JP6889769B2 - 核酸配列決定の非対称な鋳型および非対称な方法 - Google Patents

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Description

本発明は、核酸配列決定の分野に、より具体的には核酸配列決定のための環状鋳型の調製に関する。
配列決定のための環状鋳型の使用は、当該技術で既知である。例えば、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓは、そのような鋳型を生成するためにＳＭＲＴＢｅｌｌ（商標）アダプターを用いている。米国特許第７，３０２，１４６号および第８，１５３，３７５号を参照。環状一本鎖鋳型は、合成による配列決定においていくつかの利点を有する：配列決定ポリメラーゼがローリングサークル複製を行うことができる場合、鋳型は、多数回読まれると考えられ、ワトソンおよびクリック鎖の両方が読まれるであろう。対合した鎖の多数回の読みは、より正確なコンセンサス配列の出力を約束する。しかし、既存の環状鋳型は、２つの配列決定ポリメラーゼをそれぞれの鋳型に結合させるように設計されている。その２つのポリメラーゼは、互いに干渉して合成の失速または終結を引き起こし、最適以下の配列決定データを生成する可能性を有する。本発明は、既存の技術に改良を加えてより正確な配列決定の読みを可能にする。
米国特許第７，３０２，１４６号 米国特許第８，１５３，３７５号
ある態様において、本発明は、以下の工程を含む、試料中の二本鎖標的核酸の配列を決定する方法である：二本鎖標的核酸を含む試料を、二本鎖ステム領域および一本鎖ループ領域を含むヘアピンアダプター分子と接触させ；標的核酸分子のそれぞれの末端をアダプター分子の二本鎖領域にライゲーションし、それにより、標的核酸を含み、かつ二本鎖領域ならびに二本鎖領域に共有結合的に連結された近位一本鎖ループ領域および遠位一本鎖ループ領域を有する環状ジョイント分子を形成し；試料を固体支持体に繋がれた限られた濃度のブロッキングオリゴヌクレオチド（ここで、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、核酸ポリメラーゼにより伸長不能であり、近位および遠位一本鎖ループ領域に相補的である）と接触させ、それにより環状ジョイント分子を固体支持体上で捕捉し、近位一本鎖ループ領域をブロックし；試料を近位および遠位一本鎖ループ領域に相補的なオリゴヌクレオチドプライマーと接触させ、それによりプライマーを遠位一本鎖ループ領域にハイブリダイズさせ；プライマーを配列決定ポリメラーゼにより伸長し、それにより二本鎖標的核酸の配列を決定する。ある態様において、標的核酸およびアダプターの末端は、平滑である。ある態様において、標的核酸およびアダプターの末端は、酵素処理により突出状にされている。酵素処理は、ヌクレオチド付加ならびに標的核酸およびアダプターの制限エンドヌクレアーゼによる消化であることができる。ブロッキングオリゴヌクレオチドは、支持体分子との共有結合または支持体分子との非共有結合から選択される手段により固体支持体に繋ぐことができる。支持体分子との非共有結合は、ビオチン−ストレプトアビジン、抗体−抗原またはブロッキングオリゴヌクレオチドの固体支持体に共有結合的もしくは非共有結合的に連結された相補的オリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションから選択される特異的相互作用であることができる。ブロッキングオリゴヌクレオチドは、核酸ポリメラーゼにより伸長不能であることができる。ブロッキングオリゴヌクレオチドは、３’−Ｈ、２’−ホスフェートおよび３’−ホスフェートから選択される化学修飾により、核酸ポリメラーゼにより伸長不能にされることができる。ブロッキングオリゴヌクレオチドは、核酸ポリメラーゼの結合を妨げる修飾を有することができる。ブロッキングオリゴヌクレオチドは、その３’末端を介して固体支持体に連結されているせいで核酸ポリメラーゼにより伸長不能であることができる。ブロッキングオリゴヌクレオチドは、１以上の二本鎖安定化修飾、例えばＬＮＡ、ＰＮＡおよび非天然ヌクレオチドを含むことができる。ブロッキングオリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼ消化をブロックする１以上の修飾、例えばホスホロチオエート骨格を含む。固体支持体のそれぞれの粒子は、多数のブロッカーオリゴヌクレオチドに連結されている。ある態様において、その方法は、さらに固体支持体上に捕捉されていない環状分子を除去する工程を含むことができる。配列決定は、単分子配列決定、合成による配列決定、ナノポア配列決定またはトンネル効果認識配列決定であることができる。ある態様において、プライマーの伸長は、鎖置換ポリメラーゼによるか、またはローリングサークル複製による。ある態様において、二本鎖標的核酸は、インビトロで一本鎖標的核酸から生成される。
ある態様において、本発明は、以下の工程を含む、試料中の二本鎖標的核酸の配列を決定する方法である：二本鎖標的核酸を含む試料を、それぞれが二本鎖ステム領域および第１一本鎖ループ領域または第２一本鎖ループ領域を含む第１および第２ヘアピンアダプター分子の混合物と接触させ；標的核酸分子のそれぞれの末端をアダプター分子の二本鎖領域にライゲーションし、それにより、標的核酸を含み、かつ二本鎖領域ならびに二本鎖領域に共有結合的に連結された一端に第１一本鎖ループ領域および他端に第２一本鎖ループ領域を有する環状ジョイント分子を形成し；試料を固体支持体に繋がれた限られた濃度のブロッキングオリゴヌクレオチド（ここで、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、核酸ポリメラーゼにより伸長不能であり、第１一本鎖ループ領域に相補的である）と接触させ、それにより環状分子を固体支持体上で捕捉し、第１一本鎖ループ領域をブロックし；試料を第２一本鎖ループ領域に相補的なオリゴヌクレオチドプライマーと接触させ、それによりプライマーを第２一本鎖ループ領域にハイブリダイズさせ；プライマーを配列決定ポリメラーゼにより伸長し、それにより二本鎖標的核酸の配列を決定する。標的核酸およびアダプターの末端は、平滑であることができ、または酵素処理により突出状にされていることもでき、それは、ヌクレオチド付加ならびに標的核酸およびアダプターの制限エンドヌクレアーゼによる消化から選択されることができる。ある態様において、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、支持体分子との共有結合または支持体分子との非共有結合から選択される手段により固体支持体に繋がれている。支持体分子との非共有結合は、ビオチン−ストレプトアビジン、抗体−抗原またはブロッキングオリゴヌクレオチドの固体支持体に共有結合的もしくは非共有結合的に連結された相補的オリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションから選択される特異的相互作用であることができる。ブロッキングオリゴヌクレオチドは、例えば３’−Ｈ，２’−ホスフェートおよび３’−ホスフェートから選択される化学修飾により、核酸ポリメラーゼにより伸長不能であることができる。ブロッキングオリゴヌクレオチドは、核酸ポリメラーゼの結合を妨げる修飾を有することができる。ブロッキングオリゴヌクレオチドは、その３’末端を介して固体支持体に連結されているせいで核酸ポリメラーゼにより伸長不能であることができる。ブロッキングオリゴヌクレオチドは、１以上の二本鎖安定化修飾、例えばロックド（ｌｏｃｋｅｄ）核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）および非天然ヌクレオチドを含むことができる。ブロッキングオリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼ消化をブロックする１以上の修飾、例えばホスホロチオエート骨格を含むことができる。ある態様において、固体支持体のそれぞれの粒子は、多数のブロッカーオリゴヌクレオチドに連結されている。ある態様において、その方法は、さらに固体支持体上に捕捉されていない核酸の除去を含む。ある態様において、配列決定は、単分子配列決定、合成による配列決定、ナノポア配列決定またはトンネル効果認識配列決定である。ある態様において、プライマーの伸長は、鎖置換ポリメラーゼによるか、またはローリングサークル複製による。ある態様において、二本鎖標的核酸は、インビトロで一本鎖標的核酸から生成される。
ある態様において、本発明は、以下の工程を含む、試料中の二本鎖標的核酸の配列を決定する方法である：２つの５’末端および２つの伸長可能な３’末端を有する二本鎖標的核酸を含む試料を、ターミナルトランスフェラーゼ、単一の伸長可能なヌクレオチド種と接触させ、ターミナルトランスフェラーゼによるヌクレオチドの組み込みを制御するための手段を提供し、伸長可能な３’末端を、多数単位の一種類のヌクレオチドを組み込むことにより伸長し、それにより、標的核酸を含み、かつ二本鎖領域ならびに近位および遠位一本鎖ホモポリマー領域を有する線状ジョイント分子を形成し；試料を固体支持体に繋がれた限られた濃度の捕捉オリゴヌクレオチド（ここで、捕捉オリゴヌクレオチドは、近位および遠位一本鎖ホモポリマー領域に相補的である）と接触させ、それにより線状分子を固体支持体上で捕捉し；試料を近位および遠位一本鎖ホモポリマー領域に相補的なオリゴヌクレオチドプライマーと接触させ、それによりプライマーを遠位一本鎖ホモポリマー領域にハイブリダイズさせ；プライマーを配列決定ポリメラーゼにより伸長し、それにより二本鎖標的核酸の配列を決定する。ターミナルトランスフェラーゼによるヌクレオチドの組み込みを制御するための手段は、反応中の伸長可能なヌクレオチドを有利にする比率でのターミネーターヌクレオチド種の存在または組み込み反応の時間である。ある態様において、捕捉オリゴヌクレオチドは、伸長可能であり、該方法は、さらに捕捉オリゴヌクレオチドを標的核酸の末端に達するまで伸長することを含む。該方法は、さらに、伸長した捕捉オリゴヌクレオチドを標的核酸の末端とライゲーションして連続した核酸鎖を作り出す工程を含むことができる。ブロッキングオリゴヌクレオチドは、支持体分子との共有結合または支持体分子との非共有結合から選択される手段により固体支持体に繋ぐことができる。支持体分子との非共有結合は、ビオチン−ストレプトアビジン、抗体−抗原またはブロッキングオリゴヌクレオチドの固体支持体に共有結合的もしくは非共有結合的に連結された相補的オリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションから選択される特異的相互作用であることができる。ある態様において、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、１以上の二本鎖安定化修飾、例えばロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）および非天然ヌクレオチドを含む。ある態様において、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼ消化をブロックする１以上の修飾、例えばホスホロチオエート骨格を含む。ある態様において、固体支持体のそれぞれの粒子は、多数のブロッカーオリゴヌクレオチドに連結されている。ある態様において、その方法は、さらに固体支持体上に捕捉されていない核酸を除去する工程を含む。ある態様において、それぞれの線状分子は、標的核酸の近位末端をブロックする一方で第１非ターミネーターヌクレオチドを含む混合物により遠位末端を伸長し、近位末端のブロックを外し、そして第２非ターミネーターヌクレオチドを含む混合物により近位末端を伸長することにより作り出された２種類の異なるホモポリマーを有する。ある態様において、配列決定は、単分子配列決定、合成による配列決定、ナノポア配列決定またはトンネル効果認識配列決定である。ある態様において、二本鎖標的核酸は、インビトロで一本鎖標的核酸から生成される。
ある態様において、本発明は、以下のものを含む、二本鎖標的核酸の配列を決定するための組成物である：それぞれの末端において二本鎖ステム領域および一本鎖ループ領域を含むアダプター分子にライゲーションした標的核酸を含む環状ジョイント分子（その環状ジョイント分子は、二本鎖領域ならびに二本鎖領域に共有結合的に連結された近位一本鎖ループ領域および遠位一本鎖ループ領域を有する）；固体支持体に繋がれたブロッキングオリゴヌクレオチド（ここで、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、核酸ポリメラーゼにより伸長不能であり、近位一本鎖ループ領域にハイブリダイズし、それにより環状ジョイント分子を固体支持体上で捕捉し、近位一本鎖ループ領域をブロックする）；遠位一本鎖ループ領域にハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドプライマー；ならびに配列決定ポリメラーゼ。
ある態様において、本発明は、以下のものを含む、二本鎖標的核酸の配列を決定するための組成物である：標的核酸を含み、二本鎖領域ならびに近位および遠位一本鎖ホモポリマー領域を有する線状ジョイント分子；固体支持体に繋がれ、近位一本鎖ホモポリマー領域にハイブリダイズし、それにより線状分子を固体支持体上で捕捉する捕捉オリゴヌクレオチド；遠位一本鎖ホモポリマー領域にハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドプライマー；ならびに配列決定ポリメラーゼ。
図１は、環状鋳型を作製および配列決定する先行技術の方法を示す。アダプターにハイブリダイズした捕捉プローブは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７として示されている配列＋アダプターのヘアピン領域に相補的な追加の配列を含む。 図２は、本発明の方法の一態様を示す。アダプターにハイブリダイズした捕捉プローブは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８として示されている配列＋アダプターのヘアピン領域に相補的な追加の配列を含む。 図３は、図２において図示された構造のヌクレオチド配列の詳細を示す。ヘアピンアダプターＡは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１において示されている配列を含む。ヘアピンアダプターＢは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２において示されている配列を含む。捕捉プローブは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４として示されている。配列決定プライマーは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５として示されている。 図４は、ホモポリマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）を有する対称線状鋳型を示す。 図５は、配列決定ポリメラーゼの非対称な装填を有する対称線状鋳型を示す（ホモポリマーは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９として示されている）。 図６は、図２において図示されている構造の別の態様のヌクレオチド配列の詳細を示す。ヘアピンアダプターＡは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１において示されている配列を含む。ヘアピンアダプターＣは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３において示されている配列を含む。ビーズに連結された捕捉配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０において示されている。配列決定プライマーは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５として示されている。 図７は、図２において図示されている構造の別の態様のヌクレオチド配列の詳細を示す。ヘアピンアダプターＡは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１において示されている配列を含む。ヘアピンアダプターＢは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２において示されている配列を含む。捕捉プローブ／配列決定プライマーは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６として示されている。 図８Ａ〜８Ｆは、本発明の方法に従う配列決定のための配列決定ライブラリーを調製するために用いられる一連の組み立ての作業の流れを示す。作業の流れは、オリゴ−ｄＴ捕捉プローブを用いて開始する（図８Ａ）。捕捉プローブ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）が、捕捉ビーズに添加されて捕捉プローブ−捕捉ビーズ複合体を形成する（図８Ｂ）。二本鎖標的核酸分子および２つのヘアピンアダプター（ヘアピンアダプターＡおよびＢ、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１および２を含む）を含む環状配列決定鋳型が、捕捉プローブ−捕捉ビーズ複合体と接触させられて（図８Ｃ）、捕捉ビーズ、捕捉プローブおよび環状配列決定鋳型の複合体を形成する。次いで、配列決定プライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）（図８Ｄ）および配列決定ポリメラーゼ（図８Ｅ）が、添加される。図８Ｆは、構成要素が図８Ａ〜８Ｅにおいて示されている通りに添加された場合の組み立てられた配列決定ライブラリーの構成要素の分析を示す。ビーズ、捕捉プローブおよびライブラリー分子が全て含まれていた場合のみ、３つ全てが、最終的な組み立てられた複合体において検出されるであろう。 図８Ａ〜８Ｆは、本発明の方法に従う配列決定のための配列決定ライブラリーを調製するために用いられる一連の組み立ての作業の流れを示す。作業の流れは、オリゴ−ｄＴ捕捉プローブを用いて開始する（図８Ａ）。捕捉プローブ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）が、捕捉ビーズに添加されて捕捉プローブ−捕捉ビーズ複合体を形成する（図８Ｂ）。二本鎖標的核酸分子および２つのヘアピンアダプター（ヘアピンアダプターＡおよびＢ、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１および２を含む）を含む環状配列決定鋳型が、捕捉プローブ−捕捉ビーズ複合体と接触させられて（図８Ｃ）、捕捉ビーズ、捕捉プローブおよび環状配列決定鋳型の複合体を形成する。次いで、配列決定プライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）（図８Ｄ）および配列決定ポリメラーゼ（図８Ｅ）が、添加される。図８Ｆは、構成要素が図８Ａ〜８Ｅにおいて示されている通りに添加された場合の組み立てられた配列決定ライブラリーの構成要素の分析を示す。ビーズ、捕捉プローブおよびライブラリー分子が全て含まれていた場合のみ、３つ全てが、最終的な組み立てられた複合体において検出されるであろう。 図８Ａ〜８Ｆは、本発明の方法に従う配列決定のための配列決定ライブラリーを調製するために用いられる一連の組み立ての作業の流れを示す。作業の流れは、オリゴ−ｄＴ捕捉プローブを用いて開始する（図８Ａ）。捕捉プローブ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）が、捕捉ビーズに添加されて捕捉プローブ−捕捉ビーズ複合体を形成する（図８Ｂ）。二本鎖標的核酸分子および２つのヘアピンアダプター（ヘアピンアダプターＡおよびＢ、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１および２を含む）を含む環状配列決定鋳型が、捕捉プローブ−捕捉ビーズ複合体と接触させられて（図８Ｃ）、捕捉ビーズ、捕捉プローブおよび環状配列決定鋳型の複合体を形成する。次いで、配列決定プライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）（図８Ｄ）および配列決定ポリメラーゼ（図８Ｅ）が、添加される。図８Ｆは、構成要素が図８Ａ〜８Ｅにおいて示されている通りに添加された場合の組み立てられた配列決定ライブラリーの構成要素の分析を示す。ビーズ、捕捉プローブおよびライブラリー分子が全て含まれていた場合のみ、３つ全てが、最終的な組み立てられた複合体において検出されるであろう。 図８Ａ〜８Ｆは、本発明の方法に従う配列決定のための配列決定ライブラリーを調製するために用いられる一連の組み立ての作業の流れを示す。作業の流れは、オリゴ−ｄＴ捕捉プローブを用いて開始する（図８Ａ）。捕捉プローブ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）が、捕捉ビーズに添加されて捕捉プローブ−捕捉ビーズ複合体を形成する（図８Ｂ）。二本鎖標的核酸分子および２つのヘアピンアダプター（ヘアピンアダプターＡおよびＢ、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１および２を含む）を含む環状配列決定鋳型が、捕捉プローブ−捕捉ビーズ複合体と接触させられて（図８Ｃ）、捕捉ビーズ、捕捉プローブおよび環状配列決定鋳型の複合体を形成する。次いで、配列決定プライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）（図８Ｄ）および配列決定ポリメラーゼ（図８Ｅ）が、添加される。図８Ｆは、構成要素が図８Ａ〜８Ｅにおいて示されている通りに添加された場合の組み立てられた配列決定ライブラリーの構成要素の分析を示す。ビーズ、捕捉プローブおよびライブラリー分子が全て含まれていた場合のみ、３つ全てが、最終的な組み立てられた複合体において検出されるであろう。 図８Ａ〜８Ｆは、本発明の方法に従う配列決定のための配列決定ライブラリーを調製するために用いられる一連の組み立ての作業の流れを示す。作業の流れは、オリゴ−ｄＴ捕捉プローブを用いて開始する（図８Ａ）。捕捉プローブ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）が、捕捉ビーズに添加されて捕捉プローブ−捕捉ビーズ複合体を形成する（図８Ｂ）。二本鎖標的核酸分子および２つのヘアピンアダプター（ヘアピンアダプターＡおよびＢ、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１および２を含む）を含む環状配列決定鋳型が、捕捉プローブ−捕捉ビーズ複合体と接触させられて（図８Ｃ）、捕捉ビーズ、捕捉プローブおよび環状配列決定鋳型の複合体を形成する。次いで、配列決定プライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）（図８Ｄ）および配列決定ポリメラーゼ（図８Ｅ）が、添加される。図８Ｆは、構成要素が図８Ａ〜８Ｅにおいて示されている通りに添加された場合の組み立てられた配列決定ライブラリーの構成要素の分析を示す。ビーズ、捕捉プローブおよびライブラリー分子が全て含まれていた場合のみ、３つ全てが、最終的な組み立てられた複合体において検出されるであろう。 図８Ａ〜８Ｆは、本発明の方法に従う配列決定のための配列決定ライブラリーを調製するために用いられる一連の組み立ての作業の流れを示す。作業の流れは、オリゴ−ｄＴ捕捉プローブを用いて開始する（図８Ａ）。捕捉プローブ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）が、捕捉ビーズに添加されて捕捉プローブ−捕捉ビーズ複合体を形成する（図８Ｂ）。二本鎖標的核酸分子および２つのヘアピンアダプター（ヘアピンアダプターＡおよびＢ、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１および２を含む）を含む環状配列決定鋳型が、捕捉プローブ−捕捉ビーズ複合体と接触させられて（図８Ｃ）、捕捉ビーズ、捕捉プローブおよび環状配列決定鋳型の複合体を形成する。次いで、配列決定プライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）（図８Ｄ）および配列決定ポリメラーゼ（図８Ｅ）が、添加される。図８Ｆは、構成要素が図８Ａ〜８Ｅにおいて示されている通りに添加された場合の組み立てられた配列決定ライブラリーの構成要素の分析を示す。ビーズ、捕捉プローブおよびライブラリー分子が全て含まれていた場合のみ、３つ全てが、最終的な組み立てられた複合体において検出されるであろう。
定義
用語“試料”は、標的核酸を含有する、または含有することが推定されるあらゆる組成物を指す。これは、個人から分離された組織または流体の試料、例えば皮膚、血漿、血清、脊髄液、リンパ液、滑液、尿、涙、血球、器官および腫瘍を含み、個人から採取された細胞から確立されたインビトロ培養物の試料も含み、ホルマリン固定されパラフィン包理された試料（ＦＦＰＥＴ）およびそれらから単離された核酸も含む。試料は、無細胞材料、例えば無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）または循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）を含有する無細胞血液画分も含むことができる。
用語“核酸”は、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびそれらの下位カテゴリー、例えばｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ等を含むヌクレオチド（例えばリボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチド、天然および非天然両方）のポリマーを指す。核酸は、一本鎖であることも二本鎖であることもでき、一般に５’−３’ホスホジエステル結合を含有するであろうが、ある場合には、ヌクレオチド類似体が、他の結合を有し得る。核酸は、天然存在塩基（アデノシン、グアノシン、シトシン、ウラシルおよびチミジン）ならびに非天然塩基を含むことができる。非天然塩基の一部の例は、例えばSeela et al., (1999) Helv. Chim. Acta 82:1640において記載されている非天然塩基を含む。非天然塩基は、特定の機能、例えば核酸二本鎖の安定性の増大、ヌクレアーゼ消化の阻害またはプライマー伸長もしくは鎖重合の遮断を有することができる。
用語“ポリヌクレオチド”および“オリゴヌクレオチド”は、互換的に用いられている。ポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖核酸である。オリゴヌクレオチドは、より短いポリヌクレオチドを記載するために時々用いられる用語である。オリゴヌクレオチドは、少なくとも６ヌクレオチドまたは約１５〜３０ヌクレオチドで構成されることができる。オリゴヌクレオチドは、当該技術で既知のあらゆる適切な方法により、例えばNarang et al. (1979) Meth. Enzymol. 68:90-99; Brown et al. (1979) Meth. Enzymol. 68:109-151; Beaucage et al. (1981) Tetrahedron Lett. 22:1859-1862; Matteucci et al. (1981) J. Am. Chem. Soc. 103:3185-3191において記載されているような直接的な化学合成を含む方法により調製される。
用語“プライマー”は、標的核酸中の配列（“プライマー結合部位”）にハイブリダイズして核酸の相補鎖に沿った合成の開始点の役目をそのような合成に適した条件下で果たすことができる一本鎖オリゴヌクレオチドを指す。
用語“アダプター”は、別の配列にその配列に追加の特性を導入するために付加されることができるヌクレオチド配列を意味する。アダプターは、典型的には一本鎖もしくは二本鎖であることができる、または一本鎖部分および二本鎖部分の両方を有することができるオリゴヌクレオチドである。
用語“ライゲーション”は、２つの核酸鎖を連結する縮合反応を指し、ここで、一方の分子の５’−ホスフェート基が、別の分子の３’−ヒドロキシル基と反応する。ライゲーションは、典型的にはリガーゼまたはトポイソメラーゼにより触媒される酵素反応である。ライゲーションは、２つの一本鎖を連結して１つの一本鎖分子を作り出すことができる。ライゲーションは、それぞれが二本鎖分子に属する２つの鎖を連結し、そうして２つの二本鎖分子を連結することもできる。ライゲーションは、二本鎖分子の両方の鎖を別の二本鎖分子の両方の鎖に連結し、そうして２つの二本鎖分子を連結することもできる。ライゲーションは、二本鎖分子内の鎖の２つの末端を連結し、そうして二本鎖分子中のニックを修復することもできる。
用語“バーコード”は、検出および同定されることができる核酸配列を指す。バーコードは、様々な核酸中に組み込まれることができる。バーコードは、試料中でバーコードを組み込んでいる核酸がバーコードに従って識別または分類されることができるように十分に長く、例えば２、５、１０ヌクレオチドである。
用語“多重識別子”または“ＭＩＤ”は、標的核酸の源（例えば、その核酸が由来する試料）を同定するバーコードを指す。同じ試料からの全ての、または実質的に全ての標的核酸は、同じＭＩＤを共有するであろう。異なる源または試料からの標的核酸が、混合され、同時に配列決定されることができる。ＭＩＤを用いて、その配列の読みは、その標的核酸が由来する個々の試料に割り当てられることができる。
用語“ユニーク分子識別子”または“ＵＩＤ”は、それが結合している核酸を同定するバーコードを指す。同じ試料からの全ての、または実質的に全ての標的核酸は、異なるＵＩＤを有するであろう。同じ元の標的核酸に由来する子孫（例えば増幅産物）の全てまたは実質的に全ては、同じＵＩＤを共有するであろう。
用語“ユニバーサルプライマー”および“ユニバーサルプライミング結合部位”または“ユニバーサルプライミング部位”は、プライマーおよび異なる標的核酸中に存在する（典型的には、インビトロで付加された）プライマー結合部位を指す。ユニバーサルプライミング部位は、複数の標的核酸に、アダプターを用いて、または５’部分中にユニバーサルプライミング部位を有する標的特異的（非ユニバーサル）プライマーを用いて付加される。ユニバーサルプライマーは、ユニバーサルプライミング部位に結合してそこからのプライマー伸長を方向付けることができる。
本明細書で用いられる際、用語“標的配列”、“標的核酸”または“標的”は、検出または分析されるべき試料中の核酸配列の部分を指す。標的という用語は、標的配列の全てのバリアント、例えば１以上の変異体バリアントおよび野生型バリアントを含む。
用語“配列決定”は、標的核酸中のヌクレオチドの配列を決定するあらゆる方法を指す。
本発明は、以下の工程を含む、試料中の二本鎖標的核酸の配列を決定する方法を提供する：
（ａ）二本鎖標的核酸を含む試料を、二本鎖ステム領域および一本鎖ループ領域を含むヘアピンアダプター分子と接触させ；
（ｂ）標的核酸分子のそれぞれの末端をアダプター分子の二本鎖領域にライゲーションし、それにより、標的核酸を含み、かつ二本鎖領域ならびに二本鎖領域に共有結合的に連結された近位一本鎖ループ領域および遠位一本鎖ループ領域を有する環状ジョイント分子を形成し；
（ｃ）試料を固体支持体に繋がれた限られた濃度のブロッキングオリゴヌクレオチド（ここで、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、核酸ポリメラーゼにより伸長不能であり、近位および遠位一本鎖ループ領域に相補的である）と接触させ、それにより環状ジョイント分子を固体支持体上で捕捉し、近位一本鎖ループ領域をブロックし；
（ｄ）試料を遠位一本鎖ループ領域に相補的なオリゴヌクレオチドプライマーと接触させ、それによりプライマーを遠位一本鎖ループ領域にハイブリダイズさせ；
（ｅ）プライマーを配列決定ポリメラーゼにより伸長し、それにより二本鎖標的核酸の配列を決定する。
あるいは、本発明は、以下の工程を含む、試料中の二本鎖標的核酸の配列を決定する方法を提供する：
（ａ）二本鎖標的核酸を含む試料を、それぞれが二本鎖ステム領域および第１一本鎖ループ領域または第２一本鎖ループ領域を含む第１および第２ヘアピンアダプター分子の混合物と接触させ；
（ｂ）標的核酸分子のそれぞれの末端をアダプター分子の二本鎖領域にライゲーションし、それにより、標的核酸を含み、かつ二本鎖領域ならびに二本鎖領域に共有結合的に連結された一端に第１一本鎖ループ領域および他端に第２一本鎖ループ領域を有する環状ジョイント分子を形成し；
（ｃ）試料を固体支持体に繋がれた限られた濃度のブロッキングオリゴヌクレオチド（ここで、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、核酸ポリメラーゼにより伸長不能であり、第１一本鎖ループ領域に相補的である）と接触させ、それにより環状分子を固体支持体上で捕捉し、第１一本鎖ループ領域をブロックし；
（ｄ）試料を第２一本鎖ループ領域に相補的なオリゴヌクレオチドプライマーと接触させ、それによりプライマーを第２一本鎖ループ領域にハイブリダイズさせ；
（ｅ）プライマーを配列決定ポリメラーゼにより伸長し、それにより二本鎖標的核酸の配列を決定する。
工程（ｃ）の後、固体支持体上に捕捉されていないジョイント分子は、除去されることができる。
標的核酸およびアダプターの末端は、平滑であることができ、または酵素処理により突出状にされていることもできる。前記の酵素処理は、ヌクレオチド付加ならびに標的核酸およびアダプターの制限エンドヌクレアーゼによる消化から選択されることができる。ブロッキングオリゴヌクレオチドは、支持体分子との共有結合または支持体分子との非共有結合から選択される手段により固体支持体に繋ぐことができる。支持体分子との非共有結合は、ビオチン−ストレプトアビジン、抗体−抗原またはブロッキングオリゴヌクレオチドの固体支持体に共有結合的もしくは非共有結合的に連結された相補的オリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションから選択される特異的相互作用であることができる。ブロッキングオリゴヌクレオチドは、核酸ポリメラーゼにより伸長不能であることができ、３’−Ｈ，２’−ホスフェートおよび３’−ホスフェートから選択される化学修飾により伸長不能にされることができる。ブロッキングオリゴヌクレオチドは、核酸ポリメラーゼの結合を妨げる修飾を有することができる。ブロッキングオリゴヌクレオチドは、その３’末端を介して固体支持体に連結されているせいで核酸ポリメラーゼにより伸長不能であることができる。ブロッキングオリゴヌクレオチドは、１以上の二本鎖安定化修飾を含むことができ、それは、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）および非天然ヌクレオチドから選択されることができる。ブロッキングオリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼ消化をブロックする１以上の修飾、例えばホスホロチオエート骨格を含むことができる。固体支持体は、粒子で構成されることができ、それぞれの粒子は、多数のブロッカーオリゴヌクレオチドに連結されていることができる。
配列決定は、単分子配列決定、合成による配列決定、ナノポア配列決定またはトンネル効果認識配列決定であることができる。プライマー伸長は、鎖置換ポリメラーゼにより、および／またはローリングサークル複製により行われることができる。前記の二本鎖標的核酸は、インビトロで一本鎖標的核酸から生成されることができる。
本発明は、以下の工程を含む、試料中の二本鎖標的核酸の配列を決定する方法も提供する：
（ａ）２つの５’末端および２つの伸長可能な３’末端を有する二本鎖標的核酸を含む試料を、ターミナルトランスフェラーゼ、単一の伸長可能なヌクレオチド種と接触させ、ターミナルトランスフェラーゼによるヌクレオチドの組み込みを制御するための手段を提供し；
（ｂ）伸長可能な３’末端を、多数単位の一種類のヌクレオチドを組み込むことにより伸長し、それにより、標的核酸を含み、かつ二本鎖領域、近位一本鎖ホモポリマー領域および遠位一本鎖ホモポリマー領域を有する線状ジョイント分子を形成し；
（ｃ）試料を固体支持体に繋がれた限られた濃度の捕捉オリゴヌクレオチド（ここで、捕捉オリゴヌクレオチドは、近位および遠位一本鎖ホモポリマー領域に相補的である）と接触させ、それにより線状分子を固体支持体上で捕捉し；
（ｄ）試料を近位および遠位一本鎖ホモポリマー領域に相補的なオリゴヌクレオチドプライマーと接触させ、それによりプライマーを遠位一本鎖ホモポリマー領域にハイブリダイズさせ；
（ｅ）プライマーを配列決定ポリメラーゼにより伸長し、それにより二本鎖標的核酸の配列を決定する。
工程（ｃ）の後、固体支持体上に捕捉されていない核酸は、除去されることができる。
ターミナルトランスフェラーゼによるヌクレオチドの組み込みを制御するための手段は、反応中の伸長可能なヌクレオチドを有利にする比率でのターミネーターヌクレオチド種の存在または組み込み反応の時間であることができる。
捕捉オリゴヌクレオチドが伸長可能である場合、該方法は、さらに工程（ｃ）の後に捕捉オリゴヌクレオチドを標的核酸の末端に達するまで伸長することを含むことができる。次いで、該方法は、さらに、伸長した捕捉オリゴヌクレオチドを標的核酸の末端とライゲーションして連続した核酸鎖を作り出す工程を含むことができる。
ブロッキングオリゴヌクレオチドは、支持体分子との共有結合または支持体分子との非共有結合から選択される手段により固体支持体に繋ぐことができる。前記の支持体分子との非共有結合は、ビオチン−ストレプトアビジン、抗体−抗原またはブロッキングオリゴヌクレオチドの固体支持体に共有結合的もしくは非共有結合的に連結された相補的オリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションから選択される特異的相互作用であることができる。ブロッキングオリゴヌクレオチドは、１以上の二本鎖安定化修飾、例えばロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）または非天然ヌクレオチドを含むことができる。ブロッキングオリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼ消化をブロックする１以上の修飾、例えばホスホロチオエート骨格を含むことができる。固体支持体は、粒子で構成されていることができ、それぞれの粒子は、多数のブロッカーオリゴヌクレオチドに連結されていることができる。
それぞれの線状分子は、標的核酸の近位末端をブロックする一方で第１非ターミネーターヌクレオチドを含む混合物により遠位末端を伸長し、近位末端のブロックを外し、そして第２非ターミネーターヌクレオチドを含む混合物により近位末端を伸長することにより作り出された２種類の異なるホモポリマーを有することができる。
配列決定は、単分子配列決定、合成による配列決定、ナノポア配列決定またはトンネル効果認識配列決定であることができる。二本鎖標的核酸は、インビトロで一本鎖標的核酸から生成されることができる。
ある態様において、本発明は、二本鎖標的核酸を配列決定において有用な環状のロックされた鎖の鋳型の構造に変換する方法である。環状鋳型の使用は、当該技術で既知であり、合成による配列決定の適用においていくつかの利点を有する。米国特許第７，３０２，１４６号および第８，１５３，３７５号ならびに図１を参照。鎖置換ポリメラーゼが用いられる場合、それは、ローリングサークル複製に従事する（ｅｎｇａｇｅ）、すなわち新生鎖を連続的に置き換え、多数ラウンドの環状鋳型のコピーを行うであろう。標的を多数回配列決定し（読み通し）、連結されて環状構造になった標的核酸のワトソンおよびクリック鎖の両方を比較する能力は、エラーのない、または低エラーのコンセンサス配列を生成することを可能にする。
しかし、既存の環状鋳型は、標的核酸の両端にライゲーションされたアダプターを有するように設計されている（図１）。それぞれのアダプターは、配列決定プライマーのための結合部位を有し、それは、２つの配列決定プライマーおよび２つの配列決定ポリメラーゼのそれぞれの環状鋳型への結合を可能にする。一度配列決定反応が開始したら、２つのポリメラーゼは、互いに干渉して合成の失速または終結を引き起こし、配列決定データの読みの長さおよび収率を低下させる可能性を有する。これは、より短い鋳型に関して特に問題となる。一部の適用、例えば合成による単分子配列決定において、検出点（例えばナノポアまたはＺｅｒｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｗａｖｅｇｕｉｄｅ（ＺＭＷ））あたり２つのポリメラーゼの存在は、配列決定データの質を低減させるであろう。
本発明は、単一の配列決定ポリメラーゼのみがそれぞれの配列決定鋳型に結合し、合成が一方向でのみ進行することを保証することにより、既存の技術に改良を加える（図２）。本発明は、配列決定の質、読みの長さおよび効率を増大させることができる新規の方法である。本発明の態様において、二本鎖標的核酸は、２つのアダプター（分子のそれぞれの末端上に１つ）にコンジュゲートしている。それぞれのアダプター配列は、プライマー結合部位（例えばユニバーサルプライマー結合部位）を有し、ここで配列決定が開始される予定である。結果として得られたジョイント分子は、一端において捕捉され、一方で第２末端は、配列決定ポリメラーゼのために利用可能なままである（図２）。
本発明は、標的核酸または標的核酸のライブラリーを配列決定するための鋳型を作製する方法である。ある態様において、第１工程において、標的核酸は、二本鎖ステム領域および一本鎖ループ領域を含むステムループアダプター分子と接触させられる。標的核酸のそれぞれの末端は、アダプターにライゲーションされ、それによりジョイント分子を形成する。アダプターがステムループ構造を有する場合、結果として得られるジョイント分子は、二本鎖領域（標的核酸を含む）および二本鎖領域に共有結合的に連結された近位一本鎖ループ領域および遠位一本鎖ループ領域を有する。ジョイント分子は、単一の連続する鎖で構成される位相幾何学的に閉じられた環状分子である。ある態様において、ライゲーションされていないアダプターおよびライゲーションされていない標的核酸は、さらなる処理の前に試料から除去される。
ある態様において、全てのアダプター分子は、同じである。他の態様において、２種類のアダプター分子の混合物が、存在する。２種類のアダプター（例えばＡおよびＢ）の等しい混合物の場合、ジョイント分子の５０％が、所望の非対称なアダプター構造（例えばＡ−Ｂ）を有するであろう。
次いで、ジョイント分子は、固体支持体に繋がれた限られた濃度のブロッキングオリゴヌクレオチドと接触させられる。ブロッキングオリゴヌクレオチドは、それらがジョイント分子を例えば溶液中または固体支持体上で捕捉するために用いられることができるため、“捕捉オリゴヌクレオチド”とも呼ばれ得る。捕捉は、単に捕捉オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーション複合体を形成することを含むことができ、または捕捉は、捕捉オリゴヌクレオチドが繋がれていることができる固体支持体上での捕捉を含むこともできる。限られた濃度のブロッキングオリゴヌクレオチドは、２つのアダプター末端の一方のみが捕捉またはブロックされた状態になり、一方で他方のアダプター末端はさらなる酵素工程にアクセス可能なままであることを確実にするために用いられる。それぞれのジョイント分子が２つの異なるアダプターを有する態様において、捕捉オリゴヌクレオチドは、一方のアダプターにのみ相補的であり、他方のアダプターには相補的ではなく、これは、アダプター末端の一方のみが捕捉されることを確実にする。それぞれのジョイント分子が両端に同じアダプターを有する態様において、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、アダプターに相補的である。限られた濃度のブロッキングオリゴヌクレオチドの使用は、アダプター末端の一方のみが捕捉され、他方がアクセス可能なままであることを確実にする。便宜上、本開示において、捕捉されたアダプター末端は、近位として示され、遊離のアダプター末端は、遠位として示される。
下記の次の工程から明らかであろうように、ブロッキング捕捉オリゴヌクレオチドは、その３’末端において核酸ポリメラーゼにより伸長不能でなければならない。捕捉オリゴヌクレオチドは、近位アダプター末端に少なくとも部分的に相補的であり、アダプター末端の一本鎖部分にハイブリダイズし、それによりアダプター末端をブロックする。ブロッキングオリゴヌクレオチドの３’末端は伸長不能であるため、それは、核酸ポリメラーゼの存在下で鎖重合の開始点の役目を果たすことができない。場合により、捕捉されていないジョイント分子は、次の工程の前に除去されることができる。
次に、試料は、アダプターの一本鎖領域中のプライマー結合部位に相補的なオリゴヌクレオチドプライマーと接触させられる。近位末端はブロックされているため、遠位末端のみがプライマー結合およびハイブリダイゼーションのために利用可能である。プライマーは、配列決定ポリメラーゼにより伸長され、それにより二本鎖標的核酸の配列を決定することができる。配列決定は、単分子配列決定または核酸もしくは核酸誘導体のあらゆる配列決定を含む合成による配列決定である。配列決定技術は、ＰａｃＢｉｏ（登録商標）ＲＳシステム、ナノポア配列決定システムもしくはトンネル効果認識配列決定システムまたは鋳型の連続的な読みが可能であり所望されるあらゆる配列決定システムを含むことができる。
ある態様において、プライマー伸長は、鎖置換ポリメラーゼにより実施される。ある態様において、プライマー伸長は、それぞれの鋳型が単一のポリメラーゼにより多数回読まれることを可能にするローリングサークル複製により起こる。
該方法のある態様において、標的核酸の末端に隣接しているアダプターは、一本鎖ホモポリマー領域である。上記の態様において記載されたようにアダプターを標的核酸の末端にライゲーションする代わりに、標的核酸の伸長可能な３’末端は、試料を適切な酵素および１種類の伸長可能なヌクレオチド種と接触させることにより伸長される。適切な酵素は、例えばターミナルデオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）のような鋳型に依存しないＤＮＡポリメラーゼである。１種類のヌクレオチド種の連続的な付加は、標的核酸の両側にホモポリマー領域を生成する。ある態様において、その方法は、ホモポリマー領域の大きさを制御するための手段を含む。制御は、反応中の伸長可能なヌクレオチドを有利にする比率でのターミネーターヌクレオチド種の存在または組み込み反応の時間により成し遂げられることができる。適切な酵素は、ターミナルトランスフェラーゼであることができる。
この態様において、ジョイント分子は、標的核酸を含み、かつ二本鎖領域ならびに近位および遠位一本鎖ホモポリマー領域を有する線状分子である。この態様において、捕捉オリゴヌクレオチドは、ホモポリマー領域に相補的であり、一本鎖ホモポリマー領域を捕捉してそれにより線状ジョイント分子を固体支持体上で捕捉することができる。固体支持体上で捕捉されたホモポリマー領域は、近位領域と呼ばれ、遊離の領域は、遠位領域である。本発明の他の態様におけるように、配列決定プライマーは、遊離の遠位ホモポリマー領域に結合およびハイブリダイズしてプライマー伸長を開始することができる。ある態様において、その方法は、さらに固体支持体上で捕捉されていない核酸を除去する工程を含む。
ある態様において、それぞれの線状分子は、順次標的核酸の一端をブロックする一方で異なるヌクレオチドで他端を伸長することにより作製された２つの異なるホモポリマーを有する。そのような態様において、捕捉オリゴヌクレオチドおよびプライマーは、ジョイント分子の反対側のホモポリマーに相補的である。
本発明は、試料中の標的核酸を検出することを含む。ある態様において、試料は、対象または患者に由来する。ある態様において、試料は、対象または患者から例えば生検により得られた固形組織または固形腫瘍の断片を含むことができる。試料は、体液（例えば尿、痰、血清、血漿またはリンパ液、唾液、痰、汗、涙、脳脊髄液、羊水、滑液、心膜液、腹腔液、胸水、嚢胞液、胆汁、胃液、腸液および／または糞便試料）を含むこともできる。試料は、腫瘍細胞が存在し得る全血または血液画分を含むことができる。ある態様において、試料、特に液体試料は、無細胞材料、例えば無細胞腫瘍ＤＮＡまたは腫瘍ＲＮＡを含む無細胞ＤＮＡもしくはＲＮＡを含むことができる。ある態様において、試料は、無細胞試料、例えば無細胞腫瘍ＤＮＡまたは腫瘍ＲＮＡが存在する無細胞血液由来の試料である。他の態様において、試料は、感染性因子または感染性因子由来の核酸を含有する、または含有することが疑われる培養された試料、例えば培養物または培養上清である。ある態様において、感染性因子は、細菌、原生動物、ウイルスまたはマイコプラズマである。
標的核酸は、試料中に存在し得る対象の核酸である。ある態様において、標的核酸は、遺伝子または遺伝子断片である。他の態様において、標的核酸は、遺伝的バリアント、例えば多型（一塩基多型もしくはバリアント（ＳＮＶのＳＮＰ）を含む）または結果として例えば遺伝子融合をもたらす遺伝的再編成を含有する。ある態様において、標的核酸は、バイオマーカーを含む。他の態様において、標的核酸は、特定の生物に特徴的であり（例えば病原性生物の同定を助ける）、または病原性生物の特徴（例えば薬剤感受性または薬剤耐性）である。さらに他の態様において、標的核酸は、ヒトの対象に特徴的であり、例えば対象の特有のＨＬＡまたはＫＩＲ遺伝子型を定めるＨＬＡまたはＫＩＲ配列である。さらに他の態様において、例えばショットガンゲノム配列決定において、試料中の全ての配列が、標的核酸である。
本発明の一態様において、二本鎖標的核酸は、本発明の鋳型構成に変換される。ある態様において、標的核酸は、天然に一本鎖形態で存在する（例えば、ｍＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ウイルスＲＮＡを含むＲＮＡ；または一本鎖ウイルスＤＮＡ）。一本鎖標的核酸は、特許請求される方法のさらなる工程を可能にするために二本鎖形態に変換される。より長い標的核酸は、断片化されることができるが、一部の適用において、より長い標的核酸は、より長い読みを達成することが所望され得る。ある態様において、標的核酸は、自然に断片化されている（例えば、循環無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）または化学分解されたＤＮＡ、例えば保存された試料中に見られるＤＮＡ）。
本発明のある態様において、アダプター分子は、標的核酸にライゲーションされる。ライゲーションは、平滑末端ライゲーションまたはより効率的な突出末端ライゲーションであることができる。標的核酸またはアダプターは、鎖を埋めること（ｓｔｒａｎｄ−ｆｉｌｌｉｎｇ）、すなわち３’末端をＤＮＡポリメラーゼにより伸長して５’オーバーハングを除去することにより平滑末端状にされることができる。ある態様において、平滑末端状のアダプターおよび標的核酸は、例えばＤＮＡポリメラーゼまたはターミナルトランスフェラーゼによるアダプターの３’末端への一種類のヌクレオチドの付加および標的核酸の３’末端への一種類の相補的ヌクレオチドの付加により、突出状にされることができる。さらに他の態様において、アダプターおよび標的核酸は、制限エンドヌクレアーゼによる消化により突出末端（オーバーハング）を獲得することができる。後者の選択肢は、制限酵素認識部位を含有することが既知である既知の標的配列に関してより好都合である。上記の態様のそれぞれにおいて、アダプター分子は、所望の末端（平滑、一塩基伸長または多塩基オーバーハング）を、下記でさらに記載される合成アダプターオリゴヌクレオチドの設計により獲得することができる。ある態様において、他の酵素工程が、ライゲーションを成し遂げるために必要とされ得る。ある態様において、ポリヌクレオチドキナーゼが、標的核酸分子およびアダプター分子に５’ホスフェートを付加するために用いられることができる。
本発明は、標的核酸の一端または両端にライゲーションされるためのアダプター分子の使用を含む。ある態様において、アダプターは、少なくとも１つの二本鎖領域および少なくとも１つの一本鎖領域を含むステムループ二次構造をとる核酸の一本鎖である。二本鎖領域は、少なくとも部分的に自己相補的な領域を含み、それは、本明細書で用いられる反応条件下での二次構造の安定性を確実にする。ある態様において、アダプター分子は、インビトロで合成された人工配列である。他の態様において、アダプター分子は、所望の二次構造を有することが既知であるインビトロで合成された天然存在配列である。さらに他の態様において、アダプター分子は、単離された天然存在分子または単離された非天然存在分子である。
ある態様において、アダプターは、少なくとも１つの二本鎖領域および少なくとも１つの一本鎖領域を含む。ある態様において、アダプターは、少なくとも１つの二本鎖ステムおよび少なくとも１つの一本鎖ループを有するステムループ二次構造を形成する。ある態様において、二本鎖ステムは、二本鎖標的核酸へのライゲーションのために用いられる。他の態様において、アダプターの一本鎖部分は、標的核酸の一本鎖部分にライゲーションしている。ある態様において、一本鎖核酸のライゲーションは、スプリント（ｓｐｌｉｎｔ）オリゴヌクレオチドを用いて実施される（例えば米国出願公開第２０１２０００３６５７号を参照）。他の態様において、一本鎖核酸または部分的に一本鎖の核酸のライゲーションは、５’および３’末端の一本鎖領域（オーバーハング）を用いて実施される（例えば米国出願公開第２０１４０１９３８６０号を参照）。
ある態様において、アダプターは、１以上のバーコード：多重試料ＩＤ（ＭＩＤ）、ユニークＩＤ（ＵＩＤ）またはＵＩＤおよびＭＩＤの組み合わせを含む。ある態様において、単一のバーコードが、ＵＩＤおよびＭＩＤの両方として用いられる。
ある態様において、アダプターは、ユニバーサルプライマー、例えばユニバーサル配列決定プライマーのためのプライマー結合部位を含む。ある態様において、アダプターは、捕捉オリゴヌクレオチドのための結合部位を含む。ある態様において、本発明の方法において用いられるアダプターは、プライマーのための結合部位を含むアダプターおよび捕捉オリゴヌクレオチドのための結合部位を含むアダプターの混合物である。
ある態様において、本発明は、捕捉オリゴヌクレオチドの使用を含む。ある態様において、捕捉オリゴヌクレオチドは、固体支持体に直接結合している。この態様において、捕捉オリゴヌクレオチドは、一端に結合部分および他端に遊離末端を含む。捕捉オリゴヌクレオチドは、固体支持体（例えばビーズ、マイクロスフィア）にその結合部分を介して繋がれている。ある態様において、オリゴヌクレオチドの結合末端は、ビオチンを含み、固体支持体は、ストレプトアビジンでコートされている。他の態様において、オリゴヌクレオチドの結合末端は、捕捉分子を含み、固体支持体は、その捕捉分子に特異的な抗体を含む。例えば、ジゴキシゲニンおよび抗ジゴキシゲニン抗体が、用いられることができる。
ある態様において、捕捉オリゴヌクレオチドは、固体支持体に直接結合しておらず、上記の方法のいずれかにより固体支持体に直接連結されている別のオリゴヌクレオチド（“ビーズオリゴヌクレオチド”）にハイブリダイズしている。捕捉オリゴヌクレオチドおよびビーズオリゴヌクレオチドは、相補性のある少なくとも１つの領域を共有している。例えば、ビーズオリゴヌクレオチドは、ｄＴのホモポリマー（オリゴｄＴ）を含むことができ、一方で捕捉オリゴヌクレオチドの一部は、ｄＡのホモポリマー（オリゴｄＡ）である（図３、６および７）。
ある態様において、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、３’末端において核酸ポリメラーゼにより伸長不能である。３’末端は、化学修飾により伸長不能にされることができる。例えば、３’−Ｈ、２’ホスフェートおよび３’ホスフェートが、そのような修飾である。ブロッキングオリゴヌクレオチドは、核酸ポリメラーゼの結合を妨げる修飾、例えば３’末端を立体的にブロックする嵩張る付加物を有することができる。ブロッキングオリゴヌクレオチドは、その３’末端を介して固体支持体に連結されているせいで伸長不能にされていることができる。ブロッキングオリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼ消化をブロックする１以上の修飾、例えばホスホロチオエート骨格を含むこともできる。
ある態様において、オリゴヌクレオチドは、遊離の５’末端を含み、かつ固体支持体に繋がれた３’末端を有する。他の態様において、オリゴヌクレオチドは、遊離の３’末端を含み、かつ固体支持体に繋がれた５’末端を有する。遊離の５’末端または３’末端の少なくとも一部は、アダプター中の配列に相補的である。ある態様において、遊離末端は、アダプターの一本鎖部分に、例えばループ構造に相補的である。この相補的な部分を介して、固体支持体に繋がれた捕捉オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのアダプターにライゲーションした標的核酸を含むジョイント分子にハイブリダイズする。捕捉オリゴヌクレオチドは、前記のハイブリッドを安定化する１以上の修飾を含むことができる。ある態様において、その修飾は、例えば米国特許第５，９９０，３０３号において記載されているように、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、非天然ヌクレオチド、例えば７−デアザプリン（例えば７−デアザグアニン、７−デアザアデニン等）、ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン類、プロピニル−ｄＮ（例えばプロピニル−ｄＵ、プロピニル−ｄＣ等）等から選択される。
ある態様において、その方法は、ジョイント分子の作製を含む。ジョイント分子は、１以上のアダプター分子にライゲーションした二本鎖標的核酸を含む。ある態様において、ジョイント分子は、それぞれの末端において閉じたループの一本鎖領域（アダプター配列を含む）により隣接されている二本鎖領域（標的核酸を含む）を含む、位相幾何学的に環状の（閉じた）一本鎖である。
ある態様において、ジョイント分子は、同一の末端を有し、すなわち、２つの同一のアダプターにライゲーションしている。他の態様において、ジョイント分子は、それぞれが異なるアダプター分子にライゲーションしている異なる末端を含む。ある態様において、アダプター分子は、２タイプのアダプター（例えばＡおよびＢ）の混合物である。従って、試料は、アダプターＡＡ、ＡＢおよびＢＢを特定の比率で有するジョイント分子の混合物を含む。ある態様において、等しい比率のＡおよびＢが、用いられる。結果として得られるジョイント分子の５０％は、所望の構造Ａ−Ｂを有するであろう。２５％は、Ａ−Ａであると考えられ、すなわち配列決定プライマーのための結合部位がなく、２５％は、Ｂ−Ｂであると考えられ、先行技術において用いられていたように配列決定プライマーに関する２つの部位がある。そのような場合、本発明は、ジョイント分子の２／３（Ａ−Ｂ）が向上した方法に従って処理されて向上した読みを生成すると考えられるため、先行技術を超える向上を与えるであろう。
ある態様において、ジョイント分子は、それぞれの末端においてアダプター等の配列により隣接されている標的核酸を含む二本鎖領域を含む線状分子である。ある態様において、アダプターは、線状二本鎖分子である。他の態様において、アダプターは、線状一本鎖分子であることができる。さらに他の態様において、標的核酸を含む二本鎖領域は、１つまたは２つのホモポリマーにより隣接されている。
ある態様において、本発明は、酵素を利用する。酵素は、ＤＮＡポリメラーゼ（配列決定ポリメラーゼを含む）、ＤＮＡリガーゼおよびターミナルトランスフェラーゼを含む。
ある態様において、ＤＮＡポリメラーゼは、鎖置換活性を有し、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を有しない。ある態様において、Ｐｈｉ２９ポリメラーゼおよびその派生物が、用いられる（米国特許第５００１０５０号、第５５７６２０４号、第７８５８７４７号および第８９２１０８６号参照）。
ある態様において、本発明は、ＤＮＡリガーゼも利用する。ある態様において、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼまたは大腸菌ＤＮＡリガーゼが、用いられる。
ある態様において、本発明は、鋳型非依存性ＤＮＡポリメラーゼ、例えばターミナルトランスフェラーゼも利用する。ある態様において、本発明は、哺乳類のターミナルトランスフェラーゼを用いる。
ある態様において、本発明は、二本鎖標的核酸の配列を決定するための組成物であって、標的核酸を含み、かつ二本鎖領域ならびに二本鎖領域に共有結合的に連結された近位一本鎖ループ領域および遠位一本鎖ループ領域を有する環状ジョイント分子を含み、近位領域が、核酸ポリメラーゼにより伸長不能であるブロッキングオリゴヌクレオチドにハイブリダイズしている組成物である。ブロッキングオリゴヌクレオチドは、固体支持体に繋がれていることができる。ある態様において、組成物は、さらに近位および遠位一本鎖ループ領域に相補的なオリゴヌクレオチドプライマーならびに場合により核酸ポリメラーゼを含む。
ある態様において、本発明は、二本鎖標的核酸の配列を決定するための組成物であって、標的核酸を含み、かつ二本鎖領域ならびに近位および遠位一本鎖ホモポリマー領域を有する線状ジョイント分子を含み、近位ホモポリマー領域が、核酸ポリメラーゼにより伸長不能であるブロッキングオリゴヌクレオチドにハイブリダイズしている組成物である。ブロッキングオリゴヌクレオチドは、固体支持体に繋がれていることができる。ある態様において、組成物は、さらに近位および遠位一本鎖ループ領域に相補的なオリゴヌクレオチドプライマーならびに場合により核酸ポリメラーゼを含む。
実施例１（仮想例）配列決定ポリメラーゼの非対称な装填を用いる配列決定のための対称的に適合させられた環状ジョイント分子の調製
この実験において、二本鎖標的ＤＮＡが、得られる。ＤＮＡは、インビトロで適切な大きさに断片化されるか、または天然に断片化されている。アダプターは、二本鎖部分およびループ部分を有するヘアピン分子である。Pacific Biosciences（登録商標）Template Preparation and Sequencing Guide (2012) Pacific Biosciences of California, Inc.および米国特許第８，１５３，３７５号において記載されているように、同一のアダプターが、ジョイント分子を作製するために標的ＤＮＡのそれぞれの末端にライゲーションされる。図２Ａ参照。捕捉オリゴヌクレオチドは、アダプター分子の一本鎖部分に相補的である（図２Ｂ）。捕捉オリゴヌクレオチドは、ポリスチレンコートされた磁性ビーズ（ＤｙｎａＢｅａｄｓ（登録商標）、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、マサチューセッツ州ウォルサム）に結合したポリｄＴオリゴヌクレオチドに相補的なポリｄＡ部分も含む（図２Ａ参照）。捕捉オリゴヌクレオチドは、アダプターとの複合体を安定化するいくつかのＬＮＡ塩基を有する（図２Ａおよび図２Ｂ参照）。他のアダプターは、結果的にポリメラーゼの装填および配列決定の開始のために利用可能である。配列決定プライマーは、アダプターの一本鎖部分に相補的であり、配列決定ポリメラーゼは、プライマーを伸長し、それにより配列決定反応を実施することができる。構成要素は、図２において示されている順序で追加される。
ビーズに結合した捕捉オリゴヌクレオチドの濃度と比較してジョイント分子が過剰であること（高いライブラリー：ビーズ比）は、十分な量のジョイント分子が一端でのみ捕捉され、配列決定のために利用可能な一端を有することを確実にする。
配列決定は、機器の製造業者により意図されるように進行する。
実施例２（仮想例）配列決定のための非対称に適合させられた環状ジョイント分子の調製
この実験において、二本鎖標的ＤＮＡが、得られる。ＤＮＡは、インビトロで適切な大きさに断片化されるか、または天然に断片化されている。アダプターは、二本鎖部分およびループ部分を有するヘアピン分子である。等量の２種類のアダプターの混合物が、添加される。アダプターは、少なくともループ配列において異なる。Pacific Biosciences（登録商標）Template Preparation and Sequencing Guide (2012) Pacific Biosciences of California, Inc.および米国特許第８，１５３，３７５号において記載されているように、アダプターが、ジョイント分子を作製するために標的ＤＮＡのそれぞれの末端にライゲーションされる。図２Ａ参照。捕捉オリゴヌクレオチドは、アダプター分子の一本鎖部分に相補的である（図２Ｂ）。捕捉オリゴヌクレオチドは、ポリスチレンコートされた磁性ビーズ（ＤｙｎａＢｅａｄｓ（登録商標）、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、マサチューセッツ州ウォルサム）に結合したポリｄＴオリゴヌクレオチドに相補的なポリｄＡ部分も含む（図２Ａ参照）。捕捉オリゴヌクレオチドは、アダプターとの複合体を安定化するいくつかのＬＮＡ塩基を有する（図２Ａおよび図２Ｂ参照）。他のアダプターは、結果的にポリメラーゼの装填および配列決定の開始のために利用可能である。配列決定プライマーは、アダプターの一本鎖部分に相補的であり、配列決定ポリメラーゼは、プライマーを伸長し、それにより配列決定反応を実施することができる。構成要素は、図２において示されている順序で追加される。配列決定は、機器の製造業者により意図されるように進行する。
実施例３（仮想例）配列決定のための非対称に適合させられた線状ジョイント分子の調製
この実験において、二本鎖標的ＤＮＡが、得られる。ＤＮＡは、インビトロで適切な大きさに断片化されるか、または天然に断片化されている。標的ＤＮＡの３’末端のそれぞれは、ターミナルトランスフェラーゼおよび少量のジ−デオキシヌクレオチド（例えばｄｄＣＴＰ）と混合された１種類のヌクレオチド（例えばｄＡＴＰ）を用いて伸長される。標的ＤＮＡは、それぞれの末端にホモポリマーを有する（図４、５）。捕捉オリゴヌクレオチドは、固体支持体に直接結合しており、ホモポリマー（例えばオリゴｄＴを有する）に相補的である（図４、５）。固体支持体は、ポリスチレンコートされた磁性ビーズ（ＤｙｎａＢｅａｄｓ（登録商標）、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、マサチューセッツ州ウォルサム）を含む。ホモポリマーは、ポリメラーゼの装填および配列決定の開始のために利用可能である。
２つのポリメラーゼが同じ鋳型上に装填される（図４）のを防ぐため、捕捉オリゴヌクレオチドの３’末端は、ｄＴＴＰおよびＤＮＡポリメラーゼにより伸長され、それを配列決定プライマーに利用不能にする。捕捉オリゴヌクレオチドは、伸長産物がそれ以上伸長可能でないようにするためにｄＴＴＰおよびｄｄＴＴＰの混合物を用いて伸長される。あるいは、捕捉オリゴヌクレオチドは、ｄＴＴＰを用いて伸長され、標的の５’末端とライゲーションにより連結される。
実施例４：配列決定のための非対称に適合させられた線状ジョイント分子に関する組み立ての作業の流れ
図８Ａ〜８Ｆにおいて示されているこの実験において、一連の組み立ての作業の流れが、本発明の方法に従う配列決定のための配列決定ライブラリーを調製するために用いられた。作業の流れは、上記のようなオリゴｄＴ捕捉プローブを用いて開始した（図８Ａ）。捕捉プローブ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）が、捕捉ビーズに添加されて、捕捉プローブ−捕捉ビーズ複合体（図８Ｂ）を形成した。二本鎖標的核酸分子および２つのヘアピンアダプター（ヘアピンアダプターＡおよびＢ、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１および２を含む）を含む環状配列決定鋳型が、捕捉プローブ−捕捉ビーズ複合体（図８Ｃ）と接触させられて、捕捉ビーズ、捕捉プローブおよび環状配列決定鋳型の複合体を形成した。次いで、配列決定プライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）（図８Ｄ）および配列決定ポリメラーゼ（図８Ｅ）が、添加された。図８Ｆは、構成要素が図８Ａ〜８Ｅにおいて示されているように添加された場合の組み立てられた配列決定ライブラリーの構成要素の分析の結果を示す。ビーズ、捕捉プローブおよびライブラリー分子が全て含まれている場合のみ、３つ全てが最終的な組み立てられた複合体において検出された。
２つのホモポリマーの一方のみが、ここでポリメラーゼの装填および配列決定の開始に利用可能である。配列決定プライマーは、ホモポリマーに相補的であり（例えばオリゴｄＴを有する）、配列決定ポリメラーゼは、プライマーを伸長してそれにより配列決定反応を実施することができる。構成要素は、図２において示されている順序で追加される。配列決定は、機器の製造業者により意図されるように進行する。

Claims (15)

  1. 試料中の二本鎖標的核酸の配列を決定する方法であって、以下の工程：
    （ａ）該二本鎖標的核酸を含む試料を、それぞれが二本鎖ステム領域および第１一本鎖ループ領域または第２一本鎖ループ領域を含む第１および第２ヘアピンアダプター分子の混合物と接触させること；
    （ｂ）該標的核酸分子のそれぞれの末端を該アダプター分子の二本鎖領域にライゲーションし、それにより、該標的核酸を含み、かつ二本鎖領域ならびに該二本鎖領域に共有結合的に連結された一端に第１一本鎖ループ領域および他端に第２一本鎖ループ領域を有する環状ジョイント分子を形成すること；
    （ｃ）該試料を固体支持体に繋がれた限られた濃度のブロッキングオリゴヌクレオチドと接触させ、それにより該環状分子を該固体支持体上で捕捉し、該第１一本鎖ループ領域をブロックすること、ここで該ブロッキングオリゴヌクレオチドは核酸ポリメラーゼにより伸長不能であり、該第１一本鎖ループ領域に相補的である； （ｄ）該試料を該第２一本鎖ループ領域に相補的なオリゴヌクレオチドプライマーと接触させ、それにより該プライマーを該第２一本鎖ループ領域にハイブリダイズさせること；ならびに、
    （ｅ）該プライマーを配列決定ポリメラーゼにより伸長し、それにより該二本鎖標的核酸の配列を決定すること；
    を含む、前記方法。
  2. 該標的核酸および該アダプターの末端が酵素処理により突出状にされている、請求項１に記載の方法。
  3. 該酵素処理が、ヌクレオチド付加ならびに該標的核酸および該アダプターの制限エンドヌクレアーゼによる消化から選択される、請求項２に記載の方法。
  4. 該ブロッキングオリゴヌクレオチドが、該支持体分子との共有結合または該支持体分子との非共有結合から選択される手段により該固体支持体につながれている、請求項１に記載の方法。
  5. 該支持体分子との非共有結合が、ビオチン−ストレプトアビジン、抗体−抗原または該ブロッキングオリゴヌクレオチドの該固体支持体に共有結合的もしくは非共有結合的に連結された相補的オリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションから選択される特異的相互作用である、請求項４に記載の方法。
  6. 該ブロッキングオリゴヌクレオチドが、好ましくは３’−Ｈ，２’−ホスフェートおよび３’−ホスフェートから選択される化学修飾により、該核酸ポリメラーゼにより伸長不能である、請求項１に記載の方法。
  7. 該ブロッキングオリゴヌクレオチドが、核酸ポリメラーゼの結合を妨げる修飾を有する、請求項１に記載の方法。
  8. 該ブロッキングオリゴヌクレオチドが、その３’末端を介して該固体支持体に連結されているせいで核酸ポリメラーゼにより伸長不能である、請求項１に記載の方法。
  9. 該ブロッキングオリゴヌクレオチドが、好ましくはロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）および非天然ヌクレオチドから選択される１以上の二本鎖安定化修飾を含む、請求項１に記載の方法。
  10. 該ブロッキングオリゴヌクレオチドが、ヌクレアーゼ消化をブロックする１以上の修飾、好ましくはホスホロチオエート骨格を含む、請求項１に記載の方法。
  11. 該固体支持体が粒子で構成されており、それぞれの粒子が多数のブロッカーオリゴヌクレオチドに連結されている、請求項１に記載の方法。
  12. 該プライマーの伸長が、鎖置換ポリメラーゼによるものである、請求項１に記載の方法。
  13. 該プライマーの伸長が、ローリングサークル複製によるものである、請求項１に記載の方法。
  14. 該二本鎖標的核酸が、インビトロで一本鎖標的核酸から生成される、請求項１に記載の方法。
  15. 二本鎖標的核酸の配列を決定するための組成物であって、以下：
    （ａ）それぞれの末端において二本鎖ステム領域および一本鎖ループ領域を含むアダプター分子にライゲーションされた該標的核酸を含む環状ジョイント分子、ここで該環状ジョイント分子は、二本鎖領域ならびに該二本鎖領域に共有結合的に連結された第１一本鎖ループ領域および第２一本鎖ループ領域を有するものである；
    （ｂ）固体支持体に繋がれたブロッキングオリゴヌクレオチド、ここで該ブロッキングオリゴヌクレオチドは核酸ポリメラーゼにより伸長不能であり、該第１一本鎖ループ領域にハイブリダイズしており、それにより該環状ジョイント分子を該固体支持体上で捕捉し、該第１一本鎖ループ領域をブロックするものである；
    （ｃ）該第２一本鎖ループ領域にハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドプライマー；ならびに、
    （ｄ）配列決定ポリメラーゼ；
    を含む、前記組成物。
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