JP5077862B2 - Human and mouse targeting peptides identified by phage display - Google Patents

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Description

【０００１】
発明の背景
本出願は、2000年9月8日に提出された米国特許仮出願第60/231,266号および2001年1月17日に提出された米国特許出願第09/765,101号からの優先権を主張する。本発明は、米国陸軍の助成金DAMD 17-98-1-8041および17-98-1-8581ならびに米国国立衛生研究所の助成金1R01CA78512-01A1、1R1CA90810-01、および1R01CA82976-01により政府の支援を受けて行われた。米国政府は本発明に一定の権利を保有する。
【０００２】
1. 発明の分野
本発明は、分子薬品および治療剤の標的化送達の分野に関する。より具体的には、本発明は、インビボまたはインビトロにおいて、臓器、組織、または細胞型を選択的に標的にするペプチドの同定および使用のための組成物および方法に関する。
【０００３】
2. 関連技術の説明
多くの疾患状態の治療的治療は、用いる治療剤の全身毒性のために制限される。癌治療剤は、特に非常に低い治療指数を示し、皮膚および骨髄のような急速に増殖する正常組織は、腫瘍細胞を殺すために用いる濃度ほど高くない薬剤の濃度で影響を受ける。癌および他の臓器、組織、または細胞型限定疾患の治療は、所望の臓器、組織、または細胞型への治療剤の標的化送達のための組成物および方法を開発することによって大きく促進されるであろう。
【０００４】
最近、マウスモデル系において臓器、組織、または細胞型ターゲティングペプチドを同定するためのファージディスプレイライブラリを用いるインビボ選択系が開発された。バクテリオファージの表面上にトランスジェニックペプチドを発現するファージディスプレイライブラリは、当初、免疫グロブリンのエピトープ結合部位をマッピングするために開発された（SmithおよびScott、1986、1993）。そのようなライブラリは、ファージの表面タンパク質をコードするcDNAにランダムオリゴヌクレオチドを挿入すること、独自のペプチドを109個もの順列で示すファージ粒子のコレクションを作製することによって作製することができる（PasqualiniおよびRuoslahti、1996；Arapら、1998a；Arapら、1998b）。
【０００５】
ファージディスプレイライブラリをマウスに静脈内投与した後に、個々の臓器からのファージの回収を行った（PasqualiniおよびRuoslahti、1996）。ファージの外部表面上に発現された特異的ターゲティングペプチド配列に基づいて、異なるマウス臓器、組織、または細胞型の血管床に選択的に回帰することができるファージを回収した（PasqualiniおよびRuoslahti、1996）。多様な臓器および腫瘍回帰ペプチドがこの方法によって同定されている（Rajotteら、1998、1999；Koivunenら、1999；Burgら、1999；Pasqualini、1999）。それらのターゲティングペプチドはそれぞれ、マウス標的組織の血管上に選択的に発現される異なる受容体に結合した（Pasqualini、1999；Pasqualiniら、2000；Folkman、1995；Folkman、1997）。腫瘍回帰ペプチドはマウスの腫瘍新生血管において上方制御されている受容体に結合した（Brooksら、1994；Pasqualini、2000）。臓器、組織、または細胞型に対して選択的な個々のターゲティングペプチドを同定する他に、（PasqualiniおよびRuoslahti、1996；Arapら、1998a；Koivunenら、1999）、このシステムは、インビボでマウスに発現される内皮細胞表面マーカーを同定するために用いられている（RajotteおよびRuoslahti、1999）。
【０００６】
ターゲティングペプチドに治療剤が結合すれば、マウスモデル系において、作用薬剤は所望の臓器、組織、または細胞型へと選択的に送達される。化学療法剤およびアポトーシス促進ペプチドを、腫瘍新生血管に存在する受容体に標的化送達すると、担癌マウスモデルにおいて治療有効性の著しい増加および全身毒性の減少が起こる（Arapら、1998a、1998b；Ellerbyら、1999）。
【０００７】
いくつかの場合、従来のインビボのファージディスプレイスクリーニング法は、非特異的ファージ結合の比較的高いバックグラウンドをもたらした。これは、網膜内皮系に属する組織に特に当てはまった。ターゲティングペプチドと細胞受容体との特異的な相互作用を保持しつつ、非特異的なファージ結合を減少させる改良されたファージディスプレイ法が必要とされている。また、臓器、組織、又は細胞型の中の特異的な細胞集団に関する受容体をターゲティングする必要も存在する。多くの場合、組織又は臓器は、種々の細胞型の高度に異種性の集団を含む。ファージディスプレイスクリーニングを特異的な細胞集団へとターゲティングする能力が、必要とされている。
【０００８】
同様に、臓器および組織における受容体-リガンド対を同定する必要性も存在する。標的化受容体および受容体に対するリガンド結合を同定するためのこれまでの試みは、試験するために一度に単一のリガンドを主にターゲティングしていた。これまで未知の受容体およびまだ特徴が調べられていないリガンドの同定は、非常に遅く、骨の折れるプロセスであった。そのような新規受容体およびリガンドは、真性糖尿病、炎症疾患、関節炎、アテローム性動脈硬化、癌、自己免疫疾患、細菌感染症、ウイルス感染症、心臓血管疾患、または変性疾患のような多様な疾患状態に対する新規治療の基礎を提供する可能性がある。
【０００９】
発明の概要
本発明は、臓器、組織、又は特定の細胞型に選択的なターゲティングペプチドを同定し、使用するための組成物及び方法を提供することにより、当技術分野における長年にわたる需要を満たす。いくつかの態様において、方法は、ファージと細胞受容体との選択的な結合を保持しつつ、非特異的なファージ結合のバックグラウンドを減少させる新規なファージディスプレイ法である、選択的相互作用リガンドのバイオパニング及び迅速な分析（Biopanning and Rapid Analysis of Selective Interactive Ligands）（BRASIL）に関する。好ましい態様において、ターゲティングペプチドは、被験者をファージディスプレイライブラリへと曝露すること、1つ又は複数の臓器、組織、又は細胞型の試料を収集すること、水相に懸濁した単離細胞又は小さい細胞塊へと試料を分離させること、水相を有機相の上に重層すること、細胞が遠心分離チューブの底にペレット化されるよう二相を遠心分離すること、及びペレットからファージを収集することにより同定される。さらに好ましい態様において、有機相はジブチルフタレートである。
【００１０】
他の態様において、標的の臓器、組織、又は細胞型、例えば胎盤と結合するファージは、その臓器、組織、又は細胞型を欠いている被験者に対してプレスクリーニング又はポストスクリーニングされうる。標的の臓器、組織、又は細胞型を欠いている被験者と結合するファージは、臓器、組織、又は細胞型を保有している被験者におけるスクリーニングの前にライブラリより除去される。好ましい態様において、臓器、組織、又は細胞型は、胎盤又は脂肪組織である。
【００１１】
好ましい態様において、ターゲティングファージは、PALM（Positioning and Ablation with Laser Microbeams）による細胞型の選択の後、臓器又は組織に存在する特異的な細胞型又は亜型より回収されうる。PALMは、例えば臓器又は組織の薄片からの、特異的な細胞型の選択を可能にする。ファージは、選択された試料より回収されうる。
【００１２】
もう一つの態様において、抗体の抗原結合部分を表示しているファージディスプレイライブラリが被験者より調製され、ライブラリが1つ又は複数の抗原に対してスクリーニングされ、抗原と結合するファージが収集される。より好ましい態様において、抗原はターゲティングペプチドである。
【００１３】
特定の態様において、方法及び組成物は、ターゲティングペプチドの1つ又は複数の受容体を同定するために使用されうる。別の態様において、組成物及び方法は、既知の、又は新たに同定された受容体に対する天然に存在するリガンドを同定するために使用されうる。
【００１４】
いくつかの態様において、本発明の方法は、関心対象の受容体を含む臓器、組織、または細胞にターゲティングペプチドを接触させる段階、ペプチドを受容体に結合させる段階、およびペプチドに対するその結合によって受容体を同定する段階を含んでもよい。好ましい態様において、ターゲティングペプチドは、配列番号：5〜配列番号：45、配列番号：47〜配列番号：121、配列番号：123、および配列番号：125〜配列番号：251のいずれかから選択される少なくとも3つの連続するアミノ酸を含む。他の好ましい態様において、ターゲティングペプチドは、受容体に対する抗体の一部を含む。もう一つの態様において、ターゲティングペプチドは、ランダムアミノ酸配列を含んでもよい。当業者は、接触させる段階が臓器、組織、もしくは細胞を利用することができる、または臓器、組織、もしくは細胞のホモジネートもしくは洗浄剤抽出物を利用してもよいと認識するであろう。特定の態様において、接触させるべき細胞は、ターゲティングペプチドに関して疑われる受容体を発現するように遺伝子操作してもよい。好ましい態様において、ターゲティングペプチドは、受容体に対するその共有結合を可能にする反応部分によって改変される。より好ましい態様において、反応部分は、光によって活性化されると受容体に共有結合するようになる光反応基である。もう一つの好ましい態様において、ペプチドは、固体支持体に結合して受容体をアフィニティクロマトグラフィーによって精製する。他の好ましい態様において、固体支持体は磁性ビーズ、セファロースビーズ、アガロースビーズ、ニトロセルロースメンブレン、ナイロンメンブレン、カラムクロマトグラフィーマトリクス、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）マトリクス、またはファストパフォーマンス（fast performance）液体クロマトグラフィー（FPLC）マトリクスを含む。特定の態様において、ターゲティングペプチドは、受容体に結合すると、受容体の活性を阻害する。当業者は、受容体の活性を、触媒活性および結合活性を含むがこれらに限定されない当技術分野で既知の多様な方法によってアッセイすることができることを認識するであろう。もう一つの好ましい態様において、受容体は、エンドスタチン受容体、メタロプロテアーゼまたはアミノペプチダーゼである。
【００１５】
代替的態様において、関心対象の受容体の一つまたは複数のリガンドを、開示の方法および組成物によって同定してもよい。天然に存在するリガンドの一部または全てを模倣する一つまたは複数のターゲティングペプチドは、インビボまたはインビトロにおけるファージディスプレイおよびバイオパニング（biopanning）によって同定してもよい。天然に存在するリガンドは、受容体に結合する単一のターゲティングペプチド、または受容体に結合する配列のコンセンサスモチーフとの相同性によって同定してもよい。他のもう一つの態様において、関心対象の受容体に結合する一つまたは複数のターゲティングペプチドに対する抗体を調製してもよい。そのような抗体は、本来のリガンドの同定または免疫アフィニティ精製のために用いてもよい。
【００１６】
特定の態様において、本発明のターゲティングペプチドは、遺伝子治療ベクターおよび融合タンパク質を含むがこれらに限定されない治療剤を、被験者における特定の臓器、組織、または細胞型に選択的に送達するために用いられる。当業者は、使用される、主張される方法の範囲には、所望の臓器、組織、または細胞型への治療剤の標的化送達によって治療することができる任意の疾患状態も含まれることを認識するであろう。そのような疾患状態には、疾患を有する細胞が、非転移性癌のような特定の臓器、組織、または細胞型に限定される疾患が含まれるが、他の疾患状態を臓器、組織、または細胞型ターゲティングアプローチによって治療してもよい。
【００１７】
本発明の一つの態様は、配列番号：5〜配列番号：45、配列番号：47〜配列番号：121、配列番号：123、および配列番号：125〜配列番号：251のいずれかから選択されるターゲティングペプチド配列の少なくとも3つの連続するアミノ酸を含む、大きさがアミノ酸100個またはそれ未満の単離ペプチドに関する。
【００１８】
好ましい態様において、単離ペプチドは、アミノ酸50個もしくはそれ未満、より好ましくはアミノ酸30個もしくはそれ未満、より好ましくはアミノ酸20個もしくはそれ未満、より好ましくはアミノ酸10個もしくはそれ未満、またはさらにより好ましくは大きさがアミノ酸5個もしくはそれ未満である。他の好ましい態様において、請求項1記載の単離ペプチドは、配列番号：5〜配列番号：45、配列番号：47〜配列番号：121、配列番号：123、および配列番号：125〜配列番号：251のいずれかから選択されるターゲティングペプチド配列の少なくとも4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、または25個の連続するアミノ酸を含む。
【００１９】
特定の態様において、単離ペプチドは分子に結合する。好ましい態様において、結合は共有結合である。さらなる態様において、分子は、薬物、化学療法剤、放射性同位元素、アポトーシス促進剤、抗血管新生剤、ホルモン、サイトカイン、増殖因子、細胞毒性剤、ペプチド、タンパク質、抗生物質、抗体、抗体のFab断片、生存因子、抗アポトーシス剤、ホルモンアンタゴニスト、造影剤、核酸または抗原である。それらの分子は、例示目的により挙げたに過ぎない。本発明の範囲に含まれる分子には、ターゲティングペプチドに結合して、被験者に投与してもよい実質的に任意の分子が含まれる。好ましい態様において、アポトーシス促進剤は、グラミシジン、マガイニン、メリチン、デフェンシン、セクロピン、(KLAKLAK)2（配列番号：1）、(KLAKKLA)2（配列番号：2）、(KAAKKAA)2（配列番号：3）、または(KLGKKLG)3（配列番号：4）である。他の好ましい態様において、抗血管新生剤は、アンジオスタチン5、色素上皮由来因子、アンジオテンシン、ラミニンペプチド、フィブロネクチンペプチド、プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤、組織メタロプロテイナーゼ阻害剤、インターフェロン、インターロイキン12、血小板因子4、IP-10、Gro-β、トロンボスポンジン、2-メトキシエストラジオール、プロリフェリン関連タンパク質、カルボキシアミドトリアゾール、CM101、マリマスタット、ペントサンポリサルフェート、アンジオポエチン2（レジェネロン）、インターフェロン-α、ハービマイシンA、PNU145156E、16Kプロラクチン断片、リノマイド、サリドマイド、ペントキシフィリン、ゲニステイン、TNP-470、エンドスタチン、パクリタキセル、ドセタキセル、ポリアミン、プロテアソーム阻害剤、キナーゼ阻害剤、シグナル伝達阻害剤（SU5416、SU6668、Sugen、South San Fransisco、CA）、アキュチン、シドフォビル、ビンクリスチン、ブレオマイシン、AGM-1470、血小板因子4またはミノサイクリンである。さらに好ましい態様において、サイトカインは、インターロイキン1（IL-1）、IL-2、IL-5、IL-10、IL-11、IL-12、IL-18、インターフェロン-γ（IF-γ）、IF-α、IF-β、腫瘍壊死因子-α（TNF-α）、またはGM-CSF（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子）である。そのような例は、代表として示したに過ぎず、当技術分野で既知の他のアポトーシス促進剤、抗血管新生剤、またはサイトカインを除外すると解釈されない。
【００２０】
他の態様において、単離ペプチドは高分子複合体に結合する。好ましい態様において、結合は共有結合である。他の好ましい態様において、高分子複合体はウイルス、バクテリオファージ、細菌、リポソーム、微粒子、磁性ビーズ、酵母細胞、哺乳動物細胞、細胞、または微小装置である。これらは例示目的で示したに過ぎない。本発明の範囲に含まれる高分子複合体には、ターゲティングペプチドに結合して、被験者に投与してもよい実質的に任意の高分子複合体が含まれる。他の好ましい態様において、単離ペプチドは、真核細胞発現ベクター、より好ましくは遺伝子治療ベクターに結合する。
【００２１】
もう一つの態様において、単離ペプチドは、固体支持体、好ましくは磁性ビーズ、セファロースビーズ、アガロースビーズ、ニトロセルロースメンブレン、ナイロンメンブレン、カラムクロマトグラフィーマトリクス、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）マトリクス、またはファストパフォーマンス液体クロマトグラフィー（FPLC）に結合する。
【００２２】
本発明のさらなる態様は、配列番号：5〜配列番号：45、配列番号：47〜配列番号：121、配列番号：123、および配列番号：125〜配列番号：251のいずれかから選択される配列の連続アミノ酸少なくとも3個を含む融合タンパク質に関する。
【００２３】
その他の特定の態様は、薬学的に許容される担体において主張される単離ペプチドまたは融合タンパク質を含む組成物に関する。さらなる態様は、一つまたは複数の容器において主張される単離ペプチドまたは融合タンパク質を含むキットに関する。
【００２４】
その他の態様は、所望の臓器、組織、または細胞型に対するターゲティングペプチドを選択する段階、上記のターゲティングペプチドを分子、高分子複合体、または遺伝子治療ベクターに結合させる段階、および上記の分子、複合体、またはベクターに結合した上記のペプチドを被験者に提供する段階を含む、標的化送達方法に関する。好ましくは、ターゲティングペプチドは、配列番号：5〜配列番号：45、配列番号：47〜配列番号：121、配列番号：123、および配列番号：125〜配列番号：251のいずれか由来の連続アミノ酸少なくとも3個を含むように選択される。特定の好ましい態様において、臓器、組織、または細胞型は、骨髄、リンパ節、前立腺癌、または骨髄に転移した前立腺癌である。他の好ましい態様において、ターゲティングペプチドに結合した分子は、化学療法剤、抗原、または造影剤である。当業者は、本明細書の範囲において、任意の臓器、組織、または細胞型が、任意の分子、高分子複合体、または遺伝子治療ベクターに結合したターゲティングペプチドを用いた送達のための標的となりうることを認識するであろう。
【００２５】
本発明のその他の態様は、ターゲティングペプチドをコードする、大きさが300ヌクレオチドまたはそれ未満の単離核酸に関する。好ましい態様において、単離核酸は、大きさが250、225、200、175、150、125、100、75、50、40、30、20または10ヌクレオチドまたはそれ未満である。他の好ましい態様において、単離核酸は、真核または原核細胞発現ベクターに組み入れられる。さらにより好ましい態様において、ベクターは、プラスミド、コスミド、酵母人工染色体（YAC）、細菌人工染色体（BAC）、ウイルスまたはバクテリオファージである。他の好ましい態様において、単離核酸は、発現されたペプチドを宿主細胞の細胞外表面に局在させるリーダー配列に機能的に結合している。
【００２６】
本発明のさらなる態様は、疾患状態に関連する細胞を標的とするターゲティングペプチドを選択する段階、疾患状態を治療するために有効な一つまたは複数の分子をペプチドに結合させる段階、および疾患状態を有する被験者にペプチドを投与する段階を含む、疾患状態を治療する方法に関する。好ましくは、ターゲティングペプチドには、配列番号：5〜配列番号：45、配列番号：47〜配列番号：121、配列番号：123、および配列番号：125〜配列番号：251のいずれかから選択される連続アミノ酸少なくとも3個が含まれる。好ましい態様において、疾患状態は、真性糖尿病、炎症疾患、関節炎、アテローム性動脈硬化、癌、自己免疫疾患、細菌感染症、ウイルス感染症、心血管疾患、または変性疾患である。
【００２７】
本発明のもう一つの態様は、癌に対する腫瘍ターゲティングペプチドを用いる組成物および方法に関する。本出願に開示の方法によって同定された腫瘍ターゲティングペプチドは、分子または高分子群を含むがこれらに限定されない治療剤に結合させて、癌を有する被験者に投与してもよく、治療剤の有効性の増加および全身毒性の減少を提供する。本発明の範囲に含まれる治療剤には、化学療法剤、放射性同位元素、アポトーシス促進剤、細胞毒性剤、細胞分裂阻害剤、および遺伝子治療ベクターが含まれるがこれらに限定されない。そのような治療剤の腫瘍への標的化送達は、腫瘍に対する薬剤の送達を増加させながら、患者の正常な臓器および組織に対する薬剤の不適切な送達を減少させることに関して、先行技術に対する有意な改善を提供する。好ましい態様において、腫瘍ターゲティングペプチドは、ファージの送達を腫瘍血管の血管新生内皮細胞にターゲティングするためにファージ遺伝子治療ベクターのカプセルに組み入れられる。
【００２８】
特定の態様は、抗原に対する抗体を得る方法に関する。好ましい態様において、抗原は、一つまたは複数のターゲティングペプチドを含む。ターゲティングペプチドを調製して、固体支持体に固定して、抗体を含む血清を加えて、ターゲティングペプチドに結合する抗体を回収する。
【００２９】
例示的な態様の説明
本明細書において使用されるように、「一つの」（「a」又は「an」）とは、1以上を意味しうる。本発明の特許請求の範囲において使用されるように、「を含む」という用語と関連して、「一つの」（「a」又は「an」）とは、1以上を意味しうる。本発明において使用されるように、「もう一つの（another）」とは、少なくとも第二又はそれ以上の項目を意味しうる。
【００３０】
「ターゲティングペプチド」とは、ある臓器、組織、又は細胞型への選択的局在を特徴とする、連続的なアミノ酸の配列を含むペプチドである。選択的局在は、例えば、推定ターゲティングペプチド配列を、ファージの外表面上に表示されるタンパク質へと組み込む、後に開示される方法により、決定されうる。異なるアミノ酸配列のそのようなターゲティングペプチドを多数発現するよう遺伝学的に改変されたそのようなファージのライブラリを、被験者に投与した後、被験者から1つ又は複数の臓器、組織、又は細胞型を収集し、その臓器、組織、又は細胞型に見出されるファージを同定する。ターゲティングペプチド配列を発現するファージは、対照の組織又は臓器と比較して、より多い結合を、その組織又は臓器において示す場合、その組織又は臓器に選択的に局在するものと見なされる。好ましくは、ターゲティングペプチドの選択的局在は、対照の臓器、組織、又は細胞型と比較して2倍以上大きいファージの濃縮を、標的の臓器、組織、又は細胞型においてもたらすべきである。対照の臓器、組織、又は細胞型と比較して少なくとも3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、又はそれ以上の濃縮を標的臓器においてもたらす選択的局在は、より好ましい。又は、選択的局在を示すターゲティングペプチド配列を発現するファージは、好ましくは、標的臓器から回収されたファージを、次回のスクリーニングのため第二の宿主へと再注射した場合に、対照臓器と比較して増加した濃縮を標的臓器において示す。3回目のスクリーニングの後には、さらなる濃縮が示されうる。選択的局在を決定するためのもう一つの別の手段は、推定標的ペプチドを発現するファージが、非特異的ペプチドを発現するか、又は推定標的ペプチドを発現するよう遺伝学的に改変されていない対照ファージと比較して、好ましくは2倍、より好ましくは3倍、又はそれ以上の濃縮を標的臓器において示すことである。選択的局在を決定するためのもう一つの手段は、標的ペプチドを発現するファージの標的臓器への局在が、標的ペプチド配列を含む合成ペプチドの共投与により少なくとも部分的に阻止されることである。「ターゲティングペプチド」および「回帰ペプチド」とは、本明細書において同義に使用される。
【００３１】
「ファージディスプレイライブラリ」とは、その外表面上に推定のターゲティングペプチドの組を発現するように遺伝子操作されているファージのコレクションを意味する。好ましい態様において、推定のターゲティングペプチドをコードするDNA配列は、ファージ莢膜タンパク質をコードする遺伝子にフレームが合うように挿入される。他の好ましい態様において、推定のターゲティングペプチド配列は、一部が20個全てのアミノ酸のランダム混合物であり、一部が非ランダム混合物である。特定の好ましい態様において、ファージディスプレイライブラリの推定のターゲティングペプチドは、ターゲティングペプチド配列内の固定位置で一つまたは複数のシステイン残基を示す。
【００３２】
「高分子複合体」とは、その配列がランダム、規則正しい、または部分的に規則正しくてもよい分子のコレクションを意味する。この用語は、バクテリオファージ、ウイルス、細菌、単細胞病原性生物、多細胞病原性生物、および原核または真核細胞のような生物を含む。この用語はまた、リポソーム、微小カプセル、微粒子、磁性ビーズおよび微小装置のような非生存分子群を含む。唯一の要件は、複合体が一つ以上の分子を含むことである。分子は同一であっても、または互いに異なっていてもよい。
【００３３】
ターゲティングペプチドのための「受容体」には、ターゲティングペプチドに結合する任意の分子または分子の複合体が含まれるがこれらに限定されない。受容体の非限定的な例には、ペプチド、タンパク質、糖タンパク質、リポタンパク質、エピトープ、脂質、糖質、多分子構造、一つまたは複数の分子の特異的コンフォメーションおよび形態解剖学的実体が含まれる。好ましい態様において、「受容体」とは、標的臓器、組織、または細胞型内の血管を形成する細胞の管腔表面上に存在する天然に存在する分子または分子の複合体である。
【００３４】
「被験者」とは、一般的に哺乳動物を意味する。特定の好ましい態様において、被験者は、マウスまたはウサギである。さらにより好ましい態様において、被験者はヒトである。
【００３５】
ファージディスプレイ
ターゲティングペプチドを同定するための本明細書に記載の方法は、ファージディスプレイライブラリのインビトロ投与を含む。ファージディスプレイの様々な方法およびペプチドの多様な集団を作製する方法は当技術分野で周知である。例えば、そのそれぞれが参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第5,223,409号、第5,622,699号、および第6,068,829号は、ファージライブラリを調製する方法を開示する。ファージディスプレイ技術は、小さいペプチドがその表面上に発現されうるようにバクテリオファージを遺伝子操作することを含む（Smithら、1985、1993）。この技術を適用できる可能性がある範囲はかなり広く、過去10年の間に、ファージによって表示されたペプチドライブラリの構築、およびライブラリを用いてペプチドリガンドを単離するスクリーニング方法の開発にはかなりの進歩が認められている。例えば、ペプチドライブラリを用いることによって、相互作用部位、および炎症反応に関与する抗体または細胞接着を媒介するインテグリンのような多くのタンパク質における受容体-リガンド結合モチーフの特徴を調べることが可能となった。この方法は同様に、ペプチド模倣薬または造影剤を開発するためのリードとして役立つ新規ペプチドリガンドを同定するためにも用いられている（Arapら、1998a）。ペプチドの他に、一本鎖抗体のようなより大きいタンパク質ドメインもまた、ファージ粒子の表面上に表示されうる（Arapら、1998a）。
【００３６】
ある臓器、組織、又は細胞型に選択的なターゲティングアミノ酸配列は、「バイオパニング（biopanning）」により単離されうる（PasqualiniおよびRuoslahti、1996；Pasqualini、1999）。簡単に説明すると、推定ターゲティングペプチドを含むファージのライブラリを動物又はヒトに投与し、ファージを含む臓器、組織、又は細胞型の試料を回収する。繊維状ファージを利用した好ましい態様においては、バイオパニングとバイオパニングの間に、線毛陽性細菌においてインビトロでファージを繁殖させることができる。この細菌は、ファージによって溶解せず、特定の挿入物を表示するファージを、多コピー、分泌する。標的分子と結合するファージは、標的の臓器、組織、又は細胞型から溶出させ、次いで宿主細菌において増殖させることにより増幅することができる。所望により、増幅されたファージを宿主に投与し、臓器、組織、又は細胞型の試料を再び収集してもよい。選択的バインダーの集団が得られるまで、複数回のバイオパニングを実施することができる。ペプチドのアミノ酸配列を、ファージゲノム内のターゲティングペプチド挿入物に相当するDNAを配列決定することにより、決定する。次いで、同定されたターゲティングペプチドを、標準的なタンパク質化学技術（Arapら、1998a、Smithら、1985）により合成ペプチドとして作製することができる。この手法は、標的の性質を予想することなく、バイアスのない機能アッセイにおいて、循環ターゲティングペプチドを検出することを可能にする。候補標的がターゲティングペプチドの受容体として同定された後は、標準的な生化学的方法（Pasqualini、1999；RajotteおよびRuoslahti、1999）を使用することにより、それを単離、精製、クローニングすることが可能である。
【００３７】
特定の態様において、バックグラウンドファージ結合をさらに減少させるため、サブトラクションプロトコルが使用される。サブトラクションの目的は、目的の細胞以外の細胞と結合するか、又は不活化された細胞と結合するファージをライブラリから除去することである。別の態様において、ファージライブラリは、ターゲティングされた細胞、組織、又は臓器を保有していない被験者に対してプレスクリーニングされうる。例えば、胎盤結合ペプチドは、男性又は非妊娠女性に対してライブラリをプレスクリーニングした後に同定されうる。サブトラクション後、ライブラリは、目的の細胞、組織、又は臓器に対してスクリーニングされうる。もう一つの別の態様において、刺激されていない休止期の細胞型、組織、又は臓器が、ライブラリに対してスクリーニングされ、結合するファージが除去される。次いで、細胞系、組織、又は臓器が、例えばホルモン、増殖因子、サイトカイン、又はケモカインの投与によって活性化され、活性化された細胞型、組織、又は臓器が、サブトラクトされたファージライブラリに対してスクリーニングされる。
【００３８】
例えば、参照として本明細書に組み込まれる米国特許第号5,840,841号、第5,705,610号、5,670,312号、及び第5,492,807号に開示されるように、他のサブトラクションプロトコルの方法も既知であり、本発明の実施において使用されうる。
【００３９】
ファージディスプレイ系の選択
マウスにおいて行われたこれまでのインビボ選択研究は、fUSE5ベクターにおけるIII遺伝子莢膜タンパク質との融合タンパク質として発現されたランダムペプチドのライブラリを好んで用いた（PasqualiniおよびRuoslahti、1996）。所定のライブラリに存在する個々のクローンの数および多様性は、インビボ選択の成否にとって重要な要因である。欠損ファージクローンの過剰発現を有する可能性が低い一次ライブラリを用いることが好ましい（Koivunenら、1999）。ライブラリの調製は、108〜109形質導入単位（T.U.）/mlのあいだで最適化しなければならない。特定の態様において、各選択ラウンドの間にバルク増幅戦略を適用する。
【００４０】
直鎖、環状、または二環ペプチドを示すファージライブラリを、本発明の範囲内で用いてもよい。しかし、単環ペプチドは直鎖ペプチドより標的臓器に対して高い親和性を有する傾向があることから、環状挿入物（CX3-10C）において3〜10個のランダム残基を表示するファージライブラリが好ましい。二環ペプチドを示すライブラリ（CX3C X3CX3Cなど；Rajotteら、1998）も首尾よく用いられている。しかし、同源の合成ペプチドの産生は、可能ではあるが、異なるジスルフィド架橋配列を有する多数の配座異性体のために複雑となりうる。
【００４１】
マウスにおけるインビボファージディスプレイによる回帰ペプチドおよび受容体の同定
マウスに投与されたファージディスプレイペプチドライブラリ由来のペプチドのインビボ選択を用いて、正常なマウス脳、腎臓、肺、皮膚、膵臓、網膜、腸、子宮、前立腺、および副腎に関して選択的なターゲティングペプチドを同定した（PasqualiniおよびRuoslahti、1996；Pasqualini、1999；Rajotteら、1998）。これらの結果は、正常な臓器の血管内皮が、ペプチドプローブによる異なるターゲティングを可能にするために十分に不均一であることを示している（PasqualiniおよびRuoslahti、1996；Rajotteら、1998）。腫瘍の新生血管に回帰するペプチドを同定する手段は、下記のように考案されている。ヌードマウスにおける腫瘍異種移植片の血管を標的とするペプチドモチーフのパネルが構築されている（Arapら、1998a；Pasqualini、1999により概説）。これらのモチーフには、配列RGD-4C、NGR、およびGSLが含まれる。RGD-4Cペプチドはこれまで、選択的に結合するαvインテグリンとして同定されており、ヌードマウスにおける腫瘍異種移植片の血管に回帰することが示されている（Arapら、1998a、1998b；Pasqualini、1997）。
【００４２】
腫瘍回帰RGD4Cターゲティングペプチドの受容体は、αvインテグリンとして同定されている（Pasqualiniら、1997）。αvインテグリンは、血管新生において重要な役割を果たす。αvβ3およびαvβ5インテグリンは、正常な内皮細胞には存在しないか、または発現されても低レベルであるが、腫瘍の新生血管では誘導される（Brooksら、1994；Hammesら、1996）。アミノペプチダーゼN/CD13は最近、NGRモチーフの血管新生受容体であると同定されている（Burgら、1999）。アミノペプチダーゼN/CD13は、TRAMPにおける前立腺癌の新生血管においてだけでなく、正常上皮前立腺組織においても強く発現されている。
【００４３】
腫瘍回帰ファージは、腫瘍の新生血管においてその受容体と共局在するが、正常組織の非新生血管には存在しない（Arapら、1998b）。免疫組織化学的証拠から、血管ターゲティングファージが、組織切片においてヒト腫瘍血管に結合するが（Pasqualiniら、2000）、正常血管には結合しないことが示されている。挿入物を有さない陰性対照ファージ（fdファージ）は、正常または腫瘍組織切片に結合しなかった。血管新生受容体の発現を、細胞株、非増殖血管、および腫瘍の活性化血管、ならびに黄体のような他の血管新生組織において評価した。フローサイトメトリーおよび免疫組織化学から、これらの受容体が多くの腫瘍細胞および活性化HUVECsにおいて発現されていることが示された（データは示さない）。血管新生受容体は、マウスまたはヒト組織の正常臓器の血管において検出されなかった。
【００４４】
これらの受容体の分布を、腫瘍細胞、腫瘍血管、および正常血管において免疫組織化学によって分析した。αvインテグリン、CD13、アミノペプチダーゼA、NG2、および腫瘍血管における既知の受容体であるMMP-2/MMP-9は、ヒトおよびマウス起源の双方の新生血管の内皮細胞および周皮細胞において特異的に発現される。新生血管は、非増殖性の内皮細胞では非常に低レベルで発現されるか、または全く発現されないマーカーを発現する（示していない）。
【００４５】
新生血管内皮のマーカーには、VEGFおよび塩基性FGF受容体の特異的サブタイプ、ならびに中でもαvインテグリンのような血管増殖因子の受容体が含まれる（MustonenおよびAlitalo、1995）。これまで、新生血管の特徴である新規分子の同定および単離は、主に内皮細胞を培養で増殖させると表現型が劇的に変化するために遅れている（Watsonら、1995）。
【００４６】
これらの腫瘍血管マーカーの多くはプロテアーゼであり、マーカーのいくつかは、ウイルス受容体として作用する。αvインテグリンは、アデノウイルスの受容体であり（Wickhamら、1997c）、CD13はコロナウイルスの受容体である（Lookら、1989）。MMP-2およびMMP-9は、エコーウイルスの受容体である（Koivunenら、1999）。アミノペプチダーゼAも同様にウイルス受容体であるように思われる。バクテリオファージは真核細胞ウイルスと同じ細胞受容体を利用する可能性がある。これらの知見は、インビボファージディスプレイによって単離された受容体が、同定されたペプチドモチーフを標的遺伝子治療担体として利用するための重要な特徴である、細胞内部移行（internalization）能を有することを示唆している。
【００４７】
標的化送達
腫瘍血管に回帰するペプチドを細胞毒性薬またはアポトーシス促進ペプチドにカップリングさせると、腫瘍異種移植片を有する実験的マウスモデルにおいて親化合物より有効でより毒性の低い化合物が得られている（Arapら、1998a；Ellerbyら、1999）。下記に示すように、RGD-4Cペプチドをアデノウイルスの表面タンパク質に挿入すると、腫瘍標的化遺伝子治療のために用いてもよいアデノウイルスベクターが得られる（Arapら、1998b）。
【００４８】
BRASIL
好ましい態様において、標的臓器、組織、または細胞型の細胞に結合したファージを未結合のファージから分離することは、BRASIL技術を用いて行う（2000年9月8日に提出された米国特許仮出願第60/231,266号；参照として本明細書に組み入れられており、本明細書と共に提出された、Arap、Pasqualini、およびGiordanoによる「選択的相互作用リガンドのバイオパニングおよび迅速な分析（Biopanning and Rapid Analysis of Selective Interactive Ligands（BRASIL））」と題する米国特許）。BRASIL（可溶性相互作用リガンドのバイオパニングおよび迅速な分析）では、臓器、組織、または細胞型を細胞または小さい細胞塊に穏やかに分離して、これを水相に懸濁する。水相を、適当な密度の有機相の上に層にして、遠心分離する。結合したファージに接着した細胞は遠心管の底に沈殿して、未結合のファージは水相に残ったままとなる。これによって、ファージと細胞との結合相互作用を維持しながら、結合したファージを未結合のファージからより効率よく分離することができる。臓器、組織、もしくは細胞型を静脈内投与によりファージディスプレイライブラリに曝露する、インビボプロトコールにおいて、または、細胞を水相においてファージライブラリに曝露してから遠心分離する、エクスビボプロトコールによって、BRASILを行ってもよい。
【００４９】
タンパク質とペプチド
特定の態様において、本発明は、少なくとも一つのタンパク質またはペプチドを含む新規組成物に関する。本明細書において用いられるように、タンパク質またはペプチドは一般的に、アミノ酸約200個以上で遺伝子から翻訳された完全長の配列までのタンパク質；アミノ酸約100個以上のポリペプチド；および/またはアミノ酸約3〜約100個のペプチドを意味するがこれらに限定されない。便宜上、「タンパク質」、「ポリペプチド、および「ペプチド」という用語は、本明細書において互換的に用いられる。
【００５０】
特定の態様において、少なくとも一つのタンパク質またはペプチドの大きさは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、約110、約120、約130、約140、約150、約160、約170、約180、約190、約200、約210、約220、約230、約240、約250、約275、約300、約325、約350、約375、約400、約425、約450、約475、約500、約525、約550、約575、約600、約625、約650、約675、約700、約725、約750、約775、約800、約825、約850、約875、約900、約925、約950、約975、約1000、約1100、約1200、約1300、約1400、約1500、約1750、約2000、約2250、約2500個のアミノ酸残基またはそれ以上を含んでもよいがこれらに限定されない。
【００５１】
本明細書において用いられるように、「アミノ酸残基」とは、当技術分野で既知の任意の天然のアミノ酸、任意のアミノ酸誘導体、または任意のアミノ酸模倣体を意味する。特定の態様において、タンパク質またはペプチドの残基は連続的であって、アミノ酸残基の配列を中断する任意の非アミノ酸は存在しない。他の態様において、配列は一つまたは複数の非アミノ酸部分を含んでもよい。特定の態様において、タンパク質またはペプチドの残基の配列は、一つまたは複数のアミノ酸部分によって中断されてもよい。
【００５２】
したがって、「タンパク質またはペプチド」という用語は、天然に存在するタンパク質において認められる一般的なアミノ酸20個の少なくとも一つ、または下記の表1に示すアミノ酸を含むがこれらに限定しない少なくとも一つの改変もしくはまれな（unusual）アミノ酸を含むアミノ酸配列を含む。
【００５３】
【表１】
改変アミノ酸およびまれなアミノ酸

Figure 0005077862
【００５４】
タンパク質またはペプチドは、標準的な分子生物学的技術を用いたタンパク質、ポリペプチドもしくはペプチドの発現、タンパク質もしくはペプチドの天然資源からの単離、またはタンパク質もしくはペプチドの化学合成を含む、当業者に既知の任意の技術によって作製してもよい。様々な遺伝子に対応するヌクレオチドならびにタンパク質、ポリペプチド、およびペプチド配列がこれまでに開示されており、当業者に既知のコンピューターデータベースにおいて認められるであろう。そのような一つのデータベースは、国立バイオテクノロジー情報センターのGenBankおよびGenPeptデータベースである（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）。既知の遺伝子のコード領域は、本明細書に開示の技術を用いて、または当業者に既知であるように増幅および/または発現してもよい。または、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドの様々な市販の調製物が、当業者に既知である。
【００５５】
ペプチド模倣体
本発明に従ってポリペプチドを調製するためのもう一つの態様は、ペプチド模倣体を用いることである。模倣体は、タンパク質の二次構造の要素を模倣するペプチド含有分子である。例えば、参照として本明細書に組み入れられる、「バイオテクノロジーと薬学（Biotechnology and Pharmacy）」、ペズット（Pezzuto）ら編、Chapman and Hall、ニューヨーク（1993）内、ジョンソン（Johnson）ら、「ペプチド折り返し模倣体（Peptide Turn Mimetics）」を参照のこと。ペプチド模倣体を用いる背景の基礎となる根本的理由は、タンパク質のペプチド骨格が、抗体と抗原の相互作用のような分子間相互作用を促進するようにアミノ酸側鎖を主に向けるように存在する点である。ペプチド模倣体は、天然の分子と類似の分子間相互作用を可能にすると予想される。これらの原理を用いて、本明細書に開示のターゲティングペプチドの天然の特性の多くを有するが、改変および改善すらされた特徴を有する第二世代の分子を操作してもよい。
【００５６】
融合タンパク質
本発明の他の態様は、融合タンパク質に関する。これらの分子は一般的に、ターゲティングペプチドの全てまたは実質的な部分が、N末端またはC末端で第二のポリペプチドまたはタンパク質の全てまたは実質的な部分に結合している。例えば、融合体は、異種宿主においてタンパク質の組み換え型を発現させるように他の種からのリーダー配列を用いてもよい。もう一つの有用な融合には、融合タンパク質の精製を促進するために、抗体のエピトープのような免疫学的に活性なドメインを付加することが含まれる。融合部またはその近傍に切断部位を含めると、精製後の外来性のポリペプチドの除去が促進されるであろう。他の有用な融合には、酵素からの活性部位、グリコシル化ドメイン、細胞ターゲティングシグナル、または膜貫通領域のような機能的ドメインの連結が含まれる。好ましい態様において、本発明の融合タンパク質は、治療タンパク質またはペプチドに結合したターゲティングペプチドを含む。融合タンパク質に組み入れてもよいタンパク質またはペプチドの例には、細胞分裂阻害タンパク質、殺細胞タンパク質、アポトーシス促進剤、抗血管新生剤、ホルモン、サイトカイン、増殖因子、ペプチド薬、抗体、Fab断片抗体、抗原、受容体タンパク質、酵素、レクチン、MHCタンパク質、細胞接着タンパク質、および結合タンパク質が含まれる。これらの例は、制限することを意味しておらず、実質的に本発明の範囲内において、タンパク質またはペプチドはターゲティングペプチドを含む融合タンパク質に組み入れることができることを意図している。融合タンパク質を作製する方法は、当業者に周知である。そのようなタンパク質は、例えば二官能架橋剤を用いる化学的結合によって、完全な融合タンパク質の新規合成によって、またはターゲティングペプチドをコードするDNA配列を第二のペプチドまたはタンパク質をコードするDNA配列に結合させた後、無傷の融合タンパク質を発現させることによって、産生することができる。
【００５７】
タンパク質の精製
特定の態様において、タンパク質またはペプチドは単離または精製してもよい。タンパク質精製技術は当業者に周知である。これらの技術は、一つのレベルで細胞、組織、または臓器のポリペプチドおよび非ポリペプチド画分へのホモジナイゼーションならびに粗分画化を含む。関心対象のタンパク質またはポリペプチドは、部分的または完全な精製を得るために（または均一になるまで精製）、クロマトグラフィーおよび電気泳動技術を用いてさらに精製してもよい。純粋なペプチドの調製に特に適した分析法は、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル排除クロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、アフィニティクロマトグラフィー、免疫アフィニティクロマトグラフィー、および等電点電気泳動である。アフィニティクロマトグラフィーによる受容体タンパク質精製の例は、その全文が参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第5,206,347号に開示されている。ペプチドを精製する特に効率のよい方法は、高速タンパク質液体クロマトグラフィー（FPLC）またはHPLCである。
【００５８】
精製タンパク質またはペプチドは、タンパク質またはペプチドが、その天然に得られる状態と比較して任意の程度にも精製されている、他の成分から単離可能な組成物を意味すると解釈される。したがって、単離または精製タンパク質またはペプチドも同様に、天然に存在する可能性がある環境を含まないタンパク質またはペプチドを意味する。一般的に、「精製された」とは、様々な他の成分を除去するために分画化が行われている、および組成物がその発現された生物活性を実質的に保持しているタンパク質またはペプチド組成物を意味するであろう。「実質的に精製された」という用語を用いる場合、この用語は、タンパク質またはペプチドが、組成物におけるタンパク質の約50％、約60％、約70％、約80％、約90％、約95％、またはそれ以上を構成するような、組成物の主成分を形成する組成物を意味する。
【００５９】
タンパク質またはペプチドの精製の程度を定量する様々な方法が、本開示に照らして当業者に既知である。これらには、例えば、活性な画分の比活性を決定する、またはSDS/PAGE分析によって画分内でのポリペプチドの量を評価することが含まれる。画分の純度を評価する好ましい方法は、画分の比活性を計算すること、それを最初の抽出物の比活性と比較すること、およびこのように、「〜精製倍率」によって評価して、その純度を計算することである。活性の量を示すために用いられる実際の単位は、当然、精製を行うために選択される特定のアッセイ技術、および発現されたタンパク質またはペプチドが検出可能な活性を示すか否かに依存するであろう。
【００６０】
タンパク質精製に用いるために適した様々な技術は、当業者に周知である。これらには、例えば、硫酸アンモニウム、PEG、抗体等による沈殿、または熱変性の後に遠心分離；イオン交換、ゲル濾過、逆相、ヒドロキシアパタイト、およびアフィニティクロマトグラフィーのようなクロマトグラフィー段階；等電点電気泳動；ゲル電気泳動；ならびにこれらおよび他の技術の組み合わせが含まれる。当技術分野で一般的に既知であるように、様々な精製段階を行う順序は、変更してもよく、または特定の段階を省略してもよいと考えられ、なおも実質的に精製されたタンパク質またはペプチドを調製するための適した方法が得られる。
【００６１】
タンパク質またはペプチドは常にその最も精製された状態で提供すべきであるという一般要件はない。実際に、実質的にあまり精製されていない産物は、特定の態様において有用であると考えられる。部分精製は、より少ない精製段階を組み合わせて用いて、または同じ一般的精製スキームの異なる型を用いて行ってもよい。例えば、HPLC装置を用いて行われる陽イオン交換カラムクロマトグラフィーは、一般的に低圧クロマトグラフィーシステムを用いる同じ技術より大きい精製「倍率」が得られるであろうと認識される。相対的により低い程度の精製を示す方法は、タンパク質産物の総収量や、または発現されたタンパク質の活性を維持する点において長所を有する可能性がある。
【００６２】
アフィニティクロマトグラフィーは、単離される物質と、それが特異的に結合する分子との特異的親和性に依存するクロマトグラフィー技法である。これは、受容体-リガンドタイプの相互作用である。カラム材料は、結合パートナーの一つを不溶性のマトリクスに共有結合カップリングさせることによって合成される。次に、カラム材料は溶液から物質を特異的に吸収することができる。条件を結合が起こらない条件に変更すると（例えば、pH、イオン強度、温度等の変化）、溶出が起こる。マトリクスは、如何なる有意な程度にもそれ自身が分子を吸収せず、しかも広い範囲の化学、物理、および熱安定性を有する物質でなければならない。リガンドはその結合特性に影響を及ぼさないようにカップリングしなければならない。リガンドは、比較的堅固な結合を提供しなければならない。そして、試料またはリガンドを破壊することなく、物質を溶出することができなければならない。
【００６３】
合成ペプチド
本発明のターゲティングペプチドは、その大きさが比較的小さいために、従来の技術に従って溶液または固体支持体上で合成することができる。様々な自動シンセサイザーが市販されており、既知のプロトコールに従って用いることができる。例えば、そのそれぞれが参照として本明細書に組み入れられる、スチュワート（Stewart）およびヤング（Young）、1984；タム（Tam）ら、1983；メリフィールド（Merrifield）、1986；およびバラニー（Barany）およびメリフィールド（Merrifield）、1979を参照のこと。通常、アミノ酸約6個から約35〜50個までの短いペプチド配列は、そのような方法によって容易に合成することができる。または、本発明のペプチドをコードするヌクレオチド配列が発現ベクターに挿入され、適当な宿主細胞に形質転換またはトランスフェクトされ、発現に適した条件で培養される組み換え型DNA技術を用いてもよい。
【００６４】
抗体
特定の態様において、同定されたターゲティングペプチドまたはその受容体に対する抗体を作製することが望ましいかもしれない。適当なターゲティングペプチドまたは受容体、またはその一部をリンカー、ポリリンカー、または誘導体化アミノ酸によって一つまたは複数の物質にカップリング、結合（bonded）、結合（bound）、接合、または化学的に結合させてもよい。これは、二重特異的、または多価組成物またはワクチンが産生されるように行ってもよい。これらの組成物の調製において用いられる方法は、当業者に周知であり、ヒトに投与するために適していなければならない、すなわち薬学的に許容されなければならないとさらに想像される。好ましい物質は、担体であり、キーホールリンペットヘモシアニン（KLH）、またはウシ血清アルブミン（BSA）である。
【００６５】
「抗体」という用語は、抗原結合領域を有する任意の抗体様分子を意味するために用いられ、Fab'、Fab、F(ab')2、一本鎖ドメイン抗体（DABs）、Fv、scFv（一本鎖Fv）等のような抗体断片が含まれる。様々な抗体に基づく構築物および断片を調製および用いる技術は、当技術分野で周知である。抗体を調製および特徴付けする手段も同様に、当技術分野で周知である（例えば、「抗体：実験マニュアル（Antibodies：A Laboratory Manual）」、Cold Spring Harbor Laboratory、1988を参照のこと；参照として本明細書に組み入れられる）。
【００６６】
サイトカインとケモカイン
特定の態様において、臓器、組織、または細胞型に標的化送達するために、特異的生物活性物質を一つまたは複数のターゲティングペプチドにカップリングさせることが望ましいかもしれない。そのような物質には、サイトカイン、ケモカイン、アポトーシス促進因子、および抗血管新生因子が含まれるがこれらに限定されない。「サイトカイン」という用語は、細胞間メディエータとしてもう一つの細胞に作用する、一つの細胞集団によって放出されたタンパク質の総称である。そのようなサイトカインの例は、リンフォカイン、モノカイン、増殖因子、および従来のポリペプチドホルモンである。サイトカインには、ヒト成長ホルモン、N-メチオニルヒト成長ホルモン、およびウシ成長ホルモンのような成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；リラキシン；プロリラキシン；卵胞刺激ホルモン（FSH）、甲状腺刺激ホルモン（TSH）、および黄体形成ホルモン（LH）のような糖タンパク質ホルモン；肝増殖因子；プロスタグランジン、線維芽細胞増殖因子、プロラクチン；胎盤ラクトゲン、OBタンパク質；腫瘍壊死因子-αおよび腫瘍壊死因子-β；ムレリアン阻害物質；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子；インテグリン；トロンボポエチン（TPO）；NGF-βのような神経生長因子；血小板増殖因子；TGF-αおよびTGF-βのようなトランスフォーミング増殖因子（TGF）；インスリン様増殖因子-Iおよびインスリン様増殖因子-II；エリスロポエチン（EPO）；骨誘導因子；インターフェロン-α、-β、および-γのようなインターフェロン；マクロファージ-CSF（M-CSF）、顆粒球-マクロファージ-CSF（GM-CSF）、および顆粒球-CSF（G-CSF）のようなコロニー刺激因子（CSF）；IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18のようなインターロイキン（IL）、LIF、G-CSF、GM-CSF、M-CSF、EPO、キット-リガンドまたはFLT-3、アンジオスタチン、トロンボスポンジン、エンドスタチン、腫瘍壊死因子ならびにLTが含まれる。本明細書において用いられるように、サイトカインという用語には、天然起源からのタンパク質または組み換え型細胞培養からのタンパク質、および本来の配列サイトカインの生物活性同等物が含まれる。
【００６７】
ケモカインは、一般的に、ケモカイン発現部位に免疫エフェクター細胞を動員するための化学誘引物質として作用する。例えば、他の免疫系成分の治療部位への動員を増強するために、サイトカイン遺伝子と併用して特定のケモカイン遺伝子を発現することが有利であろう。ケモカインには、RANTES、MCAF、MIP1-α、MIP1-β、およびIP-10が含まれるが、これらに限定されない。当業者は、特定のサイトカインも同様に化学誘引作用を有することが知られており、それらも同様にケモカインという用語の下に分類されうることを認識するであろう。
【００６８】
造影剤と放射性同位元素
特定の態様において、本発明で主張されるペプチドまたはタンパク質は、様々な疾患を有する臓器、組織、または細胞型を造影および診断するために用いられる造影剤に結合してもよい。多くの適当な造影剤が、それらをタンパク質またはペプチドに結合させる方法と共に当技術分野で既知である（例えば、いずれも参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第5,021,236号および第4,472,509号を参照のこと）。タンパク質またはペプチドはまた、グルタルアルデヒドまたは過ヨウ素酸塩のようなカップリング剤の存在下で酵素と反応させてもよい。蛍光マーカーとの接合体は、これらのカップリング剤の存在下で、またはイソチオシアネートとの反応によって調製する。
【００６９】
造影剤として用いられる可能性がある常磁性イオンの非限定的な例には、クロム（III）、マンガン（II）、鉄（III）、鉄（II）、コバルト（II）、ニッケル（II）、銅（II）、ネオジム（III）、サマリウム（III）、イッテルビウム（III）、ガドリニウム（III）、バナジウム（II）、テルビウム（III）、ジスプロシウム（III）、ホルミウム（III）、およびエルビウム（III）が含まれ、ガドリニウムが特に好ましい。X線造影のような他の状況において有用なイオンには、ランタン（III）、金（III）、鉛（II）および特にビスマス（III）が含まれるがこれらに限定されない。
【００７０】
造影剤または治療剤として用いられる可能性がある放射性同位元素には、アスタチン211、14炭素、51クロム、36塩素、57コバルト、58コバルト、銅67、152ユーロピウム、ガリウム67、3水素、ヨウ素123、ヨウ素125、ヨウ素131、インジウム111、59鉄、32リン、レニウム186、レニウム188、75セレニウム、35硫黄、テクネチウム99m、およびイットリウム90が含まれる。125Iは、特定の態様における使用に好ましいことが多く、テクネチウム99mおよびインジウム111も同様に、低エネルギーであって、長い範囲の検出に適しているため、好ましいことが多い。
【００７１】
本発明の放射活性標識タンパク質またはペプチドは、当技術分野で周知の方法に従って産生してもよい。例えば、それらは、ヨウ化ナトリウムまたはヨウ化カリウム、および次亜塩素酸ナトリウムのような化学酸化剤またはラクトペルオキシダーゼのような酵素的酸化剤と接触させることによってヨウ化することができる。本発明によるタンパク質またはペプチドは、リガンド交換プロセスによって、例えば、ペルテクネートをスズ溶液によって還元して、還元したテクネチウムをセファデックスカラム上でキレート化して、ペプチドをこのカラムに適用することによって、または直接標識技術によって、例えばペルテクネート、SNCl2のような還元物質、フタル酸ナトリウムカリウム溶液のような緩衝液、およびペプチドをインキュベートすることによって、テクネチウム99mによって標識してもよい。金属イオンとして存在する放射性同位元素に結合するために用いられることが多い中間官能基は、ジエチレントリアミン五酢酸（DPTA）およびエチレンジアミン四酢酸（EDTA）である。ローダミン、フルオレセインイソチオシアネート、およびレノグラフィンを含む蛍光標識も同様に用いることが考慮される。
【００７２】
特定の態様において、主張されるタンパク質またはペプチドは、色素産生基質に接触させると着色産物を生じる二次結合リガンドまたは酵素（酵素タグ）に結合してもよい。適した酵素の例には、ウレアーゼ、アルカリホスファターゼ、（ホースラディッシュ）水素ペルオキシダーゼ、およびグルコースオキシダーゼが含まれる。好ましい二次結合リガンドはビオチンおよびアビジンまたはストレプトアビジン化合物である。そのような標識の利用は当業者に周知であり、例えば、それぞれが参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第3,817,837号、第3,850,752号、第3,939,350号、第3,996,345号；第4,277,437号；第4,275,149号；および第4,366,241号に記載されている。
【００７３】
架橋剤（cross-linker）
二官能架橋試薬は、アフィニティマトリクスの調製、多様な構造の改変および安定化、リガンドおよび受容体結合部位の同定、ならびに構造研究を含む多様な目的のために広く用いられている。二つの同一の官能基を有するホモ二官能試薬は、同一および異なる高分子または高分子サブユニット間の架橋を誘導するために、ならびにポリペプチドリガンドをその特異的結合部位に結合させるために非常に効率がよいことが判明した。ヘテロ二官能試薬は、異なる二つの官能基を含む。異なる二つの官能基の異なる反応性を利用することによって、架橋は、選択的および連続的に制御することができる。二官能架橋試薬はその官能基の特異性に従って、例えばアミノ、スルフヒドリル、グアニジノ、インドール、カルボキシル特異的基に分類することができる。これらの中で、遊離のアミノ基に対する試薬は、それらが市販されているため、合成が容易であるため、およびそれらを適用できる緩和な反応条件のために特に一般的となった。ヘテロ二官能架橋試薬の大部分は、一級アミン反応基とチオール反応基とを含む。
【００７４】
リガンドをリポソームに架橋させる例示的方法は、それぞれが特に参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第5,603,872号、および米国特許第5,401,511号に記載されている。様々なリガンドをアミン残基の架橋によってリポソーム表面に共有結合させることができる。リポソーム、特に、それぞれがホスファチジルエタノールアミン（PE）を含む微小乳化リポソーム（MEL）および大きい単層リポソーム（LUVET）のような多層小胞（MLV）または単層小胞は、確立された技法によって調製されている。リポソームにPEを含めこと、架橋目的のためにリポソーム表面上に活性な官能残基、1級アミンを提供する。上皮細胞増殖因子（EGF）のようなリガンドは、PE-リポソームに首尾よく結合されている。リガンドは、リポソーム表面上の明確な部位に共有結合している。これらの部位の数および表面密度は、リポソーム製剤およびリポソームタイプによって決まる。リポソーム表面はまた、非共有結合部位を有してもよい。リガンドとリポソームとの共有結合体を形成するために、架橋試薬を有効性および生体適合性に関して調べられている。架橋試薬には、グルタルアルデヒド（GAD）、二官能オキシラン（OXR）、エチレングリコールジグリシジルエーテル（EGDE）、および水溶性カルボジイミド、好ましくは1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド（EDC）が含まれる。架橋の複合体化学によって、認識物質のアミン残基とリポソームとの結合が確立される。
【００７５】
もう一つの例において、ヘテロ二官能架橋試薬および架橋試薬を用いる方法を記載する（特にその全文が参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第5,889,155号）。架橋試薬は、求核性のヒドラジド残基を求電子性のマレイミド残基と組み合わせて、それによって一つの例においてアルデヒドを遊離のチオールにカップリングさせることができる。架橋試薬は、様々な官能基を架橋するように改変することができる。
【００７６】
核酸
本発明による核酸は、ターゲティングペプチド、受容体タンパク質、または融合タンパク質をコードしてもよい。核酸は、ゲノムDNA、相補的DNA（cDNA）、または合成DNAに由来してもよい。発現ベクターに組み入れることが望ましい場合、核酸はまた、天然のイントロンまたはもう一つの遺伝子に由来するイントロンを含んでもよい。そのような操作された分子は時に、「ミニ遺伝子」と呼ばれる。
【００７７】
本明細書において用いられる「核酸」には、一本鎖および二本鎖分子と共に、DNA、RNA、化学改変核酸および核酸類似体が含まれる。本発明の範囲内の核酸は、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、約110、約120、約130、約140、約150、約160、約170、約180、約190、約200、約210、約220、約230、約240、約250、約275、約300、約325、約350、約375、約400、約425、約450、約475、約500、約525、約550、約575、約600、約625、約650、約675、約700、約725、約750、約775、約800、約825、約850、約875、約900、約925、約950、約975、約1000、約1100、約1200、約1300、約1400、約1500、約1750、約2000、約2250、約2500個のヌクレオチド残基またはそれ以上の長さであってもよいと考えられる。
【００７８】
ターゲティングペプチド、融合タンパク質、および受容体は、適当なアミノ酸配列をコードする任意の核酸配列によってコードされうると考えられる。所望のアミノ酸配列をコードする核酸の設計および産生は、標準化コドン表を用いて当業者に周知である（下記の表2を参照のこと）。好ましい態様において、それぞれのアミノ酸をコードするために選択されたコドンは、関心対象の宿主細胞において核酸の発現を最適にするように改変してもよい。宿主細胞の様々な種のコドン選択性は当技術分野で周知である。
【００７９】
【表２】
Figure 0005077862
【００８０】
所望のターゲティングペプチド、融合タンパク質または受容体アミノ酸配列をコードする核酸の他に、本発明は、そのようなコードする核酸配列と高ストリンジェンシー条件でハイブリダイズする相補的核酸を含む。核酸ハイブリダイゼーションのための高ストリンジェンシー条件は当技術分野で周知である。例えば、条件は、温度約50℃〜約70℃で約0.02 M〜約0.15 M NaClによって提供される条件のように、低い塩および/または高い温度条件を含んでもよい。所望のストリンジェンシーの温度およびイオン強度は特定の核酸の長さ、標的配列の長さおよびヌクレオチド含有量、核酸の荷電組成物、およびハイブリダイゼーション混合物中のホルムアミド、塩化テトラメチルアンモニウム、または他の溶媒の存在または濃度によって部分的に決定される。
【００８１】
クローニング、遺伝子移入、および発現のためのベクター
特定の態様において、発現ベクターを用いてターゲティングペプチドまたは融合タンパク質を発現して、次にこれを精製および用いることができる。他の態様において、発現ベクターは、遺伝子治療において用いられる。発現は、適当なシグナルがベクターにおいて提供される必要があり、宿主細胞において関心対象の遺伝子の発現を促進するウイルスおよび哺乳動物起源の双方からのエンハンサー/プロモーターのような様々な調節要素が含まれる。宿主細胞においてメッセンジャーRNA安定性および翻訳可能性を最適にするように設計した要素も同様に既知である。
【００８２】
調節要素
「発現構築物」または「発現ベクター」という用語は、核酸コード配列の一部または全てが転写されることが可能である遺伝子産物をコードする核酸を含む任意の種類の遺伝子構築物が含まれることを意味する。好ましい態様において、遺伝子産物をコードする核酸は、プロモーターの転写制御下である。「プロモーター」とは、細胞の合成機構または導入された合成機構によって認識され、遺伝子の特異的転写を開始するために必要なDNA配列を意味する。「転写制御下」という用語は、プロモーターが、RNAポリメラーゼの開始および遺伝子の発現を制御するために、核酸に対して正しい位置および方向に存在することを意味する。
【００８３】
関心対象の核酸配列の発現を制御するために用いられる特定のプロモーターは、標的細胞において核酸の発現を指示することができる限り、重要ではないと考えられている。このように、ヒト細胞が標的となる場合、ヒト細胞において発現されることができるプロモーターに隣接してその制御下にあるように核酸コード領域を配置することが好ましい。一般的に、そのようなプロモーターには、ヒトまたはウイルスプロモーターのいずれかが含まれてもよい。
【００８４】
様々な態様において、ヒトサイトメガロウイルス（CMV）前初期遺伝子プロモーター、SV40初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルス長末端反復、ラットインスリンプロモーター、およびグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼプロモーターを用いて、関心対象のコード配列の高レベル発現を得ることができる。関心対象のコード配列の発現を得るために、当技術分野で周知である他のウイルスもしくは哺乳動物の細胞プロモーターまたは細菌ファージプロモーターを用いることも同様に、発現レベルが所定の目的にとって十分である限り考慮される。
【００８５】
cDNA挿入物を用いる場合、典型的にこれは遺伝子転写物の適切なポリアデニル化を行うためにポリアデニル化シグナルを含むであろう。ポリアデニル化シグナルの特性は、本発明の実践の成功にとって重要ではないと考えられ、ヒト成長ホルモン、およびSV40ポリアデニル化シグナルのようなそのような任意の配列を用いてもよい。同様に、ターミネータも発現構築物の要素として同様に考慮される。これらの要素は、メッセージレベルを増強して構築物からの他の配列への読み過ごしを最小限にするように作用しうる。
【００８６】
選択マーカー
本発明の特定の態様において、本発明の核酸構築物を含む細胞は、発現構築物にマーカーを含めることによってインビトロまたはインビボで同定してもよい。そのようなマーカーは、細胞に対して同定可能な変化を付与して、発現構築物を含む細胞を容易に同定できるようにするであろう。通常、薬物選択マーカーを含めると、形質転換体のクローニングおよび選択に役立つ。例えば、ネオマイシン、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、DHFR、GPT、ゼオシン、およびヒスチジノールに対して抵抗性を付与する遺伝子は、有用な選択マーカーである。または、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（tk）のような酵素、またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）のような酵素を用いてもよい。免疫学的マーカーも同様に用いることができる。用いられる選択マーカーは、それが遺伝子産物をコードする核酸と同時に発現されることができる限り、重要ではないと考えられる。選択マーカーのさらなる例は当業者に周知である。
【００８７】
発現ベクターの送達
発現ベクターを細胞に導入する多くの方法がある。本発明の特定の態様において、発現構築物は、ウイルス、またはウイルスゲノムに由来する操作された構築物を含む。特定のウイルスは受容体媒介エンドサイトーシスによって細胞内に入ることができること、宿主細胞ゲノムに組み入れられうること、およびウイルス遺伝子を安定かつ効率よく発現できることによって、それらは、哺乳動物細胞に外来遺伝子を移入するための魅力的な候補物質となる（Ridgeway、1988；NicolasおよびRubenstein、1988；BaichwalおよびSugden、1986；Temin、1986）。一般的に、好ましい遺伝子治療ベクターはウイルスベクターである。
【００８８】
外来の遺伝子材料を許容することができるいくつかのウイルスは、それらが収容することができるヌクレオチドの数およびそれらが感染する細胞の範囲が制限されるが、これらのウイルスは遺伝子発現を首尾よく行うことができることが証明されている。しかし、アデノウイルスは、宿主ゲノムにその遺伝子材料を組み入れず、したがって、遺伝子発現のために宿主複製を必要とせず、そのためそれらは迅速で、効率のよい、異種遺伝子発現にとって理想的に適している。複製欠損ウイルスを調製する技術は当技術分野で周知である。
【００８９】
ウイルス送達系を用いる場合、それがベクター構築物を受け入れる細胞、動物または個体において望ましくない反応を引き起こさないように、欠損干渉ウイルス粒子またはエンドトキシンおよび他の発熱物質のような望ましくない混入物を本質的に含まないようにするために十分にビリオンを精製することが望ましいであろう。ベクターを精製する好ましい手段は、塩化セシウム勾配遠心分離のような浮遊密度勾配を用いることを含む。
【００９０】
遺伝子ベクターとして用いられるDNAウイルスは、パポバウイルス（例えば、シミアンウイルス40、ウシ乳頭腫ウイルス、およびポリオーマ）（Ridgeway、1988；BaichwalおよびSugden、1986）およびアデノウイルス（Ridgeway、1988；BaichwalおよびSugden、1986）が含まれる。
【００９１】
インビボ送達のための好ましい方法の一つは、アデノウイルス発現ベクターを用いることを含む。アデノウイルスベクターは、ゲノムDNAに対する組み込み能が低いことが知られているが、この特徴は、これらのベクターによって得られる遺伝子移入効率が高いことによって相殺される。「アデノウイルス発現ベクター」とは、（a）構築物のパッケージングを支持するため、および（b）その中にクローニングされているアンチセンスまたはセンスポリヌクレオチドを発現するために十分なアデノウイルス配列を含む構築物を含むことを意味するがこれらに限定されない。
【００９２】
発現ベクターは、アデノウイルスの遺伝子操作型を含む。アデノウイルスの遺伝子構築が、36 kbの直線状の二本鎖DNAウイルスであることを理解すれば、アデノウイルスDNAの大きい断片を7kbまでの外来配列に置換することが可能である（GrunhausおよびHorwitz、1992）。レトロウイルス感染症とは対照的に、宿主細胞のアデノウイルス感染症は、アデノウイルスDNAがエピソームにおいて複製できることから、染色体組み込みが起こらず、可能性がある遺伝子毒性を示さない。同様に、アデノウイルスは構造的に安定であり、十分に増幅させた後もゲノム再編成は検出されていない。アデノウイルスは、その細胞周期段階によらず、実質的に全ての上皮細胞に感染することができる。これまで、アデノウイルス感染症は、ヒトにおける急性呼吸器疾患のようにごく軽度の疾患に関係しているように思われる。
【００９３】
アデノウイルスは、そのゲノムの大きさが中等度であること、操作が容易であること、高力価、広い細胞範囲、および高い感染性のために、遺伝子移入ベクターとして用いるために特に適している。ウイルスゲノムの両端は100塩基対〜200塩基対の逆方向反復配列（ITR）を含み、これはウイルスDNA複製およびパッケージングにとって必要なシス要素である。ゲノムの初期（E）および後期（L）領域は、ウイルスDNA複製の開始によって分割される異なる転写単位を含む。E1領域（E1AおよびE1B）は、ウイルスゲノムおよびいくつかの細胞遺伝子の転写の調節に関与するタンパク質をコードする。E2領域（E2AおよびE2B）の発現によって、ウイルスDNA複製のためのタンパク質の合成が起こる。これらのタンパク質は、DNA複製、後期遺伝子発現、および宿主細胞の遮断（Renan、1990）に関係している。ウイルスカプシドタンパク質の大多数を含む後期遺伝子の産物は、主要な後期プロモーター（MLP）によって生じた単一の主転写物の有意なプロセシングの後に限って発現される。MLP（16.8 m.u.に存在）は、感染の後期段階において特に効率的であり、このプロモーターに由来する全てのmRNAは、5'-3連（tripartite）リーダー（TPL）配列を有し、それによってそれらは翻訳にとって好ましいmRNAとなる。
【００９４】
現在用いられている系において、組み換え型アデノウイルスは、シャトルベクターとプロウイルスベクターとの相同的組み換えによって生じる。二つのプロウイルスベクターのあいだの可能性がある組み換えにより、野生型アデノウイルスがこのプロセスから生じる可能性がある。したがって、個々のプラークからウイルスの単一のクローンを単離して、そのゲノム構造を調べることが重要である。
【００９５】
複製欠損であるアデノウイルスベクターの作製および増殖は、Ad5 DNA断片によってヒト胎児腎細胞から形質転換され、E1タンパク質を構成的に発現する293と呼ばれる独自のヘルパー細胞株に依存する（Grahamら、1977）。E3領域は、アデノウイルスゲノムにとって重要ではないため（JonesおよびShenk、1978）、現在のアデノウイルスベクターは、293細胞の助けを借りて、E1、E3、または双方の領域のいずれかに外来DNAを有する（GrahamおよびPrevecら、1991）。本質的に、アデノウイルスは、野生型ゲノムの約105％をパッケージングすることができ（Ghosh-Choudhuryら、1987）、約2kbの余分のDNAの容量を提供する。E1領域およびE3領域において置換可能な約5.5 kbのDNAと組み合わせると、現在のアデノウイルスベクターの最大容量は7.5 kb以下、またはベクターの全長の約15％である。アデノウイルスウイルスゲノムの80％以上がベクター骨格に残っており、ベクター媒介細胞毒性の原因となる。同様に、E1欠失ウイルスの複製欠損も不完全である。例えば、ウイルス遺伝子発現の漏出は、現在利用可能なベクターについて高い感染多重度（MOI）で認められる（Mulligan、1993）。
【００９６】
ヘルパー細胞株は、ヒト胎児腎細胞、筋細胞、造血細胞、または他のヒト胎児間葉細胞または上皮細胞のようなヒト細胞に由来してもよい。または、ヘルパー細胞は、ヒトアデノウイルスにとって許容される他の哺乳動物種の細胞に由来してもよい。そのような細胞には、例えば、Vero細胞、または他のサル胎児間葉もしくは上皮細胞が含まれる。考察したように、好ましいヘルパー細胞株は293である。
【００９７】
レイチャー（Racher）ら（1995）は、293細胞を培養して、アデノウイルスを増殖させる改善された方法を開示した。一つの形式において、個々の細胞を培地100 ml〜200 mlを含む1Lのシリコン処理スピナーフラスコ（Techne、Cambridge、UK）に接種して天然の細胞凝集体を増殖させる。40 rpmで攪拌した後、細胞生存率をトリパンブルーによって推定する。もう一つの形式において、フィブラ-セル微小担体（5 g/l）（Bibby Sterlin、Stone、UK）を以下のように用いる。培地5mlに再懸濁させた細胞接種物を250 mlアーレンマイヤーフラスコ中の担体（50 ml）に加えて、時折攪拌しながら1時間〜4時間静置した。次に、培地を新鮮な培地50 mlに交換して振とうを開始する。ウイルスを産生するために、細胞を約80％コンフルエントまで増殖させて、その後培地を交換して（最終容積の25％）、アデノウイルスをMOI 0.05で加える。培養物を一晩静置して、その後容積を100％まで増加させて、振とうをさらに72時間行う。
【００９８】
アデノウイルスベクターが複製欠損である、または少なくとも条件的に欠損であるという要件以外に、アデノウイルスベクターの特性は、本発明の実施の成功にとって重要ではないと考えられる。アデノウイルスは、既知の異なる血清型42個またはサブグループA〜Fのいずれかであってもよい。サブグループCのアデノウイルス5型は、本発明において用いられる条件的複製欠損アデノウイルスベクターを得るために好ましい開始材料である。これは、5型アデノウイルスが、それに関する膨大な生化学および遺伝子情報が既知であるヒトアデノウイルスであるためであり、このためこのアデノウイルスは、歴史的にアデノウイルスをベクターとして用いるほとんどの構築物について用いられている。
【００９９】
本発明を実践するために適用可能な典型的なベクターは、複製欠損であり、アデノウイルスE1領域を有さないであろう。このように、E1コード配列が除去されている位置で遺伝子をコードするポリヌクレオチドを導入することが最も簡便である。しかし、アデノウイルス配列内の構築物の挿入位置は重要ではない。関心対象の遺伝子をコードするポリヌクレオチドも同様に、カールソン（Karlsson）ら、1986によって記載されるようにE3置換ベクターにおいて欠失されたE3領域の代わりに、またはヘルパー細胞株もしくはヘルパーウイルスがE4欠損を補う場合にはE4領域の代わりに挿入してもよい。
【０１００】
アデノウイルスは、増殖および操作が容易で、インビトロおよびインビボで広い宿主範囲を示す。このグループのウイルスは、高い力価、例えば、109〜1011プラーク形成単位/mlで得ることができ、それらは非常に感染性である。アデノウイルスの生活環は宿主細胞ゲノムに組み入れられる必要はない。アデノウイルスベクターによって送達される外来遺伝子は、エピソームであり、したがって、宿主細胞に対する遺伝子毒性は低い。野生型アデノウイルスをワクチン接種した研究では副作用は報告されておらず（Couch、1963；Topら、1971）、インビボ遺伝子移入ベクターとしてのその安全性および治療能を証明する。
【０１０１】
アデノウイルスベクターは、真核細胞遺伝子発現（Levreroら、1991；Gomez-Foixら、1992）およびワクチン開発（GrunhausおよびHorwitz、1992；GrahamおよびPrevec、1991）に用いられている。動物試験から、組み換え型アデノウイルスが遺伝子治療に用いられ得ることが示唆された（Stratford-PerricaudetおよびPerricaudet、1991；Stratford-Perricaudetら、1990；Richら、1993）。異なる組織に組み換え型アデノウイルスを投与する研究には、気管注入（Rosenfeldら、1991；Rosenfeldら、1992）、筋肉注射（Ragotら、1993）、末梢静脈注射（HerzおよびGerard、1993）、および脳への定位注射（Le Gal La Salleら、1993）が含まれる。
【０１０２】
他の遺伝子移入ベクターは、レトロウイルスから構築してもよい。レトロウイルスは、逆転写のプロセスによって感染細胞においてそのRNAを二本鎖DNAに変換できることを特徴とする一本鎖RNAウイルスの群である（Coffin、1990）。次に、得られたDNAは、プロウイルスとして細胞の染色体に安定に組み入れられ、ウイルスタンパク質の合成を指示する。組み込みによって、レシピエント細胞およびその子孫においてウイルス遺伝子配列が保持される。レトロウイルスゲノムは、カプシドタンパク質、ポリメラーゼ酵素、およびエンベロープ成分をそれぞれコードする3つの遺伝子、gag、pol、およびenvを含む。gag遺伝子から上流に認められる配列は、ゲノムをビリオンにパッケージングするためのシグナルを含む。二つの長末端反復（LTR）配列は、ウイルスゲノムの5'および3'末端に存在する。これらは、強いプロモーターおよびエンハンサー配列を含み、同様に、宿主細胞ゲノムへの組み込みにとって必要である（Coffin、1990）。
【０１０３】
レトロウイルスベクターを構築するために、関心対象のタンパク質をコードする核酸を、特定のウイルス配列の代わりにウイルスゲノムに挿入して、複製欠損であるウイルスを作製する。ビリオンを産生するために、gag、pol、およびenv遺伝子を含むが、LTRおよびパッケージング成分を含まないパッケージング細胞株を構築する（Mannら、1983）。レトロウイルスLTRおよびパッケージング配列と共にcDNAを含む組み換え型プラスミドをこの細胞株に導入する場合（例えば、リン酸カルシウム沈殿によって）、パッケージング配列によって、組み換え型プラスミドのRNA転写物をウイルス粒子にパッケージングすることが可能となり、次に、これを培養培地に分泌する（NicolasおよびRubenstein、1988；Temin、1986；Mannら、1983）。次に、組み換え型レトロウイルスを含む培地を回収して、任意に濃縮し、遺伝子移入のために用いる。レトロウイルスベクターは広く多様な細胞型に感染することができる。しかし、組み込みおよび安定な発現には宿主細胞の分裂を必要とする（Paskindら、1975）。
【０１０４】
レトロウイルスベクターを用いることには特定の制限がある。例えば、レトロウイルスベクターは、通常、細胞ゲノムにおけるランダムな部位に組み入れられる。このため、宿主遺伝子の中断によって、または隣接遺伝子の機能を妨害することができるウイルス調節配列の挿入によって挿入変異誘発が起こりうる（Varmusら、1981）。欠損レトロウイルスベクターを用いる場合のもう一つの懸念は、パッケージング細胞において野生型複製コンピテントウイルスが出現する可能性である。これは、gag、pol、env配列から上流の組み換え型ウイルス挿入物からの無傷の配列が宿主細胞ゲノムに組み入れられる組み換え事象が原因である可能性がある。しかし、今では新しいパッケージング細胞株を利用することができ、それらは組み換えの可能性を大きく減少させるはずである（Markowitzら、1988；Hersdorfferら、1990）。
【０１０５】
他のウイルスベクターを発現構築物として用いてもよい。ワクシニアウイルス（Ridgeway、1988；BaichwalおよびSugden、1986；Couparら、1988）、アデノ随伴ウイルス（AAV）（Ridgeway、1988；BaichwalおよびSugden、1986；HermonatおよびMuzycska、1984）、およびヘルペスウイルスのようなウイルスに由来するベクターを用いてもよい。それらは様々な哺乳動物細胞にとっていくつかの魅力的な特徴を提供する（Friedmann、1989；Ridgeway、1988；BaichwalおよびSugden、1986；Couparら、1988；Horwichら、1990）。
【０１０６】
発現構築物を培養哺乳動物細胞に移入するためのいくつかの非ウイルス法もまた、本発明によって考慮される。これらには、リン酸カルシウム沈殿（GrahamおよびVan Der Eb、1973；ChenおよびOkayama、1987；Rippeら、1990）、DEAEデキストラン（Gopal、1985）、エレクトロポレーション（Tur-Kaspaら、1986；Potterら、1984）、直接マイクロインジェクション、DNA負荷リポソーム、およびリポフェクタミン-DNA複合体、細胞の超音波処理、高速微小弾丸を用いた遺伝子衝突、および受容体媒介トランスフェクション（WuおよびWu、1987；WuおよびWu、1988）が含まれる。これらの技術のいくつかは、インビボまたはエクスビボでの使用に首尾よく適合させてもよい。
【０１０７】
本発明のさらなる態様において、発現構築物はリポソームに封入してもよい。リポソームはリン脂質二重膜と内側の水性媒体とを特徴とする小胞構造である。多層リポソームは水性媒体で分かれた多数の脂質層を有する。それらは、リン脂質が過剰量の水溶液に懸濁されると自然に形成する。脂質成分は閉鎖構造を形成する前に自己再配列を受けて、脂質二重層の間に水と溶存溶質とを捕獲する。同様に、リポフェクタミン-DNA複合体も考慮される。
【０１０８】
リポソーム媒介核酸送達および外来DNAのインビトロでの発現は非常に成功している。ウォン（Wong）ら、（1980）は、培養ニワトリ胚、HeLa、および肝腫細胞において外来DNAのリポソーム媒介送達および発現の実現可能性を証明した。ニコラウ（Nicolau）ら、（1987）は、静脈内注射後のラットにおいてリポソーム媒介遺伝子移入に成功した。
【０１０９】
tk細胞、hgprt細胞、またはapart細胞においてそれぞれ、HSVチミジンキナーゼ、ヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子を含むがこれらに限定されない多くの選択系を用いてもよい。同様に、抗代謝物抵抗性を、メソトレキセートに対する抵抗性を付与するdhfr、ミコフェノール酸に対する抵抗性を付与するgpt、アミノグリコシドG418に対する抵抗性を付与するneo、およびハイグロマイシンに対する抵抗性を付与するhygroを選択するための基礎として用いることができる。
【０１１０】
薬学的組成物
臨床応用を考慮する場合、薬学的組成物発現ベクター、ウイルス保存液、タンパク質、抗体、および薬物を意図する適用にとって適当な形で調製する必要があるかもしれない。一般的に、これは、ヒトまたは動物に対して有害となりうる不純物を本質的に含まない組成物を調製することを含むであろう。
【０１１１】
一般的に、送達ベクターを安定にして、標的細胞によって取り込まれることができるように、適当な塩および緩衝液を用いることが望まれるであろう。組み換え型細胞を患者に導入する場合には緩衝液も同様に用いる。本発明の水性組成物は、薬学的に許容される担体または水性培地に溶解または分散させたタンパク質またはペプチドの有効量を含む。そのような組成物も同様に、接種物と呼ばれる。「薬学的または薬理学的に許容される」という用語は、動物またはヒトに投与した場合に有害、アレルギー、またはその他の望ましくない反応を引き起こさない分子実体および組成物を意味する。本明細書において用いられるように、「薬学的に許容される担体」には、任意のおよび全ての溶媒、分散培地、コーティング、抗菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤等が含まれる。そのような培地および物質を薬学的活性物質のために用いることは当技術分野で周知である。従来の培地または物質が本発明のタンパク質またはペプチドと不適合である場合を除き、治療的組成物において用いることが考慮される。補助活性成分も同様に組成物に組み入れることができる。
【０１１２】
本発明の活性組成物には、古典的な薬学的調製物が含まれてもよい。本発明によるこれらの組成物は、標的組織がその経路によって利用可能である限り、任意の一般的な経路によって投与される。これには、経口、鼻腔内、口腔内、直腸内、膣内、または局所投与が含まれる。または、投与は、正所性、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、動脈内、または静脈内注射であってもよい。そのような組成物は通常、上記の薬学的に許容される組成物として投与されるであろう。
【０１１３】
注射によって用いるために適した薬学的剤形は、滅菌水溶液または分散液、および注射可能滅菌溶液または分散液の即時調合製剤のための滅菌粉末が含まれる。全ての場合において、製剤は滅菌でなければならず、容易なシリンジ操作性が存在する程度に流動性でなければならない。これは、製造および保存条件で安定でなければならず、細菌および真菌のような微生物の混入作用に対して保存されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール等）、その適した混合物、および植物油を含む溶媒または分散培地となりうる。適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングを用いることによって、分散剤の場合には必要な粒子径を維持することによって、および界面活性剤を用いることによって維持することができる。微生物の作用の予防は、様々な抗菌および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等によって得ることができる。多くの場合、等張剤、例えば糖または塩化ナトリウムを含めることが好ましい。注射可能な組成物の持続的な吸収は、吸収を遅らせる物質、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物において用いることによって得ることができる。
【０１１４】
注射可能滅菌溶液は、必要な量の活性化合物を、先に列挙した様々な他の成分と共に適当な溶媒において組み入れて、必要であれば濾過滅菌することによって調製される。一般的に、分散剤は、様々な滅菌活性成分を滅菌媒体に組み入れることによって調製される。注射可能滅菌溶液を調製するための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、活性成分および先に濾過滅菌したその溶液からの任意のさらなる所望の成分の粉末を生じる真空乾燥および凍結乾燥技術である。
【０１１５】
治療剤
特定の態様において、化学療法剤を、腫瘍に選択的に送達するためのターゲティングペプチドまたは融合タンパク質に結合してもよい。用いるために適した物質または因子には、細胞に適用した場合にDNA損傷を誘導する任意の化学化合物が含まれてもよい。化学療法剤には、5-フルオロウラシル、ブレオマイシン、ブスルファン、カンプトテシン、カルボプラチン、クロラムブシル、シスプラチン（CDDP）、シクロホスファミド、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エストロゲン受容体結合物質、エトポシド（VP16）、ファルネシル-タンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、ゲムシタビン、イフォスファミド、メクロレタミン、メルファラン、マイトマイシン、ナベルビン、ニトロソウレア、プリコマイシン、プロカルバジン、ラロキシフェン、タモキシフェン、タキソール、テマゾロミド（DTICの水溶性型）、トランスプラチナ、ビンブラスチンおよびメソトレキセート、ビンクリスチン、または上記の任意の類似体もしくは誘導体変種が含まれるがこれらに限定されない。ほとんどの化学療法剤は以下の分類に入る：アルキル化剤、抗代謝剤、抗腫瘍抗生物質、コルチコステロイドホルモン、有糸分裂阻害剤、およびニトロソウレア、ホルモン物質、雑多な物質、およびその任意の類似体または誘導体変種。
【０１１６】
化学療法剤および投与方法、用量等は、当業者に周知であり（例えば、関連部分が参照として本明細書に組み入れられる、「医師用添付文書集」、GoodmanおよびGilmanの「治療の薬理学的基礎（The Pharmacological Basis of Therapeutics）」、および「レミントンの薬化学（Remington's Pharmaceutical Sciences）」、を参照のこと）、本明細書に開示に照らして本発明と組み合わせてもよい。用量の何らかの変更は、治療すべき被験者の状態に応じて必要に応じて起こるであろう。投与の責任者は、いずれにせよ、個々の被験者に関して適当な用量を決定するであろう。特定の化学療法剤および用量レジメの例も同様に本明細書に記載する。当然、これらの用量および物質および投与レジメは全て、制限するためではなく一例であって、特定の患者または適用に関して当業者は他の用量または物質を用いてもよい。これらの点のあいだの任意の用量、またはそこから誘導されうる範囲も同様に、本発明において用いられると予想される。
【０１１７】
アルキル化剤
アルキル化剤は、ゲノムDNAと直接相互作用して癌細胞の増殖を防止する薬物である。この範疇の化学療法剤は、細胞周期の全ての期に影響を及ぼす、すなわちそれらは期特異的ではない物質を表す。アルキル化剤には、ニトロジェンマスタード、エチレニメン、メチルメラミン、アルキルスルホネート、ニトロソウレア、またはトリアジンが含まれてもよいがこれらに限定されない。それらには、ブスルファン、クロラムブシル、シスプラチン、シクロホスファミド（シトキサン）、ダカルバジン、イフォスファミド、メクロレタミン（マスタージェン）、およびメルファランが含まれるがこれらに限定されない。
【０１１８】
抗代謝剤
抗代謝剤はDNAおよびRNA合成を破壊する。アルキル化剤とは異なり、それらは細胞周期のS期に特異的に影響を及ぼす。抗代謝剤は、葉酸類似体、ピリミジン類似体およびプリン類似体ならびに関連阻害化合物のような様々な範疇に分類することができる。抗代謝剤には、5-フルオロウラシル（5-FU）、シタラビン（Ara-C）、フルダラビン、ゲミシタビンおよびメソトレキセートが含まれるがこれらに限定されない。
【０１１９】
天然物
天然物は一般的に、最初に天然資源から単離された化合物を意味する。そのような化合物、その類似体および誘導体は天然起源から単離してもよく、当業者に既知の任意の技術によって化学合成または組み換えによって産生してもよい。天然物には、分裂阻害剤、抗腫瘍抗生物質、酵素および生物反応修飾剤のような分類が含まれる。
【０１２０】
有糸分裂阻害剤には、細胞分裂または有糸分裂に必要ないずれかのタンパク質合成を阻害することができる植物アルカロイドおよび他の天然物が含まれる。それらは、細胞周期の特定の期において作用する。有糸分裂阻害剤には、例えば、ドセタキセル、エトポシド（VP16）、テニポシド、パクリタキセル、タキソール、ビンブラスチン、ビンクリスチン、およびビノレルビンが含まれる。
【０１２１】
タキソイドは、トネリコ（ash）の木であるタクサス・ブレビフォリア（Taxus brevifolia）の樹皮から単離された関連化合物の一種である。タキソイドにはドセタキセルおよびパクリタキセルのような化合物が含まれるがこれらに限定されない。パクリタキセルはチューブリンに結合して（ビンカアルカロイドによって用いられるものとは異なる部位で）、微小管の集合を促進する。
【０１２２】
ビンカアルカロイドは、薬学的活性を有すると同定された植物アルカロイドのタイプである。それらには、ビンブラスチン（VLB）およびビンクリスチンのような化合物が含まれる。
【０１２３】
抗腫瘍抗生物質
抗腫瘍抗生物質は、抗菌および細胞毒性活性の双方を有する。これらの薬物はまた、酵素および有糸分裂を化学的に阻害することによって、または細胞膜を変化させることによって、DNAを妨害する。これらの物質は、それらが細胞周期の全ての期において作用するため細胞周期特異的ではない。抗腫瘍抗生物質の例には、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、プリカマイシン（ミスラマイシン）、およびイダルビシンが含まれるがこれらに限定されない。
【０１２４】
ホルモン
コルチコステロイドホルモンは、それらが癌細胞を殺すまたは増殖を遅らせる場合に、化学療法薬と見なされる。コルチコステロイドホルモンは、他の化学療法剤の有効性を増加させるため、併用治療において用いられることが多い。プレドニゾンおよびデキサメタゾンは、コルチコステロイドホルモンの例である。
【０１２５】
カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、酢酸メドロキシプロゲステロン、および酢酸メゲストロールのようなプロゲスチンは、子宮内膜および乳房の癌において用いられてきた。ジエチルスチルベストロールおよびエチニルエストラジオールのようなエストロゲンは、乳房および前立腺のような癌に用いられている。タモキシフェンのような抗エストロゲン剤は、乳癌のような癌に用いられてきた。プロピオン酸テストステロンおよびフルオキシメステロンのようなアンドロゲンも同様に、乳癌の治療に用いられてきた。フルタミドのような抗アンドロゲンは、前立腺癌の治療に用いられている。リュープロリドのようなゴナドトロピン放出ホルモン類似体は、前立腺癌の治療に用いられている。
【０１２６】
雑多な物質
いくつかの化学療法剤は、その活性に基づくこれまでの範疇に入らない。それらには、白金配位複合体、アントラセンジオン、置換ウレア、メチルヒドラジン誘導体、副腎皮質抑制剤、アムサクリン、L-アスパラギナーゼ、およびトレチノインが含まれるがこれらに限定されない。それらは、本発明の組成物および方法において用いてもよいと考慮される。
【０１２７】
白金配位複合体には、カルボプラチンおよびシスプラチン（シス-DDP）のような化合物が含まれる。
【０１２８】
ミトキサントロンのようなアントラセンジオンは、急性顆粒球白血病および乳癌の治療に用いられている。ヒドロキシウレアのような置換ウレアは、慢性顆粒球白血病、真性赤血球増加症、本態性血小板増加症、および悪性黒色腫を治療するために用いられている。プロカルバジン（N-メチルヒドラジン、MIH）のようなメチルヒドラジン誘導体は、ホジキン病の治療に用いられている。ミトタンのような副腎皮質抑制剤は、副腎皮質癌を治療するために用いられており、アミノグルテチミドは、ホジキン病を治療するために用いられている。
【０１２９】
プログラムされた細胞死の調節物質
アポトーシスまたはプログラムされた細胞死は、正常な胚発生の際に、成人組織において恒常性を維持し、および発癌を抑制するための本質的なプロセスである（Kerrら、1972）。Bcl-2タンパク質ファミリーおよびICE-様プロテアーゼが、他の系においてアポトーシスの重要な調節物質およびエフェクターであることが証明されている。濾胞性リンパ腫に関連して発見されたBcl-2タンパク質は、アポトーシスの制御および多様なアポトーシス刺激に反応した細胞の生存を増強するために顕著な役割を果たしている（Bakhshiら、1985；ClearyおよびSklar、1985；Clearyら、1986；Tsujimotoら、1985；TsujimotoおよびCroce、1986）。進化的に保存されたBcl-2タンパク質は今では、関連タンパク質ファミリーのメンバーであると認識され、これらは死のアゴニストまたは死のアンタゴニストとして分類することができる。
【０１３０】
その発見後、Bcl-2は、様々な刺激によって誘発された細胞死を抑制するように作用することが示された。同様に、共通の構造および配列相同性を有するBcl-2細胞死調節タンパク質のファミリーが存在することが今では明らかである。これらの異なるファミリーメンバーは、Bcl-2と類似の機能（BclXL、Bclw、Bcls、Mcl-1、A1、Bfl-1）を有するか、またはBcl-2機能を相殺して細胞死を促進するか（例えば、Bax、Bak、Bik、Bim、Bid、Bad、Harakiri）のいずれかであることが示されている。
【０１３１】
本発明の範囲内で考慮されるアポトーシス促進剤の非限定的な例には、グラミシジン、マガイニン、メリチン、デフェンシン、セクロピン、(KLAKLAK)2（配列番号：1）、(KLAKKLA)2（配列番号：2）、(KAAKKAA)2（配列番号：3）、または(KLGKKLG)3（配列番号：4）が含まれる。
【０１３２】
血管新生阻害剤
特定の態様において、本発明は、アンジオテンシン、ラミニンペプチド、フィブロネクチンペプチド、プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤、組織メタロプロテイナーゼ阻害剤、インターフェロン、インターロイキン12、血小板因子4、IP-10、Gro-β、トロンボスポンジン、2-メトキシエストラジオール、プロリフェリン関連タンパク質、カルボキサミドトリアゾール、CM101、マリマスタット、ペントサンポリスルフェート、アンジオポエチン2（レジェネロン）、インターフェロン-α、ハービマイシンA、PNU145156E、16Kプロラクチン断片、リノマイド、サリドマイド、ペントキシフィリン、ゲニステイン、TNP-470、エンドスタチン、パクリタキセル、アキュチン、アンジオスタチン、シドフォビル、ビンクリスチン、ブレオマイシン、AGM-1470、血小板因子4、またはミノサイクリンのような抗血管新生剤に結合したターゲティングペプチドを投与することに関してもよい。
【０１３３】
用量
当業者は、「レミントンの薬科学（Remington's Pharmaceutical Sciences）」、第15版、第33章、特に624頁〜652頁に従う。治療すべき被験者の状態に応じて用量の何らかの変更が必然的に起こるであろう。投与の責任者は、いずれにせよ、個々の被験者にとって適当な用量を決定するであろう。その上、ヒトでの投与に関して、調製物は、FDAの生物医薬品標準局によって必要とされる滅菌性、発熱性、および全身的安全性および純度標準を満たさなければならない。
【０１３４】
実施例
以下の実施例は、本発明の好ましい態様を示すために含められる。以下の実施例に開示した技術は、本発明の実践において十分に機能するように本発明者らによって発見された技術を表し、このように、その実践のために好ましい様式を構成すると見なされうると、当業者によって認識されなければならない。しかし、当業者は、開示の特定の態様に多くの変更を行うことができ、それらも本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく同様または類似の結果をなおも得ることができることを、本開示に照らして認識すべきである。
【０１３５】
実施例1. 骨髄ターゲティングペプチド
ターゲティングペプチドに関して特に関心対象となる臓器の非限定的な例は骨髄である。骨は、前立腺癌を有する患者の大多数において転移の好ましい部位である（Fidler、1999）。この顕著な選択性は、癌の進行にとって必須である部位特異的相互作用の例として見なされている（Rak、1995；Zetter、1998）。臨床での関連性にもかかわらず、骨に広がった前立腺癌を制御する機構に関してはほとんどわかっていない。さらに、転移性前立腺癌の治療のために治療剤をターゲティングするための有効な戦略はなかった（Brodtら、1996）。
【０１３６】
体循環を通して骨髄に選択的に回帰することができるペプチドのサブセットは、骨転移形成の際に前立腺癌細胞の挙動を刺激する可能性がある。ファージディスプレイを用いることによってターゲティングされる血管マーカーも同様に、腫瘍細胞が転移するために利用される可能性がある。この考え方は既に、肺回帰ペプチドに関して当てはまることが証明されている。肺の血管に回帰するペプチドは、実験的転移を阻害する。これらの結果は、部位特異的転移の根本となっているのは、転移が選択的に起こる特定の組織の血管に回帰受容体が存在することであるという「改変された種子と土壌」モデルに適合する。そのような選択的血管マーカーを、転移カスケードの第一段階である接着の際に腫瘍細胞に曝露する。骨髄回帰ペプチドの単離は、転移プロセスの際に前立腺癌細胞回帰を媒介するそれらの血管マーカーを同定するために、および骨転移を阻止するために可能性がある治療的介入にとって、または骨に既に転移した癌を選択的に造影するおよび/または治療するために有用である。
【０１３７】
方法
マウスにおいて骨髄と結合するペプチドを単離するために、ファージライブラリのインビボスクリーニングを使用した。骨髄ターゲティングペプチドを、前立腺癌マウスモデルにおいて転移を阻害する能力に関して特徴決定した。骨髄結合ペプチドの受容体を同定するために、アフィニティクロマトグラフィ及び分子クローニングを使用した。ここに開示される組成物及び方法は、骨転移の予防及び治療に焦点を当てた、新たな抗前立腺癌治療戦略を開発するために有用であった。
【０１３８】
マウスにおける骨髄へと回帰するペプチドを単離するためのインビボスクリーニング
ファージライブラリを静脈注射した。後述の改良を施したSmithおよびScott（1985）のプロトコルに従い、ライブラリを調製した。これらのライブラリに含まれるファージは、5残基〜11残基の範囲の挿入物を表示していた。ガラスチューブ内の1ml DMEM-PIへと移すことによりファージレスキューのため組織試料を処理し、グラインダーでホモジナイズした。骨髄は、ホモジナイゼーションを必要としないが、対照として使用された他の臓器は、効率的にホモジナイズされうる前に切り刻む必要があった。試料を、オートクレーブ処理された2mlエッペンドルフチューブへと移した。組織を、1％BSAを含む氷冷DMEM-PIで洗浄した。3回の洗浄後、ペレットを再懸濁させ、37℃にした後、細胞を添加した。ファージ粒子を回収するため、洗浄された組織試料の、1.5mlのコンピテントK91-kan細菌（1：10希釈率でOD600 0.2）との、室温における1時間のインキュベーションを使用した。
【０１３９】
複数のアリコートを、40μg/mlのテトラサイクリン及び100μg/mlのカナマイシンを含むLB tet/kanプレート又はシャーレに播いた。播種は、広範囲の試料をカバーするいくつかの濃度、即ち、3ml、1ml、300μl、100μl、30μlで実施した。播種に使用されたビーズを、ビーズ表面に捕捉された可能性があるファージ感染細菌クローンを全て回収するため、2個の次の10cm LB tet/kanプレートへと継代した。シャーレを37℃で一晩インキュベートした。残りの2〜3mlの感染培養物（ホモジナイズされた組織を含む）を、40μg/mlのテトラサイクリン及び100μg/mlのカナマイシンを含む10mlのLB培地（LB tet/kan）へと移し、37℃の振とう器内に2時間置いた。12mlの培養物を、1リットルのLB tet/kanへと拡張し、37℃の振とう器内で一晩増殖させた。12時間〜16時間後、標準的なプロトコルに従い、バルク増幅された細菌培養物からファージをレスキューし、2回目の選択のため取り分けた。インキュベーター内のプレート/シャーレから、骨髄由来の十分分離したコロニーを配列決定した。配列決定のため、1ウェル当たり20μlのPBSを含む96ウェルプレートへ、コロニーを移した。
【０１４０】
抗M13抗体を用いた免疫組織化学的染色を、様々な組織におけるファージターゲティングを調査するために使用した（PasqualiniおよびRuoslahti、1996；Arapら、1998）。ファージをIV注射し、5分間又は24時間、循環させた。5分間の実験においては、循環系から未結合のファージを除去するため、ファージ注射の後、マウスにDMEMを灌流させた。24時間後には、循環ファージはほとんど存在しなかった（Arapら、1998a、1998b）。動物を屠殺し、組織を収集し、ブワン（Bouin）溶液で固定し、切片化し、ファージに対する抗体で染色した。
【０１４１】
結果
マウスにおけるインビボのマウス骨髄ターゲティング
ファージライブラリをマウスへと静脈注射し、骨髄よりファージを回収することにより、骨髄ターゲティング配列モチーフが同定された。ファージは、静脈注射され、骨髄より回収され、十分な濃縮が得られるまで反復的にインビトロで増幅され、再注射された。3回の選択の後、マウス骨髄へと回帰するファージ調製物が得られた。個々のファージは、静脈注射の後、プールされたファージと類似した臓器特異性を示した。いくつかのペプチドモチーフが同定され、特徴決定された。インビボで特異性を示す最も有望なモチーフを、表3に示す。
【０１４２】
【表３】
インビボでマウス骨髄をターゲティングするファージ内の配列
Figure 0005077862
【０１４３】
当業者であれば、ここで同定された骨髄ターゲティングペプチド配列が、治療剤の標的化送達又は遺伝子治療、正常な又は罹患した臓器、組織、又は細胞型のインビボ画像化、臓器、組織、又は細胞型における受容体及び受容体リガンドの同定、並びに多数のヒト疾患、特に転移性前立腺癌の治療的処置を非限定的に含む、本発明の範囲内の多数の用途に有用であろうことを理解するであろう。
【０１４４】
実施例2. 前立腺及び前立腺癌に対するターゲティングペプチド
ターゲティングのための特に重要な非限定的なもう一つの臓器は、前立腺である。前立腺は、成体期の間中、増殖を継続するため、通常とは異なる臓器である。結果として、良性前立腺肥大（BPH）は、大部分の高齢の男性に、ある程度の影響を与えている。さらに重大なことに、前立腺は悪性腫瘍の好発部位である。11人に1人の男性が、一生のうちに前立腺癌を発症するとされる。前立腺癌の血清マーカーが利用可能となったため、現在では、これらの悪性腫瘍の多くは、疾患の経過の初期に検出された。臨床的に進行するであろう者を予測するための信頼性の高い手段が存在しないため、多くは、失禁及び性交不能のような壊滅的な副作用を伴うことが多い、手術又は放射線療法により侵襲的に治療された（LaneおよびShah、1999；Mikolajczykら、2000）。ヒト前立腺癌の検出、診断、及び治療のための改良された方法が、明らかに必要とされている。
【０１４５】
前立腺の多くの関心対象の遺伝子が、前立腺血管系のような限定された（しかし、おそらくは高度に特異的又は到達可能な）細胞位置に発現する可能性がある。従って、微小解剖学的又は生理学的な環境に固有の分子の不均一性を考慮に入れないハイスループット配列決定法又は遺伝子アレイ法では、介入のための可能性のある標的が容易に見落とされる可能性がある。
【０１４６】
本発明の方法は、インビボで特異的な標的部位へと回帰するペプチドの同定を可能にする（Pasqualiniら、1996、1997、Koivunenら、1999；Pasqualini、1999）。ファージペプチドライブラリのインビボ選択は、循環系を介して標的組織の特異的受容体へと回帰することができるペプチドを与える。これらの研究は、様々な正常組織における驚くべき程の特殊化を明らかにした（Pasqualini、1999；Rajotteら、1998、1999）。本発明は、前立腺癌ターゲティングペプチドの組成物及び使用法に関する。
【０１４７】
方法
前立腺のインビボファージターゲティング
ファージディスプレイライブラリを静脈注射した。試料は、常に、氷上に維持した。前立腺組織試料を、以下のようにして処理した。第一の試料は、バックアップとして-80℃で保存した。第二の試料は、組織学/病理学、及びHE又は抗M13ファージ免疫染色のため処理した。第三の試料は、同じ重量の断片を3個得るため、清潔な条件下で分割した。
【０１４８】
第三の前立腺試料に由来する3通りの試料を、宿主細菌感染及びファージ回収のため処理した。前立腺試料をガラス組織グラインダー内の1mlのDMEMプロテアーゼ阻害剤（PI）へと移し、ホモジナイズし、細胞懸濁物をオートクレーブ処理された2mlエッペンドルフチューブへと移した。次に、前立腺組織試料を、1％BSAを含む氷冷DMEM-PIで3回洗浄した。各洗浄後に、組織をDMEM-PIと混合し、30秒間ボルテックス処理した。4,000rpmで3分間スピンした後、上清を注意深く廃棄した（組織ペレットには触れないようにした）。次に、1.5mlのDMEM-PI/BSAを添加した。3回目の洗浄の後、ペレットを再懸濁させるため短時間ボルテックス処理し、溶解したペレットを、短時間37℃に加温した後、宿主細菌を添加した。次いで、混合物を1.5mlのコンピテントK91-kan細菌（OD600＝2）と共に室温で1時間インキュベートした。
【０１４９】
混合物を、10mlのLB培地+0.2μg/mlテトラサイクリンを含むファルコン（Falcon）チューブへ、RTで20分間、移した。複数のアリコートを、40μg/mlのテトラサイクリン及び100μg/mlのカナマイシンを含むLB tet/kanプレート又はシャーレに播いた。最後に、シャーレを37℃でインキュベートし、一晩のインキュベーションの後、ファージ形質導入単位数を決定した。
【０１５０】
前立腺癌ターゲティング
腫瘍血管は、漏出性であることが知られている。マウス被験者のファージディスプレイライブラリへの比較的長期間の曝露は、ファージの遊走及び前立腺癌細胞マーカーとの結合をもたらしうる。癌細胞マーカーをターゲティングするため、マウスを、ファージライブラリと共に24時間インキュベートした。
【０１５１】
雄ヌードマウス（4匹）に、106個のDU-145細胞を含むPBSを注射した。腫瘍増殖の後、マウスにいずれかのCX10Cファージディスプレイライブラリを注射した。ライブラリを24時間循環させた後、マウスを屠殺し、組織試料を収集した。試料をダウンス（Dounce）ホモジナイザーでホモジナイズし、ファージを回収するためK91細菌を添加した。一連の希釈度で、細菌を3通り、kan/tet LBプレートに播いた。細菌を含む残りの腫瘍ホモジネートを、10mlのLB/tet/kanと共にRTで1時間インキュベートした。大量のファージストックを得るため、さらに10mlのLK/tet/kanを添加し、37℃で振とう器内でインキュベートした。2回目のスクリーニングのための、混和されたストックを作成するため、216個のコロニーをプレートから選出した。クローンを増幅した後、それらをプールし、ファージをPEG/NaClで沈殿させた。1回目から回収されたプールされたファージを使用して、前立腺腫瘍を保持するヌードマウスを、前記と同様の2回目の選択に供した。3回目のスクリーニングを、前記と同様にして実施した。
【０１５２】
結果
正常マウス前立腺
上に開示された方法により得られたマウス前立腺ターゲティングペプチドモチーフを、表4に示す。
【０１５３】
【表４】
インビボファージディスプレイにより得られたマウス前立腺ターゲティングペプチド
Figure 0005077862
【０１５４】
前立腺癌
3回目のインビボスクリーニングにより、対照正常腎組織と比較して高い腫瘍局在の選択性を示したファージが得られた（示していない）。ファージ挿入物をDNA配列決定することにより同定された前立腺癌ターゲティング配列を、表5に挙げる。
【０１５５】
【表５】
前立腺癌ターゲティングペプチド
Figure 0005077862
【０１５６】
当業者であれば、ここで同定された前立腺ターゲティングペプチド配列が、治療剤の標的化送達又は遺伝子治療、正常な又は罹患した臓器、組織、又は細胞型のインビボ画像化、臓器、組織、又は細胞型における受容体及び受容体リガンドの同定、並びに多数のヒト疾患、特に前立腺癌の治療的処置を非限定的に含む、本発明の範囲内の多数の用途に有用であろうことを理解するであろう。
【０１５７】
実施例3. マウスの胎盤、脂肪、卵巣、及び尿管に対するターゲティングペプチドの同定胎盤回帰ペプチドの同定
マウス胎盤へと回帰するペプチドを、ファージディスプレイライブラリを使用したポストクリアリング（post-clearing）プロトコルにより同定した。1回目のバイオパニングを、妊娠マウスにおいて実施した。胎盤の試料を摘出し、一つの修飾を含む前記の標準的なプロトコルに従いファージをレスキューした。典型的なバイオパニングプロトコルにおいては、単一の臓器、組織、又は細胞型から数千個のファージが回収されうる。典型的には、播種されたファージから200個〜300個の独立のコロニーを選択し、これらを増幅し、プールして、2回目又は3回目のバイオパニングのためのファージディスプレイライブラリを形成させた。本実施例においては、1回目のバイオパニングからレスキューされたファージ全てを固体培地上でバルク増幅し、次いで2回目のバイオパニングのためのファージディスプレイライブラリを形成させるため、プールした。即ち、1回目のバイオパニングからレスキューされたファージの制限が存在しなかった。この制限なしのインビボバイオパニングを3回（1回目〜3回目）実施し、次いでポストクリアリング法を使用した。
【０１５８】
ポストクリアリングプロトコル（4回目）においては、ファージを非妊娠マウスに投与した。胎盤以外の組織と結合したファージを、循環系から吸収した。残りのファージを非妊娠マウスの胎盤から回収した。このプロトコルは、胎盤と結合し、他のマウスの臓器、組織、又は細胞型とは結合しないファージを単離するために設計された。以下の胎盤ターゲティングペプチドが、それらの頻度と共に同定された。GenBankデータベースの検索は、以下に挙げた配列番号のうち、既知のペプチド配列と100％相同なものは存在しないことを開示した。
Figure 0005077862
【０１５９】
示されている通り、ポストクリアリング法の使用は、胎盤ターゲティングペプチドを保持するファージの実質的な濃縮をもたらした。この手法は胎盤に関して使用されたが、当業者であれば、その臓器、組織、又は細胞型を欠いている被験者へとファージライブラリが投与されうる場合には、任意の臓器、組織、又は細胞型に関してポストクリアランスが実施されうることを理解するであろう。例えば、前立腺又は精巣に対するターゲティングペプチドのためのポストクリアリング法は、雌被験者において実施されうるし、卵巣、膣、又は子宮に関しては、雄被験者において実施されうる。
【０１６０】
相同性検索によって、TCRγ-1（TPKTSVT、配列番号：39）、テネイシン（RMDGPVR、配列番号：40及びRAPGGVR、配列番号：41）、MHCクラスII（LGLRSVG、配列番号：44）、アンジオテンシンI（YIRPFTL、配列番号：43）、及びMHC H2-D-q α鎖（VGLHARA、配列番号：42）を含むいくつかの候補タンパク質が、胎盤ターゲティングペプチドの内因性類似体として、同定された。
【０１６１】
胎盤回帰ペプチドの確認及び妊娠の阻害
妊娠マウスへの注射及び胎盤からの回収により、胎盤回帰ペプチドの確認をインビボで行った。図1は、選択された胎盤回帰ファージに関する確認研究の結果を示している。ファージクローンは、PA- TPKTSVT（配列番号：39）、PC- RAPGGVR（配列番号：41）、PE- LGLRSVG（配列番号：44）、PF- YIRPFTL（配列番号：43)として同定される。PAクローンが、対照fd-tetファージで観察されたよりも1桁超大きい胎盤回帰を示したことが、示されている。PCクローンも、有意に高い胎盤局在を示したが、PEクローン及びPFクローンは、対照ファージと比較して、胎盤において実質的には濃縮されなかった。
【０１６２】
胎盤組織におけるPFクローンの明らかな濃縮の欠如にも関わらず、PAペプチド及びPFペプチドは、いずれも、抗胎盤活性を示した。表6は、妊娠マウスへ注射された、FITC（フルオレセインイソチオシアネート）、GST（グルタチオンS-トランスフェラーゼ）、又はファージに結合した胎盤ターゲティングペプチドPA及びPFの効果を示している。比較的低い用量（計450μg）において、FITCと接合したPA及びPFは、妊娠に対するわずかな効果を示した（表6）。比較的高い用量（800μg〜1000μgタンパク質又は4.5×1010ファージ）においては、タンパク質と接合したペプチドPA及びPFも、ファージと接合したペプチドPA及びPFも、胎児発達を実質的に妨害し（表6）、大部分の場合に、明らかに胎児の死をもたらした。CARACペプチド（配列番号：46）、脂肪ターゲティングペプチド（FE、TREVHRS、配列番号：47）、又はfd-tetファージを、非胎盤ターゲティング対照として使用した。
【０１６３】
【表６】
胎盤ターゲティングペプチドの胎児発達に対する効果
Figure 0005077862
【０１６４】
これらの結果により、上で同定された胎盤ターゲティングペプチド配列が確認される。さらに、ターゲティング配列を保持するファージの標的臓器への実質的な濃縮が欠如している場合（例えば、ペプチドPF、図1）ですら、ターゲティングペプチドが、治療剤の標的臓器への標的化送達を提供しうることを証明している。この研究において、PAペプチドが何倍も高レベルにファージを胎盤へと局在させたという観察にも関わらず、比較的低い用量では、PFペプチドの方が、妊娠を妨害する効果がPAペプチドより高いようであった。
【０１６５】
当業者であれば、開示された方法及びペプチドが、胎盤を介した治療剤の胎児への標的化送達、及び妊娠を終結させるための新規手法に有用であり得ることを理解するであろう。
【０１６６】
脂肪ターゲティングペプチド
遺伝的に肥満のマウス（Zhangら、1994；Pelleymounterら、1995）より、脂質ターゲティングペプチドを単離するため、正常マウスにおいて実施されたポストクリアリングを含む、類似のプロトコルを使用した。単離された脂質ターゲティングペプチドには、TRNTGNI（配列番号：48）、FDGQDRS（配列番号：49）、WGPKRL（配列番号：50）、WGESRL（配列番号：51）、VMGSVTG（配列番号：52）、KGGRAKD（配列番号：53）、RGEVLWS（配列番号：54）、TREVHRS（配列番号：47）、及びHGQGVRP（配列番号：55)が含まれる。
【０１６７】
相同性検索によって、幹細胞増殖因子(SCGF)(KGGRAKD、配列番号：53）、アトラクチン（attractin）（マホガニー（mahogany））(RGEVLWS、配列番号：54）、アンジオポエチン関連脂肪因子（angiopoitin-related adipose factor）(FIAF)(TREVHRS、配列番号：47）、アジポフィリン（adipophilin）(ADRP) (VMGSVTG、配列番号：52）、Flt-1又はプロコラーゲンXVII型（TRNTGNI、配列番号：48）、及びフィブリリン2もしくはトランスフェリン様タンパク質p97 (HGQGVRP、配列番号：55)を含むいくつかの候補タンパク質が、脂質ターゲティングペプチドの内因性類似体として同定された。
【０１６８】
脂肪ターゲティングペプチドの確認
図2に示されるように、脂質回帰ペプチドの確認を、インビボ回帰により行った。選択された脂質回帰クローンは、FA-KGGRAKD（配列番号：53）、FC- RGEVLWS（配列番号：54）、FE-TREVHRS（配列番号：47）、及びFX-VMGSVTG（配列番号：52）であった。図2に示されるように、これらのクローンは、全て、脂肪組織への回帰の上昇を示し、クローンFXは、対照fd-tetファージよりも数桁高い脂肪局在を示した。クローンFXは、他の選択された脂質回帰クローンよりも実質的に高い局在を示した。しかしながら、上に開示された胎盤回帰ペプチドからの類推により、当業者であれば、比較的低レベルの脂肪組織局在を示す脂質回帰クローンであっても、治療剤の標的化送達に有用であり得ることを理解するであろう。
【０１６９】
当業者であれば、脂肪組織内の血管新生性血管系に選択的なターゲティングペプチドが、体重減少、又は体重増加の予防に有用であろうことを理解するであろう。抗血管新生性又は毒性の部分を脂肪ターゲティングペプチドに結合させることにより、新たな脂質組織へ栄養を供給する血管を選択的に阻害し、新たな脂質沈着物の成長を予防することが可能であり、既存の脂質沈着物を消滅させることも可能であるかもしれない。
【０１７０】
卵巣及び腹水に対するターゲティングペプチド
さらに、以下に挙げられる、マウスの卵巣及び腹水に対するターゲティングペプチド配列が同定された。
【０１７１】
マウス卵巣ターゲティングペプチドには、GLAKLIP（配列番号：56）、HLISDMS（配列番号：57）、LQHWLLS（配列番号：58）、ALVLQG（配列番号：59）、TGVALQS （配列番号：60）、YVQSREG（配列番号：61）、PLFWPYS（配列番号：62）、DGSG（配列番号：63）、EGSG（配列番号：64）、SSPRPGV（配列番号：65）、DGYPAIA（配列番号：66）、GHAIE（配列番号：67）、及びIWSTSER（配列番号：68）が含まれる。
【０１７２】
マウス腹水に対するターゲティングペプチドには、YRLRG（配列番号：69）、YRARG（配列番号：70）、SQPLG（配列番号：71）、SQPWG（配列番号：72）、QRLVTP（配列番号：73）、QVLVTP（配列番号：74）、QRLVHP（配列番号：75）、QVLVHP（配列番号：76）、ITRWRYL（配列番号：77）、SLGGMSG（配列番号：78）、SQLAAG（配列番号：79）、SLLAAG（配列番号：80）、SQLVAG（配列番号：81）、SLLAAG（配列番号：82）、GLPSGLL（配列番号：83）、HGGSANP（配列番号：84）、SLEAFFL（配列番号：85）、CVPELGHEC（配列番号：86）、CELGFELGC（配列番号：87）、及びCFFLRDWFC（配列番号：88）が含まれる。
【０１７３】
子宮ターゲティングペプチド
表7に開示される、C57B1マウスにおける尿道ターゲティングペプチドを同定するため、類似のプロトコルを使用した。
【０１７４】
【表７】
尿道ターゲティングペプチド
Figure 0005077862
【０１７５】
実施例4：BRASILによるα脾臓抗体ライブラリのインビボスクリーニング
脾臓に対するターゲティングペプチドは、従来同定されていない。網膜内皮系の一部として、非特異的なファージの脾臓への局在の高いバックグラウンドのため、脾臓組織に対するバイオパニングは複雑である。BRASIL法によるバイオパニングにおいて観察される減少したバックグラウンドは、脾臓のような組織に対するターゲティングペプチドの同定にとって有利である。
【０１７６】
本実施例は、BRASIL法の例示的な態様を証明する。標識臓器（マウス脾臓）に対して得られた免疫グロブリンに基づくファージライブラリを開発し、次いでインビボバイオパニングに供した。免疫グロブリンライブラリを構築するため、マウス脾臓をニワトリに注射した。追加接種の後、ニワトリ脾臓を収集し、免疫グロブリン可変ドメイン配列を、ニワトリ脾臓mRNAのPCR（商標）増幅により得た。増幅された免疫グロブリン可変配列を、ファージディスプレイライブラリへと挿入し（α-ライブラリ）、次いで、それをマウス脾臓に対するインビボバイオパニングに使用した。従って、インビボでマウス脾臓へと局在したファージから得られた脾臓ターゲティングペプチドは、マウス脾臓抗原に応答してニワトリにおいて産生された抗体断片に由来していた。本実施例の成功は、さらに、BRASIL法の広範な利用可能性を示す。当業者であれば、本発明がここに開示された態様に限定されないこと、及びBRASIL方法論の多くのさらなる開発が本発明の範囲内に含まれることを理解するであろう。
【０１７７】
材料及び方法
ライブラリ構築
白色レグホン（white leghorn）ニワトリを、還流（10ml MEM）されたBalb/cマウスに由来する脾臓ホモジネート（注射1回当たり約150mg）で免疫した。初回免疫後4週目及び8週目に、脾臓ホモジネートの追加接種をニワトリに与えた。FACS分析によるマウス脾臓に対する免疫応答は、ニワトリ免疫血清が、マウス細胞系（TRAMP-C1）に対する抗体を含むことを示した。初回免疫後12週目に、ニワトリを屠殺し、その脾臓をTRI試薬（Molecular Research Center,Inc.、Cincinatti、OH）へと摘出した。
【０１７８】
TRI試薬の製造業者のプロトコルを使用して、ニワトリ脾臓から全RNAを調製した。オリゴ（dT）プライマー及びスーパースクリプト（Superscript）酵素（Life Technologies）を使用して、全RNAからcDNAを調製した。ニワトリ脾臓免疫グロブリン可変領域をコードするcDNAを、標準的な技術に従い、CHybVHプライマー及びChybIgBプライマー（Vheavy）、又はCSCVKプライマー及びCHHybL-Bプライマー（Vκ）により増幅した。軽鎖の可変領域及び定常領域は、CSC-Fプライマー及びlead-Bプライマー、並びにVκ鋳型及びCκ鋳型を使用して、共にPCR（商標）増幅した。重鎖の可変領域及び定常領域は、dp-seqプライマー及びlead-Fプライマー、並びにVheavy鋳型及びCheavy鋳型を使用して、共にPCR（商標）増幅した。重鎖断片及び軽鎖断片は、CSC-Fプライマー及びdp-Exプライマーを用いて、共にPCR（商標）増幅した。PCRプライマーは、コールドスプリングハーバー・ラボラトリー講座マニュアル「コンビナトリアル抗体ライブラリのファージディスプレイ（Phage Display of Combinatorial Antibody Libraries）」（Barbasら、2000）（この内容は、参照として本明細書に組み込まれる）に挙げられているプライマー配列を使用して、ジェノシス（Genosys）又はゲンベース（GenBase）より購入した。
【０１７９】
SfiIで消化した後、ファージライブラリへの挿入のため、増幅産物をSfiI消化pComb3xと連結させた。連結したpComb3-123プラスミドをER2537大腸菌へとエレクトロポレーションし、その後のVCM13（ヘルパーファージ）感染によりファージ産生を開始させた。得られたライブラリサイズは、約5×106cfuであった。
【０１８０】
BRASILを使用したα脾臓ライブラリのインビボスクリーニング
ニワトリα脾臓ライブラリを使用して、マウスにおける4回のインビボスクリーニングを実施した。約0.8〜2.0×1010TUをBalb/cマウスに注射した。ライブラリを5分間循環させた。屠殺後、マウス脾臓を回収し、70μm細胞濾過ナイロンメッシュへと脾臓を通すことにより、単一細胞懸濁液を調製した。BRASIL技術を使用して、単一細胞懸濁液を油（9：1ジブチルフタレート：シクロヘキサン）で遠心分離し、対数増殖期のER2537大腸菌200μlにペレットを感染させた。マウス脾臓から回収された増幅されたファージを、次回のスクリーニングに使用した。BRASILの前に得られた脾臓片を使用した従来のバイオパニング法と比較して、脾臓及び脳へと回帰するファージの数に、スクリーニング中、明らかな濃縮は見られなかった。
【０１８１】
ニワトリFab挿入物の4回目のスクリーニングからのマウス脾臓に局在したファージを、PCR（商標）増幅し、PCR産物をBstIで消化した。分析された90個のクローンのうちの半分が、類似の制限パターンを与えた。そのうち、20個のクローンを配列決定したところ、同一の制限パターンを有するものはわずか2個であった。抗体に基づくファージクローンのうちの4個（2番、6番、10番、及び12番）を、結合アッセイ及び局在アッセイを使用したさらなる分析に供した。
【０１８２】
BRASILを使用したインビトロでのクローンの試験
単一細胞懸濁液を、2個のマウス脾臓より調製した。懸濁液を5個のチューブに分割し、3×109TUのFabクローン#2、#6、#10、#12、及び2×109TUのtetファージと共に、氷上でインキュベートした。マウス脾細胞と結合したファージをBRASILにより回収した。200μlの対数増殖期ER2537大腸菌にペレットを感染させ、ファージ結合の評価のため、段階希釈物をLB/カルベニシリンプレート及びLB/テトラサイクリンプレートに播いた。fd-tetを、全てのファージ回帰実験を規準化するための内部標準として使用した。
【０１８３】
BRASILによるインビボでのクローンの試験
Fabクローン#2、#6、#10、#12のファージ（3×109）、及び2×109TUのtetファージを、Balb/cマウスの尾静脈に注射し、5分間循環させた。脾臓を回収し、全脾臓から単一細胞懸濁液を氷上で調製した。細胞結合ファージをBRASILにより回収した。200μlの対数増殖期ER2537大腸菌にペレットを感染させ、ファージ回収の評価のため、段階希釈物をLB/カルベニシリンプレート及びLB/テトラサイクリンプレートに播いた。
【０１８４】
BRASILによるインビボでのクローン#10の試験（対照ファージNPC-3TTと比較）
Fabクローン#10及びNPC-3TT（対照Fabファージ）のファージ（3×109TU）、並びに1×109TUのFd-tetファージをマウス（NPC-3TTについて2匹、クローン#10について2匹）に注射し、5分間循環させた。脾臓を回収し、単一細胞懸濁液を氷上で調製した。細胞結合ファージをBRASILにより回収した。200μlの対数増殖期ER2537大腸菌にペレットを感染させ、段階希釈物をLB/カルベニシリンプレート及びLB/テトラサイクリンプレートに播いた。NPC-3TTファージは、ヒト抗破傷風毒素Fab断片を表示しているファージである。
【０１８５】
脾臓へのFabクローン#10の回帰（骨髄と比較）
Fabクローン#10及びNPC-3tt対照のファージ（3×109TU）、並びに1×109TUのFd-tet対照ファージをマウス（NPC-3TTについて2匹、クローン#10について2匹）に注射し、5分間循環させた。脾臓を回収し、単一細胞懸濁液を氷上で調製した。臓器特異的回帰の対照として、同じマウスから骨髄（両大腿骨）を回収した。細胞結合ファージをBRASILにより回収した。
【０１８６】
Fab断片の作製
ニワトリFab挿入物を含むプラスミドpComb3を、ER2537大腸菌へとエレクトロポレーションした。段階希釈物をLB/カルベニシリンプレートに播き、37℃で一晩インキュベートした。Fab産生培養物（100μg/mlのカルベニシリンを含むスーパーブロス（super broth）中）を、単一の播種されたコロニーから開始させた。1mM IPTGにより、30℃で7時間、Fab産生を誘導した。細菌上清、周辺質画分SN1及びSN2、並びに細菌溶解物の中のFab濃度のELISAによる決定の後、アフィニティ精製により、周辺質画分SN2からFab断片を精製した。標準的なプロトコル（HarlowおよびLane、1988）を使用して、α-Fab-プロテインGカラムに、ジメチルピメリミデート（DMP）をカップリングさせた（2mg/ml）。
【０１８７】
Fab断片を精製するため、以下の方法を使用した。2時間（スーパーループ（superloop）を用いて、50ml未満の容量を使用する場合）又は一晩（蠕動ポンプを使用して、50ml超の容量を用いる場合）かけて、SN2画分を1mlのHiTrap-プロテインG-α-Fabカラム（Amersham Pharmacia Biotech、Piscataway、NJ）にロードした。カラムを10〜20mlのPBS（リン酸緩衝生理食塩水）で洗浄した。Fab断片を10mlの20mMグリシン緩衝液、pH2.2、150mM NaClを用いて溶出させ、1ml画分を収集した。画分を、溶出直後に1Mトリスで中和した。タンパク質濃度は、A280により定量した。
【０１８８】
血管内染色
回収されたFab断片のインビボ分布を決定するため、50〜60μgのFab断片（Fab#10、NPC3-tt、又はR#16）をBalb/cマウスの尾静脈に注射し、8分間循環させた。50μgのトマト（L.esculentum）レクチン-FITCをマウスに注射し、2分間のレクチン循環の後、25〜30mlの4％パラホルムアルデヒド/PBSの灌流によりマウス組織を固定した。組織を摘出し、4％パラホルムアルデヒドで、1時間、後固定した。固定された組織を、溶液を少なくとも2回変えながら、4℃で一晩、30％ショ糖/PBS中でインキュベートした。組織を凍結培地で包埋し、ドライアイス上で凍結させた。
【０１８９】
固定された組織切片を、以下のようにしてFabに関して染色した。凍結組織切片（55μm）をミクロトーム上で切り分け、PBSで3回洗浄した。PBS/0.3％TritonX-100/5％ヤギ血清で、室温で1時間、薄片をブロッキングした。切片を、1：400のCy3と接合したα-ヒト抗Fab抗体と共に、室温で一晩、インキュベートした。接合した切片を、PBS/0.3％TritonX-100で6回、PBSで3回洗浄し、4％パラホルムアルデヒドで15分間固定した。固定後、切片をPBSで2回洗浄し、蒸留水で2回洗浄し、次いでベクターシールド（VectorShield）を用いてスライドガラス上に設置した。
【０１９０】
結果
ニワトリFab断片を発現するファージクローンのマウス脾細胞へのインビトロ局在を、BRASILにより調査した。図3に示されるように、BRASILにより単離されたFabファージクローンは、挿入物を含まないFd-tet対照ファージと比較して、ディファレンシャルなマウス脾細胞との結合を示した。クローン#6は、Fab断片を含むが、マウス脾臓から単離されたのではない対照ファージNPC-3TTと類似した、最も低い程度のディファレンシャル結合を示した。クローン#2、#10、及び#12は、全て、Fd-tet対照と比較して、マウス脾細胞との選択的な結合を示し、クローン#2及び#10については少なくとも2倍増加した結合が観察された。クローン挿入物について決定されたアミノ酸配列は、以下の通りである：
Figure 0005077862
【０１９１】
NPC-3TTと比較されたFabクローンについてのインビトロファージ結合の直接比較を行った。図4に示されるように、クローン#2及び#10は、最高レベルのマウス脾細胞との結合をインビトロで示した。クローン#6及び#12は、ファージNPC-3TTの結合よりも極わずかに高いレベルのマウス脾臓との結合を示した。
【０１９２】
ニワトリFabファージクローンの優先的な結合を、BRASILを使用したインビボ研究により確認した。図5に示されるように、マウス脾臓への選択的局在は、インビボでははるかに劇的であり、Fabクローン#2、#6、及び#10は、Fd-tetファージと比較して、何倍にも増加した脾臓との結合を示した。対照的に、Fabクローン#12は、Fd-tetファージと比較して有意に上昇したマウス脾臓との結合を示さなかった。これらの結果は、脾臓ターゲティングファージを用いて得られたインビトロの結果が、インビボで確認されることを示している。
【０１９３】
Fabクローン#10を、インビボのマウス脾臓への局在によるさらなる特徴決定のため、選択した。図6に示されている結果は、Fabクローン#10が、Fd-tetと比較して3〜10倍の脾臓における濃縮を示したことを確認している。Fab対照ファージNPC-3TTは、挿入物を含まないFd-tetファージと比較して選択的な脾臓局在を示さなかったため、この効果は、一般的なFab結合によるものではなかった。
【０１９４】
図7において証明されるように、Fabクローン#10の結合は臓器特異的であった。Fabクローン#10及びNPC-3TT対照に由来するファージを、同一の注射されたマウスの脾臓及び骨髄から回収した。図7より、Fabクローン#10は、脾臓への選択的局在を示すが、骨髄組織への選択的局在は示さなかったことが明らかである。対照ファージは、骨髄（図7）又は脾臓（示していない）への選択的局在を示さなかった。
【０１９５】
これらの結果は、Fabクローン#10が、インビトロにおいてもインビボにおいても結合に関してマウス脾臓組織を選択的にターゲティングすることを示している。これらの結果は、インビボファージ分布に関する血管染色によりさらに確認された。この研究に使用された対照ファージは、クローンNPC-3TT（Fab断片）及びクローンR#16（血管新生性網膜スクリーニングより単離）であった。
【０１９６】
蛍光染色により、Fabクローン#10は、インビボでマウス脾臓組織と結合することが観察された（示していない）。対照ファージNPC-3TT及びR#16は、同一条件下で脾臓組織を染色しなかった。クローン#10及びNPC-3TTのファージは、おそらくは糸球体濾過のため、注射された動物の腎臓を強く染色することが観察された（示していない）。その他の対照臓器（肺、脳、肝臓、心臓、及び骨格筋）は、クローン#10による染色を示さなかった（示していない）。
【０１９７】
これらの結果は、脾臓ターゲティングファージペプチドが、BRASIL法により同定されうることを証明している。さらに、出発ファージライブラリを得るための、標的の臓器、組織、又は細胞型に対する抗体断片を使用したファージディスプレイ技術の実施可能性を示している。高い非特異的バックグラウンドのために、標準的なファージディスプレイプロトコルを使用したバイオパニングが適用できなかった組織である脾臓に対するターゲティングペプチドを得ることが可能であったことは、BRASIL法の利点を示している。
【０１９８】
実施例5：血管新生性網膜におけるα-カポジ肉腫ライブラリのインビボスクリーニング
血管新生性網膜系は、血管新生性腫瘍組織のモデルとして開発された。新生マウスにおける低酸素は、網膜における血管新生応答を引き起こす。血管新生性網膜組織受容体は、ファージディスプレイ結合に関して血管新生性腫瘍組織との類似性を示す。
【０１９９】
材料及び方法
血管新生性モデル系
1週齢C57BL/6Jマウスを、5日間、75％酸素雰囲気に曝露し、次いでさらに5日間、大気中で維持した。6μm横断切片において網膜から硝子体領域へと伸長した新血管の核を計数することにより、増殖性新生血管応答を定量した。このモデルを、マウスへ静脈注射されたファージディスプレイライブラリの、新たに形成された血管新生性血管への結合を評価するために使用した。血管新生のピークは、生後17〜21日目に観察された。
【０２００】
ファージディスプレイ
脾臓に関して既に開示したのと同じ方法を使用して、ウサギへと免疫されたカポジ肉腫腫瘍組織に対するFabファージライブラリ（α-KS）を作製した。血管新生性網膜モデル系において、α-KS ライブラリを使用して、3回のインビボスクリーニングを実施した。生後18〜20日目に低酸素により誘導された網膜血管新生を有する2匹のC57BL/6Jマウスに、約3〜10×1010TUのα-KSファージを注射した。ライブラリを5分間、循環させた。眼を摘出し、網膜を眼の残部から分離した。2枚のスライドガラスの間で破砕することにより、網膜から単一細胞懸濁液を調製した。単一細胞懸濁液を、前記のようなBRASILにより処理し、200μlの対数増殖期ER2537大腸菌にペレットを感染させた。一晩増幅したファージを網膜組織から回収し、次回のスクリーニングに使用した。各選択後の回収は、3400〜5000TUであった。
【０２０１】
3回の選択後、90個の選択されたクローンを、HUVEC細胞との結合能に関して試験した。マイクロタイターウェルに、HUVECを含む完全培地をコーティングした。細胞を固定し、ファージ感染細胞のIPTG誘導培養物からの上清と共に一晩インキュベートした。α-Fab ELISAにより、Fab産生を検出した。FabのHUVECとの結合は、α-Fab-AFOS ELISAにより検出した。
【０２０２】
図8は、α-KSファージライブラリを使用したFabクローンのHUVECとの結合の結果を示している。クローン#16は、インビトロでHUVECとよく結合するようであった。
【０２０３】
これらの結果は、ファージディスプレイライブラリの作製のため、Fab抗体断片を使用することの可能性を確認している。そのようなライブラリは、従来のバイオパニング法において使用されてきたランダム配列ファージディスプレイライブラリと比較して、宿主動物を免疫するために使用された特定の臓器、組織、又は細胞型に対してターゲティングされるペプチド配列に富んでいるはずである。結果は、ターゲティングペプチド配列を同定するためのBRASIL法の利用可能性も確認している。
【０２０４】
実施例6. 受容体/リガンド対の同定：インテグリン受容体に対するターゲティングペプチド
本発明のいくつかの態様は、様々な用途のための受容体/リガンド対の同定に関する。臓器、組織、又は細胞型に選択的なターゲティングペプチドは、通常は標的内の血管の内腔側表面上に位置している（前記定義のような）受容体と結合する。いくつかの態様において、ターゲティングペプチドは、直接的又は間接的に、そのような受容体を同定又は特徴決定するために使用されうる。遺伝子治療ベクター、その他の治療剤、又はインビボ画像化用の造影剤の送達のための標的としての使用に加え、そのような天然に存在する受容体は、受容体自体に対する新たな治療剤の開発、受容体に対するワクチンの開発、及び様々な疾患状態の基礎となっている分子機構の理解のための可能性のある標的として有用である。当然、ターゲティングペプチド自体は、受容体に対する新たな治療剤のための基礎として有益であり得る。
【０２０５】
ターゲティングペプチドは、ターゲティングされた受容体と結合する内因性リガンドのミメオトープ（mimeotopes）として作用する場合が多い。他の態様において、開示された方法を使用して、内因性リガンドが同定され、特徴決定されうる。そのようなリガンドも、新たな治療剤の開発等のための標的として潜在的に有用である。
【０２０６】
本実施例は、受容体（この場合にはインテグリン受容体）/リガンド対の同定に関する一つの態様を例示する。インテグリンに対するターゲティングペプチドの用途の例には、細胞の増殖及び走化性の制御、アポトーシス促進、並びに抗血管新生が非限定的に含まれる。この態様においては、固体基質に結合した精製されたインテグリンを、インテグリンに対するターゲティングペプチドを同定するため、ファージディスプレイライブラリをスクリーニングするために使用した。
【０２０７】
背景
インテグリンの機能は、多様な生物学的系においてサイトカイン及びその他の可溶性因子により制御されている。最も一般的には、そのような因子の曝露は、受容体の活性化状態の変化（即ち、特定のリガンドに対する親和性の増加もしくは減少、及び/又は原形質膜内での受容体クラスター形成）をもたらすコンフォメーションの改変へと至る。インテグリン依存性接着の変化は、最終的には、様々な複雑なシグナル伝達経路を活性化する。分子レベルにおいては、誘導された細胞骨格タンパク質のインテグリン細胞質ドメインとの共局在が、シグナル伝達を調節する。
【０２０８】
細胞質ドメインは、インテグリン機能の重要な制御因子である（Hynes、1992；Ruoslahti、1996の総説）。個々のαサブユニット及びβサブユニットの細胞質ドメインは、異なる種間で高度に保存されている（Hemlerら、1994）。様々なβサブユニットの細胞質ドメインは、類似の一次構造を共有しているが、いくつかの機能的特徴に関しては異なっている。キメラインテグリンを用いた実験によって、β鎖の細胞質ドメインが、受容体の分布及び限局性付着（focal adhesion）部位への動員の制御を担っていることが示されている（PasqualiniおよびHemler、1994）。従って、いくつかの細胞質ドメインは、インテグリンによって媒介される細胞へのシグナル伝達（外から内へのシグナル伝達）、及びインテグリン-リガンド結合活性の活性化（内から外へのシグナル伝達）にとって重要である（Hemlerら、1994）。
【０２０９】
インテグリンαvβ3及びαvβ5は、正常血管系には発現しておらず、血管新生性血管系に選択的に発現する（Brooksら、1994a、1994b；Pasqualiniら、1997；Arapら、1998）。さらに、αvインテグリンアンタゴニストは、新生血管の成長を阻止することが示されている（Brooksら、1994a、1994b、1995；Hammesら、1996）。これらの実験において、内皮細胞のアポトーシスが、血管新生の阻害のための機構として同定された（Brooksら、1994a、1994b、1995）。bFGFにより開始する血管新生は、抗αvβ3阻止抗体によって阻害され、VEGFにより媒介される血管新生は、αvβ5に対する阻止抗体によって防止されうる。インテグリンαvβ3及びαvβ5は、異なる型の眼新生血管疾患において優先的に表示されることが報告されている（Friedlanderら、1995、1996）。従って、別個のサイトカインにより誘導される血管新生へと至る経路は、特異的なαvインテグリンに依存していると考えられる。
【０２１０】
インテグリンαvβ3及びαvβ5は、いずれも、ビトロネクチンと結合するが、おそらくは、異なるリガンド結合後事象を媒介する。例えば、外因性可溶性因子の非存在下では、インテグリンαvβ5は、細胞の接着、拡散、遊走、及び血管新生を促進することができない。他方、αvβ3インテグリンは、サイトカインによる付加的な刺激なしに、そのような事象を誘導することができる（Klemkeら、1994；Lewisら、1996；Friedlanderら、1995）。
【０２１１】
サイトカインによるαvβ5機能の制御に関する分子的基礎を研究するために設計された実験によって、固定化されたビトロネクチンとの結合時、不活化されたαvβ5は、アクチン、α-アクチニン、テーリン、テンシン（tensin）、p130cas、及びビンキュリンと会合して検出されることはほとんどないことが示されている。対照的に、αvβ3は、そのような分子の局所的な蓄積を誘導する。プロテインキナーゼC（PKC）の活性化により、αvβ5は、αvβ3と類似の挙動を示すようになるが、テーリンを動員することはできない（Lewisら、1996）。さらに、PKCの阻害剤であるカルホスチン（calphostin）Cは、αvβ5により媒介される血管新生を阻止するが、αvβ3により媒介されるものは阻止しないようである（Friedlanderら、1995）。これらの観察は、PKC活性化が、おそらく、β5細胞質ドメインのコンフォメーション又はリン酸化状態に影響を与えることを示唆している。細胞質タンパク質においても、類似の変化が起こりうる（KolanusおよびSeed、1997）。サイトカインによるαvβ5インテグリンの制御は、リガンド結合は不変であるが、リガンド結合後の事象が異なる点で、通常とは異なる（Lewisら、1996）。従って、αvβ3又はαvβ5により媒介される細胞事象は、明らかに、異なる機構によって調節されている（FilardoおよびCheresh、1994b）。
【０２１２】
αvインテグリン会合分子の検索は、技術的な問題によって妨げられてきた。第一に、含まれている物理的会合が、細胞が完全でない場合にはもはや起こらない多量体リガンドの集合に頼っている可能性が高い。第二に、それらのインテグリンとの会合は、通常、低親和性である。最後に、会合タンパク質のコンフォメーション及びリン酸化状態の変化が、これらの一時的に調整される相互作用の複雑度をさらに増大させている可能性がある。これらの問題のため、インテグリン細胞質ドメインと結合するタンパク質は、限定された数しか同定されていない。パキシリン（paxillin）及びICAP-1のようなこれらのタンパク質は、主に、β1鎖と会合する（ShattilおよびGinsberg、1997）。サイトヘシン（cytohesin）-1及びフィラミンは、β2の細胞質ドメインと会合する。
【０２１３】
いくつかの他のタンパク質（テーリン、フィラミン、α-アクチニン、限局性付着キナーゼ、セリン/トレオニンキナーゼILK、及びスケルミン（skelemin））は、βインテグリン細胞質ドメイン全般と相互作用することが報告されている。テーリン、α-アクチニン、及び限局性付着キナーゼは、β1細胞質ドメイン内の推定結合部位を欠失させた後には、もはやβ1インテグリンと共局在しない。類似の手法により、他の細胞骨格関連タンパク質及びシグナル伝達分子が、インテグリンと共局在することが示されている。
【０２１４】
インテグリンは、増殖因子シグナル伝達に関与している分子と会合する。αvβ3と会合して見出されうる190kDaタンパク質及びIRS-1（VuoriおよびRuoslahti、1994）に加え、αvβ3インテグリンと、インスリン及びPDGFのシグナル伝達経路に関連している分子との会合の分析は、インスリン受容体及びPDGFβ受容体の両方がαvβ3と共免疫沈降することを明らかにした。インテグリンと会合した受容体分子は、そのような分子の高度にリン酸化され高度に活性化された亜画分を表している。これらの結果は、インテグリンにより媒介される細胞接着が、増殖因子に対する細胞応答と同調しているという見解を強化するため、重要である。インテグリン依存性シグナル伝達過程は、増殖シグナルと協同している（FrischおよびRuoslahti、1997；ClarkおよびBrugge、1995；LonghurstおよびJennings、1998）。
【０２１５】
タンパク質リン酸化は、インテグリン刺激に対する応答において検出される最初期事象の一つである。チロシンキナーゼ阻害剤が、限局性付着の形成を抑制することができることから、インテグリン受容体と連結されているシグナル伝達経路におけるチロシンリン酸化の役割が示唆される（Defilippiら、1994）。プロテインキナーゼC（PKC）及びマイトジェン活性化プロテイン（MAP）キナーゼのようなセリン/トレオニンキナーゼファミリーも、インテグリン刺激によって活性化され、PKCの阻害剤は、いくつかの細胞システムにおける細胞の接着及び拡散を阻止する（VuoriおよびRuoslahti、1993）。インテグリンは、やはりチロシンリン酸化に依存している応答であるプログラム細胞死を制御することにより細胞生存に影響を与えると考えられる。インテグリンタンパク質複合体と会合するいくつかのタンパク質は、タンパク質-タンパク質カップリングを特異的に媒介するSrcホモロジー2（SH2）及び3（SH3）と呼ばれるモジュラードメインを含む。SH2ドメインは、ホスホチロシンを含む特異的ペプチドモチーフとの相互作用を介してタンパク質と結合し、SH3ドメインは、タンパク質標的上の短いプロリンリッチなペプチドモチーフと結合する（ClarkおよびBrugge、1995）。インテグリンにより媒介される細胞接着は、MAPキナーゼの活性化を引き起こし、限局性付着キナーゼ（FAK）のチロシンリン酸化を増加させる。FAKの自己リン酸化は、Srcファミリーキナーゼ及びGrb-2-Sos複合体を含むSH2ドメインタンパク質の結合へと至る。一つの妥当な仮説は、インテグリンにより媒介されるFAKのチロシンリン酸化が、Rasカスケードの活性化に至り、最終的にはMAPキナーゼ活性化へと至るというものである。しかしながら、インテグリンにより媒介されるMAPキナーゼ活性化は、FAKとは無関係であることが示されており、そのことは、（i）分裂促進シグナル及び生存シグナルにおいて役割を果たしうるMAPキナーゼ活性化、並びに（ii）細胞骨格組織化に明らかに関与しているFAKチロシンリン酸化、という少なくとも2個の別個のインテグリンシグナル伝達経路が存在することを示している（Linら、1997）。
【０２１６】
ペプチド基質及び相同性に基づく分子モデルの以前の研究より、ペプチド基質の約9〜13残基が、キナーゼドメインの活性部位間隙と接触することが示唆された（Bossemeyerら、1993）。ファージディスプレイ技術は、多様なコンビナトリアルペプチドライブラリを生成させ、選択するための代替的な手法を提供する（Smith、1991；WellsおよびLowman、1992）。ファージディスプレイライブラリ内の化学的多様性は、複製され増幅されうるDNAによってコードされているため、ファージライブラリの選択は複数回実施することが可能であり、従って稀少なモチーフですら同定することが可能である。合成化学ライブラリとは対照的に、ファージディスプレイは、プールされた種ではなく単一の種の分析を許容する。この技術の力は、大規模なコンビナトリアルライブラリからの稀少な抗体又はペプチドの選択によって主に証明されてきた。
【０２１７】
コンビナトリアルファージライブラリは、全てSrcファミリーの近縁メンバーである異なるプロテインチロシンキナーゼ（PTK）及び1個の比較的遠縁のPTK、Sykの好ましい基質配列を決定するために使用された（Schmitzら、1996）。組換えPTKによるその後のリン酸化、及び抗ホスホチロシン抗体によるリン酸化されたファージの選択が、基質ペプチドを表示しているファージを濃縮するために使用された。数回の選択の後、試験された各PTKについて別個の基質配列が見出された。Srcファミリーと関連したPTKについては、これらの正準配列の重要な特質が、既知又は仮定のタンパク質基質において再利用された。最も注目すべきことは、不変のチロシン残基と直接隣接しているアミノ酸が、高度に保存されており、試験された各PTKに対して特異的であった点である。従って、同定されたモチーフは、PTKの触媒ドメインの小さい特異的な阻害剤を開発するための合理的基礎を提供しうる（Schmitzら、1996）。
【０２１８】
さらなる研究は、SrcファミリーのプロテインキナーゼであるFynの基質特異性を検討するために、如何にしてペプチドライブラリが使用されうるかを示すことにより、ファージディスプレイ技術の範囲を拡大した（Denteら、1997；Gramら、1997）。ファージによって表示された修飾されたペプチドが、タンパク質Shcのホスホチロシン結合ドメイン（PTB）のホスホチロシン特異性を決定するために使用された（Denteら、1997）。他の関連する実験は、ファージ上に確立されたランダムペプチドライブラリをスクリーニングすることによる、アダプタータンパク質Grb2のSrcホモロジー2（SH2）ドメインと相互作用するホスホペプチドリガンドの同定に焦点を当てた。ホスホチロシンキナーゼc-Src、Blk、及びSykの混合物により、ファージの不変チロシン残基がインビトロでリン酸化された。グルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）融合タンパク質として発現させたGrb2の組換えSH2ドメインとのライブラリの相互作用により、結合モチーフが選択された。その後の数回の選択によって、先にリン酸化された場合にのみGST-Grb2 SH2ドメインと結合するファージが濃縮された。配列分析によって、選択されたファージが、全て、コンセンサスモチーフY*M/NW（Y*はホスホチロシンを意味する）を含むペプチドを表示していることが明らかとなった。1個のペプチドは、天然リガンドShcに由来するペプチドモチーフY*VNV より3倍高い親和性でGrb2 SH2ドメインと結合した。これらの所見は、ファージディスプレイが、SH2ドメインに対する高親和性リガンド及びシグナル伝達に関与しているその他の相互作用タンパク質を迅速に同定するために使用されうることを示している。
【０２１９】
β5の細胞質ドメインは、他のインテグリンサブユニットと較べて構造的及び機能的に独特であり（表8）、わずか38％というβ3の細胞質ドメインとの相同性を有している（Hemlerら、1994）。αvとの会合のための構造的要件が、β3とβ5とのさらなる一次配列の相違を防止しているが；既存の差異が、αvβ5のテーリンとの減少した相互作用の原因となっている可能性が高いことが提唱されている（Lewisら、1996）。β5の細胞質ドメインを、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞において、β1の細胞外ドメインとのキメラとして発現させた場合、キメラ受容体はβ5と同様の挙動を示し、細胞遊走及び受容体の限局性付着への局在の欠損を促進した（PasqualiniおよびHemler、1994）。しかしながら、インテグリンサブユニットβ1及びβ3の細胞質ドメインは、機能的に相互に交換可能であることが示された（Solowskaら、1991）。他の研究によって、αvβ3及びαvβ5が、限局性付着への局在及び細胞遊走への寄与に関して異なっていると考えられることが示された（Delannetら、1994；Filardoら、1995）。しかしながら、これらは、機能的相違が、特定のドメインにマッピングされていないことを報告した。
【０２２０】
【表８】
類似のインテグリンβサブユニット細胞質ドメインの整列化
β3細胞質ドメインとβ5細胞質ドメインとの主要な差異が強調されている。
Figure 0005077862
【０２２１】
血管新生スイッチが誘発された後は、別個の分子が、β3又はβ5のいずれかと会合する可能性が高い。さらに、αv細胞質ドメインとの選択的会合も、各ヘテロダイマーの環境において可能性がある。例えば、インテグリンαvサブユニットの細胞質テール内のβターンは、αvβ3のコンフォメーション及びリガンド結合に影響を与えることが示されている（FilardoおよびCheresh、1994）。選択的シグナル伝達特性の基礎は、それぞれの細胞質ドメインと会合する特異的分子の集合であるのかもしれない。本研究は、β3及びβ5の細胞質ドメインに対するファージディスプレイライブラリのパニング、並びに細胞質ドメイン結合ペプチドの生物学的特性の決定という新規な戦略を活用することにより、αvβ3及びαvβ5に選択的な血管新生シグナル伝達に関与している分子を確定する。
【０２２２】
開示された方法は、従来の手法と比していくつかの利点を有している。（i）インテグリン細胞質ドメインと直接的又は間接的に相互作用する細胞内分子を特徴決定する能力；（ii）極めて少量でインテグリン細胞質ドメインと結合する分子に対する抗体の開発；及び（iii）ファージディスプレイライブラリスクリーニングは、細胞質ドメイン結合タンパク質を模倣するペプチドの同定に至るであろう。
【０２２３】
方法
二次元細胞培養
β3及びβ5インテグリンを発現する3個のヒト内皮細胞系：KS1767細胞（Herndierら、1996）、HUVEC（ATCC）、及びBCE細胞（Solowskaら、1991）を使用した。異なるタンパク質（即ち、ビトロネクチン、フィブロネクチン、コラーゲン、又はラミニン）で覆われた無菌のガラス製カバーガラスを基質として使用した。細胞が接着し拡散した後、0.05％ウシ胎仔血清を含む培地中での12時間のインキュベーションにより、単層を休止状態にした。ペネトラチン（penetratin）膜透過性タグ（下記参照）を使用して、ペプチドを細胞へと導入した。細胞を、接着及び拡散のため、ECMタンパク質へと播いた。単層を、bFGF、TNFα、VEGF、及びTGFβを含む、αvにより媒介される血管新生に関与している各増殖因子で6時間刺激した。未処理の細胞が、陰性対照であった。
【０２２４】
三次元細胞培養：
24穴組織培養プレートのウェルに各150μlのマトリゲル（Matrigel）を添加し、37℃で10分間ゲル化させた。2％FCSが補足されたM199培地中で24時間、HUVECを枯渇状態にした後、トリプシン処理したものを使用した。104個の細胞を3通り、各ウェルに穏和に添加し、37℃で30分間、ゲルコーティングへと接着させた。次いで、培地を、ペプチドを含む完全培地に交換した。24時間後、倒立顕微鏡（Canon）を用いて、プレートをモニタリングし、写真撮影した。
【０２２５】
走化性アッセイ：
細胞遊走アッセイを、以下のようにして実施した。48ウェルマイクロケモタキシスチャンバーを使用した。8μm孔を有する、ポリビニルピロリドンを含まないポリカーボネートフィルター（Nucleopore、Cambridge、MA）に、室温で10分間、1％ゼラチンをコーティングし、2％FCSが補足されたM199培地で平衡化した。ペプチドを含む2％FCS、20ng/ml VEGF-A（R＆D System）、及び1U/mlヘパリンが補足されたM199を、ボイデン（Boyden）チャンバーの下室に置いた。一晩、枯渇状態にしたサブコンフルエントの培養物を迅速にトリプシン処理し、最終濃度2×106個/mlで、2％FCSが補足されたM199に再懸濁させた。フィルターを下チャンバーと上チャンバーの間に置いた後、50μlの細胞懸濁液を上室に蒔いた。5％CO2を含む湿潤雰囲気中で37℃で5時間、細胞を遊走させた。次いで、フィルターを除去し、上側の細胞を、ゴムポリスマン（policeman）を用いて剥離した。遊走した細胞をメタノールで固定し、ギムザ溶液（Diff-Quick、Baxter Diagnostics、Rome、Italy）で染色した。各ウェル内の5個のランダムな高倍率視野（40倍）を計数した。
【０２２６】
増殖アッセイ：
細胞増殖は、記載されているようにして（PasqualiniおよびHemler、1994）測定した。簡単に説明すると、4×104個のHUVECを24ウェルプレート内でインキュベートした。細胞を24時間枯渇状態にし、次いで培地を除去し、VEGF及び15μMの各ペプチドの存在下で交換し、18時間インキュベートした。次いで、50μlの[3H]チミジン（1μCi/ml）を含む培地をウェルに添加し、さらに6時間37℃でインキュベートした後、培地を除去し、細胞を10％TCAで4℃で30分間固定し、エタノールで洗浄し、0.5N NaOHで可溶化した。LS 6000SCベックマン（Beckman）シンチレーションカウンターを用いて液体シンチレーションにより放射能を計数した。各実験を3通り3回実施し、結果を平均値±SDで表した。
【０２２７】
アポトーシスアッセイ（ヨウ化プロピジウム染色サブジプロイド（subdiploid）集団）
およそ1×106個の細胞を完全培地中に採集し、15μMのペプチドを4時間、8時間、又は12時間添加した。次いで、細胞をPBSで洗浄し、0.5mlのヨウ化プロピジウム溶液（50μg/ml PI、0.1％Triton X-100、0.1％クエン酸ナトリウム）に再懸濁させた。4℃で24時間のインキュベーションの後、細胞を、488nmレーザーを用いてXLコールター（Coulter）（Coulter Corporation）で計数し；各ヒストグラムについて12,000個の細胞を計数し、細胞周期分布をマルチサイクル（Multicycle）プログラムで分析した。
【０２２８】
ペプチド及び適切な対照の微小注入又はペネトラチン媒介取り込みの後、アポタグ（ApopTag）キットを使用して細胞アポトーシスをモニタリングした。実験は、カスパーゼ阻害剤及び特異的カスパーゼに対する抗体の存在下で実施した。
【０２２９】
サイトカイン及び腫瘍により誘導される血管新生のアッセイ
CAMへと移植された血管新生因子及び腫瘍細胞は、新たな毛細血管の成長を刺激する。10日ニワトリ胚に由来するCAMにおいて、以前には無血管であった領域に移植されたVEGF又はbFGFのフィルターにより、血管新生を誘導した。異なる処理（ペネトラチンペプチド及び対照）を局所適用し、3日後、フィルター及び周囲のCAMを切除しホルマリンで固定した。立体顕微鏡を用いて、CAMの焦平面内で、ディスクに侵入した血管の数を定量した。各群8個のCAMからの血管数の平均値及び標準誤差を比較した。
【０２３０】
リン酸化及びリン酸化されたファージライブラリのパニング
srcファミリーのプロテインキナーゼ（Fyn、c-Src、Lyn、及びSyc）、並びにMAPキナーゼのようなセリン/トレオニンキナーゼによるペプチドライブラリのリン酸化を、以前に記載されたようにして実施した（Schmitzら、1996；Denteら、1997；Gramら、1997）。簡単に説明すると、20％ポリエチレングリコール8000を含む2.5M NaClによる二重沈殿により、培養上清からファージ粒子を収集した。粒子を1012個/mlで溶解させた。精製されたファージ（10μl）を、50μlの反応緩衝液容量で、異なる濃度（35〜3,500単位）のプロテインキナーゼと共に、室温で3時間インキュベートした。リン酸化されたペプチドを表示しているファージを選択するため、反応混合物を、10μgのアガロースと接合した抗P-Tyr、抗P-Ser、又は抗P-Thrモノクローナル抗体を含むチューブに移した。結合したファージを、0.3mlの溶出緩衝液（0.1 M NaCl/グリシン/1mg/ml BSA、pH2.35）でカラムを洗浄することにより溶出させた。溶出液を2Mトリス塩基で中和し、2mlの対数増殖期中期（mid-log）の細菌培養物と共にインキュベートした。その一部20μlを播種のため取り出し、記載されているようにしてファージを採集した。リン酸化から選択までの工程を繰り返した。β3及びβ5の細胞質ドメインと結合するリン酸化されたペプチドを、先のセクションに記載されたようにして分析した。
【０２３１】
β3及びβ5の細胞質ドメイン上のリン酸化部位、並びに細胞質ドメイン結合ペプチドをインビトロでマッピングするため、マトリックス支援レーザーデソープション飛行時間型（Matrix-assisted laser desorption time-of-flight）（MALDI-TOF）質量分析計を使用した。融合タンパク質又はペプチドを記載されたようにしてインビトロでリン酸化し、RP-HPLC又はRPマイクロチップカラムにより精製した。リン酸化されたペプチドを、三つの方法により同定した。（1）キナーゼ反応後の80Daの質量シフト；（2）ホスファターゼ処理後の80Daの欠損；又は（3）チロシンリン酸化ペプチド又はセリン、トレオニンリン酸化ペプチドについての、リニア（linear）モードに対するリフレクター（reflector）モードでのそれぞれ80Da又は98Daの欠損。必要に応じて、ペプチドをRP-HPLCにより精製し、配列ラダーを作製するため、カルボキシペプチダーゼ及びアミノペプチダーゼによる消化に供した。これは、1個のペプチドが2個またはそれ以上のリン酸化部位を内含している場合に特に有用であった。
【０２３２】
リン酸化されたGST-融合タンパク質に対するパニング
GST融合タンパク質を記載されたようにしてインビトロでリン酸化した（Schmitzら、1996；Denteら、1997；Gramら、1997）。簡単に説明すると、10μg/mlを、5.5単位のFynプロテインキナーゼを含む反応緩衝液（50 mM Tris、5mM MgCl2、500μM Na3VO4、 500μM ATP、全容量50μl）と共に室温で3時間インキュベートした。40％のTCAを添加することにより、反応を停止させた。キナーゼ基質タンパク質を沈殿させた後、それをPBSに再懸濁させ、マイクロタイターウェル上に10μg/ウェルでコーティングした。CX7Cライブラリの一部（2.5×1011形質導入単位）をGST融合タンパク質上でインキュベートした。ランダムに選択されたクローンから、ファージを配列決定した。
【０２３３】
質量分析研究
質量分析によるペプチド質量マッピングを、β3及び/又はβ5の細胞質ドメインの新規リガンドを同定するために使用した。細胞質ドメイン結合ペプチドに対して産生させたポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を、標的タンパク質（細胞骨格分子又はシグナル伝達分子）を精製するために使用した。これらのタンパク質をSDS-PAGEにより分離し、SDSゲルから切り出し、トリプシンでゲル内消化した。ペプチドの抽出後、ペプチド質量のリストを作製するためMALDI-TOF質量分析を実施した。このペプチド質量のリストは、プロテアーゼ特異性と組み合わされ、配列データベースを検索するために使用されうる比較的特異的な「サイン」を与える。タンパク質配列がデータベース内に存在する場合には、この方法により、高い信頼性でタンパク質が同定されうる。この手法の検出下限は、現在のところ、N末端エドマン配列決定法よりも少なくとも10〜20倍低い1pmolである。
【０２３４】
結果
β3及びβ5の細胞質ドメインに対するファージペプチドライブラリのパニング
β3及びβ5の細胞質ドメインと結合するタンパク質を、マイクロタイターウェルにコーティングされたGST-β3cyto又はGST-β5cytoのいずれかを含む組換えGST融合タンパク質を用いた複数のファージライブラリのスクリーニングにより単離した。固定化GSTを、各細胞質ドメインのパニングにおける濃縮についての陰性対照として使用した。他に開示されたようにして（Koivunenら、1995；Pasqualiniら、1995）、3回のパニングの後、ランダムに選択されたクローンからファージを配列決定した。β3又はβ5細胞質ドメインと特異的に相互作用する別個の配列が単離された（表9）。2回目及び3回目のパニングからランダムに選択されたクローンを配列決定した。ファージミドによりコードされたペプチドのアミノ酸配列を、ヌクレオチド配列から推定した。示されたライブラリを用いたパニングの後、最も高頻度に見出されたモチーフが、表9に示されている。比率は、β3-GSTでコーティングされたウェルから回収されたコロニーの数を、GST又はBSAから回収されたもので割ることにより計算した。
【０２３５】
【表９】
β3又はβ5の細胞質ドメインと結合するファージにより表示された配列
Figure 0005077862
【０２３６】
β3又はβ5の細胞質ドメインとの相互作用の特異性を、細胞質ドメイン含有融合タンパク質（β3又はβ5）と結合したファージの数と、GST単独（陰性対照）の数との比率を計算することにより決定した。図9は、GST-β3cyto結合ファージを用いて実施された結合アッセイからの結果を示している。2回目及び3回目のパニングにおいて最も高頻度に見出されたモチーフを表示していた6個のファージを試験した。各パネルは、示されたようなβ3細胞質ドメインと結合する異なるペプチドを表示していたファージについての結合アッセイからの結果を示している。挿入物非含有ファージ、又は未選択のライブラリが、陰性対照として使用され、それらは、バックグラウンドを超える結合を示さなかった。各アッセイについて二つの播種希釈率が示されている。
【０２３７】
β5細胞質ドメイン融合タンパク質を含むスクリーニングにおいて単離されたファージの特異性を決定するため、類似の戦略を使用した。結合アッセイは、図10に示される個々に増幅されたファージを用いて実施した。2回目及び3回目のパニングにおいて最も高頻度に見出されたモチーフを表示していた5個のファージを試験した。各パネルは、β5細胞質ドメインと結合するペプチドを表示していたファージについての結合アッセイを示している。挿入物非含有ファージ、又は未選択のライブラリが、陰性対照として使用され、それらは、これらのアッセイにおいて、バックグラウンドを超える結合を示さなかった。
【０２３８】
選択されたモチーフの結合が各細胞質ドメインに特異的であるか否かを決定するため、個々のファージモチーフの、β1、β3、又はβ5細胞質ドメイン融合タンパク質との相互作用を比較する結合アッセイを実施した。抗GST抗体を用いたELISAは、3個のタンパク質が、等しい効率でプラスチックへとコーティングされうること、及び従って結合の差がコーティング濃度の差を反映するのではないことを示した（示していない）。β3で選択されたファージ及びβ5で選択されたファージの両方が、最初に選択されたタンパク質と選択的に相互作用し、β3/β1＝3.9、β3/β5＝3.7、β5/β1＝4.8、及びβ5/β3＝6.9という平均結合選択性が観察された（示していない）。BSAに対するインテグリン細胞質ドメインへの平均選択性は、約1〜2桁大きかった（示していない）。試験されたファージは、いずれも、β1細胞質ドメインとは強く結合しないようであった（示していない）。
【０２３９】
インテグリン細胞質ドメイン結合ファージにより表示された配列に相当する合成ペプチドの特徴決定
結合特性に基づき、さらなる研究のため、特定のファージを選択した。各ファージにより表示された配列に相当する合成ペプチドを、結合阻害研究を実施するために使用した。このアッセイにより、ファージ結合が各ファージにより表示されたターゲティングペプチドにより完全に媒介されるのか、又は非特異的成分も含んでいるのか、が決定された。予想通り、合成ペプチドは、用量依存的に対応するファージの結合を阻害した（図11及び図12）。無関係のアミノ酸を含む対照ペプチドは、同一濃度で試験した場合、ファージ結合に対する効果を有していなかった。
【０２４０】
リン酸化事象が、選択されたペプチドの細胞質ドメインとの相互作用を調整する
リン酸化を含む事象は、シグナル伝達の制御において重要である。ファージディスプレイ系を、二つのレベルでチロシンリン酸化の効果を評価するために使用した。第一に、β3又はβ5の細胞質ドメインを含む組換え融合タンパク質を、チロシン含有ペプチドを表示しているファージライブラリのパニングに使用した。第二に、細胞質ドメイン自体をリン酸化した後、ファージ選択を実施した。特定のチロシンキナーゼの、選択されたペプチドの細胞質ドメインとの相互作用を調整する能力を調査するための実験を、実施した。チロシン含有ペプチドを表示しているファージライブラリのパニングにおいて得られた結果は、表10に示されている。
【０２４１】
3回目及び4回目からランダムに選択されたクローンを、Fynによりリン酸化されたX4YX4ライブラリから配列決定した。ファージミドによりコードされたペプチドのアミノ酸配列を、ヌクレオチド配列から推定した。表10は、示されたライブラリをβ3又はβ5でパニングした後、最も高頻度に見出されたモチーフを示している。β3又はβ5との結合の比率は、パニング後に見出されたβ3又はβ5コロニーの数を、GST又はBSAコロニーの数で割ることにより計算した。β3又はβ5のFynによりリン酸化されたファージとの結合の、未リン酸化ファージとの結合に対する比率を、パニング後に見出されたコロニーの数を割ることにより計算した。
【０２４２】
【表１０】
インテグリン細胞質ドメインと結合するリン酸化されたファージにより表示された配列
Figure 0005077862
【０２４３】
細胞質ドメイン結合の親和性及び特異性に対するリン酸化の効果を調査した。β3及びβ5の細胞質ドメインと結合するペプチドを表示しているファージを、Fynキナーゼを使用して、以前に記載されたようにして（Schmitzら、1996；Denteら、1997；Gramら、1997）、インビトロでリン酸化した。ファージ表面上のチロシン含有ペプチドの特異的リン酸化を、キナーゼ反応において32P-γdATPを使用し、ファージpIIIタンパク質をSDS-PAGEで分離することにより確認した。
【０２４４】
インビトロでリン酸化されたファージは、β3インテグリン細胞質ドメインとの結合の親和性及び特異性の増加を示した（図13）。TLRKYFHSS（配列番号：120）ファージを、特異性を決定するため、他のGST細胞質ドメイン融合タンパク質を含むアッセイにおいても試験した（図14）。
【０２４５】
インテグリン結合ペプチドと既知の細胞骨格タンパク質及びシグナル伝達タンパク質との配列類似性
インテグリン細胞質ドメイン結合ファージにより表示されたペプチドは、細胞骨格タンパク質及びシグナル伝達に関与しているタンパク質に見出されるいくつかの領域と類似していた（表11）。単離ペプチドのいくつかと、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ5のある領域（MAPK5、アミノ酸227〜234）との類似性は、特に興味深かった。MAPKカスケード、細胞の接着、遊走、及び増殖を含む関連が提唱されている（Linら、1997）。
【０２４６】
【表１１】
インテグリン結合ペプチドと、既知の細胞骨格タンパク質及びシグナル伝達タンパク質との配列類似性
Figure 0005077862
【０２４７】
膜透過性ペプチド
ペネトラチンは、親水性化合物に原形質膜を通過させることができるペプチドである。浸透部分との融合は、明らかな崩壊なしに、オリゴペプチドを細胞質、核、又はその両方へと直接的にターゲティングすることを可能にする（Derossiら、1994）。この膜透過性ペプチドは、ショウジョウバエ（Drosophila）転写因子（Jolietら、1991a、1991b ；Le Rouxら、1993）であるアンテナペディアのホメオドメインのアミノ酸43〜58に相当する16残基
Figure 0005077862
からなる。ペネトラチンにより媒介される取り込みは、37℃及び4℃の両方で起こり、取り込まれたペプチドは細胞から完全な状態で回収されうる。
【０２４８】
β3又はβ5の細胞質ドメインと結合することが見出されたモチーフの配列と融合したペネトラチン配列を含むペプチドを設計した。ペプチドは、p-ヒドロキシメチルフェノキシメチルポリスチレン（HMP）樹脂及び標準的なFmoc化学を使用して、431アプライドバイオシステムズ（Applied Biosystems）ペプチド合成機で合成した。ペプチドの取り込み及び可視化は、記載されているようにして（Derossiら、1994；Hallら、1996；Theodoreら、1995）、実施した。
【０２４９】
簡単に説明すると、10〜50μg/mlのビオチン化ペプチドを細胞培養物へ添加した。ペプチドを、播種された細胞と共にインキュベートした。2〜4時間後、培養物を組織培養培地で3回洗浄し、固定し、エタノール：酢酸（9：1）を使用して、-20℃で5分間、透過処理した。培養物を、10％ウシ胎仔血清（FCS）及び0.02％Tweenを含むトリス緩衝生理食塩水（TBS）と共に30分間インキュベートすることにより、非特異的タンパク質結合部位をブロッキングした。培養物を、FITCと接合したストレプトアビジン（1：200希釈）を含む同緩衝液の中でインキュベートし、TBSで洗浄した後、共焦点顕微鏡検による視察のため設置した。ペネトラチンと連結されたペプチドは、極めて効率的に取り込まれた（データは示していない）。
【０２５０】
機能データは、β3又はβ5に対して選択された細胞質ドメイン結合ペプチドが、インテグリンにより媒介されるシグナル伝達及びその後の細胞応答（即ち、内皮細胞の接着、拡散、増殖、遊走）を妨害しうることを示した。ファージスクリーニングにより見出された合成モチーフ（SDNRYIGSW、配列番号：97；及びCEQRQTQEGC、配列番号：93；β3結合ペプチド、並びにVVISYSMPD、配列番号：112；β5結合ペプチド）の「取り込み可能」型の市販のパネルを得た。これらの複合キメラペプチドは、ペネトラチンとカップリングした、β3又はβ5細胞質ドメイン結合ペプチドのうちの最も選択的なもの+完全細胞へと取り込まれた後のペプチドの追跡を可能にするためのビオチン部分からなる。これらの膜透過性型のペプチドは、取り込まれ、β3及びβ5のリガンド結合後の細胞事象に影響を与え、多量のアポトーシスを誘導しうる（データは示していない）。
【０２５１】
内皮細胞の増殖、走化性、及びアポトーシス
β3及びβ5インテグリン細胞質ドメイン結合モチーフの、内皮細胞増殖に対する効果を、内皮細胞を活性化する因子による刺激の後、評価した（図15）。細胞増殖は、パスカリーニ（Pasqualini）およびエルマー（Hemler）（1994）に従い測定した。簡単に説明すると、4×104個のHUVECを24ウェルプレートでインキュベートし、24時間枯渇状態にし、その後、培地を除去し、VEGF及び15μMの各ペプチドの存在下で交換した。さらに18時間のインキュベーションの後、50μlの[3H]チミジン（1μCi/ml）を含む培地をウェルに添加した。さらに6時間37℃でインキュベートした後、培地を除去し、細胞を10％TCAで4℃で30分間固定し、エタノールで洗浄し、0.5N NaOHで可溶化した。LS 6000SCベックマン（Beckman）シンチレーションカウンターを使用することにより、液体シンチレーションにより放射能を計数した。各実験を3通り3回実施し、結果を平均値±SDで表した。
【０２５２】
β3及びβ5インテグリン細胞質ドメイン結合モチーフの、内皮細胞遊走に対する効果を、内皮細胞を活性化する因子による刺激の後、評価した。試験されたペプチドは、用量依存的かつ特異的に細胞機能に影響を与えた。それらの特性は、β3又はβ5細胞質ドメインに内在性のものと考えられる（図16）。
【０２５３】
走化性アッセイ
細胞遊走は、48ウェルマイクロケモタキシスチャンバーにおいてアッセイした。8μm孔を有する、ポリビニルピロリドンを含まないポリカーボネートフィルターを、室温で10分間1％ゼラチンでコーティングし、2％FCSが補足されたM199培地で平衡化した。ペプチドを含む2％FCS、20ng/ml VEGF-A（R＆D System）、及び1U/mlヘパリンが補足されたM199を、ボイデンチャンバーの下室に置いた。一晩、枯渇状態にしたサブコンフルエントの培養物を迅速にトリプシン処理し、最終濃度2×106個/mlで、2％FCSを含むM199培地に再懸濁させた。フィルターを下チャンバーと上チャンバーの間に置いた後、50μlの細胞懸濁液を上室に蒔いた。5％CO2を含む湿潤雰囲気中で37℃で5時間、細胞を遊走させた。次いで、フィルターを除去し、上側の細胞を、ゴムポリスマンを用いて剥離した。遊走した細胞をメタノールで固定し、ギムザ溶液で染色した。各ウェル内の5個のランダムな高倍率視野（40倍）を計数した。結果は、両方のβ3インテグリン細胞質ドメイン結合ペプチドが細胞の遊走を増加させたが、ペネトラチンは細胞に影響を与えなかったことを示している。
【０２５４】
アポトーシスアッセイ（ヨウ化プロピジウム（PI）染色サブジプロイド集団）
およそ1×106個の細胞を完全培地中に採集し、15μMのペプチドを4時間、8時間、又は12時間添加した。次いで、細胞をPBSで洗浄し、0.5mlのヨウ化プロピジウム溶液（50μg/ml PI、0.1％Triton X-100、0.1％クエン酸ナトリウム）に再懸濁させた。4℃での24時間のインキュベーションの後、細胞を、488nmレーザーを用いてXLコールター（Coulter Corporation）で計数し；各ヒストグラムについて12,000個の細胞を計数し、細胞周期分布をマルチサイクルプログラムで分析した。
【０２５５】
VISY-ペネトラチンキメラによる細胞の処理は、アポトーシスの誘導をもたらした（図17、パネルd）。細胞を他の増殖因子に曝露した場合には、アポトーシス促進効果は観察されなかった（示していない）。ペネトラチン単独及び他のペネトラチンキメラも、類似の効果を誘導することができなかった（図17、パネルc）。この所見は、血管新生を阻害するための新規な手法が、インテグリンターゲティングペプチドの使用に基づき開発されうることを示している。
【０２５６】
細胞質ドメイン結合ペプチドによる免疫、及び得られた抗体の特徴決定
標準的な技術を使用して、αvβ3結合ペプチド及びαvβ5結合ペプチドを認識するポリクローナル抗体を、合成ペプチドを用いて作製されたKLH接合体を使用して生成させた。2個の異なる合成ペプチドに対する抗体を作製した（図18）。血清は、ウェスタンブロット分析により示されるように、固定化ペプチドを認識するだけでなく、全細胞抽出物中の特異的タンパク質も認識する（図19）。
【０２５７】
ウサギを、SDNRYIGSW（配列番号：97）-KLH接合体又はGLDTYRGSP（配列番号：96）-KLH接合体で免疫した。各ウサギに、200μgのKLHと接合したペプチドを含む完全フロイントアジュバントを注射した。20〜60日後、ウサギに100μgの不完全フロイントアジュバントを注射した。3回目の免疫後、血清を収集した。最初の免疫の前に得られた免疫前血清を、実験において付加的な対照として使用した。
【０２５８】
ポリクローナル抗体をELISA、ウェスタンブロット、及び免疫沈降により試験した。ELISAアッセイにおいては、マイクロタイターウェルプレートに10μg/mlのペプチドをコーティングした。プレートを37℃で乾燥させ、PBS+3％BSAでブロッキングし、異なる血清希釈物を含むPBS+1％BSAと共にインキュベートした。洗浄及び二次抗体とのインキュベーションの後、アルカリホスファターゼ基質を添加し、抗体結合を405nmで比色検出した。マウスポリクローナル血清及びウサギポリクローナル血清の両方で観察された反応性は、高度に特異的であった。全ての場合に、抗体結合は、免疫に使用された対応するペプチドによるプレインキュベーションにより消失したが、対照ペプチドによっては消失しなかった（図18及び図19）。2個のβ3細胞質ドメイン結合ペプチドに対して産生された抗体は、35S標識抽出物を使用した免疫沈降実験において、全細胞抽出物上の特異的バンドを認識する。ポリクローナル血清及び精製されたIgGで、類似の結果が得られた（示していない）。
【０２５９】
本実施例は、細胞受容体の特定のドメインに対するターゲティングペプチドが、ファージディスプレイにより同定されうることを示している。そのようなペプチドは、エンドスタチンのような細胞受容体の内因性リガンドを同定するために使用されうる。さらに、ペプチド自体が、治療効果を有する場合もあるし、又はより有効な治療剤の同定のための基礎として有益である場合もある。ここで同定されたエンドスタチンターゲティングペプチドは、細胞へと導入した場合、細胞の増殖、走化性及びアポトーシスに対する効果を示した。当業者であれば、本発明が、開示されたペプチド又は治療効果に限定されないことを理解するであろう。その他の細胞受容体及びリガンド、並びにそれらの阻害剤及び活性化剤も、開示された方法により同定されうる。
【０２６０】
実施例7. インテグリン結合ペプチドによるアポトーシスの誘導（エンドタノス（Endothanos））
実施例9は、ペネトラチンへの結合により細胞へと輸入されたVISYペプチド（VVISYSMPD、配列番号：112）が、HUVEC細胞においてアポトーシスを誘導しうることを示した。ここでアネキシンVとして同定されたペプチドの内因性細胞類似体を同定するため、VISYペプチドに対して産生された抗体が使用された。結果は、アネキシンVが、新規アポトーシス経路に関与しているインテグリンの内因性リガンドであることを示している。
【０２６１】
方法
タンパク質精製
前記実施例9に記載の方法を使用して、VISYペプチド（VVISYSMPD、配列番号：112）に対するポリクローナル抗体を調製した。MDA-MB-435乳癌細胞を、内因性VISYペプチド類似体の精製のため使用した。細胞を氷冷PBSで3回洗浄し、冷水で20分間溶解させた。膜画分から細胞質画分を分離するため、細胞抽出物を100,000×gで30分間遠心分離した。細胞質画分をゲル濾過カラム（10〜50kDa）及び陰イオン交換カラム（monoQ）でのカラムクロマトグラフィに供した。陰イオン交換カラムを、50mM〜1M NaClの塩勾配で溶出させた。1ml画分を収集し、SDS-PAGEを実行し、抗VISY抗体と反応性の内因性タンパク質の存在に関してウェスタンブロッティングにより試験した。36kDaの抗体反応性バンドを含む目的の画分は、約300mM NaClで溶出した。
【０２６２】
36kDaは、抗VISY抗体との陽性の反応性を示す画分に必ず出現した。画分をSDS-PAGE及び2Dゲル電気泳動、続いてウェスタンブロッティングにより分析した。カラムクロマトグラフィの後、36 kDaタンパク質の実質的な濃縮が見られた（示していない）。36 kDaペプチドをSDS-PAGEゲルから切り出し、その配列を得るため質量分析により分析した。質量分析により得られた5個のペプチド配列は、全て、報告されているアネキシンVの配列（GenBankアクセッション番号GI_468888）との100％の相同性を示した。435細胞における存在に加え、36 kDaバンドは、カポジ肉腫細胞、SKOV細胞、及びHUVEC細胞にも見られた（示していない）。
【０２６３】
市販のアネキシンVに対する抗体を入手した（Santa Cruz Biologics、Santa Cruz、CA）。抗VISY抗体及び抗アネキシンV抗体を使用して、競合ウェスタンブロットを実施した。両方の抗体が、36 kDaタンパク質との反応性を示した（示していない）。これらの結果は、VISYペプチドの内因性タンパク質類似体がアネキシンVであることを示している。
【０２６４】
アネキシンV及びβ5細胞質ドメインによるタンパク質-タンパク質相互作用
アネキシンVのβ5インテグリンとの結合、及びVISYペプチドの効果を調査するため、競合結合アッセイを実施した。プレートに様々なインテグリンの細胞質ドメインのGST融合タンパク質をコーティングし、アネキシンVをプレートに添加した。抗アネキシンV抗体を使用して、アネキシンVの結合を決定した。図20Aに示されるように、アネキシンVはGST-β1インテグリンともGST-β3インテグリンとも結合しなかった。アネキシンVは、GST-β5インテグリンと強く結合したが、結合は使用された緩衝液に依存していた（図20A）。トリス緩衝生理食塩水（TBS）においては低い結合が観察され、カルシウム（2mM）が添加された、又は添加されていない「細胞質緩衝液」（100 mM KCl、3mM NaCl、3.5 mM MgCl2、10mM PIPES、3mM DTT）では高い結合が観察された（図20A）。カルシウムは、アネキシンV活性がカルシウムにより調整されることが報告されているため、使用した。アネキシンVのGST-β5との結合は、VISYペプチドの添加により阻止された（図20A）。図20Bは、抗アネキシンV抗体の精製されたアネキシンV及びVISYペプチドとの結合の相対レベルを示している。
【０２６５】
プレートのコーティングにアネキシンVを使用し、インテグリン細胞質ドメインのGST融合タンパク質を添加する、逆の実験を実施した。抗GST融合タンパク質抗体を使用して結合を評価した。予想通り、GST-β5のみがアネキシンVとの実質的な結合を示し、GST-β1及びGST-β3は、低レベルのアネキシンV結合を示した（示していない）。いくつかの実験において、カルシウムの存在下では減少した結合が観察され、カルシウムイオンは、GST-β5とアネキシンVとの結合相互作用を妨害すると考えられた（示していない）。カルシウムの存在下（67％阻害）では、カルシウムの非存在下（45％）よりも大きい程度のVISYペプチドによるアネキシンVのGST-β5との結合の阻害が観察された（図20A）。
【０２６６】
β5細胞質ドメインと結合するペネトラチンペプチドキメラはプログラム細胞死を誘導する
実施例9において示されたVISYペプチドによるアポトーシスの誘導を確認した。106個のHUVEC細胞を15μMのVISYアンテナペディア（ペネトラチン）キメラ、又は15μMのアンテナペディアペプチド（ペントラチン（pentratin））単独で2〜4時間処理し、アガロースゲル電気泳動によりクロマチン断片化を分析した。図21は、クロマチン断片化により示されるようなVISY-Ant（ペネトラチン）によるアポトーシスの誘導を示している。VISYも、ペネトラチンも、単独ではアポトーシスを誘導しなかった。アポトーシスの誘導は、カスパーゼ阻害剤（zVAD、カスパーゼインヒビター（caspase inhibitor）I、Calbiochem #627610、San Diego、CA）をVISYキメラペプチドと同時に培地へ添加した場合に、最大70％阻害された。
【０２６７】
VISYペプチドにより誘導された細胞死の機構と他のアポトーシス促進剤によるものとの相違点は、細胞培養物において評価された他のアポトーシス機構には、細胞死の前に基質からの細胞の脱離が含まれる点である。対照的に、VISYにより誘導される細胞死においては、細胞は細胞死前に基質から脱離しない。従って、エンドタノス（内からの死）は、アノイキス（anoikis）（ホームレスネス（homelessness））とは異なっていると考えられる。
【０２６８】
実施例9及び本実施例の結果は、VISYペプチドがインテグリン依存性アポトーシス経路を活性化することを示している。本実施例は、VISYペプチドの内因性類似体がアネキシンVであることを示している。これらの結果は、アネキシンVとβ5インテグリンとの間の相互作用により媒介され、かつカスパーゼ活性に依存している新規アポトーシス経路の存在を証明している。この新規アポトーシス機構は、エンドタノスと呼ばれる。当業者であれば、アポトーシスを誘導又は阻害するための新規機構が、癌療法のような多様な用途に有用であることを理解するであろう。
【０２６９】
実施例8. 受容体/リガンド対の同定：アミノペプチダーゼAは内皮細胞機能及び血管新生を制御する
腫瘍血管の内皮細胞は、特異的な血管新生マーカーを発現する。アミノペプチダーゼA（APA、EC 3.4.11.7）は、血管新生中の微小血管においてアップレギュレートされる。APAは、オリゴペプチドからN末端のグルタミル残基又はアスパルチル残基を加水分解するホモダイマーの膜結合型亜鉛メタロペプチダーゼである（Nanusら、1993）。インビボで、APAは、アンジオテンシンIIをアンジオテンシンIIIへと変換する。レニン-アンジオテンシン系は、いくつかの内分泌機能、心血管機能、及び行動的機能の制御において重要な役割を果たしている（Ardaillou、1997；StrothおよびUnger、1999）。最近の研究は、血管新生におけるアンジオテンシンの役割も示唆しているが（Andradeら、1996）、血管新生過程におけるAPAの機能は、従来検討されていない。
【０２７０】
本実施例においては、APA発現細胞に対してファージライブラリをスクリーニングすることにより、APAと結合することができるターゲティングペプチドが同定された。モチーフCPRECESIC（配列番号：123）を含むAPA結合ペプチドは、APA酵素活性を特異的に阻害した。可溶性CPRECESIC（配列番号：123）ペプチドはインビトロで内皮細胞の遊走、増殖、及び形態形成を阻害し、ニワトリ胚絨毛尿膜（CAM）アッセイにおいてインビボの血管新生を妨害した。さらに、APAヌルマウスは、未成熟マウスにおける低酸素により誘導される網膜症において、野生型（wt）マウスと比較して減少した量の網膜血管新生を有していた。これらの結果は、血管新生におけるAPAの役割のよりよい理解、及び新たな抗腫瘍治療戦略の開発をもたらしうる。
【０２７１】
材料及び方法
細胞培養
腎癌細胞系SK-RC-49に、全長APA cDNA（Gengら、1998）をコードする発現ベクターをトランスフェクトした。細胞を、2mMグルタミン、1％非必須アミノ酸、1％ビタミン（Gibco BRL）、100U/mlストレプトマイシン、100U/mlペニシリン（Irvine Scientific）、10mMピルビン酸ナトリウム（Sigma-Aldrich）、及び10％ウシ胎仔血清（FCS）（Tissue Culture Biological、Tulare、CA）が補足されたMEM（Irvine Scientific、Santa Ana、CA）の中で維持した。安定的にトランスフェクトされた細胞を、G418含有培地中で維持した。HUVECをコラゲナーゼ処理により単離し、1〜4代の間で使用した。細胞を、ゼラチンでコーティングされたプラスチック上で、20％FCS、ペニシリン（100 U/ml）、ストレプトマイシン（50μg/ml）、ヘパリン（50μg/ml）、ウシ脳抽出物（100μg/ml）が補足されたM199培地（Sigma）の中で増殖させた。培地補助剤は、全て商業的に入手した（Life Technologies,Inc.、Milan、Italy）。
【０２７２】
抗体及びペプチド
抗APA mAb RC38（Schlingemannら、1996）を、トランスフェクトされた細胞溶解物からAPAを免疫捕獲（immunocapture）するために使用した。CPRECESIC（配列番号：123）及び GACVRLSACGA（配列番号：124）環状ペプチドを化学合成し、非還元条件下で自発的に環状化させ、質量分析（AnaSpec San Jose、CA）により精製した。CPRECESIC（配列番号：123）ペプチドの質量分析機分析は、おそらくは異なるジスルフィド結合の位置及びダイマーの形成を反映している6個の異なるピークを明らかにした。異なる画分のAPA酵素活性に対する生化学的挙動は類似していたため、下記の全ての手順において、6個のピークの混合物を使用した。
【０２７３】
APA免疫捕獲
セミコンフルエントのプレートから、100 mM N-オクチル-β-グルコピラノシド（Calbiochem）を含む冷PBSへと細胞を剥離し、氷上で2時間溶解させ、13,000×gで15分間遠心分離した。マイクロタイター丸底ウェル（Falcon）に、2μgのRC38を室温で4時間コーティングし、室温で1時間、PBS/3％BSA（Intergen、Purchase、NY）でブロッキングし、その後、150μlの細胞溶解物（1mg/ml）をmAbでコーティングされたウェル上で4℃で一晩インキュベートし、PBS/0.1％Tween-20（Sigma）で5回洗浄し、PBSで2回洗浄した。
【０２７４】
APA酵素アッセイ
細胞及び免疫捕獲されたタンパク質を、リルン（Liln）ら（1998）に従い、特異的酵素活性について試験した。簡単に説明すると、接着細胞又はRC38で免疫捕獲された細胞の抽出物を、3mM α-L-グルタミル-p-ニトロアニリド（Fluka）及び1 mM CaCl2を含むPBSと共に、37℃で2時間インキュベートした。マイクロプレートリーダー（Molecular Devices、Sunnyvale、CA）で405nmにおける吸光度（O.D.）を読み取ることにより、酵素活性を決定した。
【０２７５】
細胞パニング
CX3CX3CX3C（Cはシステインであり、Xは任意のアミノ酸である）ライブラリを調製した（Rajotteら、1998）。ファージ粒子の増幅及び精製、並びにファージ表示された挿入物のDNA配列決定を、前記と同様にして実施した。2.5mM EDTAを含むPBSとのインキュベーションにより細胞を脱離させ、結合培地（20mM HEPES及び2％FCSが補足されたDMEMハイグルコース）で1回洗浄し、2×106細胞/mlの濃度で同培地に再懸濁させた。1010TUのファージを500μlの細胞懸濁液に添加し、混合物を穏和に回転させながら一晩（1回目）又は2時間（後続回）4℃でインキュベートした。細胞を室温で結合培地で5回洗浄し、100μlの同培地に再懸濁させた。1mlの対数増殖期K91kan大腸菌を添加し、混合物を室温で1時間インキュベートすることにより、ファージをレスキューした。細菌を、10mlの0.2μg/mlテトラサイクリンが補足されたLB培地で希釈し、室温でさらに20分間インキュベートした。段階希釈物を40μg/mlテトラサイクリンを含むLBプレートに播き、プレートを37℃で一晩インキュベートした後、コロニーを計数した。
【０２７６】
ファージ結合特異性アッセイ
細胞パニングについて記載したようにして、109TUの入力量を用いて細胞結合アッセイを実施した。増加性の濃度でCPRECESIC（配列番号：123）ペプチドを結合培地へ添加することにより、特異性を確認した。ファージを免疫捕獲されたAPAと結合させるため、ウェルをPBS/3％BSAで室温で1時間ブロッキングし、50μlのPBS/3％BSA の中で109TUと共に室温で1時間インキュベートした。PBS/1％BSA/0.01％Tween-20で8回洗浄し、PBSで2回洗浄した後、200μlの対数増殖期K91kan大腸菌を添加することにより、ファージをレスキューした。各実験を少なくとも3回繰り返した。
【０２７７】
APA結合ファージのインビボ腫瘍回帰
MDA-MB-435に由来する腫瘍異種移植片を、2ヶ月齢の雌ヌードマウス（Jackson Labs、Bar Harbor、Maine）で確立した。マウスにアバーチン（Avertin）麻酔を施し、109TUのファージを含む200μl容量のDMEMを尾静脈から静脈注射した。ファージを5分間循環させ、5mlのDMEMで心臓を通って動物を還流した。各マウスから腫瘍及び脳を切除し、計量し、等量の組織をホモジナイズした。組織ホモジネートを、プロテイナーゼ阻害剤カクテル及び0.1％BSAを含む氷冷DMEMで3回洗浄した。結合したファージをレスキューし、細胞パニングについて記載したようにして計数した。Fd-tetファージを、対照として同じ入力量で注射した。その実験を2回繰り返した。平行して、同組織試料の一部をブアン溶液で固定し、組織切片の調製のためパラフィン包埋した。M-13ファージに対する抗体（Amersham-Pharmacia）を染色に使用した。
【０２７８】
細胞増殖アッセイ
HUVECを含む完全M199培地を、48ウェルプレート（104個/ウェル）に蒔き、24時間付着させた。次いで、2％FCSを含むM199培地中で24時間細胞を枯渇状態にした。CPRECESIC（配列番号：123）ペプチド又は対照GACVRLSACGA（配列番号：124）ペプチド（1 mM）を含む、2％FCS及び10ng/ml VEGF-A（R＆D System、Abingdom、UK）を含む培地を、ウェルに添加した。示された時間インキュベートした後、細胞を2.5％グルタルアルデヒドで固定し、0.1％クリスタルバイオレットを含む20％メタノールで染色し、10％酢酸で可溶化した。全ての処理を3通り行った。細胞増殖は、マイクロプレートリーダー（Biorad、Hercules、CA）で590nmのO.D.を測定することにより評価した。較正曲線を確立し、O.D.と細胞数との直線的な相関が、103〜105細胞で観察された。
【０２７９】
走化性アッセイ
細胞遊走アッセイは、ブリッソーニ（Bussolini）ら（1995）に従い、48ウェルマイクロケモタキシスチャンバー（NeuroProbe、Gaithersburg、MD）において実施した。8μm孔を有する、ポリビニルピロリドンを含まないポリカーボネートフィルター（Nucleopore、Cambridge、MA）を、室温で10分間1％ゼラチンでコーティングし、2％FCSが補足されたM199培地で平衡化した。CPRECESIC（配列番号：123）ペプチド又は対照GACVRLSACGA（配列番号：124）ペプチド（1mM）を含む、2％FCS及び10ng/ml VEGF-A（R＆D System）が補足されたM199培地を、ボイデンチャンバーの下室に置いた。一晩、枯渇状態にしたサブコンフルエントの培養物を、2.5mM EDTAを含むPBSに採集し、PBSで1回洗浄し、最終濃度2×106個/mlで2％FCSを含むM199培地に再懸濁させた。フィルターを下チャンバーと上チャンバーの間に置いた後、50μlの細胞懸濁液を上室に蒔き、5％CO2を含む湿潤雰囲気中で37℃で5時間、細胞を遊走させた。次いで、フィルターを除去し、上側の細胞を、ゴムポリスマンを用いて剥離した。遊走した細胞をメタノールで固定し、ギムザ溶液（Diff-Quick、Baxter Diagnostics、Rome、Italy）で染色した。各ウェル内の5個のランダムな高倍率視野（100倍）を計数した。各アッセイを3通り実行した。
【０２８０】
三次元細胞培養
48穴組織培養プレートのウェルに各100μlのマトリゲル（Matrigel）（Collaborative Research、Bedford、MA）を添加し、37℃で10分間、固体化させた。2％FCSが補足されたM199培地中で24時間、HUVECを枯渇状態にした後、2.5mM EDTAを含むPBSに採集した。104個の細胞を3通り各ウェルに穏和に添加し、37℃で30分間、ゲルコーティングへと接着させた。次いで、培地を、示された濃度のCPRECESIC（配列番号：123）ペプチド又はGACVRLSACGA（配列番号：124）ペプチドを含む完全培地に交換した。24時間後、倒立顕微鏡（Canon）を用いてプレートを写真撮影した。そのアッセイを3回繰り返した。
【０２８１】
CAMアッセイ
CAMアッセイ（Ribattiら、1994）によりインビボ血管新生を評価した。白色レグホンニワトリ由来の受精卵を一定の湿度で37℃で維持した。インキュベーション3日目、卵殻に四角形の窓を開け、殻から発達中のCAMを脱離させるために2〜3mlの卵白を取り出した。同サイズのガラスプレートで窓を密封し、卵をインキュベーターに戻した。8日目、1mm3の滅菌したゼラチンスポンジ（Gelfoam、Upjohn Co、Kalamazoo、Milan）に、VEGF-A（20ng、R＆D System）と、CPRECESIC（配列番号：123）又は対照GACVRLSACGA（配列番号：124）ペプチド（1mM）のいずれかとを含む3μlのPBSを吸収させ、無菌条件下で成長中のCAMの頂部に移植した。12日目まで毎日CAMを調査し、ライカ（Leica）実体顕微鏡でインオボ（in ovo）で写真撮影した。スポンジから出現した毛細血管を計数した。そのアッセイを2回繰り返した。
【０２８２】
網膜血管新生の誘導
APAヌルマウスは記載されている（Linら、1998）。P7（生後7日目）の仔マウスを授乳する母親と共に5日間75％酸素に曝露した。P12に正常酸素（大気）へとマウスを戻した。組織学的分析のため、P17〜P21にマウスを屠殺し、眼を摘出し、4％パラホルムアルデヒドを含むPBSで+4℃で一晩固定した。固定された眼をパラフィン包埋し、5μmの連続切片を切り出した。切片をヘマトキシリン/エオシン（h/e）溶液で染色した。各眼について20個のh/e染色切片から、内境界膜の硝子体側の新生血管核を計数した。切片1個当たりの新生血管核数の平均値を計算し、スチューデントt検定を使用して動物群間で比較した。
【０２８３】
結果
ファージディスプレイによる細胞パニングによりAPA結合モチーフが選択される
APAと結合することができるペプチドを同定するため、細胞をランダムペプチドファージライブラリでスクリーニングした。まず、天然コンフォメーションでのAPA発現のモデルを得るため、APAを発現していないSK-RC-49腎癌細胞に、全長APA cDNAをトランスフェクトした。トランスフェクションの結果として発現されたAPAは、APA酵素アッセイにより立証されたように機能的に活性であったが（示していない）、親SK-RC-49細胞はAPAの発現も活性も示さなかった（示していない）。
【０２８４】
非特異的結合を減少させるため、CX3CX3CX3Cファージライブラリ（1010形質導入単位［TU］）を親SK-RC-49細胞に予備吸着させた。再懸濁させたSK-RC-49/APA細胞を、親細胞と結合しなかったファージでスクリーニングした。SK-RC-49/APA結合ファージを増幅し、2回の連続的な選択のため使用した。ファージのSK-RC-49親細胞との結合と較べたファージのSK-RC-49/APA細胞との結合の増加が、2回目及び3回目に観察された（示していない）。
【０２８５】
それに続くファージの配列決定により、一般ライブラリ配列CX3CX3CX3Cのタンデム反復を含むペプチド挿入物
Figure 0005077862
の特異的な濃縮が明らかとなった。この配列は、2回目からランダムに選択され18個のファージ挿入物の50％を占め、3回目からのファージ挿入物の100％を占めていた。2回目から得られた4個のペプチド挿入物は、タンデムファージとの配列類似性を有していた（表12、太字フォント）。2回目ペプチドの中には、明らかに保存されているモチーフが他にもいくつか観察された（表12、下線又はイタリック体）。これらのうちの1個は、タンデムリピート配列と一部重複していた。選択されたペプチドのヒトデータベースに対する配列相同性の検索は、有意な一致を与えなかった。
【０２８６】
【表１２】
APA結合ペプチド配列
Figure 0005077862
【０２８７】
選択されたファージ挿入物は、特異的なAPAリガンドである
ペプチド挿入物
Figure 0005077862
を表示しているファージを、個々にAPA結合に関して試験した。3個のファージは、全て、SK-RC-49親細胞に対して6倍濃縮された類似のパターンで、特異的にSK-RC-49/APA細胞の表面と結合した（示していない）。対照の挿入物非含有ファージは、結合優先性を示さなかった（示していない）。2回目に選択されたCGTGCAVECEVVC（配列番号：128）及びその他のファージは、SK-RC-49/APA細胞との選択的結合を示さなかった（データは示していない）。APA結合ファージ挿入物を再現するコンセンサス配列を含む可溶性ペプチドCPRECESIC（配列番号：123）を合成した。
【０２８８】
CPRECESIC（配列番号：123）ペプチドの存在下で、CPKVCPRECESNC（配列番号：127）ファージを用いて結合アッセイを実施した。可溶性CPRECESIC（配列番号：123）ペプチドは、SK-RC-49/APA細胞との結合に関してCPKVCPRECESNC（配列番号：127）ファージと競合したが、SK-RC-49親細胞との非特異的結合に対する効果は有していなかった（示していない）。無関係の環状ペプチドGACVRLSACGA（配列番号：124）は競合活性を有していなかった（示していない）。
Figure 0005077862
ファージの結合も、CPRECESIC（配列番号：123）ペプチドによって置換されたが、CLGQCASICVNDC（配列番号：126）ファージの結合は影響を受けなかった（データは示していない）。
【０２８９】
選択されたペプチド挿入物の基質特異性をさらに確認するため、mAB RC38を用いた免疫捕獲により、APAでトランスフェクトされた細胞の抽出物からAPAを部分精製した。RC38でコーティングされたマイクロウェルの上に固定化されたAPAタンパク質は、酵素アッセイにより確認されたように機能性であった（示していない）。
Figure 0005077862
ファージは、RC38免疫捕獲されたSK-RC-49親細胞由来細胞溶解物とのファージの結合と比較して10〜12倍の濃縮で、免疫捕獲されたAPAと選択的に結合した（示していない）。
【０２９０】
APA結合ファージはインビボで腫瘍をターゲティングする
同定されたペプチドの、腫瘍へと回帰する能力を、ヒト乳房腫瘍異種移植片が移植されたヌードマウスをモデル系として使用して評価した。ファージを腫瘍保持マウスの尾静脈に注射し、組織ホモジネートからのファージ回収によりターゲティングを評価した。CPKVCPRECESNC（配列番号：127）ファージは、対照として使用された脳組織と比較して腫瘍移植片において4倍濃縮されていた（図22）。挿入物非含有ファージは、腫瘍をターゲティングしなかった（図22）。CYNLCIRECESICGADGACWTWCADGCSRSC（配列番号：125）ファージもCLGQCASICVNDC（配列番号：126）ファージも、腫瘍回帰優先性を示さなかった（データは示していない）。
【０２９１】
CPKVCPRECESNC（配列番号：127）の回帰は、組織切片上の抗M13免疫染色によって確認された（示していない）。腫瘍血管系には強いファージ染色が見られたが、正常血管系には見られなかった（示していない）。挿入物非含有ファージは、腫瘍血管と結合しなかった。
【０２９２】
CPRECESIC（配列番号：123）はAPA活性の特異的阻害剤である
APA酵素活性に対するCPRECESIC（配列番号：123）の効果を検討するため、SK-RC-49/APA細胞を、増加性の濃度のCPRECESIC（配列番号：123）ペプチド又は対照GACVRLSACGA（配列番号：124）ペプチドの存在下で、APA特異的基質α-グルタミル-p-ニトロアニリドと共にインキュベートした。37℃での2時間のインキュベーションの後、比色アッセイにより酵素活性を評価した。CPRECESIC（配列番号：123）は、APA酵素活性を阻害し、試験された最高濃度では活性を60％減少させた（図23）。酵素阻害に関するCPRECESIC（配列番号：123）のIC50は、800μMと計算された。CPRECESIC（配列番号：123）は、近縁のプロテアーゼであるアミノペプチダーゼNの活性には影響を与えなかった（データは示していない）。
【０２９３】
CPRECESIC（配列番号：123）は内皮細胞の遊走及び増殖を阻害する
抗血管新生薬としてのCPRECESIC（配列番号：123）ペプチドの可能性のある使用を決定した。まず、インビトロのCPRECESIC（配列番号：123）ペプチドによるAPA阻害の、VEGF-A（10ng/ml）で刺激されたヒト臍静脈内皮細胞（HUVEC）の遊走及び増殖に対する効果を調査した。HUVEC上の機能性APAの存在を、酵素アッセイにより評価した（示していない）。試験された最高濃度（1mM）において、CPRECESIC（配列番号：123）ペプチドは、ボイデンチャンバーアッセイにおいてHUVECの走化性を70％阻害した（図24）。同じペプチド濃度で、細胞増殖は50％阻害された（図25）。比較的低濃度のCPRECESIC（配列番号：123）ペプチド又はGACVRLSACGA（配列番号：124）対照ペプチドは、細胞の遊走及び増殖に対する有意な効果を有していなかった（示していない）。
【０２９４】
CPRECESIC（配列番号：123）はインビトロ及びインビボで血管新生を阻害する
異なるインビトロ及びインビボの血管新生モデルにおけるCPRECESIC（配列番号：123）ペプチドの阻害効果を調査した。三次元マトリックスゲル上に播かれたHUVECは、毛細血管様の構造へと分化し、インビトロ血管新生モデルを与える。増加性の濃度のCPRECESIC（配列番号：123）ペプチドは、このネットワークの形成の進行的な減損をもたらした（示していない）。1mMのペプチド濃度で、血管様枝分かれ構造は、有意に少なく、かつ短くなり、結果として細胞は完全なネットワーク組織を形成することができなかった（示していない）。対照ペプチドGACVRLSACGA（配列番号：124）は、HUVEC形態形成に影響を与えなかった（示していない）。
【０２９５】
一般的に使用されている単純化されたインビボ血管新生のモデルは、胚発生中に血管新生が刺激されうるニワトリ胚絨毛尿膜（CAM）である。ゼラチンスポンジに吸収された適切な刺激は、新たな毛細血管のリモデリング及び分枝により達成される微小血管のスポンジそのものへの動員を誘導する。8日齢のニワトリ卵CAMをVEGF-A単独（20ng）又はVEGF-A+CPRECESIC（配列番号：123）ペプチド又はGACVRLSACGA（配列番号：124）ペプチド（1mM）で刺激した。12日目にCAMの写真を撮影した。VEGF-Aにより誘導された血管新生は、スポンジから出現した毛細血管の数に基づき、CPRECESIC（配列番号：123）により40％阻害された（表13）。新生血管は、VEGF-A刺激後に典型的に見られた高度に枝分かれした毛細血管構造を示さなかった（示していない）。対照ペプチドGACVRLSACGA（配列番号：124）又は比較的低いペプチド濃度のCPRECESIC（配列番号：123）による処理は、成長血管の数に対する効果を有していなかった（示していない）。
【０２９６】
【表１３】
血管新生に関するCAMアッセイ
Figure 0005077862
*スチューデント-ニューマン-クールズ（Student-Newman-Keuls）検定によりp＜0.01。結果は、2回の独立の実験からの平均値及び標準誤差として表されている。
【０２９７】
APA欠損マウスは、減損した血管新生を示す
未成熟マウスにおける低酸素網膜症のモデルにおいて、APA+/-マウス及びAPA-/-ヌルマウスの血管新生能を調査した。相対的低酸素による網膜血管新生の誘導は、野生型マウスと比較してAPA+/-マウスに既に存在していた（示していない）。APAヌルマウスにおいて、血管新生はほぼ検出不可能であった（示していない）。血管新生は、低酸素眼の切片20個から硝子体の突出している新生血管核を計数することにより定量した。P7〜P12の75％酸素処理の後、網膜血管新生の有意な誘導（眼切片1個当たり16.17±1.19個の新生血管核）が生後17日目（P17）の野生型マウスにおいて見られた。P7〜P12の75％酸素曝露の後、P17のAPA+/-マウス（眼切片1個当たり10.76±1.03個の新生血管核）及びAPAヌルマウス（眼切片1個当たり4.25±0.45個の新生血管核）の網膜には、減少した量の新生血管核が見られた。
【０２９８】
考察
インビボで、APAは、腫瘍を含む活性化された微小血管により過剰発現されているが、休止期血管系にはほぼ検出不可能であり、従って血管指向腫瘍療法のための適当な標的である。本実施例は、APAの新規ターゲティングペプチドリガンドCPRECESIC（配列番号：123）を同定した。可溶性CPRECESIC（配列番号：123）ペプチドは、800μMのIC50でAPA酵素活性を阻害した。
【０２９９】
インビトロ血管新生モデルとして培養HUVECを使用した場合、可溶性CPRECESIC（配列番号：123）ペプチドは、VEGF-Aにより誘導されるHUVECの遊走及び増殖を阻害した。これらのデータは、血管新生中には内皮細胞の遊走及び増殖が必要であることと一致している。CPRECESIC（配列番号：123）は、マトリゲルモデルにおいても毛細血管様構造の形成を阻止し、VEGF-Aにより刺激されたCAMにおける血管新生を阻害した。
【０３００】
APAヌルマウスは、野生型マウスと比較して有意に低い網膜血管新生を有していたため、APAが、相対的低酸素により誘導された血管新生において重要な役割を果たしていることが示された。これらの結果は、腫瘍血管新生の阻害のための特異的な標的としてAPAを使用することの可能性を増強する。
【０３０１】
要約すると、可溶性ペプチドCPRECESIC（配列番号：123）は、選択的なAPAリガンドであり阻害剤である。CPRECESIC（配列番号：123）によるAPAの阻害は、異なるインビトロ及びインビボのアッセイにおいて血管新生を阻害し、このことから、血管新生過程におけるAPAの顕著な役割が初めて証明された。さらに、APA結合ファージは、腫瘍血管へと回帰することができ、このことは、CPRECESIC（配列番号：123）を腫瘍血管新生の阻害剤として治療的に使用することの可能性を示唆している。CPRECESIC（配列番号：123）の内因性類似体は、上に開示されたものと類似した、抗体に基づく精製又は同定の方法により同定されうる。
【０３０２】
実施例9. PALMによるファージライブラリのスクリーニング
特定の態様において、臓器または組織の不均一な試料から特定の細胞型を選択することができることが望ましい。そのような選択的サンプリングを行う一つの方法はPALM（レーザーマイクロビームによる位置決定と剥離）によることである。
【０３０３】
PALMロボットマイクロビームは、微量剥離のための正確なコンピューター誘導レーザーを用いる。パルス紫外線（UV）レーザーを顕微鏡にインターフェースで接続して、直径1マイクロメートル未満のビームスポットの大きさに対物鏡を通して焦点を合わせる。レーザー切断の原理は、加熱することなく局所的に制限された剥離的光分解プロセスである（Hendrix、1999）。有効なレーザーエネルギーは、微小な焦点スポットのみに濃縮され、ほとんどの生物学的物体は、適用されたレーザーの波長に関して透過性である。このシステムは、その後のファージ回収のために、同種の細胞集団、または単一の細胞もしくは細胞下構造を回収するための選択ツールであるように思われる。組織試料は、被験者にファージを投与後に選択域または単細胞を切除することによって回収してもよい。選択域と非選択域との明確なギャップが典型的に得られる。単離された組織標本は、対物平面から放射して、全く接触しないように、一般的な微量遠心管のキャップに直接発射することができる。このいわゆるレーザー圧発射（LPC）方法の基礎は、正確に焦点を当てたレーザーマイクロビームの極めて高い光子密度によって引き起こされた標本の下で生じたレーザー圧力であると考えられる。この組織採取技術によって、ファージは微小切除技法から生き残って、救済することができる。
【０３０４】
PALMは、本実施例において、下記のようにマウス膵臓組織に関するターゲティングファージを選択するために用いた。
【０３０５】
材料および方法
インビトロおよびインサイチューパニング
CX7Cペプチドファージライブラリ（109 TU）を、C57BL/6雄性マウスの尾静脈へ注射し、膵臓を採取して細菌感染によってファージを回収した。コロニー246個からのファージをLB/カナマイシン（100 μg/ml）/テトラサイクリン（40 μg/ml）5ml中で37℃の暗所で攪拌しながら個々に増殖させた。一晩培養物をプールして、ファージを別のインビボバイオパニングラウンドのためにNaCl/PEG沈殿によって精製した。コロニー300個を2回目のパニングラウンドから採取して、ファージを沈殿によって回収した。次に、2回目のバイオパニングラウンドからのファージをもう一回のバイオパニングラウンドのために用いて、同様に、一回のインサイチューパニングラウンドのために凍結融解したマウス膵臓切片と共にインキュベートした。
【０３０６】
3回目のインビボパニングラウンドにおいて、第二のラウンドからのファージ109 TUを第三のマウスに注射して、6分間循環させた後、FITC-レクチン（Vector Laboratories Inc.）50 μlの静脈内注射を行った。2分間循環させた後、MEM Earle塩3mlによってマウスの左心室を還流した。膵臓を採取して、Tissue Tek（Sakura）において-80℃で凍結して、調製スライドガラス上で切片にした。
【０３０７】
第三のインサイチューラウンドに関して、第二のラウンドから単離した精製ファージを、融解したマウス膵臓切片4〜14 μm切片と共に氷中で30分間インキュベートした。切片を氷冷PBS 100 μlによって室温（RT）で8回すすいだ。結合したファージを、RTで30分間〜60分間感染させるために、K91 KanR（OD600＝2.03）100 μlを加えることによって各切片から回収した。感染したK91 KanRをそれぞれの切片から回収して、LB/Kan/Tet（0.2 μg/ml）10 mlにおいて暗所で20分間回復させた。各培養物からのアリコートをLB/Kan/Tet（40 μg/ml）プレートに播種して、37℃の暗所で一晩インキュベートした。各培養物の残りのテトラサイクリン濃度を40 μg/mlに増加して、ファージを増幅および精製するために培養物を37℃の暗所で攪拌しながら一晩インキュベートした。
【０３０８】
DNA増幅
ファージは、PALM（レーザーマイクロビームによる位置決定と剥離）コールドレーザー圧発射システムを用いて14 μm切片から微小切除した、凍結保存FITC-レクチン染色マウス膵島および周辺の腺房から回収した。膵島および対照切片をpH8の1mM EDTAに発射して、PCR増幅のために十分な材料が回収されるまで-20℃で凍結した。ファージDNAを、fUSE5プライマーを用いて増幅した。
Figure 0005077862
重なり合った組のプライマーを用いて、PCR産物に、もう1回のPCRラウンドを行った。第二のプライマーの組の3'末端に、配列決定目的のためにM13リバースプライマーによってテールをつけた。用いた入れ子（nested）プライマーセットは、
Figure 0005077862
であった。隣接するSfiI制限部位を含むペプチド挿入物配列を作製するために、さらに2つのプライマーを用いた。
Figure 0005077862
入れ子プライマーから作製したPCR産物をゲル精製して（Qiagen）、自動配列決定によってM13リバースプライマーを用いてCX7Cペプチド挿入物が存在することを確認した。ライブラリプライマーから生じたPCR産物をゲル精製して（Qiagen）、CsCl2精製fUSE5/SfiIにライゲーションして、エレクトロコンピテントMC1061細胞にエレクトロポレーションして、LB/ストレプトマイシン（100 μg/ml）/テトラサイクリン（40 μg/ml）寒天プレート上に播種した。ゲル電気泳動によってCX7C挿入物配列の存在を確認するために、単一のコロニーにfUSE5プライマーを用いてコロニーPCRを行った。陽性クローンをBig Dyeターミネーター（Perkin Elmer）を用いて配列決定した。
【０３０９】
ファージ感染
膵島および対照切片を1mM AEBSF、20 μg/mlアプロチニン、10 μg/mlロイペプチン、1mMエラスターゼ阻害剤I、0.1 mM TPCK、1nMペプスタチンAのpH 7.4のPBS溶液に入れて、十分な材料が収集されるまで48時間またはそれ未満凍結させた。切片を氷中で融解して、容量をpH 7.4のPBSによって200 μlに調節した。試料をK91 KanR（OD＝0.22）1mlと共にRTで旋回装置上で2時間インキュベートした。各培養物をLB/Kan/Tet（0.2 μg/ml）1.2 mlに移して、RTの暗所で40分間インキュベートした。テトラサイクリンの濃度をそれぞれの培養物について40 μg/mlに増加して、培養物を攪拌しながら37℃で一晩インキュベートした。翌日、各培養物をLB/Kan/Tet寒天プレートに播種して、37℃の暗所で14時間インキュベートした。陽性クローンをコロニーPCRおよび自動配列決定のために採取した。
【０３１０】
結果
PALMを用いたインビボパニングの一般的スキームを、図26に示す。最初のインビボ選択ラウンド後、ファージをバルク増幅するか、または膵臓、腎臓、肺、および副腎からファージの単一のコロニーを増幅して、インビボスクリーニングのさらなるラウンドを行った。マウス膵臓からのバルク増幅およびコロニー増幅ファージはいずれも、選択ラウンドが増加するにつれて連続的な濃縮を示した（示していない）。3回の選択ラウンドの後、コロニー増幅したファージは、バルク増幅したファージよりほぼ1次数高い濃縮を示した（示していない）。
【０３１１】
表14は、膵臓スクリーニングによって同定された選択されたターゲティング配列およびコンセンサスモチーフを記載する。
【０３１２】
【表１４】
膵臓のターゲティングペプチドとモチーフ
Figure 0005077862
Figure 0005077862
Figure 0005077862
【０３１３】
図27は、PALM選択薄切片材料からのファージ挿入物配列の回収の一般的プロトコールを示す。表記のように、ファージは、薄切片試料のプロテアーゼ消化後に大腸菌宿主細菌の直接感染によって回収してもよい。または、ファージ挿入物はPCR増幅によって回収してもよく、新しいベクターDNAにクローニングした後、クローニングするために宿主細菌にエレクトロポレーションするか、または形質転換してもよい。
【０３１４】
ファージをPALM回収するいずれの方法も、膵ターゲティング配列の回収に成功した。直接細菌感染によって回収された膵配列には、
Figure 0005077862
が含まれた。ファージ挿入物の増幅およびファージへのクローニングによって回収された膵ターゲティング配列には、
Figure 0005077862
が含まれる。
【０３１５】
図28〜図31は、選択された膵ターゲティング配列に関して同定された配列相同性を示す。膵組織に存在することが知られているいくつかのタンパク質を同定した。本実施例の結果は、組織薄切片から細胞型を選択するため、およびターゲティングファージ配列を回収するためにPALM法を用いてもよいことを示している。当業者は、この方法は、異種臓器または組織における細胞の特定のタイプに向けられたターゲティング配列を得るために、実質的に任意の組織に用いることができることを認識するであろう。
【０３１６】
本明細書において開示および主張される組成物、方法、および装置は全て、本開示に照らして不適当な実験を行うことなく作製され、実行することができる。本発明の組成物および方法は、好ましい態様に関して説明してきたが、組成物、方法、および装置、ならびに本明細書に開示の段階、または段階の順序に変更を行ってもよく、それらも本発明の概念、趣旨、および範囲に含まれることは、当業者には明らかであろう。より具体的には、化学的および生理的に関連する特定の物質は、同じまたは類似の結果が得られれば、本明細書に記載の物質に置換してもよいことは明らかである。当業者に明らかであるそのような類似の置換基および改変は全て、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の趣旨、範囲、および概念の範囲内であるように思われる。
【０３１７】
参照
以下の参照は、これらが、例示的手法又は本明細書に記載されたもののその他の詳細を提供するという程度まで、本明細書において特に参照として組み入れられる。
Figure 0005077862
Figure 0005077862
Figure 0005077862
Figure 0005077862
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【図面の簡単な説明】
添付の図面は、本明細書の一部であり、本発明の特定の局面をさらに示すために含まれる。本発明は、本明細書に示す特定の態様の詳細説明と共にこれらの図面の一つまたは複数を参照することによってよりよく理解されるであろう。
【図１】 胎盤回帰ファージの確認。実施例3で同定されたターゲティングペプチドを保持するファージを、妊娠マウスに注射し、胎盤からの回収率を、ターゲティング配列を含まない対照fd-tetファージと比較した。胎盤回帰ファージクローンは、PA- TPKTSVT（配列番号：39）、PC-RAPGGVR（配列番号：41）、PE-LGLRSVG（配列番号：44）、PF-YIRPFTL（配列番号：43)であった。
【図２】 脂肪回帰ペプチドの確認。実施例4で同定されたターゲティングペプチドを保持するファージを、妊娠マウスに注射し、脂肪組織からの回収率を、ターゲティング配列を含まない対照fd-tetファージと比較した。
【図３】 BRASILを使用したインビトロの脾臓ターゲティング。Fabクローン#2、#6、#10、及び#12、並びに対照FabクローンNPC-3TTの結合を、対照Fd-tetファージと比較した。
【図４】 BRASILを使用したインビトロの脾臓ターゲティング。Fabクローン#2、#6、#10、及び#12、並びに対照FabクローンNPC-3TTの結合を、相互に直接比較した。
【図５】 BRASILを使用したインビボの脾臓ターゲティング。Fabクローン#2、#6、#10、及び#12の結合を、Fd-tetファージの結合と比較した。
【図６】 BRASILを使用したインビボの脾臓ターゲティング。Fabクローン#10の脾臓組織との結合を、Fab対照クローンNPC-3TT及びFd-tetファージの結合と比較した。
【図７】 Fd-tetファージと比較したFabクローン#10の、脾臓との結合（骨髄との比較）。
【図８】 抗カポジ肉腫ライブラリ由来のFabクローンの、血管新生網膜（angiogenic retina）との結合。
【図９】 β3細胞質ドメインで選択されたファージの、固定化されたタンパク質との結合。GST融合タンパク質又はGST単独を、10μg/mlでマイクロタイターウェルにコーティングし、エンドスタチンターゲティングペプチドを発現するファージを結合させるために使用した。表示されたペプチド配列によって、各ファージを同定した：GLDTYRGSP（配列番号：96)；YDWWYPWSW（配列番号：95)；CLRQSYSYNC（配列番号：104)；SDNRYIGSW（配列番号：97)；CEQRQTQEGC（配列番号：93)；CFQNRC（配列番号：102)。データは、3通りのウェルからの平均コロニー数を、平均値の10％未満の標準誤差と共に表している。
【図１０】 β5細胞質ドメインで選択されたファージの、固定化されたタンパク質との結合。GST融合タンパク質又はGST単独を、10μg/mlでマイクロタイターウェルにコーティングし、エンドスタチンターゲティングペプチドを発現するファージを結合させるために使用した。表示されたペプチド配列によって、各ファージを同定した：(A) DEEGYYMMR（配列番号：110)；(B) KQFSYRYLL（配列番号：111)；(C)CEPYWDGWFC（配列番号：106)；(D) VVISYSMPD（配列番号：112)；及び(E)CYIWPDSGLC（配列番号：105)。データは、3通りのウェルからの平均コロニー数を、平均値の10％未満の標準誤差と共に表している。
【図１１】 細胞質ドメイン結合ファージの、β3固定化タンパク質との結合、及び合成ペプチドによる阻害。増加性の濃度の対応する合成ペプチド又は対照ペプチドの存在下で、GST-β3cytoでコーティングされたウェル上でファージをインキュベートした。データは、3通りのウェルからの平均コロニー数を、平均値の10％未満の標準誤差と共に表している。
【図１２】 細胞質ドメイン結合ファージの、β5固定化タンパク質との結合、及び合成ペプチドによる阻害。増加性の濃度の対応する合成ペプチド又は対照ペプチドの存在下で、GST-β5cytoでコーティングされたウェル上でファージをインキュベートした。データは、3通りのウェルからの平均コロニー数を、平均値の10％未満の標準誤差と共に表している。
【図１３】 リン酸化後のファージの、固定化されたβ3-GST及びβ5-GSTとの結合。ファージをFynキナーゼでリン酸化した。挿入物非含有ファージを、対照として使用した。GST-β3cyto又はGST-β5cytoでコーティングされたウェル上でファージをインキュベートした。データは、3通りのウェルからの平均コロニー数を、平均値の10％未満の標準誤差と共に表している。
【図１４】 リン酸化後のファージの、固定化されたGST融合タンパク質との結合。ファージをFynキナーゼでリン酸化した。挿入物非含有ファージを、対照として使用した。GST細胞質ドメインでコーティングされたウェル上でファージをインキュベートした。データは、3通りのウェルからの平均コロニー数を、平均値の10％未満の標準誤差と共に表している。
【図１５】 インテグリン細胞質ドメイン結合ペプチドの、細胞増殖に対する効果。血清枯渇細胞を24時間培養し、[3H]チミジン（1μCi/ml）取り込み測定により増殖を判定した。陽性対照においては、血清枯渇細胞にVEGFを戻し添加した。各実験を3通り3回実施し、結果を平均値±SDとして表した。
【図１６】 ペネトラチンペプチドキメラの、内皮細胞遊走に対する効果。細胞遊走アッセイを、48ウェル微小走化性（microchemotaxis）チャンバーで実施した。各ウェルにおいて、5個の無作為な高倍率視野（40倍）を計数した。結果は、両方のβ3インテグリン細胞質ドメイン結合ペプチド（Y-18及びTYR-11）が細胞遊走を増加させる一方で、ペネトラチンが細胞に影響を与えなかったことを示している。
【図１７】 β5細胞質ドメインと結合するペネトラチンペプチドキメラは、プログラム細胞死を誘導する。106個のHUVEC細胞を完全培地中で採集し、15μMのペネトラチンペプチドキメラを細胞へ添加した。4時間後、8時間後、及び12時間後に、細胞をヨウ化プロピジウム（PI）で染色し、アポトーシス誘導を細胞数測定分析により分析した。a）24時間後に枯渇細胞を用いて得られたプロファイル。b）完全培地中のコンフルエント細胞。c）4時間後の15μMのペネトラチン。d）4時間後の15μMのVISY-ペネトラチンキメラ。8時間後及び12時間後に分析された細胞は、G0/G1比の類似したプロファイルを示した。
【図１８】 β3又はβ5で選択されたファージに対して産生された抗体の特異性（ELISA）。KLHと接合したGLDTYRGSP（配列番号：96）又はSDNRYIGSW（配列番号：97）による3回の免疫後に得られた増加性の希釈率の血清を、10μgのSDNRYIGSW（配列番号：97、Y-18）、GLDTYRGSP（配列番号：96、TYR-11）、又は対照ペプチドでコーティングされたマイクロタイターウェル上でインキュベートした。対照として免疫前血清を用いた。HRPヤギ抗ウサギ抗体とのインキュベーション後、ODを405nmで測定した。データは、3通りウェルからの平均値を、10％未満の標準誤差と共に表している。
【図１９】 β3又はβ5で選択されたファージに対して産生された抗体の特異性（ELISA）。KLHと接合したSDNRYIGSW（配列番号：97、Y-18）又はGLDTYRGSP（配列番号：96、TYR-11）による3回の免疫後に得られた血清を、10μgのTYR-11又はY-18でコーティングされたマイクロタイターウェルにおいてインキュベートした。GLDTYRGSP（配列番号：96）又はSDNRYIGSW（配列番号：97）及び対照ペプチドを溶液に添加した。HRPヤギ抗ウサギ抗体とのインキュベーションの後、ODを405nmで測定した。データは、3通りのウェルからの平均値を、10％未満の標準誤差と共に表している。溶液に添加されたペプチドは、固定化されたペプチドとの反応性を特異的に阻止する。
【図２０】 図20Aは、VISYペプチドとの、アネキシンVのβ5インテグリンへの競合的結合を示す。結合アッセイをELISAにより実施した。図20Bは、抗アネキシンV抗体の精製アネキシンVタンパク質及びVISYペプチドへの結合の相対レベルを示す。
【図２１】 ペネトラチン（アンテナペディア）と連結されたVISYペプチドを含むキメラペプチドは、アポトーシスを誘導する。VISYにより誘導されたアポトーシスは、カスパーゼ阻害剤（zVAD）の添加により阻害された。
【図２２】 APA結合ファージは腫瘍と特異的に結合する。等量のファージをMDA-MB-435由来腫瘍を保持するマウスの尾静脈へ注射し、灌流後、ファージを回収した。3通りの播種からの、腫瘍又は対照組織（脳）より回収されたファージの平均値及び標準誤差が、示されている。
【図２３】 CPRECESIC（配列番号：123）は、APA活性の特異的阻害剤である。増加性の濃度のGACVRLSACGA（配列番号：124）ペプチド（対照）又はCPRECESIC（配列番号：123）ペプチドのいずれかの存在下で、APA酵素活性をアッセイした。CPRECESIC（配列番号：123）によるAPA阻害に関するIC50は、800μMにおいて推定された。エラーバーは、3通りのウェルの平均値の標準誤差である。実験は、3回繰り返され、類似の結果を示した。
【図２４】 CPRECESIC（配列番号：123）は、HUVEC遊走を阻害する。HUVECをVEGF-A（10ng/ml）で刺激した。アッセイを、Boyden微小走化性チャンバーにおいて実施し、37℃で5時間、8μm孔フィルターを介して細胞を遊走させた。GACVRLSACGA（配列番号：124）ペプチド（対照）及びCPRECESIC（配列番号：123）ペプチドを、1mMという濃度で試験した。遊走した細胞を染色し、各マイクロウェルについて5個の高倍率視野（100倍）を計数した。エラーバーは、3通りのマイクロウェルの平均値の標準誤差である。
【図２５】 CPRECESIC（配列番号：123）は、HUVEC増殖を阻害する。細胞をVEGF-A（10ng/ml）で刺激し、表記の時点において、クリスタルバイオレット染色に基づく比色アッセイにより増殖を評価した。エラーバーは、3通りのウェルの平均値の標準誤差である。各実験は、少なくとも2回繰り返され、類似の結果を示した。
【図２６】 マウス膵臓、腎臓、肝臓、肺、及び副腎内でターゲティングされるファージ用のインビボバイオパニングのプロトコル。
【図２７】 大腸菌の感染によるファージの回収、又は増幅及びサブクローニングによるファージDNAの回収のプロトコル。
【図２８】 膵島ターゲティングペプチド及び相同タンパク質。標準的な相同性検索により同定される、以下の膵島ターゲティングペプチドにより模倣された内因性タンパク質候補：CVSNPRWKC（配列番号：197）、CVPRRWDVC（配列番号：194）、CQHTSGRGC（配列番号：195）、及びCRARGWLLC（配列番号：196）。
【図２９】 膵島ターゲティングペプチド及び相同タンパク質。標準的な相同性検索により同定される、以下の膵島ターゲティングペプチドにより模倣された内因性タンパク質候補：CGGVHALRC（配列番号：175）、CFNRTWIGC（配列番号：198）、及びCWSRQGGC（配列番号：200）。
【図３０】 膵島ターゲティングペプチド及び相同タンパク質。標準的な相同性検索により同定される、以下の膵島ターゲティングペプチドにより模倣された内因性タンパク質候補：CLASGMDAC（配列番号：204）、CHDERTGRC（配列番号：205）、CAHHALMEC（配列番号：206）、及びCMQGARTSC（配列番号：208）。
【図３１】 膵島ターゲティングペプチド及び相同タンパク質。標準的な相同性検索により同定される、以下の膵島ターゲティングペプチドにより模倣された内因性タンパク質候補：CHVLWSTRC（配列番号：201）、CMSSPGVAC（配列番号：203）、及びCLGLLMAGC（配列番号：202）。[0001]
Background of the Invention
  This application claims priority from US Provisional Application No. 60 / 231,266, filed September 8, 2000, and US Patent Application No. 09 / 765,101, filed January 17, 2001. The present invention is supported by the US Army grants DAMD 17-98-1-8041 and 17-98-1-8581 and the National Institutes of Health grants 1R01CA78512-01A1, 1R1CA90810-01, and 1R01CA82976-01. Was done. The US government has certain rights in this invention.
[0002]
1. Field of the Invention
  The present invention relates to the field of targeted delivery of molecular drugs and therapeutic agents. More specifically, the present invention relates to compositions and methods for the identification and use of peptides that selectively target organs, tissues, or cell types in vivo or in vitro.
[0003]
2. Explanation of related technology
  The therapeutic treatment of many disease states is limited due to the systemic toxicity of the therapeutic agents used. Cancer therapeutics exhibit particularly low therapeutic indices, and rapidly proliferating normal tissues such as skin and bone marrow are affected by drug concentrations that are not as high as those used to kill tumor cells. Treatment of cancer and other organ, tissue, or cell type limited diseases is greatly facilitated by developing compositions and methods for targeted delivery of therapeutic agents to the desired organ, tissue, or cell type. Will.
[0004]
  Recently, in vivo selection systems have been developed that use phage display libraries to identify organ, tissue, or cell type targeting peptides in mouse model systems. Phage display libraries that express transgenic peptides on the surface of bacteriophages were originally developed to map the epitope binding sites of immunoglobulins (Smith and Scott, 1986, 1993). Such libraries can insert random oligonucleotides into cDNAs that encode phage surface proteins, create unique peptides.9It can be made by creating a collection of phage particles that show as many permutations (Pasqualini and Ruoslahti, 1996; Arap et al., 1998a; Arap et al., 1998b).
[0005]
  After intravenous administration of the phage display library to mice, phages were collected from individual organs (Pasqualini and Ruoslahti, 1996). Based on specific targeting peptide sequences expressed on the external surface of the phage, phage were recovered that could selectively return to the vascular bed of different mouse organs, tissues, or cell types (Pasqualini and Ruoslahti, 1996) . A variety of organ and tumor regression peptides have been identified by this method (Rajotte et al., 1998, 1999; Koivunen et al., 1999; Burg et al., 1999; Pasqualini, 1999). Each of these targeting peptides bound to a different receptor that was selectively expressed on the blood vessels of the mouse target tissue (Pasqualini, 1999; Pasqualini et al., 2000; Folkman, 1995; Folkman, 1997). Tumor regression peptides bound to receptors that are up-regulated in mouse neovascularization (Brooks et al., 1994; Pasqualini, 2000). In addition to identifying individual targeting peptides selective for organs, tissues, or cell types (Pasqualini and Ruoslahti, 1996; Arap et al., 1998a; Koivunen et al., 1999), this system is expressed in mice in vivo Have been used to identify endothelial cell surface markers (Rajotte and Ruoslahti, 1999).
[0006]
  Once the therapeutic agent is conjugated to the targeting peptide, the active agent is selectively delivered to the desired organ, tissue, or cell type in a mouse model system. Target chemotherapeutic agents and pro-apoptotic peptides to receptors present in tumor neovasculatureConversionUpon delivery, there is a significant increase in therapeutic efficacy and a decrease in systemic toxicity in a tumor bearing mouse model (Arap et al., 1998a, 1998b; Ellerby et al., 1999).
[0007]
  In some cases, conventional in vivo phage display screening methods have resulted in a relatively high background of non-specific phage binding. This was especially true for tissues belonging to the retinal endothelial system. There is a need for improved phage display methods that reduce non-specific phage binding while retaining specific interactions between targeting peptides and cellular receptors. There is also a need to target receptors for specific cell populations within an organ, tissue, or cell type. Often, a tissue or organ comprises a highly heterogeneous population of various cell types. There is a need for the ability to target phage display screening to specific cell populations.
[0008]
  Similarly, there is a need to identify receptor-ligand pairs in organs and tissues. Previous attempts to identify targeted receptors and ligand binding to receptors have primarily targeted a single ligand at a time for testing. The identification of unknown receptors and ligands that have not yet been characterized has been a very slow and laborious process. Such novel receptors and ligands include diabetes mellitus, inflammatory diseases, arthritis,AtherosclerosisMay provide a basis for new treatments for a variety of disease states, such as cancer, autoimmune diseases, bacterial infections, viral infections, cardiovascular diseases, or degenerative diseases.
[0009]
Summary of the Invention
  The present invention relates to organs, tissues, orspecificMeeting the long-standing demand in the art by providing compositions and methods for identifying and using targeting peptides that are selective for cell types. In some embodiments, the method is a selective interacting ligand, which is a novel phage display method that reduces the background of non-specific phage binding while retaining selective binding of phage to cell receptors. Biopanning and Rapid Analysis of Selective Interactive Ligands (BRASIL). In a preferred embodiment, the targeting peptide comprises exposing a subject to a phage display library, collecting a sample of one or more organs, tissues, or cell types, isolated cells or small cells suspended in an aqueous phase. Separating the sample into clumps, overlaying the aqueous phase on top of the organic phase, centrifuging the two phases so that the cells are pelleted to the bottom of the centrifuge tube, and collecting phage from the pellet Identified by In a further preferred embodiment, the organic phase is dibutyl phthalate.
[0010]
  In other embodiments, a target organ, tissue, or cell type, eg, a phage that binds to the placenta, can be pre-screened or post-screened against a subject lacking that organ, tissue, or cell type. Phages that bind to subjects lacking the target organ, tissue, or cell type are removed from the library prior to screening in subjects that possess the organ, tissue, or cell type. In preferred embodiments, the organ, tissue, or cell type is placenta or adipose tissue.
[0011]
  In a preferred embodiment, the targeting phage can be recovered from a specific cell type or subtype present in an organ or tissue after selection of the cell type by PALM (Positioning and Ablation with Laser Microbeams). PALM allows the selection of specific cell types, for example from organ or tissue slices. The phage can be recovered from the selected sample.
[0012]
  In another embodiment, a phage display library displaying the antigen-binding portion of an antibody is prepared from a subject, the library is screened against one or more antigens, and phage that binds the antigen are collected. In a more preferred embodiment, the antigen is a targeting peptide.
[0013]
  In certain embodiments, the methods and compositions can be used to identify one or more receptors for a targeting peptide. In another aspect, the compositions and methods can be used to identify naturally occurring ligands for known or newly identified receptors.
[0014]
  In some embodiments, the methods of the present invention may include accepting a receptor by contacting a targeting peptide with an organ, tissue, or cell that contains the receptor of interest, binding the peptide to the receptor, and binding to the peptide. May be included. In a preferred embodiment, the targeting peptide is selected from any of SEQ ID NO: 5 to SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47 to SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 123, and SEQ ID NO: 125 to SEQ ID NO: 251. Contains at least 3 consecutive amino acids. In other preferred embodiments, the targeting peptide comprises a portion of an antibody against the receptor. In another embodiment, the targeting peptide may comprise a random amino acid sequence. One skilled in the art will recognize that the contacting step may utilize an organ, tissue, or cell, or may utilize a homogenate or detergent extract of the organ, tissue, or cell. In certain embodiments, the cells to be contacted may be genetically engineered to express a suspected receptor for the targeting peptide. In preferred embodiments, the targeting peptide is modified by a reactive moiety that allows its covalent binding to the receptor. In a more preferred embodiment, the reactive moiety is a photoreactive group that becomes covalently bound to the receptor when activated by light. In another preferred embodiment, the peptide is bound to a solid support and the receptor is purified by affinity chromatography. In another preferred embodiment, the solid support isMagnetismIncludes beads, sepharose beads, agarose beads, nitrocellulose membranes, nylon membranes, column chromatography matrices, high performance liquid chromatography (HPLC) matrices, or fast performance liquid chromatography (FPLC) matrices. In certain embodiments, the targeting peptide, when bound to a receptor, inhibits the activity of the receptor. One skilled in the art will recognize that receptor activity can be assayed by a variety of methods known in the art including, but not limited to, catalytic activity and binding activity. In another preferred embodiment, the receptor is an endostatin receptor, metalloprotease or aminopeptidase.
[0015]
  In alternative embodiments, one or more ligands of the receptor of interest may be identified by the disclosed methods and compositions. One or more targeting peptides that mimic some or all of the naturally occurring ligands may be identified by in vivo or in vitro phage display and biopanning. Naturally occurring ligands may be identified by homology to a single targeting peptide that binds to the receptor, or to a consensus motif of sequences that bind to the receptor. In another alternative embodiment, antibodies against one or more targeting peptides that bind to the receptor of interest may be prepared. Such antibodies may be used for native ligand identification or immunoaffinity purification.
[0016]
  In certain embodiments, the targeting peptides of the present invention are used to selectively deliver therapeutic agents, including but not limited to gene therapy vectors and fusion proteins, to specific organs, tissues, or cell types in a subject. . Those skilled in the art will recognize that the scope of the claimed method used also includes any disease state that can be treated by targeted delivery of the therapeutic agent to the desired organ, tissue, or cell type. Will do. Such disease states include diseases in which cells with the disease are limited to a particular organ, tissue, or cell type, such as non-metastatic cancer, but other disease states are organs, tissues, or Treatment may be by a cell-type targeting approach.
[0017]
  One embodiment of the present invention is selected from any of SEQ ID NO: 5 to SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47 to SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 123, and SEQ ID NO: 125 to SEQ ID NO: 251. It relates to an isolated peptide that is at least 100 amino acids in size, comprising at least 3 consecutive amino acids of the targeting peptide sequence.
[0018]
  In preferred embodiments, the isolated peptide has 50 or fewer amino acids, more preferably 30 or fewer amino acids, more preferably 20 or fewer amino acids, more preferably 10 or fewer amino acids, or even more preferably. Is 5 amino acids in size or less. In another preferred embodiment, the isolated peptide of claim 1 is SEQ ID NO: 5 to SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47 to SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 123, and SEQ ID NO: 125 to SEQ ID NO: At least 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 of a targeting peptide sequence selected from any of 251 , 23, 24, or 25 consecutive amino acids.
[0019]
  In certain embodiments, the isolated peptide binds to a molecule. In a preferred embodiment, the bond is a covalent bond. In further embodiments, the molecule is a drug, chemotherapeutic agent, radioisotope, pro-apoptotic agent, anti-angiogenic agent, hormone, cytokine, growth factor,CytotoxicityAgent, peptide, protein, antibiotic, antibody, antibody Fab fragment, survival factor, anti-apoptotic agent, hormone antagonist, contrast agent, nucleic acid or antigen. These molecules are listed for illustrative purposes only. Molecules included within the scope of the present invention include virtually any molecule that may be conjugated to a targeting peptide and administered to a subject. In a preferred embodiment, the pro-apoptotic agent is gramicidin, magainin, melittin, defensin, cecropin, (KLAKLAK)2(SEQ ID NO: 1), (KLAKKLA)2(SEQ ID NO: 2), (KAAKKAA)2(SEQ ID NO: 3) or (KLGKKLG)Three(SEQ ID NO: 4). In other preferred embodiments, the anti-angiogenic agent is angiostatin 5, pigment epithelium-derived factor, angiotensin, laminin peptide, fibronectin peptide, plasminogenActivatorInhibitor, tissue metalloproteinase inhibitor, interferon, interleukin 12, platelet factor 4, IP-10, Gro-β, thrombospondin, 2-methoxyestradiol, proliferin-related protein, carboxamidotriazole, CM101, marimastat, pentosanPolysulfate, Angiopoietin 2 (regeneron), interferon-α, herbimycin A, PNU145156E, 16K prolactin fragment, linomide, thalidomide, pentoxifylline, genistein, TNP-470, endostatin, paclitaxel,Docetaxel, Polyamines, proteasome inhibitors, kinase inhibitors, signaling inhibitors (SU5416, SU6668, Sugen, South San Fransisco, CA), acutin, cidofovir, vincristine, bleomycin, AGM-1470, platelet factor 4 or minocycline. In a further preferred embodiment, the cytokine is interleukin 1 (IL-1), IL-2, IL-5, IL-10, IL-11, IL-12, IL-18, interferon-γ (IF-γ), IF-α, IF-β, tumor necrosis factor-α (TNF-α), or GM-CSF (granulocyte macrophage colony stimulating factor). Such examples are merely representative and are not to be construed as excluding other pro-apoptotic agents, anti-angiogenic agents, or cytokines known in the art.
[0020]
  In other embodiments, the isolated peptide binds to a macromolecular complex. In a preferred embodiment, the bond is a covalent bond. In other preferred embodiments, the polymer complex is a virus, bacteriophage, bacterium, liposome, microparticle,MagnetismBeads, yeast cells,MammalA cell, cell, or microdevice. These are shown for illustrative purposes only. Polymer complexes included within the scope of the present invention include virtually any polymer complex that may be conjugated to a targeting peptide and administered to a subject. In other preferred embodiments, the isolated peptide binds to a eukaryotic expression vector, more preferably a gene therapy vector.
[0021]
  In another embodiment, the isolated peptide is a solid support, preferablyMagnetismBind to beads, sepharose beads, agarose beads, nitrocellulose membrane, nylon membrane, column chromatography matrix, high performance liquid chromatography (HPLC) matrix, or fast performance liquid chromatography (FPLC).
[0022]
  A further embodiment of the present invention provides a sequence selected from any of SEQ ID NO: 5 to SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47 to SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 123, and SEQ ID NO: 125 to SEQ ID NO: 251. A fusion protein comprising at least three consecutive amino acids.
[0023]
  Another particular embodiment relates to a composition comprising an isolated peptide or fusion protein claimed in a pharmaceutically acceptable carrier. A further aspect relates to a kit comprising an isolated peptide or fusion protein claimed in one or more containers.
[0024]
  Other embodiments include selecting a targeting peptide for a desired organ, tissue, or cell type, coupling the targeting peptide to a molecule, macromolecular complex, or gene therapy vector, and the molecule, complex Or a targeted delivery method comprising providing a subject with the above-described peptide bound to a vector. Preferably, the targeting peptide is at least a contiguous amino acid from any of SEQ ID NO: 5 to SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47 to SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 123, and SEQ ID NO: 125 to SEQ ID NO: 251. Selected to include three. In certain preferred embodiments, the organ, tissue, or cell type is bone marrow, lymph node, prostate cancer, or prostate cancer that has metastasized to bone marrow. In other preferred embodiments, the molecule attached to the targeting peptide is a chemotherapeutic agent, antigen, or contrast agent. One skilled in the art can, within the scope of this specification, target any organ, tissue, or cell type for delivery using targeting peptides attached to any molecule, macromolecular complex, or gene therapy vector. You will recognize that.
[0025]
  Another aspect of the invention relates to an isolated nucleic acid that encodes a targeting peptide and is 300 nucleotides in size or less. In preferred embodiments, the isolated nucleic acid is 250, 225, 200, 175, 150, 125, 100, 75, 50, 40, 30, 20 or 10 nucleotides in size or less. In other preferred embodiments, the isolated nucleic acid is incorporated into a eukaryotic or prokaryotic expression vector. In an even more preferred embodiment, the vector is a plasmid, cosmid, yeast artificial chromosome (YAC), bacterial artificial chromosome (BAC), virus or bacteriophage. In other preferred embodiments, the isolated nucleic acid is operably linked to a leader sequence that localizes the expressed peptide to the extracellular surface of the host cell.
[0026]
  Further aspects of the invention include selecting a targeting peptide that targets cells associated with a disease state, coupling one or more molecules effective to treat the disease state to the peptide, and the disease state. It relates to a method of treating a disease state comprising administering a peptide to a subject having the disease. Preferably, the targeting peptide is selected from any one of SEQ ID NO: 5 to SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47 to SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 123, and SEQ ID NO: 125 to SEQ ID NO: 251. Contains at least 3 consecutive amino acids. In a preferred embodiment, the disease state is diabetes mellitus, inflammatory disease, arthritis,AtherosclerosisCancer, autoimmune disease, bacterial infection, viral infection, cardiovascular disease, or degenerative disease.
[0027]
  Another aspect of the invention relates to compositions and methods using tumor targeting peptides against cancer. Tumor targeting peptides identified by the methods disclosed in this application may be conjugated to a therapeutic agent, including but not limited to a molecule or group of macromolecules, and administered to a subject with cancer. Provides increased and reduced systemic toxicity. The therapeutic agents included within the scope of the present invention include chemotherapeutic agents, radioisotopes, pro-apoptotic agents,CytotoxicityAgent,Cell division inhibitionIncluding, but not limited to, agents and gene therapy vectors. Targeted delivery of such therapeutic agents to tumors is a significant improvement over the prior art with respect to reducing inappropriate delivery of drugs to the patient's normal organs and tissues while increasing drug delivery to the tumor. I will provide a. In a preferred embodiment, the tumor targeting peptide is incorporated into a phage gene therapy vector capsule to target phage delivery to tumor vessel angiogenic endothelial cells.
[0028]
  A particular embodiment relates to a method for obtaining an antibody against an antigen. In preferred embodiments, the antigen comprises one or more targeting peptides. A targeting peptide is prepared, immobilized on a solid support, and serum containing the antibody is added to recover the antibody that binds to the targeting peptide.
[0029]
Description of exemplary aspects
  As used herein, “a” (“a” or “an”) may mean one or more. As used in the claims of the present invention, in connection with the term “comprising”, “a” (“a” or “an”) may mean one or more. As used herein, “another” may mean at least a second or more items.
[0030]
  A “targeting peptide” is selective to an organ, tissue, or cell typeLocalizationIs a peptide comprising a continuous amino acid sequence. SelectiveLocalizationCan be determined, for example, by methods disclosed later that incorporate a putative targeting peptide sequence into a protein displayed on the outer surface of the phage. After administering to the subject a library of such phage that has been genetically modified to express a large number of such targeting peptides of different amino acid sequences, one or more organs, tissues, or cell types from the subject are Collect and identify phage found in the organ, tissue, or cell type. A phage that expresses a targeting peptide sequence is selective for a tissue or organ if it exhibits more binding in that tissue or organ compared to a control tissue or organ.LocalizationIs considered to be. Preferably, targeting peptide selectiveLocalizationShould provide phage enrichment in the target organ, tissue, or cell type that is at least twice as large as the control organ, tissue, or cell type. Selective that provides at least 3-fold, 4-fold, 5-fold, 6-fold, 7-fold, 8-fold, 9-fold, 10-fold, or more enrichment in the target organ compared to a control organ, tissue, or cell typeLocalizationIs more preferable. Or selectiveLocalizationPhage expressing a targeting peptide sequence that preferably exhibits increased enrichment relative to control organs when phage recovered from the target organ is reinjected into the second host for the next screening. Shown in the target organ. Further enrichment can be shown after the third screening. SelectiveLocalizationAnother alternative means for determining a phage that expresses a putative target peptide is a non-specific peptide or a control phage that has not been genetically modified to express the putative target peptide. By comparison, preferably a 2-fold, more preferably 3-fold or more enrichment is shown in the target organ. SelectiveLocalizationAnother means for determining theLocalizationIs at least partially blocked by co-administration of a synthetic peptide containing the target peptide sequence. “Targeting peptide” and “regression peptide” are used interchangeably herein.
[0031]
  By “phage display library” is meant a collection of phage that have been genetically engineered to express a putative targeting peptide set on its outer surface. In a preferred embodiment, the DNA sequence encoding the putative targeting peptide is a phageCapsuleIt is inserted in frame with the gene encoding the protein. In other preferred embodiments, the putative targeting peptide sequence is partly a random mixture of all 20 amino acids and partly a non-random mixture. In certain preferred embodiments, the putative targeting peptide of the phage display library exhibits one or more cysteine residues at fixed positions within the targeting peptide sequence.
[0032]
  By “polymer complex” is meant a collection of molecules whose sequence may be random, regular, or partially regular. The term includes organisms such as bacteriophages, viruses, bacteria, unicellular pathogenic organisms, multicellular pathogenic organisms, and prokaryotic or eukaryotic cells. The term also includes liposomes, microcapsules, microparticles,MagnetismIncludes non-viable molecular groups such as beads and microdevices. The only requirement is that the complex contains one or more molecules. The molecules may be the same or different from each other.
[0033]
  A “receptor” for a targeting peptide includes, but is not limited to, any molecule or complex of molecules that binds to the targeting peptide. Non-limiting examples of receptors include peptides, proteins, glycoproteins, lipoproteins, epitopes, lipids, carbohydrates, multimolecular structures, specific conformations of one or more molecules and morphological anatomical entities. included. In preferred embodiments, a “receptor” is a naturally occurring molecule or complex of molecules that is present on the luminal surface of cells that form blood vessels within a target organ, tissue, or cell type.
[0034]
  “Subject” generally refers toMammalMeans. In certain preferred embodiments, the subject is a mouse or a rabbit. In an even more preferred embodiment, the subject is a human.
[0035]
Phage display
  The methods described herein for identifying targeting peptides include in vitro administration of phage display libraries. Various methods of phage display and methods for generating diverse populations of peptides are well known in the art. For example, US Pat. Nos. 5,223,409, 5,622,699, and 6,068,829, each of which is incorporated herein by reference, disclose methods for preparing phage libraries. Phage display technology involves genetic manipulation of bacteriophages so that small peptides can be expressed on their surface (Smith et al., 1985, 1993). The scope to which this technology can be applied is quite broad, and over the past decade, it has been considerable in the construction of phage-displayed peptide libraries and in the development of screening methods for isolating peptide ligands using libraries. Progress is recognized. For example, peptide libraries have made it possible to characterize the site of interaction and receptor-ligand binding motifs in many proteins such as antibodies involved in inflammatory responses or integrins that mediate cell adhesion . This method has also been used to identify novel peptide ligands that serve as leads for developing peptidomimetics or contrast agents (Arap et al., 1998a). In addition to peptides, larger protein domains such as single chain antibodies can also be displayed on the surface of phage particles (Arap et al., 1998a).
[0036]
  Targeting amino acid sequences that are selective for an organ, tissue, or cell type can be isolated by “biopanning” (Pasqualini and Ruoslahti, 1996; Pasqualini, 1999). Briefly, a library of phage containing a putative targeting peptide is administered to an animal or human and an organ, tissue, or cell type sample containing the phage is collected. In a preferred embodiment utilizing filamentous phage, the phage can be propagated in vitro in pili-positive bacteria between biopanning. This bacterium does not lyse by the phage and secretes multiple copies of the phage that display a particular insert. Phage that bind to the target molecule can be amplified by eluting from the target organ, tissue, or cell type and then growing in a host bacterium. If desired, the amplified phage may be administered to the host and the organ, tissue, or cell type sample collected again. Multiple biopannings can be performed until a population of selective binders is obtained. The amino acid sequence of the peptide is determined by sequencing the DNA corresponding to the targeting peptide insert in the phage genome. The identified targeting peptide can then be made as a synthetic peptide by standard protein chemistry techniques (Arap et al., 1998a, Smith et al., 1985). This approach makes it possible to detect circulating targeting peptides in an unbiased functional assay without expecting the nature of the target. Once a candidate target has been identified as a receptor for a targeting peptide, it can be isolated, purified and cloned by using standard biochemical methods (Pasqualini, 1999; Rajotte and Ruoslahti, 1999). Is possible.
[0037]
  In certain embodiments, a subtraction protocol is used to further reduce background phage binding. The purpose of subtraction is to remove from the library phage that bind to cells other than the cells of interest or that bind to inactivated cells. In another embodiment, the phage library can be pre-screened against subjects who do not have targeted cells, tissues, or organs. For example, placental binding peptides can be identified after pre-screening the library against men or non-pregnant women. After subtraction, the library can be screened against the cell, tissue, or organ of interest. In another alternative, unstimulated quiescent cell types, tissues, or organs are screened against the library to remove bound phage. The cell line, tissue, or organ is then activated, for example, by administration of a hormone, growth factor, cytokine, or chemokine, and the activated cell type, tissue, or organ is screened against the subtracted phage library. Is done.
[0038]
  Other subtraction protocol methods are known, for example, as disclosed in U.S. Pat.Nos. 5,840,841, 5,705,610, 5,670,312, and 5,492,807, which are incorporated herein by reference. Can be used.
[0039]
Selection of phage display system
  Previous in vivo selection studies conducted in mice show that the III gene in the fUSE5 vectorCapsuleA library of random peptides expressed as fusion proteins with proteins was preferred (Pasqualini and Ruoslahti, 1996). The number and diversity of individual clones present in a given library are important factors for successful in vivo selection. It is preferred to use a primary library that is unlikely to have overexpression of defective phage clones (Koivunen et al., 1999). Library preparation is 108~Ten9Optimized between transducing units (T.U.) / Ml. In certain embodiments, a bulk amplification strategy is applied during each selection round.
[0040]
  Phage libraries that exhibit linear, circular, or bicyclic peptides may be used within the scope of the present invention. However, since monocyclic peptides tend to have higher affinity for target organs than linear peptides, cyclic inserts (CX3-10Phage libraries displaying 3-10 random residues in C) are preferred. Library showing bicyclic peptides (CXThreeC XThreeCXThreeC et al .; Rajotte et al., 1998) have also been used successfully. However, the production of syngeneic synthetic peptides, although possible, can be complicated due to the large number of conformers with different disulfide bridge sequences.
[0041]
Identification of regression peptides and receptors by in vivo phage display in mice
  Identify selective targeting peptides for normal mouse brain, kidney, lung, skin, pancreas, retina, intestine, uterus, prostate, and adrenal gland using in vivo selection of peptides from phage display peptide libraries administered to mice (Pasqualini and Ruoslahti, 1996; Pasqualini, 1999; Rajotte et al., 1998). These results indicate that the vascular endothelium of normal organs is heterogeneous enough to allow different targeting by peptide probes (Pasqualini and Ruoslahti, 1996; Rajotte et al., 1998). A means for identifying a peptide that returns to the neovascularization of a tumor has been devised as follows. A panel of peptide motifs targeting the blood vessels of tumor xenografts in nude mice has been constructed (reviewed by Arap et al., 1998a; Pasqualini, 1999). These motifs include the sequences RGD-4C, NGR, and GSL. The RGD-4C peptide has been previously identified as a selectively binding αv integrin and has been shown to return to tumor xenograft vessels in nude mice (Arap et al., 1998a, 1998b; Pasqualini, 1997). ).
[0042]
  The receptor for tumor regression RGD4C targeting peptide has been identified as αv integrin (Pasqualini et al., 1997). αv integrins play an important role in angiogenesis. αvβ3 and αvβ5 integrins are absent in normal endothelial cells or are expressed at low levels, but are induced in tumor neovasculature (Brooks et al., 1994; Hammes et al., 1996). Aminopeptidase N / CD13 has recently been identified as an angiogenic receptor for the NGR motif (Burg et al., 1999). Aminopeptidase N / CD13 is strongly expressed not only in prostate cancer neovascularization in TRAMP but also in normal epithelial prostate tissue.
[0043]
  Tumor-regressing phages interact with their receptors in tumor neovasculature.BothIt is localized but not present in non-neovascular vessels of normal tissue (Arap et al., 1998b). Immunohistochemical evidence indicates that vascular targeting phage bind to human tumor blood vessels in tissue sections (Pasqualini et al., 2000) but not normal blood vessels. Negative control phage without an insert (fd phage) did not bind to normal or tumor tissue sections. Angiogenic receptor expression was evaluated in cell lines, non-proliferating blood vessels, and tumor activated blood vessels, and other angiogenic tissues such as the corpus luteum. Flow cytometry and immunohistochemistry showed that these receptors are expressed in many tumor cells and activated HUVECs (data not shown). Angiogenic receptors were not detected in blood vessels of normal organs of mouse or human tissues.
[0044]
  The distribution of these receptors was analyzed by immunohistochemistry in tumor cells, tumor vessels, and normal vessels. αMP integrin, CD13, aminopeptidase A, NG2, and MMP-2 / MMP-9, known receptors in tumor blood vessels, are specific in neovascular endothelial and pericytes of both human and mouse origin Expressed. Neovascularization expresses markers that are expressed at very low levels or not at all in non-proliferating endothelial cells (not shown).
[0045]
  Neovascular endothelial markers include specific subtypes of VEGF and basic FGF receptors, as well as receptors for vascular growth factors such as αv integrins (Mustonen and Alitalo, 1995). To date, the identification and isolation of new molecules characteristic of new blood vessels has been delayed due to dramatic changes in phenotype, mainly when endothelial cells are grown in culture (Watson et al., 1995).
[0046]
  Many of these tumor vascular markers are proteases, and some of the markers act as viral receptors. αv integrin is an adenovirus receptor (Wickham et al., 1997c) and CD13 is a coronavirus receptor (Look et al., 1989). MMP-2 and MMP-9 are Echovirus receptors (Koivunen et al., 1999). Aminopeptidase A also appears to be a viral receptor. Bacteriophages may utilize the same cellular receptors as eukaryotic cell viruses. These findings suggest that the receptor isolated by in vivo phage display has the ability to internalize cells, an important feature for utilizing the identified peptide motif as a target gene therapy carrier doing.
[0047]
Targeted delivery
  Peptides that return to tumor blood vesselsCytotoxicityCoupling to drugs or pro-apoptotic peptides has yielded compounds that are more effective and less toxic than the parent compound in experimental mouse models with tumor xenografts (Arap et al., 1998a; Ellerby et al., 1999). As shown below, insertion of the RGD-4C peptide into an adenovirus surface protein yields an adenovirus vector that may be used for tumor targeted gene therapy (Arap et al., 1998b).
[0048]
BRASIL
  In a preferred embodiment, the separation of phage bound to cells of the target organ, tissue, or cell type from unbound phage is performed using BRASIL technology (US provisional application filed September 8, 2000). No. 60 / 231,266; “Biopanning and Rapid Analysis of Selective Interaction Ligands” by Arap, Pasqualini, and Giordano, incorporated herein by reference and filed with the present specification. of Selective Interactive Ligands (BRASIL)). BRASIL (SolubleBiopanning and rapid analysis of interacting ligands) for organs, tissues, or cell typesTheGently separate cells or small cell masses and suspend them in the aqueous phase. The aqueous phase is layered over a suitably dense organic phase and centrifuged. Cells that adhere to the bound phage will settle to the bottom of the centrifuge tube and unbound phage will remain in the aqueous phase. This allows more efficient separation of bound phage from unbound phage while maintaining the binding interaction between the phage and the cell. BRASIL can also be performed in vivo protocols where organs, tissues, or cell types are exposed to phage display libraries by intravenous administration, or by ex vivo protocols where cells are exposed to phage libraries in aqueous phase and then centrifuged. Good.
[0049]
Protein and peptide
  In certain embodiments, the present invention relates to novel compositions comprising at least one protein or peptide. As used herein, a protein or peptide is generally an amino acid.aboutMore than 200 proteins from gene to full-length sequence; amino acidsaboutMeans, but is not limited to, 100 or more polypeptides; and / or peptides of about 3 to about 100 amino acids. For convenience, the terms “protein”, “polypeptide, and“ peptide ”are used interchangeably herein.
[0050]
  In certain embodiments, the size of at least one protein or peptide is 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, about 110, about 120, about 130, about 140, about 150, about 160, about 170, about 180, about 190, about 200, about 210, about 220, about 230, about 240, about 250, about 275, about 300, about 325, about 350, about 375, about 400, about 425, about 450, about 475, about 500, about 525, about 550, about 575, About 600, about 625, about 650, about 675, about 700, about 725, about 750, about 775, about 800, about 825, about 850, about 875, about 900, about 925, about 950, about 975, about 1 It may include, but is not limited to, 000, about 1100, about 1200, about 1300, about 1400, about 1500, about 1750, about 2000, about 2250, about 2500 amino acid residues or more.
[0051]
  As used herein, “amino acid residue” means any natural amino acid, any amino acid derivative, or any amino acid mimic known in the art. In certain embodiments, the residues of the protein or peptide are contiguous and there are no non-amino acids that interrupt the sequence of amino acid residues. In other embodiments, the sequence may include one or more non-amino acid moieties. In certain embodiments, the sequence of residues of the protein or peptide may be interrupted by one or more amino acid moieties.
[0052]
  Thus, the term “protein or peptide” refers to at least one of the 20 common amino acids found in naturally occurring proteins, or at least one modification, including but not limited to the amino acids shown in Table 1 below. Includes amino acid sequences that contain unusual amino acids.
[0053]
[Table 1]
  Modified and rare amino acids
Figure 0005077862
[0054]
  A protein or peptide is known to those skilled in the art, including expression of a protein, polypeptide or peptide using standard molecular biology techniques, isolation of the protein or peptide from natural sources, or chemical synthesis of the protein or peptide. It may be produced by any technique. Nucleotides and proteins, polypeptides, and peptide sequences corresponding to various genes have been previously disclosed and will be found in computer databases known to those skilled in the art. One such database is the National Center for Biotechnology Information's GenBank and GenPept databases (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/). The coding region of a known gene may be amplified and / or expressed using the techniques disclosed herein or as known to those skilled in the art. Alternatively, various commercial preparations of proteins, polypeptides, or peptides are known to those skilled in the art.
[0055]
Peptidomimetics
  Another embodiment for preparing polypeptides according to the present invention is to use peptidomimetics. Mimetics are peptide-containing molecules that mimic elements of protein secondary structure. See, for example, “Biotechnology and Pharmacy,” edited by Pezzuto et al., Chapman and Hall, New York (1993), Johnson et al. See Peptide Turn Mimetics. The underlying reason behind the use of peptidomimetics is that the peptide backbone of the protein is primarily oriented with amino acid side chains to promote intermolecular interactions such as antibody-antigen interactions. Is a point. Peptidomimetics are expected to allow intermolecular interactions similar to natural molecules. These principles may be used to engineer second generation molecules that have many of the natural properties of the targeting peptides disclosed herein, but have altered and even improved characteristics.
[0056]
Fusion protein
  Another aspect of the invention relates to a fusion protein. These molecules generally have all or a substantial portion of the targeting peptide attached to all or a substantial portion of the second polypeptide or protein at the N-terminus or C-terminus. For example, the fusion may use leader sequences from other species to express the recombinant form of the protein in a heterologous host. Another useful fusion includes adding an immunologically active domain, such as an epitope of an antibody, to facilitate purification of the fusion protein. If a cleavage site is included at or near the fusion site,ExogenousRemoval of the polypeptide will be facilitated. Other useful fusions include linking functional domains such as active sites from enzymes, glycosylation domains, cell targeting signals, or transmembrane regions. In a preferred embodiment, the fusion protein of the invention comprises a targeting peptide conjugated to a therapeutic protein or peptide. Examples of proteins or peptides that may be incorporated into the fusion protein include:Cell division inhibitionProtein, cytocidal protein, pro-apoptotic agent, anti-angiogenic agent, hormone, cytokine, growth factor, peptide drug, antibody, Fab fragment antibody, antigen, receptor protein, enzyme, lectin, MHC protein, cell adhesion protein, and binding Contains protein. These examples are not meant to be limiting, and it is contemplated that the protein or peptide can be incorporated into a fusion protein comprising a targeting peptide, substantially within the scope of the present invention. Methods for making fusion proteins are well known to those skilled in the art. Such proteins can be linked, for example, by chemical conjugation using a bifunctional crosslinker, by de novo synthesis of a complete fusion protein, or by linking a DNA sequence encoding a targeting peptide to a DNA sequence encoding a second peptide or protein. Can then be produced by expressing an intact fusion protein.
[0057]
Protein purification
  In certain embodiments, the protein or peptide may be isolated or purified. Protein purification techniques are well known to those skilled in the art. These techniques include homogenization and coarse fractionation of cells, tissues, or organs at one level into polypeptide and non-polypeptide fractions. The protein or polypeptide of interest may be further purified using chromatography and electrophoresis techniques to obtain partial or complete purification (or purification to homogeneity). Analytical methods that are particularly suitable for the preparation of pure peptides are ion exchange chromatography, gel exclusion chromatography, polyacrylamide gel electrophoresis, affinity chromatography, immunoaffinity chromatography, and isoelectric focusing. An example of receptor protein purification by affinity chromatography is disclosed in US Pat. No. 5,206,347, the entire text of which is incorporated herein by reference. A particularly efficient method for purifying peptides is:high speedProtein liquid chromatography (FPLC) or HPLC.
[0058]
  A purified protein or peptide is taken to mean a composition that can be isolated from other components in which the protein or peptide is purified to any degree as compared to its naturally obtained state. Thus, an isolated or purified protein or peptide likewise refers to a protein or peptide that does not contain a naturally occurring environment. In general, "purified" is a protein that has been fractionated to remove various other components and whose composition substantially retains its expressed biological activity. Or it may mean a peptide composition. When the term “substantially purified” is used, the term means that the protein or peptide is about 50%, about 60%, about 70%, about 80%, about 90%, about 95% of the protein in the composition. Means a composition that forms the main component of the composition, such as constituting% or more.
[0059]
  Various methods for quantifying the degree of purification of a protein or peptide are known to those of skill in the art in light of the present disclosure. These include, for example, determining the specific activity of the active fraction or assessing the amount of polypeptide within the fraction by SDS / PAGE analysis. A preferred method of assessing the purity of the fraction is to calculate the specific activity of the fraction, compare it to the specific activity of the original extract, and thus, as assessed by “˜purification factor”, It is to calculate its purity. The actual unit used to indicate the amount of activity will, of course, depend on the particular assay technique chosen to effect purification and whether the expressed protein or peptide exhibits detectable activity. I will.
[0060]
  Various techniques suitable for use in protein purification are well known to those skilled in the art. These include, for example, ammonium sulfate, PEG, precipitation with antibodies, or centrifugation after heat denaturation.SeparationChromatographic steps such as ion exchange, gel filtration, reverse phase, hydroxyapatite, and affinity chromatography; isoelectric focusing; gel electrophoresis; and combinations of these and other techniques. As is generally known in the art, the order in which the various purification steps are performed may be altered, or certain steps may be omitted, and still substantially purified. A suitable method for preparing a protein or peptide is obtained.
[0061]
  There is no general requirement that the protein or peptide always be provided in their most purified state. In fact, substantially less purified products are considered useful in certain embodiments. Partial purification may be performed using a combination of fewer purification steps or using different types of the same general purification scheme. For example, it is recognized that cation exchange column chromatography performed using an HPLC apparatus will generally provide a greater purification “magnification” than the same technique using a low pressure chromatography system.Methods that exhibit a relatively lower degree of purification may have advantages in maintaining the overall yield of the protein product or the activity of the expressed protein.
[0062]
  Affinity chromatography is a chromatographic technique that relies on the specific affinity between the material to be isolated and the molecule to which it specifically binds. This is a receptor-ligand type interaction. Column material shares one binding partner with an insoluble matrixJoinIt is synthesized by coupling. The column material can then specifically absorb the substance from the solution. Elution occurs when conditions are changed to conditions that do not cause binding (eg, changes in pH, ionic strength, temperature, etc.). The matrix must be a substance that does not absorb molecules to any significant extent and that has a wide range of chemical, physical, and thermal stability. The ligand must be coupled so that it does not affect its binding properties. The ligand must provide a relatively strong bond. And it must be possible to elute the substance without destroying the sample or the ligand.
[0063]
Synthetic peptide
  Since the targeting peptides of the present invention are relatively small in size, they can be synthesized on a solution or solid support according to conventional techniques. Various automatic synthesizers are commercially available and can be used according to known protocols. For example, Stewart and Young, 1984; Tam et al., 1983; Merrifield, 1986; and Barany and Merrifield, each of which is incorporated herein by reference. (Merrifield), 1979. In general, short peptide sequences of about 6 to about 35-50 amino acids can be readily synthesized by such methods. Alternatively, recombinant DNA technology may be used in which a nucleotide sequence encoding the peptide of the present invention is inserted into an expression vector, transformed or transfected into a suitable host cell, and cultured under conditions suitable for expression.
[0064]
antibody
  In certain embodiments, it may be desirable to generate antibodies against the identified targeting peptide or its receptor. Coupling, bonding, binding to a suitable targeting peptide or receptor, or part thereof, to one or more substances by a linker, polylinker, or derivatized amino acid,JoiningOr may be chemically coupled. this is,DoubleSpecific or multivalent compositions or vaccines may be produced. It is further envisioned that the methods used in the preparation of these compositions are well known to those skilled in the art and must be suitable for administration to humans, i.e., pharmaceutically acceptable. A preferred substance is a carrier, keyhole limpet hemocyanin (KLH), or bovine serum albumin (BSA).
[0065]
  The term “antibody” refers to an antigenJoinUsed to mean any antibody-like molecule with a region, Fab ′, Fab, F (ab ′)2Antibody fragments such as single chain domain antibodies (DABs), Fv, scFv (single chain Fv) and the like. Techniques for preparing and using various antibody-based constructs and fragments are well known in the art. Means for preparing and characterizing antibodies are also well known in the art (see, eg, “Antibodies: A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988; Incorporated in the description).
[0066]
Cytokines and chemokines
  In certain embodiments, it may be desirable to couple a specific bioactive agent to one or more targeting peptides for targeted delivery to an organ, tissue, or cell type. Such substances include but are not limited to cytokines, chemokines, pro-apoptotic factors, and anti-angiogenic factors. The term “cytokine” is a generic term for proteins released by one cell population that act on another cell as an intercellular mediator. Examples of such cytokines are lymphokines, monokines, growth factors, and conventional polypeptide hormones. Cytokines include human growth hormone, growth hormone such as N-methionyl human growth hormone, and bovine growth hormone; parathyroid hormone; thyroxine; insulin; proinsulin; relaxin; prorelaxin; follicle stimulating hormone (FSH), thyroid stimulating hormone (TSH), and glycoprotein hormones such as luteinizing hormone (LH); liver growth factor; prostaglandin, fibroblast growth factor, prolactin; placental lactogen, OB protein; tumor necrosis factor-α and tumor necrosis factor- β; Murrelian inhibitor; mouse gonadotropin related peptide; inhibin; activin; vascular endothelial growth factor; integrin; thrombopoietin (TPO); nerve growth factor like NGF-β; platelet growth factor; like TGF-α and TGF-β Transforming growth factor (TGF) Insulin-like growth factor-I and insulin-like growth factor-II; erythropoietin (EPO); osteoinductive factor; interferons such as interferon-α, -β, and -γ; macrophage-CSF (M-CSF), granulocyte- Colony stimulating factors (CSF) such as macrophage-CSF (GM-CSF) and granulocyte-CSF (G-CSF); IL-1, IL-1α, IL-2, IL-3, IL-4, IL -5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17 Interleukin (IL) such as IL-18, LIF, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, EPO, kit-ligand or FLT-3, angiostatin, thrombospondin, endostatin, tumor necrosis factor As well as LT. As used herein, the term cytokine includes proteins from natural sources or from recombinant cell culture, and biologically active equivalents of native sequence cytokines.
[0067]
  Chemokines generally act as chemoattractants to recruit immune effector cells to chemokine expression sites. For example, it may be advantageous to express certain chemokine genes in combination with cytokine genes to enhance the recruitment of other immune system components to the treatment site. Chemokines include, but are not limited to, RANTES, MCAF, MIP1-α, MIP1-β, and IP-10. One skilled in the art will recognize that certain cytokines are known to have chemoattractant effects as well, and can be classified under the term chemokine as well.
[0068]
Contrast media and radioisotopes
  In certain embodiments, the peptides or proteins claimed in the present invention may be conjugated to a contrast agent used to image and diagnose organs, tissues, or cell types with various diseases. Many suitable contrast agents are known in the art, along with methods for attaching them to proteins or peptides (see, eg, US Pat. Nos. 5,021,236 and 4,472,509, both incorporated herein by reference). ) The protein or peptide may also be reacted with the enzyme in the presence of a coupling agent such as glutaraldehyde or periodate. With fluorescent markerZygoteAre prepared in the presence of these coupling agents or by reaction with isothiocyanates.
[0069]
  Non-limiting examples of paramagnetic ions that may be used as contrast agents include chromium (III), manganese (II), iron (III), iron (II), cobalt (II), nickel (II) , Copper (II), neodymium (III), samarium (III), ytterbium (III), gadolinium (III), vanadium (II), terbium (III), dysprosium (III), holmium (III), and erbium (III) ) And gadolinium is particularly preferred. Ions useful in other situations such as X-ray imaging include lanthanum (III), gold (III), lead (II) and especially bismuth(III)Is included, but is not limited to these.
[0070]
  Radioisotopes that may be used as contrast or therapeutic agents include astatine211,14carbon,51chromium,36chlorine,57cobalt,58Cobalt, copper67,152Europium, gallium67,ThreeHydrogen, iodineone two Three,Iodine125,Iodine131,indium111,59iron,32Phosphorus, rhenium186,rhenium188,75Selenium,35Sulfur, technetium99m, And yttrium90Is included.125I is often preferred for use in certain embodiments and technetium99mSimilarly, indium 111 is also preferred because it is similarly low energy and suitable for long range detection.
[0071]
  The radioactively labeled protein or peptide of the present invention may be produced according to methods well known in the art. For example, they can be iodinated by contact with a chemical oxidant such as sodium or potassium iodide and sodium hypochlorite or an enzymatic oxidant such as lactoperoxidase. A protein or peptide according to the invention is labeled by a ligand exchange process, for example by reducing pertechnate with a tin solution and chelating the reduced technetium on a Sephadex column and applying the peptide to this column or directly. Depending on the technology, for example pertechnate, SNCl2Technetium by incubating reducing substances such as, buffers such as sodium potassium phthalate solution, and peptides99mYou may label by. Intermediate functional groups often used to bind to radioisotopes present as metal ions are diethylenetriaminepentaacetic acid (DPTA) and ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA). It is contemplated that fluorescent labels including rhodamine, fluorescein isothiocyanate, and renographin may be used as well.
[0072]
  In certain embodiments, the claimed protein or peptide may bind to a secondary binding ligand or enzyme (enzyme tag) that produces a colored product when contacted with a chromogenic substrate. Examples of suitable enzymes include urease, alkaline phosphatase, (horseradish) hydrogen peroxidase, and glucose oxidase. Preferred secondary binding ligands are biotin and avidin or streptavidin compounds. The use of such labels is well known to those skilled in the art, for example, U.S. Pat. Nos. 3,817,837, 3,850,752, 3,939,350, 3,996,345; 4,277,437; each incorporated herein by reference. 4,275,149; and 4,366,241.
[0073]
Cross-linker
  Bifunctional cross-linking reagents are widely used for a variety of purposes including affinity matrix preparation, various structural modifications and stabilization, identification of ligand and receptor binding sites, and structural studies. Homobifunctional reagents with two identical functional groups are used to induce cross-linking between the same and different polymers or polymer subunits, andPolyIt has been found that it is very efficient for binding peptide ligands to their specific binding sites. Heterobifunctional reagents contain two different functional groups. By taking advantage of the different reactivity of the two different functional groups, the crosslinking can be controlled selectively and continuously. Bifunctional cross-linking reagents are specific to their functional group, eg amino, sulfhydryl, guanidino, indole, carboxyl specificBaseCan be classified. Of these, reagents for free amino groups have become particularly common because of their commercial availability, ease of synthesis, and the mild reaction conditions to which they can be applied. The majority of heterobifunctional cross-linking reagents contain primary amine reactive groups and thiol reactive groups.
[0074]
  Exemplary methods for cross-linking ligands to liposomes are described in US Pat. No. 5,603,872 and US Pat. No. 5,401,511, each of which is specifically incorporated herein by reference. Various ligands can be covalently bound to the liposome surface by cross-linking of amine residues. Liposomes, especially multi-layered vesicles (MLV) or unilamellar vesicles such as microemulsified liposomes (MEL) and large unilamellar liposomes (LUVET), each containing phosphatidylethanolamine (PE), are prepared by established techniques Has been. The inclusion of PE in the liposomes provides an active functional residue, a primary amine, on the liposome surface for crosslinking purposes. Ligands such as epidermal growth factor (EGF) have been successfully bound to PE-liposomes. The ligand is covalently bound to a distinct site on the liposome surface. The number and surface density of these sites depends on the liposome formulation and the liposome type. The liposome surface may also have non-covalent binding sites. Crosslinking reagents have been investigated for efficacy and biocompatibility to form covalent conjugates of ligands and liposomes. Cross-linking reagents include glutaraldehyde (GAD), bifunctional oxirane (OXR), ethylene glycol diglycidyl ether (EGDE), and water soluble carbodiimide, preferably 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC). ) Is included. Crosslinking complex chemistry establishes the bond between the amine residue of the recognition substance and the liposome.
[0075]
  In another example, heterobifunctional cross-linking reagents and methods using cross-linking reagents are described (especially US Pat. No. 5,889,155, which is hereby incorporated by reference in its entirety). The cross-linking reagent can combine a nucleophilic hydrazide residue with an electrophilic maleimide residue, thereby coupling the aldehyde to the free thiol in one example. Cross-linking reagents can be modified to cross-link various functional groups.
[0076]
Nucleic acid
  The nucleic acid according to the present invention may encode a targeting peptide, receptor protein, or fusion protein. The nucleic acid may be derived from genomic DNA, complementary DNA (cDNA), or synthetic DNA. If it is desired to incorporate into an expression vector, the nucleic acid may also contain a natural intron or an intron derived from another gene. Such engineered molecules are sometimes referred to as “minigenes”.
[0077]
  As used herein, “nucleic acid” includes DNA, RNA, chemically modified nucleic acids and nucleic acid analogs, as well as single and double stranded molecules. Nucleic acids within the scope of the present invention are 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23. , 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 , 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 99, 100, about 110, about 120, about 130, about 140, about 150, about 160, about 170, about 180, about 190, about 200, about 210, about 220, about 230, about 240, about 250, About 275, about 300, about 325, about 350, about 375, about 400, about 425, about 450, about 475, about 500, about 525, about 550, about 575, about 600, about 625, about 650, about 675 About 700, about 725, about 750, about 775, about 800, about 825, about 850, about 875, about 900, about 925, about 950, about 975, about 1000, about 1100, about 1200, about 1300, about 1400, about 1500, about 1750, about 2000, about 2 It is contemplated that the length may be 250, about 2500 nucleotide residues or longer.
[0078]
  It is contemplated that the targeting peptide, fusion protein, and receptor can be encoded by any nucleic acid sequence that encodes the appropriate amino acid sequence. The design and production of nucleic acids encoding the desired amino acid sequence is well known to those skilled in the art using standardized codon tables (see Table 2 below). In preferred embodiments, the codons selected to encode each amino acid may be modified to optimize nucleic acid expression in the host cell of interest. The codon selectivity of various species of host cells is well known in the art.
[0079]
[Table 2]
Figure 0005077862
[0080]
  In addition to nucleic acids encoding the desired targeting peptide, fusion protein or receptor amino acid sequence, the present invention includes complementary nucleic acids that hybridize under high stringency conditions to such encoding nucleic acid sequences. High stringency conditions for nucleic acid hybridization are well known in the art. For example, the conditions may include low salt and / or high temperature conditions, such as those provided by about 0.02 M to about 0.15 M NaCl at a temperature of about 50 ° C. to about 70 ° C. The temperature and ionic strength of the desired stringency depends on the specific nucleic acidLength of, In part, by the length or nucleotide content of the target sequence, the charged composition of the nucleic acid, and the presence or concentration of formamide, tetramethylammonium chloride, or other solvent in the hybridization mixture.
[0081]
Vectors for cloning, gene transfer, and expression
  In certain embodiments, an expression vector can be used to express a targeting peptide or fusion protein which can then be purified and used. In other embodiments, the expression vector is used in gene therapy. Expression requires that an appropriate signal be provided in the vector, and the virus promotes expression of the gene of interest in the host cell andMammalVarious regulatory elements such as enhancers / promoters from both sources are included. Elements designed to optimize messenger RNA stability and translatability in host cells are also known.
[0082]
Regulatory elements
  The term “expression construct” or “expression vector” is meant to include any type of genetic construct that includes a nucleic acid that encodes a gene product in which part or all of the nucleic acid coding sequence can be transcribed. To do. In a preferred embodiment, the nucleic acid encoding the gene product is under transcriptional control of a promoter. “Promoter” refers to a DNA sequence that is recognized by the cell's synthetic machinery or introduced synthetic machinery and is required to initiate specific transcription of a gene. The term “under transcriptional control” means that the promoter is in the correct position and orientation relative to the nucleic acid in order to control RNA polymerase initiation and gene expression.
[0083]
  The particular promoter used to control the expression of the nucleic acid sequence of interest is considered insignificant as long as it can direct the expression of the nucleic acid in the target cell. Thus, when a human cell is the target, it is preferable to place the nucleic acid coding region adjacent to and under the control of a promoter that can be expressed in the human cell. In general, such promoters may include either human or viral promoters.
[0084]
  In various embodiments, the human cytomegalovirus (CMV) immediate early gene promoter, SV40initialA promoter, rous sarcoma virus long terminal repeat, rat insulin promoter, and glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase promoter can be used to obtain high level expression of the coding sequence of interest. To obtain expression of the coding sequence of interest, other viruses known in the art orMammalSimilarly, the use of a cellular promoter or bacterial phage promoter is also contemplated as long as the expression level is sufficient for a given purpose.
[0085]
  If a cDNA insert is used, this will typically include a polyadenylation signal to effect proper polyadenylation of the gene transcript. The nature of the polyadenylation signal is not believed to be critical to the success of the practice of the invention, and any such sequences, such as human growth hormone, and SV40 polyadenylation signal may be used. Similarly, terminators are similarly considered as elements of expression constructs. These elements can act to increase message levels and minimize read through from the construct to other sequences.
[0086]
Selection marker
  In certain embodiments of the invention, cells comprising a nucleic acid construct of the invention may be identified in vitro or in vivo by including a marker in the expression construct. Such markers will confer identifiable changes to the cells so that cells containing the expression construct can be easily identified. In general, the inclusion of drug selectable markers helps in the cloning and selection of transformants. For example, genes that confer resistance to neomycin, puromycin, hygromycin, DHFR, GPT, zeocin, and histidinol are useful selectable markers. Alternatively, an enzyme such as herpes simplex virus thymidine kinase (tk) or an enzyme such as chloramphenicol acetyltransferase (CAT) may be used. Immunological markers can be used as well. The selectable marker used is not considered critical as long as it can be expressed simultaneously with the nucleic acid encoding the gene product. Additional examples of selectable markers are well known to those skilled in the art.
[0087]
Expression vector delivery
  There are many ways to introduce expression vectors into cells. In certain embodiments of the invention, the expression construct comprises a virus or engineered construct derived from a viral genome. Because certain viruses can enter cells by receptor-mediated endocytosis, can be integrated into the host cell genome, and can stably and efficiently express viral genes, theyMammalIt is an attractive candidate for transferring foreign genes into cells (Ridgeway, 1988; Nicolas and Rubenstein, 1988; Baichwal and Sugden, 1986; Temin, 1986). In general, preferred gene therapy vectors are viral vectors.
[0088]
  Some viruses that can tolerate foreign genetic material areContainmentAlthough the number of nucleotides that can be done and the range of cells they can infect is limited, these viruses have proven successful in gene expression. However, adenoviruses do not incorporate their genetic material into the host genome and thus do not require host replication for gene expression, so they are ideally suited for rapid, efficient, heterologous gene expression . Techniques for preparing replication defective viruses are well known in the art.
[0089]
  When using viral delivery systems, essentially eliminate unwanted contaminants such as defective interfering virus particles or endotoxins and other pyrogens so that they do not cause unwanted reactions in cells, animals or individuals that receive the vector construct. It may be desirable to purify the virions sufficiently to avoid inclusion. A preferred means of purifying the vector is cesium chloride gradient centrifugation.SeparationlikeFloatingUsing a density gradient.
[0090]
  DNA viruses used as gene vectors include papovaviruses (eg, simian virus 40, bovine papilloma virus, and polyoma) (Ridgeway, 1988; Baichwal and Sugden, 1986) and adenoviruses (Ridgeway, 1988; Baichwal and Sugden, 1986) Is included.
[0091]
  One preferred method for in vivo delivery involves using an adenoviral expression vector. Adenoviral vectors are known to have low integration capacity for genomic DNA, but this feature is offset by the high gene transfer efficiency obtained by these vectors. An “adenoviral expression vector” includes adenoviral sequences sufficient to (a) support packaging of the construct and (b) express an antisense or sense polynucleotide cloned therein. Means including but not limited to constructs.
[0092]
  Expression vectors include adenovirus genetically engineered forms. If it is understood that the adenoviral gene structure is a 36 kb linear double-stranded DNA virus, it is possible to replace large fragments of adenoviral DNA with foreign sequences up to 7 kb (Grunhaus and Horwitz 1992). In contrast to retroviral infection, adenoviral infection of host cells does not cause chromosomal integration because adenoviral DNA can replicate in the episome and does not exhibit potential genotoxicity. Similarly, adenovirus is structurally stable and no genome rearrangement has been detected after sufficient amplification. Adenovirus can infect virtually all epithelial cells regardless of their cell cycle stage. To date, adenovirus infections appear to be associated with very mild illnesses such as acute respiratory disease in humans.
[0093]
  Adenovirus is particularly suitable for use as a gene transfer vector because of its moderate genome size, ease of manipulation, high titer, wide cell range, and high infectivity. . Both ends of the viral genome contain 100-200 base pair inverted repeats (ITRs), which are cis elements necessary for viral DNA replication and packaging. The early (E) and late (L) regions of the genome contain different transcription units that are divided by the onset of viral DNA replication. The E1 region (E1A and E1B) encodes proteins involved in the regulation of transcription of the viral genome and several cellular genes. Expression of the E2 region (E2A and E2B) results in the synthesis of proteins for viral DNA replication. These proteins are involved in DNA replication, late gene expression, and host cell blockade (Renan, 1990). The product of a late gene containing the majority of viral capsid proteins is expressed only after significant processing of a single major transcript produced by the major late promoter (MLP). MLP (present in 16.8 mu) is particularly efficient in the late stages of infection, and all mRNAs derived from this promoter have 5'-3 tripartite leader (TPL) sequences, thereby Is a preferred mRNA for translation.
[0094]
  In currently used systems, recombinant adenoviruses are generated by homologous recombination between shuttle vectors and proviral vectors. Due to possible recombination between the two proviral vectors, wild-type adenovirus may result from this process. It is therefore important to isolate a single clone of the virus from each plaque and examine its genomic structure.
[0095]
  The generation and propagation of replication-deficient adenoviral vectors relies on a unique helper cell line called 293 that is transformed from human fetal kidney cells with Ad5 DNA fragments and constitutively expresses the E1 protein (Graham et al., 1977 ). Because the E3 region is not important for the adenoviral genome (Jones and Shenk, 1978), current adenoviral vectors with the help of 293 cells put foreign DNA into E1, E3, or both regions (Graham and Prevec et al., 1991). In essence, adenovirus can package approximately 105% of the wild-type genome (Ghosh-Choudhury et al., 1987), providing an extra DNA capacity of approximately 2 kb. When combined with about 5.5 kb of DNA that can be substituted in the E1 and E3 regions, the maximum capacity of current adenoviral vectors is 7.5 kb or less, or about 15% of the total length of the vector. More than 80% of the adenovirus virus genome remains in the vector backbone and is vector mediatedCytotoxicityCause. Similarly, the replication deficiency of E1 deletion virus is incomplete. For example, leakage of viral gene expression is observed with high multiplicity of infection (MOI) for currently available vectors (Mulligan, 1993).
[0096]
  Helper cell lines may be derived from human cells such as human fetal kidney cells, muscle cells, hematopoietic cells, or other human fetal mesenchymal cells or epithelial cells. Alternatively, helper cells may be other permissive for human adenovirus.MammalIt may be derived from a seed cell. Such cells include, for example, Vero cells, or other monkey fetal mesenchymal or epithelial cells. As discussed, the preferred helper cell line is 293.
[0097]
  Racher et al. (1995) disclosed an improved method of culturing 293 cells to propagate adenovirus. In one format, individual cells are seeded into 1 L siliconized spinner flasks (Techne, Cambridge, UK) containing 100-200 ml of medium to grow native cell aggregates. After stirring at 40 rpm, cell viability is estimated with trypan blue. In another form, Fibra-cell microcarriers (5 g / l) (BibbySterlin, Stone, UK) are used as follows. The cell inoculum resuspended in 5 ml of medium was added to the carrier (50 ml) in a 250 ml Arlenmeyer flask and allowed to stand for 1 to 4 hours with occasional stirring. The medium is then replaced with 50 ml of fresh medium and shaking is started. To produce virus, the cells are grown to approximately 80% confluence, after which the medium is changed (25% of the final volume) and adenovirus is added at a MOI of 0.05. The culture is left overnight, after which the volume is increased to 100% and shaken for a further 72 hours.
[0098]
  Other than the requirement that the adenoviral vector is replication defective or at least conditionally defective, the characteristics of the adenoviral vector are not believed to be critical to the successful practice of the invention. The adenovirus may be any of the 42 known different serotypes or subgroups AF. Subgroup C adenovirus type 5 is a preferred starting material for obtaining the conditional replication-deficient adenovirus vector used in the present invention. This is because type 5 adenovirus is a human adenovirus for which vast biochemistry and genetic information is known, and so this adenovirus has historically been used in most constructs that use adenovirus as a vector. Has been used.
[0099]
  A typical vector applicable for practicing the invention is replication defective and will not have an adenovirus E1 region. Thus, it is most convenient to introduce a polynucleotide encoding a gene at a position where the E1 coding sequence has been removed. However, the position of insertion of the construct within the adenovirus sequence is not critical. The polynucleotide encoding the gene of interest is similarly E4 deficient in place of the E3 region deleted in the E3 replacement vector as described by Karlsson et al., 1986, or in helper cell lines or helper viruses. May be inserted instead of the E4 region.
[0100]
  Adenovirus is easy to grow and manipulate and exhibits broad host range in vitro and in vivo. This group of viruses has a high titer, eg 109~Ten11Plaque-forming units / ml can be obtained and they are very infectious. The life cycle of the adenovirus need not be integrated into the host cell genome. The foreign gene delivered by the adenoviral vector is episomal and therefore has low genotoxicity to the host cell. No side effects have been reported in studies vaccinated with wild-type adenovirus (Couch, 1963; Top et al., 1971), demonstrating its safety and therapeutic potential as an in vivo gene transfer vector.
[0101]
  Adenoviral vectors have been used for eukaryotic gene expression (Levrero et al., 1991; Gomez-Foix et al., 1992) and vaccine development (Grunhaus and Horwitz, 1992; Graham and Prevec, 1991). Animal studies suggested that recombinant adenoviruses can be used for gene therapy (Stratford-Perricaudet and Perricaudet, 1991; Stratford-Perricaudet et al., 1990; Rich et al., 1993). Studies that administer recombinant adenovirus to different tissues include tracheal infusion (Rosenfeld et al., 1991; Rosenfeld et al., 1992), intramuscular injection (Ragot et al., 1993), peripheral venous injection (Herz and Gerard, 1993), and brain Stereotaxic injection (Le Gal La Salle et al., 1993) is included.
[0102]
  Other gene transfer vectors may be constructed from retroviruses. Retroviruses are a group of single-stranded RNA viruses characterized by the ability to convert their RNA into double-stranded DNA in infected cells by the process of reverse transcription (Coffin, 1990). The resulting DNA is then stably integrated into the cell's chromosome as a provirus and directs the synthesis of viral proteins. Integration retains the viral gene sequence in the recipient cell and its progeny. The retroviral genome contains three genes, gag, pol, and env that code for capsid proteins, polymerase enzyme, and envelope components, respectively. The sequence found upstream from the gag gene contains a signal for packaging the genome into virions. Two long terminal repeat (LTR) sequences are present at the 5 ′ and 3 ′ ends of the viral genome. These contain strong promoter and enhancer sequences and are also required for integration into the host cell genome (Coffin, 1990).
[0103]
  To construct a retroviral vector, a nucleic acid encoding a protein of interest is inserted into the viral genome instead of a specific viral sequence to create a virus that is replication defective. In order to produce virions, a packaging cell line containing the gag, pol, and env genes but without the LTR and packaging components is constructed (Mann et al., 1983). When a recombinant plasmid containing cDNA along with retroviral LTR and packaging sequences is introduced into this cell line (eg, calcium phosphatePrecipitationThe packaging sequence allows the RNA transcript of the recombinant plasmid to be packaged into a viral particle, which is then secreted into the culture medium (Nicolas and Rubenstein, 1988; Temin, 1986; Mann et al. 1983). Next, collect the medium containing the recombinant retrovirus,AnyConcentrated and used for gene transfer. Retroviral vectors can infect a wide variety of cell types. However, for integration and stable expression,division(Paskind et al., 1975).
[0104]
  There are certain limitations to using retroviral vectors. For example, retroviral vectors are usually integrated at random sites in the cell genome. Thus, insertional mutagenesis can occur by disruption of the host gene or by insertion of viral regulatory sequences that can interfere with the function of adjacent genes (Varmus et al., 1981). Another concern when using defective retroviral vectors is the possibility of wild-type replicating competent viruses appearing in packaging cells. This may be due to a recombination event in which the intact sequence from the recombinant viral insert upstream from the gag, pol, env sequence is incorporated into the host cell genome. However, new packaging cell lines are now available and they should greatly reduce the possibility of recombination (Markowitz et al., 1988; Hersdorffer et al., 1990).
[0105]
  Other viral vectors may be used as expression constructs. Viruses such as vaccinia virus (Ridgeway, 1988; Baichwal and Sugden, 1986; Coupar et al., 1988), adeno-associated virus (AAV) (Ridgeway, 1988; Baichwal and Sugden, 1986; Hermonat and Muzycska, 1984), and herpes viruses Vectors derived from can also be used. They are variousMammalIt provides several attractive characteristics for cells (Friedmann, 1989; Ridgeway, 1988; Baichwal and Sugden, 1986; Coupar et al., 1988; Horwich et al., 1990).
[0106]
  Incubate the expression constructMammalSeveral non-viral methods for transferring to cells are also contemplated by the present invention. These include calcium phosphate precipitation (Graham and Van Der Eb, 1973; Chen and Okayama, 1987; Rippe et al., 1990), DEAE dextran (Gopal, 1985), electroporation (Tur-Kaspa et al., 1986; Potter et al., 1984). ), Direct microinjection, DNA-loaded liposomes, and lipofectamine-DNA complexes, sonication of cells, gene collisions using high-speed microbullets, and receptor-mediated transfection (Wu and Wu, 1987; Wu and Wu, 1988) ) Is included. Some of these techniques may be successfully adapted for in vivo or ex vivo use.
[0107]
  In a further aspect of the invention, the expression construct may be encapsulated in a liposome. Liposomes are vesicular structures characterized by a phospholipid bilayer membrane and an inner aqueous medium. Multilamellar liposomes have multiple lipid layers separated by an aqueous medium. They form spontaneously when phospholipids are suspended in an excess of aqueous solution. The lipid component undergoes self-rearrangement before forming a closed structure, trapping water and dissolved solutes between the lipid bilayers. Similarly, lipofectamine-DNA complexes are contemplated.
[0108]
  Liposome-mediated nucleic acid delivery and in vitro expression of foreign DNA has been very successful. Wong et al. (1980) demonstrated the feasibility of liposome-mediated delivery and expression of foreign DNA in cultured chicken embryos, HeLa, and hepatoma cells. Nicolau et al. (1987) succeeded in liposome-mediated gene transfer in rats after intravenous injection.
[0109]
  Many selection systems may be used including, but not limited to, HSV thymidine kinase, hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase, and adenine phosphoribosyltransferase genes in tk cells, hgprt cells, or apart cells, respectively. Similarly, antimetabolite resistance, dhfr conferring resistance to methotrexate, gpt conferring resistance to mycophenolic acid, neo conferring resistance to aminoglycoside G418, and hygromy conferring resistance to hygromycin. Can be used as a basis for selecting.
[0110]
Pharmaceutical composition
  When considering clinical applications, pharmaceutical composition expression vectors, viral stocks, proteins, antibodies, andDrugMay need to be prepared in a form suitable for the intended application. Generally, this will involve preparing a composition that is essentially free of impurities that may be harmful to humans or animals.
[0111]
  In general, it will be desirable to use appropriate salts and buffers so that the delivery vector is stable and can be taken up by the target cells. A buffer is also used when introducing recombinant cells into a patient. The aqueous composition of the present invention comprises an effective amount of a protein or peptide dissolved or dispersed in a pharmaceutically acceptable carrier or aqueous medium. Such a composition is likewise called an inoculum. The term “pharmaceutically or pharmacologically acceptable” refers to molecular entities and compositions that do not cause adverse, allergic, or other undesirable reactions when administered to animals or humans. As used herein, “pharmaceutically acceptable carrier” includes any and all solvents, dispersion media, coatings, antibacterial and antifungal agents, isotonic and absorption delaying agents and the like. The use of such media and materials for pharmaceutically active substances is well known in the art. Except insofar as conventional media or materials are incompatible with the proteins or peptides of the present invention, they are contemplated for use in therapeutic compositions. Supplementary active ingredients can also be incorporated into the compositions.
[0112]
  The active compositions of the present invention may include classic pharmaceutical preparations. These compositions according to the invention are administered by any common route so long as the target tissue is available by that route. This includes oral, nasal, buccal, rectal, vaginal, or topical administration. Alternatively, administration may be orthotopic, intradermal, subcutaneous, intramuscular, intraperitoneal, intraarterial, or intravenous injection. Such compositions will normally be administered as the pharmaceutically acceptable compositions described above.
[0113]
  Pharmaceutical dosage forms suitable for use by injection include sterile aqueous solutions or dispersions and sterile powders for the extemporaneous preparation of sterile injectable solutions or dispersion. In all cases, the formulation must be sterile and must be fluid to the extent that easy syringability exists. It must be stable at the conditions of manufacture and storage and must be preserved against the contaminating action of microorganisms such as bacteria and fungi. The carrier can be a solvent or dispersion medium containing, for example, water, ethanol, polyol (for example, glycerol, propylene glycol, and liquid polyethylene glycol, and the like), suitable mixtures thereof, and vegetable oils. The proper fluidity can be maintained, for example, by the use of a coating such as lecithin, by the maintenance of the required particle size in the case of dispersion and by the use of surfactants. Prevention of the action of microorganisms can be obtained by various antibacterial and antifungal agents, for example, parabens, chlorobutanol, phenol, sorbic acid, thimerosal, and the like. In many cases, it will be preferable to include isotonic agents, for example, sugars or sodium chloride. Prolonged absorption of the injectable compositions can be brought about by using in the composition an agent which delays absorption, for example, aluminum monostearate and gelatin.
[0114]
  Sterile injectable solutions are prepared by incorporating the required amount of the active compound in a suitable solvent with the various other ingredients listed above and, if necessary, filter sterilizing. Generally, dispersions are prepared by incorporating various sterilized active ingredients into a sterile medium. In the case of sterile powders for preparing injectable sterile solutions, the preferred method of preparation is the vacuum drying and lyophilization techniques that yield a powder of the active ingredient and any further desired ingredients from the solution previously filter sterilized.
[0115]
Therapeutic agent
  In certain embodiments, the chemotherapeutic agent may be coupled to a targeting peptide or fusion protein for selective delivery to the tumor. Substances or factors suitable for use may include any chemical compound that induces DNA damage when applied to a cell. Chemotherapeutic agents include 5-fluorouracil, bleomycin, busulfan, camptothecin, carboplatin, chlorambucil, cisplatin (CDDP), cyclophosphamide, dactinomycin, daunorubicin, doxorubicin, estrogen receptor binding substance, etoposide (VP16), farnesyl -Protein transferase inhibitors, gemcitabine, ifosfamide, mechlorethamine, melphalan, mitomycin, navelbine, nitrosourea, pricomycin, procarbazine, raloxifene, tamoxifen, taxol, temazolomide (water soluble form of DTIC), transplatinum, vinblastine and methotrexate, vincristine Or any analog or derivative variant described above, but not limited thereto. Most chemotherapeutic agents fall into the following categories: alkylating agents, antimetabolites, antitumor antibiotics, corticosteroid hormones,YarnMitotic inhibitors, and nitrosoureas, hormonal substances, miscellaneous substances, and any analog or derivative variants thereof.
[0116]
  Chemotherapeutic agents and methods of administration, dosages, etc. are well known to those of skill in the art (eg, “Doctor's Collection”, Goodman and Gilman “Treatment Pharmacology,” the relevant portions of which are incorporated herein by reference. The Pharmacological Basis of Therapeutics ”and“ Remington's Pharmaceutical Sciences ”), may be combined with the present invention in light of the disclosure herein. Any change in dosage will occur as necessary depending on the condition of the subject to be treated. The person responsible for administration will, in any event, determine the appropriate dose for the individual subject. Examples of specific chemotherapeutic agents and dosage regimes are also described herein. Of course, all of these doses and substances and dosing regimes are by way of example, not limitation, and other doses or substances may be used by those skilled in the art for a particular patient or application. Any dose between these points, or a range derivable therefrom, is also expected to be used in the present invention.
[0117]
Alkylating agent
  Alkylating agents interact directly with genomic DNA to prevent cancer cell growthDrugIt is. This category of chemotherapeutic agentsPeriodThat is, they arePeriodRepresents a non-specific substance. Alkylating agents may include, but are not limited to, nitrogen mustard, ethylenimene, methyl melamine, alkyl sulfonate, nitrosourea, or triazine. They include but are not limited to busulfan, chlorambucil, cisplatin, cyclophosphamide (cytoxan), dacarbazine, ifosfamide, mechloretamine (mastergen), and melphalan.
[0118]
Antimetabolite
  Antimetabolites disrupt DNA and RNA synthesis. Unlike alkylating agents, they specifically affect the S phase of the cell cycle. Antimetabolites can be divided into various categories such as folic acid analogs, pyrimidine analogs and purine analogs and related inhibitory compounds. Antimetabolites include, but are not limited to, 5-fluorouracil (5-FU), cytarabine (Ara-C), fludarabine, gemicitabine and methotrexate.
[0119]
Natural products
  Natural products generally mean compounds that were first isolated from natural resources. Such compounds, analogs and derivatives thereof may be isolated from natural sources and may be produced by chemical synthesis or recombinant by any technique known to those skilled in the art. Natural products include classifications such as mitotic inhibitors, antitumor antibiotics, enzymes and biological response modifiers.
[0120]
  YarnMitotic inhibitors include cell division orYarnPlant alkaloids and other natural products that can inhibit any protein synthesis required for division are included. They act at specific phases of the cell cycle.YarnMitotic inhibitors include, for example, docetaxel, etoposide (VP16), teniposide, paclitaxel, taxol, vinblastine, vincristine, and vinorelbine.
[0121]
  Taxoids are a type of related compound isolated from the bark of the ash tree Taxus brevifolia. Taxoids include, but are not limited to, compounds such as docetaxel and paclitaxel. Paclitaxel binds to tubulin (at a site different from that used by vinca alkaloids) and promotes microtubule assembly.
[0122]
  Vinca alkaloids are a type of plant alkaloid that has been identified as having pharmaceutical activity. They include compounds such as vinblastine (VLB) and vincristine.
[0123]
Antitumor antibiotics
  Anti-tumor antibiotics are antibacterial andCytotoxicityHas both activities. theseDrugIs also an enzyme andYarnDNA is disrupted by chemically inhibiting division or by altering cell membranes. These substances are not cell cycle specific because they act at all phases of the cell cycle. Examples of antitumor antibiotics include, but are not limited to, bleomycin, dactinomycin, daunorubicin, doxorubicin (adriamycin), pricamycin (mythramycin), and idarubicin.
[0124]
hormone
  Corticosteroid hormones are used to treat chemotherapy when they kill cancer cells or delay growthmedicineIs considered. Corticosteroid hormones are often used in combination therapy because they increase the effectiveness of other chemotherapeutic agents. Prednisone and dexamethasone are examples of corticosteroid hormones.
[0125]
  Progestins such as hydroxyprogesterone caproate, medroxyprogesterone acetate, and megestrol acetate have been used in endometrial and breast cancer. Estrogens such as diethylstilbestrol and ethinylestradiol are used in cancers such as breast and prostate. Antiestrogens such as tamoxifen have been used for cancers such as breast cancer. Androgens such as testosterone propionate and fluoxymesterone have also been used to treat breast cancer. Antiandrogens such as flutamide are used to treat prostate cancer. Gonadotropin releasing hormone analogs such as leuprolide have been used to treat prostate cancer.
[0126]
Miscellaneous substances
  Some chemotherapeutic agents fall outside the previous category based on their activity. They include, but are not limited to, platinum coordination complexes, anthracenediones, substituted ureas, methylhydrazine derivatives, adrenocortical inhibitors, amsacrine, L-asparaginase, and tretinoin. It is contemplated that they may be used in the compositions and methods of the present invention.
[0127]
  Platinum coordination complexes include compounds such as carboplatin and cisplatin (cis-DDP).
[0128]
  Anthracenediones such as mitoxantrone have been used to treat acute granulocyte leukemia and breast cancer. Substituted ureas such as hydroxyurea have been used to treat chronic granulocyte leukemia, polycythemia vera, essential thrombocytosis, and malignant melanoma. Methylhydrazine derivatives such as procarbazine (N-methylhydrazine, MIH) have been used to treat Hodgkin's disease. Adrenal cortex inhibitors such as mitotane are used to treat adrenocortical cancer, and aminoglutethimide is used to treat Hodgkin's disease.
[0129]
Programmed cell death regulator
  Apoptosis or programmed cell death is a normal embryoOccurrenceIs an essential process for maintaining homeostasis and suppressing carcinogenesis in adult tissues (Kerr et al., 1972). The Bcl-2 protein family and ICE-like proteases have proven to be important regulators and effectors of apoptosis in other systems. The Bcl-2 protein discovered in association with follicular lymphoma plays a prominent role in regulating apoptosis and enhancing cell survival in response to various apoptotic stimuli (Bakhshi et al., 1985; Cleary and Sklar 1985; Cleary et al., 1986; Tsujimoto et al., 1985; Tsujimoto and Croce, 1986). Evolutionarily conserved Bcl-2 proteins are now recognized to be members of related protein families, which can be classified as death agonists or death antagonists.
[0130]
  After its discovery, Bcl-2 was shown to act to suppress cell death induced by various stimuli. Similarly, it is now clear that there is a family of Bcl-2 cell death regulatory proteins with common structural and sequence homology. These different family members have functions similar to Bcl-2 (Bcl-2XL, Bclw, Bcls, Mcl-1, A1, Bfl-1) or offset Bcl-2 function to promote cell death (eg, Bax, Bak, Bik, Bim, Bid, Bad, Harakiri) It is shown that.
[0131]
  Non-limiting examples of pro-apoptotic agents considered within the scope of the present invention include gramicidin, magainin, melittin, defensin, cecropin, (KLAKLAK)2(SEQ ID NO: 1), (KLAKKLA)2(SEQ ID NO: 2), (KAAKKAA)2(SEQ ID NO: 3) or (KLGKKLG)Three(SEQ ID NO: 4) is included.
[0132]
Angiogenesis inhibitor
  In certain embodiments, the present invention provides an angiotensin, laminin peptide, fibronectin peptide, plasminogenActivatorInhibitor, tissue metalloproteinase inhibitor, interferon, interleukin 12, platelet factor 4, IP-10, Gro-β, thrombospondin, 2-methoxyestradiol, proliferin-related protein, carboxamide triazole, CM101, marimastat, pentosanpolis Rufate, Angiopoietin 2 (Regeneron), Interferon-α, Herbimycin A, PNU145156E, 16K prolactin fragment, linomide, thalidomide, pentoxifylline, genistein, TNP-470, endostatin, paclitaxel, acutin, angiostatin, cidofovir, vincristine , Bleomycin, AGM-1470, platelet factor 4, or a targeting peptide conjugated to an anti-angiogenic agent such as minocycline.
[0133]
dose
  The person skilled in the art follows “Remington's Pharmaceutical Sciences”, 15th edition, chapter 33, in particular pages 624-652. Some variation in dosage will necessarily occur depending on the condition of the subject being treated. The person responsible for administration will, in any event, determine the appropriate dose for the individual subject. In addition, for human administration, preparations must meet sterility, pyrogenicity, and systemic safety and purity standards required by the FDA Biopharmaceutical Standards Bureau.
[0134]
Example
  The following examples are included to demonstrate preferred embodiments of the invention. The technology disclosed in the following examples represents the technology discovered by the inventors to function well in the practice of the present invention and thus can be considered to constitute a preferred mode for that practice. And must be recognized by those skilled in the art. However, it will be appreciated by those skilled in the art that many changes may be made in particular aspects of the disclosure, which may still achieve similar or similar results without departing from the spirit and scope of the invention. Should be recognized in the light of
[0135]
Example 1. Bone marrow targeting peptide
  A non-limiting example of an organ of particular interest for the targeting peptide is bone marrow. Bone is the preferred site of metastasis in the majority of patients with prostate cancer (Fidler, 1999). This remarkable selectivity has been regarded as an example of site-specific interactions that are essential for cancer progression (Rak, 1995; Zetter, 1998). Despite the clinical relevance, little is known about the mechanisms that control prostate cancer that has spread to the bone. Furthermore, there was no effective strategy for targeting therapeutic agents for the treatment of metastatic prostate cancer (Brodt et al., 1996).
[0136]
  A subset of peptides that can selectively return to the bone marrow through the systemic circulation may stimulate prostate cancer cell behavior during bone metastasis formation. Vascular markers targeted by using phage display may also be utilized for tumor cell metastasis. This notion has already proven to be true for lung regression peptides. Peptides that return to pulmonary blood vessels inhibit experimental metastasis. These results are based on a “modified seed and soil” model in which the basis for site-specific metastasis is the presence of regression receptors in the blood vessels of specific tissues where metastasis occurs selectively. Fits. Such selective vascular markers are exposed to tumor cells during adhesion, the first step in the metastasis cascade. Isolation of bone marrow regression peptides can be used to identify those vascular markers that mediate prostate cancer cell regression during the metastatic process and to prevent therapeutic interventions that may prevent bone metastasis or to bone Useful for selectively imaging and / or treating cancer that has already metastasized.
[0137]
Method
  In vivo screening of phage libraries was used to isolate peptides that bind to bone marrow in mice. Bone marrow targeting peptides were characterized for their ability to inhibit metastasis in a prostate cancer mouse model. Affinity chromatography and molecular cloning were used to identify receptors for bone marrow binding peptides. The compositions and methods disclosed herein have been useful for developing new anti-prostate cancer treatment strategies focused on the prevention and treatment of bone metastases.
[0138]
In vivo screening to isolate peptides that return to bone marrow in mice
  The phage library was injected intravenously. Libraries were prepared according to the protocol of Smith and Scott (1985) with the improvements described below. Phages contained in these libraries displayed inserts ranging from 5 to 11 residues. Tissue samples were processed for phage rescue by transferring to 1 ml DMEM-PI in a glass tube and homogenized with a grinder. Bone marrow does not require homogenization, but other organs used as controls had to be minced before they could be efficiently homogenized. Samples were transferred to autoclaved 2 ml Eppendorf tubes. The tissue was washed with ice-cold DMEM-PI containing 1% BSA. After three washes, the pellet was resuspended and brought to 37 ° C. before adding cells. To recover phage particles, 1.5 ml of competent K91-kan bacteria (OD at a 1:10 dilution) of the washed tissue sample600 0.2), 1 hour incubation at room temperature was used.
[0139]
  Multiple aliquots were plated on LB tet / kan plates or dishes containing 40 μg / ml tetracycline and 100 μg / ml kanamycin. Seeding was performed at several concentrations covering a wide range of samples: 3 ml, 1 ml, 300 μl, 100 μl, 30 μl. The beads used for seeding were passaged to two subsequent 10 cm LB tet / kan plates in order to recover any phage-infected bacterial clones that might have been trapped on the bead surface. The petri dish was incubated overnight at 37 ° C. Transfer the remaining 2-3 ml of infected culture (including homogenized tissue) to 10 ml LB medium (LB tet / kan) containing 40 μg / ml tetracycline and 100 μg / ml kanamycin and shake at 37 ° C. Placed in the container for 2 hours. A 12 ml culture was expanded to 1 liter LB tet / kan and grown overnight in a 37 ° C. shaker. After 12-16 hours, phage were rescued from the bulk amplified bacterial culture according to standard protocols and set aside for the second round of selection. Well separated colonies from bone marrow were sequenced from the plates / petri dish in the incubator. Colonies were transferred to 96 well plates containing 20 μl PBS per well for sequencing.
[0140]
  Immunohistochemical staining with anti-M13 antibody was used to investigate phage targeting in various tissues (Pasqualini and Ruoslahti, 1996; Arap et al., 1998). Phages were injected IV and circulated for 5 minutes or 24 hours. In the 5 minute experiment, mice were perfused with DMEM after phage injection to remove unbound phage from the circulatory system. There was almost no circulating phage after 24 hours (Arap et al., 1998a, 1998b). Animals were sacrificed, tissues were collected, fixed with Bouin solution, sectioned, and stained with antibodies against phage.
[0141]
result
In vivo mouse bone marrow targeting in mice
  The bone marrow targeting sequence motif was identified by intravenously injecting the phage library into mice and collecting the phage from the bone marrow. The phage was injected intravenously, recovered from the bone marrow, repeatedly amplified in vitro and re-injected until sufficient enrichment was obtained. After three rounds of selection, a phage preparation that returned to mouse bone marrow was obtained. Individual phage showed organ specificity similar to pooled phage after intravenous injection. Several peptide motifs have been identified and characterized. The most promising motifs showing specificity in vivo are shown in Table 3.
[0142]
[Table 3]
  Sequences within phage targeting mouse bone marrow in vivo
Figure 0005077862
[0143]
  Those skilled in the art will be able to identify bone marrow targeting peptide sequences identified herein for targeted delivery of therapeutic agents or gene therapy, in vivo imaging of normal or diseased organs, tissues, or cell types, organs, tissues, or cells. Understand the identification of receptors and receptor ligands in the form and will be useful for a number of applications within the scope of the invention, including but not limited to the therapeutic treatment of a number of human diseases, particularly metastatic prostate cancer Will do.
[0144]
Example 2. Targeting peptide for prostate and prostate cancer
  Another non-limiting organ of particular importance for targeting is the prostate. The prostate is an unusual organ because it continues to grow throughout the adult life. As a result, benign prostatic hyperplasia (BPH) has had some impact on most older men. More importantly, the prostate is a common site for malignant tumors. One in 11 men will develop prostate cancer in their lifetime. Due to the availability of serum markers for prostate cancer, many of these malignancies are now detected early in the course of the disease. Many are invasive by surgery or radiation therapy, often with devastating side effects such as incontinence and incompetence, because there is no reliable means to predict who will progress clinically (Lane and Shah, 1999; Mikolajczyk et al., 2000). There is clearly a need for improved methods for detection, diagnosis, and treatment of human prostate cancer.
[0145]
  Many genes of interest in the prostate can be expressed in limited (but possibly highly specific or reachable) cell locations such as the prostate vasculature. Thus, high-throughput sequencing or gene array methods that do not take into account the molecular heterogeneity inherent in microanatomical or physiological environments can easily miss potential targets for intervention There is sex.
[0146]
  The method of the invention allows the identification of peptides that return to a specific target site in vivo (Pasqualini et al., 1996, 1997, Koivunen et al., 1999; Pasqualini, 1999). In vivo selection of phage peptide libraries provides peptides that can return to specific receptors in the target tissue via the circulatory system. These studies revealed a surprising specialization in various normal tissues (Pasqualini, 1999; Rajotte et al., 1998, 1999). The present invention relates to compositions and uses of prostate cancer targeting peptides.
[0147]
Method
In vivo phage targeting of the prostate
  Phage display library was injected intravenously. Samples were always kept on ice. Prostate tissue samples were processed as follows. The first sample was stored at −80 ° C. as a backup. The second sample was processed for histology / pathology and HE or anti-M13 phage immunostaining. The third sample was split under clean conditions to obtain 3 pieces of the same weight.
[0148]
  Triplicate samples from the third prostate sample were processed for host bacterial infection and phage recovery. Prostate samples were transferred to 1 ml of DMEM protease inhibitor (PI) in a glass tissue grinder, homogenized, and the cell suspension was transferred to an autoclaved 2 ml Eppendorf tube. Next, prostate tissue samples were washed 3 times with ice cold DMEM-PI containing 1% BSA. After each wash, the tissue was mixed with DMEM-PI and vortexed for 30 seconds. After spinning at 4,000 rpm for 3 minutes, the supernatant was carefully discarded (the tissue pellet was not touched). Next, 1.5 ml of DMEM-PI / BSA was added. After the third wash, the pellet was briefly vortexed to resuspend and the lysed pellet was warmed to 37 ° C for a short time before adding host bacteria. The mixture was then mixed with 1.5 ml of competent K91-kan bacteria (OD600= 2) and incubated at room temperature for 1 hour.
[0149]
  The mixture was transferred to a Falcon tube containing 10 ml LB medium + 0.2 μg / ml tetracycline for 20 minutes at RT. Multiple aliquots were plated on LB tet / kan plates or dishes containing 40 μg / ml tetracycline and 100 μg / ml kanamycin. Finally, the dishes were incubated at 37 ° C. and after overnight incubation, the number of phage transducing units was determined.
[0150]
Prostate cancer targeting
  Tumor blood vessels are known to be leaking. A relatively long-term exposure of a mouse subject to a phage display library can result in phage migration and binding to prostate cancer cell markers. Mice were incubated with the phage library for 24 hours to target cancer cell markers.
[0151]
  10 male nude mice (4)6PBS containing DU-145 cells was injected. After tumor growth, mice were injected with either CX10C phage display library. After circulating the library for 24 hours, the mice were sacrificed and tissue samples were collected. Samples were homogenized with a Dounce homogenizer and K91 bacteria were added to recover the phage. Bacteria were seeded in triplicate on kan / tet LB plates. The remaining tumor homogenate containing bacteria was incubated with 10 ml LB / tet / kan for 1 hour at RT. To obtain a large amount of phage stock, an additional 10 ml of LK / tet / kan was added and incubated at 37 ° C. in a shaker. 216 colonies were picked from the plate to create a mixed stock for the second screening. After the clones were amplified, they were pooled and the phage were precipitated with PEG / NaCl. Using pooled phage collected from the first round, nude mice bearing prostate tumors were subjected to a second round of selection as described above. A third screening was performed as described above.
[0152]
result
Normal mouse prostate
  The mouse prostate targeting peptide motif obtained by the method disclosed above is shown in Table 4.
[0153]
[Table 4]
  Mouse prostate targeting peptide obtained by in vivo phage display
Figure 0005077862
[0154]
Prostate cancer
  Higher tumor compared to control normal kidney tissue by third in vivo screeningLocalizationA phage that exhibited a selectivity of (not shown) was obtained. Phage insertDNAProstate cancer targeting sequences identified by sequencing are listed in Table 5.
[0155]
[Table 5]
  Prostate cancer targeting peptide
Figure 0005077862
[0156]
  Those skilled in the art will be able to identify prostate targeting peptide sequences identified herein for targeted delivery of therapeutic agents or gene therapy, in vivo imaging of normal or diseased organs, tissues, or cell types, organs, tissues, or cells. It will be appreciated that it will be useful for a number of applications within the scope of the present invention, including, but not limited to, the identification of receptors and receptor ligands in types and therapeutic treatment of a number of human diseases, particularly prostate cancer. I will.
[0157]
Example 3. Identification of targeting peptides for mouse placenta, fat, ovary, and ureter Identification of placental regression peptides
  Peptides that return to the mouse placenta were identified by a post-clearing protocol using a phage display library. The first biopanning was performed on pregnant mice. A placenta sample was removed and the phage rescued according to the standard protocol described above with one modification. In a typical biopanning protocol, thousands of phage can be recovered from a single organ, tissue, or cell type. Typically, 200-300 independent colonies were selected from the seeded phage, which were amplified and pooled to form a phage display library for the second or third biopanning. . In this example, all rescued phage from the first biopanning were bulk amplified on solid media and then pooled to form a phage display library for the second biopanning. That is, there was no restriction of the rescued phage from the first biopanning. This unrestricted in vivo biopanning was performed 3 times (from 1st to 3rd time) and then the post-clearing method was used.
[0158]
  In the post-clearing protocol (4th round), phage were administered to non-pregnant mice. Phages bound to tissues other than the placenta were absorbed from the circulatory system. The remaining phage was recovered from the placenta of non-pregnant mice. This protocol was designed to isolate phage that bind to the placenta and not to other mouse organs, tissues, or cell types. The following placenta targeting peptides were identified along with their frequency. A GenBank database search disclosed that none of the SEQ ID NOs listed below was 100% homologous to known peptide sequences.
Figure 0005077862
[0159]
  As shown, the use of post-clearing methods resulted in substantial enrichment of phage carrying placental targeting peptides. Although this technique has been used with respect to the placenta, one skilled in the art will recognize any organ, tissue or cell type if the phage library can be administered to a subject lacking that organ, tissue or cell type. It will be appreciated that post clearance may be implemented with respect to. For example, post-clearing methods for targeting peptides to the prostate or testis can be performed in female subjects, and for ovaries, vagina, or uterus, in male subjects.
[0160]
  By homology search, TCRγ-1 (TPKTSVT, SEQ ID NO: 39), tenascin (RMDGPVR, SEQ ID NO: 40 and RAPGGVR, SEQ ID NO: 41), MHC class II (LGLRSVG, SEQ ID NO: 44), angiotensin I (YIRPFTL) , SEQ ID NO: 43), and several candidate proteins including MHC H2-Dq α chain (VGLHARA, SEQ ID NO: 42) have been identified as endogenous analogs of placental targeting peptides.
[0161]
Identification of placental return peptide and inhibition of pregnancy
  Confirmation of placental regression peptides was performed in vivo by injection into pregnant mice and recovery from the placenta. FIG. 1 shows the results of a confirmatory study on selected placental regressing phage. The phage clones are identified as PA-TPKTSVT (SEQ ID NO: 39), PC-RAPGGVR (SEQ ID NO: 41), PE-LGLRSVG (SEQ ID NO: 44), PF-YIRPFTL (SEQ ID NO: 43). It is shown that the PA clone showed a placental regression that was over an order of magnitude greater than that observed with the control fd-tet phage. PC clone is also significantly higher placentaLocalizationHowever, the PE and PF clones were not substantially enriched in the placenta compared to the control phage.
[0162]
  Despite the apparent lack of enrichment of PF clones in placental tissue, both PA and PF peptides showed anti-placental activity. Table 6 shows FITC (fluorescein isothiocyanate), GST (glutathione S-transferase), or phage injected into pregnant mice.JoinThe placenta targeting peptides PA and PF show the effect. At relatively low doses (total 450 μg), PA and PF conjugated to FITC showed a slight effect on pregnancy (Table 6). Relatively high dose (800 μg to 1000 μg protein or 4.5 × 10TenIn phage), both peptides PA and PF conjugated to proteins and peptides PA and PF conjugated to phage substantially interfere with fetal development (Table 6), and in most cases, apparently cause fetal death. Brought. CARAC peptide (SEQ ID NO: 46), fat targeting peptide (FE, TREVHRS, SEQ ID NO: 47), or fd-tet phage were used as non-placental targeting controls.
[0163]
[Table 6]
  Effects of placental targeting peptides on fetal development
Figure 0005077862
[0164]
  These results confirm the placenta targeting peptide sequence identified above. Furthermore, even in cases where substantial enrichment of the phage carrying the targeting sequence into the target organ is lacking (eg, peptide PF, Figure 1), the targeting peptide will allow targeted delivery of the therapeutic agent to the target organ. Prove that it can be provided. In this study, the PA peptide is many times higher in the level of phage to the placenta.LocalizationDespite the observation that they did, at lower doses, the PF peptide appeared to be more effective at preventing pregnancy than the PA peptide.
[0165]
  One skilled in the art will appreciate that the disclosed methods and peptides may be useful for targeted delivery of therapeutic agents to the fetus via the placenta and for new approaches to terminate pregnancy.
[0166]
Fat targeting peptide
  A similar protocol was used to isolate lipid targeting peptides from genetically obese mice (Zhang et al., 1994; Pelleymounter et al., 1995), including post-clearing performed in normal mice. The isolated lipid targeting peptides include TRNTGNI (SEQ ID NO: 48), FDGQDRS (SEQ ID NO: 49), WGPKRL (SEQ ID NO: 50), WGESRL (SEQ ID NO: 51), VMGSVTG (SEQ ID NO: 52), KGGRAKD (SEQ ID NO: 53), RGEVLWS (SEQ ID NO: 54), TREVHRS (SEQ ID NO: 47), and HGQGVRP (SEQ ID NO: 55) are included.
[0167]
  By homology search, stem cell growth factor (SCGF) (KGGRAKD, SEQ ID NO: 53), attractin (mahogany) (RGEVLWS, SEQ ID NO: 54), angiopoitin-related adipose factor (FIAF) (TREVHRS, SEQ ID NO: 47), adipophilin (ADRP) (VMGSVTG, SEQ ID NO: 52), Flt-1 or procollagen type XVII (TRNTGNI, SEQ ID NO: 48), and fibrillin 2 or transferrin Several candidate proteins including the like protein p97 (HGQGVRP, SEQ ID NO: 55) were identified as endogenous analogs of lipid targeting peptides.
[0168]
Confirmation of fat targeting peptide
  As shown in FIG. 2, confirmation of lipid regression peptides was performed by in vivo regression. The selected lipid regression clones were FA-KGGRAKD (SEQ ID NO: 53), FC-RGEVLWS (SEQ ID NO: 54), FE-TREVHRS (SEQ ID NO: 47), and FX-VMGSVTG (SEQ ID NO: 52). It was. As shown in FIG. 2, all of these clones show an increase in the return to adipose tissue, and clone FX is a few orders of magnitude higher in fat than the control fd-tet phage.Localizationshowed that. Clone FX is substantially higher than other selected lipid regression clonesLocalizationshowed that. However, by analogy with the placental regression peptide disclosed above, those skilled in the art will recognize that relatively low levels of adipose tissueLocalizationIt will be appreciated that even lipid regressing clones exhibiting can be useful for targeted delivery of therapeutic agents.
[0169]
  One skilled in the art will appreciate that targeting peptides that are selective for angiogenic vasculature in adipose tissue will be useful in preventing weight loss or weight gain. Anti-angiogenic or toxic moieties as fat targeting peptidesJoinIt is possible to selectively inhibit blood vessels that supply nutrients to new lipid tissues, prevent the growth of new lipid deposits, and it is also possible to extinguish existing lipid deposits It may be.
[0170]
Targeting peptides for ovary and ascites
  In addition, the following targeting peptide sequences for mouse ovary and ascites were identified.
[0171]
  Mouse ovary targeting peptides include GLAKLIP (SEQ ID NO: 56), HLISDMS (SEQ ID NO: 57), LQHWLLS (SEQ ID NO: 58), ALVLQG (SEQ ID NO: 59), TGVALQS (SEQ ID NO: 60), YVQSREG (sequence) No. 61), PLFWPYS (SEQ ID NO: 62), DGSG (SEQ ID NO: 63), EGSG (SEQ ID NO: 64), SSPRPGV (SEQ ID NO: 65), DGYPAIA (SEQ ID NO: 66), GHAIE (SEQ ID NO :) 67), and IWSTSER (SEQ ID NO: 68).
[0172]
  Targeting peptides for mouse ascites include YRLRG (SEQ ID NO: 69), YRARG (SEQ ID NO: 70), SQPLG (SEQ ID NO: 71), SQPWG (SEQ ID NO: 72), QRLVTP (SEQ ID NO: 73), QVLVTP ( SEQ ID NO: 74), QRLVHP (SEQ ID NO: 75), QVLVHP (SEQ ID NO: 76), ITRWRYL (SEQ ID NO: 77), SLGGMSG (SEQ ID NO: 78), SQLAAG (SEQ ID NO: 79), SLLAAG (SEQ ID NO: : 80), SQLVAG (SEQ ID NO: 81), SLLAAG (SEQ ID NO: 82), GLPSGLL (SEQ ID NO: 83), HGGSANP (SEQ ID NO: 84), SLEAFFL (SEQ ID NO: 85), CVPELGHEC (SEQ ID NO: 86) ), CELGFELGC (SEQ ID NO: 87), and CFFLRDWFC (SEQ ID NO: 88).
[0173]
Uterine targeting peptide
  A similar protocol was used to identify urethral targeting peptides in C57B1 mice, disclosed in Table 7.
[0174]
[Table 7]
  Urethral targeting peptide
Figure 0005077862
[0175]
Example 4: In vivo screening of α-spleen antibody library with BRASIL
  A targeting peptide for the spleen has not been previously identified. As part of the retinal endothelial system, nonspecific phages into the spleenLocalizationDue to its high background, biopanning on spleen tissue is complex. The reduced background observed in BRASIL biopanning is advantageous for the identification of targeting peptides for tissues such as the spleen.
[0176]
  This example demonstrates an exemplary embodiment of the BRASIL method. A phage library based on the immunoglobulin obtained for the labeled organ (mouse spleen) was developed and then subjected to in vivo biopanning. To construct an immunoglobulin library, mouse spleens were injected into chickens. Following booster inoculation, chicken spleens were collected and immunoglobulin variable domain sequences were obtained by PCR ™ amplification of chicken spleen mRNA. Amplified immunoglobulin variable sequences were inserted into a phage display library (α-library), which was then used for in vivo biopanning on mouse spleens. Thus, in vivo into the mouse spleenLocalizationThe spleen targeting peptide obtained from the phage was derived from antibody fragments produced in chickens in response to mouse spleen antigen. The success of this example further demonstrates the wide applicability of the BRASIL method. One skilled in the art will appreciate that the present invention is not limited to the embodiments disclosed herein, and that many further developments of the BRASIL methodology are within the scope of the present invention.
[0177]
Materials and methods
Library construction
  White leghorn chickens were immunized with spleen homogenate (approximately 150 mg per injection) from refluxed (10 ml MEM) Balb / c mice. Chickens were given a booster spleen homogenate at 4 and 8 weeks after the first immunization. The immune response against the mouse spleen by FACS analysis indicated that chicken immune serum contained antibodies against the mouse cell line (TRAMP-C1). At 12 weeks after the first immunization, the chickens were sacrificed and their spleens were excised into TRI reagent (Molecular Research Center, Inc., Cincinatti, OH).
[0178]
  Total RNA was prepared from chicken spleen using TRI reagent manufacturer's protocol. CDNA was prepared from total RNA using oligo (dT) primers and Superscript enzyme (Life Technologies). The cDNA encoding the chicken spleen immunoglobulin variable region was purified according to standard techniques using the CHybVH primer and the ChybIgB primer (Vheavy), Or CSCVK primer and CHHybL-B primer (Vκ). The variable and constant regions of the light chain are CSC-F and lead-B primers, and VκMold and CκBoth were PCR ™ amplified using a template. The variable and constant regions of the heavy chain are dp-seq and lead-F primers, and VheavyMold and CheavyBoth were PCR ™ amplified using a template. Both heavy chain and light chain fragments were PCR ™ amplified using CSC-F and dp-Ex primers. PCR primers are listed in the Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual “Phage Display of Combinatorial Antibody Libraries” (Barbas et al., 2000), the contents of which are incorporated herein by reference. The primer sequences were purchased from Genosys or GenBase.
[0179]
  After digestion with SfiI, the amplified product was ligated with SfiI digested pComb3x for insertion into the phage library. The ligated pComb3-123 plasmid was electroporated into ER2537 E. coli, and phage production was initiated by subsequent VCM13 (helper phage) infection. The resulting library size is approximately 5 x 106cfu.
[0180]
In vivo screening of α-spleen library using BRASIL
  Four in vivo screens in mice were performed using the chicken alpha spleen library. 0.8 ~ 2.0 × 10TenTU was injected into Balb / c mice. The library was circulated for 5 minutes. After sacrifice, the mouse spleen was collected and a single cell suspension was prepared by passing the spleen through a 70 μm cell filtration nylon mesh. Using BRASIL technology, single cell suspensions were centrifuged with oil (9: 1 dibutyl phthalate: cyclohexane) and pellets were infected with 200 μl of logarithmic growth phase ER2537 E. coli. Amplified phage recovered from the mouse spleen was used for the next screening. There was no apparent enrichment during screening in the number of phage returning to the spleen and brain compared to the conventional biopanning method using spleen pieces obtained before BRASIL.
[0181]
  In the mouse spleen from the fourth screening of chicken Fab insertsLocalizationThe phage was amplified by PCR ™ and the PCR product was digested with BstI. Half of the 90 clones analyzed gave similar restriction patterns. Of these, 20 clones were sequenced and only 2 had the same restriction pattern. Four of the antibody-based phage clones (No. 2, No. 6, No. 10, and No. 12) were tested for binding assayLocalizationSubjected to further analysis using the assay.
[0182]
In vitro clone testing using BRASIL
  Single cell suspensions were prepared from 2 mouse spleens. Divide the suspension into 5 tubes, 3 x 109TU Fab clones # 2, # 6, # 10, # 12, and 2 × 109Incubated with TU tet phage on ice. Phage bound to mouse spleen cells were recovered by BRASIL. 200 μl of logarithmic growth phase ER2537 E. coli was infected with the pellet and serial dilutions were plated on LB / carbenicillin and LB / tetracycline plates for assessment of phage binding. fd-tet was used as an internal standard to normalize all phage regression experiments.
[0183]
In vivo clone testing with BRASIL
  Fab clone # 2, # 6, # 10, # 12 phage (3 × 109), And 2 × 109TU tet phage was injected into the tail vein of Balb / c mice and allowed to circulate for 5 minutes. The spleen was collected and a single cell suspension was prepared on ice from the whole spleen. Cell bound phage was recovered by BRASIL. 200 μl of logarithmic growth phase ER2537 E. coli was infected with the pellet and serial dilutions were plated on LB / carbenicillin and LB / tetracycline plates for evaluation of phage recovery.
[0184]
In vivo clone # 10 test with BRASIL (compared to control phage NPC-3TT)
  Fab clone # 10 and NPC-3TT (control Fab phage) phage (3 × 109TU), and 1 × 109TU Fd-tet phage was injected into mice (2 for NPC-3TT, 2 for clone # 10) and allowed to circulate for 5 minutes. The spleen was collected and a single cell suspension was prepared on ice. Cell bound phage was recovered by BRASIL. 200 μl of logarithmic growth phase ER2537 E. coli was infected with the pellet and serial dilutions were plated on LB / carbenicillin plates and LB / tetracycline plates. NPC-3TT phage is a phage displaying human anti-tetanus toxin Fab fragment.
[0185]
Return of Fab clone # 10 to spleen (compared to bone marrow)
  Fab clone # 10 and NPC-3tt control phage (3 × 109TU), and 1 × 109TU Fd-tet control phage was injected into mice (2 for NPC-3TT, 2 for clone # 10) and allowed to circulate for 5 minutes. The spleen was collected and a single cell suspension was prepared on ice. As a control for organ specific regression, bone marrow (both femur) was collected from the same mouse. Cell bound phage was recovered by BRASIL.
[0186]
Fab fragment production
  Plasmid pComb3 containing the chicken Fab insert was electroporated into ER2537 E. coli. Serial dilutions were plated on LB / carbenicillin plates and incubated overnight at 37 ° C. Fab production cultures (in super broth containing 100 μg / ml carbenicillin) were started from a single seeded colony. Fab production was induced with 1 mM IPTG for 7 hours at 30 ° C. Fab fragments were purified from periplasmic fraction SN2 by affinity purification after determination of the Fab concentration in bacterial supernatant, periplasmic fractions SN1 and SN2 and bacterial lysates by ELISA. Dimethylpimelimidate (DMP) was coupled to an α-Fab-Protein G column (2 mg / ml) using a standard protocol (Harlow and Lane, 1988).
[0187]
  The following method was used to purify the Fab fragment. Over 2 hours (if using a superloop and using a volume less than 50 ml) or overnight (if using a peristaltic pump and using a volume greater than 50 ml), add the SN2 fraction to 1 ml HiTrap. -Loaded onto a protein G-α-Fab column (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). The column was washed with 10-20 ml PBS (phosphate buffered saline). The Fab fragment was eluted using 10 ml of 20 mM glycine buffer, pH 2.2, 150 mM NaCl, and 1 ml fractions were collected. Fractions were neutralized with 1M Tris immediately after elution. Protein concentration is A280Was quantified.
[0188]
Intravascular staining
  To determine the in vivo distribution of recovered Fab fragments, 50-60 μg Fab fragments (Fab # 10, NPC3-tt, or R # 16) were injected into the tail vein of Balb / c mice and allowed to circulate for 8 minutes . Mice were injected with 50 μg tomato (L. esculentum) lectin-FITC, and after 2 minutes lectin circulation, mouse tissues were fixed by perfusion with 25-30 ml 4% paraformaldehyde / PBS. The tissue was removed and postfixed with 4% paraformaldehyde for 1 hour. Fixed tissues were incubated in 30% sucrose / PBS overnight at 4 ° C., changing the solution at least twice. Tissues were embedded in freezing medium and frozen on dry ice.
[0189]
  Fixed tissue sections were stained for Fab as follows. Frozen tissue sections (55 μm) were cut on a microtome and washed 3 times with PBS. The slices were blocked with PBS / 0.3% TritonX-100 / 5% goat serum for 1 hour at room temperature. Sections were incubated overnight with α-human anti-Fab antibody conjugated with 1: 400 Cy3 at room temperature. Joined sections 6 times with PBS / 0.3% TritonX-100, 3 times with PBSWashed and fixed with 4% paraformaldehyde for 15 minutes. After fixation, the sections were washed twice with PBS, twice with distilled water, and then placed on a glass slide using VectorShield.
[0190]
result
  In vitro of mouse splenocytes of phage clones expressing chicken Fab fragments.LocalizationWas investigated by BRASIL. As shown in FIG. 3, Fab phage clones isolated by BRASIL showed binding to differential mouse splenocytes compared to Fd-tet control phage without insert. Clone # 6 showed the lowest degree of differential binding, similar to the control phage NPC-3TT, which contained the Fab fragment but was not isolated from mouse spleen. Clones # 2, # 10, and # 12 all showed selective binding to mouse splenocytes compared to the Fd-tet control, with clones # 2 and # 10 having at least a 2-fold increased binding. Observed. The amino acid sequence determined for the clone insert is as follows:
Figure 0005077862
[0191]
  A direct comparison of in vitro phage binding for Fab clones compared to NPC-3TT was performed. As shown in FIG. 4, clones # 2 and # 10 showed the highest level of binding to mouse splenocytes in vitro. Clones # 6 and # 12 showed a slightly higher level of binding to the mouse spleen than that of phage NPC-3TT.
[0192]
  Preferential binding of chicken Fab phage clones was confirmed by in vivo studies using BRASIL. As shown in FIG. 5, the selective localization to the mouse spleen is much more dramatic in vivo, and Fab clones # 2, # 6, and # 10 show no comparison with the Fd-tet phage. A double increase in spleen binding was also demonstrated. In contrast, Fab clone # 12 did not show significantly increased binding to mouse spleen compared to Fd-tet phage. These results indicate that the in vitro results obtained using spleen targeting phage are confirmed in vivo.
[0193]
  Fab clone # 10 to mouse spleen in vivoLocalizationSelected for further characterization by The results shown in FIG. 6 confirm that Fab clone # 10 showed 3-10 fold enrichment in the spleen compared to Fd-tet. Fab control phage NPC-3TT is selective spleen compared to Fd-tet phage without insertLocalizationThis effect was not due to general Fab binding.
[0194]
  As demonstrated in FIG. 7, the binding of Fab clone # 10 was organ specific. Phage from Fab clone # 10 and NPC-3TT control were recovered from the spleen and bone marrow of the same injected mice. From FIG. 7, Fab clone # 10 is selective to the spleen.LocalizationBut selective to bone marrow tissueLocalizationIs clearly not shown. Control phage is selective for bone marrow (Figure 7) or spleen (not shown)LocalizationDid not show.
[0195]
  These results indicate that Fab clone # 10 selectively targets mouse spleen tissue for binding both in vitro and in vivo. These results were further confirmed by vascular staining for in vivo phage distribution. Control phage used in this study were clone NPC-3TT (Fab fragment) and clone R # 16 (isolated from angiogenic retinal screening).
[0196]
  By fluorescence staining, Fab clone # 10 was observed to bind to mouse spleen tissue in vivo (not shown). Control phage NPC-3TT and R # 16 did not stain spleen tissue under the same conditions. Clone # 10 and NPC-3TT phage were observed to strongly stain the kidneys of the injected animals, presumably due to glomerular filtration (not shown). Other control organs (lung, brain, liver, heart, and skeletal muscle) did not show staining with clone # 10 (not shown).
[0197]
  These results demonstrate that spleen targeting phage peptides can be identified by the BRASIL method. Furthermore, it demonstrates the feasibility of phage display technology using antibody fragments against the target organ, tissue or cell type to obtain a starting phage library. Due to the high non-specific background, it was possible to obtain targeting peptides for the spleen, a tissue for which biopanning using standard phage display protocols could not be applied, indicating the advantage of the BRASIL method ing.
[0198]
Example 5: In vivo screening of α-Kaposi's sarcoma library in angiogenic retina
  The angiogenic retinal system has been developed as a model of angiogenic tumor tissue. Hypoxia in newborn mice causes an angiogenic response in the retina. Angiogenic retinal tissue receptors show similarity to angiogenic tumor tissue with respect to phage display binding.
[0199]
Materials and methods
Angiogenic model system
  One week-old C57BL / 6J mice were exposed to a 75% oxygen atmosphere for 5 days and then maintained in air for an additional 5 days. Proliferative neovascular responses were quantified by counting the nuclei of new blood vessels that extended from the retina to the vitreous region in 6 μm cross sections. This model was used to evaluate the binding of phage display libraries intravenously injected into mice to newly formed angiogenic vessels. The peak of angiogenesis was observed on days 17-21 after birth.
[0200]
Phage display
  Fab phage libraries (α-KS) were generated for Kaposi's sarcoma tumor tissue immunized to rabbits using the same method as previously disclosed for the spleen. Three in vivo screens were performed using an α-KS library in an angiogenic retinal model system. Two C57BL / 6J mice with hypoxia-induced retinal neovascularization 18-20 days after birth were approximately 3-10 × 10TenTU α-KS phage was injected. The library was circulated for 5 minutes. The eyes were removed and the retina was separated from the rest of the eyes. Single cell suspensions were prepared from the retina by breaking between two glass slides. Single cell suspensions were treated with BRASIL as described above and 200 μl of logarithmic growth phase ER2537 E. coli was infected with the pellet. The overnight amplified phage was recovered from retinal tissue and used for the next screening. The recovery after each selection was 3400-5000 TU.
[0201]
  After 3 rounds of selection, 90 selected clones were tested for their ability to bind HUVEC cells. Microtiter wells were coated with complete medium containing HUVEC. Cells were fixed and incubated overnight with supernatant from IPTG-induced cultures of phage infected cells. Fab production was detected by α-Fab ELISA. The binding of Fab to HUVEC was detected by α-Fab-AFOS ELISA.
[0202]
  FIG. 8 shows the results of binding of Fab clones to HUVEC using the α-KS phage library. Clone # 16 appeared to bind well to HUVEC in vitro.
[0203]
  These results confirm the possibility of using Fab antibody fragments for the production of phage display libraries. Such libraries are targeted to the specific organ, tissue, or cell type used to immunize the host animal as compared to random sequence phage display libraries that have been used in conventional biopanning methods. The peptide sequence should be rich. The results also confirm the availability of the BRASIL method for identifying targeting peptide sequences.
[0204]
Example 6. Identification of receptor / ligand pairs: targeting peptides for integrin receptors
  Some embodiments of the invention relate to the identification of receptor / ligand pairs for various uses. Targeting peptides selective for organs, tissues, or cell types usually bind to receptors (as defined above) located on the luminal surface of blood vessels in the target. In some embodiments, targeting peptides can be used to identify or characterize such receptors, either directly or indirectly. In addition to use as targets for the delivery of gene therapy vectors, other therapeutic agents, or contrast agents for in vivo imaging, such naturally occurring receptors are developing new therapeutic agents for the receptors themselves. It is useful as a potential target for the development of vaccines against receptors, and for understanding the molecular mechanisms underlying various disease states. Of course, the targeting peptide itself may be useful as a basis for new therapeutic agents for the receptor.
[0205]
  Targeting peptides often act as mimeotopes of endogenous ligands that bind to the targeted receptor. In other embodiments, endogenous ligands can be identified and characterized using the disclosed methods. Such ligands are also potentially useful as targets for the development of new therapeutic agents and the like.
[0206]
  This example illustrates one embodiment for identification of a receptor (in this case an integrin receptor) / ligand pair. Examples of uses of targeting peptides for integrins include, but are not limited to, control of cell proliferation and chemotaxis, pro-apoptosis, and anti-angiogenesis. In this embodiment, the solid substrateJoinThe purified integrin was used to screen a phage display library to identify targeting peptides for the integrin.
[0207]
background
  Integrin function is regulated by cytokines and other soluble factors in a variety of biological systems. Most commonly, exposure to such factors alters the activation state of the receptor (ie, increased or decreased affinity for a particular ligand and / or receptor clustering within the plasma membrane). Leading to conformational changes that lead to Changes in integrin-dependent adhesion ultimately activate various complex signaling pathways. At the molecular level, colocalization of induced cytoskeletal proteins with integrin cytoplasmic domains regulates signal transduction.
[0208]
  The cytoplasmic domain is an important regulator of integrin function (Hynes, 1992; review of Ruoslahti, 1996). The cytoplasmic domains of individual α and β subunits are highly conserved between different species (Hemler et al., 1994). The cytoplasmic domains of the various β subunits share similar primary structures but differ with respect to some functional characteristics. Experiments with chimeric integrins have shown that the cytoplasmic domain of the β chain is responsible for the control of receptor distribution and recruitment to focal adhesion sites (Pasqualini and Hemler, 1994) . Thus, some cytoplasmic domains are important for integrin-mediated cell signaling (external to internal signaling) and activation of integrin-ligand binding activity (internal to external signaling). Yes (Hemler et al., 1994).
[0209]
  Integrins αvβ3 and αvβ5 are not expressed in normal vasculature but are selectively expressed in angiogenic vasculature (Brooks et al., 1994a, 1994b; Pasqualini et al., 1997; Arap et al., 1998). In addition, αv integrin antagonists have been shown to block neovascular growth (Brooks et al., 1994a, 1994b, 1995; Hammes et al., 1996). In these experiments, apoptosis of endothelial cells was identified as a mechanism for inhibition of angiogenesis (Brooks et al., 1994a, 1994b, 1995). Angiogenesis initiated by bFGF can be inhibited by anti-αvβ3 blocking antibodies, and VEGF-mediated angiogenesis can be prevented by blocking antibodies against αvβ5. Integrins αvβ3 and αvβ5 have been reported to be preferentially displayed in different types of ocular neovascular diseases (Friedlander et al., 1995, 1996). Thus, the pathway leading to angiogenesis induced by distinct cytokines appears to be dependent on specific αv integrins.
[0210]
  Integrins αvβ3 and αvβ5 both bind to vitronectin, but probably mediate different post-ligand binding events. For example, in the absence of exogenous soluble factors, integrin αvβ5 cannot promote cell adhesion, spreading, migration, and angiogenesis. On the other hand, αvβ3 integrin can induce such events without additional stimulation by cytokines (Klemke et al., 1994; Lewis et al., 1996; Friedlander et al., 1995).
[0211]
  By experiments designed to study the molecular basis for the regulation of αvβ5 function by cytokines, αvβ5 inactivated upon binding to immobilized vitronectin is actin, α-actinin, tailin, tensin. , P130cas, And rarely detected in association with vinculin. In contrast, αvβ3 induces local accumulation of such molecules. Activation of protein kinase C (PKC) causes αvβ5 to behave similarly to αvβ3, but cannot mobilize tailin (Lewis et al., 1996). Furthermore, the PKC inhibitor calphostin C appears to block αvβ5 mediated angiogenesis but not αvβ3 mediated (Friedlander et al., 1995). These observations suggest that PKC activation probably affects the conformation or phosphorylation status of the β5 cytoplasmic domain. Similar changes can occur in cytoplasmic proteins (Kolanus and Seed, 1997). Regulation of αvβ5 integrin by cytokines is unusual in that ligand binding is unchanged but events after ligand binding are different (Lewis et al., 1996). Thus, cellular events mediated by αvβ3 or αvβ5 are clearly regulated by different mechanisms (Filardo and Cheresh, 1994b).
[0212]
  The search for αv integrin-associated molecules has been hampered by technical problems. First, it is likely that the contained physical association relies on an assembly of multimeric ligands that no longer occurs if the cell is not complete. Secondly, their association with integrins is usually of low affinity. Finally, changes in the conformation and phosphorylation state of associated proteins may further increase the complexity of these temporarily regulated interactions. Because of these problems, only a limited number of proteins that bind to the integrin cytoplasmic domain have been identified. These proteins such as paxillin and ICAP-1 are primarily associated with the β1 chain (Shattil and Ginsberg, 1997). Cytohesin-1 and filamin are associated with the cytoplasmic domain of β2.
[0213]
  Several other proteins (tailin, filamin, α-actinin, localized adhesion kinase, serine / threonine kinase ILK, and skelemin) have been reported to interact with the overall β integrin cytoplasmic domain. Tailin, α-actinin, and localized adhesion kinase no longer colocalize with β1 integrin after deletion of a putative binding site within the β1 cytoplasmic domain. Similar approaches have been shown to co-localize other cytoskeleton-related proteins and signaling molecules with integrins.
[0214]
  Integrins associate with molecules that are involved in growth factor signaling. In addition to the 190 kDa protein and IRS-1 (Vuori and Ruoslahti, 1994) that can be found associated with αvβ3, analysis of the association of αvβ3 integrin with molecules involved in the insulin and PDGF signaling pathways It was revealed that both the receptor and PDGFβ receptor co-immunoprecipitated with αvβ3. Receptor molecules associated with integrins represent a highly phosphorylated and highly activated subfraction of such molecules. These results are important because they reinforce the view that integrin-mediated cell adhesion is synchronized with the cellular response to growth factors. The integrin-dependent signaling process cooperates with proliferation signals (Frisch and Ruoslahti, 1997; Clark and Brugge, 1995; Longhurst and Jennings, 1998).
[0215]
  Protein phosphorylation is one of the earliest events detected in response to integrin stimulation. The ability of tyrosine kinase inhibitors to suppress the formation of focal adhesions suggests a role for tyrosine phosphorylation in signal transduction pathways linked to integrin receptors (Defilippi et al., 1994). Serine / threonine kinase families such as protein kinase C (PKC) and mitogen-activated protein (MAP) kinases are also activated by integrin stimulation, and inhibitors of PKC inhibit cell adhesion and diffusion in several cellular systems Stop (Vuori and Ruoslahti, 1993). Integrins are thought to influence cell survival by controlling programmed cell death, a response that is also dependent on tyrosine phosphorylation. Some proteins that associate with integrin protein complexes contain modular domains called Src homology 2 (SH2) and 3 (SH3) that specifically mediate protein-protein coupling. The SH2 domain binds to proteins through interaction with specific peptide motifs including phosphotyrosine, and SH3 domains bind to short proline-rich peptide motifs on protein targets (Clark and Brugge, 1995). Cell adhesion mediated by integrins causes activation of MAP kinase and increases tyrosine phosphorylation of localized adhesion kinase (FAK). Autophosphorylation of FAK leads to the binding of SH2 domain proteins including Src family kinases and Grb-2-Sos complexes. One reasonable hypothesis is that integrin-mediated tyrosine phosphorylation of FAK leads to activation of the Ras cascade and ultimately to MAP kinase activation. However, integrin-mediated MAP kinase activation has been shown to be independent of FAK, including (i) MAP kinase activation that may play a role in mitogenic and survival signals, and (Ii) There are at least two distinct integrin signaling pathways, FAK tyrosine phosphorylation that is clearly involved in cytoskeletal organization (Lin et al., 1997).
[0216]
  Previous studies of peptide models and molecular models based on homology suggested that approximately 9-13 residues of peptide substrates contact the active site gap of the kinase domain (Bossemeyer et al., 1993). Phage display technology provides an alternative approach for generating and selecting diverse combinatorial peptide libraries (Smith, 1991; Wells and Lowman, 1992). Since the chemical diversity within the phage display library is encoded by DNA that can be replicated and amplified, the selection of the phage library can be performed multiple times, thus identifying even rare motifs. It is. In contrast to synthetic chemical libraries, phage display allows the analysis of a single species rather than a pooled species. The power of this technique has been largely demonstrated by the selection of rare antibodies or peptides from large combinatorial libraries.
[0217]
  Combinatorial phage libraries were used to determine preferred substrate sequences for different protein tyrosine kinases (PTKs) and one relatively distantly related PTK, Syk, all closely related members of the Src family (Schmitz et al., 1996). . Subsequent phosphorylation with recombinant PTK and selection of phosphorylated phage with anti-phosphotyrosine antibody was used to enrich for phage displaying substrate peptides. After several selections, a separate substrate sequence was found for each PTK tested. For PTKs associated with the Src family, important attributes of these canonical sequences were reused in known or hypothetical protein substrates. Most notably, the amino acids immediately adjacent to the invariant tyrosine residue were highly conserved and specific for each PTK tested. Thus, the identified motif may provide a reasonable basis for developing small specific inhibitors of the catalytic domain of PTK (Schmitz et al., 1996).
[0218]
  Further studies have expanded the scope of phage display technology by showing how peptide libraries can be used to investigate the substrate specificity of the Src family protein kinase Fyn (Dente et al., 1997; Gram et al., 1997). The modified peptide displayed by the phage was used to determine the phosphotyrosine specificity of the phosphotyrosine binding domain (PTB) of the protein Shc (Dente et al., 1997). Other related experiments focused on identifying phosphopeptide ligands that interact with the Src homology 2 (SH2) domain of the adapter protein Grb2 by screening a random peptide library established on phage. A mixture of phosphotyrosine kinases c-Src, Blk, and Syk phosphorylated invariant tyrosine residues of the phage in vitro. Binding motifs were selected by library interaction with the recombinant SH2 domain of Grb2 expressed as a glutathione-S-transferase (GST) fusion protein. Subsequent selections enriched for phage that bound to the GST-Grb2 SH2 domain only if previously phosphorylated. By sequence analysis, the selected phages are all consensus motif Y*M / NW (Y*It is clear that the peptide containing phosphotyrosine is indicated. One peptide is a peptide motif Y derived from the natural ligand Shc*It bound to Grb2 SH2 domain with 3 times higher affinity than VNV. These findings indicate that phage display can be used to rapidly identify high affinity ligands for the SH2 domain and other interacting proteins involved in signal transduction.
[0219]
  The cytoplasmic domain of β5 is structurally and functionally unique compared to other integrin subunits (Table 8) and has only 38% homology with the cytoplasmic domain of β3 (Hemler et al., 1994 ). Structural requirements for αv association prevent further primary sequence differences between β3 and β5; existing differences may be responsible for the reduced interaction of αvβ5 with tailin It has been proposed to be highly sexual (Lewis et al., 1996). When the cytoplasmic domain of β5 is expressed as a chimera with the extracellular domain of β1 in Chinese hamster ovary (CHO) cells, the chimeric receptor behaves similarly to β5, and cell migration and localized adhesion of the receptor Promoted loss of localization to (Pasqualini and Hemler, 1994). However, the cytoplasmic domains of integrin subunits β1 and β3 have been shown to be functionally interchangeable (Solowska et al., 1991). Other studies have shown that αvβ3 and αvβ5 appear to be different with respect to localization to localized adhesion and contribution to cell migration (Delannet et al., 1994; Filardo et al., 1995). However, they reported that functional differences were not mapped to specific domains.
[0220]
[Table 8]
  Alignment of similar integrin beta subunit cytoplasmic domains
The major differences between the β3 and β5 cytoplasmic domains are highlighted.
Figure 0005077862
[0221]
  After the angiogenic switch is triggered, a separate molecule is likely to associate with either β3 or β5. Furthermore, selective association with the αv cytoplasmic domain is also possible in each heterodimeric environment. For example, β-turns in the cytoplasmic tail of the integrin αv subunit have been shown to affect αvβ3 conformation and ligand binding (Filardo and Cheresh, 1994). The basis for selective signaling properties may be a collection of specific molecules that associate with their respective cytoplasmic domains. This study exploits a novel strategy of panning the phage display library against the cytoplasmic domains of β3 and β5, and determining the biological properties of cytoplasmic domain-binding peptides, thereby selective angiogenic signaling for αvβ3 and αvβ5 Determine the molecules involved in
[0222]
  The disclosed method has several advantages over conventional approaches. (I) the ability to characterize intracellular molecules that interact directly or indirectly with integrin cytoplasmic domains; (ii) development of antibodies against molecules that bind integrin cytoplasmic domains in very small amounts; and (iii) phage display libraries Screening will lead to the identification of peptides that mimic cytoplasmic domain binding proteins.
[0223]
Method
2D cell culture
  Three human endothelial cell lines expressing β3 and β5 integrins were used: KS1767 cells (Herndier et al., 1996), HUVEC (ATCC), and BCE cells (Solowska et al., 1991). Sterile glass coverslips covered with different proteins (ie vitronectin, fibronectin, collagen or laminin) were used as substrates. After the cells attached and spread, the monolayer was rested by incubation for 12 hours in medium containing 0.05% fetal calf serum. The peptide was introduced into the cells using a penetratin membrane permeable tag (see below). Cells were seeded into ECM protein for adhesion and spreading. Monolayers were stimulated with each growth factor involved in αv-mediated angiogenesis, including bFGF, TNFα, VEGF, and TGFβ for 6 hours. Untreated cells were negative controls.
[0224]
Three-dimensional cell culture:
  150 μl of Matrigel was added to each well of a 24-well tissue culture plate and gelled at 37 ° C. for 10 minutes. After depleting HUVEC in M199 medium supplemented with 2% FCS for 24 hours, trypsinized one was used. TenFourCells were gently added in triplicate to each well and allowed to adhere to the gel coating at 37 ° C. for 30 minutes. The medium was then changed to a complete medium containing the peptide. After 24 hours, the plate was monitored and photographed using an inverted microscope (Canon).
[0225]
Chemotaxis assay:
  Cell migration assay was performed as follows. A 48 well microchemotaxis chamber was used. Polyvinyl pyrrolidone-free polycarbonate filters (Nucleopore, Cambridge, Mass.) With 8 μm pores were coated with 1% gelatin for 10 minutes at room temperature and equilibrated with M199 medium supplemented with 2% FCS. M199 supplemented with 2% FCS containing peptide, 20 ng / ml VEGF-A (R & D System), and 1 U / ml heparin was placed in the lower chamber of the Boyden chamber. Overnight depleted subconfluent cultures are rapidly trypsinized to a final concentration of 2 x 106Resuspended in M199 supplemented with 2% FCS at pcs / ml. After placing the filter between the lower and upper chambers, 50 μl of cell suspension was spread over the upper chamber. 5% CO2Cells were allowed to migrate for 5 hours at 37 ° C. in a humidified atmosphere. The filter was then removed and the upper cells were detached using a rubber policeman. Migrated cells were fixed with methanol and stained with Giemsa solution (Diff-Quick, Baxter Diagnostics, Rome, Italy). Five random high power fields (40x) in each well were counted.
[0226]
Proliferation assay:
  Cell proliferation was measured as described (Pasqualini and Hemler, 1994). In brief, 4 × 10FourIndividual HUVECs were incubated in 24-well plates. Cells were depleted for 24 hours, then the medium was removed and replaced in the presence of VEGF and 15 μM of each peptide and incubated for 18 hours. Then 50 μl [ThreeMedium containing H] thymidine (1 μCi / ml) was added to the wells and incubated for an additional 6 hours at 37 ° C., then the medium was removed and the cells were fixed with 10% TCA for 30 minutes at 4 ° C. and washed with ethanol. And solubilized with 0.5N NaOH. Radioactivity was counted by liquid scintillation using an LS 6000SC Beckman scintillation counter. Each experiment was performed three times in triplicate, and the results were expressed as mean ± SD.
[0227]
Apoptosis assay (propidium iodide stained subdiploid population)
  1x106Individual cells were collected in complete medium and 15 μM peptide was added for 4 hours, 8 hours, or 12 hours. Cells were then washed with PBS and resuspended in 0.5 ml propidium iodide solution (50 μg / ml PI, 0.1% Triton X-100, 0.1% sodium citrate). After incubation at 4 ° C. for 24 hours, cells are counted with XL Coulter (Coulter Corporation) using a 488 nm laser; 12,000 cells are counted for each histogram and the cell cycle distribution is multicycled. ) Analyzed by program.
[0228]
  Following microinjection or penetratin mediated uptake of peptides and appropriate controls, cell apoptosis was monitored using the ApopTag kit. Experiments were performed in the presence of caspase inhibitors and antibodies to specific caspases.
[0229]
Assays for angiogenesis induced by cytokines and tumors
  Angiogenic factors and tumor cells transplanted into the CAM stimulate the growth of new capillaries. In CAMs derived from 10-day chick embryos, angiogenesis was induced by VEGF or bFGF filters implanted in previously avascular areas. Different treatments (Penetratin peptide and control) were applied topically, and after 3 days the filter and surrounding CAM were excised and fixed with formalin. A stereo microscope was used to quantify the number of blood vessels that had penetrated the disk within the focal plane of the CAM. The mean and standard error of the number of blood vessels from 8 CAMs in each group were compared.
[0230]
Panning of phosphorylated and phosphorylated phage libraries
  Phosphorylation of peptide libraries with src family protein kinases (Fyn, c-Src, Lyn, and Syc) and serine / threonine kinases such as MAP kinase was performed as previously described (Schmitz et al., 1996; Dente et al., 1997; Gram et al., 1997). Briefly, phage particles were collected from the culture supernatant by double precipitation with 2.5M NaCl containing 20% polyethylene glycol 8000. 10 particles12Dissolved in pieces / ml. Purified phage (10 μl) was incubated for 3 hours at room temperature with different concentrations (35-3,500 units) of protein kinase in a reaction buffer volume of 50 μl. To select phage displaying phosphorylated peptides, the reaction mixture was transferred to a tube containing anti-P-Tyr, anti-P-Ser, or anti-P-Thr monoclonal antibody conjugated with 10 μg of agarose. Bound phage was eluted by washing the column with 0.3 ml elution buffer (0.1 M NaCl / glycine / 1 mg / ml BSA, pH 2.35). The eluate was neutralized with 2M Tris base and incubated with 2 ml of mid-log bacterial culture. A 20 μl aliquot was removed for seeding and the phage collected as described. The process from phosphorylation to selection was repeated. Phosphorylated peptides that bind to the cytoplasmic domains of β3 and β5 were analyzed as described in the previous section.
[0231]
  Matrix-assisted laser desorption time-of-flight (MALDI-TOF) to map phosphorylation sites on the cytoplasmic domains of β3 and β5 and cytoplasmic domain-binding peptides in vitro A mass spectrometer was used. Fusion proteins or peptides were phosphorylated in vitro as described and purified by RP-HPLC or RP microchip columns. Phosphorylated peptides were identified by three methods. (1) 80 Da mass shift after kinase reaction; (2) 80 Da loss after phosphatase treatment; or (3) Reflector for linear mode for tyrosine phosphorylated peptide or serine, threonine phosphorylated peptide. ) 80Da or 98Da deficiency in mode respectively. If necessary, the peptide was purified by RP-HPLC and subjected to digestion with carboxypeptidase and aminopeptidase to generate a sequence ladder. This was particularly useful when a peptide contained two or more phosphorylation sites.
[0232]
Panning for phosphorylated GST-fusion proteins
  GST fusion proteins were phosphorylated in vitro as described (Schmitz et al., 1996; Dente et al., 1997; Gram et al., 1997). Briefly, 10 μg / ml of reaction buffer containing 5.5 units of Fyn protein kinase (50 mM Tris, 5 mM MgCl2, 500 μM NaThreeVOFour, 500 μM ATP, total volume 50 μl) for 3 hours at room temperature. The reaction was stopped by adding 40% TCA. After the kinase substrate protein was precipitated, it was resuspended in PBS and coated on microtiter wells at 10 μg / well. Part of CX7C library (2.5 × 1011Transducing units) were incubated on the GST fusion protein. Phages were sequenced from randomly selected clones.
[0233]
Mass spectrometry research
  Peptide mass mapping by mass spectrometry was used to identify novel ligands in the cytoplasmic domain of β3 and / or β5. Polyclonal and monoclonal antibodies raised against cytoplasmic domain binding peptides were used to purify the target protein (cytoskeleton molecule or signal transduction molecule). These proteins were separated by SDS-PAGE, excised from the SDS gel, and digested in gel with trypsin. After peptide extraction, MALDI-TOF mass spectrometry was performed to generate a list of peptide masses. This list of peptide masses, combined with protease specificity, provides a relatively specific “signature” that can be used to search sequence databases. If the protein sequence is present in the database, this method can identify the protein with high reliability. The lower detection limit of this approach is currently 1 pmol which is at least 10-20 times lower than N-terminal Edman sequencing.
[0234]
result
Panning of phage peptide libraries against the cytoplasmic domains of β3 and β5
  Proteins that bind to the cytoplasmic domains of β3 and β5 were isolated by screening multiple phage libraries using recombinant GST fusion proteins containing either GST-β3cyto or GST-β5cyto coated in microtiter wells. Immobilized GST was used as a negative control for enrichment in panning of each cytoplasmic domain. Phage were sequenced from randomly selected clones after 3 rounds of panning as disclosed elsewhere (Koivunen et al., 1995; Pasqualini et al., 1995). A separate sequence that specifically interacts with the β3 or β5 cytoplasmic domain was isolated (Table 9). Clones randomly selected from the second and third panning were sequenced. The amino acid sequence of the peptide encoded by the phagemid was deduced from the nucleotide sequence. The most frequently found motifs after panning with the indicated libraries are shown in Table 9. The ratio was calculated by dividing the number of colonies recovered from wells coated with β3-GST by those recovered from GST or BSA.
[0235]
[Table 9]
  Sequences displayed by phage that bind to the cytoplasmic domain of β3 or β5
Figure 0005077862
[0236]
  Specificity of β3 or β5 interaction with cytoplasmic domain determined by calculating the ratio of the number of phage bound to the cytoplasmic domain containing fusion protein (β3 or β5) and the number of GST alone (negative control) did. FIG. 9 shows the results from a binding assay performed using GST-β3cyto binding phage. Six phage displaying the motifs most frequently found in the second and third panning were tested. Each panel shows the results from the binding assay for phage that displayed different peptides that bind to the β3 cytoplasmic domain as shown. Insert-free phage or unselected libraries were used as negative controls and they showed no binding above background. Two seeding dilutions are shown for each assay.
[0237]
  A similar strategy was used to determine the specificity of phage isolated in screens containing β5 cytoplasmic domain fusion proteins. The binding assay was performed using individually amplified phage as shown in FIG. Five phage displaying the motifs found most frequently in the second and third panning were tested. Each panel shows a binding assay for phage that displayed peptides that bound to the β5 cytoplasmic domain. Insert-free phage, or unselected libraries were used as negative controls and they did not show more than background binding in these assays.
[0238]
  Perform binding assays comparing the interaction of individual phage motifs with β1, β3, or β5 cytoplasmic domain fusion proteins to determine whether binding of selected motifs is specific for each cytoplasmic domain did. ELISA with anti-GST antibody showed that the three proteins can be coated onto plastic with equal efficiency, and therefore the difference in binding does not reflect the difference in coating concentration (not shown) ). Both β3-selected phage and β5-selected phage interact selectively with the originally selected protein, β3 / β1 = 3.9, β3 / β5 = 3.7, β5 / β1 = 4.8, and An average binding selectivity of β5 / β3 = 6.9 was observed (not shown). The average selectivity for the integrin cytoplasmic domain for BSA was about 1-2 orders of magnitude greater (not shown). None of the phages tested seemed to bind strongly to the β1 cytoplasmic domain (not shown).
[0239]
Characterization of synthetic peptides corresponding to sequences displayed by integrin cytoplasmic domain-binding phages
  Based on the binding properties, specific phages were selected for further study. Synthetic peptides corresponding to the sequences displayed by each phage were used to perform binding inhibition studies. This assay determined whether phage binding was completely mediated by the targeting peptide displayed by each phage or whether it also contained non-specific components. As expected, the synthetic peptide inhibited the binding of the corresponding phage in a dose-dependent manner (FIGS. 11 and 12). A control peptide containing an irrelevant amino acid had no effect on phage binding when tested at the same concentration.
[0240]
Phosphorylation events modulate the interaction of selected peptides with the cytoplasmic domain
  Events involving phosphorylation are important in the control of signal transduction. A phage display system was used to evaluate the effect of tyrosine phosphorylation at two levels. First, recombinant fusion proteins containing β3 or β5 cytoplasmic domains were used for panning phage libraries displaying tyrosine-containing peptides. Secondly, phage selection was performed after phosphorylating the cytoplasmic domain itself. Experiments were conducted to investigate the ability of specific tyrosine kinases to modulate the interaction of selected peptides with the cytoplasmic domain. The results obtained in the panning of phage libraries displaying tyrosine containing peptides are shown in Table 10.
[0241]
  Clones randomly selected from the third and fourth rounds were sequenced from the X4YX4 library phosphorylated by Fyn. The amino acid sequence of the peptide encoded by the phagemid was deduced from the nucleotide sequence. Table 10 shows the motifs found most frequently after panning the indicated library with β3 or β5. The ratio of binding to β3 or β5 was calculated by dividing the number of β3 or β5 colonies found after panning by the number of GST or BSA colonies. The ratio of binding to phage phosphorylated by β3 or β5 Fyn to binding to unphosphorylated phage was calculated by dividing the number of colonies found after panning.
[0242]
[Table 10]
  Sequences displayed by phosphorylated phage binding to the integrin cytoplasmic domain
Figure 0005077862
[0243]
  The effect of phosphorylation on the affinity and specificity of cytoplasmic domain binding was investigated. Phage displaying peptides that bind to the cytoplasmic domains of β3 and β5 were used as described previously (Schmitz et al., 1996; Dente et al., 1997; Gram et al., 1997) using Fyn kinase. Phosphorylated in vitro. Specific phosphorylation of tyrosine-containing peptides on the phage surface in the kinase reaction32P-γdATP was used and confirmed by separating the phage pIII protein by SDS-PAGE.
[0244]
  Phages phosphorylated in vitro showed increased affinity and specificity for binding to the β3 integrin cytoplasmic domain (FIG. 13). TLRKYFHSS (SEQ ID NO: 120) phage was also tested in assays containing other GST cytoplasmic domain fusion proteins to determine specificity (Figure 14).
[0245]
Sequence similarity between integrin-binding peptides and known cytoskeletal and signaling proteins
  Peptides displayed by integrin cytoplasmic domain binding phage were similar to several regions found in cytoskeletal proteins and proteins involved in signal transduction (Table 11). The similarity between some of the isolated peptides and a region of mitogen-activated protein kinase 5 (MAPK5, amino acids 227-234) was particularly interesting. Associations involving the MAPK cascade, cell adhesion, migration, and proliferation have been proposed (Lin et al., 1997).
[0246]
[Table 11]
  Sequence similarity between integrin-binding peptides and known cytoskeletal and signaling proteins
Figure 0005077862
[0247]
Membrane-permeable peptide
  Penetratin is a peptide that allows a hydrophilic compound to pass through the plasma membrane. Fusion with the penetrating moiety allows the oligopeptide to be directly targeted to the cytoplasm, nucleus, or both without obvious disruption (Derossi et al., 1994). This membrane-permeable peptide consists of 16 residues corresponding to amino acids 43-58 of the antennapedia homeodomain, the Drosophila transcription factor (Joliet et al., 1991a, 1991b; Le Roux et al., 1993).
Figure 0005077862
Consists of. Penetratin-mediated uptake occurs at both 37 ° C. and 4 ° C., and the incorporated peptide can be recovered intact from the cells.
[0248]
  Peptides containing penetratin sequences fused to sequences of motifs found to bind to the cytoplasmic domain of β3 or β5 were designed. The peptides were synthesized on a 431 Applied Biosystems peptide synthesizer using p-hydroxymethylphenoxymethyl polystyrene (HMP) resin and standard Fmoc chemistry. Peptide uptake and visualization were performed as described (Derossi et al., 1994; Hall et al., 1996; Theodore et al., 1995).
[0249]
  Briefly, 10-50 μg / ml biotinylated peptide was added to the cell culture. The peptide was incubated with the seeded cells. After 2-4 hours, the cultures were washed 3 times with tissue culture medium, fixed, and permeabilized with ethanol: acetic acid (9: 1) at −20 ° C. for 5 minutes. Non-specific protein binding sites were blocked by incubating the culture with Tris-buffered saline (TBS) containing 10% fetal calf serum (FCS) and 0.02% Tween for 30 minutes. Cultures were incubated in the same buffer containing streptavidin conjugated with FITC (1: 200 dilution), washed with TBS, and then set up for inspection by confocal microscopy. The peptide linked to penetratin was taken up very efficiently (data not shown).
[0250]
  Functional data show that cytoplasmic domain-binding peptides selected for β3 or β5 can interfere with integrin-mediated signaling and subsequent cellular responses (ie, endothelial cell adhesion, diffusion, proliferation, migration) showed that. Commercially available “incorporable” forms of synthetic motifs (SDNRYIGSW, SEQ ID NO: 97; and CEQRQTQEGC, SEQ ID NO: 93; β3-binding peptide, and VVISYSMPD, SEQ ID NO: 112; β5-binding peptide) found by phage screening I got a panel. These complex chimeric peptides are coupled with penetratin, the most selective of the β3 or β5 cytoplasmic domain binding peptides + from the biotin moiety to allow tracking of the peptide after it has been incorporated into whole cells Become. These membrane-permeable peptides can be taken up and affect cellular events after β3 and β5 ligand binding and induce a large amount of apoptosis (data not shown).
[0251]
Endothelial cell proliferation, chemotaxis, and apoptosis
  The effect of β3 and β5 integrin cytoplasmic domain binding motifs on endothelial cell proliferation was evaluated after stimulation with factors that activate endothelial cells (FIG. 15). Cell proliferation was measured according to Pasqualini and Hemler (1994). In brief, 4 × 10FourHUVECs were incubated in 24-well plates and depleted for 24 hours, after which the medium was removed and replaced in the presence of VEGF and 15 μM of each peptide. After an additional 18 hours incubation, 50 μl [ThreeMedium containing H] thymidine (1 μCi / ml) was added to the wells. After further incubation for 6 hours at 37 ° C., the medium was removed and the cells were fixed with 10% TCA for 30 minutes at 4 ° C., washed with ethanol and solubilized with 0.5 N NaOH. Radioactivity was counted by liquid scintillation by using an LS 6000SC Beckman scintillation counter. Each experiment was performed three times in triplicate, and the results were expressed as mean ± SD.
[0252]
  The effect of β3 and β5 integrin cytoplasmic domain binding motifs on endothelial cell migration was evaluated after stimulation with factors that activate endothelial cells. The tested peptides affected cell function in a dose-dependent and specific manner. These properties are thought to be intrinsic to the β3 or β5 cytoplasmic domain (FIG. 16).
[0253]
Chemotaxis assay
  Cell migration was assayed in a 48-well microchemotaxis chamber. Polyvinyl pyrrolidone-free polycarbonate filters with 8 μm pores were coated with 1% gelatin for 10 minutes at room temperature and equilibrated with M199 medium supplemented with 2% FCS. M199 supplemented with 2% FCS containing peptide, 20 ng / ml VEGF-A (R & D System), and 1 U / ml heparin was placed in the lower chamber of the Boyden chamber. Overnight depleted subconfluent cultures are rapidly trypsinized to a final concentration of 2 x 106Resuspended in M199 medium containing 2% FCS at a volume / ml. After placing the filter between the lower and upper chambers, 50 μl of cell suspension was spread over the upper chamber. 5% CO2Cells were allowed to migrate for 5 hours at 37 ° C. in a humidified atmosphere. The filter was then removed and the upper cells were detached using a rubber policeman. The migrated cells were fixed with methanol and stained with Giemsa solution. Five random high power fields (40x) in each well were counted. The results show that both β3 integrin cytoplasmic domain binding peptides increased cell migration, but penetratin did not affect the cells.
[0254]
Apoptosis assay (propidium iodide (PI) -stained subdiploid population)
  1x106Individual cells were collected in complete medium and 15 μM peptide was added for 4 hours, 8 hours, or 12 hours. Cells were then washed with PBS and resuspended in 0.5 ml propidium iodide solution (50 μg / ml PI, 0.1% Triton X-100, 0.1% sodium citrate). After 24 hours incubation at 4 ° C., cells were counted with XL Coulter (Coulter Corporation) using a 488 nm laser; 12,000 cells were counted for each histogram and cell cycle distribution was analyzed with a multicycle program .
[0255]
  Treatment of cells with the VISY-Penetratin chimera resulted in induction of apoptosis (Figure 17, panel d). No pro-apoptotic effect was observed when cells were exposed to other growth factors (not shown). Penetratin alone and other penetratin chimeras failed to induce a similar effect (Figure 17, panel c). This finding indicates that new approaches for inhibiting angiogenesis can be developed based on the use of integrin targeting peptides.
[0256]
Immunization with cytoplasmic domain-binding peptides and characterization of the resulting antibodies
  Using standard techniques, polyclonal antibodies that recognize αvβ3 and αvβ5 binding peptides were generated using KLH conjugates made with synthetic peptides. Antibodies against two different synthetic peptides were generated (Figure 18). Serum not only recognizes the immobilized peptide, as shown by Western blot analysis, but also recognizes specific proteins in whole cell extracts (Figure 19).
[0257]
  Rabbits were immunized with SDNRYIGSW (SEQ ID NO: 97) -KLH conjugate or GLDTYRGSP (SEQ ID NO: 96) -KLH conjugate. Each rabbit was injected with complete Freund's adjuvant containing the peptide conjugated with 200 μg KLH. 20-60 days later, rabbits were injected with 100 μg incomplete Freund's adjuvant. Serum was collected after the third immunization. Preimmune serum obtained prior to the first immunization was used as an additional control in the experiment.
[0258]
  Polyclonal antibodies were tested by ELISA, Western blot, and immunoprecipitation. In the ELISA assay, microtiter well plates were coated with 10 μg / ml peptide. Plates were dried at 37 ° C., blocked with PBS + 3% BSA, and incubated with PBS + 1% BSA containing different serum dilutions. After washing and incubation with secondary antibody, alkaline phosphatase substrate was added and antibody binding was detected colorimetrically at 405 nm. Mouse polyclonalserumAnd rabbit polyclonalserumThe reactivity observed in both was highly specific. In all cases, antibody binding was lost by preincubation with the corresponding peptide used for immunization, but not by the control peptide (FIGS. 18 and 19). Antibodies raised against two β3 cytoplasmic domain binding peptides are:35In immunoprecipitation experiments using S-labeled extracts, specific bands on the whole cell extract are recognized. Similar results were obtained with polyclonal sera and purified IgG (not shown).
[0259]
  This example shows that targeting peptides for specific domains of cellular receptors can be identified by phage display. Such peptides can be used to identify endogenous ligands of cellular receptors such as endostatin. Furthermore, the peptides themselves may have a therapeutic effect or may be useful as a basis for the identification of more effective therapeutic agents. The endostatin targeting peptide identified here showed effects on cell proliferation, chemotaxis and apoptosis when introduced into cells. One skilled in the art will appreciate that the present invention is not limited to the disclosed peptides or therapeutic effects. Other cellular receptors and ligands, and their inhibitors and activators can also be identified by the disclosed methods.
[0260]
Example 7. Induction of apoptosis by integrin-binding peptide (Endothanos)
  Example 9 is an example of penetratinJoinIt has been shown that the VISY peptide (VVISYSMPD, SEQ ID NO: 112) imported into cells by can induce apoptosis in HUVEC cells. To identify an endogenous cellular analog of the peptide identified here as Annexin V, an antibody raised against the VISY peptide was used. The results indicate that annexin V is an endogenous ligand for integrins involved in a novel apoptotic pathway.
[0261]
Method
Protein purification
  Using the method described in Example 9, a polyclonal antibody against the VISY peptide (VVISYSMPD, SEQ ID NO: 112) was prepared. MDA-MB-435 breast cancer cells were used for purification of endogenous VISY peptide analogs. Cells were washed 3 times with ice cold PBS and lysed with cold water for 20 minutes. To separate the cytoplasmic fraction from the membrane fraction, the cell extract was centrifuged at 100,000 × g for 30 minutes. The cytoplasmic fraction was subjected to column chromatography on a gel filtration column (10-50 kDa) and an anion exchange column (monoQ). The anion exchange column was eluted with a salt gradient from 50 mM to 1 M NaCl. 1 ml fractions were collected, subjected to SDS-PAGE and tested by Western blotting for the presence of endogenous protein reactive with anti-VISY antibody. The fraction of interest containing a 36 kDa antibody reactive band was eluted with approximately 300 mM NaCl.
[0262]
  36 kDa always appeared in the fraction showing positive reactivity with anti-VISY antibody. Fractions were analyzed by SDS-PAGE and 2D gel electrophoresis followed by Western blotting. Substantial enrichment of the 36 kDa protein was seen after column chromatography (not shown). The 36 kDa peptide was excised from the SDS-PAGE gel and analyzed by mass spectrometry to obtain its sequence. All five peptide sequences obtained by mass spectrometry showed 100% homology with the reported annexin V sequence (GenBank accession number GI_468888). In addition to its presence in 435 cells, a 36 kDa band was also seen in Kaposi sarcoma cells, SKOV cells, and HUVEC cells (not shown).
[0263]
  Commercial antibodies against Annexin V were obtained (Santa Cruz Biologics, Santa Cruz, CA). Competition Western blots were performed using anti-VISY and anti-annexin V antibodies. Both antibodies showed reactivity with the 36 kDa protein (not shown). These results indicate that the endogenous protein analog of the VISY peptide is annexin V.
[0264]
Protein-protein interaction by annexin V and β5 cytoplasmic domains
  To investigate the binding of Annexin V to β5 integrin and the effect of the VISY peptide, a competitive binding assay was performed. Plates were coated with GST fusion proteins of various integrin cytoplasmic domains and Annexin V was added to the plates. Anti-Annexin V antibody was used to determine Annexin V binding. As shown in FIG. 20A, Annexin V did not bind to GST-β1 or GST-β3 integrin. Annexin V bound strongly to GST-β5 integrin, but binding was dependent on the buffer used (FIG. 20A). Low binding was observed in Tris-buffered saline (TBS), “cytoplasmic buffer” with or without added calcium (2 mM) (100 mM KCl, 3 mM NaCl, 3.5 mM MgCl2, 10 mM PIPES, 3 mM DTT), high binding was observed (FIG. 20A). Calcium was used because annexin V activity has been reported to be regulated by calcium. Annexin V binding to GST-β5 was blocked by the addition of the VISY peptide (FIG. 20A). FIG. 20B shows the relative level of binding of anti-annexin V antibody to purified annexin V and VISY peptides.
[0265]
  The reverse experiment was performed using annexin V to coat the plate and adding the GST fusion protein of the integrin cytoplasmic domain. Binding was assessed using an anti-GST fusion protein antibody. As expected, only GST-β5 showed substantial binding with Annexin V, and GST-β1 and GST-β3 showed low levels of Annexin V binding (not shown). In some experiments, decreased binding was observed in the presence of calcium, and calcium ions were thought to interfere with the binding interaction between GST-β5 and Annexin V (not shown). In the presence of calcium (67% inhibition), a greater degree of inhibition of Annexin V binding to GST-β5 was observed by the VISY peptide than in the absence of calcium (45%) (FIG. 20A).
[0266]
Penetratin peptide chimeras that bind to the .BETA.5 cytoplasmic domain induce programmed cell death
  Induction of apoptosis by the VISY peptide shown in Example 9 was confirmed. Ten6HUVEC cells were treated with 15 μM VISY Antennapedia (Penetratin) chimera or 15 μM Antennapedia peptide (pentratin) alone for 2-4 hours and analyzed for chromatin fragmentation by agarose gel electrophoresis. FIG. 21 shows the induction of apoptosis by VISY-Ant (Penetratin) as shown by chromatin fragmentation. Neither VISY nor penetratin alone induced apoptosis. Induction of apoptosis was inhibited by up to 70% when a caspase inhibitor (zVAD, caspase inhibitor I, Calbiochem # 627610, San Diego, Calif.) Was added to the medium simultaneously with the VISY chimeric peptide.
[0267]
  The difference between the mechanism of cell death induced by the VISY peptide and that of other pro-apoptotic agents is that other apoptotic mechanisms evaluated in cell culture include the detachment of cells from the substrate prior to cell death. Is included. In contrast, in cell death induced by VISY, the cells do not detach from the substrate prior to cell death. Endothanos (death from within) is therefore considered to be different from anoikis (homelessness).
[0268]
  The results of Example 9 and this example show that the VISY peptide activates the integrin-dependent apoptotic pathway. This example shows that the endogenous analog of the VISY peptide is annexin V. These results demonstrate the existence of a novel apoptotic pathway that is mediated by the interaction between Annexin V and β5 integrin and that is dependent on caspase activity. This novel apoptotic mechanism is called endotanus. One skilled in the art will appreciate that the novel mechanisms for inducing or inhibiting apoptosis are useful for a variety of applications such as cancer therapy.
[0269]
Example 8. Identification of receptor / ligand pairs: aminopeptidase A regulates endothelial cell function and angiogenesis
  Tumor vascular endothelial cells express specific angiogenic markers. Aminopeptidase A (APA, EC 3.4.11.7) is upregulated in microvascular vessels during angiogenesis. APA is a homodimeric membrane-bound zinc metallopeptidase that hydrolyzes N-terminal glutamyl or aspartyl residues from oligopeptides (Nanus et al., 1993). In vivo, APA converts angiotensin II to angiotensin III. The renin-angiotensin system plays an important role in the control of several endocrine, cardiovascular and behavioral functions (Ardaillou, 1997; Stroth and Unger, 1999). Recent studies also suggest a role for angiotensin in angiogenesis (Andrade et al., 1996), but the function of APA in the process of angiogenesis has not been previously investigated.
[0270]
  In this example, a targeting peptide capable of binding to APA was identified by screening a phage library against APA-expressing cells. An APA-binding peptide containing the motif CPRECESIC (SEQ ID NO: 123) specifically inhibited APA enzyme activity. Soluble CPRECESIC (SEQ ID NO: 123) peptide inhibited endothelial cell migration, proliferation, and morphogenesis in vitro and prevented in vivo angiogenesis in the chick embryo chorioallantoic membrane (CAM) assay. Furthermore, APA null mice had a reduced amount of retinal neovascularization in hypoxia-induced retinopathy in immature mice compared to wild type (wt) mice. These results can lead to a better understanding of the role of APA in angiogenesis and the development of new anti-tumor treatment strategies.
[0271]
Materials and methods
Cell culture
  The renal cancer cell line SK-RC-49 was transfected with an expression vector encoding the full-length APA cDNA (Geng et al., 1998). Cells were treated with 2 mM glutamine, 1% non-essential amino acids, 1% vitamin (Gibco BRL), 100 U / ml streptomycin, 100 U / ml penicillin (Irvine Scientific), 10 mM sodium pyruvate (Sigma-Aldrich), and 10% fetal calf serum Maintained in MEM (Irvine Scientific, Santa Ana, CA) supplemented with (FCS) (Tissue Culture Biological, Tulare, CA). Stably transfected cells were maintained in media containing G418. HUVEC was isolated by collagenase treatment and used between 1-4 generations. Cells are supplemented with 20% FCS, penicillin (100 U / ml), streptomycin (50 μg / ml), heparin (50 μg / ml), bovine brain extract (100 μg / ml) on plastic coated with gelatin. In M199 medium (Sigma). All media supplements were obtained commercially (Life Technologies, Inc., Milan, Italy).
[0272]
Antibodies and peptides
  Anti-APA mAb RC38 (Schlingemann et al., 1996) was used to immunocapture APA from transfected cell lysates. CPRECESIC (SEQ ID NO: 123) and GACVRLSACGA (SEQ ID NO: 124) cyclic peptides were chemically synthesized, spontaneously cyclized under non-reducing conditions, and purified by mass spectrometry (AnaSpec San Jose, CA). Mass spectrometric analysis of the CPRECESIC (SEQ ID NO: 123) peptide revealed six different peaks, probably reflecting different disulfide bond positions and dimer formation. Because the biochemical behavior for the APA enzyme activity of the different fractions was similar, a mixture of 6 peaks was used in all the procedures below.
[0273]
APA immune capture
  Cells were detached from semi-confluent plates into cold PBS containing 100 mM N-octyl-β-glucopyranoside (Calbiochem), lysed on ice for 2 hours, and centrifuged at 13,000 × g for 15 minutes. Microtiter round bottom wells (Falcon) were coated with 2 μg RC38 for 4 hours at room temperature, blocked with PBS / 3% BSA (Intergen, Purchase, NY) for 1 hour at room temperature, and then 150 μl cell lysate ( 1 mg / ml) was incubated overnight at 4 ° C. on wells coated with mAb, washed 5 times with PBS / 0.1% Tween-20 (Sigma) and twice with PBS.
[0274]
APA enzyme assay
  Cells and immunocaptured proteins were tested for specific enzyme activity according to Liln et al. (1998). Briefly, extracts of adherent cells or cells immuno-captured with RC38 were treated with 3 mM α-L-glutamyl-p-nitroanilide (Fluka) and 1 mM CaCl.2Incubated with PBS containing for 2 hours at 37 ° C. Enzyme activity was determined by reading the absorbance (O.D.) at 405 nm with a microplate reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA).
[0275]
Cell panning
  CXThreeCXThreeCXThreeA library of C (C is cysteine and X is any amino acid) was prepared (Rajotte et al., 1998). Phage particle amplification and purification, and DNA sequencing of phage-displayed inserts were performed as described above. Cells are detached by incubation with PBS containing 2.5 mM EDTA, washed once with binding medium (DMEM high glucose supplemented with 20 mM HEPES and 2% FCS), 2 × 106Resuspended in the same medium at a concentration of cells / ml. TenTenTU phage was added to 500 μl of cell suspension and the mixture was incubated overnight (first time) or 2 hours (subsequent time) at 4 ° C. with gentle rotation. The cells were washed 5 times with binding medium at room temperature and resuspended in 100 μl of the same medium. Phages were rescued by adding 1 ml of log phase K91kan E. coli and incubating the mixture for 1 hour at room temperature. Bacteria were diluted in 10 ml of LB medium supplemented with 0.2 μg / ml tetracycline and incubated at room temperature for an additional 20 minutes. Serial dilutions were plated on LB plates containing 40 μg / ml tetracycline and the plates were incubated overnight at 37 ° C. before colonies were counted.
[0276]
Phage binding specificity assay
  As described for cell panning, 109Cell binding assays were performed using the input amount of TU. Specificity was confirmed by adding CPRECESIC (SEQ ID NO: 123) peptide to binding medium at increasing concentrations. To bind the phage to the immunocaptured APA, the wells were blocked with PBS / 3% BSA for 1 hour at room temperature and 10% in 50 μl PBS / 3% BSA.9Incubated with TU for 1 hour at room temperature. After washing 8 times with PBS / 1% BSA / 0.01% Tween-20 and 2 times with PBS, the phage was rescued by adding 200 μl of logarithmic growth phase K91kan E. coli. Each experiment was repeated at least 3 times.
[0277]
In vivo tumor regression of APA-binding phage
  Tumor xenografts derived from MDA-MB-435 were established in 2 month old female nude mice (Jackson Labs, Bar Harbor, Maine). Avertin anesthesia is given to the mice, 109A 200 μl volume of DMEM containing TU phage was injected intravenously from the tail vein. Phages were circulated for 5 minutes and the animals were refluxed through the heart with 5 ml of DMEM. Tumors and brains were excised from each mouse, weighed, and an equal volume of tissue was homogenized. Tissue homogenates were washed 3 times with ice-cold DMEM containing proteinase inhibitor cocktail and 0.1% BSA. Bound phage was rescued and counted as described for cell panning. Fd-tet phage was injected with the same input as a control. The experiment was repeated twice. In parallel, a portion of the tissue sample was fixed with Buan solution and embedded in paraffin for the preparation of tissue sections. An antibody against M-13 phage (Amersham-Pharmacia) was used for staining.
[0278]
Cell proliferation assay
  Complete M199 medium containing HUVEC in a 48-well plate (10FourPer well / well) and allowed to attach for 24 hours. Cells were then depleted for 24 hours in M199 medium containing 2% FCS. Medium containing 2% FCS and 10 ng / ml VEGF-A (R & D System, Abingdom, UK) containing CPRECESIC (SEQ ID NO: 123) peptide or control GACVRLSACGA (SEQ ID NO: 124) peptide (1 mM) in wells Added. After incubation for the indicated times, cells were fixed with 2.5% glutaraldehyde, stained with 20% methanol containing 0.1% crystal violet, and solubilized with 10% acetic acid. All treatments were performed in triplicate. Cell proliferation was assessed by measuring OD at 590 nm with a microplate reader (Biorad, Hercules, CA). A calibration curve was established and a linear correlation between O.D.Three~TenFiveObserved in cells.
[0279]
Chemotaxis assay
  The cell migration assay was performed in a 48 well microchemotaxis chamber (NeuroProbe, Gaithersburg, MD) according to Bussolini et al. (1995). Polyvinyl pyrrolidone free polycarbonate filters (Nucleopore, Cambridge, Mass.) With 8 μm pores were coated with 1% gelatin for 10 minutes at room temperature and equilibrated with M199 medium supplemented with 2% FCS. M199 medium supplemented with 2% FCS and 10 ng / ml VEGF-A (R & D System) containing CPRECESIC (SEQ ID NO: 123) peptide or control GACVRLSACGA (SEQ ID NO: 124) peptide (1 mM) was added to the Boyden chamber. Placed in the lower chamber. Overnight subconfluent cultures were collected in PBS containing 2.5 mM EDTA, washed once with PBS, and a final concentration of 2 × 106The cells were resuspended in M199 medium containing 2% FCS per unit / ml. After placing the filter between the lower and upper chambers, 50 μl of the cell suspension is spread over the upper chamber and 5% CO2Cells were allowed to migrate for 5 hours at 37 ° C. in a humidified atmosphere. The filter was then removed and the upper cells were detached using a rubber policeman. Migrated cells were fixed with methanol and stained with Giemsa solution (Diff-Quick, Baxter Diagnostics, Rome, Italy). Five random high power fields (100x) in each well were counted. Each assay was performed in triplicate.
[0280]
3D cell culture
  100 μl of Matrigel (Collaborative Research, Bedford, Mass.) Was added to each well of a 48-well tissue culture plate and solidified at 37 ° C. for 10 minutes. HUVEC were depleted in M199 medium supplemented with 2% FCS for 24 hours, and then collected in PBS containing 2.5 mM EDTA. TenFourCells were gently added to each well in triplicate and allowed to adhere to the gel coating for 30 minutes at 37 ° C. The medium was then replaced with complete medium containing the indicated concentrations of CPRECESIC (SEQ ID NO: 123) peptide or GACVRLSACGA (SEQ ID NO: 124) peptide. After 24 hours, the plates were photographed using an inverted microscope (Canon). The assay was repeated three times.
[0281]
CAM assay
  In vivo angiogenesis was assessed by the CAM assay (Ribatti et al., 1994). Fertilized eggs from white leghorn chickens were maintained at 37 ° C. at a constant humidity. On the third day of incubation, a square window was opened in the eggshell, and 2-3 ml of egg white was removed to detach the developing CAM from the shell. The window was sealed with a glass plate of the same size and the eggs were returned to the incubator. 8th day, 1mmThreeSterilized gelatin sponge (Gelfoam, Upjohn Co, Kalamazoo, Milan), VEGF-A (20 ng, R & D System), CPRECESIC (SEQ ID NO: 123) or control GACVRLSACGA (SEQ ID NO: 124) peptide (1 mM) 3 μl of PBS containing heel was absorbed and transplanted on top of growing CAM under aseptic conditions. CAM was examined daily until day 12, and photographed in ovo with a Leica stereomicroscope. Capillaries that emerged from the sponge were counted. The assay was repeated twice.
[0282]
Induction of retinal neovascularization
  APA null mice have been described (Lin et al., 1998). P7 (7 days old) pups were exposed to 75% oxygen for 5 days with their breastfeeding mothers. Mice were returned to normoxia (atmosphere) at P12. For histological analysis, mice were sacrificed at P17-P21, eyes were removed and fixed overnight at + 4 ° C. in PBS containing 4% paraformaldehyde. The fixed eye was embedded in paraffin, and 5 μm serial sections were cut out. Sections were stained with hematoxylin / eosin (h / e) solution. Neovascular nuclei on the vitreous side of the inner limiting membrane were counted from 20 h / e stained sections for each eye. The average number of neovascular nuclei per section was calculated and compared between groups of animals using the Student t test.
[0283]
result
APA-binding motif is selected by cell panning with phage display
  To identify peptides capable of binding APA, cells were screened with a random peptide phage library. First, to obtain a model of APA expression in the native conformation, full-length APA cDNA was transfected into SK-RC-49 renal cancer cells that did not express APA. APA expressed as a result of transfection was functionally active as demonstrated by the APA enzyme assay (not shown), but parental SK-RC-49 cells did not show APA expression or activity (Not shown).
[0284]
  CX to reduce non-specific bindingThreeCXThreeCXThreeC phage library (10TenTransduction units [TU]) were pre-adsorbed on parental SK-RC-49 cells. Resuspended SK-RC-49 / APA cells were screened with phage that did not bind to parental cells. SK-RC-49 / APA binding phage was amplified and used for two successive selections. Increased binding of phage to SK-RC-49 / APA cells compared to binding of phage to SK-RC-49 parental cells was observed a second time and a third time (not shown).
[0285]
  Subsequent phage sequencing determines the general library sequence CXThreeCXThreeCXThreePeptide inserts containing C tandem repeats
Figure 0005077862
Specific enrichment of was revealed. This sequence was randomly selected from the second round and accounted for 50% of the 18 phage inserts and 100% of the phage inserts from the third round. The four peptide inserts obtained from the second round had sequence similarity to tandem phage (Table 12, bold font). Several other clearly conserved motifs were observed in the second peptide (Table 12, underlined or italicized). One of these partially overlapped with the tandem repeat sequence. A search for sequence homology against the human database of selected peptides did not give significant matches.
[0286]
[Table 12]
  APA-binding peptide sequence
Figure 0005077862
[0287]
Selected phage inserts are specific APA ligands
  Peptide insert
Figure 0005077862
The phages displaying were individually tested for APA binding. All three phages specifically bound to the surface of SK-RC-49 / APA cells (not shown) in a similar pattern enriched 6-fold over SK-RC-49 parental cells. Control insert-free phage showed no binding preference (not shown). The second-selected CGTGCAVECEVVC (SEQ ID NO: 128) and other phage did not show selective binding to SK-RC-49 / APA cells (data not shown). A soluble peptide CPRECESIC (SEQ ID NO: 123) containing a consensus sequence that reproduces the APA-binding phage insert was synthesized.
[0288]
  Binding assays were performed using CPKVCPRECESNC (SEQ ID NO: 127) phage in the presence of CPRECESIC (SEQ ID NO: 123) peptide. Soluble CPRECESIC (SEQ ID NO: 123) peptide competed with CPKVCPRECESNC (SEQ ID NO: 127) phage for binding to SK-RC-49 / APA cells, but against non-specific binding to SK-RC-49 parental cells Has no effect (not shown). The irrelevant cyclic peptide GACVRLSACGA (SEQ ID NO: 124) had no competitive activity (not shown).
Figure 0005077862
Phage binding was also replaced by CPRECESIC (SEQ ID NO: 123) peptide, but CLGQCASICVNDC (SEQ ID NO: 126) phage binding was not affected (data not shown).
[0289]
  To further confirm the substrate specificity of selected peptide inserts, APA was partially purified from extracts of cells transfected with APA by immunocapture with mAB RC38. APA protein immobilized on RC38 coated microwells was functional as confirmed by enzyme assay (not shown).
Figure 0005077862
Phage selectively bound to immunocaptured APA with a 10-12 fold enrichment compared to phage binding to RC38 immunocaptured SK-RC-49 parental cell-derived cell lysates (shown) Absent).
[0290]
APA-binding phage targets tumors in vivo
  The ability of the identified peptides to return to tumor was assessed using nude mice implanted with human breast tumor xenografts as a model system. Phages were injected into the tail vein of tumor-bearing mice and targeting was assessed by phage recovery from tissue homogenates. CPKVCPRECESNC (SEQ ID NO: 127) phage was enriched 4-fold in tumor grafts compared to brain tissue used as a control (FIG. 22). Insert-free phage did not target the tumor (Figure 22). Neither CYNLCIRECESICGADGACWTWCADGCSRSC (SEQ ID NO: 125) phage or CLGQCASICVNDC (SEQ ID NO: 126) phage showed tumor regression preference (data not shown).
[0291]
  Regression of CPKVCPRECESNC (SEQ ID NO: 127) was confirmed by anti-M13 immunostaining on tissue sections (not shown). Strong phage staining was seen in the tumor vasculature but not in the normal vasculature (not shown). Insert-free phage did not bind to tumor vessels.
[0292]
CPRECESIC (SEQ ID NO: 123) is a specific inhibitor of APA activity
  To study the effect of CPRECESIC (SEQ ID NO: 123) on APA enzyme activity, SK-RC-49 / APA cells were treated with increasing concentrations of CPRECESIC (SEQ ID NO: 123) peptide or control GACVRLSACGA (SEQ ID NO: 124). Incubation with the APA-specific substrate α-glutamyl-p-nitroanilide in the presence of peptides. Enzyme activity was assessed by colorimetric assay after 2 hours incubation at 37 ° C. CPRECESIC (SEQ ID NO: 123) inhibited APA enzyme activity and reduced activity by 60% at the highest concentration tested (FIG. 23). IC of CPRECESIC (SEQ ID NO: 123) for enzyme inhibition50Was calculated to be 800 μM. CPRECESIC (SEQ ID NO: 123) did not affect the activity of aminopeptidase N, a closely related protease (data not shown).
[0293]
CPRECESIC (SEQ ID NO: 123) inhibits endothelial cell migration and proliferation
  The potential use of CPRECESIC (SEQ ID NO: 123) peptide as an anti-angiogenic agent was determined. First, the effect of APA inhibition by in vitro CPRECESIC (SEQ ID NO: 123) peptide on migration and proliferation of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) stimulated with VEGF-A (10 ng / ml) was investigated. The presence of functional APA on HUVEC was assessed by enzyme assay (not shown). At the highest concentration tested (1 mM), CPRECESIC (SEQ ID NO: 123) peptide inhibited HUVEC chemotaxis by 70% in the Boyden chamber assay (FIG. 24). At the same peptide concentration, cell proliferation was inhibited by 50% (Figure 25). Relatively low concentrations of CPRECESIC (SEQ ID NO: 123) peptide or GACVRLSACGA (SEQ ID NO: 124) control peptide had no significant effect on cell migration and proliferation (not shown).
[0294]
CPRECESIC (SEQ ID NO: 123) inhibits angiogenesis in vitro and in vivo
  The inhibitory effect of CPRECESIC (SEQ ID NO: 123) peptide in different in vitro and in vivo angiogenesis models was investigated. HUVECs seeded on a three-dimensional matrix gel differentiate into capillary-like structures, giving an in vitro angiogenesis model. Increasing concentrations of CPRECESIC (SEQ ID NO: 123) peptide resulted in progressive impairment of the formation of this network (not shown). At 1 mM peptide concentration, the vascular-like branching structure was significantly less and shorter and as a result the cells were unable to form a complete network tissue (not shown). The control peptide GACVRLSACGA (SEQ ID NO: 124) did not affect HUVEC morphogenesis (not shown).
[0295]
  A commonly used model for in vivo angiogenesis is the chick embryo chorioallantoic membrane (CAM), which can be stimulated during embryogenesis. Appropriate stimulation absorbed by the gelatin sponge induces the recruitment of microvessels to the sponge itself, which is achieved by remodeling and branching of new capillaries. Eight-day-old chicken egg CAMs were stimulated with VEGF-A alone (20 ng), VEGF-A + CPRECESIC (SEQ ID NO: 123) peptide or GACVRLSACGA (SEQ ID NO: 124) peptide (1 mM). A CAM photo was taken on the 12th day. Angiogenesis induced by VEGF-A was inhibited 40% by CPRECESIC (SEQ ID NO: 123) based on the number of capillaries emerging from the sponge (Table 13). Neovascularization did not show the highly branched capillary structure typically seen after VEGF-A stimulation (not shown). Treatment with the control peptide GACVRLSACGA (SEQ ID NO: 124) or CPRECESIC (SEQ ID NO: 123) at a relatively low peptide concentration had no effect on the number of growing blood vessels (not shown).
[0296]
[Table 13]
  CAM assay for angiogenesis
Figure 0005077862
* P <0.01 by Student-Newman-Keuls test. Results are expressed as mean and standard error from two independent experiments.
[0297]
APA-deficient mice show impaired angiogenesis
  In a model of hypoxic retinopathy in immature mice, APA+/-Mouse and APA-/-The angiogenic ability of null mice was investigated. Induction of retinal neovascularization by relative hypoxia is APA compared to wild-type mice+/-It was already present in the mouse (not shown). In APA null mice, angiogenesis was almost undetectable (not shown). Angiogenesis was quantified by counting the vitreous protruding neovascular nuclei from 20 hypoxic eye sections. After 75% oxygen treatment of P7-P12, a significant induction of retinal neovascularization (16.17 ± 1.19 neovascular nuclei per eye section) was found in wild-type mice on day 17 (P17). After P7-P12 75% oxygen exposure, P17 APA+/-Reduced amounts of neovascular nuclei were found in the retina of mice (10.76 ± 1.03 neovascular nuclei per eye section) and APA null mice (4.25 ± 0.45 neovascular nuclei per eye section) .
[0298]
Consideration
  In vivo, APA is overexpressed by activated microvessels, including tumors, but is almost undetectable in the resting vasculature and is therefore a suitable target for vascular-oriented tumor therapy. In this example, a novel targeting peptide ligand CPRECESIC (SEQ ID NO: 123) of APA was identified. Soluble CPRECESIC (SEQ ID NO: 123) peptide is 800 μM IC50Inhibited APA enzyme activity.
[0299]
  When cultured HUVEC was used as an in vitro angiogenesis model, soluble CPRECESIC (SEQ ID NO: 123) peptide inhibited HUVEC migration and proliferation induced by VEGF-A. These data are consistent with the requirement for endothelial cell migration and proliferation during angiogenesis. CPRECESIC (SEQ ID NO: 123) blocked the formation of capillary-like structures in the Matrigel model and inhibited angiogenesis in CAM stimulated by VEGF-A.
[0300]
  APA null mice had significantly lower retinal neovascularization compared to wild type mice, indicating that APA plays an important role in angiogenesis induced by relative hypoxia. These results enhance the possibility of using APA as a specific target for inhibition of tumor angiogenesis.
[0301]
  In summary, the soluble peptide CPRECESIC (SEQ ID NO: 123) is a selective APA ligand and inhibitor. Inhibition of APA by CPRECESIC (SEQ ID NO: 123) inhibits angiogenesis in different in vitro and in vivo assays, demonstrating for the first time a significant role for APA in the angiogenesis process. In addition, APA-binding phage can return to tumor blood vessels, suggesting the potential for therapeutic use of CPRECESIC (SEQ ID NO: 123) as an inhibitor of tumor angiogenesis. . Endogenous analogs of CPRECESIC (SEQ ID NO: 123) can be identified by antibody-based purification or identification methods similar to those disclosed above.
[0302]
Example 9. Screening of phage library by PALM
  In certain embodiments, it is desirable to be able to select a particular cell type from a heterogeneous sample of an organ or tissue. One way to perform such selective sampling is by PALM (positioning and stripping with a laser microbeam).
[0303]
  The PALM robot microbeam uses an accurate computer-guided laser for microexfoliation. A pulsed ultraviolet (UV) laser is interfaced to the microscope and focused through the objective to a beam spot size less than 1 micrometer in diameter. The principle of laser cutting is a locally limited exfoliative photolysis process without heating (Hendrix, 1999). Effective laser energy is concentrated only in a small focal spot, and most biological objects are transparent with respect to the wavelength of the applied laser. This system appears to be a selection tool for recovering homogenous cell populations or single cells or subcellular structures for subsequent phage recovery. The tissue sample may be collected by excising selected areas or single cells after administering the phage to the subject. A clear gap between the selected area and the non-selected area is typically obtained. The isolated tissue specimen can be fired directly onto a typical microcentrifuge tube cap so that it radiates from the object plane and does not come into contact at all. The basis for this so-called laser pressure firing (LPC) method is thought to be the laser pressure generated under the specimen caused by the extremely high photon density of the precisely focused laser microbeam. With this tissue harvesting technique, the phage can survive and be rescued from the microablation technique.
[0304]
  PALM was used in this example to select targeting phage for mouse pancreatic tissue as described below.
[0305]
Materials and methods
In vitro and in situ panning
  CX7C peptide phage library (109 TU) was injected into the tail vein of C57BL / 6 male mice, the pancreas was collected and the phages were recovered by bacterial infection. Phage from 246 colonies were individually grown in 5 ml of LB / kanamycin (100 μg / ml) / tetracycline (40 μg / ml) with stirring in the dark at 37 ° C. Overnight cultures were pooled and the phage purified by NaCl / PEG precipitation for another in vivo biopanning round. 300 colonies were picked from the second panning round and the phages were recovered by precipitation. The phage from the second biopanning round was then used for another biopanning round and similarly incubated with freeze-thawed mouse pancreas sections for one in situ panning round.
[0306]
  In the third in vivo panning round, phage 10 from the second round9 TU was injected into a third mouse and allowed to circulate for 6 minutes, followed by an intravenous injection of 50 μl FITC-lectin (Vector Laboratories Inc.). After circulating for 2 minutes, the left ventricle of the mouse was refluxed with 3 ml of MEM Earle salt. The pancreas was harvested and frozen at −80 ° C. in Tissue Tek (Sakura) and sectioned on a prepared glass slide.
[0307]
  For the third in situ round, purified phage isolated from the second round was incubated with thawed mouse pancreas sections 4-14 μm sections for 30 minutes in ice. Sections were rinsed 8 times with 100 μl ice-cold PBS at room temperature (RT). To infect the bound phage for 30-60 minutes at RT, use K91 KanR(OD600= 2.03) Recovered from each section by adding 100 μl. Infected K91 KanR was recovered from each section and allowed to recover for 20 minutes in the dark in 10 ml of LB / Kan / Tet (0.2 μg / ml). Aliquots from each culture were plated on LB / Kan / Tet (40 μg / ml) plates and incubated overnight in the dark at 37 ° C. The remaining tetracycline concentration in each culture was increased to 40 μg / ml and the cultures were incubated overnight with agitation in the dark at 37 ° C. to amplify and purify the phage.
[0308]
DNA amplification
  Phages were recovered from cryopreserved FITC-lectin-stained mouse pancreatic islets and surrounding acinar microdissected from 14 μm sections using a PALM (laser microbeam positioning and detachment) cold laser pressure firing system. Islets and control sections were fired into 1 mM EDTA at pH 8 and frozen at −20 ° C. until enough material was collected for PCR amplification. Phage DNA was amplified using fUSE5 primer.
Figure 0005077862
The PCR product was subjected to another round of PCR using overlapping sets of primers. The 3 ′ end of the second primer set was tailed with an M13 reverse primer for sequencing purposes. The nested primer set used is
Figure 0005077862
Met. Two additional primers were used to generate a peptide insert sequence containing an adjacent SfiI restriction site.
Figure 0005077862
The PCR product generated from the nested primer was gel purified (Qiagen) and CX using M13 reverse primer by automated sequencing7The presence of the C peptide insert was confirmed. The PCR product generated from the library primer is gel purified (Qiagen) and CsCl2Ligated to purified fUSE5 / SfiI, electroporated into electrocompetent MC1061 cells and seeded on LB / streptomycin (100 μg / ml) / tetracycline (40 μg / ml) agar plates. CX by gel electrophoresis7To confirm the presence of the C insert sequence, colony PCR was performed on a single colony using fUSE5 primer. Positive clones were sequenced using a Big Dye terminator (Perkin Elmer).
[0309]
Phage infection
  Enriched material is collected by placing islets and control sections in 1 mM AEBSF, 20 μg / ml aprotinin, 10 μg / ml leupeptin, 1 mM elastase inhibitor I, 0.1 mM TPCK, 1 nM pepstatin A, pH 7.4 in PBS. Frozen up to 48 hours or less. Sections were thawed in ice and the volume adjusted to 200 μl with PBS pH 7.4. Sample K91 KanR(OD = 0.22) Incubated with 1 ml at RT on a swirler for 2 hours. Each culture was transferred to 1.2 ml LB / Kan / Tet (0.2 μg / ml) and incubated for 40 minutes in the dark of RT. The concentration of tetracycline was increased to 40 μg / ml for each culture and the cultures were incubated overnight at 37 ° C. with agitation. The next day, each culture was seeded on LB / Kan / Tet agar plates and incubated for 14 hours in the dark at 37 ° C. Positive clones were picked for colony PCR and automated sequencing.
[0310]
result
  A general scheme for in vivo panning using PALM is shown in FIG. After the first in vivo selection round, phage were either bulk amplified or a single colony of phage was amplified from the pancreas, kidney, lung, and adrenal gland for further rounds of in vivo screening. Both bulk amplified and colony amplified phage from mouse pancreas showed continuous enrichment as selection rounds increased (not shown). After 3 rounds of selection, colony amplified phage showed almost 1 order enrichment higher than bulk amplified phage (not shown).
[0311]
  Table 14 lists selected targeting sequences and consensus motifs identified by pancreatic screening.
[0312]
[Table 14]
  Pancreatic targeting peptides and motifs
Figure 0005077862
Figure 0005077862
Figure 0005077862
[0313]
  FIG. 27 shows a general protocol for recovery of phage insert sequences from PALM-selected thin section material. As indicated, phage may be recovered by direct infection of E. coli host bacteria after protease digestion of thin section samples. Alternatively, the phage insert may be recovered by PCR amplification, cloned into new vector DNA, and then electroporated or transformed into a host bacterium for cloning.
[0314]
  Both methods of PALM recovery of phage successfully recovered pancreatic targeting sequences. Pancreatic sequences recovered by direct bacterial infection include
Figure 0005077862
Was included. Pancreatic targeting sequences recovered by amplification of the phage insert and cloning into the phage include:
Figure 0005077862
Is included.
[0315]
  Figures 28-31 show the sequence homologies identified for selected pancreatic targeting sequences. Several proteins have been identified that are known to be present in pancreatic tissue. The results of this example indicate that the PALM method may be used to select cell types from tissue slices and to recover targeting phage sequences. One skilled in the art will recognize that this method can be used on virtually any tissue to obtain targeting sequences directed to a particular type of cell in a heterologous organ or tissue.
[0316]
  All of the compositions, methods, and devices disclosed and claimed herein can be made and executed without undue experimentation in light of the present disclosure. Although the compositions and methods of the present invention have been described with reference to preferred embodiments, modifications may be made to the compositions, methods, and apparatus and steps or sequence of steps disclosed herein, which It will be apparent to those skilled in the art that the present invention falls within the concept, spirit and scope. More specifically, it is clear that certain substances that are chemically and physiologically related may be substituted for the substances described herein if the same or similar results are obtained. All such similar substituents and modifications apparent to those skilled in the art are deemed to be within the spirit, scope and concept of the invention as defined by the appended claims.
[0317]
reference
  The following references are specifically incorporated herein by reference to the extent that they provide exemplary techniques or other details of those described herein.
Figure 0005077862
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[Brief description of the drawings]
  The accompanying drawings are part of the present specification and are included to further demonstrate certain aspects of the present invention. The invention may be better understood by reference to one or more of these drawings in combination with the detailed description of specific embodiments presented herein.
FIG. 1 Confirmation of placental return phage. Phage carrying the targeting peptide identified in Example 3 were injected into pregnant mice and the recovery from placenta was compared to control fd-tet phage containing no targeting sequence. Placental regression phage clones were PA-TPKTSVT (SEQ ID NO: 39), PC-RAPGGVR (SEQ ID NO: 41), PE-LGLRSVG (SEQ ID NO: 44), PF-YIRPFTL (SEQ ID NO: 43).
FIG. 2 Confirmation of fat regression peptide. The phage carrying the targeting peptide identified in Example 4 was injected into pregnant mice and the recovery from adipose tissue was compared to a control fd-tet phage containing no targeting sequence.
FIG. 3. In vitro spleen targeting using BRASIL. The binding of Fab clones # 2, # 6, # 10, and # 12 and the control Fab clone NPC-3TT were compared to the control Fd-tet phage.
FIG. 4. In vitro spleen targeting using BRASIL. The binding of Fab clones # 2, # 6, # 10, and # 12 and the control Fab clone NPC-3TT were directly compared to each other.
FIG. 5. In vivo spleen targeting using BRASIL. The binding of Fab clones # 2, # 6, # 10, and # 12 was compared with that of Fd-tet phage.
FIG. 6. In vivo spleen targeting using BRASIL. Binding of Fab clone # 10 to spleen tissue was compared to that of Fab control clones NPC-3TT and Fd-tet phage.
FIG. 7. Binding of Fab clone # 10 compared to Fd-tet phage to spleen (compared to bone marrow).
FIG. 8. Binding of Fab clones from anti-Kaposi's sarcoma library with angiogenic retina.
FIG. 9. Binding of phage selected in the β3 cytoplasmic domain to immobilized protein. GST fusion protein or GST alone was coated at 10 μg / ml into microtiter wells and used to bind phage expressing endostatin targeting peptides. Each phage was identified by the displayed peptide sequence: GLDTYRGSP (SEQ ID NO: 96); YDWWYPWSW (SEQ ID NO: 95); CLRQSYSYNC (SEQ ID NO: 104); SDNRYIGSW (SEQ ID NO: 97); CEQRQTQEGC (SEQ ID NO: 93); CFQNRC (SEQ ID NO: 102). The data represents the average number of colonies from triplicate wells with a standard error of less than 10% of the average value.
FIG. 10. Binding of phage selected in the β5 cytoplasmic domain to immobilized protein. GST fusion protein or GST alone was coated at 10 μg / ml into microtiter wells and used to bind phage expressing endostatin targeting peptides. Each phage was identified by the displayed peptide sequence: (A) DEEGYYMMR (SEQ ID NO: 110); (B) KQFSYRYLL (SEQ ID NO: 111); (C) CEPYWDGWFC (SEQ ID NO: 106); (D) VVISYSMPD (SEQ ID NO: 112); and (E) CYIWPDSGLC (SEQ ID NO: 105). The data represents the average number of colonies from triplicate wells with a standard error of less than 10% of the average value.
FIG. 11. Binding of cytoplasmic domain-binding phage to β3 immobilized protein and inhibition by synthetic peptides. Phage were incubated on wells coated with GST-β3cyto in the presence of increasing concentrations of the corresponding synthetic or control peptide. The data represents the average number of colonies from triplicate wells with a standard error of less than 10% of the average value.
FIG. 12. Binding of cytoplasmic domain binding phage to β5 immobilized protein and inhibition by synthetic peptides. Phage were incubated on wells coated with GST-β5cyto in the presence of increasing concentrations of the corresponding synthetic or control peptide. The data represents the average number of colonies from triplicate wells with a standard error of less than 10% of the average value.
FIG. 13: Binding of phage after phosphorylation with immobilized β3-GST and β5-GST. The phage was phosphorylated with Fyn kinase. Insert-free phage was used as a control. Phages were incubated on wells coated with GST-β3cyto or GST-β5cyto. The data represents the average number of colonies from triplicate wells with a standard error of less than 10% of the average value.
FIG. 14. Binding of phosphorylated phage to immobilized GST fusion protein. The phage was phosphorylated with Fyn kinase. Insert-free phage was used as a control. Phages were incubated on wells coated with GST cytoplasmic domain. The data represents the average number of colonies from triplicate wells with a standard error of less than 10% of the average value.
FIG. 15: Effect of integrin cytoplasmic domain binding peptide on cell proliferation. Serum-depleted cells are cultured for 24 hours,ThreeProliferation was determined by measuring H] thymidine (1 μCi / ml) uptake. In the positive control, VEGF was added back to the serum-depleted cells. Each experiment was performed three times in triplicate, and the results were expressed as mean ± SD.
FIG. 16: Effect of penetratin peptide chimera on endothelial cell migration. Cell migration assays were performed in a 48-well microchemotaxis chamber. In each well, 5 random high power fields (40x) were counted. The results indicate that both β3 integrin cytoplasmic domain binding peptides (Y-18 and TYR-11) increased cell migration while penetratin did not affect the cells.
FIG. 17. Penetratin peptide chimeras that bind to the β5 cytoplasmic domain induce programmed cell death. Ten6Individual HUVEC cells were collected in complete medium and 15 μM penetratin peptide chimera was added to the cells. Cells were stained with propidium iodide (PI) after 4 hours, 8 hours, and 12 hours, and apoptosis induction was analyzed by cytometric analysis. a) Profile obtained with depleted cells after 24 hours. b) Confluent cells in complete medium. c) 15 μM penetratin after 4 hours. d) 15 μM VISY-Penetratin chimera after 4 hours. Cells analyzed after 8 and 12 hours are G0/ G1Similar ratio profiles were shown.
FIG. 18: Specificity of antibodies produced against phage selected at β3 or β5 (ELISA). Serum with increasing dilution obtained after 3 immunizations with GLDTYRGSP (SEQ ID NO: 96) or SDNRYIGSW (SEQ ID NO: 97) conjugated with KLH, 10 μg of SDNRYIGSW (SEQ ID NO: 97, Y-18) , GLDTYRGSP (SEQ ID NO: 96, TYR-11), or microtiter wells coated with a control peptide. Pre-immune serum was used as a control. HRPGoatAfter incubation with anti-rabbit antibody, OD was measured at 405 nm. Data represent the mean from triplicate wells with a standard error of less than 10%.
FIG. 19: Specificity of antibodies raised against phage selected at β3 or β5 (ELISA). Serum obtained after 3 immunizations with SDNRYIGSW (SEQ ID NO: 97, Y-18) or GLDTYRGSP (SEQ ID NO: 96, TYR-11) conjugated with KLH is coated with 10 μg TYR-11 or Y-18 Incubated in microtiter wells. GLDTYRGSP (SEQ ID NO: 96) or SDNRYIGSW (SEQ ID NO: 97) and a control peptide were added to the solution. HRPGoatAfter incubation with anti-rabbit antibody, OD was measured at 405 nm. The data represents the mean from triplicate wells with a standard error of less than 10%. The peptide added to the solution specifically blocks reactivity with the immobilized peptide.
FIG. 20A shows competitive binding of Annexin V to β5 integrin with the VISY peptide. Binding assay was performed by ELISA. FIG. 20B shows the relative level of binding of anti-annexin V antibody to purified annexin V protein and VISY peptide.
FIG. 21. A chimeric peptide comprising a VISY peptide linked to penetratin (antennapedia) induces apoptosis. Apoptosis induced by VISY was inhibited by the addition of caspase inhibitor (zVAD).
FIG. 22. APA-binding phage specifically binds to tumors. An equal amount of phage was injected into the tail vein of mice bearing MDA-MB-435-derived tumors, and the phages were collected after perfusion. Average values and standard errors of phage recovered from tumors or control tissues (brain) from triplicate seedings are shown.
FIG. 23: CPRECESIC (SEQ ID NO: 123) is a specific inhibitor of APA activity. APA enzyme activity was assayed in the presence of increasing concentrations of either GACVRLSACGA (SEQ ID NO: 124) peptide (control) or CPRECESIC (SEQ ID NO: 123) peptide. IC for APA inhibition by CPRECESIC (SEQ ID NO: 123)50Was estimated at 800 μM. The error bar is the standard error of the average value of the three wells. The experiment was repeated three times with similar results.
FIG. 24. CPRECESIC (SEQ ID NO: 123) inhibits HUVEC migration. HUVEC were stimulated with VEGF-A (10 ng / ml). The assay was performed in a Boyden micro chemotaxis chamber and cells were allowed to migrate through an 8 μm pore filter for 5 hours at 37 ° C. GACVRLSACGA (SEQ ID NO: 124) peptide (control) and CPRECESIC (SEQ ID NO: 123) peptide were tested at a concentration of 1 mM. Migrated cells were stained and five high power fields (100 ×) were counted for each microwell. The error bar is the standard error of the average value of three microwells.
FIG. 25: CPRECESIC (SEQ ID NO: 123) inhibits HUVEC proliferation. Cells were stimulated with VEGF-A (10 ng / ml) and proliferation was assessed at the indicated time points by a colorimetric assay based on crystal violet staining. The error bar is the standard error of the average value of the three wells. Each experiment was repeated at least twice and showed similar results.
FIG. 26: In vivo biopanning protocol for phage targeted in mouse pancreas, kidney, liver, lung, and adrenal gland.
FIG. 27: Protocol for phage recovery by E. coli infection or phage DNA recovery by amplification and subcloning.
FIG. 28. Islet targeting peptides and homologous proteins. Endogenous protein candidates mimicked by the following islet targeting peptides identified by standard homology searches: CVSNPRWKC (SEQ ID NO: 197), CVPRRWDVC (SEQ ID NO: 194), CQHTSGRGC (SEQ ID NO: 195), and CRARGWLLC (SEQ ID NO: 196).
FIG. 29. Islet targeting peptides and homologous proteins. Endogenous protein candidates mimicked by the following islet targeting peptides identified by standard homology searches: CGGVHALRC (SEQ ID NO: 175), CFNRTWIGC (SEQ ID NO: 198), and CWSRQGGC (SEQ ID NO: 200).
FIG. 30. Islet targeting peptides and homologous proteins. Endogenous protein candidates mimicked by the following islet targeting peptides identified by standard homology searches: CLASMGMDAC (SEQ ID NO: 204), CHDERTGRC (SEQ ID NO: 205), CAHHALMEC (SEQ ID NO: 206), and CMQGARTSC (SEQ ID NO: 208).
FIG. 31. Islet targeting peptides and homologous proteins. Endogenous protein candidates mimicked by the following islet targeting peptides identified by standard homology searches: CHVLWSTRC (SEQ ID NO: 201), CMSSPGVAC (SEQ ID NO: 203), and CLLGLMAGC (SEQ ID NO: 202).

Claims (30)

配列番号：125、配列番号：126、配列番号：127、及び配列番号：252からなる群より選択されるペプチド配列を含む、アミノペプチダーゼAに選択的に結合する50アミノ酸以下の単離ペプチド。An isolated peptide of 50 amino acids or less that selectively binds to aminopeptidase A, comprising a peptide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 127, and SEQ ID NO: 252 . 配列番号:125のペプチド配列を含む、請求項1記載の単離ペプチド。  2. The isolated peptide of claim 1, comprising the peptide sequence of SEQ ID NO: 125. 配列番号:126のペプチド配列を含む、請求項1記載の単離ペプチド。  2. The isolated peptide of claim 1, comprising the peptide sequence of SEQ ID NO: 126. 配列番号:127のペプチド配列を含む、請求項1記載の単離ペプチド。  2. The isolated peptide of claim 1, comprising the peptide sequence of SEQ ID NO: 127. 配列番号：252のペプチド配列を含む、請求項1記載の単離ペプチド。 2. The isolated peptide of claim 1, comprising the peptide sequence of SEQ ID NO: 252 . 長さが40アミノ酸以下である、請求項1〜5のいずれか一項記載の単離ペプチド。  The isolated peptide according to any one of claims 1 to 5, which has a length of 40 amino acids or less. 長さが30アミノ酸以下である、請求項3〜5のいずれか一項記載の単離ペプチド。The isolated peptide according to any one of claims 3 to 5, which has a length of 30 amino acids or less. 長さが20アミノ酸以下である、請求項3〜5のいずれか一項記載の単離ペプチド。The isolated peptide according to any one of claims 3 to 5, which has a length of 20 amino acids or less. 長さが10アミノ酸以下である、請求項5記載の単離ペプチド。  6. The isolated peptide according to claim 5, having a length of 10 amino acids or less. 請求項1〜9のいずれか一項記載の単離ペプチドと治療剤の結合物。 A conjugate of the isolated peptide according to any one of claims 1 to 9 and a therapeutic agent . 治療剤が、薬物、化学療法剤、放射性同位体、アポトーシス促進剤、抗血管新生剤、ホルモン、サイトカイン、細胞毒性剤、殺細胞タンパク質、細胞増殖抑制剤、ペプチド、タンパク質、抗生物質、抗体、抗体のFab断片、ホルモンアンタゴニスト、核酸、または抗原である、請求項10記載の結合物。The therapeutic agent is a drug, chemotherapeutic agent, radioisotope, pro-apoptotic agent, anti-angiogenic agent, hormone, cytokine, cytotoxic agent, cytocidal protein, cytostatic agent, peptide, protein, antibiotic, antibody, antibody 11. The conjugate according to claim 10, which is a Fab fragment, a hormone antagonist, a nucleic acid, or an antigen. 抗血管新生剤が、トロンボスポンジン、アンジオスタチン5、色素上皮由来因子(pigment epithelium-drived factor)、アンジオテンシン、ラミニンペプチド、フィブロネクチンペプチド、プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤、組織メタロプロテイナーゼ阻害剤、インターフェロン、インターロイキン12、血小板因子4、IP-10、Gro-β、トロンボスポンジン、2-メトキシエストラジオール、プロリフェリン(proliferin)関連タンパク質、カルボキシアミドトリアゾール、CM101、マリマスタット(Marimastat)、ペントサンポリスルフェート(pentosan polysulphate)、アンジオポエチン2、インターフェロンα、ハービマイシン(herbimycin)A、PNU145156E、16Kプロラクチン断片、リノマイド(Linomide)、サリドマイド、ペントキシフィリン(pentoxifylline)、ゲニステイン(genistein)、TNP-470、エンドスタチン、パクリタキセル、ドセタキセル(Docetaxel)、ポリアミン、プロテアソーム阻害剤、キナーゼ阻害剤、シグナル伝達ペプチド、アキュチン(accutin)、シドフォビル(cidofovir)、ビンクリスチン、ブレオマイシン、AGM-1470、血小板因子4、及びミノサイクリン(minocycline)からなる群より選択される、請求項11記載の結合物。Anti-angiogenic agents are thrombospondin, angiostatin 5, pigment epithelium-driven factor, angiotensin, laminin peptide, fibronectin peptide, plasminogen activator inhibitor, tissue metalloproteinase inhibitor, interferon, Interleukin 12, platelet factor 4, IP-10, Gro-β, thrombospondin, 2-methoxyestradiol, proliferin-related protein, carboxamidotriazole, CM101, marimastat, pentosan polysulfate (pentosan) polysulphate), angiopoietin 2, interferon alpha, herbimycin A, PNU145156E, 16K prolactin fragment, linomide, thalidomide, pentoxifylline, genistein, TNP-470, endo Tachin, paclitaxel, docetaxel, polyamine, proteasome inhibitor, kinase inhibitor, signaling peptide, accutin, cidofovir, vincristine, bleomycin, AGM-1470, platelet factor 4, and minocycline 12. A conjugate according to claim 11, selected from the group consisting of: アポトーシス促進剤が、エトポシド、Bax、Bid、Bik、BadまたはアネキシンVからなる群より選択される、請求項11記載の結合物。12. A conjugate according to claim 11, wherein the pro-apoptotic agent is selected from the group consisting of etoposide, Bax, Bid, Bik, Bad or Annexin V. サイトカインが、インターロイキン1(IL-1)、IL-2、IL-5、IL-10、IL-11、IL-12、IL-18、インターフェロン-γ(IF-γ)、IF-α、IF-β、腫瘍壊死因子-α(TNF-α)、またはGM-CSF(顆粒球マクロファージコロニー刺激因子)からなる群より選択される、請求項11記載の結合物。Cytokines are interleukin 1 (IL-1), IL-2, IL-5, IL-10, IL-11, IL-12, IL-18, interferon-γ (IF-γ), IF-α, IF 12. The conjugate according to claim 11, selected from the group consisting of -β, tumor necrosis factor-α (TNF-α), or GM-CSF (granulocyte macrophage colony stimulating factor). 請求項1〜9のいずれか一項記載の単離ペプチドと分子複合体の結合物。 A conjugate of the isolated peptide according to any one of claims 1 to 9 and a molecular complex . 複合体が、ウイルス、バクテリオファージ、細菌、リポソーム、微粒子、磁性ビーズ、酵母細胞、哺乳動物細胞、または細胞である、請求項15記載の結合物。16. The conjugate according to claim 15, wherein the complex is a virus, bacteriophage, bacterium, liposome, microparticle, magnetic bead, yeast cell, mammalian cell, or cell. 複合体がウイルスまたはバクテリオファージである、請求項16記載の結合物。17. A conjugate according to claim 16, wherein the complex is a virus or a bacteriophage. ウイルスが、アデノウイルス、レトロウイルス、およびアデノ随伴ウイルスからなる群より選択される、請求項17記載の結合物。18. The conjugate according to claim 17, wherein the virus is selected from the group consisting of adenovirus, retrovirus, and adeno-associated virus. ウイルスが、遺伝子治療ベクターを含むものとしてさらに定義される、請求項18記載の結合物。19. The conjugate of claim 18, wherein the virus is further defined as comprising a gene therapy vector. 請求項1〜9のいずれか一項記載の単離ペプチドと真核生物発現ベクターの結合物。 A conjugate of the isolated peptide according to any one of claims 1 to 9 and a eukaryotic expression vector . 請求項1記載の単離ペプチドと診断薬の結合物。 A conjugate of the isolated peptide of claim 1 and a diagnostic agent . 診断薬が造影剤である、請求項21記載の結合物。The conjugate according to claim 21, wherein the diagnostic agent is a contrast agent. 造影剤が、クロム(III)、マンガン(II)、鉄(III)、鉄(II)、コバルト(II)、ニッケル(II)、銅(II)、ネオジム(III)、サマリウム(III)、イッテルビウム(III)、ガドリニウム(III)、バナジウム(II)、テルビウム(III)、ジスプロシウム(III)、ホルミウム(III)、エルビウム(III)、ランタン(III)、金(III)、鉛(II)、またはビスマス(III)を含む、請求項22記載の結合物。Contrast agent is chromium (III), manganese (II), iron (III), iron (II), cobalt (II), nickel (II), copper (II), neodymium (III), samarium (III), ytterbium (III), gadolinium (III), vanadium (II), terbium (III), dysprosium (III), holmium (III), erbium (III), lanthanum (III), gold (III), lead (II), or 23. A conjugate according to claim 22, comprising bismuth (III). 造影剤が放射性同位元素を含み、該放射性同位元素が、アスタチン211、14炭素、51クロム、36塩素、57コバルト、58コバルト、銅67、152ユーロピウム、ガリウム67、3水素、ヨウ素123、ヨウ素125、ヨウ素131、インジウム111、59鉄、32リン、レニウム186、レニウム188、 75 セレニウム、35硫黄、テクネチウム 99m 、またはイットリウム90である、請求項22記載の結合物。 The contrast agent contains a radioisotope, and the radioisotope is astatine 211 , 14 carbon, 51 chromium, 36 chlorine, 57 cobalt, 58 cobalt, copper 67 , 152 europium, gallium 67 , 3 hydrogen, iodine 123 , iodine 125 23. A conjugate according to claim 22 , which is iodine 131 , indium 111 , 59 iron, 32 phosphorus, rhenium 186 , rhenium 188 , 75 selenium , 35 sulfur, technetium 99m , or yttrium 90 . 疾患の処置のための、請求項10〜20のいずれか一項記載の結合物。21. A conjugate according to any one of claims 10 to 20 for the treatment of a disease. 疾患の診断のための、請求項21から24のいずれか一項記載の結合物。25. A conjugate according to any one of claims 21 to 24 for the diagnosis of a disease. 疾患が、異常な血管新生に関連する疾患である、請求項25または26記載の結合物。27. The conjugate according to claim 25 or 26, wherein the disease is a disease associated with abnormal angiogenesis. 疾患が癌である、請求項25または26記載の結合物。27. The conjugate according to claim 25 or 26, wherein the disease is cancer. 疾患が網膜新生血管形成である、請求項27記載の結合物。28. The conjugate according to claim 27, wherein the disease is retinal neovascularization. 請求項1〜9のいずれか一項記載の単離ペプチドをコードする核酸。A nucleic acid encoding the isolated peptide according to any one of claims 1 to 9 .
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