JPH02100691A - Ｓ‐カルボキシメチル‐ｌ‐システインの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、トリプトファンシンターゼの存在下に、Ｌ−
セリンと一般式ＨＳ−ＣＨｚ−ＣＯＯＲ（ただし、Ｒは
アルキル基を示す）で表されるチオグリコール酸エステ
ルとを反応させ、−形式（Ｉ）で表されるＳ−カルボキ
シメチル−し−　システィン誘導体を生成させ、３亥Ｓ
−カルボキシメチル− 体を加水分解して、Ｓ−カルボキシメチル−し−システ
インを生成させるＳ〜カルボキシメチル−し−システイ
ンの製造方法に関する。

ＲＯＯＣ−ＣＨｚ−Ｓ−ＣＨｚ−ＣＩ（ＣＯＯＨＮｉ＋
．　　　　　　　　（１） （ただし、ＲはＨＳ−ＣＨｚ−ＣＯＯＲのＲと同しアル
キル基を示す） Ｓ−カルボキシメチル−Ｌ−システインは、去痰剤など
の医薬品原料として有用な物質である。

〔従来の技術〕

Ｓ−カルボキシメチル−Ｌ−システインは、入毛の加水
分解物から得られるし一シスチンを還元して得たＬ−シ
ステインにモノクロル酢酸を反応させる方法で製造され
ている。

一方、トリプトファンシンターゼは、種々の反応を触媒
する多機能酵素としてよく知られている（例えば、Ａｄ
ｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　
Ｒｅ１ａｔｅｄＡｒｅａｓ　ｏｆ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ
　Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ、４９．ｐ、１２７　Ａ＋１
８５（１９７９）　）　、また、トリプトファンシンタ
ーゼが、β−クロロアラニンまたはセリンとチオグリコ
ール酸からＳ−カルボキシ−し−システインを合成する
反応を触媒することが知られている（特開昭５８−１８
７１９８）。

〔発明が解決しようとする課題〕

しかし、Ｌ−シスチンを原料とする方法では、原料の供
給量に限度があり、更に、Ｓ−カルボキシメチル−し−
システインにＬ−シスチンが混入するなどの問題がある
。

一方、トリプトファンシンターゼを用いる方法では、反
応速度が著しく小さいのが問題である。

本発明の課題は、上記の問題点を解消したＳ−カルボキ
シメチル−し−システインの製造方法を提供することで
ある。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者らは、トリプトファンシンターゼの新しい酵素
機能の開発を目的として研究を重ねた結果、トリプトフ
ァンシンターゼの存在下に、し−セリンと一般式ＨＳ−
ＣＨｚ−ＣＯＯＲ（ただし、Ｒはアルキル基を示す）で
表されるチオグリコール酸エステルとを反応させると一
般式（１）で表されるＳ−カルボキシメチル−Ｌ−シス
テイン誘導体が生成し、驚＜ヘキ事には、このトリプト
ファンシンターゼによるセリンとチオグリコール酸エス
テルからのＳ−カルボキシ−Ｌ−システイン誘導体合成
の酵素反応速度は、従来公知のトリプトファンシンター
ゼによるセリンとチオグリコール酸からのＳ−力ルボキ
シメチルーＬ−システイン合成の酵素反応速度に比べて
著しく大きく、更に、このようにして得たＳ−カルボキ
シメチル−Ｌ−システイン誘導体のエステル部分を加水
分解することにより高収率でＳ−力ルボキシメチル−Ｌ
−システインが得られることを見い出した０本発明は、
このような知見に基づいて完成したものである。

トリプトファンシンターゼは、微生物、高等植物などに
広く存在していることが知られており（例えば、Ｂａｃ
ｔｅｒｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｒｅｖｉｅｗｓ、　Ｖｏｌ
、３９．　Ｎｏ。

２、ｐ、８７〜１２０　（１９７５））　、本発明にお
いても酵素源は特に限定されないが、通常は微生物起源
のものが用いられる。トリプトファンシンターゼを生産
する菌株としては、例えば、エシェリヒア・コリ（Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　ＭＴ−１０２３２（
ＦＥＲＭ　ＢＰ−１９）、エシェリヒア・コリＭＴ−１
０２４２（ＦＥＲＭ　ＢＰ−２０）、ノイロスポラ拳り
ラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ　ｃｒａｓｓａ）　ＡＴ
ＣＣ−１４６９２、サツカロミセス・セレビシェ（Ｓａ
ｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｔａｅ）　Ａ
ＴＣＣ−２６７８７などがある。

エシェリヒア・コリの培養菌体からのトリプトファンシ
ンターゼの抽出法については、Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ
　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＋
Ｖｏ１．２４９．ＮＯ，２４＋ｐ。

７７５６〜７７６３　（１９７４年）、ノイロスポラ・
クラッテの培養菌体からの抽出法については、同Ｖｏ１
．２５０゜Ｎｏ、８．ｐ、２９４１〜２９４６　（１９
７５年）、サツカロミセス・セレビシェの培養菌体から
の抽出法については、Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｊｏｕｒｎａ
ｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｖｏｌ、１０２
．ｐ２１５９〜１６５（１９７９年）に記載され知られ
ている。

しかし、本発明に使用されるトリプトファンシンターゼ
は、必ずしも抽出された純粋な物である必要はない。す
なわち、トリプトファンシンターゼ生産菌の培養物、培
養物から遠心分離などの方法によって採取した生菌体、
その乾燥菌体あるいは菌体を磨砕、自己消化、超音波処
理などをすることによって得られる菌体処理物、更には
、これらの菌体よりの、抽出物並びに該抽出物より得ら
れる酵素の粗製物であっても利用できる。もちろん、こ
れらの固定化物でもよい。

トリプトファンシンターゼ生産菌を培養するための培地
としては、炭素源、窒素源、無機物および必要に応じて
少量の微量栄養素を含むものであれば、合成培地または
天然培地の何れも使用可能である。培地へ微量のトリプ
トファンまたはインドールを添加することが有効なこと
もある。また、培地へ微量のインドールアクリル酸を添
加することによりトリプトファンシンターゼ生産量が高
まることもある。

培養は、振盪培養あるいは通気撹拌培養などの好気的条
件下で行う。

培養温度は２０〜４０°Ｃ１通常は２５〜３７°Ｃの範
囲である。また、培養液のｐＨは５〜８である。

トリプトファンシンターゼは、インドール−３−グリセ
ロ燐酸とＬ−セリンからＬ−）リプトファンを合成する
反応の他に種々の反応を触媒する多機能酵素であること
は良く知られている（例えば　Ａｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ
　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｒｅ１ａｔｅｄ　Ａ
ｒｅａｓ　ｏｆ　Ｍ。

１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ、４９．ｐ、
１２７〜１８５（１９７９））、　Ｌかしながら、トリ
プトファンシンターゼによる本発明の反応は、本発明者
らが初めて見出したものである。

本発明の方法で反応基質であるセリンとしては、通常は
Ｌ体が用いられる。ＤＬ−セリンも用いることができる
が、この場合はし体のみが反応の基質となる。

もう一方の基質であるチオグリコール酸アルキルエステ
ルのエステル部分の炭素数は、特に制限はないが、通常
は１から８程度のものが用いられる。

本発明の方法においては、トリプトファンシンターゼの
存在下、通常ｐＨ６〜１０の水性媒質中で、Ｌ−セリン
とチオグリコール酸エステルとを反応させる。

反応温度は、２０〜６０°Ｃが適当である。

反応時間は、酵素力価、基質濃度、その他の条件により
異なるが、回分反応では通常１〜１００時間である。

反応は、静置または攪拌下に行われる。特に、チオグリ
コール酸アルキルエステルはエステル部分の炭素数が多
くなると水に対する溶解度が小さくなるので、反応は攪
拌下で行なうことが望ましい。基質であるし一セリンと
チオグリコール酸エステルの濃度は特に制限はないが、
通常は０．１〜３０重量％程度である。基質は反応開始
時に全量を反応液に添加しても良いし、反応の進行にと
もない分割添加することも可能である。反応に際しては
、基質の他に補酵素であるピリドキサール燐酸を微量添
加することが望ましい。

このようにして反応を行うと、反応液中にはＳ−カルボ
キシメチル−し−システイン誘導体が生成す反応液から
Ｓ−カルボキシメチル−Ｌ−システイン誘導体を回収す
るには、通常の方法を用いることができる。特に、反応
基質のチオグリコール酸アルキルエステルとしてエステ
ル部分の炭素数の多いものを用いた場合は、生成するＳ
−カルボキシメチル−Ｌ−システイン誘導体は水に対す
る溶解度が小さいので反応液から、濾過などにより容易
に回収できる。しかし、反応液からＳ−カルボキシメチ
ル−Ｌ−システイン誘導体を回収せず、反応液のままエ
ステルの加水分解に供する事もできる。

このようにして得られたＳ−カルボキシメチル−し−シ
ステイン誘導体は、エステル部分を常法により加水分解
すれば、Ｓ−カルボキシメチル−し−システインを得る
ことができる。

エステルの加水分解方法としては、酸加水分解、アルカ
リ加水分解、酵素加水分解などを用いることができるが
、工業的には酸またはアルカリによる加水分解が好まし
い、使用する酸またはアルカリは水に溶解するものが好
ましく、酸としては、特に塩酸、硫酸、硝酸、燐酸など
の無機酸が好ましい。また、使用するアルカリとしては
、特に水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどが好まし
い。

酸は、酸加水分解時のｐｌ＋が２以下、好ましくは、１
．５以下となる量を用いるのが好ましい。アルカリは、
アルカリ加水分解時のｐｕが１１以上、好ましくは、１
２以上となる量を用いるのが好ましい。

加水分解反応温度は、酸加水分解では、４０から９０’
Ｃ程度、アルカリ加水分解では、２０から６０°Ｃ程度
が好ましい。

反応時間は、Ｓ−力ルボキシメチル−し−システイン誘
導体や酸またはアルカリの濃度、反応温度にもよるが、
通常は、３０分から５時間程度である。

エステル加水分解終了後の反応液から、Ｓ−力ルボキシ
メチルーＬ−システインを回収するには、公知の方法を
用いることができる。例えば、反応液のｐＨをＳ−力ル
ボキシメチル＝Ｌ−システインの等電点である２、５か
ら３付近に調整することにより、容易に結晶化すること
ができる。

〔実施例〕

以下、実施例により本発明の詳細な説明する。

なお、Ｓ−カルボキシメチル−し−システインとＳ−カ
ルポキシメチルーＬ−システイン誘導体の定量は、液体
クロマトグラフィーで行った。生成したＳ−カルポキシ
メチルーＬ−システインとＳ−カルボキシメチル−Ｌ−
システイン誘導体がＬ体であることは、光学異性体分離
用カラムを用いた液体クロマトグラフィーにより確認し
た。

実施例１ 肉エキス１χ、ペプトン０．５χ、酵母エキス０．１χ
、ＫＨ２ＰＯａ　Ｏ，２χ、ｐＨ７，０の液体培地にエ
シェリヒア・コリ　ＭＴ−１０２４２（ＦＥＲ？Ｉ　Ｂ
Ｐ−２０）を接種し、３０°Ｃにて２０時間振盪培養し
た。培養終了後、遠心分離して菌体を集め、０．Ａｄａ
ｃｈｔらの方法（Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉ
ｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｖｏｌ、２４
９．ＮＯ，２４、ｐ、７７５６〜７７６３　（１９７４
年））に従って＃ｎ製操作を行い、比活性が９．２単位
／ｍｇの力価のトリプトファンシンターゼを取得し、こ
の酵素を用いて以下の反応を行った。

トリプトファンシンターゼの活性は、Ｃ，Ｙａｎｏｆｓ
ｋｙらの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ
ｏｇｙ、Ｖｏｌ、５＋Ｉ）、８０１〜８０７　（１９６
２）　）により測定し、ｐＨ７，８，３７°Ｃにおいて
１μｍｏ　ｌ　／ｍｉｎのトリプトファンをＬ−セリン
とインドールから合成する酵素量を１単位とした。

Ｌ−セリン１００μｍｏ！、第１表に示したチオグリコ
ール酸エステル１００μｍｏｆｆｉ、ピリドキサール燐
酸０．１μｌｌ１ｏ２、トリプトファンシンターゼ０．
９単位を含みｐｉ（８，５に調整した反応液１ｍＮを、
３５°Ｃで３０分間マグネチフクスクーラーを用いて攪
拌した。

生成したＳ−カルボキシメチル−し−システイン誘導体
（ＳＣＭＣエステル）の量を第１表に示した。

次いで、１規定の水酸化ナトリウム０．５ｍ　ｌを加え
、室温で２時間放置した。生成したＳ−カルボキシメチ
ル−Ｌ−システイン（ＳＣＭＣ）の量を第１表に示した
。

〔以下余白〕

参考例１゜ 実施例１におけるチオグリコール酸エステルの代りに、
チオグリコール酸を用いる他は、実施例１と同様に反応
を行なった。反応液中に生成したＳ−カルボキシメチル
−し−システインは、僅か０．１７μＩ！１ＯＩｌであ
った。

実施例２ ノイロスポラ・クラッサ　ＡＴＣＣ−１４６９２を用い
、Ｗ、Ｈ，Ｍａｔｃｈｅｔｔらの方法（Ｔｈｅ　Ｊｏｕ
ｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｔｓ
ｔｒｙ、Ｖｏｌ、２５０．Ｎｏ、８．ｐ、２９４１〜２
９４６（１９７５年））に従い、培養および酵素精製を
行い、比活性が１，３単位７ｍｇの力価のトリプトファ
ンシンターゼを取得し、この酵素液を用いて以下の反応
を行った。

Ｌ−セリン５０μｍｏＩ！、、チオグリコール酸ブチル
５０μｍｏｆｆｉ、ピリドキサール燐酸０．１μｍｏｌ
、ビロリン酸カリウム緩衝ンｒｉ、５０μｌｌ１ｏ２、
トリプトファンシンターゼ０．２単位を含む反応液（ｐ
Ｈ８，５）　１ｍＩＶ、を、４０’Ｃで５時間振盪した
。

反応液中には、４４μｗｌＯｒのＳ−ブトキシカルボニ
ルメチルーＬ−システインが生成した。

次いで、２規定の水酸化ナトリウム０．２ｍｌを加え、
室温で４時間放置したところ、Ｓ−カルボキシメチル−
し−システインが４２　μｍｏｆ生成した。

実施例３ ペプトン１χ、酵母エキス０．５χ、グルコース２ｚ、
インドールアクリル 体培地にサツカロミセス・セレビシェＡＴＣＣ−２６７
８７を接種し、３０°Ｃにて２０時間振盪培養した。培
養終了後、遠心分離して菌体を集め、Ｍ．Ｄｅｔｔｗｉ
ｌｅｒらの方法（Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　
ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ。

１０２、ｐ．１５９〜１６５（１９７９年））に従い酵
素精製を行い、比活性が１．２単位／ｍｇの力価のトリ
プトファンシンターゼを取得し、この酵素液を用いて以
下の反応を行った。

Ｌ−セリン５０μｍｏｆ、チオグリコール酸エチル５０
μｍｏｌ、ピリドキサール燐酸０．１μｍｏｂ、ピロリ
ン酸カリウム緩衝液５０μＩＩＩ０２、トリプトファン
シンターゼ０．２単位を含む反応液（ｐＨ　８．５）　
１ｍｆを、３０°Ｃで５時間振丑した。

反応液中には、１６μｍｏｆのＳ−エトキシカルボニル
メチル−し−システインが生成した。

次いで、２規定の水酸化ナトリウム０．５　ｍｌを加え
、４０°Ｃで２時間放置したところ、Ｓ−カルボキシメ
チル−し−システインが１５μｍｏＪ２生成した。

実施例４ 肉エキス１χ、ペプトン０．５χ、酵母エキス０、１　
’１　、ＫＨ２ＰＯ４　０．２Ｘ　、　ｐＨ７．０　ノ
液体培地ニエシェリヒア・コリ　ＭＴ−１０２４２　（
ＦＥＲＭ　ＢＰ−２０）を接種し、３５°Ｃにて１５時
間振盪培養した。培養終了後、遠心分離して菌体を集め
、これをトリプトファンシンターゼの酵素源として用い
た。このソＷ菌体１ｇ当たりのトリプトファンシンター
ゼ活性は、２３０単位であった。

Ｌ−セリン３００ｍＭ，チオグリコール酸２−エチルヘ
キシル３００１、ピリドキサール燐酸０．５ｍ’Ｍ，ピ
ロリン酸カリウム１００１を含む水溶液に２ｇの湿菌体
を添加したＬｏｏｍ　Ｑの反応液（ｐ）Ｉ　８．０）を
、６００ｒｐｍで攪拌しながら、４０゛Ｃで４時間反応
した。

反応液中には、２７４ｍＭのＳ−（２−エチルヘキシル
オキシカルボニルメチル）−Ｌ−システインと３ｍＭの
Ｓ−カルボキシメチル−Ｌ−システインが生成した。

反応液から濾過により、Ｓ−（２−エチルへキシルオキ
シカルボニルメチル）−Ｌ−システインを回収し、これ
を３規定の塩酸３０抛２中で７０°Ｃ，１時間加熱した
。

次いで、濾過により菌体を除去したのち、水酸化ナトリ
ウムにより、溶液のｐＨを２．５に調整し、生じた結晶
を濾別、乾燥することにより３．６ｇのＳ−力ルボキシ
メチル−し−システインを得た。

実施例５ 実施例４におけるし一セリンの代りに、Ｉ）Ｌ−セリン
６００ｍＭを用い、他は実施例４と同様に反応を行なっ
た。

反応液中には、２６８ｍＭのＳ−（２−エチルへキシル
オキシカルボニルメチル）−Ｌ−システインと３ｍＭの
Ｓ−カルボキシメチル−Ｌ−システインが生成した。

反応液に６規定の水酸化ナトリウムを３０ｍＮ添加した
のち、５０°Ｃで３０分間加熱した。次いで、濾過によ
り菌体を除去したのち、塩酸により、溶液のｐＨを２．
５に調整し、生じた結晶を濾別、乾燥することにより３
．９８のＳ−力ルポキシメチル−し−システインを得た
。

実施例６ し−セリン５０ｍＭ、千オグリコール酸２ーエチルヘキ
シル５０ｍＭ、ピリドキサール燐酸０．１ｍＭ　、ピロ
リン酸カリウム５０Ｃ１実施例１に示したトリプトファ
ンシンターゼ９単位を含む１０ｍ２の反応液（ｐＨ８、
０）を、６００ｒｐｍで撹拌しながら、４０゛Ｃで１時
間反応した。

反応液中には、１２．５ｎ＋ＭのＳ−（２−エチルへキ
シルオキシカルボニルメチル）−Ｌ−システインが生成
していた。

この反応液１ｍｆｆｉに第２表に示す酸またはアルカリ
１ｍｊ２を加え、酸加水分解については、６０°Ｃ，２
時間、アルカリ加水分解については、４０°Ｃ、１時間
加熱した。生じたＳ＝カルボキシチメルーＬ−システイ
ンの量を第２表に示した。

第２表 参考例２ Ｓ−（２−エチルへキシルオキシカルボニルメチル）−
Ｌ−システイン２．９ｇを０．０６規定から１規定の塩
酸１２にそれぞれ溶解し、８０°Ｃ，４時間加熱したの
ち、生したＳ−カルボキシメチル−Ｌ、システィンを定
量した。

加水分解時の１１）１とＳ−力ルポキシメチル＝Ｌ−シ
ステインの収率との関係を第１図に示した。

参考例３ Ｓ−（２−エチルへキシルオキシカルボニルメチル）−
Ｌ−システイン２．９ｇを０．０３規定から０．５規定
の水酸化ナトリウム１２にそれぞれ溶解し、４０°Ｃ１
２時間加熱したのち、生じたＳ−カルボキシメチル−Ｌ
システィンを定量した。

加水分解時のｐＨとＳ−カルボキシメチル−Ｌ−システ
インの収率との関係を第２図に示した。

【図面の簡単な説明】

図面第１図は、５−（２−エチルへキシルオキシカルボ
ニルメチル）−Ｌ−システインの酸加水分解時のｐＨと
Ｓ−カルボキシメチル−Ｌ−システインの収率との関係
を示す図である。また、第２図は５−（２−エチルへキ
シルオキシカルボニルメチル）−Ｌ−システインのアル
カリ加水分解時のｐＨ，！＝Ｓ−カルボキシメチルーＬ
−システインの収率との関係を第２図に示した。 特許出願人　　三井東圧化学株式会社 第１図 第２図 ｌ−１ Ｈ 手続補正占印発） 昭和６３年１２月１ｑ日 特許庁長官　吉　１）文　毅　殿 １、事件の表示 昭和６３年特許願第２５２０２１号 ２、発明の名称 Ｓ−カルボキシメチル−し−システインの製造方法 ３、補正をする者 事件との関係　　特許出願人 住所　東京都千代田区霞が関三丁目２番５号名称（３１
２）　　三井東圧化学株式会社４、補正により増加する
発明の数　　零５、補正の対象 明細書の発明の詳細な説明の欄 ６、補正の内容

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）トリプトファンシンターゼの存在下に、Ｌ−セリン
   と一般式ＨＳ−ＣＨ＿２−ＣＯＯＲ（ただし、Ｒはアル
   キル基を示す）で表されるチオグリコール酸エステルと
   を反応させ、一般式（ I ）で表される５−カルボキシ
   メチル−Ｌ−システイン誘導体を生成させ、該Ｓ−カル
   ボキシメチル−Ｌ−システイン誘導体を加水分解してＳ
   −カルボキシメチル−Ｌ−システインを生成させること
   を特徴とするＳ−カルボキシメチル−Ｌ−システインの
   製造方法。 ＲＯＯＣ−ＣＨ＿２−Ｓ−ＣＨ＿２−ＣＨＣＯＯＨＮＨ
   ＿２（ I ） （ただし、ＲはＨＳ−ＣＨ＿２−ＣＯＯＲのＲと同じア
   ルキル基を示す）