JP4934369B2 - 血圧低下作用を有するペプチド - Google Patents

Description

本発明は血圧低下作用を有し、医薬品および食品等に利用できる新規なペプチドおよびその塩、ならびに該ペプチドまたはその塩を有効成分とする血圧低下剤および血圧低下用食品に関する。

高血圧症に悩まされている患者を救済するため、高血圧症の理論的な解明の研究が盛んに行われ、数多くの報告がある。血圧上昇をもたらす代表的な生体内因子としてレニン・アンジオテンシン系が、また血圧降下に働く代表的な生体内因子としてカリクレイン・キニン系が知られており、またアンジオテンシン変換酵素（以後ＡＣＥという）がこのいずれの系にも大きく関与していることが知られている。

ＡＣＥはレニン・アンジオテンシン系において、血圧を上昇させるアンジオテンシンIIを生成する一方で、カリクレイン・キニン系においては血圧を低下させるブラジキニンを不活性化する。このためＡＣＥは強力な昇圧作用を有する。したがってこのＡＣＥの作用を抑制するＡＣＥ阻害剤は、血圧上昇物質であるアンジオテンシンIIの生成を抑制し、且つ血圧を低下させるブラジキニンの不活性化を防止するため、血圧を低下させることが可能である。

このような点から、近年ＡＣＥ阻害剤の研究開発が盛んに行われており、すでに医薬品としてもカプトプリル等いくつかの化合物が利用可能となっている。一方で、ある種のペプチド類がＡＣＥ阻害作用を有することが報告されており、動物由来として、蛇毒の数種のペプチドが、また植物由来として、小麦グルテンの加水分解ペプチド（特許文献１、２）および大豆の蛋白質分解酵素処理によるペプチド（特許文献３）等が、提案されている。

しかしながら、これまで報告されているＡＣＥ阻害作用を有するペプチド類は血圧低下作用の弱いものがほとんどであった。特に特許文献２および３に記載されるペプチド類は、実際に血圧を低下させるためには、１ｇ／ｋｇもの大量摂取を必要とするものであった。すなわち、これらのペプチド類は、血圧低下作用が弱いことから、実質的な効果を得るためには大量摂取する必要があり、血圧低下剤として実用化することは非常に困難であった。

また、上記のようなペプチド類は、ＡＣＥ阻害機能を果たす結果として、キニン増強作用が起こり、そのために空咳、発疹およびフラッシュなどの副作用を引き起こす可能性が高いという欠点も指摘されていた。

特開平４−６６５９４号公報 特開平４−３４９８９３号公報 特開平８−２２５５９３号公報

本発明は、副作用がなく安全で、血圧低下作用が高く、しかも医薬品のみならず、簡便に入手可能な食品の形態で利用できる血圧低下成分を提供することを目的とする。

本発明者らは上記状況に鑑み、鋭意研究を重ね、血圧を有効に低下させる成分を探索してきた。その結果、上記既知のＡＣＥ阻害ペプチドとは異なったアミノ酸配列を有する新規なペンタペプチド、すなわち、バリン−プロリン−バリン−プロリン−グルタミンが配列したペンタペプチド（Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ）を小麦グルテンの加水分解物から単離することに成功した。そしてこのペンタペプチドが高い血圧低下作用を有することを見出し、本発明を完成するに至った。

一実施形態において、本発明は、下記の式：
Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ
で表されるアミノ酸配列からなるペプチドおよびその塩に関する。

更に、本発明は、上記式で表されるアミノ酸配列からなるペプチドまたはその塩を有効成分とする血圧低下剤および血圧低下用食品を包含する。

本発明により、従来技術よりも簡単な方法で、安全性および血圧低下能に優れたペプチド、血圧低下剤および血圧低下用食品を提供することができる。

以下、本発明の好適な実施形態について具体的に説明する。
本発明の血圧低下作用を有するペプチドは、当初、小麦グルテンのプロテアーゼによる加水分解処理生成物から分離精製されて見出されたものである。小麦から分離精製されたものの場合には、本発明のペプチドに含まれる３種のアミノ酸Ｖａｌ、ＰｒｏおよびＧｌｎは、いずれもＬ−アミノ酸である。しかし、本発明のペプチドは、Ｌ−アミノ酸のみからなるペプチドに限定されず、上記のアミノ酸配列を有するペプチドであればいずれの光学異性体であるアミノ酸であってもよい。該５つのアミノ酸の全部がＤ−アミノ酸からなるペプチドであっても、５つのアミノ酸のうちいずれか１〜４つがＬ−アミノ酸であって残りがＤ−アミノ酸であるペプチドであっても、化学合成により製造することができ、いずれも本発明のペプチドに包含される。

本発明のペプチドの塩は、薬学的に許容できる塩であれば限定されないが、たとえば、酸付加塩および塩基付加塩が挙げられる。酸付加塩としては、塩酸、硫酸、硝酸またはリン酸等の無機酸との塩、酢酸、リンゴ酸、コハク酸、酒石酸またはクエン酸等の有機酸との塩が挙げられる。また塩基付加塩としては、ナトリウムまたはカリウム等のアルカリ金属との塩、カルシウムまたはマグネシウム等のアルカリ土類金属との塩、アンモニウムまたはトリエチルアミン等のアミン類との塩が挙げられる。

本発明のペプチドを製造する方法の例としては、化学的に合成する方法、または天然物由来蛋白質、たとえば植物蛋白質、好ましくは小麦蛋白質の加水分解物から分離精製する方法が挙げられる。後者の方法は、日常的に摂取されている小麦等を原料とするものであり、安全性の面から好ましい。

本発明のペプチドを小麦蛋白質の加水分解物から分離精製する場合、用いられる小麦蛋白質は、グルテンを主成分とするが、その他にアルブミン、グロブリン、グルテニン、グリアジンなどの小麦中に含まれていることが知られる他の蛋白質を含有していてもよく、さらに澱粉質や繊維質などの不純物を不可避的に含有していてもよい。また、本発明では、小麦蛋白質として、小麦由来のグルテンに予め化学的処理や酵素などによる生物的処理を施して、分子量を低下させたものやプロテアーゼとの親和性などを高めたものも使用できる。

蛋白質の加水分解方法としては、公知の加水分解方法を適宜採用できる。具体的には、プロテアーゼを用いて加水分解する方法などが挙げられる。プロテアーゼを用いて小麦蛋白質を加水分解する方法としては、たとえば、特開平４−３４９８９３号公報に記載された方法が挙げられる。

具体的には、プロテアーゼを用いて蛋白質を加水分解する場合、水性媒体中、１種または複数種のプロテアーゼを作用させて加水分解物を生成させることができる。酸性プロテアーゼ単独で用いる方法、または酸性プロテアーゼと中性プロテアーゼまたはアルカリ性プロテアーゼとを用いる方法が、目的物であるペプチドを高収率で得ることができる点で好ましい。

酸性プロテアーゼと中性プロテアーゼまたはアルカリ性プロテアーゼとを用いる場合、酸性プロテアーゼと中性プロテアーゼまたはアルカリ性プロテアーゼとを同時に加水分解処理に適用してもよいが、まず酸性プロテアーゼで処理した後、酸性プロテアーゼを失活させ、その後、中性プロテアーゼまたはアルカリ性プロテアーゼで処理すると、酸性溶液中で蛋白質の分散性が向上して、加水分解の反応効率が上がるため好ましい。

プロテアーゼを用いて蛋白質を加水分解する場合、水性媒体中における蛋白質の濃度は、使用するプロテアーゼの種類によって適宜調節する必要があるが、通常、水性媒体中１.０〜２０質量％に調整するのがよい。水性媒体としては、例えば、水、生理食塩水、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液等を使用できる。

酸性プロテアーゼとしては、ペプシン、微生物由来の酸性プロテアーゼ、たとえば、麹菌由来の酸性プロテアーゼ、ペニシリウム属微生物由来のアスパルティックプロテアーゼ、アスペルギルス属微生物由来の酸性プロテアーゼ、バチルス属微生物由来の酸性プロテアーゼおよびヒイロタケ由来のアスパルティックプロテアーゼなどを使用することができる。酸性プロテアーゼは、通常ｐＨ約１．５〜７．０の酸性領域で活性を有する。酸性プロテアーゼのうち、ペプシンや麹菌由来の酸性プロテアーゼを用いると、目的物である蛋白質加水分解物を高収率で得ることができ好ましい。

酸性プロテアーゼは、１種類を単独で用いても、または酸性プロテアーゼ同士が互いに悪影響を及ぼさない限りは複数種を併用してもよい。また、酸性プロテアーゼは、遊離の状態で使用しても、固定化して使用してもよい。いずれの場合も乾燥した蛋白質１００ｇ当たり、酸性プロテアーゼを約５，０００〜２５０，０００ｕｎｉｔの割合で用いるのがよい。

なお、本明細書中、プロテアーゼ活性（ｕｎｉｔ）は、基質として、米国メルク社製のハマーステインカゼイン１％溶液を用い、アンソン−萩原変法（赤堀四郎編“酵素研究法”第２巻、第２３７ページ、昭和３６年１月１０日、朝倉書店発行）により測定され、反応は３０℃で３０分間行い、１分間に１μｇのチロシン相当量を遊離するのに要する酵素量を１ｕｎｉｔとした。

酸性プロテアーゼを用いて処理する場合、通常、蛋白質の加水分解度が３０〜６０％の状態になるまで行うとよい。

たとえば、酸性プロテアーゼとしてペプシンや麹菌由来の酸性プロテアーゼを用いて小麦蛋白質を加水分解する場合、小麦蛋白質を含有する水性媒体のｐＨを約１.５〜６.０にして、温度約３０〜７０℃で約２〜２５時間反応させると、加水分解度が３０〜６０％の状態になるので、その時点で酸性プロテアーゼを失活させて加水分解反応を停止させる。酸性プロテアーゼの失活は、溶液のｐＨを酸性プロテアーゼの活性ｐＨよりも高くするか、温度を高くする（通常、約７０〜９０℃）ことにより行うことができる。

なお、本明細書中、蛋白質の加水分解度とは、全蛋白質量に占める、０．７５Ｍトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）に溶解する蛋白質量の割合（ＴＣＡへの溶解率）を意味し、下記式で求められる。
加水分解度（％）＝[（０．７５Ｍ ＴＣＡ溶解蛋白質量）／（全蛋白質量）]×１００
中性プロテアーゼまたはアルカリ性プロテアーゼを用いて更に処理する場合には、中性プロテアーゼまたはアルカリ性プロテアーゼとして、サーモアーゼ、サーモリシン、トリプシン、キモトリプシン、プロナーゼ、サチライシン、エスペラーゼなどを使用することができる。そのうちでも、サーモアーゼ、サーモリシン、サチライシンを用いると、目的物である蛋白質加水分解物を高収率で得ることができ好ましい。

中性プロテアーゼまたはアルカリ性プロテアーゼは、１種類を単独で用いても、またはプロテアーゼ同士が互いに悪影響を及ぼさない限りは複数種を併用してもよい。また、中性プロテアーゼまたはアルカリ性プロテアーゼは、遊離の状態で使用しても、固定化して使用してもよく、いずれの場合も乾燥した蛋白質１００ｇ当たり、中性プロテアーゼまたはアルカリ性プロテアーゼを約１０，０００〜５００，０００ｕｎｉｔの割合で用いるのがよい。中性プロテアーゼまたはアルカリ性プロテアーゼによる処理は、蛋白質の加水分解度が６０〜９０％の状態になるまで行うとよい。

たとえば、中性プロテアーゼとしてサーモリシンやサーモアーゼを用いて小麦蛋白質を加水分解する場合、小麦蛋白質を含有する水性媒体のｐＨを約７.０〜８.０にして、温度約３０〜７０℃で約１〜２５時間反応させると、加水分解度が６０〜９０％の状態になるので、その時点でプロテアーゼを失活させるとよい。中性プロテアーゼまたはアルカリ性プロテアーゼの失活は、溶液のｐＨを活性ｐＨよりも低くするか、温度を高くする（通常、約８０〜１００℃）方法で行うことができる。

次に、上記の加水分解液から、不溶物を分離除去して水溶性成分を得る。ここで、不溶物とは本発明で規定する基質のプロテアーゼ処理物に存在する不溶物を意味する。不溶物の除去は、従来から知られている方法を適宜使用すればよい。具体的な方法としては、遠心分離、濾過、デカンテーション等の通常の固液分離方法が挙げられ、いずれか単独で使用するか、あるいは複数を組み合わせて使用する。

上記不溶物を除去した後の水溶性成分をそのまま次の工程に供してもよいが、活性炭、ケイソウ土等の吸着剤を使用してそこに含まれる不純物を吸着除去してから次の工程に供するのが好ましい。

上記水溶性成分は、蛋白質加水分解処理による水溶性ペプチド混合物が主成分であり、さらにアミノ酸や他の水溶性の物質を含む。このようにして得られた蛋白質加水分解物を精製する方法としては、含水アルコールにより分画（抽出）した後、ゲル濾過クロマトグラフィーや高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で精製する方法等が挙げられる。本発明のペプチドは水および含水アルコールに可溶であり、含水アルコールを用いると、簡便にアルコールに不溶な不純物を除去することができ、ＨＰＬＣを用いて精製する工程を簡略化することができる。

上記水溶性成分を、含水アルコールを用いて分画する場合、分画液中のアルコール濃度を高めて分画の効率を高めるため、水性成分を除去した濃縮物を形成させるのが好ましい。濃縮物には、濃縮液体および濃縮固体のいずれも包含される。濃縮液体を形成させる方法としては、フラッシュ式、遠心薄膜式等の減圧濃縮法等を、また濃縮固体を形成させる方法としては、噴霧乾燥法、凍結乾燥法、スプレークール法、加熱乾燥等を適宜選択できる。濃縮液体の水分含量は４０〜７０重量％とすることが好ましく、濃縮固体の水分含量は５〜１５重量％とすることが好ましい。より好ましくは濃縮固体を用いる。

含水アルコールを用いて蛋白質加水分解物を分画する場合、用いるアルコールとしては、炭素数１〜４の直鎖または分岐鎖アルコールを用いるのが適当であり、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール等が挙げられる。中でも、分画物および精製物を摂取する際の安全性を考慮すると、エタノールを用いるのがより好ましい。含水アルコールによる分画は、通常、濃度７０〜１００％のアルコール水溶液を使用して行うと効率がよい。

含水アルコールを用いる分画方法は、一段階で行っても、多段階で行ってもよい。例えば、高濃度アルコール水溶液を用いて１段階で分画してもよいし、中濃度アルコール水溶液−高濃度アルコール水溶液と２段階にアルコール濃度を高めて分画してもよい。２段階で分画すると、各アルコール濃度で不溶な不純物を効率よく除去することができ、後のクロマトグラフィーにより精製する工程をより簡略化することができる。

１段階で分画する場合、乾燥した蛋白質加水分解物に８５〜９５％の濃度のアルコール水溶液を加えて攪拌し、不溶物を取り除いてＨＰＬＣ用サンプルとする。２段階で分画する場合は、乾燥した蛋白質加水分解物をまず７０〜８５％の濃度のアルコール水溶液を加えて攪拌し、不溶物を取り除いた上清にさらにアルコールを加えて９０〜９５％アルコール水溶液として攪拌し、再度不溶物を取り除いてＨＰＬＣ用サンプルとする。

クロマトグラフィーで精製する場合、上記含水アルコール分画により得られた含水アルコール可溶性画分を一旦濃縮・乾固することが好ましい。その方法は常法に従えばよく、蒸発、凍結乾燥、熱風乾燥、真空乾燥、スプレードライ法等適宜選択できる。本発明のペプチドを、ＨＰＬＣを用いて精製する場合、濃縮・乾固した上記含水アルコール可溶性画分を直接ＨＰＬＣにかけてもよいし、ゲル濾過カラムクロマトグラフィー等により粗精製した後、ＨＰＬＣにかけてもよい。

ＨＰＬＣによる分離においては、例えば、ペプチド用ＨＰＬＣでおもに用いられる逆相系カラムまたはイオン交換系カラムを使用でき、これらはそれぞれ充填剤の基剤によりシリカ系（シリカゲルなど）と高分子系（ビニルポリマーなど）にわけられる。本発明では、好ましくはシリカ系充填剤を用いる逆相系カラムを用いる。

逆相系充填剤の置換基としては、オクタデシルシリル基、オクチル基、フェニル基、ジフェニル基などが挙げられる。これらの置換基は、通常、シリカゲル表面のシラノール基に導入されるが、トリメチルシリル化することにより残存シラノール基をエンドキャップしたものが好ましく用いられる。

分離カラムの具体例としては、例えば、オクタデシルシリル基をシルカゲルに結合させたＩｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−３（ＧＬサイエンス）等が挙げられる。

逆相系カラムによるＨＰＬＣにおける移動相としては、極性溶媒を使用する。極性溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコールなどの低級アルコールや、アセトニトリル、テトラヒドロフラン等の水溶液を使用でき、好ましくはアセトニトリルを用いる。また、上記極性溶媒にはベースラインの安定化やピークのテーリングを防止する目的でトリフルオロ酢酸を添加して用いるのが好ましい。

ＨＰＬＣにおける移動相の流速は、カラムの用途に合わせて適宜選択することができ、通常、０．１〜１００．０ｍＬ／分、好ましくは１〜３０ｍＬ／分である。分離カラムの温度は、通常、２０〜５０℃、好ましくは３０〜４５℃である。

ＨＰＬＣにおける検出器としては、通常、ＵＶ検出器を用い、検出波長を２０５〜２７０ｎｍ、好ましくは２１０ｎｍまたは２３４ｎｍ付近とし、得られた信号に応じて分取することが好ましい。

このようにして分取された画分について、ペプチドシークエンサーを用いてアミノ酸配列を解析し、Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎのアミノ酸配列を有するペプチドを含む画分を採取することにより、本発明のペプチドを得ることができる。

従って、一実施形態において本発明は、Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎで表されるアミノ酸配列からなるペプチドを製造する方法であって、
(ａ)小麦蛋白質を水性媒体中で酸性プロテアーゼで加水分解する工程、あるいは小麦蛋白質を水性媒体中で酸性プロテアーゼで加水分解した後更に中性またはアルカリ性プロテアーゼで加水分解する工程；
(ｂ)工程(ａ)の加水分解生成物から不溶物を除去して水溶性成分を回収する工程;
(ｃ)工程(ｂ)で回収した水溶性成分から水性成分を除去して濃縮物を回収する工程；
(ｄ)工程(ｃ)で回収した濃縮物を含水アルコールで分画処理して、ペプチド混合物を含水アルコール可溶性画分として分取する工程；および
(ｅ)工程(ｄ)で分取した含水アルコール可溶性画分をＨＰＬＣで分離し、Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎで表されるアミノ酸配列からなるペプチドを含む画分を採取する工程
を含む前記方法に関する。

続いて、本発明のペプチドの化学合成法について述べる。本発明のペプチドは、アミノ酸が５つ結合したペンタペプチドであり、液相合成法および固相合成法のいずれでも合成することができる。固相合成法を採用する場合、ペプチド合成装置（たとえばファルマシア社製のＢｉｏｌｙｎｘ ４１７０等）を使用して合成することもできる。

具体的な合成法としては、公知の方法を用いることができる。たとえば、本発明のペプチドＶａｌ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−ＧｌｎのＣ末端アミノ酸であるグルタミンに、アミノ基をＢｏｃ（ｔ−ブチルオキシカルボニル）基またはＦｍｏｃ（９−フルオレニルメトキシカルボニル）基等の保護基を用いて保護し、カルボキシル基を活性化したプロリンを縮合させる。次いで、Ｐｒｏ−Ｇｌｎジペプチドのプロリンのアミノ基の保護基を除去した後、アミノ基を保護し、カルボキシル基を活性化したバリンを縮合させる。このようにＣ末端側からＮ末端側へ順次アミノ酸を縮合させていくことにより、Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎのアミノ酸配列を有するペプチドを合成することができる。この際に各アミノ酸のＬ体、Ｄ体を用いることにより、５種のアミノ酸のうちいずれか１〜４つがＬ−アミノ酸であって残りがＤ−アミノ酸からなるペプチドを合成することもできる。

このようにして合成したペプチドは、固相合成法の場合にはペプチドを担体から解離し、全ての保護基を除去した後、逆相系のカラムを用いたＨＰＬＣ等による通常の方法で精製することができる。

本発明のペプチドは、高い血圧低下作用を有することから、血圧低下剤および血圧低下用食品における有効成分として使用できる。本発明のペプチド、血圧低下剤および血圧低下用食品（本発明の血圧低下剤には、血圧低下用食品が包含される場合がある）は、ヒトおよび種々の動物に投与することができ、それによってヒトや動物の血圧低下および血圧上昇抑制をもたらすことができる。また、本発明のペプチドは、アンジオテンシン変換酵素阻害作用が低いため、アンジオテンシン変換酵素阻害作用に由来する空咳、発疹、フラッシュなどの作用がない。従って、本発明のペプチドを有効成分とする血圧低下剤は、副作用がなく安全であるという点でも有利である。さらに、本発明のペプチドは、上記のとおり高い血圧低下作用を有することから、従来の血圧低下作用を有するペプチドが大量投与を必要とするのに対し、低用量で効果を発揮することができ、血圧低下剤の有効成分として実用的である。

本発明の血圧低下剤の好適な投与量は、投与されるヒトや動物の年令、体重、性別、症状、動物の種類等の種々の条件によって異なり、適宜設定することが可能である。そして、本発明の血圧低下剤は経口投与および非経口投与のいずれによっても投与可能である。本発明の血圧低下剤の投与量は、経口投与の場合、有効成分であるペプチドの質量を基準として、通常、一日量として、１〜１０００ｍｇ、好ましくは１０〜５００ｍｇである。

さらに、本発明の血圧低下剤には、医薬、食品、飼料の製造に用いられる種々の添加剤を配合することができ、種々の物質と共存させてもよい。このような物質や添加剤としては、各種油脂、生薬、アミノ酸、多価アルコール、天然高分子、ビタミン、ミネラル、食物繊維、界面活性剤、精製水、賦形剤、安定剤、ｐＨ調製剤、酸化防止剤、甘味料、呈味成分、酸味料、着色料および香料などが挙げられる。

前記各種油脂としては、たとえば大豆油、サフラワー油、オリーブ油等の植物油、牛脂、イワシ油等の動物油脂が挙げられる。

前記生薬としては、たとえば牛黄、地黄、枸杞子、ロイヤルゼリー、人参、鹿茸等が挙げられる。

前記アミノ酸としては、たとえばシステイン、ロイシン、アルギニン等が挙げられる。

多価アルコールとしては、たとえばエチレングリコール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン、糖アルコール等が挙げられる。前記糖アルコールとして、たとえば、ソルビトール、エリスリトール、キシリトール、マルチトール、マンニトール等が挙げられる。

前記天然高分子としては、たとえばアラビアガム、寒天、水溶性コーンファイバー、ゼラチン、キサンタンガム、カゼイン、グルテンまたはグルテン加水分解物、レシチン、デキストリン等が挙げられる。

前記各種ビタミンとしては、たとえばビタミンＣ（アスコルビン酸）、ビタミンＢ群、ビタミンＥ（トコフェロール）の他に、ビタミンＡ、Ｄ、Ｋ、酪酸リボフラビンなどが含まれる。また、ビタミンＢ群には、ビタミンＢ１誘導体、ビタミンＢ２、ビタミンＢ６、ビタミンＢ１２、さらにビオチン、パントテン酸、ニコチン酸、葉酸などの各種ビタミンＢ複合体が包含される。ビタミンＢ１誘導体には、チアミンまたはその塩、チアミンジスルフィド、フルスルチアミンまたはその塩、ジセチアミン、ビスブチチアミン、ビスベンチアミン、ベンフォチアミン、チアミンモノフォスフェートジスルフィド、シコチアミン、オクトチアミン、プロスルチアミンなどのビタミンＢ１の生理活性を有する全ての化合物が包含される。

前記ミネラルとしては、たとえばカルシウム、マグネシウム、亜鉛、鉄等が挙げられる。

食物繊維としては、ガム類、マンナン、ペクチン、ヘミセルロース、リグニン、β−グルカン、キシラン、アラビノキシランなどが挙げられる。

前記界面活性剤としては、たとえば、グリセリン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル等が挙げられる。

前記賦形剤としては、たとえば白糖、ブドウ糖、コーンスターチ、リン酸カルシウム、乳糖、デキストリン、澱粉、結晶セルロース、サイクロデキストリン等が挙げられる。

また、種々の添加剤として、上記以外に、たとえば、タウリン、グルタチオン、カルニチン、クレアチン、コエンザイムＱ、グルクロン酸、グルクロノラクトン、テアニン、γ−アミノ酪酸、カプサイシン、各種有機酸、フラボノイド類、ポリフェノール類、カテキン類、キサンチン誘導体、フラクトオリゴ糖などの難消化性オリゴ糖、ポリビニルピロリドン等が挙げられる。

それら添加剤の配合量は、添加剤の種類と所望すべき摂取量に応じて適宜決められるが、一般的には０.０１〜３０質量％の範囲であり、好ましくは０.１〜１０質量％の範囲である。

本発明の血圧低下剤は、単独で投与しても、また製薬工業において通常使用されている固体担体や液状担体と一緒に投与してもよい。また、本発明の血圧低下剤は、他の薬剤と混合または組み合わせて使用することができる。その際の投与形態は、錠剤、丸剤、散剤、カプセル剤、顆粒剤、粉剤、シロップ、水溶液、注射剤、ドリンク剤、流動食等の任意の形態が可能である。

さらに、本発明の血圧低下剤は、食品や飼料中に添加することもできる。従って、本発明はまた、本発明のペプチドまたはその塩を含有する血圧低下用食品に関する。本発明の食品には、健康食品や機能性食品、例えば、粉剤、タブレット、細粒、錠剤、顆粒剤、カプセル剤、流動食等の各種形態の食品が包含される。このような形態の食品は、本発明のペプチドに適当な賦形剤（例えば、でん粉、加工でん粉、乳糖、ブドウ糖、水等）を加えた後、慣用の手段を用いて製造することができる。本発明の食品の具体例として、さらに、コーヒー飲料、茶飲料、果汁入り飲料、清涼飲料、乳飲料、バター、マヨネーズ、ショートニング、マーガリン、種々のサラダドレッシング、パン類、麺類、米飯類、パスタ、菓子、クッキー類、チョコレート、キャンディ、チューインガム、各種調味料、各種ダイエット製品などが挙げられる。

これら本発明の血圧低下作用を有するペプチドまたはその塩を含む食品を摂取することにより、血圧の低下または血圧上昇抑制などの効果を期待することができる。

以下、実施例に基づき本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例になんら限定されるものではない。

実施例１ 新規ペンタペプチドの分離・精製
反応釜に小麦グルテン（活性グルテン、Ｗｅｓｔｏｎ Ｆｏｏｄｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ製）２６７ｇ、水１７００ｍＬ、１規定クエン酸３２ｍＬを仕込み、さらにクエン酸を用いてｐＨを４．０に調整し、酸性プロテアーゼ（プロテアーゼＭアマノ、アマノエンザイム製）０．４ｇ（２００００ｕｎｉｔ）を加えて４５℃に加温し、５時間反応させた。その反応液に水酸化ナトリウムを加えて溶液をｐＨ７．５に調製し、温度を８５℃にして１０分間保って酸性プロテアーゼを失活させた。

次に水２０００ｍＬを加え、温度を６５℃に調整し、中性プロテアーゼ（サーモアーゼ、大和化成製）４ｇ（３２００００ｕｎｉｔ）を加えて４時間反応させた後、温度を９０℃にして２０分間保って中性プロテアーゼを失活させた。

該反応液を遠心分離（８０００Ｇ、３０分）して不溶物を除去し、上清を回収して水溶性成分を得たのち、活性炭８ｇ、ケイソウ土６０ｇを添加して室温で１時間攪拌した。次いで、濾過処理し、固形物を分離除去して液体分を回収し、凍結乾燥して乾燥固体１５０ｇを得た。

上記で得られた乾燥個体１００ｇに対して８０％（ｖ／ｖ）エタノールを２０００ｍＬ加えて攪拌し、不溶物を濾過により除去した。残った上清に２０００ｍＬの９９．５％エタノールを加えてエタノール濃度を９０％としてさらに攪拌した。生成した不溶物を濾過により除去した。上清を減圧下に濃縮、乾固し、４０．７８ｇの分画物を得た。

この固形の分画物をＹＭＣｇｅｌ ＯＤＳ−ＡＱ１２Ｓ５０（２．５×４０ｃｍ）を用いてゲル濾過クロマトグラフィーにより更に分画し、その１０％アセトニトリル−０．１％トリフルオロ酢酸水溶液による溶出部をＨＰＬＣに付し、図１矢印のピークを分取し、精製を行った。その結果、１８０ｍｇのペプチドが得られた。
ＨＰＬＣ分離条件
カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−３ φ２０×２５０ ｍｍ（ＧＬ サイエンス製）
移動相：１０％アセトニトリル−０．１％トリフルオロ酢酸水溶液
流速：１０ｍＬ／分
検出器：紫外分光光度計 ２１０ｎｍ
温度：４０℃

精製したペプチドについて、ペプチドシークエンサーを用いてアミノ酸配列を解析したところ、Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎのアミノ酸配列を有することが確認された。

比較例１ 小麦由来のＡＣＥ阻害ペプチドの単離
ＡＣＥ阻害剤である、小麦由来のＡＣＥ阻害ペプチドであるＩｌｅ−Ａｌａ−Ｐｒｏの製造は、特開平４−６６５９４号公報を参考にして行った。

小麦グルテン１０００ｇを０.０３ｍｏｌ／Ｌ塩酸２０Ｌに分散溶解し、蒸留水を加えて４０Ｌにした。塩酸を用いてｐＨを２.０に調整し、ペプシン（ロシュ製）６０００００ｕｎｉｔを添加して３７℃で１５時間反応させた。反応終了後、５ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウムでｐＨ４.４に調整し、酸性プロテアーゼ（プロテアーゼＭアマノ、アマノエンザイム社製）１０００００ｕｎｉｔを添加して４５℃で５時間反応させた。次いで、ｐＨを６.０に調整し、９０℃で２０分間加熱して酵素を失活させた。遠心分離により不溶物を除去した後、上清を凍結乾燥して乾燥固体６７４.１ｇを得た。

上記で得られた乾燥個体をＹＭＣｇｅｌ ＯＤＳ-ＡＱ１２Ｓ５０（２.５×４０ｃｍ）を用いてゲル濾過クロマトグラフィーにより分画し、ＡＣＥ阻害活性の高い画分を分取した。さらにＨＰＬＣを用いて精製し。その結果、６７ｍｇのペプチドが得られた。精製したペプチドをペプチドシークエンサーを用いてアミノ酸配列を解析したところ、Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｐｒｏのアミノ酸配列を有することが確認された。

試験例１：血圧低下作用試験（単回投与）およびその評価
１２週齢の高血圧自然発症ラット（ＳＨＲラット）の収縮期血圧（ＳＢＰ）を、小動物加温型非観血式血圧計（ＭＫ−２０００；室町機械製）を用いて測定し、ＳＢＰ２００ｍｍＨｇ以上の動物を試験に用いた。

実施例１および比較例１のペプチド、ならびに陽性対照としてカプトプリル（シグマアルドリッチ製）をそれぞれ別個に注射用水に溶解したものを、表１に記載した用量となるように調整し、動物に単回経口投与した。投与前および、投与の２、４、６、８および２４時間後に血圧測定を行った。対照群には注射用水を経口投与し、１群の動物数は１０とした。

なお、使用ラットは、１１週齢のＳＨＲ／Ｉｚｍ雄性ラットを日本エスエルシー株式会社より購入し、１週間以上の検疫期間を含む予備飼育の後、一般状態に異常がみられなかった動物を選択し、使用した。

測定結果は、投与前のＳＢＰと投与後各時点のＳＢＰの差の平均を求め（Ｃｈａｎｇｅ ｏｆ ＳＢＰ）、対照群との各時点のＣｈａｎｇｅ ｏｆ ＳＢＰの差として、表１に示した。

表１から明らかなように、本発明の実施例１のペプチドを投与した動物は、比較例１のＡＣＥ阻害活性を示すペプチドを投与した動物に比べ、血圧低下の程度がずっと大きいことが明らかとなった。すなわち、本発明のペプチドは、従来知られていた血圧低下ペプチドに比べて非常に強力な血圧低下作用を有することが示された。

また、本発明の実施例１のペプチドを投与した動物は、血圧低下剤として承認されているカプトプリルを投与した動物と同等の血圧低下を示した。すなわち、本発明のペプチドの血圧低下作用が、血圧低下剤の有効成分として実用化するために十分であることが示された。

実施例２ 錠剤の製造
実施例１と同様にして得られたペプチド２０ｇ、結晶セルロース（旭化成）７３.８ｇおよびポリビニルピロリドン（ＢＡＳＦ）５ｇを混合し、これにエタノール３０ｍＬを添加して、湿式法により常法にしたがって顆粒を製造した。この顆粒を乾燥した後、ステアリン酸マグネシウム１．２ｇを加えて打錠用顆粒末とし、打錠機を用いて打錠し、１錠が１ｇの錠剤１００個を製造した。

実施例３ 顆粒剤の製造
実施例１と同様にして得られたペプチド２０ｇ、乳糖（ＤＭＶ）１６０ｇおよび結晶セルロース（旭化成）６０ｇを混合し、これにエタノール１３０ｍＬを添加し、練合機を用いて通常の方法で５分間練合した。練合終了後、１０メッシュで篩過し、乾燥機中にて５０℃で乾燥した。乾燥後、整粒し、顆粒剤２４０ｇを得た。

実施例４ シロップ剤の製造
精製水４００ｇを煮沸し、これをかき混ぜながら、白糖７５０ｇおよび実施例１と同様にして得られたペプチド１０ｇを加えて溶解し、熱時に布ごしし、これに精製水を加えて全量１０００ｍＬとし、シロップ剤を製造した。

本発明のペプチドは、アンジオテンシン変換酵素阻害作用が低いため、アンジオテンシン変換酵素阻害作用に由来する空咳、発疹、フラッシュなどの副作用がない。そのうえ、本発明の血圧低下剤は入手が容易で安価な原料を用いて簡単に製造できるうえ、安全性が高いことから各種飲食品に配合することができるため、きわめて実用的である。

小麦グルテンをプロテアーゼ処理し、反応液を遠心分離し、上清を濾過処理し、液体分を凍結乾燥して得られた乾燥固体にエタノールを加え、上清を減圧下に濃縮、乾固し、ゲル濾過クロマトグラフィーにより分画し、その１０％アセトニトリル−０．１％トリフルオロ酢酸水溶液による溶出部をＨＰＬＣに付した結果得られたＨＰＬＣチャートを示す。

Claims (3)

1. 次式：
   Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ
   で表されるアミノ酸配列からなるペプチドまたはその塩。
2. 請求項１に記載のペプチドまたはその塩からなる血圧低下剤。
3. 請求項１に記載のペプチドまたはその塩からなる食品添加物。

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