあるいはウルトロゲルAoA44又
は54を充填したカラム（16×1000mm）に付し、ゲ
ル過を行なう。あるいはトーヨーソーダ高速液
体クロマト用カラムG2000SW又はG3000SW（東
洋曹達社製）を用いてゲル過を行なう。この工
程における活性回収率は25〜75％であり、精製度
は約３〜15倍である。精製工程１〜６を通しての活性回収率は、５〜
30％であり、精製度は約1.0×10⁵〜1.0×10⁶倍で
ある。この様にして得られた生理活性を有する本発明
の蛋白質の特性を測定した結果は、前記した通り
である。かくして本発明の蛋白質を得る。得られる本発
明物質は前述した通り、Ｌ−細胞に対してインビ
トロで直接細胞毒性作用を有し、またインビボで
抗腫瘍作用を有するに加え、以下の薬理試験例に
示す通りヒトガン細胞乃至メラノーマ細胞に対し
ても細胞毒作用乃至殺細胞作用を示し、しかも低
毒性である。薬理試験例細胞毒乃至殺細胞作用 (a) ヒトガン細胞殺細胞作用ヒトバーキツトリンパ腫由来株Raji〔J.Mat.
Cancer Inst.，37巻、547頁、1966年〕、ヒト胃癌
（印環細胞癌）由来株Kato−〔Jpn.J.Exp.
Med.，48巻、61頁、1978年〕及びヒト鼻咽腔癌
由来株KB〔Cancer Res.，18巻、1017頁、1958
年〕の各細胞に対する本発明物質の殺細胞効果を
評価した。すなわち、ヒトバーキツトリンパ腫由
来細胞株及びヒト胃癌由来細胞株を、250単位／
mlのペニシリン、125μｇ／mlのストレプトマイ
シン及び10％非働化牛胎児血清を含むRPMI1640
培地で２×10⁵細胞／mlに調整した。また、ヒト
鼻咽腔癌由来細胞株を、250単位／mlのペニシリ
ン、125μｇ／mlのストレプトマイシン及び10％
非働化牛血清を含むイーグルスミニマルエツ
センシヤルメデイウム培地を用いて２×10⁵細
胞／mlに調整した。上記各細胞調整液0.1mlと各種濃度に希釈した
本発明物質0.1mlとを96穴マイクロプレートの各
ウエルに入れ、これを５％炭酸ガス含有空気中、
37℃で48時間培養した。培養48時間後に細胞をトリパンブルーで染色
し、顕微鏡下でビルケルチユルク計算盤（エルマ
オプテイカルワークス社製、日本）を使用して生
細胞数を算出した。この結果、本発明物質の各種
細胞の増殖を50％抑制する濃度は、ヒトバーキツ
トリンパ腫由来細胞に対しては40ng蛋白量／ml
以上、ヒト胃癌由来細胞に対しては140ng蛋白
量／ml以上、ヒト鼻咽腔癌由来細胞に対しては
56ng蛋白量／ml以上であつた。 (b) メラノーマ細胞に対する細胞毒性作用ヘルソン（Helson）らの方法〔Nature，258
巻，731頁，1975年〕に準じて、本発明物質のメ
ラノーマＡ−375〔J.Natl.Cancer Inst.，51巻，
1417頁，1973年〕細胞に対する細胞毒性作用を評
価した。即ち、グルタミン、非必須アミノ酸、ペ
ニシリン、ストレプトマイシン及び10％非働化牛
胎児血清を含むイーグルス培地を用いてメラノー
マＡ−375細胞５×10⁴細胞／mlの懸濁液を調整し
た。この細胞懸濁液各１ml及び本発明物質を適当
に希釈調整した試料溶液１mlを3.5cm径のシヤー
レに入れ、５％炭酸ガス含有空気中下37℃で培養
した。培養３日目に上記(a)と同様にして細胞をトリパ
ンブルーで染色し、顕微鏡下でビルケルチユルク
計算盤を使用して生細胞数を算出した。この結
果、本発明物質のメノラーマＡ−375細胞の増殖
を50％抑制するのに必要な量は72ng蛋白量／ml
以上であつた。薬理試験例急性毒性８週令のddY系雌雄マウスを各々10匹用い、本
発明物質を19mg蛋白量／Kgの割合で静脈内投与
し、急性毒性を調べた。その結果死亡例は認められず、LD₅₀は19.0mg／
Kg以上であることが確認された。また、観察期間
中、本発明物質に起因すると考えられる明らかな
中毒症状は認められなかつた。以上の通り本発明物質は各種細胞に対し細胞毒
作用乃至殺細胞作用を奏し、また低毒性であると
ころから抗腫瘍剤として有用である。本発明物質はこれを抗腫瘍剤として利用するに
当つては、その有効量を含有する各種形態に調整
され、該形態に応じた各種投与経路により投与さ
れる。その製剤形態としては通常液状溶液、懸濁
液、乳濁液等を例示でき、これらは一般に静脈、
皮下又は筋肉内に投与される。これらはまた使用
前に適当な担体の添加によつて液状になし得る乾
燥品として提供することもできる。該抗腫瘍剤の
投与量は、疾患の程度、患者の年齢、性別等によ
つて異なるが、通常、蛋白量として約9.5〜95μ
ｇ／Kg／日を１〜数回に分けて投与するのが好ま
しい。以下に参考例及び実施例を示し、本発明をより
具体的に述べるが、本発明はこれらに限定される
ものではない。参考例１以下の細胞及び抗腫瘍物質誘導剤を各々使用し
た。 (1) 抗腫瘍物質誘導剤センダイウイルス（HVJ：Sendai virus，
Hemagglutinating virus of Japan）は、カンテ
ル（K.Cantell）より供与されたもので、10〜12
日目の受精鶏卵に接種し、３日後に漿尿液を採取
した。漿尿液を連続超遠心（35000rpm）して
HVJを精製し、その沈渣をPBS（−）で浮遊させ
た。精製HVJは、使用時まで適当に分注し、−80
℃にて凍結保存した。他に抗腫瘍物質誘導剤としてPHA（デイフコ
社、アメリカ）、ConA（和光純薬社）、LPS（大腸
菌055：B5、デイフコ社）、コリネバクテリウ
ム・パルバム（ウエルカム社、イギリス）を使用
した。 (2) 細胞本発明物質の産生に利用した細胞は、ヒト由来
の培養株化リンパ系細胞（CCRF−CEM DND
−41，TALL−１，RPMI−8402，CCRF−HSB
−２細胞、いずれもImmunol.Commun.，９(8)，
p731〜734（1980）記載のものである）を、10％
FCS加RPMI−1640培地を用いて、37℃にて５％
炭酸ガスインキユベーター内で静置培養して調整
した。また上記各ヒトリンパ系細胞の各々１×10⁷個
を、自家繁殖させた生後24時間以内の新生ハムス
ター（ゴールデン・ハムスター）に皮下移殖し、
週に２回の割で家兎抗ハムスター胸腺リンパ球血
清（ALS）を0.1ml投与して、４〜５週間接に生
着腫瘍塊を割出し、これをイーグルMEM培地で
洗浄後、細断器で細断し、細胞過器を通して調
製したものも使用した。実施例１上記参考例１−(2)で調製した各ヒト由来培養株
化リンパ系細胞を、イーグルMEM培地にて遠心
洗浄後、10％FCS加RPMI−1640培地で2.5×10⁶
個／mlに調製した。上記細胞浮遊液に、前記参考例１−(1)に示した
各抗腫瘍物質誘導剤の所定量（PHAは50μｇ／
ml、ConAは10μｇ／ml、HVJは500HA／ml、
LPSは10μｇ／ml）を添加し、37℃で１〜６日間
攪拌培養し、得られる培養上清を遠心分離
（10000rpm）により採取し、−20℃にて凍結保存
した（粗製溶液）。斯くして得た粗製溶液のＬ−細胞に対する細胞
毒性作用（力価、単位／ml）を、下記第２表に示
す。尚、上記力価の測定は、培養上清を無菌過
後行なつた。またHVJを含む培養上清は、HVJ
を不活性化するためにUV処理（15WUVランプ、
20cm下、30分処理）後、力価測定を行なつた。

【表】 (2) 上記(1)と同様にして、５×10⁶個／mlRPMI
−1640培地単独、のCCRF−CEMに100〜
4000HA／mlのHVJを添加し、24時間培養し
て、同様に粗製溶液を得た。その力価（単位／
ml）を下記３表に示す。

【表】 (3) 10％FCS加RPMI−1640培地を用いて５×
10⁶個／mlに調製したCCRFCEMに50〜200μ
ｇ／mlのPHAを添加し、72時間培養し、前記
(1)と同様に粗製溶液（No.７〜９）を得た。また、上記においてPHA50μｇ／mlの添加48
時間培養後、更にPHAの50μｇ／ml（粗製溶液
No.10）、C.parvumの50μｇ／ml（粗製溶液No.
11）、又はHVJの500HA／ml（粗製溶液No.12）
を添加して更に４日間培養して粗製溶液を得
た。それらの力価（単位／ml）を下記第４表に
示す。

【表】 (4) 本発明物質の単離上記(2)において、CCRF−CEMにHVJ
（100HA／ml）を作用させて得た粗製溶液（54
単位／ml）の1000mlに472ｇの硫安を添加溶解
後、４℃で一夜放置し、活性物質を沈澱させ
た。沈澱を10000回転／分で30分間遠心分離
（４℃）し、沈澱を集め、約100mlの0.02Mトリ
ス−塩酸緩衝液／0.1M NaCl（PH7.8）に懸濁さ
せた。この段階での活性回収率は96％で精製度
は18倍であつた。次いで、該沈澱懸濁液100mlに対し36.04ｇの
尿素を加え溶解させた。これを10000回転／分
で30分間冷却遠心分離（４℃）し、不溶物質を
除去した。この上清液50mlをとり、0.02Mトリ
ス−塩酸／0.5M NaCl緩衝液で平衡化したウ
ルトロゲルAcA54を用いゲル過（カラムサ
イズ50×1000mm）し、溶出区分につきＬ−細胞
に対する活性測定法により、活性を調べ活性区
分を集めた。該方法による活性回収率は95％
で、精製度は47倍であつた。全段階を通しての
活性回収率は91.2％で精製度は約846倍であつ
た。次いでアミコン限外過膜YM10を装着した
限外過濃縮器TCF−10を用いて活性区分を
濃縮した。この濃縮液を透析用チユーブにい
れ、50倍量の0.02Mリン酸緩衝液（PH6.8）に
対して４℃透析を行なつた。外液を３時間毎に
３回交換した後、同緩衝液中で、４℃、一夜放
置した。この透析活性区分をあらかじめ0.02M
リン酸緩衝液（PH6.8）で平衡化したハイドロ
キシアパタイトゲルのカラム（サイズ26×400
mm）に付した。流速5.0ml／時、３ml／分画の
条件下に同緩衝液で充分洗浄した後、0.02Mリ
ン酸緩衝液（PH6.8）500ml及び0.5Mリン酸緩
衝液（PH6.8）500mlを使用し、連続的に濃度勾
配を上昇させ、吸着物質を溶離した。この方法
では非吸着区分に活性は認められず、すべての
活性は吸着され、吸着された活性区分はリン酸
緩衝液濃度0.15M〜0.3Mの間に溶出された。
活性区分を集め、アミコン限外過濃縮装置
TCF−10を用い、４℃で限外過濃縮を行な
つた。この方法による活性回収率は63％であ
り、精製度は6.3倍であつた。全工程を通して
の活性回収率は57.5％であり、精製度は5.33×
10³倍であつた。次いで、上記方法で得られた活性区分の濃縮
液を透析用チユーブにいれ、50倍量の0.02Mト
リス−塩酸（PH7.8）／0.1M NaCl緩衝液に対
して、４℃で一夜透析を行なつた。同緩衝液で
緩衝化したフアルマシアモノＱカラムに透析内
液を付し、１ml／分、１ml／分画の条件で活性
物質を吸着させた。次いで同緩衝液で充分洗浄
後、0.02Mトリス−塩酸（PH7.8）／1.0M
NaClを用い連続的にNaCl濃度を上昇させ、吸
着した活性区分を溶離させた。活性区分をアミ
コン限外過膜YM10を装着した限外過装置
を用い濃縮した。この方法による活性回収率は
80％であり、精製度は5.1倍上昇した。全工程
を通しての活性回収率は50％であり、精製度は
2.72×10⁴倍であつた。次いで、上記濃縮液を0.1Mトリス−塩酸
（PH7.8）／70％飽和硫安で平衡化したトーヨー
パールSW60（カラムサイズ10×500mm）に、流
速１ml／分、２ml／分画で付与し、カラム中で
塩析した。ついで0.1Mトリス−塩酸（PH7.8）
の緩衝液を用い、連続的に硫安濃度を低下させ
て溶出溶離を行なつた。活性区分を集め、アミ
コン限外過膜YM10を装着した限外過濃縮
装置により濃縮した。この方法による活性回収
率は61％であり、精製度は３倍であつた。全工
程を通しての活性回収率は28.0％、精製度は
8.15×10⁴倍であつた。次いで、上記濃縮液を0.1Mリン酸ナトリウ
ム（PH7.0）／0.2M NaCl／0.1％SDS緩衝液で
平衡化したトーヨーソーダーG3000SWカラム
（7.5×600mm）を用い、流速１ml／分、１ml／
分画でゲル過を行なつた。この方法で活性回
収率は26％であり、精製度は2.9倍上昇した。
全工程を通じての活性回収率は7.29％であり、
精製度は2.36×10⁵倍であつた。斯くして、本発明の蛋白質を得た。該蛋白質
は前述した生理活性及び物理化学的性状を示
す。尚、本生理活性を有する蛋白質の比活性は
3.54×10⁶単位／mg蛋白質であつた。 (5) 前記(1)において、DND−41にPHAを作用さ
せて得た粗製溶液（24単位／ml）を用いて、上
記(4)と同様にして、本発明蛋白質を得た。全工
程を通じての活性回収率は、5.57％であり、精
製度は4.92×10⁵倍であり、比活性は3.49×10⁶
単位／mg蛋白質であつた。 (6) 前記(1)において、TALL−１にHVJを作用
させて得た粗製溶液（63単位／ml）を用いて、
上記(4)と同様にして、本発明蛋白質を得た。全
工程を通じての活性回収率は、5.52％であり、
精製度は1.95×10⁵倍であり、比活性は3.51×
10⁶単位／mg蛋白質であつた。 (7) 前記(1)において、RPMI−8402にConAを作
用させて得た粗製溶液（12単位／ml）を用い
て、上記(4)と同様にして、本発明蛋白質を得
た。全工程を通じての活性回収率は、7.45％で
あり、精製度は8.87×10⁵倍であり、比活性は
3.55×10⁶単位／mg蛋白質であつた。 (8) 前記(1)において、CCRF−HBS−２のConA
を作用させて得た粗製溶液（10単位／ml）を用
いて、上記(4)と同様にして、本発明蛋白質を得
た。全工程を通じての活性回収率は、6.4％で
あり、精製度は9.52×10⁵倍であり、比活性は
3.52×10⁶単位／mg蛋白質であつた。 (9) 上記(4)と同様にして、前記(1)〜(3)において得
た各酵素溶液を用いて、略々同様の活性回収
率、精製度、比活性にて、同一の物性を有する
本発明蛋白質を得た。以下、本発明物質を用いた製剤例を挙げる。製剤例１本発明蛋白質１×10⁹単位の生理食塩水溶液100
mlを無菌過後２mlずつ分注し、凍結乾燥して、
注射用抗腫瘍剤を得る。

Claims

【特許請求の範囲】１ヒト由来の培養株化リンパ系細胞に、抗腫瘍
物質誘導剤を作用させることによつて誘導産生さ
れる下記の特性を有する蛋白質。ａ）分子量：56000±3000 ｂ）等電点：PH4.9±0.3 ｃ）３mg蛋白量／mlの0.02Mトリス−塩酸緩衝
液（PH7.8）溶液において無色透明であり、ア
セトン又はエタノールを該溶液に70V／Ｖ％以
上加えると沈澱を生ずるｄ）水溶液は弱酸性を示すｅ）ビユウレツト反応、フオリンローリー反応
法ならびに塩酸加水分解後のニンヒドリン反応
についてペプチド結合ならびにアミノ酸の呈色
反応を示すｆ）培養細胞マウスＬ−細胞に対してインビト
ロで直接細胞毒作用を有する及びｇ）メスＡザルコーマ担ガンマウスに対してイ
ンビボで抗腫瘍作用を有する。