JP7489134B2 - Ｄ－プシコース３－エピメラーゼ産生菌株及びその使用 - Google Patents
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Description
本発明はＤ－プシコース３－エピメラーゼ産生菌株及びその使用に関し、生物工学の技術分野に属する。
Ｄ－プシコース（Ｄ－ａｌｌｕｌｏｓｅ）はＤ－フルクトースのＣ－３位のエピマーであり、低カロリー甘味料として使用でき、メイラード反応により心地よい味（美味しさ）を生成でき、食品のゲル性を改善することができ、血糖と血中脂質レベルの低下、脂肪蓄積の減少、活性酸素（ＲＯＳ）の除去などの生物調節機能を有する。
２０１４年には、米国食品医薬品局の法規制により、Ｄ－プシコースが一般安全とされ、食品や栄養補助食品、医薬品製剤への添加が認められていた。そのため、Ｄ－プシコースは医薬、食品などの分野で広く応用可能な将来性がある。
Ｄ－プシコースは、自然界に存在する量が極めて少なく、直接抽出することは現実的ではない希少糖である。また、化学合成は副生成物を生成し、分離が困難になり、生産コストを大幅に高め、しかも複雑な反応過程は過度の汚染をもたらす。そのため、現在、Ｄ－プシコースの生産には、主に生物転化法が用いられている。自然抽出法や化学合成法に比べ、生物転化法は反応条件が温和で、特異性が高く、環境に優しいなどの利点がある。生物転化法では、Ｄ－フルクトースをＤ－プシコースに変換することができるＤ－プシコース３－エピメラーゼが重要な役割を果たす。
枯草菌は食品級微生物（ＧＲＡＳ）であり、工業生産に適している。また、それは遺伝背景が明確で、遺伝操作が簡単で成熟しており、規模が拡大しやすく培養しやすいなどの利点があり、Ｄ－プシコース３－エピメラーゼを発酵合成するために好適なプラットフォームである。
本発明の第１目的は目的タンパク質の発現量を向上する発現ベクターであって、ｐＰ４３ＮＭＫプラスミド上のＰ４３プロモーターをｈａｇ、ｙｌｂＰ、ｈａｇＰ４３、ｙｌｂＰｙｌｂＰ、ｈａｇｈａｇのいずれか１つのプロモーターに置換して得られたものであり、
前記プロモーターｈａｇ、ｙｌｂＰ、ｈａｇＰ４３、ｙｌｂＰｙｌｂＰ、ｈａｇｈａｇのヌクレオチド配列がそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６で示される、発現ベクターを提供することである。
前記プロモーターｈａｇ、ｙｌｂＰ、ｈａｇＰ４３、ｙｌｂＰｙｌｂＰ、ｈａｇｈａｇのヌクレオチド配列がそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６で示される、発現ベクターを提供することである。
本発明の一実施形態では、前記目的タンパク質はＤ－プシコース３－エピメラーゼ又はリン酸化グリコシルエピメラーゼであり、前記Ｄ－プシコース３－エピメラーゼのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２０又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２１で示され、前記リン酸化グリコシルエピメラーゼのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２３で示される。
本発明の一実施形態では、前記Ｄ－プシコース３－エピメラーゼをコードするヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１で示される。
本発明の第２目的は、ｐＰ４３ＮＭＫプラスミド上のＰ４３プロモーターが、ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２で示されるｈａｇプロモーターに置換されているとともに、ｈａｇプロモーター配列上の塩基の第１２９位～１３７位が同時に変異している、発現ベクターを提供することである。
本発明の一実施形態では、ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２で示されるｈａｇ配列上の塩基の第１２９位～１３７位のａｇｇｇａｇｇａａ配列が、ｇａｇｇａｇｇａａ（Ｒ２と命名する）、ｇｇｇｇａｇｇａｇ（Ｒ４と命名する）、ａｇｇｇａｇｇａｇ（Ｒ１１と命名する）、ａｇｇｇａｇｇｇｇ（Ｒ１３と命名する）、ａａｇｇａｇｇａｇ（Ｒ１４と命名する）、又はａａｇｇａｇｇｇｇ（Ｒ１５と命名する）に変異している。
本発明の第３目的は、
ｐＰ４３ＮＭＫプラスミド上のＰ４３プロモーターが、ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２で示されるｈａｇプロモーターに置換されているとともに、ｈａｇプロモーター配列上の塩基の第１２９位～１３７位が、ｇｇｇｇａｇｇａｇに同時に変異しており、ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１９のアラニンラセマーゼ遺伝子ｄａｌにより、ｐＰ４３ＮＭＫプラスミド上の耐性遺伝子カナマイシンＫａｎが代替された、又は、ｐＵＢ１１０プラスミド上のＰ４３プロモーターが、ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２で示されるｈａｇプロモーターに置換されているとともに、ｈａｇプロモーター配列上の塩基の第１２９位～１３７位が、ｇｇｇｇａｇｇａｇに同時に変異しており、ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１９のアラニンラセマーゼ遺伝子ｄａｌにより、ｐＵＢ１１０プラスミド上の耐性遺伝子カナマイシンＫａｎ及びブレオマイシンＢｌｍが代替されたものである無耐性発現ベクターを提供することである。
ｐＰ４３ＮＭＫプラスミド上のＰ４３プロモーターが、ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２で示されるｈａｇプロモーターに置換されているとともに、ｈａｇプロモーター配列上の塩基の第１２９位～１３７位が、ｇｇｇｇａｇｇａｇに同時に変異しており、ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１９のアラニンラセマーゼ遺伝子ｄａｌにより、ｐＰ４３ＮＭＫプラスミド上の耐性遺伝子カナマイシンＫａｎが代替された、又は、ｐＵＢ１１０プラスミド上のＰ４３プロモーターが、ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２で示されるｈａｇプロモーターに置換されているとともに、ｈａｇプロモーター配列上の塩基の第１２９位～１３７位が、ｇｇｇｇａｇｇａｇに同時に変異しており、ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１９のアラニンラセマーゼ遺伝子ｄａｌにより、ｐＵＢ１１０プラスミド上の耐性遺伝子カナマイシンＫａｎ及びブレオマイシンＢｌｍが代替されたものである無耐性発現ベクターを提供することである。
本発明の一実施形態では、前記発現ベクターが、アラニンラセマーゼ遺伝子ｄａｌにより、耐性遺伝子カナマイシンＫａｎ及びブレオマイシンＢｌｍを代替して、スクリーニングマーカーであるコピー可能プラスミドｐＵＢ－ｈａｇ－ＲＢＳ４－ｄｐｅ－ｄａｌにし、アラニンラセマーゼ遺伝子ｄａｌにより、耐性遺伝子カナマイシンＫａｎを代替して、スクリーニングマーカーであるコピー可能プラスミドｐＰ４３ＮＭＫ－ｈａｇ－ＲＢＳ４－ｄｐｅ－ｄａｌにする。
本発明の一実施形態では、アラニンラセマーゼ遺伝子ｄａｌのヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１９で示される。
本発明の第３目的は、上記発現ベクターを含む組換え細胞を提供することである。
本発明の一実施形態では、前記組換え細胞は細菌又は真菌を発現宿主とする。
本発明の一実施形態では、前記組換え細胞は枯草菌ＷＢ８００又は枯草菌１Ａ７５１を発現宿主とする。
本発明の第４目的は上記ベクターを発現ベクター、枯草菌ＷＢ８００又は枯草菌１Ａ７５１を発現宿主として、Ｄ－プシコース３－エピメラーゼを発現させる組換え枯草菌を提供することである。
本発明の一実施形態では、前記Ｄ－プシコース３－エピメラーゼ遺伝子をコードするヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１で示される。
本発明の第５目的は、組換え枯草菌であって、目的遺伝子を担持した発現ベクターをアラニンラセマーゼ遺伝子ノックアウト枯草菌に導入して得るものであり、前記発現ベクターは、
ｐＰ４３ＮＭＫプラスミド上のＰ４３プロモーターが、ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２で示されるｈａｇプロモーターに置換されているとともに、ｈａｇプロモーター配列上の塩基の第１２９位～１３７位が、ｇｇｇｇａｇｇａｇに同時に変異している、又は
ｐＰ４３ＮＭＫプラスミド上のＰ４３プロモーターが、ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２で示されるｈａｇプロモーターに置換されているとともに、ｈａｇプロモーター配列上の塩基の第１２９位～１３７位が、ｇｇｇｇａｇｇａｇに同時に変異しており、ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１９のアラニンラセマーゼ遺伝子ｄａｌにより、ｐＰ４３ＮＭＫプラスミド上の耐性遺伝子カナマイシンＫａｎが代替された、又は、
ｐＵＢ１１０プラスミド上のＰ４３プロモーターが、ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２で示されるｈａｇプロモーターに置換されているとともに、ｈａｇプロモーター配列上の塩基の第１２９位～１３７位が、ｇｇｇｇａｇｇａｇに同時に変異しており、ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１９のアラニンラセマーゼ遺伝子ｄａｌにより、ｐＵＢ１１０プラスミド上の耐性遺伝子カナマイシンＫａｎ及びブレオマイシンＢｌｍが代替されたものである、組換え枯草菌を提供することである。
ｐＰ４３ＮＭＫプラスミド上のＰ４３プロモーターが、ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２で示されるｈａｇプロモーターに置換されているとともに、ｈａｇプロモーター配列上の塩基の第１２９位～１３７位が、ｇｇｇｇａｇｇａｇに同時に変異している、又は
ｐＰ４３ＮＭＫプラスミド上のＰ４３プロモーターが、ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２で示されるｈａｇプロモーターに置換されているとともに、ｈａｇプロモーター配列上の塩基の第１２９位～１３７位が、ｇｇｇｇａｇｇａｇに同時に変異しており、ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１９のアラニンラセマーゼ遺伝子ｄａｌにより、ｐＰ４３ＮＭＫプラスミド上の耐性遺伝子カナマイシンＫａｎが代替された、又は、
ｐＵＢ１１０プラスミド上のＰ４３プロモーターが、ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２で示されるｈａｇプロモーターに置換されているとともに、ｈａｇプロモーター配列上の塩基の第１２９位～１３７位が、ｇｇｇｇａｇｇａｇに同時に変異しており、ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１９のアラニンラセマーゼ遺伝子ｄａｌにより、ｐＵＢ１１０プラスミド上の耐性遺伝子カナマイシンＫａｎ及びブレオマイシンＢｌｍが代替されたものである、組換え枯草菌を提供することである。
本発明の一実施形態では、前記組換え枯草菌はアラニンラセマーゼ遺伝子ノックアウト枯草菌１Ａ７５１、枯草菌ＷＢ６００又は枯草菌ＷＢ８００を発現宿主とする。
本発明の一実施形態では、前記発現宿主は枯草菌１Ａ７５１であり、前記アラニンラセマーゼ遺伝子ノックアウト枯草菌は枯草菌１Ａ７５１Δｄａｌである。
本発明の一実施形態では、本発明に使用される枯草菌１Ａ７５１Δｄａｌ、すなわち枯草菌１Ａ７５１染色体上のＤ－アラニンラセマーゼ遺伝子ｄａｌをノックアウトしたものは、従来、発明者ら（ラボ前期）で構築されたものである（構築方法は特許：江波、沐万孟、何偉偉、張涛．Ｃｒｅ／ｌｏｘ系統に基づく無耐性遺伝子染色体に組み込むＤ－プシコース３－エピメラーゼ発現組換え枯草菌の構築方法［Ｐ］、及び開示番号ＣＮ１０４９４６５７７Ａの中国発明特許の出願文献を参照）。
本発明の第６目的は、上記発現ベクターを用いて発現させるＤ－プシコース３－エピメラーゼ発現量の向上方法を提供することである。
本発明の第７目的は、Ｄ－プシコース３－エピメラーゼを担持した組換え枯草菌から菌体を得て、菌体からＤ－プシコース３－エピメラーゼを単離するＤ－プシコース３－エピメラーゼ産生方法を提供することである。
本発明の第８目的は、上記製造した組換えＤ－プシコース３－エピメラーゼを、フルクトース含有反応系に添加して反応させ、反応液を得て、反応液からＤ－プシコースを単離する、Ｄ－プシコースの生産方法を提供することである。
本発明の一実施形態では、前記組換え細胞又は組換え枯草菌の発酵液において、組換えＤ－プシコース３－エピメラーゼの酵素活性が、少なくとも１５．６７Ｕ／ｍＬである。
本発明の第９目的は、上記Ｄ－プシコース３－エピメラーゼを担持した組換え枯草菌の、Ｄ－プシコース又はＤ－プシコースを含有する製品の製造における使用を提供することである。
本発明の一実施形態では、前記製品は食品、医薬品又は化粧品である。
有利な効果
（１）本発明は、プロモータースクリーニング及びそのＲＢＳ最適化によるＤ－プシコース３－エピメラーゼ発現量の向上方法を提供する。本発明によるベクターｐＰ４３ＮＭＫ－ｈａｇ及びｐＰ４３ＮＭＫ－ｈａｇ－ＲＢＳ４で構築された組換え枯草菌は、目的遺伝子Ｄ－プシコース３－エピメラーゼの酵素活性を向上させ、改変後の酵素活性はそれぞれ元のｐＰ４３ＮＭＫ－Ｐ４３／Ｂ． Ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＷＢ８００の１．３０倍及び１．６９倍、ｐＰ４３ＮＭＫ－ＨｐａＩＩ／Ｂ． Ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＷＢ８００の１．７７倍及び２．２９倍である。
（２）本発明は、一般な宿主菌よりも安全でＤ－プシコースの工業的生産に適している食品等級のＤプシコース３－エピメラーゼを発現させた組換え枯草菌を提供する。
（１）本発明は、プロモータースクリーニング及びそのＲＢＳ最適化によるＤ－プシコース３－エピメラーゼ発現量の向上方法を提供する。本発明によるベクターｐＰ４３ＮＭＫ－ｈａｇ及びｐＰ４３ＮＭＫ－ｈａｇ－ＲＢＳ４で構築された組換え枯草菌は、目的遺伝子Ｄ－プシコース３－エピメラーゼの酵素活性を向上させ、改変後の酵素活性はそれぞれ元のｐＰ４３ＮＭＫ－Ｐ４３／Ｂ． Ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＷＢ８００の１．３０倍及び１．６９倍、ｐＰ４３ＮＭＫ－ＨｐａＩＩ／Ｂ． Ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＷＢ８００の１．７７倍及び２．２９倍である。
（２）本発明は、一般な宿主菌よりも安全でＤ－プシコースの工業的生産に適している食品等級のＤプシコース３－エピメラーゼを発現させた組換え枯草菌を提供する。
以下の実施例に係るｐＰ４３ＮＭＫプラスミドは、武漢▲みゃお▼霊生物社（Wuhan miaolingbio bioscience & technology co.,ltd）より購入したものであり、下記の実施例に係る大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＤＨ５αは、通用生物技術有限公司（Generalbiol）より購入したものであり、下記の実施例に係る枯草菌ＷＢ８００は、ＮＴＣＣ典型培養物寄託センターより購入したものである。
下記の実施例に係る枯草菌１Ａ７５１Δｄａｌ、即ち枯草菌１Ａ７５１の染色体上のＤ－アラニンラセマーゼ遺伝子ｄａｌをノックアウトしたものの構築方法は特許：江波、沐万孟、何偉偉、張涛．Ｃｒｅ／ｌｏｘ系統に基づく無耐性遺伝子染色体に組み込むＤ－プシコース３－エピメラーゼ発現組換え枯草菌の構築方法［Ｐ］、及び開示番号ＣＮ１０４９４６５７７Ａの中国発明特許の出願文献を参照する。
下記実施例に係るＤ－プシコース３－エピメラーゼについては、本発明では、ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１で示されるＤ－プシコース３－エピメラーゼを例として本発明の技術的効果を説明するが、本発明の実施例はこれらに制限されるものではなく、なお、本発明のアミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２０又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２１で示されるＤ－プシコース３－エピメラーゼ、又はコドン最適化若しくは突然変異改変を受けた配列も本発明の技術的効果を奏しうる。
下記実施例に係る培地は以下のとおりである。
ＬＢ液体培地：トリプシン１０ｇ／Ｌ、酵母抽出物５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１０ｇ／Ｌ、ｐＨ自然。
ＬＢ固体培地：トリプシン１０ｇ／Ｌ、酵母抽出物５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１０ｇ／Ｌ、寒天粉１５ｇ／Ｌ。
発酵培地：ブドウ糖１５ｇ／Ｌ、酵母抽出物２０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム８ｇ／Ｌ、リン酸水素二ナトリウム・十ニ水和物１ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム7水和物１ｇ／Ｌ、ｐＨ７．０。
ＬＢ液体培地：トリプシン１０ｇ／Ｌ、酵母抽出物５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１０ｇ／Ｌ、ｐＨ自然。
ＬＢ固体培地：トリプシン１０ｇ／Ｌ、酵母抽出物５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１０ｇ／Ｌ、寒天粉１５ｇ／Ｌ。
発酵培地：ブドウ糖１５ｇ／Ｌ、酵母抽出物２０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム８ｇ／Ｌ、リン酸水素二ナトリウム・十ニ水和物１ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム7水和物１ｇ／Ｌ、ｐＨ７．０。
下記実施例に係る検出方法は以下のとおりである。
Ｄ－プシコース３－エピメラーゼ酵素活性の測定方法：反応系１ｍＬにリン酸塩緩衝液（５０ ｍＭ、ｐＨ７．０）で溶解した１００ｇ／ＬのＤ－フルクトース８００μＬ、発酵液２００μＬを加え、５５℃で１０ｍｉｎ保温した後、１０ｍｉｎ沸騰させて酵素反応を停止する。
ＨＰＬＣによってＤ－プシコースの生成量を検出し、酵素活性を算出する。酵素活性単位の定義（Ｕ）：１分あたり１μｍｏｌのＤ－プシコースを触媒により産生するのに必要な酵素量は１酵素活性単位とする。
酵素活性（Ｕ／ｍＬ）＝反応系中に産生されたプシコース量（ｍｇ／ｍＬ）＊１ｍＬ＊１０００／１８０／１０／０．２。
Ｄ－プシコース３－エピメラーゼ酵素活性の測定方法：反応系１ｍＬにリン酸塩緩衝液（５０ ｍＭ、ｐＨ７．０）で溶解した１００ｇ／ＬのＤ－フルクトース８００μＬ、発酵液２００μＬを加え、５５℃で１０ｍｉｎ保温した後、１０ｍｉｎ沸騰させて酵素反応を停止する。
ＨＰＬＣによってＤ－プシコースの生成量を検出し、酵素活性を算出する。酵素活性単位の定義（Ｕ）：１分あたり１μｍｏｌのＤ－プシコースを触媒により産生するのに必要な酵素量は１酵素活性単位とする。
酵素活性（Ｕ／ｍＬ）＝反応系中に産生されたプシコース量（ｍｇ／ｍＬ）＊１ｍＬ＊１０００／１８０／１０／０．２。
実施例１：各プロモーターを含有する組換え枯草菌の構築
具体的な操作ステップ：
（１）Ｄ－プシコース３－エピメラーゼ遺伝子の取得：人工合成ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１で示される。
（２）各プロモーター遺伝子の取得：使用されるプロモーターはｈａｇ、ｙｌｂＰ、ｈａｇＰ４３、ｙｌｂＰｙｌｂＰ、ｈａｇｈａｇ、ａｍｙＥ、ａｐｒＥ、ｇｓｉＢ、ＨｐａＩＩ、ｎｐｒＥ、ｓｉｇＸ、Ｐ４３ｈａｇ、ｙｌｂＰｈａｇ、ｈａｇｙｌｂＰ、ｙｌｂＰＰ４３、Ｐ４３ｙｌｂＰ、Ｐ４３Ｐ４３であり、そのヌクレオチド配列はそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２～ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１８で示される。
シングルプロモーターでは、ＨｐａＩＩがＰＭＡ５プラスミドをテンプレートとしてクローニングされたことを除き、残りのシングルプロモーターは全てＢ． Ｓｕｂｔｉｌｉｓ １６８をテンプレートとしてＰＣＲ増幅を行い、デュアルプロモーターはシングルプロモーターのベクターをテンプレートとして、融合ＰＣＲ（Fusion PCR）による増幅を行うことにより得ることができる。
（３）Ｄ－プシコース３－エピメラーゼの遺伝子とプロモーターの遺伝子を融合ＰＣＲにより融合した後、融合後の断片とＰ４３プロモーター遺伝子を除去した線状化ｐＰ４３ＮＭＫプラスミドとを相同組換え酵素Ｅｘｎａｓｅ IIで連結し、連結産物（ライゲーション産物）を得た。連結産物を大腸菌ＤＨ５αコンピテント細胞に形質転換した。形質転換した大腸菌ＤＨ５αコンピテント細胞をＬＢ固体培地（１００μｇ・ｍＬ－１アンピシリン含有）に塗布し、３７℃で１２ｈ倒置培養した。陽性形質転換体を選択してプラスミドを抽出し、シーケンシングにより検証して正しい場合、組換えプラスミドｐＰ４３ＮＭＫ－Ｐｒｏｍｏｔｅｒ－ｄｐｅを取得した。取得した組換えプラスミドｐＰ４３ＮＭＫ－Ｐｒｏｍｏｔｅｒ－ｄｐｅをＢ． Ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＷＢ８００コンピテント細胞に導入し、形質転換産物を得た。形質転換産物をＬＢ固体培地（１００μｇ・ｍＬ－１カナマイシン含有）に塗布し、３７℃の恒温インキュベータにて１２ｈ倒置培養し、形質転換体を得た。形質転換体についてＰＣＲ検証を行った結果、正しい場合、組換え枯草菌を取得した。
B. subtilis WB800/pP43NMK-hag-dpe、B. subtilis WB800/pP43NMK-ylbP -dpe、B. subtilis WB800/pP43NMK-hagP43-dpe、B. subtilis WB800/pP43NMK-ylbPylbP-dpe、B. subtilis WB800/pP43NMK-haghag-dpe、B. subtilis WB800/pP43NMK-amyE-dpe、B. subtilis WB800/pP43NMK-aprE-dpe、B. subtilis WB800/pP43NMK-gsiB-dpe、B. subtilis WB800/pP43NMK-HpaII-dpe、B. subtilis WB800/pP43NMK-nprE-dpe、B. subtilis WB800/pP43NMK-sigX-dpe、B. subtilis WB800/pP43NMK-P43hag-dpe、B. subtilis WB800/pP43NMK-ylbPhag-dpe、B. subtilis WB800/pP43NMK-hagylbP-dpe、B. subtilis WB800/pP43NMK-ylbPP43-dpe、B. subtilis WB800/pP43NMK-P43ylbP-dpe、B. subtilis WB800/pP43NMK-P43P43-dpeがそれぞれ調製された。
具体的な操作ステップ：
（１）Ｄ－プシコース３－エピメラーゼ遺伝子の取得：人工合成ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１で示される。
（２）各プロモーター遺伝子の取得：使用されるプロモーターはｈａｇ、ｙｌｂＰ、ｈａｇＰ４３、ｙｌｂＰｙｌｂＰ、ｈａｇｈａｇ、ａｍｙＥ、ａｐｒＥ、ｇｓｉＢ、ＨｐａＩＩ、ｎｐｒＥ、ｓｉｇＸ、Ｐ４３ｈａｇ、ｙｌｂＰｈａｇ、ｈａｇｙｌｂＰ、ｙｌｂＰＰ４３、Ｐ４３ｙｌｂＰ、Ｐ４３Ｐ４３であり、そのヌクレオチド配列はそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２～ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１８で示される。
シングルプロモーターでは、ＨｐａＩＩがＰＭＡ５プラスミドをテンプレートとしてクローニングされたことを除き、残りのシングルプロモーターは全てＢ． Ｓｕｂｔｉｌｉｓ １６８をテンプレートとしてＰＣＲ増幅を行い、デュアルプロモーターはシングルプロモーターのベクターをテンプレートとして、融合ＰＣＲ（Fusion PCR）による増幅を行うことにより得ることができる。
（３）Ｄ－プシコース３－エピメラーゼの遺伝子とプロモーターの遺伝子を融合ＰＣＲにより融合した後、融合後の断片とＰ４３プロモーター遺伝子を除去した線状化ｐＰ４３ＮＭＫプラスミドとを相同組換え酵素Ｅｘｎａｓｅ IIで連結し、連結産物（ライゲーション産物）を得た。連結産物を大腸菌ＤＨ５αコンピテント細胞に形質転換した。形質転換した大腸菌ＤＨ５αコンピテント細胞をＬＢ固体培地（１００μｇ・ｍＬ－１アンピシリン含有）に塗布し、３７℃で１２ｈ倒置培養した。陽性形質転換体を選択してプラスミドを抽出し、シーケンシングにより検証して正しい場合、組換えプラスミドｐＰ４３ＮＭＫ－Ｐｒｏｍｏｔｅｒ－ｄｐｅを取得した。取得した組換えプラスミドｐＰ４３ＮＭＫ－Ｐｒｏｍｏｔｅｒ－ｄｐｅをＢ． Ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＷＢ８００コンピテント細胞に導入し、形質転換産物を得た。形質転換産物をＬＢ固体培地（１００μｇ・ｍＬ－１カナマイシン含有）に塗布し、３７℃の恒温インキュベータにて１２ｈ倒置培養し、形質転換体を得た。形質転換体についてＰＣＲ検証を行った結果、正しい場合、組換え枯草菌を取得した。
B. subtilis WB800/pP43NMK-hag-dpe、B. subtilis WB800/pP43NMK-ylbP -dpe、B. subtilis WB800/pP43NMK-hagP43-dpe、B. subtilis WB800/pP43NMK-ylbPylbP-dpe、B. subtilis WB800/pP43NMK-haghag-dpe、B. subtilis WB800/pP43NMK-amyE-dpe、B. subtilis WB800/pP43NMK-aprE-dpe、B. subtilis WB800/pP43NMK-gsiB-dpe、B. subtilis WB800/pP43NMK-HpaII-dpe、B. subtilis WB800/pP43NMK-nprE-dpe、B. subtilis WB800/pP43NMK-sigX-dpe、B. subtilis WB800/pP43NMK-P43hag-dpe、B. subtilis WB800/pP43NMK-ylbPhag-dpe、B. subtilis WB800/pP43NMK-hagylbP-dpe、B. subtilis WB800/pP43NMK-ylbPP43-dpe、B. subtilis WB800/pP43NMK-P43ylbP-dpe、B. subtilis WB800/pP43NMK-P43P43-dpeがそれぞれ調製された。
実施例２：プロモーターを含有する組換え枯草菌の発酵によるＤ－プシコース３－エピメラーゼの産生
具体的なステップは以下のとおりである。
（１）実施例１で調製された組換え枯草菌をＬＢ液体培地にそれぞれ添加し、３７℃、２００ｒｐｍの条件下で、１２ｈ振とう培養し、シード液を製造した。
（２）製造されたシード液を３％（ｖ／ｖ）の播種量で発酵培地に播種し、３７℃、２００ｒｐｍの条件下で、振とう培養を行い、酵素含有菌体細胞を単離した。
発酵液菌体細胞中のＤ－プシコース３－エピメラーゼの酵素活性をそれぞれ検出し、結果を表１及び図１に示す。
その結果、組換え菌Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＷＢ８００／ｐＰ４３ＮＭＫ－ｈａｇ－ｄｐｅは効果が最も高く、酵素活性が１９．６２Ｕ／ｍＬと高い。
よって、後の実施例では、プラスミドｐＰ４３ＮＭＫ－ｈａｇ－ｄｐｅをテンプレートとして、ｈａｇプロモーター上のＲＢＳ配列を変異することによって、Ｄ－プシコース３－エピメラーゼの酵素活性をさらに向上させる。
具体的なステップは以下のとおりである。
（１）実施例１で調製された組換え枯草菌をＬＢ液体培地にそれぞれ添加し、３７℃、２００ｒｐｍの条件下で、１２ｈ振とう培養し、シード液を製造した。
（２）製造されたシード液を３％（ｖ／ｖ）の播種量で発酵培地に播種し、３７℃、２００ｒｐｍの条件下で、振とう培養を行い、酵素含有菌体細胞を単離した。
発酵液菌体細胞中のＤ－プシコース３－エピメラーゼの酵素活性をそれぞれ検出し、結果を表１及び図１に示す。
よって、後の実施例では、プラスミドｐＰ４３ＮＭＫ－ｈａｇ－ｄｐｅをテンプレートとして、ｈａｇプロモーター上のＲＢＳ配列を変異することによって、Ｄ－プシコース３－エピメラーゼの酵素活性をさらに向上させる。
実施例３：各ＲＢＳを含有する組換え枯草菌の構築
具体的なステップは以下のとおりである。
プラスミドｐＰ４３ＮＭＫ－ｈａｇ－ｄｐｅをテンプレート、ＲＢＳ－Ｆ／ＲＢＳ－Ｒをプライマーとして、ｏｎｅ－ｓｔｅｐ ＰＣＲを行い、ｈａｇプロモーター上のＲＢＳ配列を変異させ、各ＲＢＳ配列を含有する線状化プラスミドを構築した。
プライマー：
RBS-F: tgccttaacaacatattcrrggaggrrcaaaacaatgaagcatggta
RBS-R: taccatgcttcattgttttgyycctccyygaatatgttgttaaggca
構築した線状化プラスミドを大腸菌ＤＨ５αコンピテント細胞に形質転換した。形質転換後の大腸菌ＤＨ５αコンピテント細胞をＬＢ固体培地（１００μｇ・ｍＬ－１アンピシリン含有）に塗布し、３７℃で１２ｈ倒置培養した。所定量の陽性形質転換体を選択して、プラスミドを抽出し、シーケンシングにより検証して正しい場合、組換えプラスミドｐＰ４３ＮＭＫ－ｈａｇ－ＲＢＳｎ－ｄｐｅを取得し、１５個の異なるＲＢＳ変異体をそれぞれ取得した。変異配列は以下のとおりである。
ｇｇｇｇａｇｇａａ（Ｒ１と命名する）、ｇａｇｇａｇｇａａ（Ｒ２と命名する）、ｇｇｇｇａｇｇｇａ（Ｒ３と命名する）、ｇｇｇｇａｇｇａｇ（Ｒ４と命名する）、ｇａｇｇａｇｇｇｇ（Ｒ５と命名する）、ｇａｇｇａｇｇｇａ（Ｒ６と命名する）、ｇｇｇｇａｇｇｇｇ（Ｒ７と命名する）、ｇａｇｇａｇｇａｇ（Ｒ８と命名する）、ａａｇｇａｇｇａａ（Ｒ９と命名する）、ａｇｇｇａｇｇｇａ（Ｒ１０と命名する）、ａｇｇｇａｇｇａｇ（Ｒ１１と命名する）、ａａｇｇａｇｇｇａ（Ｒ１２と命名する）、ａｇｇｇａｇｇｇｇ（Ｒ１３と命名する）、ａａｇｇａｇｇａｇ（Ｒ１４と命名する）、ａａｇｇａｇｇｇｇ（Ｒ１５と命名する）
組換えプラスミドpP43NMK-hag-R1-dpe、pP43NMK-hag-R2-dpe、pP43NMK-hag-R3-dpe、pP43NMK-hag-R4-dpe、pP43NMK-hag-R5-dpe、pP43NMK-hag-R6-dpe、pP43NMK-hag-R7-dpe、pP43NMK-hag-R8-dpe、pP43NMK-hag-R9-dpe、pP43NMK-hag-R10-dpe、pP43NMK-hag-R11-dpe、pP43NMK-hag-R12-dpe、pP43NMK-hag-R13-dpe、pP43NMK-hag-R14-dpe、pP43NMK-hag-R15-dpeがそれぞれ調製された。
変異前のＲＢＳ配列をＲ０と命名すると、組換えプラスミドはｐＰ４３ＮＭＫ－ｈａｇ－Ｒ０－ｄｐｅとして表現される。
取得した組換えプラスミドｐＰ４３ＮＭＫ－ｈａｇ－Ｒｎ－ｄｐｅ及びｐＰ４３ＮＭＫ－ｈａｇ－Ｒ０－ｄｐｅをそれぞれＢ． Ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＷＢ８００コンピテント細胞に導入し、形質転換産物を得た。形質転換産物をＬＢ固体培地（１００μｇ・ｍＬ－１カナマイシン含有）に塗布し、３７℃の恒温インキュベータで１２ｈ倒置培養し、形質転換体を得た。形質転換体をシーケンシングして正しい場合、組換え枯草菌を取得した。
即ち、
B. subtilis WB800/pP43NMK-hag-R1-dpe、B. subtilis WB800/pP43NMK-hag-R2-dpe、B. subtilis WB800/pP43NMK-hag-R3-dpe、B. subtilis WB800/pP43NMK-hag-R4-dpe、B. subtilis WB800/pP43NMK-hag-R5-dpe、B. subtilis WB800/pP43NMK-hag-R6-dpe、B. subtilis WB800/pP43NMK-hag-R7-dpe、B. subtilis WB800/pP43NMK-hag-R8-dpe、B. subtilis WB800/pP43NMK-hag-R9-dpe、B. subtilis WB800/pP43NMK-hag-R10-dpe、B. subtilis WB800/pP43NMK-hag-R11-dpe、B. subtilis WB800/pP43NMK-hag-R12-dpe、B. subtilis WB800/pP43NMK-hag-R13-dpe、B. subtilis WB800/pP43NMK-hag-R14-dpe、B. subtilis WB800/pP43NMK-hag-R15-dpe、B. subtilis WB800/pP43NMK-hag-R0-dpeがそれぞれ調製された。
具体的なステップは以下のとおりである。
プラスミドｐＰ４３ＮＭＫ－ｈａｇ－ｄｐｅをテンプレート、ＲＢＳ－Ｆ／ＲＢＳ－Ｒをプライマーとして、ｏｎｅ－ｓｔｅｐ ＰＣＲを行い、ｈａｇプロモーター上のＲＢＳ配列を変異させ、各ＲＢＳ配列を含有する線状化プラスミドを構築した。
プライマー：
RBS-F: tgccttaacaacatattcrrggaggrrcaaaacaatgaagcatggta
RBS-R: taccatgcttcattgttttgyycctccyygaatatgttgttaaggca
構築した線状化プラスミドを大腸菌ＤＨ５αコンピテント細胞に形質転換した。形質転換後の大腸菌ＤＨ５αコンピテント細胞をＬＢ固体培地（１００μｇ・ｍＬ－１アンピシリン含有）に塗布し、３７℃で１２ｈ倒置培養した。所定量の陽性形質転換体を選択して、プラスミドを抽出し、シーケンシングにより検証して正しい場合、組換えプラスミドｐＰ４３ＮＭＫ－ｈａｇ－ＲＢＳｎ－ｄｐｅを取得し、１５個の異なるＲＢＳ変異体をそれぞれ取得した。変異配列は以下のとおりである。
ｇｇｇｇａｇｇａａ（Ｒ１と命名する）、ｇａｇｇａｇｇａａ（Ｒ２と命名する）、ｇｇｇｇａｇｇｇａ（Ｒ３と命名する）、ｇｇｇｇａｇｇａｇ（Ｒ４と命名する）、ｇａｇｇａｇｇｇｇ（Ｒ５と命名する）、ｇａｇｇａｇｇｇａ（Ｒ６と命名する）、ｇｇｇｇａｇｇｇｇ（Ｒ７と命名する）、ｇａｇｇａｇｇａｇ（Ｒ８と命名する）、ａａｇｇａｇｇａａ（Ｒ９と命名する）、ａｇｇｇａｇｇｇａ（Ｒ１０と命名する）、ａｇｇｇａｇｇａｇ（Ｒ１１と命名する）、ａａｇｇａｇｇｇａ（Ｒ１２と命名する）、ａｇｇｇａｇｇｇｇ（Ｒ１３と命名する）、ａａｇｇａｇｇａｇ（Ｒ１４と命名する）、ａａｇｇａｇｇｇｇ（Ｒ１５と命名する）
組換えプラスミドpP43NMK-hag-R1-dpe、pP43NMK-hag-R2-dpe、pP43NMK-hag-R3-dpe、pP43NMK-hag-R4-dpe、pP43NMK-hag-R5-dpe、pP43NMK-hag-R6-dpe、pP43NMK-hag-R7-dpe、pP43NMK-hag-R8-dpe、pP43NMK-hag-R9-dpe、pP43NMK-hag-R10-dpe、pP43NMK-hag-R11-dpe、pP43NMK-hag-R12-dpe、pP43NMK-hag-R13-dpe、pP43NMK-hag-R14-dpe、pP43NMK-hag-R15-dpeがそれぞれ調製された。
変異前のＲＢＳ配列をＲ０と命名すると、組換えプラスミドはｐＰ４３ＮＭＫ－ｈａｇ－Ｒ０－ｄｐｅとして表現される。
取得した組換えプラスミドｐＰ４３ＮＭＫ－ｈａｇ－Ｒｎ－ｄｐｅ及びｐＰ４３ＮＭＫ－ｈａｇ－Ｒ０－ｄｐｅをそれぞれＢ． Ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＷＢ８００コンピテント細胞に導入し、形質転換産物を得た。形質転換産物をＬＢ固体培地（１００μｇ・ｍＬ－１カナマイシン含有）に塗布し、３７℃の恒温インキュベータで１２ｈ倒置培養し、形質転換体を得た。形質転換体をシーケンシングして正しい場合、組換え枯草菌を取得した。
即ち、
B. subtilis WB800/pP43NMK-hag-R1-dpe、B. subtilis WB800/pP43NMK-hag-R2-dpe、B. subtilis WB800/pP43NMK-hag-R3-dpe、B. subtilis WB800/pP43NMK-hag-R4-dpe、B. subtilis WB800/pP43NMK-hag-R5-dpe、B. subtilis WB800/pP43NMK-hag-R6-dpe、B. subtilis WB800/pP43NMK-hag-R7-dpe、B. subtilis WB800/pP43NMK-hag-R8-dpe、B. subtilis WB800/pP43NMK-hag-R9-dpe、B. subtilis WB800/pP43NMK-hag-R10-dpe、B. subtilis WB800/pP43NMK-hag-R11-dpe、B. subtilis WB800/pP43NMK-hag-R12-dpe、B. subtilis WB800/pP43NMK-hag-R13-dpe、B. subtilis WB800/pP43NMK-hag-R14-dpe、B. subtilis WB800/pP43NMK-hag-R15-dpe、B. subtilis WB800/pP43NMK-hag-R0-dpeがそれぞれ調製された。
実施例４：各ＲＢＳを含有する組換え枯草菌の発酵
具体的なステップは以下のとおりである。
（１）実施例３で製造された組換え枯草菌の形質転換体をそれぞれ用いてＬＢ固体培地（１００μｇ・ｍＬ－１カナマイシン含有）でストリークし、３７℃の恒温インキュベータで１２ｈ倒置培養し、単一コロニーをそれぞれ得た。
（２）単一コロニーをそれぞれピックアップしてＬＢ液体培地（１００μｇ・ｍＬ－１カナマイシン含有）に播種し、３７℃、２００ｒ／ｍｉｎで１２ｈ培養し、シード液を得た。
（３）製造されたシード液を３％（ｖ／ｖ）の播種量で発酵培地に移し、３７℃、２００ｒ／ｍｉｎで１２ｈ以上培養し、発酵液を得た。
（４）上記発酵液中の各組換え枯草菌で製造されたＤ－プシコース３－エピメラーゼの酵素活性をそれぞれ検出し、結果を表２及び図２に示す。
その結果、組換え菌Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＷＢ８００／ｐＰ４３ＮＭＫ－ｈａｇ－Ｒ４－ｄｐｅは効果が最も高く、Ｄ－プシコース３－エピメラーゼの酵素活性が２５．３９Ｕ／ｍＬと高い。
さらに、組換え菌Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＷＢ８００／ｐＰ４３ＮＭＫ－ｈａｇ－Ｒ２－ｄｐｅの発酵により製造されたＤ－プシコース３－エピメラーゼの酵素活性が、２２．４９Ｕ／ｍＬである。
組換え菌Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＷＢ８００／ｐＰ４３ＮＭＫ－ｈａｇ－Ｒ１１－ｄｐｅの発酵により製造されたＤ－プシコース３－エピメラーゼの酵素活性が、２４．４６Ｕ／ｍＬである。
組換え菌Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＷＢ８００／ｐＰ４３ＮＭＫ－ｈａｇ－Ｒ１３－ｄｐｅの発酵により製造されたＤ－プシコース３－エピメラーゼの酵素活性が、２３．３５Ｕ／ｍＬである。
組換え菌Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＷＢ８００／ｐＰ４３ＮＭＫ－ｈａｇ－Ｒ１４－ｄｐｅの発酵により製造されたＤ－プシコース３－エピメラーゼの酵素活性が、２２．６４Ｕ／ｍＬである。
組換え菌Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＷＢ８００／ｐＰ４３ＮＭＫ－ｈａｇ－Ｒ１５－ｄｐｅの発酵により製造されたＤ－プシコース３－エピメラーゼの酵素活性が２３．３５Ｕ／ｍＬである。
具体的なステップは以下のとおりである。
（１）実施例３で製造された組換え枯草菌の形質転換体をそれぞれ用いてＬＢ固体培地（１００μｇ・ｍＬ－１カナマイシン含有）でストリークし、３７℃の恒温インキュベータで１２ｈ倒置培養し、単一コロニーをそれぞれ得た。
（２）単一コロニーをそれぞれピックアップしてＬＢ液体培地（１００μｇ・ｍＬ－１カナマイシン含有）に播種し、３７℃、２００ｒ／ｍｉｎで１２ｈ培養し、シード液を得た。
（３）製造されたシード液を３％（ｖ／ｖ）の播種量で発酵培地に移し、３７℃、２００ｒ／ｍｉｎで１２ｈ以上培養し、発酵液を得た。
（４）上記発酵液中の各組換え枯草菌で製造されたＤ－プシコース３－エピメラーゼの酵素活性をそれぞれ検出し、結果を表２及び図２に示す。
さらに、組換え菌Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＷＢ８００／ｐＰ４３ＮＭＫ－ｈａｇ－Ｒ２－ｄｐｅの発酵により製造されたＤ－プシコース３－エピメラーゼの酵素活性が、２２．４９Ｕ／ｍＬである。
組換え菌Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＷＢ８００／ｐＰ４３ＮＭＫ－ｈａｇ－Ｒ１１－ｄｐｅの発酵により製造されたＤ－プシコース３－エピメラーゼの酵素活性が、２４．４６Ｕ／ｍＬである。
組換え菌Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＷＢ８００／ｐＰ４３ＮＭＫ－ｈａｇ－Ｒ１３－ｄｐｅの発酵により製造されたＤ－プシコース３－エピメラーゼの酵素活性が、２３．３５Ｕ／ｍＬである。
組換え菌Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＷＢ８００／ｐＰ４３ＮＭＫ－ｈａｇ－Ｒ１４－ｄｐｅの発酵により製造されたＤ－プシコース３－エピメラーゼの酵素活性が、２２．６４Ｕ／ｍＬである。
組換え菌Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＷＢ８００／ｐＰ４３ＮＭＫ－ｈａｇ－Ｒ１５－ｄｐｅの発酵により製造されたＤ－プシコース３－エピメラーゼの酵素活性が２３．３５Ｕ／ｍＬである。
実施例５：無耐性組換えベクターの調製
具体的な操作ステップは以下のとおりである。
（１）アラニンラセマーゼ遺伝子の取得：人工合成ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１９で示される。
（２）ＰＵＢ－ｈａｇ－ＲＢＳ４－ｄｐｅ－ｄａｌベクターの製造：
ＰＵＢ－Ｐ４３－ｄｐｅ－ｄａｌプラスミド（構築方法は公開番号ＣＮ１０４８９４０４７Ｂの中国発明特許文献に記載されている）をテンプレートとして、ＰＣＲによってＰ４３遺伝子を含まない線状化ベクターを増幅した。実施例３で構築されたｐＰ４３ＮＭＫ－ｈａｇ－Ｒ４－ｄｐｅプラスミドをテンプレートとして、ＰＣＲによってそのｈａｇ－ＲＢＳ４－ｄｐｅ遺伝子を増幅した。以上の線状化ベクターと目的遺伝子を高忠実度ポリメラーゼＰｈａｔａ Ｍａｘ Ｓｕｐｅｒ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅで相同アーム組換えの原理により連結した。
（３）ｐＰ４３ＮＭＫ－ｈａｇ－ＲＢＳ４－ｄｐｅ－ｄａｌベクターの調製：
実施例３で構築したｐＰ４３ＮＭＫ－ｈａｇ－Ｒ４－ｄｐｅプラスミドをテンプレートとして、ＰＣＲによって耐性遺伝子カナマイシンＫａｎ以外の線状化ベクターを増幅した。以前発明者らで構築したＰＵＢ－Ｐ４３－ｄｐｅ－ｄａｌプラスミドをテンプレートとして、ＰＣＲによってアラニンラセマーゼ遺伝子を増幅した。以上の線状化ベクターと目的遺伝子を高忠実度ポリメラーゼＰｈａｔａ Ｍａｘ Ｓｕｐｅｒ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅで相同アーム組換え原理により連結した。
（４）ステップ（２）及びステップ（３）の連結時の反応系及び反応条件：
変性－アニール－最終伸長は合計２５～３５サイクル行った。
（５）ステップ（２）及びステップ（３）で得たＰＣＲ産物（多量体断片）を１Ａ７５１Δｄａｌコンピテント枯草菌に導入し、形質転換産物を得て、形質転換産物を、抗生物質を含まないＬＢ固体培地に塗布し、３７℃の恒温インキュベータで１２ｈ倒置培養し、形質転換体を得て、形質転換体をＰＣＲで検証して正しい場合、無耐性組換え枯草菌：枯草菌１Ａ７５１Δｄａｌ／ＰＵＢ－ｈａｇ－ＲＢＳ４－ｄｐｅ－ｄａｌ、枯草菌１Ａ７５１Δｄａｌ／ｐＰ４３ＮＭＫ－ｈａｇ－ＲＢＳ４－ｄｐｅ－ｄａｌを得た。
具体的な操作ステップは以下のとおりである。
（１）アラニンラセマーゼ遺伝子の取得：人工合成ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１９で示される。
（２）ＰＵＢ－ｈａｇ－ＲＢＳ４－ｄｐｅ－ｄａｌベクターの製造：
ＰＵＢ－Ｐ４３－ｄｐｅ－ｄａｌプラスミド（構築方法は公開番号ＣＮ１０４８９４０４７Ｂの中国発明特許文献に記載されている）をテンプレートとして、ＰＣＲによってＰ４３遺伝子を含まない線状化ベクターを増幅した。実施例３で構築されたｐＰ４３ＮＭＫ－ｈａｇ－Ｒ４－ｄｐｅプラスミドをテンプレートとして、ＰＣＲによってそのｈａｇ－ＲＢＳ４－ｄｐｅ遺伝子を増幅した。以上の線状化ベクターと目的遺伝子を高忠実度ポリメラーゼＰｈａｔａ Ｍａｘ Ｓｕｐｅｒ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅで相同アーム組換えの原理により連結した。
（３）ｐＰ４３ＮＭＫ－ｈａｇ－ＲＢＳ４－ｄｐｅ－ｄａｌベクターの調製：
実施例３で構築したｐＰ４３ＮＭＫ－ｈａｇ－Ｒ４－ｄｐｅプラスミドをテンプレートとして、ＰＣＲによって耐性遺伝子カナマイシンＫａｎ以外の線状化ベクターを増幅した。以前発明者らで構築したＰＵＢ－Ｐ４３－ｄｐｅ－ｄａｌプラスミドをテンプレートとして、ＰＣＲによってアラニンラセマーゼ遺伝子を増幅した。以上の線状化ベクターと目的遺伝子を高忠実度ポリメラーゼＰｈａｔａ Ｍａｘ Ｓｕｐｅｒ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅで相同アーム組換え原理により連結した。
（４）ステップ（２）及びステップ（３）の連結時の反応系及び反応条件：
（５）ステップ（２）及びステップ（３）で得たＰＣＲ産物（多量体断片）を１Ａ７５１Δｄａｌコンピテント枯草菌に導入し、形質転換産物を得て、形質転換産物を、抗生物質を含まないＬＢ固体培地に塗布し、３７℃の恒温インキュベータで１２ｈ倒置培養し、形質転換体を得て、形質転換体をＰＣＲで検証して正しい場合、無耐性組換え枯草菌：枯草菌１Ａ７５１Δｄａｌ／ＰＵＢ－ｈａｇ－ＲＢＳ４－ｄｐｅ－ｄａｌ、枯草菌１Ａ７５１Δｄａｌ／ｐＰ４３ＮＭＫ－ｈａｇ－ＲＢＳ４－ｄｐｅ－ｄａｌを得た。
実施例６：無耐性組換え枯草菌の発酵によるＤ－プシコース３－エピメラーゼの製造
具体的なステップは以下のとおりである。
（１）実施例３で取得した組換え枯草菌である枯草菌１Ａ７５１Δｄａｌ／ＰＵＢ－ｈａｇ－ＲＢＳ４－ｄｐｅ－ｄａｌ、枯草菌１Ａ７５１Δｄａｌ／ｐＰ４３ＮＭＫ－ｈａｇ－ＲＢＳ４－ｄｐｅ－ｄａｌを用いてそれぞれ無耐性ＬＢ固体培地でストリークし、３７℃の恒温インキュベータで１２ｈ倒置培養し、単一コロニーをそれぞれ得た。
（２）単一コロニーをそれぞれピックアップして、無耐性ＬＢ液体培地に播種し、３７℃、２００ｒ／ｍｉｎで１２ｈ培養し、シード液を得た。
（３）製造されたシード液を３％（ｖ／ｖ）の播種量で無耐性発酵培地に移し、３７℃、２００ｒ／ｍｉｎで１２ｈ以上培養し、発酵液を得た。
（４）上記各組換え枯草菌で製造されたＤ－プシコース３－エピメラーゼの酵素活性をそれぞれ検出し、結果を表３に示す。
その結果、無耐性組換え菌株Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ １Ａ７５１－ｄａｌ－／ｐＰ４３ＮＭＫ－ｈａｇ－ＲＢＳ４－ｄｐｅ－ｄａｌは酵素産生効果が最も高く、最高発酵酵素活性が２４．７２Ｕ／ｍＬである。
よって、本発明は抗生物質を添加していない培地において食品等級の菌株発酵を用いてＤ－プシコース３－エピメラーゼを製造することができる。
具体的なステップは以下のとおりである。
（１）実施例３で取得した組換え枯草菌である枯草菌１Ａ７５１Δｄａｌ／ＰＵＢ－ｈａｇ－ＲＢＳ４－ｄｐｅ－ｄａｌ、枯草菌１Ａ７５１Δｄａｌ／ｐＰ４３ＮＭＫ－ｈａｇ－ＲＢＳ４－ｄｐｅ－ｄａｌを用いてそれぞれ無耐性ＬＢ固体培地でストリークし、３７℃の恒温インキュベータで１２ｈ倒置培養し、単一コロニーをそれぞれ得た。
（２）単一コロニーをそれぞれピックアップして、無耐性ＬＢ液体培地に播種し、３７℃、２００ｒ／ｍｉｎで１２ｈ培養し、シード液を得た。
（３）製造されたシード液を３％（ｖ／ｖ）の播種量で無耐性発酵培地に移し、３７℃、２００ｒ／ｍｉｎで１２ｈ以上培養し、発酵液を得た。
（４）上記各組換え枯草菌で製造されたＤ－プシコース３－エピメラーゼの酵素活性をそれぞれ検出し、結果を表３に示す。
よって、本発明は抗生物質を添加していない培地において食品等級の菌株発酵を用いてＤ－プシコース３－エピメラーゼを製造することができる。
実施例７：Ｄ－プシコース３－エピメラーゼの発酵による製造
（１）プレートにおける無耐性組換え菌株Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ １Ａ７５１－ｄａｌ－／ｐＰ４３ＮＭＫ－ｈａｇ－ＲＢＳ４－ｄｐｅ－ｄａｌ単一コロニーをピックアップして、５０ｍＬ（液体仕込み量１０％）のＬＢ液体培地に播種し、３７℃、２００ｒ／ｍｉｎで１２ｈ振とう培養し、シード液を得た。
（２）発酵培地を３Ｌ発酵タンク（ファーメンター）に入れて、ステップ（１）で得たシード液を３％（ｖ／ｖ）の播種量で発酵培地に播種し、発酵培養し、発酵において通気量と撹拌速度を絶えず調整し、ＤＯ値を３０％、発酵温度を３７℃に制御した。
（３）溶存酸素が回復し始めたら、補充し、補充培地にはブドウ糖２００ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム7水和物５ｇ／Ｌが含まれており、補充速度を４０ｍＬ／ｈに設定した。
（４）補充過程では、酵素活性を常に検出し、酵素活性が低下し始めるまで補充した。この時に、発酵を停止し、検出したところ、得られたＤ－プシコース３－エピメラーゼの発酵酵素活性は、７１４．８Ｕ／ｍＬである。
（５）発酵菌体を遠心分離し、検出したところ、得られたＤ－プシコース３－エピメラーゼを含む湿菌体の酵素活性は、１３６１２．５Ｕ／ｇである。
（１）プレートにおける無耐性組換え菌株Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ １Ａ７５１－ｄａｌ－／ｐＰ４３ＮＭＫ－ｈａｇ－ＲＢＳ４－ｄｐｅ－ｄａｌ単一コロニーをピックアップして、５０ｍＬ（液体仕込み量１０％）のＬＢ液体培地に播種し、３７℃、２００ｒ／ｍｉｎで１２ｈ振とう培養し、シード液を得た。
（２）発酵培地を３Ｌ発酵タンク（ファーメンター）に入れて、ステップ（１）で得たシード液を３％（ｖ／ｖ）の播種量で発酵培地に播種し、発酵培養し、発酵において通気量と撹拌速度を絶えず調整し、ＤＯ値を３０％、発酵温度を３７℃に制御した。
（３）溶存酸素が回復し始めたら、補充し、補充培地にはブドウ糖２００ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム7水和物５ｇ／Ｌが含まれており、補充速度を４０ｍＬ／ｈに設定した。
（４）補充過程では、酵素活性を常に検出し、酵素活性が低下し始めるまで補充した。この時に、発酵を停止し、検出したところ、得られたＤ－プシコース３－エピメラーゼの発酵酵素活性は、７１４．８Ｕ／ｍＬである。
（５）発酵菌体を遠心分離し、検出したところ、得られたＤ－プシコース３－エピメラーゼを含む湿菌体の酵素活性は、１３６１２．５Ｕ／ｇである。
実施例８：Ｄ－プシコースの製造
１０００ｍＬジャケット酵素反応器に濃度４５％の基質であるＤ－フルクトース溶液を加え、反応温度を５５℃に保持し、ｐＨを７．０に調整し、３０Ｕ／ｇフルクトースで実施例７で製造されたＤ－プシコース３－エピメラーゼを含む菌体を加え、回転数１００ｒ／ｍｉｎで撹拌して反応させた。
反応中にサンプリングして、沸騰させて酵素を不活性化し、遠心分離して上澄み液を得て、ＨＰＬＣ分析によってＤ－プシコースの含有量を検出した。
８ｈ反応後、反応全体が平衡の状態になり、Ｄ－プシコースの転化率は２８．５％である。
１０００ｍＬジャケット酵素反応器に濃度４５％の基質であるＤ－フルクトース溶液を加え、反応温度を５５℃に保持し、ｐＨを７．０に調整し、３０Ｕ／ｇフルクトースで実施例７で製造されたＤ－プシコース３－エピメラーゼを含む菌体を加え、回転数１００ｒ／ｍｉｎで撹拌して反応させた。
反応中にサンプリングして、沸騰させて酵素を不活性化し、遠心分離して上澄み液を得て、ＨＰＬＣ分析によってＤ－プシコースの含有量を検出した。
８ｈ反応後、反応全体が平衡の状態になり、Ｄ－プシコースの転化率は２８．５％である。
本発明は好適な実施例を以上で開示しているが、これらは本発明を限定するものではなく、当業者であれば、本発明の趣旨及び範囲を逸脱することなく様々な修正や変更が可能であり、このため、本発明の特許範囲は特許請求の範囲により定められるものに準じる。
Claims (12)
- 組換え枯草菌であって、目的遺伝子Ｄ－プシコース３－エピメラーゼを担持した発現ベクターをアラニンラセマーゼ遺伝子ノックアウト枯草菌に導入して得られるものであり、前記発現ベクターは、
Ｄ－プシコース３－エピメラーゼ遺伝子を担持したｐＰ４３ＮＭＫプラスミド上のＰ４３プロモーターが、ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２で示されるｈａｇプロモーターに置換されているとともに、ｈａｇプロモーター配列上の塩基の第１２９位～１３７位がｇｇｇｇａｇｇａｇに同時に変異しており、ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１９のアラニンラセマーゼ遺伝子ｄａｌにより、ｐＰ４３ＮＭＫプラスミド上の耐性遺伝子カナマイシンＫａｎが代替されたもの、又は、
Ｄ－プシコース３－エピメラーゼ遺伝子を担持したｐＵＢ１１０プラスミド上のＰ４３プロモーターが、ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２で示されるｈａｇプロモーターに置換されているとともに、ｈａｇプロモーター配列上の塩基の第１２９位～１３７位がｇｇｇｇａｇｇａｇに同時に変異しており、ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１９のアラニンラセマーゼ遺伝子ｄａｌにより、ｐＵＢ１１０プラスミド上の耐性遺伝子カナマイシンＫａｎ及びブレオマイシンＢｌｍが代替されたものであることを特徴とする、組換え枯草菌。 - アラニンラセマーゼ遺伝子ノックアウト枯草菌１Ａ７５１を発現宿主とすることを特徴とする、請求項１に記載の組換え枯草菌。
- アラニンラセマーゼ遺伝子ノックアウト枯草菌ＷＢ６００を発現宿主とすることを特徴とする、請求項１に記載の組換え枯草菌。
- アラニンラセマーゼ遺伝子ノックアウト枯草菌ＷＢ８００を発現宿主とすることを特徴とする、請求項１に記載の組換え枯草菌。
- 枯草菌ＷＢ８００又は枯草菌１Ａ７５１を発現宿主として、Ｄ－プシコース３－エピメラーゼを発現させており、Ｄ－プシコース３－エピメラーゼの発現ベクターは、
ｐＰ４３ＮＭＫプラスミド上のＰ４３プロモーターが、ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２で示されるｈａｇプロモーターに置換されているとともに、ｈａｇプロモーター配列上の塩基の第１２９位～１３７位がｇｇｇｇａｇｇａｇに同時に変異したものであることを特徴とする、組換え枯草菌。 - ｐＰ４３ＮＭＫプラスミド上のＰ４３プロモーターが、ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２で示されるｈａｇプロモーターに置換されているとともに、ｈａｇプロモーター配列上の塩基の第１２９位～１３７位が同時に変異したものであり、
ｈａｇプロモーター配列上の塩基の第１２９位～１３７位が、ｇａｇｇａｇｇａａ、ｇｇｇｇａｇｇａｇ、ａｇｇｇａｇｇａｇ、ａｇｇｇａｇｇｇｇ、ａａｇｇａｇｇａｇ、又はａａｇｇａｇｇｇｇに同時に変異していることを特徴とする、発現ベクター。 - ｐＰ４３ＮＭＫプラスミド上のＰ４３プロモーターが、ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２で示されるｈａｇプロモーターに置換されているとともに、ｈａｇプロモーター配列上の塩基の第１２９位～１３７位が、ｇｇｇｇａｇｇａｇに同時に突然変異しており、ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１９のアラニンラセマーゼ遺伝子ｄａｌにより、ｐＰ４３ＮＭＫプラスミド上の耐性遺伝子カナマイシンＫａｎが代替されたものであり、又は、
ｐＵＢ１１０プラスミド上のＰ４３プロモーターが、ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２で示されるｈａｇプロモーターに置換されているとともに、ｈａｇプロモーター配列上の塩基の第１２９位～１３７位が、ｇｇｇｇａｇｇａｇに同時に突然変異しており、ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１９のアラニンラセマーゼ遺伝子ｄａｌにより、ｐＵＢ１１０プラスミド上の耐性遺伝子カナマイシンＫａｎ及びブレオマイシンＢｌｍが代替されたものであることを特徴とする無耐性発現ベクター。 - 請求項６又は７に記載の発現ベクターを含有する、組換え細胞。
- 枯草菌ＷＢ８００又は枯草菌１Ａ７５１を発現宿主とすることを特徴とする、請求項８に記載の組換え細胞。
- Ｄ－プシコース３－エピメラーゼを担持した請求項１～５のいずれか１項に記載の組換え枯草菌から菌体を得て、菌体からＤ－プシコース３－エピメラーゼを単離することを特徴とする、Ｄ－プシコース３－エピメラーゼ産生方法。
- Ｄ－プシコース３－エピメラーゼを担持した請求項１～５のいずれか１項に記載の組換え枯草菌をフルクトース含有反応系に添加して反応させ、反応液を得て、反応液からＤ－プシコースを単離することを特徴とする、Ｄ－プシコースの生産方法。
- 請求項１～５のいずれか１項に記載の組換え枯草菌の、Ｄ－プシコース又はＤ－プシコースを含有する製品の製造における、使用。
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