JP6289951B2 - 薄膜生体分子検出素子、生体分子検出方法、及び生体分子検出装置 - Google Patents

Description

本発明の実施形態は、薄膜生体分子検出素子、生体分子検出方法、及び生体分子検出装置に関する。

バイオセンサーとは、酵素、免疫反応系、組織、又は細胞を介する選択的な化学反応で化学物質を電気、熱、光信号として検出する素子である。近年、バイオセンサーの中でも、腫瘍マーカーを高精度で検出する素子が注目を集めている。その中でも特定のタンパク質を蛍光プローブ法で検出する方法は、簡便かつ安価なセンシングが可能であるため、さかんに研究開発が行われている。
しかしながら、従来のバイオセンサーは、認識精度に劣る場合があった。

ＮＴＴ技術ジャーナル（２０１３．６、ｐ２７〜ｐ３０） Furukawa K., et al., Journal of Materials Chemistry B, vol 1, 1119-1124, 2013 CREST 研究領域「医療に向けた化学、生物系分子を利用したバイオ素子、システムの創製」（研究終了報告書 研究期間 平成１４年１１月〜平成１８年１０月）

本発明が解決しようとする課題は、生体分子を高精度で検出することができる薄膜生体分子検出素子、生体分子検出方法、及び生体分子検出装置を提供することである。

実施形態の薄膜生体分子検出素子は、基板と、基板吸着部と、リンカーと、希土類錯体とを持つ。基板吸着部は、基板上に設けられている。リンカーは、一端を介して基板吸着部に接着している。希土類錯体は、リンカーの他端に結合している。

第１の実施形態の薄膜生体分子検出素子を示す概略構成図。 第２の実施形態の薄膜生体分子検出素子を示す概略構成図。 第３の実施形態の薄膜生体分子検出素子を示す概略構成図。 第１の実施形態の生体分子検出装置を示す概略構成図。

以下、実施形態の薄膜生体分子検出素子を、図面を参照して説明する。

［薄膜生体分子検出素子］
（第１の実施形態）
実施形態の薄膜生体分子検出素子７は、図１に示すように、基板２と、該基板２上に設けられた基板吸着部１と、該基板吸着部１に、一端を介して接着したリンカー６と、該リンカー６の他端に結合した希土類錯体４と、を持つバイオセンサーである。図１（Ａ）は、ｉｎｉｔｉａｌの薄膜生体分子検出素子７を示し、図１（Ｂ）は、生体分子５が結合した場合の薄膜生体分子検出素子７を示す。

希土類錯体４は、アミノ基やリン酸基と配位結合することにより、タンパク質や核酸等の生体分子５と相互作用をする。
希土類錯体４は、以下の特徴を有する。
第一に、一般の有機蛍光体の発光寿命は、ナノ秒オーダーであるのに対して、希土類錯体の発光寿命は、サブミリ秒オーダーと長い。
第二に、一般の有機蛍光体は溶媒が変わるとスペクトルがシフトするのに対して、希土類錯体はｆ−ｆ遷移に基づく発光を示すことから、様々な波長の光を吸収しても、発する蛍光は一定の波長のものに収束する。
第三に、希土類錯体の発光は、磁気双極子遷移及び電気双極子遷移から構成され、磁気双極子遷移に由来する発光スペクトル形状は、常に一定である一方、電気双極子遷移に由来する発光スペクトル形状は配位環境に大きく依存する。この磁気双極子遷移と電気双極子遷移の比をブランチング比という。ブランチング比は、配位子の構造によって変化するため、ブランチング比で配位環境を特定することができる。
希土類錯体４はこれらの特徴を有するため、生体分子と相互作用することにより、希土類錯体の発光強度比、発光寿命、及び発光スペクトルの電気双極子遷移と磁気双極子遷移の発光強度比から算出されるブランチング比からなる群から選ばれる少なくとも一つの情報から生体分子を検出・特定することができる。
また、細胞等の生体分子は、紫外線を照射すると、自家蛍光として、ナノ秒オーダーの発光をする。一方、希土類錯体の発光寿命は、サブミリ秒オーダーであるため、時間分解測定により希土類錯体由来の蛍光と自家蛍光を分離することができ、測定時のバックグラウンドを低減することができる。
このように、希土類錯体４を用いることにより、生体分子を高いＳ／Ｎ比で高感度に検出することができる。

希土類錯体としては、例えば、以下の式（１）で表わされる基と、希土類イオンとの錯体が挙げられる。前記希土類イオンとしては、Ｔｂ³⁺、Ｅｕ³⁺、Ｄｙ³⁺、Ｓｍ³⁺等が挙げられ、Ｔｂ³⁺、Ｅｕ³⁺が好ましい。

（式中、Ｒ^５はフッ素原子で置換されていてもよい炭素数１〜６のアルキル基を示し、Ｒ^６は炭素数１〜６のアルキル基又は炭素数６〜２０のアリール基を示す。）

前記Ｒ^５のフッ素原子で置換されていてもよい炭素数１〜６のアルキル基としては、具体的にはメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ −ブチル基、ｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、これらの基の水素原子がフッ素原子で置換された基が挙げられる。検出感度を向上させる観点から、炭素数１〜６のパーフルオロアルキル基が好ましく、トリフルオロメチル基、ヘプタフルオロプロピル基がより好ましい。
前記Ｒ^６の炭素数１〜６のアルキル基としては、前記Ｒ^５と同様のものが挙げられ、溶媒に対する溶解性の観点から、ｔ−ブチル基が好ましい。
前記Ｒ^６の炭素数６〜２０のアリール基としては、フェニル基、ナフチル基が挙げられ、ナフチル基が好ましい。
長波長側の光を吸収する観点から、前記Ｒ^６は、炭素数６〜２０のアリール基が好ましい。

Ｒ^５とＲ^６としては、炭素数１〜６のパーフルオロアルキル基と炭素数１〜６のアルキル基の組み合わせ、炭素数１〜６のパーフルオロアルキル基と炭素数６〜２０のアリール基の組み合わせが好ましく、トリフルオロメチル基とナフチル基の組み合わせ、ヘプタフルオロプロピル基とｔ−ブチル基の組み合わせが挙げられる。これらは、検出対象に合わせて適宜選択できる。

実施形態に用いる希土類錯体は蛍光性のものであり、発光強度が大きいユーロピウム錯体またはテルビウム錯体が好ましい。６配位の錯体を用い、相互作用時に７配位以上になることにより発光強度、発光寿命、ブランチング比が大きく変化するものがより好ましい。

実施形態において、基板２の表面の少なくとも一部は、酸化グラフェンが固定されてなる。基板２として、例えばガラス基板上に酸化グラフェンを転写したものを用いることができる。酸化グラフェンは、蛍光クエンチャーであり、希土類錯体４から発せられる蛍光が、希土類錯体４と基板２との距離によって変化する。
即ち、希土類錯体４が生体分子５を捕捉していない場合には、希土類錯体４と基板２は近接しており、酸化グラフェンのクエンチング効率は最大となっている。希土類錯体４が生体分子５を捕捉した場合には、希土類錯体４と基板２の距離は遠くなり、酸化グラフェンンによるクエンチング効率は低下する。
従って、基板２に酸化グラフェンを用いることにより、生体分子５をより高いＳ／Ｎ比で検出することができる。

基板吸着部１は、基板２に物理的に吸着する分子であれば特に限定されず、一例としてピレン骨格を有する分子が挙げられる。図１に示すように、酸化グラフェンの一部には、グラフェン構造を維持した領域であるＳＰ２ドメイン３が点在する。ＳＰ２ドメイン３には、ベンゼン環４個が連結した構造のピレンと呼ばれる分子が強く吸着される。従って、ピレン骨格を有する分子は、酸化グラフェン等の炭素材料との親和性が高い観点から好ましい。

リンカー６は、一端に基板吸着部１と結合し、他端に希土類錯体４と結合して、基板吸着部１と希土類錯体４を接続するものであれば特に限定されず、核酸、ペプチド等が挙げられる。

実施形態によれば、希土類錯体の発光強度比、発光寿命、及び発光スペクトルの電気双極子遷移と磁気双極子遷移の発光強度比から算出されるブランチング比からなる群から選ばれる少なくとも一つの情報から生体分子を検出・特定することができる。また、基板に酸化グラフェンを用いることにより、生体分子をより高いＳ／Ｎ比で検出することができる。

（第２の実施形態）
実施形態の薄膜生体分子検出素子１１は、図２に示すように、基板２と、該基板２上に設けられた基板吸着部１と、該基板吸着部１に、一端を介して接着したアプタマー１４と、該アプタマー１４の他端に結合した希土類錯体４と、を持つバイオセンサーである。図２（Ａ）は、ｉｎｉｔｉａｌの薄膜生体分子検出素子１１を示し、図２（Ｂ）は、生体分子５が結合した場合の薄膜生体分子検出素子１１を示す。実施形態の薄膜生体分子検出素子１１は、リンカーとしてアプタマー１４を用いている点で、図１に示す薄膜生体分子検出素子７と相違し、その他の構成は薄膜生体分子検出素子７と同じである。
尚、図２において、図１に示す構成要素と同一のものについては同じ符号を用いている。

実施形態において、アプタマー１４は、標的とする生体分子に対する結合活性を有する核酸である。本実施形態のアプタマー１４は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、修飾ヌクレオチド又はそれらの混合物からなる。アプタマー１４の長さは特に限定されず、１６〜２００塩基が好ましく、１００塩基以下がより好ましく、５０塩基以下が特に好ましい。

アプタマー１４が、標的とする生体分子５と結合すると、特定の構造へと変化する。この構造変化により、希土類錯体４と基板２の距離が変化する。
実施形態によれば、アプタマーによる生体分子識別機能により、標的とする生体分子をより特異的に検出することができる。

（第３の実施形態）
実施形態の薄膜生体分子検出素子２１は、図３に示すように、基板２と、該基板２上に設けられた基板吸着部１と、該基板吸着部１に、一端を介して接着した、腫瘍関連分子を標的とするアプタマー２４と、該アプタマー２４の他端に結合した希土類錯体４と、を持つバイオセンサーである。実施形態の薄膜生体分子検出素子２１は、アプタマー２４として腫瘍関連分子を標的とするものを用いている点で、図２に示す薄膜生体分子検出素子１１と相違し、その他の構成は薄膜生体分子検出素子１１と同じである。
尚、図３において、図２に示す構成要素と同一のものについては同じ符号を用いている。

腫瘍関連分子は、がん遺伝子又はがん抑制遺伝子によってコードされるタンパク質であることが好ましい。
がん遺伝子としては、テロメラーゼをコードする遺伝子；ｓｉｓ等の増殖因子をコードする遺伝子群；ｅｒｂＢ、ｆｍｓ、ｒｅｔ等のレセプター型チロシンキナーゼをコードする遺伝子群；ｆｅｓ等の非レセプター型チロシンキナーゼをコードする遺伝子群；ｒａｓ等のＧＴＰ／ＧＤＰ結合タンパク質をコードする遺伝子群；ｓｒｃ、ｍｏｓ、ｒａｆ等のセリン／スレオニンキナーゼをコードする遺伝子群；ｍｙｃ、ｍｙｂ、ｆｏｓ、ｊｕｎ、ｅｒｂＡ等の核内タンパク質をコードする遺伝子群；ｃｒｋ等のシグナル伝達アダプター分子をコードする遺伝子群；Ｂｃｒ−Ａｂｌ等の融合遺伝子が挙げられる。
更に、がん遺伝子として、Ｓｈｃ、Ｇｒｂ２、Ｓｏｓ、ＭＥＫ、Ｒｈｏ、Ｒａｃ遺伝子等のＲａｓ−ＭＡＰキナーゼ経路関連遺伝子；ＰＬＣγ、ＰＫＣ等のホスホリパーゼＣガンマ-プロテインキナーゼＣ経路関連遺伝子；ＰＩ３Ｋ、Ａｋt、Ｂａｄ等のＰＩ３Ｋ−Ａｋt経路関連遺伝子；ＪＡＫ、ＳＴＡＴ等のＪＡＫ−ＳＴＡＴ経路関連遺伝子；ＧＡＰ、ｐ１８０、ｐ６２等のＧＡＰ系経路関連遺伝子が挙げられる。

がん抑制遺伝子としては、ＲＢ、ｐ５３、ＷＴ１、ＮＦ１、ＡＰＣ、ＶＨＬ、ＮＦ２、ｐ１６、ｐ１９、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＰＴＥＮ、Ｅカドヘリン遺伝子等が挙げられる。

実施形態によれば、アプタマーによる生体分子識別機能により、標的とする生体分子をより特異的に検出することができる。従って、実施形態によれば、複数種類の腫瘍関連分子を標的とするアプタマーを持つ薄膜生体分子検出素子を複数揃えることにより、複数の腫瘍マーカーを高精度で検出できる。

また、アプタマーが認識する腫瘍関連分子は、１種類の癌腫から抽出される複数の腫瘍関連分子であってもよい。即ち、実施形態の薄膜生体分子検出素子２１は、癌腫別診断用であってもよい。

癌腫としては、皮膚癌、肺癌、大腸癌、胃癌、乳癌、前立腺癌、甲状腺癌等が挙げられる。上述したがん遺伝子及びがん抑制遺伝子をはじめとして、癌腫特異的な遺伝子の発現／変異パターンが存在することが報告されている。そのため、癌腫ごとの遺伝子発現プロファイル等に基づいて、薄膜生体分子検出素子を作製することにより、検出の精度を高めることができる。

以上説明した少なくともひとつの実施形態によれば、希土類錯体を持つことにより、希土類錯体の発光強度比、発光寿命、及び発光スペクトルの電気双極子遷移と磁気双極子遷移の発光強度比から算出されるブランチング比からなる群から選ばれる少なくとも一つの情報から生体分子を、高精度に検出・特定することができる。

［生体分子検出方法］
実施形態の生体分子検出方法は、上述した各実施形態の薄膜生体分子検出素子を用いて、発光スペクトル、発光寿命、及びブランチング比からなる群から選ばれる少なくとも一つから生体分子を特定する方法である。実施形態において、検出目的とするタンパク質が希土類錯体と相互作用した時の発光強度、発光寿命、ブランチング比のデータを予めデータベース化しておく。そして、薄膜生体分子検出素子から得られる信号と照合することにより、生体分子を特定することができる。
実施形態によれば、希土類錯体を持つことにより、発光スペクトル、発光寿命、及びブランチング比からなる群から選ばれる少なくとも一つの情報から、相互作用した生体分子を高精度に検出・特定することができる。

［生体分子検出装置］
実施形態の生体分子検出装置３１は、図４に示すように、薄膜生体分子検出素子３２と、二波長同時検出装置３３とを持つ。
二波長同時検出装置３３は、発光スペクトル、発光寿命、及びブランチング比からなる群から選ばれる少なくとも一つから、薄膜生体分子検出素子３２の錯体またはアプタマーに吸着したタンパク質等の生体分子を特定する装置である。
更に、実施形態の生体分子検出装置３１は、パソコンなどの制御部３４を有する。
実施形態によれば、希土類錯体との相互作用から得られる生体分子の発光スペクトル、発光寿命、及びブランチング比の多数の情報をデータベース化することにより、相互作用した生体分子を高精度に検出・特定することができる。

以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

［実施例１］
酢酸エチルに下記式（２）に示すユーロピウム錯体溶解液、式（２）に示すユーロピウム錯体、及びトリフェニルホスフィンオキシド（ＴＰＰＯ）溶解液、式（２）に示すユーロピウム錯体、及びトリオクチルホスフィンオキシド（ＴＯＰＯ）溶解液、並びに、式（２）に示すユーロピウム錯体、トリフェニルホスフィンオキシド、及びトリオクチルホスフィンオキシド溶解液を調製し、それぞれの溶液の発光寿命を測定した。結果を表１に示す。表１に示すように、６配位のユーロピウム錯体単独の場合と比較して、これに種類が異なるホスフィンオキシドが配位することにより、発光寿命は鋭敏に変化することが確認された。
即ち、希土類錯体は、配位状況の変化に応じた発光寿命の変化を示す性質があり、生体分子の判別が可能であることが確認された。

［実施例２］
酢酸エチルに下記式（３）に示す８配位の希土類錯体を溶解し、発光スペクトルからブランチング比の計測を行った。結果を表２に示す。表２に示すように、配位子の分子構造の違いにより、ブランチング比が特異的に変化することが確認された。このことから、ブランチング比により生体分子識別機能があることが確認された。

本発明のいくつかの実施形態を説明したが、これらの実施形態は、例として提示したものであり、発明の範囲を限定することは意図していない。これら実施形態は、その他の様々な形態で実施されることが可能であり、発明の要旨を逸脱しない範囲で、種々の省略、置き換え、変更を行うことができる。これら実施形態やその変形は、発明の範囲や要旨に含まれると同様に、特許請求の範囲に記載された発明とその均等の範囲に含まれるものである。

１…基板吸着部、２…基板、３…ＳＰ２領域、４…希土類錯体、５…生体分子、６…リンカー、７…薄膜生体分子検出素子、１１…薄膜生体分子検出素子、１４…アプタマー、２１…薄膜生体分子検出素子、２４…アプタマー、３１…生体分子検出装置、３２…薄膜生体分子検出素子、３３…二波長同時検出装置、３４…制御部

Claims (11)

1. 基板と、該基板上に設けられた基板吸着部と、該基板吸着部に、一端を介して接着したリンカーと、該リンカーの他端に結合した希土類錯体とを備え、前記希土類錯体は、下記式（１）で表わされる基と、Ｔｂ ^３＋ イオン、Ｅｕ ^３＋ イオン、Ｄｙ ^３＋ イオン又はＳｍ ^３＋ イオンとの錯体である、薄膜生体分子検出素子。
   

   

   ［式（１）中、Ｒ ^５ はフッ素原子で置換されていてもよい炭素数１〜６のアルキル基を示し、Ｒ ^６ は炭素数１〜６のアルキル基又は炭素数６〜２０のアリール基を示す。］
2. 前記希土類錯体が、前記式（１）で表わされる基とＥｕ ^３＋ イオンとの錯体であり、前記式（１）におけるＲ ^５ が炭素数１〜６のパーフルオロアルキル基である、請求項１に記載の薄膜生体分子検出素子。
3. 前記式（１）におけるＲ ^５ がトリフルオロメチル基又はヘプタフルオロプロピル基である、請求項１又は２に記載の薄膜生体分子検出素子。
4. 前記式（１）におけるＲ ^６ がナフチル基又はｔ−ブチル基である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の薄膜生体分子検出素子。
5. 前記基板の表面の少なくとも一部は、酸化グラフェンが固定されてなる請求項１〜４のいずれか一項に記載の薄膜生体分子検出素子。
6. 前記リンカーは、アプタマーからなる請求項１〜５のいずれか一項に記載の薄膜生体分子検出素子。
7. 前記アプタマーは、腫瘍関連分子を標的とするものである請求項６に記載の薄膜生体分子検出素子。
8. 前記アプタマーは、核酸アプタマーである請求項６又は７に記載の薄膜生体分子検出素子。
9. 請求項１〜８のいずれか一項に記載の薄膜生体分子検出素子を用いて、発光スペクトル、発光寿命、及びブランチング比からなる群から選ばれる少なくとも一つから生体分子を特定する生体分子検出方法。
10. 前記生体分子がアミノ基又はＰ＝Ｏで示される基を有する、請求項９に記載の生体分子検出方法。
11. 請求項１〜８のいずれか一項に記載の薄膜生体分子検出素子と、二波長同時検出装置とを備える生体分子検出装置。

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