JP5683948B2

JP5683948B2 - 糖を含有する全ての（ｐａｎ）癌のマーカー

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Publication number: JP5683948B2
Application number: JP2010507772A
Authority: JP
Inventors: グレゴリーリー、チ−ユー
Original assignee: バンクーバーバイオテクリミテッド
Priority date: 2007-05-14
Filing date: 2008-05-14
Publication date: 2015-03-11
Anticipated expiration: 2028-05-14
Also published as: EP2155250A1; AU2008250953B2; US20110033445A1; EP2155250B1; CN102014955A; CA2687403A1; WO2008138139A1; JP2010529950A; EP2155250A4; US8143373B2; AU2008250953A1; AU2008250953A2; US20120177636A1

Description

本発明は、癌細胞又は組織を通常の細胞又は組織及びから識別することができ、そしてヒト被験体における多くの腫瘍で見られるタンパク質マーカーの分野に関する。より特徴的には、本発明は、既知の癌マーカーＣＡ２１５の糖含有エピトープ及びこのエピトープを使用する方法に関する。

参照によって本願明細書に組み込まれるＵＳ特許第５，６５０，２９１（‘２９１）は、卵巣腫瘍細胞系統（株）に存在し、そして、ヒトの多くの腫瘍にも示される腫瘍関連抗原（ＣＡ２１５）の単離を記載する。この抗原に対してモノクローナル抗体が調製された（ＲＰ２１５モノクローナル抗体を含む）。この抗体を生成するハイブリドーマ細胞系統は、ＡＴＣＣＨＢ１００９５としてアメリカ培養細胞系統保存機関（American Type Culture Collection）に寄託された。特許‘２９１は、ＣＡ２１５を、ＲＰ２１５で同定される場合にＳＤＳゲルで６０ｋＤの最低分子量を有すると記載する。しかしながら、１００ｋＤから２，０００ｋＤに渡る分子量の凝集物が存在することも示された。ＣＡ２１５は免疫親和性のクロマトグラフ的な手法によって精製され、培養した卵巣腫瘍細胞（ＯＣ−３−ＶＧＨ）の抽出物又はそれら細胞の培養培地上澄（cultured shed medium）の何れかから精製することができた。抗原ＣＡ２１５は、卵巣癌又は（子宮）頚癌を有する患者の血清中において、ＲＰ２１５によって検出することができる「膜関連」可溶性抗原として特徴付けられる。該抗原は、どの正常組織においても検出することができなかった。この抗原及びそれを認識するモノクローナル抗体は、Lee, C. Y. G., et al, Cancer Immunol. Immunother. (1992) 35:19-26による論文にも記載されている。ＣＡ２１５はその論文においてCox-1と命名された。

同一グループによって書かれた、後の論文（Lee, G., et al, J. Clin. Ligand Assay (2006) 29:47-51）に、ＲＰ２１５を採用するサンドイッチ（法）アッセイにおいて、中性ｐＨの過ヨウ素酸による処置が実質的にＣＡ２１５の免疫反応性を無くすることが報告された。このことが、ＲＰ２１５と反応性のＣＡ２１５のエピトープが糖を含み得るという結論に筆者（ないし発明者）を導いた。

ＲＰ２１５によって認識されるＣＡ２１５のエピトープが全ての癌のおよそ６０％に存在すると思われる。その分布のさらなる情報は上記Lee, G., et al, J. Clin. Ligand Assay (2006)に見られる。

特許‘２９１は、抗原ＣＡ２１５を生成する細胞を標識する（該細胞に対する）免疫反応性抗体を利用することによって、抗原ＣＡ２１５を保有する腫瘍の位置を決定する方法をさらに記載する。種々の放射性同位体でモノクローナル抗体を標識すること、並びにこれらの抗体に毒素を抱合（接合）すること、そして治療上の使用のための抗体又は免疫毒素の投与が記載された。
［先行技術文献］
［特許文献１］ＵＳ特許５，６５０，２９１
［非特許文献１］ Lee, C. Y. G., et al, Cancer Immunol. Immunother. (1992) 35:19-26
［非特許文献２］ Lee, G., et al, J. Clin. Ligand Assay (2006)

発明の開示
本発明は、エピトープの糖の部分が免疫グロブリンの重鎖様分子の可変領域に位置することを実証することによって、これらの刊行物に記載の研究をさらに洗練し（精度を上げ）、従って、ＣＡ２１５の関連部分のみを含む組成物がワクチンに包含されること、又は標的癌細胞のイメージング（画像診断）に有用な抗体を生成及び精製することを可能にする。この研究は、２つのＣＡ２１５の形態（１つは膜結合型であり、別の１つは分泌型である）があることも実証する。

本発明は、ＣＡ２１５のエピトープ領域（ないし部分）から本質的にから構成される組成物に向けられる。このエピトープ領域は、糖(carbohydrate)を含み、そして、任意に免疫グロブリン重鎖様の可変領域アミノ酸シーケンスの少なくとも一部を含む。このエピトープは、ＲＰ２１５モノクローナル抗体と特異的に免疫反応性であるが、抗ヒトＩｇＧとは顕著に免疫反応性でない。

他の視点において、本発明は、癌を処置するための治療方法及び予防方法における活性成分としての最小のエピトープ又はそれを模倣する抗イディオタイプの抗体の使用に関する。エピトープ及び抗イディオタイプ抗体は、癌の診断又は治療用の試薬として有用な更なるモノクローナル抗体のアフィニティー精製用の試薬、そして［該モノクローナル抗体の］同定用の試薬として使用することもできる。

別の視点において、本発明は、新たなるサンドイッチ法のアッセイにおける構成要素としてＣＡ２１５に対して向けられた、代替的にモノクローナル抗体又はＩｇＧと免疫反応性である抗体を使用する、ＣＡ２１５の免疫アッセイにおける改良に関する。

別の視点において、本発明は、ヒト化形態（ヒューマナイズドフォーム）を含むＲＰ２１５の修飾形態（ないし変化形態）である改良モノクローナル抗体に関する。ＲＰ２１５のヒト化形態は、治療方法に有用であり、更なる抗腫瘍性部分に抱合（ないし接合：conjugate）され、そのような部分の標的性能（ターゲッティング）を改良することができる。

更なる視点において、本発明は、ＣＡ２１５抗原の分泌型／膜結合型の２つの性質の利点を利用するプロトコル（ないし方法）に関する。そのようなプロトコルにおいて、分泌型形態の検出による体液の診断が行われ、任意的に本発明の改良アッセイシステムを使用し、その後、任意的に処置用の細胞毒性剤、又は局在化用及び／又は処置用の放射線同位体にカップルしたヒト化形態の本発明の抗体を使用して、固形の腫瘍の局在化及び処置が行われる。
なお、本発明には、以下の好ましい実施形態も含まれる。
（形態１）
ＲＰ２１５モノクローナル抗体と免疫反応性であるが、抗ヒトＩｇＧとは顕著に免疫反応性でない糖（carbohydrate）含有エピトープから本質的に構成され、
前記糖は、免疫グロブリンの重鎖様アミノ酸シーケンスの可変領域の少なくとも一部にカップルされる物質の組成物。
（形態２）
前記重鎖様アミノ酸シーケンスは、ＩｇＧ、ＩｇＡ又はＩｇＭ抗体と関連することを特徴とする形態１に記載の組成物。
（形態３）
ＲＰ２１５モノクローナル抗体と免疫反応性である糖保有可変領域ＩｇＧ様のアミノ酸シーケンスから本質的に構成される物質の組成物。
（形態４）
ＲＰ２１５モノクローナル抗体と免疫反応性である糖保有可変領域ＩｇＡ様のアミノ酸シーケンスから本質的に構成される物質の組成物。
（形態５）
ＲＰ２１５モノクローナル抗体と免疫反応性である糖保有可変領域ＩｇＭ様のアミノ酸シーケンスから本質的に構成される物質の組成物。
（形態６）
前記エピトープが異種性の部分（モイエティ）にカップルされることを特徴とする形態１又は２に記載の組成物。
（形態７）
免疫抗原性の組成物として調製されることを特徴とする形態１〜６のいずれか１つに記載の組成物。
（形態８）
被験体における癌を処置する方法であって、
前記癌が、ＣＡ２１５を発現し、
前記方法が、形態１〜６のいずれか１つに定義の組成物を含む製剤を前記被験体に投与することを含む方法。
（形態９）
前記被験体はヒトであり、
前記方法が、化学的治療剤又は放射線治療で前記被験体を処置することをさらに含むことを特徴とする形態８に記載の方法。
（形態１０）
前記被験体は動物腫瘍モデルであることを特徴とする形態８に記載の方法。
（形態１１）
被検体の癌を処置する方法であって、
前記癌が、ＣＡ２１５を発現し、
前記方法が、ＲＰ２１５モノクローナル抗体に対する抗イディオタイプ抗体を含む製剤を前記被験体に投与することを含む方法。
（形態１２）
前記被検体がヒトであり、
前記方法が、化学的治療剤又は放射線治療で前記被験体を処置することをさらに含むことを特徴とする形態１１に記載の方法。
（形態１３）
前記被験体は動物腫瘍モデルであることを特徴とする形態１１に記載の方法。
（形態１４）
サンプル中のＣＡ２１５を検出する方法であって、
該方法は、前記サンプルを、抗ヒトＩｇＧを結合させた固形支持体と接触させること、
その後、標識された、若しくはその後に標識を含むように修飾ないし修正されたＲＰ２１５モノクローナル抗体、ＣＡ２１５と交差反応性の抗体、又は、これら抗体の何れか一つの免疫特異性フラグメントと、前記支持体とを接触させること、
を含む方法。
（形態１５）
サンプル中のＣＡ２１５を検出する方法であって、
該方法は、サンドイッチ法の免疫アッセイを実行することを含み、
サンドイッチ法の［抗体の］メンバーの１つは、ＲＰ２１５抗体であり、サンドイッチ法の他のメンバーは、抗ヒトＩｇＧと免疫反応性［の抗体］であること、
を特徴とする方法。
（形態１６）
ヒト化ＲＰ２１５抗体又はそのフラグメントを含む組成物。
（形態１７）
前記ＲＰ２１５抗体又は［その］フラグメントは、抗腫瘍性剤にカップルされることを特徴とする形態１６に記載の組成物。
（形態１８）
抗腫瘍性剤は抗成長因子又は抗成長因子受容体でであることを特徴とする形態１６に記載の組成物。
（形態１９）
ヒト患者における固形の腫瘍の診断用及び処置用のプロトコル（ないし方法）であって、
該方法（ないしプロトコル）は、
ａ）前記患者からの体液のサンプルを、ＣＡ２１５の存在又は、不在についてアッセイすることによって前記患者を診断すること、ここで、ＣＡ２１５の存在は、前記患者における固形の腫瘍の存在を指示し、そして、
ｂ）膜結合型ＣＡ２１５のエピトープに結合するヒト化抗体を前記患者に投与することによって前記患者を処置すること、ここで、前記抗体は、細胞毒素剤に任意的にカップルされること、
を特徴とするプロトコル（ないし方法）。
（形態２０）
前記抗体は、ＲＰ２１５のヒト化形態であることを特徴とする形態１９に記載の方法。
あるいは、本発明は以下のように記載され得る。
（付記１）
ＲＰ２１５モノクローナル抗体と免疫反応性であり、
抗ヒトＩｇＧ抗体とは顕著に免疫反応性でなく、
少なくともＣＡ２１５のＦＲ１の一部、ＣＤＲ１重鎖様配列の一部、ＦＲ１及びＣＤＲ１の間の接合部の近くに位置するスレオニン又はセリングリコシル化サイトにカップルされる糖（carbohydrate）から成る、分子。
（付記２）
異種性の部分（モイエティ）にカップルされる付記１に記載の分子。
（付記３）
付記１又は２に記載の分子を含む医薬組成物。
（付記４）
ワクチン組成物として製剤化され、
ＣＡ２１５を発現する癌に対する免疫応答を被験体において誘導することに使用される
付記３に記載の医薬組成物。
（付記５）
被験体がヒトであることを特徴とする付記４に記載の医薬組成物。
（付記６）
被験体が動物腫瘍モデルであることを特徴とする付記４に記載の医薬組成物。
（付記７）
付記１に記載の分子を模倣する、ＲＰ２１５モノクローナル抗体に対する抗イディオタイプ抗体を含み、
被検体におけるＣＡ２１５を発現する癌を処置する方法に使用される、医薬組成物。
（付記８）
被験者がヒトであることを特徴とする付記７に記載の医薬組成物。
（付記９）
被験体が動物腫瘍モデルであることを特徴とする付記７に記載の医薬組成物。
（付記１０）
サンプルにおけるＣＡ２１５を検出する方法であって、
前記サンプルを、抗ヒトＩｇＧを結合させた固形支持体と接触させること、
前記支持体と、標識された、若しくはその後に標識を含むように修飾ないし修正された、ＲＰ２１５モノクローナル抗体、ＣＡ２１５と交差反応性の抗体、又は、これらの抗体の何れか一つの免疫特異性フラグメントと、を接触させること、
（付記１１）
サンプル中のＣＡ２１５を検出する方法であって、
該方法は、サンドイッチ法の免疫アッセイを実行することを含み、
サンドイッチ法において使用される抗体のメンバーの１つは、ＲＰ２１５抗体であり、かつ、サンドイッチ法において使用される他のメンバーは、抗ヒトＩｇＧであること、
を特徴とする方法。

図１は、ヒトＩｇＧ、ＲＰ２１５ｍＡｂ（ｍＡｂ：モノクローナル抗体）及び３つのＣＡ２１５のサンプルそれぞれから遊離したＮ−結合型グリカンのフル（full）ＥＳＩ−ＭＳスペクトルである。図２は、ヒトＩｇＧ、ＲＰ２１５ｍＡｂ（ｍＡｂ：モノクローナル抗体）及び３つのＣＡ２１５のサンプルそれぞれから遊離したＮ−結合型グリカンのフル（full）ＥＳＩ−ＭＳスペクトルである。図３は、ヒトＩｇＧ、ＲＰ２１５ｍＡｂ（ｍＡｂ：モノクローナル抗体）及び３つのＣＡ２１５のサンプルそれぞれから遊離したＮ−結合型グリカンのフル（full）ＥＳＩ−ＭＳスペクトルである。図４は、ヒトＩｇＧ、ＲＰ２１５ｍＡｂ（ｍＡｂ：モノクローナル抗体）及び３つのＣＡ２１５のサンプルそれぞれから遊離したＮ−結合型グリカンのフル（full）ＥＳＩ−ＭＳスペクトルである。図５は、ヒトＩｇＧ、ＲＰ２１５ｍＡｂ（ｍＡｂ：モノクローナル抗体）及び３つのＣＡ２１５のサンプルそれぞれから遊離したＮ−結合型グリカンのフル（full）ＥＳＩ−ＭＳスペクトルである。

図６は、ＯＣ−３−ＶＧＨの細胞（上）の膜結合型のＣＡ２１５の存在に対する洗浄の影響を示す。

図７は、ＣＡ２１５の分泌型形態に関連するハイブリドーマ細胞系統（株）と比較したＯＣ−３−ＶＧＨの細胞系統（株）の分泌パターンを示す。

本発明は、ＲＰ２１５モノクローナル抗体と免疫反応性であるＣＡ２１５（上）のエピトープを、この抗原の糖の部分を含むものとして同定し、タンパク質部分のアイデンティティを、免疫グロブリン（ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＭのクラスの免疫グロブリンを含む）の重鎖様分子（heavy chain immunoglobulin-like molecule）として確立する。いくつかの免疫グロブリンの軽鎖様部分（light chain immunoglobulin-like moieties）は、ＣＡ２１５と関連するように見えるが、それらは、通常の免疫グロブリンにおける[割合]のように、重鎖に対して１：１の割合で存在せず、重鎖様部分と関連する糖含有エピトープを保有しない。ＣＡ２１５は、癌細胞の表面上の未定義の凝集物（undefined aggregates）として存在する。

エピトープ（ＲＰ２１５によって認識され、一般的に免疫グロブリン[の表面上]に存在しない糖を含み、免疫グロブリンの重鎖様分子の可変領域と関連する）の同定は、より洗練された免疫原性組成物の生成を許容する（該組成物は、次いで、細胞の表面でＣＡ２１５を示す腫瘍細胞の成長を阻害すること、そして、検出試薬又は免疫毒素として有用な更なる抗体を生成することに有用である）。下記の実施例で示されるように、およそ６０％のヒトの癌に存在する、効果的な（ないし効率的な）ＣＡ２１５のエピトープを上述のように使用することで、より効果的な免疫原性組成物を癌の予防及び処置用に調製することができる。

従って、既に確立された癌の進行を減速するワクチン、あるいは検出可能な量の癌細胞（抗原ＣＡ２１５を発現する）の出現を防止するワクチンとして、抗原ＣＡ２１５全体を採用するというよりも、検出及び処置に関連するエピトープを有するＣＡ２１５の部分のみが採用される必要がある。

下記に示すように、エピトープは、実質的に、抗ヒトＩｇＧ、抗ヒトＩｇＡ又は抗ヒトＩｇＭに対して免疫反応しない抗原の一部（a portion of the antigen）から成る。糖エピトープは、これらのヒト免疫グロブリンの構成成分（composition）と異なり、かつ、該糖エピトープと免疫反応するモノクローナル抗体ＲＰ２１５の構成成分と異なる構成成分を有する。糖エピトープの構成成分は、およそ１−３％のフコース、９−１５％のＮ−アセチルガラクトサミン、２７−３０％のＮ−アセチルグルコサミン、６−１５％のグルコース及び４７−５１％のマンノースである。これらは、後述の４つのケースにおいて、少なくとも±１〜２％での、およその数値（figures）である。糖エピトープはＮ−アセチルノイラミン酸及びＮ−グリコールノイラミン酸を含まない。

エピトープは、糖が結合する可変領域免疫グロブリン重鎖様タンパク質の小さな部分（small portion）を少なくとも含む。

かくして、精製抗原ＣＡ２１５は、免疫グロブリン重鎖様分子として同定された（ここで、ＲＰ２１５と免疫反応性のエピトープ部分は、このアミノ酸シーケンスと関連する糖を含む）。「免疫グロブリンの重鎖様分子（immunoglobulin heavy chain-like molecule）」とは、抗免疫グロブリン抗体との免疫反応性を与えることができるアミノ酸シーケンスを含む分子を意味する。従って、本発明の場合には、ＣＡ２１５は、抗ＩｇＧ、抗ＩｇＡ及び抗ＩｇＭと免疫反応性である。しかしながら、ＲＰ２１５と免疫反応性のエピトープは、抗ＩｇＧ、抗ＩｇＡ及び抗ＩｇＭと免疫反応性ではない。従って、ＣＡ２１５のタンパク質部分のアミノ酸シーケンスは、抗免疫グロブリン重鎖抗体に関しては免疫反応性が示される免疫グロブリンの重鎖と十分に相同性（homologous）である。ＣＡ２１５は、免疫グロブリンの軽鎖を認識する抗体とも免疫反応性である。従って、より一般的には、ＣＡ２１５は、単に「免疫グロブリン様分子」として記述することができる。

本発明の同定されたエピトープは、癌の処置及び予防のために、被験体に投与するワクチンの中に処方することができる。製剤及びプロトコルを最適化するために、動物モデル被検体（マウス、ラット、ウサギ、モルモット及び同様のもの）に、そのようなワクチンを投与することができる。ヒト被検体を、本発明の免疫原性組成物と一緒に、放射線療法及び化学療法などの更なる治療（法）で処置することができる。

正常及び癌の組織の免疫組織染色［を使用する］実験は、様々なレベルの染色輝度で、本願明細書において同定されたエピトープがいくつかのヒトの癌のタイプに存在することを示す。該エピトープは卵巣、頸部、子宮内膜、大腸、胃、腸管、食道、乳房及び肺のヒトの癌に対して非常に強い着色を示す。本願明細書に記載のように、特定の被験体からの腫瘍組織は、免疫染色を使用して、このエピトープの存在及びレベルに関して評価することができ、従って、適するワクチンの設計（エピトープそれ自体で構成するか、あるいは、以下にさらに記載するようなそれを模倣する抗イディオタイプ抗体で構成するか）において有用な情報を提供することができる。

癌を患う被験体において内因的に抗体を生成するための本発明のエピトープの使用に加え、エピトープを、更なる抗体（検出に有用であり、それ自体が処置に有用である）を生成することにも使用することができる。本願明細書において使用するように、「抗体」とは、完全な免疫グロブリン、並びに、Ｆａｂ、Ｆａｂ_２’及びＦ_ｖフラグメントなどの、その免疫特異的フラグメント（immunospecific fragments）を含む。抗体は、モノクローナル又は単鎖の抗体であり得る。このモノクローナル抗体は、標準的、かつ周知の技術によって調製し、これらの技術環境の下で、ヒト化形態、あるいはある種と関連する可変領域を、別の（種）と関連する定常領域にカップルしたキメラ形態を得るように組換え的に操作することができる。組換え体生成のツールを使用するモノクローナル抗体を操作する技術は、よく確立されている。本発明のエピトープは、適する抗体用の精製ツール及び同定ツールとしても使用することができる。

診断に使用するため又はワクチン製剤としてのモノクローナル又はポリクローナル抗体を調製する目的のためであるにしても［なかろうとも］、任意の免疫原性の組成物において、適するアジュバント（フロイントの不完全アジュバント、ミョウバン、本発明の分野において周知の多様な（ないし多数の）他のアジュバントなど）を［本発明の］組成物に含むことができる。さらに、その免疫原性を増強するように、エピトープをＫＬＨ又はテタヌストキソイドなどの更なる部分にカップルすることができる。従って、本発明のエピトープと、更なる異種性のタンパク質との融合タンパク質が、本発明の範囲に含まれる。

本発明の特定のエピトープに対する反応（応答）において生成された抗体は、放射性同位体、フルオロフォア、そして、（インビトロのアッセイのケースにおいては）酵素で標識することができ、癌細胞の存在を検出するために使用することができる。それらは、治療において使用する毒素とカップルすることもできる。

免疫抗原性製剤を調製するための本発明の特定のエピトープの使用に加え、このエピトープを模倣する抗イディオタイプの抗体をＲＰ２１５又はＲＰ２１５と同様にエピトープを認識する免疫原で免疫化された被験体から単離することができる。抗イディオタイプのモノクローナル抗体は、当該可変領域におけるエピトープに対する抗イディオタイプの反応を誘導するために、マウス又は他の適する被験体を、精製ＲＰ２１５のｍＡｂ又は精製ＲＰ２１５のＦａｂフラグメント（又は精製ＲＰ２１５のヒト化形態）で免疫化することによって得られる。例えば、ＢＡＬＢ／Ｃマウスを使用することができる。細胞融合と、ＲＰ２１５、そのＦａｂフラグメント又は本発明のエピトープを認識する他の部分（モイエティ）を使用するスクリーニングとによる通常のモノクローナル抗体の調製は、抗イディオタイプであるモノクローナル抗体を同定するだろう。これらの抗イディオタイプのｍＡｂ（モノクローナル抗体）は、そのとき、被検体（内）において、癌細胞をターゲットする抗体を誘導する免疫原としての役割を果たすことができる。従って、抗イディオタイプの抗体は、癌治療の際、及び他の適用例において、ＣＡ２１５エピトープの代わりとなることができる。

本発明の特定のエピトープに適する製剤は、例えば、一般的な免疫抗原性の組成物及びRemington's Pharmaceutical Sciences、最新版、Mack Publishing Co.、Easton、PA（本願明細書に引用によって組み込まれる）に見られる組成物である。投与プロトコルは、症状の性質、担当医師の判断、そして悪性腫瘍の重篤度に依存する。群又は個々を基本単位とするそのようなプロトコルの最適化は、十分に通常の技術を有する者（医師）の技能の範疇内である。

免疫グロブリン様部分（モイエティ）に付随する（residing）ものとしてのＣＡ２１５エピトープの同定は、この抗原の免疫のアッセイの改良に導いた。従来、モノクローナルＲＰ２１５は、種々の検出用の標識（酵素、放射性同位体、蛍光分子を含む）を使用する標準的な免疫アッセイにおいて採用される「サンドイッチ法」の双方のメンバーとして使用されてきた。ＣＡ２１５が通常、重合体の形態で存在し、かつ複数コピーの同様のエピトープが利用可能であるので、このことが可能であった。しかしながら、該アッセイの改良形態は、単量体の形態のＣＡ２１５も検出することができるように、ヒト免疫グロブリン（好ましくは、ＩｇＧ）と免疫反応性の抗体をサンドイッチ法の１つのメンバーとして採用する。

可変領域をエンコードするヌクレオチドシーケンスの操作を介してＲＰ２１５の構造においても、改良が考慮される。従って、ＲＰ２１５をヒト化することができ、あるいは他の方法では、その免疫特異性を改良するように修飾（ないし修正）することができる。この抗体のヒト化形態は、治療上の適用に、特に有用である。そのようなヒト化形態は、完全免疫グロブリンであり得、若しくはＦａｂ又はＦａｂ_２’部分などの可変領域のみを含むことができ、あるいは組み換え的に生成された単鎖Ｆ_ｖ抗体であり得る。ＲＰ２１５の任意の免疫特異的部分は、ヒト被験体内での免疫反応性を上昇させないように修飾（ないし修正）することもできる。

そのような抗体又はフラグメント、あるいは［それらの］改変形態を、更なる生物学的に活性化の部分（モイエティ）（免疫グロブリン又は所望でない成長因子と免疫反応性のそのフラグメントを含む抗腫瘍性剤など）にカップルすることができる。これらの抱合体（conjugates）において、ＲＰ２１５は、ターゲッティングエージェントとして、並びに、それ自体で抗腫瘍因子としての役割を果たす。従って、これらのＲＰ２１５の形態は、抗腫瘍性剤（パクリタキセル、ラパマイシン又はフマギリンなど）に、あるいは成長因子又はそれらの受容体（抗ＧＮＲＨ受容体、抗ＥＧＦ、抗ＥＧＦＲ、抗ＶＥＧＦ、抗ＶＥＧＦＲ及び同様のもの）の阻害因子である部分（モイエティ）にカップルすることができる。

本願明細書において使用されるように、「抗腫瘍性剤」とは、上記提示のそれらなどの小（small）分子、並びに、成長因子又はそのような成長因子の受容体に対して向けられたそれらの抗体又はフラグメントを含む。従って、「抗成長因子」又は「抗成長因子受容体」は、これらの部分（モイエティ）と免疫反応性である免疫グロブリン又はそのフラグメントを意味する。

本発明の改良プロトコルにおいて、最初のステップは、体液中でのＣＡ２１５抗原の存在に起因して上皮細胞によって特徴付けられる悪性腫瘍の存在の診断である。そのような［体］液は、血清、血漿、血液、尿、唾液及び同様のものを含む。検出は、ＲＰ２１５又は上記のその改変形態を使用して実行することができる。本発明の修飾アッセイも使用することができる。

一度診断が行われると、ヒトのケースにおいては、画像化することが可能な標識（放射線同位体、蛍光色素又は発光システムなど）にカップルされたヒト化形態のＲＰ２１５の注射により、画像を得ることによって、腫瘍の位置を確認することができる。蛍光タンパク質を、融合タンパク質て採用することができ、あるいは他の方法によって抗体に結合することができる。さらに、抗体は、これらの固形の腫瘍の処置用の細胞毒性剤のターゲッティングエージェントとして使用することもできる。

以下の実施例は、本発明を説明するために提供され、本発明を限定するためではない。

［実施例１］
糖を含むエピトープを有する分泌型及び膜結合型の両方における免疫グロブリン様分子としてのＣＡ２１５の特徴付け

この実施例において、ＣＡ２１５の免疫グロブリン様の性質が確認され、そして、この癌関連抗原が異なる分子量を有する分泌型及び膜結合型の両方で同時に生成されることが実証された。加えて、ＲＰ２１５と免疫反応性であるＣＡ２１５のエピトープは、糖の部分（モイエティ）を含む。

引用によって（本書に）繰り込まれたＵ．Ｓ．特許５，６５０，２９１に記載の方法を使用して、ＣＡ２１５をＯＣ−３−ＶＧＨの癌培養細胞の培地上澄（分画）（shed medium）から精製した。

精製したＣＡ２１５のＮＨ_２−端末アミノ酸シーケンス解析は、通常のヒトＩｇＧ（ＶＥＬＶＥＳＧＡ）のシーケンスと同様のシーケンスを与えた。

ＣＡ２１５の免疫グロブリンの性質を、ウェスタンブロットアッセイによって確認した。ＯＣ−３−ＶＧＨの癌細胞抽出物、培地上澄又はアフィニティ精製したＣＡ２１５の何れかのＣＡ２１５タンパク質を［ＳＤＳ−ＰＡＧＥ］によって分離し、該ＳＤＳ−ＰＡＧＥからニトロセルロース膜片に転写した。

酵素標識ＲＰ２１５と、あるいはアルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）標識抗ヒトＩｇＧとの直接インキュベーションの後、ニトロセルロース片をタンパク質バンドの色検出用の基質(Bio-Rad Labs)とインキュベートした。ニトロセルロース膜片との間接結合アッセイも、一次抗体として非標識ＲＰ２１５又は抗ヒトＩｇを使用し、二次抗体として酵素標識ヤギ抗マウスＩｇＧ又はウサギ抗ヤギＩｇＧを使用して行った。これらの広範囲実験の結果を表１に要約する。
［表１］
種々の抗体を使用するウェスタンブロットアッセイをプローブして、これらの癌細胞抽出物、培養培地上澄（cultured shed medium）又は精製ＣＡ２１５由来のニトロセルロース片（上の）検出されたタンパク質バンドの分子量を示す。

^ａＨＲＰ−ホースラディッシュペルオキシダーゼ
ＡＬＰ−アルカリフォスファターゼ

検出にＲＰ２１５を使用する直接及び間接ウェスタンブロットアッセイの両方とも、タンパク質が細胞抽出物、培地上澄、あるいはアフィニティ精製ＣＡ２１５の何れであるかに関わらず、同様のタンパク質バンドパターンを与える。強く、ブロードのタンパク質バンドが、６０ｋＤａの分子量で観察され、そして、微量のタンパク質バンドも９０ｋＤａで検出された。

抗ヒトＩｇＧモノクローナル抗体(γ鎖に特異的)は、ＡＬＰ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧでの直接アッセイ、又は二次マーカーとしてこの抗体を使用する間接アッセイのいずれにおいても、ブロードの６０ｋＤａのタンパク質バンド（１以上）を与える。抗ヒトＩｇＧλ（ラムダ）及びκ（カッパ）の軽鎖のモノクローナル抗体は、ずっと低い染色輝度であるが、低分子量（２５−３０ｋＤａ）のタンパク質バンド（１以上）も認識する。抗ヒトＩｇＡ及びＩｇＭモノクローナル抗体は、ＲＰ２１５モノクローナル抗体によってそれらが認識されるのと同様の６０ｋＤａに似た分子サイズでタンパク質バンドを認識する。

示したように、癌細胞由来のＩｇＧ相対濃度は、ヒトＩｇＡ又はヒトＩｇＭのそれ（≦ＩｇＧの５〜１０％）よりも顕著に高い。ペプシン消化前及び後のアフィニティ精製ＣＡ２１５のウェスタンブロットは、ペプシン消化の後、ＲＰ２１５モノクローナル抗体によって、低分子の範囲（〜３０ｋＤａ）で、ＣＡ２１５の残りのＦａｂフラグメント（１以上）を検出できることを示した。

癌細胞におけるＣＡ２１５がヒトＩｇＧ、ヒトＩｇＡ又はヒトＩｇＭと交差反応すること、そして、ＲＰ２１５によって認識されるユニークなエピトープ（１以上）がこれらの癌細胞由来免疫グロブリン様分子に存在することのさらに直接的な証拠を以下のように得た。モノクローナル抗ヒトＩｇＧ（Ｃｏｘ−１００）^＊、抗ヒトＩｇＡ及び抗ヒトＩｇＭを、マイクロウェル（上）に標準的な手順に従って、別々にコートした。ＯＣ−３−ＶＧＨの細胞からの培地上澄をウェルに加え、ＲＰ２１５−ＨＲＰを検出抗体として使用した。サンドイッチ（法）免疫アッセイを、１ステップ、室温、オーバーナイト、１／２００ＲＰ２１５−ＨＲＰ＋ノーマルマウスＩｇＧ（１０μｇ／ｍｌ）で行った。

表２におけるこのアッセイの結果は、ヒト免疫グロブリン分子に対する種々の抗体［と反応する］ＯＣ−３−ＶＧＨの癌細胞の培養培地上澄におけるヒト免疫グロブリン様分子の存在を示す。ＯＤｓは、サンプルのＯＤ値であり、ＯＤｎは、ネガティブコントロール（培地）のＯＤ値である。（ＯＤ：Optical Density）
［表２］

ｈ：ヒト
Ｍａｂ：モノクローナル抗体
Ａｂ：抗体
Ａｇ：抗グロブリン

表３Ａに示すように、ＯＣ−３−ＶＧＨの癌細胞に存在するＣＡ２１５に対する種々の抗免疫グロブリン抗体間の直接結合を実証するために、更なるデータを得た。この場合では、一次抗体をサンプルとオーバーナイトで室温でインキュベートし、次にヤギ抗マウスＩｇＧ−ＡＬＰ抗体を１時間、３７℃でインキュベートする二次２ステップＥＬＩＳＡ法として実験を行った。ＯＤｓは、サンプルのＯＤ値であり、ＯＤｎは、ノーマルマウスＩｇＧの濃度に対応するＯＤ値である。
［表３Ａ］

ＣＡ２１５が、ＩｇＧの重鎖を模倣する免疫グロブリン様分子であるという更なる証拠を相同性解析を使用して得た。表３Ｂは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳシステム解析によって得られた結果を示す。
［表３Ｂ］
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳによって決定されたＣＡ２１５のトリプシン（処置）ペプチドのアミノ酸シーケンス相同性解析

^＊Ｃｏｘ−１００は、モノクローナル抗体調製のための標準技術を用い、精製ＣＡ２１５でマウスを免疫し、脾臓を収穫し、細胞融合し、スクリーニングして得られたモノクローナル抗体である。Ｃｏｘ−１００は、ＣＡ２１５と反応し、ヒトＩｇＧと交差反応をする。

従って、ＣＡ２１５に含まれるシーケンスは、ヒト免疫グロブリンの重鎖のシーケンスに相同性である。

表３Ｃにおいて、ＣＡ２１５の部分的なアミノシーケンスを、いくつかの他の癌細胞又は以前に（既に）報告した組織の既知のヒト免疫グロブリン重鎖のシーケンスとマップさせた。今や、ＣＡ２１５は単一の良く定義された分子ではなく、多数のヒト免疫グロブリン重鎖分子(例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ及びＶ領域（複数）における多数のバリエーション)の混合物（ないし混合体）であることが明白に確立される。これらの免疫グロブリン混合物のユニークな特徴は、共通してＲＰ２１５モノクローナル抗体によって認識され得る特異的な糖関連エピトープ（specific carbohydrate-associated epitope）の存在である。
［表３Ｃ］
癌細胞からの既知のヒトＩｇ重鎖のアミノ酸とのＭＡＬＤＩ− ＴＯＦＭＳから導出されたＣＡ２１５の部分的なアミノ酸の比較

注：以下のシーケンスは微小不均一性のためマップすることができなかった。
：1.GPLCGCCPGRSSQK；2.APTVVLMMTK；3.3MSTRYHQAASDSYLELIK；4.SLPGSPKDSSHLLSPLR

表３Ｄに、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ及びＲＴ−ＰＣＲから導出されたＣＡ２１５の定常領域におけるアミノ酸シーケンスと、GenBankからの抗ヒト結腸（大腸）癌重鎖のアミノ酸シーケンスとの比較を示す。
［表３Ｄ］
ＲＴ−ＰＣＲ及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳから推定されたＣＡ２１５のアミノ酸シーケンス中の定常領域におけるアミノ酸シーケンスと、抗ヒト結腸（大腸）癌重鎖（Anti- human Colon Carcinoma heavy chain: AHCCHC gb|AAB28159.1|)とのアミノ酸シーケンスの比較

ＣＡ２１５の糖の部分が、サンドイッチアッセイにおけるこの抗原の免疫反応性を破壊する過ヨウ素酸の能力を示すという以下の検証結果によって解析された。それに従って、エピトープにおける糖の存在を確立する。検証を以下のように行った：

ＰＢＳで洗浄したＯＣ−３−ＶＧＨの癌細胞（密度１ｘ１０^６細胞／ｍｌ）を１００ｍＭＮａＩＯ_４で３０分間インキュベートし、細胞を０．５％ＢＳＡ含有ＰＢＳで洗浄し、次に、１ｘ１０^４細胞／ウェルでマイクロウェル（上）で乾燥させた。細胞をコートしたマイクロウェルを、次に、０．５％ＢＳＡ含有ＰＢＳでブロック（ブロッキング）し、そして、ホースラディッシュペルオキシダーゼで標識されたＲＰ２１５（ＲＰ２１５−ＨＲＰ）を使用する直接結合酵素免疫アッセイを３７℃で１時間行い、その後、十分洗浄し、ＴＭＢ基質でカラー現像（color development）した。比較のために、ウェルを、コントロールとしての役割を果たすＮａＩＯ_４処理無しの癌細胞でコートした。ＲＰ２１５−ＨＲＰと、過ヨウ素酸で処理した癌細胞コートウェルとの間の結合は劇的に減少した。さらに、１０〜１００μｇ／ｍｌのヤギ抗ヒトＩｇＧの存在は、癌細胞でコートされたウェルにＲＰ２１５−ＨＲＰが結合することを投与量依存的態様で減少させ、ヤギ抗ヒトＩｇＧが、完全なＣＡ２１５抗原に結合することについて、ＲＰ２１５−ＨＲＰと競合することを指し示した。この研究の結果を表４に要約する。
［表４］
ＯＣ−３−ＶＧＨの癌細胞へのＮａＩＯ_４処理による、ＲＰ２１５−ＨＲＰの癌細胞でコートしたウェルへの結合に対する影響、並びに、ヤギ抗ヒトＩｇＧの存在下におけるその結合阻害を明らかにするための直接結合アッセイ

^ａ：最大結合パーセント

ＯＣ−３−ＶＧＨの細胞におけるＣＡ２１５の分泌型及び膜結合型の両方の存在を、以下の表５、図６及び図７に示すようにさらに確認した。表５は、固定化したＯＣ−３−ＶＧＨのホール（whole）細胞、ＯＣ−３−ＶＧＨの培養培地又は精製抗原の何れかを含む（膜）片を検出剤で処理した場合のウェスタンブロットの結果を示す。［表５に］示すように、検出方法にかかわらず、培養培地の場合のように、精製抗原は、分子量５４−５５ｋＤでのみ結果を出した。しかしながら、ホール細胞は、５０−５６ｋＤ及び６８−７３ｋＤの両方の分子量で結果を示した。表５において、Ｎ／Ａは、「適用不可（not applicable）」を表し、ＮＤは、「実行しない（not done）」を表す。
［表５］
還元条件下のＯＣ−３−ＶＧＨの細胞、培養培地及び精製ＣＡ２１５の、ＲＰ２１５及び抗ヒトＩｇＧプローブでのウェスタンブロット

ＭＡＨ：モノクローナル抗ヒト
ＧＡＭ：ヤギ抗マウス

図６は、ＯＣ−３−ＶＧＨの細胞に結合するＲＰ２１５の分画の連続的なＰＢＳ洗浄の結果を示す。図６に示すように、５回の連続的な洗浄の後であっても、細胞を結合する分画における認識可能な変化は起こらない。これらの結果は、培養（培地）ではなく、単離したＯＣ−３−ＶＧＨの細胞で得た。

このことは、ＯＣ−３−ＶＧＨの細胞又は比較可能な標準的なハイブリドーマの分泌システムの何れかから培養培地を評価する場合に、同様の分泌のパターンが、ＨＲＰ検出システムを使用して４５０ｎｍでの吸光度に基づいて得られることを示す、図７における結果と対照的である（相反する）。

従って、分泌型及び膜結合型は、同時に生成されかつ異なる分子量を有するように見える。分泌型はおよそ５５ｋＤの分子量を有し、膜結合型は、およそ７３ｋＤの分子量を有する。

［実施例２］
アフィニティ精製ＣＡ２１５の糖の組成

ＣＡ２１５の糖の組成を、Complex Carbohydrate Research Center(Athens, Georgia, USA)による契約サービスを介して解析した。比較のために、ノーマルヒトＩｇＧ及びＲＰ２１５モノクローナル抗体の組成解析も行った。

この糖組成解析の比較結果を表６に要約する。グルコースは、主要混入物として同定されたため、正確な測定は容易ではないので、グルコースの値は、決定しなかった。
［表６］
中性 (ニュートラル)のアミノ糖組成（グルコースを除く）

ヒトＩｇは、ＲＰ２１５（マウスＩｇＧ）に無いＮ−アセチルガラクトサミンを含むが、ノーマルヒトＩｇＧ及びＲＰ２１５は、同様の糖組成を有する。ＣＡ２１５は、ノーマルヒトＩｇＧ又はマウスＩｇＧの何れからも異なる糖の内容を示す。ＣＡ２１５は、比較的低いパーセンテージのＮ−アセチルグルコサミン(２７−２８％対４０−４５％)を含むが、顕著に比較的高い量のマンノースを含む（４８−５０％対３８−４５％)。

［実施例３］
Ｎ−結合型及びＯ−結合型のオリゴ糖の鑑定

全体的な糖の内容に加え、エレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）によって、ヒトＩｇＧ、ＲＰ２１５及びＣＡ２１５に関連するＮ−結合型グリカンの構造を決定した。

この決定を実行する際に、サンプルを１ｍｌのナノピュア水（nanopure water）に溶解した。各々８００μＬのヒトＩｇＧ、ＲＰ２１５ｍＡＢ、ＣＡ２１５のサンプルＢ、９００μＬのＣＡ２１５のサンプルＡ、及び全てのＣＡ２１５のサンプルＣをねじ口チューブにピペット注入し、凍結乾燥させた。乾燥させたサンプルを１００μＬの炭酸水素アンモニウムバッファー（５０ｍＭ、ｐＨ８．４）で溶解し、その直後（トリプシン消化（３７℃、オーバーナイト）する前）に２５ｍＭのジチオスレイトールで還元させ（４５分間、５０℃）、９０ｍＭのヨードアセトアミドでカルボキシアミドメチル化した(４５分間、室温、暗所)。各々のトリプシン消化物に第二の酵素（ペプチドＮ−グリコシダーゼＦ（New England BioLabs））を加え、３７℃で１８時間インキュベートして、Ｎ−結合型グリカンを遊離させた。酵素消化の後、サンプルはＣ１８逆相カートリッジ（reversed phase cartridge）を通過させた。各サンプルからのＮ−結合型グリカンを５％酢酸で溶出し、次に凍結乾燥した。

各サンプルの凍結乾燥したＮ−結合型分画をジメチルスルホキシドに溶解し、次に、ＮａＯＨ及びヨウ化メチルでメチル化させた。反応を水の添加によって停止（ないし抑制）し、ペル−Ｏ−メチル化糖（per-O-methylated carbohydrates）をジクロロメタンで抽出した。有機相を乾燥状態まで濃縮し、次にグリカン構造解析のためメタノールで溶解した。

５つのサンプル全てからのＮ−結合型グリカンの特性（profiles）を、エレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）によって、ＬＣＱ−ＭＳ(Thermo Finnigan)四重極イオントラップを使用して解析した。各サンプル（〜５ｐｍｏｌ／μＬ）を装置にシリンジポンプ(Harvard Apparatus)を通して１μＬ／分の一定の流速で直接注入し、３．５ｋＶでスプレーした。規格化した３５の衝突エネルギー及び２Ｄａの単離質量窓（isolation mass window）を採用し、ＭＳｎを得た。

結果を表７〜１０及び図１〜５に示す。明らかにサンプルが小さ過ぎて規定のピークを得ることができなかったので、ＣＡ２１５サンプルＣに関して表を提供しない。表９及び１０において、ハイライト（網かけ）した部分は、ＣＡ２１５においては見られるがＩｇＧ又はＲＰ２１５においては見られない構造を表す。

さらに、おそらく低サンプルサイズのため、再度、シアル酸は検出されなかったように見える。
［表７］
ＥＳＩ−ＭＳによるヒトＩｇＧのＮ−結合型グリカンの特性（profiles）

［表８］
ＥＳＩ−ＭＳによるＲＰ２１５ＭａｂのＮ−結合型グリカンの特性（profiles）

［表９］
ＥＳＩ−ＭＳによるＣＡ２１５サンプルＡのＮ−結合型グリカンの特性（profiles）

［表１０］
ＥＳＩ−ＭＳによるＣＡ２１５サンプルＢのＮ−結合型グリカンの特性（profiles）

一般的に、ヒトＩｇＧ及びＲＰ２１５の両方において、検出された主要なイオンは、グリコシル化構造（Ｎ／Ｚ１８３６）を有する。これは、ＣＡ２１５のサンプルにおいても検出されたが、シグナルは、ヒトＩｇＧ及びＲＰ２１５ほど支配的ではなかった。他のフコシル化及びシアル酸付加のグリカンが全てのサンプルにおいて検出された。

さらに、これらの物質のＯ−結合型糖の内容も決定し、結果を表１１に示した。
［表１１］
ＨＰＡＥＣにより解析されたＯ−グリカンの単糖の内容

［実施例４］
糖エピトープの位置

ウェスタンブロットを使用して、ＲＰ２１５特異的糖関連ピトープが癌細胞由来のＣＡ２１５のＩｇ重鎖のＦａｂ領域に位置することを示してきた。いくつかの免疫グロブリン重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３領域のアミノ酸（解析）を解析し、糖鎖付加（ないしグルコシル化）部分（の位置）を位置づけした。表１２において、これらの比較結果を示す。
［表１２］

セリン又はスレオニンを有する定常性のＯ−結合型糖鎖付加部分は、常にＦＲ１及びＣＤＲ１の間の接合部の近くに位置し、従ってＲＰ２１５特異的エピトープは、この位置（部分）におけるセリン又はスレオニン残基の存在に関連することが指し示された。このＯ−糖鎖付加部分の欠如は、ＲＰ２１５がＣＡ２１５を認識できないという結果になる。

［実施例５］
インビボのＲＰ２１５の有効性

ＯＣ−３−ＶＧＨの卵巣癌細胞の培養細胞へのＲＰ２１５モノクローナル抗体の添加は、成長に対する影響を有さないが、これらの抗体は、インビボにおいて腫瘍の成長を阻害することに成功した。培養細胞の成長は、インビトロにおいても、ヒトＩｇＧ又はヤギ抗ヒトＩｇＧの何れによっても細胞培養（液）中２００μｇ／ｍｌの濃度まで阻害されなかった。

生後２〜３週間の（ないし２〜３週間の成長期間の）４つのヌード（nude）マウスの各グループに、胸に近い部分において、２ｘ１０^６細胞／マウス（０．２ｍｌ中）で皮下に移植した。目に見える明らかな腫瘍の成長の後に、処置を行った。表１３に実験計画を示す。放射線標識のｍＡｂ（モノクローナル抗体）は、１２．５μＣｉ／ｍｇの特異的な放射活性であった。
［表１３］

抗体を処置した後、１６日目にマウスを屠殺（ないし解剖）し、体重を決定するとともに、各マウスにおける腫瘍の大きさを重量によって決定した。これらの結果を表１４に示す。
［表１４］

［表１４に］示すように、放射線同位体標識なしの１０ｍｇ／ｋｇで投与された抗体は、６０ｍｇ／ｋｇのシクロホスホンアミドが採用されたポジティブコントロールよりも顕著に腫瘍の大きさを減少させた。同じ投与量のＩ¹³¹標識抗体は、さらに腫瘍の大きさを減少させた。

［実施例６］
ＲＰ２１５の可変領域のヌクレオチドシーケンス

ＲＰ２１５をヒト化（humanizing）する目的のため、そして、突然変異誘発の標的として、ＣＡ２１５に対する好ましい免疫反応性の性質を有する更なる抗体を得るように、ＲＰ２１５の重鎖及び軽鎖の可変部分をエンコードするヌクレオチドシーケンスを決定し、［そのヌクレオチドシーケンスを］論理的に導出されるアミノ酸シーケンスに沿って表１５に示す。
［表１５］

この情報を使用して、ＣＡ２１５と免疫反応性のモノクローナル抗体の代替的形態（ＣＡ２１５のヒト化形態を含む）を設計し、生成した。

［実施例７］
ＲＰ２１５のヒト化

実施例６に提示の情報を使用して、ＲＰ２１５のヒト化形態（ｈＲＰ２１５）を調製した。

さらに、同様のヒトの定常領域及び実施例６に上記提示のマウスの可変領域を使用して、キメラのＲＰ２１５ｍＡｂ（ｃｈＲＰ２１５）を調製した。

ＲＰ２１５、ＨＲＰ２１５及びｃｈＲＰ２１５を、精製形態で取得し、以下に記載のように比較した。

各々［の抗体］を、別々に５μｇ／ｍｌでオーバーナイトで、マイクロウェルにコートした。マイクロウェルをＯＣ−３−ＶＧＨの細胞（ＣＡ２１５を供給する）の濃縮細胞培養液の培地上澄（shed medium）で処理し、次に、検出抗体としてのＨＲＰ標識ＲＰ２１５で処理した。検出抗体を、各ウェルで、６０分間、３７℃でインキュベートした。３０分後、カラー現像用のＴＭＢ基質を２０分間加え、そして、反応を停止した後、ＥＬＩＳＡリーダーにおいて４５０ｎｍで強度(intensity)を決定した。いくつかのケースにおいて、１０μｇ／ｍｌのヒトＩｇＧをウェルに加えたが、これは、シグナル強度に対する明らかな影響を有さなかった。結果を表１６に示す。
［表１６］

[表１６に]示すように、ｈＲＰ２１５及びｃｈＲＰ２１５は、（より）低い結合親和性を示したが、それにもかかわらず、ＣＡ２１５に特異的に結合することができ、ヒトＩｇＧによって影響されなかった。

更なる実験において、ＲＰ２１５でコートしたマイクロウェルは、アルカリフォスファターゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ又はこの抗体のＦａｂ又はＦｃ領域の結合を示さなかった。しかしながら、ＲＰ２１５は、ヤギ抗マウスＩｇＧの強力な結合を示した。

ＨＲＰ２１５は、ヤギ抗マウスＩｇＧに対する結合をほとんど示さない、あるいは全く示さなかったが、ヤギ抗ヒトＩｇＧに対する強力な結合を示した。結果は、ｃｈＲＰ２１５と同様であった。

これらの結果を表１７に示す。
［表１７］

ａ：ヤギ抗マウスＩｇＧ及びヤギ抗ヒトＩｇＧに関するシグナル強度は、比較目的のために１００％に調節した。

表１７に示すように、ウェルを、ＲＰ２１５、ヒトＲＰ２１５（ｈＲＰ２１５）、キメラヒトＲＰ２１５（ｃｈＲＰ２１５）又はヒトＩｇＧの何れかでコートした。第１行において、ＲＰ２１５及びヤギ抗マウスＩｇＧ間の相互作用について、結果を１００％に規格化した。第一行において示されるように、ヤギ抗マウスＩｇＧは、ヒト化形態又はキメラのヒト化形態に比べて、貧弱に結合した。

第２行において、ヤギ抗ヒトＩｇＧが検出因子として使用され、ヒト化ＲＰ２１５（ｈＲＰ２１５）を１００％に据えた（規格化した）とき、ヒトＩｇＧに関しては減少した結合を示し、そして、キメラ又はマウスのＲＰ２１５に関して非常に減少した結合を示した。

第３行において、検出抗体がヤギ抗ヒトＩｇＦｃであったとき、強力な結合がヒト化ＲＰ２１５及びヒトＩｇＧに対して示されたが、減少した結合がキメラのヒトＲＰ２１５に対して示され、ＲＰ２１５それ自体に対しては実質的に結合が示されなかった

第４行において、ヤギ抗ヒトＩｇＦａｂが使用されたとき、ヒト化ＲＰ２１５において強力な結合が検出されたが、相対的に貧弱なヒトＩｇＧの結合が検出され、そしてＲＰ２１５及びキメラのＲＰ２１５について、予測ないし期待されたように、非常に弱い結合が検出された。

このことから、以下のことが結論付けられる：
（１）ヒト化抗体（ｈＲＰ２１５）及びキメラの抗体（ｃｈＲＰ２１５）は、ヤギ抗ヒトＩｇＧに対する交差反応性と比較可能な（comparable）ほど低い交差反応性をヤギ抗マウスＩｇＧに対して示した。
（２）ｈＲＰ２１５及びｃｈＲＰ２１５の両方は、マウス起源の［抗体］であるＲＰ２１５の非常に弱い結合［すなわち、ヤギ抗ヒトＩｇＦｃ抗体のＲＰ２１５に対する結合］に比べて、ヒトＩｇＧの結合活性と同じような高い結合活性をヤギ抗ヒトＩｇＦｃ抗体に対して示した。ｃｈＲＰ２１５は、これに対して、非常に低い結合活性をヤギ抗ヒトＩｇＦａｂに対して有する。

これらの結果は、ヒト化抗体がＣＡ２１５に対する抗原結合特異性を保持し、かつマウスの特徴を排除したヒトの特徴を有することを示す。

［実施例８］
ＣＡ２１５の存在に関する癌細胞系統（株）の解析

ＡＴＣＣ及びその他からの３０を上回る癌細胞系統（株）におけるＲＰ２１５特異的エピトープ（１以上）の存在は、ウェスタンブロットアッセイ及びサンドイッチＥＩＡを使用してテストされてきた。以下の癌細胞系統は、癌細胞抽出物における、そして細胞を培養した培地上澄におけるＲＰ２１５関連エピトープの存在に関してポジティブであることが示された（＞９０％）。

乳癌細胞系統：
MCF7 (HTB-22)、MDA-MB-231 (HTB-26)、MDA-MB-468(HTB-132)、MDA- 435、SW-48(CCL-231)、T-47D (HTB-133)

子宮頚癌細胞系統：
C-33A(HTB-31)、ME-180(HTB-33)

結腸癌（ないし大腸癌）細胞系統：
HCT115(ABM)、HCT116 (CCL-247)、HT29 (HTB-38)

肝臓癌細胞系統：
Hep3B(HB-8064)、HepG2 (HB-8065)、Hep-2 (CCL-23)

腎臓癌細胞系統：
293(UBC)

肺癌細胞系統：
A549(CCL-185)、Calu-6(HTB-56)、H441(HTB-174)、MRC-5(CCL-171)、WI-38 (CCL-75)

リンパ腫
HEL(ABM)

メラノーマ：
MMAN、MMRU、SK-Mel-3 (HTB-69)

神経芽細胞腫：
SH-SY5Y(CRL-2266)、Neuro2A(CCL-131)

骨癌細胞系統：
U-20S (HTB-96)

卵巣癌細胞系統：
Skov-3(HTB-77)、OC-3-VGH(台湾)

前立腺癌細胞系統：
DU145(HTB-81)、PC-3 (CRL-1435)

しかしながら、いくつかの癌細胞系統において、ＲＰ２１５特異的エピトープの存在は、容易に示すことができない。それらは、SiHa(HTB-35、（子宮）頚)、JEG-3 (HTB-36、胎盤)、Jurkat(TIB-152、Ｔ−細胞白血病)である。

Claims

ＦＲ１と、ＣＤＲ１重鎖様配列の一部と、ＦＲ１及びＣＤＲ１の間の接合部の近くに位置するスレオニン又はセリングリコシル化サイトにカップルされる糖（carbohydrate）とから成るエピトープの一部を模倣するＲＰ２１５モノクローナル抗体に対する抗イディオタイプ抗体を含み、
被験体におけるＣＡ２１５を発現する癌を処置する方法に使用される、医薬組成物。
被験体がヒトであることを特徴とする請求項１に記載の医薬組成物。
被験体が動物腫瘍モデルであることを特徴とする請求項１に記載の医薬組成物。
サンプルにおけるＣＡ２１５を検出する方法であって、
前記サンプルを、抗ヒトＩｇＧ抗体又はその免疫特異性フラグメントを結合させた固形支持体と接触させること、
前記支持体と、標識された、若しくはその後に標識を含むように修飾ないし修正された、ＲＰ２１５モノクローナル抗体、ＣＡ２１５と交差反応性の抗体、又は、それらの免疫特異性フラグメントと、を接触させること、
を含む方法。
サンプル中のＣＡ２１５を検出する方法であって、
該方法は、サンドイッチ法の免疫アッセイを実行することを含み、
サンドイッチ法において使用されるメンバーの１つは、ＲＰ２１５抗体であり、かつ、サンドイッチ法において使用される他のメンバーはヒトＩｇＧと免疫反応性の抗体であること、
を特徴とする方法。