JP7524240B2 - ヒト化ｃｄ３複合体を発現する非ヒト動物 - Google Patents

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Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１４年１１月２４日出願の米国特許仮出願第６２／０８３，６５３号、及び２０１５年１月２３日出願の同第６２／１０６，９９９号の非仮出願であり、それぞれ全ての目的においてその全体が参照により組み込まれる。
（関連出願）
本出願は、２０１５年１１月２３日に２３，９６５バイトで作成された４７０３８２＿ＳＥＱＬＳＴ．ｔｘｔという名前のｔｘｔファイルにある配列を含み、このファイルは参照により本明細書に援用される。
（発明の分野）
そのゲノム内にヒト化ＣＤ３タンパク質をコードする核酸配列、例えば、ヒト化ＣＤ３ε、ヒト化ＣＤ３δ、及び／又はヒト化ＣＤ３γを含む遺伝子改変非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、マウス又はラット）が提供される。したがって、ヒト化ＣＤ３複合体を発現する遺伝子改変非ヒト動物が提供される。本明細書で更に提供されるのは、ＣＤ３に基づいた治療（例えば、ＣＤ３系抗体、例えば、ＣＤ３系二重特異性抗体）の非臨床試験のためのモデルである。
Ｔ細胞受容体サブユニット、例えば、非常に多様なＴＣＲα及びＴＣＲβなどに加えて、Ｔ細胞の表面にあるＴ細胞受容体複合体は、不変のＣＤ３ε鎖、ＣＤ３δ鎖、及びＣＤ３γ鎖を含み、これらはＣＤ３εδ及びＣＤ３εγからなるヘテロ二量体を形成する。ＴＣＲ／ＣＤ３複合体と更に関連するのは、ζ鎖であり、これはジスルフィド結合ホモ二量体として存在する。
ＣＤ３鎖は、Ｔ細胞受容体会合、細胞表面への輸送、表面受容体のエンドサイトーシス、Ｔ細胞発生、及びＴ細胞シグナル伝達、における重要な役割を担う。例えば、ＣＤ３鎖は、ダブルネガティブ（ＣＤ４－ＣＤ８－又はＤＮ）のダブルポジティブ（ＣＤ４＋ＣＤ８＋又はＤＰ）を経たシングルポジティブ（ＣＤ４＋若しくはＣＤ８＋又はＳＰ）へのＴ細胞の転換にとって重要であることが、様々なＣＤ３サブユニットの欠損の研究を通して実証されてきた。加えて、ＣＤ３ε鎖、ＣＤ３δ鎖、及びＣＤ３γ鎖のそれぞれは、１つの免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）を含み、一方ζ鎖二量体は全６個のＩＴＡＭを含む。これらのモチーフは、シグナル伝達モジュールとして機能し、ＴＣＲ結合時に関連するキナーゼによってリン酸化される。
ＣＤ３に対する抗体は、Ｔ細胞上のＣＤ３をクラスター化し、それによって、ペプチド負荷ＭＨＣ分子によるＴＣＲの結合と類似の方法でＴ細胞活性化を生じさせることが示されてきた。したがって、抗ＣＤ３抗体は、Ｔ細胞の活性化を目的とした治療候補として提案されてきた。加えて、ＣＤ３と標的抗原とに結合することができる二重特異性抗体は、標的抗原を発現する組織及び細胞に対するＴ細胞免疫応答を目的とすることを伴う治療的使用に提案されてきた。
単一特異性及び二重特異性のＣＤ３系治療用抗体の非臨床試験のための簡便な動物モデルが、特に所望される。
本明細書で提供されるのは、ヒトＣＤ３タンパク質の細胞外ドメインをコードするために遺伝子改変された内在性非ヒトＣＤ３遺伝子座を含む遺伝子改変非ヒト動物であり、ヒトＣＤ３タンパク質は、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、又はそれらの任意の組み合わせである。一実施形態では、内在性非ヒトＣＤ３遺伝子座は、ヒトＣＤ３εの細胞外ドメイン、ヒトＣＤ３δの細胞外ドメイン、及びヒトＣＤ３γの細胞外ドメインをコードするために遺伝子改変される。一実施形態では、内在性非ヒトＣＤ３遺伝子座は、対応する非ヒトタンパク質の機能性細胞外ドメインを発現しないように遺伝子改変される。一実施形態では、内在性非ヒトＣＤ３遺伝子座は、対応する内在性非ヒト動物ＣＤ３タンパク質の膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを更にコードし、その動物は、Ｔ細胞の表面に、ヒトＣＤ３タンパク質の細胞外ドメイン、並びに内在性非ヒト動物ＣＤ３タンパク質の膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを含むキメラＣＤ３タンパク質を発現する。一実施形態では、非ヒト動物においてヒトＣＤ３の細胞外ドメインをコードする核酸配列は、対応する内在性非ヒト動物ＣＤ３タンパク質の膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインをコードする核酸配列に作動可能に連結されている。特定の実施形態では、非ヒト動物は、（ａ）内在性ＣＤ３ε遺伝子座において、内在性非ヒト動物ＣＤ３εの膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインをコードする核酸配列に作動可能に連結されたヒトＣＤ３εの細胞外ドメインをコードする核酸配列、（ｂ）内在性ＣＤ３δ遺伝子座において、内在性非ヒト動物ＣＤ３δの膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインをコードする核酸配列に作動可能に連結されたヒトＣＤ３δの細胞外ドメインをコードする核酸配列、並びに（ｃ）内在性ＣＤ３γ遺伝子座において、内在性非ヒト動物ＣＤ３γの膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインをコードする核酸配列に作動可能に連結されたヒトＣＤ３γの細胞外ドメインをコードする核酸配列を含み、非ヒト動物は、そのＴ細胞の表面にキメラＣＤ３ε、ＣＤ３δ、及びＣＤ３γタンパク質を発現する。いくつかの実施形態では、非ヒト動物におけるヒトＣＤ３タンパク質の細胞外ドメインは、配列番号３３、配列番号３４、及び配列番号３５からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、動物は、配列番号３３、配列番号３４、及び配列番号３５の配列を含むヒトＣＤ３タンパク質の細胞外ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記述された遺伝子改変非ヒト動物は、ＣＤ３プロモーターに作動可能に連結されたヒトＣＤ３タンパク質の細胞外ドメインをコードする核酸配列を含む。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記述された非ヒト動物は、ＣＤ３プロモーターに作動可能に連結されたヒトＣＤ３εの細胞外ドメイン、ＣＤ３プロモーターに作動可能に連結されたヒトＣＤ３δの細胞外ドメイン、及びＣＤ３プロモーターに作動可能に連結されたヒトＣＤ３γの細胞外ドメインをコードする核酸配列を含む。一実施形態では、ＣＤ３プロモーターは、非ヒト動物ＣＤ３プロモーターである。一実施形態では、ＣＤ３プロモーターは、ヒトＣＤ３プロモーターである。一実施形態では、ＣＤ３プロモーターは、内在性非ヒトＣＤ３プロモーターである。
特定の実施形態では、提供される非ヒト動物は、哺乳類である。一実施形態では、動物は、げっ歯類である。一実施形態では、動物は、ラット又はマウスである。一実施形態では、動物は、マウスである。したがって、一実施形態では、本明細書で提供されるのは、遺伝子改変マウスであり、このマウスは、（ａ）内在性マウスＣＤ３ε遺伝子座において、内在性マウスＣＤ３εの膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインをコードする核酸配列に作動可能に連結されたヒトＣＤ３εの細胞外ドメインをコードする核酸配列、（ｂ）内在性マウスＣＤ３δ遺伝子座において、内在性マウスＣＤ３δの膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインをコードする核酸配列に作動可能に連結されたヒトＣＤ３δの細胞外ドメインをコードする核酸配列、並びに（ｃ）内在性マウスＣＤ３γ遺伝子座において、内在性マウスＣＤ３γの膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインをコードする核酸配列に作動可能に連結されたヒトＣＤ３γの細胞外ドメインをコードする核酸配列を含み、このマウスは、そのＴ細胞の表面にヒト化ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、及びＣＤ３γタンパク質を発現する。一実施形態では、前記マウスにおけるヒト化ＣＤ３εタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号２４に示され、ヒト化ＣＤ３δタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号２５に示され、ヒト化ＣＤ３γタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号２６に示されている。一実施形態では、本明細書で提供される遺伝子改変マウスは、マウスＣＤ３プロモーターに作動可能に連結されたヒトＣＤ３の細胞外ドメインをコードする核酸配列を含む。一実施形態では、プロモーターは、内在性マウスＣＤ３プロモーターである。別の実施形態では、本明細書で提供される遺伝子改変マウスは、ヒトＣＤ３プロモーターに作動可能に連結されたヒトＣＤ３の細胞外ドメインをコードする核酸配列を含む。一実施形態では、マウスは、ヒト化ＣＤ３タンパク質を発現するように遺伝子改変されていないマウスと比較して、類似の、胸腺におけるＣＤ４＋とＣＤ８＋細胞の比率を示す。一実施形態では、マウスの胸腺におけるＣＤ４＋とＣＤ８＋Ｔ細胞の比率は、ヒト化ＣＤ３タンパク質を発現するように遺伝子改変されていないマウスのＣＤ４＋とＣＤ８＋細胞の比率の３０％以内、２５％以内、２０％以内、１５％以内、１２％以内、１０％以内、５％以内、又は２％以内である。一実施形態では、マウスは、ヒト化ＣＤ３タンパク質を発現するように遺伝子改変されていないマウスと類似の、脾臓、リンパ節、及び末梢血におけるＴ及びＢ細胞のパーセンテージを示す。一実施形態では、マウスは、ヒト化ＣＤ３タンパク質を発現するように遺伝子改変されていないマウスと類似の数の循環白血球、単球、好中球、好酸球、及び好塩基球を示す。
したがって、一態様では、本明細書で提供されるのは、内在性マウスＣＤ３遺伝子座において、ヒトＣＤ３タンパク質の細胞外ドメインをコードする核酸配列を含む遺伝子改変マウスであり、ヒトＣＤ３タンパク質は、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。一実施形態では、マウスは、ヒトＣＤ３ε、ＣＤ３δ、及びＣＤ３γの細胞外ドメインを含む。マウスの一実施形態では、ヒトＣＤ３εの細胞外ドメインは、配列番号３３で示され、ヒトＣＤ３δの細胞外ドメインは、配列番号３４で示され、ヒトＣＤ３γの細胞外ドメインは、配列番号３５で示される。一実施形態では、マウスは、ヒト化ＣＤ３ε、ヒト化ＣＤ３δ、及びヒト化ＣＤ３γを発現する。マウスの一実施形態では、ヒト化ＣＤ３εは、配列番号２４で示され、ヒト化ＣＤ３δは、配列番号２５で示され、ヒト化ＣＤ３γは、配列番号２６で示される。一実施形態では、マウスは、マウスＣＤ３ε、ＣＤ３δ、及びＣＤ３γの膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを更に含む。一実施形態では、マウスは、内在性マウスＣＤ３ε、ＣＤ３δ、及びＣＤ３γの膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを更に含む。
別の態様では、本明細書で提供されるのは、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるヒトＣＤ３タンパク質の細胞外ドメインをコードする核酸配列を非ヒト動物の細胞のゲノムに導入すること、及び遺伝子改変非ヒト動物を細胞から繁殖させることを含む、ヒト化ＣＤ３タンパク質を発現する遺伝子改変非ヒト動物を作製する方法である。方法の一実施形態では、動物は、対応する非ヒトタンパク質の機能性細胞外ドメインを含まない。方法の一実施形態では、動物は、内在性ＣＤ３遺伝子座において、ヒトＣＤ３εの細胞外ドメイン、ヒトＣＤ３δの細胞外ドメイン、及びヒトＣＤ３γの細胞外ドメインをコードする核酸配列を含む。方法の一実施形態では、ヒトＣＤ３εの細胞外ドメインは、配列番号３３で示され、ヒトＣＤ３δの細胞外ドメインは、配列番号３４で示され、ヒトＣＤ３γの細胞外ドメインは、配列番号３５で示される。方法の一実施形態では、動物は、対応する非ヒトタンパク質の機能性細胞外ドメインを含まない。１つの特定の実施形態において、方法は、内在性ＣＤ３遺伝子座において非ヒトＣＤ３タンパク質の細胞外ドメインを対応するヒトＣＤ３タンパク質の細胞外ドメインで置換することを含む。方法の一実施形態では、動物は、対応する内在性非ヒト動物ＣＤ３タンパク質の膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインをコードする核酸配列を更に含む。方法の一実施形態では、非ヒト動物はマウスであり、置換は内在性マウスＣＤ３遺伝子座においてである。動物がマウスである方法の一実施形態では、マウスは、配列番号２４で示されるヒト化ＣＤ３ε、配列番号２５で示されるヒト化ＣＤ３δ、配列番号２６で示されるヒト化ＣＤ３γ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるヒト化ＣＤ３タンパク質を発現する。この方法の一実施形態では、置換は、単一ＥＳ細胞内で行われ、この単一ＥＳ細胞をマウス胚に導入してマウスを作製する。
更に別の態様では、本明細書で提供されるのは、非ヒト動物モデル、例えば、ＣＤ３系二重特異性抗原結合タンパク質を試験するためのマウスモデルであり、この抗原結合タンパク質は、ＣＤ３と所望の抗原の両方に結合することができ、マウスモデルは、ヒトＣＤ３タンパク質の細胞外ドメインをコードするように遺伝子改変されたマウスを含み、ヒトＣＤ３タンパク質は、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、又はそれらの任意の組み合わせ（例えば、２つ又は３つ以上のＣＤ３タンパク質）であり、所望の非マウス抗原を発現する細胞を含むか又は所望の非マウス抗原を含む。モデルの非ヒト動物は、上述の又は本明細書の他の部分に記載される非ヒト動物の任意のものであり得る。マウスモデルの一実施形態では、ヒト化ＣＤ３タンパク質の核酸配列は、内在性ＣＤ３遺伝子座に位置する。マウスモデルの一実施形態では、抗原結合タンパク質が、前記マウスに導入された。マウスモデルの一実施形態では、マウスは、ヒトＣＤ３ε、ＣＤ３δ、及びＣＤ３γの細胞外ドメインを発現する。マウスモデルの一実施形態では、マウスは、マウスＣＤ３ε、ＣＤ３δ、及びＣＤ３γの膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを更に発現する。
マウスモデルの一実施形態では、マウスは、所望の抗原を発現する腫瘍の異種移植片を含む。マウスモデルの一実施形態では、所望の抗原を発現する又は含む細胞は、腫瘍細胞である。マウスモデルの一実施形態では、選択された二重特異性抗原結合タンパク質は、ヒト化ＣＤ３タンパク質及び所望の抗原の両方に結合する。マウスモデルの一実施形態では、所望の抗原は、ヒト抗原である。マウスモデルの一実施形態では、抗原結合タンパク質は、サルＣＤ３タンパク質に結合することができる。マウスモデルの一実施形態では、所望の抗原は、腫瘍関連抗原である。そのような実施形態では、腫瘍関連抗原は、ＡＬＫ、ＢＡＧＥタンパク質、ＢＩＲＣ５（サバイビン）、ＢＩＲＣ７、ＣＡ９、ＣＡＬＲ、ＣＣＲ５、ＣＤ１９、ＣＤ２０（ＭＳ４Ａ１）、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７９、ＣＤＫ４、ＣＥＡＣＡＭ３、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ変異体ＩＩＩ、ＥＲＢＢ２（ＨＥＲ２）、ＥＲＢＢ３、ＥＲＢＢ４、ＥＰＣＡＭ、ＥＰＨＡ２、ＥＰＨＡ３、ＦＣＲＬ５、ＦＬＴ３、ＦＯＬＲ１、ＧＡＧＥタンパク質、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＰＮＭＢ、ＧＭ３、ＧＰＲ１１２、ＩＬ３ＲＡ、ＫＩＴ、ＫＲＡＳ、ＬＧＲ５、ＥＢＶ由来のＬＭＰ２、Ｌ１ＣＡＭ、ＭＡＧＥタンパク質、ＭＬＡＮＡ、ＭＳＬＮ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５、ＭＵＣ１６、ＭＵＭ１、ＡＮＫＲＤ３０Ａ、ＮＹ－ＥＳＯ１（ＣＴＡＧ１Ｂ）、ＯＸ４０、ＰＡＰ、ＰＡＸ３、ＰＡＸ５、ＰＬＡＣ１、ＰＲＬＲ、ＰＭＥＬ、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＭＡ（ＦＯＬＨ１）、ＲＡＧＥタンパク質、ＲＥＴ、ＲＧＳ５、ＲＯＲ１、ＳＡＲＴ１、ＳＡＲＴ３、ＳＬＡＭＦ７、ＳＬＣ３９Ａ６（ＬＩＶ１）、ＳＴＥＡＰ１、ＳＴＥＡＰ２、ＴＥＲＴ、ＴＭＰＲＳＳ２、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ－ｎｏｕｖｅｌｌｅ抗原、ＴＮＦＲＳＦ１７、ＴＹＲ、ＵＰＫ３Ａ、ＶＴＣＮ１、ＷＴ１からなる群から選択され得る。
別の実施形態では、所望の抗原は、感染症関連抗原である。そのような実施形態では、マウスは、感染因子に感染していてもよい。そのような一実施形態では、感染症関連抗原は、ウイルス抗原であってもよく、このウイルス抗原は、ＨＩＶ、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ヘルペスウイルス（例えば、ＨＳＶ－１、ＨＳＶ－２、ＣＭＶ、ＨＡＶ－６、ＶＺＶ、エプスタインバールウイルス）、アデノウイルス、インフルエンザウイルス、フラビウイルス、エコーウイルス、ライノウイルス、コクサッキーウイルス、コロナウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、ムンプスウイルス、ロタウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、パルボウイルス、ワクシニアウイルス、ＨＴＬＶ、デングウイルス、パピローマウイルス、水いぼウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、ＪＣウイルス、エボラウイルス、及びアルボウイルス脳炎のウイルス抗原からなる群から選択される。そのような別の実施形態では、感染症関連抗原は、細菌性抗原であってもよく、この細菌性抗原は、クラミジア、リケッチア、マイコバクテリア、ブドウ球菌、連鎖球菌、肺炎球菌（pneumonococci）、髄膜炎菌、淋菌、クレブシエラ、プロテウス、セラチア、シュードモナス、レ
ジオネラ菌、ジフテリア、サルモネラ、桿菌、コレラ、破傷風、ボツリズム、炭疽、ペスト、レプトスピラ、及びライム病の細菌性抗原からなる群から選択される。
提供されたマウスモデルの一実施形態では、ＣＤ３系抗原結合タンパク質は、抗体である。一実施形態では、ＣＤ３系抗原結合タンパク質は、ヒト又はヒト化抗原結合タンパク質である。そのようなマウスモデルは、マウスにおける抗原結合タンパク質の有効性及び／又は毒性の試験を可能にし得る。
また、本明細書で提供されるのは、（ａ）ヒトＣＤ３タンパク質の細胞外ドメインをコードするように遺伝子改変された内在性非ヒトＣＤ３遺伝子座を含む遺伝子改変マウスに所望の抗原を導入することであって、このヒトＣＤ３タンパク質は、上記若しくは本明細書の他の部分に定義されたようにＣＤ３ε、ＣＤ３δ、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、又はそれらの任意の組み合わせであることと、（ｂ）マウスを所望の薬物候補と接触させることであって、この薬物候補が、ヒトＣＤ３及び所望の抗原に対するものであることと、（ｃ）その薬物候補が、所望の抗原の存在又は発現を特徴とする細胞を予防、低減又は排除することに効果があるかどうかを判定することと、を含む、所望の抗原を標的とする薬物候補のスクリーニング方法である。方法の一実施形態では、遺伝子改変マウスは、内在性マウスＣＤ３遺伝子座において、ヒトＣＤ３εの細胞外ドメイン、ヒトＣＤ３δの細胞外ドメイン、及びヒトＣＤ３γの細胞外ドメインをコードする核酸配列を含む。方法の一実施形態では、マウスは、対応するマウスタンパク質の機能性細胞外ドメインを含まない。方法の一実施形態では、マウスは、対応する内在性マウスＣＤ３タンパク質の膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインをコードする核酸配列を含む。方法の一実施形態では、ヒトＣＤ３の細胞外ドメインをコードする核酸配列は、対応する内在性マウスＣＤ３タンパク質の膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインをコードする核酸配列に作動可能に連結される。方法の一実施形態では、ヒトＣＤ３εの細胞外ドメインは、配列番号３３で示され、ヒトＣＤ３δの細胞外ドメインは、配列番号３４で示され、ヒトＣＤ３γの細胞外ドメインは、配列番号３５で示される。したがって、方法の１つの特定の実施形態において、マウスは、配列番号２４で示されるアミノ酸配列を含むヒト化ＣＤ３εタンパク質、配列番号２５で示されるアミノ酸配列を含むヒト化ＣＤ３δタンパク質、及び配列番号２６で示されるアミノ酸配列を含むヒト化ＣＤ３γタンパク質を発現する。
本明細書に記述された薬物候補のスクリーニング方法の特定の実施形態では、本明細書に記述されたマウスに所望の抗原を導入する工程は、マウスで所望の抗原を発現することを含む。一実施形態では、マウスで所望の抗原を発現する工程は、所望の抗原を発現するようにマウスを遺伝子改変することを含む。一実施形態では、所望の抗原を導入する工程は、マウスに所望の抗原を感染させることを含む。方法の一実施形態では、導入する工程は、前記マウスに所望の抗原を発現する細胞を導入することを含む。方法の様々な実施形態では、細胞は、腫瘍細胞、細菌細胞、又はウイルスに感染した細胞であり得る。したがって、方法のいくつかの実施形態では、マウスは、ウイルス又は細菌の感染のいずれかである感染を含む。したがって、所望の抗原は、感染症関連抗原であり得る。一実施形態では、所望の抗原は、ウイルス抗原であり、このウイルス抗原は、ＨＩＶ、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ヘルペスウイルス（例えば、ＨＳＶ－１、ＨＳＶ－２、ＣＭＶ、ＨＡＶ－６、ＶＺＶ、エプスタインバールウイルス）、アデノウイルス、インフルエンザウイルス、フラビウイルス、エコーウイルス、ライノウイルス、コクサッキーウイルス、コロナウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、ムンプスウイルス、ロタウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、パルボウイルス、ワクシニアウイルス、ＨＴＬＶ、デングウイルス、パピローマウイルス、水いぼウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、ＪＣウイルス、エボラウイルス、及びアルボウイルス脳炎のウイルス抗原からなる群から選択される。別の実施形態では、所望の抗原は、感染症関連抗原であり、これは、クラミジア、リケッチア、マイコバクテリア、ブドウ球菌、連鎖球菌、肺炎球菌、髄膜炎菌、淋菌、クレブシエラ、プロテウス、セラチア、シュードモナス、レジオネラ菌、ジフテリア、サルモネラ、桿菌、コレラ、破傷風、ボツリズム、炭疽、ペスト、レプトスピラ、及びライム病の細菌性抗原からなる群から選択される細菌性抗原である。
薬物候補のスクリーニング方法の別の実施形態では、所望の抗原は、腫瘍関連抗原である。方法の一実施形態では、腫瘍関連抗原は、ＡＬＫ、ＢＡＧＥタンパク質、ＢＩＲＣ５（サバイビン）、ＢＩＲＣ７、ＣＡ９、ＣＡＬＲ、ＣＣＲ５、ＣＤ１９、ＣＤ２０（ＭＳ４Ａ１）、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７９、ＣＤＫ４、ＣＥＡＣＡＭ３、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ変異体ＩＩＩ、ＥＲＢＢ２（ＨＥＲ２）、ＥＲＢＢ３、ＥＲＢＢ４、ＥＰＣＡＭ、ＥＰＨＡ２、ＥＰＨＡ３、ＦＣＲＬ５、ＦＬＴ３、ＦＯＬＲ１、ＧＡＧＥタンパク質、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＰＮＭＢ、ＧＭ３、ＧＰＲ１１２、ＩＬ３ＲＡ、ＫＩＴ、ＫＲＡＳ、ＬＧＲ５、ＥＢＶ由来のＬＭＰ２、Ｌ１ＣＡＭ、ＭＡＧＥタンパク質、ＭＬＡＮＡ、ＭＳＬＮ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５、ＭＵＣ１６、ＭＵＭ１、ＡＮＫＲＤ３０Ａ、ＮＹ－ＥＳＯ１（ＣＴＡＧ１Ｂ）、ＯＸ４０、ＰＡＰ、ＰＡＸ３、ＰＡＸ５、ＰＬＡＣ１、ＰＲＬＲ、ＰＭＥＬ、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＭＡ（ＦＯＬＨ１）、ＲＡＧＥタンパク質、ＲＥＴ、ＲＧＳ５、ＲＯＲ１、ＳＡＲＴ１、ＳＡＲＴ３、ＳＬＡＭＦ７、ＳＬＣ３９Ａ６（ＬＩＶ１）、ＳＴＥＡＰ１、ＳＴＥＡＰ２、ＴＥＲＴ、ＴＭＰＲＳＳ２、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ－ｎｏｕｖｅｌｌｅ抗原、ＴＮＦＲＳＦ１７、ＴＹＲ、ＵＰＫ３Ａ、ＶＴＣＮ１、ＷＴ１からなる群から選択される。
薬物候補のスクリーニング方法のいくつかの実施形態では、マウスは、免疫応答性マウスである。本明細書に記述された方法のいくつかの実施形態では、所望の抗原は、所望のヒト抗原である。
方法のいくつかの実施形態では、薬物候補は、抗体である。いくつかの実施形態では、薬物候補は、抗原結合タンパク質である。いくつかの実施形態では、薬物候補は、二重特異性抗体又は二重特異性抗原結合タンパク質である。いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合タンパク質は、ヒトＣＤ３タンパク質と所望の抗原の両方に結合することができる。一実施形態では、薬物候補は、サルＣＤ３タンパク質を認識することができる。
薬物候補のスクリーニング方法のいくつかの実施形態では、薬物候補は、所望の抗原を標的としない作用物質と比較して腫瘍の増殖を低減、排除、又は予防することができる。そのような方法のいくつかの実施形態では、薬物候補が所望の抗原の存在又は発現を特徴とする細胞を予防、低減又は排除することに効果があるかどうかを判定する工程は、腫瘍体積アッセイ又はＴ細胞媒介性腫瘍細胞キリングアッセイを含む。
他の実施形態では、薬物候補は、所望の抗原を標的としない作用物質と比較して細菌又はウイルスの感染を低減、排除、又は予防することができる。いくつかのそのような実施形態では、薬物候補が所望の抗原の存在又は発現を特徴とする細胞を予防、低減又は排除することに効果があるかどうかを判定する工程は、ウイルス又は細菌の力価の測定を含む。
更に他の実施形態では、本明細書で提供されるのは、併用薬物療法の安全性、有効性、及び薬物動態を試験するための非ヒト動物モデル（例えば、マウスモデル）であり、その併用療法はヒトＣＤ３分子に結合する薬物（例えば、抗原結合タンパク質）を含む。そのような併用療法は、Ｔ細胞の漸増及び／又は活性化から利益を受け得る特定の腫瘍、感染症、又は本明細書に記述された他の疾病を標的とすることを目的とする。
Ｔ細胞受容体複合体の構造を示す。複合体は、２つのＣＤ３εサブユニット、１つのＣＤ３δサブユニット、１つのＣＤ３γサブユニット、及び２つのＣＤ３ζサブユニット（Ｔ細胞表面でＴＣＲαβヘテロ二量体と複合体化）を含む。アスタリスクは、ＩＴＡＭモチーフの位置を示す。 ヒト化ＣＤ３γδεの大型標的化ベクターの模式図（一定の比率の縮小ではない）である。図２Ａは、ヒトＣＤ３Ｅ、ＣＤ３Ｄ、及びＣＤ３Ｇ配列のノックイン箇所が示された状態の、選択カセット（Ｎｅｏ）欠失前の大型標的化ベクターを示す。Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、及びＧは、表１で表される接合核酸配列の位置を示す。 ヒト化ＣＤ３γδεの大型標的化ベクターの模式図（一定の比率の縮小ではない）である。図２Ｂは、選択カセット（Ｎｅｏ）欠失後の大型標的化ベクターを示しており、図２Ａと同様に、ヒトＣＤ３Ｅ、ＣＤ３Ｄ、及びＣＤ３Ｇの位置を示している。Ａ－Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、及びＧは、表１及び３で表される接合核酸配列の位置を示す。 ヒト化ＣＤ３γδεマウスにおけるヒト化ＣＤ３タンパク質のアミノ酸配列を示す。ヒト由来のＣＤ３タンパク質配列は、下線が付されている。 マウス及びヒトのＣＤ３ｅ、ＣＤ３ｄ、及びＣＤ３ｇ配列間のアライメントを示す。マウスＣＤ３遺伝子座に導入されたヒト配列の５’末端及び３’末端は、＊及び＊＊がそれぞれ付けられている。 （最上段）は、野生型（ＷＴ）、ヘテロ接合ヒト化ＣＤ３γδε（ＨＥＴ）、又はホモ接合ヒト化ＣＤ３γδε（ＨＯ）マウスにおけるＣＤ４＋及びＣＤ８＋胸腺細胞の正規分布を示すＦＡＣｓ分析のプロットである。 （最上段）は、示された動物の末梢血におけるＢ及びＴ細胞のパーセンテージ並びに数を示すデータである。図５Ｂの最下段は、示された動物の脾臓におけるＴ及びＢ細胞のパーセンテージを示すデータである。 ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＶβレパートリーの多クローン性を示し、この細胞は、ヒト化ＣＤ３γδεマウスの脾臓から得られる。 マウスにおける野生型コントロール又はヒト化ＣＤ３γδεマウスのいずれかの脾臓内のウイルスＬＣＭＶ力価の実例であり、このマウスは、ＬＣＭＶクローン１３（図６Ａ）に感染させた。 マウスにおける野生型コントロール又はヒト化ＣＤ３γδεマウスのいずれかの脾臓内のウイルスＬＣＭＶ力価の実例であり、このマウスは、事前ＬＣＭＶ Ａｒｍｓｔｒｏｎｇクローン感染後にＬＣＭＶクローン１３（図６Ｂ）に感染させた。 サルＣＤ３（ａｈ／ｍｆＣＤ３－２及びａｈ／ｍｆＣＤ３－１）と交差反応もする２種類の抗ヒトＣＤ３抗体、ヒトＣＤ３特異的（ａｈＣＤ３－１及びａｈＣＤ３－２）である２種類の抗ヒトＣＤ３抗体、コントロールの抗マウスＣＤ３（ａｍＣＤ３－２Ｃ１１）、無関係コントロールヒトＩｇＧ（ｃｏｎｔｒｏｌ ｈＩｇＧ）、及び二次抗体のみのコントロール（２番目のみ）で分類された野生型（ＷＴ）、ヘテロ接合ヒト化ＣＤ３γδε（ｈＣＤ３γδε Ｈｅｔ）、又はホモ接合ヒト化ＣＤ３γδε（ｈＣＤ３γδεＨｏ）のマウスの脾細胞のＦＡＣＳ分析からのデータである。ＭＦＩ値は、各グラフの下の表に列挙されている。 ヒト化ＣＤ３γδεマウスにおける抗ＣＤ３抗体に対する反応を実証する。抗ＣＤ３抗体で処理されたマウスの血液中の一時的なＴ及びＢ細胞の喪失、即ち、示された各抗体に関する１日目のＴ細胞の喪失（左図）、又は試験された各抗体に関する１４日間にわたるＴ及びＢ細胞の喪失及び回復（中央及び右図）を実証する。 ヒト化ＣＤ３γδεマウスにおける抗ＣＤ３抗体に対する反応を実証する。示された抗体で処理した２時間後の放出されたサイトカインの濃度の増加を示す（ＩＦＮγ、ＫＣ、ＴＮＦα、ＩＬ－６、及びＩＬ－１０）。 野生型（ＷＴ）及びヒト化ＣＤ３γδεホモ接合（ｈＣＤ３γδε Ｈｏ）のマウスにおいて示された抗体の量を増加させて処理する際の脾細胞の増殖（細胞上のみの活性化倍数として測定される）を実証する。 ヒト化ＣＤ３マウスモデルの様々な特性を要約している表である。 腫瘍の移植と同時に処置を開始したときのＢ１６Ｆ１０．９／ＣＤ２０腫瘍の腫瘍体積における抗ＣＤ３抗体（Ａｂ－１；２つの異なる濃度で試験された、ＣＤ３及びＣＤ２０を認識する二重特異性抗体）の効果を実証する（予防モデル）。 既に確立されたＢ１６Ｆ１０．９／ＣＤ２０腫瘍の腫瘍体積における抗ＣＤ３抗体（Ａｂ－１；２つの異なる濃度で試験された、ＣＤ３及びＣＤ２０を認識する二重特異性抗体）の効果を実証する（治療モデル）。
定義
本発明は、例えば、ヒト化ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、ＣＤ３γ、及び／又はＣＤ３ζタンパク質などのヒト化ＣＤ３タンパク質を発現する遺伝子改変非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、マウス又はラット）を提供する。本発明はまた、例えば、キメラヒト／マウスＣＤ３タンパク質などのヒト化ＣＤ３タンパク質をコードする遺伝子改変ＣＤ３遺伝子座を、例えば、それらの生殖細胞系内などのゲノム内に含む遺伝子改変非ヒト動物にも関連する。また提供されるのは、それを含む胚、細胞、及び組織、それを作製する方法、並びにそれを使用する方法である。特に定義されない限りは、本明細書で使用される全ての用語及び語句は、用語及び語句が使用されている文脈からその反対が明示されない又は明確にわからない限り、用語及び語句が当該技術分野において得てきた意味を含む。
本明細書で使用するとき、「ＣＤ３」は、多分子Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体の一部としてＴ細胞で発現する抗原を含み、多分子ＴＣＲ複合体は、次の受容体鎖：ＣＤ３－イプシロン（ε）、ＣＤ３－デルタ（δ）、ＣＤ３－ゼータ（ζ）、及びＣＤ３－ガンマ（γ）（図１を参照）のうち１つ又は２つ以上を含むホモ二量体及び／又はヘテロ二量体の会合から形成される。ヒト及びマウスＣＤ３－デルタ、ＣＤ３－ゼータ、及びＣＤ３－ガンマの配列及びＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号は下の表４に示される。本出願を通して、ε又はイプシロンは、Ｅと書くこともでき、δ又はデルタは、Ｄと書くこともでき、ζ又はゼータは、Ｚと書くこともでき、γ又はガンマは、Ｇと書くこともできる。
本明細書で使用するとき、「ＣＤ３に結合する抗体」又は「抗ＣＤ３抗体」は、単一のＣＤ３サブユニット（例えば、イプシロン、デルタ、ガンマ又はゼータ）を特異的に認識する抗体及びその抗原結合性断片、並びに２つのＣＤ３サブユニットの二量体複合体（例えば、ガンマ／イプシロン、デルタ／イプシロン、及びゼータ／ゼータＣＤ３二量体）を特異的に認識する抗体及びその抗原結合性断片を含む。本発明の抗体及び抗原結合性断片は、可溶性ＣＤ３及び／又は細胞表面に発現されるＣＤ３に結合し得る。可溶性ＣＤ３は、天然のＣＤ３タンパク質、並びに例えば、単量体及び二量体のＣＤ３構造体などの組み換えＣＤ３タンパク質変異体を含み、これは、膜貫通ドメインが欠損している、ないしは別の方法で細胞膜と関連しない。
保存的アミノ酸置換を説明するために使用されるとき、用語「保存的」は、化学的性質（例えば、電荷又は疎水性）が類似した側鎖Ｒ基を有する別のアミノ酸残基によるアミノ酸残基の置換を含む。保存的アミノ酸置換は、保存的置換をコードするヌクレオチド変化を導入するようにヌクレオチド配列を改変することによって実現することができる。一般的には、保存的アミノ酸置換は、例えば、ＣＤ３タンパク質がＴ細胞受容体会合及びシグナル伝達における役割を担う能力などのタンパク質の所望の機能特性を実質的に変更しない。化学的性質が類似した側鎖を有するアミノ酸の基の例として、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシンなどの脂肪族側鎖；セリン及びスレオニンなどの脂肪族－ヒドロキシル側鎖；アスパラギン及びグルタミンなどのアミド含有側鎖；フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンなどの芳香族側鎖；リシン、アルギニン、及びヒスチジンなどの塩基性側鎖；アスパラギン酸及びグルタミン酸などの酸性側鎖；並びにシステイン及びメチオニンなどのイオウ含有側鎖が挙げられる。保存的アミノ酸置換基として、例えば、バリン／ロイシン／イソロイシン、フェニルアラニン／チロシン、リシン／アルギニン、アラニン／バリン、グルタメート／アスパルテート、及びアスパラギン／グルタミンが挙げられる。いくつかの実施形態では、例えば、アラニンスキャニング変異誘発などで使用されるとき、保存的アミノ酸置換は、タンパク質内の任意の天然残基をアラニンで置換してもよい。いくつかの実施形態では、参照により本明細書に組み込まれる、Ｇｏｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．（（１９９２）Ｅｘｈａｕｓｔｉｖｅ Ｍａｔｃｈｉｎｇ
ｏｆ ｔｈｅ Ｅｎｔｉｒｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａｂａｓｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：１４４３～４５）に開示されたＰＡＭ２５０対数尤度行列内の正の値を有する保存的置換が行われる。いくつかの実施形態では、置換は、中程度の保存的置換であり、その置換はＰＡＭ２５０対数尤度行列内で非負値を有する。
したがって、本発明により包含されるのは、本明細書に記述されたアミノ酸配列内に保存的アミノ酸置換を含むヒト化ＣＤ３タンパク質を発現する遺伝子改変非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、マウス又はラット）である。
当業者は、本明細書に記述されたヒト化ＣＤ３タンパク質をコードする核酸残基に加え、遺伝暗号の縮重のため、他の核酸が本発明のポリペプチドをコードし得ることを理解するだろう。したがって、本明細書に記述されたヒト化ＣＤ３タンパク質をコードするヌクレオチド配列をそのゲノム内に含む遺伝子改変非ヒト動物に加え、遺伝暗号の縮重のために本明細書に記述されたものと異なるヌクレオチド配列をそのゲノム内に含む非ヒト動物もまた提供される。
配列に関連して使用されるとき、用語「同一性」は、ヌクレオチド及び／又はアミノ酸配列同一性を測定するために使用され得る当該技術分野において周知の多数の異なるアルゴリズムによって決定されるような同一性を含む。本明細書に記述されたいくつかの実施形態では、同一性は、１０．０のｏｐｅｎ ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ、０．１のｅｘｔｅｎｄ ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙを使用するＣｌｕｓｔａｌＷ ｖ．１．８３（ｓｌｏｗ）アライメントを用い、かつＧｏｎｎｅｔ類似度マトリックス（ＭａｃＶｅｃｔｏｒ（商標）１０．０．２、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ Ｉｎｃ．，２００８）を用いて決定される。配列の同一性について比較した配列の長さは、特定の配列に依存する。様々な実施形態において、同一性は、成熟タンパク質の配列をＮ末端からＣ末端まで比較することによって決定される。様々な実施形態において、ヒト化配列をヒト配列と比較する際、ヒト化配列（ただし非ヒト部分でない）のヒト部分は、ヒト配列とヒト化配列との間の同一性のレベルを確認する目的で比較するのに使用される。
「作動可能に連結されている」という用語は、そのように記載される成分が意図される様式で機能することを可能にする関係にある近位を含む。このように、タンパク質をコードする核酸配列は、調節配列（例えばプロモーター、エンハンサー、サイレンサー配列等）に作動可能に連結させてもよく、それにより、適切な転写調節が維持される。加えて、本発明のヒト化タンパク質の様々な部分を作動可能に連結して、適切な折り畳み、プロセッシング、標的化、発現、及び細胞内のタンパク質の他の機能特性を維持することができる。特に明記しない限り、本発明のヒト化タンパク質の様々なドメインは、互いに作動可能に連結されている。ＣＤ３タンパク質のヒト細胞外ドメイン並びに非ヒト膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインの作動可能な連結は、核酸コード配列から隣接する融合タンパク質としてこれらの構成要素を発現することによって実現することができる。
遺伝子置換に関して「置換」という用語は、外因性遺伝物質を内在性遺伝子座に置き、それにより内在性遺伝子の全て又は一部をオルソロガス又は相同核酸配列で置換することを含む。一例では、内在性非ヒト遺伝子又はその断片は、対応するヒト遺伝子又はその断片で置換されている。例えば、マウス又は他の非ヒトＣＤ３タンパク質の細胞外ドメインをコードするＤＮＡを、対応するヒトタンパク質の細胞外ドメインをコードするＤＮＡで置換することができる。対応するヒト遺伝子又はその断片は、置換される内在性非ヒト遺伝子又はその断片のオルソログ、ホモログである、又は置換される内在性非ヒト遺伝子又はその断片と構造及び／若しくは機能において実質的に同一若しくは同一であるヒト遺伝子又は断片である。下の実施例で実証されるように、内在性非ヒトＣＤ３細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列は、ヒトＣＤ３細胞外ドメインに対応するヌクレオチド配列によって置換された。
例えば、機能性タンパク質に関連してなど、本明細書で使用するとき「機能性」は、通常天然タンパク質に関連する少なくとも１つの生物活性を維持するタンパク質を含む。例えば、本発明のいくつかの実施形態では、内在性遺伝子座における置換（例えば、内在性非ヒトＣＤ３遺伝子座における置換）は、機能性内在性タンパク質を発現できない遺伝子座をもたらす。
ＣＤ３遺伝子座の場合、「遺伝子座」という用語は、ＣＤ３コード領域を含むゲノムＤＮＡを含む。異なるＣＤ３遺伝子であるＣＤ３ε、ＣＤ３δ、ＣＤ３γは、互いに近接して同一の染色体をマップする。このようにして状況により、内在性ＣＤ３遺伝子座への言及は、これらのコード領域のいくつか若しくは全て又は個々のコード領域を含む遺伝子座を指す場合もある。例えば、ＣＤ３εなどのようなヒトＣＤ３のうちの１つだけが非ヒト動物に導入されている場合、次に、そのＣＤ３をコードする核酸は、好ましくは対応する非ヒトＣＤ３の遺伝子座を改変する。ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、ＣＤ３γなどのいくつかのヒトＣＤ３が非ヒト動物に導入されている場合、次に改変された内在性遺伝子座は、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、及びＣＤ３γのそれぞれのコード領域を含む。ＣＤ３遺伝子座はまた、ＣＤ３ζの遺伝子座を指すこともあり、それはＣＤ３ε、ＣＤ３δ、及びＣＤ３γとは異なる染色体を占位する。ヒトＣＤ３ζが、ヒトＣＤ３ε、ＣＤ３δ、又はＣＤ３γのいずれかと共に導入されている場合、２つ又はそれ以上のＣＤ３遺伝子座を異なる染色体上で改変することができる。他の配列は、例えば、選択カセット、制限部位などの遺伝子操作の目的のために導入されたＣＤ３遺伝子座に含まれ得る。
免疫グロブリン核酸配列に関する用語「生殖細胞系」には、子孫に継承できる核酸配列が含まれる。
語句「免疫グロブリン分子」は、２つの免疫グロブリン重鎖及び２つの免疫グロブリン軽鎖を含む。重鎖は、同一又は異なってもよく、軽鎖は、同一又は異なってもよい。
本明細書で使用するとき、用語「抗体」は、ジスルフィド結合によって相互接続された４つのポリペプチド鎖、２つの重（Ｈ）鎖、及び２つの軽（Ｌ）鎖を含む免疫グロブリン分子を含む。各重鎖は、重鎖可変ドメイン及び重鎖定常領域（ＣＨ）を含む。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３を含む。各軽鎖は、軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常領域（ＣＬ）を含む。重鎖及び軽鎖可変ドメインは、超可変性のいわゆる相補性決定領域（ＣＤＲ）、より保存されている領域が組み入れられている、いわゆるフレームワーク領域（ＦＲ）の領域へと更に細分化され得る。各重及び軽鎖可変ドメインは、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順でアミノ末端からカルボキシ末端まで配列された、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲを含む（重鎖ＣＤＲは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３と省略することができ、軽鎖ＣＤＲは、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３と省略することができる）。
「高親和性」抗体という用語は、標的エピトープに対するＫＤが約１０－９Ｍ以下である抗体を指す（例えば、約１×１０－９Ｍ、１×１０－１０Ｍ、１×１０－１１Ｍ、又は約１×１０－１２Ｍ）。
「二重特異性抗体」という語句は、２つのエピトープに選択的に結合することができる抗体を含む。二重特異性抗体は、通常、２つの異なる分子上（例えば、２つの異なる免疫原上の異なるエピトープ）又は同じ分子上（例えば、同じ免疫原上の異なるエピトープ）のいずれかで、それぞれ異なるエピトープ（例えば、異なる特異性を有する２つの重鎖）に結合する２つのアームを含む。二重特異性抗体が２つの異なるエピトープ（第１のエピトープ及び第２のエピトープ）に選択的に結合することができる場合、第１のエピトープの第１の抗体アームの親和性は、第２のエピトープの第１の抗体アームの親和性より少なくとも１～２又は３又は４又は５桁以上低くなり、逆もまた同様である。二重特異性抗体によって特異的に結合されたエピトープは、同じ又は異なる標的上（例えば、同じ又は異なるタンパク質上）にあり得る。例示の二重特異性抗体は、腫瘍抗原に特異的な第１の抗体アーム及び細胞毒性マーカー、例えば、Ｆｃ受容体（例えば、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩなど）又はＴ細胞マーカー（例えば、ＣＤ３、ＣＤ２８など）などに特異的な第２の抗体アームを有するものを含む。本発明の一実施形態では、二重特異性抗体の１つのアームは、ＣＤ３に特異的である。更に、腫瘍抗原に特異的な第１のアーム及び毒素に特異的な第２のアームを有する二重特異性抗体は、毒素（例えば、サポリン、ビンカアルカロイドなど）を腫瘍細胞に放出するために対をなすことができる。その他の例示の二重特異性抗体は、活性化受容体（例えば、Ｂ細胞受容体、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＩＡ、ＦｃγＲＩ、Ｔ細胞受容体など）に特異的な第１のアーム及び阻害性受容体（例えば、ＦｃγＲＩＩＢ、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７２、ＣＤ３００ａなど）に特異的な第２のアームを有するものを含む。そのような二重特異性抗体は、細胞活性化（例えば、アレルギー及び喘息）に関連する治療的状態のために構成され得る。二重特異性抗体は、例えば、同じ免疫原の異なるエピトープを認識する重鎖を結合することによって作製され得る。例えば、同じ免疫原の異なるエピトープを認識する重鎖可変配列をコードする核酸配列を、同じ又は異なる重鎖定常領域をコードする核酸配列と融合することができ、そのような配列は、免疫グロブリン軽鎖を発現する細胞で発現され得る。典型的な二重特異性抗体は、それぞれ３つの重鎖ＣＤＲを有する２つの重鎖、続いて（Ｎ末端からＣ末端へ）ＣＨ１ドメイン、ヒンジ、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメイン、並びにエピトープ結合特異性を付与しないが各重鎖と結合することができる、又は各重鎖と結合することができ、重鎖エピトープ結合性領域によって結合されたエピトープのうち１つ若しくは２つ以上に結合することができる、又は各重鎖と結合することができ、重鎖の一方若しくは両方をエピトープの一方若しくは両方に結合可能である、のいずれかである免疫グロブリン軽鎖を有する。同様に、「多重特異性抗体」という語句は、多数のエピトープ（例えば、２つ、３つ、４つのエピトープ）に選択的に結合することができる抗体を含む。
「相補的決定領域」という語句又は「ＣＤＲ」という用語は、通常（即ち野生動物において）免疫グロブリン分子の軽又は重鎖の様々な領域で２つのフレームワーク領域間に現れる有機体の免疫グロブリン遺伝子の核酸配列によってコードされたアミノ酸配列を含む。例えば、生殖細胞系配列又は再配列された若しくは再配列されていない配列によって、及び、例えば、ナイーブ又は成熟Ｂ細胞によって、ＣＤＲをコードすることができる。ＣＤＲは、体細胞変異（例えば、動物の生殖細胞系でコードされた配列と異なる）、ヒト化、及び／又はアミノ酸の置換、付加、若しくは欠失によって変性され得る。いくつかの状況では（例えば、ＣＤＲ３について）、（例えば、再配列されていない核酸配列では）隣接していないが、例えば、配列のスプライシング又は結合（例えば、重鎖ＣＤＲ３を形成するためのＶ－Ｄ－Ｊ組み換え）の結果としてＢ細胞核酸配列で隣接している２つ又はそれ以上の配列（例えば、生殖細胞系配列）によってＣＤＲをコードすることができる。
「機能性断片」という語句は、発現され、分泌され、マイクロモル、ナノモル又はピコモルの範囲のＫＤでエピトープに特異的に結合することができる抗体などの抗原結合タンパク質の断片を含む。特異的認識は、ＫＤが少なくともマイクロモルの範囲、ナノモルの範囲、又はピコモルの範囲であるものを含む。
用語「重鎖」又は「イムノグロブリン重鎖」には、いかなる生物由来の免疫グロブリン重鎖定常領域配列を含む免疫グロブリン重鎖配列も含まれる。特に明記しない限り、重鎖可変ドメインは、３つの重鎖ＣＤＲ及び４つのＦＲ領域を含む。重鎖の断片は、ＣＤＲ、ＣＤＲ及びＦＲｓ、並びにその組み合わせを含む。典型的な重鎖は、可変ドメイン（Ｎ末端からＣ末端に向かって）、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを有する。重鎖の機能性断片は、エピトープを特異的に認識（例えばマイクロモル、ナノモル又はピコモルの範囲のＫＤでエピトープを認識）できて、発現された後細胞から分泌されることが可能で、かつ少なくとも１つのＣＤＲを含む断片を含む。重鎖可変ドメインは、可変領域遺伝子配列によってコードされ、通常、生殖細胞系に存在するＶＨ、ＤＨ、及びＪＨセグメントのレパートリーに由来するＶＨ、ＤＨ、及びＪＨセグメントを含む。様々な有機体のＶ、Ｄ、及びＪ重鎖セグメント用の配列、位置、及び命名法は、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＩＭＧＴデータベース）のウェブサイトに見出すことができる。
用語「軽鎖」には、あらゆる生物由来の免疫グロブリン軽鎖配列が含まれ、特に明記しない限り、ヒトのカッパ及びラムダ軽鎖及びＶｐｒｅＢ、並びに代替軽鎖が含まれる。特に明記しない限り、軽鎖可変ドメインは典型的には３つの軽鎖ＣＤＲ及び４つのフレームワーク（ＦＲ）領域を含む。通常、全長軽鎖は、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって、ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４を含む可変ドメインと、軽鎖定常領域と、を含む。軽鎖可変ドメインは、軽鎖可変領域遺伝子配列によってコードされ、通常、生殖細胞系に存在するＶ及びＪセグメントのレパートリーに由来するＶＬ及びＪＬセグメントを含む。様々な有機体のＶ及びＪ軽鎖セグメント用の配列、位置、及び命名法は、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＩＭＧＴデータベース）のウェブサイトに見出すことができる。軽鎖には、例えば、それが現れる抗原結合タンパク質（例えば、抗体）によって認識されるいかなるエピトープにも選択的に結合しないものが含まれる。軽鎖にはまた、それが現れる抗原結合タンパク質（例えば、抗体）によって選択的に結合される１つ又は２つ以上のエピトープに結合及びそのエピトープを認識するもの、又は重鎖がそのエピトープに結合及びそのエピトープを認識することを補助するものが含まれる。
本明細書で使用するとき、用語「抗原結合タンパク質」は、所望の抗原に結合することができる抗体並びに様々な天然に産生された分子及び遺伝子操作を受けた分子を含む。そのようなものとして、例えば、ドメイン特異抗体、単一ドメイン抗体（例えば、ラクダ類及び魚類などに由来）、ドメイン欠失抗体、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、ナノボディ（nanabodies）（例えば、一価ナノボディ、二価ナノボディなど）、小モジュラー免疫薬（ＳＭＩＰ）、サメ可変ＩｇＮＡＲドメインなどが挙げられる。抗原結合タンパク質はまた、例えば、（ｉ）Ｆａｂ断片、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、（ｉｉｉ）Ｆｄ断片、（ｉｖ）Ｆｖ断片、（ｖ）単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子、（ｖｉ）ｄＡｂ断片、及び（ｖｉｉ）抗体の高度可変領域（例えば、ＣＤＲ３ペプチドなどの単離された相補的決定領域（ＣＤＲ））を模倣するアミノ酸残基からなる最小認識単位などの抗原結合性断片も含み得る。
用語「細胞」は、遺伝子組み換え型核酸配列を発現するのに好適である任意の細胞を含む。細胞には、原核生物及び真核生物（単細胞又は多重細胞）、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、バチルス属、ストレプトマイセス属などの菌株）、マイコバクテリア細胞、真菌細胞、酵母細胞（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓ．ｐｏｍｂｅ、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａなど）、植物細胞、昆虫細胞（例えば、ＳＦ－９、ＳＦ－２１、バキュロウイルス感染昆虫細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉなど）、非ヒト動物細胞、ヒト細胞、又は、例えばハイブリドーマ又はクアドローマなどの細胞融合のものが含まれる。いくつかの実施形態では、この細胞は、ヒト、サル、類人猿、ハムスター、ラット、又はマウス細胞である。いくつかの実施形態では、この細胞は、真核であり、ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ Ｋ１、ＤＸＢ－１１ ＣＨＯ、Ｖｅｇｇｉｅ－ＣＨＯ）、ＣＯＳ（例えば、ＣＯＳ－７）、網膜細胞、Ｖｅｒｏ、ＣＶ１、腎臓（例えば、ＨＥＫ２９３、２９３ ＥＢＮＡ、ＭＳＲ ２９３、ＭＤＣＫ、ＨａＫ、ＢＨＫ）、ＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２、ＷＩ３８、ＭＲＣ ５、Ｃｏｌｏ２０５、ＨＢ ８０６５、ＨＬ－６０、（例えば、ＢＨＫ２１）、ジャーカット、Ｄａｕｄｉ、Ａ４３１（表皮性）、ＣＶ－１、Ｕ９３７、３Ｔ３、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、ＳＰ２／０、ＮＳ－０、ＭＭＴ ０６０５６２、セルトリ細胞、ＢＲＬ ３Ａ細胞、ＨＴ１０８０細胞、骨髄腫細胞、腫瘍細胞、及び上記の細胞に由来する細胞株などの細胞から選択される。いくつかの実施形態では、この細胞は、例えば、ウイルス遺伝子（例えば、ＰＥＲ．Ｃ６（商標）細胞）を発現する網膜細胞など、１つ又は２つ以上のウイルス遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、この細胞はＥＳ細胞である。
ヒト化ＣＤ３タンパク質は、一実施形態で、細胞外ドメインがヒト配列であるＣＤ３タンパク質を意味する。膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインはまた、ヒトであってもよいが、非ヒト内在性配列であることが好ましい。異なる種、特にヒト細胞外ドメイン、及び非ヒト膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインからの配列を含むＡＣＤ３タンパク質はまた、キメラＣＤ３タンパク質と呼ばれることもある。
遺伝子改変ヒト化ＣＤ３動物
様々な実施形態において、本発明は、ヒト化ＣＤ３タンパク質（例えば、ヒト化ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、又はそれらの組み合わせ）をコードする核酸配列をそのゲノム内（例えば、その生殖細胞系ゲノム内）に含む遺伝子改変非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、マウス又はラット）を提供する。一実施形態では、本発明は、ヒト化ＣＤ３δ、ヒト化ＣＤ３γ、及びヒト化ＣＤ３εタンパク質をコードするヌクレオチド配列をそのゲノム内に含む遺伝子改変非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、マウス又はラット）を提供する。したがって、本発明のいくつかの実施形態では、マウスは、ヒト化ＣＤ３γδεが同じＴ細胞で発現されたＴ細胞受容体を有する複合体を形成するように、ヒト化ＣＤ３γδε複合体をそのＴ細胞の表面で発現する。
ＣＤ３分子は、一般にＴ細胞免疫を調節することを目的とする作用物質の標的であり、いくつかの抗ＣＤ３抗体は、その目的のために開発されてきた（例えば、ムロモナブ－ＣＤ３又はＯＫＴ３）。ＯＫＴ３などの抗ＣＤ３抗体は、（例えば、移植拒絶において）免疫抑制薬として使用されるが、自己免疫疾患（例えば、クローン病、Ｉ型糖尿病、潰瘍性大腸炎など）における治療可能性についても研究されている。
加えて、ＣＤ３分子はまた、抗ＣＤ３二重特異性抗体が、例えば、特定の所望の抗原を発現する細胞など標的細胞にＴ細胞を補充する能力のために、例えば、二重特異性抗体など二重特異性物質の標的としても研究されている。例示の抗ＣＤ３二重特異性抗体は、米国特許出願公開第２０１４／００８８２９５号、及び同第２０１５／０２６６９６６号に記述されており、その両方が参照により本明細書に援用される。
薬物の非臨床開発段階の間に、候補作用物質は、通常それらの有効性、毒性、並びに他の薬物動態学及び薬力学特性に基づいて研究される。研究の最終目標は、ヒトの治療を開発することであるので、抗体などの候補作用物質は、通常ヒト抗原を標的にする。多くの非臨床試験は、それらの生理機能及び薬物代謝がヒトに最も類似しているので、霊長類などの大型動物で行われる。ＣＤ３（例えば、ＯＫＴ３）に対して生じるいくつかの抗体は、非ヒトＣＤ３、特に霊長類ＣＤ３に対して交差反応しないと知られている。薬物候補の有効性、毒性、及び他のパラメータに関する効果的な非臨床試験を行うために、まず、薬物候補を決定して霊長類ＣＤ３分子を認識する必要がある。
しかしながら、抗ＣＤ３治療の開発を複雑にする別個の因子は、チンパンジーなどの大型霊長類が、絶滅寸前であり、多くの国でチンパンジーにおける研究は禁止されている一方、他の霊長類（例えば、カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ））における研究が倫理的な問題を引き起こし得ることである。例えば、上記理由の全てのために、今までヒト腫瘍の有効な霊長類モデルは存在しない。したがって、げっ歯類、例えば、マウスなどのより小型の動物モデルで得ることができる特異的な治療候補での任意の予備的データは、大型霊長類における非臨床試験の更なる進歩を決定するのに有用であり得る。
マウスなどの小型動物モデルにおける非臨床試験は、伝統的に薬物代用物を使用して行われてきた。例えば、特異的ヒト抗原を標的にする臨床上の候補が開発中であるとき、いくつかの非臨床データは、例えば、抗原結合タンパク質又は抗体などの分子を使用してマウスで生成され、その分子は所望の抗原のマウスホモログを特異的に標的にする。有効性、様々な投与計画、毒性及び副作用、並びに薬物投与の他の態様に関する情報は、そのような薬物代用物の研究から集められる。しかしながら、開発中であるのが実際の薬物ではない、又は研究されているのがヒト標的であることから、そのような所見は制限される。
したがって、予備的な非臨床試験を行うのに最も有用な小型動物モデルは、ヒト又はヒト化ＣＤ３タンパク質を発現し、後続の霊長類の非臨床試験を可能にするカニクイザルＣＤ３と交差反応もする抗ＣＤ３薬物候補を試験することができる、例えば、げっ歯類などの非ヒト動物である。本発明は、そのような複雑な動物モデルを提供する。
したがって、本明細書で提供されるのは、ヒトＣＤ３タンパク質の細胞外ドメインをコードする核酸配列をそのゲノム内に含む遺伝子改変非ヒト動物である。本発明のいくつかの実施形態では、ＣＤ３タンパク質は、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＣＤ３タンパク質は、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＣＤ３タンパク質は、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、及びＣＤ３εポリペプチド鎖を含む。したがって、いくつかの実施形態では、遺伝子改変非ヒト動物は、そのゲノム内にヒトＣＤ３γの細胞外ドメイン、ヒトＣＤ３δの細胞外ドメイン、及びヒトＣＤ３εの細胞外ドメインをコードする核酸配列を含む。そのような実施形態のいくつかにおいて、ヒトＣＤ３γ、ＣＤ３δ、及びＣＤ３εの細胞外ドメインは、単一の核酸によってコードされ得る。いくつかの実施形態では、ヒトＣＤ３γ、ＣＤ３δ、及びＣＤ３εの細胞外ドメインは、別個の核酸によってコードされる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記述された非ヒト動物は、内在性非ヒトＣＤ３プロモーター及び／又は調節因子（例えば、内在性非ヒトのＣＤ３γ、ＣＤ３δ、及び／又はＣＤ３εプロモーター及び／又は調節因子）を維持する。他の実施形態では、非ヒト動物は、ヒトＣＤ３プロモーター及び調節因子を含む。
ＣＤ３に対して生成された抗体の大多数がＣＤ３εエピトープを認識すると仮定されてきたが（Ｔｕｎｎａｃｌｉｆｆｅ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１（５）：５４６～５０を参照）、他のＣＤ３サブユニット（例えば、ＣＤ３γ又はＣＤ３δ）を認識し得るか、又は結合するためにＣＤ３複合体の会合を必要とし得る多数の作用物質が存在する。したがって、ヒトＣＤ３γの細胞外ドメイン、ヒトＣＤ３δの細胞外ドメイン、及びヒトＣＤ３εの細胞外ドメインをコードする核酸配列をそのゲノム内に含む遺伝子改変非ヒト動物は、ＣＤ３サブユニット又はＣＤ３複合体のいずれかに結合する作用物質を調節することができるので、利点を提供する。
例示のＣＤ３タンパク質は、図４のアライメントに示されている。マウスＣＤ３εタンパク質配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０３１６７４及び配列番号２７に見出すことができるが、ヒトＣＤ３εタンパク質配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０００７２４及び配列番号２８に見出すことができる。マウスＣＤ３δタンパク質配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０３８５１５及び配列番号２９に見出すことができるが、ヒトＣＤδタンパク質配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０００７２３及び配列番号３０に見出すことができる。マウスＣＤ３γタンパク質配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０３３９８０及び配列番号３１に見出すことができるが、ヒトＣＤ３γタンパク質配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００００６４及び配列番号３２に見出すことができる。
本発明のいくつかの実施形態では、例えば、ヒトＣＤ３γ、ヒトＣＤ３δ、及びヒトＣＤ３εの細胞外ドメインなど、ヒトＣＤ３の細胞外ドメインをコードする核酸配列は、内在性非ヒトＣＤ３遺伝子座に位置している。換言すれば、そのような核酸は、ヒトＣＤ３ポリペプチドをコードするように内在性ＣＤ３遺伝子座を改変する。本発明のいくつかの実施形態では、非ヒト動物は、内在性遺伝子座の遺伝子改変のために、対応する非ヒトＣＤ３タンパク質の機能性細胞外ドメインを含まず、その結果、機能性細胞外ドメインは、発現されない。本発明のいくつかの実施形態では、ヒトＣＤ３の細胞外ドメインをコードする核酸配列は、内在性非ヒトＣＤ３をコードする対応の核酸配列を置換する。したがって、いくつかの実施形態では、ヒトＣＤ３γの細胞外ドメインをコードする核酸配列は、内在性非ヒトＣＤ３γの細胞外ドメインをコードする核酸配列を置換し、ヒトＣＤ３δの細胞外ドメインをコードする核酸配列は、内在性非ヒトＣＤ３δの細胞外ドメインをコードする核酸配列を置換し、ヒトＣＤ３εの細胞外ドメインをコードする核酸配列は、内在性非ヒトＣＤ３εの細胞外ドメインをコードする核酸配列を置換する。いくつかの実施形態では、この置換は、内在性シグナル配列をコードする核酸配列の置換を含まない。別の実施形態では、この置換は、内在性シグナル配列をコードする核酸配列のヒトシグナル配列をコードする核酸配列との置換を含む。
本発明のいくつかの態様では、細胞外ドメインは、例えば、細胞の表面に現れるタンパク質の領域など、膜貫通又は細胞質ドメインではなく、一部分において複合体での会合時に、例えば、ＴＣＲα及びβ細胞外ドメインなどＴＣＲシグナル伝達複合体の他の構成要素の細胞外ドメインと相互作用する、タンパク質の領域を含む。本明細書に記述された様々な実施形態において、細胞外ドメインは、細胞表面で発現されたタンパク質のドメインを指し、別途記載のない限り、通常、細胞（sell）表面発現の前にタンパク質分解的に分解されるシグナル配列を含まない。本発明のいくつかの実施形態では、ＣＤ３εの細胞外ドメインは、配列番号２４で示されるアミノ酸配列のアミノ酸１７～１３０を含む（配列番号３３として別途示される）。いくつかのそのような実施形態において、この動物は、内在性ＣＤ３εシグナル配列（例えば、配列番号２４のアミノ酸１～１６におけるシグナル配列）をコードする核酸配列を含む。本発明の他の実施形態では、この動物は、ヒトＣＤ３εシグナル配列をコードする核酸配列を含む。本発明のいくつかの実施形態では、ＣＤ３δの細胞外ドメインは、配列番号２５で示されるアミノ酸配列のアミノ酸１９～１０５を含む（配列番号３４として別途示される）。いくつかのそのような実施形態において、この動物は、内在性ＣＤ３δシグナル配列（例えば、配列番号２５のアミノ酸１～１８におけるシグナル配列）をコードする核酸配列を含む。本発明の他の実施形態では、この動物は、ヒトＣＤ３δシグナル配列をコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３γの細胞外ドメインは、配列番号２６で示されるアミノ酸配列のアミノ酸２０～１１６（配列番号３５として別途示される）。いくつかのそのような実施形態において、この動物は、内在性ＣＤ３γシグナル配列（例えば、配列番号２６のアミノ酸１～１９におけるシグナル配列）をコードする核酸配列を含む。本発明の他の実施形態では、この動物は、ヒトＣＤ３γシグナル配列をコードする核酸配列を含む。
本発明のいくつかの態様では、この非ヒト動物は、例えば、対応する内在性ＣＤ３タンパク質などの内在性ＣＤ３タンパク質の膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインをコードする核酸配列を含む。したがって、一実施形態では、この非ヒト動物は、ヒトＣＤ３タンパク質の細胞外ドメイン、並びに対応する内在性非ヒトＣＤ３タンパク質の膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを含むキメラタンパク質が発現されるように、対応する内在性非ヒトＣＤ３タンパク質の膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインをコードする核酸配列に作動可能に連結されたヒトＣＤ３タンパク質の細胞外ドメインをコードする核酸配列を含む。したがって、一態様では、この動物は、内在性ＣＤ３遺伝子座において、内在性非ヒトＣＤ３の膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインをコードする核酸配列に作動可能に連結されたヒトＣＤ３タンパク質の細胞外ドメインをコードする核酸配列を含む。一実施形態では、動物は、内在性ＣＤ３ε遺伝子座において、内在性非ヒト動物ＣＤ３εの膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインをコードする核酸配列に作動可能に連結されたヒトＣＤ３εの細胞外ドメインをコードする核酸配列、内在性ＣＤ３δ遺伝子座において、内在性非ヒト動物ＣＤ３δの膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインをコードする核酸配列に作動可能に連結されたヒトＣＤ３δの細胞外ドメインをコードする核酸配列、並びに内在性ＣＤ３γ遺伝子座において、内在性非ヒト動物ＣＤ３γの膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインをコードする核酸配列に作動可能に連結されたヒトＣＤ３γの細胞外ドメインをコードする核酸配列を含む。ヒト細胞外ドメイン並びに内在性膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインと共にキメラＣＤ３タンパク質を使用することは、薬物とヒトＣＤ３の特異性との相互作用を可能にするが、完全なヒトＣＤ３タンパク質と比較して、内在性Ｔ細胞受容体及びそのシグナル伝達構成要素との相互作用を再現することもまた可能にし得る。
本発明のいくつかの態様では、非ヒト動物は、ヒトＣＤ３タンパク質の細胞外ドメインを発現する。いくつかの態様では、非ヒト動物は、配列番号３３で示されるヒトＣＤ３εの細胞外ドメインを発現する。いくつかの態様では、非ヒト動物は、配列番号３４で示されるヒトＣＤ３δの細胞外ドメインを発現する。いくつかの態様では、非ヒト動物は、配列番号３５で示されるヒトＣＤ３γの細胞外ドメインを発現する。
本発明のいくつかの実施形態では、非ヒト動物は哺乳類である。一態様では、非ヒト動物は、例えば、トビネズミ科又はネズミ上科の小型哺乳動物である。一実施形態では、遺伝子改変動物はげっ歯類である。一実施形態では、げっ歯類は、マウス、ラット、及びハムスターから選択される。一実施形態では、げっ歯類は、ネズミ上科から選択される。一実施形態では、遺伝子改変動物は、カンガルーハムスター科（例えば、マウス様ハムスター）、キヌゲネズミ科（例えば、ハムスター、新世界ラット及びマウス、ハタネズミ）、ネズミ科（真正マウス及びラット、スナネズミ、トゲマウス、タテガミネズミ）、アシナガマウス科（キノボリマウス、イワマウス、オジロラット、マダガスカルラット及びマウス）、トゲヤマネ科（例えば、トゲヤマネ）、及びメクラネズミ科（例えば、デバネズミ、タケネズミ、及びモグラネズミ）から選択される科に属する。特定の実施形態では、遺伝子改変げっ歯類は、真正マウス又はラット（ネズミ科）、スナネズミ、トゲマウス、及びタテガミネズミから選択される。一実施形態では、遺伝子改変マウスはネズミ科に属する。一実施形態では、動物は、げっ歯類である。特定の実施形態では、げっ歯類は、マウス及びラットから選択される。一実施形態では、この非ヒト動物はマウスである。
一実施形態では、この非ヒト動物は、Ｃ５７ＢＬ／Ａ、Ｃ５７ＢＬ／Ａｎ、Ｃ５７ＢＬ／ＧｒＦａ、Ｃ５７ＢＬ／ＫａＬｗＮ、Ｃ５７ＢＬ／６、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、Ｃ５７ＢＬ／６ＢｙＪ、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＪ、Ｃ５７ＢＬ／１０、Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎ、Ｃ５７ＢＬ／１０Ｃｒ、及びＣ５７ＢＬ／Ｏｌａから選択されるＣ５７ＢＬ系統のマウスであるげっ歯類である。別の実施形態では、マウスは、１２９Ｐ１、１２９Ｐ２、１２９Ｐ３、１２９Ｘ１、１２９Ｓ１（例えば、１２９Ｓ１／ＳＶ、１２９Ｓ１／ＳｖＩｍ）、１２９Ｓ２、１２９Ｓ４、１２９Ｓ５、１２９Ｓ９／ＳｖＥｖＨ、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）、１２９Ｓ７、１２９Ｓ８、１２９Ｔ１、１２９Ｔ２である系統からなる群から選択される１２９系統である（例えば、Ｆｅｓｔｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｒｅｖｉｓｅｄ ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ ｆｏｒ ｓｔｒａｉｎ １２９ ｍｉｃｅ，Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｇｅｎｏｍｅ １０：８３６を参照されたく、Ａｕｅｒｂａｃｈ
ｅｔ ａｌ（２０００）Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ａｎｄ Ｃｈｉｍｅｒａ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ １２９／ＳｖＥｖ－ａｎｄ Ｃ５７ＢＬ／６－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓも参照のこと）。特定の実施形態では、遺伝子改変マウスは、上記１２９系統と上記Ｃ５７ＢＬ／６系統との混合物である。別の特定の実施形態では、マウスは、上記の１２９系統の混合、又は上記のＢＬ／６系統の混合である。特定の実施形態では、混合の１２９系統は、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）系統である。別の実施形態では、このマウスは、ＢＡＬＢ系統、例えばＢＡＬＢ／ｃ系統である。更に別の実施形態では、このマウスは、ＢＡＬＢ系統と別の上記系統との混合物である。
一実施形態では、この非ヒト動物はラットである。一実施形態では、ラットは、ウィスターラツト、ＬＥＡ系統、Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ系統、Ｆｉｓｃｈｅｒ系統、Ｆ３４４、Ｆ６、及びＤａｒｋ Ａｇｏｕｔｉから選択される。一実施形態では、ラット系統は、ウィスター、ＬＥＡ、Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ、Ｆｉｓｃｈｅｒ、Ｆ３４４、Ｆ６、及びＤａｒｋ Ａｇｏｕｔｉからなる群から選択される、２つ又はそれ以上の系統の混合体である。
したがって、一実施形態では、この遺伝子改変非ヒト動物はげっ歯類である。一実施形態では、この遺伝子改変非ヒト動物は、ラット又はマウスである。一実施形態では、動物は、マウスである。したがって、一実施形態では、この遺伝子改変動物は、マウスであり、このマウスは、内在性マウスＣＤ３遺伝子座において、ヒトＣＤ３タンパク質の細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、マウスは、ヒトＣＤ３εの細胞外ドメインをコードする核酸配列、ヒトＣＤ３δの細胞外ドメインをコードする核酸配列、及びヒトＣＤ３γの細胞外ドメインをコードする核酸配列を含む。本発明のいくつかの実施形態では、ヒトＣＤ３εの細胞外ドメインは、配列番号３３で示される配列を含み、ヒトＣＤ３δの細胞外ドメインは、配列番号３４で示される配列を含み、ヒトＣＤ３γの細胞外ドメインは、配列番号３５で示される配列を含む。いくつかの実施形態では、マウスは、内在性マウスＣＤ３シグナル配列をコードする配列を含む。他の実施形態では、マウスは、ヒトＣＤ３シグナル配列をコードする配列を含む。
本発明のいくつかの実施形態では、本発明のマウスは、ヒト化ＣＤ３タンパク質を発現する。一実施形態では、マウスは、ヒト化ＣＤ３ε、ヒト化ＣＤ３δ、及びヒト化ＣＤ３γタンパク質を発現する。本発明のいくつかの実施形態では、マウスは、ヒトＣＤ３ε細胞外ドメイン並びに内在性マウスＣＤ３ε膜貫通ドメイン及び細胞質ドメイン、ヒトＣＤ３δ細胞外ドメイン並びに内在性マウスＣＤ３δ膜貫通ドメイン及び細胞質ドメイン、並びにヒトＣＤ３γ細胞外ドメイン並びに内在性マウスＣＤ３γ膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを発現する。いくつかのそのような実施形態において、マウスは、ヒト化ＣＤ３タンパク質を発現し、このヒト化ＣＤ３タンパク質は、配列番号２４で示されるヒト化ＣＤ３ε、配列番号２５で示されるヒト化ＣＤ３δ、及び配列番号２６で示されるヒト化ＣＤ３γである。
本発明のいくつかの態様では、遺伝子組み換えされたマウスは、免疫応答性マウスである。本発明のいくつかの実施形態では、ヒト化ＣＤ３タンパク質の導入は、マウスの免疫系機能に影響を与えない。本発明のいくつかの実施形態では、マウスは、通常のＴ及びＢ細胞比を含む。本発明のいくつかの実施形態では、マウスは、マウス感染に対する正常な応答を開始することができる。いくつかの態様では、マウスは、例えば、ヒト化ＣＤ３タンパク質を発現するように遺伝子改変されていないマウスなどの野生型マウスと比較して、類似の、胸腺におけるＣＤ４＋とＣＤ８＋細胞の比率を示す。本発明のいくつかの実施形態では、マウスの胸腺におけるＣＤ４＋とＣＤ８＋細胞の比率は、ヒト化ＣＤ３タンパク質を発現するように遺伝子改変されていないマウスのＣＤ４＋とＣＤ８＋細胞の比率の３０％以内、例えば２０％以内、例えば１５％以内、例えば１２％以内、例えば１０％以内、例えば５％以内、例えば２％以内である。いくつかの態様では、マウスは、例えば、ヒト化ＣＤ３タンパク質を発現するように遺伝子改変されていないマウスなどの野生型マウスと類似の、脾臓、リンパ節、及び末梢血におけるＴ及びＢ細胞のパーセンテージを示す。いくつかの態様では、マウスは、例えば、ヒト化ＣＤ３タンパク質を発現するように遺伝子改変されていないマウスなどの野生型マウスと類似の数の循環白血球、単球、好中球、好酸球、及び好塩基球を示す。
また、本明細書で提供されるのは、本明細書に記述された遺伝子改変非ヒト動物を作製する方法である。いくつかの実施形態では、ヒト化ＣＤ３タンパク質を発現する遺伝子改変非ヒト動物を作製する方法は、内在性非ヒト動物ＣＤ３遺伝子座において、ヒトＣＤ３タンパク質の細胞外ドメインをコードする核酸配列を含み、ヒトＣＤ３タンパク質は、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。複数のヒトＣＤ３タンパク質が導入される場合、それらを単一の核酸に共に（本実施例におけるように）又は別個に導入することができる。後者の場合、単一細胞株（例えば、ＥＳ細胞株）は、所望されるヒトＣＤ３のそれぞれをコードする核酸を含むように改変されるまで連続した改変を受けることができる。一実施形態では、動物は、対応する非ヒトＣＤ３タンパク質の機能性細胞外ドメインを含まない。一態様では、動物は、内在性非ヒトＣＤ３遺伝子座において、ヒトＣＤ３εの細胞外ドメイン、ヒトＣＤ３δの細胞外ドメイン、及びヒトＣＤ３γの細胞外ドメインをコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ヒトＣＤ３εの細胞外ドメインは、配列番号３３で示され、ヒトＣＤ３δの細胞外ドメインは、配列番号３４で示され、ヒトＣＤ３γの細胞外ドメインは、配列番号３５で示される。一実施形態では、動物は、対応する非ヒトＣＤ３タンパク質の機能性細胞外ドメインを含まない。
いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子改変非ヒト動物を作製する方法は、内在性ＣＤ３遺伝子座において、非ヒトＣＤ３タンパク質の細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列を、対応するヒトＣＤ３タンパク質の細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列と置換することを含む。一実施形態では、動物は、非ヒトＣＤ３タンパク質の膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを維持する。いくつかの実施形態では、置換は、ヒトＣＤ３タンパク質の細胞外ドメイン並びに対応する内在性非ヒトＣＤ３タンパク質の膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを含むキメラタンパク質をもたらす。
ヒトＣＤ３タンパク質をコードする核酸は、通常、細胞に導入され、非ヒト動物はその細胞から繁殖される。いくつかの実施形態では、置換方法は、実施例に記述されるように、ＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）技術を使用して作製された標的化構築物を利用し、この構築物をＥＳ細胞に導入し、標的化されたＥＳ細胞クローンをＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）技術を使用してマウス胚に導入する。
方法が、内在性非ヒトＣＤ３εの細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列の、ヒトＣＤ３εタンパク質の細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列との置換を含む一実施形態では、この方法は、マウスＣＤ３ε遺伝子の内在性のマウスコーディングエクソン２～４の部分配列の、ヒトＣＤ３ε遺伝子のヒトコーディングエクソン２～５の部分配列との置換を含む。方法が、内在性非ヒトＣＤ３δの細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列の、ヒトＣＤ３δの細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列との置換を含む一実施形態では、この方法は、マウスＣＤ３δの内在性のマウスコーディングエクソン２～３の部分配列の、ヒトＣＤ３δ遺伝子のヒトコーディングエクソン２～３の部分配列との置換を含む。方法が、内在性非ヒトＣＤ３γの細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列の、ヒトＣＤ３γの細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列との置換を含む一実施形態では、この方法は、マウスＣＤ３γのマウスコーディングエクソン２～４の部分配列の、ヒトＣＤ３γ遺伝子のヒトコーディングエクソン２～４の部分配列との置換を含む。本発明の一実施形態では、置換は、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、及びＣＤ３γの配列の置換を含む。そのような実施形態では、置換は、３つの遺伝子座全てにおける連続的な遺伝子改変を包含する大型標的化ベクターを作り出すこと、及び次に大型標的化ベクターをマウスＥＳ細胞に導入して、例えば、実施例１に記述されるようにマウスを作製することにより実現され得る。
したがって、一実施形態では、本明細書で提供されるのは、本発明の遺伝子改変動物を作製するための大型標的化ベクターである。一実施形態では、大型標的化ベクターは、５’及び３’マウスホモロジーアームと、マウスＣＤ３εのコーディングエクソン２～４の部分配列の、ヒトＣＤ３εのコーディングエクソン２～５の部分配列との置換を含むＣＤ３ε遺伝子を含むＤＮＡ断片と、マウスＣＤ３δのコーディングエクソン２～３の部分配列の、ヒトＣＤ３δのコーディングエクソン２～３の部分配列との置換を含むＣＤ３δ遺伝子を含むＤＮＡ断片と、マウスＣＤ３γのコーディングエクソン２～４の部分配列の、ヒトＣＤ３γのコーディングエクソン２～４の部分配列との置換を含むＣＤ３γ遺伝子を含むＤＮＡ断片と、選択カセットと、を含む。
選択カセットは、所望の構築物を統合した細胞（例えば、細菌細胞、ＥＳ細胞）の選択を容易にするために標的化構築物に挿入されたヌクレオチド配列である。多数の好適な選択カセットが当該技術分野において周知である（Ｎｅｏ、Ｈｙｇ、Ｐｕｒ、ＣＭ、ＳＰＥＣなど）。加えて、選択カセットは、組み換え部位に隣接してもよく、これは、リコンビナーゼ酵素による処理の際に選択カセットの欠失を可能にする。一般的に用いられる組み換え部位は、それぞれＣｒｅ及びＦｌｐ酵素によって認識されるｌｏｘＰ及びＦｒｔであるが、その他は当該技術分野において周知である。選択カセットは、コード領域の外側の構築物内のどこに位置してもよい。一実施形態では、選択カセットは、ヒトＣＤ３εの挿入配列の上流に挿入される。
遺伝子ターゲティングの完了時、ＥＳ細胞又は遺伝子改変非ヒト動物をスクリーニングして、所望の外因性ヌクレオチド配列の成功した取り込み又は外因性ポリペプチドの発現を確認する。多数の技術が当業者に知られており、（これらに限定されるものではないが）サザンブロッティング、ｌｏｎｇ ＰＣＲ、定量ＰＣＲ（例えば、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）を使用するリアルタイムＰＣＲ）、蛍光インサイチューハイブリダイゼーション、ノーザンブロッティング、フローサイトメトリー、ウエスタン分析、免疫細胞化学、免疫組織化学などが挙げられる。一例では、所望の遺伝子改変を有する非ヒト動物（例えば、マウス）は、Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｇｅｎｏｍｅ ｃｏｕｐｌｅｄ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ－ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２１（６）：６５２～６５９に記載された対立遺伝子アッセイの改変を用いて、マウス対立遺伝子の喪失及び／又はヒト対立遺伝子の獲得のスクリーニングによって同定され得る。遺伝子改変動物における特定のヌクレオチド又はアミノ酸配列を同定するその他のアッセイは、当業者に周知である。
上記方法から生じるヘテロ接合体を繁殖してホモ接合体を発生させることができる。
一態様では、単一細胞中で本明細書に記述されるようにヌクレオチド構築物からキメラＣＤ３タンパク質を発現させることを含む、キメラヒト／非ヒトＣＤ３分子を作製するための方法が提供される。一実施形態では、ヌクレオチド構築物は、ウイルスベクターであり、特定の実施形態では、このウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。一実施形態では、細胞は、ＣＨＯ、ＣＯＳ、２９３、ＨｅＬａ、及びウイルス核酸配列（例えば、ＰＥＲＣ．６（商標）細胞）を発現する網膜細胞から選択される。
一態様では、キメラヒト／非ヒトＣＤ３タンパク質を発現する細胞が提供される。一実施形態では、細胞は、本明細書に記述されるようにキメラＣＤ３配列を含む発現ベクターを含む。一実施形態では、細胞は、ＣＨＯ、ＣＯＳ、２９３、ＨｅＬａ、及びウイルス核酸配列（例えば、ＰＥＲＣ．６（商標）細胞）を発現する網膜細胞から選択される。
本明細書に記述されるように非ヒト動物によって作製されるキメラＣＤ３分子もまた提供され、一実施形態では、このキメラＣＤ３分子は、ヒトＣＤ３タンパク質の細胞外ドメインの全て又は実質的に全てのアミノ酸配列、並びに、例えば、マウスＣＤ３タンパク質など非ヒトＣＤ３タンパク質から少なくとも膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを含む。
遺伝子組み換えされた非ヒト動物に加えて、非ヒト胚（例えば、げっ歯類、例えば、マウス又はラット胚）もまた提供され、この胚は、本明細書に記述されるように非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、マウス又はラット）に由来するドナーＥＳ細胞を含む。一態様では、胚は、キメラＣＤ３遺伝子及び宿主胚細胞を含むＥＳドナー細胞を含む。
また提供されるのは、組織であり、この組織は、本明細書に記述されるように非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、マウス又はラット）に由来し、キメラＣＤ３タンパク質を発現する。
加えて、本明細書に記述されるように、非ヒト動物から単離された非ヒト細胞が提供される。一実施形態では、細胞はＥＳ細胞である。一実施形態では、細胞はＴ細胞である。一実施形態では、細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞である。別の実施形態では、細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞である。
いくつかの実施形態では、また本明細書で提供されるのは、本明細書に記述されたヒト化ＣＤ３タンパク質をコードする核酸配列を含む遺伝子座である。
ヒトの治療を試験するためのマウスモデル
いくつかの態様では、本明細書で提供されるのは、ＣＤ３を標的とした（「抗ＣＤ３」）治療薬を試験するためのマウスモデルである。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、抗ＣＤ３抗原結合タンパク質を試験するためのマウスモデルである。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、抗ＣＤ３抗体を試験するためのマウスモデルである。いくつかのそのような実施形態において、提供されるのは、抗ＣＤ３多重特異性、例えば二重特異性の抗原結合タンパク質又は抗ＣＤ３二重特異性抗体を試験するためのマウスモデルである。このように、抗ＣＤ３多重特異性抗原結合タンパク質、例えば、抗ＣＤ３二重特異性抗原結合タンパク質などは、前記ヒト化ＣＤ３タンパク質及び少なくとも１つの他の所望の抗原を標的にするか、又はそれに特異的に結合する。様々な態様では、抗原結合タンパク質がＣＤ３と所望の抗原の両方に結合することができる抗ＣＤ３二重特異性抗原結合タンパク質を試験するためのマウスモデルは、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるヒト化ＣＤ３タンパク質をコードする核酸配列と、所望の抗原を発現又は含む細胞と、を含む。一実施形態では、マウスは、前記ヒト化ＣＤ３タンパク質を発現するＴ細胞を含む。
実施形態において、単一特異性又は二重特異性抗原結合タンパク質の試験は、前記ヒト化ＣＤ３タンパク質を発現するＴ細胞上の抗原結合タンパク質の効果の判定を可能にするアッセイ又は研究を実行することを伴う。別の実施形態では、二重特異性抗原結合タンパク質の試験は、前記ヒト化ＣＤ３タンパク質を発現するＴ細胞、及び所望の抗原を発現するか若しくは含む細胞の両方の上での抗原結合タンパク質の効果、又は前記ＣＤ３を発現するＴ細胞と所望の抗原を発現するか若しくは含む細胞との間の相互作用の判定を可能にするアッセイ又は研究を実行することを伴う。一実施形態では、単一特異性又は二重特異性抗原結合タンパク質の試験は、前記所望の抗原を発現するか又は含む細胞上で前記ヒト化ＣＤ３タンパク質を発現するＴ細胞の効果の判定を可能にするアッセイ又は研究を実行することを伴う。一実施形態では、そのようなアッセイは、例えば、所望の抗原を発現する細胞の数、免疫応答、細胞間相互作用、細胞傷害性、サイトカイン放出、細胞の活性化、細胞増殖、腫瘍成長又は退行、病理学における変化などを測定する。様々なアッセイには、補体誘導性細胞傷害（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）、ＰＭＢＣ増殖、ＣＤ６９活性化、組織学的組織分析、組織及び細胞バイオマーカーの分析（例えば、細胞又は組織は、マウスからアッセイの目的のために抽出されてもよいか又はＸ線撮影、ＭＲＩ、ＰＥＴ、ＳＰＥＣＴ、ＢＬＩ、及び蛍光系画像診断法によって分析されてもよい）の測定が挙げられるがそれらに限定されない。
本発明のいくつかの実施形態では、そのようなマウスモデルにおいて、所望の抗原が、前記マウスに導入された。所望の抗原は、当業者に既知のいくつかの方法により導入され得る。いくつかの非限定的な方法として、遺伝子導入、注入、感染、組織又は細胞の移植が挙げられる。所望の抗原又はその断片（例えば、試験されている抗原結合タンパク質によって認識される断片）は、特定の細胞タイプに対して標的化され得るか又は特定の細胞タイプによって発現され得る。いくつかの実施形態では、所望の抗原は、マウスゲノムによってコードされる所望のヒト化抗原である。
所望の抗原は、それが細胞表面上のみで発現されるような膜結合型タンパク質であってもよい。あるいは、所望の抗原又はその断片（例えば、試験されている抗原結合タンパク質によって認識される断片）は、別のタンパク質又は部分と複合体化された細胞表面に示され得る。いくつかの細胞表面抗原は、共受容体の複合体として他のタンパク質と結合するか、又は細胞外分子と結合するか若しくは細胞外分子との親和性を有してもよい。したがって、マウスモデルを利用して、様々な細胞系においてＴ細胞と相互作用する二重特異性抗原結合分子を試験することができる。
一実施形態では、マウスモデルは、ヒトＣＤ３ε、ＣＤ３δ、ＣＤ３γの細胞外ドメインを発現する。一実施形態では、マウスは、マウスのＣＤ３ε、ＣＤ３δ、及びＣＤ３γの膜貫通及び細胞質ドメインを発現し、一実施形態では、膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインは、内在性のマウスドメインである。一実施形態では、マウスモデルは、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、及びＣＤ３γを発現し、それぞれは、ヒト細胞外ドメイン及びマウス（例えば内在性のマウス）膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを含む。
本発明の様々な実施形態において、抗原結合タンパク質は、ＣＤ３及びマウスモデル中の所望の抗原の両方に結合する。一実施形態では、所望の抗原は、ヒト抗原である。一実施形態では、所望の抗原は、例えばカニクイザル抗原などの霊長類抗原である。一実施形態では、抗原結合タンパク質は、ヒト及びサル由来の両方の同じ所望の抗原に結合することができる。一実施形態では、抗原結合タンパク質は、ヒト及びサルＣＤ３の両方に結合することができる。
一実施形態では、マウスモデルは、所望の抗原を発現する腫瘍の異種移植片を含む。一実施形態では、前記マウスにおいて所望の抗原を発現するか又は含む細胞は、腫瘍細胞などの不死化細胞である。したがって、マウスモデルを利用して、所望の抗原を発現する腫瘍細胞を阻害又はこれに作用する際の抗ＣＤ３二重特異性抗原結合タンパク質の活性を試験する。
したがって、所望の抗原を発現するか又は含む細胞が腫瘍細胞である本発明の実施形態において、所望の抗原は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）であり得る。様々な腫瘍抗原が、Ｔ ｃｅｌｌ ｄｅｆｉｎｅｄ ｔｕｍｏｒ ａｎｔｉｇｅｎｓ（ｖａｎ ｄｅｒ Ｂｒｕｇｇｅｎ Ｐ，Ｓｔｒｏｏｂａｎｔ Ｖ，Ｖｉｇｎｅｒｏｎ Ｎ，Ｖａｎ ｄｅｎ Ｅｙｎｄｅ Ｂ．Ｐｅｐｔｉｄｅ ｄａｔａｂａｓｅ：Ｔ ｃｅｌｌ－ｄｅｆｉｎｅｄ ｔｕｍｏｒ ａｎｔｉｇｅｎｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎ ２０１３）のデータベースに列挙されている。例示の腫瘍関連抗原としては、ＡＬＫ、ＢＡＧＥタンパク質、ＢＩＲＣ５（サバイビン）、ＢＩＲＣ７、ＣＡ９、ＣＡＬＲ、ＣＣＲ５、ＣＤ１９、ＣＤ２０（ＭＳ４Ａ１）、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７９、ＣＤＫ４、ＣＥＡＣＡＭ３、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ変異体ＩＩＩ、ＥＲＢＢ２（ＨＥＲ２）、ＥＲＢＢ３、ＥＲＢＢ４、ＥＰＣＡＭ、ＥＰＨＡ２、ＥＰＨＡ３、ＦＣＲＬ５、ＦＬＴ３、ＦＯＬＲ１、ＧＡＧＥタンパク質、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＰＮＭＢ、ＧＭ３、ＧＰＲ１１２、ＩＬ３ＲＡ、ＫＩＴ、ＫＲＡＳ、ＬＧＲ５、ＥＢＶ由来のＬＭＰ２、Ｌ１ＣＡＭ、ＭＡＧＥタンパク質、ＭＬＡＮＡ、ＭＳＬＮ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５、ＭＵＣ１６、ＭＵＭ１、ＡＮＫＲＤ３０Ａ、ＮＹ－ＥＳＯ１（ＣＴＡＧ１Ｂ）、ＯＸ４０、ＰＡＰ、ＰＡＸ３、ＰＡＸ５、ＰＬＡＣ１、ＰＲＬＲ、ＰＭＥＬ、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＭＡ（ＦＯＬＨ１）、ＲＡＧＥタンパク質、ＲＥＴ、ＲＧＳ５、ＲＯＲ１、ＳＡＲＴ１、ＳＡＲＴ３、ＳＬＡＭＦ７、ＳＬＣ３９Ａ６（ＬＩＶ１）、ＳＴＥＡＰ１、ＳＴＥＡＰ２、ＴＥＲＴ、ＴＭＰＲＳＳ２、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ－ｎｏｕｖｅｌｌｅ抗原、ＴＮＦＲＳＦ１７、ＴＹＲ、ＵＰＫ３Ａ、ＶＴＣＮ１、ＷＴ１が挙げられるがこれらに限定されない。一例では、本明細書の実施例３に記載されるように、所望の抗原は、例えば、ヒト又はヒト化ＣＤ２０などのＣＤ２０であり得る。
本発明の別の実施形態では、マウスモデルを使用して、候補の二重特異性抗原結合タンパク質が、感染症関連抗原である所望の抗原を阻害するか又はこれに作用することができるかどうかを判断する。本発明の一実施形態では、マウスは、感染因子に感染している。本発明の一実施形態では、感染症関連抗原は、ウイルス抗原である。一態様では、ウイルス抗原は、ＨＩＶ、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ヘルペスウイルス（例えば、ＨＳＶ－１、ＨＳＶ－２、ＣＭＶ、ＨＡＶ－６、ＶＺＶ、エプスタインバールウイルス）、アデノウイルス、インフルエンザウイルス、フラビウイルス、エコーウイルス、ライノウイルス、コクサッキーウイルス、コロナウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、ムンプスウイルス、ロタウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、パルボウイルス、ワクシニアウイルス、ＨＴＬＶ、デングウイルス、パピローマウイルス、水いぼウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、ＪＣウイルス、エボラウイルス、及びアルボウイルス脳炎のウイルス抗原からなる群から選択される。
所望の抗原が感染症関連抗原である本発明の別の実施形態では、所望の抗原は、細菌性抗原である。本発明のいくつかの態様では、細菌性抗原は、クラミジア、リケッチア、マイコバクテリア、ブドウ球菌、連鎖球菌、肺炎球菌、髄膜炎菌、淋菌、クレブシエラ、プロテウス、セラチア、シュードモナス、レジオネラ菌、ジフテリア、サルモネラ、桿菌、コレラ、破傷風、ボツリズム、炭疽、ペスト、レプトスピラ、及びライム病の細菌性抗原からなる群から選択される。
本発明のいくつかの態様では、ＣＤ３系二重特異性抗原結合タンパク質は、ヒトＣＤ３系抗原結合タンパク質である。一実施形態では、抗原結合タンパク質は、例えばヒト抗体などの抗体又はその抗原結合断片である。
本発明のいくつかの実施形態では、マウスモデルは、免疫応答性マウスモデルである。本発明のいくつかの実施形態では、マウスモデルは、所望の抗原結合タンパク質の有効性及び／又は毒性の試験を可能にする。有効性の測定は、二重特異性物質によって標的化される所望の抗原によって異なるだろう。いくつかの実施形態では、有効性の測定は、抗原を発現する細胞のＴ細胞死滅である。他の実施形態では、有効性の測定は、ウイルスの中和である。他の実施形態では、有効性の測定は、動物の生存性であってもよい。更に別の実施形態では、有効性の測定は、所望の抗原を発現する細胞の除去、Ｔ細胞の増殖、サイトカイン（例えば、ＩＦＮｇ、ＴＮＦａ、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－１０、ＩＬ４、ＩＬ－６、グランザイム、パーフォリンなど）の産生であってもよい。
本発明のいくつかの実施形態では、動物における毒性は、例えば、体重の変化、食欲、消化性の変化、血球算定の変化、脾腫、器官の組織構造の変化、肝臓酵素機能の変化、尿分析における変化、器官の毒性、出血、脱水、毛の喪失及びみすぼらしさ、又は病的状態の他の兆候など、動物における有害事象として測定され得る。１つの測定は、無関係な抗原との抗原結合タンパク質の交差反応性の判定であってもよい。これは、一実施形態では、器官の組織学的検査、具体的には所望の抗原を発現すると知られていない組織又は細胞のタイプでの抗原結合タンパク質の検出によって、検出することができる。
遺伝子改変非ヒト動物の使用
本発明はまた、本明細書に記述された遺伝子改変非ヒト動物を使用する様々な方法も提供する。
一実施形態では、本明細書で提供されるのは、（ａ）内在性マウスＣＤ３遺伝子座において、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるヒトＣＤ３タンパク質の細胞外ドメインをコードする核酸配列を含む遺伝子改変マウスを提供すること又は受容することと、（ｂ）所望の抗原を前記遺伝子改変マウスに導入することと、（ｃ）前記マウスを所望の薬物候補と接触させることであって、その薬物候補がヒトＣＤ３及び所望の抗原に対するものであることと、（ｄ）その薬物候補が、所望の抗原の存在又は発現を特徴とする細胞を予防、低減又は排除することに効果があるかどうかを判定することと、を含む、所望の抗原を標的とする治療用薬物候補のスクリーニング方法である。様々な実施形態において、マウスは、そのＴ細胞の表面上に機能性ヒト化ＣＤ３タンパク質を発現する。方法の一実施形態では、遺伝子改変マウスは、内在性マウスＣＤ３遺伝子座において、ヒトＣＤ３εの細胞外ドメイン、ヒトＣＤ３δの細胞外ドメイン、及びヒトＣＤ３γの細胞外ドメインをコードする核酸配列を含む。本明細書に記述された方法の一実施形態では、マウスは、対応するマウスタンパク質の機能性細胞外ドメインをコードする核酸配列を含まない。方法のいくつかの実施形態では、ヒトＣＤ３タンパク質の細胞外ドメインは、対応する内在性マウスＣＤ３タンパク質の膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインに作動可能に連結されている。方法の多様なかかる実施形態では、ヒトＣＤ３εの細胞外ドメインは、配列番号３３で示され、ヒトＣＤ３δの細胞外ドメインは、配列番号３４で示され、ヒトＣＤ３γの細胞外ドメインは、配列番号３５で示される。ここに記載された方法の様々な実施形態では、マウスは、配列番号２４で示されるヒト化ＣＤ３εタンパク質、配列番号２５で示されるヒト化ＣＤ３δタンパク質、及び配列番号２６で示されるヒト化ＣＤ３γを発現し得る。
本明細書に記述された方法の様々な実施形態では、所望の抗原の本明細書に記述された遺伝子改変マウスへの導入は、当業者に既知の任意の方法により実現することができ、それには、遺伝子導入、注入、感染、組織又は細胞の移植を制限なく挙げることができる。このように、導入は、マウスで所望の抗原を発現することによって実現することができ、所望の抗原を発現するように前記マウスを遺伝子改変することを含み得る。あるいは、導入は、例えば、組織又は細胞の移植の場合など、前記マウスへの所望の抗原を発現する細胞の導入を含み得る。導入はまた、例えば、細菌又はウイルス感染の場合など、前記マウスに所望の抗原を感染させることも含み得る。一実施形態では、所望の抗原は、所望のヒト抗原であり得る。別の実施形態では、それは、所望の細菌又はウイルス抗原であり得る。
所望の抗原は、上に詳細に記述されるように腫瘍関連抗原であり得る。抗原はまた、上に詳細に記述されるように、例えば、細菌又はウイルス抗原など感染症関連抗原であり得る。
治療用薬物候補のスクリーニング方法の様々な実施形態では、薬物候補は、例えば、抗体、例えば、二重特異性抗体など、抗原結合タンパク質であり得る。様々な態様において、そのような薬物候補は、ヒトＣＤ３及び所望の抗原の両方に結合することができる。所望の抗原は、ヒト抗原であり得る。所望の抗原はまた、例えば、サルなど霊長類の抗原であり得る。したがって、スクリーニングに使用される薬物候補は、ヒトＣＤ３に結合することに加えて、ヒト抗原及び対応する霊長類抗原の両方に結合することが可能であり得る。薬物候補はまた、霊長類（例えば、サル）ＣＤ３に結合することも可能であり得る。したがって、薬物候補は、ヒト及び霊長類（例えば、サル）ＣＤ３の両方に結合することが可能であり得、また、一実施形態では、所望のヒト抗原に結合することが可能であり得る。別の実施形態では、所望の抗原は、細菌又はウイルス抗原であり得、薬物候補は、ヒト及び霊長類（例えば、サル）ＣＤ３並びに所望の細菌又はウイルス抗原の両方に結合することが可能であり得る。
いくつかの態様では、治療候補は、抗体であり、それはヒト抗体である。他の態様では、それはヒト化抗体であってもよい。例えば、治療候補は、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウス（参照により本明細書に援用される米国特許第８，５０２，０１８号）で生成された抗体であってもよく、したがって、初期の抗体候補は、ヒト可変領域及びマウス定常領域を含んでもよい。抗体候補のマウス定常領域は、ヒト定常領域と作動可能に連結したＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスで選択されたヒト可変領域を発現することによってヒト由来であるように再設計され得る。
本明細書に記述された方法の様々な実施形態では、治療候補は、病気を低減、排除、又は予防することができる。一実施形態では、病気は腫瘍であり、治療候補は、所望の抗原を標的としない作用物質と比較して腫瘍の増殖を低減、排除、又は予防することができる。方法のそのような実施形態では、薬物候補が所望の抗原の存在又は発現を特徴とする細胞を予防、低減又は排除することに効果があるかどうかの判定は、腫瘍体積アッセイ、腫瘍細胞キリングアッセイ、腫瘍におけるアポトーシスマーカーの導入、腫瘍内での血管の増大の低減、腫瘍への免疫細胞の浸潤などを使用して実行することができる。別の実施形態では、病気は感染症であり、治療候補は、所望の抗原を標的としない作用物質と比較して細菌又はウイルス感染を低減、排除、又は予防することができる。方法のそのような実施形態では、薬物候補が所望の抗原の存在又は発現を特徴とする細胞を予防、低減又は排除することに効果があるかどうかの判定は、細菌又はウイルスの力価の測定、感染した細胞におけるアポトーシスマーカーの導入などを使用して実行することができる。
本発明のヒト化ＣＤ３マウスの使用の他の方法もまた提供される。例えば、本明細書に記述された非ヒト動物、例えば、ヒト化ＣＤ３マウスを使用して、薬物作用の機序を研究することができる。本動物の開発の前には、そのような研究は通常ヒト及び霊長類で行われず、多くの場合、免疫応答性動物モデルを必要とするので、薬物作用の機序を研究することは困難であった。薬物作用の機序の理解は、より良好な抗体の開発につながり得る。本発明の様々な実施形態では、ヒト化ＣＤ３マウスは、免疫応答性マウスである。例えば、本発明のヒト化ＣＤ３マウスは、無傷の発達及び全ての免疫細胞のタイプの完全相補及び無傷の免疫シグナル伝達経路を有する健康で正常な免疫系を含み、特定の細胞タイプ、サイトカイン、ケモカインなどで様々な治療候補の効果を研究するのに使用することができる。それからマウスを使用して、薬物候補機能に関する機構的な問題に回答することができる。
加えて、このヒト化ＣＤ３マウスを、腫瘍移植片上での二重特異性抗ＣＤ３の薬物候補の効果の試験を含む方法で使用することができる。以前に開発されたマウスモデルは、正常なヒト腫瘍の生着を可能にするために免疫無防備状態のマウスモデルであった。ヒト化ＣＤ３マウスは、完全に免疫応答性であり、所望の抗原を発現する腫瘍細胞の導入及び成長を可能にするので、機構的な問題、早期の毒性の問題、早期の有効性の問題などに回答することが挙げられるがこれらに限定されない免疫応答での十分な効果（affect）を研究することができる。
更に他の実施形態では、ヒト化ＣＤ３マウスを使用して動物モデルにおける併用薬物療法、特に、例えば、１つの薬物がＣＤ３に結合する抗原結合タンパク質であり、別の薬物が以前に特定の適応症のために許可された物質である併用薬物療法の効果を研究することができる。薬物の投与に関連する特定の問題及びその効果を、何らかのヒトの実験の前に動物モデルで処理することができる。
次の実施例は、本発明の方法及び組成物を、どのように作りどのように使用するかを当業者に説明するために提供され、本発明者らが彼らの発明と見なすものの範囲を限定しようとするものではない。使用された数字（例えば、量、温度など）に対する精度を確保する努力がなされたが、ある程度の実験誤差及び偏差が考慮されるべきである。実施例は、当業者には周知であろう従来の方法の詳細な説明を含まない（分子クローニング技術など）。別途記載のない限り、部は重量部であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏で示され、圧力は大気又はほぼ大気である。
実施例１．ヒト化ＣＤ３遺伝子座のコンストラクション
実施例１．１．ヒト化ＣＤ３γδεのコンストラクション
ＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）技術を使用して、ヒト及びマウスの細菌人工染色体（ＢＡＣ）ＤＮＡからの固有の標的化ベクターのコンストラクションによりマウスＣＤ３遺伝子座をヒト化した。（例えば、両者とも参照により本明細書に援用される、米国特許第６，５８６，２５１号及びＶａｌｅｎｚｕｅｌａ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｇｅｎｏｍｅ ｃｏｕｐｌｅ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ－ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２１（６）：６５２～６５９を参照されたい）。マウスＢＡＣ ｂＭＱ－４２５Ｋ１１からのＤＮＡを相同組み換えによって改変して、マウスＣＤ３ε、ＣＤ３δ、及びＣＤ３γ遺伝子（染色体９上で互いにごく近接して位置するマウスＣＤ３遺伝子）の部分をコードするゲノムＤＮＡを、ヒトＢＡＣ ＲＰ１１－４１４Ｇ２１（ヒトＣＤ３遺伝子は、染色体１１上で互いにごく近接して位置している）に由来するＣＤ３ε、ＣＤ３δ、及びＣＤ３γ遺伝子の対応する部分とそれぞれ置換した。
具体的には、ヒト化ＣＤ３γδεマウスを生成するために、マウスホモロジーアームを使用するＳｐｅｃカセットを含む標的化ベクターを使用する単一の標的化事象においてマウスＣｄ３ｄ配列の７１４ｂｐ（Ｃｄ３ｄ遺伝子のマウスコーディングエクソン２～３の部分配列に対応）をヒトＣＤ３Ｄ配列の９３９ｂｐ（ＣＤ３Ｄ遺伝子のヒトコーディングエクソン２～３の部分配列に対応）と置換することにより、マウスＢＡＣをまず改変した。
ＣＤ３ｄ遺伝子のマウスコーディングエクソン２～３の部分配列の、対応するヒト配列との置換を含むマウスＢＡＣを、また別のＳｐｅｃカセット含有ベクター及びマウスホモロジーアームを使用する単一の標的化事象において、続けてマウスＣｄ３ｇ配列の１，７３８ｂｐ（Ｃｄ３ｇ遺伝子のマウスコーディングエクソン２～４の部分配列に対応）の、ヒトＣＤ３Ｇ配列の１，６３９ｂｐ（ＣＤ３Ｇ遺伝子のヒトコーディングエクソン２～４の部分配列に対応）との置換によって改変した。
最後に、マウスＣＤ３ｄ及びＣＤ３ｇ遺伝子の、対応するヒト遺伝子との置換を含むＢＡＣを、６，２１３ｂｐマウスＣＤ３ｅ配列の、ヒト配列の６，８１７ｂｐとの置換によって（マウスＣＤ３ｅ遺伝子のマウスコーディングエクソン２～４の部分配列の、ヒトＣＤ３Ｅ遺伝子のヒトコーディングエクソン２～５の部分配列との置換に対応）、更に改変した。４，９９６ｂｐのｌｏｘＰが導入されたネオマイシンカセットを、ヒトＣＤ３Ｅ配列のノックインの上流に挿入した。
結果として得られるＥＳ細胞に挿入するためのヒト化された大型標的化ベクターは、図２Ａに示されており、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、及びＧは、様々なマウス／ヒト又はマウス／ＮＥＯカセット又はヒト／ＮＥＯカセットの接合部を示している。接合部における配列を、下の表１に示す。
そのＴ細胞の表面にヒト化ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、及びＣＤ３γを発現するマウスを生成するための改変されたＥＳ細胞を作製するために、標的化ＢＡＣ ＤＮＡを使用して、マウスＣＤ３遺伝子座内に欠失を含むマウスＥＳ細胞を電気穿孔した。ヒトＣＤ３ε、ＣＤ３δ、及びＣＤ３γ配列の挿入を含むＥＳ細胞を、定量ＴＡＱＭＡＮ（商標）アッセイによって同定した（例えば、参照により本明細書に援用されるＬｉｅ ａｎｄ Ｐｅｔｒｏｐｏｕｌｏｓ，１９９８．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：４３～４８を参照）。特定のプライマーセット及びプローブを、ヒト配列の挿入（ｇａｉｎ－ｏｆ－ａｌｌｅｌｅ、ＧＯＡ）及びマウス配列の欠失（ｌｏｓｓ－ｏｆ－ａｌｌｅｌｅ、ＬＯＡ）の検出のために設計した。表２は、定量ＰＣＲアッセイで使用されるプライマー／プローブセットのそれぞれの名前及び位置を識別する。
上記の標的化ＥＳ細胞をドナーＥＳ細胞として使用し、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）法によって８細胞段階マウス胚に導入した（例えば、米国特許第７，２９４，７５４号及びＰｏｕｅｙｍｉｒｏｕ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｆ０ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ
ｍｉｃｅ ｔｈａｔ ａｒｅ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｆｕｌｌｙ ｄｅｒｉｖｅｄ
ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｄｏｎｏｒ ｇｅｎｅ－ｔａｒｇｅｔｅｄ ＥＳ ｃｅｌｌｓ ａｌｌｏｗｉｎｇ ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ａｎａｌｙｓｅｓ Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２５（１）：９１～９９を参照）。ヒト化ＣＤ３遺伝子を独立して有するＶＥＬＯＣＩＭＩＣＥ（登録商標）（ドナーＥＳ細胞に完全に由来するＦ０マウス）は、特異的なヒトＣＤ３遺伝子配列の存在を検出する対立遺伝子アッセイ（上記参照）の改変を使用した遺伝子型判定によって同定した。
選択カセットは、当業者によって既知の方法で除去され得る。例えば、ヒト化ＣＤ３遺伝子座を有するＥＳ細胞は、ｌｏｘＰが導入されたカセットを除去するためにＣｒｅを発現する構築物でトランスフェクトされ得る。選択カセットは、Ｃｒｅリコンビナーゼを発現するマウスとの交配によって任意追加的に除去することができる。所望により、選択カセットをマウス内に保持する。選択カセット除去後のヒト化ＣＤ３ε対立遺伝子のマウス／ヒト接合部（図２ＢにＡ－Ｂとして示される）は、下の表３に示される。残りの接合部配列は、標的化ベクターの場合と同じであり、上の表１に示されている。
結果として得られるヒト化ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、及びＣＤ３γタンパク質の配列は、図３に示され、配列表に含まれている。加えて、マウス－ヒト配列のアライメント及び挿入されたヒト配列の５’及び３’の接合部は、それぞれ＊及び＊＊として図４に示されている。ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、及びＣＤ３γタンパク質のＧｅｎＢａｎｋタンパク質アクセッション番号は、下の表４にまとめられている。
実施例２．ヒト化ＣＤ３マウスの特性化
実施例２．１．ヒト化ＣＤ３マウスにおける免疫細胞の発生
蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）分析及び細胞分画を使用して、ヒトＣＤ３εδγマウスの胸腺及び末梢での免疫細胞の発生を評価した。野生型（ＷＴ、非ヒトＣＤ３γδε）、ヘテロ接合（Ｈｅｔ、１つのｈＣＤ３γδε対立遺伝子）、及びホモ接合（Ｈｏ、２つのｈＣＤ３γδε対立遺伝子）マウスの同時発生集団から胸腺、脾臓、及びリンパ節を回収した。末梢血を、ＥＤＴＡコーティングしたＭｉｃｒｏｔａｉｎｅｒ管（ＢＤ）内に心臓穿刺又は眼窩後方出血によって得た。機械的破壊を使用して脾臓、ＬＮ、及び胸腺から単一細胞懸濁液を調製し、ＡＫＣ Ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒを用いた溶解によって脾臓、胸腺、及び全血から赤血球を除去した。Ｆｃ受容体による非特異的結合をブロックするために、ＣＤ１６／ＣＤ３２（ＦｃＢｌｏｃｋ）に対する精製された抗体を用いて、細胞を室温で１０分間インキュベートし、それから、Ｔ及びＢ細胞マーカーに直接結合された抗体のカクテルを用いて、４℃で３０分間インキュベートした。細胞を、１％ ＢＳＡを含有する冷却ＰＢＳで２回洗浄し、緩衝液に再懸濁させ、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ ＩＩ（商標）フローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上のフローサイトメトリーで分析した。胸腺細胞を、まず、前方及び側方散乱ゲーティングによって、次にＢ２２０－集団でのゲーティングによって同定した。末梢では、Ｔ細胞をＣＤ４５＋／ＴＣＲｂ＋／Ｂ２２０－として同定し、Ｂ細胞をＣＤ４５＋／ＴＣＲｂ－／Ｂ２２０＋として同定した。絶対計数を、Ｈｅｍａｖｅｔ ９５０ＦＳ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ Ａｎａｌｙｚｅｒで得た。
図５Ａ及び５Ｂに例証するように、ヒト化ＣＤ３γδεマウスは、正常な胸腺細胞の発生及び胸腺、末梢血、及び脾臓において正常なＴ細胞及びＢ細胞の割合を有するように見えた。加えて、Ｔ及びＢ細胞のパーセンテージは、リンパ節で正常に見え、脾臓及びリンパ節の絶対細胞計数（データは図示せず）は正常範囲内であった。血液中のＣＤ４及びＣＤ８細胞数は、ＷＴ、Ｈｅｔ、及びＨｏマウス間で同様であった。循環白血球、リンパ球、単球、好中球、好酸球、及び好塩基球は全て正常範囲内に見えた（データは図示せず）。したがって、正常な免疫細胞の発生が、ヒト化ＣＤ３εδγマウスにおいて観察される。
ヒト化ＣＤ３εδγマウスが、ポリクローナルＶβＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞のレパートリーを呈したかどうかを判定するために、脾細胞を４種類のヒト化マウス、及び５種類の系統を一致させたコントロールマウスから分離し、ＴＣＲ Ｖβの利用について検査した。脾臓を回収し、単一細胞の脾細胞を上述のように調製した。Ｆｃ受容体による非特異的結合をブロックするために、ＣＤ１６／ＣＤ３２（ＦｃＢｌｏｃｋ；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）に対する精製された抗体を用いて、細胞を室温で１０分間インキュベートし、それから、マウスＣＤ４（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）及びマウスＣＤ８（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）に直接結合された抗体のカクテルを用いて、再懸濁した。ＴＣＲ Ｖβに直接結合された抗体を次に個々のウェルに添加し、４℃で３０分間インキュベートした。細胞を冷却ＰＢＳで洗浄し、生存率判定用染料（ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ Ｆｉｘａｂｌｅ Ａｑｕａ Ｄｅａｄ ｃｅｌｌ ｓｔａｉｎ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて室温で１５分間インキュベートした。細胞を、２％ ＦＢＳを含有する冷却ＰＢＳで洗浄し、次に緩衝液に再懸濁させ、ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａ（商標）フローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上のフローサイトメトリーで分析する前に、ＢＤ固定化緩衝液で固定した。ＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞を、まず、前方及び側方散乱ゲーティングによって、次に生存集団でのゲーティングによって同定した。ＣＤ４Ｔ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ８－）及びＣＤ８Ｔ細胞（ＣＤ４－ＣＤ８＋）を次にＴＣＲ Ｖβの利用について検査した。
図５Ｃからわかるように、ＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞の両方によって使用されるＶβレパートリー（この細胞は、ヒト化ＣＤ３εδγマウス中にある）は、系統を一致させたコントロールマウスと著しい違いのない利用による多クローン性を示す。
実施例２．２．ヒト化ＣＤ３マウスでの感染に対するＴ細胞の応答
ヒト化ＣＤ３マウス（ヒト化ＣＤ３γδεマウス）が感染に対して正常な応答を呈したかどうかを判定するために、ヒト化マウスのリンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）を取り除く能力を試験した。ＬＣＭＶは、マウス指向性ウイルスであり、感染の成り行きはウイルスの株に依存する。Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ株による感染は、急性の感染をもたらし、マウスは、ウイルスに対するＴ細胞応答を迅速に開始し、約１週間で感染を取り除くことができる。他方では、クローン１３ウイルスを取り除くことはできず、Ｔ細胞は「疲弊」になり、慢性感染を確立する。慢性及び急性感染は両方とも、Ｔ細胞活性に依存するので、ＬＣＭＶは、Ｔ細胞の機能を試験するには理想のモデルである。
生後６～８週のヒト化ＣＤ３又は系統を一致させたコントロールマウスを、２×１０５ｆｆｕのＡｒｍｓｔｒｏｎｇ（腹腔内投与）及び／又はクローン１３の感染のために２×１０６ｆｆｕのクローン１３（静脈内投与）に感染させ、感染の２週間後に脾臓を回収し、ウイルス力価をプラークアッセイにより測定した。ウイルスの力価は、コントロール及びｈｕＣＤ３マウスの両方で同様であった（図６Ａ）。このことは、Ｔ－細胞がマウスの両系統で類似のレベルまでウイルスを制御できるので、ＣＤ３のヒト化は、Ｔ－細胞の疲弊表現型に影響がなかったことを示す。Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ株の感染に関しては、初期のＡｍｓｔｒｏｎｇ株の感染の２週間後に、マウスをクローン１３でチャレンジさせ、クローン１３チャレンジの２週間後のウイルス力価を脾臓内で測定した。ウイルスは、コントロール又はヒト化ＣＤ３マウスのどちらでも検出されなかった（図６Ｂ）。このデータは、急性Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ感染が取り除かれたことを示唆している。加えて、これは、両方の系統のマウスにおいてＡｒｍｓｔｒｏｎｇ感染から誘導されたＴ－細胞の記憶が、マウスを後続のクローン１３の感染から保護するのに十分であったことを実証している。
実施例３．抗ＣＤ３系治療候補を試験するためのモデルとしてのヒト化ＣＤ３マウス
実施例３．３．カニクイザル交差反応性抗ヒトＣＤ３抗体を試験するためのヒト化ＣＤ３マウス
特別なヒトに限定された、又はカニクイザル交差反応性抗ＣＤ３抗体の、野生型（ＷＴ）又はヒト化ＣＤ３γδε（Ｈｏ＝ホモ接合、Ｈｅｔ＝ヘテロ接合）マウスの脾細胞と結合する能力を、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）分析を使用して試験した。
新鮮分離した脾細胞（ウェルあたり２×１０５）を、抗ＣＤ３抗体（１５μｇ／ｍＬを用いて、４℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を２回洗浄し、適切な二次抗体（例えば、蛍光のタグを付けたＰＥ抗ヒトＩｇＧ及びＴ細胞マーカーに直接結合された抗体）を添加し、４℃で更に３０分間インキュベートしてから、２回洗浄した。次の抗体を使用した。ａｈ／ｍｆＣＤ３－２及びａｈ／ｍｆＣＤ３－１は、ヒト及びサルＣＤ３の両方を認識する２つの抗体であり、ａｈＣＤ３－２及びａｈＣＤ３－１は、ヒトＣＤ３だけを認識する２つの抗体であり、ａｍＣＤ３－２Ｃ１１は、マウスＣＤ３だけを認識する抗体であり、コントロールヒトＩｇＧは、無関係のコントロール抗体であり、２番目だけは、コントロールのみの二次抗体である。細胞を、１％ ＢＳＡを含有する冷却ＰＢＳで２回洗浄し、緩衝液に再懸濁させ、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ ＩＩ（商標）フローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上のフローサイトメトリーで分析した。Ｔ細胞を、ＣＤ４５＋／ＴＣＲｂ＋／Ｂ２２０－として同定した。ｈＩｇＧ１を含有するように遺伝子操作を受けた抗ｍＣＤ３－２Ｃ１１を使用して、ＷＴマウス脾細胞上のＴ細胞を同定した。
図７に例証するように、ヒトＣＤ３だけを認識する抗ＣＤ３抗体は、ヒト化ＣＤ３γδεマウスの脾細胞の表面でＣＤ３と結合することができ、同様にヒト及びサルＣＤ３を認識する抗ＣＤ３抗体は、ヒト化ＣＤ３γδεマウスの表面でＣＤ３と結合することができた。したがって、３つのＣＤ３ε、ＣＤ３δ、及びＣＤ３γの全てについてヒト化されたマウスは、カニクイザルでの有効性及び毒性の研究によって追跡調査することができるＣＤ３系薬物候補の早期の非臨床試験に関係するものである。
実施例３．２．ヒト化ＣＤ３マウスにおけるＴ細胞活性化
抗ヒトＣＤ３抗体の、ヒト化ＣＤ３マウスにおいて免疫応答を誘導する能力を試験した。ＣＤ３γδε（２／群のｎ）についてヒト化されたマウスに、特別なヒトに限定された、又はカニクイザル交差反応性抗ＣＤ３抗体（全てのｈＩｇＧ１）１０μｇを腹腔内注射した。細胞構成及び血漿サイトカインレベルを得るために、注射２時間後に開始して血液を眼窩後方洞からＥＤＴＡコーティングしたＭｉｃｒｏｔａｉｎｅｒ管（ＢＤ）内に引き込んだ。末梢Ｔ及びＢ細胞の数をＦＡＣＳによって評価した。簡潔に、全血５０ｕＬを、Ｔ及びＢ細胞マーカーに直接結合された抗体のカクテルを用いて、４℃で３０分間インキュベートした。ＡＫＣ Ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒを用いた溶解によって赤血球を除去し、標識した細胞を、１％ＢＳＡを含有する冷却ＰＢＳで１回洗浄した。洗浄後、細胞を冷却緩衝液に再懸濁させ、ＦＡＣＳＣＡＮＴＯ ＩＩ（商標）フローサイトメーター（ＢＤ
Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上のフローサイトメトリーで分析した。Ｔ細胞を生存ＣＤ４５＋／ＴＣＲｂ＋／Ｂ２２０－として同定し、Ｂ細胞を生存ＣＤ４５＋／ＴＣＲｂ－／Ｂ２２０＋として同定した。既知量のＣｏｕｎｔＢｒｉｇｈｔ（商標）Ａｂｓｏｌｕｔｅ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｂｅａｄｓを添加することによって絶対細胞計数を測定した。Ｍｏｕｓｅ ＰｒｏＩｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ７－Ｐｌｅｘ Ｕｌｔｒａ－Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｋｉｔ（Ｍｅｓｏ－Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）を使用して、注射２時間後に採取した血液から血漿サイトカインレベルを評価した。
図８Ａに例証するように、抗ＣＤ３抗体１０μｇの注射は、一時的なＴ及びＢ細胞の喪失を誘発し、それは初期の抗体処置後４日後までに大きく回復した。加えて、抗ＣＤ３抗体の注射（ヒトＣＤ３（ａｈＣＤ３－１及びａｈＣＤ３－３）だけを認識する抗ＣＤ３抗体、並びにヒト及びサルＣＤ３（ａｈ／ｍｆＣＤ３－１及びａｈ／ｍｆＣＤ３－２）を両方認識する抗ＣＤ３抗体の両方）は、ＣＤ３γδεヒト化マウスにおけるサイトカイン産生を誘発した（図８Ｂ）。
加えて、抗ヒトＣＤ３、抗ヒト／カニクイザルＣＤ３、又は抗マウス抗体の、野生型又はヒト化ＣＤ３γδεマウスから得られた脾細胞の増殖を誘発する能力をＡＴＰ触媒定量（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏ（登録商標））を使用して評価した。マウス脾細胞の活性化は、サイトカインの放出をもたらし、それは細胞増殖を推進する。増殖データを次の実験計画書を使用して取得した。野生型（ＷＴ）又はヒト化ホモ接合ＣＤ３γδε（ｈＣＤ３γδεＨｏ）に由来する脾細胞（５×１０５／ウェル）を、ヒトに限定された、カニクイザル交差反応性、又はマウス特異的抗ＣＤ３抗体の量を減少させて４℃で一晩コーティングしていた９６ウェルプレートに添加した。５００ｎｇ／ｍＬの抗マウスＣＤ２８を培養物に添加し、プレートを３７℃で７２時間インキュベートした。インキュベーションに続いて、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏ（登録商標）を添加し、ＶＩＣＴＯＲ Ｘ５マルチラベルプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して輝度を測定した。Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ））を使用して、ＥＣ５０の細胞生存性（ＡＴＰ触媒定量）を測定した。４パラメータ非線形回帰分析を使用して、値を計算した。
図９に例証するように、ヒト化ＣＤ３γδεマウスの脾細胞をカニクイザル交差性ＣＤ３抗体によって増殖するように誘導した。
ＷＴ及びＣＤ３γδεマウスの様々な特性の概要を図１０に示す。見られるように、ＣＤ３γδεマウスのリンパ球は、抗ヒトＣＤ３抗体と結合し、抗ヒトＣＤ３抗体、特にサルＣＤ３と交差反応することが知られているもの、に応答することができる。このことは、薬物候補の非臨床試験が多くの場合、カニクイザルのような大型動物で行われるので、治療薬にとって重要な態様である。
実施例３．３．ヒト化ＣＤ３マウスにおける腫瘍喪失の研究
ＣＤ３遺伝子座でヒト化されたマウスを、ＣＤ２０遺伝子座でヒト化されたマウスと交配することによって、ＣＤ３（上述のヒト化ＣＤ３γδεマウス）及びＣＤ２０の両方について二重にヒト化されたマウスを創出した。得られた動物は、両方のヒト化タンパク質を発現した。具体的には、ヒト化ＣＤ２０マウスを創出するために、マウスＭｓ４ａ１（Ｃｄ２０）全コード領域の２番目のアミノ酸（１番目はＭｅｔであり共通している）から１６７ｂｐ下流の３’非翻訳領域まで、スパン９３１２ｂｐ（マウス１９番染色体）を、対応するＣＤ２０ヒトコード領域の２番目のアミノ酸から１０７ｂｐ下流の３’非翻訳領域まで、スパン８４８２ｂｐ（ヒト１１番染色体）と置換した。マウス及びヒトＣＤ２０は両方とも、６個のエクソンを有する。後述の実験で使用される動物は、ＣＤ３とＣＤ２０遺伝子座両方での置換についてはホモ接合であり、また個々の遺伝子座で改変されたマウスを交配することによって創出された。
ヒト化ＣＤ３／ＣＤ２０マウスの皮下にヒトＣＤ２０が導入された２×１０５のＢ１６Ｆ１０．９黒色腫腫瘍細胞を移植した。０日目（腫瘍移植の日）に開始して、溶媒（ＰＢＳ；ｎ＝５）、０．４ｍｇ／ｋｇのコントロールＡｂ ２（ＣＤ２０抗原に交差反応性を示さないコントロール抗体；ｎ＝５）、０．４ｍｇ／ｋｇのＡｂ１（抗ＣＤ３／ＣＤ２０二重特異性抗体、２０１４年８月７日公開の国際公開第２０１４１２１０８７（Ａ１）号を参照、Ｎ＝５）、又は０．００４ｍｇ／ｋｇのＡｂ１（ｎ＝５）のいずれも週２回マウスに腹腔内処置をした。腫瘍体積を、図１１Ａに示されるように測定した。腫瘍が約１５００ｍｍ３を超える体積に達すると、マウスを犠牲にした。図１１Ａに例証されるように、腫瘍移植により処置を同時に開始したとき、Ａｂ １による処置は、腫瘍の成長を遅延させた。
別個の実験において、Ａｂ １の、既に定着した腫瘍における腫瘍成長を阻害する能力もまた試験した（図１１Ｂ）。ヒト化ＣＤ３／ＣＤ２０マウスの皮下にヒトＣＤ２０を発現する２×１０５のＢ１６Ｆ１０．９黒色腫腫瘍細胞を移植した。腫瘍移植後１０日目に、マウスを腫瘍のサイズに基づきランダム化し、各群５匹のマウスを含む次の処置群に分けた。溶媒（ＰＢＳ）、４ｍｇ／ｋｇのコントロールＡｂ ２（ＣＤ２０抗原に交差反応性を示さないコントロール抗体）、４ｍｇ／ｋｇのＡｂ１、０．４ｍｇ／ｋｇのＡｂ １．全てのマウスを週２回腹腔内処置した。腫瘍が約１５００ｍｍ３を超える体積に達すると、マウスを犠牲にした。図１１Ｂに例証されるように、Ａｂ １による処置は、既に定着した腫瘍における腫瘍成長を遅延させた。このことは、ヒト化ＣＤ３マウスが早期の薬物候補研究にとって有利であることを示している。
等価物
当業者は、単に日常的な実験を使用して、本明細書に記載の発明の特定の実施形態の多くの等価物を認識するか、確認することが可能であろう。かかる等価物は、以下の「特許請求の範囲」によって包含されることが意図される。
本願を通して引用される全ての非特許文献、アクセッション番号、ウェブサイトなど、特許出願及び特許の内容全体は、あたかも個々に示されたかのようにあらゆる目的のために同じ程度まで全体にわたり参照により本明細書に援用される。アクセッション番号又はその他の引用が、異なる時期に異なる内容と関連する場合、有効な出願日に有効な内容が意味されるものであって、その有効な出願日とは、その引用を参照する優先権出願の最も早い出願日であり、又はない場合は実際の出願日である。
任意の実施形態の文脈から特に明らかではない限り、態様、要素、特徴、工程など互いと組み合わせることができる。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
ヒトＣＤ３タンパク質の細胞外ドメインをコードするために遺伝子改変された内在性非ヒトＣＤ３遺伝子座を含み、前記ヒトＣＤ３タンパク質がＣＤ３ε、ＣＤ３δ、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、又はそれらの任意の組み合わせである、遺伝子改変非ヒト動物。
（項目２）
前記内在性非ヒトＣＤ３遺伝子座が、ヒトＣＤ３εの細胞外ドメイン、ヒトＣＤ３δの細胞外ドメイン、及びヒトＣＤ３γの細胞外ドメインをコードするために遺伝子改変される、項目１に記載の動物。
（項目３）
前記内在性非ヒトＣＤ３遺伝子座が、前記ヒトＣＤ３タンパク質に対応する非ヒトＣＤ３タンパク質の機能性細胞外ドメインを発現しないように遺伝子改変される、項目１又は２に記載の動物。
（項目４）
前記内在性遺伝子座が、前記内在性非ヒト動物のＣＤ３タンパク質の膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを更にコードし、前記動物が、そのＴ細胞の表面に、前記ヒトＣＤ３タンパク質の前記細胞外ドメインと、前記内在性非ヒト動物ＣＤ３タンパク質の前記膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインと、を含むキメラＣＤ３タンパク質を発現する、項目１に記載の動物。
（項目５）
前記動物が、
内在性ＣＤ３ε遺伝子座において、前記内在性非ヒト動物のＣＤ３εの膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインをコードする核酸配列に作動可能に連結されたヒトＣＤ３εの細胞外ドメインをコードする核酸配列と、
内在性ＣＤ３δ遺伝子座において、前記内在性非ヒト動物のＣＤ３δタンパク質の膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインをコードする核酸配列に作動可能に連結されたヒトＣＤ３δの細胞外ドメインをコードする核酸配列と、
内在性ＣＤ３γ遺伝子座において、内在性非ヒト動物ＣＤ３γのＣＤ３γタンパク質の膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインをコードする核酸配列に作動可能に連結されたヒトＣＤ３γの細胞外ドメインをコードする核酸配列と、を含み、
前記非ヒト動物が、そのＴ細胞の前記表面に、キメラＣＤ３ε、ＣＤ３δ、及びＣＤ３γタンパク質を発現する、項目２に記載の動物。
（項目６）
前記動物が、配列番号３３、配列番号３４、及び配列番号３５の配列を含むヒトＣＤ３タンパク質の細胞外ドメインを含む、項目１～５のいずれか一項に記載の動物。
（項目７）
前記動物が哺乳類である、項目１～６のいずれか一項に記載の動物。
（項目８）
前記動物がげっ歯類である、項目１～７のいずれか一項に記載の動物。
（項目９）
前記動物がマウスである、項目８に記載の動物。
（項目１０）
前記マウスが、
内在性マウスＣＤ３ε遺伝子座において、内在性マウスＣＤ３εの膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインをコードする核酸配列に作動可能に連結されたヒトＣＤ３εの細胞外ドメインをコードする核酸配列と、
内在性マウスＣＤ３δ遺伝子座において、内在性マウスＣＤ３δの膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインをコードする核酸配列に作動可能に連結されたヒトＣＤ３δの細胞外ドメインをコードする核酸配列と、
内在性マウスＣＤ３γ遺伝子座において、内在性マウスＣＤ３γの膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインをコードする核酸配列に作動可能に連結されたヒトＣＤ３γの細胞外ドメインをコードする核酸配列と、を含み、
前記マウスが、そのＴ細胞の前記表面にキメラＣＤ３ε、ＣＤ３δ、及びＣＤ３γタンパク質を発現する、項目９に記載のマウス。
（項目１１）
前記キメラＣＤ３εタンパク質の前記アミノ酸配列が、配列番号２４に示され、前記キメラＣＤ３δタンパク質の前記アミノ酸配列が、配列番号２５に示され、前記キメラＣＤ３γタンパク質の前記アミノ酸配列が、配列番号２６に示されている、項目１０に記載のマウス。
（項目１２）
前記改変された内在性非ヒトＣＤ３遺伝子座がヘテロ接合である、項目１～１１のいずれか一項に記載の動物。
（項目１３）
前記改変された内在性非ヒトＣＤ３遺伝子座がホモ接合である、項目１～１１のいずれか一項に記載の動物。
（項目１４）
項目１～１３のいずれか一項に定義されるような遺伝子改変非ヒト動物を作製する方法であって、
ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、又はそれらの任意の組み合わせであるヒトＣＤ３タンパク質の細胞外ドメインをコードする核酸配列を、内在性ＣＤ３遺伝子座において非ヒト動物の細胞のゲノムに導入することと、
前記遺伝子改変非ヒト動物を前記細胞から繁殖させることと、を含む方法。
（項目１５）
前記細胞が、単一ＥＳ細胞であり、前記単一ＥＳ細胞をマウス胚に導入してマウスを繁殖させる、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
抗原結合タンパク質がＣＤ３と所望の非マウス抗原の両方に結合することができる、ＣＤ３系二重特異性抗原結合タンパク質を試験するためのマウスモデルであって、ヒトＣＤ３タンパク質の細胞外ドメインをコードするために遺伝子改変されたマウスを含み、前記ヒトＣＤ３タンパク質が、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、又はそれらの任意の組み合わせであり、前記所望の非マウス抗原を発現する細胞を含むか又は前記所望の非マウス抗原を含む、マウスモデル。
（項目１７）
前記マウスが、項目１～１６のいずれか一項により定義されるとおりである、項目１６に記載のマウスモデル。
（項目１８）
ａ．項目１～１７のいずれか一項に定義されるような遺伝子改変マウスに前記所望の抗原を導入することと、
ｂ．前記マウスを所望の薬物候補と接触させることであって、前記薬物候補が前記ヒトＣＤ３及び前記所望の抗原に対するものであることと、
ｃ．前記薬物候補が、前記所望の抗原の存在又は発現を特徴とする細胞を予防、低減又は排除することに効果があるかどうかを判定することと、を含む、所望の抗原を標的にする薬物候補のスクリーニング方法。
（項目１９）
前記導入する工程が、前記マウスで前記所望の抗原を発現することを含む、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記導入する工程が、前記マウスに前記所望の抗原を感染させることを含む、項目１８又は１９に記載の方法。
（項目２１）
前記マウスで前記所望の抗原を発現する工程が、前記所望の抗原を発現するように前記マウスを遺伝子改変することを含む、項目１９に記載の方法。
（項目２２）
前記導入する工程が、前記マウスに前記所望の抗原を発現する細胞を導入することを含む、項目１８～２１のいずれか一項に記載の方法。
（項目２３）
前記細胞が腫瘍細胞である、項目１６又は２２に記載の方法又はマウスモデル。
（項目２４）
前記細胞が細菌細胞である、項目１６又は２２に記載の方法又はマウスモデル。
（項目２５）
前記感染させることが、ウイルス又は細菌感染を実行することを含む、項目２０に記載の方法。
（項目２６）
前記マウスが免疫応答性マウスである、項目１６～２５のいずれか一項に記載の方法又はマウスモデル。
（項目２７）
前記所望の抗原が腫瘍関連抗原である、項目１６～２６のいずれか一項に記載の方法又はマウスモデル。
（項目２８）
前記腫瘍関連抗原が、ＡＬＫ、ＢＡＧＥタンパク質、ＢＩＲＣ５（サバイビン）、ＢＩＲＣ７、ＣＡ９、ＣＡＬＲ、ＣＣＲ５、ＣＤ１９、ＣＤ２０（ＭＳ４Ａ１）、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７９、ＣＤＫ４、ＣＥＡＣＡＭ３、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ変異体ＩＩＩ、ＥＲＢＢ２（ＨＥＲ２）、ＥＲＢＢ３、ＥＲＢＢ４、ＥＰＣＡＭ、ＥＰＨＡ２、ＥＰＨＡ３、ＦＣＲＬ５、ＦＬＴ３、ＦＯＬＲ１、ＧＡＧＥタンパク質、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＰＮＭＢ、ＧＭ３、ＧＰＲ１１２、ＩＬ３ＲＡ、ＫＩＴ、ＫＲＡＳ、ＬＧＲ５、ＥＢＶ由来のＬＭＰ２、Ｌ１ＣＡＭ、ＭＡＧＥタンパク質、ＭＬＡＮＡ、ＭＳＬＮ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５、ＭＵＣ１６、ＭＵＭ１、ＡＮＫＲＤ３０Ａ、ＮＹ－ＥＳＯ１（ＣＴＡＧ１Ｂ）、ＯＸ４０、ＰＡＰ、ＰＡＸ３、ＰＡＸ５、ＰＬＡＣ１、ＰＲＬＲ、ＰＭＥＬ、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＭＡ（ＦＯＬＨ１）、ＲＡＧＥタンパク質、ＲＥＴ、ＲＧＳ５、ＲＯＲ１、ＳＡＲＴ１、ＳＡＲＴ３、ＳＬＡＭＦ７、ＳＬＣ３９Ａ６（ＬＩＶ１）、ＳＴＥＡＰ１、ＳＴＥＡＰ２、ＴＥＲＴ、ＴＭＰＲＳＳ２、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ－ｎｏｕｖｅｌｌｅ抗原、ＴＮＦＲＳＦ１７、ＴＹＲ、ＵＰＫ３Ａ、ＶＴＣＮ１、及びＷＴ１からなる群から選択される、項目２７に記載の方法又はマウスモデル。
（項目２９）
前記所望の抗原が感染症抗原である、項目１６～２６のいずれか一項に記載の方法又はマウスモデル。
（項目３０）
前記感染症抗原がウイルス抗原である、項目２９に記載の方法又はマウスモデル。
（項目３１）
前記ウイルス抗原が、ＨＩＶ；Ａ型肝炎；Ｂ型肝炎；Ｃ型肝炎；ＨＳＶ－１、ＨＳＶ－２、ＣＭＶ、ＨＡＶ－６、ＶＺＶ、エプスタインバールウイルスなどのヘルペスウイルス；アデノウイルス；インフルエンザウイルス；フラビウイルス；エコーウイルス；ライノウイルス；コクサッキーウイルス；コロナウイルス；呼吸器合胞体ウイルス；ムンプスウイルス；ロタウイルス；麻疹ウイルス；風疹ウイルス；パルボウイルス；ワクシニアウイルス；ＨＴＬＶ；デングウイルス；パピローマウイルス；水いぼウイルス；ポリオウイルス；狂犬病ウイルス；ＪＣウイルス；エボラウイルス、及びアルボウイルス脳炎のウイルス抗原からなる群から選択される、項目３０に記載の方法又はマウスモデル。
（項目３２）
前記感染症抗原が細菌性抗原である、項目２９に記載の方法又はマウスモデル。
（項目３３）
前記細菌性抗原が、クラミジア、リケッチア、マイコバクテリア、ブドウ球菌、連鎖球菌、肺炎球菌、髄膜炎菌、淋菌、クレブシエラ、プロテウス、セラチア、シュードモナス、レジオネラ菌、ジフテリア、サルモネラ、桿菌、コレラ、破傷風、ボツリズム、炭疽、ペスト、レプトスピラ、及びライム病の細菌性抗原からなる群から選択される、項目３２に記載の方法又はマウスモデル。
（項目３４）
前記薬物候補が抗体である、項目１８～３３のいずれか一項に記載の方法。
（項目３５）
前記薬物候補が抗原結合タンパク質である、項目１８～３３のいずれか一項に記載の方法。
（項目３６）
前記薬物候補が、二重特異性抗体又は二重特異性抗原結合タンパク質である、項目３４又は３５に記載の方法。
（項目３７）
前記二重特異性抗体又は前記二重特異性抗原結合タンパク質が、ヒトＣＤ３タンパク質と前記所望の抗原の両方に結合することができる、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
前記薬物候補が、サルＣＤ３タンパク質を認識することができる、項目１８～３７のいずれか一項に記載の方法。
（項目３９）
前記薬物候補が、前記所望の抗原を標的としない作用物質と比較して腫瘍の増殖を低減、排除、又は予防することができる、項目２３に記載の方法。
（項目４０）
前記判定する工程が、腫瘍体積アッセイを含む、項目２３に記載の方法。
（項目４１）
前記判定する工程が、Ｔ細胞媒介性腫瘍細胞キリングアッセイを含む、項目２３に記載の方法。
（項目４２）
前記薬物候補が、前記所望の抗原を標的としない作用物質と比較して細菌又はウイルスの感染を低減、排除、又は予防することができる、項目２５に記載の方法。
（項目４３）
前記判定する工程が、ウイルス又は細菌の力価の測定を含む、項目２５に記載の方法。（項目４４）
前記所望の抗原が、所望のヒト抗原である、項目１６～１８に記載の方法又はマウスモデル。
別の態様では、本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目Ａ１）
ヒトＣＤ３εの細胞外ドメイン、ヒトＣＤ３δの細胞外ドメイン、及びヒトＣＤ３γの細胞外ドメインに遺伝子改変された内在性非ヒトＣＤ３遺伝子座を含む、遺伝子改変非ヒト動物。
（項目Ａ３）
前記内在性非ヒトＣＤ３遺伝子座が、前記ヒトＣＤ３タンパク質に対応する非ヒトＣＤ３タンパク質の機能性細胞外ドメインを発現しないように遺伝子改変される、項目Ａ１又は２に記載の動物。
（項目Ａ５）
前記動物が、
内在性ＣＤ３ε遺伝子座において、前記内在性非ヒト動物のＣＤ３εの膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインをコードする核酸配列に作動可能に連結されたヒトＣＤ３εの細胞外ドメインをコードする核酸配列と、
内在性ＣＤ３δ遺伝子座において、前記内在性非ヒト動物のＣＤ３δタンパク質の膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインをコードする核酸配列に作動可能に連結されたヒトＣＤ３δの細胞外ドメインをコードする核酸配列と、
内在性ＣＤ３γ遺伝子座において、内在性非ヒト動物ＣＤ３γのＣＤ３γタンパク質の膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインをコードする核酸配列に作動可能に連結されたヒトＣＤ３γの細胞外ドメインをコードする核酸配列と、を含み、
前記非ヒト動物が、そのＴ細胞の前記表面に、キメラＣＤ３ε、ＣＤ３δ、及びＣＤ３γタンパク質を発現する、項目Ａ１に記載の動物。
（項目Ａ６）
前記動物が、配列番号３３、配列番号３４、及び配列番号３５の配列を含むヒトＣＤ３タンパク質の細胞外ドメインを含む、項目Ａ１～５のいずれか一項に記載の動物。
（項目Ａ７）
前記動物が哺乳類である、項目Ａ１～６のいずれか一項に記載の動物。
（項目Ａ８）
前記動物がげっ歯類である、項目Ａ１～７のいずれか一項に記載の動物。
（項目Ａ９）
前記動物がマウスである、項目Ａ８に記載の動物。
（項目Ａ１０）
前記マウスが、
内在性マウスＣＤ３ε遺伝子座において、内在性マウスＣＤ３εの膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインをコードする核酸配列に作動可能に連結されたヒトＣＤ３εの細胞外ドメインをコードする核酸配列と、
内在性マウスＣＤ３δ遺伝子座において、内在性マウスＣＤ３δの膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインをコードする核酸配列に作動可能に連結されたヒトＣＤ３δの細胞外ドメインをコードする核酸配列と、
内在性マウスＣＤ３γ遺伝子座において、内在性マウスＣＤ３γの膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインをコードする核酸配列に作動可能に連結されたヒトＣＤ３γの細胞外ドメインをコードする核酸配列と、を含み、
前記マウスが、そのＴ細胞の前記表面にキメラＣＤ３ε、ＣＤ３δ、及びＣＤ３γタンパク質を発現する、項目Ａ９に記載のマウス。
（項目Ａ１１）
前記キメラＣＤ３εタンパク質の前記アミノ酸配列が、配列番号２４に示され、前記キメラＣＤ３δタンパク質の前記アミノ酸配列が、配列番号２５に示され、前記キメラＣＤ３γタンパク質の前記アミノ酸配列が、配列番号２６に示されている、項目Ａ１０に記載のマウス。
（項目Ａ１２）
前記改変された内在性非ヒトＣＤ３遺伝子座がヘテロ接合である、項目Ａ１～１１のいずれか一項に記載の動物。
（項目Ａ１３）
前記改変された内在性非ヒトＣＤ３遺伝子座がホモ接合である、項目Ａ１～１１のいずれか一項に記載の動物。
（項目Ａ１４）
項目Ａ１～１３のいずれか一項に記載の遺伝子改変非ヒト動物を作成する方法であって、
ヒトＣＤ３ε、ＣＤ３δ、及びＣＤ３γの細胞外ドメインをコードする核酸配列を、内在性ＣＤ３遺伝子座において非ヒト動物の細胞のゲノムに導入することと、
前記遺伝子改変非ヒト動物を前記細胞から繁殖させることと、を含む方法。
（項目Ａ１５）
前記細胞が、単一ＥＳ細胞であり、前記単一ＥＳ細胞をマウス胚に導入してマウスを繁殖させる、項目Ａ１４に記載の方法。
（項目Ａ１６）
抗原結合タンパク質がＣＤ３と所望の非マウス抗原の両方に結合することができる、ＣＤ３系二重特異性抗原結合タンパク質を試験するためのマウスモデルであって、ヒトＣＤ３ε、ＣＤ３δ、及びＣＤ３γの細胞外ドメインをコードするために遺伝子改変されたマウスを含み、前記所望の非マウス抗原を発現する細胞を含むか又は前記所望の非マウス抗原を含む、マウスモデル。
（項目Ａ１７）
前記マウスが項目Ａ１～１６のいずれか一項に記載される、項目Ａ１６に記載のマウスモデル。
（項目Ａ１８）
ａ．前記所望の抗原を、項目Ａ１～１７のいずれか一項に記載の遺伝子改変マウスに導入することと、
ｂ．前記マウスを所望の薬物候補と接触させることであって、前記薬物候補が前記ヒトＣＤ３及び前記所望の抗原に対するものであることと、
ｃ．前記薬物候補が、前記所望の抗原の存在又は発現を特徴とする細胞を予防、低減又は排除することに効果があるかどうかを判定することと、を含む、所望の抗原を標的にする薬物候補のスクリーニング方法。
（項目Ａ１９）
前記導入する工程が、前記マウスで前記所望の抗原発現させることを含む、項目Ａ１８に記載の方法。
（項目Ａ２０）
前記導入する工程が、前記マウスに前記所望の抗原を感染させることを含む、項目Ａ１８又は１９に記載の方法。
（項目Ａ２１）
前記マウスで前記所望の抗原を発現する工程が、前記所望の抗原を発現するように前記マウスを遺伝子改変することを含む、項目Ａ１９に記載の方法。
（項目Ａ２２）
前記導入する工程が、前記マウスに前記所望の抗原を発現している細胞を導入することを含む、項目Ａ１８～２１のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ａ２３）
前記細胞が腫瘍細胞である、項目Ａ１６又は２２に記載の方法又はマウスモデル。
（項目Ａ２４）
前記細胞が細菌細胞である、項目Ａ１６又は２２に記載の方法又はマウスモデル。
（項目Ａ２５）
前記感染させることが、ウイルス感染又は細菌感染を行うことを含む、項目Ａ２０に記載の方法。
（項目Ａ２６）
前記マウスが免疫応答性マウスである、項目Ａ１６～２５のいずれか一項に記載の方法又はマウスモデル。
（項目Ａ２７）
前記所望の抗原が、腫瘍関連抗原である、項目Ａ１６～２６のいずれか一項に記載の方法又はマウスモデル。
（項目Ａ２８）
前記腫瘍関連抗原が、ＡＬＫ、ＢＡＬＥタンパク質、ＢＩＲＣ５（サバイビン）、ＢＩＲＣ７、ＣＡ９、ＣＡＬＲ、ＣＣＲ５、ＣＤ１９、ＣＤ２０（ＭＳ４Ａ１）、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７９、ＣＤＫ４、ＣＥＡＣＡＭ３、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ変異体ＩＩＩ、ＥＲＢＢ２（ＨＥＲ２）、ＥＲＢＢ３、ＥＲＢＢ４、ＥＰＣＡＭ、ＥＰＨＡ２、ＥＰＨＡ３、ＦＣＲＬ５、ＦＬＴ３、ＦＯＬＲ１、ＧＡＧＥタンパク質、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＰＮＭＢ、ＧＭ３、ＧＰＲ１１２、ＩＬ３ＲＡ、ＫＩＴ、ＫＲＡＳ、ＬＧＲ５、ＥＢＶ由来のＬＭＰ２、Ｌ１ＣＡＭ、ＭＡＧＥタンパク質、ＭＬＡＮＡ、ＭＳＬＮ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５、ＭＵＣ１６、ＭＵＭ１、ＡＮＫＲＤ３０Ａ、ＮＹ－ＥＳ０１（ＣＴＡＧ１Ｂ）、０Ｘ４０、ＰＡＰ、ＰＡＸ３、ＰＡＸ５、ＰＬＡＣ１、ＰＲＬＲ、ＰＭＥＬ、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＭＡ（ＦＯＬＨ１）、ＲＡＧＥタンパク質、ＲＥＴ、ＲＧＳ５、ＲＯＲ１、ＳＡＲＴ１、ＳＡＲＴ３、ＳＬＡＭＦ７、ＳＬＣ３９Ａ６（ＬＩＶ１）、ＳＴＥＡＰ１、ＳＴＥＡＰ２、ＴＥＲＴ、ＴＭＰＲＳＳ２、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ－ｎｏｕｖｅｌｌｅ抗原、ＴＮＦＲＳＦ１７、ＴＹＲ、ＵＰＫ３Ａ、ＶＴＣＮ１、及びＷＴ１からなる群から選択される、項目Ａ２７に記載の方法又はマウスモデル。
（項目Ａ２９）
前記所望の抗原が、感染症抗原である、項目Ａ１６～２６のいずれか一項に記載の方法又はマウスモデル。
（項目Ａ３０）
前記感染症抗原がウイルス抗原である、項目Ａ２９に記載の方法又はマウスモデル。
（項目Ａ３１）
前記ウイルス抗原が、ＨＩＶ、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ヘルペスウイルス、例えば、ＨＳＶ－１、ＨＳＶ－２、ＣＭＶ、ＨＡＶ－６、ＶＺＶ、及びエプスタインバールウイルス、アデノウイルス、インフルエンザウイルス、フラビウイルス、エコーウイルス、ライノウイルス、コクサッキーウイルス、コロナウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、ムンプスウイルス、ロタウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、パルボウイルス、ワクシニアウイルス、ＨＴＬＶ、デングウイルス、パピローマウイルス、水いぼウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、ＪＣウイルス、エボラウイルス、並びにアルボウイルス脳炎のウイルス抗原からなる群から選択される、項目Ａ３０に記載の方法又はマウスモデル。
（項目Ａ３２）
前記感染症抗原が細菌性抗原である、項目Ａ２９に記載の方法又はマウスモデル。
（項目Ａ３３）
前記細菌性抗原が、クラミジア、リケッチア、マイコバクテリア、ブドウ球菌、連鎖球菌、肺炎球菌、髄膜炎菌、淋菌、クレブシエラ、プロテウス、セラチア、シュードモナス、レジオネラ菌、ジフテリア、サルモネラ、桿菌、コレラ、破傷風、ボツリズム、炭疽、ペスト、レプトスピラ、及びライム病の細菌性抗原からなる群から選択される、項目Ａ３２に記載の方法又はマウスモデル。
（項目Ａ３４）
前記薬物候補が抗体である、項目Ａ１８～３３のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ａ３５）
前記薬物候補が抗原結合タンパク質である、項目Ａ１８～３３のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ａ３６）
前記薬物候補が二重特異性抗体又は二重特異性抗原結合タンパク質である、項目Ａ３４又は３５に記載の方法。
（項目Ａ３７）
前記二重特異性抗体又は前記二重特異性抗原結合タンパク質が、ヒトＣＤ３タンパク質と前記所望の抗原の両方に結合することができる、項目Ａ３６に記載の方法。
（項目Ａ３８）
前記薬物候補が、サルＣＤ３タンパク質を認識することができる、項目Ａ１８～３７のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ａ３９）
前記薬物候補が、前記所望の抗原を標的としない作用物質と比較して腫瘍の増殖を低減、排除、又は予防することができる、項目Ａ２３に記載の方法。
（項目Ａ４０）
前記判定する工程が、腫瘍体積アッセイを含む、項目Ａ２３に記載の方法。
（項目Ａ４１）
前記判定する工程が、Ｔ細胞媒介性腫瘍細胞キリングアッセイを含む、項目Ａ２３に記載の方法。
（項目Ａ４２）
前記薬物候補が、前記所望の抗原を標的としない作用物質と比較して細菌又はウイルスの感染を低減、排除、又は予防することができる、項目Ａ２５に記載の方法。
（項目Ａ４３）
前記判定する工程が、ウイルス又は細菌の力価の測定を含む、項目Ａ２５に記載の方法。
（項目Ａ４４）
前記所望の抗原が所望のヒト抗原である、項目Ａ１６～１８のいずれか一項に記載の方法又はマウスモデル。

Claims (16)

  1. （ａ）内在性げっ歯類ＣＤ３ε遺伝子座において、ヒトＣＤ３εの細胞外ドメインを含む機能性キメラヒト／げっ歯類ＣＤ３εタンパク質をコードする核酸配列、
    （ｂ）内在性げっ歯類ＣＤ３δ遺伝子座において、ヒトＣＤ３δの細胞外ドメインを含む機能性キメラヒト／げっ歯類ＣＤ３δタンパク質をコードする核酸配列、及び
    （ｃ）内在性げっ歯類ＣＤ３γ遺伝子座において、ヒトＣＤ３γの細胞外ドメインを含む機能性キメラヒト／げっ歯類ＣＤ３γタンパク質をコードする核酸配列
    を含む、遺伝子改変されたげっ歯類胚性幹（ＥＳ）細胞であって、
    前記げっ歯類がラット又はマウスであり、前記齧歯類ＥＳ細胞が、改変された内在性げっ歯類ＣＤ３遺伝子座についてヘテロ接合である、ＥＳ細胞。
  2. 前記内在性げっ歯類ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、及びＣＤ３γ遺伝子座は、内在性げっ歯類ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、及びＣＤ３γの機能性細胞外ドメインをコードする配列が欠損している、請求項１に記載のＥＳ細胞。
  3. （ａ）前記機能性キメラヒト／げっ歯類ＣＤ３εタンパク質をコードする前記核酸配列は、対応する内在性げっ歯類ＣＤ３εタンパク質をコードする核酸配列を置換する、
    （ｂ）前記機能性キメラヒト／げっ歯類ＣＤ３δタンパク質をコードする前記核酸配列は、対応する内在性げっ歯類ＣＤ３δタンパク質をコードする核酸配列を置換する、及び
    （ｃ）前記機能性キメラヒト／げっ歯類ＣＤ３γタンパク質をコードする前記核酸配列は、対応する内在性げっ歯類ＣＤ３γタンパク質をコードする核酸配列を置換する、請求項１又は２に記載のＥＳ細胞。
  4. （ａ）前記機能性キメラヒト／げっ歯類ＣＤ３εタンパク質が、配列番号３３のアミノ酸配列を含む、
    （ｂ）前記機能性キメラヒト／げっ歯類ＣＤ３δタンパク質が、配列番号３４のアミノ酸配列を含む、及び
    （ｃ）前記機能性キメラヒト／げっ歯類ＣＤ３γタンパク質が、配列番号３５のアミノ酸配列を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のＥＳ細胞。
  5. 前記げっ歯類がマウスである、請求項１～４のいずれか一項に記載のＥＳ細胞。
  6. （ａ）前記機能性キメラヒト／マウスＣＤ３εタンパク質が配列番号２４に示されるアミノ酸配列を含む、
    （ｂ）前記機能性キメラヒト／マウスＣＤ３δタンパク質が配列番号２５に示されるアミノ酸配列を含む、及び
    （ｃ）前記機能性キメラヒト／マウスＣＤ３γタンパク質が配列番号２６に示されるアミノ酸配列を含む、請求項５に記載のＥＳ細胞。
  7. 請求項１～６のいずれか一項に記載の遺伝子改変されたげっ歯類ＥＳ細胞を繁殖させることを含む、遺伝子改変されたげっ歯類を作製する方法。
  8. 前記ＥＳ細胞がげっ歯類の胚に導入されて前記げっ歯類を生成する、請求項７に記載の方法。
  9. 前記げっ歯類が、（ａ）前記機能性キメラヒト／げっ歯類ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、及びＣＤ３γタンパク質を含み、（ｂ）同じ細胞上に発現する内在性げっ歯類Ｔ細胞受容体と複合体化される、機能性ヒト化ＣＤ３複合体をそのＴ細胞の表面に発現する、請求項７又は請求項８に記載の方法。
  10. 前記ＥＳ細胞のゲノムが、所望の抗原をコードする核酸配列を含むようにさらに改変される、請求項７～９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記所望の抗原が、
    （ａ）腫瘍関連抗原
    （ｂ）感染症抗原、又は
    （ｃ）細菌性抗原
    である、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記腫瘍関連抗原が、ＡＬＫ、ＢＡＧＥタンパク質、ＢＩＲＣ５（サバイビン）、ＢＩＲＣ７、ＣＡ９、ＣＡＬＲ、ＣＣＲ５、ＣＤ１９、ＣＤ２０（ＭＳ４Ａ１）、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７９、ＣＤＫ４、ＣＥＡＣＡＭ３、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ変異体ＩＩＩ、ＥＲＢＢ２（ＨＥＲ２）、ＥＲＢＢ３、ＥＲＢＢ４、ＥＰＣＡＭ、ＥＰＨＡ２、ＥＰＨＡ３、ＦＣＲＬ５、ＦＬＴ３、ＦＯＬＲ１、ＧＡＧＥタンパク質、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＰＮＭＢ、ＧＭ３、ＧＰＲ１１２、ＩＬ３ＲＡ、ＫＩＴ、ＫＲＡＳ、ＬＧＲ５、ＥＢＶ由来のＬＭＰ２、Ｌ１ＣＡＭ、ＭＡＧＥタンパク質、ＭＬＡＮＡ、ＭＳＬＮ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５、ＭＵＣ１６、ＭＵＭ１、ＡＮＫＲＤ３０Ａ、ＮＹ－ＥＳＯ１（ＣＴＡＧ１Ｂ）、ＯＸ４０、ＰＡＰ、ＰＡＸ３、ＰＡＸ５、ＰＬＡＣ１、ＰＲＬＲ、ＰＭＥＬ、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＭＡ（ＦＯＬＨ１）、ＲＡＧＥタンパク質、ＲＥＴ、ＲＧＳ５、ＲＯＲ１、ＳＡＲＴ１、ＳＡＲＴ３、ＳＬＡＭＦ７、ＳＬＣ３９Ａ６（ＬＩＶ１）、ＳＴＥＡＰ１、ＳＴＥＡＰ２、ＴＥＲＴ、ＴＭＰＲＳＳ２、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ－ｎｏｕｖｅｌｌｅ抗原、ＴＮＦＲＳＦ１７、ＴＹＲ、ＵＰＫ３Ａ、ＶＴＣＮ１、及びＷＴ１からなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記感染症抗原がウイルス抗原である、請求項１１に記載の方法。
  14. 前記ウイルス抗原が、ＨＩＶ；Ａ型肝炎；Ｂ型肝炎；Ｃ型肝炎；ヘルペスウイルス；アデノウイルス；インフルエンザウイルス；フラビウイルス；エコーウイルス；ライノウイルス；コクサッキーウイルス；コロナウイルス；呼吸器合胞体ウイルス；ムンプスウイルス；ロタウイルス；麻疹ウイルス；風疹ウイルス；パルボウイルス；ワクシニアウイルス；ＨＴＬＶ；デングウイルス；パピローマウイルス；水いぼウイルス；ポリオウイルス；狂犬病ウイルス；ＪＣウイルス；エボラウイルス、及びアルボウイルス脳炎のウイルス抗原からなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記ヘルペスウイルスが、ＨＳＶ－１、ＨＳＶ－２、ＣＭＶ、ＨＡＶ－６、ＶＺＶ、又はエプスタインバールウイルスである、請求項１４に記載の方法。
  16. 前記細菌性抗原が、クラミジア、リケッチア、マイコバクテリア、ブドウ球菌、連鎖球菌、肺炎球菌、髄膜炎菌、淋菌、クレブシエラ、プロテウス、セラチア、シュードモナス、レジオネラ菌、ジフテリア、サルモネラ、桿菌、コレラ、破傷風、ボツリズム、炭疽、ペスト、レプトスピラ、及びライム病の細菌性抗原からなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
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Families Citing this family (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107105633B (zh) * 2014-11-24 2021-02-12 瑞泽恩制药公司 表达人源化cd3复合物的非人类动物
CA2967834C (en) 2014-12-05 2024-01-16 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals having a humanized cluster of differentiation 47 gene
ES2982515T3 (es) 2014-12-09 2024-10-16 Regeneron Pharma Animales no humanos que tienen un gen del grupo de diferenciación 274 humanizado
US11612149B2 (en) 2015-07-10 2023-03-28 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Non-human animal having human CD3 gene substituted for endogenous CD3 gene
PL3376857T3 (pl) 2015-11-20 2021-09-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Zwierzęta inne niż człowiek posiadające humanizowany gen aktywacji limfocytów 3
SG11201807038UA (en) 2016-02-29 2018-09-27 Regeneron Pharma Rodents having a humanized tmprss gene
US11793180B2 (en) 2016-08-22 2023-10-24 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Gene-modified mouse expressing human GPC3 polypeptide
US11696572B2 (en) * 2017-06-27 2023-07-11 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals comprising a humanized ASGR1 locus
AU2018341685A1 (en) 2017-09-29 2020-04-02 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals expressing humanized C1q complex
US11419318B2 (en) 2017-11-30 2022-08-23 Regeneran Pharmaceuticals, Inc. Genetically modified rat comprising a humanized TRKB locus
WO2019114768A1 (en) * 2017-12-12 2019-06-20 Biocytogen Jiangsu Co., Ltd. GENETICALLY MODIFIED NON-HUMAN ANIMAL WITH HUMAN OR CHIMERIC CD3e
TW202431987A (zh) 2018-03-26 2024-08-16 美商再生元醫藥公司 用於測試治療藥劑之人類化囓齒動物
US10463029B1 (en) * 2018-06-07 2019-11-05 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Rodent model of steel syndrome
IL278267B1 (en) 2018-07-16 2024-10-01 Regeneron Pharma NON-HUMAN ANIMAL MODELS OF DITRA DISEASE AND USES THEREOF
CN109355309B (zh) * 2018-10-18 2021-02-05 江苏集萃药康生物科技股份有限公司 一种cd3e基因修饰人源化动物模型的构建方法
CN112300265B (zh) * 2019-07-29 2022-09-27 百奥赛图(北京)医药科技股份有限公司 Il33基因人源化的非人动物的构建方法和应用
CN114276433A (zh) * 2020-04-01 2022-04-05 百奥赛图(北京)医药科技股份有限公司 Cd38基因人源化的非人动物及其构建方法和应用
CA3176391A1 (en) * 2020-04-24 2021-10-28 Memorial Sloan-Kettering Cancer-Center Anti-cd3 antibodies and uses thereof
EP4240833A1 (en) * 2020-11-06 2023-09-13 BioVentures, LLC T cells and bifunctional protein against human papillomavirus
CN112458117B (zh) * 2021-02-02 2021-05-04 百奥赛图(北京)医药科技股份有限公司 Cd155基因人源化的非人动物的构建方法及应用
EP4294180A1 (en) * 2021-02-19 2023-12-27 Biocytogen Pharmaceuticals (Beijing) Co., Ltd. Genetically modified non-human animal with human or chimeric cd3 genes
US20240277844A1 (en) 2023-02-17 2024-08-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Induced nk cells responsive to cd3/taa bispecific antibodies

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070209083A1 (en) 2001-07-13 2007-09-06 Genoway Cell and transgenic animal modelling human antigenic presentation and their uses
WO2014030049A2 (en) 2012-08-21 2014-02-27 Glaxo Group Limited Compositions comprising a single variable domain and camostat mesylate (cm)
WO2014047231A1 (en) 2012-09-21 2014-03-27 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-cd3 antibodies, bispecific antigen-binding molecules that bind cd3 and cd20, and uses thereof
WO2014056783A1 (en) 2012-10-08 2014-04-17 Roche Glycart Ag Fc-free antibodies comprising two fab-fragments and methods of use
WO2014130671A1 (en) 2013-02-20 2014-08-28 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mice expressing humanized t-cell co-receptors
JP7018314B2 (ja) 2014-11-24 2022-02-10 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド ヒト化ｃｄ３複合体を発現する非ヒト動物

Family Cites Families (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2096749T3 (es) * 1990-12-14 1997-03-16 Cell Genesys Inc Cadenas quimericas para vias de transduccion de señal asociada a un receptor.
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
US6586251B2 (en) 2000-10-31 2003-07-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
ATE347593T1 (de) 2002-01-23 2006-12-15 Univ Utah Res Found Zielgerichtete chromosomale mutagenese mit zinkfingernukleasen
EP1344824A1 (en) * 2002-03-11 2003-09-17 Institut de la Santé et de la Recherche Médicale Mutated gene coding for a LAT protein and the biological applications thereof
US7888121B2 (en) 2003-08-08 2011-02-15 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for targeted cleavage and recombination
UA94211C2 (ru) * 2004-06-03 2011-04-26 Новиммюн С.А. Выделенное полностью человеческое моноклональное cd3 антитело
DK2767161T3 (en) 2004-10-19 2018-05-07 Regeneron Pharma Method of generating an animal homozygous for genetic modification
KR101626988B1 (ko) 2007-04-03 2016-06-02 암젠 리서치 (뮌헨) 게엠베하 종간 특이적 이중특이적인 결합제들
PL2155783T5 (pl) * 2007-04-03 2023-03-13 Amgen Research (Munich) Gmbh Swoista międzygatunkowo domena wiążąca CD3epsilon
HUE040467T2 (hu) * 2007-04-03 2019-03-28 Amgen Res Munich Gmbh Keresztfaj-specifikus kötõdomén
US8632768B2 (en) * 2008-05-30 2014-01-21 University Of Louisville Research Foundation, Inc. Human facilitating cells
CA2738545A1 (en) * 2008-10-01 2010-04-08 Micromet Ag Cross-species-specific pscaxcd3, cd19xcd3, c-metxcd3, endosialinxcd3, epcamxcd3, igf-1rxcd3 or fapalpha xcd3 bispecific single chain antibody
EP2389443B1 (en) * 2009-01-23 2018-11-14 Roger Williams Hospital Retroviral vectors encoding multiple highly homologous non-viral polypeptides and the use of same
RU2425880C2 (ru) * 2009-07-30 2011-08-10 Учреждение Российской академии наук Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН Способ получения трансгенных мышей
US20120117671A1 (en) 2009-07-31 2012-05-10 Hiroyuki Yoneyama Steatohepatitis-liver cancer model animal
US8883496B2 (en) * 2009-12-21 2014-11-11 Regeneron Phamaceuticals, Inc. Humanized FcgR mice
TW201125583A (en) * 2009-12-23 2011-08-01 Bioalliance Cv Anti-EpCAM antibodies that induce apoptosis of cancer cells and methods using same
NZ734532A (en) 2011-10-28 2022-12-23 Regeneron Pharma Genetically modified major histocompatibility complex mice
LT3272214T (lt) 2011-10-28 2020-03-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Genetiškai modifikuotos pelės, ekspresuojančios chimerines pagrindinio audinių dermės komplekso (mhc) ii molekules
RS61455B1 (sr) * 2011-10-28 2021-03-31 Regeneron Pharma Genetski modifikovani miševi t ćelijskog receptora
MY172726A (en) 2011-10-28 2019-12-11 Regeneron Pharma Humanized il-6 and il-6 receptor
WO2014028776A1 (en) * 2012-08-15 2014-02-20 Zyngenia, Inc. Monovalent and multivalent multispecific complexes and uses thereof
CN104797132B (zh) 2012-09-13 2017-06-30 中外制药株式会社 基因敲入非人动物
IL311744A (en) 2012-11-05 2024-05-01 Regeneron Pharma Genetically modified non-human animals and methods of their use
TWI635098B (zh) 2013-02-01 2018-09-11 再生元醫藥公司 含嵌合恆定區之抗體
EP2958937B1 (en) 2013-02-22 2018-08-15 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mice expressing humanized major histocompatibility complex
US20150342163A1 (en) 2013-02-22 2015-12-03 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Genetically modified major histocompatibility complex mice
PL3175706T3 (pl) 2013-09-23 2019-05-31 Regeneron Pharma Zwierzęta inne niż człowiek mające humanizowany gen sygnałowego białka regulatorowego
CN103509122B (zh) * 2013-09-23 2015-04-15 武汉友芝友生物制药有限公司 一种cd3抗原及其制备方法和用途
SG10201900003WA (en) 2013-11-19 2019-02-27 Regeneron Pharma Non-human animals having a humanized b-cell activating factor gene
TWI754319B (zh) 2014-03-19 2022-02-01 美商再生元醫藥公司 用於腫瘤治療之方法及抗體組成物
SI3129400T1 (sl) 2014-04-08 2020-07-31 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Živali, ki niso človek in imajo humanizirane receptorje FC-gama
NO2785538T3 (ja) 2014-05-07 2018-08-04
WO2015179317A2 (en) 2014-05-19 2015-11-26 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Genetically modified non-human animals expressing human epo
SI3157956T1 (sl) 2014-06-19 2020-06-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Nehumane živali, ki imajo humaniziran gen programirane celične smrti 1

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070209083A1 (en) 2001-07-13 2007-09-06 Genoway Cell and transgenic animal modelling human antigenic presentation and their uses
WO2014030049A2 (en) 2012-08-21 2014-02-27 Glaxo Group Limited Compositions comprising a single variable domain and camostat mesylate (cm)
WO2014047231A1 (en) 2012-09-21 2014-03-27 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-cd3 antibodies, bispecific antigen-binding molecules that bind cd3 and cd20, and uses thereof
WO2014056783A1 (en) 2012-10-08 2014-04-17 Roche Glycart Ag Fc-free antibodies comprising two fab-fragments and methods of use
WO2014130671A1 (en) 2013-02-20 2014-08-28 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mice expressing humanized t-cell co-receptors
JP7018314B2 (ja) 2014-11-24 2022-02-10 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド ヒト化ｃｄ３複合体を発現する非ヒト動物
JP7269214B2 (ja) 2014-11-24 2023-05-08 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド ヒト化ｃｄ３複合体を発現する非ヒト動物

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