JP5205798B2 - マイクロインジェクション装置、捕捉プレート、およびマイクロインジェクション方法 - Google Patents

Description

本発明は、マイクロインジェクション装置、捕捉プレート、およびマイクロインジェクション方法に関し、特に、細胞内に確実に薬液を注入するとともに、キャピラリ針の先端を保護することができるマイクロインジェクション装置、捕捉プレート、およびマイクロインジェクション方法に関する。

近年、細胞内に遺伝子を直接注入することにより、細胞の遺伝情報を改変する研究が盛んに行われている。この研究が進めば、遺伝子の役割が解明されるとともに、例えば個人の遺伝的特性に適合した遺伝子治療を行うテーラメード医療が可能となる。細胞内に遺伝子を注入する方式としては、電気的な方法（エレクトロポレーション）、化学的な方法（リポフェクション）、生物的な方法（ベクター法）、機械的な方法（マイクロインジェクション）、および光学的な方法（レーザインジェクション）などが提案されている。しかし、電気的な方式は、大電流を流して細胞膜を破るため細胞へのダメージが大きく、化学的な方式は、導入可能な遺伝子に制限があるため効率が悪く、生物的な方法は、すべての材料を導入できずに安全性が確認できないなどの欠点がある。一方で、機械的な方法であるマイクロインジェクションは、最も安全で効率が高い方法として注目されている。

マイクロインジェクションにおいては、図１３に示すように、キャピラリ針１０が細胞Ｃの位置へ自動的に移動し、薬液を直接注入する。このとき、キャピラリ針１０が正確に細胞Ｃの位置へ移動するためには、シャーレ２０内での細胞Ｃの位置を固定する必要がある。そこで、図１３においては、複数の貫通孔が設けられた捕捉プレート３０がシャーレ２０内に設置され、捕捉プレート３０のシャーレ２０底面側を負圧にすることにより、細胞Ｃが捕捉プレート３０の貫通孔に吸い寄せられている。

具体的には、図１３において、シャーレ２０内は緩衝液で満たされており、捕捉プレート３０および細胞Ｃは、緩衝液に浸っている。そして、シャーレ２０の底面から緩衝液が吸引されることにより、捕捉プレート３０のシャーレ２０底面側が負圧となり、細胞Ｃは捕捉プレート３０に穿設された貫通孔に吸い寄せられる。これにより、細胞Ｃの位置は捕捉プレート３０の貫通孔の位置に固定され、貫通孔の座標があらかじめ記憶されていれば、キャピラリ針１０を細胞Ｃの位置へ正確に移動させることが可能となる。

ところで、吸引によって細胞Ｃの位置を固定する場合には、細胞の大きさと貫通孔の大きさとの関係を適切に調整することが困難である。すなわち、例えば図１４に示すように、細胞Ｃの大きさに対して捕捉プレート３０の貫通孔が大きすぎる場合には、吸引により細胞Ｃそのものが貫通孔から吸引される虞がある。また、例えば図１５に示すように、細胞Ｃの大きさに対して捕捉プレート３０の貫通孔が小さすぎる場合には、確実に細胞Ｃの位置を固定することができず、キャピラリ針１０の接触に伴って細胞Ｃが動いてしまうことがある。

そこで、例えば特許文献１においては、捕捉プレートに直径が小さい貫通孔を穿設するとともに、貫通孔の周囲に直径が大きい凹み部を設けることが記載されている。すなわち、特許文献１に記載の捕捉プレートにおいては、周囲より高さが低くなった円形平面の凹み部の中心に貫通孔が設けられている。このような捕捉プレートによれば、貫通孔からの吸引により細胞が捕捉プレートに吸着されると同時に、凹み部によって細胞の位置が確実に固定される。

特開２００５−３１８８５１号公報

しかしながら、一般に細胞の細胞膜は柔軟性に富んでいるため、キャピラリ針を突き出しても破れにくく、薬液を確実に細胞内に注入することが困難であるという問題がある。具体的には、例えば図１６に示すように、円形の凹み部と貫通孔によって細胞が確実に固定されていても、キャピラリ針の突き出しに伴って細胞の上側細胞膜が細胞内まで伸張し、キャピラリ針先端の細胞内への進入が妨げられることがある。そして、この状態でキャピラリ針先端から薬液が吐出されても、薬液は細胞内へ注入されることがなく、マイクロインジェクションは失敗に終わる。

また、図１６に示すように、上側細胞膜が下側細胞膜に接触する程度にまでキャピラリ針の突き出し量を大きくすれば、上側細胞膜が破れてキャピラリ針の先端が細胞内へ進入すると考えられるが、この場合には、キャピラリ針先端が下側細胞膜にほぼ当接しているため、キャピラリ針先端と下側細胞膜の間に薬液を注入するのに十分な空間がなくなってしまう。

さらに、キャピラリ針の突き出し量を大きくしすぎると、キャピラリ針の先端が下側細胞膜も貫通し、細胞外で薬液が吐出されてしまう虞があるとともに、キャピラリ針の先端が捕捉プレートに圧接されて破損してしまうことがある。特に、マイクロインジェクションにおいては、対象となる細胞が数μｍから数十μｍ程度の大きさであるため、キャピラリ針の移動も微小なものとなる。このため、例えば１〜２μｍ程度の誤差であっても、キャピラリ針が捕捉プレートに圧接されることがあり、キャピラリ針が破損する可能性が大きい。

本発明はかかる点に鑑みてなされたものであり、細胞内に確実に薬液を注入するとともに、キャピラリ針の先端を保護することができるマイクロインジェクション装置、捕捉プレート、およびマイクロインジェクション方法を提供することを目的とする。

上記課題を解決するために、本発明は、細胞に物質を注入するマイクロインジェクション装置であって、細胞を捕捉して位置を固定する捕捉プレートと、前記捕捉プレートによって捕捉された細胞に物質を注入するキャピラリ針と、前記キャピラリ針を長手方向先端側へ突き出した後、長手方向根元側へ引き上げる移動機構部と、前記移動機構部によって前記キャピラリ針が所定位置まで引き上げられた際に、前記キャピラリ針の先端から物質を吐出させる吐出制御部とを有する構成を採る。

この構成によれば、キャピラリ針が突き出される際に上側の細胞膜を破るとともに、キャピラリ針が引き上げられてキャピラリ針の先端と下側の細胞膜との間に空間ができたタイミングでキャピラリ針の先端から物質を吐出する。このため、細胞膜が破られる前に物質が吐出されたり、物質を注入するのに十分な空間が細胞内に形成されていない状態で物質が吐出されたりすることがなく、細胞内に確実に薬液を注入することができる。

また、本発明は、上記構成において、前記捕捉プレートは、細胞を捕捉する複数の捕捉孔があらかじめ定められた座標に形成される構成を採る。

この構成によれば、細胞を捕捉する捕捉孔の座標があらかじめ定められているため、捕捉プレートを移動させて捕捉孔の位置をキャピラリ針の先端が到達する位置に合わせることが容易であり、捕捉孔に捕捉された細胞を対象としてマイクロインジェクションを行うことができる。

また、本発明は、上記構成において、前記捕捉孔は、平面視形状が円形であり、直径が細胞の直径の７０〜８０％に相当する構成を採る。

この構成によれば、細胞に対する捕捉孔の直径が小さすぎもせず大きすぎもせず、捕捉孔によって細胞を確実に固定することができる。

また、本発明は、上記構成において、前記捕捉プレートは、いずれか一方の面に細胞を捕捉する平面部と、前記平面部のいずれか他方の面の周囲に密閉された空間が形成されるように前記平面部を支持する脚部とを有し、前記平面部は、細胞を捕捉する一方の面が円柱形状に陥没する複数の捕捉孔を備える構成を採る。

この構成によれば、平面部を挟む両側の空間は、平面部によって遮断されているため、平面部に貫通孔を設けて一方の空間を負圧状態にすれば、他方の空間に存在する細胞を捕捉孔に吸着することができる。

また、本発明は、上記構成において、前記捕捉孔は、底面に前記平面部を貫通する貫通孔が形成される構成を採る。

この構成によれば、貫通孔が平面部を挟む両側の空間の通路となるため、一方の空間を負圧状態にすることにより、他方の空間に存在する緩衝液を吸引し、これに伴って緩衝液中の細胞を捕捉孔に吸着することができる。

また、本発明は、上記構成において、前記貫通孔は、直径が１〜２μｍまたは細胞の直径の１０〜２０％に相当する構成を採る。

この構成によれば、細胞に対する貫通孔の直径が大きすぎることがなく、細胞が貫通孔内へ吸引されてしまうことを防止することができる。

また、本発明は、上記構成において、前記捕捉孔は、底面の前記キャピラリ針が前記移動機構部によって突き出された際の先端到達位置付近にさらに円柱形状に陥没するリセス部が形成される構成を採る。

この構成によれば、キャピラリ針が突き出される際の移動に誤差が生じた場合でも、過度に突き出されたキャピラリ針が捕捉孔の底面に接触することがなく、キャピラリ針の先端を保護し破損を防止することができる。

また、本発明は、上記構成において、前記リセス部は、底面の直径が３〜４μｍかつ深さが２〜３μｍの円柱形状に前記捕捉孔の底面が陥没して形成される構成を採る。

この構成によれば、キャピラリ針の位置の微調整や突き出しに誤差が生じても、十分にキャピラリ針の先端を保護することができる。

また、本発明は、物質を注入するために緩衝液中の細胞を捕捉して位置を固定する捕捉プレートであって、当該捕捉プレートを貫通し、直径が細胞の直径と比較して十分小さい貫通孔と、前記貫通孔付近に捕捉された細胞に物質を注入するキャピラリ針の先端到達位置付近が円柱形状に陥没するリセス部とを有する構成を採る。

この構成によれば、捕捉プレートを挟む一方の空間を負圧状態にすることにより、捕捉プレートを挟む他方の空間に存在する細胞を貫通孔を介して吸着することができるとともに、キャピラリ針が突き出される際の移動に誤差が生じた場合でも、過度に突き出されたキャピラリ針が捕捉プレートに接触することがなく、キャピラリ針の先端を保護し破損を防止することができる。

また、本発明は、細胞を捕捉して位置を固定する捕捉プレートと、前記捕捉プレートによって捕捉された細胞に物質を注入するキャピラリ針とを備えたマイクロインジェクション装置におけるマイクロインジェクション方法であって、前記キャピラリ針を長手方向先端側へ突き出す突出ステップと、前記突出ステップ後、前記キャピラリ針を長手方向根元側へ引き上げる引上ステップと、前記引上ステップにおいて前記キャピラリ針が所定位置まで引き上げられた際に、前記キャピラリ針の先端から物質を吐出する吐出ステップとを有するようにした。

この方法によれば、キャピラリ針が突き出される際に上側の細胞膜を破るとともに、キャピラリ針が引き上げられてキャピラリ針の先端と下側の細胞膜との間に空間ができたタイミングでキャピラリ針の先端から物質を吐出する。このため、細胞膜が破られる前に物質が吐出されたり、物質を注入するのに十分な空間が細胞内に形成されていない状態で物質が吐出されたりすることがなく、細胞内に確実に薬液を注入することができる。

本発明によれば、細胞内に確実に薬液を注入するとともに、キャピラリ針の先端を保護することができる。

本発明の骨子は、キャピラリ針が最大限に突き出された後、引き上げ方向の移動が開始されてから薬液を吐出するとともに、捕捉プレートのキャピラリ針長手方向の延長線上付近に窪みを設けてキャピラリ針の先端と捕捉プレートの接触を防止することである。以下、本発明の一実施の形態について、図面を参照して詳細に説明する。

図１は、本発明の一実施の形態に係る自動マイクロインジェクション装置１００の構成を模式的に示す図である。同図に示す自動マイクロインジェクション装置１００は、キャピラリ針１０１、シャーレ１０２、捕捉プレート１０３、ステージ１０４、照明１０５、吸引部１０６、ステージ移動機構部１０７、キャピラリ針移動機構部１０８、捕捉座標記憶部１０９、制御部１１０、吐出機構部１１１、ＣＣＤ（Charge Coupled Device）カメラ１１２、および倒立顕微鏡１１３を有している。

キャピラリ針１０１は、キャピラリ針移動機構部１０８に取り付けられ、水平面上を移動するとともに、長手方向に突き出されたり引き上げられたりする。そして、キャピラリ針１０１は、内部に保持している薬液を吐出機構部１１１から吐出圧が加えられるタイミングで吐出する。

シャーレ１０２は、高さに対して底面の直径が大きい略円柱状の容器であり、細胞が生存可能な緩衝液で満たされている。シャーレ１０２は、ステージ１０４上に載置されており、ステージ１０４とともに水平面上を移動する。

捕捉プレート１０３は、シャーレ１０２の中央に収容され、シャーレ１０２の底面と平行な平面部に設けられた捕捉孔の位置で緩衝液中の細胞を捕捉する。捕捉プレート１０３の脚部とシャーレ１０２の底面との間は密閉されており、捕捉プレート１０３のシャーレ１０２底面側と捕捉プレート１０３の上側とは捕捉プレート１０３の捕捉孔のみを介して連続している。捕捉プレート１０３の具体的な形状および機能については、後に詳述する。

ステージ１０４は、ステージ移動機構部１０７に固定され、上面にシャーレ１０２を載置可能となっている。そして、ステージ１０４は、ステージ移動機構部１０７の制御によって、捕捉プレート１０３によって捕捉されたインジェクション対象の細胞が照明１０５の鉛直下方かつ倒立顕微鏡１１３のレンズの鉛直上方に位置するように水平面上を移動する。なお、ステージ１０４は、ＣＣＤカメラ１１２が捕捉プレート１０３上の細胞を撮影可能なように、透明な材料で製造されているか、または、捕捉プレート１０３が位置する中央部分に撮影用の穴が設けられている。

照明１０５は、捕捉プレート１０３に捕捉された細胞を照らす光源であり、倒立顕微鏡１１３のレンズの鉛直上方に設けられている。照明１０５の位置は、常に固定されている。

吸引部１０６は、捕捉プレート１０３のシャーレ１０２底面側から緩衝液を吸引し、捕捉プレート１０３のシャーレ１０２底面側を負圧状態にする。

ステージ移動機構部１０７は、制御部１１０からの指示に従ってステージ１０４を水平面上に移動させる。具体的には、ステージ移動機構部１０７は、細胞が捕捉される捕捉プレート１０３の捕捉孔の座標が照明１０５の鉛直下方かつ倒立顕微鏡１１３のレンズの鉛直上方に位置するようにステージ１０４を移動させる。

キャピラリ針移動機構部１０８は、インジェクション時のキャピラリ針１０１の先端が照明１０５の鉛直下方かつ倒立顕微鏡１１３のレンズの鉛直上方に位置するようにキャピラリ針１０１を水明面上に移動させる。また、キャピラリ針移動機構部１０８は、キャピラリ針１０１の水平面上の移動が完了した後、キャピラリ針１０１を長手方向の先端側へ突き出し、その後、キャピラリ針１０１を長手方向の根元側へ引き上げる。このとき、キャピラリ針移動機構部１０８は、キャピラリ針１０１の長手方向の変位を制御部１１０へ通知する。

捕捉座標記憶部１０９は、シャーレ１０２内の捕捉プレート１０３に設けられた捕捉孔の座標を記憶する。換言すれば、捕捉座標記憶部１０９は、細胞が捕捉される捕捉座標をあらかじめ記憶する。

制御部１１０は、捕捉座標記憶部１０９から捕捉孔の座標を読み出し、読み出した座標を照明１０５の鉛直下方かつ倒立顕微鏡１１３のレンズの鉛直上方に位置させるようにステージ移動機構部１０７へ指示する。また、制御部１１０は、ステージ１０４の位置が調整されると、キャピラリ針移動機構部１０８へキャピラリ針１０１の位置の微調整を支持する。

さらに、制御部１１０は、キャピラリ針移動機構部１０８からキャピラリ針１０１の長手方向の変位の通知を受け、キャピラリ針１０１が最大限に突き出された後、所定の位置まで引き上げられた時に、吐出機構部１１１へ薬液の吐出を指示する。すなわち、制御部１１０は、キャピラリ針１０１が捕捉プレート１０３に最も接近した後、捕捉プレート１０３からキャピラリ針１０１の先端までの高さが所定の高さに達したタイミングで薬液の吐出を吐出機構部１１１へ指示する。

吐出機構部１１１は、制御部１１０から薬液の吐出が指示されると、キャピラリ針１０１の内部に吐出圧を加え、キャピラリ針１０１の先端から薬液を吐出させる。

ＣＣＤカメラ１１２は、倒立顕微鏡１１３によって拡大された細胞であって捕捉プレート１０３に捕捉された細胞に薬液が注入される様子を撮影する。また、ＣＣＤカメラ１１２は、薬液の注入後、細胞に生じた変化などを撮影する。

倒立顕微鏡１１３は、照明１０５の鉛直下方を拡大可能な位置に設置され、キャピラリ針１０１の先端付近および捕捉プレート１０３に捕捉された細胞を拡大する。

図２は、本実施の形態に係る捕捉プレート１０３の構成を示す平面図である。同図に示すように、捕捉プレート１０３の中央の平面部２０２には複数の捕捉孔２０１が形成されている。これらの捕捉孔２０１は、平面部２０２に規則的に配列されていても良いが、図２に示すようにランダムに配置されることにより、平面部２０２に亀裂を生じにくくさせ強度を確保することができる。特に、本実施の形態においては、平面部２０２を挟んで一方の側（すなわちシャーレ１０２底面側）が負圧状態となって、平面部２０２に圧力がかかるため、ある程度は平面部２０２の強度を確保しておく必要がある。

また、平面部２０２における捕捉孔２０１の座標は、捕捉座標記憶部１０９によってあらかじめ記憶されている。したがって、捕捉孔２０１の座標が照明１０５の鉛直下方かつ倒立顕微鏡１１３のレンズの鉛直上方に位置するようにステージ１０４を水平面上で移動させることにより、捕捉孔２０１に捕捉された細胞をインジェクション対象の細胞とすることができる。後述するように、この捕捉孔２０１の直径は、インジェクション対象の細胞の直径のおよそ７０〜８０％が望ましい。具体的には、例えば細胞の直径が１６μｍ程度であれば、捕捉孔２０１の直径は１２μｍ程度が望ましい。

図３は、図２のＡＡ線断面を示す断面図である。同図に示すように、捕捉プレート１０３は平面部２０２の周囲に脚部２０３が形成されており、脚部２０３がシャーレ１０２の底面に密着し、捕捉孔２０１内に設けられた貫通孔のみが周囲の緩衝液の通路となる。すなわち、図３においては図示を省略したが、捕捉孔２０１の底面には貫通孔が設けられており、平面部２０２の下側が負圧になることにより、平面部２０２の上側の緩衝液は、捕捉孔２０１の底面に設けられた貫通孔を通路として平面部２０２の下側へ吸引される。このとき、緩衝液とともに緩衝液中の細胞が捕捉孔２０１に吸着され、捕捉孔２０１によって細胞が捕捉される。

平面部２０２から捕捉孔２０１の底面までの深さは、細胞を確実に固定可能な深さであり、例えば細胞の直径が１６μｍ程度であれば、３〜４μｍ程度が望ましい。したがって、平面部２０２の厚さは、捕捉孔２０１の深さより大きいことが要求され、例えば１０μｍ程度とされる。

図４は、本実施の形態に係る捕捉孔２０１の構成を示す平面図である。同図に示すように、捕捉孔２０１内には、複数の貫通孔２０１ａが形成されるとともに、円形のリセス部２０１ｂが設けられている。なお、貫通孔２０１ａは、捕捉孔２０１内に１つだけ形成しても良く、捕捉孔２０１内に複数の貫通孔２０１ａを形成する場合にも、その配置は、図４に示すものに限定されない。

貫通孔２０１ａの直径は、捕捉対象の細胞の直径と比較して十分に小さく、例えば１〜２μｍ程度である。または、細胞の直径に対して貫通孔２０１ａの直径を１０〜２０％程度としても良い。これらの貫通孔２０１ａは、捕捉孔２０１の下側が負圧となった際に、緩衝液の通路となり細胞を吸着する。本実施の形態においては、１つの捕捉孔２０１内に複数の貫通孔２０１ａを形成することにより、細胞に対する吸着力を大きくしている。

リセス部２０１ｂは、捕捉孔２０１の底面とキャピラリ針１０１長手方向の延長線との交点を中心とした円形部分が陥没して形成される。すなわち、本実施の形態においては、図１に示したように、キャピラリ針１０１の長手方向が鉛直方向に対して所定の角度となるように設けられているため、リセス部２０１ｂは、捕捉孔２０１の中心からずれた位置に形成されているが、キャピラリ針１０１の長手方向が鉛直方向に一致していれば、リセス部２０１ｂは、捕捉孔２０１の中心に形成されることになる。

リセス部２０１ｂは、キャピラリ針移動機構部１０８によってキャピラリ針１０１が突き出される際、突き出し量に誤差が生じて過大となった場合の逃げとして機能する。したがって、リセス部２０１ｂの直径は、キャピラリ針１０１の先端が接触し得る捕捉孔２０１の底面の範囲に応じて決定され、例えば３〜４μｍ程度にするのが望ましい。リセス部２０１ｂを設けることにより、キャピラリ針１０１の突き出し量が過大となった場合でも、キャピラリ針１０１の先端がリセス部２０１ｂの範囲内に収まって、捕捉プレート１０３に接触することがなく破損を防止することができる。

図５は、図４のＢＢ線断面を示す断面図である。図４および図５に示すように、リセス部２０１ｂは、捕捉孔２０１の底面が円柱状に陥没して形成される一方、貫通孔２０１ａは、捕捉プレート１０３の捕捉孔２０１の底面を貫通して形成されている。リセス部２０１ｂの深さは、キャピラリ針１０１の突き出し量の誤差に応じて決定され、例えば２〜３μｍ程度にするのが望ましい。

貫通孔２０１ａは、捕捉孔２０１の底面を貫通することにより、捕捉プレート１０３がシャーレ１０２内に設置された際、平面部２０２を挟んだ両側の空間を連続させる唯一の通路となる。このため、平面部２０２の下側が負圧になれば、貫通孔２０１ａによって平面部２０２の上側に存在する細胞が吸着される。

図６は、上述した構成の捕捉孔２０１の直径と細胞捕捉力の関係の一例を示す図である。ここでは、細胞の平均直径を１６μｍとして細胞捕捉力を測定した。同図から明らかなように、捕捉孔２０１の直径が１２μｍ程度のときに細胞捕捉力が最大となり、捕捉プレート１０３が最も効率良く細胞を捕捉することが分かる。捕捉孔２０１の直径１２μｍは、細胞の平均直径１６μｍの７５％に相当し、上述したように、捕捉孔２０１の直径は、細胞の直径の７０〜８０％程度であるのが望ましいことが分かる。

すなわち、捕捉孔２０１の直径が細胞に比して小さすぎると、細胞全体の大きさに対して捕捉孔２０１内に収まる部分が小さく、細胞を確実に固定することができない。反対に、捕捉孔２０１の直径が細胞に比して大きすぎると、細胞全体が捕捉孔２０１内に収まった上に細胞の周囲に余裕が生じ、この場合も細胞を確実に固定することができない。

次いで、上記のように構成された自動マイクロインジェクション装置１００によるインジェクション動作について、図７に示すフロー図を参照しながら説明する。

インジェクション開始時には、シャーレ１０２内に捕捉プレート１０３が設置され、複数の細胞が生存する緩衝液が満たされている。この状態で、吸引部１０６によって捕捉プレート１０３のシャーレ１０２底面側の吸引が開始される（ステップＳ１０１）。吸引が開始されることにより、捕捉プレート１０３のシャーレ１０２底面側が負圧となり、シャーレ１０２内の緩衝液が捕捉プレート１０３の貫通孔２０１ａを通過して捕捉プレート１０３のシャーレ１０２底面側へ流入する。これに伴って、緩衝液中の細胞が貫通孔２０１ａに吸着され、捕捉孔２０１によって捕捉される。これにより、細胞は、捕捉プレート１０３の捕捉孔２０１の座標に固定されたことになる。

一方、制御部１１０によって、すべての捕捉孔２０１の座標が捕捉座標記憶部１０９から読み込まれる（ステップＳ１０２）。上述したように、捕捉孔２０１には細胞が捕捉されているため、捕捉孔２０１の座標は細胞が捕捉された捕捉座標に他ならない。制御部１１０によって捕捉座標が読み込まれると、いずれか１つの捕捉座標が制御部１１０からステージ移動機構部１０７へ通知され、この捕捉座標をインジェクション対象の位置へ移動させるように指示される。すなわち、細胞が捕捉された捕捉座標が照明１０５の鉛直下方かつ倒立顕微鏡１１３のレンズの鉛直上方に位置するようにステージ１０４の位置を調整することがステージ移動機構部１０７に要求される。

そして、ステージ移動機構部１０７によって、ステージ１０４の位置が調整される（ステップＳ１０３）。具体的には、ステージ移動機構部１０７によって、ステージ１０４が水平面上を移動し、ステージ１０４上のシャーレ１０２および捕捉プレート１０３が制御部１１０からの指示通りの位置に固定される。また、キャピラリ針移動機構部１０８によって、キャピラリ針１０１の先端が薬液吐出時に照明１０５の鉛直下方に位置するように、キャピラリ針１０１の水平方向の位置が微調整される（ステップＳ１０４）。

ステージ１０４およびキャピラリ針１０１の水平方向の位置が調整されると、キャピラリ針移動機構部１０８によって、キャピラリ針１０１が長手方向の先端側へ突き出される（ステップＳ１０５）。キャピラリ針１０１長手方向の延長線上には、捕捉プレート１０３の捕捉孔２０１によって細胞が捕捉されている。したがって、キャピラリ針１０１が突き出されると、やがてキャピラリ針１０１の先端が細胞に接触する。具体的には、キャピラリ針１０１の先端が細胞の細胞膜を押圧し、図８に示すように、キャピラリ針１０１の先端が細胞３０１の上側細胞膜３０１ａを貫通する。

このとき、細胞３０１の上側細胞膜３０１ａは、柔軟性に富んでいるため、キャピラリ針１０１の突き出しに伴って伸張するが、上側細胞膜３０１ａが下側細胞膜３０１ｂに接するまで伸張すると、キャピラリ針１０１の先端付近では細胞膜が二重になり強度が向上する。これにより、上側細胞膜３０１ａの伸張が抑制され、キャピラリ針１０１の先端が上側細胞膜３０１ａを貫通する。すなわち、下側細胞膜３０１ｂが上側細胞膜３０１ａを支えることにより、キャピラリ針１０１が上側細胞膜３０１ａを貫通することができる。

このようにキャピラリ針１０１に上側細胞膜３０１ａを貫通させるために、キャピラリ針１０１が突き出される最中、キャピラリ針移動機構部１０８によって、キャピラリ針１０１の先端が捕捉孔２０１の底面から所定の高さに到達したか否かが判断される（ステップＳ１０６）。一般に、図１０に示すように、キャピラリ針１０１の先端の高さが１μｍ程度にまでなると、薬液の導入率が大きくなることから、キャピラリ針１０１の先端と捕捉孔２０１の底面との距離が１μｍ程度になるまでキャピラリ針１０１を突き出せば、キャピラリ針１０１の先端が上側細胞膜３０１ａを貫通すると考えられる。そこで、キャピラリ針移動機構部１０８によって、キャピラリ針１０１の先端が捕捉孔２０１の底面から例えば１μｍの高さに到達したか否かが判断される。

この結果、キャピラリ針１０１の先端が所定位置に到達すると（ステップＳ１０６Ｙｅｓ）、今度はキャピラリ針移動機構部１０８によって、キャピラリ針１０１が長手方向の根元側へ引き上げられ始める（ステップＳ１０７）。この段階では、まだキャピラリ針１０１の先端から薬液が吐出されることはなく、単にキャピラリ針１０１の先端によって上側細胞膜３０１ａが破られたのみである。ただし、上側細胞膜３０１ａが破られているため、この段階で、上側細胞膜３０１ａの伸張によって薬液が細胞内に注入されない状況が回避されたことになる。

そして、キャピラリ針１０１が引き上げられる最中、キャピラリ針移動機構部１０８から制御部１１０へキャピラリ針１０１の長手方向の変位が通知され、キャピラリ針１０１の先端が細胞の中心付近まで引き上げられると、制御部１１０によって、薬液を吐出するように吐出機構部１１１へ指示される。換言すれば、キャピラリ針１０１が最大限に突き出されてから所定の高さにまで引き上げられたタイミングで、薬液の吐出が制御部１１０から吐出機構部１１１へ指示される。

そして、吐出機構部１１１によって、キャピラリ針１０１の内部に吐出圧が加えられ、キャピラリ針１０１の先端から薬液が吐出される（ステップＳ１０８）。このとき、キャピラリ針１０１の先端は、細胞の中心付近にまで引き上げられているため、図９に示すように、キャピラリ針１０１の先端と下側細胞膜３０１ｂとの間に薬液を注入するのに十分な空間がある。このため、キャピラリ針１０１の先端から吐出された薬液が細胞外に溢れ出ることがなく、確実に細胞内に注入される。

キャピラリ針１０１の先端から薬液が吐出された後、キャピラリ針１０１が初期位置まで引き上げられると、制御部１１０によって、捕捉座標記憶部１０９から読み込まれたすべての捕捉座標についてインジェクションが完了したか否かが判断され（ステップＳ１０９）、まだ完了していない捕捉座標がある場合には（ステップＳ１０９Ｎｏ）、ステージ移動機構部１０７によるステージ１０４の移動から処理が繰り返される。こうして、すべての捕捉座標に捕捉された細胞のインジェクションが完了する。

ところで、上述したように、キャピラリ針１０１を突き出す際には、先端が捕捉孔２０１の底面から１μｍ程度にまで接近する。このため、キャピラリ針移動機構部１０８による制御の誤差があると、比較的頻繁にキャピラリ針１０１の先端が捕捉孔２０１の底面の高さまで到達することがあると考えられる。しかし、本実施の形態においては、捕捉孔２０１の底面のキャピラリ針１０１長手方向の延長線上にリセス部２０１ｂが設けられているため、キャピラリ針１０１が過度に突き出された場合でも、先端が捕捉孔２０１の底面に接触することがない。

すなわち、図１１に示すように、キャピラリ針１０１の突き出しに誤差が生じ、キャピラリ針１０１の先端１０１ａが上側細胞膜３０１ａのみならず下側細胞膜３０１ｂまで貫通し、捕捉孔２０１の底面の高さにまで到達しても、先端１０１ａは、リセス部２０１ｂに進入するのみで、捕捉プレート１０３に接触することがない。このため、キャピラリ針１０１の先端１０１ａが破損することがない。

また、本実施の形態においては、キャピラリ針１０１が最大限に突き出されたタイミングで薬液が吐出されるのではなく、キャピラリ針１０１が引き上げられている最中に薬液が吐出される。したがって、たとえ図１１に示す状態となっても、キャピラリ針１０１の先端１０１ａが細胞外にある状態で薬液が吐出されることがなく、確実に細胞内で薬液が吐出される。

次に、本実施の形態に係る捕捉プレート１０３の製造方法について、図１２を参照しながら説明する。図１２は、捕捉プレート１０３の製造過程１〜８を示す図である。

捕捉プレート１０３は、ＳＯＩ（Silicon On Insulator）基板を用いて製造される。まず、レジストパターニングにより、捕捉孔２０１の形状がＳＯＩ基板に転写される（製造過程１）。そして、厚さ１０μｍ程度の活性層シリコン層にＲＩＥ（Reactive Ion Etching）によって貫通孔２０１ａが形成される（製造過程２）。同様に、ＲＩＥによってリセス部２０１ｂおよび捕捉孔２０１全体の円柱形状が形成される（製造過程３、４）。こうして、捕捉プレート１０３の捕捉孔２０１の形状が整えられる。

そして、捕捉孔２０１が形成されたＳＯＩ基板全体が熱酸化によりシリコン酸化膜で保護された後（製造過程５）、脚部２０３に相当する部分がマスクされて平面部２０２の下側のシリコン酸化膜が緩衝フッ酸（ＢＨＦ）によってエッチングされる（製造過程６）。引き続き、平面部２０２の下側の活性層シリコン層が水酸化カリウム（ＫＯＨ）溶液によって異方性エッチングされ（製造過程７）、最後に全体のシリコン酸化膜が緩衝フッ酸（ＢＨＦ）によって除去されて捕捉プレート１０３が完成する（製造過程８）。

このように、本実施の形態に係る捕捉プレート１０３は、捕捉孔２０１がＲＩＥによってエッチングされるため、微小な貫通孔２０１ａやリセス部２０１ｂなども精度良く形成される。結果として、キャピラリ針１０１が過度に突き出された場合でも、正確な位置に形成されたリセス部２０１ｂによって、キャピラリ針１０１の先端を確実に保護することができる。

以上のように、本実施の形態によれば、キャピラリ針が最大限に突き出された後、引き上げられる最中に薬液を吐出するとともに、細胞を捕捉する捕捉孔のキャピラリ針先端が到達する部分にはリセス部を形成しておく。このため、確実に細胞膜が破られるように、最大限に突き出された際のキャピラリ針と捕捉孔の底面との距離を小さくしてもキャピラリ針の先端がリセス部に進入するのみで破損することがなく、細胞内に薬液が注入される空間が形成されたタイミングで薬液を吐出することができる。結果として、細胞内に確実に薬液を注入するとともに、キャピラリ針の先端を保護することができる。

（付記１）細胞に物質を注入するマイクロインジェクション装置であって、
細胞を捕捉して位置を固定する捕捉プレートと、
前記捕捉プレートによって捕捉された細胞に物質を注入するキャピラリ針と、
前記キャピラリ針を長手方向先端側へ突き出した後、長手方向根元側へ引き上げる移動機構部と、
前記移動機構部によって前記キャピラリ針が所定位置まで引き上げられた際に、前記キャピラリ針の先端から物質を吐出させる吐出制御部と
を有することを特徴とするマイクロインジェクション装置。

（付記２）前記捕捉プレートは、
細胞を捕捉する複数の捕捉孔があらかじめ定められた座標に形成されることを特徴とする付記１記載のマイクロインジェクション装置。

（付記３）前記捕捉孔は、
平面視形状が円形であり、直径が細胞の直径の７０〜８０％に相当することを特徴とする付記２記載のマイクロインジェクション装置。

（付記４）前記捕捉プレートは、
いずれか一方の面に細胞を捕捉する平面部と、
前記平面部のいずれか他方の面の周囲に密閉された空間が形成されるように前記平面部を支持する脚部とを有し、
前記平面部は、
細胞を捕捉する一方の面が円柱形状に陥没する複数の捕捉孔を備えることを特徴とする付記１記載のマイクロインジェクション装置。

（付記５）前記捕捉孔は、
底面に前記平面部を貫通する貫通孔が形成されることを特徴とする付記４記載のマイクロインジェクション装置。

（付記６）前記貫通孔は、
直径が１〜２μｍまたは細胞の直径の１０〜２０％に相当することを特徴とする付記５記載のマイクロインジェクション装置。

（付記７）前記捕捉孔は、
底面の前記キャピラリ針が前記移動機構部によって突き出された際の先端到達位置付近にさらに円柱形状に陥没するリセス部が形成されることを特徴とする付記４記載のマイクロインジェクション装置。

（付記８）前記リセス部は、
底面の直径が３〜４μｍかつ深さが２〜３μｍの円柱形状に前記捕捉孔の底面が陥没して形成されることを特徴とする付記７記載のマイクロインジェクション装置。

（付記９）物質を注入するために緩衝液中の細胞を捕捉して位置を固定する捕捉プレートであって、
当該捕捉プレートを貫通し、直径が細胞の直径と比較して十分小さい貫通孔と、
前記貫通孔付近に捕捉された細胞に物質を注入するキャピラリ針の先端到達位置付近が円柱形状に陥没するリセス部と
を有することを特徴とする捕捉プレート。

（付記１０）細胞を捕捉して位置を固定する捕捉プレートと、前記捕捉プレートによって捕捉された細胞に物質を注入するキャピラリ針とを備えたマイクロインジェクション装置におけるマイクロインジェクション方法であって、
前記キャピラリ針を長手方向先端側へ突き出す突出ステップと、
前記突出ステップ後、前記キャピラリ針を長手方向根元側へ引き上げる引上ステップと、
前記引上ステップにおいて前記キャピラリ針が所定位置まで引き上げられた際に、前記キャピラリ針の先端から物質を吐出する吐出ステップと
を有することを特徴とするマイクロインジェクション方法。

本発明は、細胞内に確実に薬液を注入するとともに、キャピラリ針の先端を保護する場合に適用することができる。

一実施の形態に係る自動マイクロインジェクション装置の構成を模式的に示す図である。 一実施の形態に係る捕捉プレートの構成を示す平面図である。 一実施の形態に係る捕捉プレートの構成を示す断面図である。 一実施の形態に係る捕捉孔の構成を示す平面図である。 一実施の形態に係る捕捉孔の構成を示す断面図である。 捕捉孔の直径と細胞捕捉力の関係を示す図である。 一実施の形態に係るインジェクション動作を示すフロー図である。 一実施の形態に係るインジェクションの過程を説明する図である。 図８に続く図である。 針の高さと薬液の導入率の関係を示す図である。 一実施の形態に係るインジェクション時のキャピラリ針先端付近を示す拡大図である。 一実施の形態に係る捕捉プレートの製造方法を示す図である。 インジェクション時の細胞捕捉方法の一例を示す図である。 捕捉された細胞の様子の一例を示す図である。 捕捉された細胞の様子の他の一例を示す図である。 インジェクション時の細胞の形状を示す図である。

符号の説明

１０１ キャピラリ針
１０２ シャーレ
１０３ 捕捉プレート
１０４ ステージ
１０５ 照明
１０６ 吸引部
１０７ ステージ移動機構部
１０８ キャピラリ針移動機構部
１０９ 捕捉座標記憶部
１１０ 制御部
１１１ 吐出機構部
１１２ ＣＣＤカメラ
１１３ 倒立顕微鏡
２０１ 捕捉孔
２０１ａ 貫通孔
２０１ｂ リセス部
２０２ 平面部
２０３ 脚部

Claims (9)

1. 細胞に物質を注入するマイクロインジェクション装置であって、
   細胞を捕捉して位置を固定する複数の捕捉孔があらかじめ定められた座標に形成された捕捉プレートと、
   前記捕捉プレートによって捕捉された細胞に物質を注入するキャピラリ針と、
   前記捕捉孔の底面から第１の距離まで前記キャピラリ針を長手方向先端側へ突き出した後、前記第１の距離よりも大きい第２の距離であって前記捕捉孔の底面および細胞の中心の距離を基準に設定された第２の距離まで前記キャピラリ針を長手方向根元側へ引き上げる移動機構部と、
   前記移動機構部によって前記キャピラリ針が前記捕捉孔の底面から前記第２の距離の位置まで引き上げられた際に、前記キャピラリ針の先端から物質を吐出させる吐出制御部と
   を有することを特徴とするマイクロインジェクション装置。
2. 前記捕捉孔は、
   平面視形状が円形であり、直径が細胞の直径の７０〜８０％に相当することを特徴とする請求項１記載のマイクロインジェクション装置。
3. 前記捕捉プレートは、
   いずれか一方の面に細胞を捕捉する平面部と、
   前記平面部のいずれか他方の面の周囲に密閉された空間が形成されるように前記平面部を支持する脚部とを有し、
   前記平面部は、
   細胞を捕捉する一方の面が円柱形状に陥没する複数の捕捉孔を備えることを特徴とする請求項１記載のマイクロインジェクション装置。
4. 前記捕捉孔は、
   底面に前記平面部を貫通する貫通孔が形成されることを特徴とする請求項３記載のマイクロインジェクション装置。
5. 前記貫通孔は、
   直径が１〜２μｍまたは細胞の直径の１０〜２０％に相当することを特徴とする請求項４記載のマイクロインジェクション装置。
6. 前記捕捉孔は、
   底面の前記キャピラリ針が前記移動機構部によって突き出された際の先端到達位置付近にさらに円柱形状に陥没するリセス部が形成されることを特徴とする請求項３記載のマイクロインジェクション装置。
7. 前記リセス部は、
   底面の直径が３〜４μｍかつ深さが２〜３μｍの円柱形状に前記捕捉孔の底面が陥没して形成されることを特徴とする請求項６記載のマイクロインジェクション装置。
8. 物質を注入するために緩衝液中の細胞を捕捉して位置を固定する捕捉プレートであって、
   当該捕捉プレートを貫通し、直径が細胞の直径と比較して十分小さい貫通孔と、
   前記貫通孔付近に捕捉された細胞に物質を注入するキャピラリ針の先端到達位置付近が円柱形状に陥没するリセス部と
   を有することを特徴とする捕捉プレート。
9. 細胞を捕捉して位置を固定する複数の捕捉孔があらかじめ定められた座標に形成された捕捉プレートと、前記捕捉プレートによって捕捉された細胞に物質を注入するキャピラリ針とを備えたマイクロインジェクション装置におけるマイクロインジェクション方法であって、
   前記捕捉孔の底面から第１の距離まで前記キャピラリ針を長手方向先端側へ突き出す突出ステップと、
   前記突出ステップ後、前記第１の距離よりも大きい第２の距離であって前記捕捉孔の底面および細胞の中心の距離を基準に設定された第２の距離まで前記キャピラリ針を長手方向根元側へ引き上げる引上ステップと、
   前記引上ステップにおいて前記キャピラリ針が前記捕捉孔の底面から前記第２の距離の位置まで引き上げられた際に、前記キャピラリ針の先端から物質を吐出する吐出ステップと
   を有することを特徴とするマイクロインジェクション方法。

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