JP6946304B2

JP6946304B2 - 増殖分化因子１５（ｇｄｆ−１５）を使用して代謝障害を処置するまたは軽快させる方法

Info

Publication number: JP6946304B2
Application number: JP2018532639A
Authority: JP
Inventors: チャトコー，ウィリアム; リチャードネヴィルハドコック，ジョン; アレックスヘルドウェイン，カート; リチャードソンウセラ，アイミー
Original assignee: ノバルティスアーゲー
Priority date: 2015-12-22
Filing date: 2016-12-20
Publication date: 2021-10-06
Anticipated expiration: 2036-12-20
Also published as: CN108367053A; JP2018538335A; WO2017109706A1; US20190000923A1; EP3393494A1; US20220249614A1

Description

関連出願の相互参照
本出願は、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる２０１５年１２月２２日に出願された米国特許仮出願第６２／２７０，９６７号の利益を主張する。

配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出されており、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる配列表を含有する。２０１６年１２月１６日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、ＰＡＴ０５７１６８−ＷＯ−ＰＣＴ＿ＳＬ．ｔｘｔと名付けられ、９２０，２５４バイトの大きさである。

本発明は、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）および非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、ならびに、それだけには限らないが、アルコール性脂肪性肝炎（ＡＳＨ）、末期肝臓疾患、脂肪肝（hepatic steatosis）（脂肪肝（fatty liver））、肝臓線維症、肝臓炎症、肝硬変、原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）および肝細胞癌（ＨＣＣ）を含む関連状態の処置に関する。

非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）は、米国では、３〜５人に１人の成人および１０人に１人の小児に影響を及ぼす障害であり、アルコールをほとんど飲まないまたは全く飲まない人の肝臓において過剰の脂肪の蓄積がある状態を指す。ＮＡＦＬＤの最も一般的な形態は、脂肪が肝臓細胞に蓄積する脂肪肝（hepatic steatosis）（脂肪肝（fatty liver））と呼ばれる非重篤状態である。生理学的には正常な状態ではないが、脂肪肝自体は、肝臓に傷害を与えない可能性が高い。

ＮＡＦＬＤは、ほとんどの場合、食後グルコースに対する不耐容性を伴うまたは伴わない空腹時血糖値（ＦＰＧ）の上昇、過体重または肥満であること、コレステロールおよびトリグリセリド（ＴＧ）などの高い血中脂質および低い高密度リポタンパク質コレステロール（ＨＤＬ−Ｃ）レベルならびに高血圧を特徴とする「メタボリックシンドローム」と呼ばれるリスク因子の集まりを有する個体において現れる。すべてのＮＡＦＬＤ患者が、メタボリックシンドロームの徴候を有するわけではない。

肥満症は、ＮＡＦＬＤの最も一般的な原因であると考えられており、一部の専門家は、肥満の成人の約３分の２および肥満の小児の２分の１が、脂肪肝（hepatic steatosis）を有し得ると推定している。ＮＡＦＬＤを有する個体の大部分は、症状および通常の身体診察を全く有さず（肝臓が、わずかに肥大している場合はあるが）、小児は、腹痛および疲労などの症状を呈することもあり、斑状の暗い皮膚変色（黒色表皮腫）を示すこともある。ＮＡＦＬＤの診断は、通常、まず、日常的な試験の際にその肝臓血液試験において軽度の上昇を有するとわかった、過体重または肥満の人において疑われる。ＮＡＦＬＤは、通常の肝臓血液試験を用いて示され得るが、腹部超音波またはＣＴスキャンなどの画像法調査で偶発的に検出され得る。画像法研究、最も一般的には、肝臓超音波または磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）および他の原因の排除によって確認される。

ＮＡＦＬＤを有する一部の人は、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）と呼ばれるより重篤な状態を発生し得る：成人米国人の約２〜５パーセントおよび肥満である人の最大２０パーセントは、ＮＡＳＨを患い得る。ＮＡＳＨでは、肝臓の脂肪蓄積は、炎症および種々の程度の瘢痕を伴う。ＮＡＳＨは、末期肝臓疾患、硬変および肝細胞癌へ進行する実質的なリスクを有する潜在的に重篤な状態である。硬変を発症し、肝不全のリスクにある一部の患者は、最終的に肝臓移植を必要とすることもある。

ＮＡＦＬＤは、ＮＡＦＬＤ活性スコア（ＮＡＳ）、脂肪肝（steatosis）（０〜３）、小葉炎症（０〜２）および肝細胞バルーニング（０〜２）の肝臓生検の組織病理学スコアの合計によってＮＡＳＨから区別することができる。＜３のＮＡＳは、ＮＡＦＬＤに相当し、３〜４は、境界型ＮＡＳＨに相当し、＞５は、ＮＡＳＨに相当する。生検はまた、線維症（０〜４）についてもスコア化される。

ＮＡＦＬＤまたはＮＡＳＨを予防または処置するための現在承認されている薬物はない。ＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨにおいていくつかの薬理学的介入が試みられてきたが、全体的に限定された利益しか有さなかった。

本発明は、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）および非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、ならびにそれだけには限らないが、アルコール性脂肪性肝炎（ＡＳＨ）を含む関連状態を処置するための方法に関し、前記方法は、それを必要とする対象に、有効量の、本明細書において記載されるような、ＧＤＦ１５融合ポリペプチドまたはＧＤＦ１５コンジュゲート、例えば、ＧＤＦ１５脂肪酸コンジュゲート（通常、医薬組成物の形態の）を投与することを含む。いくつかの態様では、本発明は、それを必要とする対象において、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）および非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）ならびに末期肝臓疾患、脂肪肝（hepatic steatosis）（脂肪肝（fatty liver））、肝臓線維症、肝臓炎症、肝硬変、原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）および肝細胞癌（ＨＣＣ）を処置するための方法に関し、前記方法は、それを必要とする対象に、有効量の、本明細書において記載されるようなＧＤＦ１５融合ポリペプチド（通常、医薬組成物の形態の）を投与することを含む。

いくつかの実施形態では、本発明の方法は、例えば、ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＰ＿００４８５５．２を有し、ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＭ＿００４８６４．２を有するポリヌクレオチド配列によってコードされ、例えば、Ｓｔ．ＶｉｎｃｅｎｔｓＨｏｓｐｉｔａｌに譲渡された国際公開第９７／００９５８号パンフレットのような公開特許出願において見出される野生型ＧＤＦ１５全長タンパク質の一部を含む。限定されない例として、いくつかの実施形態では、本発明の方法は、成熟ＧＤＦ１５タンパク質、すなわち、野生型ＧＤＦ１５全長タンパク質のアミノ酸残基１９８〜３０８を含む。その他の実施形態では、本発明の方法は、全長ＧＤＦ１５タンパク質のより小さい断片、ドメインおよび／または領域を含む。

いくつかの実施形態では、本発明の方法は、ＧＤＦ１５タンパク質配列の変異体または突然変異、例えば、生物学的に活性なＧＤＦ１５変異体を含み、ＧＤＦ１５タンパク質の末端切断型（Ｃ−および／またはＮ末端領域から残基が除去されており、それによって、短縮している／末端切断されているタンパク質）ならびに対象の位置でのアミノ酸の１つまたは複数の点置換、欠失および／または部位特異的組込みを有する（例えば、保存的アミノ酸残基を有する、非保存的残基を有する、またはピロリジンなどの非天然アミノ酸残基を有する）変異体を含み得る。用語「変異体」および「突然変異体」は、同義的に使用され、本明細書においてさらに定義される。

いくつかの実施形態では、本発明の方法は、Ｆｃ融合物または血清アルブミン（ＳＡ）融合物などのＧＤＦ１５融合タンパク質配列を含む。用語「融合タンパク質」、「融合ポリペプチド」および「融合物」は、同義的に使用され、本明細書においてさらに定義される。さらにその他の実施形態では、本発明の方法は、ＧＤＦ１５および脂肪酸のコンジュゲーションを含む。前記コンジュゲートおよび融合物は、本明細書において列挙される状態の治療剤として働くことに加えてＧＤＦ１５部分の半減期を延長するよう意図され得る。いくつかの実施形態では、本発明の方法において使用されるコンジュゲートおよび融合物は、野生型ＧＤＦ１５を含み、その他の実施形態では、コンジュゲートおよび融合物は、野生型全長または成熟タンパク質に対して変異体ＧＤＦ１５配列を含む。

前記ＧＤＦ１５変異体、コンジュゲートおよび融合物の代表例は、例えば、ＰＣＴ国際公開第１３／１４８１１７号パンフレットおよび国際公開第１４／１２０６１９号パンフレットおよびすべての関連パテントファミリーメンバー（それだけには限らないが、米国特許第９，１６１，９６６号明細書を含む）に、ならびにＰＣＴ国際公開第２０１２／１３８９１９号パンフレット、国際公開第１３／１１３００８号パンフレットおよび国際公開第１５／０１７７１０号パンフレットおよびすべての関連パテントファミリーメンバーに記載されている。すべての場合において、前記ＧＤＦ１５変異体、コンジュゲートおよび融合物の代表例は、米国および世界のその他の地域の両方における、任意の関連出願、交付済み特許および上記のもののファミリーメンバー中に見出すことができる。上記のもののすべての、ならびに任意の関連出願、交付済みの特許およびファミリーメンバーの開示内容は、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる。具体的な実施形態は、以下の表中に見出すことができる（表１）：

いくつかの実施形態では、本発明の方法は、Ｆｃ融合物またはアルブミン融合物などのＧＤＦ１５融合タンパク質を含む。前記融合物は、野生型ＧＤＦ１５またはその変異体を含み得る。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、異種アミノ酸配列と、任意選択で、ＧＳ（配列番号３１３）または（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号３０３）（ここで、ｎは、１〜約２０、好ましくは、１、２、３または４である）などのリンカーを介して融合され得るポリペプチドを含む。

異種アミノ酸配列は、ＩｇＧ定常ドメインまたはその断片（例えば、Ｆｃ領域）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）またはアルブミン結合性ポリペプチドであり得る。いくつかの実施形態では、異種アミノ酸配列は、その他のＩｇＧサブタイプと比較して低減した、Ｆｃγ受容体および補体因子に結合する能力のために、ヒトＩｇＧ４Ｆｃ領域に由来する。このような方法は、前記融合ポリペプチドの多量体を含み得る。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、異種アミノ酸配列（例えば、ＨＳＡ、Ｆｃなど）が、本明細書に記載されるようなＧＤＦ１５タンパク質または変異体のアミノ末端に融合される融合タンパク質を含み、その他の実施形態では、融合は、ＧＤＦ１５タンパク質または変異体のカルボキシル末端で起こる。

いくつかの実施形態では、本発明の方法は、ＧＤＦ１５コンジュゲート、例えば、ＧＤＦ１５脂肪酸（ＦＡ）コンジュゲート、例えば、リンカーを介して脂肪酸部分に共有結合によって付加されているＧＤＦ１５野生型タンパク質（全長、成熟またはその断片もしくは末端切断物）または変異体を含む。具体的な実施形態では、本明細書において提供される方法は、脂肪酸コンジュゲートではないＧＤＦ１５コンジュゲートまたはＧＤＦ１５変異体コンジュゲートを投与することを含む。具体的な実施形態では、本明細書において提供される方法は、ＧＤＦ１５脂肪酸コンジュゲートまたはＧＤＦ１５変異体脂肪酸コンジュゲートを投与することを含み、脂肪酸部分は、ミリスチン酸ではなく、本明細書において記載されるような式Ａ１、Ａ２およびＡ３の脂肪酸ではない。

いくつかの実施形態では、本発明の方法は、１つもしくは複数のポリマー、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリシアル酸に共有結合によって連結されるＧＤＦ１５融合タンパク質またはコンジュゲートを含む。ＰＥＧ基は、本発明の融合タンパク質またはコンジュゲートの成分部分の生物学的機能を増強し、および／または干渉しないような方法で付加される。

本発明はまた、本明細書において開示されるＧＤＦ１５融合タンパク質またはＧＤＦ１５コンジュゲートおよび医薬上許容される製薬物質を含む医薬組成物を用いて処置する方法を提供する。このような医薬組成物は、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）および非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）ならびに末期肝臓疾患、脂肪肝（hepatic steatosis）（脂肪肝（fatty liver））、肝臓線維症、肝臓炎症、肝硬変、原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）および肝細胞癌（ＨＣＣ）のうちの１つまたは複数を処置するための方法において使用でき、方法は、それを必要とするヒト患者に、本発明の医薬組成物を投与することを含む。

本発明はまた、本明細書において開示されるＧＤＦ１５融合タンパク質またはＧＤＦ１５コンジュゲートおよび医薬上許容される製薬物質を含む医薬組成物を用いて処置する方法も提供する。このような医薬組成物は、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）および非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）ならびに末期肝臓疾患、脂肪肝（hepatic steatosis）（脂肪肝（fatty liver））、肝臓線維症、肝臓炎症、肝硬変、原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）および肝細胞癌（ＨＣＣ）のうちの１つまたは複数を処置するための方法において使用でき、方法は、それを必要とするヒト患者に本発明の医薬組成物を投与することを含む。

本発明はまた、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）および非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）ならびに末期肝臓疾患、脂肪肝（hepatic steatosis）（脂肪肝（fatty liver））、肝臓線維症、肝臓炎症、肝硬変、原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）および肝細胞癌（ＨＣＣ）のうちの１つまたは複数の処置のために、本明細書において開示されるＧＤＦ１５融合タンパク質またはＧＤＦ１５コンジュゲートを提供する。本発明はまた、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）および非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）ならびに末期肝臓疾患、脂肪肝（hepatic steatosis）（脂肪肝（fatty liver））、肝臓線維症、肝臓炎症、肝硬変、原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）および肝細胞癌（ＨＣＣ）のうちの１つまたは複数の処置のために、本明細書において開示されるＧＤＦ１５融合タンパク質またはＧＤＦ１５コンジュゲートを含む医薬組成物も提供する。

本開示の限定されない実施形態は、以下の態様において記載される：
１．ＧＤＦ１５変異体、ＧＤＦ１５融合タンパク質またはＧＤＦ１５コンジュゲートのうちの１つまたは複数を含むＧＤＦ１５治療剤の治療上有効な量を投与することによって、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、末期肝臓疾患、脂肪肝（hepatic steatosis）（脂肪肝（fatty liver））、肝臓線維症、肝臓炎症、肝硬変、原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）または肝細胞癌（ＨＣＣ）を処置する方法。
２．ＧＤＦ１５治療剤が、ＧＤＦ１５コンジュゲートである、態様１の方法。
３．ＧＤＦ１５治療剤が、ＨＳＡ−ＧＤＦ１５融合タンパク質またはＦｃ−ＧＤＦ１５融合タンパク質である、態様１の方法。
４．ＧＤＦ１５治療剤が、表１から選択される、態様１の方法。
５．ＧＤＦ１５タンパク質、変異体、突然変異体、融合物またはコンジュゲートのうちの１つまたは複数を含むＧＤＦ１５治療剤の治療上有効な量を投与することによって、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）または非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）を処置する方法。
６．ＧＤＦ１５治療剤が、脂肪酸−ＧＤＦ１５コンジュゲートまたはＰＥＧ−ＧＤＦ１５コンジュゲートである、態様５の方法。
７．ＧＤＦ１５治療剤が、ＨＳＡ−ＧＤＦ１５融合タンパク質またはＦｃ−ＧＤＦ１５融合タンパク質である、態様５の方法。
８．ＧＤＦ１５治療剤が、表１から選択される、態様５の方法。
９．ＧＤＦ１５タンパク質、変異体、突然変異体、融合物またはコンジュゲートのうちの１つまたは複数を含むＧＤＦ１５治療剤を含む医薬組成物の治療上有効な量を投与することによって、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、末期肝臓疾患、脂肪肝（hepatic steatosis）（脂肪肝（fatty liver））、肝臓線維症、肝臓炎症、肝硬変、原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）または肝細胞癌（ＨＣＣ）を処置する方法。
１０．ＧＤＦ１５治療剤が、脂肪酸−ＧＤＦ１５コンジュゲートまたはＰＥＧ−ＧＤＦ１５コンジュゲートである、態様９の方法。
１１．ＧＤＦ１５治療剤が、ＨＳＡ−ＧＤＦ１５融合タンパク質またはＦｃ−ＧＤＦ１５融合タンパク質である、態様９の方法。
１２．ＧＤＦ１５治療剤が、表１から選択される、態様９の方法。
１３．ＧＤＦ１５タンパク質、変異体、突然変異体、融合物またはコンジュゲートのうちの１つまたは複数を含むＧＤＦ１５治療剤を含む医薬組成物の治療上有効な量を投与することによって、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）または非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）を処置する方法。
１４．ＧＤＦ１５治療剤が、脂肪酸−ＧＤＦ１５コンジュゲートまたはＰＥＧ−ＧＤＦ１５コンジュゲートである、態様１３の方法。
１５．ＧＤＦ１５治療剤が、ＨＳＡ−ＧＤＦ１５融合タンパク質またはＦｃ−ＧＤＦ１５融合タンパク質である、態様１３の方法。
１６．ＧＤＦ１５治療剤が、表１から選択される、態様１３の方法。
１７．ＧＤＦ１５治療剤が、配列番号４１のアミノ酸配列を含むＧＤＦ１５ポリペプチドを含まない、態様１から１６のいずれか１つの方法。
１８．ＧＤＦ１５治療剤が、配列番号４１のアミノ酸配列を含む脂肪酸−ＧＤＦ１５コンジュゲートではない、態様１から１７のいずれか１つの方法。
１９．ＧＤＦ１５治療薬が、以下のアミノ配列：
（ｉ）配列番号４１；
（ｉｉ）
ＭＨＨＨＨＨＨＡＲＮＧＤＨＣＰＬＧＰＧＲＣＣＲＬＨＴＶＲＡＳＬＥＤＬＧＷＡＤＷＶＬＳＰＲＥＶＱＶＴＭＣＩＧＡＣＰＳＱＦＲＡＡＮＭＨＡＱＩＫＴＳＬＨＲＬＫＰＤＴＶＰＡＰＣＣＶＰＡＳＹＮＰＭＶＬＩＱＫＴＤＴＧＶＳＬＱＴＹＤＤＬＬＡＫＤＣＨＣＩ（Ｍ−（ｈｉｓ）_６−ｈＧＤＦ１５（１９７〜３０８））（配列番号３２１）、
（ｉｉｉ）ＭＨＨＨＨＨＨＭＡＲＮＧＤＨＣＰＬＧＰＧＲＣＣＲＬＨＴＶＲＡＳＬＥＤＬＧＷＡＤＷＶＬＳＰＲＥＶＱＶＴＭＣＩＧＡＣＰＳＱＦＲＡＡＮＭＨＡＱＩＫＴＳＬＨＲＬＫＰＤＴＶＰＡＰＣＣＶＰＡＳＹＮＰＭＶＬＩＱＫＴＤＴＧＶＳＬＱＴＹＤＤＬＬＡＫＤＣＨＣＩ（Ｍ−（ｈｉｓ）_６−Ｍ−ｈＧＤＦ１５（１９７〜３０８））（配列番号３２２）、
（ｉｖ）ＭＨＨＨＨＨＨＡＨＡＲＤＧＣＰＬＧＥＧＲＣＣＲＬＱＳＬＲＡＳＬＱＤＬＧＷＡＮＷＶＶＡＰＲＥＬＤＶＲＭＣＶＧＡＣＰＳＱＦＲＳＡＮＴＨＡＱＭＱＡＲＬＨＧＬＮＰＤＡＡＰＡＰＣＣＶＰＡＳＹＥＰＶＶＬＭＨＱＤＳＤＧＲＶＳＬＴＰＦＤＤＬＶＡＫＤＣＨＣＶ（Ｍ−（ｈｉｓ）_６−ｄＧＤＦ１５）（配列番号３２３）、
（ｖ）ＭＨＮＧＤＨＣＰＬＧＰＧＲＣＣＲＬＨＴＶＲＡＳＬＥＤＬＧＷＡＤＷＶＬＳＰＲＥＶＱＶＴＭＣＩＧＡＣＰＳＱＦＲＡＡＮＭＨＡＱＩＫＴＳＬＨＲＬＫＰＤＴＶＰＡＰＣＣＶＰＡＳＹＮＰＭＶＬＩＱＫＴＤＴＧＶＳＬＱＴＹＤＤＬＬＡＫＤＣＨＣＩ（ＭＨ−ｈＧＤＦ１５（１９９〜３０８））（配列番号３２４）、
（ｖｉ）ＭＨＡＧＤＨＣＰＬＧＰＧＲＣＣＲＬＨＴＶＲＡＳＬＥＤＬＧＷＡＤＷＶＬＳＰＲＥＶＱＶＴＭＣＩＧＡＣＰＳＱＦＲＡＡＮＭＨＡＱＩＫＴＳＬＨＲＬＫＰＤＴＶＰＡＰＣＣＶＰＡＳＹＮＰＭＶＬＩＱＫＴＤＴＧＶＳＬＱＴＹＤＤＬＬＡＫＤＣＨＣＩ（ＭＨＡ−ｈＧＤＦ１５（２００〜３０８））（配列番号３２５）、または
（ｖｉｉ）ＡＨＮＧＤＨＣＰＬＧＰＧＲＣＣＲＬＨＴＶＲＡＳＬＥＤＬＧＷＡＤＷＶＬＳＰＲＥＶＱＶＴＭＣＩＧＡＣＰＳＱＦＲＡＡＮＭＨＡＱＩＫＴＳＬＨＲＬＫＰＤＴＶＰＡＰＣＣＶＰＡＳＹＮＰＭＶＬＩＱＫＴＤＴＧＶＳＬＱＴＹＤＤＬＬＡＫＤＣＨＣＩ（ＡＨ−ｈＧＤＦ１５（１９９〜３０８））（配列番号３２６）
を含まない脂肪酸コンジュゲートである、態様１、２、４、５、６、８、９、１０、１２から１４および１６のいずれか１つの方法。
２０．ＧＤＦ１５治療剤が、ヒト血清アルブミン−ＧＤＦ１５融合物などの、配列番号４１のアミノ酸配列を含むアルブミン−ＧＤＦ１５融合物ではない、態様１から１７のいずれか１つの方法。
２１．ＧＤＦ１５治療剤が、以下：配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号４２〜６３、配列番号６９〜１０７、配列番号１４８、配列番号１４９および配列番号３２０のうちのいずれか１つ、または以下：配列番号４２〜６３、配列番号６９〜１０７、配列番号１４８、配列番号１４９および配列番号３２０のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む、態様１から１６のいずれか１つの方法。
２２．ＧＤＦ１５治療剤が、以下のアミノ酸配列：
（ｉ）ＭＨＨＨＨＨＨＡＲＮＧＤＨＣＰＬＧＰＧＲＣＣＲＬＨＴＶＲＡＳＬＥＤＬＧＷＡＤＷＶＬＳＰＲＥＶＱＶＴＭＣＩＧＡＣＰＳＱＦＲＡＡＮＭＨＡＱＩＫＴＳＬＨＲＬＫＰＤＴＶＰＡＰＣＣＶＰＡＳＹＮＰＭＶＬＩＱＫＴＤＴＧＶＳＬＱＴＹＤＤＬＬＡＫＤＣＨＣＩ（Ｍ−（ｈｉｓ）_６−ｈＧＤＦ１５（１９７〜３０８））（配列番号３２１）、
（ｉｉ）配列番号６、
（ｉｉｉ）配列番号７、
（ｉｖ）ＭＨＨＨＨＨＨＭＡＲＮＧＤＨＣＰＬＧＰＧＲＣＣＲＬＨＴＶＲＡＳＬＥＤＬＧＷＡＤＷＶＬＳＰＲＥＶＱＶＴＭＣＩＧＡＣＰＳＱＦＲＡＡＮＭＨＡＱＩＫＴＳＬＨＲＬＫＰＤＴＶＰＡＰＣＣＶＰＡＳＹＮＰＭＶＬＩＱＫＴＤＴＧＶＳＬＱＴＹＤＤＬＬＡＫＤＣＨＣＩ（Ｍ−（ｈｉｓ）_６−Ｍ−ｈＧＤＦ１５（１９７〜３０８））（配列番号３２２）、
（ｖ）ＭＨＨＨＨＨＨＡＨＡＲＤＧＣＰＬＧＥＧＲＣＣＲＬＱＳＬＲＡＳＬＱＤＬＧＷＡＮＷＶＶＡＰＲＥＬＤＶＲＭＣＶＧＡＣＰＳＱＦＲＳＡＮＴＨＡＱＭＱＡＲＬＨＧＬＮＰＤＡＡＰＡＰＣＣＶＰＡＳＹＥＰＶＶＬＭＨＱＤＳＤＧＲＶＳＬＴＰＦＤＤＬＶＡＫＤＣＨＣＶ（Ｍ−（ｈｉｓ）_６−ｄＧＤＦ１５）（配列番号３２３）、
（ｖｉ）ＭＨＮＧＤＨＣＰＬＧＰＧＲＣＣＲＬＨＴＶＲＡＳＬＥＤＬＧＷＡＤＷＶＬＳＰＲＥＶＱＶＴＭＣＩＧＡＣＰＳＱＦＲＡＡＮＭＨＡＱＩＫＴＳＬＨＲＬＫＰＤＴＶＰＡＰＣＣＶＰＡＳＹＮＰＭＶＬＩＱＫＴＤＴＧＶＳＬＱＴＹＤＤＬＬＡＫＤＣＨＣＩ（ＭＨ−ｈＧＤＦ１５（１９９〜３０８））（配列番号３２４）、
（ｖｉｉ）ＭＨＡＧＤＨＣＰＬＧＰＧＲＣＣＲＬＨＴＶＲＡＳＬＥＤＬＧＷＡＤＷＶＬＳＰＲＥＶＱＶＴＭＣＩＧＡＣＰＳＱＦＲＡＡＮＭＨＡＱＩＫＴＳＬＨＲＬＫＰＤＴＶＰＡＰＣＣＶＰＡＳＹＮＰＭＶＬＩＱＫＴＤＴＧＶＳＬＱＴＹＤＤＬＬＡＫＤＣＨＣＩ（ＭＨＡ−ｈＧＤＦ１５（２００〜３０８））（配列番号３２５）、
（ｖｉｉｉ）配列番号４１、および
（ｉｘ）ＡＨＮＧＤＨＣＰＬＧＰＧＲＣＣＲＬＨＴＶＲＡＳＬＥＤＬＧＷＡＤＷＶＬＳＰＲＥＶＱＶＴＭＣＩＧＡＣＰＳＱＦＲＡＡＮＭＨＡＱＩＫＴＳＬＨＲＬＫＰＤＴＶＰＡＰＣＣＶＰＡＳＹＮＰＭＶＬＩＱＫＴＤＴＧＶＳＬＱＴＹＤＤＬＬＡＫＤＣＨＣＩ（ＡＨ−ｈＧＤＦ１５（１９９〜３０８））（配列番号３２６）
のうちの１つを含まない、態様１から１６のいずれか１つの方法。
２３．ＧＤＦ１５治療剤が、式Ａ１、Ａ２およびＡ３：

［Ｒ^１は、ＣＯ_２ＨまたはＨであり、
Ｒ^２、Ｒ^３およびＲ^４は、互いに独立して、Ｈ、ＯＨ、ＣＯ_２Ｈ、−ＣＨ＝ＣＨ_２または−Ｃ≡ＣＨであり、
Ａｋは、分岐Ｃ_６〜Ｃ_３０アルキレンであり、
ｎ、ｍおよびｐは互いに独立して、６から３０の間の整数である］のうちのいずれか１つの脂肪酸を含まず、テトラデカン酸を含まない脂肪酸−ＧＤＦ１５コンジュゲートである、態様１、２、４、５、６、８、９、１０、１２から１４および１６のいずれか１つの方法。
２４．ＧＤＦ１５治療剤が、以下の脂肪酸：

のうちの１つまたは複数を含まない脂肪酸−ＧＤＦ１５コンジュゲートである、態様１、２、４、５、６、８、９、１０、１２から１４、１６および２２のいずれか１つの方法。

本発明のこれらおよびその他の態様は、以下の発明の詳細な説明において明らかにされる。

０．０１２５および０．５ｍｇ／ｋｇの脂肪酸−ＧＤＦ１５コンジュゲートの投与（６週間の研究）後の、それぞれ、体重の変化％および累積食物摂取量を表す図である。０．０１２５および０．５ｍｇ／ｋｇの脂肪酸−ＧＤＦ１５コンジュゲートの投与（６週間の研究）後の、肝臓重量および脂肪肝（hepatic steatosis）の変化を表す図である。０．０１２５および０．５ｍｇ／ｋｇの脂肪酸−ＧＤＦ１５コンジュゲートの投与（１６週間の研究）後の、体重の変化％を表す図である。０．０１２５および０．５ｍｇ／ｋｇの脂肪酸−ＧＤＦ１５コンジュゲートの投与（１６週間の研究）後の、肝臓重量および脂肪肝（hepatic steatosis）の変化を表す図である。

本発明は、ＧＤＦ１５、例えば、ＧＤＦ１５の変異体、コンジュゲートまたは融合物の投与による、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）および非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）ならびにそれだけには限らないが、アルコール性脂肪性肝炎（ＡＳＨ）、末期肝臓疾患、脂肪肝（hepatic steatosis）（脂肪肝（fatty liver））、肝臓線維症、肝臓炎症、肝硬変、原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）および肝細胞癌（ＨＣＣ）を含む関連状態の処置に関する。

増殖分化因子１５（ＧＤＦ１５）は、ＴＧＦβスーパーファミリーの多様なメンバーである。マクロファージ阻害性サイトカイン１（ＭＩＣｌ）（Bootcov MR, 1997, Proc Natl Acad Sci 94: 11514-9）、胎盤の骨形態形成因子（ＰＬＡＢ）（Hromas R 1997, Biochim Biophys Acta. 1354:40-4）、胎盤のトランスフォーミング増殖因子ベータ（ＰＴＧＦＢ）（Lawton LN 1997, Gene. 203: 17-26）、前立腺由来因子（ＰＤＦ）（Paralkar VM 1998, J Biol Chem. 273: 13760-7）および非ステロイド性抗炎症薬活性化遺伝子（ＮＡＧ−１）（Baek SJ 2001, J Biol Chem. 276: 33384- 92）とも呼ばれる。

ヒトＧＤＦ１５遺伝子は、染色体１９ｐ１３．２−１３．１上に位置し、ラットＧＤＦ１５遺伝子は、染色体１６上に位置し、マウスＧＤＦ１５遺伝子は、染色体８上に位置する。ＧＤＦ１５オープンリーディングフレームは、２つのエキソンにまたがる（Bottner M 1999, Gene. 237: 105-11およびNCBI）。成熟ＧＤＦ１５ペプチドは、その他のファミリーメンバーと低い相同性しか共有しない（Katoh M 2006, IntJMol Med. 17:951-5）。

ＧＤＦ１５は、大きな前駆体タンパク質として合成され、これが二塩基性切断部位で切断されて、カルボキシ末端成熟ペプチドを放出する。マウスおよびラットＧＤＦ１５プレプロペプチドは、両方とも３０３個のアミノ酸を含有する。ヒト全長前駆体は、３０８個のアミノ酸を含有する。げっ歯類成熟ペプチドは、ＲＧＲＲ（配列番号１）切断部位でのプロセシング後に１１５個のアミノ酸を含有する。ヒト成熟ペプチドは、ＲＧＲＲＲＡＲ（配列番号３０２）切断部位でのプロセシング後に１１２個のアミノ酸を含有する。ヒト成熟ＧＤＦ１５ペプチドは、ラットおよびマウス成熟ＧＤＦ１５ペプチドと、６６．１パーセントおよび６８．１パーセントの配列類似性を共有する（Bottner M 1999, Gene. 237: 105-11；Bauskin AR 2000, EMBO J. 19:2212-20；NCBI）。成熟ＧＤＦ１５ペプチド中にグリコシル化部位はない。

成熟ＧＤＦ１５ペプチドは、ＴＧＦスーパーファミリーメンバーに典型的であるシステインノットモチーフ（３つの鎖内ジスルフィド結合を有する）および単一の鎖間ジスルフィド結合の形成に必要な７個の保存されたシステイン残基を含有する。成熟ＧＤＦ１５ペプチドは、第４の鎖内ジスルフィド結合を形成する２つのさらなるシステイン残基をさらに含有する。生物学的に活性なＧＤＦ１５は、１つの鎖間ジスルフィド結合によって共有結合によって連結された成熟ペプチドの２５ＫＤのホモ二量体である。

ＧＤＦ１５循環レベルは、複数の病理学的および生理学的状態、最も著しくは、妊娠（Moore AG 2000. J Clin Endocrinol Metab 85: 4781-4788）、ベータ−サラセミア（Tanno T 2007, Nat Med 13: 1096-101）（Zimmermann MB, 2008 Am J Clin Nutr 88: 1026-31）および先天性赤血球異形成貧血（Tamary H 2008, Blood. 112:5241-4）において上昇すると報告されてきた。ＧＤＦ１５はまた、文献での報告において複数の生物学的活性と結びつけられてきた。ＧＤＦ１５ノックアウトおよびトランスジェニックマウスの研究は、ＧＤＦ１５は、虚血／再灌流−または過負荷−誘発性心臓損傷に対して保護的（Kempf T, 2006, Circ Res.98:351-60）（Xu J, 2006, Circ Res. 98:342-50）、加齢関連運動ニューロンおよび感覚ニューロン喪失に対して保護的（Strelau J, 2009, J Neurosci. 29: 13640-8）、腎臓における代謝性アシドーシスに対して軽度に保護的であり得、がん患者において悪液質を引き起こし得る（Johnen H 2007 Nat Med. 11: 1333-40）ことを示唆した。多数のグループがまた、細胞アポトーシスおよび増殖におけるＧＤＦ１５の役割を研究し、種々の細胞培養物および異種移植片モデルを使用して議論の余地がある結果を報告した。トランスジェニックマウスに関する研究は、ＧＤＦ１５が、腸および肺において発癌物質またはＡｐｃ突然変異誘発性新生物に対して保護的であることを示した（Baek SJ 2006, Gastroenterology. 131: 1553-60; Cekanova M 2009, Cancer Prev Res 2:450-8）。

ヒト成熟ＧＤＦ１５タンパク質のＸ線結晶構造は、ジスルフィド連結された二量体の構造を示す。各ＧＤＦ１５モノマーは、Ｎ末端に見られる相当な相違を有するその他のＴＧＦベータスーパーファミリーシステインノットタンパク質と同様の折りたたみをとる。成熟ＧＤＦ１５タンパク質は、合計９個のシステインを含有し、そのすべては、Ｃｙｓ２７３とジスルフィド結合しており、二量体の界面を越えて鎖間ジスルフィドを形成する。最初の４個のシステインのジスルフィド結合パターンは、ＴＧＦベータおよびＢＭＰファミリーメンバーと比較した場合にＧＤＦ１５に特有である。Ｃｙｓ２０３およびＣｙｓ２１０（成熟タンパク質中の最初の２個のシステイン）は、互いとジスルフィドを形成して、タンパク質から突出する小さいループ構造を作る。

残りのジスルフィドは、ＴＧＦベータファミリーと構造的に同様であるが、Ｃｙｓ２１１−Ｃｙｓ２７４（第３および第７のシステイン）、Ｃｙｓ２４０−Ｃｙｓ３０５（第４および第８のシステイン）およびＣｙｓ２４４−Ｃｙｓ３０７（第５および第９のシステイン）によって形成される。結晶構造は、ヒトＧＤＦ−１５ホモ二量体には、広範なペプチド−ペプチド界面があり、約１３００平方オングストロームの埋没した表面積があり、３７個のアミノ酸が関与していることをさらに示した。

結晶構造は、以下のアミノ酸が、ペプチド−ペプチド界面に関与していることを示す：Ｖａｌ２１６、Ａｓｐ２２２、Ｌｅｕ２２３、Ｔｒｐ２２５、Ｖａｌ２３７、Ｍｅｔ２３９、Ｉｌｅ２４１、Ａｓｎ２５２、Ｍｅｔ２５３、Ｈｉｓ２５４、Ｉｌｅ２５７、Ｌｙｓ２５８、Ｓｅｒ２６０、Ｌｅｕ２６１、Ｌｅｕ２６４、Ｌｙｓ２６５、Ｔｈｒ２６８、Ｖａｌ２６９、Ｐｒｏ２７０、Ｃｙｓ２７３、Ｖａｌ２７５、Ｐｒｏ２７６、Ｔｙｒ２７９、Ｔｙｒ２９７、Ａｓｐ２９９、Ｌｅｕ３００およびＩｌｅ３０８。成熟ペプチドの最後のアミノ酸、Ｉｌｅ３０８は、その二量体パートナーから１０オングストローム未満だけ離れて位置する。このスーパーファミリーには珍しく、電子密度は、タンパク質構造の内部に向いた側鎖と一致し、Ｖａｌ２７５およびＰｒｏ２７６と疎水性ポケットを形成する。その他のファミリーメンバーは、構造の内側に向いたカルボン酸および溶媒に曝露される側鎖を有する（ＴＧＦｂ３（２ＰＪＹ）、ＢＭＰ６（２Ｒ５２）、ＢＭＰ７（１ＬＸ５）、ＧＤＦ５（３ＥＶＳ）、ＧＤＦ２（４ＦＡＯ）を参照のこと）。これは、ＧＤＦ１５は、そのタンパク質の折りたたみを撹乱することなくＣＯＯＨ末端に、より長いペプチド配列を受け入れるその能力において独特であり得ることを示唆する。

一実施形態では、本発明の方法は、本明細書において記載されるようなＧＤＦ１５融合タンパク質、例えば、血清アルブミン融合物を含む。いくつかの実施形態では、前記融合物は、任意の適したＳＡ部分、任意の適したＧＤＦ１５部分および所望の場合、任意の適したリンカーを含有し得る。一般に、ＳＡ部分、ＧＤＦ１５部分および存在すれば、リンカーは、ＮＡＳＨ、ＮＡＦＬＤまたは本明細書において記載されるその他の障害において治療有効性を有すると予測され、それが投与されるべき種と免疫学的に適合すると予測される融合ポリペプチドを提供するように選択される。例えば、融合ポリペプチドが、ヒトに投与されるように意図される場合には、ＳＡ部分は、ＨＳＡまたはその機能的変異体であり得、ＧＤＦ１５部分は、ヒトＧＤＦ１５またはその機能的変異体であり得る。同様に、その他の種（例えば、ペットまたは家畜動物）に由来するＳＡおよびその機能的変異体ならびにＧＤＦ１５およびその機能的変異体が、融合タンパク質がこのような種における使用のために意図される場合には使用され得る。

特定の実施形態では、本発明の方法において使用するためのＧＤＦ１５融合物は、参照によりその全文が本明細書に組み込まれるＰＣＴ国際公開第２０１５／１９８１９９号パンフレットに記載されるＧＤＦ１５融合物（例えば、ＳＡ−ＧＤＦ１５融合物またはＨＳＡ−ＧＤＦ１５融合物）を含まない。

特定の実施形態では、本発明の方法において使用するためのＧＤＦ１５コンジュゲートは、参照によりその全文が本明細書に組み込まれるＰＣＴ国際公開第２０１５／２０００７８号パンフレットに記載されるＧＤＦ１５コンジュゲート（例えば、脂肪酸−ＧＤＦ１５コンジュゲート）を含まない。

ＧＤＦ１５部分
本発明の方法において、例えば、任意のＧＤＦ１５融合タンパク質またはコンジュゲート、例えば、脂肪酸コンジュゲートにおいて使用されるＧＤＦ１５部分は、任意の適したＧＤＦ１５ポリペプチドまたはその機能的変異体、例えば、表１に記載されるＧＤＦ１５変異体であり得る。好ましくは、ＧＤＦ１５部分は、ヒトＧＤＦ１５またはその機能的変異体である。ヒトＧＤＦ１５は、シグナルペプチド（アミノ酸１〜２９）、プロペプチド（アミノ酸３０〜１９６）および１１２個のアミノ酸の成熟ＧＤＦ１５ペプチド（アミノ酸１９７〜３０８（配列番号５））を含む３０８個のアミノ酸のプレプロタンパク質（配列番号１）として合成される。プロペプチドおよび成熟ペプチドは、それぞれ、配列番号２のアミノ酸３０〜１９４および１９５〜３０８として報告されている。（Ｕｎｉｐｒｏｔ配列Ｑ９９９８８を参照のこと）。配列変動が報告されている。例えば、アミノ酸２０２、２６９および２８８（配列番号２中）は、それぞれＡｓｐ、ＧｌｕおよびＡｌａであると報告されている（Hromas R, et al., Biochem. Biophys. Acta 1354:40-44 (1997)、Lawton L.N. et al, Gene 203:17-26 (1997)）。

ヒトＧＤＦ１５部分を含有する本発明の方法において使用される融合タンパク質は、一般に、１１２個のアミノ酸の成熟ＧＤＦ１５ペプチド（例えば、配列番号１、配列番号５のアミノ酸１９７〜３０８）またはその機能的変異体を含有する。機能的変異体は、任意の所望の組合せで１つまたは複数のアミノ酸欠失、付加または置き換えを含み得る、例えば、表１中のＧＤＦ１５変異体。アミノ酸配列変動の量（例えば、アミノ酸欠失、付加または置き換えによる）は、成熟ＧＤＦ１５ペプチドの体重減少活性を保つように制限される。いくつかの実施形態では、成熟ＧＤＦ１５ペプチドの機能的変異体は、配列番号５に対して、任意の所望の組合せで、１〜約２０、１〜約１８、１〜約１７、１〜約１６、１〜約１５、１〜約１４、１〜約１３、１〜約１２、１〜約１１、１〜約１０、１〜約９、１〜約８、１〜約７、１〜約６または１〜約５つのアミノ酸欠失、付加または置き換えを有する。あるいは、またはさらに、機能的変異体は、配列番号５と、好ましくは、配列番号５の全長にわたって測定された場合に、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％または少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％または９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有し得る。具体的な実施形態では、ＧＤＦ１５機能的変異体は、配列番号５と、好ましくは、配列番号５の全長にわたって測定された場合に、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有し得る。

いかなる特定の理論にも捉われることを望むことなく、ＮＡＳＨ、ＮＡＦＬＤおよび関連状態におけるＧＤＦ１５の治療有効性は、ＧＤＦ１５（および本明細書において記載される融合タンパク質および変異体）の、１つまたは複数の受容体および／または可溶性補助因子への結合によって開始される細胞性シグナル伝達によって、または直接競合もしくはアロステリックモジュレーションを介してその他の因子によって利用されるシグナル伝達経路の調節によって媒介されるということであり得る。アミノ酸置換、欠失または付加は、受容体または補助因子結合に関与しない、ペプチド間相互作用による全体的なタンパク質コンホメーションの維持に関与しない位置であることが好ましい。

例えば、位置２１６、２２２、２２３、２２５、２３７、２３９、２４１、２５２、２５３、２５４、２５７、２５８、２６０、２６１、２６４、２６５、２６８、２６９、２７０、２７３、２７５、２７６、２７９、２９７、２９９、３００および３０８のアミノ酸は、ペプチド−ペプチド界面に関与する。具体的な実施形態では、これらの位置での任意のアミノ酸置き換えは、一般に、不利であり、任意の置き換えは、保存的置き換えでなくてはならない。表面に露出しているが、種間で保存されていないアミノ酸は、一般に、ペプチドの折りたたみまたはその体重減少活性を妨害することなく、その他のアミノ酸と置き換えられ得る。本発明者らは、ヒト成熟ＧＤＦ１５ペプチドの結晶構造を決定し、位置２１７、２１９、２２６、２３４、２４３、２４６、２４７、２６３、２６５、２６８、２７７、２８０、２８７、２９０、３０３および３０４のアミノ酸を、その他の種において保存されない表面に露出した残基として同定した。

本発明者らは、ヒト成熟ＧＤＦ１５ペプチドの結晶構造を決定し、位置２１７、２１９、２２６、２３４、２４３、２４６、２４７、２６３、２６５、２６８、２７７、２８０、２８７、２９０、３０３および３０４のアミノ酸を、その他の種において保存されない表面に露出した残基として同定した。さらに、体重減少活性にとって必須ではない、成熟ヒトＧＤＦ１５のアミノ末端（配列番号１のアミノ酸１９７〜２１０）ならびにＣｙｓ２０３、Ｃｙｓ２１０およびＣｙｓ２７３は、一般に、別のアミノ酸と置き換えられ得る、および／または取り除かれ得る。具体的な実施形態では、成熟ヒトＧＤＦ１５の最初の１〜８個のまたは最初の１〜６個のＮ末端アミノ酸は、除去または置換され得る。具体的な実施形態では、成熟ヒトＧＤＦ１５の最初の１〜５個のまたは最初の１〜４個のＮ末端アミノ酸は、除去または置換され得る。具体的な実施形態では、成熟ヒトＧＤＦ１５の最初の２個のまたは最初の３個のＮ末端アミノ酸は、除去または置換され得る。具体的な実施形態では、成熟ヒトＧＤＦ１５の最初の３個または最初の６個のＮ末端アミノ酸は、除去または置換され得る。

融合ポリペプチドにおいて使用するのに適しているヒト成熟ＧＤＦ１５ペプチドの例示的変異体は、位置１〜約２５から１個または複数の残基が置き換えられている、または欠失されている配列番号５を含む。例えば、変異体は、最初の２５個の、最初の１５個の、最初の１４個の、最初の１３個の、最初の１２個の、最初の１１個の、最初の１０個の、最初の９個の、最初の８個の、最初の７個の、最初の６個の、最初の５個の、最初の４個の、最初の３個の、最初の２個の、または最初の１個のアミノ酸が欠失されている配列番号４４の配列を有し得る。

本発明の融合ポリペプチドにおいて使用するのに適しているヒト成熟ＧＤＦ１５ペプチドのさらなる例示的変異体は、位置１９８のＡｒｇ、位置１９９のＡｓｎまたは位置１９８のＡｒｇおよび位置１９９のＡｓｎが、１個または複数のその他のアミノ酸と置き換えられている、配列番号１のアミノ酸１９７〜３０８（配列番号５）を含む。アミノ酸が置き換えられている場合には、保存的アミノ酸置き換えが好ましい。特定の実施形態では、位置１９８のＡｒｇは、Ｈｉｓで置き換えられており、位置１９９のＡｓｎは、ＡｌａまたはＧｌｕで置き換えられている。より特定の実施形態では、位置１９８のＡｒｇは、Ｈｉｓで置き換えられており、位置１９９のＡｓｎは、Ａｌａで置き換えられている。

特定の実施形態では、本発明のコンジュゲートおよび融合ポリペプチドにおいて使用するのに適しているヒト成熟ＧＤＦ１５ペプチドの例示的変異体は、位置１９８のＡｒｇがＨｉｓで置き換えられておらず、位置１９９のＡｓｎがＡｌａで置き換えられていない、配列番号１のアミノ酸１９７〜３０８（配列番号５）を含む。具体的な実施形態では、本発明のコンジュゲートおよび融合ポリペプチドにおいて使用するのに適しているヒト成熟ＧＤＦ１５ペプチドの例示的変異体は、配列番号４１または配列番号３２０または
ＭＨＨＨＨＨＨＡＲＮＧＤＨＣＰＬＧＰＧＲＣＣＲＬＨＴＶＲＡＳＬＥＤＬＧＷＡＤＷＶＬＳＰＲＥＶＱＶＴＭＣＩＧＡＣＰＳＱＦＲＡＡＮＭＨＡＱＩＫＴＳＬＨＲＬＫＰＤＴＶＰＡＰＣＣＶＰＡＳＹＮＰＭＶＬＩＱＫＴＤＴＧＶＳＬＱＴＹＤＤＬＬＡＫＤＣＨＣＩ（Ｍ−（ｈｉｓ）６−ｈＧＤＦ１５）（配列番号３２１）、
または
ＭＨＨＨＨＨＨＭＡＲＮＧＤＨＣＰＬＧＰＧＲＣＣＲＬＨＴＶＲＡＳＬＥＤＬＧＷＡＤＷＶＬＳＰＲＥＶＱＶＴＭＣＩＧＡＣＰＳＱＦＲＡＡＮＭＨＡＱＩＫＴＳＬＨＲＬＫＰＤＴＶＰＡＰＣＣＶＰＡＳＹＮＰＭＶＬＩＱＫＴＤＴＧＶＳＬＱＴＹＤＤＬＬＡＫＤＣＨＣＩ（Ｍ−（ｈｉｓ）６−Ｍ−ｈＧＤＦ１５）（配列番号３２２）
のＧＤＦ１５変異体を含まない。

具体的な実施形態では、本発明の脂肪酸−ＧＤＦ１５コンジュゲートにおいて使用するのに適しているヒト成熟ＧＤＦ１５ペプチドの例示的変異体は、配列番号４１または配列番号３２０または
ＭＨＨＨＨＨＨＡＲＮＧＤＨＣＰＬＧＰＧＲＣＣＲＬＨＴＶＲＡＳＬＥＤＬＧＷＡＤＷＶＬＳＰＲＥＶＱＶＴＭＣＩＧＡＣＰＳＱＦＲＡＡＮＭＨＡＱＩＫＴＳＬＨＲＬＫＰＤＴＶＰＡＰＣＣＶＰＡＳＹＮＰＭＶＬＩＱＫＴＤＴＧＶＳＬＱＴＹＤＤＬＬＡＫＤＣＨＣＩ（Ｍ−（ｈｉｓ）６−ｈＧＤＦ１５）（配列番号３２１）、
または
ＭＨＨＨＨＨＨＭＡＲＮＧＤＨＣＰＬＧＰＧＲＣＣＲＬＨＴＶＲＡＳＬＥＤＬＧＷＡＤＷＶＬＳＰＲＥＶＱＶＴＭＣＩＧＡＣＰＳＱＦＲＡＡＮＭＨＡＱＩＫＴＳＬＨＲＬＫＰＤＴＶＰＡＰＣＣＶＰＡＳＹＮＰＭＶＬＩＱＫＴＤＴＧＶＳＬＱＴＹＤＤＬＬＡＫＤＣＨＣＩ（Ｍ−（ｈｉｓ）６−Ｍ−ｈＧＤＦ１５）（配列番号３２２）
のＧＤＦ１５変異体を含まない。

具体的な実施形態では、本発明のＧＤＦ１５融合ポリペプチド、例えば、ＳＡ−ＧＤＦ１５融合物において使用するのに適しているヒト成熟ＧＤＦ１５ペプチドの例示的変異体は、配列番号４１または配列番号３２０または
ＭＨＨＨＨＨＨＡＲＮＧＤＨＣＰＬＧＰＧＲＣＣＲＬＨＴＶＲＡＳＬＥＤＬＧＷＡＤＷＶＬＳＰＲＥＶＱＶＴＭＣＩＧＡＣＰＳＱＦＲＡＡＮＭＨＡＱＩＫＴＳＬＨＲＬＫＰＤＴＶＰＡＰＣＣＶＰＡＳＹＮＰＭＶＬＩＱＫＴＤＴＧＶＳＬＱＴＹＤＤＬＬＡＫＤＣＨＣＩ（Ｍ−（ｈｉｓ）６−ｈＧＤＦ１５）（配列番号３２１）、
または
ＭＨＨＨＨＨＨＭＡＲＮＧＤＨＣＰＬＧＰＧＲＣＣＲＬＨＴＶＲＡＳＬＥＤＬＧＷＡＤＷＶＬＳＰＲＥＶＱＶＴＭＣＩＧＡＣＰＳＱＦＲＡＡＮＭＨＡＱＩＫＴＳＬＨＲＬＫＰＤＴＶＰＡＰＣＣＶＰＡＳＹＮＰＭＶＬＩＱＫＴＤＴＧＶＳＬＱＴＹＤＤＬＬＡＫＤＣＨＣＩ（Ｍ−（ｈｉｓ）６−Ｍ−ｈＧＤＦ１５）（配列番号３２２）
のＧＤＦ１５変異体を含まない。

特定の実施形態では、本発明のコンジュゲートおよび融合ポリペプチドにおいて使用するのに適しているヒト成熟ＧＤＦ１５ペプチドの変異体は、配列番号５に対して少なくとも９５％同一であり、位置１９８のＡｒｇがＨｉｓで置き換えられておらず、位置１９９のＡｓｎがＡｌａで置き換えられていないか、またはＧＤＦ１５変異体が、配列番号４１もしくは配列番号３２０ではないアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、本発明のコンジュゲートおよび融合ポリペプチドにおいて使用するのに適しているヒト成熟ＧＤＦ１５ペプチドの変異体は、表１に記載されるものを含み、位置１９８のＡｒｇがＨｉｓで置き換えられておらず、位置１９９のＡｓｎがＡｌａで置き換えられていないか、またはＧＤＦ１５変異体が、配列番号４１もしくは配列番号３２０ではない。ある特定の実施形態では、本発明のコンジュゲート（例えば、脂肪酸−ＧＤＦ１５コンジュゲート）および融合ポリペプチド（例えば、ＳＡ−ＧＤＦ１５融合ポリペプチド）において使用するのに適しているヒト成熟ＧＤＦ１５ペプチドの変異体は、表１に記載されるものを含み、ヒト成熟ＧＤＦ１５ペプチドの変異体は、配列番号４１または配列番号３２０またはＭＨＨＨＨＨＨＡＲＮＧＤＨＣＰＬＧＰＧＲＣＣＲＬＨＴＶＲＡＳＬＥＤＬＧＷＡＤＷＶＬＳＰＲＥＶＱＶＴＭＣＩＧＡＣＰＳＱＦＲＡＡＮＭＨＡＱＩＫＴＳＬＨＲＬＫＰＤＴＶＰＡＰＣＣＶＰＡＳＹＮＰＭＶＬＩＱＫＴＤＴＧＶＳＬＱＴＹＤＤＬＬＡＫＤＣＨＣＩ（Ｍ−（ｈｉｓ）６−ｈＧＤＦ１５）（配列番号３２１）、
または
ＭＨＨＨＨＨＨＭＡＲＮＧＤＨＣＰＬＧＰＧＲＣＣＲＬＨＴＶＲＡＳＬＥＤＬＧＷＡＤＷＶＬＳＰＲＥＶＱＶＴＭＣＩＧＡＣＰＳＱＦＲＡＡＮＭＨＡＱＩＫＴＳＬＨＲＬＫＰＤＴＶＰＡＰＣＣＶＰＡＳＹＮＰＭＶＬＩＱＫＴＤＴＧＶＳＬＱＴＹＤＤＬＬＡＫＤＣＨＣＩ（Ｍ−（ｈｉｓ）６−Ｍ−ｈＧＤＦ１５）（配列番号３２２）
のＧＤＦ１５変異体を含まない。

特定の実施形態では、本発明のコンジュゲートおよび融合ポリペプチドにおいて使用するのに適しているヒト成熟ＧＤＦ１５ペプチドの変異体は、参照によりその全文が本明細書に組み込まれるＰＣＴ国際公開第２０１５／１９８１９９号パンフレットに記載されるＧＤＦ１５変異体、例えば、本明細書において提供される配列番号２０、２６、２８、３０、３２、３８、４０および４２を含まない。特定の実施形態では、本発明のコンジュゲートおよび融合ポリペプチドにおいて使用するのに適しているヒト成熟ＧＤＦ１５ペプチドの変異体は、１個または複数の表面に露出した残基（例えば、Ａｒｇ２１７、Ｓｅｒ２１９、Ａｌａ２２６、Ｇｌｕ２３４、Ａｌａ２４３、Ｓｅｒ２４６、Ｇｌｎ２４７、Ａｒｇ２６３、Ｌｙｓ２６５、Ｔｈｒ２６８、Ａ３ａ２７７、Ａｓｎ２８０、Ｌｙｓ２８７、Ｔｈｒ２９０、Ｌｙｓ３０３およびＡｓｐ３Ｇ４）、１個または複数のＮ末端アミノ酸（アミノ酸１９７〜２１０）、Ｃｙｓ２０３、Ｃｙｓ２１０および／またはＣｙｓ２７３のアミノ酸置き換えまたは欠失を含むＧＤＦ１５変異体を含まない。特定の実施形態では、本発明の、融合ポリペプチド、例えば、アルブミン−ＧＤＦ１５融合物（例えば、ＨＳＡ−ＧＤＦ１５融合物）において使用するのに適しているヒト成熟ＧＤＦ１５ペプチドの変異体は、１個または複数の表面に露出した残基（例えば、Ａｒｇ２１７、Ｓｅｒ２１９、Ａｌａ２２６、Ｇｌｕ２３４、Ａｌａ２４３、Ｓｅｒ２４６、Ｇｌｎ２４７、Ａｒｇ２６３、Ｌｙｓ２６５、Ｔｈｒ２６８、Ａ３ａ２７７、Ａｓｎ２８０、Ｌｙｓ２８７、Ｔｈｒ２９０、Ｌｙｓ３０３およびＡｓｐ３Ｇ４）、１個または複数のＮ末端アミノ酸（アミノ酸１９７〜２１０）、Ｃｙｓ２０３、Ｃｙｓ２１０および／またはＣｙｓ２７３のアミノ酸置き換えまたは欠失を含むＧＤＦ１５変異体を含まない。

特定の実施形態では、本発明のコンジュゲート（例えば、脂肪酸−ＧＤＦ１５コンジュゲート）および融合ポリペプチド（例えば、ＳＡ−ＧＤＦ１５融合ポリペプチド、例えば、ＨＳＡ−ＧＤＦ１５融合ポリペプチド）において使用するのに適しているヒト成熟ＧＤＦ１５ペプチドの変異体は、以下のＧＤＦ１５変異体を含まない：
（ｉ）Ｈｉｓ６−ｈＧＤＦ１５（１９７〜３０８）：ＨＨＨＨＨＨＡＲＮＧＤＨＣＰＬＧＰＧＲＣＣＲＬＨＴＶＲＡＳＬＥＤＬＧＷＡＤＷＶＬＳＰＲＥＶＱＶＴＭＣＩＧＡＣＰＳＱＦＲＡＡＮＭＨＡＱＩＫＴＳＬＨＲＬＫＰＤＴＶＰＡＰＣＣＶＰＡＳＹＮＰＭＶＬＩＱＫＴＤＴＧＶＳＬＱＴＹＤＤＬＬＡＫＤＣＨＣＩ（配列番号６）；
（ｉｉ）Ｈｉｓ８−ＴＥＶ−ｈＧＤＦ１５（１９７〜３０８）：ＨＨＨＨＨＨＨＨＧＧＳＥＮＬＹＦＱＧＡＲＮＧＤＨＣＰＬＧＰＧＲＣＣＲＬＨＴＶＲＡＳＬＥＤＬＧＷＡＤＷＶＬＳＰＲＥＶＱＶＴＭＣＩＧＡＣＰＳＱＦＲＡＡＮＭＨＡＱＩＫＴＳＬＨＲＬＫＰＤＴＶＰＡＰＣＣＶＰＡＳＹＮＰＭＶＬＩＱＫＴＤＴＧＶＳＬＱＴＹＤＤＬＬＡＫＤＣＨＣＩ（配列番号７）；および
（ｉｉｉ）ｈＧＤＦ１５（１９７〜３０８）：ＡＲＮＧＤＨＣＰＬＧＰＧＲＣＣＲＬＨＴＶＲＡＳＬＥＤＬＧＷＡＤＷＶＬＳＰＲＥＶＱＶＴＭＣＩＧＡＣＰＳＱＦＲＡＡＮＭＨＡＱＩＫＴＳＬＨＲＬＫＰＤＴＶＰＡＰＣＣＶＰＡＳＹＮＰＭＶＬＩＱＫＴＤＴＧＶＳＬＱＴＹＤＤＬＬＡＫＤＣＨＣＩ（配列番号５）。

成熟ヒトＧＤＦ１５は、９個のシステイン残基を含み、そのうち８個は、ＴＧＦベータスーパーファミリーメンバーの中で特有であるパターンで鎖内ジスルフィド結合を形成する。一実施形態では、Ｃｙｓ２０３、２１０および２７３は、その他のアミノ酸で置き換えられ得る、または所望の場合取り除かれ得る。

血清アルブミン（ＳＡ）部分
ＳＡ部分は、任意の適した血清アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）または別の種に由来する血清アルブミン）またはその機能的変異体である。好ましくは、ＳＡ部分は、ＨＳＡまたはその機能的変異体である。ＳＡ部分は、野生型ＧＤＦ１５と比較して、それが付加される融合ポリペプチドの血清半減期を延ばす。薬物動態解析および血清半減期の決定のための方法は、当業者は精通しているであろう。詳細は、Kenneth, A et al: Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for PharmacistsおよびPeters et al, Pharmacokinetc analysis: A Practical Approach (1996)に見出すことができる。ｔアルファおよびｔベータ半減期および曲線下面積（ＡＵＣ）などの薬物動態パラメータを説明する、「Pharmacokinetics」, M Gibaldi & D Perron, published by Marcel Dekker, 2^nd Rev. ex edition (1982)も参照される。

ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）は、約６６，５００ＫＤａの血漿タンパク質であり、５８５個のアミノ酸から構成され、少なくとも１７のジスルフィド橋を含む。（Peters, T., Jr. (1996), All about Albumin: Biochemistry, Genetics and Medical, Applications, pp10, Academic Press, Inc., Orlando (ISBN 0-12-552110-3）。ＨＳＡは、長い半減期を有し、肝臓によって極めて遅く排除される。ＨＳＡの血漿半減期は、およそ１９日であると報告されている（Peters, T., Jr. (1985) Adv. Protein Chem. 37, 161-245; Peters, T., Jr. (1996) All about Albumin, Academic Press, Inc., San Diego, CA. (page 245-246)）；Benotti P, Blackburn GL: Crit Care Med (1979) 7:520-525）。

ＨＳＡは、改善された有効期間および半減期を有する融合タンパク質を生成するために使用されてきた。例えば、ＰＣＴ国際公開第０１／７９２７１号パンフレットおよび国際公開第０３／５９９３４号パンフレットには、（ｉ）さまざまな治療用タンパク質（例えば、増殖因子、ｓｃＦｖ）を含むアルブミン融合タンパク質および（ｉｉ）その治療用タンパク質単独よりも長い有効期間および半減期を有すると報告されているＨＳＡが開示されている。

ＨＳＡは、５８５個のアミノ酸の成熟した天然に存在するＨＳＡ（シグナルおよびプロペプチドのプロセシングおよび除去後に（配列番号４））の全長配列または対立遺伝子変異体を含むその天然に存在する変異体を含み得る。天然に存在するＨＳＡおよびその変異体は、当技術分野で周知である（例えば、Meloun, et al., FEBS Letters 58:136 (1975); Behrens, et al., Fed. Proc. 34:591 (1975); Lawn, et al., Nucleic Acids Research 9:6102-6114 (1981); Minghetti, et al., J. Biol. Chem. 261:6747 (1986)）；およびWeitkamp, et al., Ann. Hum. Genet. 37:219 (1973)を参照のこと）。

ヒト血清アルブミン部分を含有する融合タンパク質は、一般に、５８５個のアミノ酸のＨＳＡ（配列番号３のアミノ酸２５〜６０９、配列番号４）またはその機能的変異体を含有する。機能的変異体は、任意の所望の組合せで１個または複数のアミノ酸欠失、付加または置き換えを含み得、ＨＳＡの機能的断片を含む。アミノ酸配列変動（例えば、アミノ酸欠失、付加または置き換えによる）の量は、ＨＳＡの血清半減期を延長する特性を保つように制限される。

いくつかの実施形態では、本明細書において開示される融合タンパク質において使用するためのＨＳＡの機能的変異体は、配列番号４と、好ましくは、配列番号４の全長配列にわたって測定された場合に、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％または少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有し得る。あるいは、またはさらに、ＨＳＡの機能的変異体は、１〜約２０、１〜約１８、１〜約１７、１〜約１６、１〜約１５、１〜約１４、１〜約１３、１〜約１２、１〜約１１、１〜約１０、１〜約９、１〜約８、１〜約７、１〜約６、または１〜約５つのアミノ酸欠失、付加または置き換えを任意の所望の組合せで有し得る。具体的な実施形態では、本明細書において開示される融合タンパク質において使用するためのＨＳＡの機能的変異体は、Ｃ３４Ａ突然変異を含む。

本明細書において開示される融合タンパク質において使用するためのＨＳＡの一部の機能的変異体は、少なくとも１００個のアミノ酸長、または少なくとも１５０個のアミノ酸長であり得、ＨＳＡのドメインのすべてまたは一部、例えば、ドメインＩ（配列番号４のアミノ酸１〜１９４）、ＩＩ（配列番号４のアミノ酸１９５〜３８７）またはＩＩＩ（配列番号４のアミノ酸３８８〜５８５）を含有する、またはからなり得る。所望の場合、ＨＳＡの機能的変異体は、任意の所望のＨＳＡドメインの組合せ、例えば、ドメインＩ＋ＩＩ（配列番号４のアミノ酸１〜３８７）、ドメインＩＩ＋ＩＩＩ（配列番号４のアミノ酸１９５〜５８５）またはドメインＩ＋ＩＩＩ（配列番号４のアミノ酸１〜１９４＋配列番号４のアミノ酸３８８〜５８５）からなり得る、あるいは、含み得る。当技術分野で周知のように、ＨＳＡの各ドメインは、２つの相同サブドメイン、すなわち、それぞれ、ドメインＩ、ＩＩおよびＩＩＩのアミノ酸１〜１０５および１２０〜１９４、１９５〜２９１および３１６〜３８７ならびに３８８〜４９１および５１２〜５８５で構成されており、可動性サブドメイン間のリンカー領域は、残基Ｌｙｓ１０６〜Ｇｌｕ１１９、Ｇｌｕ２９２〜Ｖａｌ３１５およびＧｌｕ４９２〜Ａｌａ５１１を含む。ある特定の実施形態では、本発明の融合物タンパク質のＳＡ部分は、ＨＳＡの少なくとも１つのサブドメインまたはドメインを含有する。

本明細書において開示される融合タンパク質において使用するのに適したＨＳＡの機能的断片は、少なくとも約５個以上のＨＳＡの連続アミノ酸、好ましくは、少なくとも約１０個、少なくとも約１５個、少なくとも約２０個、少なくとも約２５個、少なくとも約３０個、少なくとも約５０個またはそれを超えるＨＳＡ配列の連続アミノ酸を含有するか、ＨＳＡの特定のドメインの一部またはすべてを含み得る。

いくつかの実施形態では、本明細書において開示される融合タンパク質において使用するためのＨＳＡの機能的変異体（例えば、断片）は、Ｎ末端欠失、Ｃ末端欠失またはＮ末端およびＣ末端欠失の組合せを含む。このような変異体は、機能的変異体の配列中の最初および最後のアミノ酸のアミノ酸番号を使用して言及されることが好都合である。例えば、Ｃ末端切断を有する機能的変異体は、ＨＳＡ（配列番号４）のアミノ酸１〜３８７であり得る。

本明細書において記載されるＧＤＦ１５融合ポリペプチドにおいて使用するのに適しているＨＳＡおよびＨＳＡ変異体（断片を含む）の例は、当技術分野で公知である。適したＨＳＡおよびＨＳＡ変異体として、例えば、全長成熟ＨＳＡ（配列番号４）および断片、例えば、成熟ＨＳＡのアミノ酸１〜３８７、アミノ酸５４〜６１、アミノ酸７６〜８９、アミノ酸９２〜ｌ００、アミノ酸１７０〜１７６、アミノ酸２４７〜２５２、アミノ酸２６６〜２７７、アミノ酸２８０〜２８８、アミノ酸３６２〜３６８、アミノ酸４３９〜４４７、アミノ酸４６２〜４７５、アミノ酸４７８〜４８６およびアミノ酸５６０〜５６６が挙げられる。このようなＨＳＡポリペプチドおよび機能的変異体は、参照によりその全文が本明細書に組み込まれるＰＣＴ国際公開第２００５／０７７０４２号パンフレットに開示されている。ＨＳＡのアミノ酸１〜３７３、１〜３８８、１〜３８９、１〜３６９、１〜４１９およびアミノ酸１からアミノ酸３６９〜４１９を含有する断片などのＨＳＡのさらなる変異体は、欧州特許出願公開第３２２０９４号明細書に開示されており、１〜１７７、１〜２００およびアミノ酸１からアミノ酸１７８〜１９９を含有する断片は、欧州特許出願公開第３９９６６６号明細書に開示されている。

特定の実施形態では、本発明の使用に適しているＨＳＡ−ＧＤＦ１５融合ポリペプチドは、以下の融合物を含まない：
（ｉ）ＨＳＡ（２５〜６０９）、Ｃ３４Ｓ、Ｎ５０３Ｑ−ｈＧＤＦ１５（２１１〜３０８）：ＤＡＨＫＳＥＶＡＨＲＦＫＤＬＧＥＥＮＦＫＡＬＶＬＩＡＦＡＱＹＬＱＱＳＰＦＥＤＨＶＫＬＶＮＥＶＴＥＦＡＫＴＣＶＡＤＥＳＡＥＮＣＤＫＳＬＨＴＬＦＧＤＫＬＣＴＶＡＴＬＲＥＴＹＧＥＭＡＤＣＣＡＫＱＥＰＥＲＮＥＣＦＬＱＨＫＤＤＮＰＮＬＰＲＬＶＲＰＥＶＤＶＭＣＴＡＦＨＤＮＥＥＴＦＬＫＫＹＬＹＥＩＡＲＲＨＰＹＦＹＡＰＥＬＬＦＦＡＫＲＹＫＡＡＦＴＥＣＣＱＡＡＤＫＡＡＣＬＬＰＫＬＤＥＬＲＤＥＧＫＡＳＳＡＫＱＲＬＫＣＡＳＬＱＫＦＧＥＲＡＦＫＡＷＡＶＡＲＬＳＱＲＦＰＫＡＥＦＡＥＶＳＫＬＶＴＤＬＴＫＶＨＴＥＣＣＨＧＤＬＬＥＣＡＤＤＲＡＤＬＡＫＹＩＣＥＮＱＤＳＩＳＳＫＬＫＥＣＣＥＫＰＬＬＥＫＳＨＣＩＡＥＶＥＮＤＥＭＰＡＤＬＰＳＬＡＡＤＦＶＥＳＫＤＶＣＫＮＹＡＥＡＫＤＶＦＬＧＭＦＬＹＥＹＡＲＲＨＰＤＹＳＶＶＬＬＬＲＬＡＫＴＹＥＴＴＬＥＫＣＣＡＡＡＤＰＨＥＣＹＡＫＶＦＤＥＦＫＰＬＶＥＥＰＱＮＬＩＫＱＮＣＥＬＦＥＱＬＧＥＹＫＦＱＮＡＬＬＶＲＹＴＫＫＶＰＱＶＳＴＰＴＬＶＥＶＳＲＮＬＧＫＶＧＳＫＣＣＫＨＰＥＡＫＲＭＰＣＡＥＤＹＬＳＶＶＬＮＱＬＣＶＬＨＥＫＴＰＶＳＤＲＶＴＫＣＣＴＥＳＬＶＮＲＲＰＣＦＳＡＬＥＶＤＥＴＹＶＰＫＥＦＱＡＥＴＦＴＦＨＡＤＩＣＴＬＳＥＫＥＲＱＩＫＫＱＴＡＬＶＥＬＶＫＨＫＰＫＡＴＫＥＱＬＫＡＶＭＤＤＦＡＡＦＶＥＫＣＣＫＡＤＤＫＥＴＣＦＡＥＥＧＫＫＬＶＡＡＳＱＡＡＬＧＬＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＣＲＬＨＴＶＲＡＳＬＥＤＬＧＷＡＤＷＶＬＳＰＲＥＶＱＶＴＭＣＩＧＡＣＰＳＱＦＲＡＡＮＭＨＡＱＩＫＴＳＬＨＲＬＫＰＤＴＶＰＡＰＣＣＶＰＡＳＹＮＰＭＶＬＩＱＫＴＤＴＧＶＳＬＱＴＹＤＤＬＬＡＫＤＣＨＣＩ（配列番号３２７）；
（ｉｉ）ＨＳＡ−３ｘ４ＧＳ−ｈＧＤＦ１５（１９７〜３０８）：ＤＡＨＫＳＥＶＡＨＲＦＫＤＬＧＥＥＮＦＫＡＬＶＬＩＡＦＡＱＹＬＱＱＣＰＦＥＤＨＶＫＬＶＮＥＶＴＥＦＡＫＴＣＶＡＤＥＳＡＥＮＣＤＫＳＬＨＴＬＦＧＤＫＬＣＴＶＡＴＬＲＥＴＹＧＥＭＡＤＣＣＡＫＱＥＰＥＲＮＥＣＦＬＱＨＫＤＤＮＰＮＬＰＲＬＶＲＰＥＶＤＶＭＣＴＡＦＨＤＮＥＥＴＦＬＫＫＹＬＹＥＩＡＲＲＨＰＹＦＹＡＰＥＬＬＦＦＡＫＲＹＫＡＡＦＴＥＣＣＱＡＡＤＫＡＡＣＬＬＰＫＬＤＥＬＲＤＥＧＫＡＳＳＡＫＱＲＬＫＣＡＳＬＱＫＦＧＥＲＡＦＫＡＷＡＶＡＲＬＳＱＲＦＰＫＡＥＦＡＥＶＳＫＬＶＴＤＬＴＫＶＨＴＥＣＣＨＧＤＬＬＥＣＡＤＤＲＡＤＬＡＫＹＩＣＥＮＱＤＳＩＳＳＫＬＫＥＣＣＥＫＰＬＬＥＫＳＨＣＩＡＥＶＥＮＤＥＭＰＡＤＬＰＳＬＡＡＤＦＶＥＳＫＤＶＣＫＮＹＡＥＡＫＤＶＦＬＧＭＦＬＹＥＹＡＲＲＨＰＤＹＳＶＶＬＬＬＲＬＡＫＴＹＥＴＴＬＥＫＣＣＡＡＡＤＰＨＥＣＹＡＫＶＦＤＥＦＫＰＬＶＥＥＰＱＮＬＩＫＱＮＣＥＬＦＥＱＬＧＥＹＫＦＱＮＡＬＬＶＲＹＴＫＫＶＰＱＶＳＴＰＴＬＶＥＶＳＲＮＬＧＫＶＧＳＫＣＣＫＨＰＥＡＫＲＭＰＣＡＥＤＹＬＳＶＶＬＮＱＬＣＶＬＨＥＫＴＰＶＳＤＲＶＴＫＣＣＴＥＳＬＶＮＲＲＰＣＦＳＡＬＥＶＤＥＴＹＶＰＫＥＦＮＡＥＴＦＴＦＨＡＤＩＣＴＬＳＥＫＥＲＱＩＫＫＱＴＡＬＶＥＬＶＫＨＫＰＫＡＴＫＥＱＬＫＡＶＭＤＤＦＡＡＦＶＥＫＣＣＫＡＤＤＫＥＴＣＦＡＥＥＧＫＫＬＶＡＡＳＱＡＡＬＧＬＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＲＮＧＤＨＣＰＬＧＰＧＲＣＣＲＬＨＴＶＲＡＳＬＥＤＬＧＷＡＤＷＶＬＳＰＲＥＶＱＶＴＭＣＩＧＡＣＰＳＱＦＲＡＡＮＭＨＡＱＩＫＴＳＬＨＲＬＫＰＤＴＶＰＡＰＣＣＶＰＡＳＹＮＰＭＶＬＩＱＫＴＤＴＧＶＳＬＱＴＹＤＤＬＬＡＫＤＣＨＣＩ（配列番号３２８）；
（ｉｉｉ）ＨＳＡ−ＧＧＧＧＳ−ｈＧＤＦ１５（１９７〜３０８）：ＤＡＨＫＳＥＶＡＨＲＦＫＤＬＧＥＥＮＦＫＡＬＶＬＩＡＦＡＱＹＬＱＱＣＰＦＥＤＨＶＫＬＶＮＥＶＴＥＦＡＫＴＣＶＡＤＥＳＡＥＮＣＤＫＳＬＨＴＬＦＧＤＫＬＣＴＶＡＴＬＲＥＴＹＧＥＭＡＤＣＣＡＫＱＥＰＥＲＮＥＣＦＬＱＨＫＤＤＮＰＮＬＰＲＬＶＲＰＥＶＤＶＭＣＴＡＦＨＤＮＥＥＴＦＬＫＫＹＬＹＥＩＡＲＲＨＰＹＦＹＡＰＥＬＬＦＦＡＫＲＹＫＡＡＦＴＥＣＣＱＡＡＤＫＡＡＣＬＬＰＫＬＤＥＬＲＤＥＧＫＡＳＳＡＫＱＲＬＫＣＡＳＬＱＫＦＧＥＲＡＦＫＡＷＡＶＡＲＬＳＱＲＦＰＫＡＥＦＡＥＶＳＫＬＶＴＤＬＴＫＶＨＴＥＣＣＨＧＤＬＬＥＣＡＤＤＲＡＤＬＡＫＹＩＣＥＮＱＤＳＩＳＳＫＬＫＥＣＣＥＫＰＬＬＥＫＳＨＣＩＡＥＶＥＮＤＥＭＰＡＤＬＰＳＬＡＡＤＦＶＥＳＫＤＶＣＫＮＹＡＥＡＫＤＶＦＬＧＭＦＬＹＥＹＡＲＲＨＰＤＹＳＶＶＬＬＬＲＬＡＫＴＹＥＴＴＬＥＫＣＣＡＡＡＤＰＨＥＣＹＡＫＶＦＤＥＦＫＰＬＶＥＥＰＱＮＬＩＫＱＮＣＥＬＦＥＱＬＧＥＹＫＦＱＮＡＬＬＶＲＹＴＫＫＶＰＱＶＳＴＰＴＬＶＥＶＳＲＮＬＧＫＶＧＳＫＣＣＫＨＰＥＡＫＲＭＰＣＡＥＤＹＬＳＶＶＬＮＱＬＣＶＬＨＥＫＴＰＶＳＤＲＶＴＫＣＣＴＥＳＬＶＮＲＲＰＣＦＳＡＬＥＶＤＥＴＹＶＰＫＥＦＮＡＥＴＦＴＦＨＡＤＩＣＴＬＳＥＫＥＲＱＩＫＫＱＴＡＬＶＥＬＶＫＨＫＰＫＡＴＫＥＱＬＫＡＶＭＤＤＦＡＡＦＶＥＫＣＣＫＡＤＤＫＥＴＣＦＡＥＥＧＫＫＬＶＡＡＳＱＡＡＬＧＬＧＧＧＧＳＡＲＮＧＤＨＣＰＬＧＰＧＲＣＣＲＬＨＴＶＲＡＳＬＥＤＬＧＷＡＤＷＶＬＳＰＲＥＶＱＶＴＭＣＩＧＡＣＰＳＱＦＲＡＡＮＭＨＡＱＩＫＴＳＬＨＲＬＫＰＤＴＶＰＡＰＣＣＶＰＡＳＹＮＰＭＶＬＩＱＫＴＤＴＧＶＳＬＱＴＹＤＤＬＬＡＫＤＣＨＣＩ（配列番号３２９）；
（ｉｖ）ＨＳＡ−ＧＰＰＧＳ−ｈＧＤＦ１５（１９７〜３０８）：ＤＡＨＫＳＥＶＡＨＲＦＫＤＬＧＥＥＮＦＫＡＬＶＬＩＡＦＡＱＹＬＱＱＣＰＦＥＤＨＶＫＬＶＮＥＶＴＥＦＡＫＴＣＶＡＤＥＳＡＥＮＣＤＫＳＬＨＴＬＦＧＤＫＬＣＴＶＡＴＬＲＥＴＹＧＥＭＡＤＣＣＡＫＱＥＰＥＲＮＥＣＦＬＱＨＫＤＤＮＰＮＬＰＲＬＶＲＰＥＶＤＶＭＣＴＡＦＨＤＮＥＥＴＦＬＫＫＹＬＹＥＩＡＲＲＨＰＹＦＹＡＰＥＬＬＦＦＡＫＲＹＫＡＡＦＴＥＣＣＱＡＡＤＫＡＡＣＬＬＰＫＬＤＥＬＲＤＥＧＫＡＳＳＡＫＱＲＬＫＣＡＳＬＱＫＦＧＥＲＡＦＫＡＷＡＶＡＲＬＳＱＲＦＰＫＡＥＦＡＥＶＳＫＬＶＴＤＬＴＫＶＨＴＥＣＣＨＧＤＬＬＥＣＡＤＤＲＡＤＬＡＫＹＩＣＥＮＱＤＳＩＳＳＫＬＫＥＣＣＥＫＰＬＬＥＫＳＨＣＩＡＥＶＥＮＤＥＭＰＡＤＬＰＳＬＡＡＤＦＶＥＳＫＤＶＣＫＮＹＡＥＡＫＤＶＦＬＧＭＦＬＹＥＹＡＲＲＨＰＤＹＳＶＶＬＬＬＲＬＡＫＴＹＥＴＴＬＥＫＣＣＡＡＡＤＰＨＥＣＹＡＫＶＦＤＥＦＫＰＬＶＥＥＰＱＮＬＩＫＱＮＣＥＬＦＥＱＬＧＥＹＫＦＱＮＡＬＬＶＲＹＴＫＫＶＰＱＶＳＴＰＴＬＶＥＶＳＲＮＬＧＫＶＧＳＫＣＣＫＨＰＥＡＫＲＭＰＣＡＥＤＹＬＳＶＶＬＮＱＬＣＶＬＨＥＫＴＰＶＳＤＲＶＴＫＣＣＴＥＳＬＶＮＲＲＰＣＦＳＡＬＥＶＤＥＴＹＶＰＫＥＦＮＡＥＴＦＴＦＨＡＤＩＣＴＬＳＥＫＥＲＱＩＫＫＱＴＡＬＶＥＬＶＫＨＫＰＫＡＴＫＥＱＬＫＡＶＭＤＤＦＡＡＦＶＥＫＣＣＫＡＤＤＫＥＴＣＦＡＥＥＧＫＫＬＶＡＡＳＱＡＡＬＧＬＧＰＰＧＳＡＲＮＧＤＨＣＰＬＧＰＧＲＣＣＲＬＨＴＶＲＡＳＬＥＤＬＧＷＡＤＷＶＬＳＰＲＥＶＱＶＴＭＣＩＧＡＣＰＳＱＦＲＡＡＮＭＨＡＱＩＫＴＳＬＨＲＬＫＰＤＴＶＰＡＰＣＣＶＰＡＳＹＮＰＭＶＬＩＱＫＴＤＴＧＶＳＬＱＴＹＤＤＬＬＡＫＤＣＨＣＩ（配列番号３３０）；
（ｖ）ＨＳＡ−ｈＧＤＦ１５（１９７〜３０８）（リンカーなし）：ＤＡＨＫＳＥＶＡＨＲＦＫＤＬＧＥＥＮＦＫＡＬＶＬＩＡＦＡＱＹＬＱＱＣＰＦＥＤＨＶＫＬＶＮＥＶＴＥＦＡＫＴＣＶＡＤＥＳＡＥＮＣＤＫＳＬＨＴＬＦＧＤＫＬＣＴＶＡＴＬＲＥＴＹＧＥＭＡＤＣＣＡＫＱＥＰＥＲＮＥＣＦＬＱＨＫＤＤＮＰＮＬＰＲＬＶＲＰＥＶＤＶＭＣＴＡＦＨＤＮＥＥＴＦＬＫＫＹＬＹＥＩＡＲＲＨＰＹＦＹＡＰＥＬＬＦＦＡＫＲＹＫＡＡＦＴＥＣＣＱＡＡＤＫＡＡＣＬＬＰＫＬＤＥＬＲＤＥＧＫＡＳＳＡＫＱＲＬＫＣＡＳＬＱＫＦＧＥＲＡＦＫＡＷＡＶＡＲＬＳＱＲＦＰＫＡＥＦＡＥＶＳＫＬＶＴＤＬＴＫＶＨＴＥＣＣＨＧＤＬＬＥＣＡＤＤＲＡＤＬＡＫＹＩＣＥＮＱＤＳＩＳＳＫＬＫＥＣＣＥＫＰＬＬＥＫＳＨＣＩＡＥＶＥＮＤＥＭＰＡＤＬＰＳＬＡＡＤＦＶＥＳＫＤＶＣＫＮＹＡＥＡＫＤＶＦＬＧＭＦＬＹＥＹＡＲＲＨＰＤＹＳＶＶＬＬＬＲＬＡＫＴＹＥＴＴＬＥＫＣＣＡＡＡＤＰＨＥＣＹＡＫＶＦＤＥＦＫＰＬＶＥＥＰＱＮＬＩＫＱＮＣＥＬＦＥＱＬＧＥＹＫＦＱＮＡＬＬＶＲＹＴＫＫＶＰＱＶＳＴＰＴＬＶＥＶＳＲＮＬＧＫＶＧＳＫＣＣＫＨＰＥＡＫＲＭＰＣＡＥＤＹＬＳＶＶＬＮＱＬＣＶＬＨＥＫＴＰＶＳＤＲＶＴＫＣＣＴＥＳＬＶＮＲＲＰＣＦＳＡＬＥＶＤＥＴＹＶＰＫＥＦＮＡＥＴＦＴＦＨＡＤＩＣＴＬＳＥＫＥＲＱＩＫＫＱＴＡＬＶＥＬＶＫＨＫＰＫＡＴＫＥＱＬＫＡＶＭＤＤＦＡＡＦＶＥＫＣＣＫＡＤＤＫＥＴＣＦＡＥＥＧＫＫＬＶＡＡＳＱＡＡＬＧＬＡＲＮＧＤＨＣＰＬＧＰＧＲＣＣＲＬＨＴＶＲＡＳＬＥＤＬＧＷＡＤＷＶＬＳＰＲＥＶＱＶＴＭＣＩＧＡＣＰＳＱＦＲＡＡＮＭＨＡＱＩＫＴＳＬＨＲＬＫＰＤＴＶＰＡＰＣＣＶＰＡＳＹＮＰＭＶＬＩＱＫＴＤＴＧＶＳＬＱＴＹＤＤＬＬＡＫＤＣＨＣＩ（配列番号３３１）；
（ｖｉ）ＨＳＡ−ｈＧＤＦ１５（１９７〜３０８）、Ｒ１９８Ｈ：ＤＡＨＫＳＥＶＡＨＲＦＫＤＬＧＥＥＮＦＫＡＬＶＬＩＡＦＡＱＹＬＱＱＣＰＦＥＤＨＶＫＬＶＮＥＶＴＥＦＡＫＴＣＶＡＤＥＳＡＥＮＣＤＫＳＬＨＴＬＦＧＤＫＬＣＴＶＡＴＬＲＥＴＹＧＥＭＡＤＣＣＡＫＱＥＰＥＲＮＥＣＦＬＱＨＫＤＤＮＰＮＬＰＲＬＶＲＰＥＶＤＶＭＣＴＡＦＨＤＮＥＥＴＦＬＫＫＹＬＹＥＩＡＲＲＨＰＹＦＹＡＰＥＬＬＦＦＡＫＲＹＫＡＡＦＴＥＣＣＱＡＡＤＫＡＡＣＬＬＰＫＬＤＥＬＲＤＥＧＫＡＳＳＡＫＱＲＬＫＣＡＳＬＱＫＦＧＥＲＡＦＫＡＷＡＶＡＲＬＳＱＲＦＰＫＡＥＦＡＥＶＳＫＬＶＴＤＬＴＫＶＨＴＥＣＣＨＧＤＬＬＥＣＡＤＤＲＡＤＬＡＫＹＩＣＥＮＱＤＳＩＳＳＫＬＫＥＣＣＥＫＰＬＬＥＫＳＨＣＩＡＥＶＥＮＤＥＭＰＡＤＬＰＳＬＡＡＤＦＶＥＳＫＤＶＣＫＮＹＡＥＡＫＤＶＦＬＧＭＦＬＹＥＹＡＲＲＨＰＤＹＳＶＶＬＬＬＲＬＡＫＴＹＥＴＴＬＥＫＣＣＡＡＡＤＰＨＥＣＹＡＫＶＦＤＥＦＫＰＬＶＥＥＰＱＮＬＩＫＱＮＣＥＬＦＥＱＬＧＥＹＫＦＱＮＡＬＬＶＲＹＴＫＫＶＰＱＶＳＴＰＴＬＶＥＶＳＲＮＬＧＫＶＧＳＫＣＣＫＨＰＥＡＫＲＭＰＣＡＥＤＹＬＳＶＶＬＮＱＬＣＶＬＨＥＫＴＰＶＳＤＲＶＴＫＣＣＴＥＳＬＶＮＲＲＰＣＦＳＡＬＥＶＤＥＴＹＶＰＫＥＦＮＡＥＴＦＴＦＨＡＤＩＣＴＬＳＥＫＥＲＱＩＫＫＱＴＡＬＶＥＬＶＫＨＫＰＫＡＴＫＥＱＬＫＡＶＭＤＤＦＡＡＦＶＥＫＣＣＫＡＤＤＫＥＴＣＦＡＥＥＧＫＫＬＶＡＡＳＱＡＡＬＧＬＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＨＮＧＤＨＣＰＬＧＰＧＲＣＣＲＬＨＴＶＲＡＳＬＥＤＬＧＷＡＤＷＶＬＳＰＲＥＶＱＶＴＭＣＩＧＡＣＰＳＱＦＲＡＡＮＭＨＡＱＩＫＴＳＬＨＲＬＫＰＤＴＶＰＡＰＣＣＶＰＡＳＹＮＰＭＶＬＩＱＫＴＤＴＧＶＳＬＱＴＹＤＤＬＬＡＫＤＣＨＣＩ（配列番号３３２）；
（ｖｉｉ）ＨＳＡ−ｈＧＤＦ１５（１９７〜３０８）、Ｒ１９８Ｈ、Ｎ１９９Ａ：ＤＡＨＫＳＥＶＡＨＲＦＫＤＬＧＥＥＮＦＫＡＬＶＬＩＡＦＡＱＹＬＱＱＣＰＦＥＤＨＶＫＬＶＮＥＶＴＥＦＡＫＴＣＶＡＤＥＳＡＥＮＣＤＫＳＬＨＴＬＦＧＤＫＬＣＴＶＡＴＬＲＥＴＹＧＥＭＡＤＣＣＡＫＱＥＰＥＲＮＥＣＦＬＱＨＫＤＤＮＰＮＬＰＲＬＶＲＰＥＶＤＶＭＣＴＡＦＨＤＮＥＥＴＦＬＫＫＹＬＹＥＩＡＲＲＨＰＹＦＹＡＰＥＬＬＦＦＡＫＲＹＫＡＡＦＴＥＣＣＱＡＡＤＫＡＡＣＬＬＰＫＬＤＥＬＲＤＥＧＫＡＳＳＡＫＱＲＬＫＣＡＳＬＱＫＦＧＥＲＡＦＫＡＷＡＶＡＲＬＳＱＲＦＰＫＡＥＦＡＥＶＳＫＬＶＴＤＬＴＫＶＨＴＥＣＣＨＧＤＬＬＥＣＡＤＤＲＡＤＬＡＫＹＩＣＥＮＱＤＳＩＳＳＫＬＫＥＣＣＥＫＰＬＬＥＫＳＨＣＩＡＥＶＥＮＤＥＭＰＡＤＬＰＳＬＡＡＤＦＶＥＳＫＤＶＣＫＮＹＡＥＡＫＤＶＦＬＧＭＦＬＹＥＹＡＲＲＨＰＤＹＳＶＶＬＬＬＲＬＡＫＴＹＥＴＴＬＥＫＣＣＡＡＡＤＰＨＥＣＹＡＫＶＦＤＥＦＫＰＬＶＥＥＰＱＮＬＩＫＱＮＣＥＬＦＥＱＬＧＥＹＫＦＱＮＡＬＬＶＲＹＴＫＫＶＰＱＶＳＴＰＴＬＶＥＶＳＲＮＬＧＫＶＧＳＫＣＣＫＨＰＥＡＫＲＭＰＣＡＥＤＹＬＳＶＶＬＮＱＬＣＶＬＨＥＫＴＰＶＳＤＲＶＴＫＣＣＴＥＳＬＶＮＲＲＰＣＦＳＡＬＥＶＤＥＴＹＶＰＫＥＦＮＡＥＴＦＴＦＨＡＤＩＣＴＬＳＥＫＥＲＱＩＫＫＱＴＡＬＶＥＬＶＫＨＫＰＫＡＴＫＥＱＬＫＡＶＭＤＤＦＡＡＦＶＥＫＣＣＫＡＤＤＫＥＴＣＦＡＥＥＧＫＫＬＶＡＡＳＱＡＡＬＧＬＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＨＡＧＤＨＣＰＬＧＰＧＲＣＣＲＬＨＴＶＲＡＳＬＥＤＬＧＷＡＤＷＶＬＳＰＲＥＶＱＶＴＭＣＩＧＡＣＰＳＱＦＲＡＡＮＭＨＡＱＩＫＴＳＬＨＲＬＫＰＤＴＶＰＡＰＣＣＶＰＡＳＹＮＰＭＶＬＩＱＫＴＤＴＧＶＳＬＱＴＹＤＤＬＬＡＫＤＣＨＣＩ（配列番号３３３）；および
（ｖｉｉｉ）ＨＳＡ−ｈＧＤＦ１５（１９７〜３０８）、Ｎ１９９Ｅ：ＤＡＨＫＳＥＶＡＨＲＦＫＤＬＧＥＥＮＦＫＡＬＶＬＩＡＦＡＱＹＬＱＱＣＰＦＥＤＨＶＫＬＶＮＥＶＴＥＦＡＫＴＣＶＡＤＥＳＡＥＮＣＤＫＳＬＨＴＬＦＧＤＫＬＣＴＶＡＴＬＲＥＴＹＧＥＭＡＤＣＣＡＫＱＥＰＥＲＮＥＣＦＬＱＨＫＤＤＮＰＮＬＰＲＬＶＲＰＥＶＤＶＭＣＴＡＦＨＤＮＥＥＴＦＬＫＫＹＬＹＥＩＡＲＲＨＰＹＦＹＡＰＥＬＬＦＦＡＫＲＹＫＡＡＦＴＥＣＣＱＡＡＤＫＡＡＣＬＬＰＫＬＤＥＬＲＤＥＧＫＡＳＳＡＫＱＲＬＫＣＡＳＬＱＫＦＧＥＲＡＦＫＡＷＡＶＡＲＬＳＱＲＦＰＫＡＥＦＡＥＶＳＫＬＶＴＤＬＴＫＶＨＴＥＣＣＨＧＤＬＬＥＣＡＤＤＲＡＤＬＡＫＹＩＣＥＮＱＤＳＩＳＳＫＬＫＥＣＣＥＫＰＬＬＥＫＳＨＣＩＡＥＶＥＮＤＥＭＰＡＤＬＰＳＬＡＡＤＦＶＥＳＫＤＶＣＫＮＹＡＥＡＫＤＶＦＬＧＭＦＬＹＥＹＡＲＲＨＰＤＹＳＶＶＬＬＬＲＬＡＫＴＹＥＴＴＬＥＫＣＣＡＡＡＤＰＨＥＣＹＡＫＶＦＤＥＦＫＰＬＶＥＥＰＱＮＬＩＫＱＮＣＥＬＦＥＱＬＧＥＹＫＦＱＮＡＬＬＶＲＹＴＫＫＶＰＱＶＳＴＰＴＬＶＥＶＳＲＮＬＧＫＶＧＳＫＣＣＫＨＰＥＡＫＲＭＰＣＡＥＤＹＬＳＶＶＬＮＱＬＣＶＬＨＥＫＴＰＶＳＤＲＶＴＫＣＣＴＥＳＬＶＮＲＲＰＣＦＳＡＬＥＶＤＥＴＹＶＰＫＥＦＮＡＥＴＦＴＦＨＡＤＩＣＴＬＳＥＫＥＲＱＩＫＫＱＴＡＬＶＥＬＶＫＨＫＰＫＡＴＫＥＱＬＫＡＶＭＤＤＦＡＡＦＶＥＫＣＣＫＡＤＤＫＥＴＣＦＡＥＥＧＫＫＬＶＡＡＳＱＡＡＬＧＬＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＲＥＧＤＨＣＰＬＧＰＧＲＣＣＲＬＨＴＶＲＡＳＬＥＤＬＧＷＡＤＷＶＬＳＰＲＥＶＱＶＴＭＣＩＧＡＣＰＳＱＦＲＡＡＮＭＨＡＱＩＫＴＳＬＨＲＬＫＰＤＴＶＰＡＰＣＣＶＰＡＳＹＮＰＭＶＬＩＱＫＴＤＴＧＶＳＬＱＴＹＤＤＬＬＡＫＤＣＨＣＩ（配列番号３３４）。

リンカー
本発明の方法において使用されるＧＤＦ１５融合タンパク質（例えば、血清アルブミンＧＤＦ１５融合タンパク質）に関して、異種タンパク質／ペプチド、例えば、ＳＡおよびＧＤＦ１５部分は、連続ポリペプチド鎖中で互いに直接的に、または好ましくは、適したリンカーを介して互いに間接的に結合させ得る。リンカーは、好ましくは、ペプチドリンカーである。ペプチドリンカーは、融合ポリペプチドにおいて一般的に使用され、リンカーを選択または設計する方法は周知である。（例えば、Chen X et al. Adv. Drug Deliv. Rev. 65(10):135701369 (2013)およびWriggers W et al., Biopolymers 80:736-746 (2005)を参照のこと）。

ペプチドリンカーは、一般に、ｉ）可動性リンカー、ｉｉ）ヘリックス形成性リンカーおよびｉｉｉ）切断可能リンカーとして分類され、各種類の例は、当技術分野で公知である。可動性リンカーが、本明細書において記載される融合ポリペプチド中に含まれることが好ましい。可動性リンカーは、グリシンおよびアラニンなどの立体障害のない大部分のアミノ酸を含有し得る。親水性アミノ酸Ｓｅｒもまた、可動性リンカー中に従来使用されている。可動性リンカーの例として、ポリグリシン（例えば、（Ｇｌｙ）_４（配列番号３３５）および（Ｇｌｙ）_５）（配列番号３３６）、ポリアラニンポリ（Ｇｌｙ−Ａｌａ）およびポリ（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）（例えば、（Ｇｌｙ_ｎ−Ｓｅｒ_ｎ）_ｎまたは（Ｓｅｒ_ｎ−Ｇｌｙ_ｎ）_ｎ、（式中、各ｎは、１以上の独立した整数である））が挙げられる。

ペプチドリンカーは、適した長さのものであり得る。ペプチドリンカー配列は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５またはそれを超えるアミノ酸残基長であり得る。例えば、ペプチドリンカーは、約５〜約５０アミノ酸長、約１０〜約４０アミノ酸長、約１５〜約３０アミノ酸長または約１５〜約２０アミノ酸長であり得る。ペプチドリンカー長の変動は、活性を保持または増強し、活性研究において優れた有効性を引き起こし得る。ペプチドリンカー配列は、天然に存在する、または天然に存在しないアミノ酸から構成され得る。

いくつかの態様では、アミノ酸グリシンおよびセリンは、リンカー配列内にアミノ酸を含む。ある特定の態様では、リンカー領域は、グリシンリピート（ＧＳＧ_３）_ｎ（式中、ｎは、１以上の正の整数（好ましくは、１〜約２０）である）のセットを含む（配列番号３０５）。より詳しくは、リンカー配列は、ＧＳＧＧＧ（配列番号３０６）であり得る。リンカー配列は、ＧＳＧＧ（配列番号３０７）であり得る。ある特定のその他の態様では、リンカー領域配向は、グリシンリピート（ＳｅｒＧｌｙ_３）_ｎのセット（式中、ｎは、１以上の正の整数（好ましくは、１〜約２０）である）を含む（配列番号３０８）。

さらなる実施形態では、リンカーは、グリシン（Ｇ）およびセリン（Ｓ）をランダムに、または好ましくは、反復されたパターンで含有し得る。例えば、リンカーは、（ＧＧＧＧＳ）_ｎ（配列番号３０３）（式中、ｎは、１〜２０、好ましくは１〜４の範囲の整数である）であり得る。特定の実施例では、ｎは、３であり、リンカーは、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３００）である。

その他の実施形態では、リンカーは、グリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）およびプロリン（Ｐ）をランダムに、または好ましくは、反復されたパターンで含有し得る。例えば、リンカーは、（ＧＰＰＧＳ）_ｎ（配列番号３０４）（式中、ｎは、１〜２０、好ましくは、１〜４の範囲の整数である）であり得る。特定の実施例では、ｎは、１であり、リンカーは、ＧＰＰＧＳ（配列番号３０９）である。

一般に、リンカーは、ヒトなどの患者に投与される場合に免疫原性ではない。したがって、リンカーは、低い免疫原性を有するか、または低い免疫原性を有すると考えられるように選択され得る。

本明細書において記載されるリンカーは、例示的なものであり、リンカーは、所望の場合、ＧｌｕおよびＬｙｓなどのその他のアミノ酸を含み得る。ペプチドリンカーは、所望の場合、例えば、（Ｇ_４Ｓ）（配列番号３１０）、（Ｇ_３Ｓ）（配列番号３１１）、（Ｇ_２Ｓ）（配列番号３１２）および／または（ＧｌｙＳｅｒ）（配列番号３１３）の複数のリピートを含み得る。ある特定の態様では、ペプチドリンカーは、例えば、（ＳＧ_４）（配列番号３１４）、（ＳＧ_３）（配列番号３１５）、（ＳＧ_２）（配列番号３１６）または（ＳｅｒＧｌｙ）（配列番号３１７）の複数のリピートを含み得る。その他の態様では、ペプチドリンカーは、（Ｇ_３Ｓ）＋（Ｇ_４Ｓ）＋（ＧｌｙＳｅｒ）（配列番号３１１＋配列番号３１０＋配列番号３１３）などの反復するアミノ酸配列ユニットの組合せおよび複数のものを含み得る。その他の態様では、Ｓｅｒは、Ａｌａと置き換えられ得る、例えば、（Ｇ_４Ａ）（配列番号３１８）または（Ｇ_３Ａ）（配列番号３０１）。さらにその他の態様では、リンカーは、モチーフ（ＥＡＡＡＫ）_ｎ（式中、ｎは、１以上の正の整数、好ましくは、１〜約２０である）（配列番号３１９）を含む。ある特定の態様では、ペプチドリンカーはまた、切断可能なリンカーを含み得る。

特定の実施形態では、本発明の方法において使用されるＧＤＦ１５融合物またはコンジュゲートは、異種タンパク質／ペプチド（例えば、ＨＳＡまたはＦｃ）に連結されたＧＤＦ１５部分（例えば、配列番号５に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むＧＤＦ１５ポリペプチド（polyptide））またはリンカーを有するコンジュゲート部分を含み、リンカーは、アミノ酸配列ＧＧＳＳＥＡＡＥＡＡＥＡＡＥＡＡＥＡＡＥＡＡＥ（配列番号３３７）を有する。配列番号４〜１３および２４〜３８など、リンカーのさらなる限定されない例は、参照によりその全文が本明細書に組み込まれるＰＣＴ国際公開第２０１５／１９７４４６号パンフレットに記載されている。

本発明の方法において使用されるＧＤＦ１５コンジュゲート（例えば、ＧＤＦ１５ＦＡコンジュゲート）に関して、ＧＤＦ１５部分およびコンジュゲート部分、例えば、脂肪酸部分は、以下のようにリンカーによって接続され得る：

リンカーは、ＧＤＦ１５部分とコンジュゲート部分、例えば、脂肪酸部分を分ける。特定の実施形態では、それが主にスペーサーとして働くので、その化学構造は重大ではない。

具体的な実施形態では、リンカーは、２つの反応性基／官能基を含有し、その一方は、ＧＤＦ１５部分と反応でき、もう一方は、コンジュゲート部分、例えば、脂肪酸部分と反応できる化学部分である。リンカーの２つの反応性／官能基は、連結部分またはスペーサーを介して連結され、その構造は、リンカーのＧＤＦ１５部分およびコンジュゲート部分、例えば、脂肪酸部分、例えば、式Ａ１、Ａ２またはＡ３の脂肪酸部分などへのカップリングを干渉しない限りは重大ではない。

リンカーは、ペプチド結合によって互いに連結されるアミノ酸で構成され得る。アミノ酸は、天然または非天然アミノ酸であり得る。本発明のいくつかの実施形態では、リンカーは、ペプチド結合によって連結される１〜２０個のアミノ酸で構成されており、アミノ酸は、２０種の天然に存在するアミノ酸から選択される。種々の実施形態では、１〜２０個のアミノ酸は、アミノ酸グリシン、セリン、アラニン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、グルタミン酸およびリジン、またはリジンアミドなどのそのアミド誘導体から選択される。いくつかの実施形態では、リンカーは、大部分の、グリシンおよびアラニンなどの立体障害のないアミノ酸で構成されている。いくつかの実施形態では、リンカーは、ポリグリシン、ポリアラニン、グリシンおよびアラニンの組合せ（ポリ（Ｇｌｙ−Ａｌａ）など）またはグリシンおよびセリンの組合せ（ポリ（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）など）である。いくつかの実施形態では、リンカーは、大部分の、ヒスチジン、アラニン、メチオニン、グルタミン、アスパラギンおよびグリシンから選択されるアミノ酸で構成されている。いくつかの実施形態では、リンカーは、ポリヒスチジン部分を含有する。その他の実施形態では、リンカーは、グルタミン酸、グルタミン、リジンまたはリジンアミドまたはそれらの組合せを含有する。

いくつかの実施形態では、リンカーは、３以上の利用可能な反応性官能基を有し得、したがって、２以上の脂肪酸部分を連結する手段として働くことができる。例えば、グルタミン、グルタミン酸、セリンまたはリジンなどのアミノ酸は、脂肪酸部分を付加する点、つまり、アミノ酸の側鎖およびＮ末端またはＣ末端の官能基を提供し得る。

いくつかの実施形態では、リンカーは、非天然アミノ酸から選択される１〜２０個のアミノ酸を含む。脂肪酸部分とのコンジュゲーションには、１〜１０個のアミノ酸残基のリンカーが好ましいが、本発明は、任意の長さまたは組成のリンカーを考慮する。非天然アミノ酸リンカーの例として、次式：

またはそのリピートユニットを有する８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸がある。

本明細書において記載されるリンカーは、例示的であり、かなり長い、その他の残基を含むリンカーが、本発明によって考慮される。非ペプチドリンカーも本発明によって考慮される。

その他の実施形態では、リンカーは、１つもしくは複数のアルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、複素環式基、ポリエチレングリコールおよび／または１つもしくは複数の天然もしくは非天然アミノ酸またはそれらの組合せを含み、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、ポリエチレングリコールおよび／または天然もしくは非天然アミノ酸の各々が、任意選択で組み合わされ、互いに連結されるか、またはＧＤＦ１５部分に、および／または脂肪酸部分に、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＮＨＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−Ｏ−、−ＮＨ−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）−Ｏ−、＝ＮＨ−Ｏ−、＝ＮＨ−ＮＨ−もしくは＝ＮＨ−Ｎ（アルキル）−から選択される化学基を介して連結される。

アルキルスペーサーを含有するリンカーとして、例えば、−ＮＨ−（ＣＨ_２）_ｚ−Ｃ（Ｏ）−または−Ｓ−（ＣＨ_２）_ｚ−Ｃ（Ｏ）−または−Ｏ−（ＣＨ_２）_ｚ−Ｃ（Ｏ）−、−ＮＨ−（ＣＨ_２）_ｚ−ＮＨ−、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ_２）ｚ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ_２）_ｚ−Ｏ−、−ＮＨＣ（Ｏ）−（ＣＨ_２）_ｚ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−などがあり、式中、ｚは、２〜２０が使用され得る。これらのアルキルリンカーは、それだけには限らないが、低級アルキル（例えば、Ｃ_１〜Ｃ_６）、低級アシル、ハロゲン（例えば、Ｃｌ、Ｂｒ）、ＣＮ、ＮＨ_２またはフェニルを含む、任意の立体障害しない基によってさらに置換され得る。

リンカーはまた、ポリマー性のものであり得る。リンカーは、生体安定性または生物分解性であるポリマー鎖またはユニットを含み得る。リピート連結を有するポリマーは、結合の不安定さに応じて生理学的条件下で種々の程度の安定性を有し得る。ポリマーは、ポリカーボネート（−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−）、ポリエステル（−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−）、ポリウレタン（−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−）、ポリアミド（−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−）などの結合を含有し得る。これらの結合は、例として提供され、本発明のポリマー鎖またはリンカーにおいて使用可能な結合の種類を制限するものではない。適したポリマーとして、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリアミノ酸、ジビニルエーテルマレイン酸無水物、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）−メタクリリックアミド（methacrylicamide）、デキストラン、デキストラン誘導体、ポリプロピレングリコール、ポリオキシエチル化ポリオール、ヘパリン、ヘパリン断片、多糖、セルロースおよびセルロース誘導体、デンプンおよびデンプン誘導体、ポリアルキレングリコールおよびその誘導体、ポリアルキレングリコールおよびその誘導体のコポリマー、ポリビニルエチルエーテルなどおよびそれらの混合物が挙げられる。ポリマーリンカーは、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。ＰＥＧリンカーは、直鎖である場合も分岐している場合もある。本発明におけるＰＥＧリンカーの分子量は、任意の特定の大きさに制限されないが、ある特定の実施形態は、１００から５０００ダルトン、例えば、５００から１５００ダルトンの間の分子量を有する。

連結部分（またはスペーサー）は、ペプチドまたはポリペプチド／タンパク質のアミノ基（例えば、リジンのＮ末端または側鎖）と脂肪酸部分上の官能基／反応性基（例えば、脂肪酸部分のカルボン酸官能基）の間に架橋を形成する、両末端の適当な官能基−反応性基を含有する。あるいは、連結部分（またはスペーサー）は、ペプチドまたはポリペプチド／タンパク質の酸性カルボキシル基（例えば、Ｃ末端）と脂肪酸部分上の官能基／反応性基（例えば、式Ａ１、Ａ２およびＡ３の脂肪酸部分のカルボン酸官能基）の間に架橋を形成する、両末端の適当な官能基−反応性基を含有する。

リンカーは、種々の性質のいくつかの連結部分（またはスペーサー）を含み得る（例えば、アミノ酸、ヘテロシクリル部分、ＰＥＧおよび／またはアルキル部分の組合せ）。この場合には、各連結部分は、ペプチドまたはポリペプチド／タンパク質のアミノ基（例えば、リジンのＮ末端または側鎖）と、種々の性質の次の連結部分の間に架橋を形成する両末端の適当な官能基−反応性基を含有する、および／または種々の性質の前の連結部分と脂肪酸部分の間に架橋を形成する適当な官能基−反応性基を含有する。その他の例では、各連結部分は、ペプチドまたはポリペプチド／タンパク質の酸性カルボキシル基（例えば、Ｃ末端）と種々の性質の次の連結部分の間に架橋を形成する両末端の適当な官能基−反応性基を含有し、および／または種々の性質の前の連結部分と脂肪酸部分の間に架橋を形成する適当な官能基−反応性基を含有する。

さらに、連結部分は、３以上の末端官能基を有し得、したがって、２以上の脂肪酸部分に連結され得る。これらの多重官能基部分の例として、グルタミン酸、リジンまたはセリンがある。アミノ酸の側鎖はまた、別の脂肪酸部分を付加する点として働き得る。

修飾されたペプチドまたはポリペプチドおよび／またはペプチド−ポリペプチド部分構築物（すなわち、部分リンカーに付加されているペプチド／ポリペプチド）は、脂肪酸部分（または修飾された脂肪酸部分：すなわち、部分リンカーがすでに付加されている）上の利用可能な反応性官能基と反応して共有結合を形成可能な反応性基を含む。反応性基は、共有結合を形成可能な化学基である。反応性基は、コンジュゲーションの１つの部位に位置し、一般に、カルボキシ、ホスホリル、アシル基、エステルまたは混合無水物、マレイミド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、テトラジン、アルキン、イミデート（imidate）、ピリジン−２−イル−ジスルファニルであり得、それによって、コンジュゲーションのその他の部位のアミノ基、ヒドロキシル基、アルケン基、ヒドラジン基、ヒドロキシルアミン基、アジド基またはチオール基のような官能基と共有結合を形成可能である。

ＧＤＦ１５部分をリンカーに、および／またはリンカーを脂肪酸部分にコンジュゲートするため、および／または異なる性質の種々の連結部分を一緒にコンジュゲートするための特に興味深い反応性基は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、アルキン（より詳しくはシクロオクチン）である。

官能基として、１．マレイミド、トシルスルホンまたはピリジン−２−イルジスルファニルと反応するためのチオール基、２．カルボン酸または活性化カルボン酸に結合するための（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンアミド化学反応によるアミド結合形成）アミノ基（例えば、アミノ酸のアミノ官能基）、ホスホリル基、アシル基または混合無水物、３．末端アルキンと、より詳しくは、シクロオクチンとヒュスゲン環化付加反応（より一般には、クリックケミストリーとして公知である）を起こすアジド、４．ヒドロキシルアミンまたはヒドラジンと反応して、それぞれ、オキシムまたはヒドラジンを形成するカルボニル基、５．アザ［４＋２］付加においてテトラジンと反応するためのアルケン、より詳しくは、ひずみアルケンが挙げられる。リンカーおよび官能基／反応性基のいくつかの例が本明細書において記載されているが、本発明の方法は、任意の長さおよび組成のリンカーを考慮する。

ＧＤＦ１５融合ポリペプチド
具体的な態様では、本発明の処置の方法のために投与するのに有用なものとして本明細書において記載されるＧＤＦ１５融合ポリペプチドは、ＧＤＦ１５部分および異種部分、および任意選択で、リンカーを含有し得る。特定の実施形態では、本発明の処置の方法のために投与するのに有用なものとして本明細書において記載されるＧＤＦ１５融合ポリペプチドは、ＧＤＦ１５部分およびアルファ−１−アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）またはその変異体である異種部分、および任意選択で、リンカーを含有し得る。例えば、ＧＤＦ１５−Ａ１ＡＴ融合ポリペプチドは、参照によりその全文が本明細書に組み込まれるＰＣＴ国際公開第２０１６／１０２５８０号パンフレットに記載されている。

具体的な態様では、本発明の処置の方法のために投与するのに有用なものとして本明細書において記載されるＧＤＦ１５融合ポリペプチドは、ＧＤＦ１５部分および血清アルブミン（ＳＡ）部分、および任意選択で、リンカーを含有し得る。一実施形態では、融合ポリペプチドは、ＳＡ部分がＧＤＦ１５部分のＮ末端に位置する連続アミノ酸鎖である。ＳＡ部分のＣ末端は、ＧＤＦ１５部分のＮ末端に直接結合させ得る。好ましくは、ＳＡ部分のＣ末端は、ＧＤＦ１５部分のＮ末端にペプチドリンカーを介して間接的に結合させる。

ＳＡ部分およびＧＤＦ１５部分は、任意の所望の種に由来し得る。例えば、融合タンパク質は、ヒト、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマまたは任意のその他の所望の種に由来するＳＡおよびＧＤＦ１５部分を含有し得る。ＳＡおよびＧＤＦ１５部分は、一般に、同じ種に由来するが、ＳＡ部分がある種に由来し、ＧＤＦ１５部分が別の種に由来する融合ペプチド（例えば、マウスＳＡおよびヒトＧＤＦ１５）も、本開示内容に包含される。

いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、マウス血清アルブミンまたはその機能的変異体および成熟ヒトＧＤＦ１５ペプチドまたはその機能的変異体を含む。例えば、融合タンパク質は、配列番号９、１０、１２、１３および１８のいずれかのアミノ酸配列を有し得る。

好ましい実施形態では、ＳＡ部分は、ＨＳＡまたはその機能的変異体であり、ＧＤＦ１５部分は、成熟ヒトＧＤＦペプチドまたはその機能的変異体である。存在する場合には、任意選択のリンカーは、好ましくは、可動性ペプチドリンカーである。特定の実施形態では、融合ポリペプチドは、
Ａ）Ｃｙｓ３４がＳｅｒで置き換えられており、Ａｓｎ５０３がＧｌｎで置き換えられている、ＨＳＡ（２５〜６０９）（配列番号４）およびＨＳＡ（２５〜６０９）からなる群から選択されるＳＡ部分ならびに
Ｂ）ヒトＧＤＦ１５（１９７〜３０８）（配列番号５）、
ヒトＧＤＦ１５（２１１〜３０８）（配列番号２のアミノ酸２１１〜３０８）、
Ｃｙｓ２０３がＳｅｒで置き換えられており（Ｃ２０３Ｓ）、Ｃｙｓ２１０が、Ｓｅｒと置き換えられている（Ｃ２１０Ｓ）、ヒトＧＤＦ１５（１９７〜３０８）（配列番号５）、および
Ｃｙｓ２７３がＳｅｒで置き換えられている（Ｃ２７３Ｓ）、ヒトＧＤＦ１５（１９７〜３０８）（配列番号５）
なる群から選択されるＧＤＦ１５部分
を含む。

所望の場合、融合ポリペプチドは、ＳＡ部分のＣ末端をＧＤＦ１５部分のＮ末端に連結するリンカーをさらに含み得る。好ましくは、リンカーは、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号３０３）および（ＧＰＰＧＳ）ｎ（配列番号３０４）（式中、ｎは、１〜約２０である）から選択される。好ましいリンカーとして、（（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号３０３）および（ＧＰＰＧＳ）ｎ（配列番号３０４）（式中、ｎは、１、２、３または４である）が挙げられる。

より特定の実施形態では、融合ポリペプチドは、ＨＳＡまたはその機能的変異体、リンカーおよび成熟ヒトＧＤＦ１５ポリペプチドまたはその機能的変異体を含み、配列番号１１、１８、１９、１５のいずれかに対して少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。

さらにより特定の実施形態では、融合ポリペプチドは、配列番号１１、１４、１５、１６、１７、２０、２１および２２のアミノ酸配列を有する。

所望の場合、融合ポリペプチドは、さらなるアミノ酸配列を含有し得る。例えば、融合ポリペプチドの検出および／または精製を促進するために、親和性タグが含まれ得る。

ＧＤＦ１５コンジュゲート
本発明の処置の方法において使用できるＧＤＦ１５コンジュゲート、例えば、ＧＤＦ１５脂肪酸コンジュゲートの種々の実施形態は、本明細書において記載される。各実施形態において具体的に説明される特色を、さらなる実施形態を提供するために、その他の具体的に説明される特色と組み合わせてもよいということは認識されよう。

具体的な実施形態では、本明細書において提供される方法のためのＧＤＦ１５コンジュゲートは、脂肪酸部分などの部分にコンジュゲートされ、任意選択で、リンカーを含むＧＤＦ１５ポリペプチドまたはその機能的変異体を含む。本発明のいくつかの実施形態では、脂肪酸残基は、親油性残基である。

別の実施形態では、脂肪酸残基は、生理学的ｐＨで負電荷を有する。別の実施形態では、脂肪酸残基は、負電荷を有し得る基を含む。負電荷を有し得る１つの好ましい基として、カルボン酸基がある。

本発明の別の実施形態では、脂肪酸残基は、非共有結合によって、アルブミンまたはその他の血漿タンパク質に結合する。本発明のさらに別の実施形態では、脂肪酸残基は、直鎖アルキル基、分岐アルキル基、ω−カルボン酸基、部分的または完全に水素付加されたシクロペンタノフェナントレン骨格を有する基から選択される。

別の実施形態では、脂肪酸残基は、シバクロニル（cibacronyl）残基である。

別の実施形態では、脂肪酸残基は、６〜４０個の炭素原子、８〜２６個の炭素原子または８〜２０個の炭素原子を有する。

別の実施形態では、脂肪酸残基は、Ｒ−Ｃ（Ｏ）−（式中、Ｒは、Ｃ_４〜３８直鎖もしくは分岐アルキルまたはＣ_４〜３８直鎖もしくは分岐アルケニルであり、前記アルキルおよびアルケニルは各々、任意選択で、−ＣＯ_２Ｈ、ヒドロキシル、−ＳＯ_３Ｈ、ハロおよび−ＮＨＣ（Ｏ）Ｃ（Ｏ）ＯＨから選択される１つもしくは複数の置換基で置換されてもよい）を含む基から選択されるアシル基である。アシル基（Ｒ−Ｃ（Ｏ）−）は、対応するカルボン酸Ｒ−Ｃ（Ｏ）ＯＨの、ＧＤＦ１５ポリペプチド上のアミノ基との反応に由来する。

別の実施形態では、脂肪酸残基は、ＣＨ_３（ＣＨ_２）_ｒ−ＣＯ（式中、ｒは、４〜３８の整数、好ましくは、４〜２４の整数である）を含む群から選択される、より好ましくは、ＣＨ_３（ＣＨ_２）_６ＣＯ−、ＣＨ_３（ＣＨ_２）_８−ＣＯ−、ＣＨ_３（ＣＨ_２）_１０−ＣＯ−、ＣＨ_３（ＣＨ_２）_１２−ＣＯ−、ＣＨ_３（ＣＨ_２）_１４−ＣＯ−、ＣＨ_３（ＣＨ_２）_１６−ＣＯ−、ＣＨ_３（ＣＨ_２）_１８−ＣＯ−、ＣＨ_３（ＣＨ_２）_２０−ＣＯおよびＣＨ_３（ＣＨ_２）_２２−ＣＯ−を含む群から選択されるアシル基である。

別の実施形態では、脂肪酸残基は、直鎖または分岐アルカンα，ωジカルボン酸のアシル基である。

別の実施形態では、脂肪酸残基は、ＨＯＯＣ−（ＣＨ_２）_ｓＣＯ−（式中、ｓは、４〜３８の整数、好ましくは、４〜２４の整数である）を含む群から選択される、より好ましくは、ＨＯＯＣ（ＣＨ_２）_１４−ＣＯ−、ＨＯＯＣ（ＣＨ_２）_１６−ＣＯ−、ＨＯＯＣ（ＣＨ_２）_１８−ＣＯ−、ＨＯＯＣ（ＣＨ_２）_２０−ＣＯ−およびＨＯＯＣ（ＣＨ_２）_２２−ＣＯ−を含む群から選択されるアシル基である。

別の実施形態では、脂肪酸残基は、式ＣＨ_３−（ＣＨ_２）_ｘ−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ_２ＣＯ_２Ｈ）−Ｃ（Ｏ）−（式中、ｘは、８〜２４の整数である）の基である。

さらに別の実施形態では、脂肪酸残基は、
ＣＨ_３−（ＣＨ_２）_６〜２４−ＣＯ_２Ｈ；ＣＦ_３−（ＣＦ_２）_４〜９−ＣＨ_２ＣＨ_２−ＣＯ_２Ｈ；ＣＦ_３−（ＣＦ_２）_４〜９−ＣＨ_２ＣＨ_２−Ｏ−ＣＨ_２−ＣＯ_２Ｈ；ＣＯ_２Ｈ−（ＣＨ_２）_６〜２４−ＣＯ_２Ｈ；ＳＯ_２Ｈ−（ＣＨ_２）_６〜２４−ＣＯ_２Ｈからなる群から選択され、脂肪酸は、ＧＤＦ１５ポリペプチド上のアミノ基（リジンのＮ末端または側鎖）に、またはリンカー上のアミノ基にそのカルボキシル官能基のうちの１つを介して連結される。

脂肪酸の具体例として：

があり、ここで、脂肪酸は、ＧＤＦ１５のＮ末端に、またはＧＤＦ１５の側鎖上のアミノ基に、またはリンカー上のアミノ基にそのカルボキシル官能基のうちの１つを介して連結される。

特に興味深いことに、上記の脂肪酸と、ＧＤＦ１５の間のリンカーは、リジン、グルタミン酸、好ましくは１〜３の

のリピートユニット、またはそれらの混合物を含む。

より好ましくは、リンカーは、１個または複数のグルタミン酸アミノ酸およびＣＯ_２Ｈ−ＣＨ_２−Ｏ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＮＨ_２の１つまたは複数のリピートユニットを含む。

１個または２個のグルタミン酸アミノ酸に連結される脂肪酸の例として、

があり、ここで、キラル炭素原子は独立して、ＲまたはＳのいずれかであり、脂肪酸−リンカー部分は、ＧＤＦ１５のＮ末端に、またはＧＤＦ１５の側鎖上のアミノ基に、または別の連結部分上のアミノ基にグルタミン酸のカルボン酸官能基のうちの１つを介して連結される。

また、特に興味深いことに、リンカーは、１個または複数のリジンまたはリジンアミドアミノ酸ならびにＣＯ_２Ｈ−ＣＨ_２−Ｏ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＮＨ_２の１つまたは複数のリピートユニットを含む。

リジンまたは／およびリジンアミドアミノ酸に連結される脂肪酸部分（単数または複数）の例として、

があり、ここで、リジンの第１級アミノ基が、ＧＤＦ１５のＣ末端に、またはＧＤＦ１５の側鎖上のカルボン酸官能基に、または別の連結部分上のカルボン酸官能基に付加されている。

上記の脂肪酸とともに使用されるべきリンカーの別の具体例として、４−スルファモイルブタン酸がある：

上記リンカーに連結される脂肪酸の例として、以下：

があり、ここで、脂肪酸−リンカー部分は、ＧＤＦ１５のＮ末端に、またはＧＤＦ１５の側鎖上のアミノ基に、または別の連結部分上のアミノ基に、スルファモイルブタン酸部分上のカルボン酸官能基を介して連結される。

さらに、このような脂肪酸リンカー構築物は、好ましくは１〜４の以下：

のリピートユニットをさらに含み得る。

脂肪酸−リンカー構築物のその他の例は、参照により組み込まれる米国特許出願公開第２０１３／００４０８８４号明細書、Albumin-binding conjugates comprising fatty acid and PEG (Novo Nordisk)にさらに開示されている。

このような構築物は、ＧＤＦ１５のＮ末端に、カルボン酸官能基を介して連結されることが好ましい。

実施形態１において、本発明は、リンカーを介して脂肪酸部分に連結されたＧＤＦ１５部分を含むコンジュゲートに関し、ここで、脂肪酸部分は、次式Ａ１、Ａ２またはＡ３：

［Ｒ^１は、ＣＯ_２Ｈ、Ｈであり、
Ｒ^２、Ｒ^３およびＲ^４は互いに独立して、Ｈ、ＯＨ、ＣＯ_２Ｈ、−ＣＨ＝ＣＨ_２または−Ｃ≡ＣＨであり、
Ａｋは、分岐Ｃ_６〜Ｃ_３０アルキレンであり、
ｎ、ｍおよびｐは互いに独立して、６から３０の間の整数である］またはそのアミド、エステルまたは医薬上許容される塩を有する。

実施形態１Ａでは、本発明は、脂肪酸部分が式Ａ１のものである実施形態１のコンジュゲートに関する。この実施形態の特定の態様では、コンジュゲートは、ｎおよびｍが独立して、８〜２０、好ましくは、１０〜１６である、式Ａ１の脂肪酸部分を含む。この実施形態の別の態様では、本発明は、脂肪酸部分が、Ｒ２およびＲ３の少なくとも一方がＣＯ２Ｈである式Ａ１のものである、実施形態１または１Ａのコンジュゲートに関する。

実施形態２では、本発明は、脂肪酸部分が、次式：

［式中、Ａｋ３、Ａｋ４、Ａｋ５、Ａｋ６およびＡｋ７は独立して、（Ｃ_８〜_２０）アルキレンであり、Ｒ５およびＲ６は独立して、（Ｃ_８−２０）アルキルである］から選択される、実施形態１または１Ａのコンジュゲートに関する。

実施形態３では、本発明は、脂肪酸部分が、次式：

から選択される、実施形態１、１Ａまたは２のコンジュゲートに関する。

実施形態３Ａでは、本発明は、脂肪酸部分が、次式：

実施形態３Ｂでは、本発明は、脂肪酸部分が、式Ａ２またはＡ３のものである、実施形態１のコンジュゲートに関する。この実施形態の特定の態様では、コンジュゲートは、ｐが８〜２０である式Ａ２の脂肪酸部分またはＡｋがＣ_８〜２０アルキレンである式Ａ３の脂肪酸部分を含む。

実施形態３Ｃでは、本発明は、脂肪酸部分が次式：

［式中、Ａｋ_２は、Ｃ_８〜２０アルキレンである］から選択される実施形態１または３Ｂのコンジュゲートに関する。

実施形態４では、本発明は、リンカーが、１個または複数のアルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、複素環式基、ポリエチレングリコール、１個または複数の天然または非天然（unatural）アミノ酸またはそれらの組合せを含み、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、ポリエチレングリコールおよび／または天然もしくは非天然（unatural）アミノ酸の各々が、任意選択で組み合わされ、互いに連結されるか、またはＧＤＦ１５部分に、および／もしくは脂肪酸部分に、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＮＨＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−Ｏ−、−ＮＨ−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）−Ｏ−、＝ＮＨ−Ｏ−、＝ＮＨ−ＮＨ−もしくは＝ＮＨ−Ｎ（アルキル）−から選択される化学基を介して連結される、先行するコンジュゲートの実施形態のいずれかのコンジュゲートに関する。

実施形態５では、本発明の処置の方法において使用できる脂肪酸コンジュゲートは、先行するコンジュゲートの実施形態のいずれかのコンジュゲートに関し、リンカーは、式：

［式中、ｙが０〜３４である］の非分岐オリゴエチレングリコール部分を含む。

実施形態６では、本発明は、リンカーが、次式：

から選択される複素環式部分を含む（またはさらに含む）、先行するコンジュゲートの実施形態のいずれかのコンジュゲートに関する。

このようなヘテロシクリル含有リンカーは、例えば、より一般的に、クリックケミストリーとして公知であるアジド−アルキンヒュスゲン環化付加反応によって得られる。より詳しくは、上記で表されるヘテロシクリルの一部は、シクロアルキンのアジド含有部分との反応に起因する。

シクロアルキンは、市販の供給源から容易に入手可能であり、したがって、アジド官能基を含有する部分（例えば、末端アジド官能基を含有するリンカー）との環化付加によって官能基付与され得る。タンパク質標識における環状アルキンクリックケミストリーの使用の例は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００９／００６８７３８号明細書に記載されている。

ヒュスゲン環化付加反応において使用できるシクロアルキン（cycloakyne）物質の限定されない例として：

がある。

実施形態６Ａでは、本発明は、リンカーが、次式：

［式中、ｒが、０〜２の整数であり、ｓが、０〜３の整数である］から選択されるヘテロシクリルを含む（またはさらに含む）脂肪酸コンジュゲートに関する。

このような複素環式リンカーは、アルケン、または好ましくは、シクロアルカンなどのひずみアルケンの、以下の部分：

［式中、Ｒｆは、例えば、−ＣＨ_２ＮＨ_２、−ＯＨ、−ＣＨ_２−ＣＯ_２Ｈ、−Ｓ−ＣＨ_２−ＣＯ_２Ｈ、−（Ｏ−ＣＨ_２）_４〜６−Ｃ（Ｏ）−ＯＨ−または

である］とのアザ［４＋２］環化付加（cycloadditon）によって得ることができる。

このようなテトラジン部分は、市販の供給源から容易に入手可能であり、アルケン含有部分、例えば、末端アルケン官能基を含有するリンカーと反応し得る。

実施形態６Ｂでは、本発明は、リンカーが、式：

のヘテロシクリルを含む（またはさらに含む）、脂肪酸コンジュゲートに関する。

このような複素環式部分は、マレイミドを、チオール含有部分、例えば、末端チオール官能基を含有するリンカーなどと反応させることによって得ることができる。

容易に入手可能な、および／または商業的に入手可能なこれらの試薬は、対象のペプチドまたはポリペプチドに直接付加されている、または上記で記載されたリンカーを介して付加されている。アルキン、マレイミドまたはテトラジン反応性基は、脂肪酸部分上またはリンカー−脂肪酸構築物（例えば、ＰＥＧ−脂肪酸構築物など）上に存在する官能基（それぞれ、アジド、チオールおよびアルケン）と反応される。

実施形態７では、本発明は、先行するコンジュゲートの実施形態のいずれかのコンジュゲートに関し、リンカーは、ヒスチジン、メチオニン、アラニン、グルタミン、アスパラギンおよびグリシンから独立して選択される１個または複数のアミノ酸を含む、またはさらに含む。この実施形態の１つの特定の態様では、リンカーは、ヒスチジン、アラニンおよびメチオニンから選択される１〜６個のアミノ酸を含む。

実施形態８では、本発明は、先行するコンジュゲートの実施形態のいずれか１つのコンジュゲートに関し、ＧＤＦ１５部分は、ヒト増殖分化因子１５（ＧＤＦ１５）またはその関連タンパク質および相同体、変異体、断片およびその他の修飾された形態である。実施形態８Ａでは、本発明は、先行するコンジュゲートの実施形態のいずれか１つのコンジュゲートに関し、ＧＤＦ１５部分は、ヒト増殖分化因子１５（ＧＤＦ１５）変異体である。

実施形態８Ｂでは、本発明は、ヒトＧＤＦ１５変異体が、成熟ポリペプチドの１個または複数のアミノ酸残基の、別の残基との置き換えによって得られる、実施形態８Ａのコンジュゲートを考慮する。この実施形態の１つの特定の態様では、ヒトＧＤＦ１５のＮ末端の最後の２個のアミノ酸残基（すなわち、アルギニン１９８およびアラニン１９７）は、アミノ酸配列ＸＨ−（式中、Ｈはヒスチジンであり、Ｘは、メチオニン、アラニン、グルタミン、アスパラギンおよびグリシンから選択されるアミノ酸である）と置き換えられている。この実施形態の好ましい態様では、ｈＧＤＦ１５変異体は、ＭＨ（１９９〜３０８）ｈＧＤＦ１５またはＡＨ（１９９〜３０８）ｈＧＤＦ１５である。

実施形態８Ｃでは、ヒトＧＤＦ１５のＮ末端の最後の３個のアミノ酸残基（すなわち、アスパラギン１９９、アルギニン１９８およびアラニン１９７）は、アミノ酸配列ＸＨＸ’−（式中、Ｈは、ヒスチジンであり、Ｘ’およびＸは、メチオニン、アラニン、グルタミン、アスパラギンおよびグリシンから独立して選択されるアミノ酸である）と置き換えられている。この実施形態の別の態様では、ヒトＧＤＦ１５のＮ末端の最後の３個のアミノ酸残基（すなわち、アスパラギン１９９、アルギニン１９８およびアラニン１９７）は、アミノ酸配列ＡＨＸ’−（式中、Ｈは、ヒスチジンであり、Ｘ’は、メチオニン、アラニン、グルタミン、アスパラギンおよびグリシンから独立して選択されるアミノ酸である）と置き換えられている。この実施形態の好ましい態様では、修飾されたＧＤＦ１５タンパク質は、ＭＨＡ（２００〜３０８）ｈＧＤＦ１５またはＡＨＡ（２００〜３０８）ｈＧＤＦ１５である。

一実施形態では、本発明は、式Ｒ−ＣＯ２Ｈ（式中、Ｒは、Ｃ_４〜３８直鎖もしくは分岐アルキルまたはＣ_４〜３８直鎖もしくは分岐アルケニルであり、各前記アルキルおよびアルケニルは、任意選択で−ＣＯ_２Ｈ、ヒドロキシル、−ＳＯ_３Ｈ、ハロおよび−ＮＨＣ（Ｏ）Ｃ（Ｏ）ＯＨから選択される１個または複数の置換基で置換されていてもよい）のものである脂肪酸を含むＧＤＦ１５脂肪酸コンジュゲートを対象とするが、脂肪酸残基は、式Ａ１、Ａ２、Ａ３の脂肪酸ではなく、脂肪酸はミリスチン酸ではない。

別の実施形態では、本発明は、実施形態７、８、８Ｂ、８Ｃのいずれか１つのＧＤＦ１５脂肪酸コンジュゲートに関し、ここでＧＤＦ１５脂肪酸コンジュゲートは、式Ａ１、Ａ２またはＡ３の脂肪酸を含まず、ミリスチン酸を含まない。

別の実施形態では、本発明は、実施形態１〜８のＧＤＦ１５−脂肪酸コンジュゲートを対象としており、ここで、ＧＤＦ１５脂肪酸コンジュゲートは、
（ｉ）配列番号４１；
（ｉｉ）
ＭＨＨＨＨＨＨＡＲＮＧＤＨＣＰＬＧＰＧＲＣＣＲＬＨＴＶＲＡＳＬＥＤＬＧＷＡＤＷＶＬＳＰＲＥＶＱＶＴＭＣＩＧＡＣＰＳＱＦＲＡＡＮＭＨＡＱＩＫＴＳＬＨＲＬＫＰＤＴＶＰＡＰＣＣＶＰＡＳＹＮＰＭＶＬＩＱＫＴＤＴＧＶＳＬＱＴＹＤＤＬＬＡＫＤＣＨＣＩ（Ｍ−（ｈｉｓ）_６−ｈＧＤＦ１５（１９７〜３０８））（配列番号３２１）、
（ｉｉｉ）ＭＨＨＨＨＨＨＭＡＲＮＧＤＨＣＰＬＧＰＧＲＣＣＲＬＨＴＶＲＡＳＬＥＤＬＧＷＡＤＷＶＬＳＰＲＥＶＱＶＴＭＣＩＧＡＣＰＳＱＦＲＡＡＮＭＨＡＱＩＫＴＳＬＨＲＬＫＰＤＴＶＰＡＰＣＣＶＰＡＳＹＮＰＭＶＬＩＱＫＴＤＴＧＶＳＬＱＴＹＤＤＬＬＡＫＤＣＨＣＩ（Ｍ−（ｈｉｓ）_６−Ｍ−ｈＧＤＦ１５（１９７〜３０８））（配列番号３２２）、
（ｉｖ）ＭＨＨＨＨＨＨＡＨＡＲＤＧＣＰＬＧＥＧＲＣＣＲＬＱＳＬＲＡＳＬＱＤＬＧＷＡＮＷＶＶＡＰＲＥＬＤＶＲＭＣＶＧＡＣＰＳＱＦＲＳＡＮＴＨＡＱＭＱＡＲＬＨＧＬＮＰＤＡＡＰＡＰＣＣＶＰＡＳＹＥＰＶＶＬＭＨＱＤＳＤＧＲＶＳＬＴＰＦＤＤＬＶＡＫＤＣＨＣＶ（Ｍ−（ｈｉｓ）_６−ｄＧＤＦ１５）（配列番号３２３）、
（ｖ）ＭＨＮＧＤＨＣＰＬＧＰＧＲＣＣＲＬＨＴＶＲＡＳＬＥＤＬＧＷＡＤＷＶＬＳＰＲＥＶＱＶＴＭＣＩＧＡＣＰＳＱＦＲＡＡＮＭＨＡＱＩＫＴＳＬＨＲＬＫＰＤＴＶＰＡＰＣＣＶＰＡＳＹＮＰＭＶＬＩＱＫＴＤＴＧＶＳＬＱＴＹＤＤＬＬＡＫＤＣＨＣＩ（ＭＨ−ｈＧＤＦ１５（１９９〜３０８））（配列番号３２４）、
（ｖｉ）ＭＨＡＧＤＨＣＰＬＧＰＧＲＣＣＲＬＨＴＶＲＡＳＬＥＤＬＧＷＡＤＷＶＬＳＰＲＥＶＱＶＴＭＣＩＧＡＣＰＳＱＦＲＡＡＮＭＨＡＱＩＫＴＳＬＨＲＬＫＰＤＴＶＰＡＰＣＣＶＰＡＳＹＮＰＭＶＬＩＱＫＴＤＴＧＶＳＬＱＴＹＤＤＬＬＡＫＤＣＨＣＩ（ＭＨＡ−ｈＧＤＦ１５（２００〜３０８））（配列番号３２５）、および
（ｖｉｉ）ＡＨＮＧＤＨＣＰＬＧＰＧＲＣＣＲＬＨＴＶＲＡＳＬＥＤＬＧＷＡＤＷＶＬＳＰＲＥＶＱＶＴＭＣＩＧＡＣＰＳＱＦＲＡＡＮＭＨＡＱＩＫＴＳＬＨＲＬＫＰＤＴＶＰＡＰＣＣＶＰＡＳＹＮＰＭＶＬＩＱＫＴＤＴＧＶＳＬＱＴＹＤＤＬＬＡＫＤＣＨＣＩ（ＡＨ−ｈＧＤＦ１５（１９９〜３０８）（配列番号３２６）
のアミノ配列を含まない。

式Ａ１、Ａ２、Ａ３の脂肪酸を含む脂肪酸ＧＤＦ１５コンジュゲートの例は、ＰＣＴ国際公開第２０１５／２０００８０号パンフレットに記載されている。

天然ＧＤＦ１５と比較して、ＧＤＦ１５変異体は、Ｎ末端でのタンパク質の選択的標識（すなわち、ＧＤＦ１５の好ましいＮ末端での脂肪酸のコンジュゲーション）を可能にする。ペプチドおよびタンパク質の選択的標識は、ＰＣＴ国際公開第２０１５／２０００７８号パンフレットにさらに詳細に記載されている。

核酸および宿主細胞
本発明はまた、融合ポリペプチドを生成するために使用できるベクターを含む、本発明の処置の方法のための投与のために有用なものとして、本明細書において記載される融合ポリペプチドをコードする核酸に関する。核酸は、単離される、および／または組換えである。ある特定の実施形態では、核酸は、ＨＳＡまたはその機能的変異体が、ヒト成熟ＧＤＦ１５またはその機能的変異体のＮ末端に位置する融合ポリペプチドをコードする。所望の場合、核酸は、ＨＳＡまたはその機能的変異体のＣ末端を、ヒト成熟ＧＤＦ１５またはその機能的変異体のＮ末端に結合するリンカー（例えば、可動性ペプチドリンカー）をさらにコードし得る。所望の場合、核酸はまた、融合ポリペプチドの細胞性プロセシングおよび分泌を指示するリーダーまたはシグナル、配列をコードし得る。

好ましい実施形態では、核酸は、ＳＡ部分がＨＳＡまたはその機能的変異体であり、ＧＤＦ１５部分が成熟ヒトＧＤＦペプチドまたはその機能的変異体である、融合ポリペプチドをコードする。存在する場合には、任意選択のリンカーは、好ましくは、可動性ペプチドリンカーである。特定の実施形態では、核酸は、Ａ）Ｃｙｓ３４がＳｅｒと置き換えられており、Ａｓｎ５０３がＧｌｎと置き換えられている、ＨＳＡ（２５〜６０９）（配列番号４）およびＨＳＡ（２５〜６０９）からなる群から選択されるＳＡ部分ならびに
Ｂ）ヒトＧＤＦ１５（１９７〜３０８）（配列番号５）、
ヒトＧＤＦ１５（２１１〜３０８）（配列番号２のアミノ酸２１１〜３０８）、
Ｃｙｓ２０３がＳｅｒと置き換えられており（Ｃ２０３Ｓ）、Ｃｙｓ２１０がＳｅｒと置き換えられている（Ｃ２１０Ｓ）、ヒトＧＤＦ１５（１９７〜３０８）（配列番号５）、および
Ｃｙｓ２７３がＳｅｒと置き換えられている（Ｃ２７３Ｓ）、ヒトＧＤＦ１５（１９７〜３０８）（配列番号５）
からなる群から選択されるＧＤＦ１５部分と
を含む融合ポリペプチドをコードする。

所望の場合、コードされる融合ポリペプチドは、ＳＡ部分のＣ末端を、ＧＤＦ１５部分のＮ末端に連結するリンカーをさらに含み得る。好ましくは、リンカーは、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号３０３）および（ＧＰＰＧＳ）ｎ（配列番号３０４）および（ＧＰＰＧＳ）ｎ（配列番号３０４）（式中、ｎは、１〜約２０である）から選択される。好ましいリンカーとして、（（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号３０３）および（ＧＰＰＧＳ）ｎ（配列番号３０４）（式中、ｎは、１、２、３または４である）が挙げられる。

宿主細胞における発現のために、当技術分野で公知である（例えば、Sambrook, J., Fritsh, E. F., and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2^nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989に記載されるような）標準クローニングおよび発現技術に従って、融合ポリペプチドをコードする核酸は、適したベクター中に存在し得、配列は、適した宿主への導入後に、コードされる融合ポリペプチドを生成するように発現され得る。本発明はまた、本発明の核酸配列を含むこのようなベクターに関する。

組換え発現ベクターは、原核細胞（例えば、大腸菌（E.coli））または真核細胞（例えば、昆虫細胞、酵母細胞または哺乳動物細胞）におけるＧＤＦ１５融合ポリペプチドの発現のために設計され得る。代表的な宿主細胞として、多数の大腸菌（E.coli）株、ＣＨＯ、ＣＨＯ−Ｋ１およびＨＥＫ２９３などの哺乳動物細胞株、Ｓｆ９細胞などの昆虫細胞ならびにＳ．セレビシエ（S. cerevisiae）およびＰ．パストリス（P. pastoris）などの酵母細胞が挙げられる。あるいは、組換え発現ベクターは、例えば、Ｔ７プロモーター調節配列およびＴ７ポリメラーゼおよびｉｎｖｉｔｒｏ翻訳系を使用してｉｎｖｉｔｒｏで転写および翻訳され得る。宿主細胞および細胞不含ｉｎｖｉｔｒｏ系における発現に適したベクターは、当技術分野で周知である。一般に、このようなベクターは、融合ポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結されている１つまたは複数の発現制御エレメントを含有する。発現制御エレメントとして、例えば、プロモーター、エンハンサー、スプライス部位、ポリアデニル化シグナルなどが挙げられる。通常、プロモーターは、上流に位置し、融合ポリペプチドをコードする核酸配列と作動可能に連結されている。ベクターは、適したプロモーター、エンハンサーおよびその他の発現制御エレメントを含み得る、または伴い得る。このようなエレメントの例として、強力な発現プロモーター（例えば、ヒトＣＭＶＩＥプロモーター／エンハンサー、ＲＳＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＳＬ３−３プロモーター、ＭＭＴＶプロモーターまたはＨＩＶＬＴＲプロモーター、ＥＦ１アルファプロモーター、ＣＡＧプロモーター）および有効なポリ（Ａ）終結配列が挙げられる。クローニングおよび増幅を促進するためにベクター中に存在し得るさらなるエレメントとして、例えば、大腸菌（E.coli）におけるプラスミド生成物の複製起点、選択マーカーとしての抗生物質耐性遺伝子および／または好都合なクローニング部位（例えば、ポリリンカー）が挙げられる。

本開示の別の態様では、本明細書において開示される核酸およびベクターを含む宿主細胞が提供される。種々の実施形態では、ベクターまたは核酸は、宿主細胞ゲノム中に組み込まれ、その他の実施形態では、ベクターまたは核酸は、染色体外である。所望の場合、宿主細胞は、単離され得る。

このような核酸、ベクターまたはそのいずれかもしくは両方の組合せを含む、酵母、細菌（例えば、大腸菌（E.coli））および哺乳動物細胞（例えば、不死化哺乳動物細胞）などの組換え細胞が提供される。種々の実施形態では、ヒト血清アルブミンまたはその機能的変異体およびヒトＧＤＦ１５タンパク質またはその機能的変異体を含む融合ポリペプチドの発現のための配列コーディングを含む、プラスミド、コスミド、ファージミドまたは直鎖発現エレメントなどの組み込まれていない核酸を含む細胞が提供される。

本明細書において提供されるＧＤＦ１５融合ポリペプチドをコードする核酸配列を含むベクターを、形質転換、トランスフェクションまたは形質導入によってなど、任意の適した方法を使用して宿主細胞中に導入できる。適した方法は、当技術分野で周知である。一例では、ヒト血清アルブミンまたはその機能的変異体およびヒトＧＤＦ１５タンパク質またはその機能的変異体を含む融合ポリペプチドをコードする核酸を、ウイルスベクターによって、宿主細胞または宿主動物中に配置する、および／または送達できる。この能力において任意の適したウイルスベクターを使用できる。

本発明はまた、本明細書において記載される融合ポリペプチドを生成するための方法であって、本発明の組換え核酸を含む組換え宿主細胞を組換え核酸の発現に適した条件下で維持し、それによって、組換え核酸が発現され、融合ポリペプチドが生成されることを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、本方法は、融合ポリペプチドを単離することをさらに含む。

治療的方法および医薬組成物
本発明は、それを必要とする対象において非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）および非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）ならびに末期肝臓疾患、脂肪肝（hepatic steatosis）（脂肪肝（fatty liver））、肝臓線維症、肝臓炎症、肝硬変、原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）および肝細胞癌（ＨＣＣ）を処置するための方法に関し、前記方法は、それを必要とする対象に、有効量の、例えば、本明細書において記載されるようなＧＤＦ１５ポリペプチド、ＧＤＦ１５変異体、ＧＤＦ１５融合ポリペプチドまたはＧＤＦ１５ＦＡコンジュゲート（通常、医薬組成物の形態の）を投与することを含む。

非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）は、米国では、３〜５人に１人の成人および１０人に１人の小児に影響を及ぼす障害であり、アルコールをほとんど飲まないまたは全く飲まない人の肝臓において過剰の脂肪の蓄積がある状態を指す。ＮＡＦＬＤの最も一般的な形態は、脂肪が、肝臓細胞に蓄積し、正常ではないが、脂肪肝自体は、おそらく肝臓に傷害を与えない脂肪肝（hepatic steatosis）（脂肪肝（fatty liver））と呼ばれる非重篤状態である。ＮＡＦＬＤは、ほとんどの場合、食後グルコースに対する不耐容性を伴うまたは伴わない空腹時血糖値（ＦＰＧ）の上昇、過体重または肥満であること、コレステロールおよびトリグリセリド（ＴＧ）などの高い血中脂質および低い高密度リポタンパク質コレステロール（ＨＤＬ−Ｃ）レベルならびに高血圧を特徴とするメタボリックシンドロームと呼ばれるリスク因子の集まりを有する個体において現れるが、すべての患者がメタボリックシンドロームの徴候を有するわけではない。肥満症は、ＮＡＦＬＤの最も一般的な原因であると考えられており、一部の専門家は、肥満の成人の約３分の２および肥満の小児の２分の１が、脂肪肝（fatty liver）を有し得ると推定している。ＮＡＦＬＤを有する個体の大部分は、症状および通常の身体診察を全く有さず（肝臓が、わずかに肥大している場合はあるが）、小児は、腹痛および疲労などの症状を呈することもあり、斑状の暗い皮膚変色（黒色表皮腫）を示すこともある。ＮＡＦＬＤの診断は、通常、まず、日常的な試験の際にその肝臓血液試験において軽度の上昇を有するとわかった、過体重または肥満の人において疑われるが、ＮＡＦＬＤは、通常の肝臓血液試験を用いて示され得るが、腹部超音波またはＣＴスキャンなどの画像法調査で偶発的に検出され得る。画像法研究、最も一般的には、肝臓超音波または磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）および他の原因の排除によって確認される。

ＮＡＦＬＤを有する一部の人は、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）と呼ばれる、より重篤な状態を発生し得る：成人米国人の約２〜５パーセントおよび肥満である人の最大２０パーセントは、ＮＡＳＨを患い得る。ＮＡＳＨでは、肝臓の脂肪蓄積は、炎症および種々の程度の瘢痕を伴う。ＮＡＳＨは、末期肝臓疾患、硬変および肝細胞癌へ進行する実質的なリスクを有する潜在的に重篤な状態である。硬変を発症し、肝不全のリスクにある一部の患者は、最終的に肝臓移植を必要とすることもある。

非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）は、肝臓における良性脂質蓄積（脂肪肝（steatosis））から炎症と組み合わさった脂肪肝（steatosis）の範囲の状態である。後者は、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）と呼ばれる。ＮＡＳＨは、メタボリックシンドロームの肝臓成分と見なされる。米国からの推定は、すべての成人の５．７％〜１７％がＮＡＳＨを有し、米国人の１７％〜３３％が、ＮＡＦＬＤを有するということである［１、２］。肥満症およびインスリン抵抗性は、先進国において蔓延しているので、ＮＡＦＬＤおよびＮＡＳＨ両方の有病率は、増大しており、したがって、主要な健康被害であると考えられる［３］。脂肪肝（steatosis）単独は、肝臓自体については比較的良性の状態と考えられ、可逆的な状態でもある。しかし、ＮＡＳＨへの移行は、線維症、硬変および肝臓がんなどの肝臓へのさらなる傷害のためのステージを設定するので、病理発生における重要なステップに相当する。脂肪肝（steatosis）につながる機序は、十分に説明されているが、ＮＡＳＨへの進行の際に肝臓炎症を引き起こす実際の危険因子については、ほとんど知られていない。結果的に、治療選択肢が不十分である。

ＮＡＳＨは、末期肝臓疾患の主因であり、ＮＡＦＬＤは、さらにより大きな程度にＮＡＳＨは、インスリン抵抗性（糖尿病前症）および２型糖尿病（Ｔ２ＤＭ）および腹部肥満症を含むメタボリックシンドロームの状態と密接に関連する。Ｔ２ＤＭは、ＮＡＦＬＤにおける予後不良の最も卓越した予測因子であったが、肝臓酵素の上昇は、信頼性がないと考えられている。ＮＡＳＨは、長年にわたるＴ２ＤＭの存在下で、かなりより頻繁に発症し、特発性硬変を有する患者の大部分は、肥満および／または糖尿病である。研究は、Ｔ２ＤＭおよびＮＡＦＬＤを有する患者の６０パーセントが、生検によって証明されたＮＡＳＨを有することおよび糖尿病および高血圧症を有する人の７５パーセントにおいて、いずれかの状態を有さない場合のわずか７パーセントと比較して、進行した肝線維症が存在することを実証した。Haukeland, 「Abnormal glucose tolerance is a predictor of nonalcoholic steatohepatitis and fibrosis in patients with non-alcoholic fatty liver disease」, Scand J. Gastroenterol., 40, 1469-1477 (2005)では、耐糖能障害（ＩＧＴ）およびＴ２ＤＭは、重症ＮＡＦＬＤおよびＮＡＳＨの唯一の独立リスク因子であり、オッズ比はおよそ４倍に増大することが報告された。「Clinical and histological spectrum of nonalcoholic fatty liver disease associated with normal ALT levels」, Hepatology, 37, 1286-1292 (2003)では、ＮＡＦＬＤを有する患者においてＮＡＳＨを診断するには肝臓トランスアミナーゼの上昇に関して適中率が不足していることを実証し、Ｔ２ＤＭが、進行した線維症のリスクの増大と独立して関連する唯一の因子であるとわかった研究が報告された。

したがって、ＮＡＳＨは、線維症を伴うことが頻繁にあるＴ２ＤＭの見落とされる合併症であり、患者のおよそ１０パーセントにおいて硬変をもたらし、Ｔ２ＤＭおよびＮＡＳＨを有する患者において肝細胞癌のリスクも増大される。ＮＡＦＬＤおよびＮＡＳＨを有する患者は、通常、混合脂質代謝異常および大部分は低密度粒子からなるアテローム生成的低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）表現型を含む上記のその他の代謝撹乱を示す。メタボリックシンドロームおよびＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨの両方は、高感受性Ｃ反応性タンパク質（ｈｓＣＲＰ）およびその他の炎症性サイトカインの上昇によって測定されるような心血管炎症の増大を特徴とする。

「非アルコール性脂肪性肝炎」またはＮＡＳＨは、アルコール性肝臓疾患と似ているが、アルコールをほとんど飲まないまたは全く飲まない人において生じる一般的な肝臓疾患である。ＮＡＳＨにおける主要な特色は、炎症および傷害に加え、肝臓における脂肪である。ＮＡＳＨは、肝臓が、持続的に傷害を受け、瘢痕が残り、もはや、適切に働くことができない硬変につながり得る。ＮＡＳＨは、米国集団の２〜５パーセントに影響を及ぼす。現在、ＮＡＳＨのための特定の療法は存在しない。さらなる１０〜２０パーセントの米国人は、肝臓に脂肪を有するが、実質的な炎症または肝臓傷害、「非アルコール性脂肪肝疾患」（ＮＡＦＬＤ）と呼ばれる状態は有さない。肝臓に脂肪を有することは正常ではないが、それ自体は、おそらくは、害または持続性の傷害をほとんど引き起こさない。血液試験結果または肝臓のスキャンに基づいて脂肪が疑われる場合には、この問題は、ＮＡＦＬＤと呼ばれる。この症例において肝臓生検が実施される場合には、一部の人がＮＡＳＨを有し、その他の人は、ＮＡＦＬＤを有することを示すであろう。

ＮＡＳＨは、通常、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）またはアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）などの日常的な血液検査パネル中に含まれる肝臓試験の上昇を有するとわかっている人においてまず疑われる。さらなる評価が、肝臓疾患の見かけの理由（薬物療法、ウイルス性肝炎またはアルコールの過剰の使用など）を示さない場合には、および肝臓のｘ腺または画像処理研究が脂肪を示す場合には、ＮＡＳＨが疑われる。ＮＡＳＨは、肝臓生検によって診断され、ＮＡＦＬＤから分けられる。肝臓生検のために、肝臓の小片を採取するために皮膚を通してニードルを挿入する。顕微鏡を用いる組織の検査が、肝臓細胞の炎症および傷害とともに脂肪を示す場合に、ＮＡＳＨが診断される。組織が、炎症および傷害を伴わずに脂肪を示す場合には、ＮＡＦＬＤが診断される。生検から得られる重要な情報は、肝臓において瘢痕組織が発達しているか否かである。

ＮＡＳＨは、ゆっくりと悪化し、肝臓において瘢痕または線維症を現れさせ、蓄積させ得る。線維症が悪化するにつれて、硬変が発生し、肝臓は、重症に瘢痕化し、硬化し、正常に機能できなくなる。ひとたび重篤瘢痕または硬変が存在すると、２、３の処置しか進行を停止できない。硬変を有する人は、体液貯留、筋肉消耗、腸からの出血および肝不全を起こす。肝臓移植は、肝不全を伴う進行した硬変の唯一の処置であり、ＮＡＳＨを有する人では移植がますます実施される。例えば、ＮＡＳＨは、米国では、Ｃ型肝炎およびアルコール性肝臓疾患の後ろに、硬変の主原因の１つにランクされる。

ＮＡＦＬＤまたはＮＡＳＨを予防または処置するための現在承認されている薬物はない。ＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨでは、いくつかの薬理学的介入が試みられてきたが、全体的に限定的な利益しか有さなかった。抗酸化物質は、脂質過酸化を停止し、細胞保護物質は、リン脂質膜を安定化し得るが、これらの物質の試みは不成功であるか、または中程度の利益しか有さず、これまでのところ、中でも、ウルソデオキシコール酸、ビタミンＥ（ａ−トコフェロール）およびＣならびにペントキシフィリンが挙げられる。オルリスタットなどの体重減少剤は、体重減少を達成するために食事および運動の使用だけと比較して有意な利益を有さない（「体重減少単独」）。ＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨにおけるほとんどの体重減少研究は、短期間の、成功は限定的なパイロット研究であり、壊死性炎症または線維症における中程度の改善しか報告していない。ピオグリタゾン、チアゾリンジンジオンペルオキシソーム増殖因子活性化受容体ガンマ（ＰＰＡＲガンマ）アゴニストおよびインスリン増感剤に対して、体重減少単独の無作為化二重盲検プラセボ対照６ヶ月試験（Belfort,「A placebo-controlled trial of pioglitazone in subjects with nonalcoholic steatohepatitis」, N. Engl. J. Med., 355, 2297-2307 (2006)）は、体重減少単独の改善を全く実証できなかったが、ピオグリタゾンを用いる処置は、ＮＡＳＨおよびＩＧＴまたはＴ２ＤＭを有する患者において、血糖コントロール、インスリン感受性、全身炎症の指標（ｈｓＣＲＰ、腫瘍壊死因子−ａおよびトランスフォーミング増殖因子−ベータを含む）および肝臓組織学を改善した。ピオグリタゾンを用いる処置はまた、脂肪性、肝臓性および筋肉ＩＲを軽快させ、壊死性炎症においておよそ５０パーセントの減少（ｐ＜０．００２）および線維症において３７パーセントの低減（ｐ＝０．０８）を伴った。１２ヶ月の期間のピオグリタゾンを用いる別の対照試験において肝細胞損傷および線維症の改善が最近報告されている。

対照的に、ＮＡＳＨにおける糖尿病処置のために承認されたロシグリタゾン、その他のチアゾリンジンジオンを用いる最初の無作為化臨床研究は、ＩＲ、血漿アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）レベルおよび脂肪肝（steatosis）の低減を実証したが、ロシグリタゾン処置は、壊死、炎症または線維症に対して有意な効果を有さなかった。２年の、この試験のオープンラベルフォローアップの予備的な報告も期待外れなものであり、ロシグリタゾン処置から有意な利益がなかった。したがって、ＮＡＳＨにおいて最も頑強な有効性を有する薬理学的物質は、ピオグリタゾンである。残念ながら、ピオグリタゾンはまた、女性および男性の両方において体重増加、浮腫、うっ血性心不全および骨粗鬆症骨折の大幅に増大したリスクも伴う。

通常、医薬組成物の形態の融合ポリペプチドの有効量を、それを必要とする対象に投与する。融合ポリペプチドを、単回用量または複数回用量で投与でき、投与される量および投薬計画は、選択される特定の融合タンパク質、対象の状態の重症度およびその他の因子に応じて変わる。通常の技術を有する臨床医は、いくつかのその他の因子、例えば、個体の年齢、感受性、耐性および全体的なウェルビーイングに基づいて、適当な投薬および投与計画を決定できる。

投与は、非経口的に（例えば、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内、くも膜下腔内注射または注入）、経口的に、局所的に、鼻腔内にまたは吸入によってなどの適した方法を使用して任意の適した経路によって実施できる。非経口（Parental）投与が一般に好ましい。皮下投与が好ましい。

本発明のＧＤＦ１５コンジュゲートまたはＧＤＦ１５融合ポリペプチドは、それを必要とする対象に、単独でまたは１つもしくは複数のその他の薬剤とともに投与できる。融合ポリペプチドが、別の薬剤とともに投与される場合には、薬剤は、薬剤の治療効果の重なりを提供するように同時にまたは逐次投与できる。融合ポリペプチドと組み合わせて投与できるその他の薬剤の例として、以下が挙げられる：

１．インスリン、インスリン誘導体およびミメティクスなどの抗糖尿病剤；スルホニル尿素（例えば、クロルプロパミド、トラザミド、アセトヘキサミド、トルブタミド、グリブリド、グリメピリド、グリピジド）などのインスリン分泌促進薬剤；グリブリドおよびアマリール；メグリチニド、例えば、ナテグリニドおよびレパグリニドなどのインスリン分泌性スルホニル尿素受容体リガンド；末梢組織においてインスリン作用を増強し（例えば、インスリン感作によって）、したがって、グルコース利用を促す、チアゾリジンジオン（例えば、ロシグリタゾン（アバンディア（AVANDIA））、トログリタゾン（レズリン（REZULIN））、ピオグリタゾン（アクトス（ACTOS））、バラグリタゾン、リボグリタゾン、ネトグリタゾン（netoglitazone）、トログリタゾン、エングリタゾン、シグリタゾン、アダグリタゾン（adaglitazone）、ダルグリタゾン；ＰＴＰ−１１２などのタンパク質チロシンホスファターゼ−１Ｂ（ＰＴＰ−１Ｂ）阻害剤；トルセトラピブなどのコレステリルエステル転送タンパク質（ＣＥＴＰ）、ＳＢ−５１７９５５、ＳＢ−４１９５０５２、ＳＢ−２１６７６３、ＮＮ−５７−０５４４１およびＮＮ−５７−０５４４５などのＧＳＫ３（グリコーゲンシンターゼキナーゼ−３）阻害剤；ＧＷ−０７９１およびＡＧＮ−１９４２０４などのＲＸＲリガンド；Ｔ−１０９５などのナトリウム依存性グルコース共輸送体阻害剤；ＢＡＹＲ３４０１などのグリコーゲンホスホリラーゼＡ阻害剤；メトホルミンなどのビグアナイドおよびグルコース利用を促し、肝臓グルコース産生を低減し、および／または腸のグルコース排出を減少することによって作用するその他の薬剤；アカルボースおよびミギイトイ（migiitoi）などのアルファ−グルコシダーゼ阻害剤ならびに炭水化物消化、結果として、腸からの吸収を減速し、食後高血糖症を低減するその他の薬剤；ＧＬＰ−１（グルカゴン様ペプチド−１）、エキセディン−４およびＧＬＰ−１ミメティクスなどのＧＬＰ−１類似体；ならびにビルダグリプチンなどのＤＰＰＩＶ（ジペプチジルペプチダーゼＩＶ）阻害剤、

２．３−ヒドロキシ−３−メチル−グルタリル補酵素Ａ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）レダクターゼ阻害剤、例えば、ロバスタチン、ピタバスタチン、シンバスタチン、プラバスタチン、セリバスタチン、メバスタチン、ベロスタチン（velostatin）、フルバスタチン、ダルバスタチン、アトルバスタチン、ロスバスタチンおよびリバスタチン（rivastatin）などの脂質低下剤；スクアレンシンターゼ阻害剤；ＦＸＲ（ファルネソイドＸ受容体）およびＬＸＲ（肝臓Ｘ受容体）リガンド；コレスチラミンおよびコレセベラムなどの胆汁酸捕捉剤（sequenstrants）；フィブラート；ニコチン酸およびアスピリン、

３．オルリスタット、リモナバン、フェンテルミン、トピラメート、キネクサおよびロカセリン（locaserin）などの抗肥満剤、

４．降圧剤、例えば、エタクリン酸、フロセミドおよびトルセミドなどのループ利尿薬；ベナゼプリル、カプトプリル、エナラプリル、ホシノプリル、リシノプリル、モエキシプリル、ペリンドプリル（perinodopril）、キナプリル、ラミプリルおよびトランドラプリルなどのアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤；ジゴキシンなどのＮａ−Ｋ−ＡＴＰアーゼ膜ポンプの阻害剤；サクビトリルなどの中性エンドペプチダーゼ（ＮＥＰ）阻害剤；オマパトリラト、サンパトリラット（sampatrilat）およびファシドトリルなどのＡＣＥ／ＮＥＰ阻害剤；カンデサルタン、エプロサルタン、イルベサルタン、ロサルタン、テルミサルタンおよびバルサルタンなどのアンジオテンシンＩＩアンタゴニスト、特に、バルサルタン；サクビトリルおよびバルサルタン（すなわち、エントレスト（Entresto））などのＮＥＰ阻害剤およびアンジオテンシンＩＩアンタゴニストの組合せ；ジテキレン（ditekiren）、ザンキレン（zankiren）、テルラキレン（terlakiren）、アリスキレン、ＲＯ６６−１１３２およびＲＯ−６６−１１６８などのレニン阻害剤；アセブトロール、アテノロール、ベタキソロール、ビソプロロール、メトプロロール、ナドロール、プロプラノロール、ソタロールおよびチモロールなどのβ−アドレナリン受容体ブロッカー；ジゴキシン、ドブタミンおよびミルリノンなどの変力剤；アムロジピン、ベプリジル、ジルチアゼム、フェロジピン、ニカルジピン、ニモジピン、ニフェジピン、ニソルジピンおよびベラパミルなどのカルシウムチャネルブロッカー；アルドステロン受容体アンタゴニスト；ならびにアルドステロンシンターゼ阻害剤、

５．フェノフィブラート、ピオグリタゾン、ロシグリタゾン、テサグリタザル、ＢＭＳ−２９８５８５、Ｌ−７９６４４９、国際公開第２００４／１０３９９５号パンフレットにおいて具体的に記載される化合物、すなわち、実施例１〜３５の化合物もしくは請求項２１において具体的に列挙される化合物または国際公開第０３／０４３９８５号パンフレットにおいて具体的に記載される化合物、すなわち、実施例１〜７の化合物もしくは請求項１９において具体的に列挙される化合物、特に、（Ｒ）−１−｛４−［５−メチル−２−（４−トリフルオロメチル−フェニル）−オキサゾール−４−イルメトキシ］−ベンゼンスルホニル｝−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−２−カルボキシリックまたはその塩などのペルオキシソーム増殖因子−アクチベーター受容体のアゴニスト、ならびに

６．Expert Opin Investig Drugs 2003, 12(4): 623-633、図１〜７に記載される特定の抗糖尿病化合物。

本発明はまた、本明細書において記載されるようなＧＤＦ１５コンジュゲートまたはＧＤＦ１５融合ポリペプチド（例えば、ヒト血清アルブミンまたはその機能的変異体およびヒトＧＤＦ１５タンパク質またはその機能的変異体を含む融合ポリペプチドを含む）を含む医薬組成物に関する。このような医薬組成物は、治療上有効な量の融合ポリペプチドおよび医薬上または生理学上許容される担体を含み得る。担体は、一般に、意図される投与様式に適しているように選択され、例えば、組成物のｐＨ、浸透圧、粘度、透明性、色、等張性、匂い、無菌性、安定性、溶解または放出の速度、吸着または浸透を改変する、維持するまたは保つための薬剤を含み得る。通常、これらの担体は、生理食塩水および／または緩衝媒体を含む、水性またはアルコール性／水溶液、エマルジョンまたは懸濁液を含む。

医薬組成物中に含めるのに適した薬剤として、それだけには限らないが、アミノ酸（グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジンなど）、抗菌剤、抗酸化剤（アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウムまたは亜硫酸水素ナトリウムなど）、バッファー（ホウ酸、重炭酸、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、クエン酸、リン酸またはその他の有機酸など）、増量剤（bulking agents）（マンニトールまたはグリシンなど）、キレート化剤（エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）など）、錯化剤（カフェイン、ポリビニルピロリドン、ベータ−シクロデキストリンまたはヒドロキシプロピル−ベータ−シクロデキストリンなど）、増量剤（fillers）、単糖、二糖およびその他の炭水化物（グルコース、マンノースまたはデキストリンなど）、タンパク質（遊離血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンなど）、着色剤、矯味剤および希釈剤、乳化剤、親水性ポリマー（ポリビニルピロリドンなど）、低分子量ポリペプチド、塩形成性対イオン（ナトリウムなど）、保存料（塩化ベンズアルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸または過酸化水素など）、溶媒（グリセリン、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールなど）、糖アルコール（マンニトールまたはソルビトールなど）、沈殿防止剤、界面活性剤または湿潤剤（プルロニック、ＰＥＧ、ソルビタンエステル、ポリソルベート２０またはポリソルベート８０などのポリソルベート、トリトン、トロメタミン、レシチン、コレステロールまたはチロキサパル（tyloxapal）など）、安定性増強剤（スクロースまたはソルビトールなど）、張力増強剤（塩化ナトリウムまたは塩化カリウムなどのアルカリ金属ハロゲン化物、またはマンニトール、ソルビトールなど）、送達ビヒクル、希釈剤、賦形剤および／または医薬的アジュバントが挙げられる。

非経口ビヒクルとして、塩化ナトリウム溶液、リンゲルのデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウムならびに乳酸リンゲルが挙げられる。カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ゼラチンおよびアルギン酸などの適した生理学的に許容される増粘剤が含まれ得る。静脈内ビヒクルとして、リンゲルのデキストロースをベースとするものなどの、流体および栄養補充剤および電解質補充剤が挙げられる。いくつかの場合には、組成物の張力を調整するための薬剤、例えば、医薬組成物中に糖、マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコールまたは塩化ナトリウムを含むことが好ましいであろう。例えば、多くの場合には、組成物が実質的に等張性であることが望ましい。保存料ならびに抗菌剤、抗酸化剤、キレート化剤および不活性ガスなどのその他の添加物も存在し得る。正確な処方は、投与経路に応じて変わる。医薬製剤のためのさらなる関連する原理、方法および成分は周知である（例えば、Allen, Loyd V. Ed, (2012) Remington's Pharmaceutical Sciences, 22th Editionを参照のこと）。

非経口投与が考慮される場合には、医薬組成物は、通常、滅菌、発熱物質不含、非経口的に許容される組成物の形態である。非経口注射のための特に適したビヒクルは、適切に保存された滅菌、等張性溶液である。医薬組成物は、凍結乾燥したケーキなどの凍結乾燥物の形態であり得る。

ある特定の実施形態では、医薬組成物は、皮下投与用である。ポリペプチド治療薬（例えば、抗体、融合タンパク質など）の皮下投与のための適した製剤成分および方法は、当技術分野で公知である。例えば、米国特許出願公開第２０１１／００４４９７７号明細書および米国特許第８，４６５，７３９号明細書および米国特許第８，４７６，２３９号明細書を参照のこと。通常、皮下投与のための医薬組成物は、適した安定剤（例えば、メチオニンなどのアミノ酸および／またはスクロースなどの糖類）、緩衝剤および等張化剤を含有する。

定義
用語「アミノ酸ミメティック」は、本明細書において、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と同様の方式で機能する化学物質を指す。

「保存的」アミノ酸置き換えまたは置換とは、あるアミノ酸を、同様の大きさ、形状および／または化学的特徴を有する側鎖を有する別のものと置き換えることを指す。保存的アミノ酸置き換えの例として、あるアミノ酸を、以下の群内の別のアミノ酸と置き換えることが挙げられる：１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；７）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；および８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）。

用語アルキルとは、１〜５０個の炭素原子を含む、完全飽和分岐または非分岐（または直鎖または線形）炭化水素部分を指す。好ましくは、アルキルは、５〜２０個の炭素原子、より好ましくは、１０〜１５個の炭素原子を含む。例えば、Ｃ_{１０〜１５}アルキルとは、１０〜１５個の炭素を含むアルキル鎖を指す。用語「アルキレン」とは、上記で定義されたような二価アルキルを指す。

用語「アルケニル」とは、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を有する分岐または非分岐炭化水素を指す。例えば、用語「Ｃ_２〜３８−アルケニル」とは、２〜３８個の炭素原子を有し、少なくとも１つの炭素−炭素三重を含む炭化水素を指す。

用語シクロアルキルとは、３〜１２個の炭素原子、好ましくは、３〜８個または３〜７個の炭素原子の、飽和または不飽和であるが、非芳香族単環式、二環式または三環式炭化水素基を指す。二環式および三環式シクロアルキル系について、すべての環は、非芳香族である。例えば、シクロアルキルは、シクロアルケニルおよびシクロアルキニルを包含する。用語「シクロアルケニル」とは、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を有する、３〜１２個の炭素原子の二環式または三環式炭化水素基を指す。用語「シクロアルキニル」は、少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を有する、３〜１２個の炭素原子の二環式または三環式炭化水素基を指す。

用語ヘテロアリールは、炭素原子および１〜５個のヘテロ原子から選択される５〜１０の環員を含有する単環式または二環式ヘテロアリールを含み、各ヘテロ原子は独立して、Ｏ、ＮまたはＳから選択され、ＳおよびＮは、種々の酸化状態に酸化され得る。二環式ヘテロアリール系について、系は、完全に芳香族である（すなわち、すべての環が芳香族である）。

用語ヘテロシクリルは、Ｏ、ＳおよびＮから選択される少なくとも１個のヘテロ原子を含有し、ＮおよびＳがまた、任意選択で、種々の酸化状態に酸化され得る、飽和または不飽和非芳香族（部分不飽和であるが、非芳香族）単環式、二環式または三環式系を指す。一実施形態では、ヘテロシクリル部分は、５〜７個の環原子を含有し、Ｏ、ＳまたはＮから選択されるさらなるヘテロ原子を任意選択で含有する飽和単環式環に相当する。複素環式環は、アルキル、ハロ、オキソ、アルコキシ、ハロアルキル、ハロアルコキシで置換され得る。その他の実施形態では、ヘテロシクリルは、二環式または三環式である。多環式系について、いくつかの環は、芳香族であり、飽和または部分飽和環（単数または複数）に縮合され得る。全体に縮合された系は、完全芳香族ではない。例えば、複素環式環系は、飽和または部分飽和シクロアルキル環系と縮合された芳香族ヘテロアリール環であり得る。

用語アリールとは、環部分中に６〜１０個の炭素原子を有する単環式または二環式芳香族炭化水素基を指す。アリールの代表例として、フェニルまたはナフチルがある。

用語「有効量」は、投与の条件下で所望の治療効果を達成するのに十分な量、例えば、空腹時血糖値（ＦＰＧ）を低下させ、体重を減少させ、コレステロールおよびトリグリセリド（ＴＧ）などの血中脂質を低減させ、肝臓酵素を低減させ、高密度リポタンパク質コレステロール（ＨＤＬ−Ｃ）レベルを上げ、血圧を低下させるのに十分な量を指す。例えば、ＮＡＳＨまたはＮＡＦＬＤを呈している、患っている、または患う傾向がある患者に投与される「治療上有効な量」のＧＤＦ１５治療剤は、病理学的症状、疾患進行、前述の障害に屈することに対する抵抗性と関連する、またはそれを誘導する生理学的状態の改善を引き起こすような量である。

「機能的変異体」および「生物学的に活性な変異体」とは、配列置き換え、欠失または付加（例えば、ＨＳＡまたはＩｇＦｃ融合ポリペプチド）、および／または非ポリペプチド部分（例えば、ＰＥＧ、脂肪酸）の付加によって参照ポリペプチド（例えば、ＨＳＡ、ヒトＩｇＦｃ、ヒト野生型成熟ＧＤＦ１５ペプチド）とは異なっているが、参照ポリペプチドの所望の機能活性を保持するアミノ酸配列を含有するポリペプチドを指す。機能的変異体のアミノ酸配列は、参照ポリペプチドに対して１つまたは複数のアミノ酸置き換え、付加または欠失を含み得、所望の活性を保持する参照ポリペプチドの断片を含む。

例えば、ＳＡ（例えば、ＨＳＡ）の機能的変異体は、参照ＧＤＦ１５（例えば、ヒトＧＤＦ１５）ポリペプチドの活性（例えば、体重減少、食欲抑制、インスリン放出、インスリン感受性および／または脂肪量減少）活性を保持しながら、ＧＤＦ１５の半減期と比較して本明細書において記載される融合ポリペプチドの血清半減期を延ばす。理想的には生物学的に活性なポリペプチドは、その野生型タンパク質対応物（参照アミノ酸配列を含有するタンパク質）に対して同様のまたは増強された生物学的特性を有するが、その野生型版に対して幾分か減少したレベルの活性を有するポリペプチド変異体は、それにもかかわらず、機能的または生物学的に活性なポリペプチド変異体であると考えられ得る。

「同一性」とは、核酸またはポリペプチド分子のヌクレオチドまたはアミノ酸配列との関連で、２つのこのような分子間の全体的な関連性を意味する。２つの配列の配列同一性パーセント（ヌクレオチドまたはアミノ酸配列同一性）の算出は、例えば、最適比較目的で２つの配列をアラインすることによって実施できる（例えば、最適アラインメントのために第１および第２の核酸またはアミノ酸配列の一方または両方にギャップを導入してもよい）。次いで、対応する位置のヌクレオチドまたはアミノ酸を比較する。第１の配列中の位置が、第２の配列中の対応する位置と同じヌクレオチドまたはアミノ酸によって占められている場合には、分子はその位置で同一である。２つの配列間の同一性パーセントは、２つの配列の最適アラインメントのために導入されることが必要であるギャップの数および各ギャップの長さを考慮した、配列によって共有される同一位置の数の関数である。２つの配列間の配列の比較および同一性パーセントの決定は、数的アルゴリズムを使用して達成できる。例えば、２つの配列間の同一性パーセントは、ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）によって記載されたものなどの方法を使用して決定できる。例えば、２つの配列間の同一性パーセントは、Ｃｌｕｓｔａｌ２．０マルチプル配列アラインメントプログラムおよびデフォルトパラメータを使用して決定できる。Larkin MA et al. (2007) 「Clustal W and Clustal X version 2.0.」 Bioinformatics 23(21): 2947-2948。

用語「部分」は、本明細書において、本明細書において記載される融合ポリペプチド（例えば、ＨＳＡ−ＧＤＦ１５）または脂肪酸コンジュゲート（例えば、ＡＨＡ−（２００〜３０８）−ｈＧＤＦ１５）の一部を指す。本発明の方法において使用される融合タンパク質は、例えば、ＧＤＦ１５に由来するアミノ酸配列を含有するＧＤＦ１５部分およびＳＡに由来するアミノ酸配列を含有するＳＡ部分を含む。本発明の方法において使用される脂肪酸コンジュゲートは、例えば、ＧＤＦ１５に由来するアミノ酸配列を含有するＧＤＦ１５部分および脂肪酸部分、例えば、本明細書においてさらに記載される式のうちの１つを含む脂肪酸を含む。用語「部分」はまた、本発明の方法において使用される脂肪酸コンジュゲートまたは融合タンパク質を含むリンカーまたは機能的分子（例えば、ＰＥＧ）を指す場合もある。融合タンパク質は、任意選択で、融合ポリペプチドにおいてＧＤＦ１５部分とＳＡ部分を連結するリンカー部分を含有する。

いかなる特定の理論にも捉われることを望むことなく、ＧＤＦ１５部分は、食欲を減少させる、体重減少を促す、ならびに肥満症およびその他の代謝疾患を処置する生物学的機能を付与し、ＳＡ部分は、血清半減期を延ばし、本明細書において記載される融合ポリペプチドの発現および安定性を改善すると考えられる。

用語「天然に存在する」とは、核酸分子、ポリペプチド、宿主細胞などといった生物学的材料に関連して使用される場合には、天然に見出される、人によって操作されていない材料を指す。同様に、「天然に存在しない」とは、本明細書において、天然に見出されない、または構造的に修飾されている、もしくは人によって合成されている材料を指す。ヌクレオチドに関連して使用される場合には、用語「天然に存在する」とは、塩基アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）およびウラシル（Ｕ）を指す。アミノ酸に関連して使用される場合には、用語「天然に存在する」とは、２０種の通常のアミノ酸（すなわち、アラニン（Ａ）、システイン（Ｃ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、フェニルアラニン（Ｆ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、リジン（Ｋ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、アスパラギン（Ｎ）、プロリン（Ｐ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）、トリプトファン（Ｗ）およびチロシン（Ｙ））ならびにセレノシステイン、ピロリジン（ＰＹＬ）およびピロリン−カルボキシ−リジン（ＰＣＬ）を指す。

「非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）」は、アルコールの摂取と関連しない、肝細胞の脂肪変化を特徴とする、小葉内炎症および線維症が付随して起こる肝臓疾患である。

ＮＡＳＨは、一般的な、多くの場合「サイレント」の、肝臓疾患である。それは、アルコール性肝臓疾患と似ているが、アルコールをほとんど飲まないまたは全く飲まない人において生じる。ＮＡＳＨにおける主要な特色は、炎症および傷害に加え、肝臓における脂肪である。ＮＡＳＨを有するほとんどの人は、体調が良く、彼らは肝臓の問題を有するとは気づかない。それにもかかわらず、ＮＡＳＨは、重症である場合もあり、肝臓が持続性に傷害を受け、瘢痕が残り、もはや、適切に働くことができない硬変につながり得る。

ＮＡＦＬＤは、慢性肝臓疾患対象において一般的な脂肪肝（fatty liver）疾患である。過剰な肝臓脂肪は、肝臓合併症につながり得る。アルコールと関連しないが、これらの状態は、肥満症、食事およびその他の健康と関連する問題と関連し得る。

肝臓酵素が上昇した個体および／または脂肪肝（fatty liver）（例えば、超音波または脂肪肝（fatty liver）指数によって決定される）を有するものは、ＮＡＳＨまたはＮＡＦＬＤを有すると考えられる。酵素、脂肪または脂肪肝（fatty liver）指数の低減は、状態の改善または補正された状態の指標である。

「アルコール性脂肪性肝炎（ＡＳＨ）」は、アルコール性脂肪性肝炎（ＡＳＨ）は、アルコール性肝臓疾患の重篤な合併症である。ＡＳＨの診断は、脂肪肝（steatosis）の関連、バルーニング変性を有する肝細胞損傷のエビデンスおよび肝臓生検での多核好中球浸潤を必要とする。

ＮＡＳＨおよびＡＳＨは、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）およびアルコール性脂肪肝（fatty liver）疾患（ＡＦＬＤ）の進行した段階である。ＮＡＦＬＤは、慢性肝臓疾患の任意のその他の明らかな原因（ウイルス、自己免疫、遺伝的など）を伴わない、アルコール摂取≦２０〜３０ｇ／日を伴う、肝臓における過剰な脂肪蓄積（脂肪肝（steatosis））を特徴とする。反対に、ＡＦＬＤは、脂肪肝（steatosis）の存在およびアルコール摂取＞２０〜３０ｇ／日として定義される。原発性ＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨの最も一般的な表現型の徴候は、過体重／肥満症、内臓脂肪症、２型糖尿病、高トリグリセリド血症および高血圧症である。

本明細書において、用語「変異体」、「突然変異体」ならびに任意の同様の用語は、ＧＤＦ１５またはＳＡまたはその特定の版（例えば、「ＧＤＦ１５変異体」、「ヒトＧＤＦ１５変異体」など）に関連して使用される場合には、修飾、末端切断、欠失を含むタンパク質もしくはポリペプチド配列または天然に存在する（すなわち、野生型）タンパク質もしくはポリペプチド対応物もしくは対応する天然配列のその他の変異体を定義する。「ＧＤＦ１５変異体」は、例えば、本明細書において記載されるような、および文献において公知の野生型（すなわち、天然に存在する）ＧＤＦ１５タンパク質に関連して記載される。

「対象」は、ＧＤＦ１５融合ポリペプチドまたはＧＤＦ１５コンジュゲート（例えば、通常、医薬組成物の形態の）が投与される個体である。対象は、好ましくは、ヒトであるが、「対象」は、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、ラット、マウスなどのペットおよび家畜動物またはその他のウシ、ヒツジ、ウマ、イヌ、ネコ、げっ歯類またはマウス種、家禽類および魚類を含む。

用語「ＧＤＦ１５治療剤」は、本明細書において、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）および非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）ならびにそれだけには限らないがアルコール性脂肪性肝炎（ＡＳＨ）、末期肝臓疾患、脂肪肝（hepatic steatosis）（脂肪肝（fatty liver））、肝臓線維症、肝臓炎症、肝硬変、原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）および肝細胞癌（ＨＣＣ）または同様の状態を含む関連状態を処置するために、対象に投与される、ＧＤＦ１５ポリペプチド、ＧＤＦ１５変異体、ＧＤＦ１５融合タンパク質またはＧＤＦ１５コンジュゲート（例えば、ＧＤＦ１５脂肪酸コンジュゲート）またはそれらのうちの１つもしくは複数を含む医薬組成物を意味する。

用語「コンジュゲート」および「脂肪酸コンジュゲート」は、同義的に使用され、ポリペプチドまたはタンパク質（またはその断片および／または変異体）を、脂肪酸部分と任意選択でリンカーを介して共有結合によって付加させた結果として形成された実体を指すものとする。

「リボ核酸」（ＲＮＡ）は、リン酸ジエステル結合によって連結されるヌクレオチドのポリマーであり、ここで、各ヌクレオチドは、リボースまたは糖成分としてのその修飾を含有する。各ヌクレオチドは、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、ウラシル（Ｕ）または塩基としてのその修飾を含有する。ｍＲＮＡ分子中の遺伝情報は、ｍＲＮＡ分子のヌクレオチド塩基の配列においてコードされ、これは、それぞれ３ヌクレオチド塩基からなるコドンに配置される。各コドンは、翻訳（タンパク質合成）を終結させる停止コドンを除いて、ポリペプチドの特定のアミノ酸をコードする。生細胞内で、ｍＲＮＡは、リボソーム、タンパク質合成部位に輸送され、ここで、タンパク質合成（翻訳）のために遺伝情報を提供する。さらなる説明のために、Alberts B et al. (2007) Molecular Biology of the Cell, Fifth Edition, Garland Scienceを参照のこと。

本明細書において、用語「ポリペプチド」は、天然に産生されようと、または合成によって生成されようと、ペプチド結合によって連結されるアミノ酸残基のポリマーを指す。約１０個未満のアミノ酸残基のポリペプチドは、一般に、「ペプチド」と呼ばれる。用語「ペプチド」は、ペプチド結合によって連結される２個以上のアミノ酸の配列を示すものとし、前記アミノ酸は、天然であっても、非天然であってもよい。この用語は、例えば、システイン架橋などの共有結合相互作用または非共有結合相互作用によって、一緒に保持される２つ以上のペプチドからなり得る、用語ポリペプチドおよびタンパク質を包含する。当技術分野において認識される３文字または１文字略語が、本発明のペプチドおよびポリペプチドを構成するアミノ酸残基を表すために使用される。「Ｄ」が先行する場合を除き、アミノ酸は、Ｌ−アミノ酸である。１文字略語が大文字である場合には、Ｄ−アミノ酸を指す。１文字略語が小文字である場合には、Ｌ−アミノ酸を指す。ペプチドを表すために、群または文字列またはアミノ酸略語が使用される。ペプチドは、Ｎ末端を左に示され、配列は、Ｎ末端からＣ末端に書かれる。

本発明のペプチドは、非天然アミノ酸（すなわち、天然に生じない化合物）および当技術分野で公知であり、代わりに使用され得るようなその他のアミノ酸類似体を含有する。

特定の非天然アミノ酸を、Deiters et al., J Am Chem Soc 125:11782-11783, 2003; Wang and Schultz, Science 301:964-967, 2003；Wang et al., Science 292:498-500, 2001; Zhang et al., Science 303:371-373, 2004に、または米国特許第７，０８３，９７０号明細書に記載される技術によって導入できる。手短には、これらの発現系のうちいくつかは、本発明のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム中にアンバーＴＡＧなどのナンセンスコドンを導入するために部位特異的突然変異誘発を含む。次いで、このような発現ベクターは、導入されるナンセンスコドンに特異的なｔＲＮＡを利用できる宿主中に導入され、選択した非天然アミノ酸が入れられる。部分を本発明のポリペプチドにコンジュゲートする目的にとって有益である特定の非天然アミノ酸として、アセチレンおよびアジド側鎖を有するものが挙げられる。

「タンパク質」は、１つまたは複数のポリペプチド鎖を含む高分子である。タンパク質はまた、炭水化物基などの非ペプチド成分を含み得る。炭水化物およびその他の非ペプチド置換基が、タンパク質が産生される細胞によってタンパク質に付加され得、これは、細胞の種類に応じて変わる。タンパク質は、そのアミノ酸骨格構造の点で本明細書において定義され、炭水化物基などの置換基は、一般に特定されないが、それにもかかわらず存在し得る。非宿主ＤＮＡ分子によってコードされるタンパク質またはポリペプチドは、「異種」タンパク質またはポリペプチドである。

「単離されたポリペプチドまたは単離されたタンパク質」は、天然にポリペプチドと関連する炭水化物、脂質またはその他のタンパク質性不純物などの細胞性成分を本質的に含まないポリペプチドまたはタンパク質（例えば、ＧＤＦ１５）である。通常、単離ポリペプチドまたはタンパク質の調製物は、高度に精製された形態の、すなわち、少なくとも約８０％純粋な、少なくとも約９０％純粋な、少なくとも約９５％純粋な、９５％を超えて純粋な、例えば、９６％、９７％または９８％もしくはそれを超えて純粋な、または９９％を超えて純粋なポリペプチドまたはタンパク質を含有する。特定のタンパク質調製物が、単離されたポリペプチドまたはタンパク質を含有することを示す１つの方法は、タンパク質調製物のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびゲルのクマシーブリリアントブルー染色後の単一バンドの出現によってである。しかし、用語「単離された」は、二量体または代替としてグリコシル化された、または誘導体化された形態などの、代替物理的形態での同じポリペプチドまたはタンパク質の存在を排除しない。好ましくは、単離されたポリペプチドは、その治療的、診断的、予防的もしくは研究使用を干渉する天然環境において見出される、任意のその他の混入ポリペプチドまたはその他の混入物を実質的に含まない。

当業者ならば、本明細書において記載されるポリペプチドまたはタンパク質のいずれかの配列において、必ずしもその活性を減少させずに、種々のアミノ酸置換、例えば、保存的アミノ酸置換を行うことができることを承知しているであろう。本明細書において、「その置換基として一般的に使用されるアミノ酸」は、保存的置換（すなわち、匹敵する化学的特徴のアミノ酸との置換）を含む。保存的置換の目的で、非極性（疎水性）アミノ酸として、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンが挙げられる。極性（親水性の）、中性アミノ酸として、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンが挙げられる。正電荷を有する（塩基性）アミノ酸として、アルギニン、リジンおよびヒスチジンが挙げられる。負電荷を有する（酸性）アミノ酸として、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。アミノ酸置換の例として、Ｌ−アミノ酸でその対応するＤ−アミノ酸を置換すること、システインでホモシステインまたはチオール含有側鎖を有するその他の非天然アミノ酸を置換すること、リジンでホモリジン、ジアミノ酪酸、ジアミノプロピオン酸、オルニチンまたはアミノ含有側鎖を有するその他の非天然アミノ酸を置換することまたはアラニンでノルバリンを置換することなどが挙げられる。

用語「アミノ酸」とは、本明細書において、その構造がそのような立体異性形を可能にする場合にはすべてそのＤおよびＬ立体異性体の、天然に存在するアミノ酸、非天然アミノ酸、天然に存在するアミノ酸と同様の方式で機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸ミメティクスを指す。アミノ酸は、その名称、その一般的に公知の３文字記号によって、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学的命名法委員会（ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＮｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅＣｏｍｍｉｓｓｉｏｎ）によって推奨される１文字記号のいずれかによって、本明細書において呼ばれる。

用語「天然に存在する」とは、天然に見出される、人によって操作されていない材料を指す。同様に、「天然に存在しない」、「非天然」などは、本明細書において、天然に見出されない、または構造的に修飾されている、もしくは人によって合成されている材料を指す。アミノ酸に関連して使用される場合には、用語「天然に存在する」とは、２０種の通常のアミノ酸（すなわち、アラニン（ＡまたはＡｌａ）、システイン（ＣまたはＣｙｓ）、アスパラギン酸（ＤまたはＡｓｐ）、グルタミン酸（ＥまたはＧｌｕ）、フェニルアラニン（ＦまたはＰｈｅ）、グリシン（ＧまたはＧｌｙ）、ヒスチジン（ＨまたはＨｉｓ）、イソロイシン（ＩまたはＩｌｅ）、リジン（ＫまたはＬｙｓ）、ロイシン（ＬまたはＬｅｕ）、メチオニン（ＭまたはＭｅｔ）、アスパラギン（ＮまたはＡｓｎ）、プロリン（ＰまたはＰｒｏ）、グルタミン（ＱまたはＧｌｎ）、アルギニン（ＲまたはＡｒｇ）、セリン（ＳまたはＳｅｒ）、トレオニン（ＴまたはＴｈｒ）、バリン（ＶまたはＶａｌ）、トリプトファン（ＷまたはＴｒｐ）およびチロシン（ＹまたはＴｙｒ））を指す。

用語「非天然（non-natural）アミノ酸」および「非天然（unnatural）アミノ酸」は、本明細書において、任意の生物に由来する修飾されていないまたは修飾された遺伝子を使用して、同じ生物であろうと異なる生物であろうと任意の生物において生合成によって作製され得ないアミノ酸構造を同義的に表すよう意図される。この用語は、本発明の天然に存在する（野生型）タンパク質配列（単数または複数）中に存在しないアミノ酸残基を指す。これらとして、それだけには限らないが、修飾されたアミノ酸および／または２０種の天然に存在するアミノ酸のうちの１種ではないアミノ酸類似体、セレノシステイン、ピロリジン（Ｐｙｌ）またはピロリン−カルボキシ−リジン（Ｐｃｌ、例えば、ＰＣＴ国際公開第２０１０／４８５８２号パンフレットに記載されるような）が挙げられる。このような非天然アミノ酸残基は、天然に存在するアミノ酸の置換によって、および／または本発明の天然に存在する（野生型）タンパク質配列（単数または複数）中への非天然アミノ酸の挿入によって導入され得る。非天然アミノ酸残基はまた、所望の機能、例えば、機能的部分（例えば、ＰＥＧ）を連結する能力が分子に与えられるように組み込まれ得る。アミノ酸に関連して使用される場合には、記号「Ｕ」は、本明細書において、「非天然（non-natural）アミノ酸」および「非天然（unnatural）アミノ酸」を意味するものとする。

ポリペプチドまたはタンパク質に関して用語「類似体」は、本明細書において、ペプチド／タンパク質の１個または複数のアミノ酸残基が、その他のアミノ酸残基によって置換されている、および／または１個または複数のアミノ酸残基が、ペプチド／タンパク質から欠失している、および／または１個または複数のアミノ酸残基が、ペプチド／タンパク質に付加されている、修飾されたペプチドまたはタンパク質を意味する。アミノ酸残基のこのような付加または欠失は、ペプチドのＮ末端で、および／またはペプチドのＣ末端で起こり得る。

用語「ＧＤＦ１５ポリペプチド」および「ＧＤＦ１５タンパク質」は、同義的に使用され、ヒトまたはマウスなどの哺乳動物において発現される天然に存在する野生型ポリペプチドを意味する。本開示の目的のために、用語「ＧＤＦ１５タンパク質」は、２０個のアミノ酸のシグナルペプチド、１６７個のアミノ酸のプロドメインおよびフリン様プロテアーゼによってプロドメインから切り出される１１２個のアミノ酸の成熟ドメインを含有する３０８個のアミノ酸残基（ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００４８５５．２）からなる任意の全長ＧＤＦ１５ポリペプチドを指すように同義的に使用され得る。３０８個のアミノ酸のＧＤＦ１５ポリペプチドは、「全長」ＧＤＦ１５ポリペプチドと呼ばれ、１１２個のアミノ酸のＧＤＦ１５ポリペプチド（例えば、アミノ酸１９７〜３０８）は、「成熟」ＧＤＦ１５ポリペプチドである。成熟ＧＤＦ１５ペプチドは、システインノットモチーフ（３つの鎖内ジスルフィド結合を有する）およびＴＧＦβスーパーファミリーメンバーにとって通常である単一の鎖間ジスルフィド結合の形成に必要な７個の保存されたシステイン残基を含有する。成熟ＧＤＦ１５ペプチドは、第４の鎖内ジスルフィド結合およびＮ末端ループを形成する２個のさらなるシステイン残基を含有する。ＧＤＦ１５タンパク質またはポリペプチドは、したがって、タンパク質の多量体、より詳しくは、二量体も含む。

用語「ＧＤＦ１５変異体」は、天然に存在するＧＤＦ１５ポリペプチド配列が修飾されているＧＤＦ１５ポリペプチドを包含する。このような修飾は、それだけには限らないが、天然に存在しないアミノ酸、天然に存在しないアミノ酸類似体およびアミノ酸ミメティクスとの置換を含む１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。

一態様では、用語「ＧＤＦ１５変異体」は、天然ＧＤＦ１５ポリペプチドの所与の位置に通常見出される少なくとも１個の残基が、欠失されている、または天然ＧＤＦ１５配列中のその位置に通常見出されない残基によって置き換えされているＧＤＦ１５タンパク質配列を指す。いくつかの場合には、天然ＧＤＦ１５ポリペプチドの所与の位置に通常見出される単一残基を、その位置に通常見出されない２個以上の残基と置き換えることが望ましく、さらにその他の場合には、天然ＧＤＦ１５ポリペプチド配列を維持し、タンパク質中の所与の位置に１個または複数の残基を挿入することが望ましい場合があり、さらにその他の場合には、所与の残基を完全に欠失することが望ましい場合があり、これらの構築物のすべては、用語「ＧＤＦ１５変異体」によって包含される。本発明の方法はまた、このようなＧＤＦ１５変異体ポリペプチド配列をコードする核酸分子を包含する。

種々の実施形態では、ＧＤＦ１５変異体は、天然に存在するＧＤＦ１５タンパク質に対して少なくとも約８５パーセント同一であるアミノ酸配列を含む。その他の実施形態では、ＧＤＦ１５ポリペプチドは、天然に存在するＧＤＦ１５ポリペプチドアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％または約９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。このようなＧＤＦ１５突然変異体ポリペプチドは、好ましくは、血中グルコース、インスリン、トリグリセリドもしくはコレステロールレベルを低下させる能力、体重を減少させる能力または耐糖能、エネルギー消費もしくはインスリン感受性を改善する能力または非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）および非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）ならびに末期肝臓疾患、脂肪肝（hepatic steatosis）（脂肪肝（fatty liver））、肝臓線維症、肝臓炎症、肝硬変、原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）および肝細胞癌（ＨＣＣ）を処置する、予防するもしくは軽快させる能力など、野生型ＧＤＦ１５突然変異体ポリペプチドの少なくとも１つの活性を有するが、必ずしも有する必要はない。

ＧＤＦ１５ポリペプチドおよびＧＤＦ１５突然変異体ポリペプチドおよびこのようなポリペプチドを含む構築物は、主にヒトＧＤＦ１５の点で開示されるが、本発明はまた、そのように制限されず、ＧＤＦ１５ポリペプチドおよびＧＤＦ１５突然変異体ポリペプチドならびにＧＤＦ１５ポリペプチドおよびＧＤＦ１５突然変異体ポリペプチドが、その他の種（例えば、カニクイザル、マウスおよびラット）に由来するこのようなポリペプチドを含む構築物に及ぶ。いくつかの場合には、ＧＤＦ１５ポリペプチドまたはＧＤＦ１５突然変異体ポリペプチドを、対象において代謝障害を処置する、または軽快させるために、対象と同じ種に由来するＧＤＦ１５突然変異体ポリペプチドの成熟形態で使用できる。

ＧＤＦ１５突然変異体ポリペプチドは、好ましくは、生物学的に活性である。種々のそれぞれの実施形態では、ＧＤＦ１５ポリペプチドまたはＧＤＦ１５突然変異体ポリペプチドは、成熟ＧＤＦ１５タンパク質の天然に存在する形態のものと同等である、それより大きいまたはそれより小さい生物学的活性を有する。生物学的活性の例として、血中グルコース、インスリン、トリグリセリドまたはコレステロールレベルを低下させる能力、体重を減少させる能力または耐糖能、脂質耐性もしくはインスリン感受性を改善する能力、尿中グルコースおよびタンパク質排泄を低下させる能力、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）および非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）ならびに末期肝臓疾患、脂肪肝（hepatic steatosis）（脂肪肝（fatty liver））、肝臓線維症、肝臓炎症、肝硬変、原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）および肝細胞癌（ＨＣＣ）を処置する能力が挙げられる。

本明細書において、ポリペプチドまたはタンパク質の構造との関連で、用語「Ｎ末端」（または「アミノ末端」）および「Ｃ末端」（または「カルボキシル末端」）とは、それぞれ、ポリペプチドの最も端のアミノおよびカルボキシル末端を指す。

用語「治療用ポリペプチド」または「治療用タンパク質」は、本明細書において、治療的使用のために開発されている、または治療的使用のために開発されたポリペプチドまたはタンパク質を意味する。

行われた実験および達成された結果を含む以下の実施例は、単に例示目的で提供され、本発明を制限すると解釈されてはならない。

［実施例１］
ＧＤＦ１５コンジュゲートは、肥満マウスにおいて糖尿病および脂肪肝（fatty liver）疾患を含む代謝疾患の尺度を改善する
食餌誘発性肥満マウスに、ビヒクルまたは脂肪酸−ＧＤＦ１５（０．５ｍｇ／ｋｇ／ｓ．ｃ．）を週に１回、４週間投薬した。第１の用量の２週間後に非絶食グルコースおよびインスリンを測定し、第１の用量の４週間後に一晩絶食血中グルコースおよびインスリンを測定した。脂肪酸−ＧＤＦ１５は、非絶食グルコースを２３％低減させた（２０７．１ｍｇ／ｄｌビヒクル処置対１６０．４ｍｇ／ｄｌ脂肪酸−ＧＤＦ１５；ｐ＜０．０５）。脂肪酸−ＧＤＦ１５は、ビヒクル処置マウスと比較して非絶食インスリンレベルを７５％低減させた（２．１対８．７ｎｇ／ｍｌ；ｐ＜０．０５）。最初の用量の４週間後、脂肪酸−ＧＤＦ１５は、絶食血中グルコースを２８％低減させ（１４２．７対１９９．５ｍｇ／ｄｌ；ｐ＜０．０５）、絶食インスリンを、７８％低減させた（０．７７対３．５ｎｇ／ｍｌ；ｐ＜０．０５）。脂肪肝（fatty liver）疾患のマーカーもまた、４回の脂肪酸−ＧＤＦ１５の週に１回の用量によって改善された。脂肪酸−ＧＤＦ１５は、脂肪肝（hepatic steatosis）を５７．５％低減させ（１１．３６対２６．７３％肝臓脂肪；ｐ＜０．０５）、肝細胞傷害のマーカー、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）の血清レベルを５８％低減させた（４６．２対１１０．５Ｕ／Ｌ；ｐ＜０．０５）。さらに、脂肪酸−ＧＤＦ１５は、ＰＮＰＬＡ３、進行性の肝臓疾患における原因遺伝子の肝臓発現を７７％減少させ（ｐ＜０．０５）、その産生が肝臓線維症と相関するＣＯＬ１Ａ１またはＩ型コラーゲンの肝臓発現を５７％減少させる（ｐ＜０．０５）と示された。食事誘発性肥満マウスの、マウス血清アルブミン−ＧＤＦ１５融合タンパク質（配列番号９）を用いる処置は、脂肪酸−ＧＤＦ１５について上記で示される研究のエンドポイントのすべてについて同様の結果を与えた。

［実施例２］
脂肪酸−ＧＤＦ１５コンジュゲートは、レプチン欠損ｏｂ／ｏｂマウスにおける脂肪肝（fatty liver）を含む代謝疾患の尺度を改善する
レプチン欠損肥満（ｏｂ／ｏｂ）マウスは、標準固形飼料食で脂肪肝（hepatic steatosis）になる傾向がある。しかし、トランス脂肪、フルクトースおよびコレステロールが高い食餌（例えば、Ｄ０９１００３０１、ＲｅｓｅａｒｃｈＤｉｅｔｓ、Ｉｎｃ．、ＮｅｗＢｒｕｎｓｗｉｃｋ、ＮＪ）では、脂肪肝（hepatic steatosis）が増悪され、肝臓線維症が発生する。ｏｂ／ｏｂマウスが高トランス脂肪、フルクトースおよびコレステロール食を給餌された場合には、体重ならびに循環コレステロールおよび肝臓酵素もまた増大する。したがって、このマウス系統および食餌の組合せが、薬理学的介入に対して応答性であるヒトＮＡＦＬＤおよびＮＡＳＨのモデルとして研究されてきた（Trevaskis JL, et al. (2012) Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 302:G762-G772）。外因性ＧＤＦ１５は、ｏｂ／ｏｂマウスにおいて食欲不振および体重減少を誘導する（Johnen H、et al. (2007) Nat Med 13:1333-1340）。したがって、本発明者らは、ＮＡＦＬＤおよびＮＡＳＨ誘発性高トランス脂肪、フルクトースおよびコレステロール食でのｏｂ／ｏｂマウスにおける脂肪肝（fatty liver）を含む、代謝疾患の尺度に対するＧＤＦ１５タンパク質投与の効果を試験した。

高トランス脂肪、高フルクトースおよび高コレステロール食でのレプチン欠損ｏｂ／ｏｂマウスにおける脂肪酸−ＧＤＦ１５の６週間の研究
レプチン欠損肥満（ｏｂ／ｏｂ）マウスに、トランス脂肪、フルクトースおよびコレステロールが高い食餌（Ｄ０９１００３０１、ＲｅｓｅａｒｃｈＤｉｅｔｓ、Ｉｎｃ．、ＮｅｗＢｒｕｎｓｗｉｃｋ、ＮＪ）を６週間給餌した。食餌で２週間後、マウスに、ビヒクル（３０ｍＭＮａＯＡｃ、ｐＨ４．０）、０．０１２５ｍｇ／ｋｇ脂肪酸−ＧＤＦ１５コンジュゲートまたは０．５ｍｇ／ｋ脂肪酸−ＧＤＦ１５コンジュゲートのいずれかを用いて４週間、週に１回皮下注射した。体重および食物摂取を週に１回測定した。血清化学解析のために、処置の２および４週間後に血清を採取した。動物を、血清採取の前に４時間の絶食に付した。最初の注射の４週間後、０．０１２５ｍｇ／ｋｇ脂肪酸−ＧＤＦ１５コンジュゲートを用いる処置は、３％のビヒクル調整された体重減少をもたらし、０．５ｍｇ／ｋｇ脂肪酸−ＧＤＦ１５コンジュゲートを用いる処置は、１５％のビヒクル調整した体重減少をもたらした（図１Ａ）。体重減少は、最初の２週間の処置の間のビヒクル対照と比較した累積食物摂取量の低下と一致した（０．０１２５ｍｇ／ｋｇ群において１０％、０．５ｍｇ／ｋｇ群において３０％）（図１Ｂ）。

０．０１２５ｍｇ／ｋｇ脂肪酸−ＧＤＦ１５コンジュゲートを用いる処置は、総肝臓重量および脂肪肝（hepatic steatosis）（Ｂｒｕｋｅｒｍｉｎｉｓｐｅｃ体組成分析計で測定された）を、ビヒクル処置されたマウスと比較してそれぞれ１０％および５％低減させ、０．５ｍｇ／ｋｇ脂肪酸−ＧＤＦ１５コンジュゲートを用いる処置は、総肝臓重量および脂肪肝（hepatic steatosis）を、それぞれ４０％および２０％低減させた（図２Ａ〜Ｂ）。０．０１２５ｍｇ／ｋｇまたは０．５ｍｇ／ｋｇ脂肪酸−ＧＤＦ１５コンジュゲートを用いる処置は、肝臓傷害の血清マーカー（ＡＬＴ（それぞれ、３０％および４５％）、ＡＳＴ（それぞれ、２９％および３１％）およびＡＬＰ（それぞれ、１２％および２８％））を、ビヒクル処置された動物と比較して低減させた（ＲｏｃｈｅＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓＣｏｂａｓ６０００シリーズ分析計で測定された）（表２）。０．０１２５ｍｇ／ｋｇまたは０．５ｍｇ／ｋｇ脂肪酸−ＧＤＦ１５コンジュゲートを用いる処置はまた、血漿トリグリセリド（それぞれ、１３％および３６％）およびコレステロールレベル（それぞれ、４％および１８％）も、ビヒクル処置された動物と比較して低減させた（表３）。グルコースレベルは、ビヒクル処置された動物と比較して０．５ｍｇ／ｋｇ群において１７％低減された。

高トランス脂肪、高フルクトースおよび高コレステロール食でのレプチン欠損ｏｂ／ｏｂマウスにおける脂肪酸−ＧＤＦ１５の１６週間の研究
レプチン欠損肥満（ｏｂ／ｏｂ）マウスに、トランス脂肪、フルクトースおよびコレステロールが高い食餌（Ｄ０９１００３０１、ＲｅｓｅａｒｃｈＤｉｅｔｓ、Ｉｎｃ．、ＮｅｗＢｒｕｎｓｗｉｃｋ、ＮＪ）を１６週間給餌した。食餌で８週間後、マウスに、ビヒクル（３０ｍＭＮａＯＡｃ、ｐＨ４．０）、０．０１２５ｍｇ／ｋｇ脂肪酸−ＧＤＦ１５コンジュゲートまたは０．５ｍｇ／ｋ脂肪酸−ＧＤＦ１５コンジュゲートのいずれかを用いて８週間、週に１回皮下注射した。体重および食物摂取量を週に１回測定した。血清化学解析のために、処置の２、５および８週間後に血清を採取した。動物を、処置の８週間後での血清および組織採取の前に４時間の絶食に付した。最初の注射の８週間後、０．０１２５ｍｇ／ｋｇ脂肪酸−ＧＤＦ１５コンジュゲートを用いる処置は、３％のビヒクル調整された体重減少をもたらし、０．５ｍｇ／ｋｇ脂肪酸−ＧＤＦ１５コンジュゲートを用いる処置は、１５％のビヒクル調整した体重減少をもたらした（図３）。０．０１２５ｍｇ／ｋｇまたは０．５ｍｇ／ｋｇ脂肪酸−ＧＤＦ１５コンジュゲートを用いる処置は、総肝臓重量をビヒクル処置されたマウスと比較して、低減させた（それぞれ、１２％および３５％）（図４Ａ）。脂肪肝（hepatic steatosis）は、０．５ｍｇ／ｋｇ群においてビヒクル処置された対照と比較して１６％低減された（図４Ｂ）。表４に見られるように、ＡＬＰレベルも０．５ｍｇ／ｋｇ群においてビヒクル処置された対照と比較して１０％低減された。

［実施例３］
ＨＳＡ融合ポリペプチドの発現および精製
Ａ．哺乳動物細胞発現および精製
ヒトＧＤＦ１５の構築物を、一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｆ細胞において発現させた。手短には、１リットルのＨＥＫ２９３Ｆ細胞あたり、１ｍｇのＤＮＡおよび３ｍｇの線形２５ｋＤａポリエチレンイミンを、１００ｍＬの培地中で混合し、室温で１０分間インキュベートし、次いで、細胞に添加した。細胞に、８％ＣＯ_２、８０％湿度で、３７℃、１２５ｒｐｍ（５０ｍｍスロー（throw））でトランスフェクション後５日間インキュベートした。細胞を、４℃で、６，０００×ｇで２０分間の遠心分離によって除去した。上清を０．８／０．２μｍメンブレンを通して濾過し、ＴＦＦによって１００ｍＭＴＲＩＳｐＨ８．０にバッファー交換した。ＧＤＦ１５構築物をＱセファロース陰イオン交換カラムで捕捉し、１００ｍＭＴＲＩＳｐＨ８．０中、０〜４００ｍＭＮａＣｌの１０カラム容量勾配で溶出した。ＧＤＦ１５を含有する画分を、１ＸＤＰＢＳ、１．４７ｍＭＫＨ_２ＰＯ_４、８．０６ｍＭＮａ_２ＨＰＯ_４−７Ｈ_２Ｏ、１３７．９ｍＭＮａＣｌ、２．６７ｍＭＫＣｌ中でサイズ排除クロマトグラフィーによってさらに精製した。ＧＤＦ１５を含有する画分を、液体窒素中で瞬間凍結し、−８０℃で保管した。

ＨＳＡ−ＧＤＦ１５融合物の哺乳動物細胞発現および精製
Ｈｉｓ−ヒトＧＤＦ１５融合タンパク質の構築物を、一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｆ細胞において発現させた。手短には、２．５リットルのＨＥＫ２９３Ｆ細胞あたり、２．５ｍｇのＤＮＡおよび７．５ｍｇの線形２５ｋＤａポリエチレンイミンを、２５０ｍＬの培地中で混合し、室温で１０分間インキュベートし、次いで、細胞に添加した。細胞に、８％ＣＯ_２、８０％湿度で、３７℃、１２５ｒｐｍ（５０ｍｍスロー（throw））でトランスフェクション後４日間インキュベートした。細胞を、４℃で、６，０００×ｇで２０分間の遠心分離によって除去した。上清を０．８／０．２μｍメンブレンを通して濾過した。濾過した上清に、１Ｍクエン酸ｐＨ３を１３５ｍＭの最終濃度に添加し、固体塩化ナトリウムを２Ｍの最終濃度に添加し、上清を０．２２μｍメンブレンを通して濾過した。５ｍＬのフェニルセファロース樹脂を、１００ｍＭクエン酸、２ＭＮａＣｌ、ｐＨ３中で平衡化し、上清に添加した。樹脂を上清とともに室温で２時間インキュベートし、５ｃｍの重力カラム中に充填した。樹脂を、２０ｍＬの１００ｍＭクエン酸、２ＭＮａＣｌ、ｐＨ３；２０ｍＬの１００ｍＭクエン酸、１．５ＭＮａＣｌ、ｐＨ３；１００ｍＭクエン酸、１ＭＮａＣｌ、ｐＨ３；１００ｍＭクエン酸、０．５ＭＮａＣｌ、ｐＨ３；１００ｍＭクエン酸、ｐＨ３；１００ｍＭクエン酸、２０％エタノール、ｐＨ３；および１００ｍＭクエン酸、５０％エタノール、ｐＨ３を用いて洗浄した。ＮａＣｌを含有しない洗浄物をプールした。２ＭＴＲＩＳ塩基をフェニルセファロースプールに１８０ｍＭの最終濃度に添加し、７．５の最終ｐＨが得られた。５ＭＮａＣｌを、１５０ｍＭの最終濃度に添加した。１６０μＬのＮｉセファロースＨＰ樹脂をＰＢＳ中で平衡化し、フェニルセファロースプールに添加し、室温で１時間インキュベートした。樹脂を１ｃｍの重力カラム中に充填し、２０ｍＬのＰＢＳと、それに続く、１ｍＬのＰＢＳ＋１００ｍＭイミダゾールを用いて洗浄した。結合しているタンパク質を、１ｍＬのＰＢＳ＋５００ｍＭイミダゾールで溶出した。ＧＤＦ１５を含有する画分を、液体窒素中で瞬間凍結し、−８０℃で保管した。

Ｂ．酵母発現および精製
ヒトＧＤＦ１５の構築物を、メタノール誘導を利用してピキア・パストリス（Pichia pastoris）において発現させた。プラスミドＤＮＡを、形質転換において使用するためにＳａｃＩを用いて線形化した。線形化されたＤＮＡを、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）株ＳＭＤ１１６８中に形質転換し、１％（ｖ／ｖ）メタノールを有する、ｐＨ６のＢＭＭＹ培地において、３０℃、２００ｒｐｍ（１インチのスロー（throw））で４日間発現させた。メタノールを、発現の間、毎日１％（ｖ／ｖ）の最終濃度に添加した。細胞を、４℃で、５，０００×ｇで２０分間の遠心分離によって除去し、上清を０．２２μｍメンブレンを通して濾過した。等容量の１Ｍクエン酸、３ＭＮａＣｌｐＨ２．７５を、濾過した上清に添加した。フェニルセファロース６を上清に添加し、撹拌しながら室温で１時間のインキュベーションによってＧＤＦ１５を結合させた。樹脂を重力カラム中に充填し、フロースルーを除去した。樹脂を、２５カラム容積の０．５Ｍクエン酸、１．５ＭＮａＣｌｐＨ３、５カラム容積の１００ｍＭクエン酸ｐＨ３および５カラム容積の１００ｍＭクエン酸、２０％エタノールｐＨ３を用いて洗浄した。結合しているタンパク質を、５×１カラム容量の１００ｍＭクエン酸、５０％エタノール、ｐＨ３で溶出した。ＧＤＦ１５を含有する溶出画分を合わせ、２５ｍＭｂｉｓ−ＴＲＩＳｐＨ５に１：１０希釈し、０．２２μｍメンブレンを通して濾過した。ＧＤＦ１５にＳＰセファロース陽イオン交換樹脂を添加し、室温で１時間インキュベートした。樹脂を重力カラム中に充填し、フロースルーを除去した。カラムを５０カラム容積の２５ｍＭｂｉｓ−ＴＲＩＳｐＨ５を用いて洗浄し、１０カラム容積の５０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭＮａＣｌｐＨ６．２で溶出した。

Ｃ．大腸菌（E.coli）発現
大腸菌（E.coli）によって産生されたＧＤＦ１５を、ブタコレラウイルス由来の修飾された自己プロテアーゼＰ２０と融合し、封入体において発現させた。ＧＤＦ１５プラスミドＤＮＡを用いて形質転換された大腸菌（E. coli）を、ＺＹＰ−５０５２自己誘導培地において３０℃で６０時間増殖させた（Studier F.W., Protein Expression and Purification 41 (2005) 207-234）。細胞ペレットを、１８℃で、５，０００×ｇで３０分間の遠心分離によって収集した。１リットルの培養物あたり、ペレットを２５０ｍＬの１００ｍＭＴＲＩＳｐＨ８、１５０ｍＭＮａＣｌ、３ｍＭＥＤＴＡ、０．０１％（ｖ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１ｍｇ／ｍＬリゾチームに再懸濁し、回転しながら、室温で２０分間インキュベートした。２５０ｍＬの１００ｍＭＴＲＩＳｐＨ８、１５０ｍＭＮａＣｌ、２０ｍＭＣａＣｌ_２、２０ｍＭＭｇＣｌ_２、０．２５ｍｇ／ｍＬＤＮアーゼＩを添加し、続いて、撹拌しながら室温で２０分間インキュベートした。

ペレットを、１８℃で、５，０００×ｇで１５分間遠心分離し、上清を廃棄した。ペレットを５００ｍＬの２％（ｖ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００に再懸濁し、回転しながら、室温で２０分間インキュベートした。ペレットを１８℃で、５，０００×ｇで１５分間遠心分離し、上清を廃棄した。ペレットを５００ｍＬの５００ｍＭＮａＣｌに再懸濁し、回転しながら、室温で２０分間インキュベートした。ペレットを１８℃で、５，０００×ｇで２０分間遠心分離し、上清を廃棄した。ペレットを、５００ｍＬの１００ｍＭＴＲＩＳｐＨ８、１５０ｍＭＮａＣｌ、２０ｍＭＣａＣｌ_２、２０ｍＭＭｇＣｌ_２、０．２５ｍｇ／ｍＬＤＮアーゼＩに再懸濁し、回転しながら、室温で２０分間インキュベートした。ペレットを、１８℃で、５，０００×ｇで２０分間遠心分離し、上清を廃棄した。ペレットを、５００ｍＬの、８０％（ｖ／ｖ）エタノールに再懸濁し、回転しながら、室温で２０分間インキュベートした。ペレットを１８℃で、５，０００×ｇで２０分間遠心分離し、上清を廃棄した。ペレットを、５００ｍＬの、１００ｍＭＴＲＩＳｐＨ８、５００ｍＭＮａＣｌ、８Ｍ尿素に再懸濁し、回転しながら、室温で１時間インキュベートした。１０ｍＬの、Ｎｉセファロース高性能樹脂を添加し、回転しながら、室温で１時間インキュベートした。

樹脂を重力カラム中に充填し、フロースルーを廃棄した。樹脂を、２５カラム容積の１００ｍＭＴＲＩＳｐＨ８、５００ｍＭＮａＣｌ、８Ｍ尿素、２５カラム容積の１００ｍＭＴＲＩＳｐＨ８、１ＭＮａＣｌ、２Ｍ尿素を用いて洗浄した。結合しているタンパク質を、２×５カラム容積の１００ｍＭＴＲＩＳｐＨ８、１ＭＮａＣｌ、２Ｍ尿素、０．５Ｍイミダゾールで溶出した。溶出されたタンパク質を、１ＭＴＲＩＳ−塩基、１ＭＮａＣｌ、０．２Ｍヒスチジン、１０ｍＭＴＣＥＰ、ｐＨ８．５で１：１０希釈した。サンプルを短期間撹拌して混合し、かき混ぜずに、室温で一晩インキュベートした。サンプルを６グラムのＨＬＢカートリッジ上にロードし、１００ｍＬの、水中、０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸で洗浄し、５０ｍＬの、イソプロパノール中、０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸で溶出した。ＨＬＢ溶出物を、１リットルの、５０ｍＭＨＥＰＥＳ、５００ｍＭＮａＣｌ、２ｍＭＴＣＥＰ、８Ｍ尿素、ｐＨ７．６に１：２０希釈した。１０ｍＬのＮｉセファロース高性能樹脂を添加し、撹拌しながら、室温で１時間インキュベートした。樹脂を重力カラム中に充填し、フロースルーを保存した。

Ｎｉフロースルーを、６グラムのＨＬＢカートリッジ上にロードし、１００ｍＬの、水中、０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸で洗浄し、５０ｍＬの、イソプロパノール中、０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸で溶出した。第２のＨＬＢ溶出物を、１リットルの、１００ｍＭＴＲＩＳｐＨ８、０．５Ｍ尿素、２ｍＭ酸化グルタチオン、２ｍＭ還元グルタチオンで１：２０希釈した。サンプルを短期間撹拌して混合し、かき混ぜずに、室温で一晩インキュベートした。１００ｍＬの５ＭＮａＣｌを添加して５００ｍＭの最終濃度とし、サンプルを６グラムのＨＬＢカートリッジ上にロードした。カートリッジを、１００ｍＬの、水中、０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸で洗浄し、２５ｍＬの、エタノール中、０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸で溶出した。ＨＬＢ溶出物を、７５ｍＬの、５０ｍＭビス−ＴＲＩＳｐＨ４．８の添加によって１：４希釈し、１ｍＬのＳＰセファロース樹脂を添加した。樹脂をＧＤＦ１５とともに室温で１時間インキュベートし、重力カラム中に充填した。樹脂を、１ｍＬの、５０ｍＭビス−ＴＲＩＳｐＨ４．８を用いて洗浄し、３×１ｍＬのＰＢＳｐＨ６．４で溶出した。画分１および２を合わせ、液体窒素中で瞬間凍結し、−８０℃で保管した。

動物研究
動物研究：本文書において記載されるすべての動物研究は、地方および連邦の規制およびガイドラインと一致する、生物医学研究動物実験委員会のためのノバルティス機関（ＮｏｖａｒｔｉｓＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓｆｏｒＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈＡｎｉｍａｌＣａｒｅａｎｄＵｓｅＣｏｍｍｉｔｔｅｅ）によって承認された。６週齢以降から標準実験室固形飼料食または６０％脂肪食（ＲｅｓｅａｒｃｈＤｉｅｔｓＤ１２４９２ｉ）のいずれかを給餌した雄マウス（Ｃ５７ＢＬ／６ＮＴａｃ）は、Ｔａｃｏｎｉｃから購入した。到着時に、マウスを、通常、１２時間：１２時間逆明暗周期下でケージあたり１匹の動物で収容した。動物にはすべて、いずれかの使用の前に、最小１週間の順化を与えた。マウスは、通常、３〜５ヶ月齢の間、研究した。研究されるのに先立って、マウスを、各群が同様の平均体重を有するように、体重に基づいて無作為化した（通常、実験期間の１日前）。

水力学的ＤＮＡ注射：研究当日に、マウスを新しいケージに入れ、古い食物を除去した。各研究動物（食餌誘発性肥満雄マウス）に、尾静脈によるプラスミドＤＮＡの単回水力学的注射を施した。ＤＮＡ（通常、３マイクログラム／マウス）を、動物の体重の約６．５％の容量の滅菌生理食塩水に希釈し、約５〜１０秒以内に迅速に注射した。注射の直後、上記の手順の最後に各ケージに予め秤量した新鮮な高脂肪食を加えた。示された時点で食物摂取量および体重を測定した。

組換えＧＤＦ１５類似体：研究当日に、マウスを新しいケージに入れ、古い食物を除去した。およそ１時間後、暗周期の直前に、マウスに、ビヒクル（１ＸＰＢＳ）またはＧＤＦ１５類似体のいずれかの皮下用量を示された時間に与えた。すべての注射が完了した後、マウスを再度秤量し、規定量の食物を戻した（マウスあたり約５０ｇの標準固形飼料または高脂肪食）。示された時間に研究の過程にわたって食物摂取量および体重を測定した。

血漿ＧＤＦ１５曝露：上記のように処置された代理動物において、示された時間に血漿をＥＤＴＡコーティングされた試験管中に採取し、製造業者の使用説明書の通りに、ＥＬＩＳＡによってヒトＧＤＦ１５レベルを測定した（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓＱｕａｎｔｉｋｉｎｅＨｕｍａｎＧＤＦ１５Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ；ＤＧＤ１５０）。このアッセイは、内因性マウスＧＤＦ１５を認識しない。

体組成：一部の動物において、体組成を、製造業者の使用説明書の通りに、ＮＭＲ（ＢｒｕｋｅｒＭｉｎｉＳｐｅｃモデルＬＦ９０ｉｉ）によって評価した。ＭｉｎｉＳｐｅｃソフトウェアＶ．２．５９．ｒｅｖ．６を使用して、脂肪組織、除脂肪組織および遊離流体の質量を算出した。

結果
ヒトＣＤ８Ａシグナルペプチドを使用して分泌された、マウスアルブミンドメイン１融合物および非３ｘ４ＧＳリンカー（配列番号３００）を除いて、すべての哺乳動物細胞によって発現された構築物は、マウスＩｇκ鎖Ｖ−ＩＩＩ領域ＭＯＰＣ６３シグナルペプチドを使用して分泌された。酵母によって発現された構築物は、修飾された接合因子アルファ−１シグナルペプチドを使用して分泌された。

ＧＤＦ１５は、マウスにおいて体重減少物質（weight loss agent）を引き起こす、または促し得る。しかし、ＧＤＦ１５の特徴は、野生型ヒトペプチドの短命な血漿半減期（約１時間）および哺乳動物細胞における不十分な発現レベル（Fairlie WD, et. al. Gene (2000) 254:67-76）など、天然に存在するペプチドをヒトにおける治療薬として使用するのに適していないものにする。その特性を改善するために、例えば、その血漿半減期を延長するために、ＧＤＦ１５が修飾され得るか否かを理解するのを補助するために、本発明者らは、タンパク質の結晶構造を解いた。ＧＤＦ１５結晶構造は、ＴＧＦＢ１−３およびインヒビンベータなどの９個の保存されたシステイン残基を含有するＴＧＦベータスーパーファミリーのその他のメンバーと比較して、ＧＤＦ１５の特有のジスルフィドパターンを示した（Galat A Cell. Mol. Life Sci. (2011) 68:3437-3451）。これらのジスルフィド結合の機能的重要性を試験するために、ジスルフィド結合を構成する保存されたシステイン残基の各々が、セリン残基に個別に突然変異されたタンパク質をコードする哺乳動物発現ベクターを構築した。材料および方法の節において記載されるように、発現構築物を水力学的ＤＮＡ注射によって、食餌誘発性肥満マウスに送達した。天然に存在するＧＤＦ１５をコードする発現ベクターを注射されたマウスは、空のベクターを注射されたマウスと比較して、３１．１％少ない食物しか食べず、処置の３週間後に３１．３％軽かった。Ｃ２０３Ｓ、Ｃ２１０ＳまたはＣ２７３Ｓに突然変異をコードする発現ベクターを与えられたマウスは、空のベクターを与えられた対照マウスよりも、それぞれ、２７．９、２８．０および３３．９％少ない食物しか食べず、それぞれ、２５．５、２０．４および３０．３％少なく秤量された。Ｃ２０３Ｓ、Ｃ２１０ＳおよびＣ２７３Ｓをコードする発現ベクターを与えられたマウスは、空のベクターを与えられた対照マウスよりも、それぞれ、２７．９、２８．０および３３．９％少ない食物しか食べず、それぞれ、２５．５、２０．４および３０．３％少なく秤量された。食物摂取量および体重は、空のベクターで処置されたマウスと、Ｃ２１１Ｓ、Ｃ２４０Ｓ、Ｃ２４４Ｓ、Ｃ２７４Ｓ、Ｃ３０５ＳまたはＣ３０７Ｓをコードする発現ベクターを用いて処置されたマウスの間で同様であった。これらのデータは、Ｃ２０３およびＣ２１０間の第１のジスルフィド結合は、有効性にとって必要ではないことを実証し、成熟ＧＤＦ１５のアミノ末端を操作できることを示唆する。興味深いことに、鎖間ジスルフィド結合を形成するＣ２７３もまた、ＧＤＦ１５の有効性にとって必要ではない。

システイン変異誘発研究から得た機能的データと組み合わせた構造的データは、ＧＤＦ１５のアミノ末端および潜在的にカルボキシ末端を、ＧＤＦ１５の半減期を延長するために修飾してもよいことを示唆した。これを試験するために、Ｎ末端Ｆｃ−ＧＤＦ１５およびＣ末端融合タンパク質ならびに成熟ＧＤＦ１５タンパク質をコードする哺乳動物発現ベクターを構築した。成熟ＧＤＦ１５をコードする発現ベクターの単回水力学的注射を施されたマウスは、一貫して、空のベクターの水力学的注射を施されたマウスよりもおよそ２５％少ない食物しか食べなかった（表５）。４週の終わりまでに、これらのマウスは、対照マウスよりも２８．９％少なく秤量された（表６）。Ｎ末端Ｆｃ−ＧＤＦ１５融合タンパク質をコードするベクターを注射されたマウスは、最初の２週間にわたって、空のベクターで処置されたマウスよりも約２５％少ない食物しか食べなかったが、３週目までに、Ｆｃ−ＧＤＦ１５処置されたマウスは、対照と同様の量の食物を食べていた。

Ｆｃ−ＧＤＦ１５処置されたマウスの体重も、最初に減少したが、次いで、リバウンドし始め、その結果、注射後４週までに、Ｆｃ−ＧＤＦ１５マウスは、空のベクターで処置されたマウスよりも、わずか９．８パーセント少なく秤量された。対照的に、Ｃ末端ＧＤＦ１５−Ｆｃ融合タンパク質をコードするベクターを注射されたマウスは、実験期間を通じて、空のベクターで処置されたマウスと同様のレベルの食物を摂取し、正確に、空のベクターで処置されたマウスのように体重が増えた。成熟ＧＤＦ１５で処置された群について、注射後１および３週で、高い血漿ＧＤＦ１５レベルが検出された（それぞれ、２．６および１．８ｎＭ）。血漿ＧＤＦ１５レベルは、用量の１週後に２．８ｎＭであったが、Ｆｃ−ＧＤＦ１５をコードするベクターの注射の３週後に検出不能であった。ＧＤＦ１５は、ＧＤＦ１５−Ｆｃ発現ベクターを用いて処置されたマウスにおいて、いずれの時間でも検出されなかった。要約すると、これらのデータは、ＧＤＦ１５のＣ末端融合物は、不活性であり、ＧＤＦ１５のＮ末端融合物は活性であることを示す。しかし、Ｆｃ−ＧＤＦ１５融合物群におけるＧＤＦ１５の発現の喪失は、ＧＤＦ１５へのＦｃ融合物は適した治療薬ではない可能性があることを示唆する。

ＦｃおよびＧＤＦ１５の反対の二量体化方向およびＦｃ−ＧＤＦ１５群における検出可能な血漿ＧＤＦ１５の喪失に基づいて、本発明者らは、Ｆｃ−ＧＤＦ１５融合タンパク質が凝集する傾向があり、結果として、Ｆｃ−ＧＤＦ１５融合タンパク質に対する免疫応答を開始する動物が生じる可能性が高いのではないかと疑った。Ｆｃ−ＧＤＦ１５融合タンパク質が凝集する傾向があるか否かを決定するために、Ｆｃ−ＧＤＦ１５融合タンパク質をＨＥＫ２９３細胞において発現させた。Ｆｃ−ＧＤＦ１５融合タンパク質が発現され、ポリアクリルアミドゲルで非還元条件下で解析された場合には、タンパク質の凝集と一致して、タンパク質の大きな割合が開始点の近くに移動した（図１ａ）。サイズ排除クロマトグラフィーによるさらなる解析によって、タンパク質が凝集されたことが確認された。

活性であるが凝集しないＧＤＦ１５融合タンパク質を同定する研究では、Ｎ末端ヒト血清アルブミン−［ＧＧＧＧＳ］_３−ＧＤＦ１５（ＨＳＡ−ＧＤＦ１５）融合タンパク質およびマウス血清アルブミン−［ＧＧＧＧＳ］_３−ＧＤＦ１５（ＭＳＡ−ＧＤＦ１５）をコードする哺乳動物発現ベクターを、ＨＥＫ２９３細胞中にトランスフェクトした。Ｆｃ−ＧＤＦ１５融合タンパク質とは異なり、ＨＳＡ−ＧＤＦ１５およびＭＳＡ−ＧＤＦ１５は両方とも、ポリアクリルアミドゲルで非還元条件下で、およびサイズ排除クロマトグラフィーによって解析された場合に予測された分子量に移動した（図１ｂ）。予想外に、哺乳動物細胞における両アルブミン−ＧＤＦ１５融合タンパク質の発現はまた、成熟ＧＤＦ１５タンパク質のものよりも約１０００Ｘ高かった。

ＧＤＦ１５のＮ末端へのアルブミンの融合が、活性タンパク質をもたらすか否かを決定するために、痩せたマウスに、ビヒクルまたは９９マイクログラム（約０．６ｎｍｏｌの二量体）のＭＳＡ−ＧＤＦ１５（１９７〜３０８）、ＭＳＡ−ＧＤＦ１５（１９７〜３０８、Ｃ２０３Ｓ、Ｃ２１０Ｓ）、ＭＳＡ−ＧＤＦ１５（２１１〜３０８）またはＭＳＡ−ＧＤＦ１５（１９７〜３０８、Ｃ２７３Ｓ）の単回皮下注射を投薬した。ビヒクル処置された動物と比較して、それぞれ、ＭＳＡ−ＧＤＦ１５（１９７〜３０８）、ＭＳＡ−ＧＤＦ１５（１９７〜３０８、Ｃ２０３Ｓ、Ｃ２１０Ｓ）、ＭＳＡ−ＧＤＦ１５（１９７〜３０８、Ｃ２７３Ｓ）およびＭＳＡ−ＧＤＦ１５（２１１〜３０８）を与えられた動物において、食物摂取量が３４、３４、４２および２５パーセント低減された。これらのデータは、アルブミンのＧＤＦ１５のＮ末端への融合は、生物学的に活性なタンパク質をもたらすことを明確に実証する。

アルブミンのＧＤＦ１５のＮ末端への融合はまた、血漿半減期を、成熟ＧＤＦ１５と比較して大幅に増大した。成熟ＧＤＦ１５の血漿半減期は、約１時間であり、Ｎ末端血清アルブミン−ＧＤＦ１５融合タンパク質の血漿半減期は、約５０時間であった。３連続週間のＭＳＡ−ＧＤＦ１５の週に１回の投与は、同等用量（０．６ｎｍｏｌ二量体／マウスｓ．ｃ．）の成熟ＧＤＦ１５と比較して、肥満マウスにおいて体重減少を大幅に増強した。最初の用量の２８日後および前の用量の２週間後、ＭＳＡ−ＧＤＦ１５で処置されたマウスは、その出発体重の１２．８パーセントを失ったが、同じ期間にかけて、ビヒクル処置されたおよびＧＤＦ１５処置されたマウスは、その出発体重をそれぞれ、さらに１０．９％および５．６％増大した。体組成の解析は、ＭＳＡ−ＧＤＦ１５によって誘導された体重減少は、大部分は体脂肪量からであり、除脂肪量を温存したことを示した。投薬の開始後２３日目に、ＭＳＡ−ＧＤＦ１５処置されたマウスの体脂肪量は、それぞれ、ビヒクルおよびＧＤＦ１５処置されたマウスの２５．２％および２４．５％と比較して１８．３％であった。ＭＳＡ−ＧＤＦ１５処置されたマウスにおける除脂肪量は、それぞれ、ビヒクル処置された、およびＧＤＦ１５処置されたマウスの５１．５％および５２％と比較して、その体重の５５．６％であった。

ＨＳＡ−ＧＤＦ１５融合物もまた、生物学的に活性であった。ＨＳＡ−ＧＤＦ１５の単回皮下用量（３ｍｇ／ｋｇｓ．ｃ．）を与えられた肥満マウスは、２４時間かけて、ビヒクル処置された対照よりも３１％少ない食物しか食べず、ＭＳＡ−ＧＤＦ１５処置されたマウスは、ビヒクル対照よりも２７％少なく食べた。アルブミンとＧＤＦ１５の間に異なるペプチドリンカーを有するＨＳＡ−ＧＤＦ１５融合物も、生物学的に活性であった。ＨＳＡ−リンカーなし−ＧＤＦ１５、ＨＳＡ−ＧＧＧＧＳ−ＧＤＦ１５、ＨＳＡ−ＧＰＰＧＳの単回皮下用量（３ｍｇ／ｋｇｓ．ｃ．）を用いて処置された肥満マウスは、２４時間かけて、ビヒクル処置されたマウスよりも２２、２７および２１％少ない食物を食べた。要約すると、これらのデータは、種々のリンカーを伴うアルブミンのＧＤＦ１５のＮ末端への融合物は、生物学的に活性であることを示す。

ＧＤＦ１５のアミノ末端は、治療用アルブミン−ＧＤＦ１５融合タンパク質の開発（例えば、安定性）に悪影響を及ぼし得る、潜在的なタンパク質分解（Ｒ１９８）および脱アミド化部位（Ｎ１９９）を含有する。これらの部位が、ＧＤＦ１５活性にとって必要であるか否かを決定するために、一連のアルブミン−ＧＤＦ１５突然変異体を生成し、ｉｎｖｉｖｏ活性について試験した。肥満マウスを、ＨＳＡ−ＧＤＦ１５、ＨＳＡ−ＧＤＦ１５（Ｒ１９８Ｈ）、ＨＳＡ−ＧＤＦ１５（Ｎ１９９Ｅ）またはＨＳＡ−ＧＤＦ１５（Ｒ１９８Ｈ、Ｎ１９９Ａ）の単回皮下用量（３ｍｇ／ｋｇｓ．ｃ．）を用いて処置した。６日の過程にわたる累積食物摂取量は、ＨＳＡ−ＧＤＦ１５を用いて処置されたマウスにおいて、ビヒクル対照と比較して２９％低減された。同じ期間にわたる食物摂取量は、ＨＳＡ−ＧＤＦ１５（Ｒ１９８Ｈ）、ＨＳＡ−ＧＤＦ１５（Ｎ１９９Ｅ）またはＨＳＡ−ＧＤＦ１５（Ｒ１９８Ｈ、Ｎ１９９Ａ）を用いて処置された肥満マウスにおいて、対照と比較して３５、２８および２５％低減された。６日かけて、ビヒクル処置された動物の体重は、６．１％増大し、ＨＳＡ−ＧＤＦ１５処置されたマウスでは、体重は４．７％低減された。それぞれ、ＨＳＡ−ＧＤＦ１５（Ｒ１９８Ｈ）、ＨＳＡ−ＧＤＦ１５（Ｎ１９９Ｅ）またはＨＳＡ−ＧＤＦ１５（Ｒ１９８Ｈ、Ｎ１９９Ａ）を用いて処置された肥満マウスでは、体重は、５．２、４．４および３．２低減された。したがって、ＧＤＦ１５のアミノ末端中にこれらの潜在的翻訳後修飾部位の突然変異を含有する融合タンパク質は、生物活性を保持する。

ＧＤＦ１５の受容体（単数または複数）は未知であるので、機能に必須であるドメインおよび残基ならびに修飾を受け入れるものを解明するために、一連の構造によって導かれる部位特異的突然変異体を設計した。ＧＤＦ１５は、フィンガードメイン、ナックルドメイン、リストドメイン、新たに発見されたＮ末端ループドメインおよびバックオブハンド（back-of-hand）ドメインを含有する。ＧＤＦ１５の新たに発見されたアミノ末端領域を破壊するＧＤＦ１５類似体、例えば、ＭＳＡ−ＧＤＦ１５（２１１〜３０８）およびＭＳＡ−ＧＤＦ１５（Ｃ２０３Ｓ、Ｃ２１０Ｓ）は、依然として生物活性を保持し、このループは、活性にとって必要ではないことを実証する。ＴＧＦベータスーパーファミリーメンバーのナックル、フィンガーおよびリスト領域は、受容体結合およびシグナル伝達にとって重要であることが公知である。ＧＤＦ１５のこれらの領域が、活性にとって重大であるか否かを決定するために、機能の喪失を誘導しようとして、重要な表面残基を大きな側鎖を含有するアミノ酸、アルギニンに突然変異させた。ＧＤＦ１５残基ロイシン２９４（ナックル）、アスパラギン酸２８９（フィンガー）、グルタミン２４７（リスト）およびセリン２７８（バックオブハンド）に突然変異を含有するＭＳＡ−ＧＤＦ１５融合タンパク質を生成し、次いで、肥満マウスに皮下投薬した（３ｍｇ／ｋｇｓ．ｃ．）。

ＭＳＡ−ＧＤＦ１５の単回皮下注射は、食物摂取量を７日の過程にわたって、ビヒクル対照と比較して３０％低減させた。食物摂取量はまた、フィンガー領域突然変異体（Ｄ２８９Ｒ）、リスト突然変異体（Ｑ２４７Ｒ）およびバックオブハンド突然変異体（Ｓ２７８Ｒ）によって、それぞれ、２２、１４および２４％対照に対して低減された。対照的に、ナックル領域突然変異体（Ｌ２９４Ｒ）は、食物摂取量を対照に対して１７％増大した。７日の過程にわたって、ビヒクルおよびＬ２９４Ｒ処置されたマウスにおいて体重が増大し（それぞれ、２．２および６．３％）、それぞれ、ＭＳＡ−ＧＤＦ１５、ＭＳＡ−ＧＤＦ１５（Ｄ２８９Ｒ）、ＭＳＡ−ＧＤＦ１５（Ｑ２４７Ｒ）およびＭＳＡ−ＧＤＦ１５（Ｓ２７８Ｒ）処置されたマウスでは、体重が６．６、５．７、５．７および５．４％減少した。これらのデータは、Ｌ２９４およびＧＤＦ１５のナックル領域は活性にとって重大であり、ＧＤＦ１５受容体と相互作用する可能性が高いことを示す。ＧＤＦ１５のその他の領域における突然変異は、許容された。

［実施例４］
脂肪酸にコンジュゲートされたｈＧＤＦ１５（ＡＨＡ−ｈＧＤＦ１５）の変異体

中間体１：ＡＨＡ−（２００〜３０８）−ｈＧＤＦ１５
ＡＨＡＧＤＨＣＰＬＧＰＧＲＣＣＲＬＨＴＶＲＡＳＬＥＤＬＧＷＡＤＷＶＬＳＰＲＥＶＱＶＴＭＣＩＧＡＣＰＳＱＦＲＡＡＮＭＨＡＱＩＫＴＳＬＨＲＬＫＰＤＴＶＰＡＰＣＣＶＰＡＳＹＮＰＭＶＬＩＱＫＴＤＴＧＶＳＬＱＴＹＤＤＬＬＡＫＤＣＨＣＩ（配列番号４１）。
ＬＣＭＳ：理論質量（二量体）：２４４３０：実測質量（二量体）：２４４３２
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞におけるヒトＧＤＦ−１５タンパク質の発現
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＢＬ２１（ＤＥ３）Ｇｏｌｄ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）およびＲｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ）を、それぞれ、ｐＥＴ２６ｂベクターにクローニングされた、構築物５１〜５６および構築物ＭＡＨＡ−（２００〜３０８）−ｈＧＤＦ１５を用いて形質転換した。形質転換された細胞を、まず、３ｍｌ中、次いで、５０ｍｌのＬｕｒｉａＢｒｏｔｈ（バクト−トリプトン１０ｇ／Ｌ、酵母抽出物５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ５／Ｌ、グルコース６ｇ／Ｌ）中、抗生物質選択下で、１．５のＯＤ６００に到達するまで増殖させた。前培養物を使用して、ＴｅｒｒｉｆｉｃＢｒｏｔｈ培地（ＮＨ４ＳＯ４１．２ｇ／Ｌ、Ｈ２ＰＯ４０．０４１ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４０．０５２ｇ／Ｌ、バクト−トリプトン１２ｇ／Ｌ、酵母抽出物２４ｇ／Ｌ）で満たした２つの１−Ｌ発酵槽に播種した。培養物を、ｐＨが７．１を上回って増大した時点での、１ｍＭイソプロピル−ベータ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の自動添加によって誘導した。その他の発酵パラメータは、以下とした：温度＝３７℃；ｐＨ２ＮＮａＯＨ／Ｈ２ＳＯ４の添加によって調整された７．０＋／−０．２；ｐＯ２スターラー速度、気流および酸素付加のカスケードを用いて＞３０％。誘導の５時間後、培養物を１０℃に冷却し、遠心分離によって細胞を収集した。

ＧＤＦ１５変異体の精製および再折りたたみ
封入体
対象のタンパク質を発現する組換え大腸菌（coli）ペレットを、４℃の５０ｍＭＮａＨ_２ＰＯ_４／１５０ｍＭＮａＣｌ／５ｍＭベンズアミジン．ＨＣｌ／５ｍＭＤＴＴ、ｐＨ８．０中に再懸濁し（５％ｗ／ｖ）、Ｆｒｅｎｃｈｐｒｅｓｓ（８００および８０バール）を２回通過させることによって、ホモジナイズし、溶解させた。４℃、１２‘０００ｒｐｍで６０分間の遠心分離によって封入体（ＩＢ）を単離した。

折りたたまれていない粗タンパク質の精製
ＩＢを、６Ｍグアニジン／１００ｍＭＮａＨ_２ＰＯ_４／１０ｍＭＴｒｉｓ／２０ｍＭベータ−メルカプトエタノール、ｐＨ８．０中で可溶化し（５％ｗ／ｖ）、室温で２時間撹拌した。１２‘０００ｒｐｍでの遠心分離によって細片を除去した。可溶化されたＩＢを、Ｎｉ−ＮＴＡ−Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ（Ｈｉｓタグを有さない構築物は、高ヒスチジン含量のために同様にこの樹脂に結合する）でさらに精製した。６Ｍグアニジン／１００ｍＭＮａＨ_２ＰＯ_４／１０ｍＭＴｒｉｓ／５ｍＭベータ−メルカプトエタノール、ｐＨ８．０を用いるベースライン洗浄後、ｐＨ４．５に調整した同じバッファーを用いて、結合している材料を溶出した。溶出液をｐＨ８．０に調整し、１００ｍＭＤＴＴを添加し、溶液を４℃で一晩撹拌した。次いで、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ、水中の１０％ストック）の添加によってｐＨを２に調整し、溶液を、水中の、０．１％ＴＦＡを用いてさらに１：１希釈した。５０分で０〜５０％アセトニトリルの勾配を使用するＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｐｏｒｏｓ）によって、粗タンパク質溶液をさらに精製した。ＧＤＦ−１５を含有する画分をプールし、凍結乾燥した。

タンパク質折りたたみ
方法１：凍結乾燥した材料を、１００ｍＭ酢酸中に２ｍｇ／ｍｌで溶解し、折りたたみバッファー（１００ｍＭＣＨＥＳ／１ＭＮａＣｌ／３０ｍＭＣＨＡＰＳ／５ｍＭＧＳＨ／０．５ｍＭＧＳＳＧ／２０％ＤＭＳＯ、ｐＨ９．５、４℃）で１５〜２０倍希釈し、溶液を、４℃で３日間穏やかに撹拌した。３日後、３容積の１００ｍＭ酢酸を添加し、限外濾過（５ｋＤａカットオフ）によって溶液を約１００〜２００ｍｌに濃縮し、１００ｍＭ酢酸を用いて１０倍希釈し、再濃縮した。再折りたたみされた材料を、５０℃（バッファーＡ：水中、０．１％ＴＦＡ；バッファーＢ：アセトニトリル中、０．０５％ＴＦＡ）で実施した、ＶｙｄａｃＣ４カラムでの分取ＲＰ−ＨＰＬＣによってさらに精製した。ローディング後、１５％バッファーＢを用いてカラムを洗浄し、５０分で１５％Ｂ〜６５％Ｂの勾配を用いて溶出した。対象のタンパク質を含有する採取した画分を、等容量のバッファーＡを用いて希釈し、凍結乾燥した。再折りたたみ収率は、両タンパク質について、約２５％であった。

方法２：折りたたみバッファー：１００ｍＭＣＨＥＳ、ｐＨ９．４、０．９Ｍアルギニン、０．５ＭＮａＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、２．５ｍＭＧＳＨ、１ｍＭＧＳＳＧ（最終濃度）を用いて、方法１におけるようにプロトコールに従った。

中間体２：脂肪酸構築物の合成

ステップ１：１８−（ベンジルオキシ）−１８−オキソオクタデカン酸、ジベンジルオクタデカンジオエート

ＴＨＦ中のオクタデカン二酸（１００ｍｇ、０．３１８ｍｍｏｌ）の溶液（容量：５ｍＬ）を、０℃に冷却し、ＥＤＣ（０．０８４ｍＬ、０．４７７ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（３．８９ｍｇ、０．０３２ｍｍｏｌ）を添加した。ベンジルアルコール（０．０３０ｍＬ、０．２８６ｍｍｏｌ）をゆっくりと滴加し、反応物を室温にゆっくりと加温し、１６時間撹拌した。ＬＣＭＳ解析は、ＥＬＳＤ（方法Ａ（この方法およびこの実施例において引用されるすべての方法については、以下の表７を参照のこと））によって、２５％所望の生成物および３８％＋２を示し、Ｒ_ｔｐｒｏｄ＝１．１８分、Ｍ＋Ｈ４０５．１；Ｒ_ｔ＋２ｐｒｏｄ＝１．４９分、Ｍ＋Ｈ_２Ｏ５１２．４）。反応混合物溶媒を除去し、粗材料をＤＣＭに溶かした。有機物を１ＭＨＣｌ（水性）（２５ｍＬｘ３）を用いて洗浄し、白色個体が得られた。次いで、有機層を、炭酸ナトリウムの飽和水溶液（２５ｍＬｘ３）を用いて洗浄し、ブラインを使用して分離を補助した。有機物をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、濃縮すると、白色フィルムが得られた。

粗材料を、最小量の２：１ＡＣＮ／ＤＭＳＯに溶解し、２０ｇの、逆相クロマトグラフィーのＣ１８１５μＭカラム上にロードした。０〜１００％ＡＣＮ／Ｈ_２Ｏ（０．１％ＴＦＡ）２４分勾配にわたって精製した。所望の生成物を有する画分をプールし、濃縮し、凍結し、凍結乾燥すると、３８．３ｍｇの白色粉末が得られた（２８％）。材料を所望の生成物１８−（ベンジルオキシ）−１８−オキソオクタデカン酸（１）と同定した。ＬＣＭＳ方法Ｂ、Ｒ_ｔ＝２．３９分、Ｍ＋Ｈ４０５．４）。1H NMR (400 MHz, クロロホルム-d) δ 7.39 - 7.32 (m, 5H), 5.11 (s, 2H), 2.35 (t, J = 7.6 Hz, 4H), 1.67 - 1.61 (m, 4H), 1.36 - 1.21 (m, 24H).

ステップ２：１−ベンジル１８−（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）オクタデカンジオエート

ＴＨＦ中の溶液（１、３８．８ｍｇ、０．０９６ｍｍｏｌ）（容量：２ｍＬ）に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（１３．２４ｍｇ、０．１１５ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（０．０２５ｍＬ、０．１４４ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（１．１７２ｍｇ、９．５９μｍｏｌ）を添加した。反応物を、Ｎ_２下で１６時間室温で撹拌した。ＬＣＭＳ解析は、出発材料の完全消費および所望の生成物の形成を示した（方法Ａ、Ｒ_ｔ＝１．２５分、Ｍ＋Ｈ５０２．４）。溶媒を除去し、反応混合物を最小量のＡＣＮに溶かし、２０ｇの逆相クロマトグラフィーのＣ１８１５μＭカラム上にロードした。０〜１００％ＡＣＮ／Ｈ_２Ｏ（０．１％ＴＦＡ）２４分の勾配にわたって精製した。所望の生成物を有する画分をプールし、濃縮し、凍結し、凍結乾燥すると、微細な白色固体（３５．９ｍｇ、７１％）が得られた。ＬＣＭＳ方法Ｂ、Ｒ_ｔ＝２．５１分、Ｍ＋Ｈ５０２．５、Ｍ＋Ｈ_２Ｏ５１９．５。1H NMR (400 MHz, クロロホルム-d) δ 7.41 - 7.32 (m, 5H), 5.11 (s, 2H), 2.83 (s, 4H), 2.60 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 2.35 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 1.73 (m, J = 7.6 Hz, 4H), 1.25 (d, J = 3.6 Hz, 24H).

ステップ３：（Ｓ）−５−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−１−（９Ｈ−フルオレン−９−イル）−３，８−ジオキソ−２，１２，１５−トリオキサ−４，９−ジアザヘプタデカン−１７−酸

ＴＨＦ（容量：９ｍＬ、比：９）中、Ｎ−アルファ−Ｆｍｏｃ−Ｌ−グルタミン酸アルファ−ベンジルエステル（２５０ｍｇ、０．５４４ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（７５ｍｇ、０．６５３ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（０．１４４ｍＬ、０．８１６ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（６．６５ｍｇ、０．０５４ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を、Ｎ_２下で３時間室温で撹拌した。ＬＣＭＳ解析は、出発材料の存在を示し（方法Ｃ、ＳＭＲ_ｔ＝１．２３分、Ｍ＋Ｈ４６０．２；ｐｒｏｄＲ_ｔ＝１．３０分、Ｍ＋Ｈ５５７．２）、そのため、０．２５当量のＮ−ヒドロキシスクシンイミドを添加し、反応物をＮ_２下で１６時間室温で撹拌した。ＬＣＭＳ解析は、ＮＨＳエステル生成物への完全変換を示した（方法Ｃ、Ｒ_ｔ＝１．３０分、Ｍ＋Ｈ５５７．２）。２−（２−（２−アミノエトキシ）エトキシ）酢酸（９８ｍｇ、０．５９８ｍｍｏｌ）を、水（容量：１．０００ｍＬ、比：１．０００）に溶解し、反応混合物に添加し、続いて、ＤＩＰＥＡ（０．４４２ｍＬ、２．７２ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を、Ｎ_２下で１６時間室温で撹拌した。ＬＣＭＳ解析は、所望の生成物および幾分かの加水分解されたグルタミン酸の形成を示した（方法Ｃ、Ｒ_ｔ＝１．１５分、Ｍ＋Ｈ６０５．３）。反応混合物（１８９ｍｇ）を５％ＭｅＯＨ／ＥｔＯＡｃに溶かし、分液漏斗に移し、次いで、０．１ＮＨＣｌの５０ｍＬの部分を用いて３回洗浄した。合わせた水層を、５０ｍＬの５％ＭｅＯＨ／ＥｔＯＡｃを用いて１回抽出し、有機層を合わせ、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、濃縮すると、無色のフィルムが得られた（１３０ｍｇ、６９％）。ＬＣＭＳ解析は、材料中の大部分の生成物を示した（方法Ｄ、Ｒ_ｔ＝２．４３分、Ｍ＋Ｈ６０５．３）。材料は、さらなる精製を伴わずに次のステップに運んだ。

ステップ４：（Ｓ）−４−アミノ−３，７−ジオキソ−１−フェニル−２，１１，１４−トリオキサ−８−アザヘキサデカン−１６−酸

３を、２０％の４−メチルピペリジン／ＤＭＦ溶液（１００ｍｇの材料あたり１ｍＬ）に溶解する。反応物を室温で１時間撹拌し、次いで、２０ｇの、逆相クロマトグラフィーのＣ１８１５μＭカラム上にロードする。粗材料を、０〜１００％ＡＣＮ／Ｈ_２Ｏ（０．１％ＴＦＡ）２４分勾配にわたって精製する。所望の生成物を有する画分をプールし、濃縮し、凍結し、凍結乾燥する。

ステップ５：（Ｓ）−２２−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−３，２０，２５−トリオキソ−１−フェニル−２，２９，３２−トリオキサ−２１，２６−ジアザテトラトリアコンタン−３４−酸

Ｎ_２でパージしたＴＨＦ（１２ｍｍｏｌａｒ、９：１ＴＨＦ／Ｈ_２Ｏ）中の４の溶液に、水中の１−ベンジル１８−（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）オクタデカンジオエート（２、１．２当量）の溶液を添加する。ＤＩＰＥＡ（５当量）を添加し、反応物をＮ_２下で１６時間室温で撹拌する。溶媒を除去し、粗材料を、最小量のＡＣＮに溶かし、次いで、２０ｇの、逆相クロマトグラフィーのＣ１８１５μＭカラム上にロードする。粗材料を、０〜１００％ＡＣＮ／Ｈ_２Ｏ（０．１％ＴＦＡ）２４分勾配にわたって精製する。所望の生成物を有する画分をプールし、濃縮し、凍結し、凍結乾燥する。

ステップ６：（Ｓ）−２２−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−３，２０，２５，３４−テトラオキソ−１−フェニル−２，２９，３２，３８，４１−ペンタオキサ−２１，２６，３５−トリアザトリテトラコンタン−４３−酸

５を、Ｎ_２下でＴＨＦ（０．０２ｍｏｌａｒ）に溶解し、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（１．２当量）、ＥＤＣ（１．５当量）およびＤＭＡＰ（０．１当量）を添加する。反応物をＮ_２下で１６時間室温で撹拌すると、ＮＨＳ−エステル中間体が得られる。水（９：１ＴＨＦ／Ｈ_２Ｏ）中の２−（２−（２−アミノエトキシ）エトキシ）酢酸（１．１当量）の溶液およびＤＩＰＥＡ（５当量）を、ＮＨＳ−エステル中間体に添加する。反応物を、Ｎ_２下で１６時間室温で撹拌する。溶媒を除去し、粗材料を最小量のＡＣＮに溶かし、２０ｇの逆相クロマトグラフィーのＣ１８１５μＭカラム上にロードする。粗材料を、０〜１００％ＡＣＮ／Ｈ_２Ｏ（０．１％ＴＦＡ）２４分勾配にわたって精製する。所望の生成物を有する画分をプールし、濃縮し、凍結し、凍結乾燥する。

ステップ７：２１，３９−ジベンジル１−（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）（Ｓ）−９，１８，２３−トリオキソ−２，５，１１，１４−テトラオキサ−８，１７，２２−トリアザノナトリアコンタン−１，２１，３９−トリカルボキシレート

Ｎ_２下、無水ＴＨＦ（０．０２ｍｏｌａｒ）中の６の溶液に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（１．２当量）を添加する。反応物をＮ_２下で１６時間室温で撹拌する。反応溶媒を蒸発させ、粗材料を最小量のＡＣＮに溶かし、次いで、２０ｇの逆相クロマトグラフィーのＣ１８１５μＭカラム上にロードする。粗材料を、０〜１００％ＡＣＮ／Ｈ_２Ｏ（０．１％ＴＦＡ）２４分勾配にわたって精製する。所望の生成物を有する画分をプールし、濃縮し、凍結し、凍結乾燥する。

ステップ８：（Ｓ）−２２−カルボキシ−１−（（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）オキシ）−１，１０，１９，２４−テトラオキソ−３，６，１２，１５−テトラオキサ−９，１８，２３−トリアザヘンテトラコンタン−４１−酸

Ｎ_２でフラッシュした無水ＴＨＦ（０．２ｍｏｌａｒ）中の７の溶液に、Ｐｄ／Ｃ（木炭上の１０％活性化、０．１当量）を添加する。反応物を、Ｎ_２下で１０分間室温で撹拌する。次いで、Ｎ_２供給源を閉じ、反応フラスコに水素を添加する。次いで、水素供給源を除去し、Ｎ_２流を戻す。反応物を１６時間室温で撹拌する。反応混合物を、セライトの溶媒湿潤パッドを通して濾過し、過剰のＴＨＦを用いて３回すすぎ、得られた濾液を濃縮する。粗材料を、最小量のＡＣＮ／水に溶解し、２０ｇの逆相クロマトグラフィーのＣ１８１５μＭカラム上にロードする。粗材料を０〜１００％ＡＣＮ／Ｈ_２Ｏ（０．１％ＴＦＡ）２４分の勾配にわたって精製する。所望の生成物を有する画分をプールし、濃縮し、凍結し、凍結乾燥する。

［実施例４Ａ］
脂肪酸構築物とのタンパク質コンジュゲーション（中間体２）：

一般的なタンパク質コンジュゲーション手順：
脂肪酸−ＮＨＳエステルの１０ｍｇ／ｍＬの溶液を、水で調製する。ＡＨＡ−ｈＧＤＦ１５（１．０当量）の溶液を、３０ｍＭＮａＯＡｃｐＨ４．６を用いて、０．８８ｍｇ／ｍＬの最終反応濃度が得られるように希釈する。タンパク質溶液に脂肪酸溶液（１０当量、１０ｍｇ／ｍＬで）を添加し、反応物を１６時間室温で振盪する。反応混合物を精製する。

ｈＧＤＦ１５のホモ二量体性を考慮して、ＡＨＡ−ｈＧＤＦ１５＋１脂肪酸およびＡＨＡ−ｈＧＤＦ１５＋２脂肪酸の混合物を得ることができる。脂肪酸構築物（中間体２）を、単量体ユニットのうちの１つまたは２つのＮ末端で連結する。コンジュゲートのこのような混合物は、以下として表すことができる：

［式中、２つのＡＨＡ−ｈＧＤＦ１５ユニット間の線は、ジスルフィド結合である］。

［実施例５Ａ］
中間体３７にコンジュゲートされたＨｉｓ−ｈＧＤＦ１５（Ｉ−５９）

１．５ｍｌの３０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ＝４バッファーにＨｉｓ−ＧＤＦ１５（０．４９３ｍｌ、０．０２６μｍｏｌ、１．４２ｍｇ／ｍｌ）を添加し、この溶液にｎｈｓ脂肪酸（０．２２１ｍｇ、０．１３２ｕｍｏｌ、１０ｍｇ／ｍＬ）を添加した。一晩で反応は完了しなかったので、さらに２．５当量の脂肪酸ＮＨＳ（０．１１０ｍｇ、０．０６６ｕｍｏｌ、１０ｍｇ／ｍＬ）を添加し、５時間後、Ｍａｌｄｉは、＋２コンジュゲートを主要な生成物として示した。ａｍｉｃｏｎ限外濾過１０ｋＤを使用して５回洗浄することによって生成物を精製すると、５６５ｕｇのコンジュゲートが７６％の収率で得られた。ＭＡＬＤＩ：ｓｍ（１８％）、期待質量：２６４６８実測質量：２６５５３；＋１脂肪酸（３８％）期待質量：２８０２２実測質量：２８０９９；＋２脂肪酸（４０％）期待質量：２９５７６実測質量：２９６４９；＋３脂肪酸（４％）期待質量：３１１３０実測質量：３１２０１。

．
［実施例５Ｂ］
中間体３７とコンジュゲートされたＡＨＡ−ｈＧＤＦ１５

分子生物学等級の水中の中間体３７の１０ｍｇ／ｍＬの溶液を調製した。ＡＨＡ−ｈＧＤＦ１５（中間体５７、３０ｍＭＮａＯＡｃｐＨ４．０中の６．６７ｍｇ／ｍＬ、５．２４７ｍＬ、１．４３３μｍｏｌ）に３０ｍＭＮａＯＡｃｐＨ４．６（許容範囲４．５〜５．０）を添加すると、０．８８ｍｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度が得られた。中間体３７（１０当量、２．３９ｍＬ、０．０１４ｍｍｏｌ）を添加し、反応物を室温で１８時間混合した。反応バイアル中に沈殿が形成された。反応混合物を４ｘ１５ｍＬ１０ｋＤａＡｍｉｃｏｎ遠心フィルターの中で分け、各々を３０ｍＭＮａＯＡｃｐＨ４．０を用いて１５ｍＬに希釈した。材料を、３０ｍＭＮａＯＡｃｐＨ４．０に４回バッファー交換し、サンプルを合わせて、２５．６ｍＬの容量とし、洗浄の間にピペットチップを用いてフィルター中で沈殿物をかき混ぜた。沈殿物は溶液中に残存し、そのため、混合物を４℃で一晩静置させた。Ａ２８０（３００４０ｃｍ^−１Ｍ^−１、２７５３８ｇ／ｍｏｌ）によって濃度を測定すると、１．６２ｍｇ／ｍＬ（１００％）であった。ＵＰＬＣ解析は、＋１および＋２生成物の６０％回収を示した（方法Ｊ）。

ｉｎｖｉｖｏで試験され、表８において報告される粗混合物：

ＡＨＡ−ｈＧＤＦ１５＋１ＦＡ（脂肪酸）は、ＧＤＦ１５ホモ二量体の１つの分子でのＮ末端アミノ官能基での反応に対応する。
ＡＨＡ−ｈＧＤＦ１５＋２ＦＡ（脂肪酸）は、ＧＤＦ１５ホモ二量体の第２の分子でのＮ末端アミノ官能基での反応に対応する。
ＡＨＡ−ｈＧＤＦ１５＋３ＦＡ（脂肪酸）は、ＧＤＦ１５ホモ二量体のいくつかの他の部位での非選択的反応に対応する。

精製：
粗生成物を、ＷａｔｅｒｓＢＥＨ３００１３０Å、３．５μｍ、４．６ｍｍＸ１００ｍｍ流速２．５ｍｌ／分での逆相クロマトグラフィー（バッファーＡ水中０．１％ＴＦＡ；バッファーＢＡＣＮ中０．１ＭＴＦＡ勾配；９９％〜８０％バッファーＡ）によって精製した。
画分１：未反応ＡＨＡ−ｈＧＤＦ１５：Ｒｔ＝１７．３３分
画分２：（１９Ｂ１）：ＡＨＡ−ＧＤＦ１５＋１ＦＡ：Ｒｔ＝２０．２分（およそ１５％の収率）
画分３：（１９Ｂ２）：ＡＨＡ−ＧＤＦ１５＋２ＦＡ：Ｒｔ＝２１．６分（およそ１５％の収率）
画分４：（１９Ｂ３）：ＡＨＡ−ＧＤＦ１５＋３ＦＡ：Ｒｔ＝２３．０分（およそ５％の収率）
１９Ｂ１および１９Ｂ２の１：１比の混合物を調製し、試験した（１９Ｂｍ）。

あるいは、反応は、４．７３のｐＨの、１０ｍＭＮａ_２ＨＰＯ_４−７Ｈ_２Ｏおよび３０ｍＭＮａＯＡｃ中で実行してもよい：分子生物学等級の水中の中間体３７の１０ｍｇ／ｍＬ溶液を調製した。ＡＨＡ−ｈＧＤＦ１５（中間体５７、３０ｍＭＮａＯＡｃｐＨ４．０中の１２．０４ｍｇ／ｍＬ、４．１５μＬ、０．００２μｍｏｌ）に、３０ｍＭＮａＯＡｃ１０ｍＭＮａ_２ＨＰＯ_４−７Ｈ_２ＯｐＨ４．７３を添加すると、０．８８ｍｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度が得られた。中間体３７（２０当量、６．８３μＬ、０．０４１μｍｏｌ）を添加し、反応物を室温で１８時間混合した。反応混合物は沈殿物で濁った。ＵＰＬＣ解析は、５８％の＋１および＋２生成物を示した（方法Ｊ）。

反応はまた、４．６のｐＨの、３０ｍＭＮａＯＡｃおよび１０ｍＭＫ_２ＨＰＯ_４中で実行してもよい：分子生物学等級の水中の中間体３７の１０ｍｇ／ｍＬの溶液を調製した。ＡＨＡ−ｈＧＤＦ１５（中間体５７、３０ｍＭＮａＯＡｃｐＨ４．０中の６．２１ｍｇ／ｍＬ、５．２６１ｍＬ、１．３３７μｍｏｌ）に、３０ｍＭＮａＯＡｃ１０ｍＭＫ_２ＨＰＯ_４ｐＨ４．６（許容範囲４．５〜５．０）を添加すると、０．８８ｍｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度が得られた。中間体３７（１０当量、６８．３μＬ、０．４０９μｍｏｌ）を添加し、反応物を室温で７時間混合した。反応混合物は、沈殿物で濁った。反応混合物を、１５ｍＬ１０ｋＤａＡｍｉｃｏｎ遠心フィルターの中で４つの９ｍＬの部分に分け、３０ｍＭＮａＯＡｃｐＨ４．０を用いて１５ｍＬに希釈した。材料を、３０ｍＭＮａＯＡｃｐＨ４．０に４回バッファー交換し、ピペットチップを用いて各洗浄の間に沈殿物をかき混ぜた。反応混合物を７５ｍＬの容量に濃縮した。沈殿物は残存し、そのため、材料を４℃で２日間保管した。Ａ２８０（３００４０ｃｍ^−１Ｍ^−１、２７５３８ｇ／ｍｏｌ）によって濃度を測定すると、０．４ｍｇ／ｍＬ（９７％）であった。ＵＰＬＣ解析は、＋１および＋２生成物の６１％回収を示した。

参考例１
中間体ＰＥＧ−ミリスチン酸構築物にコンジュゲートされたＨｉｓ−ｈＧＤＦ１５ＢＣＮ（Ｉ−５８）：
ステップ１：

アジド−ＰＥＧ２３−アミン（３０ｍｇ、０．０２７ｍｍｏｌ）およびミリスチックＮＨＳエステル（ＴｏｒｏｎｔｏＲｅｓｅａｒｃｈＣｈｅｍｉｃａｌｓ、カタログ番号Ｓ６９０８０）（１２ｍｇ、０．０３７ｍｍｏｌ）の混合物に、ＤＣＭ（１ｍＬ）およびＤＩＰＥＡ（１３ｕＬ）を添加し、混合物を室温で一晩撹拌した。混合物を、ＥｔＯＡｃ／ヘプタン（０〜１００％）、次いでＭｅＯＨ／ＤＣＭ（０〜１０％）を用いて溶出するシリカクロマトグラフィーによって精製すると、およそ５％ＭｅＯＨ／ＤＣＭで他の物質が入っていない生成物が得られた。ＬＣＭＳ：（勾配：１．４分で４０〜９８％Ｂ−フロー１ｍＬ／分溶出剤Ａ：水＋０．０５％ギ酸＋３．７５ｍＭ酢酸アンモニウム、溶出剤Ｂ：アセトニトリル＋０．０４％ギ酸）ＬＣＭＳ：ｒｔ＝２．２０（方法Ｃ）＋Ｈ理論質量：１３５４．７１実測質量：１３５４．４。

ステップ２：

ＢＣＮ−ｈＧＤＦ１５（Ｉ−５２：８００ｕＬ、０．２５ｍｇ／ｍＬ）の溶液に、（ＤＭＳＯ中、２ｍｇ／ｍＬ、６．３ｕＬ、１０当量）を添加し、混合物を室温で一晩撹拌した。定量的収量で１．１ｍＬ、０．２０ｍｇ／ｍＬ（Ｍａｌｄｉ：＋１理論質量：２８２２３実測質量：２８６４０；＋２理論質量：２９５４３；実測質量：２９９６２、＋３理論質量：３０８６３実測質量：３１４２６、＋４理論質量：３２１８３実測質量：３２９１１）。

参考例２
ｈｉｓ−ｈＧＤＦ１５−ＰＥＧ２３

３０ｍＭＮａＯＡｃｐＨ４．０（４２７μＬ）中のＨｉｓ−ｈＧＤＦ１５ＢＣＮ（Ｉ５９：４２７μＬ、１．１７ｍｇ／ｍＬ、０．０１９μｍｏｌ）の溶液に、アジド−ｄＰＥＧ２３−アミン（ＱｕａｎｔａＢｉｏｄｅｓｉｇｎ、１０４μｇ、０．０９４μｍｏｌ）を添加した。反応物を室温で１６時間混合し、その時点で、１０ｋＤａＭＷＣＯＡｍｉｃｏｎ遠心フィルターを使用して、サンプルを５回希釈および濃縮することによって、混合物を３０ｍＭＮａＯＡｃｐＨ４．０に交換して、１４０μＬの容量とした。ＭＡＬＤＩ解析は、＋１から＋４生成物への完全変換を示した。濃度は、Ａ２８０（２９０９０Ｍ−１ｃｍ−１、２７６００ｇ／ｍｏｌ）によって測定し、２．０９９ｍｇ／ｍＬ（５７％）であった。
本発明は次の態様を含む。
［１］ＧＤＦ１５変異体、ＧＤＦ１５融合タンパク質またはＧＤＦ１５コンジュゲートのうちの１つまたは複数を含むＧＤＦ１５治療剤の治療上有効な量を投与することによって、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、末期肝臓疾患、脂肪肝（hepatic steatosis）（脂肪肝（fatty liver））、肝臓線維症、肝臓炎症、肝硬変、原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）または肝細胞癌（ＨＣＣ）を処置する方法。
［２］前記ＧＤＦ１５治療剤が、ＧＤＦ１５コンジュゲートである、上記［１］に記載の方法。
［３］前記ＧＤＦ１５治療剤が、ＨＳＡ−ＧＤＦ１５融合タンパク質またはＦｃ−ＧＤＦ１５融合タンパク質である、上記［１］に記載の方法
［４］前記ＧＤＦ１５治療剤が、表１から選択される、上記［１］に記載の方法。
［５］ＧＤＦ１５タンパク質、ＧＤＦ１５変異体、ＧＤＦ１５突然変異体、ＧＤＦ１５融合物またはＧＤＦ１５コンジュゲートのうちの１つまたは複数を含むＧＤＦ１５治療剤の治療上有効な量を投与することによって、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）または非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）を処置する方法。
［６］前記ＧＤＦ１５治療剤が、脂肪酸−ＧＤＦ１５コンジュゲートまたはＰＥＧ−ＧＤＦ１５コンジュゲートである、上記［５］に記載の方法。
［７］前記ＧＤＦ１５治療剤が、ＨＳＡ−ＧＤＦ１５融合タンパク質またはＦｃ−ＧＤＦ１５融合タンパク質である、上記［５］に記載の方法。
［８］前記ＧＤＦ１５治療剤が、表１から選択される、上記［５］に記載の方法。
［９］ＧＤＦ１５タンパク質、ＧＤＦ１５変異体、ＧＤＦ１５突然変異体、ＧＤＦ１５融合物またはＧＤＦ１５コンジュゲートのうちの１つまたは複数を含むＧＤＦ１５治療剤を含む医薬組成物の治療上有効な量を投与することによって、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、末期肝臓疾患、脂肪肝（hepatic steatosis）（脂肪肝（fatty liver））、肝臓線維症、肝臓炎症、肝硬変、原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）または肝細胞癌（ＨＣＣ）を処置する方法。
［１０］前記ＧＤＦ１５治療剤が、脂肪酸−ＧＤＦ１５コンジュゲートまたはＰＥＧ−ＧＤＦ１５コンジュゲートである、上記［９］に記載の方法。
［１１］前記ＧＤＦ１５治療剤が、ＨＳＡ−ＧＤＦ１５融合タンパク質またはＦｃ−ＧＤＦ１５融合タンパク質である、上記［９］に記載の方法。
［１２］前記ＧＤＦ１５治療剤が、表１から選択される、上記［９］に記載の方法。
［１３］ＧＤＦ１５タンパク質、ＧＤＦ１５変異体、ＧＤＦ１５突然変異体、ＧＤＦ１５融合物またはＧＤＦ１５コンジュゲートのうちの１つまたは複数を含むＧＤＦ１５治療剤を含む医薬組成物の治療上有効な量を投与することによって、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）または非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）を処置する方法。
［１４］前記ＧＤＦ１５治療剤が、脂肪酸−ＧＤＦ１５コンジュゲートまたはＰＥＧ−ＧＤＦ１５コンジュゲートである、上記［１３］に記載の方法。
［１５］前記ＧＤＦ１５治療剤が、ＨＳＡ−ＧＤＦ１５融合タンパク質またはＦｃ−ＧＤＦ１５融合タンパク質である、上記［１３］に記載の方法。
［１６］前記ＧＤＦ１５治療剤が、表１から選択される、上記［１３］に記載の方法。
［１７］前記ＧＤＦ１５治療剤が、配列番号４１のアミノ酸配列を含むＧＤＦ１５ポリペプチドを含まない、上記［１］から［１６］のいずれか一項に記載の方法。
［１８］前記ＧＤＦ１５治療剤が、配列番号４１のアミノ酸配列を含む脂肪酸−ＧＤＦ１５コンジュゲートではない、上記［１］から［１７］のいずれか一項に記載の方法。
［１９］前記ＧＤＦ１５治療剤が、以下のアミノ配列：
（ｉ）配列番号４１；
（ｉｉ）ＭＨＨＨＨＨＨＡＲＮＧＤＨＣＰＬＧＰＧＲＣＣＲＬＨＴＶＲＡＳＬＥＤＬＧＷＡＤＷＶＬＳＰＲＥＶＱＶＴＭＣＩＧＡＣＰＳＱＦＲＡＡＮＭＨＡＱＩＫＴＳＬＨＲＬＫＰＤＴＶＰＡＰＣＣＶＰＡＳＹＮＰＭＶＬＩＱＫＴＤＴＧＶＳＬＱＴＹＤＤＬＬＡＫＤＣＨＣＩ（Ｍ−（ｈｉｓ）６−ｈＧＤＦ１５（１９７〜３０８））（配列番号３２１）、
（ｉｉｉ）ＭＨＨＨＨＨＨＭＡＲＮＧＤＨＣＰＬＧＰＧＲＣＣＲＬＨＴＶＲＡＳＬＥＤＬＧＷＡＤＷＶＬＳＰＲＥＶＱＶＴＭＣＩＧＡＣＰＳＱＦＲＡＡＮＭＨＡＱＩＫＴＳＬＨＲＬＫＰＤＴＶＰＡＰＣＣＶＰＡＳＹＮＰＭＶＬＩＱＫＴＤＴＧＶＳＬＱＴＹＤＤＬＬＡＫＤＣＨＣＩ（Ｍ−（ｈｉｓ）６−Ｍ−ｈＧＤＦ１５（１９７〜３０８））（配列番号３２２）、
（ｉｖ）ＭＨＨＨＨＨＨＡＨＡＲＤＧＣＰＬＧＥＧＲＣＣＲＬＱＳＬＲＡＳＬＱＤＬＧＷＡＮＷＶＶＡＰＲＥＬＤＶＲＭＣＶＧＡＣＰＳＱＦＲＳＡＮＴＨＡＱＭＱＡＲＬＨＧＬＮＰＤＡＡＰＡＰＣＣＶＰＡＳＹＥＰＶＶＬＭＨＱＤＳＤＧＲＶＳＬＴＰＦＤＤＬＶＡＫＤＣＨＣＶ（Ｍ−（ｈｉｓ）６−ｄＧＤＦ１５）（配列番号３２３）、
（ｖ）ＭＨＮＧＤＨＣＰＬＧＰＧＲＣＣＲＬＨＴＶＲＡＳＬＥＤＬＧＷＡＤＷＶＬＳＰＲＥＶＱＶＴＭＣＩＧＡＣＰＳＱＦＲＡＡＮＭＨＡＱＩＫＴＳＬＨＲＬＫＰＤＴＶＰＡＰＣＣＶＰＡＳＹＮＰＭＶＬＩＱＫＴＤＴＧＶＳＬＱＴＹＤＤＬＬＡＫＤＣＨＣＩ（ＭＨｈＧＤＦ１５（１９９〜３０８））（配列番号３２４）、
（ｖｉ）ＭＨＡＧＤＨＣＰＬＧＰＧＲＣＣＲＬＨＴＶＲＡＳＬＥＤＬＧＷＡＤＷＶＬＳＰＲＥＶＱＶＴＭＣＩＧＡＣＰＳＱＦＲＡＡＮＭＨＡＱＩＫＴＳＬＨＲＬＫＰＤＴＶＰＡＰＣＣＶＰＡＳＹＮＰＭＶＬＩＱＫＴＤＴＧＶＳＬＱＴＹＤＤＬＬＡＫＤＣＨＣＩ（ＭＨＡ−ｈＧＤＦ１５（２００〜３０８））（配列番号３２５）、または
（ｖｉｉ）ＡＨＮＧＤＨＣＰＬＧＰＧＲＣＣＲＬＨＴＶＲＡＳＬＥＤＬＧＷＡＤＷＶＬＳＰＲＥＶＱＶＴＭＣＩＧＡＣＰＳＱＦＲＡＡＮＭＨＡＱＩＫＴＳＬＨＲＬＫＰＤＴＶＰＡＰＣＣＶＰＡＳＹＮＰＭＶＬＩＱＫＴＤＴＧＶＳＬＱＴＹＤＤＬＬＡＫＤＣＨＣＩ（ＡＨ−ｈＧＤＦ１５（１９９〜３０８）（配列番号３２６）
を含まない脂肪酸コンジュゲートである、上記［１］、［２］、［４］、［５］、［６］、８］、［９］、［１０］、［１２］から［１４］および［１６］のいずれか一項に記載の方法。
［２０］前記ＧＤＦ１５治療剤が、ヒト血清アルブミン−ＧＤＦ１５融合物などの、配列番号４１のアミノ酸配列を含むアルブミン−ＧＤＦ１５融合物ではない、上記［１］から［１７］のいずれか一項に記載の方法。
［２１］前記ＧＤＦ１５治療剤が、以下：配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号４２〜６３、配列番号６９〜１０７、配列番号１４８、配列番号１４９および配列番号３２０のうちのいずれか１つ、または以下：配列番号４２〜６３、配列番号６９〜１０７、配列番号１４８、配列番号１４９および配列番号３２０のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む、上記［１］から［１６］のいずれか一項に記載の方法。
［２２］前記ＧＤＦ１５治療剤が、以下のアミノ酸配列：
（ｉ）ＭＨＨＨＨＨＨＡＲＮＧＤＨＣＰＬＧＰＧＲＣＣＲＬＨＴＶＲＡＳＬＥＤＬＧＷＡＤＷＶＬＳＰＲＥＶＱＶＴＭＣＩＧＡＣＰＳＱＦＲＡＡＮＭＨＡＱＩＫＴＳＬＨＲＬＫＰＤＴＶＰＡＰＣＣＶＰＡＳＹＮＰＭＶＬＩＱＫＴＤＴＧＶＳＬＱＴＹＤＤＬＬＡＫＤＣＨＣＩ（Ｍ−（ｈｉｓ）６−ｈＧＤＦ１５（１９７〜３０８））（配列番号３２１）、
（ｉｉ）配列番号６、
（ｉｉｉ）配列番号７、
（ｉｖ）ＭＨＨＨＨＨＨＭＡＲＮＧＤＨＣＰＬＧＰＧＲＣＣＲＬＨＴＶＲＡＳＬＥＤＬＧＷＡＤＷＶＬＳＰＲＥＶＱＶＴＭＣＩＧＡＣＰＳＱＦＲＡＡＮＭＨＡＱＩＫＴＳＬＨＲＬＫＰＤＴＶＰＡＰＣＣＶＰＡＳＹＮＰＭＶＬＩＱＫＴＤＴＧＶＳＬＱＴＹＤＤＬＬＡＫＤＣＨＣＩ（Ｍ−（ｈｉｓ）６−Ｍ−ｈＧＤＦ１５（１９７〜３０８））（配列番号３２２）、
（ｖ）ＭＨＨＨＨＨＨＡＨＡＲＤＧＣＰＬＧＥＧＲＣＣＲＬＱＳＬＲＡＳＬＱＤＬＧＷＡＮＷＶＶＡＰＲＥＬＤＶＲＭＣＶＧＡＣＰＳＱＦＲＳＡＮＴＨＡＱＭＱＡＲＬＨＧＬＮＰＤＡＡＰＡＰＣＣＶＰＡＳＹＥＰＶＶＬＭＨＱＤＳＤＧＲＶＳＬＴＰＦＤＤＬＶＡＫＤＣＨＣＶ（Ｍ−（ｈｉｓ）６−ｄＧＤＦ１５）（配列番号３２３）、
（ｖｉ）ＭＨＮＧＤＨＣＰＬＧＰＧＲＣＣＲＬＨＴＶＲＡＳＬＥＤＬＧＷＡＤＷＶＬＳＰＲＥＶＱＶＴＭＣＩＧＡＣＰＳＱＦＲＡＡＮＭＨＡＱＩＫＴＳＬＨＲＬＫＰＤＴＶＰＡＰＣＣＶＰＡＳＹＮＰＭＶＬＩＱＫＴＤＴＧＶＳＬＱＴＹＤＤＬＬＡＫＤＣＨＣＩ（ＭＨ−ｈＧＤＦ１５（１９９〜３０８））（配列番号３２４）、
（ｖｉｉ）ＭＨＡＧＤＨＣＰＬＧＰＧＲＣＣＲＬＨＴＶＲＡＳＬＥＤＬＧＷＡＤＷＶＬＳＰＲＥＶＱＶＴＭＣＩＧＡＣＰＳＱＦＲＡＡＮＭＨＡＱＩＫＴＳＬＨＲＬＫＰＤＴＶＰＡＰＣＣＶＰＡＳＹＮＰＭＶＬＩＱＫＴＤＴＧＶＳＬＱＴＹＤＤＬＬＡＫＤＣＨＣＩ（ＭＨＡ−ｈＧＤＦ１５（２００〜３０８））（配列番号３２５）、
（ｖｉｉｉ）配列番号４１、および
（ｉｘ）ＡＨＮＧＤＨＣＰＬＧＰＧＲＣＣＲＬＨＴＶＲＡＳＬＥＤＬＧＷＡＤＷＶＬＳＰＲＥＶＱＶＴＭＣＩＧＡＣＰＳＱＦＲＡＡＮＭＨＡＱＩＫＴＳＬＨＲＬＫＰＤＴＶＰＡＰＣＣＶＰＡＳＹＮＰＭＶＬＩＱＫＴＤＴＧＶＳＬＱＴＹＤＤＬＬＡＫＤＣＨＣＩ（ＡＨ−ｈＧＤＦ１５（１９９〜３０８）（配列番号３２６）
のうちの１つを含まない、上記［１］から［１６］のいずれか一項に記載の方法。
［２３］前記ＧＤＦ１５治療剤が、式Ａ１、Ａ２およびＡ３：

［Ｒ ^１は、ＣＯ _２ＨまたはＨであり、
Ｒ ^２、Ｒ ^３およびＲ ^４は、互いに独立して、Ｈ、ＯＨ、ＣＯ _２Ｈ、−ＣＨ＝ＣＨ _２または−Ｃ≡ＣＨであり、
Ａｋは、分岐Ｃ _６〜Ｃ _３０アルキレンであり、
ｎ、ｍおよびｐは互いに独立して、６から３０の間の整数である］のうちのいずれか１つである脂肪酸を含まず、テトラデカン酸を含まない脂肪酸−ＧＤＦ１５コンジュゲートである、上記［１］、［２］、［４］、［５］、［６］、［８］、［９］、［１０］、［１２］から［１４］および［１６］のいずれか一項に記載の方法。
［２４］前記ＧＤＦ１５治療剤が、以下の脂肪酸：

のうちの１つまたは複数を含まない脂肪酸−ＧＤＦ１５コンジュゲートである、上記［１］、［２］、［４］、［５］、［６］、［８］、［９］、［１０］、［１２］から［１４］、［１６］および［２２］のいずれか一項に記載の方法。

Claims

非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、および／もしくは非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、並びにまたは前記ＮＡＦＬＤもしくは前記ＮＡＳＨ誘発性の末期肝臓疾患、脂肪肝（hepatic steatosis）（脂肪肝（fatty liver））、肝臓線維症、肝臓炎症、肝硬変、原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）、もしくは肝細胞癌（ＨＣＣ）の処置に用いられる、ＧＤＦ１５タンパク質、ＧＤＦ１５タンパク質機能的変異体、ＧＤＦ１５融合タンパク質、またはＧＤＦ１５コンジュゲートの１つもしくは複数を含む、ＧＤＦ１５治療剤であって、
以下：配列番号４２〜６３、配列番号６９〜９２、配列番号９４〜１００、配列番号１０３〜１０７、配列番号１４８、配列番号１４９、および配列番号３２０のうちいずれか１つのアミノ酸配列を含む、ＧＤＦ１５治療剤。
前記ＧＤＦ１５治療剤が、ＧＤＦ１５コンジュゲートである、請求項１に記載のＧＤＦ１５治療剤。
前記ＧＤＦ１５治療剤が、ＨＳＡ−ＧＤＦ１５融合タンパク質である、請求項１に記載のＧＤＦ１５治療剤。
前記ＧＤＦ治療剤が、Ｆｃ−ＧＤＰ融合タンパク質である、請求項１に記載のＧＤＦ１５治療剤。
前記ＧＤＦ１５治療剤が、脂肪酸−ＧＤＦ１５コンジュゲートまたはＰＥＧ−ＧＤＦ１５コンジュゲートである、請求項１に記載のＧＤＦ１５治療剤。