JP6632118B2 - 腫瘍の再発を抑制する医薬 - Google Patents
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Description
[1](1)少なくとも一の殺細胞性抗腫瘍薬、および
(2)少なくとも一のRNAポリメラーゼII阻害剤、またはヒストンデアセチラーゼ阻害剤
を含み、それらを組み合わせて投与し、腫瘍の化学療法後もしくは切除後の再発を処置するための、または抗腫瘍薬に対する耐性を示す細胞の出現を抑制するための、医薬。
[2](1)が、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン、ブスルファン、ダカルバジン、ラニムスチン、ニムスチン、ビンクリスチン,イリノテカン、ドセタキセル、パクリタキセル、アドリアマイシン、マイトマイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、ブレオマイシンからなる群より選択される、1に記載の医薬。
[3](1)が、アルキル化剤または白金化合物から選択される、1または2に記載の医薬。
[4](1)が、シスプラチンである、2または3に記載の医薬。
[5](2)が、アマトキシンまたはその類縁体である、1〜4のいずれか1項に記載の医薬。
[6](2)が、α−アマニチンまたはその類縁体である、5に記載の医薬。
[7]腫瘍の化学療法後もしくは切除後の再発を、予防または遅延するためのものであり、腫瘍が、大腸がん、前立腺がん、乳がん、多発性骨髄腫、B細胞リンパ腫、悪性神経膠芽腫、腎臓がん、肝臓がん、前立腺がん、および小細胞性肺がんからなる群より選択されるいずれかである、1〜6のいずれか1項に記載の医薬。
[8]腫瘍の切除後の患者に対して、切除後2週間以内に投与するための、1〜7のいずれか1項に記載の医薬。
[9]有効成分として、少なくとも一のRNAポリメラーゼII阻害剤、またはヒストンデアセチラーゼ阻害剤 を含む、腫瘍の化学療法後もしくは切除後の再発を処置 するための、または抗腫瘍薬に対する耐性を示す細胞の出現を抑制するための、医薬。
[10]有効成分が、α−アマニチンまたはその類縁体である、9に記載の医薬。
[11]腫瘍の化学療法後もしくは腫瘍の切除後の再発を、予防または遅延するためのものであり、腫瘍が、大腸がん、前立腺がん、乳がん、多発性骨髄腫、B細胞リンパ腫、悪性神経膠芽腫、腎臓がん、肝臓がん、前立腺がん、および小細胞性肺がんからなる群より選択されるいずれかである、1〜6のいずれか1項に記載の医薬。
[12]腫瘍の切除後の患者に対して、切除後2週間以内に投与するための、1〜7のいずれか1項に記載の医薬。
[13]腫瘍の化学療法後もしくは切除後の再発を処置するための、または抗腫瘍薬に対する耐性を示す細胞の出現を抑制するための薬物の、インビトロのスクリーニング方法であって、
(i)候補薬物について予め求めたがん細胞のコロニー形成を50%抑制するのに必要な薬物濃度(CI50)の2〜100倍濃度の候補薬物で、がん細胞を1〜48時間処理し、処理済細胞を得る工程、および
(ii)処理済細胞をコロニー形成条件下で培養する
工程を含み、
工程(ii)の結果、生じたコロニーの有無または数に基づいて候補薬物を選抜する、スクリーニング方法。
(2)少なくとも一のRNAポリメラーゼII阻害剤
を含み、それらを組み合わせて投与し、腫瘍の化学療法後もしくは切除後の再発を処置するための、または抗腫瘍薬に対する耐性を示す細胞の出現を抑制するための、医薬を提供する。
(i)候補薬物について予め求めたがん細胞のコロニー形成を50%抑制するのに必要な薬物濃度(CI50)の2〜100倍濃度の候補薬物で、がん細胞を1〜48時間処理し、処理済細胞を得る工程、および
(ii)処理済細胞をコロニー形成条件下で培養する
工程を含み、
工程(ii)の結果、生じたコロニーの有無または数に基づいて候補薬物を選抜する、スクリーニング方法を提供する。
対数的に増殖する細胞の増殖抑制アッセイは、薬物が固形腫瘍のサイズを減少させるかまたは安定化する能力を反映するが、コロニー形成アッセイは薬物耐性腫瘍細胞の増殖の起源となる単一細胞(Singh et al., 2003)からもたらされる最小数のがん細胞による再発を模倣する。汎用される化学療法剤について、5つのがん細胞株を用いてコロニー形成を50%抑制するのに必要な薬物濃度(CI50)を求めた。
HCT116, HT29, HeLa, MCF7及びMKN45は理研細胞バンクから得た。5つの細胞系列すべては、10%ウシ胎児血清(FBS;ライフテクノロジーズ)を添加されたRPMI1640培地(ライフテクノロジーズ)中で生育させて、5%CO2を供給された加湿培養機中で37℃において培養した。
ランダ(登録商標、注CIS) 及び1-バイアル タキソテール(登録商標、DTX)はそれぞれ日本化薬及びサノフィから購入し、トリコスタチン(TSA)は和光純薬から購入した。アクチノマイシンD(AMD), α-アマニチン(α-AMA)及びシクロヘキシミド(CHX)はシグマから購入した;ゲフィチニブ(GEF)及びソラフェニブ(SOR)はトクリス及びセルシグナリングテクノロジー(CST)から購入した。
増殖抑制アッセイ:細胞を高密度にて(3.2-12.8×104 細胞/cm2)96ウエルプレートに播き、24時間かけて接着させた。次に、細胞を、薬物の10倍連続希釈8通りで処理した(出発濃度は図1-2Bに示す)。生存細胞中の細胞内デヒドロゲナーゼをCCK-8(同仁化学研究所)及びTriStar LB 941マイクロプレートリーダー(ベルトールドテクノロジーズ)を用いて測定した。50%増殖阻害濃度(GI50)はグラフパッドプリズムソフトウエアを用いて計算した。ヒトにおけるCIS, DTX, GEF及びSORのピーク血漿濃度は依然に報告された(Beselga et al., 2002; Himmelstein et al., 1981; Strumberg et al., 2005; Taguchi et al.,1994)。
形態的観察により、増殖抑制アッセイのための対数増殖期の細胞がフラスコの中で二次元的に増殖する(即ち、シート状)のに対し、コロニー形成細胞は密集して、小さく、そして縦方向に増殖することが観察された(図1A)。いずれの細胞株に対しても、慣用の殺細胞性抗腫瘍薬シスプラチン(CIS)およびドセタキセル(DTX)のCI50は、増殖抑制に必要な濃度(GI50)よりも2−3桁小さかった。これに対し、分子標的薬物ゲフィチニブ(GEF)およびソラフェニブ(SOR)のCI50は、対応するGI50の数倍〜10倍未満であった(図1B)。
薬物耐性コロニー(DTC)は、CI50濃度において抗がん剤の存在下にて生存し得るコロニーとして定義される(図2)。本発明者らは、別の研究により、DTC形成のためのもっとも重要な機構の一つは、転写の制御であるとの知見を得ていた。今般、どの段階がコロニー形成細胞における転写活性に支配的に影響するのかを検討した。図3Aに、遺伝子発現プロセスおよび蛋白質合成プロセスにおける、分子標的部分の模式図を示した。
クロマチン形成、転写または蛋白質合成を阻害する4つの化合物により単純なスクリーニングを実施した。トリコスタチンA(TSA)は、クラスI/IIのヒストンデアセチラーゼ(HDAC)を阻害する抗菌性抗生物質である(Bolden et al., 2006)。アクチノマイシンD(AMD)は、RNAPI(0.05μg/mlにおいて)、RNAPII(0.5μg/mlにおいて)およびRNAPIII(5μg/mlにおいて)の阻害剤として作用することにより複数の種類の肉腫を治療するための臨床的応用性を有する環状ポリペプチド含有抗生物質である(Bensaude, 2011)。α-AMAはキノコの毒素であって、RNAPIIの阻害剤である(Bensaude, 2011; Lindell et al., 1970)。シクロヘキシミド(CHX)は抗菌性抗生物質であって、翻訳伸長の阻害剤である(Schneider-Poetsch et al., 2010)。
結果を図3Bに示した。TSAは24時間の暴露によりコロニー形成を抑制した。α-AMAは、TSAと同様の24時間の処理による完全なコロニーの抑制に加えて、4時間のみの暴露においても効果を生じた。一方、特異性の低いRNAP阻害剤AMDは4時間および24時間の両方において顕著なコロニーの抑制を示さなかったことから、RNAPIIの選択的阻害がコロニー形成の阻害効果において顕著な役割を担うことが示唆される。CHXはコロニー形成をわずかに抑制したが、蛋白質合成のCHX-誘導性阻害のコロニー形成減少に対する効果は、エピジェネティック制御およびmRNA合成のそれよりも穏やかなようであった。クロマチン修飾は、コロニー形成の間の遺伝子発現における変化に隠れた主要な原因の一つであるかもしれないが(Shi et al., 2011)、本実験による発見は、初期mRNA合成のRNAPII依存性阻害がコロニー形成のほぼ完全な抑制を生じさせるのに十分であることを示唆する。
短時間(4時間)の暴露後のDTC出現の抑制に関して、TSAおよびα-AMAの効果をさらに検討した。
ヒト胃がん細胞系MKN45の細胞を高密度にて(1.0×105cells/cm2)48ウエルプレート上にプレートし、TSA(0、2.1、4.2、および8.4μM)又はα-AMA (0、0.7、1.4、および2.8 μM)により処理した。
高濃度のTSAを用いて顕著なDTCの抑制が観察されたが、α-AMAはそれでもなおDTCの抑制に関して、より有力であるようにみえた(図4)。
実験3で示したように、α-AMAによるインビトロにおけるDTC出現の抑制(図4)は、α-アマニチンがPCの処置に有用であることを期待させる。α-AMAの経口摂取は消化管、肝臓および腎臓における毒性のために直接死に結びつくことが報告されている(Word et al., 2013)。本発明者らは、確立された再発PCモデルを用いて、薬物処理後のMKN45細胞の腹腔内接種により、α-AMAの治療的特性および毒物学的特性の両方を調べた。
細胞をsingle cell懸濁液にまで希釈して、0.2μM CISの存在または不在下で低密度にて(2.6×102cells/cm2)播種した。条件ごとに播種後13日目のコロニー数を計数した。
腫瘍細胞接種後のマウスの体重は、α-AMAのみ(α-AMA)、CISのみ(CIS)および非処理の群において10日目から急激な減少を示したのに対し、α-AMAおよびCIS(α-AMA/CIS)の連続投与を受けた群は、体重を維持した(図5A)。
本発明者らは、抗がん剤の存在下で生存する亜集団である再発性のがん細胞のインビトロモデルとして、DTCを用いた。各薬物に対するDTCは、単一細胞または極めて少数の細胞のいずれかから増殖を開始することが可能であり、治療的外科手術、続くアジュバント化学療法の後のヒトにおけるがんの再発のプロセスを模倣しうる。
Bensaude, O. (2011). Inhibiting eukaryotic transcription: Which compound to choose? How to evaluate its activity? Transcription 2, 103-108.
Bolden, J.E., Peart, M.J., and Johnstone, R.W. (2006). Anticancer activities of histone deacetylase inhibitors. Nat Rev Drug Discov 5, 769-784.
Calvio, C., Neubauer, G., Mann, M., and Lamond, A.I. (1995). Identification of hnRNP P2 as TLS/FUS using electrospray mass spectrometry. RNA 1, 724-733.
Campbell, P.J., Yachida, S., Mudie, L.J., Stephens, P.J., Pleasance, E.D., Stebbings, L.A., Morsberger, L.A., Latimer, C., McLaren, S., Lin, M.L., et al. (2010). The patterns and dynamics of genomic instability in metastatic pancreatic cancer. Nature 467, 1109-1113.
Lindell, T.J., Weinberg, F., Morris, P.W., Roeder, R.G., and Rutter, W.J. (1970). Specific inhibition of nuclear RNA polymerase II by alpha-amanitin. Science 170, 447-449.
Schneider-Poetsch, T., Ju, J., Eyler, D.E., Dang, Y., Bhat, S., Merrick, W.C., Green, R., Shen, B., and Liu, J.O. (2010). Inhibition of eukaryotic translation elongation by cycloheximide and lactimidomycin. Nat Chem Biol 6, 209-217.
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Claims (3)
- シスプラチン、およびα−アマニチンを含み、腫瘍の化学療法後もしくは切除後の再発を処置するための、または抗腫瘍薬に対する耐性を示す細胞の出現を抑制するための、医薬。
- 腫瘍の化学療法後もしくは切除後の再発を、予防または遅延するためのものであり、腫瘍が、大腸がん、前立腺がん、乳がん、多発性骨髄腫、B細胞リンパ腫、悪性神経膠芽腫、腎臓がん、肝臓がん、前立腺がん、および小細胞性肺がんからなる群より選択されるいずれかである、請求項1に記載の医薬。
- 腫瘍の切除後の患者に対して、切除後2週間以内に投与するための、請求項1または2に記載の医薬。
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