JPH01238534A - エンドトキシンの除去方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、エンドトキシンの分離法に関し、特に注射に
適した高分子生理活性物質製剤を製造するだめのエンド
トキシンの分離除去法に関する。

より詳細には、目的のを用タンパク質及びエンドトキシ
ンを含む溶液を一旦、目的のタンパク質に特異的に反応
する物質を担持している担体に接触させて、そのタンパ
ク質を吸着させ、次いでアミノ化合物、例えば、アルギ
ニン、ベンツアミジン、尿素又は塩酸グアニジンを含有
する溶液で洗浄することによりエンドトキシンを除去し
、その後目的のタンパク質を回収する方法に関する。

〔従来技術と発明が解決しようとする課題３発熱物質は
極微量で恒温動物の体温を異常に上昇させる物質である
ｔ 発熱性物質には細菌性物質、炎症性物質、植物多糖体ま
たは血液型物質などが知られているが、これらの中で最
も発熱に関与する物質は細菌性のものであり、細蘭毒素
と称されており、一般に外毒素（Ｅｘｏ　ｔｏｘ　ｉｎ
）および内毒素（ｌｉｎｄｏｔｏｘｉｎ）に大別されて
いる。これら毒素のうち、ダラム陰性菌の細胞壁由来の
リポ多糖を主とするいわゆるＯ抗原としての内毒素が最
も発熱性が強力であり、−度混入すると除去するのが非
常に困難である。

また、注射薬におけるエンドトキシンによる汚染実態は
注射用蒸留水及び生理食塩液の約５０％からエンドトキ
シンを検出、輸液製剤については、９０％からエンドト
キシンが検出されている　（昭医会誌、４６巻、１３〜
２５頁、１９８６）。

一方、高分子生理活性物質の製剤化の場合、高度の′ａ
縮を必要とする場合が多い。従って、原液中のエンドト
キシン量が極微量であっても、最終濃縮製剤中にはこれ
が同様に濃縮されており、注射時に発熱の副作用を示す
結果となる。

エンドトキシンを除去又は失活させる方法として、熱、
酸、アルカリ、トリトンＸ−１００などの界面活性剤で
の処理、限外口過、酸化剤での酸化合成樹脂への吸着な
どが知られている。これらの方法の大部分は手間もかか
り、目的物質を失活させることも考えられる。

〔課題を解決するだめの手段〕

このような状況下に本発明者らは種々研究を重ねた結果
、アミノ化合物、例えば、アルギニン、ベンツアミジン
、尿素又は塩酸グアニジン等がエンドトキシンと反応性
をもつことを見出し、このことを利用してエンドトキシ
ンを除去する方法を見出し、本発明を完成した。

本発明は、目的のタンパク質及びエンドトキシンを含む
溶液を一旦、そのタンパク質に特異的に反応する物質を
担持している担体に接触させて目的のタンパク質を吸着
させ、次いでアミノ化合物、例えば、アルギニン、ベン
ツアミジン、尿素又は塩酸グアニジン等を含有する溶液
で洗浄することによりエンドトキシンを除去し、その後
目的のタンパク質を？８離し、エンドトキシンを含まな
いタンパク質を取得する方法である。

本発明における有用タンパク質とは、医療用の目的で注
射薬として利用されるものを表わし、例えば、インシュ
リン、成長ホルモンなどの各種ホルモン製剤、ウロキナ
ーゼ、ｍｍプラスミノーゲン活性化因子などの酵素製剤
γ−グロブリンなどの血清タンパク質製剤、インターフ
ェロンなどの抗ウイルス製剤などが挙げられる。これら
のタンパク質はすべて生体由来のものである。

また今日、遺伝子組み換え技法または細胞融合の技術を
用い、有用タンパク質を生産させることが行われており
、使用される宿主細胞として大腸菌、枯草菌、酵母、動
物細胞が挙げられ、これら原料の収集過程、あるいは分
離精製を行なう過程で発熱性物質の混入を受けることが
しばしば経験される。

本発明の方法は、目的の高分子生理活性物質に適した精
製過程の中で適用されるものであり、つまり、各種クロ
マトグラフィーの中で使用されうる。例えば、イオン交
換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ア
フィニティークロマトグラフィー、吸着クロマトグラフ
ィーなどを使用する際−旦、高分子生理活性物質を吸着
させた後、含まれるエンドトキシンを洗浄工程で除去す
る。

洗浄液に含有させるアミノ化合物としては、例えば、ア
ルギニン、ベンツアミジン、尿素、塩酸グアニジン、ま
たはリジン、オルニチン、イプシロンアミノカプロン酸
等の塩基性アミノ酸、エチルアミノ、エチレンジアミノ
、エタノールアミノ、ヒドロキシルアミノ等のアミノ類
、アセトアミド、ベンツアミド等のアミド類、パラアミ
ノベンツアミジン等のアミジン類、メチル尿素、エチル
尿素等の尿素誘導体等が挙げられる。通常、アルギニン
、ベンツアミジン、尿素、または塩酸グアニジン等が多
用される。

使用条件は用いるクロマトグラフィーの種類により異な
る。目的のタンパク質をｉ＄　Ｊ！しない条件で使用し
、エンドトキシンを除去した後、上記化合物を含まない
洗浄液でエンドトキシン除去の為に使用した化合物を洗
い去る。この後目的のタンパク質を？容離液で？８出す
る。

以上、タンパク質の精製過程の一つの工程でエンドトキ
シンを分離除去する方法について述べたがエンドトキシ
ン除去の為に使用される上記化合物は、他の使用法とし
て、これら化合物を不溶性担体に直接又は間隔子を介し
て結合してなる吸着体にパイロジエン含有溶液を接触さ
せてパイロジエンを該吸着体に吸着させることによりパ
イロジエンを除去することも可能である。

〔作用〕

本発明の方法によれば、非イオン性界面活性剤Ｔｒｉｔ
ｏｎ　Ｘを用いたエンドトキシンの除去方法（ＩＩＳ１
’ａｔ　Ｎｏ、４，４１２，９８５）のように、エンド
トキシンと相互作用する物質についてはエンドトキシン
除去効果が低く、その上、界面活性剤を除去し難いとい
う欠点を有するが、この欠点は改善される。

〔実施例〕

以下実施例について説明する。なお、エンドトキシンの
検出はリムルス法（Ｈａｅｍｏｓｔａ−ｓｉｓ＋　７　
＋１８３、１９８７）を用いて行った。

実施例１ ポウズ（Ｂｏｗｅｓ）メラノーマ細胞（八ＴＣＣＣＲＬ
　１４２４Ｇ３６１　）を１０％熱不活性化（５６°Ｃ
１３０分間）胎児牛血清を補充したＲＰＭＩ−１６４０
組織培養媒体中で培養後、培養物を一度洗い血清を含ま
ない媒体中で２４時間培養後、媒体を集め収穫液とした
。収＋ｉ液１０２を適当な方法で部分精製したｉｔｓプ
ラスミノーゲンアクチベータ−（ｔ−ＰＡ）水溶液を出
発物質とした。本溶？ｆｌのｐＨは７〜８、活性はＩ　
Ｘ１０’ｌＵ／ｍ１であった。また、この溶液のエンド
トキシン含量はリムルス試験法で約２０ｎｇ／ｒｄ（Ｅ
、ｃｏｌｉ　Ｏ，５５：Ｂ５相当）であった。

この／８？ｅｌ　２０　ｍｌをＦ、Ｊ、Ｊｏｕｂｅｒｔ
　らの方法（Ｈｏｐｐｅ−Ｓｏｌ−ｙｅｒｓ’Ｚ、Ｐｈ
１ｇ５ｉｄ　Ｃｈａｍ、３６２．５３１〜５３８．１９
８１）に従って精製したエリスリナトリプシンインヒビ
ター（ＥＴＩ）をアガロース樹脂に固定化したＥＴＩ−
アガロース（５■ＥＴＩ／ｄ樹脂）２戚に通した。

続いて、０．５Ｍアルギニン及び０．１Ｍ食塩を含む５
０ｍＭのＮａＨｚＰＯａ−ＮａＯＨｐＨ９，５２０ｍｆ
ｆ１さらに蒸留水１０ｄで洗浄した。素通し液中のｔ−
ＰＡ活性は添加総量の約５χであった。

続いて、０．１Ｍ食塩を含む０．１Ｍ　Ｎａ１ｌｚＰＯ
ａ−ＨｓＰＯ４ｐ）Ｉ２．８５　ｍｌでｔＰＡを溶出す
るとほぼ定量的にｔＰＡが回収でき、かつエンドトキシ
ン含量はリムルス試験法で１０ｐｇ／ｍＡ！以下であり
、はぼ完全にエンドトキシンフリーの製剤が得られた。

実施例２ 実施例１と同様に調製された出発物質を用い、この？８
液２０ｄを抗ヒトｔＰＡモノクローナル抗体をアガロー
スに固定化したα−ｔＰＡアガロース（１０ｍｇａ−ｔ
ＰＡ／ｍｌ樹脂）５０ｒｄに通した。続いて０．１Ｍベ
ンツアミジン及び１Ｍ食塩を含む０．０５Ｍ　リン酸緩
衝液ｐＨ７，５２００ｍさらに蒸留水１００ｍｊ！で洗
浄した。

素通し液中のｔＰＡ活性は、はぼ検出されなかった。続
いて０．１−食塩を含むＯ，ＬＭ　Ｎａ）Ｉ２ＰＯａ−
１１３ＰＯ４ｐＨ２，５５０ｍでｔＰＡを溶出した。添
加総量の約８５％のｔＰＡが回収でき、かつエンドトキ
シン含量はリムルス試験法でエンドトキシンは認められ
なかった。

実施例３ ヒト血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ社製）１０■を０．１
＋’１食塩を含む０．０２Ｍ　リン酸緩衝液ｐＨ６，０
５ｍｆｆ１に溶解した。

このン容ン夜のエンドトキシン含量は、リムルス試験法
で約２０ｎｇ／　ｍｆｆ１（Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｏ，５５：
　Ｂ５相当）であった。

この溶液を上記緩衝液で平衡化したレッド−セフ７０−
ス（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ
ｓ）　２　ｍｌに通した。続いて０．５Ｍ尿素を含む上
記緩衝液２０ｍ１ｌさらに上記緩衝液２０ｍ２で洗浄し
た後、１．０Ｍ食塩を含む０．０５Ｍ　ＮａｔｌｚＰＯ
，−ＮａＯＨｐＨ９，５Ｌｏｖｇで７容出した。タンパ
ク質の回収率は約９０％であり、リムルス試験法でのエ
ンドトキシン含量は１０ｐｇ／ｄ以下であっ実施例４ ヒト血漿を適当な方法で部分精製したインターアルファ
ートリプシンインヒビター溶液（３Ｍ食塩を含む釦リン
酸緩衝液ｐＨ６，８）を出発物質とした。

本１ｇ　ｌ＆のインターアルファートリプシンインヒビ
ター含量は０．７ｍｇ／！ｄ（酵素免疫法（ＥＩＡ）に
よる〕であり、またエンドトキシン含量は、リムルス試
験法で約４０ｎｇ／ｍ（Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｏ，５５：　Ｂ
５相当）であった。

この溶液３ｄをフェニールセファロース５Ｉｄに通した
。続いて０．釘グアニジン塩酸及び３Ｍ食塩を含む０．
０５Ｍ　ＮａＨｚＰＯｎ　ｐＨ６，８５０ｙｄ、さらに
３Ｍ食塩を含む０．０５Ｍ　ＮａＨ２ＰＯ４ｐＨ６，８
５０ｔａｉｌで洗浄した。

素通し液中のインターアルファートリプシンインヒビタ
ーは添加総量の約１０％であった。

続いて０．０５Ｍ　ＮａＨｚＰＯ４溶液ｐＨ９，５２０
ｍｌでインターアルファートリプシンインヒビターた。

インターアルファートリプシンインヒビターは添加総量
の約８０％が回収でき、かつエンドトキシン含量はリム
ルス試験法で１０ｐｇ／ｍｆｆ１以下であった。

実施例５ ヒト血漿からブルーセファロース及びイオン交換樹脂を
用いて精製したα−プロテイナーゼインヒビター溶液（
０，１５？Ｉ食塩を含む０．０５Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７
，３）を出発物質とした。

本溶液のα−プロテイナーゼインヒビター含量は１．２
ｍｇ／ｍであり、またエンドトキシン含量はリムルス試
験法で約５０ｎｇ／ｄ（Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｏ，５５：　Ｂ
５相当）であった。

この溶液５０１Ｒ１を樹脂（ＣＩ−セファロース（Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａＦｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ））　Ｉ
ｇ当たり５．Ｑ　ｐ　ｍｏｌｅのアルギニンを固定化し
たアルギニン−セファロース５ｄに通した。

通過液におけるα−プロテイナーゼインヒビターの回収
量はほぼ１００％であり、エンドトキシン含量はリムル
ス試験法で約３０ｐｇ／ｄであった。

特許出願人　　三井東圧化学株式会社

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １、エンドトキシンを含有する有用タンパク質の水溶液
   を一旦、そのタンパク質に特異的に反応する物質を担持
   させた担体に接触させてタンパク質を吸着させ、次いで
   アミノ化合物を含有する溶液で洗浄してエンドトキシン
   を除去し、目的のタンパク質を溶離することを特徴とす
   るエンドトキシンの除去方法。