JP7531217B2 - 癌を査定および／または処置するためのセルフリーｄｎａ - Google Patents

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Description

関連出願の相互参照
本願は、２０１８年５月１８日に出願された米国特許出願第６２／６７３，５１６号の恩典を主張し、２０１９年１月２３日に出願された米国特許出願第６２／７９５，９００号の恩典を主張する。先行出願の開示は、本願の開示の一部と考えられる（および参照により、その中に組み込まれる）。
連邦政府の資金拠出に関する陳述
本発明は、国立衛生研究所からの助成金番号ＣＡ１２１１１３を受けて、アメリカ合衆国政府の支援を得て為された。アメリカ合衆国政府は、本発明に一定の権利を有する。
１．技術分野
本文書は、癌を有する哺乳動物（例えば、ヒト）を査定し、および／または処置するための方法および材料に関する。例えば、本文書は、癌（例えば、限局性癌）を有するとして哺乳動物を特定するための方法および材料を提供する。例えば、本文書は、癌を有する哺乳動物をモニタリングし、および／または処置するための方法および材料を提供する。
２．背景事情
全世界におけるヒトの癌の罹患率および死亡率の多くは、処置の有効性がより低いこれらの疾患の診断の遅れの結果である（Ｔｏｒｒｅら、２０１５ ＣＡ Ｃａｎｃｅｒ Ｊ Ｃｌｉｎ ６５：８７；およびＷｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ，２０１７ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｃａｎｃｅｒ Ｅａｒｌｙ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ）。残念なことに、患者を広く診断および処置するために使用することができる臨床的に証明された生物マーカーは、広く利用可能でない（Ｍａｚｚｕｃｃｈｅｌｌｉ，２０００ Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ４：１１１；Ｒｕｉｂａｌ Ｍｏｒｅｌｌ，１９９２ Ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｍａｒｋｅｒｓ ７：１６０；Ｇａｌｌｉら、２０１３ Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ５１：１３６９；Ｓｉｋａｒｉｓ，２０１１ Ｈｅａｒｔ，ｌｕｎｇ＆ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ２０：６３４；Ｌｉｎら、２０１６ ｉｎ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｆｏｒ Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｃａｎｃｅｒ：Ａ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｒｅｖｉｅｗ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｕ．Ｓ．Ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ Ｔａｓｋ Ｆｏｒｃｅ．（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）；Ｗａｎｅｂｏら、１９７８ Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２９９：４４８；およびＺａｕｂｅｒ，２０１５ Ｄｉｇ Ｄｉｓ Ｓｃｉ ６０：６８１）。
Ｔｏｒｒｅら、２０１５ ＣＡ Ｃａｎｃｅｒ Ｊ Ｃｌｉｎ ６５：８７ Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ，２０１７ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｃａｎｃｅｒ Ｅａｒｌｙ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ Ｍａｚｚｕｃｃｈｅｌｌｉ，２０００ Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ４：１１１ Ｒｕｉｂａｌ Ｍｏｒｅｌｌ，１９９２ Ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｍａｒｋｅｒｓ ７：１６０ Ｇａｌｌｉら、２０１３ Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ５１：１３６９ Ｓｉｋａｒｉｓ，２０１１ Ｈｅａｒｔ，ｌｕｎｇ ＆ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ２０：６３４ Ｌｉｎら、２０１６ ｉｎ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｆｏｒ Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｃａｎｃｅｒ：Ａ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｒｅｖｉｅｗ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｕ．Ｓ．Ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ Ｔａｓｋ Ｆｏｒｃｅ．（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ） Ｗａｎｅｂｏら、１９７８ Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２９９：４４８ Ｚａｕｂｅｒ，２０１５ Ｄｉｇ Ｄｉｓ Ｓｃｉ ６０：６８１
セルフリーＤＮＡの最近の分析は、このようなアプローチが早期診断のための新たな道筋を与え得ることを示唆する（Ｐｈａｌｌｅｎら、２０１７ Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ９；Ｃｏｈｅｎら、２０１８ Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５９：９２６；Ａｌｉｘ－Ｐａｎａｂｉｅｒｅｓら、２０１６ Ｃａｎｃｅｒ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ６：４７９；Ｓｉｒａｖｅｇｎａら、２０１７ Ｎａｔｕｒｅ ｒｅｖｉｅｗｓ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｏｎｃｏｌｏｇｙ １４：５３１；Ｈａｂｅｒら、２０１４ Ｃａｎｃｅｒ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ４：６５０；Ｈｕｓａｉｎら、２０１７ ＪＡＭＡ ３１８：１２７２；およびＷａｎら、２０１７ Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ １７：２２３）。
本文書は、哺乳動物中の（例えば、哺乳動物から取得された試料中の）セルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）断片化プロファイルを決定するための方法および材料を提供する。いくつかの事例では、癌を有するとして哺乳動物を特定するために、哺乳動物中のｃｆＤＮＡ断片化プロファイルを決定することを使用することができる。例えば、哺乳動物から（例えば、哺乳動物から取得された試料から）取得されたｃｆＤＮＡ断片は、低カバレッジ全ゲノム配列決定に供することができ、配列決定された断片は、ｃｆＤＮＡ断片化プロファイルを決定するために、ゲノムに（例えば、非重複ウィンドウ中に）マッピングされ、査定されることができる。本文書は、癌を有するまたは有すると疑われる哺乳動物（例えば、ヒト）を査定し、および／または処置するための方法および材料も提供する。いくつかの事例において、本文書は、癌を有するとして哺乳動物を特定するための方法および材料を提供する。例えば、哺乳動物から取得された試料（例えば、血液試料）は、少なくとも部分的にｃｆＤＮＡ断片化プロファイルに基づいて、当該哺乳動物が癌を有するかどうかを決定するために査定することができる。いくつかの事例において、本文書は、癌を有する哺乳動物をモニタリングし、および／または処置するための方法および材料を提供する。例えば、哺乳動物を処置するために、（例えば、少なくとも部分的にｃｆＤＮＡ断片化プロファイルに基づいて）癌を有するとして特定された哺乳動物に、１または複数の癌処置を実施することができる。
癌の早期検出および位置決定のための非侵襲性の方法が本明細書に記載されている。血中ｃｆＤＮＡは、癌を有する患者に非侵襲性診断の道筋を与えることができる。本明細書において実証されているように、早期遮断のための断片のＤＮＡ評価（ＤＥＬＦＩ（ＤＮＡ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｆｏｒ ｅａｌｒｙ Ｉｎｔｅｒｃｅｐｔｉｏｎ））が開発され、乳癌、結腸直腸癌、肺癌、卵巣癌、膵臓癌、胃癌または胆管癌を有する２３６人の患者の他、２４５人の健康な個体のｃｆＤＮＡの全ゲノム断片化パターンを評価するために使用された。これらの分析は、健康な個体のｃｆＤＮＡプロファイルが白血球のヌクレオソームの断片化パターンを反映するのに対して、癌を有する患者は変化した断片化プロファイルを有することを明らかにした。ＤＥＬＦＩは、９８％の特異性で、７つの癌の種類の中で、５７％～９９％超の範囲の検出の感度を有し、７５％の症例で、癌の原発組織を限られた数の部位に特定した。（例えば、ＤＥＬＦＩを用いて）ｃｆＤＮＡを査定することは、癌の早期検出のためのスクリーニングアプローチを提供することができ、これは、癌を有する患者の処置が成功する可能性を増加させることができる。（例えば、ＤＥＬＦＩを用いて）ｃｆＤＮＡを査定することは、癌をモニタリングするためのアプローチを提供することもでき、これは、癌を有する患者の処置の成功および改善された転帰の可能性を増加させることができる。さらに、ｃｆＤＮＡ断片化プロファイルは、限られた量のｃｆＤＮＡから、安価な試薬および／または機器を使用して取得することができる。
一般に、本文書の一態様は、哺乳動物のｃｆＤＮＡ断片化プロファイルを決定するための方法を特徴とする。この方法は、前記哺乳動物から取得された試料から取得されたｃｆＤＮＡ断片を加工して配列決定ライブラリーにすること、配列決定された断片を取得するために、前記配列決定ライブラリーを全ゲノム配列決定（例えば、低カバレッジ全ゲノム配列決定）に供すること、マッピングされた配列のウィンドウを取得するために、前記配列決定された断片をゲノムにマッピングすること、およびｃｆＤＮＡ断片長を決定するために、マッピングされた配列の前記ウィンドウを分析すること、を含むことができ、または本質的にこれらからなることができる。マッピングされた配列は、数十～数千のウィンドウを含むことができる。マッピングされた配列のウィンドウは、非重複ウィンドウであり得る。マッピングされた配列のウィンドウは、それぞれ、約５００万塩基対を含むことができる。ｃｆＤＮＡ断片化プロファイルは、各ウィンドウ内で決定することができる。ｃｆＤＮＡ断片化プロファイルは、断片サイズ中央値を含むことができる。ｃｆＤＮＡ断片化プロファイルは、断片サイズ分布を含むことができる。ｃｆＤＮＡ断片化プロファイルは、マッピングされた配列のウィンドウ中での、大きなｃｆＤＮＡ断片に対する小さなｃｆＤＮＡ断片の比率を含むことができる。ｃｆＤＮＡ断片化プロファイルは、全ゲノムにわたることができる。ｃｆＤＮＡ断片化プロファイルは、サブゲノム区間（例えば、染色体の一部中の区間）にわたることができる。
別の態様において、本文書は、癌を有するとして哺乳動物を特定するための方法を特徴とする。この方法は、哺乳動物から取得された試料中のｃｆＤＮＡ断片化プロファイルを決定すること、前記ｃｆＤＮＡ断片化プロファイルを参照ｃｆＤＮＡ断片化プロファイルと比較すること、および前記哺乳動物から取得された試料中の前記ｃｆＤＮＡ断片化プロファイルが前記参照ｃｆＤＮＡ断片化プロファイルと異なる場合に、癌を有するとして前記哺乳動物を特定すること、を含むことができ、またはこれらから本質的になることができる。参照ｃｆＤＮＡ断片化プロファイルは健康な哺乳動物のｃｆＤＮＡ断片化プロファイルであり得る。参照ｃｆＤＮＡ断片化プロファイルは、健康な哺乳動物から取得された試料中のｃｆＤＮＡ断片化プロファイルを決定することによって生成されることができる。参照ＤＮＡ断片化パターンは、参照ヌクレオソームｃｆＤＮＡ断片化プロファイルであり得る。ｃｆＤＮＡ断片化プロファイルは断片サイズ中央値を含むことができ、ｃｆＤＮＡ断片化プロファイルの断片サイズ中央値は、参照ｃｆＤＮＡ断片化プロファイルの断片サイズ中央値より短いことがあり得る。ｃｆＤＮＡ断片化プロファイルは断片サイズ分布を含むことができ、ｃｆＤＮＡ断片化プロファイルの断片サイズ分布は、参照ｃｆＤＮＡ断片化プロファイルの断片サイズ分布と比べて、少なくとも１０ヌクレオチド異なり得る。ｃｆＤＮＡ断片化プロファイルは、大きなｃｆＤＮＡ断片に対する小さなｃｆＤＮＡ断片の比率を含む、断片化パターンの位置依存的な差を含むことができ、ここで、小さなｃｆＤＮＡ断片は長さ１００塩基対（ｂｐ）～１５０ｂｐであり得、大きなｃｆＤＮＡ断片は長さ１５１ｂｐ～２２０ｂｐであり得、ｃｆＤＮＡ断片化プロファイル中の断片比率の相関は、参照ｃｆＤＮＡ断片化プロファイルの断片比率の相関より低いことがあり得る。ｃｆＤＮＡ断片化プロファイルは、ゲノムにわたる、小さなｃｆＤＮＡ断片、大きなｃｆＤＮＡ断片または小さなｃｆＤＮＡ断片と大きなｃｆＤＮＡ断片の両方の配列カバレッジを含むことができる。癌は、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、胆管癌、膵臓癌、胃癌または卵巣癌であり得る。比較の工程は、全ゲノムにわたるウィンドウ中で、ｃｆＤＮＡ断片化プロファイルを参照ｃｆＤＮＡ断片化プロファイルと比較することを含むことができる。比較の工程は、サブゲノム区間（例えば、染色体の一部の中の区間）にわたって、ｃｆＤＮＡ断片化プロファイルを参照ｃｆＤＮＡ断片化プロファイルと比較することを含むことができる。哺乳動物は、癌を処置するための癌処置を以前に実施されたことがあり得る。癌処置は、手術、術後補助化学療法、術前補助化学療法、放射線療法、ホルモン療法、細胞傷害性療法、免疫療法、養子Ｔ細胞療法、標的療法またはこれらの任意の組み合わせであり得る。前記方法は、癌処置（手術、術後補助化学療法、術前補助化学療法、放射線療法、ホルモン療法、細胞傷害性療法、免疫療法、養子Ｔ細胞療法、標的療法またはこれらの任意の組み合わせ）を哺乳動物に実施することを含むこともできる。哺乳動物は、癌処置の実施後における癌の存在に対してモニターされ得る。
別の態様において、本文書は、癌を有する哺乳動物を処置するための方法を特徴とする。この方法は、癌を有するとして哺乳動物を特定することを含むことができ、または癌を有するとして哺乳動物を特定することから本質的になることができ、ここで、前記特定は、前記哺乳動物から取得された試料中のｃｆＤＮＡ断片化プロファイルを決定すること、ｃｆＤＮＡ断片化プロファイルを参照ｃｆＤＮＡ断片化プロファイルと比較すること、および前記哺乳動物から取得されたｃｆＤＮＡ断片化プロファイルが前記参照ｃｆＤＮＡ断片化プロファイルと異なる場合に、癌を有するとして前記哺乳動物を特定すること；および前記哺乳動物に癌処置を実施すること、を含む。哺乳動物は、ヒトであり得る。癌は、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、胃癌、膵臓癌、胆管癌または卵巣癌であり得る。癌処置は、手術、術後補助化学療法、術前補助化学療法、放射線療法、ホルモン療法、細胞傷害性療法、免疫療法、養子Ｔ細胞療法、標的療法またはこれらの組み合わせであり得る。参照ｃｆＤＮＡ断片化プロファイルは健康な哺乳動物のｃｆＤＮＡ断片化プロファイルであり得る。参照ｃｆＤＮＡ断片化プロファイルは、健康な哺乳動物から取得された試料中のｃｆＤＮＡ断片化プロファイルを決定することによって生成されることができる。参照ＤＮＡ断片化パターンは、参照ヌクレオソームｃｆＤＮＡ断片化プロファイルであり得る。ｃｆＤＮＡ断片化プロファイルは断片サイズ中央値を含むことができ、ここで、ｃｆＤＮＡ断片化プロファイルの断片サイズ中央値は、参照ｃｆＤＮＡ断片化プロファイルの断片サイズ中央値より短い。ｃｆＤＮＡ断片化プロファイルは断片サイズ分布を含むことができ、ここで、ｃｆＤＮＡ断片化プロファイルの断片サイズ分布は、参照ｃｆＤＮＡ断片化プロファイルの断片サイズ分布と比べて、少なくとも１０ヌクレオチド異なる。ｃｆＤＮＡ断片化プロファイルは、マッピングされた配列のウィンドウ中での、大きなｃｆＤＮＡ断片に対する小さなｃｆＤＮＡ断片の比率を含むことができ、ここで、小さなｃｆＤＮＡ断片は長さ１００ｂｐ～１５０ｂｐであり、大きなｃｆＤＮＡ断片は長さ１５１ｂｐ～２２０ｂｐであり、ｃｆＤＮＡ断片化プロファイル中の断片比率の相関は、参照ｃｆＤＮＡ断片化プロファイルの断片比率の相関より低い。ｃｆＤＮＡ断片化プロファイルは、ゲノムにわたるウィンドウ中での小さなｃｆＤＮＡ断片の配列カバレッジを含むことができる。ｃｆＤＮＡ断片化プロファイルは、ゲノムにわたるウィンドウ中での大きなｃｆＤＮＡ断片の配列カバレッジを含むことができる。ｃｆＤＮＡ断片化プロファイルは、ゲノムにわたるウィンドウ中での小さなおよび大きなｃｆＤＮＡ断片の配列カバレッジを含むことができる。比較の工程は、全ゲノムにわたり、ｃｆＤＮＡ断片化プロファイルを参照ｃｆＤＮＡ断片化プロファイルと比較することを含むことができる。比較の工程は、サブゲノム区間にわたり、ｃｆＤＮＡ断片化プロファイルを参照ｃｆＤＮＡ断片化プロファイルと比較することを含むことができる。哺乳動物は、癌を処置するための癌処置を以前に実施されたことがあり得る。癌処置は、手術、術後補助化学療法、術前補助化学療法、放射線療法、ホルモン療法、細胞傷害性療法、免疫療法、養子Ｔ細胞療法、標的療法またはこれらの組み合わせであり得る。前記方法は、癌処置の実施後における癌の存在に対して哺乳動物をモニタリングすることも含むことができる。
別段の定義がなければ、本明細書で使用されている全ての技術用語および科学用語は、当業者によって通常理解される意味と同一の意味を有する。本発明を実施するために、本明細書に記載されているものと類似のまたは均等な方法および材料を使用することができるが、以下には、適切な方法および材料が記載されている。本明細書中に挙げられている全ての刊行物、特許出願、特許および他の参照文献は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。抵触が生じる場合には、定義を含む本明細書が優越する。さらに、材料、方法および実施例は例示に過ぎず、限定することを意図していない。
本発明の１または複数の実施形態の詳細は、添付の図面および以下の記述中に記載されている。本発明の他の特徴、目的および利点が、本明細書および図面からならびに特許請求の範囲から明らかになるであろう。
例示的なＤＥＬＦＩアプローチの模式図。健康な個体および癌を有する患者のコホートから血液を収集する。血漿画分からヌクレオソーム保護されたｃｆＤＮＡを抽出し、加工して配列決定ライブラリーとし、全ゲノム配列決定を通じて調べ、ゲノムへマッピングし、ゲノムにわたる異なるウィンドウ中でｃｆＤＮＡ断片プロファイルを決定するために分析した。個体を健康としてまたは癌を有するとして分類するために、および全ゲノムｃｆＤＮＡ断片化パターンを用いて、腫瘍原発組織を特定するために、機械学習アプローチを使用する。 分析された変動の数および腫瘍由来ｃｆＤＮＡ断片分布に基づいた、非侵襲性癌検出のシミュレーション。表記された割合の腫瘍由来分子での、ｃｆＤＮＡの癌変動を検出する確率を評価するために、異なる数の腫瘍特異的変動を用いて、モンテカルロシミュレーションを行った。平均２０００ゲノム当量のｃｆＤＮＡおよび任意の変動の５またはそれを超える観察の必要性を仮定して、シミュレーションを行った。これらの分析は、腫瘍特異的変動の数を増加させることは、循環する腫瘍ＤＮＡの検出感度を向上させることを示している。 腫瘍由来ｃｆＤＮＡ断片の分布。乳癌、結腸直腸癌、肺癌または卵巣癌を有する３０人の患者から得た腫瘍特異的変動を含有する４２の座位のｃｆＤＮＡ断片長の累積密度関数が、９５％信頼帯（青）とともに示されている。変異ｃｆＤＮＡ断片の長さは、これらの座位における野生型ｃｆＤＮＡ断片（赤）と比較して、サイズが著しく異なった。 図４Ａおよび図４Ｂは、腫瘍由来ｃｆＤＮＡのＧＣ含量および断片長。Ａ、ＧＣ含量は、変異した断片および変異していない断片について類似していた。Ｂ、ＧＣ含量は断片長と相関していなかった。 生殖系列ｃｆＤＮＡ断片の分布。乳癌、結腸直腸癌、肺癌または卵巣癌を有する３８人の患者から得た生殖系列変動（非腫瘍由来）を含有する４４座位の断片長の累積密度関数が、９５％信頼帯とともに示されている。生殖系列変異（青）を有する断片の長さは、野生型ｃｆＤＮＡ断片長（赤）と同等であった。 造血系ｃｆＤＮＡ断片の分布。乳癌、結腸直腸癌、肺癌または卵巣癌を有する２８人の患者から得た造血系変動（非腫瘍由来）を含有する４１座位の断片長の累積密度関数が、９５％信頼帯とともに示されている。多重検定に対する補正後に、変異した造血系ｃｆＤＮＡ断片（青）と野生型ｃｆＤＮＡ断片（赤）のサイズ分布に有意な差は存在しなかった（α＝０．０５）。 図７Ａ～図７Ｆは、健康な個体および癌を有する患者におけるｃｆＤＮＡ断片化プロファイル。Ａ、約９×全ゲノム配列決定から得られた全ゲノムｃｆＤＮＡ断片化プロファイル（長い断片に対する短い断片の比率として定義される）が、３０人の健康な個体（上）および８人の肺癌患者（下）に対して、５Ｍｂのビンで示されている。Ｂ、１Ｍｂの解像度での、１番染色体から得られた、健康なｃｆＤＮＡ（上）、肺癌ｃｆＤＮＡ（中央）および健康なリンパ球（下）の断片化プロファイルならびにリンパ球プロファイルの分析。健康なｃｆＤＮＡプロファイル中央値の標準偏差と等しい標準偏差で、健康なリンパ球プロファイルをスケール調整した。健康なｃｆＤＮＡパターンは、健康なリンパ球中のｃｆＤＮＡパターンを極めて忠実に反映していたが、肺癌ｃｆＤＮＡプロファイルはより多様であり、健康なプロファイルおよびリンパ球プロファイルの両方と異なっている。Ｃ、健康なｃｆＤＮＡ（上）およびヌクレアーゼ消化された健康なリンパ球（中央）から１００ｋのｂビンを使用し、ゼロを中央に配置した隣接ヌクレオソーム間の平滑化された距離中央値が、以前に報告されたリンパ芽球様細胞のＨｉ－Ｃ分析（下）を通じて得られたゲノムコンタクト行列に対する第一固有ベクトルとともに図示されている。健康なｃｆＤＮＡヌクレオソーム距離は、ヌクレアーゼ消化されたリンパ球中の距離およびリンパ芽球様Ｈｉ－Ｃ分析から得られた距離を極めて忠実に反映していた。健康な個体（ｎ＝３０）からのｃｆＤＮＡ断片化プロファイルは、リンパ球（Ｄ）、健康なｃｆＤＮＡ（Ｅ）およびリンパ球ヌクレオソーム（Ｆ）距離の断片化プロファイル中央値に高い相関を有していたが、肺癌を有する患者は、より低い相関を有していた。 健康な個体および肺癌を有する患者におけるｃｆＤＮＡ断片長の密度。健康な個体（ｎ＝３０、灰色）および肺癌を有する患者（ｎ＝８、青色）に対して、ｃｆＤＮＡ断片長が示されている。 図９Ａおよび図９Ｂは、ｃｆＤＮＡ断片化プロファイルの分析のための全ゲノム配列データのサブサンプリング。Ａ、高カバレッジ（９×）全ゲノム配列決定データを、２×、１×、０．５×、０．２×および０．１×倍のカバレッジになるようにサブサンプリングした。それぞれのサブサンプリングされた倍数カバレッジに対して、３０人の健康な個体および８人の肺癌を有する患者に対する５Ｍｂビンでの平均を中央に配置した全ゲノム断片化プロファイルが、青色で示されたプロファイル中央値とともに図示されている。Ｂ、健康な個体および肺癌を有する患者に対する９×カバレッジでの当初プロファイルに対するサブサンプリングされたプロファイルのピアソン相関。 治療の間のｃｆＤＮＡ断片化プロファイルおよび配列変動。標的化されたチロシンキナーゼ阻害剤（黒い矢印）での処置を受けているＮＳＣＬＣ患者（ｎ＝１９）からの連続的採血中での癌の検出およびモニタリングを、標的化配列決定（上）および全ゲノム断片化プロファイル（下）を用いて行った。各事例について、下側パネルの縦軸は、健康ｃｆＤＮＡ断片化プロファイル中央値に対する各試料の相関の１倍を示す。エラーバーは、変異アレル頻度に対する二項検定から得られた信頼区間および全ゲノム断片化プロファイルに対するフィッシャー変換を用いて計算された信頼区間を図示する。これらのアプローチは、ｃｆＤＮＡの異なる側面（特定の変動と比較される全ゲノム）を分析するが、治療に応答している患者および安定なまたは進行する疾患を有する患者について、標的化配列決定および断片化プロファイルは類似していた。断片化プロファイルはゲノム変化およびエピゲノム変動の両方を反映するのに対して、変異アレル頻度は個別の変異のみを反映するので、変異アレル頻度単独では、健康な個体に対する断片化プロファイルの相関の絶対的水準を反映しないことがあり得る。 図１１Ａ～図１１Ｃは、健康な個体および癌を有する患者中のｃｆＤＮＡ断片化プロファイル。Ａ、腫瘍組織の平行的分析が実施された結腸直腸癌患者における、腫瘍コピー数変化（上）との関連での断片化プロファイル（下）。セグメント平均の分布および整数コピー数が、表記の色で上部右に示されている。変化された断片化プロファイルは、コピー中立であったゲノムの領域中に存在し、コピー数変化を有する領域中でさらに影響を受けた。Ｂ、健康な個体および癌を有する患者に対する１～２×全ゲノム配列決定から得られたＧＣ調製された断片化プロファイルが、５Ｍｂウィンドウを用いて、癌の種類ごとに図示されている。健康プロファイル中央値が黒色で示されており、９８％信頼帯が灰色で示されている。癌を有する患者については、各プロファイルは、健康な中央値に対するそれらの相関に基づいて色が付されている。Ｃ、癌試料の１０％超が健康な断片比率中央値から３標準偏差を超える断片比率を有していれば、ウィンドウはオレンジ色で示されている。これらの分析は、癌を有する個体のｃｆＤＮＡ中におけるゲノムにわたる多数の位置依存的変動を強調する。 図１２Ａおよび図１２Ｂは、健康な個体および結腸直腸癌を有する１人の患者におけるコピー中立領域中のｃｆＤＮＡ断片長のプロファイル。Ａ、無作為に選択された２５人の健康な個体に対する、１～６番染色体中の２１１のコピー中立ウィンドウ中の断片化プロファイル（灰色）。２０％の推定変異アレル頻度を有する結腸直腸癌を有する患者（ＣＧＣＲＣ２９１）については、癌断片長プロファイルは、およそ１０％の腫瘍寄与に希釈された（青）。ＡおよびＢ、健康な試料および癌患者に対する断片プロファイルの周辺密度は大幅な重複を示すが（Ａ、右）、断片化プロファイルの可視化（Ａ、左）および主成分分析における健康な試料からの結腸直腸癌患者の分離（Ｂ）によって明らかであるように、断片化プロファイルは異なる。 図１３Ａおよび図１３Ｂは、ｃｆＤＮＡ断片の全ゲノムにわたるＧＣ補正。配列決定カバレッジに対するＧＣ含量の効果を推測および調節するために、非重複１００ｋｂゲノムウィンドウ中のカバレッジを常染色体にわたって計算した。各ウィンドウに対して、並列された断片の平均ＧＣを計算した。Ａ、２人の無作為に選択された健康な被験者（ＣＧＰＬＨ１８９およびＣＧＰＬＨ３８０）および検出不能な異数性を有する（ＰＡスコア＜２．３５）２人の癌患者（ＣＧＰＬＬＵ１６１およびＣＧＰＬＢＲ２４）に対する未加工カバレッジのｌｏｅｓｓ平滑化（上列）。ｌｏｅｓｓモデルによって予測された平均カバレッジを差し引いた後に、常染色体カバレッジ中央値に残余のスケールを調整し直した（下列）。断片長もカバレッジバイアスをもたらし得るので、このＧＣ補正手順は、短い（≦１５０ｂｐ）および長い（≧１５１ｂｐ）断片に対して別々に行った。１９番染色体上の１００ｋｂビン（青い点）は、ｌｏｅｓｓモデルによって予測されるより少ないカバレッジを一貫して有するが、このようなアプローチは、カバレッジに対する染色体のコピー数の効果を除去するので、本発明者らは、染色体的特異的補正を実施しなかった。Ｂ、総合すると、健康な被験者および３未満のＰＡスコアを有する癌患者間で、短いまたは長い断片カバレッジと補正後ＧＣ含量の間には、限定的な相関が見出された。 機械学習モデルの模式図。癌患者または健康な個体の特徴を有するとしてｃｆＤＮＡを分類できるかどうかを調べるために、勾配木ブースティング機械学習を使用した。この機械学習モデルは、ゲノム全体を通じたウィンドウ中での断片化サイズおよびカバレッジ特性ならびに染色体腕およびミトコンドリアＤＮＡのコピー数を含んだ。各試料が１つの分割に無作為に割り当てられ、分割の９つ（データの９０％）が訓練用に使用され、１つの分割（データの１０％）が試験用に使用される１０分割交差検証アプローチを使用した。単一の交差検証から得られる予測精度は、試験および訓練セットの１０個の可能な組み合わせに対する平均である。この予測精度は、患者の最初の無作為化由来のバイアスを反映し得るので、分割への患者の無作為化を含め、手順全体を１０回繰り返した。全ての事例について、特徴選択およびモデル推定は訓練データに対して実施され、試験データに対して検証されて、試験データは特徴選択のために決して使用されなかった。最終的に、健康であるまたは癌を有する可能性が高いとして個体を分類するために使用することができるＤＥＬＦＩスコアが得られた。 反復された１０分割交差検証にわたるＡＵＣの分布。２１５人の健康な個体および２０８人の癌を有する患者のコホートに対する１００ＡＵＣの２５、５０および７５パーセンタイルが破線によって示されている。 図１６Ａおよび図１６Ｂは、染色体腕コピー数変化およびミトコンドリアゲノム表現（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｉｔｏｎ）の全ゲノム分析。Ａ、各常染色体腕に対するＺスコアが、健康な個体（ｎ＝２１５）および癌を有する患者（ｎ＝２０８）に対して図示されている。縦軸は、ゼロに正常なコピーを図示しており、正および負の値は、それぞれ、腕の増加および減少を示している。５０を上回るまたは－５０を下回るＺスコアを表記値で閾値とする。Ｂ、ミトコンドリアゲノムにマッピングされている読み取りデータの割合が、健康な個体および癌を有する患者に対して図示されている。 図１７Ａおよび図１７Ｂは、ＤＥＬＦＩを用いた癌の検出。Ａ、機械学習アプローチにおいて、ｃｆＤＮＡ断片化プロファイルおよびその他の全ゲノムにわたる特徴を用いて癌を検出するための受信者操作者特性が、２１５人の健康な個体および２０８人の癌を有する患者のコホートに対して図示されており（ＤＥＬＦＩ、ＡＵＣ＝０．９４）、９５％以上の特異性には青色の影が付されている。染色体腕コピー数（Ｃｈｒコピー数（ＭＬ））およびミトコンドリアのゲノムコピー数（ｍｔＤＮＡ）の機械学習分析が表記の色で示されている。Ｂ、ＤＥＬＦＩ複合アプローチを使用する個別の癌の種類の分析は、０．８６～０．９９超の範囲のＡＵＣを有していた。 ステージごとの癌のＤＥＬＦＩ検出。機械学習アプローチにおいて、ｃｆＤＮＡ断片化プロファイルおよびその他の全ゲノムにわたる特徴を用いて癌を検出するための受信者操作者特性が、２１５人の健康な個体および２０８人の癌を有する患者の各ステージのコホートに対して図示されており、９５％以上の特異性には青色の影が付されている。 ＤＥＬＦＩ原発組織予測。胆管癌、乳癌、結腸直腸癌、胃癌、肺癌、卵巣癌および膵臓癌のＤＥＬＦＩ組織予測に対する受信者操作者特性が図示されている。癌の種類のクラス内での試料サイズを増加させるために、９０％の特異性で検出された症例が含められ、肺癌コホートには、従前の処置を有する１８人の肺癌患者から得たベースラインｃｆＤＮＡデータの追加を補充した（例えば、Ｓｈｅｎら、２０１８ Ｎａｔｕｒｅ、５６３：５７９－５８３参照）。 ＤＥＬＦＩおよび変異をベースとしたｃｆＤＮＡアプローチを用いた癌の検出。乳癌、胆管癌、結腸直腸癌、胃癌、肺癌または卵巣癌を有する１２６人の患者のコホートにおいてＤＥＬＦＩ（緑）および変異特定のための標的化配列決定（青）を独立に行った。それぞれのアプローチおよびアプローチの組み合わせによって検出された個体の数が、９８％の特異性でＤＥＬＦＩ検出に対して、９９％超の特異性で標的化配列決定に対して、および９８％の特異性で組み合わせに対して示されている。ＮＤは、検出されなかったことを示す。
本文書は、哺乳動物中の（例えば、哺乳動物から取得された試料中の）ｃｆＤＮＡ断片化プロファイルを決定するための方法および材料を提供する。本明細書において使用される「断片化プロファイル」、「断片化パターンの位置依存的差」および「ゲノムにわたる位置依存的な様式での断片サイズおよびカバレッジの差」という用語は等価であり、互換的に使用されることができる。いくつかの事例では、癌を有するとして哺乳動物を特定するために、哺乳動物中のｃｆＤＮＡ断片化プロファイルを決定することを使用することができる。例えば、哺乳動物から（例えば、哺乳動物から取得された試料から）取得されたｃｆＤＮＡ断片は、低カバレッジ全ゲノム配列決定に供することができ、配列決定された断片は、ｃｆＤＮＡ断片化プロファイルを決定するために、ゲノムに（例えば、非重複ウィンドウ中に）マッピングされ、査定されることができる。本明細書において記載されているとおり、癌を有する哺乳動物のｃｆＤＮＡ断片化プロファイルは、（例えば、断片長において）、健康な哺乳動物（例えば、癌を有さない哺乳動物）のｃｆＤＮＡ断片化プロファイルより不均一である。したがって、本文書は、癌を有するまたは有すると疑われる哺乳動物（例えば、ヒト）を査定し、モニタリングし、および／または処置するための方法および材料も提供する。いくつかの事例において、本文書は、癌を有するとして哺乳動物を特定するための方法および材料を提供する。例えば、哺乳動物から取得された試料（例えば、血液試料）は、少なくとも部分的に当該哺乳動物のｃｆＤＮＡ断片化プロファイルに基づいて、当該哺乳動物中の癌の存在、および必要に応じて原発組織を決定するために査定することができる。いくつかの事例において、本文書は、癌を有するとして哺乳動物をモニタリングするための方法および材料を提供する。例えば、哺乳動物から取得された試料（例えば、血液試料）は、少なくとも部分的に当該哺乳動物のｃｆＤＮＡ断片化プロファイルに基づいて、当該哺乳動物中の癌の存在を決定するために査定することができる。いくつかの事例では、本文書は、癌を有するとして哺乳動物を特定し、当該哺乳動物を処置するために当該哺乳動物に１または複数の癌処置を実施するための方法および材料を提供する。例えば、少なくとも部分的に哺乳動物のｃｆＤＮＡ断片化プロファイルに基づいて当該哺乳動物が癌を有するかどうかを決定するために、当該哺乳動物から取得された試料（例えば、血液試料）を査定することができ、当該哺乳動物に、１または複数の癌処置を実施することができる。
ｃｆＤＮＡ断片化プロファイルは、１または複数のｃｆＤＮＡ断片化パターンを含むことができる。ｃｆＤＮＡ断片化パターンは、任意の適切なｃｆＤＮＡ断片化パターンを含むことができる。ｃｆＤＮＡ断片化パターンの例としては、断片サイズ中央値、断片サイズ分布、大きなｃｆＤＮＡ断片に対する小さなｃｆＤＮＡ断片の比率およびｃｆＤＮＡ断片のカバレッジが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの事例では、ｃｆＤＮＡ断片化パターンは、断片サイズ中央値、断片サイズ分布、大きなｃｆＤＮＡ断片に対する小さなｃｆＤＮＡ断片の比率およびｃｆＤＮＡ断片のカバレッジのうち、２またはそれより多く（例えば、２、３または４）を含む。いくつかの事例では、ｃｆＤＮＡ断片化プロファイルは、全ゲノムｃｆＤＮＡプロファイル（例えば、ゲノムにわたるウィンドウ中の全ゲノムｃｆＤＮＡプロファイル）であり得る。いくつかの事例では、ｃｆＤＮＡ断片化プロファイルは、標的化領域プロファイルであり得る。標的化された領域は、ゲノムの任意の適切な部分（例えば、染色体の領域）であり得る。本明細書に記載されているとおりに、ｃｆＤＮＡ断片化プロファイルを決定することができる染色体の領域の例には、染色体の一部（例えば、２ｑ、４ｐ、５ｐ、６ｑ、７ｐ、８ｑ、９ｑ、１０ｑ、１１ｑ、１２ｑおよび／または１４ｑの一部）および染色体腕（例えば、８ｑ、１３ｑ、１１ｑおよび／または３ｐの染色体腕）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの事例では、ｃｆＤＮＡ断片化プロファイルは、２またはそれを超える標的化領域のロファイルを含むことができる。
いくつかの事例では、ｃｆＤＮＡ断片化プロファイルは、ｃｆＤＮＡ断片長の変化（ｃｈａｎｇｅｓ）（例えば、変動（ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ））を特定するために使用することができる。変動は、ゲノム全域にわたる変動であり得、または１もしくは複数の標的化された領域／座位中の変更であり得る。標的領域は、１または複数の癌特異的変動を含有する任意の領域であり得る。癌特異的変動およびその染色体の位置の例としては、表３（添付書類Ｃ）に示されているものおよび表６に示されているもの（添付書類Ｆ）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの事例では、ｃｆＤＮＡ断片化プロファイルは、約１０の変動～約５００の変動（例えば、約２５～約５００、約５０～約５００、約１００～約５００、約２００～約５００、約３００～約５００、約１０～約４００、約１０～約３００、約１０～約２００、約１０～約１００、約１０～約５０、約２０～約４００、約３０～約３００、約４０～約２００、約５０～約１００、約２０～約１００、約２５～約７５、約５０～約２５０または約１００～約２００の変動）を特定する（例えば、同時に特定する）ために使用することができる。
いくつかの事例では、ｃｆＤＮＡ断片化プロファイルは、腫瘍由来ＤＮＡを検出するために使用することができる。例えば、ｃｆＤＮＡ断片化プロファイルは、癌を有するまたは癌を有すると疑われる哺乳動物のｃｆＤＮＡ断片化プロファイルを、参照ｃｆＤＮＡ断片化プロファイル（例えば、健康な哺乳動物のｃｆＤＮＡ断片化プロファイルおよび／または癌を有するもしくは癌を有すると疑われる哺乳動物からの健康な細胞のヌクレオソームのＤＮＡ断片化プロファイル）と比較することによって腫瘍由来のＤＮＡを検出するために使用することができる。いくつかの事例では、参照ｃｆＤＮＡ断片化プロファイルは、健康な哺乳動物から以前に生成されたプロファイルである。例えば、本明細書に提供されている方法は、健康な哺乳動物中の参照ｃｆＤＮＡ断片化プロファイルを決定するために使用することができ、その参照ｃｆＤＮＡ断片化プロファイルは、癌を有するまたは癌を有すると疑われる哺乳動物中の試験ｃｆＤＮＡ断片化プロファイルと将来比較するために（例えば、コンピュータまたはその他の電子的保存媒体中に）保存することができる。いくつかの事例では、健康な哺乳動物の参照ｃｆＤＮＡ断片化プロファイル（例えば、保存されたｃｆＤＮＡ断片化プロファイル）は、全ゲノムにわたって決定される。いくつかの事例では、健康な哺乳動物の参照ｃｆＤＮＡ断片化プロファイル（例えば、保存されたｃｆＤＮＡ断片化プロファイル）は、サブゲノム区間にわたって決定される。
いくつかの事例では、ｃｆＤＮＡ断片化プロファイルは、癌（例えば、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、胃癌、膵臓癌、胆管癌および／または卵巣癌）を有するとして哺乳動物（例えば、ヒト）を特定するために使用することができる。
ｃｆＤＮＡ断片化プロファイルは、ｃｆＤＮＡ断片サイズパターンを含むことができ、ｃｆＤＮＡ断片は任意の適切なサイズであり得る。例えば、ｃｆＤＮＡ断片は、約５０塩基対（ｂｐ）～約４００ｂｐの長さであり得る。本明細書に記載されているとおり、癌を有する哺乳動物は、健康な哺乳動物中のｃｆＤＮＡ断片サイズ中央値より短いｃｆＤＮＡ断片サイズ中央値を含有するｃｆＤＮＡ断片サイズパターンを有することができる。健康な哺乳動物（例えば、癌を有さない哺乳動物）は、約１６６．６ｂｐ～約１６７．２ｂｐ（例えば、約１６６．９ｂｐ）のｃｆＤＮＡ断片サイズ中央値を有するｃｆＤＮＡ断片サイズを有することができる。いくつかの事例では、癌を有する哺乳動物は、健康な哺乳動物中のｃｆＤＮＡ断片サイズより平均して約１．２８ｂｐ～約２．４９ｂｐ（例えば、約１．８８ｂｐ）短いｃｆＤＮＡ断片サイズを有することができる。例えば、癌を有する哺乳動物は、約１６４．１１ｂｐ～約１６５．９２ｂｐ（例えば、約１６５．０２ｂｐ）のｃｆＤＮＡ断片サイズ中央値を有するｃｆＤＮＡ断片サイズを有することができる。
ｃｆＤＮＡ断片化プロファイルは、ｃｆＤＮＡ断片サイズ分布を含むことができる。本明細書に記載されているとおり、癌を有する哺乳動物は、健康な哺乳動物中のｃｆＤＮＡ断片サイズ分布より可変的であるｃｆＤＮＡサイズ分布を有することができる。いくつかの事例では、サイズ分布は、標的化された領域内であり得る。健康な哺乳動物（例えば、癌を有さない哺乳動物）は、約１または約１未満の標的化された領域のｃｆＤＮＡ断片サイズ分布を有することができる。いくつかの事例では、癌を有する哺乳動物は、健康な哺乳動物中の標的化された領域のｃｆＤＮＡ断片サイズ分布より長い（例えば、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０ｂｐもしくはそれより長いまたはこれらの数字の間の塩基対の任意の数）標的化された領域のｃｆＤＮＡ断片サイズ分布を有することができる。いくつかの事例では、癌を有する哺乳動物は、健康な哺乳動物中の標的化された領域のｃｆＤＮＡ断片サイズ分布より短い（例えば、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０ｂｐもしくはそれより短いまたはこれらの数字の間の塩基対の任意の数）標的化された領域のｃｆＤＮＡ断片サイズ分布を有することができる。いくつかの事例では、癌を有する哺乳動物は、健康な哺乳動物中の標的化された領域のｃｆＤＮＡ断片サイズ分布より約４７ｂｐ小さい～約３０ｂｐ長い標的化された領域のｃｆＤＮＡ断片サイズ分布を有することができる。いくつかの事例では、癌を有する哺乳動物は、ｃｆＤＮＡ断片の長さが平均１０、１１、１２、１３、１４、１５、１５、１７、１８、１９、２０ｂｐまたはそれを超える差の標的化された領域のｃｆＤＮＡ断片サイズ分布を有することができる。例えば、癌を有する哺乳動物は、ｃｆＤＮＡ断片の長さが平均約１３ｂｐの差の標的化された領域のｃｆＤＮＡ断片サイズ分布を有することができる。いくつかの事例では、サイズ分布は、全ゲノムサイズ分布であり得る。健康な哺乳動物（例えば、癌を有さない哺乳動物）は、全ゲノムに短いおよび長いｃｆＤＮＡ断片の極めて類似した分布を有することができる。いくつかの事例では、癌を有する哺乳動物は、全ゲノムに、ｃｆＤＮＡ断片サイズの１または複数の変動（例えば、増加および減少）を有することができる。１または複数の変動は、ゲノムの任意の適切な染色体の領域であり得る。例えば、変動は、染色体の一部の中に存在し得る。ｃｆＤＮＡ断片サイズの１または複数の変動を含有することができる染色体の一部の例としては、２ｑ、４ｐ、５ｐ、６ｑ、７ｐ、８ｑ、９ｑ、１０ｑ、１１ｑ、１２ｑおよび１４ｑの一部が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、変動は、染色体腕全域（例えば、染色体腕全体）であり得る。
ｃｆＤＮＡ断片化プロファイルは、大きなｃｆＤＮＡ断片に対する小さなｃｆＤＮＡ断片の比率および参照断片比率に対する断片比率の相関を含むことができる。本明細書において使用される場合、大きなｃｆＤＮＡ断片に対する小さなｃｆＤＮＡ断片の比率に関して、小さなｃｆＤＮＡ断片は、長さ約１００ｂｐ～長さ約１５０ｂｐであり得る。本明細書において使用される場合、大きなｃｆＤＮＡ断片に対する小さなｃｆＤＮＡ断片の比率に関して、大きなｃｆＤＮＡ断片は、長さ約１５１ｂｐ～長さ２２０ｂｐであり得る。本明細書において記載されているとおり、癌を有する哺乳動物は、健康な哺乳動物におけるより低い（２倍低い、３倍低い、４倍低い、５倍低い、６倍低い、７倍低い、８倍低い、９倍低い、１０倍低いまたはそれより低い）断片比率の相関（例えば、１または複数の健康な哺乳動物から得られるＤＮＡ断片比率などの参照ＤＮＡ断片比率に対するｃｆＤＮＡ断片比率の相関）を有することができる。健康な哺乳動物（例えば、癌を有さない哺乳動物）は、約１（例えば、約０．９６）の断片比の相関（例えば、１または複数の健康な哺乳動物から得られるＤＮＡ断片比率などの参照ＤＮＡ断片比率に対するｃｆＤＮＡ断片比率の相関）を有することができる。いくつかの事例では、癌を有する哺乳動物は、健康な哺乳動物中の断片比率の相関（例えば、１または複数の健康な哺乳動物から得られるＤＮＡ断片比率などの参照ＤＮＡ断片比率に対するｃｆＤＮＡ断片比率の相関）より平均で約０．１９～約０．３０（例えば、約０．２５）低い断片比率の相関（例えば、１または複数の健康な哺乳動物から得られるＤＮＡ断片比率などの参照ＤＮＡ断片比率に対するｃｆＤＮＡ断片比率の相関）を有することができる。
ｃｆＤＮＡ断片化プロファイルは、全ての断片のカバレッジを含むことができる。全ての断片のカバレッジは、カバレッジのウィンドウ（例えば、非重複ウィンドウ）を含むことができる。いくつかの事例では、全ての断片のカバレッジは、小さな断片（例えば、長さ約１００ｂｐ～約１５０ｂｐの断片）のウィンドウを含むことができる。いくつかの事例では、全ての断片のカバレッジは、大きな断片（例えば、長さ約１５１ｂｐ～約２２０ｂｐの断片）のウィンドウを含むことができる。
いくつかの事例では、ｃｆＤＮＡ断片化プロファイルは、癌（例えば、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、胃癌、膵臓癌、胆管癌または卵巣癌）の原発組織を特定するために使用することができる。例えば、ｃｆＤＮＡ断片化プロファイルは、限局性癌を特定するために使用することができる。ｃｆＤＮＡ断片化プロファイルが標的化領域プロファイルを含む場合には、癌の原発組織を特定するために、本明細書に（例えば、表３（添付書類Ｃ）におよび／または表６（添付書類Ｆ）に）記載されている１または複数の変動を使用することができる。いくつかの事例では、癌の原発組織を特定するために、染色体領域中の１または複数の変動を使用することができる。
ｃｆＤＮＡ断片化プロファイルは、任意の適切な方法を用いて取得することができる。いくつかの事例では、哺乳動物（例えば、癌を有するまたは癌を有すると疑われる哺乳動物）から得たｃｆＤＮＡは、全ゲノム配列決定（例えば、低カバレッジ全ゲノム配列決定）に供され、ゲノムにマッピングされ、ｃｆＤＮＡ断片長を決定するために分析されることができる配列決定ライブラリーへ加工することができる。マッピングされた配列は、ゲノムを包含する非重複ウィンドウ中で分析することができる。ウィンドウは、任意の適切なサイズであり得る。例えば、ウィンドウは、長さ数千～数百万の塩基であり得る。１つの非限定的な例として、ウィンドウは、約５メガ塩基（Ｍｂ）長であり得る。任意の適切な数のウィンドウをマッピングすることができる。例えば、数十～数千のウィンドウをゲノム中でマッピングすることができる。例えば、数百～数千のウィンドウをゲノム中でマッピングすることができる。ｃｆＤＮＡ断片化プロファイルは、各ウィンドウ内で決定することができる。いくつかの事例では、ｃｆＤＮＡ断片化プロファイルは、実施例１に記載されているとおりに取得することができる。いくつかの事例では、ｃｆＤＮＡ断片化プロファイルは、図１に示されているとおりに取得することができる。
いくつかの事例では、本明細書に記載されている方法および材料は、機械学習を含むこともできる。例えば、機械学習は、（例えば、ｃｆＤＮＡ断片のカバレッジ、ｃｆＤＮＡ断片の断片サイズ、染色体のカバレッジおよびｍｔＤＮＡを用いて）変化された断片化プロファイルを特定するために使用することができる。
いくつかの事例では、本明細書に記載されている方法および材料は、癌（例えば、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、胃癌、膵臓癌、胆管癌および／または卵巣癌）を有するとして哺乳動物（例えば、ヒト）を特定するために使用される唯一の方法であり得る。例えば、ｃｆＤＮＡ断片化プロファイルを決定することは、癌を有するとして哺乳動物を特定するために使用される唯一の方法であり得る。
いくつかの事例では、本明細書に記載されている方法および材料は、癌（例えば、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、胃癌、膵臓癌、胆管癌および／または卵巣癌）を有するとして哺乳動物（例えば、ヒト）を特定するために使用される１または複数のさらなる方法と一緒に使用することができる。癌を有するとして哺乳動物を特定するために使用される方法の例には、１または複数の癌特異的な配列変動を特定すること、１または複数の染色体の変動（例えば、異数性および再編成）を特定すること、およびその他のｃｆＤＮＡ変動を特定することが含まれるが、これらに限定されない。例えば、ｃｆＤＮＡ断片化プロファイルを決定することは、癌を有するとして哺乳動物を特定するために、哺乳動物のゲノム中の１または複数の癌特異的変異を特定することと一緒に使用することができる。例えば、ｃｆＤＮＡ断片化プロファイルを決定することは、癌を有するとして哺乳動物を特定するために、哺乳動物のゲノム中の１または複数の異数性を特定することと一緒に使用することができる。
いくつかの態様において、本文書は、癌を有するまたは有すると疑われる哺乳動物（例えば、ヒト）を査定し、モニタリングし、および／または処置するための方法および材料も提供する。いくつかの事例において、本文書は、癌を有するとして哺乳動物を特定するための方法および材料を提供する。例えば、哺乳動物から取得された試料（例えば、血液試料）は、少なくとも部分的に当該哺乳動物のｃｆＤＮＡ断片化プロファイルに基づいて、当該哺乳動物が癌を有するかどうかを決定するために査定することができる。いくつかの事例では、本文書は、哺乳動物中の癌の位置（例えば、解剖学的部位または原発組織）を特定するための方法および材料を提供する。例えば、哺乳動物から取得された試料（例えば、血液試料）は、少なくとも部分的に当該哺乳動物のｃｆＤＮＡ断片化プロファイルに基づいて、当該哺乳動物中の癌の原発組織を決定するために査定することができる。いくつかの事例では、本文書は、癌を有するとして哺乳動物を特定し、当該哺乳動物を処置するために当該哺乳動物に１または複数の癌処置を実施するための方法および材料を提供する。例えば、少なくとも部分的に哺乳動物のｃｆＤＮＡ断片化プロファイルに基づいて当該哺乳動物が癌を有するかどうかを決定するために、当該哺乳動物から取得された試料（例えば、血液試料）を査定することができ、当該哺乳動物に、１または複数の癌処置を実施することができる。いくつかの事例において、本文書は、癌を有する哺乳動物を処置するための方法および材料を提供する。例えば、哺乳動物を処置するために、（例えば、少なくとも部分的に当該哺乳動物のｃｆＤＮＡ断片化プロファイルに基づいて）癌を有するとして同定された哺乳動物に、１または複数の癌処置を実施することができる。いくつかの事例では、癌処置（例えば、本明細書に記載されている癌処置のいずれも）の最中にまたは後に、哺乳動物は、モニタリングを受けることができ（または、増加したモニタリングのために選択されることができ）および／またはさらなる診断試験を受けることができる。いくつかの事例では、モニタリングは、例えば、本明細書に記載されているとおりに哺乳動物のｃｆＤＮＡ断片化プロファイルを決定するために哺乳動物から得られた試料（例えば、血液試料）を査定することによって、癌を有するまたは癌を有すると疑われる哺乳動物を査定することを含むことができ、処置に対する応答を特定するためにおよび／または癌（例えば、残存する癌）を有するとして哺乳動物を特定するために、経時的なｃｆＤＮＡ断片化プロファイルの変化を使用することができる。
任意の適切な哺乳動物が、本明細書に記載されているとおりに、査定され、モニターされ、および／または処置されることができる。哺乳動物は、癌を有する哺乳動物であり得る。哺乳動物は、癌を有すると疑われる哺乳動物であり得る。本明細書に記載されているとおりに査定され、モニターされ、および／または処置されることができる哺乳動物の例としては、ヒト、サルなどの霊長類、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、マウスおよびラットが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、癌を有するまたは癌を有すると疑われるヒトは、本明細書に記載されているとおりにｃｆＤＮＡ断片化プロファイルを決定するために査定されることができ、必要に応じて、本明細書に記載されているとおりに１または複数の癌処置で処置されることができる。
哺乳動物から得られる任意の適切な試料が、本発明に記載されているとおりに査定される（例えば、ＤＮＡ断片化パターンに対して査定される）ことができる。いくつかの事例では、試料は、ＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡ）を含むことができる。いくつかの事例では、試料は、ｃｆＤＮＡ（例えば、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ））を含むことができる。いくつかの事例では、試料は流体試料（例えば、液体生検）であり得る。ＤＮＡおよび／またはポリペプチドを含有することができる試料の例としては、血液（例えば、全血、血清または血漿）、羊膜、組織、尿、脳脊髄液、唾液、痰、気管支肺胞洗浄液、胆汁、リンパ液、嚢胞液、便、腹水、パパニコロースメア、母乳および呼気凝縮液が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、血漿試料は、本明細書に記載されているとおりにｃｆＤＮＡ断片化プロファイルを決定するために査定することができる。
本明細書に記載されているとおりに査定される（例えば、ＤＮＡ断片化パターンに対して査定される）べき、哺乳動物から得られる試料は、任意の適切な量のｃｆＤＮＡを含むことができる。いくつかの事例では、試料は、限られた量のＤＮＡを含むことができる。例えば、ｃｆＤＮＡ断片化プロファイルは、例えば、Ｐｈａｌｌｅｎら、２０１７ Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ９；Ｃｏｈｅｎら、２０１８ Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５９：９２６；Ｎｅｗｍａｎら、２０１４ Ｎａｔ Ｍｅｄ ２０：５４８；およびＮｅｗｍａｎら、２０１６ Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３４：５４７）に記載されているものなどの他のｃｆＤＮＡ分析方法のために通例必要とされるより少ないＤＮＡを含む試料から取得することができる。
いくつかの事例では、試料は、（例えば、試料からＤＮＡおよび／またはポリペプチドを単離および／または精製するために）処理することができる。例えば、ＤＮＡ単離および／または精製は、細胞溶解（例えば、洗浄剤（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ）および／または界面活性剤を用いて）、タンパク質除去（例えば、プロテアーゼを用いて）および／またはＲＮＡ除去（例えば、ＲＮアーゼを用いて）を含むことができる。別の例として、ポリペプチド単離および／または精製は、細胞溶解（例えば、洗浄剤（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ）および／または界面活性剤を用いて）、ＤＮＡ除去（例えば、ＤＮアーゼを用いて）および／またはＲＮＡ除去（例えば、ＲＮアーゼを用いて）を含むことができる。
癌の任意の適切な種類を有するまたは有すると疑われる哺乳動物は、本明細書に記載されている方法および材料を用いて、（例えば、ｃｆＤＮＡ断片化プロファイルを決定するために）査定され、および／または（例えば、１または複数の癌処置を哺乳動物に実施することによって）処置されることができる。癌は、任意のステージの癌であり得る。いくつかの事例では、癌は、早期ステージの癌であり得る。いくつかの事例では、癌は、無症候性癌であり得る。いくつかの事例では、癌は、（例えば、外科的切除後および／または癌治療後の）残存疾患および／または再発であり得る。癌は、任意の種類の癌であり得る。本明細書に記載されているとおりに査定、され、モニターされ、および／または処置されることができる癌の種類の例としては、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、胃癌、膵臓癌、胆管癌および卵巣癌が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書に記載されているとおりに癌を有するまたは癌を有すると疑われる哺乳動物を処置する場合、哺乳動物は、１または複数の癌処置を実施されることができる。癌処置は、任意の適切な癌処置であり得る。本明細書に記載されている１または複数の癌処置は、任意の適切な頻度で（例えば、１回または数日から数週の範囲の期間にわたって複数回）哺乳動物に実施することができる。癌処置の例としては、術後補助化学療法、術前補助化学療法、放射線療法、ホルモン療法、細胞傷害性療法、免疫療法、養子Ｔ細胞療法（例えば、キメラ抗原受容体および／または野生型もしくは改変されたＴ細胞受容体を有するＴ細胞）、標的療法、例えば、キナーゼ阻害剤（例えば、転座または変異など特定の遺伝的病変を標的とするキナーゼ阻害剤）、（例えば、キナーゼ阻害剤、抗体、二重特異的抗体）の投与、シグナル伝達阻害剤、二重特異的抗体または抗体断片（例えば、ＢｉＴＥ）、モノクローナル抗体、免疫チェックポイント阻害剤、手術（例えば、外科的切除）または上記の任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの事例では、癌処置は、癌の重度を低減し、癌の症候を低減し、および／または哺乳動物内に存在する癌細胞の数を低減させることができる。
いくつかの事例では、癌処置は、免疫チェックポイント阻害剤を含むことができる。免疫チェックポイント阻害剤の非限定的な例としては、ニボルマブ（オプジーボ）、ペムブロリズマブ（キートルーダ）、アテゾリズマブ（テセントリク）、アベルマブ（バベンチオ）、デュルバルマブ（イミフィンジ）、イピリムマブ（ヤーボイ）が挙げられる。例えば、Ｐａｒｄｏｌｌ（２０１２）Ｎａｔ．Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ １２：２５２－２６４；Ｓｕｎら、（２０１７）Ｅｕｒ Ｒｅｖ Ｍｅｄ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｓｃｉ ２１（６）：１１９８－１２０５；Ｈａｍａｎｉｓｈｉら、（２０１５）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．３３（３４）：４０１５－２２；Ｂｒａｈｍｅｒら、（２０１２）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３６６（２６）：２４５５－６５；Ｒｉｃｃｉｕｔｉら、（２０１７）Ｊ．Ｔｈｏｒａｃ Ｏｎｃｏｌ．１２（５）：ｅ５１－ｅ５５；Ｅｌｌｉｓら、（２０１７）Ｃｌｉｎ Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ ｐｉｉ：Ｓ１５２５－７３０４（１７）３００４３－８；Ｚｏｕ ａｎｄ Ａｗａｄ（２０１７）Ａｎｎ Ｏｎｃｏｌ ２８（４）：６８５－６８７；Ｓｏｒｓｃｈｅｒ（２０１７）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３７６（１０：９９６－７；Ｈｕｉら、（２０１７）Ａｎｎ Ｏｎｃｏｌ ２８（４）：８７４－８８１；Ｖａｎｓｔｅｅｎｋｉｓｔｅら、（２０１７）Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ １７（６）：７８１－７８９；Ｈｅｌｌｍａｎｎら、（２０１７）Ｌａｎｃｅｔ Ｏｎｃｏｌ．１８（１）：３１－４１；Ｃｈｅｎ（２０１７）Ｊ．Ｃｈｉｎ Ｍｅｄ Ａｓｓｏｃ ８０（１）：７－１４を参照。
いくつかの事例では、癌処置は、養子Ｔ細胞療法（例えば、キメラ抗原受容体および／または野生型もしくは改変されたＴ細胞受容体を有するＴ細胞）であり得る。例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｒｅｓｔｉｆｏ（２０１５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４８（６２３０）：６２－６８；Ｃｈａｎｇ ａｎｄ Ｃｈｅｎ（２０１７）Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｏｌ Ｍｅｄ ２３（５）：４３０－４５０；Ｙｅｅ ａｎｄ Ｌｉｚｅｅ（２０１６）Ｃａｎｃｅｒ Ｊ．２３（２）：１４４－１４８；Ｃｈｅｎら、（２０１６）Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ６（２）：ｅ１２７３３０２；米国特許出願公開第２０１６／０１９４４０４号；米国特許出願公開第２０１４／００５０７８８号；米国特許第２０１４／０２７１６３５号；米国特許第９，２３３，１２５号を参照；参照により、それらの全体が本明細書に組み込まれる。
いくつかの事例では、癌処置は化学療法剤であり得る。化学療法剤の非限定的な例として、アマサクリン、アザシチジン、アキサチオプリン（ａｘａｔｈｉｏｐｒｉｎｅ）、ベバシズマブ（またはその抗原結合断片）、ブレオマイシン、ブスルファン、カルボプラチン、カペシタビン、クロラムブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキシフルリジン、ドキソルビシン、エピルビシン、エルロチニブ塩酸塩、エトポシド、フィウダラビン（ｆｉｕｄａｒａｂｉｎｅ）、フロクスウリジン、フルダラビン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イホスファミド、イリノテカン、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキサート、マイトマイシン、ミトキサントロン、オキサリプラチン、パクリタキセル、ペメトレキセド、プロカルバジン、全トランスレチノイン酸、ストレプトゾシン、タフルポシド、テモゾロミド、テニポシド、チオグアニン、トポテカン、ウラムスチン、バルルビシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビンおよびこれらの組み合わせが挙げられる。抗癌治療のさらなる例が本分野において公知である；例えば、米国臨床腫瘍学会（ＡＳＣＯ）、欧州臨床腫瘍学会（ＥＳＭＯ）または全米総合癌情報ネットワーク（ＮＣＣＮ）からの治療用指針を参照。
（例えば、少なくとも部分的に哺乳動物のｃｆＤＮＡ断片化プロファイルに基づいて）本明細書に記載されているとおりに癌を有するまたは癌を有すると疑われる哺乳動物をモニタリングする場合には、モニタリングは、癌処置の経過前、間および／または後であり得る。本明細書に提供されているモニタリングの方法は、１もしくは複数の癌処置の有効性を決定するために、および／または増加されたモニタリングのために哺乳動物を選択するために使用することができる。いくつかの事例では、モニタリングは、本明細書に記載されているとおりにｃｆＤＮＡ断片化プロファイルを特定することを含むことができる。例えば、ｃｆＤＮＡ断片化プロファイルは、癌を有するまたは有すると疑われる哺乳動物へ１または複数の癌処置を投与する前に取得することができ、１または複数の癌処置を前記哺乳動物に実施することができ、１または複数のｃｆＤＮＡ断片化プロファイルは癌処置の経過の間に取得することができる。いくつかの事例では、ｃｆＤＮＡ断片化プロファイルは、癌処置（例えば、本明細書に記載されている癌処置のいずれも）の間に変化することができる。例えば、哺乳動物が癌を有するという指標となるｃｆＤＮＡ断片化プロファイルは、哺乳動物が癌を有しないという指標となるｃｆＤＮＡ断片化プロファイルへ変化することができる。このようなｃｆＤＮＡ断片化プロファイルの変化は、癌処置が奏功していることを示し得る。逆に、ｃｆＤＮＡ断片化プロファイルは、癌処置（例えば、本明細書に記載されている癌処置のいずれも）の間に、静止状態（例えば、同一またはおよそ同一）を保つことができる。このような静止したｃｆＤＮＡ断片化プロファイルは、癌処置が奏功していないことを示すことができる。いくつかの事例では、モニタリングは、１または複数の癌処置（例えば、１または複数の癌処置の有効性）をモニタリングすることができる慣用の技術を含むことができる。いくつかの事例では、増加したモニタリングのために選択された哺乳動物は、増加したモニタリングのために選択されていない哺乳動物と比較して増加した頻度で診断試験（例えば、本明細書に開示されている診断試験のいずれも）を実施されることができる。例えば、増加したモニタリングのために選択された哺乳動物は、１日２回、毎日、週２回、毎週、月２回、毎月、３ヶ月ごとに、半年ごとに、毎年の頻度でまたはこれらの中の任意の頻度で診断試験を実施されることができる。いくつかの事例では、増加したモニタリングのために選択された哺乳動物は、増加したモニタリングのために選択されていない哺乳動物と比較して、１または複数のさらなる診断試験を実施されることができる。例えば、増加したモニタリングのために選択される哺乳動物は、２つの診断試験を実施されることができるのに対して、増加したモニタリングのために選択されなかった哺乳動物は、単一の診断試験のみを実施される（または診断試験を実施されない）。いくつかの事例では、増加したモニタリングのために選択された哺乳動物は、さらなる診断試験のために選択することも可能である。腫瘍または癌（例えば、癌細胞）の存在が（例えば、本明細書に開示されている様々な方法のいずれかによって）特定されたら、哺乳動物は、増加したモニタリング（例えば、哺乳動物中の腫瘍もしくは癌の進行を査定するためにおよび／または変異などの１もしくは複数の癌生物マーカーの発達を査定するために）とさらなる診断試験（例えば、腫瘍または癌のサイズおよび／または正確な位置（例えば、原発組織）を決定するために）の両方を受けることが有益であり得る。いくつかの事例では、１または複数の癌処置は、癌生物マーカーが検出された後におよび／または哺乳動物のｃｆＤＮＡ断片化プロファイルが改善もしくは悪化されていない後に、増加したモニタリングのために選択されている哺乳動物に対して実施することができる。本明細書に開示されているまたは本分野において公知の癌処置のいずれをも実施することができる。例えば、増加したモニタリングのために選択された哺乳動物はさらにモニターすることができ、増加したモニタリング期間を通じて癌細胞の存在が維持されていれば、癌処置を実施することができる。これに加えてまたはこれに代えて、増加したモニタリングのために選択された哺乳動物は癌処置を実施され、癌処置が進行するにつれてさらにモニターすることができる。いくつかの事例では、増加したモニタリングのために選択された哺乳動物が癌処置を実施された後に、増加したモニタリングは１または複数の癌生物マーカー（例えば、変異）を明らかにするであろう。いくつかの事例では、このような１または複数の癌生物マーカーは、異なる癌処置を実施するための原因を与えるであろう（例えば、耐性変異が癌処置の間に癌細胞中に発生し得、この耐性変異を保有する癌細胞は元の癌処置に対して耐性である）。
（例えば、少なくとも部分的に哺乳動物のｃｆＤＮＡ断片化プロファイルに基づいて）本明細書に記載されているとおりに癌を有するとして哺乳動物が特定される場合には、特定は、癌処置の経過前および／または間であり得る。本明細書に提供されている癌を有するとして哺乳動物を特定する方法は、（例えば、処置のいずれかの経過前に癌を有するとして）哺乳動物を特定するために、および／またはさらなる診断試験のために哺乳動物を選択するために、第一の診断として使用することができる。いくつかの事例では、哺乳動物が癌を有することが決定されたら、哺乳動物は、さらなる試験を実施され得、および／またはさらなる診断試験のために選択され得る。いくつかの事例では、本明細書に提供されている方法は、慣用技術が早期ステージ癌を有する哺乳動物を診断することが可能である期間より前の期間において、さらなる診断試験のために哺乳動物を選択するために使用することができる。例えば、さらなる診断試験のために哺乳動物を選択するための本明細書に提供されている方法は、哺乳動物が慣用の方法によって癌と診断されていないときに、および／または哺乳動物が癌を保有することが知られていないときに使用することができる。いくつかの事例では、さらなる診断試験のために選択される哺乳動物は、さらなる診断試験のために選択されていない哺乳動物と比較して増加した頻度で診断試験（例えば、本明細書に開示されている診断試験のいずれも）を実施されることができる。例えば、さらなる診断試験のために選択される哺乳動物は、１日２回、毎日、週２回、毎週、月２回、毎月、３ヶ月ごとに、半年ごとに、毎年の頻度でまたはこれらの中の任意の頻度で診断試験を実施されることができる。いくつかの事例では、さらなる診断試験のために選択される哺乳動物は、さらなる診断試験のために選択されていない哺乳動物と比較して１または複数のさらなる診断試験を実施されることができる。例えば、さらなる診断試験のために選択された哺乳動物は、２つの診断試験を実施されることができるのに対して、さらなる診断試験のために選択されなかった哺乳動物は、単一の診断試験のみを実施される（または診断試験を実施されない）。いくつかの事例では、診断試験方法は、（例えば、少なくとも部分的に哺乳動物のｃｆＤＮＡ断片化プロファイルに基づいて）当初検出された癌と同じ種類の癌（例えば、同じ組織または起源を有する）の存在を決定することができる。これに加えてまたはこれに代えて、診断試験方法は、当初検出された癌と異なる種類の癌の存在を決定することができる。いくつかの事例では、診断試験方法はスキャンである。いくつかの事例では、スキャンは、コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）、ＣＴ血管造影（ＣＴＡ）、食道造影図（バリウム嚥下（ｓｗａｌｌｏｍ））、バリウム注腸、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、ＰＥＴスキャン、超音波（例えば、気管支内超音波、超音波内視鏡検査）、Ｘ線、ＤＥＸＡスキャンである。いくつかの事例では、診断試験方法は、肛門鏡検査、気管支鏡検査（例えば、自己蛍光気管支鏡検査、白色光気管支鏡検査、ナビゲーション気管支鏡検査）、大腸内視鏡検査、デジタル乳房トモシンセシス、内視鏡的逆行性膵胆管造影（ＥＲＣＰ）、食道胃十二指腸内視鏡検査（ｅｎｓｏｐｈａｇｏｇａｓｔｒｏｄｕｏｄｅｎｏｓｃｏｐｙ）、マンモグラフィー、パパニコロースメア、婦人科内診、ポジトロン放出断層撮影・コンピュータ断層撮影法（ＰＥＴ－ＣＴ）スキャンなどの身体検査である。いくつかの事例では、さらなる診断試験のために選択された哺乳動物は、増加したモニタリングのために選択されることもできる。腫瘍または癌（例えば、癌細胞）の存在が（例えば、本明細書に開示されている様々な方法のいずれかによって）特定されたら、哺乳動物は、増加したモニタリング（例えば、哺乳動物中の腫瘍もしくは癌の進行を査定するためにおよび／または変異などの１もしくは複数の癌生物マーカーの発達を査定するために）とさらなる診断試験（例えば、腫瘍または癌のサイズおよび／または正確な位置を決定するために）の両方を受けることが有益であり得る。いくつかの事例では、癌処置は、癌生物マーカーが検出された後におよび／または哺乳動物のｃｆＤＮＡ断片化プロファイルが改善もしくは悪化されていない後に、さらなる診断試験のために選択されている哺乳動物に対して実施される。本明細書に開示されているまたは本分野において公知の癌処置のいずれをも実施することができる。例えば、さらなる診断試験のために選択された哺乳動物には、さらなる診断試験を実施することができ、腫瘍または癌の存在が確認されれば、癌処置を実施することができる。これに加えてまたはこれに代えて、さらなる診断試験のために選択された哺乳動物は癌処置を実施されることができ、癌処置が進行するにつれてさらにモニターされることができる。いくつかの事例では、さらなる診断試験のために選択された哺乳動物が癌処置を実施された後に、追加の試験は１または複数の癌生物マーカー（例えば、変異）を明らかにするであろう。いくつかの事例では、このような１または複数の癌生物マーカー（例えば、変異）は、異なる癌処置を実施するための原因を与えるであろう（例えば、耐性変異が癌処置の間に癌細胞中に発生し得、この耐性変異を保有する癌細胞は元の癌処置に対して耐性である）。
本発明は、以下の実施例においてさらに記載されるが、以下の実施例は特許請求の範囲に記載されている本発明の範囲を限定するものではない。
実施例１：癌を有する患者におけるセルフリーＤＮＡ断片化
セルフリーＤＮＡの分析は、特定の遺伝子の標的化配列決定に主に焦点を当ててきた。このような研究は、癌を有する患者中の少数の腫瘍特異的変動の検出を可能にするが、全ての患者が、とりわけ、早期ステージの疾患を有する患者が検出可能な変化を有するわけではない。セルフリーＤＮＡの全ゲノム配列決定は、癌患者中の染色体異常および再編成を同定することができるが、このような変動の検出は、１つには、少数の異常な染色体変化を正常な染色体変化と区別することが難しいために困難であった（Ｌｅａｒｙら、２０１０ Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ２：２０ｒａ１４；およびＬｅａｒｙら、２０１２ Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ４：１６２ｒａ１５４）。その他の取り組みは、癌と正常な組織の間で、ヌクレオソームパターンおよびクロマチン構造が異なり得ること、ならびに癌を有する患者中のｃｆＤＮＡが異常なｃｆＤＮＡ断片サイズおよび位置をもたらし得ることを示唆してきた（Ｓｎｙｄｅｒら、２０１６ Ｃｅｌｌ １６４：５７；Ｊａｈｒら、２００１ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６１：１６５９；Ｉｖａｎｏｖら、２０１５ ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １６（Ｓｕｐｐｌ １３）：Ｓ１）。しかしながら、ｃｆＤＮＡのヌクレオソームフットプリント分析のために必要とされる配列決定の量は、日常的な分析に対しては実現困難である。
任意のセルフリーＤＮＡアプローチの感度は、検査される潜在的な変動の数の他、このような変化を検出する技術的および生物学的限界に依存する。典型的な血液試料は１ｍＬの血漿当たり約２０００ゲノム当量のｃｆＤＮＡを含有し（Ｐｈａｌｌｅｎら、２０１７ Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ９）、単一の変動の検出の理論的限界は、野生型分子に対して数千に１つの変異体を超えることはできない。同数のゲノム当量中により多量の変動を検出するアプローチは、循環中に癌を検出することに関して感度がより高いであろう。モンテカルロシミュレーションは、わずか数個～数十または数百検出される潜在的異常の数を増加させることは、ｃｆＤＮＡ中の複数のメチル化変化の近年における確率分析と同様、何桁も検出限界を改善できる可能性を秘めることを示す（図２）。
本研究は、全ゲノム配列決定を用いて、癌の検出および原発組織のさらなる特定のためのＤＥＬＦＩと呼ばれる新規方法を提示する（図１）。本アプローチは、健康な血液細胞ＤＮＡのパターンを腫瘍由来のＤＮＡと区別し、原発腫瘍組織を特定するために、ｃｆＤＮＡ断片化プロファイルおよび機械学習を使用する。２４５人の健康な個体および多くの患者は限局性疾患を示す、乳癌、結腸直腸癌、肺癌、卵巣癌、膵臓癌、胃癌または胆管癌を有する２３６人の患者から得たｃｆＤＮＡの遡及的分析のために、ＤＥＬＦＩを使用した。このアプローチが、０．９５の特異性を維持しながら、癌患者を健康な個体から識別することに関して０．８０以上の感度を有すると仮定すると、少なくとも２００人の癌患者の研究は、０．９５またはそれを超える所望の特異性にて、０．０６の許容誤差で真の感度の推定を可能にするであろう。
材料および方法
患者および試料の特徴
健康な個体から得た血漿試料ならびに乳癌、肺癌、卵巣癌、結腸直腸癌、胆管癌または胃癌を有する患者から得た血漿および組織試料は、ＩＬＳＢｉｏ／Ｂｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ、オーフス大学、コペンハーゲン大学のヘアレウ病院、ヴィドーヴェ（Ｈｖｉｄｏｖｒｅ）病院、ユトレヒト大学の大学附属病院、アムステルダム大学の大学附属病院、オランダ癌研究所および、カリフォルニア大学サンディエゴ校から入手した。全ての試料は、参加機関での研究使用に対するインフォームドコンセントを得て、施設内治験審査委員会によって承認されたプロトコールの下で入手した。健康な個体からの血漿試料は、大腸内視鏡検査またはパパニコロースメアなど日常的なスクリーニングの際に取得した。癌の既往歴がなく、陰性のスクリーニング結果であれば、個体は健康と考えた。
乳癌、結腸直腸癌、胃癌、肺癌、卵巣癌、膵臓癌および胆管癌を有する個体からの血漿試料は、腫瘍切除または治療の前に、診断の際に取得した。複数の時点にわたってｃｆＤＮＡ断片化プロファイルの変化に関して分析された１９人の肺癌患者は、抗ＥＧＦＲまたは抗ＥＲＢＢ２治療での処置を受けていた（例えば、Ｐｈａｌｌｅｎら、２０１９ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １５，１２０４－１２１３参照）。本研究に含まれた全ての患者に対する臨床データが表１（添付書類Ａ）中に列記されている。性別は、ＸおよびＹ染色体表現のゲノム分析を通じて確認した。胃癌患者の病的ステージ決定は、術前補助療法後に行った。腫瘍ステージが不明な試料には、ステージＸまたは不明と記した。
ヌクレオソームＤＮＡ精製
生きて凍結されたリンパ球を、健康な男性（Ｃ０６１８）および女性（Ｄ０８０８－Ｌ）から得た白血球から浄化した（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｅｌｄｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）。ＥＺ Ｎｕｃｌｅｏｓｏｍａｌ ＤＮＡ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）を用いるヌクレオソームＤＮＡ精製のために、１×１０６細胞の分割試料を使用した。最初に、１００μｌのＮｕｃｌｅｉ Ｐｒｅｐ Ｂｕｆｆｅｒで細胞を処理し、氷上で５分間インキュベートした。２００ｇで５分間の遠心後、上清を廃棄し、
１００μｌのＡｔｌａｎｔｉｓ Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒでまたは１００μＬの小球菌ヌクレアーゼ（ＭＮ）Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒで、沈降した核を２回処理した。最後に、４２℃で２０分間、０．５ＵのＡｔｌａｎｔｉｓ ｄｓＤＮアーゼで、または３７℃で２０分間、１．５ＵのＭＮアーゼで、細胞の核ＤＮＡを断片化した。５Ｘ ＭＮ Ｓｔｏｐ Ｂｕｆｆｅｒを用いて反応を停止させ、Ｚｙｍｏ－Ｓｐｉｎ（商標）ＩＩＣ Ｃｏｌｕｍｎを用いて、ＤＮＡを精製した。Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ ２１００（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）を用いて、溶出された細胞核ＤＮＡの濃度および品質を分析した。
ｃｆＤＮＡの試料調製および配列決定
全血は、ＥＤＴＡ管中に集めて、直ちにもしくは４℃での保存後１日以内に処理するか、またはモニタリング分析の一員であった３人の癌患者については、Ｓｔｒｅｃｋ管中に集め、収集の２日以内に処理した。８００ｇで、１０分間、４℃での遠心によって、血漿および細胞成分を分離した。任意の残存する細胞破片を除去するために、再度、１８，０００ｇ、室温で、血漿を遠心し、ＤＮＡ抽出の時点まで－８０℃で保存した。Ｑｉａｇｅｎ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ ＧｍｂＨ）を用いて、血漿からＤＮＡを単離し、ＬｏＢｉｎｄ管（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ＡＧ）中に溶出した。Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ ２１００（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、ｃｆＤＮＡの濃度および品質を査定した。
他の文献に記載されているとおりに５～２５０ｎｇのｃｆＤＮＡを使用する全ゲノム配列決定および標的化配列決定のためにＮＧＳ ｃｆＤＮＡライブラリーを調製した（例えば、Ｐｈａｌｌｅｎら、２０１７ Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ９：ｅａａｎ２４１５参照）。簡潔に述べると、製造業者の指針に４つの主な改変を加え、ＮＥＢＮｅｘｔ ＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ ｆｏｒ Ｉｌｌｕｍｉｎａ［Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ）］を用いて、ゲノムライブラリーを調製した；（ｉ）溶出および管への移動工程に際しての試料喪失を最小化するために、ライブラリー精製工程はオンビーズＡＭＰｕｒｅ ＸＰアプローチを使用した（例えば、Ｆｉｓｈｅｒら、２０１１ Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ １２；Ｒ１参照）；（ｉｉ）ＮＥＢ Ｎｅｘｔ Ｅｎｄ Ｒｅｐａｉｒ，Ａ－ｔａｉｌｉｎｇおよびアダプター連結酵素および緩衝液体積は、オンビーズＡＭＰｕｒｅ ＸＰ精製戦略を収容するのに適切なように調整した；（ｉｉｉ）それぞれ、６または８ｂｐバーコードを有する標準的なＩｌｌｕｍｉｎａシングルまたはデュアルインデックスアダプターに代えて、連結反応において、８塩基対（ｂｐ）バーコードを有する８つのユニークなＩｌｌｕｍｉｎａデュアルインデックスアダプターのプールを使用した；（ｉｖ）ｃｆＤＮＡライブラリーは、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いて増幅した。
全ゲノムライブラリーは、直接配列決定された。標的化ライブラリーについては、製造業者の指針にしたがって、Ａｇｉｌｅｎｔ ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ試薬および５８遺伝子を標的とするハイブリダイゼーションプローブの特別注文の組を使用して、捕捉を行った（例えば、Ｐｈａｌｌｅｎら、２０１７ Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ９：ｅａａｎ２４１５参照）。Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＮＥＢ）を用いて、捕捉されたライブラリーを増幅した。ＤＮＡ １０００ Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ ２１００上で、捕捉されたｃｆＤＮＡライブラリーの濃度および品質を査定した。標的化ライブラリーは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ ２０００／２５００（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）上で、１００ｂｐのペアードエンドランを用いて配列決定された。
ｃｆＤＮＡから得た標的化配列決定データの分析
ｃｆＤＮＡ試料に対する標的化ＮＧＳデータの分析は、他の文献に記載されているとおりに実施した（例えば、Ｐｈａｌｌｅｎら、２０１７ Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ９：ｅａａｎ２４１５参照）。簡潔に述べると、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＣＡＳＡＶＡ（Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｖａｒｉａｔｉｏｎ）ソフトウェア（バージョン１．８）を用いて、デュアルインデックスアダプター配列の逆多重化およびマスキングを含む、一次処理を完了した。ＮｏｖｏＡｌｉｇｎを用いて、配列読み取りデータをヒト参照ゲノム（バージョンｈｇ１８またはｈｇ１９）に対して並列し、ニードルマン・ウンシュ法を用いて、選択した領域をさらに再並列した（例えば、Ｊｏｎｅｓら、２０１５ Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ７：２８３ｒａ５３参照）。配列変動の位置は、異なるゲノムビルドによって影響を受けなかった。関心対象の標的化領域にわたって、ＶａｒｉａｎｔＤｘを用いて（例えば、Ｊｏｎｅｓら、２０１５ Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ７：２８３ｒａ５３参照）（Ｐｅｒｓｏｎａｌ Ｇｅｎｏｍｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ）、点変異、小さな挿入および欠失からなる候補変異を同定した。
ｃｆＤＮＡ分子の断片長を分析するために、ｃｆＤＮＡ分子からの各読み取り対は、３０以上のＰｈｒｅｄクオリティスコアを有することが必要であった。同じ開始、終末およびインデックスバーコードを有することとして定義される全ての２つ組みのｃｔＤＮＡ断片は除去した。各変異に対して、読み取り対の一方または両方が所定位置に変異した（または野生型）塩基を含有した断片のみが含められた。この分析は、ＲパッケージＲｓａｍｔｏｏｌｓおよびＧｅｎｏｍｉｃ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓを用いて行った。
体細胞変異が特定された各ゲノム座位に対して、変異体対立遺伝子を含有する断片の長さを、野生型対立遺伝子の断片の長さと比較した。１００を超える変異体断片が同定された場合には、平均断片長を比較するために、ウェルチの２標本ｔ検定を使用した。１００未満の変異体断片を有する座位については、ブートストラップ手順を実行した。具体的には、野生型対立遺伝子を含有する復元Ｎ断片を標本抽出した、ここで、Ｎは、変異を有する断片の数を表す。野生型断片の各ブートストラップ反復に対して、その長さの中央値を計算した。ｐ値は、観察された変異体断片長中央値と同じまたはより極端な野生型断片長中央値を有するブートストラップ反復の割合として推定した。
ｃｆＤＮＡから得た全ゲノム配列決定データの分析
Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＣＡＳＡＶＡ（Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｖａｒｉａｔｉｏｎ）ソフトウェア（バージョン１．８．２）を用いて、デュアルインデックスアダプター配列の逆多重化およびマスキングを含む、ｃｆＤＮＡ試料に対する全ゲノムＮＧＳデータの一次処理を行った。配列読み取りデータは、ＥＬＡＮＤを用いて、ヒト参照ゲノム（バージョンｈｇ１９）に対して並列した。
いずれかの読み取りに対して３０未満のＭＡＰＱスコアを有する読み取り対およびＰＣＲ重複を取り除いた。ｈｇ１９常染色体を、２６，２３６の隣接する非重複１００ｋｂビンにタイル化した。読み取りデータがＤｕｋｅブラックリスト領域に陥るので（例えば、ｈｇｄｏｗｎｌｏａｄ．ｃｓｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／ｇｏｌｄｅｎｐａｔｈ／ｈｇ１９／ｅｎｃｏｄｅＤＣＣ／ｗｇＥｎｃｏｄｅＭａｐａｂｉｌｉｔｙ／参照）、最低のカバレッジを有する１０％のビンによって示される低マッピング可能性領域は取り除いた（例えば、Ｆｏｒｔｉｎら、２０１５ Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ １６：１８０参照）。このアプローチを用いて、セントロメアおよびテロメア領域を含むｈｇ１９参照ゲノムの３６１Ｍｂ（１３％）が除外された。短い断片は、１００～１５０ｂｐの長さを有するとして定義し、長い断片は、１５１～２２０ｂｐの長さを有するとして定義した。
ゲノムのＧＣ含量に起因するカバレッジのバイアスを考慮するために、各１００ｋｂビンに対して計算されたカバレッジに対する平均断片ＧＣの散布図に対して、スパン３／４とする局所的に重み付けられたｌｏｅｓｓ平滑化を適用した。断片長によって、血漿中でのカバレッジに対するＧＣ効果の差が生じる可能性を考慮するために、短い断片と長い断片に対して、このｌｏｅｓｓ回帰を別個に実施した（例えば、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉら、２０１２ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４０：ｅ７２参照）。ｌｏｅｓｓモデルから得たＧＣによって説明される短いおよび長いカバレッジに対する予測を差し引き、ＧＣと相関しない短および長に対する残余を得た。カバレッジの全ゲノム中央値短および長推定値を加算し直すことによって、残余を元のスケールに戻した。試料間でカバレッジに対するＧＣ効果の差が生じる可能性を考慮するために、各試料に対してこの手順を繰り返した。特徴空間およびノイズをさらに軽減するために、５Ｍｂビン中のＧＣ調整された総カバレッジを計算した。
健康な被験体から得た断片長の可変性を、癌を有する患者中の断片と比較するために、各個体に対する短～長断片化プロファイルの標準偏差を計算した。２つの群中の標準偏差をウィルコクソン順位和検定によって比較した。
染色体腕コピー数変化の分析
コピー数変化に対する腕レベルでの統計を開発するために、他の文献に記載されているとおりの血漿中の異数性検出のためのアプローチ（例えば、Ｌｅａｒｙら、２０１２ Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ４：１６２ｒａ１５４参照）を採用した。このアプローチは、ゲノムを非重複５０ＫＢビンに分割し、スパンを３／４とするｌｏｅｓｓによる補正後に、このビンに対して、ＧＣ補正されたｌｏｇ２リードデプスが得られた。このｌｏｅｓｓをベースとする補正は、上に概述されているアプローチと同等であったが、より小さなビンにおける外れ値への頑健性を増加させるためにｌｏｇ２スケールで評価され、断片長によって層別化しない。コピー数変化に対する腕特異的Ｚスコアを得るために、それぞれ、５０の健康な試料の独立した組から得られたＧＲスコアの平均および標準偏差によって、各腕に対するＧＣ調整された平均リードデプス（ＧＲ）を中心配置し、スケール調整した。
ｃｆＤＮＡからのミトコンドリアの並列された読み取りデータの分析
ミトコンドリアのゲノムに当初マッピングした全ゲノム配列読み取りデータをｂａｍファイルから抽出し、他の文献に記載されているとおり（例えば、Ｌａｎｇｍｅａｄら、２０１２ Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ９：３５７－３５９参照）、Ｂｏｗｔｉｅ２を用いて、エンドツーエンドモードで、ｈｇ１９参照ゲノムに再並列した。両方のメイトが３０以上のＭＡＰＱでミトコンドリアゲノムに並列するように、得られた並列された読み取りデータにフィルターをかけた。ミトコンドリアゲノムにマッピングする断片の数を計数し、元のｂａｍファイル中の断片の総数の百分率に変換した。
癌分類のための予測モデル
断片化プロファイルを用いて健康者を癌患者と区別するために、確率的勾配ブースティングモデルを使用した（ｇｂｍ（ｇｒａｄｉｅｎｔ ｂｏｏｓｔｉｎｇ ｍｏｄｅｌ）；例えば、Ｆｒｉｅｄｍａｎら、２００１ Ａｎｎ Ｓｔａｔ ２９：１１８９－１２３２；およびＦｒｉｅｄｍａｎら、２００２ Ｃｏｍｐｕｔ Ｓｔａｔ Ｄａｔａ Ａｎ ３８：３６７－３７８参照）。平均０および単位標準偏差を有するように、各試料について、全ての５０４のビンに対するＧＣ補正された総および短断片カバレッジを中心配置し、スケール調整した。さらなる特徴には、３９の常染色体腕およびミトコンドリア表現の各々に対するＺスコアが含まれた（ｌｏｇ１０変換された、ミトコンドリアにマッピングされた読み取りデータの割合）。このアプローチの予測誤差を推定するために、他の文献に記載されているとおりに、１０分割交差検証を使用した（例えば、Ｅｆｒｏｎら、１９９７ Ｊ Ａｍ Ｓｔａｔ Ａｓｓｏｃ ９２，５４８－５６０参照）。各交差検証実行において訓練データに対してのみ行われた特徴選択は、高度に相関した（相関＞０．９）またはほぼゼロの分散を有するビンを除去した。パラメータをｎ．ｔｒｅｅｓ＝１５０、ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ．ｄｅｐｔｈ＝３、ｓｈｒｉｎｋａｇｅ＝０．１およびｎ．ｍｉｎｏｂｓｉｎｓｉｄｅ＝１０として、Ｒパッケージ、ｇｂｍパッケージを用いて、確率的勾配ブースト機械学習を実行した。分割への患者の無作為化から生じる予測誤差を平均するために、１０分割交差検証手順を１０回繰り返した。２０００ブートストラップの反復から９８％に固定された感度および９５％特異性に対する信頼区間が得られた。
腫瘍原発組織分類のための予測モデル
９０％の特異性で癌患者として正しく分類される試料に対して（ｎ＝１７４）、原発組織を分類するために、別個の確率的勾配ブースティングモデルを訓練した。予測のために使用した肺試料の数が少ないことを考慮するために、後期ステージ肺癌患者から得た１８ｃｆＤＮＡベースライン試料がモニタリング分析から含められた。１０分割交差検証を１０回反復することによって、モデルの性能特性を評価した。このｇｂｍモデルは、癌分類モデルにおけるのと同じ特徴を用いて訓練された。先述のとおり、交差検証の間に各訓練データセット内で、互いに０．９を上回る相関を示した特徴またはほぼゼロの分散を有した特徴は除去した。組織クラス確率は、各患者につき１０回の反復にわたって平均し、最高の確率を有するクラスを予測される組織とみなした。
ヒトリンパ球由来のヌクレオソームＤＮＡおよびｃｆＤＮＡの分析
ヌクレアーゼ処理されたリンパ球から、全ゲノムｃｆＤＮＡ分析に関して記載されているとおりに、断片サイズを５Ｍｂビンで分析した。ヌクレアーゼ処理されたリンパ球細胞株から、ヌクレオソーム位置の全ゲノムマップを構築した。このアプローチによって、循環する断片のカバレッジの局所的なバイアスが特定され、分解から保護された領域を示している。ゲノム中の各塩基対にスコア付けするために、「ウィンドウ・ポジショニング・スコア」（ＷＰＳ）を使用した（例えば、Ｓｎｙｄｅｒら、２０１６ Ｃｅｌｌ １６４：５７参照）。各塩基周囲を中心とした６０ｂｐのスライドするウィンドウを用いて、ウィンドウに完全にまたがる断片の数から１つの末端のみがウィンドウ中に存在する断片の数を差し引いたものとして、ＷＰＳを計算した。ヌクレオソームから生じる断片は１６７ｂｐの中央値長を有するので、高いＷＰＳは、ヌクレオソームの位置の可能性があることを示唆した。移動中央値を用いて、ＷＰＳスコアをゼロで中央に配置し、コルモゴロフ・ズルベンコフィルターを用いて平滑化した（例えば、Ｚｕｒｂｅｎｋｏ，Ｔｈｅ ｓｐｅｃｔｒａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｉｍｅ ｓｅｒｉｅｓ。Ｎｏｒｔｈ－Ｈｏｌｌａｎｄ ｓｅｒｉｅｓ ｉｎ ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ ａｎｄ ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ；Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，１９８６参照）。５０～４５０ｂｐの正のＷＰＳのスパンについては、ヌクレオソームピークは、そのウィンドウにおける中央値を上回るＷＰＳを有する塩基対の組として定義した。９×の配列カバレッジでの、３０人の健康な個体から得たｃｆＤＮＡに対するヌクレオソーム位置の計算を、リンパ球ＤＮＡに対するのと同様に決定した。健康なｃｆＤＮＡ中のヌクレオソームが代表的であったことを確保するために、２またはそれを超える個体中に同定されたヌクレオソームのみからなる、ヌクレオソームのコンセンサストラックを定義した。隣接するヌクレオソーム間の距離中央値をコンセンサストラックから計算した。
検出感度のモンテカルロシミュレーション
腫瘍由来の変動を有する分子を検出する確率を推定するために、モンテカルロシミュレーションを使用した。簡潔に述べると、多項分布から１００万分子を生成した。ｍ変動でのシミュレーションのために、確率ｐで野生型分子をシミュレートし、ｍ腫瘍変動の各々を確率（１－ｐ）／ｍでシミュレートした。次に、ｇ＊ｍ分子を復元的に無作為抽出した、ここで、ｇは、血漿１ｍｌ中のゲノム当量の数を表す。腫瘍変動がｓまたはそれを超える回数抽出されれば、そのサンプルは癌由来と分類した。シミュレーションを１０００回繰り返して、癌指標によって、コンピュータシミュレーションでのサンプルが癌として正しく分類される確率を推定する。ｇ＝２０００およびｓ＝５に設定して、腫瘍変動の数を２乗ずつ１から２５６まで、腫瘍由来分子の割合を０．０００１％から１％まで変動させた。
統計解析
全ての統計解析は、Ｒバージョン３．４．３を用いて行った。健康対癌および原発組織の分類を実施するために、Ｒパッケージｃａｒｅｔ（バージョン６．０－７９）およびｇｂｍ（バージョン２．１－４）を使用した。モデル出力からの信頼区間は、ｐＲＯＣ（バージョン１．１３）Ｒパッケージを用いて取得した（例えば、Ｒｏｂｉｎら、２０１１ ＢＭＣ ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １２：７７参照）。この集団中での診断されていない癌症例の有病率が高い（１００人の健康者当たり１または２症例）と仮定すると、０．９５の特異性および０．８の感度を有するゲノムアッセイは、有用な操作特性（０．２５の陽性的中率およびほぼ１の陰性的中率）を有するであろう。検定力計算は、２００人超の癌患者およびほぼ等しい数の健康な対照の分析が、０．９５またはそれを超える所望の特異性で、０．０６の許容誤差での感度の推定が可能となることを示唆する。
データおよびコードの利用可能性
本研究において使用された配列データは、研究アクセッション番号ＥＧＡＳ００００１００３６１１およびＥＧＡＳ００００１００２５７７で、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｇｅｎｏｍｅ－ｐｈｅｎｏｍｅ Ａｒｃｈｉｖｅに寄託した。分析のためのコードは、ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／Ｃａｎｃｅｒ－Ｇｅｎｏｍｉｃｓ／ｄｅｌｆｉ＿ｓｃｒｉｐｔｓで入手可能である。
結果
ＤＥＬＦＩは、断片化パターンの全ゲノム分析を通じて、ｃｆＤＮＡ中の多数の異常の同時分析を可能にする。この方法は、低カバレッジ全ゲノム配列決定および単離されたｃｆＤＮＡの分析を基礎とする。マッピングされた配列は、ゲノムを覆う非重複ウィンドウ中で分析される。概念的には、ウィンドウのサイズは、数千～数百万塩基の範囲であり得、ゲノム中に、数百～数千のウィンドウがもたらされる。１～２×ゲノムカバレッジという限られた量でさえ、ウィンドウ当たり２０，０００超の読み取りデータを与えるので、ｃｆＤＮＡ断片化パターンを評価するために、５Ｍｂウィンドウを使用した。各ウィンドウ内で、ｃｆＤＮＡ断片のカバレッジおよびサイズ分布を調べた。健康な集団および癌集団中での全ゲノム断片化プロファイルの変動を評価するために、このアプローチを使用した（表１；添付書類Ａ）。パターンが健康であるまたは癌に由来する可能性があるかどうかを決定するために、ある個体からの全ゲノムパターンを参照集団と比較することができる。全ゲノムプロファイルは、全般的な断片サイズ分布においては見逃され得る特定組織に付随する位置的差異を明らかにするので、これらのパターンは、ｃｆＤＮＡの組織源も示唆し得る。
癌由来のｃｆＤＮＡ分子は、非癌細胞由来のｃｆＤＮＡよりサイズがより可変的であり得ることが見出されたので、ｃｆＤＮＡの断片化サイズに焦点を当てた。乳癌、結腸直腸癌、肺癌または卵巣癌を有する患者から（表１（添付書類Ａ）、表２（添付書類Ｂ）および表３（添付書類Ｃ））捕捉され、高カバレッジで配列決定された（４３，７０６の総カバレッジ、８，０４４の異なるカバレッジ）標的化領域から得たｃｆＤＮＡ断片を最初に調べた。８１人の患者から得た１６５の腫瘍特異的変動（患者当たり１～７変動の範囲）を含有する座位の分析によって、中央値変異体ｃｆＤＮＡ断片の長さと中央値野生型ｃｆＤＮＡ断片の長さの間に６．５ｂｐ（９５％ＣＩ、５．４～７．６ｂｐ）の平均絶対差が明らかとなった（図３、表３（添付書類Ｃ））。変異体ｃｆＤＮＡ断片のサイズ中央値は、
野生型配列の当該領域より３番染色体の位置４１，２６６，１２４で３０塩基小さく、１１番染色体の位置１０８，１１７，７５３で４７塩基大きいという範囲であった（表３；添付書類Ｃ）。変異した断片と変異していない断片に対してＧＣ含量は同様であり（図４ａ）、ＧＣ含量と断片長の間に相関は存在しなかった（図４ｂ）。３８人の患者から得られた４４の生殖系列変動の同様の分析は、異なる対立遺伝子の断片長間に１ｂｐ未満の中央値ｃｆＤＮＡサイズ差を特定した（図５、表３（添付書類Ｃ））。さらに、同一個体の血漿、バフィーコートおよび腫瘍から得たＤＮＡの以前の配列比較を通じて、クローン性造血に関連する４１の変動が特定された。腫瘍由来の断片とは異なり、造血性変動を有する断片と野生型断片との間に有意な差は存在しなかった（図６、表３（添付書類Ｃ））。総合すると、癌由来ｃｆＤＮＡ断片長は、ある種のゲノム領域において、非癌ｃｆＤＮＡ断片と比較して、有意により可変的であった（ｐ＜０．００１、分散比検定）。これらの差は、高次クロマチン構造の変化の他、癌中でのその他のゲノムおよびエピゲノム異常によるものであり得ること、位置特異的な態様でのｃｆＤＮＡ断片化は、それ故、癌検出のための特有の生物マーカーとしての役割を果たすことが仮定された。
標的化配列決定は、限られた数の座位のみを分析するので、ｃｆＤＮＡ断片化中のさらなる異常を検出するためのより大規模な全ゲノム分析を調査した。ステージＩ～ＩＩＩ疾患を有する８人の肺癌患者ならびに３０人の健康な個体から得た約４ｍｌの血漿からｃｆＤＮＡを単離した（表１（添付書類Ａ）、表４（添付書類Ｄ）および表５（添付書類Ｅ））。ｃｆＤＮＡを次世代配列決定ライブラリーへ変換するために高効率アプローチが使用され、約９×カバレッジで全ゲノム配列決定を実施した（表４；添付書類Ｄ）。総じて、健康な個体のｃｆＤＮＡ断片長はより大きく、１６７．３ｂｐの断片サイズ中央値であったのに対して、癌を有する患者は１６３．８の断片サイズ中央値を有していた（ｐ＜０．０１、ウェルチのｔ検定）（表５；添付書類Ｅ）。ゲノムにわたる位置依存的な態様での断片サイズおよびカバレッジの差を調べるために、配列決定された断片をそれらのゲノム起源にマッピングし、ゲノムの約２．６Ｇｂを覆う５Ｍｂのサイズである５０４ウィンドウ中で断片長を評価した。各ウィンドウに対して、より大きなｃｆＤＮＡ断片（１５１～２２０ｂｐ）に対する小さなｃｆＤＮＡ断片（長さ１００～１５０ｂｐ）の割合の他に、全体的なカバレッジを決定し、各試料に対して全ゲノム断片化プロファイルを取得するために使用した。
健康な個体は、ゲノム全体を通じて極めて類似した断片化プロファイルを有していた（図７および図８）。ｃｆＤＮＡ中に通常観察される断片化パターンの起源を調べるために、２人の健康な個体の浄化されたリンパ球から核を単離し、ヌクレオソームのＤＮＡ断片を得るために、ＤＮＡヌクレアーゼで処理した。観察された健康な個体中のｃｆＤＮＡパターンの分析によって、リンパ球ヌクレオソームＤＮＡ断片化プロファイル（図７ｂおよび７ｄ）およびヌクレオソーム距離（図７ｃおよび７ｆ）への高い相関が明らかとなった。ゲノムの三次元構造を調べるためのＨｉ－Ｃ法（例えば、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ－Ａｉｄｅｎら、２００９ Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２６：２８９－２９３；およびＦｏｒｔｉｎら、２０１５ Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ １６：１８０参照）を用いて明らかにされたところによると、リンパ球中のヌクレオソーム間の距離中央値は、リンパ芽球様細胞の開放した（Ａ）および閉鎖した（Ｂ）区画に相関していた（図７ｃ）。これらの分析は、正常なｃｆＤＮＡの断片化パターンが、正常な血液細胞のクロマチン構造を概ね反映するヌクレオソームＤＮＡパターンの結果であることを示唆する。
健康なｃｆＤＮＡとは異なり、癌を有する患者は、異なる領域において断片サイズの増加および減少を伴う複数の明確なゲノムの相違を有していた（図７ａおよび７ｂ）。標的化分析から得られた本発明者らの観察と同様に、健康な個体と比べて、癌を有する患者に対して、全ゲノムで断片長のより大きな多様性も存在した。
癌を有する患者を健康な個体と識別するためにｃｆＤＮＡ断片長パターンを使用することができるかどうかを決定するために、健康な個体から計算された断片長中央値プロファイルと比較される、長いｃｆＤＮＡ断片に対する短いｃｆＤＮＡ断片の割合の全ゲノム相関分析を各試料に対して行った（図７ａ、７ｂおよび７ｅ）。ｃｆＤＮＡ断片のプロファイルは健康な個体間では極めて一貫していた（０．９９の相関中央値）のに対して、癌患者間での全ゲノム断片比率の相関中央値は０．８４であった（０．１５低い、９５％ＣＩ ０．０７～０．５０、ｐ＜０．００１、ウィルコクソン順位和検定；表５（添付書類Ｅ））。癌患者の断片化プロファイルを健康なリンパ球における断片化プロファイルまたはヌクレオソーム距離と比較すると、類似の相違が観察された（図７ｃ、７ｄおよび７ｆ）。ＧＣ含量に起因する断片化プロファイルの潜在的なバイアスを考慮するために、局所的に重み付けられた平滑化を各試料に独立して適用し、この調整後にも、健康な個体と癌患者間における断片化プロファイルの差が残存することを見出した（健康者に対する癌患者の相関中央値＝０．８３）（表５；添付書類Ｅ）。
約２×、約１×、約０．５×、約０．２×および約０．１×ゲノムカバレッジで、癌を有する患者のｃｆＤＮＡから９×カバレッジで、全ゲノム配列データのサブサンプリング分析を行い、０．５×ゲノムカバレッジにおいてさえ、変化された断片化プロファイルが容易に特定されることが決定された（図９）。これらの観察に基づいて、配列変動のモニタリングと類似した様式で、標的療法の間に断片化プロファイルが変化し得るかどうかを評価するために、１～２×のカバレッジで全ゲノム配列決定を行った。部分的なＸ線応答を有する５人、安定な疾患を有する８人、進行性疾患を有する４人および測定不能な疾患を有する２人を含む１９人の非小細胞肺癌患者から、抗ＥＧＦＲまたは抗ＥＲＢＢ２治療の間に得たｃｆＤＮＡを評価した（表６；添付書類Ｆ）。図１０に示されているように、治療の間の断片化プロファイルの異常の程度は、標的化配列決定を用いて決定されたＥＧＦＲまたはＥＲＢＢ２変異アレル頻度のレベルとよく一致した（変異アレル頻度の断片化プロファイルへのスピアマン相関＝０．７４）。全ゲノムおよび変異ベースの方法は統計学的に関係がなく、従前の治療によってこれらの患者中で抑制され得る異なるｃｆＤＮＡ変動を調べるので、この相関は特筆すべきである。注目すべきことに、６ヶ月またはそれを超える無進行の生存を有した全ての症例は、断片化プロファイルによって決定されたところ、治療の開始後に、ｃｔＤＮＡの下降を示し、または極めて低レベルのｃｔＤＮＡを有していたのに対して、不良な臨床転帰を有する症例は、ｃｔＤＮＡの増加を有していた。これらの結果は、腫瘍由来ｃｆＤＮＡの存在を検出するための断片化分析の実現可能性を実証し、このような分析が処置の間の癌患者の定量的モニタリングにとっても有用であり得ることを示唆する。
腫瘍組織の平行的分析が得られた腫瘍患者中での既知のコピー数変化との関連で、断片化プロファイルを調べた。これらの分析は、変化された断片化プロファイルがコピー中立であったゲノムの領域中に存在したこと、およびコピー数変化を有する領域中でこれらがさらに影響を受け得ることを実証した（図１１ａおよび図１２ａ）。位置依存的な断片化パターンの差は、これらの領域中で、健康なｃｆＤＮＡから癌由来のｃｆＤＮＡを区別するために使用することができた（図１２ａ、ｂ）のに対して、全般的なｃｆＤＮＡ断片サイズ測定はこのような差を見逃したであろう（図１２ａ）。
これらの分析を、癌患者および健康な個体の独立したコホートに拡張した。乳癌（ｎ＝５４）、結腸直腸癌（ｎ＝２７）、肺（ｎ＝１２）、卵巣癌（ｎ＝２８）、膵臓癌（ｎ＝３４）、胃癌（ｎ＝２７）または胆管癌（ｎ＝２６）を含む合計２０８人の癌を有する患者および癌を有さない２１５人の個体から得たｃｆＤＮＡの、１～２×カバレッジでの全ゲノム配列決定を行った（表１（添付書類Ａ）および表４（添付書類Ｄ））。全ての癌患者は処置未経験であり、大半が切除可能な疾患を有していた（ｎ＝１８３）。短いおよび長いｃｆＤＮＡ断片カバレッジのＧＣ調整後に（図１３ａ）、ゲノム全体にわたるウィンドウ中で断片のカバレッジおよびサイズ特性を調べた（図１１ｂ、表４（添付書類Ｄ）および表７（添付書類Ｇ））。ＧＣ含量へのカバレッジの全ゲノム相関は限られており、癌患者と健康な個体間でのこれらの相関の差は観察されなかった（図１３ｂ）。健康な個体は高度に一致した断片化プロファイルを有したのに対して、癌を有する患者は高い変動性を有し、健康なプロファイル中央値に対する相関が減少していた（表７：添付書類Ｇ）。癌患者の中で、ゲノム中において最も一般的に変化を受けた断片化ウィンドウの分析によって、分析された癌の種類全体にわたって中央値６０の影響を受けたウィンドウが明らかになり、癌を有する個体中にｃｆＤＮＡの断片化の位置依存的変動が多数存在することが強調される（図１１ｃ）。
癌を有する個体を検出するために、位置依存的断片化変化を使用することができるかどうかを決定するために、勾配木ブースティング機械学習モデルを実施して、癌患者または健康な個体の特徴を有するとしてｃｆＤＮＡを分類し、１０分割交差検証を１０回繰り返すことによって、このアプローチの性能特性を推定することができるかどうかを調べた（図１４および１５）。機械学習モデルは、ゲノム全体を通じたウィンドウ中でのＧＣ調整された短いおよび長い断片カバレッジ特性を含んだ。単一スコアではなく、染色体腕依存性特徴からのコピー数変化に対する機械学習分類器も開発され（図１６ａおよび表８（添付書類Ｈ））、健康な個体から癌を区別することに同じく役立ち得るので、ミトコンドリアのコピー数変化も含められた（図１６ｂ）。ＤＥＬＦＩのこの実施を用いて、健康または癌を有するとして患者を分類するために使用することができるスコアが得られた。２０８人の癌患者のうち１５２人が検出された（７３％の感度、９５％ＣＩ ６７％～７９％）が、２１５人の健康な個体のうち４人が誤って分類された（９８％の特異性）（表９）。９５％の特異性の閾値において、切除可能な（ステージＩ～ＩＩＩ）患者のうち７９％（１８３人のうち１４５人）および転移性（ステージＩＶ）の患者のうち８２％（２２人のうち１８人）を含む、癌を有する患者の８０％が検出された（９５％ＣＩ、７４％～８５％）（表９）。癌を有する患者を検出するための受信者操作者特性分析は０．９４のＡＵＣを有し（９５％ＣＩ ０．９２～０．９６）、癌の種類の間で、膵臓癌の０．８６から肺癌および卵巣癌の０．９９以上までの範囲にわたっており（図１７ａおよび１７ｂ）、全てのステージ全体で０．９２以上のＡＵＣを有していた（図１８）。ＤＥＬＦＩ分類器スコアは、癌患者または健康な個体のいずれの間でも、年齢とともに異ならなかった（表１；添付書類Ａ）。
Figure 0007531217000001
モデルの予測精度への断片サイズおよびカバレッジ、染色体腕コピー数またはミトコンドリアのマッピングの寄与を査定するために、反復した１０分割交差検証手順を実施して、これらの特徴の性能特性を分離して査定した。断片カバレッジ特徴単独（ＡＵＣ＝０．９４）は全ての特徴を合わせた分類器とほぼ同一であることが観察された（ＡＵＣ＝０．９４）（図１７ａ）。これに対して、染色体のコピー数変化の分析はより低い性能（ＡＵＣ＝０．８８）を有していたが、個別のスコア（ＡＵＣ＝０．７８）またはミトコンドリアのマッピング（ＡＵＣ＝０．７２）に基づくコピー数変化より予測性が高かった（図１７ａ）。これらの結果は、断片カバレッジが本発明者らの分類器にとって主要な寄与因子であることを示唆する。全ての特徴は同じゲノム配列データから得ることができるので、予測モデル中に全ての特徴を含めることは、癌を有する患者の検出のために相補的な様式で寄与し得る。
断片化プロファイルは組織間で異なり得る断片化の領域差を明らかにするので、ｃｆＤＮＡパターンがこれらの腫瘍の原発組織を特定することができるかどうかを調べるために、類似の機械学習アプローチを使用した。このアプローチは、乳癌に対する７６％、胆管癌に対する４４％、結腸直腸癌に対する７１％、胃癌に対する６７％、肺癌に対する５３％、卵巣癌に対する４８％および膵臓癌に対する５０％を含めて、６１％の精度（９５％ＣＩ ５３％～６７％）を有することが見出された（図１９、表１０）。異常なｃｆＤＮＡを有する患者が２つの原発部位のうち１つに割り当てられることを考慮すると、精度は７５％（９５％ ＣＩ ６９％～８１％）に増加した（表１０）。全ての腫瘍の種類に対して、ＤＥＬＦＩによる原発組織の分類は無作為な割り当てによって決定されたものより有意に高かった（ｐ＜０．０１、二項検定、表１０）。
Figure 0007531217000002
癌特異的な配列変動は癌を有する患者を特定するために使用することができるので、ＤＥＬＦＩをこのアプローチと組み合わせることが癌検出の感度を増加させることができるかどうかを評価した（図２０）。ＤＥＬＦＩおよび標的化配列決定の両方を使用する処置未経験の癌患者の部分集団から得たｃｆＤＮＡの分析によって、患者の８２％（１２６のうち１０３）が断片化プロファイルの変動を有するのに対して、６６％（１２６のうち８３）が配列変動を有することが明らかとなった。１％を超える変異アレル頻度を有する症例の８９％超がＤＥＬＦＩによって検出されたのに対して、１％未満の変異アレル頻度を有する症例については、ＤＥＬＦＩによって検出された頻度は、標的化配列決定を用いて検出できなかった症例を含めて８０％であった（表７；添付書類Ｇ）。これらのアプローチを一緒に使用すると、組み合わせた検出感度は、９８％の特異性で、９１％（１２６の患者のうち１１５）に増加した（図２０）。
総合すると、全ゲノムｃｆＤＮＡ断片化プロファイルは、癌患者と健康な個体の間で異なる。ゲノム全体を通じた位置依存的様式での断片長およびカバレッジの変動性は、特定の座位でのｃｆＤＮＡのまたは全般的な断片サイズの従前の分析の一見すると矛盾する観察を説明し得る。癌を有する患者においては、ｃｆＤＮＡ中の不均一な断片化パターンは、血液および新生物細胞の両方からのヌクレオソームＤＮＡの混合物の結果であるように見受けられる。これらの研究は、微量のｃｆＤＮＡから数十ないし可能性としては数百の腫瘍特異的異常を同時分析するための方法を提供し、ｃｆＤＮＡのより感度の高い分析の可能性を失わせてきた制約を克服する。ＤＥＬＦＩ分析は、配列または全般的断片化サイズに焦点を当ててきた従来のｃｆＤＮＡ分析法より高い割合の癌患者を検出した（例えば、Ｐｈａｌｌｅｎら、２０１７ Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ９：ｅａａｎ２４１５；Ｃｏｈｅｎら、２０１８ Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５９：９２６；Ｎｅｗｍａｎら、２０１４ Ｎａｔ Ｍｅｄ ２０：５４８；Ｂｅｔｔｅｇｏｗｄａら、２０１４ Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ６：２２４ｒａ２４；Ｎｅｗｍａｎら、２０１６ Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３４：５４７参照）。本実施例で実証されたように、ＤＥＬＦＩを他のｃｆＤＮＡ変動の分析と組み合わせることは、検出の感度をさらに増加させ得る。断片化プロファイルはヌクレオソームのＤＮＡパターンと関連するように見受けられるので、ＤＥＬＦＩは、腫瘍由来ｃｆＤＮＡの原発源を決定するために使用され得る。分析された患者の半分超での循環腫瘍ＤＮＡの源の特定は、臨床的な特徴、メチル化の変化を含む他の生物マーカーおよびさらなる診断アプローチを含めることによってさらに改善され得る（Ｒｕｉｂａｌ Ｍｏｒｅｌｌ，１９９２ Ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｍａｒｋｅｒｓ ７：１６０；Ｇａｌｌｉら、２０１３ Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ５１：１３６９；Ｓｉｋａｒｉｓ，２０１１ Ｈｅａｒｔ，ｌｕｎｇ＆ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ２０：６３４；Ｃｏｈｅｎら、２０１８ Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５９：９２６）。最後に、このアプローチは、特異的な変動に焦点を当てるアプローチに典型的なディープシーケンシングの必要がなく、少量の全ゲノム配列決定のみを必要とする。この性能特性およびＤＥＬＦＩのために必要とされる限られた量の配列決定は、本発明者らのアプローチが癌を有する患者のスクリーニングおよび管理のために広く適用可能であることを示唆する。
これらの結果は、全ゲノムｃｆＤＮＡ断片化プロファイルが、癌患者と健康な個体の間で異なることを実証する。したがって、ｃｆＤＮＡ断片化プロファイルは、ヒト癌を検出するための非侵襲性アプローチのさらなる研究および応用にとって重要な意義を有し得る。
他の実施形態
その詳細な記載とともに本発明を記載してきたが、先述の記載は例示することを意図し、本発明の範囲を限定することを意図するものではなく、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によって規定されることを理解すべきである。他の態様、利点および改変が以下の特許請求の範囲内に属する。

Claims (13)

  1. 癌を有するとして哺乳動物を特定する方法であって、
    前記哺乳動物から取得された試料から取得されたセルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）断片を加工して配列決定ライブラリーにすること；
    配列決定された断片を取得するために、前記配列決定ライブラリーを低カバレッジ全ゲノム配列決定に供すること；
    マッピングされた配列のウィンドウを取得するために、前記配列決定された断片をゲノムにマッピングすること；および
    ｃｆＤＮＡ断片長を決定するために、マッピングされた配列の前記ウィンドウを分析し、前記ｃｆＤＮＡ断片長を参照ｃｆＤＮＡ断片化プロファイルと比較すること、ここで前記参照ｃｆＤＮＡ断片化プロファイルは健康な哺乳動物のｃｆＤＮＡ断片化プロファイルである；および
    前記哺乳動物から得られた前記ｃｆＤＮＡ断片化プロファイルが前記参照ｃｆＤＮＡ断片化プロファイルと異なる場合に、癌を有するとして前記哺乳動物を特定すること；
    を含む、方法（ただし、ヒトに対する医療行為を除く）。
  2. 前記マッピングされた配列が数十～数千のウィンドウを含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記ウィンドウが非重複ウィンドウである、請求項１～２に記載の方法。
  4. 前記ウィンドウが、それぞれ約５００万の塩基対を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. ｃｆＤＮＡ断片化プロファイルが各ウィンドウ内で決定される、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. ｃｆＤＮＡ断片化プロファイルが断片サイズ中央値を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. ｃｆＤＮＡ断片化プロファイルが断片サイズ分布を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記ｃｆＤＮＡ断片化プロファイルが、マッピングされた配列の前記ウィンドウ中での、長さ１５１ｂｐ～長さ２２０ｂｐである大きなｃｆＤＮＡ断片に対する長さ１００ｂｐ～長さ１５０ｂｐである小さなｃｆＤＮＡ断片の比率を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記ｃｆＤＮＡ断片化プロファイルが、ゲノムにわたるウィンドウ中での小さなｃｆＤＮＡ断片の配列カバレッジを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  10. 前記ｃｆＤＮＡ断片化プロファイルが、ゲノムにわたるウィンドウ中での大きなｃｆＤＮＡ断片の配列カバレッジを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記ｃｆＤＮＡ断片化プロファイルが、ゲノムにわたるウィンドウ中での小さなおよび大きなｃｆＤＮＡ断片の配列カバレッジを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記ｃｆＤＮＡ断片化プロファイルが全ゲノムにわたる、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 前記ｃｆＤＮＡ断片化プロファイルがサブゲノム区間にわたる、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
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