JP7072703B2 - Axlタンパク質に結合する抗体 - Google Patents

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Description

関連出願の相互参照
本出願は、2015年5月18日出願の米国仮特許出願第62/163265号明細書
の優先権を主張し、この出願の内容は、参照によってその全体が組み込まれる。
参照による配列表の組込み
本出願は、電子フォーマットの配列表と共に提出されている。配列表は、38.3キロ
バイトのサイズである、2016年5月18日に作成された511582009841S
EQLIST.TXTという表題のファイルとして提供される。配列表の電子フォーマッ
トの情報は、参照によってその全体が組み込まれる。
連邦政府支援を受けて研究された発明の権利に関する陳述
該当せず。
本明細書中に記載される発明は、AXLと呼ばれるタンパク質に結合する抗体およびそ
の抗原結合フラグメントに関する。本発明はさらに、AXLを発現する癌の処置に有用な
、予後、予防、診断、そしてコンパニオン(companion)の治療方法および組成
物に関する。
2013年、1,660,290人の男性および女性(854,790人の男性および
805,500人の女性)が、全部位の癌と診断されて、580,350人の男性および
女性が、その癌で死亡すると推定される。2006年から2010年まで、全部位の癌の
診断時年齢の中央値は、66歳であった。年齢調整罹患率は、男女100,000人あた
り、年間463.0人であった。当該率は、18のSEER参加地域由来の、2006~
2010年に診断された症例に基づいている。2006年から2010年まで、全部位の
癌の死亡年齢の中央値は、72歳であった。年齢調整死亡率は、男女100,000人あ
たり、年間176.4人であった。当該率は、米国で2006~2010年に死亡した患
者に基づいている。18のSEER参加地域由来の、2003~2009年の5年相対全
生存率は、65.8%であった。
非ホジキンリンパ腫(NHL)は、あらゆる年齢で生じ得、多くの場合、正常時、発熱
時、そして体重減少時のリンパ節よりも大きなリンパ節によって特徴付けられる。非ホジ
キンリンパ腫は、多くの様々なタイプがある。これらのタイプは、アグレッシブ(急速な
増殖)タイプおよび無痛(遅い増殖)タイプに分けられ得、B細胞またはT細胞のいずれ
かから形成され得る。B細胞非ホジキンリンパ腫として、バーキットリンパ腫、慢性リン
パ球性白血病/小リンパ球性リンパ腫(CLL/SLL)、びまん性大細胞型B細胞リン
パ腫、濾胞性リンパ腫、免疫芽球性大細胞リンパ腫、前駆Bリンパ芽球性リンパ腫、およ
びマントル細胞リンパ腫が挙げられる。T細胞非ホジキンリンパ腫として、菌状息肉腫、
未分化大細胞リンパ腫、および前駆Tリンパ芽球性リンパ腫が挙げられる。骨髄または幹
細胞の移植後に生じるリンパ腫は、通常、B細胞非ホジキンリンパ腫である。予後および
処置は、病期、および疾患のタイプに依存する。
2013年、69,740人の男性および女性(37,600人の男性および32,1
40人の女性)が、非ホジキンリンパ腫と診断されて、19,020人の男性および女性
が非ホジキンリンパ腫で死亡すると推定される。2006年から2010年まで、非ホジ
キンリンパ腫の診断時年齢の中央値は、66歳であった。年齢調整罹患率は、男女100
,000人あたり、年間19.7人であった。当該率は、18のSEER参加地域由来の
、2006~2010年に診断された症例に基づいている。2006年から2010年ま
で、非ホジキンリンパ腫の死亡年齢の中央値は、76歳であった。年齢調整死亡率は、男
女100,000人あたり、年間6.4人であった。当該率は、米国で2006~201
0年に死亡した患者に基づいている。18のSEER参加地域由来の、2003~200
9年の5年相対全生存率は、69.0%であった。
白血病は、骨髄等の血液形成組織で始まって、多数の血球を産生して血流に入らせる癌
である。主な白血病は、急性リンパ芽球性白血病(ALL)、急性骨髄性白血病(AML
)、慢性リンパ球性白血病(CLL)、慢性骨髄性白血病(CML)、および毛状細胞白
血病(CLL)で構成される。
グループとしての当該白血病について、2013年、48,610人の男性および女性
(27,880人の男性および20,730人の女性)が白血病と診断されて、23,7
20人の男性および女性が白血病で死亡すると推定される。2006年から2010年ま
で、白血病の診断時年齢の中央値は、66歳であった。年齢調整罹患率は、男女100,
000人あたり、年間12.8人であった。当該率は、18のSEER参加地域由来の、
2006~2010年に診断された症例に基づいている。2006年から2010年まで
、白血病の死亡年齢の中央値は、75歳であった。年齢調整死亡率は、男女100,00
0人あたり、年間7.1人であった。当該率は、米国で2006~2010年に死亡した
患者に基づいている。18のSEER参加地域由来の、2003~2009年の5年相対
全生存率は、56.0%であった。
CLLは、成人で2番目に一般的なタイプの白血病であり、通常、徐々に悪化する。こ
れは、多くの場合、中年期以降に見られ、小児では滅多に見られない。早期段階のCLL
患者は、症状が現れるまで、または疾患の急速な進行の証拠を示すまで、化学療法で処置
されない。化学療法の早期開始は、CLLにおいて利点を示さず、死亡率を増大させる可
能性すらある。化学療法が開始される場合、ヌクレオシド類似体、フルダラビンが、CL
Lにおいて最も一般的に用いられる第1選択の療法である。以下が含まれる併用レジメン
が、いくつかの臨床試験において、奏効率の向上を示した:フルダラビン、シクロホスフ
ァミド、およびリツキシマブ(FCR);ペントスタチン、シクロホスファミド、および
リツキシマブ(PCR);フルダラビン、シクロホスファミド、およびミトキサントロン
(FCM);シクロホスファミド、ビンクリスチン、およびプレドニゾン(CVP);シ
クロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、およびプレドニゾン(CHOP)
。2013年、15,680人の男性および女性(9,720人の男性および5,960
人の女性)が、慢性リンパ球性白血病と診断されて、4,580人の男性および女性が慢
性リンパ球性白血病で死亡すると推定される。2006年から2010年まで、慢性リン
パ球性白血病の診断時年齢の中央値は、71歳であった。年齢調整罹患率は、男女100
,000人あたり、年間4.3人であった。当該率は、18のSEER参加地域由来の、
2006~2010年に診断された症例に基づいている。2006年から2010年まで
、慢性リンパ球性白血病の死亡年齢の中央値は、79歳であった。年齢調整死亡率は、男
女100,000人あたり、年間1.4人であった。当該率は、米国で2006~201
0年に死亡した患者に基づいている。18のSEER参加地域由来の、2003~200
9年の5年相対全生存率は、79.2%であった。
急性骨髄性白血病(AML)は、成人で最も一般的なタイプの急性白血病である。現在
のAMLの処置は、完全寛解(CR)を達成するほどに攻撃的でなければならない。なぜ
なら、部分寛解では実質的な延命効果が得られないためである。成人AMLの寛解率は、
年齢に反比例し、予想される寛解率は、60歳よりも若い人々について、65%超である
。データは、一旦達すると、より高齢の患者では、寛解期間が短くなる可能性があること
を示唆している。前駆細胞抗原CD34および/またはP糖タンパク質(MDR1遺伝子
産物)を発現する患者は、結果が悪い。細胞遺伝学的分析は、利用可能な最強の予後情報
をいくつか提供して、寛解誘導療法および寛解後療法の双方の結果を予測する。良好な予
後を示す細胞遺伝学的異常として、t(8;21)、inv(16)またはt(16;1
6)、およびt(15;17)が挙げられる。正常な細胞遺伝学は、平均のリスクAML
を予告する。染色体5もしくは7の長腕もしくはモノソミーの欠失;染色体3の転座もし
くは逆位、t(6;9)、t(9;22);または第1染色体の異常lq23によって特
徴付けられるAML患者は特に、化学療法による予後が悪い。2013年、14,590
人の男性および女性(7,820人の男性および6,770人の女性)が、急性骨髄性白
血病と診断されて、10,370人の男性および女性が急性骨髄性白血病で死亡すると推
定される。2006年から2010年まで、急性骨髄性白血病の診断時年齢の中央値は、
67歳であった。年齢調整罹患率は、男女100,000人あたり、年間3.7人であっ
た。当該率は、18のSEER参加地域由来の、2006~2010年に診断された症例
に基づいている。2006年から2010年まで、急性骨髄性白血病の死亡年齢の中央値
は、72歳であった。年齢調整死亡率は、男女100,000人あたり、年間2.8人で
あった。当該率は、米国で2006~2010年に死亡した患者に基づいている。18の
SEER参加地域由来の、2003~2009年の5年相対全生存率は、24.2%であ
った。なお、全ての一般的な癌情報は、非特許文献1から得られ、全ての統計は、以下に
見られるSEER罹患率およびNCHS死亡率の統計に基づく:非特許文献2、非特許文
献3。
モノクローナル抗体(mAb)の治療的有用性(非特許文献4)が実現している。モノ
クローナル抗体は現在、移植、癌、感染症、心血管疾患、および炎症における治療法とし
て承認されている。アイソタイプが異なると、エフェクタ機能が異なる。機能のそのよう
な差異が、様々な免疫グロブリンアイソタイプについて、異なる三次元構造に反映される
(非特許文献5)。
さらに、近年、モノクローナル抗体は、コンパニオン診断に用いられることが報告され
ている(非特許文献6)。Zhangは最初に、AXLキナーゼの活性化が、肺癌におけ
るEGFR標的療法に対する耐性を引き起こすことを報告している(非特許文献7)。A
F154AXLウサギポリAb(R&D Systems)が、肺癌患者においてAXL
を検出するのに用いられる(特許文献1)。
マウスは免疫化に便利であり、ほとんどのヒト抗原を異物と認識するので、治療可能性
を有する、ヒト標的に対するmAbは典型的に、マウス起源のものである。しかしながら
、マウスmAbは、ヒト治療剤としての固有の欠点がある。マウスmAbは、ヒト抗体よ
りもヒトにおける循環半減期が短いため、より頻繁な投与を必要とする。より厳密には、
ヒト免疫系に対するマウス抗体の反復投与により、ヒト免疫系は、マウスタンパク質を異
物と認識して、ヒト抗マウス抗体(HAMA)反応を生じさせることによって、反応する
。そのようなHAMA反応は、系由来のマウス抗体のアレルギー反応、および迅速な除去
をもたらすことによって、マウス抗体による処置を無駄にする虞がある。そのような影響
を避けるように、マウス内でヒト免疫系を作出することが試みられている。
最初の試みは、ヒト配列を有する抗体により抗原に反応することができるトランスジェ
ニックマウスを作出することを望んだ(非特許文献8参照)が、これは、利用可能なクロ
ーニングビヒクルによって安定して維持され得るDNAの量により、制限された。酵母人
工染色体(YAC)クローニングベクターを用いて、トランスジェニック哺乳動物中への
ヒトIg遺伝子座の大きな生殖細胞系フラグメントの導入が先導された。ヒトゲノムおよ
びヒト定常領域において見られる、同じ間隔で配置されるヒトV、D、およびJ領域遺伝
子の本質的に大部分が、YACを用いて、マウス中に導入された。そのようなトランスジ
ェニックマウス株の1つが、XenoMouse(登録商標)マウスとして知られており
、Amgen Fremont,Inc.(Fremont CA)から市販されている
加えて、免疫グロブリン重鎖(VH、DH、およびJHのセグメント)ならびに/また
はカッパ軽鎖(VKおよびJK)の遺伝子座に内在性マウス可変セグメントを有するゲノ
ム配列が、全体的に、または部分的に、ヒト免疫グロブリン重鎖(VH、DH、およびJ
H)ならびに/またはカッパ軽鎖(VKおよびJK)の遺伝子座の再配置されていない生
殖細胞系可変セグメントを有するヒトゲノム配列と置き換えられているVeloclmm
uneトランスジェニックマウス(Regeneron,Tarrytown,NY)を
用いて、抗体が調製され得る。例えば、特許文献2~特許文献7参照。
米国特許出願公開第2014/0121126号明細書 米国特許第6586251号明細書 米国特許第6596541号明細書 米国特許第7105348号明細書 米国特許第6528313号明細書 米国特許第6638768号明細書 米国特許第6528314号明細書
NCIウェブサイト(www.cancer.gov) Howlader N.,et al.,SEER Cancer Statistics Review,1975-2010,National Cancer Institute Bethesda,MD,http://seer.cancer.gov/csr/1975_2010/、2012年11月のSEERデータ提出物に基づいて、2013年にSEERウェブサイトに掲載 G.Kohler and C.Milstein,Nature 256:495-497(1975) P.M.Alzari et al,Annual Rev.Immunol.,6:555-580(1988) Sai-Hong Ignatius Ou,et al,Front Oncol.2014;4:58 Nature Genetics 44,852-860(2012) Bruggemann et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:6709-6713(1989)
本発明は、AXLタンパク質およびAXLタンパク質のポリペプチドフラグメントに結
合する抗体およびその抗原結合フラグメントを提供する。一部の実施形態において、本発
明は、完全ヒト抗体を含む。
本発明はさらに、様々な免疫原性組成物または治療組成物、例えば造影剤で標識された
抗体、およびAXLを発現する癌、例えば表Iに列挙される組織の癌を診断かつ処置する
ための戦略を提供する。
AXLのcDNA(配列番号1)およびアミノ酸配列(配列番号2)を示す。開始メチオニンには下線が引かれている。オープンリーディングフレームは、核酸191から、終止コドンを含む核酸2875まで延在する。 AXL抗体の核酸配列およびアミノ酸配列。図2Aは、M77-297b81.1.1重鎖のcDNA(配列番号3)およびアミノ酸配列(配列番号4)を示す。二重下線が引かれているのは重鎖可変領域であり、下線が引かれているのはマウスIgG2b重鎖の定常領域である。図2Bは、M77-297b81.1.1軽鎖のcDNA(配列番号5)およびアミノ酸配列(配列番号6)を示す。二重下線が引かれているのは軽鎖可変領域であり、下線が引かれているのはマウスカッパ定常領域である。 M77-297b81.1.1抗体のアミノ酸配列。図3Aは、M77-297b81.1.1重鎖のアミノ酸配列(配列番号7)を示す。CDR領域(kabatナンバリングに基づく)は、イタリック体である。二重下線が引かれているのは重鎖可変領域(配列番号8)であり、下線が引かれているのはマウスIgG2b定常領域である。図3Bは、M77-297b81.1.1軽鎖のアミノ酸配列(配列番号9)を示す。CDR領域(kabatナンバリングに基づく)は、イタリック体である。二重下線が引かれているのは軽鎖可変領域(配列番号10)であり、下線が引かれているのはマウスカッパ定常領域である。 M77-297b81.1.1重鎖可変領域の、ヒトIg生殖系列に対するアラインメント。 M77-297b81.1.1軽鎖可変領域の、ヒトIg生殖系列に対するアラインメント。 IHCによる、癌患者標本におけるAXLタンパク質の検出。図5Aおよび5Bは、肉腫標本を示す。図5Cおよび図5Dは、膵臓癌標本を示す。図5Eおよび図5Fは、黒色腫標本を示す。図5Gおよび図5Hは、卵巣癌標本を示す。図5Iおよび図5Jは、肺癌標本を示す。M77-297b81.1.1と表したAXL MAbが、図5A、図5C、図5E、図5G、および図5Iに示される。ネガティブコントロール抗体が、図5B、図5D、図5F、図5H、および図5Jに示される。 3つの細胞株、図6A(i)NCI-H292細胞、図6A(ii)HCC827細胞、および図6A(iii)NCI-H727細胞由来のFFPE細胞ブロックサンプルにおけるAXL発現の、RNA ISHによる検出。 3つの細胞株(NCI-H292細胞、HCC827細胞、およびNCI-H727細胞)由来のFFPE細胞ブロックサンプルにおけるAXL発現の、IHCによる、Cell Signalingウサギモノクローナル抗体[C89E7](図6B(i)、6B(ii)、および6B(iii))、ならびにR&Dヤギポリクローナル抗体[AF154](図6B(iv)、6B(v)、および6B(vi))を用いた検出。図6B(i):抗AXL抗体[C89E7]によるNCI-H292細胞。図6B(ii):抗AXL抗体[C89E7]によるHCC827細胞。図6B(iii):抗AXL抗体[C89E7]によるNCI-H727細胞。図6B(iv):抗AXL抗体[AF154]によるNCI-H292細胞。図6B(v):抗AXL抗体[AF154]によるHCC827細胞。図6B(vi):抗AXL抗体[AF154]によるNCI-H727。 AXL陰性癌標本における抗AXL抗体免疫組織化学(IHC)の比較。乳房(図7A~図7D)、肝細胞(図7E~図7H)、および結腸(図7I~図7L)の癌腫標本におけるAXL非特異的IHC染色の検出。V77-2a37.1(図7A、図7E、図7I)、M77-297b81.1.1(図7B、図7F、図7J)、AXL(C89E7)(図7C、図7G、図7K)、およびマウスIgG1ネガティブコントロール(図7D、図7H、図7L)で実行されたIHCアッセイ。結果は、癌標本における、AXL(C89E7)による、より多くの非特異的IHC染色を示し、AXL mRNA発現が制限されていた(図7C、図7G、図7K;矢印参照)。
節の概要
I.)定義
II.)AXL抗体
III.)AXLを発現する癌の診断
IV.)AXLを発現する癌の処置
V.)抗体ベース治療のための、標的としてのAXL
VI.)AXL ADCカクテル
VII.)併用療法
VIII.)キット/製造品
I.)定義:
別段の定めがない限り、本明細書中で用いられる全ての技術用語、表記、および他の科
学用語または専門用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される
意味を有することが意図される。場合によっては、一般的に理解される意味を有する用語
は本明細書中で、明瞭にするために、かつ/または容易に参照するために定義されており
、本明細書におけるそのような定義の包含は、当該技術分野において一般に理解されるも
のに対して実質的な差異を表すと解釈されるべきではない。本明細書中で記載または参照
される技術および手順の多くは、当業者によって、従来の方法論、例えば、Sambro
ok et al., Molecular Cloning:A Laborator
y Manual 2nd. edition (1989) Cold Spring
Harbor Laboratory Press, Cold Spring Ha
rbor, N.Y.に記載される、広く利用されている分子クローニング方法論を用い
て、よく理解され、かつ一般的に使用される。必要に応じて、市販のキットおよび試薬の
使用を含む手順は、特記しない限り、一般に、製造者が定義したプロトコルおよび/また
はパラメータに従って実施される。
本明細書中で商標名が用いられる場合、商標名の参照はまた、文脈によって他に示され
ない限り、製品の配合、ジェネリック薬、および商標名の製品の医薬品有効成分をも参照
する。
用語「進行癌」、「局所進行癌」、「進行性疾患」、および「局所進行性疾患」は、関
連する組織カプセルを通り抜けた癌を意味し、米国泌尿器科学会(AUA)系に基づくス
テージCの疾患、Whitmore-Jewett系に基づくステージC1~C2の疾患
、ならびにTNM(腫瘍、結節、転移)系に基づくステージT3~T4およびN+疾患を
含むことを意味する。一般に、局所進行性疾患の患者に外科手術は推奨されず、当該患者
は、臨床的に局在化した(臓器限局的)癌に苦しむ患者と比較して、結果が実質的に良好
でない。
「本来のグリコシル化パターンを変更する」とは、本明細書中で、本来の配列AXLに
見出される1つもしくは複数の炭水化物部分を(基本的なグリコシル化部位を除去するこ
とによって、または化学的手段および/もしくは酵素的手段によってグリコシル化を除去
することによって)欠失させること、かつ/または本来の配列AXL中に存在しない1つ
または複数のグリコシル化部位を加えることを意味することが意図される。また、当該フ
レーズは、天然タンパク質のグリコシル化における質的変化を含み、存在する様々な炭水
化物部分の性質および割合の変化を含む。
用語「類似体」は、別の分子(例えばAXL関連タンパク質)と構造的に類似する、ま
たは類似もしくは対応する属性を共有する分子を指す。例えば、AXLタンパク質の類似
体は、AXLに特異的に結合する抗体またはT細胞によって特異的に結合され得る。
用語「抗体」は、別段の明確な指示がない限り、最も広い意味で用いられる。したがっ
て、「抗体」は、天然に存在するものであってもよいし、従来のハイブリドーマ技術によ
って産生されるモノクローナル抗体等の人工的なものであってもよい。AXL抗体は、モ
ノクローナル抗体およびポリクローナル抗体、ならびにこれらの抗体の抗原結合ドメイン
および/または1つもしくは複数の相補性決定領域を含有するフラグメントを含む。本明
細書中で用いられる用語「抗体」は、AXLに特異的に結合し、かつ/または所望の生物
活性を示すあらゆる形態の抗体またはそのフラグメントを指し、そして特に、AXLに特
異的に結合し、かつ/または所望の生物活性を示すものであれば、モノクローナル抗体(
全長モノクローナル抗体が挙げられる)、ポリクローナル抗体、多特異的抗体(例えば二
重特異的抗体)、および抗体フラグメントを包含する。あらゆる特異的抗体が、本明細書
中で提供される方法および組成物に用いられ得る。ゆえに、一実施形態において、用語「
抗体」は、標的抗原に対する特異的結合部位を組み合わせて形成する、軽鎖免疫グロブリ
ン分子由来の少なくとも1つの可変領域、および重鎖分子由来の少なくとも1つの可変領
域を含む分子を包含する。一実施形態において、抗体はIgG抗体である。例えば、抗体
は、IgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4抗体である。本方法および本組成物
に有用な抗体は、細胞培養で、ファージ内で、またはウシ、ウサギ、ヤギ、マウス、ラッ
ト、ハムスター、モルモット、ヒツジ、イヌ、ネコ、サル、チンパンジー、および類人猿
が挙げられるがこれらに限定されない種々の動物内で、作出され得る。したがって、一実
施形態において、本発明の抗体は、哺乳動物抗体である。初期抗体を単離し、または特異
性もしくは結合力特性が変更された変異体を生じさせるために、ファージ技術が用いられ
得る。そのような技術はルーチンであり、当該技術分野において周知である。一実施形態
において、抗体は、当該技術分野において知られている組換え手段によって生産される。
例えば、組換え抗体は、抗体をコードするDNA配列を含むベクターで宿主細胞をトラン
スフェクトすることによって、生産され得る。1つまたは複数のベクターが用いられて、
宿主細胞中の少なくとも1つのVLおよび1つのVH領域を発現するDNA配列をトラン
スフェクトすることができる。抗体の作出および生産の組換え手段の例示的な記載として
、Delves, ANTIBODY PRODUCTION:ESSENTIAL T
ECHNIQUES (Wiley, 1997); Shephard, et al
, MONOCLONAL ANTIBODIES (Oxford Universi
ty Press, 2000); Goding, MONOCLONAL ANTI
BODIES:PRINCIPLES AND PRACTICE (Academic
Press, 1993);およびCURRENT PROTOCOLS IN IM
MUNOLOGY (John Wiley & Sons,最新版)が挙げられる。本
発明の抗体は、所望の機能を媒介する抗体の有効性を高めるように、組換え手段によって
修飾されてよい。ゆえに、組換え手段を用いた置換によって抗体が修飾されてよいことは
、本発明の範囲内である。典型的には、置換は保存的置換であろう。例えば、抗体の定常
領域における少なくとも1つのアミノ酸が、異なる残基で置換されてよい。例えば、米国
特許第5624821号明細書、米国特許第6194551号明細書、国際公開第99/
58572号パンフレット、およびAngal,et al,Mol.Immunol.
30:105-08(1993)参照。アミノ酸の修飾として、アミノ酸の欠失、付加、
および置換が挙げられる。場合によっては、そのような変更は、不所望の活性、例えば補
体依存性細胞傷害を減少させるようになされる。頻繁に、抗体は、検出可能なシグナルを
提供する物質を、共有結合または非共有結合のいずれかで結合することによって、標識さ
れる。幅広い種類の標識技術および結合技術が知られており、科学文献および特許文献の
双方において広範に報告されている。当該抗体は、正常なAXLまたは欠陥のあるAXL
への結合に関してスクリーニングされてよい。例えば、ANTIBODY ENGINE
ERING:A PRACTICAL APPROACH (Oxford Unive
rsity Press, 1996)参照。所望の生物活性を有する適切な抗体が、以
下が挙げられるがそれらに限定されないインビトロアッセイを用いて、同定され得る:増
殖、遊走、接着、軟寒天増殖、血管新生、細胞間コミュニケーション、アポトーシス、輸
送、シグナル伝達、および以降の腫瘍増殖の阻害等のインビボアッセイ。本明細書中で提
供される抗体はまた、診断用途にも有用であり得る。当該抗体は、捕捉抗体または非中和
抗体として、抗原の受容体結合活性または生物活性を阻害することなく特異的抗原に結合
する能力に関して、スクリーニングされてよい。中和抗体として、当該抗体は、競合結合
アッセイに有用であり得る。当該抗体はまた、AXLまたはその受容体を定量化するのに
用いられ得る。
本明細書中で用いられる用語、抗体の「抗原結合部分」、「抗体フラグメント」、また
は「抗原結合フラグメント」(または単に「抗体部分」)は、抗原(例えば、AXLおよ
び変異体;図1)に特異的に結合する能力を保持するAXL抗体の1つまたは複数のフラ
グメントを指す。抗体の抗原結合機能は、全長抗体のフラグメントによって実行され得る
ことが示された。用語、抗体の「抗原結合部分」に包含される結合フラグメントの例とし
て、(i)V、V、C、およびCH1のドメインからなる一価のフラグメントであ
るFabフラグメント;(ii)ヒンジ領域にてジスルフィド架橋によって連結される2
つのFabフラグメントを含む二価フラグメントであるF(ab’)フラグメント;(
iii)VドメインおよびCH1ドメインからなるFdフラグメント;(iv)抗体の
単腕のVドメインおよびVドメインからなるFvフラグメント、(v)Vドメイン
からなるdAbフラグメント(Ward et al.,(1989)Nature 341:544-546);ならびに(v
i)単離された相補性決定領域(CDR)が挙げられる。さらに、Fvフラグメントの2
つのドメイン、VおよびVは、別々の遺伝子によってコードされているが、これらは
、組換え法を用いて、単一のタンパク質鎖として構成されることを可能にする合成リンカ
ーによって結合されて、V領域およびV領域が対になって一価の分子(単鎖Fv(s
cFv)として知られている;例えば、Bird et al.(1988)Scien
ce 242:423-426;およびHuston et al.(1988)Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883参照)が形成され
得る。そのような一本鎖抗体はまた、用語、抗体の「抗原結合部分」に包含されることが
意図される。当該抗体フラグメントは、当業者に知られている従来技術を用いて得られ、
そしてフラグメントは、無傷抗体と同じようにして、有用性に関してスクリーニングされ
る。
AXLに特異的な抗体を生じさせるために、本明細書中で用いられる「抗原」のあらゆ
る形態が用いられ得る。ゆえに、誘発抗原は、単一のエピトープ、複数のエピトープ、ま
たはタンパク質全体の単独であってもよいし、当該技術分野において知られている1つま
たは複数の免疫原性増強剤と組み合わされたものであってもよい。誘発抗原は、単離され
た全長タンパク質であっても、細胞表面タンパク質(例えば、抗原の少なくとも一部でト
ランスフェクトされた細胞で免疫化する)であっても、可溶性タンパク質(例えば、タン
パク質の細胞外ドメイン部分のみで免疫化する)であってもよい。抗原は、遺伝子組換え
細胞内で産生され得る。抗原をコードするDNAは、ゲノムであっても非ゲノム(例えば
cDNA)であってもよく、細胞外ドメインの少なくとも一部をコードする。本明細書中
で用いられる用語、抗原の文脈における「部分(一部)」は、必要に応じて、注目する抗
原の免疫原性エピトープを構成するための、最小限の数のアミノ酸または核酸を指す。注
目する細胞の形質転換に適したあらゆる遺伝的ベクターが使用され得、アデノウイルスベ
クター、プラスミド、および非ウイルスベクター、例えばカチオン性脂質が挙げられるが
、これらに限定されない。一実施形態において、本明細書中の方法および組成物の抗体は
、注目するAXLの細胞外ドメインの少なくとも一部に特異的に結合する。
本明細書中で提供される抗体またはその抗原結合フラグメントは、「生物活性剤」に結
合されてよい。 本明細書中で用いられる用語「生物活性剤」は、抗原に結合し、かつ/
または細胞殺傷性の毒素を増強するように所望の生物効果を増強もしくは媒介するあらゆ
る合成化合物または天然化合物を指す。一実施形態において、本発明に有用な結合フラグ
メントは、生物活性フラグメントである。本明細書中で用いられる用語「生物活性」は、
所望の抗原性エピトープに結合し、かつ生物効果を直接的にまたは間接的に発揮すること
ができる抗体または抗体フラグメントを指す。直接的な効果として、増殖シグナルの調節
、刺激、および/または阻害、抗アポトーシスシグナルの調節、刺激および/または阻害
、アポトーシスシグナルまたは壊死シグナルの調節、刺激および/または阻害、ADCC
カスケードの調節、刺激、および/または阻害、ならびにCDCカスケードの調節、刺激
、および/または阻害が挙げられるが、これらに限定されない。
「二重特異的」抗体もまた、本方法および本組成物に有用である。本明細書中で用いら
れる用語「二重特異的抗体」は、少なくとも2つの異なる抗原エピトープに対する結合特
異性を有する抗体、典型的にはモノクローナル抗体を指す。一実施形態において、エピト
ープは、同じ抗原に由来する。別の実施形態において、エピトープは、2つの異なる抗原
に由来する。二重特異的抗体を作製する方法が、当該技術分野において知られている。例
えば、二重特異的抗体は、2つの免疫グロブリン重鎖/軽鎖対の共発現を用いて、組換え
により生産され得る。例えば、Milstein et al,Nature 305:
537-39(1983)参照。これ以外にも、二重特異的抗体は、化学結合を用いて調
製され得る。例えば、Brennan,et al.,Science 229:81(
1985)参照。二重特異的抗体として、二重特異的抗体フラグメントが挙げられる。例
えば、Hollinger,et al,Proc.Natl.Acad.Sci.U.
S.A.90:6444-48(1993)、Gruber,et al,J.Immu
nol.152:5368(1994)参照。
本明細書中に記載されるモノクローナル抗体として、具体的には、一部の重鎖および/
または軽鎖が、特定の種に由来する抗体または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属
する抗体中の対応する配列と同一または相同である一方、残りの鎖が、別の種に由来する
抗体または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一また
は相同である「キメラ」抗体、ならびに当該抗体のフラグメントが挙げられるが、標的抗
原に特異的に結合し、かつ/または所望の生物活性を示す場合に限る(米国特許第481
6567号明細書;およびMorrison et al,Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA 81:6851-6855(1984))。
用語「化学療法剤」は、腫瘍増殖を阻害するのに有効な全ての化合物を指す。化学療法
剤の非限定的な例として、アルキル化剤;例えば、窒素マスタード、エチレンイミン化合
物、およびアルキルスルホネート;代謝拮抗薬、例えば、葉酸、プリンまたはピリミジン
拮抗薬;有糸分裂阻害剤、例えば、抗チューブリン剤、例えばビンカアルカロイド、アウ
リスタチン、およびポドフィロ毒素の誘導体;細胞傷害性抗生物質;DNAの発現または
複製に損傷を与え、または妨害する化合物、例えばDNAマイナーグルーブバインダ;な
らびに増殖因子受容体アンタゴニストが挙げられる。また、化学療法剤として、細胞傷害
剤(本明細書中で定義される)、抗体、生体分子、および小分子が挙げられる。
用語「化合物」は、化合物それ自体、ならびに、明示的に記載されているか否かに拘ら
ず、そして文脈が、以下のものが除外されるべきであることを明確にしていない限り:化
合物の無晶形および結晶形(多形形態が挙げられ、これらの形態は、混合物の一部であっ
ても、単離体であってもよい);化合物の遊離酸形態および遊離塩基形態(典型的には、
本明細書中で提供される構造において示される形態である);化合物の異性体(光学異性
体、および互変異性異性体を指し、光学異性体として、エナンチオマーおよびジアステレ
オマー、キラル異性体および非キラル異性体が挙げられ、光学異性体として、単離された
光学異性体、ならびにラセミおよび非ラセミ混合物が挙げられる光学異性体の混合物が挙
げられ;異性体は、単離された形態であっても、1つまたは複数の他の異性体との混合物
であってもよい);化合物の同位体(ジュウテリウム含有化合物およびトリチウム含有化
合物が挙げられ、放射性同位体を含有する化合物が挙げられ、治療上、そして、診断上有
効な放射性同位体が挙げられる);化合物の多量体の形態(二量体、三量体等の形態が挙
げられる);化合物の塩、好ましくは薬学的に許容可能な塩(酸付加塩および塩基付加塩
が挙げられ、有機対イオンおよび無機対イオンを有する塩が挙げられ、そして双性イオン
形態が挙げられ、化合物が2つ以上の対イオンと結合するならば、2つ以上の対イオンは
、同じであっても異なっていてもよい);ならびに化合物の溶媒和物(ヘミソルベート、
モノソルベート、ジソルベート等が挙げられ、有機溶媒和物および無機溶媒和物が挙げら
れ、前記無機溶媒和物として水和物が挙げられ:化合物が2つ以上の溶媒分子と結合する
ならば、2つ以上の溶媒分子は、同じであっても異なってもよい)を指し、かつこれらを
包含する。一部の例では、本明細書中でなされる本発明の化合物への言及は、先の形態、
例えば塩および/または溶媒和物の1つまたは複数への明示的な言及を含むこととなる;
しかしながら、この言及は、強調するためにあるに過ぎず、先で同定された先の形態の他
のものを排除すると解釈されるべきではない。
用語「相補性決定領域」および「CDR」は、抗原特異性および結合親和性を付与する
抗体可変領域内のアミノ酸の非連続配列を指すことが、当該技術分野において知られてい
る。一般に、各重鎖可変領域内に3つのCDR(CDR-H1、CDR-H2、CDR-
H3)があり、各軽鎖可変領域内に3つのCDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR
-L3)がある。
所与のCDRの正確なアミノ酸配列境界は、Kabat et al.(1991),
「Sequences of Proteins of Immunological
Interest」,5th Ed.Public Health Service,N
ational Institutes of Health,Bethesda,MD
(「Kabat」ナンバリングスキーム)、Al-Lazikani et al.,(
1997)JMB 273,927-948(「Chothia」ナンバリングスキーム
)、MacCallum et al.,J.Mol.Biol.262:732-74
5(1996),「Antibody-antigen interactions:C
ontact analysis and binding site topogra
phy」,J.Mol.Biol.262,732-745.(「Contact」ナン
バリングスキーム)、Lefranc MP et al,「IMGT unique
numbering for immunoglobulin and T cell
receptor variable domains and Ig superfa
mily V-like domains」,Dev Comp Immunol,20
03 Jan;27(l):55-77(「IMGT」ナンバリングスキーム)、および
Honegger A and Pliickthun A,「Yet another
numbering scheme for immunoglobulin var
iable domains:an automatic modeling and
analysis tool」,J Mol Biol,2001 Jun 8;309
(3):657-70(AHoナンバリングスキーム)によって記載されるものが挙げら
れる、いくつかの周知のスキームのいずれかを用いて、容易に判断され得る。
所与のCDRの境界は、同定に用いられるスキームに応じて変わり得る。例えば、Ka
batスキームは、構造アラインメントに基づく一方、Chothiaスキームは、構造
情報に基づく。KabatスキームおよびChothiaスキームの双方のナンバリング
は、最も一般的な抗体領域配列長に基づいており、挿入文字、例えば、「30a」によっ
て対応される挿入および欠失が、いくつかの抗体において現れる。2つのスキームは、異
なる位置に、ある挿入および欠失(「indel」)を配置して、異なるナンバリングが
生じる。Contactスキームは、複雑な結晶構造の分析に基づいており、多くの点で
、Chothiaナンバリングスキームに類似する。後出の表VIIは、Kabat、C
hothia、およびContactのスキームによってそれぞれ同定された、CDR-
L1、CDR-L2、CDR-L3、およびCDR-H1、CDR-H2、CDR-H3
の位置を列挙する。CDR-H1について、残基ナンバリングが、KabatおよびCh
othiaのナンバリングスキームの双方を用いて列挙されている。
ゆえに、別段の定めがない限り、所与の抗体またはその領域、例えば可変領域の用語「
CDR」および「相補性決定領域」、ならびに抗体またはその領域の個々のCDR(例え
ば、CDR-H1、CDR-H2)は、本明細書中で先に記載される既知のスキームのい
ずれかによって定義される相補性決定領域を包含すると理解されるべきである。場合によ
っては、Kabat、Chothia、またはContactの方法によって定義される
CDR等の、特定のCDR(複数可)の同定のためのスキームが、特定される。他の場合
には、CDRの特定のアミノ酸配列が与えられる。
本明細書中で用いられる用語「保存的置換」は、当業者に知られており、概して、生じ
る分子の生物活性を変えることなくなされ得るアミノ酸の置換を指す。当業者であれば、
一般に、ポリペプチドの非必須領域における単一のアミノ酸置換が、生物活性を実質的に
変えないことを認識する(例えば、Watson,et al,MOLECULAR B
IOLOGY OF THE GENE,The Benjamin/Cummings
Pub.Co.,p.224(4th Edition 1987)参照)。そのよう
な例示的な置換は、好ましくは、表IIおよび表III(a-b)に記載される置換に従
ってなされる。例えば、そのような変更として、イソロイシン(I)、バリン(V)、お
よびロイシン(L)のいずれかを、これらの疎水性アミノ酸のあらゆる他の疎水性アミノ
酸の代わりに;アスパラギン酸(D)をグルタミン酸(E)の代わりに、そしてその逆;
グルタミン(Q)をアスパラギン(N)の代わりに、そしてその逆;そしてセリン(S)
をスレオニン(T)の代わりに、そしてその逆を用いることが挙げられる。他の置換もま
た、特定のアミノ酸の環境およびそのタンパク質の三次元構造における役割に応じて、保
存的であるとみなされ得る。例えば、グリシン(G)およびアラニン(A)は、アラニン
(A)およびバリン(V)がそうであるように、頻繁に交換可能であり得る。比較的疎水
性であるメチオニン(M)は頻繁に、ロイシンおよびイソロイシンと、そして時にはバリ
ンと交換され得る。リシン(K)およびアルギニン(R)は頻繁に、アミノ酸残基の重要
な特徴がその電荷であり、かつこれらの2つのアミノ酸残基の異なるpKが重要でない位
置において、交換可能である。更なる他の変更が、特定の環境において「保存的」である
とみなされ得る(例えば、本明細書中の表III(a);13-15頁「Biochem
istry」2nd ED.Lubert Stryer ed(Stanford U
niversity);Henikoff et al.,PNAS 1992 Vol
89 10915-10919;Lei et al,J Biol Chem 19
95 May 19;270(20):11882-6参照)。他の置換も許容され、経
験的にまたは既知の保存的置換に従って、決定され得る。
本明細書中で用いられる用語「ダイアボディ」は、2つの抗原結合部位を有する小抗体
フラグメントを指し、このフラグメントは、軽鎖可変ドメイン(V)に連結された重鎖
可変ドメイン(V)を、同じポリペプチド鎖(V-V)内に含む。同じ鎖上の2つ
のドメイン間の対形成を可能にするには短か過ぎるリンカーを用いることによって、ドメ
インは、別の鎖の相補的ドメインと対形成させられて、2つの抗原結合部位が生じる。ダ
イアボディは、例えば、EP404097号明細書;国際公開第93/11161号パン
フレット;およびHollinger et al,Proc.Natl.Acad.S
ci.USA 90:6444-48(1993)においてより完全に記載されている。
AXL発現細胞に及ぼすAXL結合剤の効果の文脈における用語「枯渇」は、AXL発
現細胞の数の減少またはその除去を指す。
用語「遺伝子産物」は、本明細書中で、ペプチド/タンパク質またはmRNAを示すの
に用いられる。例えば、「本発明の遺伝子産物」は時折、本明細書中で、「癌アミノ酸配
列」、「癌タンパク質」、「表Iに列挙される癌のタンパク質」、「癌mRNA」、「表
Iに列挙される癌のmRNA」等と呼ばれる。一実施形態において、癌タンパク質は、図
1の核酸によってコードされる。癌タンパク質は、フラグメントであってもよいし、代わ
りに、図1の核酸によってコードされる全長タンパク質であってもよい。一実施形態にお
いて、癌アミノ酸配列が、配列同一性または類似性を判定するために用いられる。別の実
施形態において、配列は、図1の核酸によってコードされるタンパク質の、天然に存在す
る対立遺伝子変異体である。別の実施形態において、配列は、本明細書中でさらに記載さ
れる配列変異体である。
「ヘテロ結合」抗体は、本方法および本組成物に有用である。本明細書中で用いられる
用語「ヘテロ結合抗体」は、2つの共有結合した抗体を指す。そのような抗体は、架橋剤
を用いることを含む、合成タンパク質化学において知られている方法を用いて、調製され
得る。例えば、米国特許第4676980号明細書参照。
用語「相同体」は、例えば、対応する位置にて同じであるまたは類似する化学残基の配
列を有することによって、別の分子との相同性を示す分子を指す。
一実施形態において、本明細書中で提供される抗体は、「ヒト抗体」である。 本明細
書中で用いられる用語「ヒト抗体」は、相補性決定領域(CDR)を含む軽鎖および重鎖
の配列の本質的に全配列が、ヒト遺伝子に由来する抗体を指す。一実施形態において、ヒ
トモノクローナル抗体が、トリオーマ技術、ヒトB細胞技術(例えば、Kozbor,e
t al,Immunol.Today 4:72(1983)参照)、EBV形質転換
技術(例えば、Cole et al.MONOCLONAL ANTIBODIES
AND CANCER THERAPY 77-96(1985)参照)によって、また
はファージディスプレイ(例えば、Marks et al,J.Mol.Biol.2
22:581(1991)参照)を用いて、調製される。特定の実施形態において、ヒト
抗体は、トランスジェニックマウスにおいて作出される。そのような部分的ヒト抗体から
完全ヒト抗体までを作製するための技術が、当該技術分野において知られており、そのい
ずれの技術も用いられ得る。1つの特に好ましい実施形態に従えば、完全ヒト抗体配列は
、ヒト重鎖および軽鎖抗体の遺伝子を発現するように操作されたトランスジェニックマウ
スにおいて、作製される。ヒト抗体を産生するトランスジェニックマウスの調製の例示的
な記載が、国際公開第02/43478号パンフレット、米国特許第6657103号明
細書(Abgenix)およびその後続において見出される。次いで、所望の抗体を産生
するトランスジェニックマウス由来のB細胞が融合されて、抗体の連続産生用のハイブリ
ドーマ細胞株が作製され得る。例えば、米国特許第5569825号明細書;米国特許第
5625126号明細書;米国特許第5633425号明細書;米国特許第566101
6号明細書;および米国特許第5545806号明細書;ならびにJakobovits
,Adv.Drug Del.Rev.31:33-42(1998);Green,e
t al,J.Exp.Med.188:483-95(1998)参照。
本明細書中で用いられる用語「ヒト化抗体」は、非ヒト(例えばマウス)抗体およびヒ
ト抗体由来の配列を含有する抗体の形態を指す。そのような抗体は、非ヒト免疫グロブリ
ンに由来する最小配列を含有するキメラ抗体である。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも
1つ、典型的には2つの可変ドメインの実質的に全てを含むこととなり、超可変ループの
全てまたは実質的に全てが、非ヒト免疫グロブリンの超可変ループに対応し、FR領域の
全てまたは実質的に全てが、ヒト免疫グロブリン配列のFR領域である。ヒト化抗体はま
た、場合によっては、免疫グロブリン定常領域(Fc)の少なくとも一部を、典型的には
ヒト免疫グロブリンの少なくとも一部を含むこととなる。例えば、Cabillyの米国
特許第4816567号明細書;Queen et al.(1989)Proc.Na
t’l Acad.Sci.USA 86:10029-10033;およびANTIB
ODY ENGINEERING:A PRACTICAL APPROACH(Oxf
ord University Press 1996)参照。
本明細書中で用いられる用語「阻害する」または「阻害」は、測定可能な量だけ減少さ
せること、または完全に防止することを意味する。
フレーズ「単離された」または「生物学的に純粋な」は、その天然の状態で見出される
ままの物質に通常付随する成分を実質的にまたは本質的に含まない物質を指す。ゆえに、
本発明に従う、単離されたペプチドは好ましくは、そのインサイチュ環境においてペプチ
ドに通常付随する物質を含有しない。例えば、AXL遺伝子以外の遺伝子に対応し、もし
くはこれに相補的であり、またはAXL遺伝子産物もしくはそのフラグメント以外のポリ
ペプチドをコードする混入ポリヌクレオチドからポリヌクレオチドが実質的に分離される
場合に、ポリヌクレオチドは「単離される」と言われる。当業者は、単離されたAXLポ
リヌクレオチドを得るための核酸単離手順を容易に使用することができる。タンパク質は
、例えば、タンパク質に通常付随する細胞成分からAXLタンパク質を取り出すための物
理的、機械的、または化学的方法が使用される場合に、「単離される」と言われる。当業
者であれば、標準的な精製方法を容易に使用して、単離されたAXLタンパク質を得るこ
とができる。これ以外にも、化学的手段によって、単離されたタンパク質が調製され得る
適切な「標識」として、放射性核種、酵素、基質、補因子、阻害剤、蛍光部分、化学発
光部分、磁性粒子等が挙げられる。そのような標識の使用を教示する特許として、米国特
許第3817837号明細書;米国特許第3850752号明細書;米国特許第3939
350号明細書;米国特許第3996345号明細書;米国特許第4277437号明細
書;米国特許第4275149号明細書;および米国特許第4366241号明細書が挙
げられる。また、本明細書中で提供される抗体は、フルオロボディの抗原結合成分として
有用であり得る。例えば、Zeytun et al.,Nat.Biotechnol
.21:1473-79(2003)参照。
用語「哺乳動物」は、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、およびヒト
が挙げられる哺乳動物として分類されるあらゆる生物を指す。本発明の一実施形態におい
て、哺乳動物はマウスである。本発明の別の実施形態において、哺乳動物はヒトである。
用語「転移性癌」および「転移性疾患」は、局所リンパ節または遠隔部位に転移した癌
を意味し、AUA系に基づくステージD疾患、およびTNM系に基づくステージTxNx
M+を含むことを意味する。
本明細書中で用いられる用語「モジュレータ」、「試験化合物」もしくは「薬物候補」
または文法上の等価物は、癌表現型、癌配列、例えば核酸配列もしくはタンパク質配列の
発現、または癌配列の効果(例えば、シグナル伝達、遺伝子発現、タンパク質相互作用等
)を直接的または間接的に変更する能力について試験されることになるあらゆる分子、例
えばタンパク質、オリゴペプチド、有機小分子、多糖類、ポリヌクレオチド等を記載する
。 一態様において、モジュレータは、本発明の癌タンパク質の作用を中和することとな
る。「中和する」とは、タンパク質の活性が阻害または阻止されて、結果として細胞に作
用することを意味する。別の態様において、モジュレータは、前記タンパク質のレベルを
正常化することによって、本発明の遺伝子およびその対応するタンパク質の効果を中和す
ることとなる。好ましい実施形態において、モジュレータは、発現プロファイル、または
本明細書中で提供される核酸もしくはタンパク質の発現プロファイル、または下流エフェ
クタ経路を変更する。一実施形態において、モジュレータは、癌の表現型を、例えば正常
な組織フィンガープリントまで、抑制する。別の実施形態において、モジュレータは、癌
の表現型を誘導した。一般に、複数のアッセイ混合物が、様々な薬剤濃度と並行して実行
されて、様々な濃度に対する様々な反応が得られる。典型的には、これらの濃度の1つ、
すなわちゼロ濃度、または検出レベル未満のものが、ネガティブコントロールとして機能
する。
モジュレータ、薬物候補、または試験化合物が、多数の化学クラスを包含するが、典型
的にはそれらは、有機分子、好ましくは分子量が100ダルトンを超えるが約2,500
ダルトン未満である有機小分子化合物である。好ましい小分子は、2000D未満、15
00D未満、1000D未満、または500D未満である。候補薬剤は、タンパク質との
構造的相互作用、特に水素結合に必須の官能基を含み、典型的には、少なくともアミン、
カルボニル、ヒドロキシル、またはカルボキシル基、好ましくは少なくとも2つの官能性
化学基を含む。候補薬剤は多くの場合、先の官能基の1つまたは複数で置換された環状炭
素構造もしくは複素環構造、および/または芳香族構造もしくは多環芳香族構造を含む。
モジュレータはまた、生体分子、例えばペプチド、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、
ピリミジン、誘導体、構造類似体、またはそれらの組合せを含む。ペプチドが特に好まし
い。モジュレータの一クラスが、例えば約5から約35個のアミノ酸のペプチドであり、
約5から約20個のアミノ酸が好ましく、約7から約15個が特に好ましい。好ましくは
、癌調節タンパク質は可溶性であり、非膜貫通領域を含み、かつ/または可溶性の一助と
なるN末端Cysを有する。一実施形態において、フラグメントのC末端は、遊離酸とし
て維持され、N末端は、カップリングの一助となる遊離アミン、すなわちシステインであ
る。一実施形態において、本発明の癌タンパク質は、本明細書中で考察されるような免疫
原に結合される。一実施形態において、癌タンパク質は、BSAに結合される。本発明の
、例えば好ましい長さのペプチドは、互いに、または他のアミノ酸に連結されて、より長
いペプチド/タンパク質を生成し得る。調節ペプチドは、先で概説されるような天然に存
在するタンパク質の消化物、ランダムペプチド、または「偏った」ランダムペプチドであ
ってよい。好ましい実施形態において、ペプチド/タンパク質ベースのモジュレータは、
本明細書中で定義される抗体およびそのフラグメントである。
本明細書中で用いられる用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均質な抗体の集団か
ら得られる抗体を指す。すなわち、集団を構成する個々の抗体は、少量存在し得る、天然
に起こり得る突然変異を除いて、同一である。モノクローナル抗体は、高度に特異的であ
り、単一の抗原性エピトープに対して向けられる。対照的に、従来の(ポリクローナル)
抗体調製物は、典型的には、異なるエピトープに対して向けられる(またはこれらに特異
的な)多数の抗体を含む。一実施形態において、ポリクローナル抗体は、複数の抗原エピ
トープを含有する単一の抗原内のエピトープの特異性、親和性、または結合力が異なる、
複数のモノクローナル抗体を含有する。修飾語「モノクローナル」は、抗体の実質的に均
質な集団から得られる抗体の特性を示しており、特定のいずれかの方法による抗体の生産
を必要とすると解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って用いられることになる
モノクローナル抗体は、Kohler et al.,Nature 256:495(1975)によって最初に記載された
ハイブリドーマ法によって作製されてもよいし、組換えDNA法によって作製されてもよ
い(例えば、米国特許第4816567号明細書参照)。「モノクローナル抗体」はまた
、例えば、Clackson et al.,Nature 352:624-628(
1991)およびMarks et al,J.Mol.Biol.222:581-5
97(1991)に記載される技術を用いて、ファージ抗体ライブラリから単離されても
よい。これらのモノクローナル抗体は、通常ELISAにより判定されて、一般的には少
なくとも約1μM、より一般的には少なくとも約300nM、典型的には少なくとも約3
0nM、好ましくは少なくとも約10nM、より好ましくは少なくとも約3nM以上のK
dで結合することとなる。
「医薬賦形剤」は、アジュバント、キャリア、pH調整剤および緩衝剤、等張化剤、湿
潤剤、防腐剤等の物質を含む。
「医薬的に許容可能な」は、非毒性であり、不活性であり、かつ/またはヒトもしくは
他の哺乳動物と生理学的に適合する組成を指す。
用語「ポリヌクレオチド」は、リボヌクレオチドもしくはデオキシヌクレオチド、また
はいずれかのタイプのヌクレオチドの修飾形態の、長さが少なくとも10塩基または10
塩基対のヌクレオチドのポリマー形態を意味し、DNAおよび/またはRNAの一本鎖形
態および二本鎖形態を含むことを意味する。当該技術分野において、当該用語は、多くの
場合、「オリゴヌクレオチド」と互換的に用いられる。ポリヌクレオチドは、本明細書中
に開示されるヌクレオチド配列を含んでよく、ここで、例えば図1に示されるチミジン(
T)は、ウラシル(U)であってもよい;この定義は、DNAとRNAとの化学構造の差
異、特にRNA中の4つの主要塩基の1つが、チミジン(T)の代わりにウラシル(U)
であるという観察に関連する。
用語「ポリペプチド」は、少なくとも約4、5、6、7、または8アミノ酸のポリマー
を意味する。本明細書の全体を通して、アミノ酸についての標準的な3文字(表III参
照)または1文字の名称が用いられる。当該技術分野において、当該用語は、多くの場合
、「ペプチド」または「タンパク質」と互換的に用いられる。
「組換え」DNA分子または「組換え」RNA分子は、インビトロでの分子操作に曝さ
れたDNA分子またはRNA分子である。
本明細書中で用いられる用語「一本鎖Fv」、「scFv」または「一本鎖」抗体は、
抗体のVドメインおよびVドメインを含む抗体フラグメントを指し、これらのドメイ
ンは、単一のポリペプチド鎖内に存在する。一般に、Fvポリペプチドはさらに、V
メインとVドメインとの間にポリペプチドリンカーを含み、これによりsFvは、抗原
結合にとって所望の構造を形成することが可能となる。sFvの総説について、Pluc
kthun,THE PHARMACOLOGY OF MONOCLONAL ANT
IBODIES,vol.113,Rosenburg and Moore eds.
Springer-Verlag,New York,pp.269-315(1994
)参照。
本明細書中で用いられる用語「特異的な」および「特異的に結合する」は、標的抗原エ
ピトープへの抗体の選択的結合を指す。抗体は、所定の条件下で、適切な抗原への結合を
、無関係の抗原または抗原混合物への結合と比較することによって、結合の特異性につい
て試験され得る。抗体が、無関係な抗原または抗原混合物に結合するよりも少なくとも2
倍、5倍、7倍、好ましくは10倍以上、適切な抗原に結合するならば、それは特異的で
あるとみなされる。一実施形態において、特異的抗体は、AXL抗原にのみ結合するが、
無関係な抗原には結合しない抗体である。別の実施形態において、特異的抗体は、ヒトA
XL抗原に結合するが、AXL抗原とのアミノ酸相同性が70%、75%、80%、85
%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99
%、またはそれ以上の非ヒトAXL抗原に結合しない抗体である。別の実施形態において
、特異的抗体は、ヒトAXL抗原に結合し、かつマウスAXL抗原に結合するが、ヒト抗
原への結合の程度がより高い抗体である。別の実施形態において、特異的抗体は、ヒトA
XL抗原に結合し、かつ霊長目AXL抗原に結合するが、ヒト抗原への結合の程度がより
高い抗体である。別の実施形態において、特異的抗体は、ヒトAXL抗原およびあらゆる
非ヒトAXL抗原に結合するが、ヒト抗原またはそのあらゆる組合せへの結合の程度がよ
り高い。
本明細書中で用いられる「処置すること」または「治療的」および文法的に関連する用
語は、生存の延長、罹患率の引下げ、および/または代替治療法の副産物である副作用の
軽減等の、疾患のあらゆる結果の何らかの向上を指す;当該技術分野において容易に理解
されるように、疾患の完全根絶が好ましいとはいえ、処置行為の必要条件ではない。
用語「変異体」は、記載されるタイプまたは基準からの変異を示す分子、例えば具体的
に記載されるタンパク質(例えば、図1に示されるAXLタンパク質)の対応する位置に
おいて1つまたは複数の異なるアミノ酸残基を有するタンパク質を指す。 類似体は、変
異体タンパク質の例である。スプライスアイソフォームおよび単一ヌクレオチド多型(S
NP)は、変異体の更なる例である。
本発明の「AXLタンパク質」および/または「AXL関連タンパク質」として、本明
細書中で具体的に同定されるもの(図1参照)、ならびに、本明細書中で概説される方法
または当該技術分野において容易に利用可能な方法に従って、過度の実験をすることなく
単離/作出され、かつ特徴付けされ得る、対立遺伝子変異体、保存的置換変異体、類似体
、および相同体が挙げられる。異なるAXLタンパク質またはそのフラグメントの部分を
組み合わせている融合タンパク質、ならびにAXLタンパク質および異種ポリペプチドの
融合タンパク質もまた挙げられる。そのようなAXLタンパク質は、一括して、AXL関
連タンパク質、本発明のタンパク質、またはAXLと呼ばれる。用語「AXL関連タンパ
ク質」は、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17
、18、19、20、21、22、23、24、25、または25を超えるアミノ酸;あ
るいは少なくとも30、35、40、45、50、55、60、65、70、80、85
、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、1
40、145、150、155、160、165、170、175、180、185、1
90、195、200、225、250、275、280、290、300、325、3
25、350、375、400、425、450、475、500、525、550、5
75、600、625、650、675、700、725、750、775、800、8
10、820、830、840、841、842、843、844、845、850、8
55、860、865、870、875、880、885、890、891、892、8
93、または894以上のアミノ酸のポリペプチドフラグメントまたはAXLタンパク質
配列を指す。
II.)AXL抗体
本発明の別の態様は、AXL関連タンパク質に結合する抗体を提供する(図1参照)。
一実施形態において、AXL関連タンパク質に結合する抗体は、配列番号2のアミノ酸配
列を含むAXLタンパク質に特異的に結合する抗体である。配列番号2のアミノ酸配列を
含むAXLタンパク質に特異的に結合する抗体として、他のAXL関連タンパク質に結合
し得る抗体が挙げられる。例えば、配列番号2のアミノ酸配列を含むAXLタンパク質に
結合する抗体は、AXL変異体等のAXL関連タンパク質、およびその相同体または類似
体に結合し得る。
本発明のAXL抗体は特に、癌(例えば、表I参照)予後アッセイ、画像化、診断、お
よび治療法に有用である。同様に、そのような抗体は、肉腫、膵臓癌、黒色腫、卵巣癌、
または肺癌、および、他の癌においてもAXLが発現または過剰発現される範囲で、他の
癌の処置および/または予後に、有用である。さらに、細胞内発現抗体(例えば一本鎖抗
体)は、AXLの発現が伴う癌、例えば進行性もしくは転移性の肉腫、膵臓癌、黒色腫、
卵巣癌、もしくは肺癌、または他の進行性もしくは転移性の癌の処置に治療上有用である
抗体、具体的にはモノクローナル抗体の調製のための種々の方法が、当該技術分野にお
いて周知である。例えば、抗体は、AXL関連タンパク質、ペプチド、またはフラグメン
トを、単離された形態で、または免疫結合された(immunoconjugated)
形態で用いて、適切な哺乳動物宿主を免疫化することによって、調製され得る(Anti
bodies:A Laboratory Manual,CSH Press,Eds
.,Harlow,and Lane(1988);Harlow,Antibodie
s,Cold Spring Harbor Press,NY(1989))。また、
AXL GST融合タンパク質等の、AXLの融合タンパク質も用いられ得る。特定の実
施形態において、図1のアミノ酸配列の全てまたは大部分を含むGST融合タンパク質が
生産されてから、免疫原として用いられて、適切な抗体が作出される。別の実施形態にお
いて、AXL関連タンパク質が合成されて、免疫原として用いられる。
また、当該技術分野において知られている裸DNA免疫化技術が用いられて(精製され
たAXL関連タンパク質またはAXL発現細胞があってもなくてもよい)、コードされた
免疫原に対する免疫反応が生じる(総説について、Donnelly et al.,1
997,Ann.Rev.Immunol.15:617-648参照)。
図1に示すようなAXLタンパク質のアミノ酸配列が分析されて、抗体を生じさせるた
めのAXLタンパク質の特定の領域が選択され得る。例えば、AXLアミノ酸配列の疎水
性分析および親水性分析が用いられて、AXL構造中の親水性領域が同定される。免疫原
性構造ならびに他の領域およびドメインを示すAXLタンパク質の領域が、当該技術分野
において知られている他の様々な方法、例えばChou-Fasman、Garnier
-Robson、Kyte-Doolittle、Eisenberg、Karplus
-Schultz、またはJameson-Wolfの分析を用いて、容易に同定され得
る。親水性プロファイルは、Hopp,T.P.and Woods,K.R.,198
1,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78:3824-3828の
方法を用いて作成され得る。疎水親水性プロファイルは、Kyte,J.and Doo
little,R.F.,1982,J.Mol.Biol.157:105-132の
方法を用いて作成され得る。アクセス可能残基パーセント(%)プロファイルは、Jan
in J.,1979,Nature 277:491-492の方法を用いて作成され
得る。平均可撓性プロファイルは、Bhaskaran R.,Ponnuswamy
P.K.,1988,Int.J.Pept.Protein Res.32:242-
255の方法を用いて作成され得る。ベータターンプロファイルは、Deleage,G
.,Roux B.,1987,Protein Engineering 1:289
-294の方法を用いて作成され得る。ゆえに、これらのプログラムまたは方法のいずれ
かによって同定された各領域は、本発明の範囲内である。AXL抗体の作出のための好ま
しい方法が、本明細書中で提供される実施例によってさらに説明される。免疫原として用
いるタンパク質またはポリペプチドを調製する方法が、当該技術分野において周知である
。BSA、KLH、または他のキャリアタンパク質等の、キャリアとのタンパク質の免疫
原結合体を調製する方法もまた、当該技術分野において周知である。一部の状況において
、例えばカルボジイミド試薬を用いた直接結合が用いられる;他の場合には、連結試薬、
例えばPierce Chemical Co.,Rockford,ILによって供給
されるものが有効である。AXL免疫原の投与は、多くの場合、当該技術分野において理
解されているように、適切な期間にわたる注射によって、そして適切なアジュバントを用
いて、行われる。免疫スケジュールの間、抗体の力価が測定されて、抗体形成の妥当性を
判定することができる。
AXLモノクローナル抗体は、当該技術分野において周知の様々な手段によって生産さ
れ得る。例えば、所望のモノクローナル抗体を分泌する不死化細胞株が、一般的に知られ
ている、KohlerおよびMilsteinの標準的なハイブリドーマ技術、または抗
体産生B細胞を不死化する改変を用いて、調製される。抗原がAXL関連タンパク質であ
るイムノアッセイによって、所望の抗体を分泌する不死化細胞株がスクリーニングされる
。適切な不死化細胞培養体が同定されると、細胞が増殖されて、抗体がインビトロ培養体
からまたは腹水から生産され得る。
本発明の抗体またはフラグメントはまた、組換え手段によって生産され得る。AXLタ
ンパク質の所望の領域に特異的に結合する領域もまた、複数の種起源のキメラ抗体または
相補性決定領域(CDR)移植抗体の関連で生産され得る。ヒト化AXL抗体またはヒト
AXL抗体もまた生産され得、治療の関連で用いるのに好ましい。非ヒト抗体CDRの1
つまたは複数を、対応するヒト抗体配列の代わりに用いることによって、マウスおよび他
の非ヒト抗体をヒト化する方法が周知である(例えば、Jones et al.,19
86,Nature 321:522-525;Riechmann et al.,1
988,Nature 332:323-327;Verhoeyen et al.,
1988,Science 239:1534-1536参照)。また、Carter
et al.,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:42
85およびSims et al,1993,J.Immunol.151:2296も
参照。
好ましい実施形態において、免疫グロブリン重鎖(VH、DH、およびJHのセグメン
ト)および/またはカッパ軽鎖(VKおよびJK)の遺伝子座に内在性マウス可変セグメ
ントを有するゲノム配列が、全体的にまたは部分的に、ヒト免疫グロブリン重鎖(VH、
DH、およびJH)および/またはカッパ軽鎖(VKおよびJK)の遺伝子座の再配置さ
れていない生殖細胞系可変セグメントを有するヒトゲノム配列と置き換えられているVe
loclmmuneマウス(Regeneron,Tarrytown,NY)を用いて
、本発明のヒトモノクローナル抗体が調製され得る。例えば、米国特許第6586251
号明細書、米国特許第6596541号明細書、米国特許第7105348号明細書、米
国特許第6528313号明細書、米国特許第6638768号明細書、および米国特許
第6528314号明細書参照。
また、本発明のヒト抗体は、HuMAbマウス(Medarex,Inc.)を用いて
作出され得、これは、再配列されていないヒト重鎖(ミューおよびガンマ)およびカッパ
軽鎖免疫グロブリン配列を、内因性ミュー鎖およびカッパ鎖の遺伝子座を不活化する標的
突然変異と一緒にコードするヒト免疫グロブリン遺伝子ミニ遺伝子座を含有する(例えば
、Lonberg,et al.(1994)Nature 368(6474):85
6-859参照)。
別の実施形態において、導入遺伝子および導入染色体上にヒト免疫グロブリン配列を有
するマウス、例えばヒト重鎖導入遺伝子およびヒト軽鎖導入染色体を有するマウスを用い
て、本発明の完全ヒト抗体が生産され得る。本明細書中で「KMマウス」と呼ばれるその
ようなマウスは、Tomizuka et al.(2000)Proc.Natl.A
cad.Sci.USA 97:722-727およびPCT国際公開第02/4347
8号パンフレット(Tomizuka,et al.)に記載されている。
本発明のヒトモノクローナル抗体はまた、ヒト免疫グロブリン遺伝子のライブラリをス
クリーニングするファージディスプレイ法を用いて調製され得る。ヒト抗体を単離するそ
のようなファージディスプレイ法は、当該技術分野において確立されている。例えば:米
国特許第5223409号明細書;米国特許第5403484号明細書;米国特許第55
71698号明細書(Ladner et al.);米国特許第5427908号明細
書および米国特許第5580717号明細書(Dower et al.);米国特許第
5969108号明細書および米国特許第6172197号明細書(McCaffert
y et al.);ならびに米国特許第5885793号明細書;米国特許第6521
404号明細書;米国特許第6544731号明細書;米国特許第6555313号明細
書;米国特許第6582915号明細書、および米国特許第6593081号明細書(G
riffiths et al.)参照。
本発明のヒトモノクローナル抗体はまた、免疫化して直ぐにヒト抗体反応が起こり得る
ようにヒト免疫細胞が再構成されているSCIDマウスを用いて、調製され得る。そのよ
うなマウスは、例えば、米国特許第5476996号明細書および米国特許第56987
67号明細書(Wilson et al.)に記載されている。
加えて、本発明のヒト抗体は、Xenomouse(Amgen Fremont,I
nc.)と呼ばれるヒト重鎖および軽鎖の遺伝子座で操作された、抗体産生のために不活
化されたトランスジェニックマウスを用いる技術で、作出され得る。ヒト抗体を産生する
トランスジェニックマウスを調製する例示的な記載は、米国特許第6657103号明細
書中に見出され得る。また、米国特許第5569825号明細書;米国特許第56251
26号明細書;米国特許第5633425号明細書;米国特許第5661016号明細書
および米国特許第5545806号明細書ならびにMendez,et al.Natu
re Genetics,15:146-156(1998);Kellerman,S
.A.& Green,L.L.,Curr.Opin.Biotechnol 13,
593-597(2002)参照。
一実施形態において、本発明のAXL MAbは、M77-297b81.1.1と称
される抗体の重鎖CDRおよび軽鎖CDRを含み、重鎖可変領域は、図3Aにおいて配列
番号8として示され、軽鎖可変領域は、図3Bにおいて配列番号10として示される。本
発明の一態様において、本発明のAXL MAbは、残基31~35(配列番号20)か
らなるCDR-H1、残基50~65(配列番号22)からなるCDR-H2、および残
基95~102(配列番号23)からなるCDR-H3を含む重鎖、ならびに残基24~
34(配列番号11)からなるCDR-L1、残基50~56(配列番号12)からなる
CDR-L2、および残基89~97(配列番号13)からなるCDR-L3を含む軽鎖
を含む。好ましい実施形態において、本発明のAXL MAbは、M77-297b81
.1.1と称される抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域は、図
3Aにおいて配列番号8として示され、軽鎖可変領域は、図3Bにおいて配列番号10と
して示される。本発明のMAbは、M77-297b81.1.1の重鎖可変領域および
軽鎖可変領域のアミノ酸配列に相同であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および軽鎖可
変領域を含み、当該抗体は、本発明のAXL MAbの所望の機能的特性を保持している
。本発明の抗体の定常領域として、定常領域のあらゆるサブクラスが選択され得ることが
留意されるべきである。一実施形態において、重鎖定常領域としてのヒトIgG1定常領
域および軽鎖定常領域としてのヒトIgカッパ定常領域が用いられ得る。他の実施形態に
おいて、重鎖定常領域としてのマウスIgG1定常領域および軽鎖定常領域としてのマウ
スIgカッパ定常領域が用いられ得る。
本発明の操作された抗体として、(例えば、抗体の特性を向上させるように)Vおよ
び/またはV内のフレームワーク残基に修飾がなされた抗体が挙げられる。典型的には
、そのようなフレームワーク修飾は、抗体の免疫原性を引き下げるようになされる。例え
ば、一アプローチが、1つまたは複数のフレームワーク残基を、対応する生殖系列配列に
「復帰突然変異させる」ものである。より具体的には、体細胞突然変異を経験した抗体は
、当該抗体が由来する生殖系列配列とは異なるフレームワーク残基を含有し得る。そのよ
うな残基は、抗体フレームワーク配列を、抗体が由来する生殖系列配列と比較することに
よって、同定され得る。フレームワーク領域配列をその生殖系列配列に戻すために、体細
胞突然変異は、例えば、部位特異的突然変異誘発またはPCR介在突然変異誘発(例えば
、ロイシンからメチオニンへの「復帰突然変異誘発」)によって、生殖系列配列に「復帰
突然変異」されてよい。そのような「復帰突然変異した」抗体もまた、本発明によって包
含されることが意図される。
別のタイプのフレームワーク修飾は、T細胞エピトープを除去することによって抗体の
潜在的な免疫原性を低下させるように、フレームワーク領域内の、またはさらには1つも
しくは複数のCDR領域内の、1つまたは複数の残基を突然変異させることを含む。この
アプローチは、「脱免疫化」とも呼ばれ、Carr et al.による米国特許出願公
開第2003/0153043号明細書にさらに詳細に記載されている。
フレームワーク領域またはCDR領域内でなされる修飾に加えて、またはその代わりに
、本発明の抗体は、Fc領域内に修飾を含めて、典型的には、抗体の1つまたは複数の機
能的特性、例えば血清半減期、補体結合、Fc受容体結合、および/または抗原依存性細
胞傷害を変更するように、操作される。さらに、本発明のAXL MAbは、ここでも、
MAbの1つまたは複数の機能的特性を変更するために、化学的に修飾されてもよい(例
えば、1つまたは複数の化学的部分が抗体に取り付けられてもよい)し、そのグリコシル
化を変更するように修飾されてもよい。これらの実施形態はそれぞれ、以下でさらに詳細
に記載される。
一実施形態において、CH1のヒンジ領域は、ヒンジ領域内のシステイン残基の数が変
更され、例えば増加または減少するように、修飾される。このアプローチは、Bodme
rらによる米国特許第5677425号明細書にさらに記載されている。CH1のヒンジ
領域中のシステイン残基の数は、例えば、軽鎖および重鎖の集合を容易にするように、ま
たはAXL MAbの安定性を増大もしくは低下させるように、変更される。
別の実施形態において、抗体のFcヒンジ領域は、AXL MAbの生物学的半減期を
引き下げるように突然変異する。より具体的には、抗体のブドウ球菌プロテインA(Sp
A)結合が、天然のFc-ヒンジドメインSpA結合に対して弱まるように、1つまたは
複数のアミノ酸突然変異が、Fc-ヒンジフラグメントのCH2-CH3ドメイン界面領
域中に導入される。このアプローチは、Ward et al.による米国特許第616
5745号明細書中にさらに詳細に記載されている。
別の実施形態において、AXL MAbは、その生物学的半減期を増大させるように修
飾される。様々なアプローチが可能である。例えば、突然変異は、米国特許第62773
75号明細書(Ward)に記載されるようにして導入され得る。これ以外にも、生物学
的半減期を増大させるために、Presta et al.による米国特許第58690
46号明細書および米国特許第第6121022号明細書に記載されるように、抗体は、
IgGのFc領域のCH2ドメインの2つのループから得られるエピトープ結合サルベー
ジ受容体を含有するように、CH1領域またはCL領域内で変更されてよい。
さらに他の実施形態において、Fc領域は、AXL MAbのエフェクタ機能を変更す
るために、少なくとも1つのアミノ酸残基を、異なるアミノ酸残基で置換することによっ
て、変更される。例えば、アミノ酸特異的残基から選択される1つまたは複数のアミノ酸
は、抗体が、エフェクタリガンドに対する親和性を変更するが親抗体の抗原結合能力を保
持するように、異なるアミノ酸残基で置換されてよい。親和性が変更されるエフェクタリ
ガンドは、例えば、Fc受容体または補体のCI成分であり得る。このアプローチは、W
inter et al.による米国特許第5624821号明細書および米国特許第5
648260号明細書中にさらに詳細に記載されている。
AXL関連タンパク質とのAXL抗体の反応性は、いくつかの周知の手段によって確立
され得、ウエスタンブロット分析、免疫沈降分析、ELISA分析、およびFACS分析
が挙げられ、これらは必要に応じて、AXL関連タンパク質、AXL発現細胞、またはそ
れらの抽出物を用いる。AXL抗体またはそのフラグメントは、検出可能なマーカーで標
識されてもよいし、第2の分子に結合されてもよい。適切な検出可能マーカーとして、放
射性同位元素、蛍光化合物、生物発光化合物、化学発光化合物、金属キレート剤、または
酵素が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、2つ以上のAXLエピトープに特
異的な二重特異的抗体が、当該技術分野において一般に知られている方法を用いて作出さ
れる。ホモ二量体抗体もまた、当該技術分野において知られている架橋技術(例えば、W
olff et al.,Cancer Res.53:2560-2565)によって
作出され得る。
さらに別の好ましい実施形態において、本発明のAXL MAbは、M77-297b
81.1.1と称される抗体の重鎖および軽鎖を含む抗体である。好ましい実施形態にお
いて、M77-297b81.1.1は、造影剤に結合される。さらに好ましい実施形態
において、M77-297b81.1.1は、コンパニオン診断(CDx)として、小分
子化合物と併せて用いられる。
さらに別の好ましい実施形態において、M77-297b81.1.1と称される抗体
を産生するハイブリドーマ細胞が、2015年4月14日にAmerican Type
Culture Collection(ATCC),P.O.Box 1549,M
anassas,VA 20108に(Federal Expressを介して)送ら
れて、登録番号PTA-122092が割り当てられた。
III.)AXLを発現する癌の診断
本発明のAXL MAbは、対象における癌の存在の検出方法にまたは対象における癌
の診断方法に用いられ得る。検出方法または診断方法における癌の例として、肉腫、膵臓
癌、黒色腫、卵巣癌、および肺癌が挙げられる。また、本発明のAXL MAbは、癌患
者等の対象から得られるサンプルにおけるAXL発現の検出方法に用いられ得る。癌細胞
におけるAXL発現は、EGFR阻害剤(例えばエルロチニブ)による処置を経験した癌
患者におけるEGFR阻害剤に対する耐性に関係があることが知られている。したがって
、AXLキナーゼ阻害剤とEGFR阻害剤の組合せは、EGFR阻害剤抵抗性の低下およ
び癌増殖の抑制に用いられ得る。本発明のAXL MAbは、AXL発現が陽性であるた
め、AXLキナーゼ阻害剤および/またはEGFR阻害剤による処置に曝される癌患者を
同定する方法に用いられ得る。一実施形態において、癌は、肉腫、膵臓癌、黒色腫、卵巣
癌、および肺癌からなる群から選択される。一実施形態において、患者は、EGFR阻害
剤による処置を経験しており、癌は、EGFR阻害剤に対して耐性である。
検出方法は、対象から得られるサンプル中のAXLタンパク質の存在を検出する工程を
含む。対象から得られるサンプルとして、対象から採取される物質(生体から分離される
サンプル)、具体的には、採取される組織、体液(好ましくは血液)、気管支肺胞洗浄液
、生検を経験したサンプル、尿中の癌細胞、および喀痰サンプルのあらゆるタイプが用い
られる。好ましい一実施形態において、対象の臓器(例えば肺)の罹患部位から採取され
る生検サンプルが用いられ得る。また、ホルマリンを用いてサンプルを固定して、パラフ
ィン中に包埋してサンプルを安定化させることによって得られる標本(FFPE)を用い
ることも可能である。さらに、FFPEを薄いスライスに切ることによって得られるFF
PEスライスが用いられてよい。FFPEスライスが用いられるならば、スライス中に存
在するAXLタンパク質を直接検出することが可能である。
AXLタンパク質を検出する工程は、当業者に知られている一方法を用いて行われ得る
。例えば、検出は、イムノアッセイと酵素活性アッセイの組合せとしての方法によって実
行され得、この中で、試験対象から得られるサンプル(例えば、試験対象から得られる癌
組織または癌細胞)由来の可溶化溶液が調製されて、当該溶液中に含有されるAXLタン
パク質が、本発明のAXL抗体と組み合わされる。さらに、検出は、免疫組織染色技術に
よって実行され得、この中で、必要に応じて前処理(例えば、パラフィンの除去)が施さ
れた、試験対象から得られたサンプル中に含有されるAXLタンパク質(例えばFFPE
フラグメント)が、本発明のAXL抗体と組み合わされる。これらの技術の例として、酵
素イムノアッセイ、二重抗体サンドイッチELISA、蛍光イムノアッセイ、ラジオイム
ノアッセイ、ウェスタンブロッティング、および免疫組織染色等の技術が挙げられる。
先の実施形態に加えて、以下の段落は、更なる抗体、抗原結合フラグメント、ならびに
これらによる方法および使用を記載する。
本明細書中で、例えば第1段落に記載されるのは、AXLタンパク質、適切にはヒトA
XLタンパク質に結合する抗体および当該抗体の抗原結合フラグメントである。特定の実
施形態において、抗体および抗原結合フラグメントは、AXLタンパク質、適切にはヒト
AXLタンパク質に特異的に結合する。そのような抗体は、Kabatスキーム、Cho
thiaスキーム、およびContactスキームによって同定される、表VIIに示さ
れる配列番号に示されるアミノ酸配列からなる相補性決定領域を含む。
ゆえに、一実施形態において、抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号11に示
されるアミノ酸配列からなるCDR-L1、配列番号12に示されるアミノ酸配列からな
るCDR-L2、配列番号13に示されるアミノ酸配列からなるCDR-L3、配列番号
20に示されるアミノ酸配列からなるCDR-H1、配列番号22に示されるアミノ酸配
列からなるCDR-H2、および配列番号23に示されるアミノ酸配列からなるCDR-
H3を含む。
代替的な実施形態において、抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号14に示さ
れるアミノ酸配列からなるCDR-L1、配列番号15に示されるアミノ酸配列からなる
CDR-L2、配列番号16に示されるアミノ酸配列からなるCDR-L3、配列番号2
5に示されるアミノ酸配列からなるCDR-H1、配列番号26に示されるアミノ酸配列
からなるCDR-H2、および配列番号27に示されるアミノ酸配列からなるCDR-H
3を含む。
さらに別の代替的な実施形態において、抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号
17に示されるアミノ酸配列からなるCDR-L1、配列番号18に示されるアミノ酸配
列からなるCDR-L2、配列番号19に示されるアミノ酸配列からなるCDR-L3、
配列番号28に示されるアミノ酸配列からなるCDR-H1、配列番号30に示されるア
ミノ酸配列からなるCDR-H2、および配列番号31に示されるアミノ酸配列からなる
CDR-H3を含む。
別の実施形態は、先の段落に従う抗体または抗原結合フラグメントであり、抗体または
抗原結合フラグメントは、配列番号8に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、お
よび配列番号10に示されるアミノ酸からなる軽鎖可変領域を含む。
本明細書中で、例えば第3段落に開示される別の実施形態は、全長抗体である。ゆえに
、一実施形態は、先の段落のいずれか1つに従う抗体または抗原結合フラグメントであり
、抗体は、配列番号7に示されるアミノ酸配列からなる重鎖、および配列番号9に示され
るアミノ酸配列からなる軽鎖を含む。
また、本明細書中で、例えば第4段落に開示されるのは、先の段落に記載されるものと
かなりの配列同一性を有するAXLタンパク質、適切にはヒトAXLタンパク質に結合す
る抗体である。ゆえに、この段落の一実施形態は、先のいずれかの段落の抗体または抗原
結合フラグメントに対して90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、
97%、98%、または99%を有する抗体またはその抗原結合フラグメントである。更
なる実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、先のいずれかの段落に
従う抗体または抗原結合フラグメントに対して95%以上の配列同一性を有する。更なる
実施形態において、本段落における抗体または抗原結合フラグメントは、元の未修飾配列
に対する結合親和性を実質的に変化させないアミノ酸変化を有する。特定の実施形態にお
いて、そのような抗体または抗原結合フラグメントは、ほぼ同じ結合親和性を有する。す
なわち、この段落の抗体または抗原結合フラグメントは、AXLタンパク質に特異的に結
合するが、先の段落のいずれか1つに従う元の抗体または抗原結合フラグメントの結合親
和性と比較して、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、10%、11%、
12%、13%、14%、または15%未満しか変化していない。
更なる適切な実施形態が、先の段落のいずれか1つに従う元の抗体またはフラグメント
に対して99%の配列同一性を有する抗体または抗原結合フラグメントであり、あらゆる
アミノ酸変化が、どのCDR領域中の残基にもあたらず、ここでCDR領域は、Kaba
tナンバリングを用いて判断される。代替的な実施形態において、抗体または抗原結合フ
ラグメントは、先の段落における元の抗体またはフラグメントに対して99%の配列同一
性を有し、あらゆるアミノ酸変化が、どのCDR領域中の残基にもあたらず、ここでCD
R領域は、Chothiaナンバリングによって判断される。代替的な実施形態において
、抗体または抗原結合フラグメントは、先の段落における元の抗体またはフラグメントに
対して99%の配列同一性を有し、あらゆるアミノ酸変化が、どのCDR領域中の残基に
もあたらず、ここでCDR領域は、Contact法によって判断される。
更なる実施形態において、先の段落の元の抗体または抗原結合フラグメントに対して9
9%の配列同一性を有する抗体または抗原結合フラグメントは、元の抗体または抗原結合
フラグメントとほぼ同じ結合親和性を有する。
本明細書中で、例えば第5段落に開示される別の実施形態は、先のいずれかの段落に従
う抗体またはその抗原結合フラグメントであり、フラグメントは、Fab、F(ab’)
2、Fv、またはscFvのフラグメントである。特定の実施形態において、この段落、
または先のいずれかの段落の抗原結合フラグメントが、異種Fc領域または異種定常領域
に融合されて、キメラ抗体が生じ得る。
本明細書中で、例えば第6段落に開示される別の実施形態は、先のいずれかの段落に従
う抗体または抗原結合フラグメントであり、抗体または抗原結合フラグメントは、完全ヒ
ト抗体である。
本明細書中で、例えば第7段落に開示される別の実施形態は、先のいずれかの段落に従
う抗体または抗原結合フラグメントであり、抗体は、M77-297b81.1.1と呼
ばれる抗体である。
本明細書中で、例えば第8段落に開示される別の実施形態は、先の段落のいずれか1つ
に従う抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする1つまたは複数のポリヌクレオ
チドである。一実施形態において、重鎖可変領域または重鎖は、1つのポリヌクレオチド
によってコードされ、軽鎖可変領域または軽鎖は、第2のポリヌクレオチド上にコードさ
れる。更なる実施形態において、1つまたは複数のポリヌクレオチドは、ベクターである
本明細書中で、例えば第9段落に開示される更なる実施形態において、宿主細胞が、先
の段落の1つまたは複数のポリヌクレオチドを含む。一実施形態において、宿主細胞は、
段落1~7のいずれか1つに従う抗体または抗原結合フラグメントの重鎖可変領域または
重鎖を含むあるベクター、および段落1~7のいずれか1つに従う抗体または抗原結合フ
ラグメントの軽鎖可変領域または軽鎖を含む別のベクターを含む。
本明細書で、例えば第10段落に開示される更なる実施形態において、抗体またはその
抗原結合フラグメントは、先の段落の宿主細胞によって産生される。更なる実施形態にお
いて、そのようにして産生された抗体または抗原結合フラグメントはさらに、当該技術分
野において知られている1つまたは複数の技術によって単離され、イオン交換クロマトグ
ラフィ、HPLC、サイズ排除クロマトグラフィ、SDS PAGE、親和性クロマトグ
ラフィ等が挙げられる。更なる実施形態において、抗体または抗原結合フラグメントは、
約90%以上の純度である。
本明細書中で、例えば第10段落に開示される別の実施形態は、段落1~7のいずれか
1つに従う抗体または抗原結合フラグメントとの結合について競合する抗体またはその抗
原結合フラグメントである。更なる実施形態において、抗体は、AXLタンパク質、適切
にはヒトタンパク質でコーティングされたマルチウェルプレートを含むELISAアッセ
イにおいて、結合について競合する。
別の実施形態は、段落1~7または段落10のいずれか1つに従う抗体または抗原結合
フラグメントであり、抗体または抗原結合フラグメントは、組換えにより生産される。
別の実施形態は、段落1~7または段落10のいずれか1つに従う抗体または抗原結合
フラグメントであり、抗体または抗原結合フラグメントは、造影剤に結合されている。代
替的な実施形態において、先のいずれかの段落に従う抗体または抗原結合フラグメントは
、造影剤として用いられる。更なる実施形態において、先の段落のいずれか1つの抗体ま
たは抗原結合フラグメントは、インビボ造影剤として用いられる。代替的な実施形態にお
いて、先の段落のいずれか1つの抗体または抗原結合フラグメントは、エクスビボ造影剤
として用いられ、適切には検出アッセイに用いられる;そのようなアッセイとして、免疫
組織化学、免疫細胞化学、イムノアッセイ、ELISA(二重抗体サンドイッチELIS
Aが挙げられる)、およびウェスタンブロッティングが挙げられるが、これらに限定され
ない。
更なる実施形態は、先のいずれかの段落に従う抗体または抗原結合フラグメントであり
、抗体または抗原結合フラグメントは、1つまたは複数の検出試薬に、直接的にまたは間
接的に結合されている。アッセイは、定性的であっても定量的であってもよく、放射能、
蛍光、化学発光が挙げられるがこれらに限定されない任意の数の検出試薬を使用してよく
、そしてまた、前述の試薬のいずれかを用いた酵素結合検出を含んでもよい。
異なる実施形態において、段落1~7または段落10のいずれか1つに従う抗体または
抗原結合フラグメントは、癌、適切には肉腫、膵臓癌、黒色腫、卵巣癌、および肺癌の診
断および/または処置および/または管理のために、1人以上の患者をスクリーニングす
るコンパニオン診断(CDx)として用いられる。
異なる実施形態において、対象における1つまたは複数の腫瘍細胞におけるAXL発現
を検出する方法が、段落1~7または段落10のいずれか1つに従う抗体または抗原結合
フラグメントを、対象から得られる1つまたは複数の細胞のサンプルと接触させる工程を
含む。更なる実施形態において、対象はヒトである。更なる実施形態において、ヒトは、
癌の診断および/または処置を必要とする。
更なる実施形態において、1つまたは複数の腫瘍細胞は、適切には、固形臓器腫瘍、適
切には膵臓、卵巣、肺、および皮膚の腫瘍の細胞である。代替的な実施形態において、1
つまたは複数の腫瘍細胞は、間葉起源の軟組織細胞である。別の実施形態において、1つ
または複数の細胞は、肉腫細胞、膵臓腫瘍細胞、黒色腫細胞、卵巣腫瘍細胞、および肺腫
瘍細胞からなる群から選択される。更なる実施形態において、対象、適切にはヒトは、E
GFR阻害剤で以前に処置された。更なる実施形態において、EGFR阻害剤で以前に処
置された対象、適切にはヒトは、EGFR阻害剤に実質的に反応しない癌、すなわちEG
FR耐性癌を有すると判断された。
異なる実施形態において、AXLの発現が陽性である1つまたは複数の癌細胞を有する
対象、適切にはヒトを同定する方法は、段落1~7または段落10のいずれか1つに従う
抗体または抗原結合フラグメントを、対象、適切にはヒトから得られる1つまたは複数の
細胞のサンプルと接触させることと、抗体または抗原結合フラグメントの、AXLへの結
合を検出することとを含む。更なる実施形態において、対象、適切にはヒトは、EGFR
阻害剤で以前に処置された。更なる実施形態において、EGFR阻害剤で以前に処置され
た対象、適切にはヒトは、EGFR耐性癌を患うと判断された。
さらに異なる実施形態において、対象、適切にはヒトにおける癌を診断する方法は、段
落1~7または段落10のいずれか1つに従う抗体または抗原結合フラグメントを、対象
、適切にはヒトから得られる1つまたは複数の細胞のサンプルと接触させることと、抗体
または抗原結合フラグメントの、AXLへの結合を検出することと、正常者由来の1つま
たは複数の細胞、すなわち非腫瘍性または非癌性の細胞のコントロールサンプルと比較し
た、AXLレベルの増大を判定することによって、癌を診断することとを含む。更なる実
施形態において、対象、適切にはヒトは、EGFR阻害剤で以前に処置された。更なる実
施形態において、EGFR阻害剤で以前に処置された対象、適切にはヒトは、EGFR耐
性癌を患うと判断された。
IV.)AXLを発現する癌の処置
制限された組織において正常に発現されるが、表Iに列挙されるような癌においても発
現されるタンパク質としてのAXLの同定は、そのような癌の処置へのいくつかの治療的
アプローチおよび診断的アプローチを開く。
注目すべきことに、標的抗腫瘍療法は、標的タンパク質が正常な組織上で、さらには生
命に不可欠な正常な臓器組織上で発現される場合ですら、有用であった。生命に不可欠な
臓器とは、生命を維持するのに必須の臓器、例えば心臓または結腸である。生命に不可欠
でない臓器は、取り出されて直ぐにその個体がなお生き残ることができる臓器である。生
命に不可欠でない臓器の例として、卵巣、乳房、および前立腺がある。
正常な組織における、さらには生命に不可欠な正常な組織における標的タンパク質の発
現は、タンパク質が過剰発現される特定の腫瘍用の治療薬としてのタンパク質について、
標的剤の有用性を損なわない。例えば、生命に不可欠な臓器における発現は、それ自体有
害なものではない。また、無くても構わないとみなされる臓器、例えば前立腺および卵巣
は、死亡率に影響を及ぼさずに除去され得る。最後に、一部の生命に不可欠な臓器は、免
疫特権のために、正常な臓器の発現に影響を受けない。免疫特権臓器は、血液-臓器関門
によって血液から保護されることで、免疫療法にアクセス可能でない臓器である。免疫特
権臓器の例として、脳および精巣がある。
したがって、AXLタンパク質の活性を阻害する治療アプローチは、AXLを発現する
癌に苦しむ患者にとって有用である。当該治療アプローチは一般に、3つのクラスに分類
される。第1のクラスは、腫瘍細胞の増殖に関係して、腫瘍細胞の増殖の阻害もしくは遅
延、またはその死滅の誘導に至るようにAXL機能を調節するものである。第2のクラス
は、AXLタンパク質の、その結合パートナとの、または他のタンパク質との結合を阻害
する様々な方法を含む。第3のクラスは、AXL遺伝子の転写またはAXL mRNAの
翻訳を阻害する様々な方法を含む。
したがって、好ましくは腫瘍組織の免疫組織化学的評価、定量的AXL画像化、または
AXL発現の存在および程度を確実に示す他の技術を用いて、癌患者は、AXL発現の存
在およびレベルについて評価され得る。この目的のために、腫瘍生検または外科標本の免
疫組織化学的分析が好ましい。腫瘍組織の免疫組織化学的分析方法は、当該技術分野にお
いて周知である。
V.)抗体ベース治療のための、標的としてのAXL
AXLは、抗体ベースの治療戦略にとって魅力的な標的である。細胞外分子および細胞
内分子の双方を標的とするいくつかの抗体戦略が当該技術において知られている(例えば
、補体およびADCC媒介死、ならびにイントラボディの使用を参照)。AXLは、正常
細胞に対して、対応する様々な系列の癌細胞によって発現されるので、免疫反応性組成物
の、非標的臓器および非標的組織への結合によって、毒性、非特異的作用、および/また
は非標的作用が引き起こされることのない、優れた感受性を示す全身投与AXL免疫反応
性組成物が調製される。AXLのドメインと特異的に反応する抗体は、好ましくは抗体薬
物結合体(すなわちADC)として、AXL発現癌を全身的に処置するのに有用であり、
結合体は、造影剤、毒素、または治療剤と共にある。
当業者であれば、抗体が、図1に示されるAXL配列の免疫原性領域等の免疫原性分子
を特異的に標的とし、かつこれに結合するように用いられ得ることを理解する。また、当
業者であれば、抗体を細胞傷害剤に結合させることがルーチンであることを理解する(例
えば、Slevers et al.Blood 93:11 3678-3684(J
une 1,1999)参照)。例えば、細胞を、当該細胞によって発現される分子(例
えば、AXL)に特異的な抗体に結合させることによって、細胞傷害剤および/または治
療剤が当該細胞に直接送達される場合、細胞傷害剤は、その知られている生物効果(すな
わち細胞毒性)を当該細胞に発揮することとなる。
抗体-細胞傷害剤結合体を用いて細胞を殺すための多種多様な組成物および方法が、当
該技術分野において知られている。癌との関連において、典型的な方法は、腫瘍を有する
哺乳動物に、発現され、結合するのにアクセス可能であり、または細胞表面上に局在して
いる抗原(例えば、AXL)に結合する標的剤(例えば、AXL MAb、好ましくはM
77-297b81.1.1)に連結された、選択された細胞毒性剤および/または治療
剤を含む結合体の生物学的に有効な量を投与することを伴う。典型的な実施形態は、AX
Lを発現する細胞に細胞毒性剤および/または治療剤を送達する方法であって、AXLエ
ピトープに免疫特異的に結合する抗体に細胞毒性剤を結合させることと、細胞を抗体薬物
結合体(ADC)に曝すこととを含む方法である。別の例示的な実施形態は、転移癌を患
っていると疑われる個体を処置する方法であって、前記個体に、細胞傷害剤および/また
は治療剤に結合された抗体の治療的に有効な量を含む医薬組成物を非経口投与する工程を
含む方法である。
AXL抗体を用いた癌免疫療法が、他のタイプの癌の処置に首尾よく用いられている様
々なアプローチに従ってなされ得、結腸癌(Arlen et al,1998,Cri
t.Rev.Immunol.18:133-138)、多発性骨髄腫(Ozaki e
t al,1997,Blood 90:3179-3186、Tsunenari e
t al,1997,Blood 90:2437-2444)、胃癌(Kasprzy
k et al,1992,Cancer Res.52:2771-2776)、B細
胞リンパ腫(Funakoshi et al,1996,J.Immunother.
Emphasis Tumor Immunol.19:93-101)、白血病(Zh
ong et al.,1996,Leuk.Res.20:581-589)、結腸直
腸癌(Moun et al.,1994,Cancer Res.54:6160-6
166;Velders et al,1995,Cancer Res.55:439
8-4403)、および乳癌(Shepard et al,1991,J.Clin.
Immunol.11:117-127)が挙げられるが、これらに限定されない。裸抗
体の、毒素または放射性同位体への結合、例えば、Y91またはI131の、抗CD20
抗体(例えば、それぞれZevalin(商標),IDEC Pharmaceutic
als Corp.またはBexxar(商標),Coulter Pharmaceu
ticals)への結合を含む治療アプローチもあれば、抗体および他の治療剤、例えば
ハーセプチン(商標)(トラスツズマブ)の、パクリタキセル(Genentech,I
nc.)との共投与を含む治療アプローチもある。好ましい実施形態において、抗体は、
造影剤と結合される。更に好ましい実施形態において、MAbは、コンパニオン診断薬と
して、疾患の処置用の別の化合物と併用されることとなる。
AXL抗体療法は、癌の全ステージに有用であるが、抗体療法は、進行癌または転移癌
において特に適切であり得る。本発明の抗体療法による処置は、1ラウンド以上の化学療
法を受けた患者に適する。これ以外にも、本発明の抗体療法は、化学療法処置を受けてい
ない患者について、化学療法レジメンまたは放射線レジメンと組み合わされる。加えて、
抗体療法は、特に化学療法剤の毒性に十分な忍容性がない患者にとって、同時化学療法の
投薬量を減らして用いることを可能にする。Fan et al.(Cancer Re
s.53:4637-4642,1993)、Prewett et al.(Inte
rnational J.of Onco.9:217-224,1996)、およびH
ancock et al.(Cancer Res.51:4575-4580,19
91)は、種々の抗体の、化学療法剤との併用を記載している。
表Iに示される癌を処置するAXLモノクローナル抗体として、腫瘍に対して強力な免
疫反応を開始する抗体、または直接的に細胞傷害性である抗体が挙げられる。この点に関
して、AXLモノクローナル抗体(MAb)は、補体媒介機構または抗体依存性細胞傷害
(ADCC)機構のいずれかによって、腫瘍細胞溶解を誘発することができ、これらは双
方とも、補体タンパク質上でのエフェクタ細胞Fc受容体部位との相互作用のために、免
疫グロブリン分子の無傷Fc部分を必要とする。また、腫瘍増殖に及ぼす直接的な生物効
果を発揮するAXL MAbは、AXLを発現する癌を処置するのに有用である。直接細
胞傷害性MAbが作用する機構として:細胞増殖の阻害、細胞分化の調節、腫瘍血管新生
因子プロファイルの調節、およびアポトーシスの誘導が挙げられる。特定のAXL MA
bが抗腫瘍効果を発揮する機構は、細胞死を評価する任意の数のインビトロアッセイ、例
えば、当該技術分野において一般に知られている、ADCC、補体媒介性細胞溶解等を用
いて、評価される。
したがって、本発明の治療方法に用いられる好ましいモノクローナル抗体は、完全ヒト
抗体であり、かつ標的AXL抗原に特異的に、高い親和性で結合する抗体である。
VI.)AXL ADCカクテル
本発明の治療方法は、単一のAXL ADC、および異なるMAb(すなわち、AXL
MAb、または別のタンパク質に結合するMAb)の組合せまたはカクテルの投与を意
図する。そのようなMAbカクテルは、異なるエピトープを標的とするMAbを含有し、
異なるエフェクタ機構を利用し、または直接細胞毒性MAbを、免疫エフェクタ機能に依
存するMAbと組み合わせるので、ある種の利点を有し得る。そのようなMAbは組み合
わされて、相乗的な治療効果を示し得る。また、AXL MAbは、様々な化学療法剤お
よび生物剤、アンドロゲン遮断薬、免疫調節剤(例えば、IL-2、GM-CSF)、外
科手術、または放射線が挙げられるが、これらに限定されない、他の治療法と同時に施さ
れ得る。好ましい実施形態において、AXL MAbは、結合形態で投与される。
AXL ADC製剤は、あらゆる経路を介して投与されて、抗体を腫瘍細胞に送達する
ことができる。投与経路として、静脈内、腹腔内、筋肉内、腫瘍内、皮内等が挙げられる
が、これらに限定されない。処置は、一般に、許容可能な投与経路、例えば、静脈内注射
(TV)を介したAXL ADC調製物の反復投与を含み、典型的には0.1、.2、.
3、.4、.5、.6、.7、.8、.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10
、15、20、または25mg/体重kgが挙げられるが、これらに限定されない範囲内
の用量である。一般に、1週あたり10~1000mg MAbの範囲の用量が効果的で
あり、十分な忍容性がある。
転移性乳癌の処置におけるハーセプチン(登録商標)(トラスツズマブ)での臨床経験
に基づいて、MAb調製物の約4mg/患者体重kg IVの初期負荷用量に続く、約2
mg/kg IVの毎週用量が、許容可能な投薬レジメンを表す。好ましくは、初期負荷
用量は、90分以上の注入として投与される。初期用量に十分な忍容性があるならば、定
期的な維持用量が、30分以上の注入として投与される。当業者によって理解されるよう
に、様々な要因が、特定のケースにおいて、理想的な用量レジメンに影響を及ぼす可能性
がある。そのような要因として、例えば、用いられるMAbの結合親和性および半減期、
患者におけるAXL発現の程度、循環するshed AXL抗原の程度、所望される定常
状態抗体濃度レベル、処置の頻度、および本発明の処置方法と組み合わせて用いられる化
学療法剤または他の薬剤の影響、ならびに特定の患者の健康状態が挙げられる。
場合によっては、患者は、最も有効な投薬レジメン等の決定の一助とするために、所与
のサンプル中のAXLのレベル(例えば、循環AXL抗原および/またはAXL発現細胞
のレベル)について評価されるべきである。そのような評価はまた、治療の全体を通して
のモニタリング目的のために用いられ、他のパラメータ(例えば、膀胱癌治療における尿
細胞学および/もしくは免疫細胞レベル、または類推による、前立腺癌治療における血清
PSAレベル)の評価と組み合わせた治療の成功を評価するのに有用である。
本発明の目的は、AXL ADCを提供することであり、これは、AXLを発現する腫
瘍細胞の増殖を阻害し、または遅延させる。本発明の更なる目的は、そのようなAXL
ADCを用いて、特にそのようなAXL ADCを、他の薬物または免疫学的に活性な処
置と併用して、血管新生機能および他の生物学的機能を阻害することによって、哺乳動物
、好ましくはヒトにおける腫瘍増殖を低下させる方法を提供することである。
VII.)併用療法
一実施形態において、ヒト腫瘍が挙げられる腫瘍が、化学療法剤もしくは放射線または
それらの組合せと併せて、AXL ADCで処置される場合、相乗効果がある。換言すれ
ば、AXL ADCによる腫瘍増殖の阻害は、化学療法剤もしくは放射線、またはそれら
の組合せと組み合わされた場合、予想されるよりも増強される。相乗効果は、例えば、A
XL ADCのみの処置、またはAXL ADCおよび化学療法剤または放射線による処
置の相加効果から予想されるよりも、併用処置による腫瘍増殖の阻害が大きいことによっ
て、示され得る。好ましくは、相乗効果は、AXL ADCによる処置から、またはAX
L ADCと化学療法剤もしくは放射線の付加的な組合せを用いた処置から寛解が予想さ
れない場合での癌の寛解によって、示される。
AXL ADC、および化学療法もしくは放射線、またはそれらの双方の組合せを用い
て、腫瘍細胞の増殖を阻害する方法は、化学療法または放射線療法の開始前、開始中、ま
たは開始後に、そしてそれらのあらゆる組合せで(すなわち、化学療法および/または放
射線療法の開始前と開始中、開始前と開始後、開始中と開始後、または開始前と開始中と
開始後)、AXL ADCを投与することを含む。例えば、AXL ADCは、典型的に
は、放射線療法および/または化学療法を開始する前の、1~60日、好ましくは3~4
0日、より好ましくは5~12日の間に、投与される。しかしながら、処置プロトコルお
よび特定の患者のニーズに応じて、当該方法は、最も効果的な処置を提供し、そして最終
的に患者の寿命を延ばすこととなるやり方で実行される。
化学療法剤の投与は、非経口経路および経腸経路による全身的なものが挙げられる、様
々な方法で達成され得る。一実施形態において、AXL ADCおよび化学療法剤は、別
個の分子として投与される。化学療法剤または化学療法の特定の例として、シスプラチン
、ダカルバジン(DTIC)、ダクチノマイシン、メクロレタミン(窒素マスタード)、
ストレプトゾシン、シクロホスファミド、カルムスチン(BCNU)、ロムスチン(CC
NU)、ドキソルビシン(アドリアマイシン)、ダウノルビシン、プロカルバジン、マイ
トマイシン、シタラビン、エトポシド、メトトレキセート、5-フルオロウラシル、ビン
ブラスチン、ビンクリスチン、ブレオマイシン、パクリタキセル(タキソール)、ドセタ
キセル(タキソテール)、アルデスロイキン、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボ
プラチン、クラドリビン、ダカルバジン、フロクスウリジン、フルダラビン、ヒドロキシ
尿素、イホスファミド、インターフェロンアルファ、ロイプロリド、メゲストロール、メ
ルファラン、メルカプトプリン、プリカマイシン、ミトタン、ペガスパルガーゼ、ペント
スタチン、ピポブロマン、プリカマイシン、ストレプトゾシン、タモキシフェン、テニポ
シド、テストラクトン、チオグアニン、チオテパ、ウラシルマスタード、ビノレルビン、
ゲムシタビン、クロラムブシル、タキソール、およびそれらの組合せが挙げられる。
AXL ADCと併用される放射線の源は、処置されることになる患者の体外にあって
も体内にあってもよい。源が患者の体外にある場合、治療は体外照射療法(EBRT)と
して知られている。放射線源が患者の体内にある場合、その処置は近接照射療法(BT)
と呼ばれる。
先に記載される治療レジメンはさらに、追加の癌処置剤および/またはレジメン、例え
ば追加の化学療法、癌ワクチン、シグナル伝達阻害剤、異常な細胞増殖もしくは癌の処置
に有用な剤、IGF-1Rに結合することによって腫瘍増殖を阻害する抗体(例えば、国
際公開第2005/092380号パンフレット(Pfizer)に記載されるような抗
CTLA-4抗体)または他のリガンド、およびサイトカインと組み合わされてよい。
哺乳動物が更なる化学療法に曝される場合、先に記載される化学療法剤が用いられてよ
い。加えて、増殖因子阻害剤、生物反応改変剤、抗ホルモン療法、選択的エストロゲン受
容体調節剤(SERM)、血管新生阻害剤、および抗アンドロゲンが用いられてよい。例
えば、抗ホルモン、例えばNolvadex(タモキシフェン)等の抗エストロゲン、ま
たはCasodex(4’-シアノ-3-(4-フルオロフェニルスルホニル)-2-ヒ
ドロキシ-2-メチル-3’-(トリフルオロメチル)プロピオンアニリド)等の抗アン
ドロゲンが用いられてよい。
先の治療アプローチは、多種多様な外科手術レジメン、化学療法レジメン、または放射
線療法レジメンのいずれか1つと組み合わされ得る。本発明の治療アプローチは、化学療
法(または他の療法)の低い投薬量および/またはより少ない投与頻度での使用を可能に
し、全ての患者にとって、特に化学療法剤の毒性に十分な忍容性がない患者にとって、有
利である。
VIII.)キット/製造品
本明細書中に記載される実験室、予後、予防、診断、および治療の用途に用いるための
キットが、本発明の範囲内である。そのようなキットは、バイアル、チューブ等の1つま
たは複数の容器を受け入れるように区画されているキャリア、パッケージ、または容器を
、本明細書中に記載される使用等の使用についての説明書を含むラベルまたは挿入物と共
に含んでよく、各容器は、当該方法において用いられることになる別個の要素の1つを含
む。例えば、容器は、検出可能に標識されている、または検出可能に標識され得る抗体を
含んでよい。キットは、薬物単位を含む容器を含んでよい。
本発明のキットは、典型的に、先に記載される容器、およびこれと関連する、商業的観
点およびユーザの観点から所望される、バッファ、希釈剤、フィルタ、針、シリンジなど
の材料を含む1つまたは複数の他の容器;内容物および/または使用説明書を記載する、
キャリア、パッケージ、容器、バイアル、および/またはチューブのラベル、ならびに使
用説明書付きパッケージ挿入物を含むこととなる。
組成物が、特定の治療、または非治療的用途、例えば、予後、予防、診断、または実験
の用途に用いられることを示すためのラベルが、容器上に、または容器と共に存在してよ
く、そしてまた、本明細書中に記載される使用等の、インビボまたはインビトロでの使用
についての手引きを示してよい。また、手引きおよび/またはその他の情報が、キットと
共に、またはキット上に含まれる挿入物またはラベル上に含められてもよい。ラベルは、
コンテナ上にあってもよいし、コンテナに付随してもよい。ラベルを形成する文字、数字
、または他の記号が容器自体に成形またはエッチングされる場合、ラベルは容器上に存在
してよい;ラベルは、コンテナを保持もするレセプタクルまたはキャリア内に、例えばパ
ッケージ挿入物として存在する場合に、コンテナに付随してよい。ラベルは、組成物が、
表Iに示される組織の癌等の症状の診断、処置、予防、または予後に用いられることを示
してよい。
用語「キット」および「製造品」は、同義語として用いられ得る。
本発明の別の実施形態において、組成物、例えば抗体、または抗体薬物結合体(ADC
)、例えば、表Iに示されるような組織の癌の診断、予後、予防、および/または処置に
有用な材料を含有する製造品が提供される。製造品は、典型的には、少なくとも1つの容
器および少なくとも1つのラベルを含む。適切な容器として、例えば、ボトル、バイアル
、シリンジ、および試験管が挙げられる。容器は、様々な材料、例えばガラス、金属、ま
たはプラスチックから形成されてよい。容器は、アミノ酸配列、小分子、核酸配列、細胞
集団、および/または抗体を保持することができる。別の実施形態において、容器は、細
胞および組織におけるAXLのタンパク質発現を評価するのに使用される、または関連の
実験、予後、診断、予防、および治療の目的のための抗体、その結合フラグメント、また
は特異的な結合タンパク質を含む;そのような使用の指示および/または手引きは、その
ような容器上に、または容器と共に含められてよく、これらの目的のために用いられる試
薬および他の組成物、またはツールも同様である。
容器は、代わりに、症状の処置、診断、予後、または予防に有効な組成物を保持し得、
そして滅菌アクセスポートを有してよい(例えば、容器は、皮下注射針によって穿孔可能
なストッパを有する静脈内溶液バッグまたはバイアルであってよい)。組成物中の活性剤
は、AXLに特異的に結合することができる抗体であってもよいし、AXLに特異的に結
合する抗体薬物結合体であってもよい。
製造品は、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液、および/またはデキストロース溶液等
の医薬的に許容可能なバッファを含む第2の容器をさらに備えてよい。これはさらに、他
のバッファ、希釈剤、フィルタ、スターラ、針、シリンジ、ならびに/または使用の指示
および/もしくは説明書付きパッケージ挿入物が挙げられる、商業的観点およびユーザの
観点から所望される他の材料を含んでよい。
本発明の様々な態様が、以下のいくつかの実施例によってさらに説明かつ例示されるが
、いずれも、本発明の範囲を限定することは意図されていない。
実施例1
AXL抗原
AXL(それ以外ではTyro7、UFO、およびARK(ならびにGenBank登
録番号:NM_021913)として知られている)は、ヒトtrk、eph、eck、
およびrosタンパク質、ならびにインスリン様増殖因子1受容体とのアミノ酸類似度が
高い受容体チロシンキナーゼをコードするタンパク質である。この遺伝子によってコード
されるタンパク質は、Rse/Tyro3受容体およびMER受容体を含む膜貫通型受容
体チロシンキナーゼ(TRK)ファミリに属する。このファミリは、免疫グロブリン様フ
ィブロネクチンIII様ドメインの特有の細胞外組成物によって特徴付けられる。これら
の構造的所見は、Axlファミリメンバが、細胞接着および細胞内シグナル伝達の双方に
関与している可能性があることを示唆している。Sainaghi,et al,J.C
ell.Phys.204:36-44(2005)参照。また、O’Bryan,et
al,J.Bio.Chem.,Vol.270 no.2,pp.551-557(
1995)参照。また、Axlは、複数の癌、例えば肺癌、乳癌、卵巣癌、甲状腺癌、胃
癌、腎臓癌、結腸癌、および骨髄性白血病において発現されることが指摘されてきた。更
なる参考文献について、Shieh,et al,Neoplasia,vol 7,N
o.12 pp 1058-1064(Dec.2005);Berclaz,et a
l.Annals of Oncology,vol.12 pp.819-824(2
001);Sun,et al.Oncology 2004;66:450-457(
2004);Ito,et al,Thyroid,vol.9:No.6,pp.56
3-567(1999);Wu,et al,Anticancer Res.,vol
.22,pp.1071-1078(2002);Chung,et al.DNA a
nd Cell Bio.,Vol.22:No.8,pp.533-540(2003
);Craven,et al,Int.J.Cancer,vol.60 pp.79
1-797(1995)。AXL cDNAは、4,743bpの長さであり、894個
のアミノ酸ORFをコードする(図1参照)。AXL抗原の例示的な実施形態について、
図1参照。
実施例2
AXLモノクローナル抗体(MAb)の作出
一実施形態において、AXLに対する診断用モノクローナル抗体(「mAb」)は、A
XLに特異的なエピトープと反応する抗体を含み、これは、患者の生検から調製した、凍
結し、またはパラフィン包埋し、ホルマリン固定した組織切片中の細胞上に発現されたA
XLに結合するであろう。そのようなMAbの作出用の免疫原として、AXLタンパク質
配列をコードまたは含有するように設計された免疫原が挙げられる。免疫原として、ペプ
チド、組換えタンパク質、AXLを内在的に発現する細胞、またはAXLを発現するよう
に操作された細胞(293T-AXL等)が挙げられる。
大腸菌(E.coli)中で発現されて、大腸菌(E.coli)から精製した組換え
可溶性AXLタンパク質によりbalb/cマウスを免疫化した後に、M77-297b
81.1.1と称されるmAbが生じた。AXL MAb、M77-297b81.1.
1は、患者の生検から調製した、凍結し、またはパラフィン包埋し、ホルマリン固定した
組織切片中のAXL発現腫瘍細胞に特異的に結合する。
Trizol試薬(Life Technologies,Gibco BRL)によ
り各ハイブリドーマ細胞からmRNAを単離した後、AXL MAb M77-297b
81.1.1のDNAコード配列を決定した。
以下のプロトコルを用いて、抗AXL M77-297b81.1.1およびM77-
297B81.1.1の重鎖および軽鎖の可変核酸配列を、ハイブリドーマ細胞から配列
決定した。M77-297b81.1.1分泌ハイブリドーマ細胞を、Trizol試薬
(Life Technologies,Gibco BRL)で溶解した。全RNAを
精製して、定量した。Gibco-BRL Superscript Preampli
fication系を用いて、オリゴ(dT)12-18プライミングにより、全RNA
から第1鎖cDNAを作出した。ヒト免疫グロブリン可変重鎖プライマー、およびヒト免
疫グロブリン可変軽鎖プライマーを用いて、第1鎖cDNAを増幅した。PCR産物を配
列決定して、可変重鎖領域および可変軽鎖領域を判断した。
重鎖領域および軽鎖領域の核酸配列およびアミノ酸配列を、図2Aおよび図2Bならび
に図3Aおよび図3Bに列挙する。M77-297b81.1.1 MAbの、ヒトIg
生殖系列に対するアラインメントを、図4A~図4Bに示す。
M77-297b81.1.1と称される抗体を産生するハイブリドーマ細胞を、20
15年4月14日にAmerican Type Culture Collectio
n(ATCC),P.O.Box 1549,Manassas,VA 20108に(
Federal Expressを介して)送って、登録番号PTA-122092が割
り当てられた。
実施例3
AXL ADCを用いた、ヒト癌腫の処置および診断についてのヒト臨床試験
AXLに特異的に結合するAXL ADCを、本発明に従って用いて、特定の腫瘍、好
ましくは表1に列挙する腫瘍の処置に用いる。これらの徴候のそれぞれに関して、2つの
臨床的アプローチを首尾よく遂行する。
I.) 補助療法:補助療法において、AXL ADCを、化学療法剤もしくは抗腫瘍
剤、および/または放射線療法、あるいはそれらの組合せと組み合わせて、患者を処置す
る。標準的な1次治療および2次治療にAXL ADCを加えることによる、標準的なプ
ロトコル下で、表Iに列挙するような原発性癌標的を処置する。プロトコル設計は、以下
の実施例によって評価する、原発性病変または転移性病変の腫瘍塊の縮小、無増悪生存、
全生存の延長、患者の健康の向上、疾患の安定化、ならびに標準的な化学療法および他の
生物剤の通常の用量を引き下げる能力が挙げられるが、これらに限定されない有効性を扱
う。この投薬量の引下げは、化学療法剤または生物剤の用量関連毒性を引き下げることに
よって、追加療法および/または長期療法を可能にする。AXL ADCを、化学療法剤
または抗腫瘍剤と組み合わせて、いくつかの補助的臨床試験で利用する。
II.)単剤療法:腫瘍の単剤療法におけるAXL ADCの使用に関して、AXL
ADCを、化学療法剤も抗腫瘍剤もなしで患者に投与する。一実施形態において、広範囲
の転移性疾患に苦しむ末期癌患者において、単剤療法を臨床的に行う。プロトコル設計は
、以下の実施例によって評価する、原発性病変または転移性病変の腫瘍塊の縮小、無増悪
生存、全生存の延長、患者の健康の向上、疾患の安定化、ならびに標準的な化学療法およ
び他の生物剤の通常の用量を引き下げる能力が挙げられるが、これらに限定されない有効
性を扱う。
投薬量
投薬レジメンを調節して、最適な所望の反応を実現することができる。例えば、単回の
ボーラス投与をしてもよいし、いくつかの分割用量を経時的に投与してもよいし、治療状
況の示される緊急性に比例させて用量を増減させてもよい。投与を容易にし、かつ投薬量
を均一にするために、非経口組成物を投薬単位形態で処方することが特に有利である。本
明細書中で用いる投薬単位形態とは、処置することになる哺乳動物対象のための単位投薬
量として適した、物理的に別個の単位を指す;各単位は、必要とされる医薬キャリアと協
働して所望の治療効果をもたらすように算出した所定量の活性化合物を含有する。本発明
の投与単位形態についての仕様は、(a)抗体および/またはADCの特有の特徴、なら
びに達成されることになる特定の治療効果または予防効果、ならびに(b)調剤技術にお
いて固有の制限、例えば処置用の活性化合物の、個体における感受性によって決定され、
かつこれらに直接依存する。
本発明に従う組合せで投与するAXL ADCの治療的に有効な量についての例示的な
非限定的範囲は、約0.5~約10mg/kg、約1~約5mg/kg、少なくとも1m
g/kg、少なくとも2mg/kg、少なくとも3mg/kg、または少なくとも4mg
/kgである。他の例示的な非限定的範囲は、例えば約0.5~約5mg/kg、例えば
約0.8~約5mg/kg、または例えば約1~約7.5mg/kgである。本発明の高
用量の実施形態は、10mg/kgを超える投薬量に関係する。投薬量の値は、緩和すべ
き症状のタイプおよび重症度によって変わり得、単回用量または複数回用量を含み得るこ
とに留意すべきである。特定のあらゆる対象について、個々のニーズ、および組成物の投
与を管理または監督する者の専門的判断に従って、特定の投薬レジメンを経時的に調整す
べきであること、そして本明細書中に示す投薬量範囲は、例示に過ぎず、特許請求する組
成物の範囲または実施を限定することを意図しないことがさらに理解されるべきである。
臨床開発計画(CDP)
CDPを、補助療法または単剤療法と併せたAXL ADCの処置に従わせて開発する
。治験は、最初に、安全性を実証し、その後、反復用量の有効性を確認する。治験は、標
準的な化学療法を、標準的な治療法プラスAXL ADCと比較する非盲検である。認識
されるように、患者の登録に関連して利用することができる非限定的な一基準が、生検に
よって判断した当該患者の腫瘍におけるAXL発現レベルである。
あらゆるタンパク質または抗体の注入ベースの治療薬と同様に、安全性の問題は主に、
(i)サイトカイン放出症候群、すなわち低血圧、発熱、震え、悪寒;(ii)その物質
に対する免疫原性反応の発現(すなわち、抗体治療剤に対する、患者によるヒト抗体の発
現、またはHAMA反応);および(iii)AXLを発現する正常細胞に対する毒性に
関係する。標準的な試験およびフォローアップを利用して、これらの安全上の懸念のそれ
ぞれを監視することができる。AXL ADCは、ヒト投与直後に安全であることが見出
されている。
実施例4
IHCによる、癌患者標本におけるAXLタンパク質の検出
免疫組織化学によるAXLタンパク質の発現を、肉腫、膵臓癌、黒色腫、卵巣癌、およ
び肺癌のサンプル由来の腫瘍標本において試験した。簡潔には、ホルマリン固定したパラ
フィンワックス包埋組織を4ミクロン切片に切って、ガラススライド上に載せた。切片を
脱ワックスして、再水和させて、BOND-MAX自動化IHC染色系(Leica B
iosystems,Buffalo Grove,IL)内で、Novocastra
Bond Epitope Retrieval Solution 2(Leica
Biosystems,Buffalo Grove,IL)と 100℃にて30分
間処理してから、室温にて12分間放置した。次いで、切片を、M77-297b81.
1.1と表したモノクローナルマウス抗AXL抗体、またはアイソタイプコントロールと
インキュベートした。その後、切片を、Novocastra Bond Polyme
r Refine Detection Systemで処理した。これは、ポストプラ
イマリウサギ抗マウスIgG試薬中でのインキュベーションに続く、ポリマー抗ウサギポ
リHRP-IgG試薬(Leica Biosystems,Buffalo Grov
e,IL)とのインキュベーションからなる。次いで、切片を3%過酸化水素溶液で処理
して、内因性ペルオキシダーゼ活性を不活化した。DAB精製キット(Leica Bi
osystems,Buffalo Grove,IL)を用いて、クロモゲン基質の可
視化を進め、ヘマトキシリンを用いて核を染色し、そしてAperio ePathol
ogy Scanscope撮像系(Leica Biosystems,Vista,
CA)上でスライドをスキャンして分析した。AXL特異的M77-297b81.1.
1抗体を用いて、患者標本において、ブラウン染色によって示される特異的染色を検出し
た。(図5A、図5C、図5E、図5G、および図5I参照)。対照的に、アイソタイプ
コントロール抗体は、腫瘍標本を染色しなかった。(図5B、図5D、図5F、図5H、
および図5J参照)。
結果は、患者の肉腫(図5A)、膵臓癌(図5C)、黒色腫(図5E)、卵巣癌(図5
G)、および肺癌(図5I)の組織の腫瘍細胞におけるAXLの発現を示している。これ
らの結果は、AXLが、ヒト癌において発現されていること、そしてこの抗原に向けられ
る抗体が、診断および予後の目的に有用であることを示している。(図5A~図5J)。
実施例5
M77-297b81.1.1 MAbのエピトープマッピング
2つの抗体のエピトープが重なっており、または互いに近接しているならば、当該エピ
トープ同士の近接によって決定される程度に、抗体は互いを阻止すると予想されることが
、当該技術分野において知られている。一抗体を標識して、モル過剰の非標識抗体でチャ
レンジしてから、固定化した標的タンパク質と反応させる抗体競合実験は、2つの抗体が
互いに近接して位置するエピトープに結合するかを判定する容易な方法である。
AXLに結合することで、重なるエピトープに結合する別のMAbを、本発明の抗AX
L抗体(すなわち、M77-297b81.1.1)が妨害するかを判定するために、抗
体競合実験を行った。
この実験では、試験抗体を最初にビオチン化した。次いで、ビオチン化抗体を、AXL
結合アッセイにおいて、非標識抗体(全て、ビオチン化抗体に対して50倍のモル過剰に
て存在)のパネルでチャレンジした。非標識抗体パネルは、2つの試験抗体の非標識バー
ジョン、Cell Signaling由来の、AXLに向けられる第3の抗体、および
適切なアイソタイプコントロールを含んだ。ビオチン化抗体と未標識抗体との混合物を、
ELISAプレート上に固定化した組換えヒトAXLと反応させた、2時間のインキュベ
ーション時間の後に、非結合抗体を洗浄によって除去して、固定化したビオチンを、スト
レプトアビジン-HRPに続くTMB基質溶液で検出した。
M77-297b81.1.1の非標識バージョンは、それ自体のビオチン化バージョ
ンを阻止すると予想された。他のAXL MAbの非標識バージョンおよびビオチン化バ
ージョンについても同じ結果が予想された。しかしながら、M77-297b81.1.
1の非標識バージョンが、他のAXL MAbのビオチン化バージョンを阻止することが
見出されたならば、またはその逆があったならば、AXLタンパク質上のエピトープが近
接していることに起因して、当該抗体は互いに競合したであろうという結論となる。Ce
ll Signaling抗体で得た結果は、この抗体のエピトープが、M77-297
b81.1.1のエピトープと遠く離れていたかまたは近接していたかを示すであろう。
材料および方法
この実験で用いたタンパク質および抗体を、表IVに要約する。
抗体のビオチン化:20倍のモル比のSulfo-NHS-LC-Biotin(Th
ermo-Fisher,Waltham,MA)を用いて、室温にて2時間、AXL抗
体M77-297b81.1.1およびV77-2a37.1のアリコートをビオチン化
した。組み込まれていないビオチンを、PBSに対する徹底的な透析によって除去した。
組換えAXLの固定化:組換えヒトAxlタグ5タンパク質を、最初に、炭酸塩バッフ
ァ中0.5μg/mLに希釈した。希釈したタンパク質溶液のアリコート(50μL)を
、96ウェルNunc Maxisorp ELISAプレート(Thermo-Fis
her,Waltham,MA)のウェル中にピペットで入れた。プレートを覆って、室
温にて一晩インキュベートして、タンパク質を固定化した。次いで、プレートを吸引して
、1洗浄サイクルにつきウェルあたり200μLのPBST(PBSプラス0.05%T
ween-20)で3回、洗浄した。プレートを、200μLのブロッキング溶液(PB
Sプラス3%脱脂粉乳)で、室温にて1時間、ブロッキングした。
抗体競合:非標識抗体を、PBSTプラス3%脱脂粉乳中100μg/mLの濃度に希
釈した一方、2つのビオチン化抗体を、PBSTプラス3%脱脂粉乳中2μg/mLの濃
度に希釈した。各非標識抗体のアリコート(25μL)に続いて、ビオチン化抗体の25
μLアリコートを、コーティングしたプレートの指定されたウェル中にピペットで入れた
。溶液を十分に混合して、室温にて2時間、プレート中でインキュベートした。プレート
をPBSTで3回洗浄した。結合したビオチン化抗体を、50μLストレプトアビジン-
HRP(Southern Biotech,Birmingham,AL)で検出した
(3%脱脂粉乳入りPBST中に1~5000倍希釈;室温にて1時間)。次いで、プレ
ートを3回洗浄して、70μLのTMB(室温にて20分)に続く50μL停止溶液によ
り、結合したHRPを検出した。次いで、プレートの光学密度を、650nmにて測定し
た。
結果:結果は、あらゆる非標識抗体の不在下で、M77-297b81.1.1および
V77-2a37.1双方のMAbのビオチン化バージョンが、AXLコーティングした
ELISAプレートでロバストなシグナルを与えたことを示す。この結果は、プレートが
十分にコーティングされていること、そしてビオチン化反応が良好な結果をもたらすこと
を示した。
さらに、この実験に含まれるアイソタイプコントロール抗体、cmlys-lc3.1
は、2つのビオチン化抗体がAXLに結合する能力を妨害せず、このことは、アイソタイ
プコントロールが、2つのビオチン化抗体のいずれとも競合しないことを示している。
予想されるように、ビオチン化バージョンの50倍のモル過剰にて存在する抗体V77
-2a37.1の非標識バージョンは、固定化AXLへの結合について、それ自体のビオ
チン化バージョンと競合する。同様に、M77-297b81.1.1の非標識バージョ
ンは、それ自体のビオチン化バージョンと競合する。しかしながら、V77-2a37.
1のビオチン化バージョンが、M77-297b81.1.1の50倍のモル過剰で提示
される場合、競合は観察されず、このことは、これらの2つの抗体のエピトープが、実際
には異なることを示している。この観察を支持して、M77-297b81.1.1のビ
オチン化バージョンが、V77-2a37.1の50倍のモル過剰で提示される場合、競
合は観察されない(表Vおよび表VI)。
加えて、この実験はまた、Cell Signalingウサギモノクローナル抗AX
L抗体がビオチン化M77-297b81.1.1およびビオチン化V77-2a37.
1MAbと競合する能力を試験した。示された結果は、Cell Signalingウ
サギモノクローナル抗AXL抗体が、ビオチン化M77-297b81.1.1の、AX
Lへの結合能力に及ぼす影響が小さく(3.3%の競合)、そしてビオチン化M77-2
97b81.1.1の、AXLへの結合能力に及ぼす影響が、同様に小さい(1.5%)
ことを示している。これらの結果は、Cell Signalingウサギモノクローナ
ル抗AXL抗体のエピトープと、2つの試験抗体との間の重なり度合の潜在性が最小であ
ることを示唆している(表VI)。
実施例6
細胞ブロックサンプルを用いたAXL検出用の免疫組織化学試薬としてのC89E7 M
AbおよびAF154 MAbの評価
この実験では、ヒト肺癌細胞株NCI-H292およびHCC827(America
n Type Culture Collectionから購入)、ならびにNCI-H
727(European Collection of Cell Cultureか
ら購入)の3つの細胞ブロックサンプルを、10%ウシ胎児血清(Sigma-Aldr
ich,St.Louis,MO)を補充したRPMI1640培地(Thermo F
isher Scientific,Waltham,MA)中で培養して、遠心分離し
て洗浄した後に、細胞を10%リン酸塩緩衝ホルマリン中で一晩固定した。次いで、細胞
ペレットを、O.C.T.コンパウンド(サクラファインテックジャパン株式会社)と混
合して、細胞ブロックを得、これをその後、パラフィン包埋した。
細胞ブロックを切って、ガラススライド上に載せた後、切片におけるAXL発現を、R
NA ISHキット(提供されるユーザーマニュアルに従って、QuantiGene
ViewRNA TYPE1 Probe Set Human AXL(Affyme
trix,Santa Clara,CA)による、QuantiGene ViewR
NA ISH tissue 1-Plex Assayキット(Affymetrix
,Santa Clara,CA)およびQuantiGene ViewRNA Ch
romogenic Signal Ampキット(Affymetrix,Santa
Clara,CA))を用いたRNAインサイチュハイブリダイゼーション(RNA
ISH)によって、確認した。アルカリホスファターゼ(AP)で標識したAXL mR
NAを視覚化するために、キットに含まれるプロトコルに従って、WarpRed Ch
romogen Kit(Biocare Medical,Concord,CA)を
色原体として用いた。次いで、スライドをヘマトキシリンで対比染色して、空気乾燥させ
て、キシレン中でクリアにして、永久マウント媒体Entellan new試薬(Me
rck,Darmstadt、ドイツ)でマウントした。AXL発現の特異的シグナルが
、NCI-H292細胞において観察された(図6A(i))一方、HCC827(図6
A(ii))およびNCI-H727細胞(図6A(iii))においてシグナルは実質
的に観察されず、このことは、NCI-H292細胞株がAXL陽性であるが、HCC8
27細胞株およびNCI-H727細胞株が双方ともAXL陰性であったことを示す。
次に、2つの抗AXL抗体、Cell Signalingウサギモノクローナル抗体
[C89E7](Cell Signaling Technologies,Danv
ers,MA)、およびR&Dヤギポリクローナル抗体[AF154](R&D sys
tems,Minneapolis,MN)を、細胞ブロックサンプルを用いて、免疫組
織化学(IHC)によって評価した。簡潔には、細胞ブロックの切片を脱ワックスして、
再水和させて、オートクレーブ(121℃で10分間)またはマイクロ波(100℃で1
5分間)によって抗原回収を実行してから、内因性ペルオキシダーゼを、3%H
メタノールで不活化した。次いで、スライドを、1%BSAを含有するTBSでブロッキ
ングして、同バッファ中1:100希釈抗体とインキュベートした。TBST(TBSプ
ラス0.05%Tween20)で3回洗浄した後、第2の抗体、3,3’-ジアミノベ
ンジジン、および表VIIIに列挙するテトラヒドロクロライド(DAB)試薬で、スラ
イド中のAXLを検出して視覚化してから、マイヤーヘマトキシリンで対比染色した。I
HC実験で用いた詳細な条件を、表VIIIに記載している。これらの3つの細胞ブロッ
クについてのAXLのIHC染色の結果を、図6B(i)~図6B(vi)に示した。N
CI-H292細胞における抗AXLモノクローナル抗体[C89E7]によるAXLに
ついてのIHCは、強い染色を示した(図6B(i))が、HCC827細胞(図6B(
ii))およびNCI-H727細胞(図6B(iii))では、染色は実質的に観察さ
れなかった。これは、RNA ISH実験によって得られたAXL発現の観察結果と一致
した。一方、ぎりぎりの、または弱いIHC染色シグナルが、抗AXLポリクローナル抗
体[AF154]によって、HCC827細胞(図6B(v))およびNCI-H727
細胞(図6B(vi))において観察された。これは、RNA ISHの結果と一致しな
かった。これらの観察は、抗AXLモノクローナル抗体[C89E7]が、抗AXLポリ
クローナル抗体[AF154]よりも、IHC試薬として適しているようであることを示
唆した。なぜなら、抗AXLモノクローナル抗体[C89E7]は、これらの3つの細胞
ブロックを用いたこれらの実験において観察されるような非特異的シグナルを示さなかっ
たからである。
実施例7
抗AXL V77-2a37.1MAb、M77-297b81.1.1MAb、および
C89E7MAbを用いた、選択されたAXL RNA(+)(-)FFPEサンプルに
おける比較免疫組織化学
抗AXL抗体V77-2a37.1(Agensys,Inc.-Veloclmmu
ne(登録商標)マウス(Regeneron,Inc.,Tarrytown NY、
重鎖アミノ酸は、配列番号32として配列表に記載され、軽鎖アミノ酸は、配列番号33
として配列表に記載されている)を用いて生じたAXL MAb)、M77-297b8
1.1.1、およびAXL(C89E7)による非特異的IHC染色を、乳房(図7A~
図7D)、肝細胞(図7E~図7H)、および結腸(図7I~7L)の癌腫サンプル由来
のAXL陰性腫瘍標本(qPCRによって測定した)において、評価した。
簡潔には、ホルマリン固定したパラフィンワックス包埋組織を4ミクロン切片に切って
、ガラススライド上に載せた。切片を脱ワックスして、再水和させて、BOND-MAX
自動化IHC染色系(Leica Biosystems,Buffalo Grove
,IL)内で、Novocastra Bond Epitope Retrieval
Solution 2(Leica Biosystems,Buffalo Gro
ve,IL)と 100℃にて30分間、続いて室温にて12分間、処理した。次いで、
切片を、モノクローナル抗AXL抗体V77-2a37.1、M77-297b81.1
、モノクローナルウサギ抗AXL抗体Axl(C89E7)(Cell Signali
ng Technology,Danvers,MA)、またはアイソタイプコントロー
ルとインキュベートした。その後、切片を、Novocastra Bond Poly
mer Refine Detection Systemで処理した。これは、ポスト
プライマリウサギ抗マウスIgG試薬中でのインキュベーションに続く、ポリマー抗ウサ
ギポリHRP-IgG試薬(Leica Biosystems,Buffalo Gr
ove,IL)とのインキュベーションからなる。次いで、切片を3%過酸化水素溶液で
処理して、内因性ペルオキシダーゼ活性を不活化した。DAB精製キット(Leica
Biosystems,Buffalo Grove,IL)を用いて、クロモゲン基質
の可視化を進め、ヘマトキシリンを用いて核を染色し、そしてAperio ePath
ology Scanscope撮像系(Leica Biosystems,Vist
a,CA)上でスライドをスキャンして分析した。
結果は、AXL特異的V77-2a37.1抗体(図7A、図7E、図7I)およびM
77-297b81.1.1抗体(図7B、図7F、および図7J)を用いて、ブラウン
染色の欠如によって示される、非特異的染色の制限または不在が、腫瘍標本の全てにおい
て観察されたことを示している。さらに、アイソタイプコントロール抗体もまた、腫瘍標
本において非特異的染色を示さなかった(図7D、図7H、図7L)。対照的に、市販の
抗AXL抗体、AXL(C89E7)は、AXL mRNA発現が制限された腫瘍標本に
おいて、顕著なブラウン染色を示した(図7C、図7G、図7K、矢印参照)。
図7における結果は、AXL mRNA陰性組織サンプルにおける非特異的染色の不在
に起因して、V77-2a37.1およびM77-297b81.1.1が、優れたIH
C抗体であることを示している。
本出願の全体を通して、様々なウェブサイトのデータの内容、出版物、特許出願、およ
び特許が参照されている。(ウェブサイトは、ユニフォームリソースロケータ、すなわち
URL、ワールドワイドウェブ上のアドレスによって参照される)。これらの引用の開示
はそれぞれ、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
本発明は、本明細書中で開示される実施形態によって範囲が限定されるべきでなく、実
施形態は、本発明の個々の態様の単なる例示として意図されており、機能的に等価なもの
は全て、本発明の範囲内である。本明細書に記載されたものに加えて、本発明のモデルお
よび方法に対する様々な修正が、上記の説明および教示から当業者に明らかであろうし、
同様に、本発明の範囲内に含まれることが意図される。そのような修正または他の実施形
態が、本発明の真の範囲および精神から逸脱せずに実施されてよい。
Figure 0007072703000001
Figure 0007072703000002
Figure 0007072703000003
Figure 0007072703000004
Figure 0007072703000005
Figure 0007072703000006
Figure 0007072703000007
Figure 0007072703000008

Claims (18)

  1. 配列番号8に示される重鎖可変領域配列中のCDRのアミノ酸配列からなる3つの相補性決定領域(CDR)を含む重鎖可変領域、および配列番号10に示される軽鎖可変領域配列中のCDRのアミノ酸配列からなる3つの相補性決定領域(CDR)を含む軽鎖可変領域を含み、前記CDRはKabat、Chothia、またはContactのナンバリングスキームにより決定される、AXLタンパク質に結合する抗体またはその抗原結合フラグメント。
  2. 前記抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号20に示されるアミノ酸配列からなるCDR-H1、配列番号22に示されるアミノ酸配列からなるCDR-H2、配列番号23に示されるアミノ酸配列からなるCDR-H3、配列番号11に示されるアミノ酸配列からなるCDR-L1、配列番号12に示されるアミノ酸配列からなるCDR-L2、および配列番号13に示されるアミノ酸配列からなるCDR-L3を含む、請求項1に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
  3. 前記抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号8に示される重鎖可変領域アミノ酸配列と約99%の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、および配列番号10に示される軽鎖可変領域アミノ酸と約99%の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含み、
    約99%の配列同一性を占めるアミノ酸の相違は、どのCDR領域中にもあたらない、請求項1又は2に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
  4. 前記フラグメントは、Fab、F(ab’)、Fv、またはscFvである、請求項1~3のいずれか1項に記載のその抗原結合フラグメント。
  5. 前記抗体はヒト化抗体である、請求項1~3のいずれか1項に記載の抗体。
  6. 前記抗体またはその抗原結合フラグメントは、組換えにより生産される、請求項1~5のいずれか1項に記載の抗体またはその結合フラグメント。
  7. 前記抗体またはその抗原結合フラグメントは、造影剤に結合されている、請求項1~6のいずれか1項に記載の抗体またはその結合フラグメント。
  8. 前記抗体またはその抗原結合フラグメントは、癌の処置および管理のために患者をスクリーニングするコンパニオン診断(CDx)として用いられる、請求項1~7のいずれか1項に記載の抗体またはその結合フラグメント。
  9. 対象の癌組織におけるAXL発現を検出する方法に使用するための請求項1~8のいずれか1項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントであって、前記方法は、前記抗体またはその抗原結合フラグメントを、前記対象から得られたサンプルと接触させる工程を含む、抗体またはその抗原結合フラグメント
  10. 前記方法は更に、前記対象からサンプルを得る工程を含む、請求項9に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント
  11. 前記対象は癌患者である、請求項9又は10に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント
  12. 前記癌は、肉腫、膵臓癌、黒色腫、卵巣癌、および肺癌からなる群から選択される、請求項9に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント
  13. AXL発現が陽性である癌患者を同定する方法に使用するための請求項1~10のいずれか1項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントであって、前記方法は、前記抗体またはその抗原結合フラグメントを、前記対象から得られたサンプルと接触させる工程を含む、抗体またはその抗原結合フラグメント
  14. 前記方法は更に、前記対象からサンプルを得る工程を含む、請求項13に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント
  15. 前記癌は、肉腫、膵臓癌、黒色腫、卵巣癌、および肺癌からなる群から選択される、請求項13に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント
  16. 前記癌患者は、EGFR阻害剤による処置を経験している、請求項13~15のいずれか1項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント
  17. 前記癌は、EGFR阻害剤に対して耐性である、請求項13~16のいずれか1項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント
  18. 請求項1~8のいずれか1項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、AXL発現を検出するためのキット。
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