JP5275898B2 - Evaluation method of skin condition - Google Patents
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Description
本発明は、化粧料の選択に好適な皮膚状態の評価方法に関し、詳しくは、角層中におけるAGEs（Advanced Glycation end products：AGEs）含有量を指標とする皮膚状態の評価方法に関する。更に、本発明は、前記皮膚状態の評価方法に基づく化粧料の選択方法に関する。
The present invention relates to a skin condition evaluation method suitable for selecting a cosmetic, and more particularly to a skin condition evaluation method using AGEs (Advanced Glycation end products: AGEs) content in the stratum corneum as an index. Furthermore, the present invention relates to a cosmetic selection method based on the skin condition evaluation method.
アミノ酸及び還元糖を加熱することにより褐色の色素が生成する糖化反応は、１９１２年にL．C．Maillardにより発見されたことからメイラ−ド反応として知られる様になった。メイラ−ド反応は、アミノ酸が有するアミノ基とグルコ−スなどの還元糖が有するカルボニル基が非酵素的に反応することによりシッフ塩基を形成した後、中間体のエナミノ−ルを経由し、アマドリ転移反応などによりアマドリ化合物を生成する。アマドリ化合物及びアマドリ化合物より生成したα−ジカルボニル化合物、シッフ塩基などの化合物は、更に分解反応、脂質過酸化反応、転移反応や縮合反応を経由し、終末糖化産物（Advanced Glycation end products：AGEs）を生成する。AGEsは、その特性により数十種類の化合物（例えば、クロスリン、ピロピリジン、ペントシジン、ピラリン、カルボキシメチルリジンなど）が存し、様々な性質を示すことが知られている。 A saccharification reaction in which a brown pigment is produced by heating amino acids and reducing sugars was performed in 1912. C. It became known as Maillard reaction because it was discovered by Maillard. In the Maillard reaction, an amino group of an amino acid and a carbonyl group of a reducing sugar such as glucose react with each other non-enzymatically to form a Schiff base, then through an intermediate enaminol, Amadori compounds are produced by a transfer reaction or the like. Amadori compounds and compounds produced from Amadori compounds, such as α-dicarbonyl compounds and Schiff bases, undergo further degradation reactions, lipid peroxidation reactions, transfer reactions, and condensation reactions to produce advanced glycation end products (AGEs). Is generated. AGEs are known to exhibit various properties due to tens of kinds of compounds (for example, crosslin, pyropyridine, pentosidine, pyralin, carboxymethyllysine, etc.) depending on their characteristics.
AGEsには、AGE化した蛋白質（AGE修飾蛋白質）をリガンドとして認識するAGE受容体の存在が明らかとなっている。該受容体は、サイトカインや成長因子の産生亢進などの細胞情報伝達系に作用（例えば、非特許文献１を参照）することにより、様々な生物活性を引き起こし、糖尿病性血管合併症、動脈硬化、アルツハイマ−病などの様々な疾患と深く関与していること（例えば、非特許文献２を参照）が知られている。また、皮膚に関しては、表皮（例えば、特許文献１を参照）及び真皮（例えば、特許文献２を参照）におけるAGEsの存在は、既に知られている。特に、真皮AGEsに関する研究は盛んに行われており、真皮AGEsの産生を抑制することによる皮膚老化防止又は改善（例えば、特許文献３を参照）、美白剤を併用した皮膚外用剤による美白作用（例えば、特許文献４を参照）などが知られている。一方、表皮AGEs、特に、角層AGEsに関しては、その存在は明らかになっているものの、その役割等に関する研究はほとんどなされていない。 In AGEs, the presence of AGE receptors that recognize AGE-modified proteins (AGE-modified proteins) as ligands has been clarified. The receptor causes various biological activities by acting on a cell information transmission system such as increased production of cytokines and growth factors (see, for example, Non-Patent Document 1), thereby causing diabetic vascular complications, arteriosclerosis, It is known to be deeply involved with various diseases such as Alzheimer's disease (see, for example, Non-Patent Document 2). Regarding the skin, the existence of AGEs in the epidermis (for example, see Patent Document 1) and dermis (for example, see Patent Document 2) is already known. In particular, research on dermis AGEs has been actively conducted, and prevention or improvement of skin aging by suppressing production of dermis AGEs (see, for example, Patent Document 3), whitening action by a skin external preparation combined with a whitening agent ( For example, see Patent Document 4). On the other hand, although the existence of epidermal AGEs, particularly stratum corneum AGEs, has been clarified, little research has been conducted on their role and the like.
また、皮膚中におけるAGEs含有量の測定に関しては、本発明者等が既に明らかにしている（例えば、特許文献５を参照）。これにより、真皮中のみならず、角層中にもAGEsが存在することが見出された。さらに、皮膚中におけるAGEsと皮膚の性状に関しては、真皮中におけるAGEs含有量と皮膚の性状との関係に関し、幾つかの報告がなされているが、詳細は明らかにされていない。加えて、角層中におけるAGEs含有量と、皮膚の性態との関係に関しては、これまで何ら検討がなされてこなかった。実際、我々の研究においては、真皮中におけるAGEs含有量と年齢、皮膚弾力性（Ur/Uf）等の指標との間には、有意な相関関係が認められた。しかしながら、角層中におけるAGEs含有量と前記の皮膚性状の指標との間には、相関関係が認められなかった。このことは、皮膚の両部位におけるAGEs含有量と、皮膚の性状との関係は全く異なることを示唆している。これらとは別に、角層の形状、形態に付いては、皮膚の性状との関係が多数明らかにされており、例えば、厚さ、扁平の程度、重層剥離の有無などが皮膚バリア機能、皮膚保湿機能に深く関係していること、角層中のメラニンの量と分布状況がくすみや色黒感に関与していること等が明らかにされている（例えば、特許文献６、特許文献７、特許文献８、特許文献９、特許文献１０、特許文献１１、特許文献１２、特許文献１３、特許文献１４を参照）。しかし、これらの中にはAGEsに関係するものも、皮膚柔軟性や皮膚表面形態との関係に関わるものは存しない。皮膚表面形態に関しては、角層からの情報は得がたく、皮膚レプリカの観察に依存するのが常であった。他方、角層を用いた皮膚性状の鑑別においては、皮膚バリア機能、皮膚保湿機能、くすみなどとの相関関係の高さから、個人個人に適合した化粧料の選択などに利用されており、前記の機能以外への発展と応用の拡大が望まれていた。
Moreover, the present inventors have already clarified the measurement of the content of AGEs in the skin (for example, see Patent Document 5). As a result, it was found that AGEs exist not only in the dermis but also in the stratum corneum. Furthermore, regarding the AGEs in the skin and the properties of the skin, some reports have been made regarding the relationship between the content of AGEs in the dermis and the properties of the skin, but details have not been clarified. In addition, no investigation has been made so far regarding the relationship between the AGE content in the stratum corneum and the sexual state of the skin. In fact, in our study, a significant correlation was found between AGE content in the dermis and indices such as age and skin elasticity (Ur / Uf). However, no correlation was observed between the AGE content in the stratum corneum and the above-mentioned skin property index. This suggests that the relationship between the content of AGEs at both sites of the skin and the properties of the skin are completely different. Apart from these, the relationship between the shape and form of the stratum corneum and the properties of the skin has been clarified. For example, the thickness, degree of flatness, presence or absence of delamination, etc. It has been clarified that it is deeply related to the moisturizing function, and that the amount and distribution of melanin in the stratum corneum are involved in dullness and darkness (for example,
本発明は、この様な状況下において為されたものであり、角層を用いた皮膚性状の鑑別において、その鑑別範囲を拡大し、化粧料選択の確度を向上せしめる技術を提供することを課題とする。
The present invention has been made under such circumstances, and it is an object of the present invention to provide a technique for expanding the discrimination range and improving the accuracy of selecting cosmetics in the discrimination of skin properties using the stratum corneum. And
この様な状況に鑑みて、本発明者等は、角層を用いた皮膚性状の鑑別において、その鑑別範囲を拡大し、化粧料の選択の確度を向上せしめる技術を求めて、鋭意努力・研究を重ねた結果、角層中におけるAGEs含有量を指標とする皮膚状態の評価方法、並びに、当該評価方法を用いた化粧料の選択方法を見出し、本発明を完成させるに至った。発明は、以下に示す通りである。
＜１＞角層中におけるAGEs（advanced glycation end products：AGEs）の存在量を指標として、表皮弾力性及び／又は皮膚表面形態から選ばれる皮膚状態を評価することを特徴とする、皮膚状態の評価方法。
＜２＞前記の皮膚表面形態が、平均粗さ（Ra）である、＜１＞に記載の皮膚状態の評価方法。
＜３＞採取された角層中に存在するAGEsを定量し、該AGEsの存在量が多いほど前記皮膚状態が好ましくない状態にあると鑑別することを特徴とする、＜１＞又は＜２＞に記載の皮膚状態の評価方法。
＜４＞角層中におけるAGEs存在量の定量は、１）採取された角層を、AGEsを認識する標識抗体と反応させ、２）角層中における標識存在量を、免疫組織染色した角層の画像を用いた画像解析により推定することを特徴とする、＜１＞〜＜３＞の何れかに記載の皮膚状態の評価方法。
＜５＞化粧料選択のための皮膚状態の評価方法であることを特徴とする、＜１＞〜＜４＞の何れかに記載の皮膚状態の評価方法。
＜６＞＜１＞〜＜５＞の何れかに記載の皮膚状態の評価方法を用いて、表皮弾力性及び／又は皮膚表面形態から選ばれる皮膚状態を評価するステップ、及び
該評価の結果、前記皮膚状態を改善しようとする対象に、AGEs分解剤を含有する化粧料を勧めるステップを有することを特徴とする、方法。
＜７＞前記AGEs分解剤は、モクセイ科に属する植物、ユキノシタ科に属する植物、バラ科に属する植物、マメ科に属する植物又はキク科に属する植物より得られる抽出物であることを特徴とする、＜６＞に記載の方法。
＜８＞前記モクセイ科に属する植物、ユキノシタ科に属する植物、バラ科に属する植物、マメ科に属する植物より得られる抽出物が、モクセイ科オリ−ブ属オリ−ブ、ユキノシタ科ユキノシタ属ユキノシタ、バラ科シモツケソウ属シモツケソウ（別名セイヨウナツユキソウ）、マメ科アスパラトゥス属ルイボス、バラ科ポテンチラ属トルメンチラより得られる植物抽出物であることを特徴とする、＜７＞に記載の方法。
In view of such circumstances, the present inventors have sought for a technique for expanding the discrimination range and improving the accuracy of selection of cosmetics in the discrimination of skin properties using the stratum corneum. As a result, a skin condition evaluation method using the AGEs content in the stratum corneum as an index and a cosmetic selection method using the evaluation method were found, and the present invention was completed. The invention is as follows.
<1> AGEs in the stratum corneum: as an indication of the presence of (advanced glycation end products AGEs), and evaluating the skin condition selected from skin elasticity and / or skin surface morphology, evaluation of skin condition Method.
<2> The skin condition evaluation method according to <1>, wherein the skin surface form is an average roughness (Ra).
<3> AGEs present in the collected stratum corneum are quantified, and as the abundance of the AGEs increases, the skin state is distinguished from being unfavorable, <1> or <2> The evaluation method of the skin condition as described in 2.
<4> Quantification of the amount of AGEs in the stratum corneum: 1) The collected stratum corneum is reacted with a labeled antibody that recognizes AGEs, and 2) the stratum corneum is stained with immune tissue. The skin condition evaluation method according to any one of <1> to <3> , wherein the estimation is performed by image analysis using the image of <1>.
<5> The skin condition evaluation method according to any one of <1> to <4> , which is a skin condition evaluation method for selecting a cosmetic.
<6> Using the skin condition evaluation method according to any one of <1> to < 5 >, a step of evaluating a skin condition selected from epidermal elasticity and / or skin surface morphology, and a result of the evaluation, to a subject in trying to improve the skin condition, characterized by the step of recommending a cosmetic containing the AGEs decomposer, methods.
<7> The AGEs-degrading agent is an extract obtained from a plant belonging to the family Asteraceae, a plant belonging to the family Asteraceae, a plant belonging to the rose family, a plant belonging to the legume family or a plant belonging to the family Asteraceae. , Law who described in <6>.
<8> Plants belonging to the above family Mucaceae, plants belonging to the family Uchinosidae, plants belonging to the family Rosaceae, extracts obtained from plants belonging to the family Legumeaceae, Rosaceae filipendula Shimotsukesou (aka meadowsweet), characterized in that it is a leguminous asparagus toe scan genus rooibos, a plant extract obtained from Rosaceae Potenchira genus Torumenchira, method person according to <7>.
本発明によれば、角層を用いた皮膚性状の鑑別において、その鑑別範囲を拡大し、化粧料選択の確度を向上せしめる技術を提供することが出来る。
ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, in the discrimination of the skin property using a stratum corneum, the technique which expands the discrimination range and improves the precision of cosmetics selection can be provided.
＜本発明の角層中におけるAGEsの存在態様を指標とする皮膚状態の評価方法＞
身体の表面を覆う皮膚は、表皮、真皮及び皮下組織により構成され、表皮はさらに、角層、顆粒層、有棘層及び基底層より構成されている。角層は、ケラチンなどの蛋白質を主成分とし、様々な外部からの刺激に対し肌を守る「バリア機能」、肌内部の水分蒸散を防ぐ「保湿機能」という２つの大切な役割を担っている。表皮の最も外側に位置する角層は、皮膚生理学的に重要な前記機能を果たすのに加え、角層の状態そのものが皮膚状態として人目に触れるために、美容上においても大きな意義を持つ。このため、角層中におけるバイオマ−カ−を指標とする非侵襲的な皮膚状態の評価方法は、皮膚生理学的な情報を簡便に入手し、定量的に評価できる重要な方法である。加えて、第三者により認識される見た目の皮膚状態を評価方法に直接的に反映することが出来るために、非常に有用な皮膚状態の評価方法になり得ると考えられる。
<Evaluation method of skin condition using AGEs in the stratum corneum of the present invention as an index>
The skin covering the surface of the body is composed of the epidermis, dermis and subcutaneous tissue, and the epidermis is further composed of a horny layer, a granular layer, a spiny layer and a basal layer. The stratum corneum is mainly composed of proteins such as keratin and plays two important roles: "barrier function" that protects the skin against various external stimuli and "moisturizing function" that prevents moisture transpiration inside the skin. . The stratum corneum located on the outermost side of the epidermis has the great significance in cosmetics because the stratum corneum itself touches the human eye as the skin state in addition to performing the above-mentioned functions important in skin physiology. For this reason, the non-invasive skin condition evaluation method using the biomarker in the stratum corneum as an index is an important method capable of easily obtaining and quantitatively evaluating skin physiological information. In addition, since the apparent skin condition recognized by a third party can be directly reflected in the evaluation method, it can be considered to be a very useful evaluation method for the skin condition.
本発明の皮膚状態の評価方法は、皮膚状態を評価するのに際し、角層中に存在するAGEsの存在態様を指標とすることを特徴とする。ここにおいて、用いる角層は、皮膚表面、好ましくは、顔面の皮膚、より好ましくは、頬部の皮膚より採取されたものを用いることが好ましく、前記採取は、薄いプラスチック板に粘着剤を塗布してなる粘着ディスク、乃至は、透明テ−プに粘着剤を塗工してなる粘着テ−プを貼布し、剥離して得られた角層を透明粘着テ−プに転写したサンプルを用いることが好ましい。かくして得られた角層標本は、二分して、一方をAGEs測定用に、もう一方を角層の形状観察用に用いることが好ましい。かくして得られた角層標本についての、本発明の角層中におけるAGEsの存在態様とは、角層中におけるAGEsの組成、濃度、存在量、分布などの存在状態を意味し、これらの内では、角層中におけるAGEsの存在量、即ち、角層中におけるAGEsの存在量が多いか、少ないかを指標とすることが好ましい。特に、角層中におけるAGEsの存在量は、角層が採取された部分の皮膚状態を厳密に反映する。後述の通り、角層中におけるAGEsの存在量には、皮膚性状や皮膚表面形態との間に相関関係が認められる。皮膚性態や皮膚表面形態を表す物性値としては、「表皮弾力性」及び「皮膚表面形態」等が好適に例示出来、前記皮膚表面形態としては、「平均粗さ（Ra）」が好適に例示出来る。皮膚表面形態の「平均粗さ（Ｒａ）」は、それぞれ水平又は垂直方向の平均粗さ（Ra）を表し、具体的には、皮膚表面における皮溝の深さを意味し、肌の肌理を表現するパラメ−タ−として使用される。角層中におけるAGEsの存在量と「表皮弾力性」及び「皮膚表面形態」との関係には、「AGEsの存在量が少ないほど、皮膚表皮弾力性が向上する」、又は、「AGEsの存在量が少ないほど、皮膚表面形態の水平又は垂直方向への平均粗さ（Ra）は大きく、肌理細かい、好ましい皮膚状態にあるといえる」など関係が見出されている。これは、コラ−ゲン部分におけるメイラ−ド反応により生じるAGEsが、コラ−ゲン部分同士を架橋構造させることにより、皮膚構造を構築する分子構造が硬化し、本来、皮膚が有する弾力性が失われることにより起こる。また、AGEsより生成する架橋物を異物と判断し、分解酵素（コラゲナーゼ、エラスターゼ）の分泌量が増えることにより、肌のハリや弾力性が失われ、また肌が脆くなると考えられる。この様な真皮膚において観察される現象が、角層においても同様に起こっていると考えられる。前記の現象が意味するところは、角層中におけるAGEsの多少と、肌のハリ、弾力、肌理、皮膚表面構造と良好な相関関係が存し、角層中のAGEsの多少を鑑別すれば、肌のハリ、皮膚表面形態の肌理などをキュ−トメ−タ−などの測定装置を用いることなく、レプリカを取ることなく、これらの評価項目を確度の高い推測がなし得ることを意味する。加えて、角層など、皮膚に存在するAGEsを分解、除去することにより、AGEsに起因する弾力の消失、皮膚表面構造の変化を好ましい方向へ戻すことも可能であることも示している。 The skin condition evaluation method of the present invention is characterized in that, when evaluating the skin condition, the presence mode of AGEs present in the stratum corneum is used as an index. Here, the stratum corneum to be used is preferably one collected from the skin surface, preferably the skin of the face, more preferably from the skin of the cheek, and the sampling is performed by applying an adhesive to a thin plastic plate. A sample obtained by applying a pressure-sensitive adhesive disk or a pressure-sensitive adhesive tape formed by applying a pressure-sensitive adhesive to a transparent tape and transferring the peeled layer to the transparent pressure-sensitive adhesive tape is used. It is preferable. The stratum corneum specimen thus obtained is preferably divided into two parts, one for AGEs measurement and the other for observing the shape of the stratum corneum. The AGEs present in the stratum corneum of the present invention for the thus obtained stratum corneum means the state of existence of the composition, concentration, abundance, distribution, etc. of AGEs in the stratum corneum. It is preferable to use as an index the amount of AGEs present in the stratum corneum, that is, whether the amount of AGEs present in the stratum corneum is large or small. In particular, the abundance of AGEs in the stratum corneum accurately reflects the skin condition of the portion from which the stratum corneum was collected. As will be described later, there is a correlation between the abundance of AGEs in the stratum corneum and the skin properties and skin surface morphology. As physical property values representing skin condition and skin surface form, “skin elasticity” and “skin surface form” can be preferably exemplified, and as the skin surface form, “average roughness (Ra)” is preferred. It can be illustrated. The “average roughness (Ra)” of the skin surface form represents the average roughness (Ra) in the horizontal or vertical direction, and specifically means the depth of the skin groove on the skin surface. Used as a parameter to express. The relationship between the amount of AGEs in the stratum corneum and “skin elasticity” and “skin surface morphology” is “the smaller the amount of AGEs, the better the skin elasticity,” or “the presence of AGEs. The smaller the amount, the larger the average roughness (Ra) of the skin surface form in the horizontal or vertical direction, and it can be said that the skin surface is fine and is in a preferable skin state. This is because AGEs generated by the Maillard reaction in the collagen part cross-link the collagen parts, the molecular structure that builds the skin structure is cured, and the elasticity inherent in the skin is lost. It happens. In addition, it is considered that the cross-linked product produced from AGEs is judged as a foreign substance, and the secretion amount of degrading enzymes (collagenase, elastase) is increased. Such a phenomenon observed in the dermis is considered to occur in the stratum corneum as well. The above-mentioned phenomenon means that there is a good correlation with the degree of AGEs in the stratum corneum, skin firmness, elasticity, texture, skin surface structure, and if the AGEs in the stratum corneum are differentiated, This means that it is possible to estimate these evaluation items with a high degree of accuracy without using a measuring device such as a curator, and taking a replica of skin firmness, skin surface morphology, and the like. In addition, it has also been shown that by decomposing and removing AGEs present in the skin, such as the stratum corneum, it is possible to return the loss of elasticity due to AGEs and the change of the skin surface structure to a preferred direction.
本発明の角層中におけるAGEsの存在量は、採取された角層中におけるAGEsの存在量を化学的又は生化学的分析方法等により測定し、定量的に評価することが出来る。前述の如く、角層中におけるAGEsを測定するための角層標本は、採取された角層をそのまま角層標本として皮膚状態の評価に使用することも出来るし、採取された角層を媒体等に転写するなどして作製された角層標本を、皮膚状態の評価に使用することも出来る。ここで、角層を採取する方法の一例を挙げれば、市販の粘着テ−プ等を利用し、頬部よりテ−プストリッピングにより採取した角層をスライドグラスに転写することにより、皮膚状態を評価するための角層標本を作製することが出来る。 The abundance of AGEs in the stratum corneum of the present invention can be quantitatively evaluated by measuring the abundance of AGEs in the collected stratum corneum by a chemical or biochemical analysis method or the like. As described above, the stratum corneum sample for measuring AGEs in the stratum corneum can be used as a stratum corneum sample as it is for skin condition evaluation, or the collected stratum corneum can be used as a medium. The stratum corneum specimen produced by transferring to the skin can also be used for evaluation of the skin condition. Here, an example of a method for collecting the stratum corneum is to use a commercially available adhesive tape or the like, and transfer the stratum corneum collected by tape stripping from the cheek to a slide glass to thereby change the skin condition. A stratum corneum specimen for evaluation can be prepared.
本発明における採取された角層標本を用い角層中におけるAGEsの存在量を測定する方法としては、得られた角層標本をホモジネートし、これによりAGEsを抽出して、これを高速液体クロマトグラフ法などの化学的分析方法、又は、角層中におけるAGEsを特異的に認識する抗体を利用した直接又は間接法による免疫組織染色方法等の生化学的分析方法の何れかを単独で用いることも出来るし、それらを組み合わせて用いることも出来る。これらの内、好ましいものとしては、AGEsを特異的に認識する抗体によりAGEsを標識した後、発色試薬を用いて染色する免疫組織染色方法による生化学的分析方法を用いることが好ましい。具体的には、免疫組織染色方法に用いる一次抗体としては、Anti AGE monoclonal antibody（mouse、TransGenic社製）、二次抗体としては、Biotin−Rabbit Anti Mouse IGg conjugate、ZYMED社製）を用い、二次抗体を認識するABC試薬（R．Ｔ．U VＥＣＴＡＳＴＡＩＮ社製）、さらには、発色試薬として、ＡＥＣ基質を反応させ、免疫組織染色することが好適に例示出来る。また、前記の一次抗体以外に、一次抗体としてCML（carboxy
methyl lysine、TransGenic社製）及びペントシジン（TransGenic社製）、二次抗体として、蛍光ビオチンやFITC標識抗体等を使用することも可能である。
As a method of measuring the abundance of AGEs in the stratum corneum using the sampled stratum corneum in the present invention, the obtained stratum corneum is homogenized, and thereby AGEs are extracted, and this is subjected to high performance liquid chromatography. Either a chemical analysis method such as a method or a biochemical analysis method such as a direct or indirect immunohistochemical staining method using an antibody that specifically recognizes AGEs in the stratum corneum They can be used in combination. Of these, those not preferable, after labeling the AGEs by antibodies which specifically recognize AGEs, it is preferable to use a biochemical analysis method according to immunohistochemical staining method for staining using a chromogenic reagent. Specifically, Anti AGE monoclonal antibody (mouse, manufactured by TransGenic) is used as the primary antibody used in the immunohistochemical staining method, and Biotin-Rabbit Anti Mouse IGg conjugate (manufactured by ZYMED) is used as the secondary antibody. An ABC reagent (manufactured by R. T. VECTASTAIN Co., Ltd.) that recognizes the next antibody, and further, as an chromogenic reagent, an AEC substrate can be reacted and immunohistological staining can be suitably exemplified. In addition to the primary antibody, CML (carboxy
Methyl lysine (manufactured by TransGenic) and pentosidine (manufactured by TransGenic) and secondary antibodies such as fluorescent biotin and FITC-labeled antibody can also be used.
前記の免疫組織染色により染色された角層中におけるAGEsは、赤〜赤橙色に染色される。免疫組織染色法により作製された角層AGEs標本を用い、角層中におけるAGEsの存在量を定量する方法としては、角層AGEs標準標本を用いた目視による角層AGEs標本のスコア化方法、更には、角層AGEs標本より得られる画像をコンピュ−タ−等の媒体に取り込んだ後、RGB分解処理、二値化処理等の画像処理を行い、輝点の数などで定量化する、或いは、得られた画像を目視によりスコア化する方法及び／又は画像解析による方法等が好適に例示出来る。 AGEs in the stratum corneum stained by the immunohistochemical staining are stained red to red-orange. Using a stratum corneum AGEs specimen prepared by immunohistochemical staining, as a method of quantifying the abundance of AGEs in the stratum corneum, scoring method of the stratum corneum AGEs specimen by visual observation using stratum corneum AGEs standard specimen, The image obtained from the stratum corneum AGEs sample is taken into a medium such as a computer, and then subjected to image processing such as RGB decomposition processing and binarization processing, and is quantified by the number of bright spots, or the like. A method of scoring the obtained image visually and / or a method by image analysis can be suitably exemplified.
角層AGEs標準標本を用いた目視による角層AGEs標本のスコア化方法としては、免疫組織染色により得られる異なる角層中におけるAGEsの存在量が異なる標準標本を用い、角層中におけるAGEsの存在量をスコア化することにより定量化する方法が好適に例示出来る。前記の免疫組織染色された角層AGEs標本においては、角層AGEs部分は、赤〜赤橙色に染色される。角層中におけるAGEsの染色強度（存在量）が異なる角層AGEs標準標本を基に、各角層AGEs標本をスコア化することにより定量化することが可能である。また、本方法における角層AGEs標本より得られるスコア値は、後記の表皮弾力性及び／又は皮膚表面状態（平均粗さ：Ra）との間に相関関係が認められる。 As a scoring method of the horny layer AGEs specimen by visual observation using the horny layer AGEs standard specimen, the presence of AGEs in the stratum corneum is determined by using standard specimens with different AGEs in different stratum corneum obtained by immunohistochemical staining. A method of quantifying the amount by scoring the amount can be suitably exemplified. In the above-mentioned stratum corneum AGEs specimen immunostained, the stratum corneum AGEs portion is stained red to red-orange. It is possible to quantify by scoring each stratum corneum AGEs specimen based on a stratum corneum AGEs standard specimen having a different staining intensity (abundance) of AGEs in the stratum corneum. Moreover, the score value obtained from the stratum corneum AGEs specimen in the present method has a correlation with epidermal elasticity and / or skin surface condition (average roughness: Ra) described later.
また、角層中におけるAGEsの存在量を定量する方法として、角層標本より得られる画像をコンピュ−タ−等の媒体に取り込んだ後、角層AGEs標準標本を用いてスコア化する方法、又は、画像解析する方法が存する。具体例を挙げれば、顕微鏡にて２０〜５０倍に拡大された染色された角層AGEs標本の拡大画像をデジタル式のマイクロスコ−プ等を利用して、コンピュ−タに取り込み、汎用的な画像解析ソフトウエアを用いて、手動又は自動処理を行い、AGEsの存在量を定量化することが出来る。デジタル式のマイクロスコ−プとしては、例えば、（株）モリテックスのコスメテック用マイクロスコ−プ、汎用的画像解析のソフトウエアとしては、例えば、三谷商事（株）のWinRooF（登録商標）が好適に例示出来る。画像処理は、一般的な手法によって行えばよく、例えば、角層AGEs標本の拡大イメ−ジ画像であるカラ−画像をモノクロ濃淡画像に変換後、当該モノクロ画像に必要に応じてフィルタ−を処理後、二値化処理を行い、統計処理によって角層AGEsの存在割合に相関する染色部の総面積を算出すればよい。 In addition, as a method for quantifying the abundance of AGEs in the stratum corneum, after taking an image obtained from the stratum corneum sample into a medium such as a computer, scoring using a standard stratum corneum AGEs sample, or There is a method for image analysis. As a specific example, a magnified image of a stained stratum corneum AGEs specimen magnified 20 to 50 times with a microscope is taken into a computer using a digital microscope, etc. Image analysis software can be used to perform manual or automatic processing to quantify the abundance of AGEs. As the digital microscope, for example, Moritex Co., Ltd. cosmetics microscope microscope, and as the general-purpose image analysis software, for example, Mitani Corporation's WinRooF (registered trademark) is suitable. Can be illustrated. The image processing may be performed by a general method. For example, a color image, which is an enlarged image image of a stratum corneum AGEs sample, is converted into a monochrome grayscale image, and then the monochrome image is processed as necessary. Thereafter, binarization processing is performed, and the total area of the stained portion correlated with the existence ratio of the stratum corneum AGEs may be calculated by statistical processing.
かくして得られた角層中におけるAGEsの存在量を定量した値は、表皮弾力性及び皮膚表面形態（特に、水平又は垂直方向への平均粗さ（Ra））等の皮膚状態を表す物性値との間に相関関係が認められる。即ち、「角層中におけるAGEsの存在量が少ないほど、皮膚表皮弾力性が向上する」、又は、「角層中におけるAGEsの存在量がすくないほど、水平又は垂直方向への平均粗さ（Ra）が大きく（皮膚表面における皮溝が大きく）、肌の肌理が細かい好ましい皮膚状態にある」ことを意味する。 The values obtained by quantifying the abundance of AGEs in the stratum corneum thus obtained are physical property values representing skin conditions such as skin elasticity and skin surface morphology (in particular, horizontal or vertical average roughness (Ra)). There is a correlation between the two. That is, “the smaller the amount of AGEs in the stratum corneum, the better the skin epidermal elasticity” or “the less the amount of AGEs in the stratum corneum is, the less the average roughness (Ra ) Is large (the skin groove on the skin surface is large) and the skin texture is fine and in a preferable skin state.
かくして得られた、角層中におけるAGEs量の定量値、該AGEsの定量値より求められた、皮膚の弾力、皮膚表面構造の状態の示性値は、従前に行われていた、角層の形状、採取の際の剥離形態(重層剥離の有無)、角層におけるメラニンの分布状況などのデ−タと共に化粧料の選択のためのデ−タとして用いることが好ましい。かかる化粧料の選択に際しては、既にAGEs分解作用を有する生薬成分が認められていることから、AGEsの過剰な産生に対して、後記に示す様なAGEs分解作用を有する成分を含有する化粧料を選択する、選択肢を設けることが好ましい。
The quantitative value of the amount of AGEs in the stratum corneum thus obtained, the elasticity value of the skin obtained from the quantitative value of the AGEs, the indication value of the state of the skin surface structure, It is preferable to use it as data for selection of cosmetics together with data such as shape, peeling form at the time of collection (presence / absence of multi-layer peeling), and distribution of melanin in the stratum corneum. In selecting such cosmetics, since herbal medicine components having AGEs-degrading action have already been recognized, cosmetics containing components having AGEs-degrading action as described below are used for excessive production of AGEs. It is preferable to provide an option for selection.
＜本発明の化粧料の必須成分であるAGEs分解剤＞
本発明におけるAGE分解剤は、後記のAGEs分解作用評価において、AGEs分解作用を有する植物抽出物を意味し、かかる成分を唯１種のみを含有することも出来るし、２種以上を組み合わせて含有させることも出来る。ここで、本発明の抽出物とは、抽出物自体、抽出物の分画、精製した分画、抽出物乃至は分画、精製物の溶媒除去物の総称を意味する。本発明のAGEs阻害作用を有する植物抽出物としては、モクセイ科に属する植物、ユキノシタ科に属する植物、バラ科に属する植物、マメ科に属する植物、キク科に属する植物より得られる抽出物が好適に例示出来、より好ましくは、モクセイ科オリーブ属オリーブ、ユキノシタ科ユキノシタ属ユキノシタ、バラ科シモツケソウ属シモツケソウ（別名：セイヨウナツユキソウ）、マメ科アスパラトゥス属ルイボス、バラ科ポテンチラ属トルメンチラより得られる植物抽出物が好適に例示出来る。
<AGEs decomposition agent which is an essential component of the cosmetics of the present invention>
The AGE degrading agent in the present invention means a plant extract having an AGEs degrading action in the AGEs degrading action evaluation described later, and can contain only one kind of such components or contain two or more kinds in combination. You can also make it. Here, the extract of the present invention means a general term for the extract itself, the fraction of the extract, the purified fraction, the extract or fraction, and the solvent-removed product of the purified product. As the plant extract having an AGEs inhibitory action of the present invention, an extract obtained from a plant belonging to the family Asteraceae, a plant belonging to the family Asteraceae, a plant belonging to the rose family, a plant belonging to the legume family, or a plant belonging to the family Asteraceae is suitable. More preferably, it is a plant extract obtained from olives of the genus Oleaceae, Yukinosita, Yukinosita, Rhizome of the genus Oleaceae (also known as Eustoma japonicus), legumes Asparatus rooibos, Rosaceae genus Tormentilla A thing can be illustrated suitably .
地中海地方が原産地とされるモクセイ科オリ−ブ属オリ−ブは、日本においては、香川県、岡山県などで栽培され、果実は、オリ−ブオイルやピクルスを作るために使用されている植物である。本発明のオリ−ブの抽出物は、オリ−ブ自体を裁断、破砕、粉砕等して含有させたものであってもよいが、好ましくは植物体の全部乃至は一部或いはその加工物を溶媒で抽出したエッセンスを有効成分として含有させる。なお、前記成分はオリーブの植物体の一部又は全部であれば特段の限定無く得ることができ、例えば、果実、果皮、樹皮、幹、枝、葉、花、根、種子等が挙げられる。日本及び中国を原産地とするユキノシタ科ユキノシタ属ユキノシタは、山地の日陰や谷川沿いに自生する常緑の多年草であり、民間薬としても利用されている。本発明のユキノシタの抽出物は、ユキノシタの植物体の一部及び／又は全部であれば特段の限定無く得ることができ、例えば、樹皮、幹、枝、葉、花、根、種子等が挙げられる。これらは単独の部位を用いてもよいし、２部位以上を用いてもよい。これらの内最も好ましい部位は枝葉である。インドから中国大陸を原産地とするバラ科シモツケソウ属シモツケソウ（別名：セイヨウナツユキソウ）は、日本においては、本州以西に自生する多年草である。本発明のシモツケソウ（セイヨウナツユキソウ）より得られる抽出物は、かかる植物の抽出物の製造に用いる植物体の部位としては、特段の限定がされず、全草を用いることができるが、花又は花序を用いることが特に好ましい。勿論、葉、茎、根などの部位のみを使用することも可能である。南アフリカ共和国を原産とするマメ科アスパラトゥス属ルイボスは、乾燥した葉が、健康茶などに使用されている。かかる植物の抽出物の製造に用いる植物体の部位としては、特段の限定がされず、全草を用いることができるが、葉を用いることが特に好ましい。勿論、花穂、花蕾、葉、茎、根などの部位のみを使用することも可能である。ヨ−ロッパを原産とするバラ科ポテンチラ属トルメンチラは、根茎が薬用に用いられる多年草である。かかる植物の抽出物の製造に用いる植物体の部位としては、特段の限定がされず、全草を用いることができる。勿論、花穂、花蕾、葉、茎、根などの部位のみを使用することも可能である。本発明における前記の植物より得られる抽出物は、日本に於いて自生又は生育された植物、漢方生薬原料などとして販売される日本産のものを用い抽出物を作製することも出来るし、丸善株式会社などの植物抽出物を扱う会社より販売されている市販の抽出物を購入し、使用することも出来る。抽出に際し、植物体、地上部又は木幹部は予め、粉砕或いは細切して抽出効率を向上させるように加工することが好ましい。 The olive genus Olive, which is the origin of the Mediterranean region, is cultivated in Kagawa Prefecture, Okayama Prefecture, etc. in Japan, and the fruit is a plant used to make olive oil and pickles. is there. The olive extract of the present invention may be obtained by cutting, crushing, pulverizing, etc. the olive itself, but preferably all or part of the plant body or a processed product thereof. An essence extracted with a solvent is contained as an active ingredient. The component can be obtained without particular limitation as long as it is a part or the whole of an olive plant, and examples thereof include fruit, pericarp, bark, trunk, branch, leaf, flower, root and seed. Yukinosita, a genus from the Japan and China, is an evergreen perennial that grows naturally in the shade of mountains and along the Tanigawa River, and is also used as a folk medicine. The extract of Yukinoshita of the present invention can be obtained without particular limitation as long as it is a part and / or whole of the plant of Yukinoshita, and examples thereof include bark, trunk, branch, leaf, flower, root, seed and the like. It is done. These may use single site | parts and may use 2 or more site | parts. Of these, the most preferred site is the branches and leaves. Originating from the mainland of India to the Chinese continent, the genus Pleurotus genus Pleurotus is also a perennial that grows naturally in the west of Honshu in Japan. The extract obtained from the flower of the present invention is not particularly limited, and the whole plant can be used as a part of the plant used for producing the extract of the plant. It is particularly preferred to use inflorescences. Of course, it is also possible to use only parts such as leaves, stems and roots. The legume Aspartus rooibos, native to South Africa, has dried leaves that are used for health teas. The plant part used for the production of the plant extract is not particularly limited, and whole plants can be used, but leaves are particularly preferable. Of course, it is also possible to use only parts such as flower ears, flower buds, leaves, stems and roots. The Rosaceae Potentira genus Tormentilla, which is native to Europe, is a perennial plant whose rhizome is used for medicinal purposes. The plant part used for the production of the plant extract is not particularly limited, and whole plants can be used. Of course, it is also possible to use only parts such as flower ears, flower buds, leaves, stems and roots. The extract obtained from the above-mentioned plant in the present invention can be prepared using a plant grown in Japan, or a plant made in Japan sold as a herbal medicine raw material, etc. Commercial extracts sold by companies that handle plant extracts such as companies can be purchased and used. In the extraction, the plant body, the above-ground part or the tree trunk part is preferably processed in advance so as to improve the extraction efficiency by crushing or chopping.
＜試験例１： 本発明のAGEs分解作用を有する植物抽出物の製造＞
バラ科ポテンチラ属トルメンチラの全草の乾燥物１００ｇを、細切した後、５００ｍＬの５０％エタノ−ル水溶液を加えて３時間、加熱還流し、冷却後濾過にて不溶物を取り除いた後、減圧濃縮し、ついで凍結乾燥し、抽出物１を得た。しかる後に、抽出物１に２００ｍＬの水と２００ｍＬの酢酸エチルを加え、液液抽出を行い、酢酸エチル相をとり、減圧濃縮し、抽出物２を得た。
<Test Example 1: Production of plant extract having AGEs decomposition action of the present invention>
After chopping 100 g of a dried product of the whole plant of the genus Rosaceae Tormentilla, 500 mL of 50% ethanol aqueous solution is added and heated under reflux for 3 hours. After cooling, the insoluble material is removed by filtration and then the pressure is reduced. Concentrated and then lyophilized to obtain
＜試験例２： AGEs分解作用評価（α−ジケトンのＣ−Ｃ結合切断能の測定）＞
２２ｍＭ １−フェニル−１，２−プロパンジオン／メタノ−ル＋０．１Ｍ リン酸緩衝液（ＰＨ７．４） １ｍＬと、ポテンチラ属の植物の抽出物乃至は分画精製物１ｍＬを混合し、３７℃で１０時間反応させ、安息香酸の量をＨＰＬＣにて定量した。
（ＨＰＬＣ条件）
分析条件 検出器 ：紫外吸光光度計（測定波長：２６０ｎｍ）
カラム ：東ソ− ＴＳＫ−ＯＤＳ８０ＴｓＱＡ
カラム温度：室温
移動層 ：氷酢酸２ｇ／アセトニトリル ５００ｍＬ＋エデト酸二ナトリウム溶液（１→２５０） ５００ｍＬ
流量：１ｍｌ／ｍｉｎ
<Test Example 2: AGEs degradation action evaluation (measurement of CC bond cleavage ability of α-diketone)>
1 mL of 22 mM 1-phenyl-1,2-propanedione / methanol + 0.1 M phosphate buffer (PH 7.4) and 1 mL of extract of the plant of the genus Potentilla or fractionated purified product were mixed at 37 ° C. The amount of benzoic acid was quantified by HPLC.
(HPLC conditions)
Analysis conditions Detector: Ultraviolet absorptiometer (measurement wavelength: 260 nm)
Column: Toso-TSK-ODS80TsQA
Column temperature: room temperature moving bed: glacial acetic acid 2 g / acetonitrile 500 mL + edetate disodium solution (1 → 250) 500 mL
Flow rate: 1 ml / min
前記測定において１−フェニル−１，２−プロパンジオンの量からの理論的な安息香酸の生成量に対して、４０％以上、より好ましくは４５％以上あった場合に、本発明の化粧料に含有させるのに適切なAGEs分解作用を有する植物抽出物と判断し、化粧料に配合する。このとき、力価が一定になるように、安息香酸の生成量が４０乃至は４５％になる量に抽出物乃至は分画精製物を水や１，３−ブタンジオールなどで希釈して配合することもできる。 In the measurement, when the amount of 1-phenyl-1,2-propanedione is 40% or more, more preferably 45% or more, based on the theoretical amount of benzoic acid produced, the cosmetic of the present invention is used. Judged as a plant extract having AGEs decomposing action suitable for inclusion, and blended into cosmetics. At this time, the extract or fraction purified product is diluted with water, 1,3-butanediol, etc. so that the titer is constant and the amount of benzoic acid produced is 40 to 45%. You can also
前記の抽出物１、２に付いて、試験例２のAGEs分解作用評価（α−ジケトンのＣ−Ｃ結合切断能の測定）に記載の方法に従い、α−ジケトンのＣ−Ｃ結合切断能の測定を行った。抽出物１は切断能が５６％で、分画精製により有効性を高める必要があることが判明した。分画精製を行った抽出物２は８５．４％であり、化粧料に配合するのに適切な効果を有することがわかった。
About the said
更に、AGEs分解作用としての確実性を期す場合には、前記の評価に加えて、実際にグルコ−スと牛血清アルブミンとをインキュベ−トし作製したAGEsを分解せしめ、分解量を確認した上で配合することが好ましい。AGEsの分解能の評価の一例を次に示す。 In addition, in order to ensure the reliability of AGEs degradation, in addition to the above evaluation, AGEs actually produced by incubating glucose and bovine serum albumin were decomposed and the amount of degradation was confirmed. It is preferable to mix with. An example of AGE resolution evaluation is shown below.
＜試験例２：AGEs分解作用評価２（グルコ−ス−牛血清アルブミンAGEs分解能の測定）＞
以下の試験材料を用い、AGEs分解作用評価を実施した。
AGE-BSA：グルコ−スとBSAを３７℃で１２週間以上インキュベ−トし、ＰＤ−１０ columns（Amersham Biosciences １７−０８５１−０１）にて余分なglucoseを除いたもの、１次抗体 ：Anti-Albumin、Bovine Serum、Rabbit−Poly ROCKLAND ２０１−４１３３１／２００００、２次抗体 ：Goat anti−rabbit IGg horseradish peroxidase conjugate BioRAD １７０−６５１５ １／１００００、基質 ：TBS solution Wako ５４６−０１９１１
（手順）
Tｙｐｅ Ｉ コラ−ゲンコ−トした９６穴マイクロプレ−ト（Bio Coat ３５ ４４０７）に１０μｇ／mLのAGE−BSAを１００μｌ加え、１．０μｇ（AGE−BSA／well） ３７℃にて４時間静置した後、０．０５％Tween２０／PBS（−）にて３回洗浄（マイクロミキサ−上で室温、３分間振とうし）、PBS（−）に溶解した各濃度の試料を１００μｌを加え、３７℃で１０時間以上反応させる。その後、０．０５％Tween２０／PBS（−）にて３回洗浄し、１次抗体を各wellに１００μｌ／ｗｅｌｌ加え、室温で３０分間静置する。０．０５％Tween２０／PBS（−）にて３回洗浄し、２次抗体を１００μｌ／ｗｅｌｌ入れ、室温３０分間静置する。０．０５％Tween２０／PBS（−）にて３回洗浄し、TMBを１００μｌ／ｗｅｌｌ加え、室温１５分反応させる。１Ｎ 塩酸を１００μｌ／ｗｅｌｌ入れ、反応を止め、４５０ｎｍの吸光度を測定する。AGEsの量を変え、検量線を引き、この検量線より残存AGEs量を定量した。残存AGEsを添加したAGEsより減じ、添加したAGEsで除し、１００を乗じてAGEs分解率を算出した。
<Test Example 2: AGEs decomposition action evaluation 2 (glucose-bovine serum albumin AGEs resolution measurement)>
AGEs decomposition action evaluation was implemented using the following test materials.
AGE-BSA: Glucose and BSA were incubated at 37 ° C. for 12 weeks or more, and excess glucose was removed with PD-10 columns (Amersham Biosciences 17-0851-1). Primary antibody: Anti- Albumin, Bovine Serum, Rabbit-Poly ROCKLAND 201-41331 / 20000, secondary antibody: Goat anti-rabbit IGg horseradish peroxidase conjugate BioRAD 170-6515 1/10000, substrate: TBS solution Wako 546-01911
(procedure)
100 μl of 10 μg / mL AGE-BSA was added to Type I collagen-coated 96-well microplate (Bio Coat 35 4407) and left at 1.0 μg (AGE-BSA / well) at 37 ° C. for 4 hours. After washing three times with 0.05% Tween20 / PBS (−) (shaking on a micromixer at room temperature for 3 minutes), 100 μl of each concentration sample dissolved in PBS (−) was added, and 37 React at 10 ° C. for 10 hours or more. Thereafter, the plate is washed 3 times with 0.05
この評価において、AGEsの分解率が１５％以上であった場合には本発明の化粧料への配合に適当な抽出物或いは分画精製物であると判断する。配合に当たっては、分解率が１５％になるように調製して用いれば、安定した力価の成分を含有することができる。又、有効濃度の設定については、かかる検討で有効と認められた濃度を含有する様に設定することが好ましい。 In this evaluation, when the degradation rate of AGEs is 15% or more, it is determined that the extract or fraction purified product suitable for blending into the cosmetic of the present invention. In blending, a component having a stable titer can be contained if it is prepared so as to have a decomposition rate of 15%. The effective concentration is preferably set so as to contain a concentration that is recognized as being effective in this study.
前記の抽出物２に付いて、[００２６]に記載したグルコ−ス−牛血清アルブミンAGEs分解能の測定を行った。抽出物２のAGEs分解率は２３．２５％（１Ｘ１０−５％）、２３．８％（１Ｘ１０−４％）、２５．３８％（１Ｘ１０−３％）であった。分画精製により有効性を高める必要があることが判明した。分画精製を行った抽出物２は８５．４％であり、化粧料に配合するのに適切な効果を有することがわかった。
Glucose-bovine serum albumin AGEs resolution described in [0026] was performed on the
＜本発明のAGEs分解剤を含有する化粧料＞
本発明の化粧料は、採取された角層に付いて、角層の形状の特徴、角層におけるメラニンの存在状況と共に、AGEsの存在態様より鑑別される皮膚状態の評価値が好ましいものではなかった場合、化粧料の必須成分としてAGEs分解剤を含有することを特徴とする。また、本発明の化粧料においては、前記必須成分以外に、通常化粧料で使用される任意成分を含有することが出来る。この様な任意成分としては、スクワラン、ワセリン、マイクロクリスタリンワックスなどの炭化水素類、ホホバ油、カルナウバワックス、オレイン酸オクチルドデシルなどのエステル類、オリ−ブ油、牛脂、椰子油などのトリグリセライド類、ステアリン酸、オレイン酸、レチノイン酸などの脂肪酸、オレイルアルコ−ル、ステアリルアルコ−ル、オクチルドデカノ−ル等の高級アルコ−ル、スルホコハク酸エステルやポリオキシエチレンアルキル硫酸ナトリウム等のアニオン界面活性剤類、アルキルベタイン塩等の両性界面活性剤類、ジアルキルアンモニウム塩等のカチオン界面活性剤類、ソルビタン脂肪酸エステル、脂肪酸モノグリセライド、これらのポリオキシエチレン付加物、ポリオキシエチレンアルキルエ−テル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル等の非イオン界面活性剤類、ポリエチレングリコ−ル、グリセリン、１，３−ブタンジオ−ル等の多価アルコ−ル類、増粘・ゲル化剤、酸化防止剤、紫外線吸収剤、色剤、防腐剤、粉体等を含有することができる。製造は、常法に従い、これらの成分を処理することにより、困難なく、為しうる。
<Cosmetics containing AGEs decomposing agent of the present invention>
The cosmetics of the present invention are not preferable for the collected stratum corneum, and the evaluation value of the skin condition differentiated from the presence of AGEs together with the features of the shape of the stratum corneum and the presence of melanin in the stratum corneum. AGEs decomposing agent as an essential component of cosmetics. Moreover, in the cosmetics of this invention, the arbitrary component normally used by cosmetics other than the said essential component can be contained. Such optional ingredients include hydrocarbons such as squalane, petrolatum, microcrystalline wax, esters such as jojoba oil, carnauba wax, octyldodecyl oleate, triglycerides such as olive oil, beef tallow, coconut oil, etc. , Fatty acids such as stearic acid, oleic acid, retinoic acid, higher alcohols such as oleyl alcohol, stearyl alcohol, octyldodecanol, anionic surface activity such as sulfosuccinic acid ester and sodium polyoxyethylene alkyl sulfate Agents, amphoteric surfactants such as alkylbetaine salts, cationic surfactants such as dialkylammonium salts, sorbitan fatty acid esters, fatty acid monoglycerides, polyoxyethylene adducts thereof, polyoxyethylene alkyl ethers, polyoxyethylenes Nonionic surfactants such as fatty acid esters, polyhydric alcohols such as polyethylene glycol, glycerin, 1,3-butanediol, thickening / gelling agents, antioxidants, UV absorbers, Coloring agents, preservatives, powders and the like can be contained. Manufacture can be done without difficulty by treating these components according to conventional methods.
これらの必須成分、任意成分を常法に従って処理し、ロ−ション、乳液、エッセンス、クリ−ム、パック化粧料、洗浄料などに加工することにより、本発明の皮膚外用剤は製造できる。皮膚に適応させることの出来る剤型であれば、いずれの剤型でも可能であるが、有効成分が皮膚に浸透して効果を発揮することから、皮膚への馴染みの良い、ロ−ション、乳液、クリ−ム、エッセンスなどの剤型がより好ましい。 The skin external preparation of this invention can be manufactured by processing these essential components and arbitrary components according to a conventional method and processing them into lotions, emulsions, essences, creams, pack cosmetics, cleansing agents and the like. As long as the dosage form can be adapted to the skin, any dosage form is possible, but since the active ingredient penetrates the skin and exerts its effect, the lotion and emulsion that are well-familiar with the skin , Cream, essence and the like are more preferable.
以下に、実施例をあげて、本発明について更に詳細に説明を加えるが、本発明がかかる実施例にのみ、限定されないことは言うまでもない。
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples, but it is needless to say that the present invention is not limited to such examples.
＜本発明の角層中におけるAGEsの存在量のスコア化による定量化検討＞
以下の手順に従い、角層中におけるAGEsの存在量をスコア化した。
１） 被験者
２００７年１０月に静岡県在住の健常成人女性４０名（２０〜５６歳、平均年齢３８．１歳）の顔頬部を対象に皮膚状態を評価した。
２） 角層中におけるAGEsの免疫組織染色
頬部よりセロハンテープで採取した角層をスライドガラスに転写し、一次抗体（anti AGE monoclonal antibody, mouse、TransGenic社製）、二次抗体（Biotin-Rabbit Anti Mouse IgG conjugate、ZYMED社製）で反応後、ABC試薬（R．Ｔ．U VECTASTAIN社製）で反応させてAEC基質（DAKO社製）で発色させた。
３） 角層中におけるAGEs存在量のスコア化検討
免疫組織染色した画像を用い、グレード１〜５までの角層AGEs標準標本を作製し、これらを基準にとして各角層AGEs標本の５段階によるスコア化を行った。角層AGEs標準標本におけるグレード１〜５は、標本中における角層AGEsの免疫組織染の色度合いを指標としてグレードを分類した（図１参照）。角層中におけるAGEs評価グレードを用い、４０名の角層中におけるAGEs含有量を評価した。
４） 角層中におけるAGEs存在量のImage Jを用いた画像解析検討
顕微鏡にて２０〜５０倍に拡大された染色された角層AGEs標本の拡大画像をデジタル式のマイクロスコープ等を利用して、コンピュータに取り込み、汎用的な画像解析ソフトウエアを用いて、手動又は自動処理を行い、AGEsの存在量を定量化することが出来る。デジタル式のマイクロスコープとしては、例えば、（株）モリテックスのコスメテック用マイクロスコープ、汎用的画像解析のソフトウエアとしては、例えば、三谷商事（株）のWinRooF（登録商標）が好適に例示出来る。画像処理は、一般的な手法によって行えばよく、例えば、角層AGEs標本の拡大イメージ画像であるカラー画像をモノクロ濃淡画像に変換後、当該モノクロ画像に必要に応じてフィルターを処理後、二値化処理を行い、統計処理によって角層AGEsの存在割合に相関する染色部の総面積を算出した。
<Quantification study by scoring the abundance of AGEs in the stratum corneum of the present invention>
According to the following procedure, the abundance of AGEs in the stratum corneum was scored.
1) Subjects In October 2007, the skin condition was evaluated on the facial cheeks of 40 healthy adult women (20-56 years old, average age 38.1 years old) living in Shizuoka Prefecture.
2) Immunohistochemical staining of AGEs in the stratum corneum The stratum corneum collected with cellophane tape was transferred to a slide glass from the cheek, and a primary antibody (anti AGE monoclonal antibody , mouse, manufactured by TransGenic), a secondary antibody (Biotin- After reaction with Rabbit Anti Mouse IgG conjugate (manufactured by ZYMED), reaction was performed with ABC reagent (manufactured by RT U VECTASTAIN) and color was developed with AEC substrate (manufactured by DAKO).
3) Examination of scoring of AGEs abundance in stratum corneum Using histologically-stained images, standard stratum corneum AGEs specimens of
4) Image analysis study using Image J of AGEs in the stratum corneum An enlarged image of a stained stratum corneum AGEs specimen magnified 20 to 50 times with a microscope using a digital microscope, etc. , AGEs can be quantified by manual or automatic processing using general-purpose image analysis software. As a digital microscope, for example, a microscope for cosmetics manufactured by Moritex Co., Ltd., and as a software for general-purpose image analysis, for example, WinRooF (registered trademark) manufactured by Mitani Corporation can be preferably exemplified. Image processing may be performed by a general method, for example, after converting a color image, which is an enlarged image image of a stratum corneum AGEs sample, into a monochrome grayscale image, processing the filter as necessary for the monochrome image, and then performing binary processing. The total area of the stained part correlated with the existence ratio of the stratum corneum AGEs was calculated by statistical processing.
角層中におけるAGEs存在量のスコア化検討の結果、並びに、Ｉmage Jを用いた画像解析検討の結果の相関関係を検討した。結果を図２に示す。目視による角層中におけるAGEsグレ−ド値と角層中におけるAGEsのImage Jによる評価値には、明らかな相関関係が認められ、標準標本を用いた目視によるスコア化した評価方法とImage Jを用いた画像解析による角層中のAGEsの存在量の結果はよく一致した。これにより、Image Jを利用した画像解析により角層中におけるAGEsの存在量を測定することを、目視によるスコア化により定量化することにより推定することが出来る。 We examined the correlation between the results of scoring studies of AGEs abundance in the stratum corneum and the results of image analysis studies using Image J. The results are shown in FIG. There is a clear correlation between the visual AGEs grade value in the stratum corneum and the image J evaluation value of AGEs in the stratum corneum. The results of abundance of AGEs in the stratum corneum by image analysis used agreed well. Thereby, it can be estimated by measuring the abundance of AGEs in the stratum corneum by image analysis using Image J by quantifying by visual scoring.
＜本発明の表皮弾力性評価＞
以下の手順に従い、表皮弾力性を評価した。表皮の弾力性は、ヴィ−ナストロン（アクシム社製）を用い、頬部を５０Hzセンサ−にて測定し、５gpressureでの測定値から算出（△△ｆ（５ｇ））した。
<Evaluation of skin elasticity of the present invention>
The skin elasticity was evaluated according to the following procedure. The elasticity of the epidermis was calculated from the measured value at 5 gpressure (ΔΔf (5 g)) using Venustron (manufactured by Axim), measuring the cheek with a 50 Hz sensor.
＜本発明の皮膚表面形態評価＞
本発明の皮膚表面形態（水平又は垂直方向への平均粗さ：Ra）を以下の手順に従い評価した。頬部に印象剤（ASB−０１−WW、アサヒバイオメッド社製）を塗布してレプリカを作製した。１cm四方を対象に転写された皮膚表面三次元情報を、レ−ザ−イメ−ジプロセッサ−ＬＩＰ５０（商標登録、サイエンスシステムズ社製）を用いて測定し、解析ソフトTalymap（Taylor Hobson社製）を用いてガウシアンフィルタ−処理を行い、水平又は垂直方向への平均粗さ（JISパラメ−タ−Ｒａ）を算出した。
<Skin surface morphology evaluation of the present invention>
The skin surface morphology (average roughness in the horizontal or vertical direction: Ra) of the present invention was evaluated according to the following procedure. An impression agent (ASB-01-WW, manufactured by Asahi Biomed) was applied to the cheek to prepare a replica. The skin surface three-dimensional information transcribed on a 1 cm square is measured using a laser image processor LIP50 (registered trademark, manufactured by Science Systems), and analysis software Talymap (manufactured by Taylor Hobson) is used. A Gaussian filter process was performed, and the average roughness (JIS parameter Ra) in the horizontal or vertical direction was calculated.
前記方法に従い得られた角層中におけるAGEsの存在量に関するグレ−ド値と、表皮弾力性及び皮膚表面形態（水平又は垂直方向への平均粗さ：Ra）との関係を検討した。結果を図３〜図５に示す。図３〜５の結果より、角層中におけるAGEsの存在量と表皮弾力性（△△ｆ（５ｇ））及び皮膚表面形態（水平又は垂直方向への平均粗さ：Ra）には、相関関係が認められた。このことより、角層中におけるAGEsの存在量が少ない場合には、「表皮弾力性が高い」、「皮膚表面形態の水平又は垂直方向への平均粗さ（Ra）が大きい」ことがわかった。皮膚表面形態の水平又は垂直方向への平均粗さ（Ra）が大きいことは、皮溝が深く、肌の肌理が細かい好ましい肌状態にあることを表す。このことにより、角層中におけるAGEsの存在量が少ない場合には、皮膚状態が好ましい状態であると認められる。 The relationship between the grade value regarding the abundance of AGEs in the stratum corneum obtained according to the above method, the skin elasticity and the skin surface morphology (average roughness in the horizontal or vertical direction: Ra) was examined. The results are shown in FIGS. From the results of FIGS. 3 to 5, there is a correlation between the abundance of AGEs in the stratum corneum, the skin elasticity (ΔΔf (5 g)) and the skin surface morphology (average roughness in horizontal or vertical direction: Ra). Was recognized. From this, it was found that when the abundance of AGEs in the stratum corneum is small, “the skin elasticity is high” and “the average roughness (Ra) in the horizontal or vertical direction of the skin surface form is large”. . A large average roughness (Ra) in the horizontal or vertical direction of the skin surface form represents a preferable skin state in which the skin groove is deep and the texture of the skin is fine. Accordingly, when the amount of AGEs in the stratum corneum is small, the skin state is recognized as a preferable state.
＜本発明のAGEs分解剤を含有する化粧料＞
表１に示す処方に従い、本発明のAGEs分解剤を含有する化粧料を作製した。即ち、処方成分を８０℃にて攪拌可溶化し、攪拌冷却して化粧水１を得た。
<Cosmetics containing AGEs decomposing agent of the present invention>
According to the formulation shown in Table 1, cosmetics containing the AGEs decomposing agent of the present invention were prepared. That is, the prescription ingredients were solubilized and stirred at 80 ° C. and stirred and cooled to obtain
化粧水１及び化粧水１の抽出物２を水に置換した比較例１の化粧水を用いて、年齢６０歳以上の肌にくすみのある人をパネラ−として、使用テストを行った。パネラ−は１０名用意し、ばらつきがないように５名ずつ２群に群分けし、１群は化粧水１を、残る１群は比較例１の化粧水を渡し、１２週間朝晩２回適量を塗布する態様で連続使用してもらった。試験前と終了後にコニカミノルタ株式会社製の色彩色差計で白色板に対する値を測定し、試験後のb*値−試験前のb*値の式で黄味の減少度合いを計測した。結果は、化粧水１の群が−２．１±０．５で、比較例１の群が＋０．４±０．７で、本発明の化粧料である化粧水１使用群においては、AGEsが分解され、黄色み、くすみが改善されたことがわかる。また、アンケ−トの結果、皮膚の弾力性に関しても化粧水１の使用群の方が優れていた。かくの如くに、AGEsの過剰な蓄積に起因する皮膚弾力の喪失、くすみなどにはAGEs分解剤を含有する化粧料の投与が有効であることがわかる。
Using the
無作為に集めた７８人のパネラ−を、年齢構成にばらつきが出ない様に１群３９名の２群にわけた。１群は、従前の角層からのくすみの程度と皮膚バリア機能に基づいた化粧料選択（特開２０００−２１２０３８ 号公報、特開２００１−１３１３８ 号公報に記載の技術）を行い（比較対照群）、もう一群にはこれらに加えて、角層中におけるAGEs含有量の多少の判別を行い、AGEsの量が多い人にはAGEs分解剤を含有する化粧料を勧める要素を加えた。（本発明群）以下詳細に説明を加える。
Randomly collected 78 panelists were divided into 2 groups of 39 people per group so that there was no variation in age composition.
＜比較対照群＞
被験者より粘着ディスクを用いて角層を採取し、これを透明粘着テ−プに転写し、標本とした。０．５％の硝酸銀水溶液にアンモニア水を滴下しｐＨを１０に調整した銀染色液を用い、４５℃１０分間処理し銀染色した後、３回水洗し０．１５％ゲンチアナバイオレット液で１０分処理した。この標本を水洗、乾燥させ、透明シリコ−ン剤を染色済みの部分を覆うように流し込みカバ−グラスをのせてサンプルとし、顕微鏡下観察し、角層細胞面積、重層剥離の度合い、有核細胞の有無より皮膚バリア機能を非常によいスコア５〜非常に悪いスコア１の５段階に分け、スコア１のパネラ−は化粧料使用不能者として試験から外し、スコア２の人は皮膚バリア機能低下者として判別した。また、同標本のメラニンの分布とメラニン量より、くすみの程度を、メラニンが多く、分布の偏りが著しいスコア１〜メラニンの量が少なく分布も均一スコア１の５段階に分け、スコア１とスコア２の人はくすみが著しい人と判別した。皮膚バリア機能が低いと判別された人には、下記のロ−ションにグリセリン５質量％とバリア機能向上成分であるポリメタクリロイルリジン０．１質量％を加えた化粧料を処方し、くすみが著しいと判別された人には下記のロ−ションに４−ｎ−ブチルレゾルシノ−ル０．３質量％を加えた化粧料を処方した。バリア機能が低く、くすみが著しい人には、グリセリン５質量％とバリア機能向上成分であるポリメタクリロイルリジン０．１質量％と４−ｎ−ブチルレゾルシノ−ル０．３質量％を加えた化粧料を処方した。被験者にはこれらの化粧料を朝晩２回３０日使用してもらい、化粧料に対する満足度をスコア５（非常に満足）、スコア４（満足）、スコア３（可もなく不可もなく）、スコア２（不満）、スコア１（大いに不満）で評価してもらった。
<Comparison control group>
A stratum corneum was collected from a subject using an adhesive disk, and transferred to a transparent adhesive tape to prepare a sample. A silver staining solution in which ammonia water was added dropwise to a 0.5% silver nitrate aqueous solution to adjust the pH to 10 was treated at 45 ° C. for 10 minutes to stain with silver, then washed with water three times and then with a 0.15% gentian violet solution for 10 minutes. Processed. This specimen is washed with water, dried, and a transparent silicone agent is poured so as to cover the stained part. A cover glass is placed on the sample, and the sample is observed under a microscope. The stratum corneum cell area, the degree of delamination, and nucleated cells The skin barrier function was divided into 5 levels of very
＜本発明群＞
比較対照群と同様に被験者から角層を採取し、皮膚バリア機能とくすみの判別用の標本と、AGEs計測用の標本とを作製した。皮膚バリア機能とくすみの判別用の標本からは比較対照群と同様の処置で、皮膚バリア機能の低い人と、くすみの著しい人とを判別した。AGEs計測用の標本は、実施例１の手技に従ってグレ−ド１（AGEsが殆ど角層中に存しない）からグレ−ド５（AGEsが多量に角層中に存在する）のグレ−ドを判別した。グレ−ド４、グレ−ド５の人はAGEsの蓄積が著しい人と判別し、AGEsの蓄積が著しい人には、下記のロ−ションに抽出物２を０．１質量％加えた化粧料を処方し、比較対照群の選別方法に加えた。同様に処方後３０日間の使用の後にアンケ−トを実施した。
<Invention Group>
The stratum corneum was collected from the subjects in the same manner as the control group, and a specimen for distinguishing skin barrier function and dullness and a specimen for AGEs measurement were prepared. From the specimen for discriminating skin barrier function and dullness, a person with low skin barrier function and a person with marked dullness were discriminated by the same treatment as the control group. Samples for AGEs measurement are
＜結果＞
アンケ−トの結果は以下に示すとおりであり、因子としてAGEsの多少とAGEs分解剤を含有する化粧料の選択を加えることにより、より満足度の高い化粧料の選択がなし得ること、言い換えれば、より確度の高い化粧料の選択がなし得ることが判る。
<Result>
The results of the questionnaire are as follows, and by adding the selection of cosmetics containing some of AGEs and AGEs degrading agents as factors, a more satisfactory selection of cosmetics can be made, in other words It can be seen that more accurate cosmetics can be selected.
本発明は化粧料に応用できる。 The present invention can be applied to cosmetics.
Claims (8)
該評価の結果、前記皮膚状態を改善しようとする対象に、AGEs分解剤を含有する化粧料を勧めるステップを有することを特徴とする、方法。 Using the skin condition evaluation method according to any one of claims 1 to 5 , a step of evaluating a skin condition selected from epidermal elasticity and / or skin surface morphology, and as a result of the evaluation, the skin condition the subject to be improved, characterized by the step of recommending a cosmetic containing the AGEs decomposer, methods.
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