JP6357113B2 - ヒトｎｒｇ１タンパク質に対する抗体 - Google Patents

Description

本発明は、ヒトＮＲＧ１タンパク質に対する抗体に関し、より詳しくは、ヒトＮＲＧ１−αタンパク質又はヒトＮＲＧ１−β１タンパク質に特異的に結合する抗体、該抗体をコードするＤＮＡ、前記抗体又は該ＤＮＡを含むハイブリドーマ、前記抗体を有効成分とする癌を治療又は予防するための組成物に関する。

ＮＲＧ１（ニューレグリン１）はＥＧＦファミリーの一員であり、特に可溶性ＮＲＧ１はＥｒｂＢ３又はＥｒｂＢ４に結合し、これら受容体のリガンドとして機能する。また、ＥｒｂＢ３及びＥｒｂＢ４は、ＥＧＦ（上皮細胞増殖因子）受容体ファミリーの一員であり、可溶性ＮＲＧ１がこれら受容体に結合することによって、当該受容体の構造が変化し、ホモあるいはヘテロ二量体化することも知られている。さらに、この二量体化に伴って、これら受容体の細胞内ドメインがリン酸化され、リン酸化された細胞内ドメインはさらなるシグナルタンパク質と結合し、様々なシグナル伝達が活性化される。そして、かかるＮＲＧ１が関与するシグナル伝達によって、細胞増殖、細胞分化、アポトーシス、細胞の移動、接着及び浸潤等、一連の生物学的反応が制御され、より具体的には、神経系及び心臓の成長及び発達や、乳癌、卵巣癌、大腸癌、胃癌、肺癌、甲状腺癌、神経膠腫、髄芽腫及びメラノーマ等の多種の癌に、ＮＲＧ１は関与していることが明らかになっている。

また、可溶性ＮＲＧ１については、ＥＧＦファミリーに属する他の因子同様に、膜貫通型の前駆体から誘導される。すなわち、膜貫通型前駆体（ｐｒｏ−ＮＲＧ１）として産生され、細胞表面（原形質膜）へ輸送されたのちに、メタロプロセアーゼ等の切断酵素によって、細胞外部分の膜近傍部が切断（シェディング）及び放出されると考えられている。かかるｐｒｏ−ＮＲＧ１の切断及び放出は、細胞表面のプロテアーゼによって生じ、ｐｒｏ−ＮＲＧ１の切断機構については、血清中の因子やプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）の活性化因子であるＰＭＡ（ホルボール−１２−ミリステート−１３−アセテート、ｐｈｏｒｂｏｌ−１２−ｍｙｒｉｓｔａｔｅ−１３−ａｃｅｔａｔｅ）によって活性化されることが報告されている（非特許文献１）。さらに、かかるプロテアーゼとして、これまでにＴＡＣＥ（腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦα）変換酵素、ＡＤＡＭ１７）及びＡＤＡＭ１９（メルトリンβ）の２つが報告されており（非特許文献２及び３）、これらのプロテアーゼが活性化される機構については、ＰＫＣ、Ｅｒｋ１／２及びｐ３８等の関与が示されている（非特許文献４）。

また、ＮＲＧ１タンパク質については９つのアイソフォームが知られており、そのうちアイソフォーム１（ＮＲＧ１−β１）、アイソフォーム２（ＮＲＧ１−α）、アイソフォーム３（ＮＲＧ１−β２）等が前記膜貫通型の前駆体である。さらに、これらアイソフォームは、２つの大きな型、α型（アイソフォーム２）及びβ型（アイソフォーム１及び３）に分類される。

前述の通り、ＮＲＧ１が関与するシグナル伝達によって、多種多様な生物学的反応が制御されているため、かかるシグナル伝達やそのシグナルの発端となる前記切断を、アイソフォームごとに解析又は制御することは、生命現象の解明、ひいては医療分野の発展に大きく貢献するものである。この点に関し、一般的に、タンパク質のアイソフォームを特異的に解析又はその機能を制御する上で、抗体は有効なツールとなり得ることが知られている。

しかしながら、図１に示すように、ＮＲＧ１タンパク質のα型及びβ型アイソフォーム間において、Ｎ末端から２１２番目のアミノ酸残基までの部分において実質的に一致しており、相違点は、ＥＧＦドメインのＣ末１０アミノ酸残基長及びジャクスタメンブレン領域（ｊｕｘｔａｍｅｍｂｒａｎｅ ｄｏｍａｉｎ、ＥＧＦドメインよりＣ末端側で膜貫通配列よりＮ末端側の領域であり、前記切断を受ける領域）の僅か２０アミノ酸程度しかない。さらにＥＧＦドメインのＣ末部分に含まれる６つのシステイン残基の間隔は一致している。従って、かかる僅かな相違点を識別できる抗体を作製するのは極めて困難であるため、これらアイソフォームを特異的に認識し、さらにそれらアイソフォームが関与するシグナル伝達を抑制する抗体は開発されていないのが現状である。

一方、前述の通り、ＮＲＧ１は様々な生命現象に関与していることが明らかになっているため、各アイソフォームに特異的に結合するものではないが、ＮＲＧ１に対する抗体が開発されている（非特許文献５〜８）。

例えば、非特許文献５には、抗ＮＲＧ１抗体によってシュワン細胞の細胞分裂誘起反応を阻害されることが開示されている。非特許文献６には、抗ＮＲＧ１抗体によって神経髄腫細胞（良性腫瘍細胞）の細胞分裂が抑制できたことから、抗ＮＲＧ１抗体による神経髄腫の治療の可能性が示唆されている。また、非特許文献７には、肝細胞癌（ＨＣＣ）由来細胞であるＳＫ−Ｈｅｐ１の培養上清を添加することにより、同じくＨＣＣ由来細胞であるＨｅｐＧ２におけるＥｒｂＢ３のリン酸化が亢進するが、抗ＮＲＧ１抗体により前処理した培養上清では、かかるリン酸化の亢進が生じなかったことが開示されている。さらに、非特許文献８においては、ＮＲＧ１アイソフォーム６（ＳＭＤＦ）による増殖刺激に対して中和活性を示す抗体（３Ｇ１１）が開示されている。しかしながら、かかる中和活性を示す抗体によっても、癌細胞であるＭＣＦ７やＴ４７Ｄに対しては阻害効果が認められなかったことも明らかになっている（同文献、第２４８ページ左欄下から５行目〜第２４８ページ左欄１３行目の記載 参照）。このように、ＮＲＧ１が関与すると想定されている様々な疾患の治療、特に癌の治療において十分な活性を有する、ＮＲＧ１に対する抗体は開発されていないのが現状である。

Ｌｏｅｂら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、１９９８年、１１巻、７７〜９１ページ Ｍｏｎｔｅｒｏ Ｊ．Ｃ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、２０００年、１６巻、６３１〜６４８ページ Ｓｈｉｒａｋａｂｅ Ｋ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２００１年、２７６巻、９３５２〜９３５８ページ Ｍｏｎｔｅｒｏ Ｊ．Ｃ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、２００２年、３６３巻、２１１〜２２１ページ Ｒｏｓｅｎｂａｕｍ Ｃ．ら、Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ．、１９９７年、１４８巻、２号、６０４〜６１５ページ Ｈａｎｓｅｎ ＭＲ．ら、Ｇｌｉａ、２００６年、５３巻、６号、５９３〜６００ページ Ｈｓｉｅｈ ＳＹ．ら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ． ２０１１年、 ５３巻、２号、５０４〜５１６ページ Ｏｓｈｅｒｏｆｆ ＰＬ．ら、Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ、１９９９年、１６巻、３号、２４１〜２５３ページ

本発明は、前記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、ヒトＮＲＧ１タンパク質のアイソフォームを特異的に認識し、かつ当該アイソフォームが関与するシグナル伝達を抑制することを可能とする抗体を提供することを目的とする。本発明は、ヒトＮＲＧ１タンパク質のアイソフォームに特異的な抗体であって抗腫瘍活性を有する抗体を提供することも目的とする。

本発明者らは、前記目的を達成すべく、ヒトＮＲＧ１タンパク質のアイソフォーム１及び２（ヒトＮＲＧ１−β１タンパク質及びヒトＮＲＧ１−αタンパク質）の計１１種の部分長タンパク質をマウスに免疫し、ヒトＮＲＧ１タンパク質に対するモノクローナル抗体を計８０クローン取得した。さらに、これらモノクローナル抗体の中から、細胞表面にあるＮＲＧ１タンパク質に対する強い反応性を指標とし、４種のモノクローナル抗体（８ａ２、８ａ４、１０ｂＭ３及び１０ｂ２Ｍ３）を選定した。そして、これらモノクローナル抗体について、ヒトＮＲＧ１タンパク質のアイソフォームに対する結合特異性についての解析、並びにエピトープの同定を行った結果、８ａ２はヒトＮＲＧ１−αタンパク質及びヒトＮＲＧ１−β１タンパク質の両方に結合する抗体であり、そのエピトープは、ヒトＮＲＧ１−αタンパク質及びヒトＮＲＧ１−β１タンパク質の共通領域である、ＥＧＦドメインよりもＮ末側であることが分かった。しかし、８ａ４については、ヒトＮＲＧ１−β１タンパク質に結合しないが、ヒトＮＲＧ１−αタンパク質に特異的に結合する抗体であり、特にヒトＮＲＧ１−αタンパク質における２２１〜２３４位の領域をエピトープとする抗体であることが明らかになった。さらに、１０ｂＭ３及び１０ｂ２Ｍ３はいずれも、ヒトＮＲＧ１−αタンパク質に結合しないが、ヒトＮＲＧ１−β１タンパク質に特異的に結合する抗体であり、特にヒトＮＲＧ１−β１タンパク質における２１３〜２３９位の領域をエピトープとする抗体であることが明らかとなった。このようにして、本発明者らは、ヒトＮＲＧ１−αタンパク質又はヒトＮＲＧ１−β１タンパク質に特異的な抗体を得ることに成功した。

本発明者らは、これらヒトＮＲＧ１タンパク質のアイソフォームに特異的なマウスモノクローナル抗体について、重鎖及び軽鎖の可変領域及びＣＤＲの配列を決定した。さらに、決定した配列に基づき、定常領域をヒトＩｇＧに由来するものに置換したキメラ抗体も作製した。そして、このようにして得られたキメラ抗体及びそれら抗体の基となった前記マウスモノクローナル抗体について、鋭意研究を重ねた結果、ヒトＮＲＧ１−αタンパク質における２２１〜２３４位の領域又はヒトＮＲＧ１−β１タンパク質における２１３〜２３９位の領域と特異的に結合することによって、ヒトＮＲＧ１タンパク質が関与するシグナル伝達の発端となる、当該タンパク質の切断をこれら抗体は阻害できることを明らかにした。また、前記シグナル伝達において生じる、癌細胞におけるＥｒｂＢ３タンパク質のリン酸化も、これら抗体は抑制できることも見出した。さらに、これらヒトＮＲＧ１タンパク質のアイソフォームに特異的な抗体を、癌細胞を移植したマウスに投与することによって、当該腫瘍の増大が抑制されること、さらには当該マウスの生存率が有意に高くなることも見出した。一方、ヒトＮＲＧ１−αタンパク質及びヒトＮＲＧ１−β１タンパク質の両方に結合する抗体（８ａ２）に関しては、ヒトＮＲＧ１タンパク質の切断に対する抑制活性、癌細胞におけるＥｒｂＢ３タンパク質のリン酸化に対する抑制活性及びｉｎ ｖｉｖｏにおける腫瘍の増殖を抑制する活性のいずれも有していないことも見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、以下＜１＞〜＜１１＞を提供するものである。
＜１＞ 配列番号：１に示されるヒトＮＲＧ１−αタンパク質における２２１〜２３４位の領域又は配列番号：２に示されるヒトＮＲＧ１−β１タンパク質における２１３〜２３９位の領域に結合する抗体であって、下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載の特徴を有する、抗体
（ａ） 配列番号：３〜５に記載のアミノ酸配列を各々相補性決定領域１〜３として含む軽鎖可変領域と、配列番号：７〜９に記載のアミノ酸配列を各々相補性決定領域１〜３として含む重鎖可変領域とを保持する
（ｂ） 配列番号：１１〜１３に記載のアミノ酸配列を各々相補性決定領域１〜３として含む軽鎖可変領域と、配列番号：１５〜１７に記載のアミノ酸配列を各々相補性決定領域１〜３として含む重鎖可変領域とを保持する
（ｃ） 配列番号：１９〜２１に記載のアミノ酸配列を各々相補性決定領域１〜３として含む軽鎖可変領域と、配列番号：２３〜２５に記載のアミノ酸配列を各々相補性決定領域１〜３として含む重鎖可変領域とを保持する。
＜２＞ 配列番号：１に示されるヒトＮＲＧ１−αタンパク質における２２１〜２３４位の領域又は配列番号：２に示されるヒトＮＲＧ１−β１タンパク質における２１３〜２３９位の領域に結合する抗体であって、下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載の特徴を有する、＜１＞に記載の抗体
（ａ） 配列番号：６に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、又は、
配列番号：６に記載のアミノ酸配列のフレームワーク領域において１〜１０のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、
配列番号：１０に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、又は、
配列番号：１０に記載のアミノ酸配列のフレームワーク領域において１〜１０のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを保持する
（ｂ） 配列番号：１４に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、又は、
配列番号：１４に記載のアミノ酸配列のフレームワーク領域において１〜１０のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、
配列番号：１８に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、又は、
配列番号：１８に記載のアミノ酸配列のフレームワーク領域において１〜１０のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列とを含む重鎖可変領域とを保持する
（ｃ） 配列番号：２２に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、又は、
配列番号：２２に記載のアミノ酸配列のフレームワーク領域において１〜１０のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、
配列番号：２６に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、又は、
配列番号：２６に記載のアミノ酸配列のフレームワーク領域において１〜１０のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを保持する。
＜３＞ 配列番号：１に示されるヒトＮＲＧ１−αタンパク質又は配列番号：２に示されるヒトＮＲＧ１−β１タンパク質の切断を抑制する活性を有する、＜１＞又は＜２＞に記載の抗体。
＜４＞ 配列番号：１に示されるヒトＮＲＧ１−αタンパク質又は配列番号：２に示されるヒトＮＲＧ１−β１タンパク質による刺激に応答した、癌細胞におけるＥｒｂＢ３タンパク質のリン酸化を抑制する活性を有する、＜１＞〜＜３＞のうちのいずれか一に記載の抗体。
＜５＞ ｉｎ ｖｉｖｏにおいて腫瘍の増殖を抑制する活性を有する、＜１＞〜＜４＞のうちのいずれか一に記載の抗体。
＜６＞ ＜１＞〜＜５＞のうちのいずれか一に記載の抗体をコードするＤＮＡ。
＜７＞ ＜１＞〜＜５＞のうちのいずれか一に記載の抗体を産生する、又は、＜６＞に記載のＤＮＡを含む、ハイブリドーマ。
＜８＞ ＜１＞〜＜５＞のうちのいずれか一に記載の抗体を産生する、又は、＜６＞に記載のＤＮＡを含む、宿主細胞。
＜９＞ ＜１＞〜＜５＞のうちのいずれか一に記載の抗体を作製するための方法であって、＜７＞に記載のハイブリドーマ又は＜８＞に記載の宿主細胞を培養し、前記ハイブリドーマ、前記宿主細胞又はそれら培養液から、抗体を分離、精製する工程を含む方法。
＜１０＞ ＜１＞〜＜５＞のうちのいずれか一に記載の抗体を有効成分とする、癌を治療又は予防するための組成物。
＜１１＞ 配列番号：１に示されるヒトＮＲＧ１−αタンパク質における２２１〜２３４位の領域又は配列番号：２に示されるヒトＮＲＧ１−β１タンパク質における２１３〜２３９位の領域に結合する抗体を有効成分とする、癌を治療又は予防するための組成物。

本発明によれば、ヒトＮＲＧ１タンパク質のアイソフォームを特異的に認識し、かつ当該アイソフォームが関与するシグナル伝達を抑制することを可能とする抗体を提供することが可能となる。また、本発明によれば、ヒトＮＲＧ１タンパク質のアイソフォームに特異的な抗体であって抗腫瘍活性を有する抗体を提供することも可能となる。

ヒトＮＲＧ１−αタンパク質とヒトＮＲＧ１−β１タンパク質との間にて、構造及びアミノ酸配列を対比した結果、並びに本発明の抗体を作製するために免疫原として用いた部分長タンパク質（ａｇ４〜ａｇ１３及びａｇＰ）のヒトＮＲＧ１タンパク質における位置関係を示す概略図である。 取得したヒトＮＲＧ１タンパク質に対する抗体（８ａ２、８ａ４、１０ｂＭ３及び１０ｂ２Ｍ３）と、Ｎ末端にＨＡタグを付加したヒトＮＲＧ１−αタンパク質又はヒトＮＲＧ１−β１タンパク質を安定的に高発現する細胞株（ＮＲＧ１−ａ／ｓｔ２９３Ｔ又はＮＲＧ１−ｂ／ｓｔ２９３Ｔ）との結合の程度をフローサイトメトリーによって解析した結果を示す、ドット−プロット図である。 ８ａ２と、ヒトＮＲＧ１−αの部分長タンパク質（ａｇ４a〜ａｇ１３a及びａｇＰa）並びにヒトＮＲＧ１−β１の部分長タンパク質（ａｇ４ｂ〜ａｇ１３ｂ及びａｇＰｂ）との結合の程度をＥＬＩＳＡによって解析した結果を示す、グラフである。 ８ａ４と、ヒトＮＲＧ１−αの部分長タンパク質及びヒトＮＲＧ１−β１の部分長タンパク質との結合の程度をＥＬＩＳＡによって解析した結果を示す、グラフである。 １０ｂＭ３と、ヒトＮＲＧ１−αの部分長タンパク質及びヒトＮＲＧ１−β１の部分長タンパク質との結合の程度をＥＬＩＳＡによって解析した結果を示す、グラフである。 １０ｂ２Ｍ３と、ヒトＮＲＧ１−αの部分長タンパク質及びヒトＮＲＧ１−β１の部分長タンパク質との結合の程度をＥＬＩＳＡによって解析した結果を示す、グラフである。 １０ｂＭ３及び１０ｂ２Ｍ３と、Ｎ末端にＨＡタグを付加したヒトＮＲＧ１−αタンパク質、ヒトＮＲＧ１−β１タンパク質又はヒトＮＲＧ１−β２タンパク質を安定的に高発現する細胞株（ＮＲＧ１−ａ／ｓｔ２９３Ｔ、ＮＲＧ１−ｂ／ｓｔ２９３Ｔ又はＮＲＧ１−ｂ２／ｓｔ２９３Ｔ）との結合の程度をフローサイトメトリーによって解析した結果を示す、ドット−プロット図である。 本発明の抗体（８ａ４、１０ｂＭ３及び１０ｂ２Ｍ３）と、ＥＧＦファミリーに属する因子（ＥＧＦ、ＨＢ−ＥＧＦ、ＴＧＦａ（ＴＧＦα）、ＡＲＥＧ、ＮＲＧ１−ａ（ＮＲＧ１−α）及びＮＲＧ１−ｂ（ＮＲＧ１−β１））との結合の程度をＥＬＩＳＡによって解析した結果を示す、グラフである。 ＰＭＡによって生じるヒトＮＲＧ１−αタンパク質の切断に対する抑制活性を、８ａ２並びに本発明の抗体（８ａ４、１０ｂＭ３及び１０ｂ２Ｍ３）について、フローサイトメトリーにより解析した結果を示すグラフである。縦軸は、ＰＭＡ添加後の細胞（ＮＲＧ１−ａ／ｓｔ２９３Ｔ）表面に残存しているヒトＮＲＧ１−αタンパク質量（平均蛍光強度）を示す。また、各群における４つの棒は、左から順に８０、２０、５及び１ｕｇ／ｍＬの濃度にて各抗体を添加した際の結果を示す（グラフの表記に関し、図１０、１１、１９、２１及び２２において同様である）。 ＰＭＡによって生じるヒトＮＲＧ１−β１タンパク質の切断に対する抑制活性を、８ａ２並びに本発明の抗体（８ａ４、１０ｂＭ３及び１０ｂ２Ｍ３）について、フローサイトメトリーにより解析した結果を示すグラフである。 ＰＭＡによって生じるヒトＮＲＧ１−β２タンパク質の切断に対する抑制活性を、８ａ２並びに本発明の抗体（８ａ４、１０ｂＭ３及び１０ｂ２Ｍ３）について、フローサイトメトリーにより解析した結果を示すグラフである。 ＰＭＡによって生じるヒトＮＲＧ１−αタンパク質の切断に対する抑制活性を、８ａ２、８ａ５、８ａ７、８ａ１７、８ａ１８、８ａ６、１３ａ３及び本発明の抗体（８ａ４）について、フローサイトメトリーにより解析した結果を示すグラフである。 ＰＭＡによって生じるヒトＮＲＧ１−β１タンパク質の切断に対する抑制活性を、８ａ２、８ａ５、８ａ７、８ａ１７、８ａ１８及び本発明の抗体（１０ｂＭ３）について、フローサイトメトリーにより解析した結果を示すグラフである。 ヒトＮＲＧ１−αタンパク質によって誘起されるＥｒｂＢ３のリン酸化に対する抑制活性を、８ａ２並びに本発明の抗体（８ａ４、１０ｂＭ３及び１０ｂ２Ｍ３）についてウェスタンブロットにより解析した結果を示す写真である。図中、「ＥｒｂＢ３」は各細胞におけるＥｒｂＢ３タンパク質の量を示し、「Ｐ−ＥｒｂＢ３」は各細胞におけるリン酸化されたＥｒｂＢ３タンパク質の量を示す。また、各群における「ｍＡｂ」は、左から順に各抗体の添加濃度が５０、１０及び５ｕｇ／ｍＬであることを示す（図中の表記に関し、図１５において同様である）。 ヒトＮＲＧ１−β１タンパク質によって誘起されるＥｒｂＢ３のリン酸化に対する抑制活性を、本発明の抗体（１０ｂＭ３及び１０ｂ２Ｍ３）についてウェスタンブロットにより解析した結果を示す写真である。 本発明のキメラ抗体（ｃｈ−８ａ４、ｃｈ−１０ｂＭ３及びｃｈ−１０ｂ２Ｍ３）と、ＮＲＧ１−ａ／ｓｔ２９３Ｔ、ＮＲＧ１−ｂ／ｓｔ２９３Ｔ又はＮＲＧ１−ｂ２／ｓｔ２９３Ｔとの結合の程度をフローサイトメトリーによって解析した結果を示す、ドット−プロット図である。 ８ａ４及びｃｈ−８ａ４と、ヒトＮＲＧ１−αタンパク質との結合の程度をフローサイトメトリーによって解析した結果を示す、グラフである。 ｃｈ−８ａ４と、ヒトＮＲＧ１−αの部分長タンパク質（ａｇ４a〜ａｇ１３a及びａｇＰa）並びにヒトＮＲＧ１−β１の部分長タンパク質（ａｇ４ｂ〜ａｇ１３ｂ及びａｇＰｂ）との結合の程度をＥＬＩＳＡによって解析した結果を示す、グラフである。 ｃｈ−１０ｂＭ３と、ヒトＮＲＧ１−αの部分長タンパク質及びヒトＮＲＧ１−β１の部分長タンパク質との結合の程度をＥＬＩＳＡによって解析した結果を示す、グラフである。 ｃｈ−１０ｂ２Ｍ３と、ヒトＮＲＧ１−αの部分長タンパク質及びヒトＮＲＧ１−β１の部分長タンパク質との結合の程度をＥＬＩＳＡによって解析した結果を示す、グラフである。 ＰＭＡによって生じるヒトＮＲＧ１−αタンパク質の切断に対する抑制活性を、本発明のキメラ抗体（ｃｈ−８ａ４、ｃｈ−１０ｂＭ３及びｃｈ−１０ｂ２Ｍ３）について、フローサイトメトリーにより解析した結果を示すグラフである。 ＰＭＡによって生じるヒトＮＲＧ１−β１タンパク質の切断に対する抑制活性を、本発明のキメラ抗体（ｃｈ−８ａ４、ｃｈ−１０ｂＭ３及びｃｈ−１０ｂ２Ｍ３）について、フローサイトメトリーにより解析した結果を示すグラフである。 ８ａ２を投与したゼノグラフトマウスにおける、腫瘍体積の経時的変化を示すグラフである。横軸は、抗体の投与を開始した日を０日とした際の経過日数を示す（横軸の表記については、図２４〜２６において同様である）。 本発明の抗体（８ａ４又はｃｈ−８ａ４）を投与したゼノグラフトマウスにおける、腫瘍体積の経時的変化を示すグラフである。 本発明の抗体（１０ｂ２Ｍ３又はｃｈ−１０ｂ２Ｍ３）を投与したゼノグラフトマウスにおける、腫瘍体積の経時的変化を示すグラフである。 本発明の抗体（８ａ４、ｃｈ−８ａ４、１０ｂ２Ｍ３又はｃｈ−１０ｂ２Ｍ３）を投与したゼノグラフトマウスの生存率の経時的変化を示すグラフである。

後述の実施例において示す通り、本発明者らは、ヒトＮＲＧ１タンパク質のアイソフォーム１又は２（ヒトＮＲＧ１−β１タンパク質又はヒトＮＲＧ１−αタンパク質）に特異的な抗体を作製することに成功した。さらに、得られた抗体のエピトープを同定すると共に、これら抗体はヒトＮＲＧ１タンパク質が関与するシグナル伝達に対し、顕著な抑制活性を有していることも見出した。従って、本発明は、ヒトＮＲＧ１タンパク質のアイソフォームに対して特異的に結合する以下の抗体を提供する。

配列番号：１に示されるヒトＮＲＧ１−αタンパク質における２２１〜２３４位の領域又は配列番号：２に示されるヒトＮＲＧ１−β１タンパク質における２１３〜２３９位（好ましくは、２３２〜２３９位）の領域に結合する抗体。

本発明における「抗体」は、免疫グロブリンのすべてのクラス及びサブクラスを含む。「抗体」には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体が含まれ、また、抗体の機能的断片の形態も含む意である。「ポリクローナル抗体」は、異なるエピトープに対する異なる抗体を含む抗体調製物である。また、「モノクローナル抗体」とは、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体（抗体断片を含む）を意味する。ポリクローナル抗体とは対照的に、モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基を認識するものである。本発明の抗体は、好ましくはモノクローナル抗体である。本発明の抗体は、自然環境の成分から分離され、及び／又は回収された（即ち、単離された）抗体である。

本発明において「ＮＲＧ１」は、ニューレグリン１、ＨＲＧα（へレグリンα）、ＨＧＬ、ＨＲＧＡ、ＮＤＦ（Ｎｅｕ分化因子）、ＡＲＩＡ（アセチルコリン受容体誘導活性因子）、ＧＧＦ２（グリア成長因子２）、ＳＭＤF（感覚運動神経由来因子）等とも称されるタンパク質である。

ヒト由来のＮＲＧ１タンパク質のアイソフォーム２（ヒトＮＲＧ１−αタンパク質）は、典型的には、配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質（ＲｅｆＳｅｑ ＩＤ：ＮＰ＿０３９２５８で特定されるタンパク質、ＲｅｆＳｅｑ ＩＤ：ＮＭ＿０１３９６４で特定される塩基配列がコードするタンパク質）である。従って、「ヒトＮＲＧ１−αタンパク質における２２１〜２３４位の領域」は、典型的には、配列番号：１に記載の２２１位のスレオニン残基〜２３４位のリジン残基のアミノ酸配列からなる領域である。

ヒト由来のＮＲＧ１タンパク質のアイソフォーム１（ヒトＮＲＧ１−β１タンパク質）は、典型的には、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質（ＲｅｆＳｅｑ ＩＤ：ＮＰ＿０３９２５０で特定されるタンパク質、ＲｅｆＳｅｑ ＩＤ：ＮＭ＿０１３９５６で特定される塩基配列がコードするタンパク質）である。従って、「ヒトＮＲＧ１−β１タンパク質における２１３〜２３９位（又は２３２〜２３９位）の領域」は、典型的には、配列番号：２に記載の２１３位のプロリン残基（又は２３２位のヒスチジン残基）〜２３９位のグルタミン酸残基のアミノ酸配列からなる領域である。

なお、ヒトＮＲＧ１タンパク質においてα型であるかβ型であるかは、ＥＧＦドメインのＣ末１０アミノ酸残基長及びジャクスタメンブレン領域（ｊｕｘｔａｍｅｍｂｒａｎｅ ｄｏｍａｉｎ、ＥＧＦドメインよりＣ末端側で膜貫通配列よりＮ末端側の領域）をコードするエクソンの選択の違いによって判別することができる。すなわち、ヒトＮＲＧ１−αタンパク質は、エクソン１１を含むヒトＮＲＧ１スプライシングバリアントによってコードされるタンパク質であり、ヒトＮＲＧ１−βタンパク質は、エクソン１２ａを含むヒトＮＲＧ１スプライシングバリアントによってコードされるタンパク質である。さらに、β型において、エクソン１２ａの次のエクソンとしてエクソン１３を有するヒトＮＲＧ１スプライシングバリアントによってコードされるタンパク質がヒトＮＲＧ１−β１タンパク質であり、エクソン１３を有していないヒトＮＲＧ１スプライシングバリアントによってコードされるタンパク質がヒトＮＲＧ１−β２タンパク質である。エクソンの番号については、ＲｅｆＳｅｑ ＩＤ：ＮＭ＿０１３９６４（ヒトＮＲＧ１−α）、ＲｅｆＳｅｑ ＩＤ：ＮＭ＿０１３９５６（ヒトＮＲＧ１−β１）及びＲｅｆＳｅｑ ＩＤ：ＮＭ＿０１３９５７（ヒトＮＲＧ１−β２）のエクソンに関する記載を参照のこと。

また、ヒトＮＲＧ１−αタンパク質における２２１〜２３４位の領域又はヒトＮＲＧ１−β１タンパク質における２１３〜２３９位の領域は、このような典型的なアミノ酸配列を有するもの以外に、天然においてアミノ酸が変異したものも存在しうる。従って、前記アミノ酸配列以外に、配列番号：１に記載の２２１〜２３４位の領域又は配列番号：２に記載の２１３〜２３９位（又は２３２〜２３９位）の領域において、１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなるものも含まれる。アミノ酸配列の置換、欠失、挿入若しくは付加は、一般的には、１０アミノ酸以内（例えば、５アミノ酸以内、３アミノ酸以内、１アミノ酸）である。

また、本発明の抗体が結合する部位、すなわち「エピトープ」は、抗原（前述の領域）中に存在する抗原決定基（抗体中の抗原結合ドメインが結合する抗原上の部位）を意味する。従って、本発明におけるエピトープは、アミノ酸の一次配列中において連続する複数のアミノ酸からなるポリペプチド（線状エピトープ）であってもよく、アミノ酸の一次配列中において隣接していないアミノ酸が、ペプチド又はタンパク質の折り畳み等の三次元構造によって近傍にくることにより形成されるポリペプチド（不連続エピトープ、構造的エピトープ）であってもよい。また、かかるエピトープとしては、典型的には、少なくとも３つ、及び最も普通には少なくとも５つ（例えば８〜１０個、６〜２０個）のアミノ酸からなる。

本発明の抗体が、ヒトＮＲＧ１−αタンパク質又はヒトＮＲＧ１−β１タンパク質中の前記特定の領域に結合することによって抑制することのできる「ヒトＮＲＧ１タンパク質が関与するシグナル伝達」としては、ヒトＮＲＧ１タンパク質の可溶型とＥＧＦ受容体とが結合することによって活性化される一連の生物学的反応のみならず、このシグナル伝達の発端となるヒトＮＲＧ１タンパク質の切断（いわゆるシェディング）及び放出を含む意味である。すなわち、本発明の抗体としては、ヒトＮＲＧ１−αタンパク質又はヒトＮＲＧ１−β１タンパク質の切断、該切断によって生じた可溶性ＮＲＧ１タンパク質の放出、可溶性ＮＲＧ１タンパク質とＥＧＦ受容体（ＥｒｂＢ３又はＥｒｂＢ４）との結合、該結合に伴うＥｒｂＢ３又はＥｒｂＢ４の構造の変化、該構造の変化によって誘導されるＥｒｂＢ３又はＥｒｂＢ４のホモあるいはヘテロ二量体化、該二量体化に伴う（ヒトＮＲＧ１−αタンパク質又はヒトＮＲＧ１−β１タンパク質による刺激に応答した）ＥｒｂＢ３又はＥｒｂＢ４のリン酸化、該リン酸化によって惹起されるＭＡＰＫ経路の活性化、前記リン酸化によって惹起されるＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ経路の活性化、並びに、これら経路の活性化によって誘導される、細胞の増殖、細胞の分化、細胞の移動、細胞の接着及び細胞の浸潤等のうちの少なくともいずれか一の過程を抑制する活性を有していればよい。

また、これら過程のうち、「ヒトＮＲＧ１−αタンパク質又はヒトＮＲＧ１−β１タンパク質の切断」、「ヒトＮＲＧ１−αタンパク質又はヒトＮＲＧ１−β１タンパク質による刺激に応答したＥｒｂＢ３又はＥｒｂＢ４のリン酸化」及び「細胞の増殖」のうちの少なくともいずれか一の過程を抑制する活性を有する抗体が好ましく、当該３過程全てを抑制する活性を有する抗体がより好ましい。

「ヒトＮＲＧ１−αタンパク質又はヒトＮＲＧ１−β１タンパク質の切断」は、ＰＭＡ、ＰＫＣ、Ｅｒｋ１／２及びｐ３８等によって活性化されたＴＡＣＥ、ＡＤＡＭ１９等のプロテアーゼによる、ヒトＮＲＧ１−α又はヒトＮＲＧ１−β１タンパク質のジャクスタメンブレン領域内における切断を意味する。また、かかる切断を抑制する活性は、例えば、後述の実施例５に示す方法にて評価することができる。

「ヒトＮＲＧ１−αタンパク質又はヒトＮＲＧ１−β１タンパク質による刺激に応答したＥｒｂＢ３又はＥｒｂＢ４のリン酸化」は、可溶性ＮＲＧ１タンパク質とＥｒｂＢ３又はＥｒｂＢ４との結合等に応答した、ＥｒｂＢ３又はＥｒｂＢ４の細胞内ドメインのチロシンリン酸化を意味する。本発明の抗体による抑制の対象として、好ましくはＥｒｂＢ３タンパク質のリン酸化であり、より好ましくは癌細胞におけるＥｒｂＢ３タンパク質のリン酸化である。また、かかるリン酸化を抑制する活性は、例えば、後述の実施例６に示す方法にて評価することができる。

本発明における「細胞の増殖の抑制」は、細胞の増殖自体（細胞の分裂）の抑制のみならず、細胞の死（アポトーシス等）の誘導による細胞の増殖抑制を含む意味である。また、本発明の抗体による抑制の対象として、好ましくは癌細胞の増殖であり、より好ましくはｉｎ ｖｉｖｏにおける癌細胞（腫瘍）の増殖である。さらに、かかるｉｎ ｖｉｖｏにおける腫瘍の増殖を抑制する活性は、例えば、後述の実施例１１に示す方法にて評価することができ、本発明の抗体の好ましい態様は、当該方法において、がん細胞株移植８０日後において、陰性対照群における腫瘍体積を１００％とした際に、腫瘍体積を３０％以下（例えば、２５％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下、５％以下、０％）にすることのできる抗体である。

また、本発明の抗体による抑制の対象となる癌の種類としては、ＮＲＧ１と多種の癌との関連は以下に示す通り明らかになっているので、特に制限はない。

例えば、肺癌ではＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３及びＥｒｂＢ４の発現が多く調べられており、ＥｒｂＢ３が過剰発現すること（Ｐｏｌｌｅｒ，Ｄ．Ｎ．ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，１６８，２７５−２８０）、及びＥｒｂＢ３の過剰発現と劣悪な予後とが相関すること（Ｙｉ，Ｅ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｍｏｄ．Ｐａｔｈｏｌ．，１０，１４２−１４８）が示されている。さらにＮＲＧ１によるＥｒｂＢの活性化が癌化をもたらすことも報告されている（Ａｌ Ｍｏｕｓｔａｆａ，Ａ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，１９，４８１−４８６、Ｇｏｌｌａｍｕｄｉ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ，４３，１３５−１４３）。また、ＥＧＦＲもＥｒｂＢ３とのヘテロダイマーを形成することによって、ＮＲＧ１が制御するシグナル伝達に関わっていることも示されている（Ｅｎｇｅｌｍａｎ，Ｊ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，１２，４３７２−４３７６）。さらに、ゲフィチニブ投与を行った非小細胞肺癌患者においてＥｒｂＢ３の遺伝子増幅が観察されたことも報告されている（Ｃａｐｐｕｚｚｏ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，９３，１３３４−１３４０）。

また、卵巣癌に関しては、当該癌及びそれに由来する多くの株化細胞において、ＮＲＧ１の発現と細胞増殖との関連が示されている。さらに、各種ＥｒｂＢ受容体の発現レベル、特にＥｒｂＢ３およびＥｒｂＢ２の発現レベルがＮＲＧ１応答性と密接に関わっていることが示されている（Ａｇｕｉｌａｒ，Ｚ．ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１８，６０５０−６０６２、Ｇｉｌｍｏｕｒ，Ｌ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｃｌｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ８， ３９３３−３９４２）。

さらに、大腸癌においては、ＮＲＧ１がオートクライン様式でＥｒｂＢ２／ＥｒｂＢ３を活性化し、他の増殖因子非依存的な細胞増殖をもたらすことが示されている（Ｖｅｎｋａｔｅｓｗａｒｌｕ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２１，７８−８６）。

また、胃癌でＥｒｂＢ３が発現亢進していることも報告されており（Ｓａｎｉｄａｓ，Ｅ．Ｅ．ｅｔａｌ．（１９９３）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，５４，９３５−９４０）、間葉細胞の産生するＮＲＧ１−αがパラクライン様式で機能して癌化に寄与することが示唆されている（Ｎｏｇｕｃｈｉ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｙ，１１７，１１１９−１１２７）。さらに、ＥｒｂＢ４の過剰発現も胃癌において報告されており、ＮＲＧ１−αがＥｒｂＢ４を介して機能していることも示唆されている。

また、乳癌においては、ＥｒｂＢ２が過剰発現していない患者の３０％でＮＲＧ１の発現亢進がみられ、ＮＲＧ１はＥｒｂＢ２／ＥｒｂＢ３を介して乳腺上皮細胞の癌化に関わっていることが示されている（Ｌｉ，Ｑ．ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，６４，７０７８−７０８５）。また、エストロゲン受容体陰性の乳癌ではエストロゲン陽性の乳癌より高い確率でＮＲＧ１の発現が見られる（Ｎｏｒｍａｎｎｏ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．Ｔｒｅａｔ．３５，２９３−２９７）。さらにＮＲＧ１やＥｒｂＢとホルモン要求性の関連については多くの研究がなされており（Ｔａｎｇ，Ｃ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５６，３３５０−３３５８、Ｇｒｕｎｔ，Ｔ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，６３，５６０−５６７、Ｐｉｅｔｒａｓ，Ｒ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１０，２４３５−２４４６）、ＮＲＧ１が発現する乳癌は予後が劣悪であることが示唆されている（Ｌｕｐｕ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．Ｔｒｅａｔ．，３８，５７−６６）。ＮＲＧ１の過剰発現は、エストロゲン刺激やＥｒｂＢ２の過剰発現の有無にかかわらず、ＭＭＰ−９やＶＥＧＦの発現亢進を介して乳癌の進展および転移をもたらす（Ａｔｌａｓ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，１，１６５−１７５）。

また、前立腺ではＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３及びＮＲＧ１の発現が示されており、ＮＲＧ１がパラクライン様式で前立腺の分化に関わっていること、また、ＮＲＧ１／ＥｒｂＢシグナル伝達経路の異常が初期癌化をもたらすことが示唆されている（Ｇｒａｓｓｏ，Ａ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１５，２７０５−２７１６、Ｌｙｎｅ，Ｊ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ Ｊ．Ｓｃｉ．Ａｍ．，３，２１−３０）。また別の研究では、前立腺癌の多くでＮＲＧ１及びＥｒｂＢ３が過剰発現しており、ＮＲＧ１−αがオートクライン様式で機能することが示されている（Ｌｅｕｎｇ，Ｈ．Ｙ．ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｂｒ．Ｊ．Ｕｒｏｌ．，７９，２１２−２１６）。また、ＮＲＧ１によるＥｒｂＢ２／ＥｒｂＢ３の活性化は、アンドロゲン受容体の活性化及びホルモン非存在下での前立腺癌再発に関わることも示されている（Ｇｒｅｇｏｒｙ，Ｃ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，１１，１７０４−１７１２．）。

また、甲状腺癌及びリンパ節転移においてもＮＲＧ１の発現亢進が示されている。また、甲状腺癌の中で最も頻度が高い甲状腺乳頭癌では、多くの症例でＮＲＧ１が核に検出される。ＮＲＧ１の発現亢進や核での染色とＥｒｂＢの発現に相関は認められないことから、ＥｒｂＢを介さないＮＲＧ１の作用メカニズムの存在も示唆される（Ｆｌｕｇｅ，Ｏ．ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８７，７６３−７７０）。

また、神経膠腫（グリオーマ）でも、ＮＲＧ１が発現すること（Ｗｅｓｔｐｈａｌ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｏｎｃｏｌ．，３５，３３５−３４６．）や、ＮＲＧ１によるシグナルが細胞生存に関わっていること（Ｆｌｏｒｅｓ，Ａ．Ｉ．ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２０，７６２２−７６３０）、さらにＮＲＧ１が接着関連分子の活性化を介して浸潤に寄与していることが示唆されている（ｖａｎ ｄｅｒ Ｈｏｒｓｔ，Ｅ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１１３，６８９−６９８）。

また、髄芽腫ではその８７％でＮＲＧ１の発現がみられ、ＥｒｂＢ２及びＥｒｂＢ４が発現している症例においてより強く発現する傾向があり、さらに、これら３因子全ての発現と転移についても記載されている（Ｇｉｌｂｅｒｔｓｏｎ，Ｒ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５８，３９３２−３９４１）。

また、色素細胞及び多くのメラノーマ由来培養細胞では、ＮＲＧ１／ＥｒｂＢのシステムによって増殖が制御されている可能性が示されている（Ｇｏｒｄｏｎ−Ｔｈｏｍｓｏｎ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｍｅｌａｎｏｍａ Ｒｅｓ．，１５，２１−２８）。さらに、ＮＲＧ１の過剰発現及び分泌は、オートクラインないしパラクライン様式で細胞増殖や遊走を制御することも示されている（Ｓｔｏｖｅ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔ．，１２１，８０２−８１２）。

また、膵臓癌では、癌組織でＮＲＧ１が多く発現していることや、βタイプＮＲＧ１の発現レベルと患者の生存率とが相関することが示されている（Ｋｏｌｂ，Ａ．ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１２０，５１４−５２３）。

さらに、ＮＲＧ１は、アクチン骨格の制御を介して癌細胞の浸潤を促進することも示されている（Ｈｉｊａｚｉ，Ｍ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．，１７，６２９−６４１）。さらに、トラスツズマブはＨＥＲ２過剰発現が認められた患者に投与される抗ＨＥＲ２抗体であるが、ＮＲＧ１（ＮＲＧａ２ｃ）が高発現している場合はＨＥＲ２の発現が高値でなくても有意に奏効する可能性が示されている（ｄｅ Ａｌａｖａ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，２５，２６５６−２６６３）。また、乳癌細胞を用いた研究では、ＮＲＧ１が癌幹細胞の自己複製能を制御するとともにＩＬ−８など様々な細胞外分泌タンパク質を産生させ、癌幹細胞ニッチ（微小環境）を熟成させる機能を果たすことが示されている（Ｈｉｎｏｈａｒａ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０９，６５８４−６５８９）。

本発明の抗体の他の好ましい態様としては、下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載の特徴を有する抗体であり、他のより好ましい態様としては、下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載の特徴を有し、配列番号：１に示されるヒトＮＲＧ１−αタンパク質における２２１〜２３４位の領域又は配列番号：２に示されるヒトＮＲＧ１−β１タンパク質における２１３〜２３９位（好ましくは、２３２〜２３９位）の領域に結合する抗体が挙げられる。
（ａ）
軽鎖ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３のアミノ酸配列（配列番号：３〜５に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列）を含む軽鎖可変領域と、
重鎖ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３のアミノ酸配列（配列番号：７〜９に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列）を含む重鎖可変領域とを保持する
（ｂ）
軽鎖ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３のアミノ酸配列（配列番号：１１〜１３に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列）を含む軽鎖可変領域と、
重鎖ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３のアミノ酸配列（配列番号：１５〜１７に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列）を含む重鎖可変領域とを保持する
（ｃ）
軽鎖ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３のアミノ酸配列（配列番号：１９〜２１に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列）を含む軽鎖可変領域と、
重鎖ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３のアミノ酸配列（配列番号：２３〜２５に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列）を含む重鎖可変領域とを保持する。

また、本発明の抗体のより好ましい態様としては、下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載の特徴を有する抗体であり、他のより好ましい態様としては、下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載の特徴を有し、配列番号：１に示されるヒトＮＲＧ１−αタンパク質における２２１〜２３４位の領域又は配列番号：２に示されるヒトＮＲＧ１−β１タンパク質における２１３〜２３９位（好ましくは、２３２〜２３９位）の領域に結合する抗体が挙げられる。
（ａ）
配列番号：６に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、
配列番号：１０に記載のアミノ酸配列または該アミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを保持する
（ｂ）
配列番号：１４に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、
配列番号：１８に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列とを含む重鎖可変領域とを保持する
（ｃ）
配列番号：２２に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、
配列番号：２６に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを保持する。

一旦、上記軽鎖可変領域と重鎖可変領域とからなる抗体が得られた場合、当業者であれば、その抗体が認識するヒト由来の配列番号：１に示されるヒトＮＲＧ１−αタンパク質における２２１〜２３４位の領域又は配列番号：２に示されるヒトＮＲＧ１−β１タンパク質における２１２〜２３９位（又は２３２〜２３９位）の領域上のペプチド領域（エピトープ）を特定して、そのペプチド領域に結合し、かつ、ヒトＮＲＧ１−αタンパク質又はヒトＮＲＧ１−β１タンパク質が関与するシグナル伝達を抑制する種々の抗体を作製することができる。抗体のエピトープは、後述の実施例において示す通り、ヒトＮＲＧ１−αタンパク質又はヒトＮＲＧ１−β１タンパク質のアミノ酸配列から得られたオーバーラップする合成オリゴペプチドへの結合をＥＬＩＳＡ等により調べるなどの周知の方法によって決定することができる。また、ファージディスプレイによるペプチドライブラリーをエピトープマッピングに用いることもできる。さらに、二つの抗体が同一または立体的に重なり合ったエピトープと結合するかどうかは、競合アッセイ法により決定することができる。

本発明の抗体には、マウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、及び、これら抗体の機能的断片が含まれる。本発明の抗体を医薬としてヒトに投与する場合は、副作用低減の観点から、キメラ抗体、ヒト化抗体、あるいはヒト抗体が望ましい。

本発明において「キメラ抗体」とは、ある種の抗体の可変領域とそれとは異種の抗体の定常領域とを連結した抗体である。キメラ抗体は、例えば、抗原をマウスに免疫し、そのマウスモノクローナル抗体の遺伝子から抗原と結合する抗体可変部（可変領域）を切り出して、ヒト骨髄由来の抗体定常部（定常領域）遺伝子と結合し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入して産生させることにより取得することができる（例えば、特開平８−２８０３８７号公報、米国特許第４８１６３９７号公報、米国特許第４８１６５６７号公報、米国特許第５８０７７１５号公報）。また、本発明において「ヒト化抗体」とは、非ヒト由来の抗体の抗原結合部位（ＣＤＲ）の遺伝子配列をヒト抗体遺伝子に移植（ＣＤＲグラフティング）した抗体であり、その作製方法は、公知である（例えば、ＥＰ２３９４００、ＥＰ１２５０２３、ＷＯ９０／０７８６１、ＷＯ９６／０２５７６参照）。本発明において、「ヒト抗体」とは、すべての領域がヒト由来の抗体である。ヒト抗体の作製においては、ヒトＢ細胞より活性のある抗体の産生をスクリーニングする方法、ファージディスプレイ法、免疫することで、ヒト抗体のレパートリーを生産することが可能なトランスジェニック動物（例えばマウス）を利用すること等が可能である。ヒト抗体の作製手法は、公知である（例えば、Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５−２５８（１９９３）、Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１３：６５−９３（１９９５）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，２２２：５８１−５９７（１９９１）、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１５：１４６−１５６（１９９７）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７：７２２−７２７（２０００）、特開平１０−１４６１９４号公報、特開平１０−１５５４９２号公報、特許２９３８５６９号公報、特開平１１−２０６３８７号公報、特表平８−５０９６１２号公報、特表平１１−５０５１０７号公報）。

本発明において抗体の「機能的断片」とは、抗体の一部分（部分断片）であって、配列番号：１に示されるヒトＮＲＧ１−αタンパク質における２２１〜２３４位の領域又は配列番号：２に示されるヒトＮＲＧ１−β１タンパク質における２１２〜２３９位（又は２３２〜２３９位）の領域に結合するものを意味する。具体的には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、可変領域断片（Ｆｖ）、ジスルフィド結合Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ｓｃ（Ｆｖ）２、ダイアボディー、多特異性抗体、及びこれらの重合体等が挙げられる。

ここで「Ｆａｂ」とは、１つの軽鎖及び重鎖の一部からなる免疫グロブリンの一価の抗原結合断片を意味する。抗体のパパイン消化によって、また、組換え方法によって得ることができる。「Ｆａｂ’」は、抗体のヒンジ領域の１つ又はそれより多いシステインを含めて、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端でのわずかの残基の付加によって、Ｆａｂとは異なる。「Ｆ（ａｂ’）２」とは、両方の軽鎖と両方の重鎖の部分からなる免疫グロブリンの二価の抗原結合断片を意味する。

「可変領域断片（Ｆｖ）」は、完全な抗原認識及び結合部位を有する最少の抗体断片である。Ｆｖは、重鎖可変領域および軽鎖可変領域が非共有結合により強く連結されたダイマーである。「一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）」は、抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、これらの領域は、単一のポリペプチド鎖に存在する。「ｓｃ（Ｆｖ）２」は、２つの重鎖可変領域及び２つの軽鎖可変領域をリンカー等で結合して一本鎖にしたものである。「ダイアボディー」とは、二つの抗原結合部位を有する小さな抗体断片であり、この断片は、同一ポリペプチド鎖の中に軽鎖可変領域に結合した重鎖可変領域を含み、各領域は別の鎖の相補的領域とペアを形成している。「多特異性抗体」は、少なくとも２つの異なる抗原に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体である。例えば、二つの重鎖が異なる特異性を持つ二つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の同時発現により調製することができる。

本発明の抗体には、望ましい活性（抗原への結合活性、ヒトＮＲＧ１−αタンパク質又はヒトＮＲＧ１−β１タンパク質が関与するシグナル伝達を抑制する活性、及び／又は他の生物学的特性）を減少させることなく、そのアミノ酸配列が修飾された抗体が含まれる。本発明の抗体のアミノ酸配列変異体は、本発明の抗体鎖をコードするＤＮＡへの変異導入によって、またはペプチド合成によって作製することができる。そのような修飾には、例えば、本発明の抗体のアミノ酸配列内の残基の置換、欠失、付加及び／又は挿入を含む。抗体のアミノ酸配列が改変される部位は、改変される前の抗体と同等の活性を有する限り、抗体の重鎖または軽鎖の定常領域であってもよく、また、可変領域（フレームワーク領域及びＣＤＲ）であってもよい。ＣＤＲ以外のアミノ酸の改変は、抗原との結合親和性への影響が相対的に少ないと考えられるが、現在では、ＣＤＲのアミノ酸を改変して、抗原へのアフィニティーが高められた抗体をスクリーニングする手法が公知である（ＰＮＡＳ，１０２：８４６６−８４７１（２００５）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，２１：４８５−４９３（２００８）、国際公開第２００２／０５１８７０号、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８０：２４８８０−２４８８７（２００５）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，２１：３４５−３５１（２００８））。

改変されるアミノ酸数は、好ましくは、１０アミノ酸以内、より好ましくは５アミノ酸以内、最も好ましくは３アミノ酸以内（例えば、２アミノ酸以内、１アミノ酸）である。アミノ酸の改変は、好ましくは、保存的な置換である。本発明において「保存的な置換」とは、化学的に同様な側鎖を有する他のアミノ酸残基で置換することを意味する。化学的に同様なアミノ酸側鎖を有するアミノ酸残基のグループは、本発明の属する技術分野でよく知られている。例えば、酸性アミノ酸（アスパラギン酸及びグルタミン酸）、塩基性アミノ酸（リシン・アルギニン・ヒスチジン）、中性アミノ酸においては、炭化水素鎖を持つアミノ酸（グリシン・アラニン・バリン・ロイシン・イソロイシン・プロリン）、ヒドロキシ基を持つアミノ酸（セリン・トレオニン）、硫黄を含むアミノ酸（システイン・メチオニン）、アミド基を持つアミノ酸（アスパラギン・グルタミン）、イミノ基を持つアミノ酸（プロリン）、芳香族基を持つアミノ酸（フェニルアラニン・チロシン・トリプトファン）で分類することができる。

また「同等の活性を有する」とは、抗原への結合活性または前記シグナル伝達を抑制する活性が対象抗体（代表的には、後述の実施例において示す、８ａ４、１０ｂＭ３又は１０ｂ２Ｍ３）と同等（例えば、７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上）であることを意味する。抗原への結合活性は、例えば、後述の実施例において示す通り、抗原との反応性をＥＬＩＳＡにより解析することや、抗原を発現する細胞を作製し、抗体サンプルとの反応性をフローサイトメーターで解析することにより評価することができる。また、前記シグナル伝達を抑制する活性は、例えば、後述の実施例に示す方法にて、ＰＭＡ刺激を与えた細胞表面におけるＮＲＧ１タンパク質の残存率、ＮＲＧ１タンパク質による刺激を与えた癌細胞におけるＥｒｂＢ３タンパク質のリン酸化の程度、ゼノグラフトマウスにおける腫瘍体積等を指標として、評価することができる。

また、本発明の抗体の改変は、例えば、グリコシル化部位の数又は位置を変化させる等の抗体の翻訳後プロセスの改変であってもよい。これにより、例えば、抗体のＡＤＣＣ活性を向上させることができる。抗体のグリコシル化とは、典型的には、Ｎ−結合又はＯ−結合である。抗体のグリコシル化は、抗体を発現するために用いる宿主細胞に大きく依存する。グリコシル化パターンの改変は、糖生産に関わる特定の酵素の導入又は欠失等の公知の方法で行うことができる（特開２００８−１１３６６３号公報、米国特許第５０４７３３５号、米国特許第５５１０２６１号、米国特許第５２７８２９９号、国際公開第９９／５４３４２号）。さらに、本発明においては、抗体の安定性を増加させる等の目的で脱アミド化されるアミノ酸若しくは脱アミド化されるアミノ酸に隣接するアミノ酸を他のアミノ酸に置換することにより脱アミド化を抑制してもよい。また、グルタミン酸を他のアミノ酸へ置換して、抗体の安定性を増加させることもできる。本発明は、こうして安定化された抗体をも提供するものである。

本発明の抗体は、ポリクローナル抗体であれば、抗原（ヒトＮＲＧ１−αタンパク質における２２１〜２３４位又はヒトＮＲＧ１−β１タンパク質における２１３〜２３９位（又は２３２〜２３９位）のアミノ酸配列からなるポリペプチド、その部分ペプチド、またはこれらを発現する細胞等）で動物を免疫し、その抗血清から、従来の手段（例えば、塩析、遠心分離、透析、カラムクロマトグラフィー等）によって、精製して取得することができる。また、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法や組換えＤＮＡ法によって作製することができる。

ハイブリドーマ法としては、代表的には、コーラー及びミルスタインの方法（Ｋｏｈｌｅｒ＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５））が挙げられる。この方法における細胞融合工程に使用される抗体産生細胞は、前記抗原で免疫された動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、サル、ヤギ、ニワトリ、ラクダ）の脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血白血球などである。免疫されていない動物から予め単離された上記の細胞又はリンパ球等に対して、抗原を培地中で作用させることによって得られた抗体産生細胞も使用することが可能である。ミエローマ細胞としては公知の種々の細胞株を使用することが可能である。抗体産生細胞及びミエローマ細胞は、それらが融合可能であれば、異なる動物種起源のものでもよいが、好ましくは、同一の動物種起源のものである。ハイブリドーマは、例えば、抗原で免疫されたマウスから得られた脾臓細胞と、マウスミエローマ細胞との間の細胞融合により産生され、その後のスクリーニングにより、ヒトＮＲＧ１−αタンパク質又はヒトＮＲＧ１−β１タンパク質に特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得ることができる。ヒトＮＲＧ１−αタンパク質又はヒトＮＲＧ１−β１タンパク質に特異的なモノクローナル抗体は、ハイブリドーマを培養することにより、また、ハイブリドーマを投与した哺乳動物の腹水から、取得することができる。

組換えＤＮＡ法は、上記本発明の抗体をコードするＤＮＡをハイブリドーマやＢ細胞等からクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主細胞（例えば哺乳類細胞株、大腸菌、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞等）に導入し、本発明の抗体を組換え抗体として産生させる手法である（例えば、Ｐ．Ｊ．Ｄｅｌｖｅｓ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９９７ ＷＩＬＥＹ、Ｐ．Ｓｈｅｐｈｅｒｄ ａｎｄ Ｃ．Ｄｅａｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，２０００ ＯＸＦＯＲＤ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＰＲＥＳＳ、Ｖａｎｄａｍｍｅ Ａ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９２：７６７−７７５（１９９０））。本発明の抗体をコードするＤＮＡの発現においては、重鎖又は軽鎖をコードするＤＮＡを別々に発現ベクターに組み込んで宿主細胞を形質転換してもよく、重鎖及び軽鎖をコードするＤＮＡを単一の発現ベクターに組み込んで宿主細胞を形質転換してもよい（国際公開第９４／１１５２３号公報 参照）。本発明の抗体は、上記宿主細胞を培養し、宿主細胞内又は培養液から分離・精製し、実質的に純粋で均一な形態で取得することができる。抗体の分離・精製は、通常のポリペプチドの精製で使用されている方法を使用することができる。トランスジェニック動物作製技術を用いて、抗体遺伝子が組み込まれたトランスジェニック動物（ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ等）を作製すれば、そのトランスジェニック動物のミルクから、抗体遺伝子に由来するモノクローナル抗体を大量に取得することも可能である。

従って、本発明は、本発明の抗体をコードするＤＮＡ、本発明の抗体を産生する又は本発明の抗体をコードするＤＮＡを含むハイブリドーマをも提供することができる。また、本発明は、以下に示す本発明の抗体を作製するための方法も提供することができる。

配列番号：１に示されるヒトＮＲＧ１−αタンパク質における２２１〜２３４位の領域又は配列番号：２に示されるヒトＮＲＧ１−β１タンパク質における２１３〜２３９位からなるペプチド、該ペプチドの部分ペプチド又は該ペプチドを含むタンパク質を、動物に免疫する工程と、前記免疫された動物から抗体を精製する工程と、前工程にて精製された抗体の中から、前記ペプチドのいずれかと結合できる抗体を選択する工程とを含む、本発明の抗体を作製するための方法。

かかる本発明の抗体を作製するための方法において、免疫される「動物」としては特に制限はなく、前述の通り、例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、サル、ヤギ、ニワトリ、ラクダ等の非ヒト動物が挙げられる。また、「免疫された動物からの抗体の精製」においては、例えば、前述の通り、免疫された動物の抗血清から、従来の手段（例えば、塩析、遠心分離、透析、カラムクロマトグラフィー等）によって抗体を精製してもよい。また、免疫された動物から取得した抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合し、得られたハイブリドーマから従来の手段によって抗体を精製してもよい。このようにして精製された抗体の中から、前記ペプチドのいずれかと結合できる抗体を「選択」する方法としても特に制限はなく、例えば、後述の実施例において示す通り、前記ペプチドとの反応性をＥＬＩＳＡにより解析することや、前記ペプチドを発現する細胞を作製し、抗体との反応性をフローサイトメーターで解析する方法が挙げられる。

また、本発明の抗体においては、薬剤若しくはプロドラッグ等の化合物又は分子が結合していてもよい。かかる抗体を投与することにより、ヒトＮＲＧ１−αタンパク質又はヒトＮＲＧ１−β１タンパク質が発現している部位（例えば、癌細胞）に、該化合物又は分子を送達することができる。そのような薬物又はプロドラッグとしては特に制限はないが、本発明の抗体による抗腫瘍効果を相加的又は相乗的に増強するという観点から、抗腫瘍性を有する物質が好ましい。かかる抗腫瘍性を有する物質としては特に制限されるものではなく、例えば、抗癌剤（イリノテカン（ＣＰＴ−１１）、イリノテカンの代謝産物ＳＮ−３８（１０−ヒドロキシ−７−エチルカンプトテシン）、アドリアマイシン、タキソール、５−フルオロウラシル、ニムスチン、ラミニスチン等のアルキル化剤、ゲムシタビン、ヒドロキシカルバミド等の代謝拮抗剤、エトポシド、ビンクリスチン等の植物アルカロイド、マイトマイシン、ブレオマイシン等の抗癌性抗生物質、シスプラチン等の白金製剤、ソラフェニブ、エルロチニブ等の分子標的剤、メトトレキセート、シトシンアラビノシド、６−チオグアニン、６−メルカプトプリン、シクロフォスファミド、イフォスファミド、ブスルファン等が挙げられる。また、放射性同位体も本発明の抗体に結合する抗腫瘍性を有する物質として好適に利用できる。

また、抗体と前記化合物又は分子との結合も、当該技術分野で公知の方法により行うことができ、直接的結合及び間接的結合のいずれでもよい。例えば、直接的な結合として、共有結合を利用することができる。間接的な結合としては、リンカーを介した結合を利用することができる。かかるリンカーを介した結合については、当業者であれば、例えばＨｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９９６；Ｈａｒｒｉｓ，Ｊ．Ｍ． ａｎｄ Ｚａｌｉｐｓｋｙ，Ｓ．編，Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ），Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＡＣＳ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ，１９９７；Ｖｅｒｏｎｅｓｅ，Ｆ． ａｎｄ Ｈａｒｒｉｓ，Ｊ．Ｍ．編，Ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ．Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗ ５４（４），２００２の記載を参照しながら行うことができる。本発明の抗体１分子に結合する前記化合物又は分子の数は、理論的には特に限定されないが、抗体と化合物等とからなる複合体の安定性や製造容易性等の観点から、通常１〜１０個、好ましくは１〜８個である。

また、後述の実施例において、本発明の抗体により、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて腫瘍の増殖を抑制することや、癌細胞移植動物（ゼノグラフトマウス）を延命できることから、癌の治療又は予防に利用することができる。従って、本発明は、本発明の抗体を有効成分とする癌を治療又は予防するための組成物、並びに本発明の抗体の治療上又は予防上の有効量を、ヒトに投与する工程を含んでなる、癌を治療又は予防するための方法をも提供するものである。なお、本発明の抗体が標的とする癌としては、前述の通り特に制限はなく、多種の癌が標的となり得る。

本発明の抗体を有効成分とする癌を治療又は予防するための組成物は、本発明の抗体と任意の成分、例えば生理食塩水、葡萄糖水溶液又はリン酸塩緩衝液等を含有する形態で使用することができる。本発明の癌を治療又は予防するための組成物は、必要に応じて液体又は凍結乾燥した形態で製形化しても良く、任意に薬学的に許容される担体若しくは媒体、例えば、安定化剤、防腐剤、等張化剤等を含有させることもできる。

薬学的に許容される担体としては、凍結乾燥した製剤の場合、マンニトール、ラクトース、サッカロース、ヒトアルブミン等を例として挙げることができ、液状製剤の場合には、生理食塩水、注射用水、リン酸塩緩衝液、水酸化アルミニウム等を例として挙げることができるが、これらに限定されるものではない。

本発明の癌を治療又は予防するための組成物の投与方法は、投与対象の年齢、体重、性別、健康状態等により異なるが、経口投与、非経口投与（例えば、静脈投与、動脈投与、局所投与）のいずれかの投与経路で投与することができる。当該組成物の投与量は、患者の年齢、体重、性別、健康状態、癌の進行の程度及び投与する組成物の成分により変動しうるが、一般的に静脈内投与の場合、成人には体重１ｋｇ当たり１日０．１〜１０００ｍｇ、好ましくは１〜１００ｍｇである。

本発明の癌を治療又は予防するための方法においては、本発明の抗体を投与方法としては前述の通り特に制限はなく、経口投与、非経口投与のいずれかの投与経路で投与することができる。当業者であれば前記薬学的に許容される担体若しくは媒体等を選択し、適した組成物の形態をとることにより達成できる。ヒトに投与される本発明の抗体の治療上又は予防上の「有効量」は、前述の通り、当業者であれば、患者の年齢、体重、性別、健康状態、癌の進行の程度、投与経路等を考慮して決定することができる。また、本発明の抗体の投与対象となる「ヒト」としては特に制限はなく、例えば、癌を罹患しているヒトである。また、予防、癌の再発を抑えるという観点から、癌を化学療法、放射線療法、外科療法等によって除去した後のヒトであってもよい。

さら、本発明の癌を治療又は予防するための方法においては、本発明の抗体を投与する工程の他、本発明の抗体の有効性を評価する工程を含んでいてもよい。すなわち、
本発明の抗体の治療上又は予防上の有効量をヒトに投与する工程と、
該投与後のヒトにおいて、本発明の抗体の有効性を評価する工程とを含む、
癌を治療又は予防するための方法を、本発明は提供する。

本発明の抗体の「有効性の評価」については特に制限はなく、例えば、投与後の腫瘍のサイズ、癌の転移能又は各種癌マーカーの発現が投与前と比べ低減していれば、癌の治療等において本発明の抗体は有効であると判定することができる。また、癌に伴う異常、例えば、体重減少、腹痛、背痛、食欲低下、嘔気、嘔吐及び全身性倦怠感、虚弱、並びに黄疸等を指標としても、本発明の抗体の有効性を評価することができる。さらに、本発明の抗体による治療後、腫瘍組織を切除した場合、該腫瘍組織におけるヒトＮＲＧ１タンパク質のアイソフォームが関与するシグナル伝達の程度を調べることによっても、癌の治療等において本発明の抗体は有効であると判定することができる。例えば、腫瘍組織において通常亢進されるＥｒｂＢ３のリン酸化が、本発明の抗体の投与によって阻害されていることが検出されれば、癌の治療等において本発明の抗体は有効であると判定することができる。

本発明の抗体は、前述の通り、多種の癌においてＮＲＧ１タンパク質の発現亢進等が認められているため、癌の治療や予防のみならず、癌の検査への応用も考えられる。特に、本発明の抗体のエピトープが存在するヒトＮＲＧ１−αタンパク質における２２１〜２３４位の領域又はヒトＮＲＧ１−β１タンパク質における２１３〜２３９位の領域は、ＮＲＧ１タンパク質の細胞外領域であるため、細胞免疫染色やフローサイトメトリー等において、簡便かつ効率良く、ヒトＮＲＧ１−αタンパク質又はヒトＮＲＧ１−β１タンパク質を発現している癌細胞を検出することができる。また、本発明は、上記本発明の抗体を有効成分とする癌の検査薬を提供する。

本発明の抗体を癌の検査に用いる場合あるいは癌の治療における腫瘍部位の検出に用いる場合、本発明の抗体は、標識したものであってもよい。標識としては、例えば、放射性物質、蛍光色素、化学発光物質、酵素、補酵素を用いることが可能である。本発明の抗体を検査薬として調剤するには、合目的な任意の手段を採用して任意の剤型でこれを得ることができる。例えば、精製した抗体についてその抗体価を測定し、適当にＰＢＳ等で希釈した後、０．１％アジ化ナトリウム等を防腐剤として加えることができる。また、例えば、ラテックス等に本発明の抗体を吸着させたものについて抗体価を求め、適当に希釈し、防腐剤を添加して用いることもできる。

また、本発明において、ヒトＮＲＧ１−αタンパク質における２２１〜２３４位の領域又はヒトＮＲＧ１−β１タンパク質における２１３〜２３９位（又は２３２〜２３９位）の領域に結合する抗体が、抗がん活性を有することが判明したことから、ヒトＮＲＧ１−αタンパク質における２２１〜２３４位又はヒトＮＲＧ１−β１タンパク質における２１３〜２３９位（好ましくは、２３２〜２３９位）からなるポリペプチド又はその部分ペプチドを癌ワクチンとして、ヒトを含む哺乳動物に投与することも可能である（例えば、特開２００７−２７７２５１号公報、特開２００６−０５２２１６号公報を参照のこと）。本発明は、このような癌ワクチン用途に用いられる、ヒトＮＲＧ１−αタンパク質における２２１〜２３４位又はヒトＮＲＧ１−β１タンパク質における２１３〜２３９位（好ましくは、２３２〜２３９位）のアミノ酸配列からなるポリペプチド又はその部分ペプチドを含む癌ワクチン組成物をも提供するものである。製剤化する場合には、上記本発明の癌を治療又は予防するための組成物と同様に、薬学的に許容される担体若しくは媒体、例えば、安定化剤、防腐剤、等張化剤等を含有させることができる。

以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。なお、本明細書において、ＮＲＧ１−αタンパク質はＮＲＧ１−ａ、ＮＲＧ１−β１タンパク質はＮＲＧ１−ｂ、ＮＲＧ１−β２タンパク質はＮＲＧ１−ｂ２とも称する。

（実施例１）
＜ヒトＮＲＧ１タンパク質に結合する抗体の作製＞
以下に示す方法にて、ヒトＮＲＧ１タンパク質に結合する抗体を作製した。

１．ＮＲＧ１（ＮＲＧ１−ａ及びＮＲＧ１−ｂ２）のｃＤＮＡ取得
ヒトＮＲＧ１−ａ及びＮＲＧ１−ｂのｃＤＮＡ配列（ＨＲＧ−α：ＮＭ＿０１３９６４、ＨＲＧ−β１：ＮＭ＿０１３９５６）に基づき、共通配列である５’ＵＴＲと３’ＵＴＲとに下記のプライマーを設計した。
１ｓｔ ＰＣＲ
ＮＲＧ１＿５’−１：
５’−ＣＴＴＧＧＡＣＣＡＡＡＣＴＣＧＣＣＴＧＣＧ−３’（配列番号：２７）
ＮＲＧ１＿３’−１：５’−ＡＴＡＡＡＧＴＴＴＴＡＣＡＧＧＴＧＡＡＴＣＴＡＴＧＴＧ−３’ （配列番号：２８）
２ｎｄ ＰＣＲ
ＮＲＧ１＿５’−２：
５’−ＧＴＡＧＡＧＣＧＣＴＣＣＧＴＣＴＣＣＧＧ−３’ （配列番号：２９）
ＮＲＧ１＿３’−２：
５’−ＧＧＴＴＴＴＡＴＡＣＡＧＣＡＡＴＡＧＧＧＴＣＴＴＧ−３’ （配列番号：３０）。

ヒト膵臓癌細胞ＭＩＡＰａＣａ−２（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１４２０）及びＡｓＰＣ−１（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１６８２）から抽出したｔｏｔａｌＲＮＡから、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ ｃｅｌｌｓ ｄｉｒｅｃｔ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製：１８０８０−２００）を用いてｃＤＮＡを作製し、これを鋳型として、ＫＯＤ Ｐｌｕｓ Ｖｅｒ．２（東洋紡社製：ＫＯＤ−２１１）を用いたｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲによってＮＲＧ１のタンパク質コード領域全長を含むｃＤＮＡを増幅した。１ｓｔ ＰＣＲは［９８℃ ２０秒、６０℃ ２０秒、６８℃ １３０秒］を３５サイクル、２ｎｄ ＰＣＲは［９８℃ １５秒、６１℃ ２０秒、６８℃ １３０秒］を３５サイクルの条件で行った。２ｎｄ ＰＣＲの増幅産物をｐＴ７Ｂｌｕｅ Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製： ６９８２０）にクローニングし、塩基配列を確認した。塩基配列の確認には、オートシークエンサー（アプライドバイオシステムズ社製）を用いた。ＭＩＡＰａＣａ−２由来のｃＤＮＡからクローニングしたｃＤＮＡはヒトＮＲＧ１−ａの配列と一致していたため、ＮＲＧ１−ａ−ｐＴ７と名づけた。ＡｓＰＣ−１由来のｃＤＮＡからクローニングしたｃＤＮＡは、ヒトＮＲＧ１−ｂの配列と比較すると膜貫通領域より５’側に２４塩基長の欠失が見られ、ヒトＮＲＧ１−ｂ２の配列と一致していたため、ＮＲＧ１−ｂ２−ｐＴ７と名づけた。

２．ＮＲＧ１（ＮＲＧ１−ｂ）のｃＤＮＡ取得
ＮＲＧ１−ｂ２のｃＤＮＡをもとに、ＰＣＲによってＮＲＧ１−ｂのｃＤＮＡを作製した。ＰＣＲはＮＲＧ１−ｂ２−ｐＴ７を鋳型として用い、下記のプライマーとＰｆｕ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製：Ｍ７７４Ａ）を使用して［９５℃ ５０秒、５８℃ ３０秒、７２℃ １０分］を２５サイクルの条件で行った。
２４ｉｎ Ｆ：
５’−ｃａｔｃｔｔｇｇｇａｔｔｇａａｔｔｔａｔｇｇａｇＧＣＧＧＡＧＧＡＧＣＴＧＴＡＣＣＡＧＡＡＧＡＧＡＧＴＧ−３’ （配列番号：３１）
２４ｉｎ Ｒ：
５’−ｃｔｃｃａｔａａａｔｔｃａａｔｃｃｃａａｇａｔｇＣＴＴＧＴＡＧＡＡＧＣＴＧＧＣＣＡＴＴＡＣＧＴＡＧＴＴＴＴＧＧＣ−３’（配列番号：３２）
なお、小文字で示した部分はＮＲＧ１−ｂ特異的配列（ｂ２で欠失する配列）に相当する。

増幅産物をＤｐｎＩで消化し、常法に従ってクローニングした。得た配列はヒトＮＲＧ１−ｂの配列と一致していたため、ＮＲＧ１−ｂ−ｐＴ７と名づけた。

３．膜型ＮＲＧ１を発現する細胞の作製
ヒトＮＲＧ１−ａ、ＮＲＧ１−ｂ又はＮＲＧ１−ｂ２の全長を安定発現する動物細胞を、以下のように作製した。なおリコンビナントＮＲＧ１分子の発現を確認するために、それぞれＮ末端にＨＡタグを付加した。

ＮＲＧ１−ａ−ｐＴ７、ＮＲＧ１−ｂ−ｐＴ７又はＮＲＧ１−ｂ２−ｐＴ７を鋳型として、下記のプライマーにより２段階のＰＣＲで増幅させたＤＮＡの末端をＮｏｔＩとＢａｍＨＩで切断し、動物細胞用発現ベクターのＮｏｔＩ−ＢａｍＨＩサイトに挿入した。動物細胞用の発現ベクターには、ＣＭＶプロモーターで制御され、ＩＲＥＳ配列により目的遺伝子とＰｕｒｏｍｙｃｉｎ−ＥＧＦＰ融合タンパク質とが同時に発現されるｐＱＣｘｍｈＩＰＧを用いた。ｐＱＣｘｍｈＩＰＧは、本発明者らが「ＢＤ Ｒｅｔｒｏ−Ｘ Ｑ Ｖｅｃｔｏｒｓ」（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製：６３１５１６）のｐＱＣＸＩＰ Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒを改変したベクターである。作製したベクターは、ＮＲＧ１−ａ−ｐＱＣｘｍｈＩＰＧ、ＮＲＧ１−ｂ−ｐＱＣｘｍｈＩＰＧ及びＮＲＧ１−ｂ２−ｐＱＣｘｍｈＩＰＧと各々名付けた。
１ｓｔ ＰＣＲ
ｆｕｌｌ＿＋ＨＡ−１：
５’−ｔａｔｇａｔｇｔｇｃｃｇｇａｔｔａｔｇｃｃＴＣＣＧＡＧＣＧＣＡＡＡＧＡＡＧＧＣＡＧＡＧ−３’ （配列番号：３３）
ｆｕｌｌ＿Ｒ＿ＢａｍＨＩ：
５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＴＡＣＡＧＣＡＡＴＡＧＧＧＴＣＴＴＧＧＴＴＡＧ−３’ （配列番号：３４、下線部はＢａｍＨＩ認識配列）
２ｎｄ ＰＣＲ
ｆｕｌｌ＿＋ＨＡ−２：
５’−ＡＡＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＣＣＡＴＧｃｃｔｔａｔｇａｔｇｔｇｃｃｇｇａｔｔａｔｇｃｃ−３’ （配列番号：３５、下線部はＮｏｔＩ認識配列）
ｆｕｌｌ＿Ｒ＿ＢａｍＨＩ：
５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＴＡＣＡＧＣＡＡＴＡＧＧＧＴＣＴＴＧＧＴＴＡＧ−３’ （配列番号：３４、下線部はＢａｍＨＩ認識配列）
小文字部分はＨＡタグをコードする配列である。

作製したベクターを、Ｐａｎｔｒｏｐｉｃ Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製：Ｋ１０６３−１）を用いて以下のように２９３Ｔ細胞に導入した。Ｃｏｌｌａｇｅｎ−ｃｏａｔｅｄ １００ｍｍ ｄｉｓｈに８０〜９０％コンフルエント状態のＧＰ２−２９３（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製：Ｋ１０６３−１）を準備し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製：１１６６８−０１９）を用いて、上で構築した発現ベクター（ＮＲＧ１−ａ−ｐＱＣｘｍｈＩＰＧ、ＮＲＧ１−ｂ−ｐＱＣｘｍｈＩＰＧ又はＮＲＧ１−ｂ２−ｐＱＣｘｍｈＩＰＧ）とｐＶＳＶ−Ｇ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製：Ｋ１０６３−１）を１１．２ｕｇずつ共導入した。４８時間後、ウイルス粒子を含む上清を回収し、超遠心（１８，０００ｒｐｍ、１．５時間、４℃）によってウイルス粒子を沈殿させ、その沈殿物を３０ｕＬのＴＮＥ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ＝７．８］、１３０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）で懸濁し、レトロウイルスベクター濃縮液を調製した。レトロウイルスベクター濃縮液５ｕＬを、８ｕｇ／ｍＬのＨｅｘａｄｉｍｅｔｈｒｉｎｅ ｂｒｏｍｉｄｅ（ＳＩＧＭＡ社製：Ｈ−９２６８）を含んだ１５０ｕＬのＤＭＥＭ（ＳＩＧＭＡ社製；Ｄ５７９６）−１０％ＦＢＳで希釈し、ウイルス粒子含有培地を調製した。９６穴のマイクロプレートに約４０％コンフルエントの状態になるように準備した２９３Ｔの培地を、調製したウイルス粒子入りの培地に交換した。これらの細胞を５ｕｇ／ｍＬのＰｕｒｏｍｙｃｉｎ（ＳＩＧＭＡ社製：Ｐ−８８３３）を含むＤＭＥＭ（ＳＩＧＭＡ社製：Ｄ５７９６）−１０％ＦＢＳで培養することによって、目的遺伝子が発現している細胞を得た。

次に、樹立した細胞を常法に従って単クローン化し、細胞表面上に目的タンパク質が多く発現するクローンを選択した。これは、各クローンを抗ＨＡタグ抗体（ＭＢＬ社製：Ｍ１３２−３）及びＰＥ標識抗マウスＩｇＧ抗体（ベックマンコールター社製：ＩＭ０８５５）で染色し、フローサイトメトリーでの平均蛍光強度を測定することによって行った。以上により、Ｎ末端にＨＡタグを付加したＮＲＧ１を安定的に高発現する細胞株（ＮＲＧ１−ａ／ｓｔ２９３Ｔ、ＮＲＧ１−ｂ／ｓｔ２９３Ｔ及びｂＮＲＧ１−ｂ２／ｓｔ２９３Ｔ）を樹立した。

４．ＮＲＧ１の部分長を分泌発現する細胞の作製
ＮＲＧ１のＥＧＦドメイン（ａａ１８１−ａａ２２２）又はＥＧＦドメインと、切断領域（ＮＲＧ１−ａはａａ１８１−ａａ２４２、ＮＲＧ１−ｂはａａ１８１−ａａ２４７）とを発現する動物細胞を、以下のように作製した。

ＮＲＧ１−ａ−ｐＴ７又はＮＲＧ１−ｂ−ｐＴ７を鋳型として、下記のプライマーによりＰＣＲで増幅させたＮＲＧ１部分長ＤＮＡの末端をＮｏｔＩ及びＢａｍＨＩで切断し、動物細胞分泌発現用ベクターのＮｏｔＩ−ＢａｍＨＩサイトに挿入した。このベクターは、上に記載したｐＱＣｘｍｈＩＰＧのクローニングサイト上流にＩｇκの分泌シグナルペプチドをコードする配列（５’−ＡＴＧＧＡＧＡＣＡＧＡＣＡＣＡＣＴＣＣＴＧＣＴＡＴＧＧＧＴＡＣＴＧＣＴＧＣＴＣＴＧＧＧＴＴＣＣＡＧＧＴＴＣＣＡＣＴＧＧＴ−３’、配列番号：３６）を組み込んだ、目的タンパク質を強制的に分泌発現させるためのベクターである。作製したベクターは、ａｇ４ａ−ｐＱＣｓｘｍｈＩＰＧ、ａｇ４ｂ−ｐＱＣｓｘｍｈＩＰＧおよびａｇ５ａ−ｐＱＣｓｘｍｈＩＰＧと名付けた。
ａｇ４ａ
ＥＧＦ＿Ｆ＿ＮｏｔＩ：５’−ＡＡＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＡＡＴＧＴＧＣＧＧＡＧＡＡＧＧＡＧＡＡＡＡＣ−３’（配列番号：３７、下線部はＮｏｔＩ認識配列）
ＥＧＦ−ａ＿Ｒ＿ＢａｍＨＩ：５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＡＧＴＡＣＡＴＣＴＴＧＣＴＣＣＡＧＴＧ−３’（配列番号：３８、下線部はＢａｍＨＩ認識配列）
ａｇ４ｂ
ＥＧＦ＿Ｆ＿ＮｏｔＩ：５’−ＡＡＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＡＡＴＧＴＧＣＧＧＡＧＡＡＧＧＡＧＡＡＡＡＣ−３’（配列番号：３９、下線部はＮｏｔＩ認識配列）
ＥＧＦ−ｂ＿Ｒ＿ＢａｍＨＩ：５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＴＴＧＧＣＡＧＣＧＡＴＣＡＣＣＡＧＴＡＡＡＣＴＣＡＴ−３’（配列番号：４０、下線部はＢａｍＨＩ認識配列）
ａｇ５ａ
ＥＧＦ＿Ｆ＿ＮｏｔＩ：５’−ＡＡＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＡＡＴＧＴＧＣＧＧＡＧＡＡＧＧＡＧＡＡＡＡＣ−３’（配列番号：３７、下線部はＮｏｔＩ認識配列）
ｐｒｅＴＭ＿Ｒ＿ＢａｍＨＩ ：５’−ＣＧＧＧＴＡＣＣＣＡＣＴＣＴＣＴＴＣＴＧＧＴＡＣＡＧＣＴＣ−３’（配列番号：４１、下線部はＢａｍＨＩ認識配列）。

作製したベクターを上記と同様にＰａｎｔｒｏｐｉｃ Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製：Ｋ１０６３−１）を用いて２９３Ｔ細胞に導入し、５ｕｇ／ｍＬのＰｕｒｏｍｙｃｉｎ（ＳＩＧＭＡ社製：Ｐ−８８３３）を含むＤＭＥＭ（ＳＩＧＭＡ社製：Ｄ５７９６）−１０％ＦＢＳで培養することによって、目的遺伝子を安定的に発現する細胞株（ａｇ４ａ／ｓｔ２９３Ｔ、ａｇ４ｂ／ｓｔ２９３Ｔ及びａｇ５ａ／ｓｔ２９３Ｔ）を樹立した。

５．ＮＲＧ１部分長精製タンパク質（動物細胞由来リコンビナントタンパク質の調製）
以上のように樹立した発現細胞株（ａｇ４ａ／ｓｔ２９３Ｔ、ａｇ４ｂ／ｓｔ２９３Ｔ及びａｇ５ａ／ｓｔ２９３Ｔ）を、ＣＤ２９３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）それぞれ１Ｌで培養した。培養上清を回収し、そこからＴＡＬＯＮ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製：Ｋ１２５３−１）を用いてリコンビナントタンパク質を精製した。精製したタンパク質（ａｇ４ａ、ａｇ４ｂ及びａｇ５ａ）は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロットにて確認した。さらにプロテインアッセイキットＩＩ（ＢｉｏＲａｄ社製：５００−０００２ＪＡ）を用いてタンパク質濃度を決定した。

６．ＮＲＧ１の部分長を発現する大腸菌の作製
ＮＲＧ１の細胞外領域全長（ＮＲＧ１−ａはａａ１−ａａ２４２、ＮＲＧ１−ｂはａａ１−ａａ２４７）、ＥＧＦドメインと切断領域（ＮＲＧ１−ａはａａ１８１−ａａ２４２、ＮＲＧ１−ｂはａａ１８１−ａａ２４７）、ＥＧＦドメインのＮ末端から切断領域のα若しくはβタイプ特異的な配列まで（ＮＲＧ１−ａはａａ１８１−ａａ２３４、ＮＲＧ１−ｂはａａ１８１−ａａ２３９）、ＥＧＦドメインと切断領域のうちα若しくはβタイプ特異的な配列（ＮＲＧ１−ａはａａ２１３−ａａ２３４、ＮＲＧ１−ｂはａａ２１３−ａａ２３９）、又は、ＥＧＦドメインのα若しくはβタイプ特異的な配列から切断領域（ＮＲＧ１−ａはａａ２１３−ａａ２４２、ＮＲＧ１−ｂはａａ２１３−ａａ２４７）を発現する大腸菌を、以下のように作製した。

ＮＲＧ１−ａ−ｐＴ７又はＮＲＧ１−ｂ−ｐＴ７を鋳型として、下記のプライマーによってＰＣＲで増幅させた。
ａｇ８ａ、ａｇ８ｂ
ＥＣ＿ｐｅｔＦ＿ＢａｍＨＩ：５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＡＴＧＴＣＣＧＡＧＣＧＣＡＡＡＧＡＡＧＧ−３’（配列番号：４２、下線部はＢａｍＨＩ認識配列）
ＥＧＦ＿ｐｅｔＲ＿ＳａｌＩ：５’−ＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＣＡＣＴＣＴＣＴＴＣＴＧＧＴＡＣＡＧＣＴＣ−３’（配列番号：４３、下線部はＳａｌＩ認識配列）
ａｇ１０ａ、ａｇ１０ｂ
ＥＧＦ＿ｐｅｔＦ＿ＢａｍＨＩ：５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＡＣＣＡＣＴＧＧＧＡＣＡＡＧＣＣ−３’（配列番号：４４、下線部はＢａｍＨＩ認識配列）
ＥＧＦ＿ｐｅｔＲ＿ＳａｌＩ：５’−ＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＣＡＣＴＣＴＣＴＴＣＴＧＧＴＡＣＡＧＣＴＣ−３’（配列番号：４３、下線部はＳａｌＩ認識配列）
ａｇ１１ａ
ＥＧＦ＿ｐｅｔＦ＿ＢａｍＨＩ：５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＡＣＣＡＣＴＧＧＧＡＣＡＡＧＣＣ−３’（配列番号：４４、下線部はＢａｍＨＩ認識配列）
ａ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ＿ｐｅｔ＿Ｒ＿ＳａｌＩ：５’−ＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＣＧＣＣＴＴＴＴＣＴＴＧＧＴＴＴＴＧＧ−３’（配列番号：４５、下線部はＳａｌＩ認識配列）
ａｇ１１ｂ
ＥＧＦ＿ｐｅｔＦ＿ＢａｍＨＩ：５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＡＣＣＡＣＴＧＧＧＡＣＡＡＧＣＣ−３’（配列番号：４４、下線部はＢａｍＨＩ認識配列）
ｂ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ＿ｐｅｔ＿Ｒ＿ＳａｌＩ：５’−ＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＣＧＣＣＴＣＣＡＴＡＡＡＴＴＣＡＡＴＣＣ−３’（配列番号：４６、下線部はＳａｌＩ認識配列）
ａｇ１２ａ
ａ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ＿ｐＧＥＸ＿Ｆ＿ＢａｍＨＩ：５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＴＧＣＣＡＡＣＣＴＧＧＡＴＴＣＡＣＴＧＧ−３’（配列番号：４７、下線部はＢａｍＨＩ認識配列）
ａ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ＿ｐＧＥＸ＿Ｒ＿ＸｈｏＩ：５’−ＣＣＧＣＴＣＧＡＧｃｔａＣＧＣＣＴＴＴＴＣＴＴＧＧＴＴＴＴＧＧ−３’（配列番号：４８、下線部はＸｈｏＩ認識配列、小文字は停止コドンに相当）
ａｇ１２ｂ
ｂ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ＿ｐＧＥＸ＿Ｆ＿ＢａｍＨＩ：５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＴＧＣＣＣＡＡＡＴＧＡＧＴＴＴＡＣＴＧＧＴＧ−３’（配列番号：４９、下線部はＢａｍＨＩ認識配列）
ｂ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ＿ｐＧＥＸ＿Ｒ＿ＸｈｏＩ：５’−ＣＣＧＣＴＣＧＡＧｃｔａＣＧＣＣＴＣＣＡＴＡＡＡＴＴＣＡＡＴＣＣ−３’（配列番号：５０、下線部はＸｈｏＩ認識配列、小文字は停止コドンに相当）
ａｇ１３ａ
ａ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ＿ｐＧＥＸ＿Ｆ＿ＢａｍＨＩ：５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＴＧＣＣＡＡＣＣＴＧＧＡＴＴＣＡＣＴＧＧ−３’（配列番号：４７、下線部はＢａｍＨＩ認識配列）
ｐｒｅＴＭ＿ｐＧＥＸ＿Ｒ＿ＸｈｏＩ：５’−ＣＣＧＣＴＣＧＡＧｃｔａＣＡＣＴＣＴＣＴＴＣＴＧＧＴＡＣＡＧＣＴＣ−３’（配列番号：５１、下線部はＸｈｏＩ認識配列、小文字は停止コドンに相当）
ａｇ１３ｂ
ｂ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ＿ｐＧＥＸ＿Ｆ＿ＢａｍＨＩ：５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＴＧＣＣＣＡＡＡＴＧＡＧＴＴＴＡＣＴＧＧＴＧ−３’（配列番号：４９、下線部はＢａｍＨＩ認識配列）
ｐｒｅＴＭ＿ｐＧＥＸ＿Ｒ＿ＸｈｏＩ：５’−ＣＣＧＣＴＣＧＡＧｃｔａＣＡＣＴＣＴＣＴＴＣＴＧＧＴＡＣＡＧＣＴＣ−３’（配列番号：５１、下線部はＸｈｏＩ認識配列、小文字は停止コドンに相当）。

ａｇ８ａ、ａｇ８ｂ、ａｇ１０ａ、ａｇ１０ｂ、ａｇ１１ａ及びａｇ１１ｂは、増幅したＮＲＧ１部分長ＤＮＡの末端をＢａｍＨＩとＳａＩＩとで切断してｐＥＴ２８ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製：６９８６４−３）のＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩサイトに挿入した。これらを用いてＢＬ２１を形質転換し、ａｇ８ａ／ＢＬ２１、ａｇ８ｂ／ＢＬ２１、ａｇ１０ａ／ＢＬ２１、ａｇ１０ｂ／ＢＬ２１、ａｇ１１ａ／ＢＬ２１及びａｇ１１ｂ／ＢＬ２１と各々名付けた。

また、ａｇ１２ａ、ａｇ１２ｂ、ａｇ１３ａ及びａｇ１３ｂは、増幅したＮＲＧ１部分長ＤＮＡの末端をＢａｍＨＩとＸｈｏＩとで切断してｐＧＥＸ４Ｔ−１（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製：２８−９５４５−４９）のＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩサイトに挿入した。これらを用いてＢＬ２１を形質転換し、ａｇ１２ａ／ＢＬ２１、ａｇ１２ｂ／ＢＬ２１、ａｇ１３ａ／ＢＬ２１及びａｇ１３ｂ／ＢＬ２１と各々名付けた。

７．ＮＲＧ１部分長精製タンパク質（大腸菌由来リコンビナントタンパク質）の調製
以上のようにして樹立した大腸菌株のうち、ａｇ８ａ／ＢＬ２１、ａｇ８ｂ／ＢＬ２１、ａｇ１０ａ／ＢＬ２１、ａｇ１０ｂ／ＢＬ２１、ａｇ１１ａ／ＢＬ２１及びａｇ１１ｂ／ＢＬ２１は、カナマイシン添加ＬＢ培地０．５Ｌでそれぞれ培養し、１ｍＭのＩＰＴＧで発現誘導を行った。集菌したペレットをＰＢＳ中で破砕し、その不溶画分を６Ｍ ウレア／ＰＢＳで可溶化したのち、ＴＡＬＯＮ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製；Ｋ１２５３−１）を用いてリコンビナントタンパク質を精製した。

また、ａｇ１２ａ／ＢＬ２１、ａｇ１２ｂ／ＢＬ２１、ａｇ１３ａ／ＢＬ２１及びａｇ１３ｂ／ＢＬ２１は、アンピシリン添加ＬＢ培地０．５Ｌでそれぞれ培養し１ｍＭのＩＰＴＧで発現誘導を行った。集菌したペレットは１ｍＭ ＤＴＴ／ＰＢＳ（ＫＣｌ ｆｒｅｅ）中で破砕し、その可溶画分からＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ（ＧＥヘルスケア社製：１７−０７５６−０５）を用いてリコンビナントタンパク質を精製した。

精製したタンパク質（ａｇ８ａ、ａｇ８ｂ、ａｇ１０ａ、ａｇ１０ｂ、ａｇ１１ａ、ａｇ１１ｂ、ａｇ１２ａ、ａｇ１２ｂ、ａｇ１３ａ及びａｇ１３ｂ）はＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロットにて確認した。またプロテインアッセイキットＩＩ（ＢｉｏＲａｄ社製：５００−０００２ＪＡ）を用いてタンパク質濃度を決定した。

８．ＮＲＧ１部分長精製タンパク質（合成ペプチド）の調製
ＮＲＧ１の切断領域（ＮＲＧ１−ａはａａ２２３−ａａ２４２、ＮＲＧ１−ｂはａａ２２３−ａａ２４７）を含むペプチド（ＣＴＥＮＶＰＭＫＶＱＮＱＥＫＡＥＥＬＹＱＫＲＶＬ（配列番号：５２）及びＣＱＮＹＶＭＡＳＦＹＫＨＬＧＩＥＦＭＥＡＥＥＬＹＱＫＲＶＬ（配列番号：５３））は、受託サービス（ＭＢＬ社）にてＦｍｏｃ法で合成した。ペプチドはそれぞれ常法に従ってＫＬＨに結合させ、ａｇＰａ及びａｇＰｂを得た。

９．抗原免疫
ａｇ５ａ、ａｇ７ａ、ａｇ７ｂ、ａｇ８ａ、ａｇ８ｂ、ａｇ１０ａ、ａｇ１０ｂ、ａｇ１３ａ、ａｇ１３ｂ、ａｇＰａ又はａｇＰｂは、同量のコンプリートアジュバント（ＳＩＧＭＡ社製：Ｆ５８８１）と混合してエマルジョンにし、４〜５週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（日本エスエルシー社製）等に１匹当たり５〜２０ｕｇ、３〜７日おきに６回免疫した。最終免疫の３日後にマウスからリンパ球細胞を摘出し、マウス骨髄腫細胞Ｐ３Ｕ１（Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８Ｕ１）と融合させた。

１０．細胞融合
細胞融合は次に示す一般的な方法を基本として行った。全ての培地中のＦＢＳは、５６℃で３０分間保温する処理によって非働化したものを使用した。Ｐ３Ｕ１は、ＲＰＭＩ１６４０−１０％ＦＢＳ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ含有）で培養して準備した。摘出したマウスリンパ球細胞とＰ３Ｕ１とを１０：１〜２：１の割合で混合し、遠心した。沈殿した細胞に５０％ポリエチレングリコール４０００（Ｍｅｒｃｋ社製：１．０９７２７．０１００）を徐々に加えながら穏やかに混合後、遠心した。沈殿した融合細胞を、１５％ＦＢＳを含むＨＡＴ培地（ＲＰＭＩ１６４０、ＨＡＴ−ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製：１１０６７−０３０）、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）で適宜希釈し、９６穴のマイクロプレートに２００ｕＬ／ウェルで播種した。融合細胞をＣＯ_２インキュベータ（５％ＣＯ_２、３７℃）中で培養し、コロニーが形成されたところで培養上清をサンプリングし、下記のようにスクリーニングを行った。

１１．抗ＮＲＧ１モノクローナル抗体産生細胞の選択
抗ＮＲＧ１抗体を産生するハイブリドーマは、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）によって選定した。本アッセイにはそれぞれ免疫原として使用したリコンビナントヒトＮＲＧ１タンパク質を９６ウェルのＥＬＩＳＡプレート（ｎｕｎｃ社製）に０．５ｕｇ／ｍＬ、５０ｕＬ／ウェルで分注し、室温２時間又は４℃一晩静置して吸着させたものを用いた。溶液を除去後、１％ＢＳＡ（ナカライ社製：０１８６３−３５）−５％Ｓｕｃｒｏｓｅ（ＷＡＫＯ社製）−ＰＢＳを１５０ｕＬ／ウェル加え、室温で２時間静置することによって、残存する活性基をブロックした。静置後、溶液を除去し、一次抗体としてハイブリドーマ培養上清を５０ｕＬ／ウェル分注し、１時間静置した。該プレートを０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳで洗浄後、二次抗体として１００００倍希釈したＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（ＭＢＬ社製：３３０）を５０ｕＬ／ウェル加えて室温で１時間静置した。該プレートを０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳで洗浄後、発色液（５ｍＭクエン酸ナトリウム、０．８ｍＭ ３．３’．５．５’テトラメチルベンチジン−２ＨＣｌ、１０％Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、０．６２５％ポリエチレングリコール４０００、５ｍＭクエン酸一水和物、５ｍＭ Ｈ２Ｏ２）を５０ｕＬ／ウェル添加し室温２０分静置して発色させ、１Ｍリン酸を５０ｕＬ／ウェル添加して発色を停止させたのち、４５０ｎｍの吸光度をプレートリーダー（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を用いて測定した。

ここで選択したハイブリドーマの培養上清は、さらに、免疫原として使用したリコンビナントタンパク質と同一のタグ配列を持つ他の精製リコンビナントタンパク質に反応しないことを同様のＥＬＩＳＡによって確認した。これにより、産生される抗体はタグ部分やリンカー部分ではなくＮＲＧ１を認識するものであることを確認した。

そして、ここで選択したハイブリドーマを、１５％ＦＢＳを含むＨＴ培地（ＲＰＭＩ１６４０、ＨＴ−ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製：２１０６０−０１７）、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）で拡大培養した後、限界希釈法によって単クローン化した。

１２．抗ＮＲＧ１モノクローナル抗体の取得
単クローン化した各ハイブリドーマを無血清培地（ＧＩＢＣＯ社製：１２３００−０６７）で培養し、その培養上清から、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを用いた一般的なアフィニティー精製法により抗体を精製した。これら抗体のヒトＮＲＧ１に対する反応性は、前記同様に、免疫原として使用した精製タンパク質を用いた酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）によって確認した。一次抗体として、抗ＮＲＧ１抗体を５ｕｇ／ｍＬを最大濃度としてＰＢＳで段階希釈したものを用いた。結果、すべての抗体が濃度依存的にヒトＮＲＧ１に反応することを確認した。

このようにして、抗ＮＲＧ１抗体を産生するハイブリドーマを計８０取得した（ａｇ８ａを免疫原として３９クローン、ａｇ８ｂを免疫原として１６クローン、ａｇ１０ａを免疫原として１６クローン、ａｇ１０ｂを免疫原として２クローン、ａｇ１３ａを免疫原として４クローン、ａｇＰａを免疫原として３クローン）。

（実施例２）
＜取得抗体の細胞表面ＮＲＧ１に対する反応性＞
取得した抗ＮＲＧ１抗体のうち、細胞表面ＮＲＧ１に強く反応するものを、フローサイトメトリーを用いた一般的な方法によって選定した。各抗体の、同条件下（同数のＮＲＧ１−ａ／ｓｔ２９３Ｔ又はＮＲＧ１−ｂ／ｓｔ２９３Ｔ（５ｘ１０＾４個）と、２９３Ｔ（１ｘ１０＾４個）と、同濃度の各精製抗体（５ｕｇ／ｍＬ）と、同濃度の二次抗体（１／１００希釈）（ベックマンコールター社製：ＩＭ０８５５）とを用いたフローサイトメトリーの平均蛍光強度を解析した。陽性対照として抗ＨＡタグ抗体（ＭＢＬ社製：Ｍ１３２−３）を用い、細胞表面上のＮＲＧ１の発現を確認した。また、抗体濃度依存的な平均蛍光強度についてもデータを取得し、低濃度での検出能を解析することで、相対的な親和性を評価した。得られた結果を図２に示す。

図２に示す通り、取得抗体のうち、８ａ２、８ａ４、１０ｂＭ３及び１０ｂ２Ｍ３の４抗体が細胞表面上のＮＲＧ１に強く反応することが明らかになった。さらに、８ａ２はＮＲＧ１−ａとＮＲＧ１−ｂの両方に反応し、８ａ４はＮＲＧ１−ａ特異的に、１０ｂＭ３と１０ｂ２Ｍ３とはＮＲＧ１−ｂに特異的に反応することが明らかになった。

（実施例３）
＜取得抗体のエピトープ解析＞
８ａ２、８ａ４、１０ｂＭ３及び１０ｂ２Ｍ３が認識する配列を、リコンビナントＮＲＧ１タンパク質に対する反応性を評価することによって解析した。すなわち、複数のＮＲＧ１部分長タンパク質を用いて、これらに対する各抗体の反応を前記と同様の酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）で検出することによって行った。得られた結果をグラフ化したものを図３〜６に示す。縦軸は吸光度を表す。また、ＮＲＧ１−ａ及びＮＲＧ１−ｂと、各ＮＲＧ１部分長タンパク質との対応関係を図１に示す。

また、１０ｂＭ３及び１０ｂ２Ｍ３が認識する配列については、細胞表面のＮＲＧ１−ｂ２に対する反応をフローサイトメトリーによっても解析した。前記同様の方法で、ＮＲＧ１−ｂ／ｓｔ２９３Ｔに対する反応性とＮＲＧ１−ｂ２／ｓｔ２９３Ｔに対する反応性を比較した。得られた結果を図７に示す。

図４に示す通り、８ａ４については、ａｇＰa（ヒトＮＲＧ１−αタンパク質の２２１〜２４４位）及びａｇ１２a（ヒトＮＲＧ１−αタンパク質の２１２〜２３５位）に反応することが明らかになった。さらに、図２に示す通り、８ａ４はヒトＮＲＧ１−β１タンパク質とは反応しないことから、８ａ４は、ＮＲＧ１タンパク質のαタイプのアイソフォーム特異的な配列、すなわちヒトＮＲＧ１−αタンパク質における２２１〜２３４位の領域を認識することが明らかになった。

また、図５〜７に示す通り、１０ｂＭ３及び１０ｂ２Ｍ３については、実施例２に記載の結果同様に、ヒトＮＲＧ１−αタンパク質とは反応しないことから、これら抗体は、ＮＲＧ１タンパク質のβタイプのアイソフォーム特異的な配列、すなわち、ヒトＮＲＧ１−β１タンパク質における２１３〜２３９位の領域を認識することが明らかになった。

さらに、フローサイトメトリーによる解析において評価に用いているのは、細胞に発現しているＮＲＧ１タンパク質であるため、当該解析の方が前記ＥＬＩＳＡよりも、抗体との反応に供したＮＲＧ１タンパク質のコンフォメーション等がより正しく保たれている可能性が高いと考えられる。従って、フローサイトメトリーによる解析結果（図７に示した結果）を重視するに、１０ｂＭ３及び１０ｂ２Ｍ３は、ヒトＮＲＧ１−β２タンパク質とは反応しないことから、これら抗体は、ＮＲＧ１タンパク質−β１タンパク質に特異的な配列、すなわち、ヒトＮＲＧ１−β１タンパク質における２３２〜２３９位の領域を認識している可能性も考えられる。

なお、図３に示す通り、８ａ２については、ａｇ８ａ（ヒトＮＲＧ１−αタンパク質の１〜２４３位）及びａｇ８ｂ（ヒトＮＲＧ１−β１タンパク質の１〜２４８位）に反応し、ａｇ１０ａ（ヒトＮＲＧ１−αタンパク質の１７３〜２４３位）及びａｇ１０ｂ（ヒトＮＲＧ１−β１タンパク質の１７３〜２４８位）に反応しないことから、ＥＧＦドメインよりＮ末端側の共通領域を認識することが明らかになった。

（実施例４）
＜ＥＧＦファミリーの他の因子に対する反応性＞
ＮＲＧ１タンパク質はＥＧＦファミリーに属するタンパク質であるが、ＥＧＦドメイン以外の領域では、ＥＧＦファミリーの他のタンパク質とＮＲＧ１タンパク質とは殆ど類似していない。また、ＥＧＦドメインに関しては、ＥＧＦドメインの第１から第６のシステインの間で、ＮＲＧ１タンパク質は、ＨＢ−ＥＧＦ（ヘパリン結合ＥＧＦ様成長因子）との相同性は４５％であり、ＡＲＥＧ（アンフィレグリン）との相同性は３５％であり、ＴＧＦ−α（トランスフォーミング成長因子α）との相同性は３２％であり、ＥＧＦとの相同性は２７％である（Ｈｏｌｍｅｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９２年、２５６巻、１２０５〜１２１０ページ 参照）。

このように、ＥＧＦドメインにおけるＮＲＧ１タンパク質との相同性はいずれも低いものであるが、ＥＧＦドメイン周辺を認識する８ａ４、１０ｂＭ３及び１０ｂ２Ｍ３について、他のＥＧＦファミリーの因子への反応性を、前記同様ＥＬＩＳＡによって解析した。すなわち、ＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ社製：２３６−ＥＧ−２００）、ＨＢ−ＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ社製：２５９−ＨＥ−０５０／ＣＦ）、ＴＧＦ−ａｌｐｈａ（Ｒ＆Ｄ社製：２３９−Ａ−１００）、ＡＲＥＧ（Ｒ＆Ｄ製：２６２−ＡＲ−１００／ＣＦ）、ＮＲＧ１−ａ（Ｒ＆Ｄ社製：２９６−ＨＲ−０５０／ＣＦ）又はＮＲＧ１−ｂ（Ｒ＆Ｄ社製：３９６−ＨＢ−０５０／ＣＦ）をそれぞれ９６穴のＥＬＩＳＡプレートに０．５ｕｇ／ｍＬ、５０ｕＬ／ウェルで分注して固相化し、各抗体の１０ｕｇ／ｍＬ及び１ｕｇ／ｍＬでの反応を検出した。その結果、図８に示す通り、８ａ４、１０ｂＭ３及び１０ｂ２Ｍ３はいずれも他のＥＧＦファミリーの因子には反応しなかった。

（実施例５）
＜取得抗体のＮＲＧ１切断阻害活性についての評価１＞
取得した抗体について、ヒトＮＲＧ１−αタンパク質又はヒトＮＲＧ１−β１タンパク質が関与するシグナル伝達を特異的に抑制できるかどうかを評価した。すなわち、該シグナル伝達の発端となるこれらタンパク質の切断を特異的に取得した抗体が抑制できるかどうかを以下に示す方法にて評価した。

前記ＨＡ−ＮＲＧ１−ａ／ｓｔ２９３Ｔ、ＨＡ−ＮＲＧ１−ｂ／ｓｔ２９３Ｔ又はＨＡ−ＮＲＧ１−ｂ２／ｓｔ２９３Ｔを、９６穴のマイクロプレートに１ウェルあたり２００００細胞播種し、３７℃で６時間培養した。細胞がプレート底面に接着したことを確認したのち、血清を含まないＤＭＥＭ培地に交換して、さらに１５時間培養した。

次に、８ａ２、８ａ４、１０ｂＭ３、１０ｂ２Ｍ３又はコントロール抗体（ＭＢＬ社製：Ｍ０７５−３）を添加した培地に交換し、３７℃で６０分間インキュベートした。この際の抗体濃度は８０、２０、５、１及び０ｕｇ／ｍＬの５段階で、１ウェルあたりの培地量は６０ｕＬである。続いて、６００ｎＭに調整したＰＭＡ添加培地を１ウェルあたり３０ｕＬ添加し混合することによって、最終濃度２００ｎＭとなるようにＰＭＡを添加した。３７℃で３０分間培養した後、ピペッティングによって細胞を回収した。なお、全てのサンプルは３ウェルずつ作製した。また、ＰＭＡ（ホルボール−１２−ミリステート−１３−アセテート）はプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）を活性化することにより、ＮＲＧ１にシェディングを誘導することが明らかになっている。

一連の処理を行ったのちに、これらの細胞の表面に残存しているＮＲＧ１分子を、ＮＲＧ１のＮ末端に付加されているＨＡタグをフローサイトメトリーで検出することによって解析した。一次抗体として２ｕｇ／ｍＬに希釈したビオチン化抗ＨＡタグ抗体（ＭＢＬ社製：Ｍ１３２−３）、二次抗体として１／１００希釈したＰＥ標識ストレプトアビジン（インビトロジェン社製：Ｓ８６６）を使用し、常法に従って行った。得られた結果を図９〜１１に示す。縦軸はフローサイトメトリーでの平均蛍光強度を表す。また、各サンプルの値は、３ウェルずつ測定した結果の平均である。

図９〜１１に示す通り、ＨＡ−ＮＲＧ１−ａ／ｓｔ２９３Ｔに対しては８ａ４が、ＨＡ−ＮＲＧ１−ｂ／ｓｔ２９３Ｔに対しては１０ｂＭ３及び１０ｂ２Ｍ３が、濃度依存的に切断を阻害することが示された。すなわち、各々のアイソフォームに特異的な領域（ヒトＮＲＧ１−αタンパク質における２２１〜２３４位の領域又はヒトＮＲＧ１−β１タンパク質における２１３〜２３９位（又は２３２〜２３９位）の領域）を認識する８ａ４、１０ｂＭ３及び１０ｂ２Ｍ３が切断阻害活性を有することが明らかになった。

＜取得抗体のＮＲＧ１切断阻害活性についての評価２＞
実施例１にて取得した抗ＮＲＧ１抗体（８ａ２、８ａ５、８ａ１７、８ａ１８、８ａ７、８ａ６、１３ａ３、８ａ４及び１０ｂＭ３）を用い、これら抗体のエピトープと、ＮＲＧ１切断阻害活性との相関について解析した。

８ａ２、８ａ５、８ａ１７、８ａ１８及び８ａ７は、ＮＲＧ１−α及びＮＲＧ１−β１に結合する抗体である。８ａ２、８ａ５、８ａ１７及び８ａ１８のエピトープはいずれも、ＥＧＦドメインよりＮ末側の領域である。８ａ７のエピトープは、ＥＧＦドメインにおけるＮＲＧ１−αとＮＲＧ１−β１との共通領域である。

８ａ６、１３ａ３及び８ａ４は、ＮＲＧ１−αに特異的に結合する抗体である。８ａ６及び１３ａ３のエピトープはいずれも、ＥＧＦドメインのＣ末側の領域（ＮＲＧ１−αとＮＲＧ１−β１とにおいて相同性の低い領域）である。８ａ４のエピトープは、前述の通り、ヒトＮＲＧ１−αタンパク質における２２１〜２３４位の領域である。

１０ｂＭ３は、前述の通り、ＮＲＧ１−β１に特異的に結合する抗体であり、そのエピトープは、ヒトＮＲＧ１−β１タンパク質における２１３〜２３９位（又は２３２〜２３９位）の領域である。

なお、これら抗ＮＲＧ１抗体は、実施例２及び３に記載の方法にて同定した。また、これら抗ＮＲＧ１抗体のＮＲＧ１切断阻害活性の評価は、前述の方法と同様の方法を用いて行った。すなわち、前記ＨＡ−ＮＲＧ１−ａ／ｓｔ２９３Ｔ又はＨＡ−ＮＲＧ１−ｂ／ｓｔ２９３Ｔを、４８穴のマイクロプレートに１ウェルあたり２０００００細胞播種し、３７℃で６時間培養した。細胞がプレート底面に接着したことを確認したのち、血清を含まないＤＭＥＭ培地に交換して、さらに１５時間培養した。

次に、前記抗ＮＲＧ１抗体又はコントロール抗体（ＭＢＬ：Ｍ０７５−３）を添加した培地に交換し、３７℃で１２０分間インキュベートした。この際の抗体濃度は１００及び１０ｕｇ／ｍＬの２段階で、１ウェルあたりの培地量は２５０ｕＬである。続いて、２００ｎＭに調整したＰＭＡ添加培地を１ウェルあたり２５０ｕＬ添加し混合することによって、最終濃度１００ｎＭとなるようにＰＭＡを添加した。３７℃で３０分間培養した後、ピペッティングによって細胞を回収した。

一連の処理を行ったのちに、これらの細胞の表面に残存しているＮＲＧ１分子を、ＮＲＧ１のＮ末端に付加されているＨＡタグをフローサイトメトリーで検出することによって解析した。一次抗体として２ｕｇ／ｍＬに希釈したビオチン化抗ＨＡタグ抗体（ＭＢＬ社製：Ｍ１３２−３）、二次抗体として１／１００希釈したＰＥ標識ストレプトアビジン（インビトロジェン社製：Ｓ８６６）を使用し、常法に従って行った。得られた結果を図１２及び１３に示す。縦軸はフローサイトメトリーでの平均蛍光強度を表す。

図１２及び１３に示す通り、前述の結果同様に、ヒトＮＲＧ１−αタンパク質に対しては８ａ４が、ヒトＮＲＧ１−β１に対しては１０ｂＭ３が、濃度依存的に切断を阻害することが示された。一方、ヒトＮＲＧ１−αタンパク質における２２１〜２３４位の領域及びヒトＮＲＧ１−β１タンパク質における２１３〜２３９位の領域以外の領域を認識する抗体（８ａ２、８ａ５、８ａ１７、８ａ１８、８ａ７、８ａ６及び１３ａ３）については、いずれもＮＲＧ１タンパク質に対する切断阻害活性が認められなかった。特に、ヒトＮＲＧ１−αタンパク質における２２１〜２３４位の領域にかなり近接している領域をエピトープとする８ａ６及び１３ａ３においてでさえ、かかる活性を確認することができなかった。従って、ヒトＮＲＧ１−αタンパク質における２２１〜２３４位の領域及びヒトＮＲＧ１−β１タンパク質における２１３〜２３９位の領域は、抗体がＮＲＧ１タンパク質に対する切断を阻害する上で重要な認識部位であることが確認された。

（実施例６）
＜取得抗体のＮＲＧ１中和活性についての評価＞
取得した抗体について、ヒトＮＲＧ１−αタンパク質又はヒトＮＲＧ１−β１タンパク質が関与するシグナル伝達を特異的に抑制できるかどうかを評価した。すなわち、これらタンパク質の刺激に特異的に応答して生じる、癌細胞のＥｒｂＢ３タンパク質のリン酸化を、取得した抗体が抑制できるかどうかを以下に示す方法にて評価した。

ヒト乳がんの株化培養細胞であるＭＣＦ７（ＡＴＣＣ社製：ＨＴＢ−２２）を用いて、ＮＲＧ１で刺激した際に誘起されるＥｒｂＢ３のリン酸化を、取得した抗ＮＲＧ１抗体が阻害できるか、すなわち抗ＮＲＧ１抗体にＮＲＧ１を中和する活性があるかどうかをウエスタンブロット法によって解析した。ＤＭＥＭ−１０％ＦＢＳ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ含有）で培養したＭＣＦ７を、６穴プレートに１ウェルあたり２５００００細胞播種し、３７℃で６時間培養した。細胞がプレート底面に接着したことを確認したのち、血清を含まないＤＭＥＭ培地に交換して、さらに２４時間培養した。

そして、ここに、ＮＲＧ１−ａ及びＮＲＧ１−ｂのリコンビナントタンパク質（Ｒ＆Ｄ社製：２９６−ＨＲ／ＣＦ及び３９６−ＨＢ／ＣＦ）と抗ＮＲＧ１抗体を３７℃で６０分間インキュベートしたものを１ウェルあたり５００ｕＬ添加した。この際、リコンビナントタンパク質の濃度は１００ｎｇ／ｍＬ（ＮＲＧ１−ａ）又は５ｎｇ／ｍＬ（ＮＲＧ１−ｂ）であり、抗体濃度は５０、１０、５及び０ｕｇ／ｍＬの４段階である。

これを３７℃で３０分間培養した後、１ウェルあたり２００ｕＬのＳＤＳサンプルバッファー（６２．５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ［ｐＨ＝６．８］、５％Ｇｌｙｃｅｒｏｌ、２％ＳＤＳ、０．００３％ＢＰＢ、５％２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）で細胞を回収した。

回収した細胞サンプルを加熱処理したのち１５ｕＬずつをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、１／１０００希釈した抗リン酸化ＥｒｂＢ３ウサギ抗体（ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇ社製：＃４７９１Ｓ）又は抗ＥｒｂＢウサギ抗体（ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇ社製：＃４７５４）と、１／５０００希釈したＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ抗体（ＭＢＬ社製：４５８）とを用いてウエスタンブロットを施行した。得られた結果を図１４及び１５に示す。

図１４及び１５に示す通り、８ａ４はＮＲＧ１−ａによるＥｒｂＢ３のリン酸化を、１０ｂＭ３及び１０ｂ２Ｍ３はＮＲＧ１−ｂによるＥｒｂＢ３のリン酸化をそれぞれ濃度依存的に阻害した。すなわち、８ａ４、１０ｂＭ３及び１０ｂ２Ｍ３がＮＲＧ１中和活性を有することが明らかになった。

（実施例７）
＜８ａ４、１０ｂＭ３及び１０ｂ２Ｍ３抗体の重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子の単離、並びにＣＤＲの同定＞
本発明の抗体（８ａ４、１０ｂＭ３及び１０ｂ２Ｍ３）について、以下に示す方法にて重鎖及び軽鎖の可変領域遺伝子を単離し、さらにこれら可変領域中のＣＤＲを同定した。

ハイブリドーマを培養し、一般的な方法によりｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。次に、ＧｅｎｅＲａｃｅｒキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製：Ｌ１５０２−０１）を用いた５’−ＲＡＣＥ法により、ｃＤＮＡを取得した。このｃＤＮＡを鋳型とし、ＧｅｎｅＲａｃｅｒ ５’Ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＣＧＡＣＴＧＧＡＧＣＡＣＧＡＧＧＡＣＡＣＴＧＡ−３’（配列番号：５４））とＣＨ１（ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ１ ｃｏｎｓｔａｎｔ領域１）３’Ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＡＡＴＴＴＴＣＴＴＧＴＣＣＡＣＣＴＧＧ−３’（配列番号：５５））とを用いてＰｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製：１１３０４−０２９）でＰＣＲ（［９４℃ ３０秒、５７℃ ３０秒、７２℃ ５０秒］を３５サイクル）を実施し、抗体重鎖可変領域の遺伝子（ｃＤＮＡ）を増幅した。一方、抗体軽鎖についても同様にＧｅｎｅＲａｃｅｒ ５’ＰｒｉｍｅｒとＣｋ（κｃｏｎｓｔａｎｔ領域）３’Ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＣＴＡＡＣＡＣＴＣＡＴＴＣＣＴＧＴＴＧＡＡＧＣＴＣＴ−３’（配列番号：５６））とを用いてＰＣＲを実施して、遺伝子（ｃＤＮＡ）を増幅した。増幅した遺伝子断片をそれぞれｐＴ７Ｂｌｕｅ Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製：６９８２０）にクローニングし、オートシークエンサー（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて配列を解析した。そして。得られた塩基配列がコードするアミノ酸、及び各ＣＤＲの配列を決定した。その結果は以下の通りである。

＜８ａ４重鎖可変領域＞
ＥＶＱＬＱＱＳＧＡＤＬＶＲＰＧＡＳＶＫＬＳＣＴＡＳＧＦＮＩＫＤＤＹＩＨＷＶＫＱＲＰＥＱＧＬＥＷＩＧＷＩＤＰＥＮＧＤＴＥＹＡＳＱＦＱＧＫＡＴＩＴＡＤＴＳＳＮＴＡＹＬＱＬＲＳＬＴＳＥＤＴＡＶＹＹＣＴＴＳＤＨＲＡＷＦＡＦＷＧＬＧＴＬＶＴＶＳＳ
（配列番号：１０）
＜８ａ４重鎖可変領域のＣＤＲ１＞
ＤＤＹＩＨ （配列番号：７）
＜８ａ４重鎖可変領域のＣＤＲ２＞
ＷＩＤＰＥＮＧＤＴＥＹＡＳＱＦＱＧ （配列番号：８）
＜８ａ４重鎖可変領域のＣＤＲ３＞
ＳＤＨＲＡＷＦＡＦ （配列番号：９）
＜８ａ４軽鎖可変領域＞
ＤＶＬＭＴＱＴＰＬＳＬＰＶＳＬＧＤＱＡＳＩＳＣＲＳＳＱＴＩＶＨＲＮＧＮＴＹＬＥＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＲＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＬＧＶＹＹＣＦＱＧＳＨＶＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬ
（配列番号：６）
＜８ａ４軽鎖可変領域のＣＤＲ１＞
ＲＳＳＱＴＩＶＨＲＮＧＮＴＹＬＥ （配列番号：３）
＜８ａ４軽鎖可変領域のＣＤＲ２＞
ＲＶＳＮＲＦＳ （配列番号：４）
＜８ａ４軽鎖可変領域のＣＤＲ３＞
ＦＱＧＳＨＶＰＬＴ （配列番号：５）
＜１０ｂＭ３重鎖可変領域＞
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＲＫＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＹＧＩＨＷＶＲＱＡＰＥＫＧＬＥＷＬＡＹＩＳＳＧＳＳＴＩＹＹＡＤＴＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＦＬＱＭＴＳＬＲＳＥＤＴＡＭＹＹＣＡＲＧＳＮＹＶＧＹＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳ
（配列番号：１８）
＜１０ｂＭ３重鎖可変領域のＣＤＲ１＞
ＤＹＧＩＨ （配列番号：１５）
＜１０ｂＭ３重鎖可変領域のＣＤＲ２＞
ＹＩＳＳＧＳＳＴＩＹＹＡＤＴＶＫＧ （配列番号：１６）
＜１０ｂＭ３重鎖可変領域のＣＤＲ３＞
ＧＳＮＹＶＧＹＹＡＭＤＹ （配列番号：１７）
＜１０ｂＭ３軽鎖可変領域＞
ＤＩＶＭＴＱＳＰＳＳＬＡＶＴＡＧＥＫＶＴＭＲＣＫＳＳＱＳＬＬＷＳＶＮＱＫＮＹＬＳＷＹＱＱＫＥＧＱＳＰＫＬＬＩＹＧＡＳＩＲＥＳＷＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＮＶＨＡＥＤＬＡＶＹＹＣＱＨＮＨＧＲＦＬＰＬＴＦＧＧＧＴＫＬ
（配列番号：１４）
＜１０ｂＭ３軽鎖可変領域のＣＤＲ１＞
ＫＳＳＱＳＬＬＷＳＶＮＱＫＮＹＬＳ （配列番号：１１）
＜１０ｂＭ３軽鎖可変領域のＣＤＲ２＞
ＧＡＳＩＲＥＳ （配列番号：１２）
＜１０ｂＭ３軽鎖可変領域のＣＤＲ３＞
ＱＨＮＨＧＲＦＬＰＬＴ （配列番号：１３）
＜１０ｂ２Ｍ３重鎖可変領域＞
ＱＶＱＬＱＱＳＧＰＥＬＶＫＰＧＡＳＶＫＩＳＣＫＡＳＧＹＡＦＳＳＳＷＭＮＷＶＫＱＲＰＧＫＧＬＥＷＩＧＲＩＹＰＧＤＧＤＩＹＹＮＧＫＦＫＧＫＡＴＬＴＡＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＮＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＦＣＡＲＴＦＮＹＰＦＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
（配列番号：２６）
＜１０ｂ２Ｍ３重鎖可変領域のＣＤＲ１＞
ＳＳＷＭＮ （配列番号：２３）
＜１０ｂ２Ｍ３重鎖可変領域のＣＤＲ２＞
ＲＩＹＰＧＤＧＤＩＹＹＮＧＫＦＫＧ （配列番号：２４）
＜１０ｂ２Ｍ３重鎖可変領域のＣＤＲ３＞
ＴＦＮＹＰＦＦＡＹ （配列番号：２５）
＜１０ｂ２Ｍ３軽鎖可変領域＞
ＤＩＬＭＴＱＳＰＳＳＬＴＶＳＴＧＥＫＶＴＭＳＣＫＳＳＱＳＬＬＡＳＡＮＱＮＮＹＬＡＷＨＱＱＫＰＧＲＳＰＫＭＬＩＩＷＡＳＴＲＶＳＧＶＰＤＲＦＩＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＮＳＶＱＡＥＤＬＡＶＹＹＣＱＱＳＹＳＡＰＴＴＦＧＡＧＴＫＬ
（配列番号：２２）
＜１０ｂ２Ｍ３軽鎖可変領域のＣＤＲ１＞
ＫＳＳＱＳＬＬＡＳＡＮＱＮＮＹＬＡ （配列番号：１９）
＜１０ｂ２Ｍ３軽鎖可変領域のＣＤＲ２＞
ＷＡＳＴＲＶＳ （配列番号：２０）
＜１０ｂ２Ｍ３軽鎖可変領域のＣＤＲ３＞
ＱＱＳＹＳＡＰＴＴ （配列番号：２１）
（実施例８）
＜８ａ４キメラ抗体、１０ｂＭ３キメラ抗体及び１０ｂ２Ｍ３キメラ抗体の作製＞
本発明のマウスモノクローナル抗体（８ａ４、１０ｂＭ３及び１０ｂ２Ｍ３）の定常領域をヒトＩｇＧ１由来のものに置換したキメラ抗体を、以下に示す方法にて作製した。

実施例７において決定した遺伝子配列をもとに以下のＰＣＲ増幅用プライマーを設計し、ＰＣＲによって抗体可変領域を増幅した。この際、分泌シグナル配列はロンザ社推奨の配列に変換し、また増幅断片の末端に制限酵素認識配列を付加した（重鎖可変領域はＨｉｎｄＩＩＩ認識配列及びＸｈｏＩ認識配列、軽鎖可変領域はＨｉｎｄＩＩＩ及びＢｓｉＷＩ認識配列を付加）。

＜８ａ４重鎖＞
８ａ４＿ＶＨ＿Ｆ＿ｓｉｇｎａｌ＿ＨｉｎｄＩＩＩ：
５’−ＡＴＡＴＡＡＡＧＣＴＴＡＣＣＡＴＧＧＡＡＴＧＧＡＧＣＴＧＧＧＴＧＴＴＣＣＴＧＴＴＣＴＴＴＣＴＧＴＣＣＧＴＧＡＣＣＡＣＡＧＧＣＧＴＧＣＡＴＴＣＴＧＡＧＧＴＴＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＡＧＴＣＴＧＧＧ−３’
（配列番号：５７、下線部はＨｉｎｄＩＩＩ認識配列）
８ａ４＿ＶＨ＿Ｒ＿ＸｈｏＩ：
５’−ＡＴＡＴＡＣＴＣＧＡＧＡＣＡＧＴＧＡＣＣＡＧＡＧＴＣＣＣＴＡＧＧＣＣ−３’
（配列番号：５８、下線部はＸｈｏＩ認識配列）
＜８ａ４軽鎖＞
８ａ４＿ＶＫ＿Ｆ＿ｓｉｇｎａｌ＿ＨｉｎｄＩＩＩ：
５’−ＡＴＡＴＡＡＡＧＣＴＴＡＣＣＡＴＧＴＣＴＧＴＧＣＣＴＡＣＣＣＡＧＧＴＧＣＴＧＧＧＡＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴＧＧＣＴＧＡＣＡＧＡＣＧＣＣＣＧＣＴＧＴＧＡＴＧＴＴＴＴＧＡＴＧＡＣＣＣＡＡＡＣＴＣＣＡＣＴＣＴＣＣ−３’
（配列番号：５９、下線部はＨｉｎｄＩＩＩ認識配列）
８ａ４／１０ｂ２Ｍ３＿ＶＫ＿Ｒ＿ＢｓｉＷＩ：
５’−ＡＴＡＴＡＣＧＴＡＣＧＴＴＴＴＡＴＴＴＣＣＡＧＣＴＴＧＧＴＣＣＣＡＧＣＡＣＣＧＡＡＣ−３’（配列番号：６０、下線部はＢｓｉＷＩ認識配列）
＜１０ｂＭ３重鎖＞
１０ｂＭ３＿ＶＨ＿Ｆ＿ｓｉｇｎａｌ＿ＨｉｎｄＩＩＩ：
５’−ＡＴＡＴＡＡＡＧＣＴＴＡＣＣＡＴＧＧＡＡＴＧＧＡＧＣＴＧＧＧＴＧＴＴＣＣＴＧＴＴＣＴＴＴＣＴＧＴＣＣＧＴＧＡＣＣＡＣＡＧＧＣＧＴＧＣＡＴＴＣＴＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧ−３’
（配列番号：６１、下線部はＨｉｎｄＩＩＩ認識配列）
１０ｂＭ３＿ＶＨ＿Ｒ＿ＸｈｏＩ：
５’−ＡＴＡＴＡＣＴＣＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＴＧＡＧＧＴＴＣＣＴＴＧＡＣＣ−３’
（配列番号：６２、下線部はＸｈｏＩ認識配列）
＜１０ｂＭ３軽鎖＞
１０ｂＭ３＿ＶＫ＿Ｆ＿ｓｉｇｎａｌ＿ＨｉｎｄＩＩＩ：
５’−ＡＴＡＴＡＡＡＧＣＴＴＡＣＣＡＴＧＴＣＴＧＴＧＣＣＴＡＣＣＣＡＧＧＴＧＣＴＧＧＧＡＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴＧＧＣＴＧＡＣＡＧＡＣＧＣＣＣＧＣＴＧＴＧＡＣＡＴＴＧＴＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣ−３’
（配列番号：６３、下線部はＨｉｎｄＩＩＩ認識配列）
１０ｂＭ３＿ＶＫ＿Ｒ＿ＢｓｉＷＩ：
５’−ＡＴＡＴＡＣＧＴＡＣＧＴＴＴＴＡＧＣＴＣＣＡＡＣＴＴＧＧＴＣＣＣＡＣＣＡＣＣ−３’
（配列番号：６４、下線部はＢｓｉＷＩ認識配列）
＜１０ｂ２Ｍ３重鎖＞
１０ｂ２Ｍ３＿ＶＨ＿Ｆ＿ｓｉｇｎａｌ＿ＨｉｎｄＩＩＩ：
５’−ＡＴＡＴＡＡＡＧＣＴＴＡＣＣＡＴＧＧＡＡＴＧＧＡＧＣＴＧＧＧＴＧＴＴＣＣＴＧＴＴＣＴＴＴＣＴＧＴＣＣＧＴＧＡＣＣＡＣＡＧＧＣＧＴＧＣＡＴＴＣＴＣＡＧＧＴＴＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＡＧＴＣＴＧＧ−３’
（配列番号：６５、下線部はＨｉｎｄＩＩＩ認識配列）
１０ｂ２Ｍ３＿ＶＨ＿ＸｈｏＩ：
５’−ＴＡＧＣＧＣＴＣＧＡＧＡＣＡＧＴＧＡＣＣＡＧＡＧＴ−３’
（配列番号：６６、下線部はＸｈｏＩ認識配列）
＜１０ｂ２Ｍ３軽鎖＞
１０ｂ２Ｍ３＿ＶＫ＿Ｆ＿ｓｉｇｎａｌ＿ＨｉｎｄＩＩＩ：
５’−ＡＴＡＴＡＡＡＧＣＴＴＡＣＣＡＴＧＴＣＴＧＴＧＣＣＴＡＣＣＣＡＧＧＴＧＣＴＧＧＧＡＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴＧＧＣＴＧＡＣＡＧＡＣＧＣＣＣＧＣＴＧＴＧＡＣＡＴＴＴＴＧＡＴＧＡＣＴＣＡＧＴＣＴＣＣ−３’
（配列番号：６７、下線部はＨｉｎｄＩＩＩ認識配列）
８ａ４／１０ｂ２Ｍ３＿ＶＫ＿Ｒ＿ＢｓｉＷＩ：
５’−ＡＴＡＴＡＣＧＴＡＣＧＴＴＴＴＡＴＴＴＣＣＡＧＣＴＴＧＧＴＣＣＣＡＧＣＡＣＣＧＡＡＣ−３’
（配列番号：６０、下線部はＢｓｉＷＩ認識配列）。

得られたＰＣＲ産物を上記の制限酵素で切断し、常法によって、ヒトＩｇＧ１の定常領域を組み込んだロンザ社のヒトＩｇＧ１抗体産生用ベクターに挿入した。これらのベクターを使用して、ロンザ社推奨プロトコルに基づいてキメラ抗体産生細胞株を樹立し、それらの培養上清からＰｒｏｔｅｉｎＡを用いてキメラ抗体（８ａ４キメラ抗体、１０ｂＭ３キメラ抗体及び１０ｂ２Ｍ３キメラ抗体）を精製した。このようにして得られたキメラ抗体に関し、８ａ４キメラ抗体をｃｈ−８ａ４、１０ｂＭ３キメラ抗体をｃｈ−１０ｂＭ３、１０ｂ２Ｍ３キメラ抗体をｃｈ−１０ｂ２Ｍ３とも以下、称する。

（実施例９）
＜８ａ４キメラ抗体、１０ｂＭ３キメラ抗体及び１０ｂ２Ｍ３キメラ抗体の反応性＞
得られたキメラ抗体のＮＲＧ１に対する反応性を、フローサイトメトリー及び酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）によって確認した。フローサイトメトリーは前述と同様の方法で行った。なお、フローサイトメトリーにおいて、一次抗体として各キメラ抗体又はコントロール抗体を５ｕｇ／ｍＬに希釈したものを、二次抗体として１／１００希釈したＰＥ標識抗ヒトＩｇＧ抗体（ベックマンコールター社製：ＩＭ０５５０）を用いた。得られた結果を図１６に示す。

図１６に示した結果から明らかなように、ｃｈ−８ａ４はＮＲＧ１−ａに、ｃｈ−１０ｂＭ３及びｃｈ−１０ｂ２Ｍ３はＮＲＧ１−ｂに反応し、活性を維持していることが示された。また、ｃｈ−８ａ４の反応性は前に前記キメラ化前（８ａ４）のものより向上しているように見られたため、さらに、抗体低濃度条件での平均蛍光強度についてもデータを取得した。すなわち、８ａ４、ｃｈ−８ａ４及びコントロール抗体をそれぞれ５ｕｇ／ｍＬを最大濃度としてＰＢＳで段階希釈し、各濃度でのフローサイトメトリーの平均蛍光強度を解析した。その結果、図１７に示す通り、８ａ４はキメラ化することによって予想外に反応性が向上していることが明らかになった。

また、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）を、一次抗体として各キメラ抗体を５ｕｇ／ｍＬに希釈したものを、二次抗体として１／５０００希釈したＨＲＰ標識抗ヒトＩｇＧ抗体（ＭＢＬ社製：２０６）を用い、前述と同様の方法で行った。その結果、図１８〜２０に示す通り、各キメラ抗体はもとのマウス抗体と同等の反応特異性を有していることが明らかになった。

（実施例１０）
＜８ａ４キメラ抗体、１０ｂＭ３キメラ抗体及び１０ｂ２Ｍ３キメラ抗体のＮＲＧ１切断阻害活性＞
実施例８において作製したキメラ抗体の切断阻害活性も、前述と同様の方法で解析した。その結果、図２１及び２２に示す通り、細胞膜上ＮＲＧ１の切断を誘導した際のフローサイトメトリーでの蛍光強度は、前述のマウス抗体の切断阻害活性を解析した場合と同様の挙動を見せた。従って、各キメラ抗体はもとのマウス抗体と同様の切断阻害活性を有していることが明らかになった。

（実施例１１）
＜ゼノグラフトマウス（初期癌モデル）を用いた抗腫瘍活性評価＞
取得した抗ＮＲＧ１抗体の抗腫瘍活性を判定するため、ゼノグラフトマウスを用いて評価を行った。ヒト肺癌細胞株 ＡＣＣ−ＬＣ−１７６（名古屋大学所属の高橋隆らが樹立したものを、同大学から受領）をＲＰＭＩ−１０％ＦＢＳ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ含有）で培養し、ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ Ｔｙｐｅ Ｉ（ＧＩＢＣＯ社製：１７１００−０１７）を２ｍｇ／ｍＬとなるようにＣｅｌｌ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ ｅｎｚｙｍｅ ｆｒｅｅ ＰＢＳ−ｂａｓｅｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製：１３１５１−０１４）に添加した溶液で、剥離した。洗浄後、ＲＰＭＩ１６４０培地で１ｘ１０^７細胞数／ｍＬとなるように縣濁した。Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ社製：３５４２３０）を等量加えて縣濁したのち、６週齢メスのＳＣＩＤマウス（日本クレア社製：Ｃ．Ｂ１７／Ｉｃｒ−ｓｃｉｄ Ｊｃｌ）の右腹側部に２００ｕＬずつ皮下移植した。同日から、１ｍｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳで希釈した抗体溶液又はＰＢＳを３００ｕＬずつ腫瘍局所投与した。用いた抗体は、８ａ２、８ａ４、８ａ４キメラ抗体、１０ｂ２Ｍ３、１０ｂ２Ｍ３キメラ抗体の５種類であり、それぞれマウス６匹ずつに投与した。投与は移植当日と６日目、１０日目、１４日目、２１日目および２８日目の計６回行った。腫瘍が観察された時点からノギスで腫瘍径を測定し、腫瘍体積を以下の式により算出した。
腫瘍体積（ｍｍ^３）＝長径×短径^２×０．５
得られた結果を図２３〜２５に示す。

また、前記抗体投与後のゼノグラフトマウスの生存率についても分析した。得られた結果を図２６に示す。

図２３に示した結果から明らかなように、８ａ２抗体については、抗腫瘍活性においてもコントロール抗体との間で有意差は見られなかった。一方、図２４及び２５に示した結果から明らかなように、８ａ４抗体投与群、１０ｂ２Ｍ３抗体投与群、ｃｈ−８ａ４抗体投与群及びｃｈ−１０ｂ２Ｍ３抗体投与群の腫瘍体積は、コントロール群と比較して、移植後３８日でそれぞれ７．７％、０％、０％及び１６．２％であり、４９日目でそれぞれ８．３％、０％、０％及び１５．４％であり、最後に確認した８０日目でも、１９．２％、０％、０％及び２６．７％であった。従って、本発明の抗ＮＲＧ１抗体は、腫瘍増大を有意に阻害できることが明らかになった（Ｐ＜０．０５）。

また、生存率に関しては、図２６に示した結果から明らかなように、コントロール群では、約１００日後に全個体死亡したのに対し、８ａ４抗体投与群、１０ｂ２Ｍ３抗体投与群、ｃｈ−８ａ４抗体投与群及びｃｈ−１０ｂ２Ｍ３抗体投与群では、約１００日を経過しても、全個体が生存しており、本発明の抗体による延命効果が示された。特に、ｃｈ−１０ｂ２Ｍ３抗体投与群、１０ｂ２Ｍ３抗体投与群及び８ａ４抗体投与群では３００日経過後もなお、５０％以上の個体が生存していた。従って、８ａ４、１０ｂ２Ｍ３、ｃｈ−８ａ４及びｃｈ−１０ｂ２Ｍ３は、抗腫瘍効果を有していることが明らかになった。

以上説明したように、本発明によれば、ヒトＮＲＧ１タンパク質のアイソフォームを特異的に認識し、かつ当該アイソフォームが関与するシグナル伝達を抑制することを可能とする抗体を提供することが可能となる。また、本発明の抗体は、腫瘍の増殖を抑制する活性においても優れるため、癌を治療又は予防する点においても有用である。

配列番号：３
＜２２３＞ 軽鎖可変領域のＣＤＲ１（８ａ４）
配列番号：４
＜２２３＞ 軽鎖可変領域のＣＤＲ２（８ａ４）
配列番号：５
＜２２３＞ 軽鎖可変領域のＣＤＲ３（８ａ４）
配列番号：６
＜２２３＞ 軽鎖可変領域（８ａ４）
配列番号：７
＜２２３＞ 重鎖可変領域のＣＤＲ１（８ａ４）
配列番号：８
＜２２３＞ 重鎖可変領域のＣＤＲ２（８ａ４）
配列番号：９
＜２２３＞ 重鎖可変領域のＣＤＲ３（８ａ４）
配列番号：１０
＜２２３＞ 重鎖可変領域（８ａ４）
配列番号：１１
＜２２３＞ 軽鎖可変領域のＣＤＲ１（１０ｂＭ３）
配列番号：１２
＜２２３＞ 軽鎖可変領域のＣＤＲ２（１０ｂＭ３）
配列番号：１３
＜２２３＞ 軽鎖可変領域のＣＤＲ３（１０ｂＭ３）
配列番号：１４
＜２２３＞ 軽鎖可変領域（１０ｂＭ３）
配列番号：１５
＜２２３＞ 重鎖可変領域のＣＤＲ１（１０ｂＭ３）
配列番号：１６
＜２２３＞ 重鎖可変領域のＣＤＲ２（１０ｂＭ３）
配列番号：１７
＜２２３＞ 重鎖可変領域のＣＤＲ３（１０ｂＭ３）
配列番号：１８
＜２２３＞ 重鎖可変領域（１０ｂＭ３）
配列番号：１９
＜２２３＞ 軽鎖可変領域のＣＤＲ１（１０ｂ２Ｍ３）
配列番号：２０
＜２２３＞ 軽鎖可変領域のＣＤＲ２（１０ｂ２Ｍ３）
配列番号：２１
＜２２３＞ 軽鎖可変領域のＣＤＲ３（１０ｂ２Ｍ３）
配列番号：２２
＜２２３＞ 軽鎖可変領域（１０ｂ２Ｍ３）
配列番号：２３
＜２２３＞ 重鎖可変領域のＣＤＲ１（１０ｂ２Ｍ３）
配列番号：２４
＜２２３＞ 重鎖可変領域のＣＤＲ２（１０ｂ２Ｍ３）
配列番号：２５
＜２２３＞ 重鎖可変領域のＣＤＲ３（１０ｂ２Ｍ３）
配列番号：２６
＜２２３＞ 重鎖可変領域（１０ｂ２Ｍ３）
配列番号：２７〜３５、３７〜５１及び５４〜６７
＜２２３＞ 人工的に合成されたプライマーの配列
配列番号：３６
＜２２３＞ 人工的に合成されたオリゴヌクレオチドの配列

Claims (11)

1. 配列番号：１に示されるヒトＮＲＧ１−αタンパク質における２２１〜２３４位の領域又は配列番号：２に示されるヒトＮＲＧ１−β１タンパク質における２１３〜２３９位の領域に結合する抗体であって、下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載の特徴を有する、抗体
   （ａ） 配列番号：３〜５に記載のアミノ酸配列を各々相補性決定領域１〜３として含む軽鎖可変領域と、配列番号：７〜９に記載のアミノ酸配列を各々相補性決定領域１〜３として含む重鎖可変領域とを保持する
   （ｂ） 配列番号：１１〜１３に記載のアミノ酸配列を各々相補性決定領域１〜３として含む軽鎖可変領域と、配列番号：１５〜１７に記載のアミノ酸配列を各々相補性決定領域１〜３として含む重鎖可変領域とを保持する
   （ｃ） 配列番号：１９〜２１に記載のアミノ酸配列を各々相補性決定領域１〜３として含む軽鎖可変領域と、配列番号：２３〜２５に記載のアミノ酸配列を各々相補性決定領域１〜３として含む重鎖可変領域とを保持する。
2. 配列番号：１に示されるヒトＮＲＧ１−αタンパク質における２２１〜２３４位の領域又は配列番号：２に示されるヒトＮＲＧ１−β１タンパク質における２１３〜２３９位の領域に結合する抗体であって、下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載の特徴を有する、請求項１に記載の抗体
   （ａ） 配列番号：６に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、又は、
   配列番号：６に記載のアミノ酸配列のフレームワーク領域において１〜１０のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、
   配列番号：１０に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、又は、
   配列番号：１０に記載のアミノ酸配列のフレームワーク領域において１〜１０のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを保持する
   （ｂ） 配列番号：１４に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、又は、
   配列番号：１４に記載のアミノ酸配列のフレームワーク領域において１〜１０のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、
   配列番号：１８に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、又は、
   配列番号：１８に記載のアミノ酸配列のフレームワーク領域において１〜１０のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列とを含む重鎖可変領域とを保持する
   （ｃ） 配列番号：２２に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、又は、
   配列番号：２２に記載のアミノ酸配列のフレームワーク領域において１〜１０のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、
   配列番号：２６に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、又は、
   配列番号：２６に記載のアミノ酸配列のフレームワーク領域において１〜１０のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを保持する。
3. 配列番号：１に示されるヒトＮＲＧ１−αタンパク質又は配列番号：２に示されるヒトＮＲＧ１−β１タンパク質の切断を抑制する活性を有する、請求項１又は２に記載の抗体。
4. 配列番号：１に示されるヒトＮＲＧ１−αタンパク質又は配列番号：２に示されるヒトＮＲＧ１−β１タンパク質による刺激に応答した、癌細胞におけるＥｒｂＢ３タンパク質のリン酸化を抑制する活性を有する、請求項１〜３のうちのいずれか一項に記載の抗体。
5. ｉｎ ｖｉｖｏにおいて腫瘍の増殖を抑制する活性を有する、請求項１〜４のうちのいずれか一項に記載の抗体。
6. 請求項１〜５のうちのいずれか一項に記載の抗体をコードするＤＮＡ。
7. 請求項１〜５のうちのいずれか一項に記載の抗体を産生する、又は、請求項６に記載のＤＮＡを含む、ハイブリドーマ。
8. 請求項１〜５のうちのいずれか一項に記載の抗体を産生する、又は、請求項６に記載のＤＮＡを含む、宿主細胞。
9. 請求項１〜５のうちのいずれか一項に記載の抗体を作製するための方法であって、
   請求項７に記載のハイブリドーマ又は請求項８に記載の宿主細胞を培養し、前記ハイブリドーマ、前記宿主細胞又はそれら培養液から、抗体を分離、精製する工程を含む方法。
10. 請求項１〜５のうちのいずれか一項に記載の抗体を有効成分とする、癌を治療又は予防するための組成物。
11. 配列番号：１に示されるヒトＮＲＧ１−αタンパク質における２２１〜２３４位の領域又は配列番号：２に示されるヒトＮＲＧ１−β１タンパク質における２１３〜２３９位の領域に結合する抗体を有効成分とする、癌を治療又は予防するための組成物。