JP6711285B2 - Detection method, detection device and chip - Google Patents

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Description

本発明は、表面プラズモン共鳴を利用して検体に含まれる２種類の被検出物質を検出する検出方法および検出装置、ならびに前記検出方法および検出装置において使用されうるチップに関する。 TECHNICAL FIELD The present invention relates to a detection method and a detection apparatus for detecting two types of substances to be detected contained in a specimen by using surface plasmon resonance, and a chip that can be used in the detection method and the detection apparatus.

臨床検査などにおいて、タンパク質やＤＮＡなどの微量の被検出物質を高感度かつ定量的に検出することができれば、患者の状態を迅速に把握して治療を行うことが可能となる。このため、微量の被検出物質を高感度かつ定量的に検出できる方法が求められている。被検出物質を高感度に検出できる方法として、表面プラズモン共鳴（Surface plasmon resonance：以下「ＳＰＲ」ともいう）を利用する検出方法が知られている（例えば、特許文献１〜３参照）。 If a trace amount of a substance to be detected such as protein or DNA can be detected with high sensitivity and quantitatively in a clinical test or the like, it becomes possible to quickly grasp the patient's condition and perform treatment. Therefore, there is a demand for a method capable of detecting a trace amount of a substance to be detected with high sensitivity and quantitatively. As a method capable of detecting a substance to be detected with high sensitivity, a detection method utilizing surface plasmon resonance (hereinafter also referred to as “SPR”) is known (see, for example, Patent Documents 1 to 3).

特許文献１に記載の検出方法では、基板と、基板上に配置された金属膜と、金属膜上の複数の領域にそれぞれ形成された複数の回折格子とを有するチップを使用する。複数の回折格子は、それぞれピッチの異なる複数のスリットを有している。各回折格子には、複数種類の被検出物質を捕捉するための複数種類の捕捉体がそれぞれ配置されている。そして、特許文献１に記載の検出方法では、複数種類の被検出物質をチップに固定された対応する複数種類の捕捉体にそれぞれ結合させる。次いで、各被検出物質を励起波長の異なる対応する蛍光物質で蛍光標識させる。次いで、表面プラズモン共鳴が生じるように、波長の異なる励起光を、チップを移動させてそれぞれの領域に照射する。そして、各領域で生じた蛍光を検出部で検出することで、複数種類の被検出物質を検出している。 The detection method described in Patent Document 1 uses a chip having a substrate, a metal film arranged on the substrate, and a plurality of diffraction gratings respectively formed in a plurality of regions on the metal film. The plurality of diffraction gratings have a plurality of slits having different pitches. Plural kinds of traps for trapping plural kinds of substances to be detected are arranged in each diffraction grating. Then, in the detection method described in Patent Document 1, a plurality of types of substances to be detected are respectively bound to a plurality of corresponding types of capturing bodies fixed to the chip. Then, each substance to be detected is fluorescently labeled with a corresponding fluorescent substance having a different excitation wavelength. Then, the chips are moved to irradiate each region with excitation light having different wavelengths so that surface plasmon resonance occurs. Then, a plurality of types of substances to be detected are detected by detecting the fluorescence generated in each region with the detection unit.

また、特許文献２に記載の検出方法では、基板と、基板上に配置された金属膜と、金属膜上に形成され、ピッチが異なる複数の回折格子が周方向に形成された平面視形状が円形のチップを使用する。そして、特許文献２に記載の検出方法では、複数種類の被検出物質を各回折格子にそれぞれ固定させる。次いで、表面プラズモン共鳴が生じるように複数種類の励起光を、チップを移動させてそれぞれの回折格子に照射する。そして、各回折格子で生じたラマン散乱光を検出部で検出することで、複数種類の被検出物質を検出している。 Further, in the detection method described in Patent Document 2, a substrate, a metal film arranged on the substrate, and a plurality of diffraction gratings formed on the metal film and having different pitches are formed in the circumferential direction to have a planar view shape. Use round tips. Then, in the detection method described in Patent Document 2, a plurality of types of substances to be detected are fixed to the respective diffraction gratings. Then, a plurality of types of excitation light are moved to irradiate the respective diffraction gratings by moving the chip so that surface plasmon resonance occurs. Then, the Raman scattered light generated in each diffraction grating is detected by the detection unit to detect a plurality of types of substances to be detected.

さらに、特許文献３に記載の検出方法では、基体と、基体上に配置された金属膜と、金属膜上の複数の領域にそれぞれ形成された複数の回折格子とを有するチップを使用する。複数の回折格子は、それぞれピッチの異なる複数の溝を有している。各回折格子には、複数種類の被検出物質を捕捉するための複数種類の捕捉体がスポット状にそれぞれ配置されている。そして、特許文献３に記載の検出方法では、表面プラズモン共鳴が生じるように単一の光源から全スポットに対して単一の波長の入射光を照射する。そして、入射光の反射光を検出部で検出することで、数種類の被検出物質を同時に検出している。 Further, the detection method described in Patent Document 3 uses a chip having a base, a metal film arranged on the base, and a plurality of diffraction gratings respectively formed in a plurality of regions on the metal film. The plurality of diffraction gratings have a plurality of grooves each having a different pitch. Plural types of traps for trapping plural types of substances to be detected are arranged in spots on each diffraction grating. Then, in the detection method described in Patent Document 3, all the spots are irradiated with incident light of a single wavelength so that surface plasmon resonance occurs. Then, by detecting the reflected light of the incident light with the detection unit, several kinds of substances to be detected are simultaneously detected.

特表２００７−５０１３９１号公報Special table 2007-501391 gazette 国際公開第２００９／１１９３９１号International Publication No. 2009/119391 特開２００３−１２１３５０号公報JP, 2003-121350, A

特許文献１、２に記載の検出方法では、チップまたは検出部を金属膜の面方向に高精度に移動させる必要がある。また、被検出物質の検出条件によっては、チップまたは検出部を平面方向に垂直な方向に高精度で移動する必要がある。 In the detection methods described in Patent Documents 1 and 2, it is necessary to move the chip or the detection unit in the surface direction of the metal film with high accuracy. Further, depending on the detection conditions of the substance to be detected, it is necessary to move the chip or the detection unit with high accuracy in the direction perpendicular to the plane direction.

また、特許文献１〜３に記載の検出方法で使用されるチップは、複数の回折格子を金属膜上にそれぞれ形成しているため大きい。 Further, the chips used in the detection methods described in Patent Documents 1 to 3 are large because a plurality of diffraction gratings are formed on the metal film.

このように、特許文献１、２に記載の検出方法では、チップまたは検出部を平面方向および平面方向に垂直な方向に高精度で移動する必要があるため、検出装置が大型化してしまうという問題があった。一方、高精度にチップまたは検出部を移動できない場合には、被検出物質の検出精度が低下してしまう問題があった。また、金属膜に複数の回折格子を形成しているため大型化するとともに、大量の検体が必要であった。 As described above, in the detection methods described in Patent Documents 1 and 2, it is necessary to move the chip or the detection unit with high precision in the plane direction and the direction perpendicular to the plane direction, and thus the detection device becomes large. was there. On the other hand, when the chip or the detection unit cannot be moved with high accuracy, there is a problem that the detection accuracy of the substance to be detected decreases. Further, since a plurality of diffraction gratings are formed on the metal film, the size is increased and a large amount of sample is required.

本発明の目的は、装置を小型化しつつ、少量の検体で複数の被検出物質を検出することができる検出方法および検出装置を提供することである。また、本発明の別の目的は、当該検出方法および当該検出装置にも使用することができるチップを提供することである。 An object of the present invention is to provide a detection method and a detection device capable of detecting a plurality of substances to be detected with a small amount of sample while reducing the size of the device. Another object of the present invention is to provide a chip that can be used in the detection method and the detection device.

上記課題を解決するため、本発明の一実施の形態に係る検出方法は、第１被検出物質を標識する第１蛍光物質と第２被検出物質を標識する第２蛍光物質とが、表面プラズモン共鳴に基づく局在場光により励起されてそれぞれ放出した蛍光を検出して、検体に含まれる前記第１被検出物質および前記第２被検出物質を検出する検出方法であって、複数の凸部が、第１の方向について第１のピッチで配列され、前記第１の方向に交差する第２の方向について第１のピッチと異なる第２のピッチで配列された回折格子を形成された金属膜と、前記回折格子に固定され、前記第１被検出物質を捕捉するための第１捕捉体と、前記回折格子の前記第１捕捉体が固定されている領域に固定され、前記第２被検出物質を捕捉するための第２捕捉体とを有するチップの前記回折格子に前記検体を提供して、前記第１捕捉体と前記第１被検出物質とを結合させ、かつ前記第２捕捉体と前記第２被検出物質とを結合させる工程と、前記回折格子の前記第１捕捉体および前記第２捕捉体が固定されている領域に前記第１蛍光物質を提供して、前記第１被検出物質を前記第１蛍光物質で標識させる工程と、前記回折格子の前記第１捕捉体および前記第２捕捉体が固定されている領域に前記第２蛍光物質を提供して、前記第２被検出物質を前記第２蛍光物質で標識させる工程と、平面視したときにその光軸が前記第１の方向に沿うように、前記回折格子の前記第１捕捉体および前記第２捕捉体が固定されている領域に第１波長の励起光を照射し、前記第１被検出物質を標識した前記第１蛍光物質から放出された蛍光を検出することで前記第１被検出物質を検出する工程と、平面視したときにその光軸が前記第２の方向に沿うように、前記回折格子の前記第１捕捉体および前記第２捕捉体が固定されている領域に前記第１波長と異なる第２波長の励起光を照射し、前記第２被検出物質を標識した前記第２蛍光物質から放出された蛍光を検出することで前記第２被検出物質を検出する工程とを有する。 In order to solve the above problems, in the detection method according to one embodiment of the present invention, the first fluorescer that labels the first substance to be detected and the second fluorescer that labels the second substance to be detected are surface plasmons. A detection method for detecting fluorescence emitted by being excited by localized field light based on resonance and detecting the first substance to be detected and the second substance to be detected, which are included in a specimen, comprising: a plurality of convex portions A metal film on which a diffraction grating is formed, which is arranged at a first pitch in a first direction and is arranged at a second pitch different from the first pitch in a second direction intersecting the first direction. A first capturing body fixed to the diffraction grating to capture the first substance to be detected, and a region of the diffraction grating where the first capturing body is fixed, and the second detection target. The analyte is provided to the diffraction grating of a chip having a second capturing body for capturing a substance to bond the first capturing body and the first substance to be detected, and the second capturing body. Combining the second substance to be detected and providing the first fluorescent substance to a region of the diffraction grating where the first capturing body and the second capturing body are fixed to provide the first detectable substance. Labeling the substance with the first fluorescent substance, and providing the second fluorescent substance to a region of the diffraction grating where the first capturing body and the second capturing body are fixed to provide the second detected substance. Labeling the substance with the second fluorescent substance, and fixing the first trapping body and the second trapping body of the diffraction grating so that the optical axis thereof is along the first direction when viewed in a plan view. Irradiating a region having a first wavelength with excitation light, and detecting fluorescence emitted from the first fluorescent substance labeled with the first substance to be detected, and detecting the first substance to be detected, A second wavelength different from the first wavelength in a region of the diffraction grating where the first trapping body and the second trapping body are fixed such that its optical axis is along the second direction when viewed in a plan view. Of the excitation light, and detecting the fluorescence emitted from the second fluorescent substance labeled with the second substance to be detected, thereby detecting the second substance to be detected.

また、上記課題を解決するため、本発明の一実施の形態に係る検出装置は、第１被検出物質を標識する第１蛍光物質と第２被検出物質を標識する第２蛍光物質とが、表面プラズモン共鳴に基づく局在場光により励起されてそれぞれ放出した蛍光を検出して、検体に含まれる前記第１被検出物質および前記第２被検出物質を検出する検出装置であって、前記第１被検出物質を捕捉するための第１捕捉体と前記第２被検出物質を捕捉するための第２捕捉体とを有するチップを保持するチップホルダーと、前記チップの同じ位置に対して、第１波長の励起光および前記第１波長と異なる第２波長の励起光を照射する光照射部と、前記第１波長の励起光によって前記第１被検出物質を標識した前記第１蛍光物質から放出された蛍光と、前記第２波長の励起光によって前記第２被検出物質を標識した前記第２蛍光物質から放出された蛍光とをそれぞれ検出する光検出部と、を有し、前記光検出部は、前記光照射部が、平面視したときにその光軸が前記チップの表面における第１の方向に沿うように、前記チップに前記第１波長の励起光を照射したときに、前記第１蛍光物質から放出された蛍光を検出し、前記光照射部が、平面視したときにその光軸が前記第１の方向に交差する前記チップの表面における第２の方向に沿うように、前記チップに前記第２波長の励起光を照射したときに、前記第２蛍光物質から放出された蛍光を検出する。 Further, in order to solve the above-mentioned problems, in the detection device according to one embodiment of the present invention, the first fluorescent substance that labels the first substance to be detected and the second fluorescent substance that labels the second substance to be detected are A detection device for detecting the fluorescence emitted by being excited by a localized field light based on surface plasmon resonance and detecting the first substance to be detected and the second substance to be detected contained in a sample, 1 A chip holder for holding a chip having a first capturing body for capturing a substance to be detected and a second capturing body for capturing the second substance to be detected, and a chip holder for the same position of the chip. A light irradiation unit for irradiating excitation light of one wavelength and excitation light of a second wavelength different from the first wavelength, and emission from the first fluorescent substance labeled with the first substance to be detected by the excitation light of the first wavelength The detected fluorescence and the fluorescence emitted from the second fluorescent substance labeled with the second substance to be detected by the excitation light of the second wavelength, respectively. When the light irradiation unit irradiates the chip with the excitation light of the first wavelength so that the optical axis thereof is along the first direction on the surface of the chip when seen in a plan view, Detecting fluorescence emitted from a fluorescent substance, the light irradiating section so that, when viewed in plan, the optical axis is along a second direction on the surface of the chip intersecting the first direction, The fluorescent light emitted from the second fluorescent substance is detected when the excitation light of the second wavelength is irradiated onto.

さらに、上記課題を解決するため、本発明の一実施の形態に係るチップは、被検出物質を標識する蛍光物質が表面プラズモン共鳴に基づく局在場光により励起されて放出した蛍光を検出して、検体に含まれる被検出物質を検出するためのチップであって、複数の凸部が、第１の方向について第１のピッチで配列され、前記第１の方向に交差する第２の方向について第１のピッチと異なる第２のピッチで配列された回折格子を形成された金属膜を有し、前記第１のピッチは、平面視したときにその光軸が前記第１の方向に沿うように第１波長の励起光を前記回折格子に照射したときに、以下の式（１）を満たし、前記第２のピッチは、平面視したときにその光軸が前記第２の方向に沿うように前記第１波長と異なる第２波長の励起光を前記回折格子に照射したときに、以下の式（２）を満たす。

Figure 0006711285
［上記式（１）において、ω1は、第１波長の励起光の角周波数であり、ｃは、光の速度であり、ε1は、前記金属膜に面する媒質の誘電率であり、ε2は、前記金属膜の誘電率であり、ｋ01は、第１波長の励起光の波数であり、θ1は、第１波長の励起光の前記金属膜に対する入射角であり、ｍは、任意の整数であり、λ1は、前記第１のピッチである。］
Figure 0006711285
 ［上記式（２）において、ω2は、第２波長の励起光の角周波数であり、ｃは、光の速度であり、ε1は、前記金属膜に面する媒質の誘電率であり、ε2は、前記金属膜の誘電率であり、ｋ02は、第２波長の励起光の波数であり、θ2は、第２波長の励起光の前記金属膜に対する入射角であり、ｍは、任意の整数であり、λ2は、前記第２のピッチである。］Further, in order to solve the above problems, the chip according to one embodiment of the present invention detects the fluorescence emitted by the fluorescent substance labeling the substance to be detected being excited by the localized field light based on surface plasmon resonance. A chip for detecting a substance to be detected contained in a sample, wherein a plurality of convex portions are arranged at a first pitch in a first direction, and in a second direction intersecting the first direction. It has a metal film formed with a diffraction grating arranged at a second pitch different from the first pitch, and the first pitch has its optical axis along the first direction when seen in a plan view. When the excitation light of the first wavelength is radiated to the diffraction grating, the following expression (1) is satisfied, and the second pitch has its optical axis along the second direction when seen in a plan view. When the excitation light having a second wavelength different from the first wavelength is applied to the diffraction grating, the following expression (2) is satisfied.
Figure 0006711285
 [In the above formula (1), ω 1 is the angular frequency of the excitation light of the first wavelength, c is the speed of light, ε 1 is the dielectric constant of the medium facing the metal film, ε 2 is the dielectric constant of the metal film, k 01 is the wave number of the excitation light of the first wavelength, θ 1 is the incident angle of the excitation light of the first wavelength with respect to the metal film, and m is , Any arbitrary integer, and λ 1 is the first pitch. ]
Figure 0006711285
 [In the above formula (2), ω 2 is the angular frequency of the excitation light of the second wavelength, c is the speed of light, ε 1 is the dielectric constant of the medium facing the metal film, ε 2 is the dielectric constant of the metal film, k 02 is the wave number of the excitation light of the second wavelength, θ 2 is the incident angle of the excitation light of the second wavelength with respect to the metal film, and m is , Is an arbitrary integer, and λ 2 is the second pitch. ]

本発明によれば、装置を大型化することなく、同一の場所に励起光を照射して複数の被検出物質を高感度に検出することができる。 According to the present invention, a plurality of substances to be detected can be detected with high sensitivity by irradiating the same place with excitation light without increasing the size of the device.

図１は、実施の形態１に係るＳＰＦＳ装置の構成を示す模式図である。FIG. 1 is a schematic diagram showing the configuration of the SPFS device according to the first embodiment. 図２は、チップの回折格子の部分拡大斜視図である。FIG. 2 is a partially enlarged perspective view of the diffraction grating of the chip. 図３Ａ、Ｂは、チップの断面図である。3A and 3B are cross-sectional views of the chip. 図４は、実施の形態１に係るＳＰＦＳ装置の動作を示すフローチャートである。FIG. 4 is a flowchart showing the operation of the SPFS device according to the first embodiment. 図５は、実施の形態２に係るＳＰＦＳ装置の構成を示す模式図である。FIG. 5 is a schematic diagram showing the configuration of the SPFS device according to the second embodiment. 図６は、実施の形態２に係るＳＰＦＳ装置の動作を示すフローチャートである。FIG. 6 is a flowchart showing the operation of the SPFS device according to the second embodiment. 図７は、回折格子の他の形態を示す斜視図である。FIG. 7 is a perspective view showing another form of the diffraction grating. 図８は、回折格子の他の形態を示す平面図である。FIG. 8 is a plan view showing another form of the diffraction grating.

以下、本発明の実施の形態について、図面を参照して詳細に説明する。 Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail with reference to the drawings.

［実施の形態１］
図１は、本発明の実施の形態１に係る表面プラズモン励起増強蛍光分析装置（ＳＰＦＳ装置）１００の構成を示す模式図（平面図）である。なお、図１では、回折格子１６の構成を明確にするため、凸部１８を拡大して示している。[Embodiment 1]
FIG. 1 is a schematic diagram (plan view) showing the configuration of a surface plasmon excitation enhanced fluorescence analyzer (SPFS device) 100 according to Embodiment 1 of the present invention. In addition, in FIG. 1, in order to clarify the configuration of the diffraction grating 16, the convex portion 18 is shown in an enlarged manner.

図１に示されるように、ＳＰＦＳ装置（検出装置）１００は、チップホルダー１１０、光照射部１２０、光検出部１３０および制御部１４０を有する。ＳＰＦＳ装置１００は、チップホルダー１１０に回折格子１６を有するチップ１０を装着した状態で使用される。そこで、チップ１０について先に説明し、その後にＳＰＦＳ装置１００の各構成要素について説明する。 As shown in FIG. 1, the SPFS device (detection device) 100 includes a chip holder 110, a light irradiation unit 120, a light detection unit 130, and a control unit 140. The SPFS device 100 is used with the chip 10 having the diffraction grating 16 mounted on the chip holder 110. Therefore, the chip 10 will be described first, and then each component of the SPFS device 100 will be described.

（チップの構成）
図２は、チップ１０の回折格子１６の部分拡大斜視図である。図３Ａは、チップ１０の断面図であり、図３Ｂは、チップ１０の他の形態であるチップ２０の断面図である。なお、図２では、基板１２および金属膜１４の断面を示すハッチングを省略している。(Chip configuration)
FIG. 2 is a partially enlarged perspective view of the diffraction grating 16 of the chip 10. 3A is a cross-sectional view of the chip 10, and FIG. 3B is a cross-sectional view of a chip 20 that is another form of the chip 10. In FIG. 2, hatching showing the cross section of the substrate 12 and the metal film 14 is omitted.

図２に示されるように、チップ１０は、基板１２および金属膜１４を有する。金属膜１４には、回折格子１６が形成されている。回折格子１６の同じ領域には第１捕捉体（例えば第１の１次抗体）および第２捕捉体（例えば第２の１次抗体）が固定化されており、この領域は、第１捕捉体と第１被検出物質とが結合するとともに、第２捕捉体と第２被検出物質とが結合するための反応場としても機能する。なお、図２では、第１捕捉体、第２捕捉体、第１被検出物質および第２被検出物質を省略している。通常、チップ１０は、検出ごとに交換される。 As shown in FIG. 2, the chip 10 has a substrate 12 and a metal film 14. A diffraction grating 16 is formed on the metal film 14. A first capturing body (for example, a first primary antibody) and a second capturing body (for example, a second primary antibody) are immobilized in the same region of the diffraction grating 16, and this region is the first capturing body. And the first substance to be detected, and also functions as a reaction field for binding the second capturing body and the second substance to be detected. Note that, in FIG. 2, the first capturing body, the second capturing body, the first substance to be detected, and the second substance to be detected are omitted. Usually, the chip 10 is replaced after each detection.

基板１２は、金属膜１４の支持部材である。基板１２の材料は、金属膜１４を支持できる機械的強度を有するものであれば特に限定されない。基板１２の材料の例には、ガラスや石英、シリコンなどの無機材料、ポリメタクリル酸メチルやポリカーボネート、ポリスチレン、ポリオレフィンなどの樹脂が含まれる。 The substrate 12 is a support member for the metal film 14. The material of the substrate 12 is not particularly limited as long as it has a mechanical strength capable of supporting the metal film 14. Examples of the material for the substrate 12 include inorganic materials such as glass, quartz, and silicon, and resins such as polymethylmethacrylate, polycarbonate, polystyrene, and polyolefin.

金属膜１４は、基板１２上に配置されている。前述のとおり、金属膜１４には、回折格子１６が形成されている。金属膜１４に光を照射すると、金属膜１４中に生じる表面プラズモンと、回折格子１６により生じるエバネッセント波とが結合して、表面プラズモン共鳴が生じる。 The metal film 14 is arranged on the substrate 12. As described above, the diffraction grating 16 is formed on the metal film 14. When the metal film 14 is irradiated with light, the surface plasmon generated in the metal film 14 and the evanescent wave generated by the diffraction grating 16 are combined to generate surface plasmon resonance.

金属膜１４の材料は、表面プラズモン共鳴を生じさせうる金属であれば特に限定されない。金属膜１４の材料の例には、金、銀、銅、アルミ、これらの合金が含まれる。本実施の形態では、金属膜１４は、金薄膜である。金属膜１４の形成方法は、特に限定されない。金属膜１４の形成方法の例には、スパッタリング、蒸着、メッキが含まれる。金属膜１４の厚みは、特に限定されないが、３０〜７０ｎｍの範囲内が好ましい。 The material of the metal film 14 is not particularly limited as long as it is a metal that can generate surface plasmon resonance. Examples of the material of the metal film 14 include gold, silver, copper, aluminum and alloys thereof. In the present embodiment, the metal film 14 is a gold thin film. The method for forming the metal film 14 is not particularly limited. Examples of the method of forming the metal film 14 include sputtering, vapor deposition, and plating. The thickness of the metal film 14 is not particularly limited, but is preferably in the range of 30 to 70 nm.

金属膜１４（反応場）には、第１被検出物質を捕捉するための第１捕捉体と、第２被検出物質を捕捉するための第２捕捉体とが固定されている。第１捕捉体は、第１被検出物質に特異的に結合する。また、第２捕捉体は、第２被検出物質に特異的に結合する。本実施の形態では、金属膜１４の同じ領域に、第１捕捉体および第２捕捉体が略均一に固定化されている。第１捕捉体および第２捕捉体の種類は、被検出物質を捕捉することができれば特に限定されない。たとえば、第１捕捉体および第２捕捉体は、第１被検出物質および第２被検出物質にそれぞれ特異的な抗体（第１の１次抗体および第２の１次抗体）またはその断片、第１被検出物質および第２被検出物質にそれぞれ特異的に結合可能な酵素などである。 On the metal film 14 (reaction field), a first capturing body for capturing the first detected substance and a second capturing body for capturing the second detected substance are fixed. The first capturing body specifically binds to the first substance to be detected. Further, the second capturing body specifically binds to the second substance to be detected. In the present embodiment, the first capturing body and the second capturing body are substantially uniformly fixed in the same region of the metal film 14. The types of the first capturing body and the second capturing body are not particularly limited as long as the substance to be detected can be captured. For example, the first capturing body and the second capturing body are an antibody (first primary antibody and second primary antibody) or a fragment thereof specific to the first substance to be detected and the second substance to be detected, respectively. An enzyme or the like that can specifically bind to each of the first substance to be detected and the second substance to be detected.

第１捕捉体および第２捕捉体の固定化方法は、特に限定されない。たとえば、金属膜１４の上に、第１捕捉体および第２捕捉体を結合させた自己組織化単分子膜（以下「ＳＡＭ」という）または高分子膜を形成すればよい。ＳＡＭの例には、ＨＯＯＣ−（ＣＨ2）11−ＳＨなどの置換脂肪族チオールで形成された膜が含まれる。高分子膜を構成する材料の例には、ポリエチレングリコールおよびＭＰＣポリマーが含まれる。また、第１捕捉体および第２捕捉体に結合可能な反応性基（または反応性基に変換可能な官能基）を有する高分子を金属膜１４に固定化し、この高分子に第１捕捉体および第２捕捉体を結合させてもよい。The method of immobilizing the first capturing body and the second capturing body is not particularly limited. For example, a self-assembled monolayer (hereinafter referred to as “SAM”) or polymer film in which the first capturing body and the second capturing body are combined may be formed on the metal film 14. Examples of SAM include HOOC- (CH 2) 11 film formed by substituted aliphatic thiols such as -SH. Examples of materials that make up the polymeric membrane include polyethylene glycol and MPC polymers. Further, a polymer having a reactive group (or a functional group convertible to a reactive group) capable of binding to the first capturing body and the second capturing body is immobilized on the metal film 14, and the first capturing body is attached to the polymer. And the second capturing body may be bound.

図２に示されるように、回折格子１６は、複数の凸部１８を有する。回折格子１６は、金属膜１４に光を照射された時に、エバネッセント波を生じさせる。複数の凸部１８は、第１の方向について第１のピッチλ1で配列されている。また、複数の凸部１８は、第１の方向に交差する第２の方向について、第１のピッチλ1と異なる第２のピッチλ2で配列されている。ここで、「第１のピッチλ1」とは、第１の方向における回折格子１６の繰り返し単位の長さをいう。また、「第２のピッチλ2」とは、第２の方向における回折格子１６の繰り返し単位の長さをいう。第１のピッチλ1と、第２のピッチλ2とは、それぞれ１００〜２０００ｎｍの範囲内であることが好ましい。As shown in FIG. 2, the diffraction grating 16 has a plurality of convex portions 18. The diffraction grating 16 produces an evanescent wave when the metal film 14 is irradiated with light. The plurality of convex portions 18 are arranged at the first pitch λ 1 in the first direction. Further, the plurality of convex portions 18 are arranged at a second pitch λ 2 different from the first pitch λ 1 in the second direction intersecting the first direction. Here, the “first pitch λ 1 ”means the length of the repeating unit of the diffraction grating 16 in the first direction. The “second pitch λ 2 ”means the length of the repeating unit of the diffraction grating 16 in the second direction. The first pitch λ 1 and the second pitch λ 2 are preferably in the range of 100 to 2000 nm, respectively.

凸部１８の平面視形状は、特に限定されない。本実施の形態では、凸部１８の平面視形状は、長方形である。また、本実施の形態では、平面視したときの各凸部１８の大きさは、すべて同じである。 The plan view shape of the convex portion 18 is not particularly limited. In the present embodiment, the plan view shape of the convex portion 18 is a rectangle. In addition, in the present embodiment, the sizes of the respective convex portions 18 in plan view are all the same.

第１の方向（図２のｘ方向）と、第２の方向（図２のｙ方向）とは、平面視したときに、第１の方向に沿う第１仮想直線Ｌ１と、第２の方向に沿う第２仮想直線Ｌ２とが交差するように設定される。また、第１仮想直線Ｌ１と、第２仮想直線Ｌ２とのなす角度は、特に限定されない。本実施の形態では、第１仮想直線Ｌ１と、第２仮想直線Ｌ２とのなす角度θは、９０°である。 The first direction (x direction in FIG. 2) and the second direction (y direction in FIG. 2) are the first imaginary straight line L1 along the first direction and the second direction when seen in a plan view. Is set so as to intersect with a second virtual straight line L2. The angle formed by the first virtual straight line L1 and the second virtual straight line L2 is not particularly limited. In the present embodiment, the angle θ formed by the first virtual straight line L1 and the second virtual straight line L2 is 90°.

また、第１の方向における凸部１８間の凹部に対する凸部１８の第１高さｈ１は、全て同じ高さである。また、第２の方向における凸部１８間の凹部に対する凸部１８の第２高さｈ２は、全て同じ高さである。さらに、第１高さｈ１と、第２高さｈ２とは、同じ高さであってもよいし、異なる高さであってもよい。本実施の形態では、第１高さｈ１と、第２高さｈ２とは、同じ高さである。また、第１高さｈ１と、第２高さｈ２とは、１０〜１０００ｎｍの範囲であることが好ましい。 Further, the first heights h1 of the convex portions 18 with respect to the concave portions between the convex portions 18 in the first direction are all the same height. Further, the second heights h2 of the convex portions 18 with respect to the concave portions between the convex portions 18 in the second direction are all the same height. Further, the first height h1 and the second height h2 may have the same height or different heights. In the present embodiment, the first height h1 and the second height h2 are the same height. The first height h1 and the second height h2 are preferably in the range of 10 to 1000 nm.

回折格子１６の形成方法は、特に限定されない。たとえば、平板状の基板１２の上に金属膜１４を形成した後、金属膜１４に凹凸形状を付与してもよい。また、予め凹凸形状を付与された基板１２の上に、金属膜１４を形成してもよい。いずれの方法であっても、回折格子１６を含む金属膜１４を形成することができる。 The method for forming the diffraction grating 16 is not particularly limited. For example, the metal film 14 may be formed on the flat plate-shaped substrate 12, and then the metal film 14 may be provided with an uneven shape. Further, the metal film 14 may be formed on the substrate 12 to which the uneven shape is previously given. With either method, the metal film 14 including the diffraction grating 16 can be formed.

回折格子１６は、使用時には、反応や洗浄などの操作のために緩衝液などの液体に接触する。したがって、通常は、回折格子１６は、液体を収容可能な空間に配置される。たとえば、回折格子１６は、図３Ａに示されるように、液体を収容するウェルの内表面（例えば底面）に配置されてもよいし、図３Ｂに示されるように、液体を連続して供給されうる流路（フローセル）の内表面（例えば底面）に配置されてもよい。 In use, the diffraction grating 16 comes into contact with a liquid such as a buffer solution for operations such as reaction and washing. Therefore, normally, the diffraction grating 16 is arranged in a space capable of containing a liquid. For example, the diffraction grating 16 may be disposed on the inner surface (eg, the bottom surface) of the well containing the liquid as shown in FIG. 3A, or continuously supplied with the liquid as shown in FIG. 3B. It may be arranged on the inner surface (for example, bottom surface) of the flow channel (flow cell).

ここで、回折格子１６に光（励起光）を照射したときにプラズモン共鳴が起こるための条件について説明する。 Here, the conditions for causing plasmon resonance when the diffraction grating 16 is irradiated with light (excitation light) will be described.

２種類の媒質の界面において、励起される表面プラズモンの波数ｋspは、以下の式（１）で表すことができる。なお、以下の式（１）において、ωは、励起光の角周波数であり、ｃは、光の速度であり、ε1は、媒質１（本実施の形態では水）の誘電率であり、ε2は、媒質２（本実施の形態では金属膜）の誘電率である。The wave number k sp of the surface plasmon excited at the interface between the two types of media can be expressed by the following equation (1). In the following formula (1), ω is the angular frequency of the excitation light, c is the speed of light, ε 1 is the dielectric constant of the medium 1 (water in this embodiment), ε 2 is the dielectric constant of the medium 2 (metal film in this embodiment).

Figure 0006711285
Figure 0006711285

そして、励起される表面プラズモンの波数ｋspが回折格子１６に対して、以下の式（２）を満たすときに表面プラズモン共鳴が起こる。なお、以下の式（２）において、ｋ0は、励起光の波数であり、θは、励起光の入射角であり、λは、回折格子１６の繰り返し単位の長さ（ピッチ）であり、ｍは、任意の整数である。Then, when the wave number k sp of the excited surface plasmon satisfies the following expression (2) with respect to the diffraction grating 16, surface plasmon resonance occurs. In the following equation (2), k 0 is the wave number of the excitation light, θ is the incident angle of the excitation light, λ is the length (pitch) of the repeating unit of the diffraction grating 16, m is an arbitrary integer.

Figure 0006711285
Figure 0006711285

よって、本実施の形態に係る回折格子１６では、第１の方向において前述の式（１）および式（２）から導き出される以下の式（３）を満たすように第１のピッチλ1が設定され、第２の方向において前述の式（１）および式（２）から導き出される以下の式（４）を満たすように第２のピッチλ2が設定される。Therefore, in the diffraction grating 16 according to the present embodiment, the first pitch λ 1 is set so as to satisfy the following equation (3) derived from the above equations (1) and (2) in the first direction. Then, the second pitch λ 2 is set so as to satisfy the following expression (4) derived from the expressions (1) and (2) described above in the second direction.

Figure 0006711285
［上記式（３）において、ω1は、第１波長の第１励起光α１の角周波数であり、ｃは、光の速度であり、ε1は、金属膜１４に面する媒質の誘電率であり、ε2は、金属膜１４の誘電率であり、ｋ01は、第１波長の第１励起光α１の波数であり、θ1は、第１波長の第１励起光α１の金属膜１４に対する入射角であり、ｍは、任意の整数であり、λ1は、第１のピッチである。］
Figure 0006711285
 [In the above formula (3), ω 1 is the angular frequency of the first excitation light α 1 of the first wavelength, c is the speed of light, and ε 1 is the dielectric constant of the medium facing the metal film 14. Where ε 2 is the dielectric constant of the metal film 14, k 01 is the wave number of the first excitation light α 1 of the first wavelength, and θ 1 is the metal film of the first excitation light α 1 of the first wavelength. 14 is the incident angle with respect to 14, m is an arbitrary integer, and λ 1 is the first pitch. ]

Figure 0006711285
［上記式（４）において、ω2は、第２波長の第２励起光α２の角周波数であり、ｃは、光の速度であり、ε1は、金属膜１４に面する媒質の誘電率であり、ε2は、金属膜１４の誘電率であり、ｋ02は、第２波長の第２励起光α２の波数であり、θ2は、第２波長の第２励起光α２の金属膜１４に対する入射角であり、ｍは、任意の整数であり、λ2は、第２のピッチである。］
Figure 0006711285
 [In the above formula (4), ω 2 is the angular frequency of the second excitation light α 2 having the second wavelength, c is the speed of light, and ε 1 is the dielectric constant of the medium facing the metal film 14. Where ε 2 is the dielectric constant of the metal film 14, k 02 is the wave number of the second excitation light α 2 having the second wavelength, and θ 2 is the metal film of the second excitation light α 2 having the second wavelength. Is the angle of incidence with respect to 14, m is an arbitrary integer, and λ 2 is the second pitch. ]

第１励起光α１は、平面視したときにその光軸が第１の方向に沿うように、金属膜１４に全反射角度（表面プラズモン共鳴が生じる角度）で入射する。また、第２励起光α２は、平面視したときにその光軸が第２の方向に沿うように、金属膜１４に全反射角度（表面プラズモン共鳴が生じる角度）で入射する。このとき、第１励起光α１および第２励起光α２は、同じ領域に入射する。このように金属膜１４に対して第１励起光α１または第２励起光α２を表面プラズモン共鳴が生じる角度でそれぞれ照射することで、金属膜１４上に局在場光（一般に「エバネッセント光」または「近接場光」とも呼ばれる）を発生させることができる。この局在場光により、金属膜１４上に存在する第１被検出物質を標識する第１蛍光物質および第２被検出物質を標識する第２蛍光物質が励起され、第１蛍光γ１および第２蛍光γ２がそれぞれ放出される。ＳＰＦＳ装置１００は、第１蛍光物質から放出された第１蛍光γ１および第２蛍光物質から放出された第２蛍光γ２の光量をそれぞれ検出することで、第１被検出物質および第２被検出物質の存在または量を検出する。 The first excitation light α1 is incident on the metal film 14 at a total reflection angle (an angle at which surface plasmon resonance occurs) so that the optical axis thereof is along the first direction when seen in a plan view. Further, the second excitation light α2 is incident on the metal film 14 at a total reflection angle (an angle at which surface plasmon resonance occurs) so that the optical axis thereof is along the second direction when seen in a plan view. At this time, the first excitation light α1 and the second excitation light α2 enter the same region. By thus irradiating the metal film 14 with the first excitation light α1 or the second excitation light α2 at an angle at which surface plasmon resonance occurs, localized field light (generally “evanescent light” or (Also called “near-field light”) can be generated. The localized field light excites the first fluorescent substance that labels the first substance to be detected and the second fluorescent substance that labels the second substance to be detected, which are present on the metal film 14, and the first fluorescent light γ1 and the second fluorescent substance γ1 The fluorescence γ2 is emitted. The SPFS apparatus 100 detects the light amounts of the first fluorescent light γ1 emitted from the first fluorescent substance and the second fluorescent light γ2 emitted from the second fluorescent substance, respectively, to thereby obtain the first detected substance and the second detected substance. The presence or amount of.

（ＳＰＦＳ装置の構成）
次に、ＳＰＦＳ装置１００の各構成要素について説明する。前述のとおり、ＳＰＦＳ装置１００は、チップホルダー１１０、光照射部１２０、光検出部１３０および制御部１４０を有する。(Structure of SPFS device)
Next, each component of the SPFS device 100 will be described. As described above, the SPFS device 100 has the chip holder 110, the light irradiation unit 120, the light detection unit 130, and the control unit 140.

チップホルダー１１０は、チップ１０を保持する。チップホルダー１１０の形状は、チップ１０を保持することができ、かつ第１励起光α１、第２励起光α２、第１蛍光γ１および第２蛍光γ２の光路を妨げなければ特に限定されない。本実施の形態では、チップホルダー１１０は、上面が開放された箱状に形成されている。チップ１０は、チップホルダー１１０の内部に収容される。 The chip holder 110 holds the chip 10. The shape of the chip holder 110 is not particularly limited as long as it can hold the chip 10 and does not disturb the optical paths of the first excitation light α1, the second excitation light α2, the first fluorescence γ1 and the second fluorescence γ2. In the present embodiment, the chip holder 110 is formed in a box shape whose upper surface is open. The chip 10 is housed inside the chip holder 110.

光照射部１２０は、チップホルダー１１０に保持されたチップ１０（金属膜１４の回折格子１６）に第１励起光α１および第２励起光α２を出射する。第１蛍光γ１および第２蛍光γ２の測定時には、光照射部１２０は、金属膜１４に対する入射角が表面プラズモン共鳴を生じさせる角度となるように、第１励起光α１および第２励起光α２を回折格子１６の同じ領域に向けて出射する。ここで「第１励起光」とは、第１蛍光物質を直接または間接的に励起させる光である。たとえば、第１励起光α１は、回折格子１６（金属膜１４）に表面プラズモン共鳴が生じる角度で照射されたときに、後述の第１蛍光物質を励起させる局在場光を金属膜１４の表面上に生じさせる光である。また、「第２励起光」とは、第２蛍光物質を直接または間接的に励起させる光である。たとえば、第２励起光α２は、回折格子１６（金属膜１４）に表面プラズモン共鳴が生じる角度で照射されたときに、後述の第２蛍光物質を励起させる局在場光を金属膜１４の表面上に生じさせる光である。 The light irradiation unit 120 emits the first excitation light α1 and the second excitation light α2 to the chip 10 (diffraction grating 16 of the metal film 14) held by the chip holder 110. During the measurement of the first fluorescence γ1 and the second fluorescence γ2, the light irradiation unit 120 sets the first excitation light α1 and the second excitation light α2 so that the incident angle with respect to the metal film 14 becomes an angle that causes surface plasmon resonance. The light is emitted toward the same region of the diffraction grating 16. Here, the "first excitation light" is light that directly or indirectly excites the first fluorescent substance. For example, when the first excitation light α1 is irradiated on the diffraction grating 16 (metal film 14) at an angle at which surface plasmon resonance occurs, localized field light that excites a first fluorescent substance described later is generated on the surface of the metal film 14. It is the light that is generated above. The “second excitation light” is light that directly or indirectly excites the second fluorescent substance. For example, when the diffraction grating 16 (metal film 14) is irradiated with the second excitation light α2 at an angle at which surface plasmon resonance occurs, localized field light that excites a second fluorescent substance, which will be described later, is generated on the surface of the metal film 14. It is the light that is generated above.

光照射部１２０は、第１光出射ユニット（第１光照射部）１２１および第２光出射ユニット（第２光照射部）１２２を有する。第１光出射ユニット１２１は、第１光源ユニット１２３、第１角度調整機構１２４および第１光源制御部１２５を含む。また、第２光出射ユニット１２２は、第２光源ユニット１２６、第２角度調整機構１２７および第２光源制御部１２８を含む。 The light irradiation unit 120 has a first light emission unit (first light irradiation unit) 121 and a second light emission unit (second light irradiation unit) 122. The first light emitting unit 121 includes a first light source unit 123, a first angle adjusting mechanism 124, and a first light source controller 125. The second light emitting unit 122 also includes a second light source unit 126, a second angle adjusting mechanism 127, and a second light source controller 128.

第１光源ユニット１２３は、コリメートされ、かつ波長および光量が一定の第１励起光α１を、金属膜１４（回折格子１６）における照射スポットの形状が略円形となるように出射する。第１光源ユニット１２３は、平面視したときに出射される光の光軸が第１の方向（図２のｘ方向）に沿うように配置されている。また、第２光源ユニット１２６は、コリメートされ、かつ波長および光量が一定の第２励起光α２を、金属膜１４（回折格子１６）における照射スポットの形状が略円形となるように出射する。第２光源ユニット１２６は、平面視したときに出射される光の光軸が第２の方向（図２のｙ方向）に沿うように配置されている。第１光源ユニット１２３は、例えば、第１励起光α１の光源、ビーム整形光学系、ＡＰＣ機構および温度調整機構（いずれも不図示）をそれぞれ含む。また、第２光源ユニット１２６は、例えば、第２励起光α２の光源、ビーム整形光学系、ＡＰＣ機構および温度調整機構（いずれも不図示）をそれぞれ含む。第１光源ユニット１２３から出射される第１励起光α１の第１波長と、第２光源ユニット１２６から出射される第２励起光α２の第２波長は、互いに異なるが、いずれも４００〜１０００ｎｍの範囲内であることが好ましい。 The first light source unit 123 emits the first excitation light α1 that is collimated and has a constant wavelength and a constant light amount such that the irradiation spot on the metal film 14 (diffraction grating 16) has a substantially circular shape. The first light source unit 123 is arranged so that the optical axis of the light emitted in a plan view is along the first direction (the x direction in FIG. 2 ). In addition, the second light source unit 126 emits the second excitation light α2 that is collimated and has a constant wavelength and a constant light amount such that the irradiation spot on the metal film 14 (diffraction grating 16) has a substantially circular shape. The second light source unit 126 is arranged so that the optical axis of the light emitted in a plan view is along the second direction (the y direction in FIG. 2 ). The first light source unit 123 includes, for example, a light source of the first excitation light α1, a beam shaping optical system, an APC mechanism, and a temperature adjusting mechanism (all not shown). In addition, the second light source unit 126 includes, for example, a light source of the second excitation light α2, a beam shaping optical system, an APC mechanism, and a temperature adjusting mechanism (all not shown). Although the first wavelength of the first excitation light α1 emitted from the first light source unit 123 and the second wavelength of the second excitation light α2 emitted from the second light source unit 126 are different from each other, both are 400 to 1000 nm. It is preferably within the range.

光源の種類は、特に限定されず、例えばレーザーダイオード（ＬＤ）である。光源の他の例には、発光ダイオード、水銀灯、その他のレーザー光源が含まれる。光源から出射される光がビームでない場合は、光源から出射される光は、レンズや鏡、スリットなどによりビームに変換される。また、光源から出射される光が単色光でない場合は、光源から出射される光は、回折格子１６などにより単色光に変換される。さらに、光源から出射される光が直線偏光でない場合は、光源から出射される光は、偏光子などにより直線偏光の光に変換される。 The type of light source is not particularly limited, and is, for example, a laser diode (LD). Other examples of light sources include light emitting diodes, mercury vapor lamps, and other laser light sources. When the light emitted from the light source is not a beam, the light emitted from the light source is converted into a beam by a lens, a mirror, a slit, or the like. If the light emitted from the light source is not monochromatic light, the light emitted from the light source is converted into monochromatic light by the diffraction grating 16 or the like. Further, when the light emitted from the light source is not linearly polarized light, the light emitted from the light source is converted into linearly polarized light by a polarizer or the like.

ビーム整形光学系は、例えば、コリメーターやバンドパスフィルター、直線偏光フィルター、半波長板、スリット、ズーム手段などを含んでいてもよい。コリメーターは、光源から出射された第１励起光α１または第２励起光α２をコリメートする。バンドパスフィルターは、光源から出射された第１励起光α１または第２励起光α２を中心波長のみの狭帯域光にする。光源からの第１励起光α１および第２励起光α２は、若干の波長分布幅を有しているためである。直線偏光フィルターは、光源から出射された第１励起光α１または第２励起光α２を完全な直線偏光の光にする。半波長板は、金属膜１４にＰ波成分が入射するように第１励起光α１または第２励起光α２の偏光方向を調整する。スリットおよびズーム手段は、金属膜１４の裏面における照射スポットの形状が所定サイズの円形となるように、第１励起光α１または第２励起光α２のビーム径や輪郭形状などを調整する。ＡＰＣ機構は、光源の出力が一定となるように光源を制御する。より具体的には、ＡＰＣ機構は、第１励起光α１または第２励起光α２から分岐させた光の光量を不図示のフォトダイオードなどで検出する。そして、ＡＰＣ機構は、回帰回路で投入エネルギーを制御することで、光源の出力を一定に制御する。温度調整機構は、例えば、ヒーターやペルチェ素子などである。光源から出射される光の波長およびエネルギーは、温度によって変動することがある。このため、温度調整機構で光源の温度を一定に保つことにより、光源から出射される光の波長およびエネルギーを一定に制御する。 The beam shaping optical system may include, for example, a collimator, a bandpass filter, a linear polarization filter, a half-wave plate, a slit, a zoom means, and the like. The collimator collimates the first excitation light α1 or the second excitation light α2 emitted from the light source. The bandpass filter converts the first excitation light α1 or the second excitation light α2 emitted from the light source into narrowband light having only the central wavelength. This is because the first excitation light α1 and the second excitation light α2 from the light source have a slight wavelength distribution width. The linear polarization filter converts the first excitation light α1 or the second excitation light α2 emitted from the light source into completely linearly polarized light. The half-wave plate adjusts the polarization direction of the first excitation light α1 or the second excitation light α2 so that the P-wave component is incident on the metal film 14. The slit and the zooming means adjust the beam diameter or the contour shape of the first excitation light α1 or the second excitation light α2 so that the irradiation spot on the back surface of the metal film 14 has a circular shape of a predetermined size. The APC mechanism controls the light source so that the output of the light source is constant. More specifically, the APC mechanism detects the amount of light branched from the first excitation light α1 or the second excitation light α2 with a photodiode (not shown) or the like. Then, the APC mechanism controls the input energy by the regression circuit to control the output of the light source to be constant. The temperature adjustment mechanism is, for example, a heater or a Peltier element. The wavelength and energy of the light emitted from the light source may change depending on the temperature. Therefore, the temperature and the energy of the light emitted from the light source are controlled to be constant by keeping the temperature of the light source constant by the temperature adjusting mechanism.

第１角度調整機構１２４は、金属膜１４の表面への第１励起光α１の入射角を調整する。第１角度調整機構１２４は、金属膜１４表面の所定の位置に向けて所定の入射角で第１励起光α１を照射するために、第１励起光α１の光軸とチップ１０（金属膜１４）とを相対的に回転させる。本実施の形態では、第１角度調整機構１２４は、第１励起光α１の光軸と金属膜１４の交点を通り、第１励起光α１の光軸に直交する金属膜１４上の軸を回転軸として第１光源ユニット１２３を回動させる。また、第２角度調整機構１２７は、金属膜１４の表面への第２励起光α２の入射角を調整する。第２角度調整機構１２７は、金属膜１４表面の所定の位置に向けて所定の入射角で第２励起光α２を照射するために、第２励起光α２の光軸とチップ１０（金属膜１４）とを相対的に回転させる。本実施の形態では、第２角度調整機構１２７は、第２励起光α２の光軸と金属膜１４の交点を通り、第２励起光α２の光軸に直交する金属膜１４上の軸を回転軸として第２光源ユニット１２６を回動させる。 The first angle adjusting mechanism 124 adjusts the incident angle of the first excitation light α1 on the surface of the metal film 14. The first angle adjusting mechanism 124 irradiates the first excitation light α1 at a predetermined incident angle toward a predetermined position on the surface of the metal film 14 and the optical axis of the first excitation light α1 and the chip 10 (the metal film 14). ) And rotate relative to. In the present embodiment, the first angle adjusting mechanism 124 rotates the axis on the metal film 14 which passes through the intersection of the optical axis of the first excitation light α1 and the metal film 14 and is orthogonal to the optical axis of the first excitation light α1. The first light source unit 123 is rotated about the axis. Further, the second angle adjusting mechanism 127 adjusts the incident angle of the second excitation light α2 on the surface of the metal film 14. The second angle adjusting mechanism 127 irradiates the second excitation light α2 with a predetermined incident angle toward a predetermined position on the surface of the metal film 14 so that the optical axis of the second excitation light α2 and the chip 10 (the metal film 14). ) And rotate relative to. In the present embodiment, the second angle adjusting mechanism 127 rotates the axis on the metal film 14 which passes through the intersection of the optical axis of the second excitation light α2 and the metal film 14 and is orthogonal to the optical axis of the second excitation light α2. The second light source unit 126 is rotated about the axis.

金属膜１４の表面に対する第１励起光α１の入射角のうち、第１プラズモン散乱光δ１の最大光量を得られる角度が第１増強角である。第１励起光α１の入射角を第１増強角に設定することで、高強度の第１蛍光γ１を測定することが可能となる。金属膜１４の表面に対する第２励起光α２の入射角のうち、第２プラズモン散乱光δ２の最大光量を得られる角度が第２増強角である。第２励起光α２の入射角を第２増強角に設定することで、高強度の第２蛍光γ２を測定することが可能となる。なお、金属膜１４の膜厚、流路内の液体の屈折率などにより、第１励起光α１または第２励起光α２の基本的な入射条件が決まるが、流路内の蛍光物質の種類および量などにより、最適な入射条件はわずかに変動する。 Of the incident angles of the first excitation light α1 with respect to the surface of the metal film 14, the angle at which the maximum amount of the first plasmon scattered light δ1 can be obtained is the first enhancement angle. By setting the incident angle of the first excitation light α1 to the first enhancement angle, it becomes possible to measure the high-strength first fluorescence γ1. Of the incident angles of the second excitation light α2 with respect to the surface of the metal film 14, the angle at which the maximum amount of the second plasmon scattered light δ2 can be obtained is the second enhancement angle. By setting the incident angle of the second excitation light α2 to the second enhancement angle, it becomes possible to measure the high intensity second fluorescence γ2. The basic incident condition of the first excitation light α1 or the second excitation light α2 is determined by the film thickness of the metal film 14, the refractive index of the liquid in the channel, and the like. The optimum incident condition slightly varies depending on the amount.

第１光源制御部１２５は、第１光源ユニット１２３に含まれる各種機器を制御して、第１光源ユニット１２３の出射光（第１励起光α１）の出射を制御する。第２光源制御部１２８は、第２光源ユニット１２６に含まれる各種機器を制御して、第２光源ユニット１２６の出射光（第２励起光α２）の出射を制御する。第１光源制御部１２５および第２光源制御部１２８は、例えば、演算装置、制御装置、記憶装置、入力装置および出力装置を含む公知のコンピュータやマイコンなどによってそれぞれ構成される。 The first light source control unit 125 controls various devices included in the first light source unit 123 to control emission of the emission light (first excitation light α1) of the first light source unit 123. The second light source control unit 128 controls various devices included in the second light source unit 126 to control emission of the emission light (second excitation light α2) of the second light source unit 126. The first light source control unit 125 and the second light source control unit 128 are each configured by, for example, a known computer or microcomputer including an arithmetic device, a control device, a storage device, an input device, and an output device.

光検出部１３０は、第１光検出ユニット１３１（第１光検出部）および第２光検出ユニット１３２（第２光検出部）を有する。第１光検出ユニット１３１は、第１被検出物質の検出時において金属膜１４の表面への第１励起光α１の照射によって生じた第１蛍光γ１と、第１増強角の測定時において金属膜１４の面への第１励起光α１の照射によって生じた第１プラズモン散乱光δ１とを検出する。第１光検出ユニット１３１は、第１光源ユニット１２３に対して、第１励起光α１の光軸と金属膜１４との交点を通り、かつ金属膜１４の表面に対する法線を挟むように配置されている。第２光検出ユニット１３２は、第２被検出物質の検出時において金属膜１４の表面への第２励起光α２の照射によって生じた第２蛍光γ２と、第２増強角の測定時において金属膜１４の面への第２励起光α２の照射によって生じた第２プラズモン散乱光δ２とを検出する。第２光検出ユニット１３２は、第２光源ユニット１２６に対して、第２励起光α２の光軸と金属膜１４との交点を通り、かつ金属膜１４の表面に対する法線を挟むように配置されている。第１光検出ユニット１３１は、第１受光センサー１３３、第３角度調整機構１３４および第１受光センサー制御部１３５を含む。また、第２光検出ユニット１３２は、第２受光センサー１３６、第４角度調整機構１３７および第２受光センサー制御部１３８を含む。 The light detection unit 130 has a first light detection unit 131 (first light detection unit) and a second light detection unit 132 (second light detection unit). The first photo-detecting unit 131 uses the first fluorescent light γ1 generated by irradiating the surface of the metal film 14 with the first excitation light α1 when detecting the first substance to be detected, and the metal film when measuring the first enhancement angle. The first plasmon scattered light δ1 generated by irradiating the surface of 14 with the first excitation light α1 is detected. The first light detection unit 131 is arranged so as to pass through the intersection of the optical axis of the first excitation light α1 and the metal film 14 with respect to the first light source unit 123 and sandwich the normal line to the surface of the metal film 14. ing. The second photodetection unit 132 uses the second fluorescence γ2 generated by irradiating the surface of the metal film 14 with the second excitation light α2 during the detection of the second substance to be detected, and the metal film during the measurement of the second enhancement angle. The second plasmon scattered light δ2 generated by the irradiation of the second excitation light α2 on the surface 14 is detected. The second light detection unit 132 is arranged so as to pass through the intersection of the optical axis of the second excitation light α2 and the metal film 14 with respect to the second light source unit 126 and sandwich the normal line to the surface of the metal film 14. ing. The first light detection unit 131 includes a first light receiving sensor 133, a third angle adjusting mechanism 134, and a first light receiving sensor controller 135. The second light detection unit 132 also includes a second light receiving sensor 136, a fourth angle adjusting mechanism 137, and a second light receiving sensor control unit 138.

第１受光センサー１３３は、第１光源ユニット１２３が第１励起光α１を照射することにより生じる第１蛍光γ１または第１プラズモン散乱光δ１を検出する。また、第２受光センサー１３６は、第２光源ユニット１２６が第２励起光α２を照射することにより生じる第２蛍光γ２または第２プラズモン散乱光δ２を検出する。第１受光センサー１３３は、微小量の第１被検出物質からの微弱な第１蛍光γ１または第１プラズモン散乱光δ１を検出することが可能な高い感度を有する。第２受光センサー１３６は、微小量の第２被検出物質からの微弱な第２蛍光γ２または第２プラズモン散乱光δ２を検出することが可能な高い感度を有する。第１受光センサー１３３および第２受光センサー１３６は、例えば、それぞれ光電子増倍管（ＰＭＴ）やアバランシェフォトダイオード（ＡＰＤ）などである。 The first light receiving sensor 133 detects the first fluorescent light γ1 or the first plasmon scattered light δ1 generated by the first light source unit 123 irradiating the first excitation light α1. Further, the second light receiving sensor 136 detects the second fluorescent light γ2 or the second plasmon scattered light δ2 generated by the second light source unit 126 irradiating the second excitation light α2. The first light receiving sensor 133 has high sensitivity capable of detecting the weak first fluorescence γ1 or the first plasmon scattered light δ1 from the minute amount of the first substance to be detected. The second light receiving sensor 136 has high sensitivity capable of detecting the weak second fluorescence γ2 or the second plasmon scattered light δ2 from the minute amount of the second substance to be detected. The first light receiving sensor 133 and the second light receiving sensor 136 are, for example, photomultiplier tubes (PMT) and avalanche photodiodes (APD), respectively.

第３角度調整機構１３４は、第１受光センサー１３３が第１蛍光γ１を検出できるように、第１受光センサー１３３の光軸を調整する。本実施の形態では、第３角度調整機構１３４は、第１蛍光γ１の光軸と金属膜１４の交点を通り、第１蛍光γ１の光軸に直交する金属膜１４上の軸を回転軸として第１受光センサー１３３を回動させる。第４角度調整機構１３７は、第２受光センサー１３６が第２蛍光γ２を検出できるように、第２受光センサー１３６の光軸を調整する。本実施の形態では、第４角度調整機構１３７は、第２蛍光γ２の光軸と金属膜１４の交点を通り、第２蛍光γ２の光軸に直交する金属膜１４上の軸を回転軸として第２受光センサー１３６を回動させる。 The third angle adjusting mechanism 134 adjusts the optical axis of the first light receiving sensor 133 so that the first light receiving sensor 133 can detect the first fluorescence γ1. In the present embodiment, the third angle adjusting mechanism 134 uses the axis on the metal film 14 that passes through the intersection of the optical axis of the first fluorescence γ1 and the metal film 14 and is orthogonal to the optical axis of the first fluorescence γ1 as the rotation axis. The first light receiving sensor 133 is rotated. The fourth angle adjusting mechanism 137 adjusts the optical axis of the second light receiving sensor 136 so that the second light receiving sensor 136 can detect the second fluorescence γ2. In the present embodiment, the fourth angle adjusting mechanism 137 uses the axis on the metal film 14 that passes through the intersection of the optical axis of the second fluorescence γ2 and the metal film 14 and is orthogonal to the optical axis of the second fluorescence γ2 as the rotation axis. The second light receiving sensor 136 is rotated.

第１受光センサー制御部１３５は、第１受光センサー１３３の出力値の検出や、検出した出力値による第１受光センサー１３３の感度の管理、適切な出力値を得るための第１受光センサー１３３の感度の変更などを制御する。第２受光センサー制御部１３８は、第２受光センサー１３６の出力値の検出や、検出した出力値による第２受光センサー１３６の感度の管理、適切な出力値を得るための第２受光センサー１３６の感度の変更などを制御する。第１受光センサー制御部１３５および第２受光センサー制御部１３８は、例えば、演算装置、制御装置、記憶装置、入力装置および出力装置を含む公知のコンピュータやマイコンなどによってそれぞれ構成される。 The first light receiving sensor control unit 135 detects the output value of the first light receiving sensor 133, manages the sensitivity of the first light receiving sensor 133 based on the detected output value, and controls the first light receiving sensor 133 to obtain an appropriate output value. Control changes such as sensitivity changes. The second light receiving sensor control unit 138 detects the output value of the second light receiving sensor 136, manages the sensitivity of the second light receiving sensor 136 based on the detected output value, and controls the second light receiving sensor 136 to obtain an appropriate output value. Control changes such as sensitivity changes. The first light receiving sensor control unit 135 and the second light receiving sensor control unit 138 are each configured by, for example, a known computer or microcomputer including an arithmetic device, a control device, a storage device, an input device, and an output device.

制御部１４０は、例えば、記憶部、処理部、演算装置、制御装置、入力装置および出力装置を含む公知のコンピュータやマイコンなどによって構成されており、第１角度調整機構１２４、第１光源制御部１２５、第２角度調整機構１２７、第２光源制御部１２８、第３角度調整機構１３４、第１受光センサー制御部１３５、第４角度調整機構１３７および第２受光センサー制御部１３８を制御する。 The control unit 140 is configured by, for example, a known computer or microcomputer including a storage unit, a processing unit, a calculation device, a control device, an input device, and an output device, and the first angle adjustment mechanism 124 and the first light source control unit. 125, the 2nd angle adjustment mechanism 127, the 2nd light source control part 128, the 3rd angle adjustment mechanism 134, the 1st light reception sensor control part 135, the 4th angle adjustment mechanism 137, and the 2nd light reception sensor control part 138 are controlled.

（検出装置の検出動作）
次に、ＳＰＦＳ装置１００の検出動作（実施の形態１に係る検出方法）について説明する。図４は、ＳＰＦＳ装置１００の動作手順の一例を示すフローチャートである。この例では、第１捕捉体として第１の１次抗体と、第２捕捉体として第２の１次抗体とが金属膜１４上の同じ領域に固定化されている。また、蛍光標識に使用する捕捉体として、第１蛍光物質で標識された第１の２次抗体と、第２蛍光物質で標識された第２の２次抗体とを使用している。(Detection operation of the detection device)
Next, the detection operation of the SPFS device 100 (the detection method according to the first embodiment) will be described. FIG. 4 is a flowchart showing an example of an operation procedure of the SPFS device 100. In this example, the first primary antibody as the first capturing body and the second primary antibody as the second capturing body are immobilized on the same region on the metal film 14. In addition, a first secondary antibody labeled with a first fluorescent substance and a second secondary antibody labeled with a second fluorescent substance are used as capture bodies used for fluorescent labeling.

まず、測定の準備をする（工程Ｓ１１０）。具体的には、チップ１０を準備して、チップホルダー１１０にチップ１０を設置する。また、チップ１０の金属膜１４上に保湿剤が存在する場合は、第１の１次抗体および第２の１次抗体が適切に第１被検出物質および第２被検出物質をそれぞれ捕捉できるように、金属膜１４上を洗浄して保湿剤を除去する。 First, the measurement is prepared (step S110). Specifically, the chip 10 is prepared, and the chip 10 is placed in the chip holder 110. Further, when the moisturizer is present on the metal film 14 of the chip 10, the first primary antibody and the second primary antibody can appropriately capture the first detected substance and the second detected substance, respectively. Then, the metal film 14 is washed to remove the moisturizing agent.

次いで、第１励起光α１の入射角を決定する（工程Ｓ１２０）。具体的には、制御部１４０は、第１角度調整機構１２４を駆動して第１励起光α１の入射角を走査しながら、第３角度調整機構１３４を駆動して第１受光センサー１３３により第１プラズモン散乱光δ１を検出する。そして、第１プラズモン散乱光δ１の光量が最大となる角度を第１蛍光γ１測定時の第１励起光α１の入射角（第１増強角）とする。 Next, the incident angle of the first excitation light α1 is determined (step S120). Specifically, the control unit 140 drives the first angle adjusting mechanism 124 to scan the incident angle of the first excitation light α1, while driving the third angle adjusting mechanism 134 to cause the first light receiving sensor 133 to detect the first angle. 1 plasmon scattered light δ1 is detected. Then, the angle at which the amount of the first plasmon scattered light δ1 is maximum is set as the incident angle (first enhancement angle) of the first excitation light α1 when measuring the first fluorescence γ1.

次いで、第２励起光α２の入射角を決定する（工程Ｓ１３０）。具体的には、制御部１４０は、第２角度調整機構１２７を駆動して第２励起光α２の入射角を走査しながら、第４角度調整機構１３７を駆動して第２受光センサー１３６により第２プラズモン散乱光δ２を検出する。そして、第２プラズモン散乱光δ２の光量が最大となる角度を第２蛍光γ２測定時の第２励起光α２の入射角（第２増強角）とする。 Next, the incident angle of the second excitation light α2 is determined (step S130). Specifically, the control unit 140 drives the second angle adjustment mechanism 127 to scan the incident angle of the second excitation light α2, drives the fourth angle adjustment mechanism 137, and causes the second light receiving sensor 136 to drive the fourth angle adjustment mechanism 137. 2 The plasmon scattered light δ2 is detected. Then, the angle at which the light amount of the second plasmon scattered light δ2 is maximum is set as the incident angle (second enhancement angle) of the second excitation light α2 when the second fluorescence γ2 is measured.

なお、第１励起光α１の入射角の決定（工程Ｓ１２０）と第２励起光α２の入射角の決定（工程Ｓ１３０）との順番は、これに限定されない。たとえば、第２励起光α２の入射角を決定した後に、第１励起光α１の入射角を決定してもよい。 The order of determining the incident angle of the first excitation light α1 (step S120) and determining the incident angle of the second excitation light α2 (step S130) is not limited to this. For example, the incident angle of the first excitation light α1 may be determined after determining the incident angle of the second excitation light α2.

次いで、検体中の第１被検出物質と第１の１次抗体とを反応させるとともに、第２被検出物質と第２の１次抗体とを反応させる（１次反応、工程Ｓ１４０）。具体的には、金属膜１４上に検体を提供して、検体と第１の１次抗体および第２の１次抗体とを接触させる。検体中に第１被検出物質が存在する場合は、第１被検出物質の少なくとも一部は第１の１次抗体に結合する。また、検体中に第２被検出物質が存在する場合は、第２被検出物質の少なくとも一部は第２の１次抗体に結合する。この後、金属膜１４上を緩衝液などで洗浄して、第１の１次抗体または第２の１次抗体に結合しなかった物質を除去する。検体および被検出物質の種類は、特に限定されない。検体の例には、血液や血清、血漿、尿、鼻孔液、唾液、精液などの体液およびその希釈液が含まれる。また、被検出物質の例には、核酸（ＤＮＡやＲＮＡなど）、タンパク質（ポリペプチドやオリゴペプチドなど）、アミノ酸、糖質、脂質およびこれらの修飾分子が含まれる。 Next, the first substance to be detected in the sample is reacted with the first primary antibody, and the second substance to be detected is reacted with the second primary antibody (primary reaction, step S140). Specifically, a sample is provided on the metal film 14 to bring the sample into contact with the first primary antibody and the second primary antibody. When the first substance to be detected is present in the sample, at least a part of the first substance to be detected binds to the first primary antibody. When the second substance to be detected is present in the sample, at least part of the second substance to be detected binds to the second primary antibody. After that, the metal film 14 is washed with a buffer solution or the like to remove a substance that is not bound to the first primary antibody or the second primary antibody. The types of the sample and the substance to be detected are not particularly limited. Examples of specimens include body fluids such as blood, serum, plasma, urine, nasal fluid, saliva, semen, and diluted solutions thereof. In addition, examples of the substance to be detected include nucleic acids (such as DNA and RNA), proteins (such as polypeptides and oligopeptides), amino acids, sugars, lipids and modified molecules thereof.

次いで、第１の１次抗体に結合した第１被検出物質を第１蛍光物質で標識するとともに、第２の１次抗体に結合した第２被検出物質を第２蛍光物質で標識する（２次反応、工程Ｓ１５０）。具体的には、第１蛍光物質で標識された第１の２次抗体および第２蛍光物質で標識された第２の２次抗体を含む蛍光標識液を金属膜１４上に提供して、第１の１次抗体に結合した第１被検出物質と蛍光標識液とを接触させるとともに、第２の１次抗体に結合した第２被検出物質と蛍光標識液とを接触させる。蛍光標識液は、例えば、第１蛍光物質で標識された第１の２次抗体と、第２蛍光物質で標識された第２の２次抗体とを含む緩衝液である。第１被検出物質が第１の１次抗体に結合している場合は、第１被検出物質の少なくとも一部は、第１蛍光物質で標識される。また、第２被検出物質が第２の１次抗体に結合している場合は、第２被検出物質の少なくとも一部は、第２蛍光物質で標識される。第１蛍光物質または第２蛍光物質で標識した後は、金属膜１４上を緩衝液などで洗浄し、遊離の第１の２次抗体および第２の２抗体などを除去することが好ましい。 Then, the first substance to be detected bound to the first primary antibody is labeled with the first fluorescent substance, and the second substance to be detected bound to the second primary antibody is labeled with the second fluorescent substance (2 Next reaction, step S150). Specifically, a fluorescent labeling liquid containing a first secondary antibody labeled with a first fluorescent substance and a second secondary antibody labeled with a second fluorescent substance is provided on the metal film 14, The first detectable substance bound to the first primary antibody and the fluorescent labeling liquid are brought into contact with each other, and the second detectable substance bound to the second primary antibody is brought into contact with the fluorescent labeling liquid. The fluorescent labeling solution is, for example, a buffer solution containing a first secondary antibody labeled with a first fluorescent substance and a second secondary antibody labeled with a second fluorescent substance. When the first substance to be detected is bound to the first primary antibody, at least a part of the first substance to be detected is labeled with the first fluorescent substance. When the second substance to be detected is bound to the second primary antibody, at least a part of the second substance to be detected is labeled with the second fluorescent substance. After labeling with the first fluorescent substance or the second fluorescent substance, it is preferable to wash the metal film 14 with a buffer solution or the like to remove free first secondary antibody, second secondary antibody and the like.

なお、１次反応（工程Ｓ１４０）と２次反応（工程Ｓ１５０）との順番は、これに限定されない。たとえば、第１被検出物質を第１の２次抗体に結合させるとともに、第２被検出物質を第２の２次抗体に結合させた後に、これらの複合体を含む液体を金属膜１４上に提供してもよい。また、金属膜１４上に検体と蛍光標識液を同時に提供してもよい。 The order of the primary reaction (step S140) and the secondary reaction (step S150) is not limited to this. For example, after binding the first substance to be detected to the first secondary antibody and the second substance to be detected to the second secondary antibody, a liquid containing these complexes is deposited on the metal film 14. May be provided. Further, the sample and the fluorescent labeling liquid may be simultaneously provided on the metal film 14.

次いで、第１被検出物質を検出する（工程Ｓ１６０）。具体的には、制御部１４０は、第１光源制御部１２５を駆動して第１励起光α１を工程Ｓ１２０で決定した入射角（第１増強角）で金属膜１４の所定の位置に照射させながら、第１受光センサー制御部１３５を駆動して金属膜１４（金属膜１４表面およびその近傍）上から放出される第１蛍光γ１の強度を検出するように第１受光センサー１３３を制御する。 Next, the first substance to be detected is detected (step S160). Specifically, the control unit 140 drives the first light source control unit 125 to irradiate the first excitation light α1 to the predetermined position of the metal film 14 at the incident angle (first enhancement angle) determined in step S120. Meanwhile, the first light receiving sensor control unit 135 is driven to control the first light receiving sensor 133 so as to detect the intensity of the first fluorescence γ1 emitted from the metal film 14 (the surface of the metal film 14 and the vicinity thereof).

次いで、第２被検出物質を検出する（工程Ｓ１７０）。具体的には、制御部１４０は、第２光源制御部１２８を駆動して第２励起光α２を工程Ｓ１３０で決定した入射角で金属膜１４の所定の位置に照射させながら、第２受光センサー制御部１３８を駆動して金属膜１４（金属膜１４表面およびその近傍）上から放出される第２蛍光γ２の強度を検出するように第２受光センサー１３６を制御する。 Next, the second substance to be detected is detected (step S170). Specifically, the control unit 140 drives the second light source control unit 128 to irradiate the second excitation light α2 to the predetermined position of the metal film 14 at the incident angle determined in step S130, while the second light receiving sensor. The control unit 138 is driven to control the second light receiving sensor 136 so as to detect the intensity of the second fluorescence γ2 emitted from the metal film 14 (the surface of the metal film 14 and the vicinity thereof).

なお、制御部１４０は、２次反応（工程Ｓ１５０）の前にブランク値を測定してもよい。この場合、第１増強角で第１励起光α１を金属膜１４に照射し、第１受光センサー１３３の検出値を第１ブランク値とする。また、第２増強角で第２励起光α２を金属膜１４に照射し、第２受光センサー１３６の検出値を第２ブランク値とする。そして、第１被検出物質を検出する工程（工程Ｓ１６０）では、第１蛍光γ１の検出値から第１ブランク値を引くことで、検体中の被検出物質の量を示す第１蛍光γ１の量を算出する。また、第２被検出物質を検出する工程（工程Ｓ１７０）では、第２蛍光γ２の検出値から第２ブランク値を引くことで、検体中の被検出物質の量を示す第２蛍光γ２の量を算出する。 The control unit 140 may measure the blank value before the secondary reaction (step S150). In this case, the metal film 14 is irradiated with the first excitation light α1 at the first enhancement angle, and the detection value of the first light receiving sensor 133 is set to the first blank value. Further, the metal film 14 is irradiated with the second excitation light α2 at the second enhancement angle, and the detection value of the second light receiving sensor 136 is set as the second blank value. Then, in the step of detecting the first substance to be detected (step S160), the first blank value is subtracted from the detected value of the first fluorescence γ1 to obtain the amount of the first fluorescence γ1 indicating the amount of the substance to be detected in the sample. To calculate. In the step of detecting the second substance to be detected (step S170), the second blank value is subtracted from the detected value of the second fluorescence γ2 to obtain the amount of the second fluorescence γ2 indicating the amount of the substance to be detected in the sample. To calculate.

なお、第１の１次抗体に結合した第１被検出物質と第１蛍光物質を含む蛍光標識液とを接触させて第１被検出物質を検出した後に、第２の１次抗体に結合した第２被検出物質と第２蛍光物質を含む蛍光標識液とを接触させて第２被検出物質を検出してもよい。 In addition, after the first substance to be detected bound to the first primary antibody and the fluorescent labeling liquid containing the first fluorescent substance are brought into contact with each other to detect the first substance to be detected, they are bound to the second primary antibody. The second substance to be detected may be detected by bringing the second substance to be detected into contact with a fluorescent labeling liquid containing a second fluorescent substance.

（効果）
以上のように、本実施の形態に係るＳＰＦＳ装置１００は、チップ１０上の１つの反応場（第１捕捉体および第２捕捉体が固定されている回折格子１６上の領域）において第１被検出物質および第２被検出物質を検出するため、装置およびチップ１０を大型化することなく少量の検体で、第１被検出物質および第２被検出物質を高感度に検出することができる。(effect)
As described above, in the SPFS device 100 according to the present embodiment, the first coating is performed in one reaction field on the chip 10 (a region on the diffraction grating 16 where the first capturing body and the second capturing body are fixed). Since the substance to be detected and the second substance to be detected are detected, the first substance to be detected and the second substance to be detected can be detected with high sensitivity with a small amount of sample without increasing the size of the device and the chip 10.

［実施の形態２］
実施の形態２に係るＳＰＦＳ装置２００は、１つの光源ユニット２２３が波長の異なる第１励起光α１および第２励起光α２の両方を照射できる点において、実施の形態１に係るＳＰＦＳ装置１００と異なる。そこで、実施の形態１に係るＳＰＦＳ装置１００と同様の構成については同一の符号を付してその説明を省略する。[Embodiment 2]
The SPFS apparatus 200 according to the second embodiment is different from the SPFS apparatus 100 according to the first embodiment in that one light source unit 223 can irradiate both the first excitation light α1 and the second excitation light α2 having different wavelengths. .. Therefore, the same components as those of the SPFS device 100 according to the first embodiment are designated by the same reference numerals and the description thereof will be omitted.

図５は、実施の形態２に係るＳＰＦＳ装置２００の構成を示す模式図（平面図）である。なお、図５では、回折格子１６を明確にするため、凸部１８を拡大して示している。 FIG. 5 is a schematic diagram (plan view) showing the configuration of the SPFS device 200 according to the second embodiment. In addition, in FIG. 5, in order to clarify the diffraction grating 16, the convex portion 18 is shown in an enlarged manner.

図５に示されるように、ＳＰＦＳ装置２００は、チップホルダー２１０と、光照射部２２０、光検出部２３０、および制御部１４０とを有する。ＳＰＦＳ装置２００は、チップホルダー２１０に回折格子１６を有するチップ１０を装着した状態で使用される。 As shown in FIG. 5, the SPFS device 200 has a chip holder 210, a light irradiation section 220, a light detection section 230, and a control section 140. The SPFS device 200 is used with the chip 10 having the diffraction grating 16 mounted on the chip holder 210.

チップホルダー２１０は、チップ１０の表面に対する法線を回転軸として、チップ１０を回転可能に保持する。チップホルダー２１０の構成は、平面視したときにおける回折格子１６に対する励起光αの光軸の方向を変化させることができれば特に限定されない。たとえば、チップホルダー２１０には、モーターが接続されている。モーターは、前記法線を中心軸としてチップホルダー２１０を回転させることによりチップ１０が所定の角度だけ回転する。 The chip holder 210 rotatably holds the chip 10 with a normal line to the surface of the chip 10 as a rotation axis. The configuration of the chip holder 210 is not particularly limited as long as it can change the direction of the optical axis of the excitation light α with respect to the diffraction grating 16 in plan view. For example, a motor is connected to the chip holder 210. The motor causes the chip 10 to rotate by a predetermined angle by rotating the chip holder 210 with the normal line as the central axis.

光照射部２２０は、波長および光量が一定の第１励起光α１と、波長および光量が一定の第２励起光α２とを、チップ１０の金属膜１４（回折格子１６）に照射する。このとき、光照射部２２０は、金属膜１４中の表面プラズモンと結合できる回折光が回折格子１６で生じるように、第１励起光α１および第２励起光α２を金属膜１４（回折格子１６）に照射する。なお、第１励起光α１の波長および第２励起光α２の波長は、互いに異なる。 The light irradiation unit 220 irradiates the metal film 14 (diffraction grating 16) of the chip 10 with the first excitation light α1 having a constant wavelength and the same amount of light and the second excitation light α2 having a constant wavelength and the same amount of light. At this time, the light irradiator 220 outputs the first excitation light α1 and the second excitation light α2 to the metal film 14 (diffraction grating 16) so that the diffraction grating 16 produces diffracted light that can be combined with the surface plasmons in the metal film 14. To irradiate. The wavelength of the first excitation light α1 and the wavelength of the second excitation light α2 are different from each other.

光照射部２２０は、第３光源ユニット２２３、第１角度調整機構１２４および第３光源制御部２２５を含む。 The light irradiation unit 220 includes a third light source unit 223, a first angle adjustment mechanism 124, and a third light source control unit 225.

第３光源ユニット２２３は、第１励起光α１と、第１励起光α１と異なる波長の第２励起光α２とを金属膜１４（回折格子１６）に向かって出射する。第３光源ユニット２２３の構成は、波長の異なる２種類の励起光を出射することができれば、特に限定されない。本実施の形態では、第３光源ユニット２２３には、２種類の波長の励起光が照射できるように２種類の光源が配置されている。また、第３光源ユニット２２３は、広い波長帯の光を出射する光源（例えば、白色光源など）と、複数のバンドパスフィルターとを備え、蛍光物質の励起波長に合わせてバンドパスフィルターを切り替えるように構成されていてもよい。 The third light source unit 223 emits the first excitation light α1 and the second excitation light α2 having a wavelength different from the first excitation light α1 toward the metal film 14 (diffraction grating 16). The configuration of the third light source unit 223 is not particularly limited as long as it can emit two types of excitation light having different wavelengths. In the present embodiment, the third light source unit 223 is provided with two types of light sources so that excitation lights of two types of wavelengths can be emitted. The third light source unit 223 includes a light source (for example, a white light source) that emits light in a wide wavelength band and a plurality of bandpass filters, and switches the bandpass filters according to the excitation wavelength of the fluorescent material. May be configured.

光検出部２３０は、例えば、第１受光センサー１３３、第３角度調整機構１３４および第３受光センサー制御部２３５を含む。光検出部２３０は、さらに集光レンズ群や開口絞り、蛍光フィルターなどを有していてもよい。光検出部２３０は、光照射部２２０に対して、第１励起光α１（第２励起光α２）の光軸と金属膜１４との交点を通り、かつ金属膜１４の表面に対する法線を挟むように配置されている。第１受光センサー１３３は、第１プラズモン散乱光δ１、第２プラズモン散乱光δ２、第１蛍光γ１または第２蛍光γ２をそれぞれ検出する。 The light detection unit 230 includes, for example, a first light receiving sensor 133, a third angle adjusting mechanism 134, and a third light receiving sensor control unit 235. The light detection unit 230 may further include a condenser lens group, an aperture stop, a fluorescence filter, and the like. The light detection unit 230 passes through the intersection of the optical axis of the first excitation light α1 (second excitation light α2) and the metal film 14 with respect to the light irradiation unit 220, and sandwiches the normal line to the surface of the metal film 14. Are arranged as follows. The first light receiving sensor 133 detects the first plasmon scattered light δ1, the second plasmon scattered light δ2, the first fluorescence γ1 or the second fluorescence γ2, respectively.

第３角度調整機構１３４は、第１受光センサー１３３が第１プラズモン散乱光δ１、第２プラズモン散乱光δ２、第１蛍光γ１または第２蛍光γ２を検出できるように、第１受光センサー１３３の光軸を調整する。第３角度調整機構１３４は、第１蛍光γ１の検出時には、第１蛍光γの光軸と金属膜１４の交点を通り、かつ第１蛍光γの光軸に直交する金属膜１４上の軸を回転軸として第１受光センサー１３３を回動させる。また、第３角度調整機構１３４は、第２蛍光γ２の検出時には、第２蛍光γの光軸と金属膜１４の交点を通り、かつ第２蛍光γの光軸に直交する金属膜１４上の軸を回転軸として第１受光センサー１３３を回動させる。 The third angle adjusting mechanism 134 detects the light of the first light receiving sensor 133 so that the first light receiving sensor 133 can detect the first plasmon scattered light δ1, the second plasmon scattered light δ2, the first fluorescence γ1 or the second fluorescence γ2. Adjust the axis. When the first fluorescence γ1 is detected, the third angle adjustment mechanism 134 passes through the intersection of the optical axis of the first fluorescence γ and the metal film 14 and sets the axis on the metal film 14 orthogonal to the optical axis of the first fluorescence γ. The first light receiving sensor 133 is rotated as a rotation axis. In addition, the third angle adjusting mechanism 134, when detecting the second fluorescence γ2, passes through the intersection of the optical axis of the second fluorescence γ and the metal film 14 and is on the metal film 14 orthogonal to the optical axis of the second fluorescence γ. The first light receiving sensor 133 is rotated around the axis as a rotation axis.

第１受光センサー１３３は、第１蛍光γ１または第２蛍光γ２を検出して、金属膜１４上の蛍光像を検出する。また、第１受光センサー１３３は、第１プラズモン散乱光δ１または第２プラズモン散乱光δ２を検出する。 The first light receiving sensor 133 detects the first fluorescence γ1 or the second fluorescence γ2, and detects the fluorescence image on the metal film 14. In addition, the first light receiving sensor 133 detects the first plasmon scattered light δ1 or the second plasmon scattered light δ2.

集光レンズ群（図示省略）は、チップ１０と第１受光センサー１３３との間に配置され、迷光の影響を受けにくい共役光学系を構成する。集光レンズ群は、金属膜１４上の蛍光像を受光センサー１２７の受光面上に結像させる。 The condenser lens group (not shown) is arranged between the chip 10 and the first light receiving sensor 133 and constitutes a conjugate optical system that is not easily affected by stray light. The condenser lens group forms a fluorescent image on the metal film 14 on the light receiving surface of the light receiving sensor 127.

蛍光フィルター（図示省略）は、チップ１０と第１受光センサー１３３との間に配置される。蛍光フィルターは、例えば、カットフィルターおよび減光（ＮＤ）フィルターを含み、第１受光センサー１３３に到達する光から蛍光γ以外のノイズ成分（例えば、励起光αや外光など）を除去したり、第１受光センサー１３３に到達する光の光量を調整したりする。本実施の形態では、蛍光フィルターとして、第１蛍光γ１または第２蛍光γ２をそれぞれ検出可能な蛍光フィルターが配置されている。 The fluorescent filter (not shown) is arranged between the chip 10 and the first light receiving sensor 133. The fluorescence filter includes, for example, a cut filter and a neutral density (ND) filter, and removes noise components other than fluorescence γ (for example, excitation light α and external light) from the light reaching the first light receiving sensor 133, The light amount of the light reaching the first light receiving sensor 133 is adjusted. In the present embodiment, as the fluorescence filter, a fluorescence filter capable of detecting the first fluorescence γ1 or the second fluorescence γ2 is arranged.

（検出装置の検出動作）
次に、実施の形態２に係るＳＰＦＳ装置２００の検出動作（検出方法）について説明する。なお、実施の形態１に係るＳＰＦＳ装置１００の検出動作と同じ工程は、同じ符号を付してその説明を省略する。(Detection operation of the detection device)
Next, a detection operation (detection method) of the SPFS device 200 according to the second embodiment will be described. The same steps as those in the detection operation of the SPFS apparatus 100 according to the first embodiment are designated by the same reference numerals, and the description thereof will be omitted.

図６は、ＳＰＦＳ装置２００の動作手順の一例を示すフローチャートである。 FIG. 6 is a flowchart showing an example of the operation procedure of the SPFS device 200.

まず、測定の準備をする（工程Ｓ１１０）。 First, the measurement is prepared (step S110).

次いで、第１励起光αの入射角を決定する（工程Ｓ２２０）。具体的には、制御部１４０は、第３光源制御部２２５により第１励起光α１のみを照射しつつ、第１角度調整機構１２４を駆動して第１励起光α１の入射角を走査しながら、第３角度調整機構１３４を駆動して第１受光センサー１３３により第１プラズモン散乱光δ１のみを検出する。そして、制御部１４０は、第１プラズモン散乱光δ１が最大となる角度を第１励起光α１の入射角（第１増強角）とする。 Next, the incident angle of the first excitation light α is determined (step S220). Specifically, the control unit 140 drives the first angle adjusting mechanism 124 to scan the incident angle of the first excitation light α1 while irradiating only the first excitation light α1 by the third light source control unit 225. , The third angle adjusting mechanism 134 is driven, and the first light receiving sensor 133 detects only the first plasmon scattered light δ1. Then, the control unit 140 sets the angle at which the first plasmon scattered light δ1 is maximum as the incident angle (first enhancement angle) of the first excitation light α1.

次いで、チップ１０を回転させる（工程Ｓ２３０）。具体的には、制御部１４０は、モーターを駆動して、第２励起光α２の光軸が第２の方向に沿うように、チップ１０（チップホルダー２１０）を回転させる。 Next, the chip 10 is rotated (step S230). Specifically, the control unit 140 drives the motor to rotate the chip 10 (chip holder 210) so that the optical axis of the second excitation light α2 is along the second direction.

次いで、第２励起光α２の入射角を決定する（工程Ｓ２４０）。具体的には、制御部１４０は、第３光源制御部２２５により第２励起光α２のみを照射しつつ、第１角度調整機構１２４を駆動して第２励起光α２の入射角を走査しながら、第３角度調整機構１３４を駆動して第１受光センサー１３３により第２プラズモン散乱光δ２のみを検出する。そして、制御部１４０は、第２プラズモン散乱光δ２が最大となる角度を第２励起光α２の入射角（第２増強角）とする。 Then, the incident angle of the second excitation light α2 is determined (step S240). Specifically, the control unit 140 drives the first angle adjusting mechanism 124 to scan the incident angle of the second excitation light α2 while irradiating only the second excitation light α2 by the third light source control unit 225. , The third angle adjusting mechanism 134 is driven, and the first light receiving sensor 133 detects only the second plasmon scattered light δ2. Then, the control unit 140 sets the angle at which the second plasmon scattered light δ2 is maximum as the incident angle (second enhancement angle) of the second excitation light α2.

次いで、検体中の第１被検出物質と第１の１次抗体とを反応させるとともに、第２被検出物質と第２の１次抗体とを反応させる（１次反応、工程Ｓ１４０）。 Next, the first substance to be detected in the sample is reacted with the first primary antibody, and the second substance to be detected is reacted with the second primary antibody (primary reaction, step S140).

次いで、第１の１次抗体に結合した第１被検出物質を第１蛍光物質で標識するとともに、第２の１次抗体に結合した第２被検出物質を第２蛍光物質で標識する（２次反応、工程Ｓ１５０）。 Then, the first substance to be detected bound to the first primary antibody is labeled with the first fluorescent substance, and the second substance to be detected bound to the second primary antibody is labeled with the second fluorescent substance (2 Next reaction, step S150).

次いで、制御部１４０は、モーターを駆動して、第１励起光α１の光軸が第１の方向に沿うように、チップ１０（チップホルダー２１０）を回転させる。 Next, the controller 140 drives the motor to rotate the chip 10 (chip holder 210) so that the optical axis of the first excitation light α1 is along the first direction.

次いで、第１被検出物質を検出する（工程Ｓ２６０）。具体的には、制御部１４０は、第３光源制御部２２５を駆動して第１励起光α１を工程Ｓ２２０で決定した入射角（第１増強角）で金属膜１４の所定の位置に照射させながら、第１受光センサー制御部１３５を駆動して金属膜１４（金属膜１４表面およびその近傍）上から放出される第１蛍光γ１の強度を検出するように第１受光センサー１３３を制御する。 Next, the first substance to be detected is detected (step S260). Specifically, the control unit 140 drives the third light source control unit 225 to irradiate the first excitation light α1 to the predetermined position of the metal film 14 at the incident angle (first enhancement angle) determined in step S220. Meanwhile, the first light receiving sensor control unit 135 is driven to control the first light receiving sensor 133 so as to detect the intensity of the first fluorescence γ1 emitted from the metal film 14 (the surface of the metal film 14 and the vicinity thereof).

次いで、チップを回転させる（工程Ｓ２７０）。具体的には、制御部１４０は、モーターを駆動して、第２励起光α２の光軸が第２の方向に沿うように、チップ１０（チップホルダー２１０）を回転させる。 Next, the chip is rotated (step S270). Specifically, the control unit 140 drives the motor to rotate the chip 10 (chip holder 210) so that the optical axis of the second excitation light α2 is along the second direction.

次いで、第２被検出物質を検出する（工程Ｓ２８０）。具体的には、制御部１４０は、第３光源制御部２２５を駆動して第２励起光α２を工程Ｓ２４０で決定した入射角（第２増強角）で金属膜１４の所定の位置に照射させながら、第２受光センサー制御部１３８を駆動して金属膜１４（金属膜１４表面およびその近傍）上から放出される第２蛍光γ２の強度を検出するように第１受光センサー１３３を制御する。 Next, the second substance to be detected is detected (step S280). Specifically, the control unit 140 drives the third light source control unit 225 to irradiate the second excitation light α2 to the predetermined position of the metal film 14 at the incident angle (second enhancement angle) determined in step S240. Meanwhile, the second light receiving sensor control unit 138 is driven to control the first light receiving sensor 133 so as to detect the intensity of the second fluorescence γ2 emitted from the metal film 14 (the surface of the metal film 14 and the vicinity thereof).

なお、光照射部２２０は、第１励起光α１および第２励起光α２を同時に照射してもよい。この場合、制御部１４０は、第１励起光α１の入射角および第１プラズモン散乱光δ１の光量のデータと、第２励起光α２の入射角および第２プラズモン散乱光δ２の光量のデータとから、第１プラズモン散乱光δ１および第２プラズモン散乱光δ２のいずれもが増大する角度を第１励起光α１および第２励起光α２の入射角とする。そして、第１蛍光γ１を検出するときは、第１蛍光γ１の光路上には、第１蛍光γ１を検出できるように蛍光フィルターが配置される。第２蛍光γ２を検出するときは、第２蛍光γ２の光路上には、第２蛍光γ２を検出できるように蛍光フィルターが配置される。また、第１蛍光γ１を検出する時と第２蛍光γ２を検出する時とで入射角が同じである必要はなく、第１励起光α１に最適な入射角で第１励起光α１および第２励起光α２を照射して第１蛍光γ１を検出した後、第２励起光α２に最適な入射角で第１励起光α１および第２励起光α２を照射して第２蛍光γ２を検出してもよい。 The light irradiation unit 220 may irradiate the first excitation light α1 and the second excitation light α2 at the same time. In this case, the control unit 140 uses the data of the incident angle of the first excitation light α1 and the light amount of the first plasmon scattered light δ1 and the data of the incident angle of the second excitation light α2 and the light amount of the second plasmon scattered light δ2. , The angle at which both the first plasmon scattered light δ1 and the second plasmon scattered light δ2 increase is the incident angle of the first excitation light α1 and the second excitation light α2. Then, when detecting the first fluorescence γ1, a fluorescence filter is arranged on the optical path of the first fluorescence γ1 so that the first fluorescence γ1 can be detected. When detecting the second fluorescence γ2, a fluorescence filter is arranged on the optical path of the second fluorescence γ2 so that the second fluorescence γ2 can be detected. Further, the incident angle does not have to be the same when detecting the first fluorescence γ1 and when detecting the second fluorescence γ2, and the first excitation light α1 and the second excitation light α1 and the second excitation light α1 can be detected at the optimum incident angle for the first excitation light α1. After irradiating the excitation light α2 to detect the first fluorescence γ1, the second excitation light α2 is irradiated with the first excitation light α1 and the second excitation light α2 at the optimum incident angle to the second excitation light α2 to detect the second fluorescence γ2. Good.

（効果）
以上のように、本実施の形態に係るＳＰＦＳ装置２００は、実施の形態１に係るＳＰＦＳ装置１００と同様の効果を有する。また、本実施の形態に係るＳＰＦＳ装置２００は、装置をさらに小型化することができる。(effect)
As described above, the SPFS device 200 according to the present embodiment has the same effects as the SPFS device 100 according to the first embodiment. Further, the SPFS device 200 according to the present embodiment can be further downsized.

なお、図７に示されるように、第１の方向における凸部１８間の凹部に対する凸部１８の第１高さｈ１と、第２の方向における凸部１８間の凹部に対する凸部１８の第２高さｈ２とは、異なる高さであってもよい。さらに、図８（平面図）に示されるように、第１仮想直線Ｌ１と、第２仮想直線Ｌ２とのなす角度θは、垂直でなくてもよい。また、実施の形態１、２では、複数の凸部１８が第１の方向と第２の方向とに所定のピッチで配列されていたが、第１の方向と第２の方向とに加え、第１の方向と第２の方向に交差する第３の方向に所定のピッチで配列されていてもよい。この場合、第１被検出物質および第２被検出物質に加え、第３被検出物質も検出できる。 Note that, as shown in FIG. 7, the first height h1 of the protrusions 18 with respect to the recesses between the protrusions 18 in the first direction and the first height h1 of the protrusions 18 with respect to the recesses between the protrusions 18 in the second direction. The two heights h2 may be different heights. Further, as shown in FIG. 8 (plan view), the angle θ formed by the first virtual straight line L1 and the second virtual straight line L2 may not be vertical. Further, in the first and second embodiments, the plurality of convex portions 18 are arranged at a predetermined pitch in the first direction and the second direction, but in addition to the first direction and the second direction, It may be arranged at a predetermined pitch in a third direction that intersects the first direction and the second direction. In this case, in addition to the first substance to be detected and the second substance to be detected, the third substance to be detected can also be detected.

本出願は、２０１５年２月２日出願の特願２０１５−０１８３４８に基づく優先権を主張する。当該出願明細書および図面に記載された内容は、すべて本願明細書に援用される。 This application claims the priority based on Japanese Patent Application No. 2005-018348 filed on February 2, 2015. The contents described in the application specification and drawings are incorporated herein by reference.

本発明に係る検出方法および検出装置は、被検出物質を高い信頼性で測定することができる。よって、非常に簡易な定量免疫測定システムの開発、普及および発展に寄与することも期待される。 The detection method and the detection device according to the present invention can measure a substance to be detected with high reliability. Therefore, it is expected to contribute to the development, spread and development of a very simple quantitative immunoassay system.

１０、２０ チップ
１２ 基板
１４ 金属膜
１６ 回折格子
１８ 凸部
１００、２００ ＳＰＦＳ装置（検出装置）
１１０ ２１０ チップホルダー
１２０、２２０ 光照射部
１２１ 第１光照射ユニット
１２２ 第２光照射ユニット
１２３ 第１光源ユニット
１２４ 第１角度調整機構
１２５ 第１光源制御部
１２６ 第２光源ユニット
１２７ 第２角度調整機構
１２８ 第２光源制御部
１３０、２３０ 光検出部
１３１ 第１光検出ユニット
１３２ 第２光検出ユニット
１３３ 第１受光センサー
１３４ 第３角度調整機構
１３５ 第１受光センサー制御部
１３６ 第２受光センサー
１３７ 第４角度調整機構
１３８ 第２受光センサー制御部
１４０ 制御部
２２３ 第３光源ユニット
２２５ 第３光源制御部
２３５ 第１受光センサー制御部
α１ 第１励起光
α２ 第２励起光
γ１ 第１蛍光
γ２ 第２蛍光
δ１ 第１プラズモン散乱光
δ２ 第２プラズモン散乱光
Ｌ１ 第１仮想直線
Ｌ２ 第２仮想直線
θ 第１仮想直線と第２仮想直線とのなす角度
10, 20 chip 12 substrate 14 metal film 16 diffraction grating 18 convex portion 100, 200 SPFS device (detection device)
110 210 Chip holder 120, 220 Light irradiation unit 121 First light irradiation unit 122 Second light irradiation unit 123 First light source unit 124 First angle adjusting mechanism 125 First light source control unit 126 Second light source unit 127 Second angle adjusting mechanism 128 second light source control unit 130, 230 light detection unit 131 first light detection unit 132 second light detection unit 133 first light receiving sensor 134 third angle adjusting mechanism 135 first light receiving sensor control unit 136 second light receiving sensor 137 fourth Angle adjusting mechanism 138 Second light receiving sensor control unit 140 Control unit 223 Third light source unit 225 Third light source control unit 235 First light receiving sensor control unit α1 First excitation light α2 Second excitation light γ1 First fluorescence γ2 Second fluorescence δ1 First plasmon scattered light δ2 Second plasmon scattered light L1 First virtual straight line L2 Second virtual straight line θ Angle formed by first virtual straight line and second virtual straight line

Claims (8)

第１被検出物質を標識する第１蛍光物質と第２被検出物質を標識する第２蛍光物質とが、表面プラズモン共鳴に基づく局在場光により励起されてそれぞれ放出した蛍光を検出して、検体に含まれる前記第１被検出物質および前記第２被検出物質を検出する検出方法であって、
複数の凸部が、第１の方向について第１のピッチで配列され、前記第１の方向に交差する第２の方向について第１のピッチと異なる第２のピッチで配列された回折格子を形成された金属膜と、前記回折格子に固定され、前記第１被検出物質を捕捉するための第１捕捉体と、前記回折格子の前記第１捕捉体が固定されている領域に固定され、前記第２被検出物質を捕捉するための第２捕捉体とを有するチップの前記回折格子に前記検体を提供して、前記第１捕捉体と前記第１被検出物質とを結合させ、かつ前記第２捕捉体と前記第２被検出物質とを結合させる工程と、
前記回折格子の前記第１捕捉体および前記第２捕捉体が固定されている領域に前記第１蛍光物質を提供して、前記第１被検出物質を前記第１蛍光物質で標識させる工程と、
前記回折格子の前記第１捕捉体および前記第２捕捉体が固定されている領域に前記第２蛍光物質を提供して、前記第２被検出物質を前記第２蛍光物質で標識させる工程と、
平面視したときにその光軸が前記第１の方向に沿うように、前記回折格子の前記第１捕捉体および前記第２捕捉体が固定されている領域に第１波長の励起光を照射し、前記第１被検出物質を標識した前記第１蛍光物質から放出された蛍光を検出することで前記第１被検出物質を検出する工程と、
平面視したときにその光軸が前記第２の方向に沿うように、前記回折格子の前記第１捕捉体および前記第２捕捉体が固定されている領域に前記第１波長と異なる第２波長の励起光を照射し、前記第２被検出物質を標識した前記第２蛍光物質から放出された蛍光を検出することで前記第２被検出物質を検出する工程とを有する、
検出方法。 The first fluorescent substance that labels the first substance to be detected and the second fluorescent substance that labels the second substance to be detected detect fluorescence emitted by being excited by localized field light based on surface plasmon resonance, A detection method for detecting the first detected substance and the second detected substance contained in a sample, comprising:
A plurality of convex portions are arranged at a first pitch in the first direction and form a diffraction grating arranged at a second pitch different from the first pitch in a second direction intersecting the first direction. A metal film, a first trapping body fixed to the diffraction grating for trapping the first substance to be detected, and a region of the diffraction grating where the first trapping body is fixed, The analyte is provided to the diffraction grating of a chip having a second capturing body for capturing a second substance to be detected, so that the first capturing body and the first substance to be detected are bound to each other, and 2 a step of binding the capturing body and the second substance to be detected,
Providing the first fluorescent substance to a region of the diffraction grating where the first capturing body and the second capturing body are fixed, and labeling the first detected substance with the first fluorescent substance,
Providing the second fluorescent substance to a region of the diffraction grating where the first capturing body and the second capturing body are fixed, and labeling the second detected substance with the second fluorescent substance;
The region of the diffraction grating where the first trapping body and the second trapping body are fixed is irradiated with the excitation light of the first wavelength so that the optical axis thereof is along the first direction when seen in a plan view. Detecting the first substance to be detected by detecting fluorescence emitted from the first fluorescent substance labeled with the first substance to be detected,
A second wavelength different from the first wavelength in a region of the diffraction grating where the first trapping body and the second trapping body are fixed such that its optical axis is along the second direction when viewed in a plan view. Irradiating the excitation light, and detecting the second substance to be detected by detecting the fluorescence emitted from the second fluorescent substance labeled with the second substance to be detected,
Detection method. 前記第１波長および前記第２波長は、それぞれ４００〜１０００ｎｍの範囲内である、請求項１に記載の検出方法。 The detection method according to claim 1, wherein the first wavelength and the second wavelength are each within a range of 400 to 1000 nm. 前記第１のピッチおよび前記第２のピッチは、それぞれ１００〜２０００ｎｍの範囲内である、請求項１または請求項２に記載の検出方法。 The detection method according to claim 1 or 2, wherein the first pitch and the second pitch are each within a range of 100 to 2000 nm. 前記凸部の高さは、１０〜１０００ｎｍの範囲内である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の検出方法。 The height of the said convex part is a detection method as described in any one of Claims 1-3 which is in the range of 10-1000 nm. 第１被検出物質を標識する第１蛍光物質と第２被検出物質を標識する第２蛍光物質とが、表面プラズモン共鳴に基づく局在場光により励起されてそれぞれ放出した蛍光を検出して、検体に含まれる前記第１被検出物質および前記第２被検出物質を検出する検出装置であって、
複数の凸部が、第１の方向について第１のピッチで配列され、前記第１の方向に交差する第２の方向について第１のピッチと異なる第２のピッチで配列された回折格子を形成された金属膜と、前記回折格子に固定された第１捕捉体と、前記回折格子の前記第１捕捉体が固定されている領域に固定された第２捕捉体とを有し、前記回折格子に前記検体を提供して、前記第１捕捉体と前記第１被検出物質とを結合させ、かつ前記第２捕捉体と前記第２被検出物質とを結合させるためのチップを保持するチップホルダーと、
前記チップの同じ位置に対して、第１波長の励起光および前記第１波長と異なる第２波長の励起光を照射する光照射部と、
前記第１波長の励起光によって前記第１被検出物質を標識した前記第１蛍光物質から放出された蛍光と、前記第２波長の励起光によって前記第２被検出物質を標識した前記第２蛍光物質から放出された蛍光とをそれぞれ検出する光検出部と、を有し、
前記光検出部は、
前記光照射部が、平面視したときにその光軸が前記チップの表面における前記第１の方向に沿うように、前記チップに前記第１波長の励起光を照射したときに、前記第１蛍光物質から放出された蛍光を検出し、
前記光照射部が、平面視したときにその光軸が前記チップの表面における前記第２の方向に沿うように、前記チップに前記第２波長の励起光を照射したときに、前記第２蛍光物質から放出された蛍光を検出する、
検出装置。 The first fluorescent substance that labels the first substance to be detected and the second fluorescent substance that labels the second substance to be detected detect fluorescence emitted by being excited by localized field light based on surface plasmon resonance, A detection device for detecting the first detected substance and the second detected substance contained in a sample, comprising:
A plurality of convex portions are arranged at a first pitch in the first direction and form a diffraction grating arranged at a second pitch different from the first pitch in a second direction intersecting the first direction. The diffraction grating, the first trapping body fixed to the diffraction grating, and the second trapping body fixed to a region of the diffraction grating where the first trapping body is fixed. A chip holder for holding the chip for providing the analyte to the first capture body to bind the first capture body to the first substance to be detected and to bind the second capture body to the second substance to be detected. When,
A light irradiation unit that irradiates the same position of the chip with excitation light of a first wavelength and excitation light of a second wavelength different from the first wavelength;
Fluorescence emitted from the first fluorescent substance that labels the first substance to be detected with the excitation light having the first wavelength, and the second fluorescence that labels the second substance to be detected with the excitation light having the second wavelength. And a photodetector that detects fluorescence emitted from the substance,
The light detection unit,
The light irradiation unit, such that its optical axis in a plan view along the first direction on the surface of the chip, when irradiated with excitation light of the first wavelength to the chip, the first fluorescent Detects the fluorescence emitted from the substance,
The light irradiation unit, such that the optical axis in a plan view is along the second direction on the surface of the pre-SL chip, when irradiated with excitation light of the second wavelength to said tip, said second Detect the fluorescence emitted from the fluorescent material,
Detection device. 前記チップホルダーは、前記チップの表面に対する法線を回転軸として、前記チップを回転可能に保持し、
前記光照射部は、前記第１波長の励起光および前記第２波長の励起光を同じ位置から前記チップに向かって照射する、
請求項５に記載の検出装置。 The chip holder rotatably holds the chip with a normal to the surface of the chip as a rotation axis.
The light irradiation unit irradiates the excitation light of the first wavelength and the excitation light of the second wavelength from the same position toward the chip,
The detection device according to claim 5. 前記光照射部は、
前記第１波長の励起光を照射するための第１光照射部と、
前記第１光照射部と異なる位置に配置され、前記第２波長の励起光を照射するための第２光照射部と、
を有する、
請求項５に記載の検出装置。 The light irradiation unit,
A first light irradiation unit for irradiating the excitation light of the first wavelength,
A second light irradiator arranged at a position different from that of the first light irradiator for irradiating the excitation light of the second wavelength;
Has,
The detection device according to claim 5. 前記第１波長および前記第２波長は、それぞれ４００〜１０００ｎｍの範囲内である、請求項５〜７のいずれか一項に記載の検出装置。 The said 1st wavelength and the said 2nd wavelength are the detection apparatuses as described in any one of Claims 5-7 which are in the range of 400-1000 nm, respectively.
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