JP4798833B2 - 加熱処理工程を含むヒト血清アルブミンの製造方法 - Google Patents
加熱処理工程を含むヒト血清アルブミンの製造方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP4798833B2 JP4798833B2 JP2000324030A JP2000324030A JP4798833B2 JP 4798833 B2 JP4798833 B2 JP 4798833B2 JP 2000324030 A JP2000324030 A JP 2000324030A JP 2000324030 A JP2000324030 A JP 2000324030A JP 4798833 B2 JP4798833 B2 JP 4798833B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- serum albumin
- human serum
- heat treatment
- rhsa
- yeast
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/76—Albumins
- C07K14/765—Serum albumin, e.g. HSA
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Hematology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヒト血清アルブミンの製造方法に関する。より詳細には、遺伝子組換え技術により得られる組換え型ヒト血清アルブミン（以下、ｒＨＳＡと称することもある）の製造工程において、宿主由来の夾雑物（主として蛋白質）の等電点近傍で加熱処理する工程を含むｒＨＳＡの製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヒト血清アルブミン（以下、ＨＳＡと称することもある）は、血漿中の主要な蛋白質成分で、585個のアミノ酸の単鎖ポリペプチドからなり、約66,000ダルトンの分子量を有する(Minghetti, P. P. et al.(1986) Molecular structure of the human albumin gene is revealed by nucleotide sequence within 11-22 of chromosome 4. J.Biol.Chem. 261, 6747-6757)。ＨＳＡは、主に血液の正常な浸透圧の維持や血中に現れるカルシウムイオン、脂肪酸、ビリルビン、トリプトファン、薬物など様々なものと結合し、これらを運搬するキャリアーとしての役割を果たすことが知られている。純化したＨＳＡは、例えば、外科手術、出血性ショックあるいは熱傷やネフローゼ症候群などアルブミンの喪失による低アルブミン血症の治療に使用される。
【０００３】
従来、ＨＳＡは、ヒト血漿からコーンの低温エタノール分画法あるいは該方法に準じて、ＨＳＡ画分（ＨＳＡは画分Vに分画される）を得た後、更に、種々の精製方法を駆使して製造されている。また近年、原料をヒト血漿に依存しない方法として、遺伝子組換え技術を応用して酵母や大腸菌、枯草菌にヒト血清アルブミンを生産させる技術が開発されている。酵母については、(1) Production of Recombinant Human Serum Albumin from Saccharomyces cerevisiae; Quirk, R. et. al, Biotechnology and Applied Biochemistry 11, 273-287(1989)、(2) Secretory Expression of the Human Serum Albumin Gene in the Yeast, Saccharomyces cerevisiae; Ken. Okabayashi et.al, J. Biochemistry, 110, 103-110 (1991)、(3)Yeast Systems for the Commercial Production of Heterologous Proteins; Richard G. Buckholz and Martin A. G. Gleeson, Bio/Technology 9, 1067-1072(1991)、大腸菌については(4) Construction of DNA sequences and their use for microbial production of proteins, in particular human serum albumin; Lawn, R. M., European Patent Appl. 73,646 (1983)、(5) Synthesis and Purification of mature human serum albumin from E. coli; Latta, L. et. al. Biotechnique 5, 1309-1314 (1987)、枯草菌については(6) Secretion of human serum albumin from Bacillus subtilis; Saunders, C. W. et. al, J. Bacteriol. 169, 2917-2925 (1987)参照。
【０００４】
ヒト血清アルブミンの精製方法としては、一般に、蛋白質化学において通常使用される精製方法、例えば、塩析法、限外濾過法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換クロマトグラフィー法、ゲル濾過クロマトグラフィー法、アフィニティークロマトグラフィー法等を用いることができる。実際には、生体組織、細胞、血液などに由来する多種類の夾雑物が混在するため、ヒト血清アルブミンの精製は、上記方法の複雑な組み合わせにより行われている。例えば、特開平５−３１７０７９には、ヒト血清アルブミンを産生する組換え酵母の培養上清を、限外濾過し、加熱処理、酸処理し、再び限外濾過した後、陽イオン交換体、疎水性クロマト、陰イオン交換体、塩析の各処理に供することからなる、該ヒト血清アルブミンの製造方法が記載されている。
【０００５】
この製造方法は、還元剤の存在下で加熱処理することにより、着色を抑制しようとするものである。他にも加熱処理工程を含むヒト血清アルブミンの製造方法が幾つか報告されており、加熱処理に基づく種々の効果が認められている。
【０００６】
例えば、特公平６−７１４３４及び特開平８−１１６９８５には、遺伝子操作により調製されたヒト血清アルブミンの培養上清を、アセチルトリプトファン又は有機カルボン酸の存在下で、50℃〜70℃、１〜5時間加熱することにより、プロテアーゼが不活化されることが記載されている。
【０００７】
また、特開平７−１２６１８２には、組換えヒトアルブミン製剤を、５０〜70℃、30分間以上加熱することによって夾雑微生物が不活化されることが記載されている。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上記の組換えアルブミンの製造工程に組み入れられた加熱処理は、いずれも夾雑蛋白質の除去方法を開示するものではない。したがって、本発明の目的は、ヒト血清アルブミン中に存在する夾雑物を効果的に除去する方法を提供することにある。
【０００９】
また、本発明の他の目的は、医薬品として安全性の高いヒト血清アルブミンを提供することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記事情に鑑みて鋭意研究を進めた結果、ヒト血清アルブミン産生組換え酵母の培養物を希釈、陽イオン交換、アルカリ処理によるアルブミン多量体の単量体化、及び限外濾過処理を行った後、得られたｒＨＳＡ含有溶液を宿主由来蛋白質の等電点近傍のｐＨで加熱処理することによって、該宿主由来の夾雑蛋白質が効果的に除去されることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
本発明は、夾雑物を含有するヒト血清アルブミン溶液を、該夾雑物の等電点近傍のｐＨで加熱処理する工程を含むことを特徴とするヒト血清アルブミンの製造方法を提供するものである。本発明はまた、該方法により得られた夾雑蛋白質を含有しない高純度ｒＨＳＡを包含する。以下、本発明について詳述する。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明の方法は、ヒト血清アルブミンの製造工程において、宿主由来の夾雑蛋白質が混在するヒト血清アルブミン溶液を宿主由来夾雑蛋白質の等電点近傍のｐＨで加熱処理することを特徴とするものである。この方法を実施することにより、例えば、酵母由来の夾雑物を容易に除去することができ、高純度のヒト血清アルブミンの製造が可能となる。
【００１３】
本発明の加熱処理に供される対象として、遺伝子組換え技術によって得られたｒＨＳＡ産生宿主由来の夾雑蛋白質が混在するｒＨＳＡ含有溶液が挙げられる。斯かる宿主には特に制限はなく、酵母、大腸菌、枯草菌及び動物細胞などが挙げられる。好ましくは、酵母、例えば、サッカロミセス属、ピキア属が使用されるが、更に好ましくは、サッカロミセスセレビシエＡＨ22株又はその変異株が用いられる。本発明の方法は、ｒＨＳＡ産生性の組換え体宿主に限らず、血漿由来の蛋白成分が夾雑物として含まれている場合にも適用することが出来る。
【００１４】
本発明の加熱処理は、ｒＨＳＡ（又は血漿由来のヒト血清アルブミン）製造工程の任意の段階で使用することが出来る。例えば、本発明の方法は、ヒト血清アルブミンを生産する組換え酵母の培養上清若しくは酵母の破砕液、これらを適当に前処理したｒＨＳＡ含有溶液、又はイオン交換体、吸着クロマト、ゲル濾過、塩析などの処理を経て精製が進んだ段階で使用することが望ましい。好ましくは、本発明の方法は、ｒＨＳＡ産生酵母の培養上清を精製水で２〜３倍に希釈した後、陽イオン交換体、アルカリ処理及び限外濾過後に適用される。
【００１５】
該陽イオン交換体処理は、通常の方法に準じて行われる。陽イオン交換体としては、スルホ−アガロース、スルホ−セルロース、スルホプロピル−アガロース、スルホプロピル−デキストラン、スルホプロピル−ポリビニル、カルボキシメチル−アガロース、カルボキシメチル−デキストラン、カルボキシメチル−セルロースなどが挙げられるが、いずれの担体を使用しても良い。例えば、50 ｍＭ塩化ナトリウムを含む50ｍＭ酢酸緩衝液(ｐＨ4.5)で平衡化した陽イオン交換カラムに、同ｐＨに調整したヒト血清アルブミン溶液を添加し、洗浄後、300ｍＭ塩化ナトリウムを含む50ｍＭリン酸緩衝液(ｐＨ9.0)で溶出しＨＳＡ画分を得る方法が取られる。
【００１６】
次いで、培養又は製造工程で生じたヒト血清アルブミンの多量体を単量体化するためにアルカリ処理が行われる。多量体の単量体化には、ｐＨ８〜１１、好ましくは、ｐＨ8.5〜9.5の範囲のアルカリ水溶液が使用される。
【００１７】
アルカリ処理を行う際の温度は、必ずしも室温である必要はなく、ＨＳＡ及びｒＨＳＡを変性しない温度、例えば、0〜65℃の範囲で処理することができる。好ましくは、室温（約２５℃）で放置する方法が取られる。
【００１８】
ヒト血清アルブミンの多量体の単量体化は、多量体を含有する水溶液とアルカリ性溶液を混合した後、15分以上放置することにより行われる。好ましくは、３時間以上であり、上限は特に限定されない。
【００１９】
アルカリ処理液のｐＨをアルカリ性にするのに使用される化学物質は、特に限定されない。例えば、アルカリ性有機化合物、アルカリ性無機化合物、具体的には、アンモニア、アンモニウム塩、塩基性金属水酸化物（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム）、ホウ酸塩、リン酸塩、酢酸塩、蓚酸塩、クエン酸塩、トリスヒドロキシアミノメタン及びこれらの2種以上の混合物からなる群より選ばれる物質が挙げられる。
かかる化学物質は、ヒト血清アルブミンを変性させない濃度で使用される。
【００２０】
アルカリ処理において、そのアルカリ処理液中にＳＨ基を有する化合物を添加すると、ＨＳＡ分子内及び/又はＨＳＡ分子間、さらにはＨＳＡと夾雑物（主として、蛋白質と考えられる）とのミスホールディングが抑制され、より効果的に単量体化が達成される。
当該処理に用いるＳＨ基含有化合物としては、官能基ＳＨ基を含む化合物であるならば特に限定されないが、ＳＨ基を有する低分子化合物が好ましい。具体的には、システイン、システアミン、シスタミン、メチオニンなどが挙げられるが、好ましくは、システインが用いられる。
ＳＨ基含有化合物の添加量は、1〜100 mg/mlのｒＨＳＡ濃度に対し、0.1〜50 mM、好ましくは0.2〜15mM、更に好ましくは0.5〜5 mMである。
【００２１】
次いで、限外濾過膜（分画分子量１万）を用いてＨＳＡ含有溶液を濃縮した後、ｐＨを夾雑物の等電点近傍に調整し、加熱処理が行われる。
【００２２】
加熱処理は、好ましくは50℃〜70℃、更に好ましくは55℃〜60℃、最も好ましくは60℃で行われる。加熱時間は、好ましくは30分間〜5時間、更に好ましくは１時間である。
【００２３】
加熱処理する際のｐＨは、夾雑物の等電点付近が好ましく、例えば、酵母サッカロミセスセレビジエAH22株又はその変異株をヒト血清アルブミン産生宿主とした場合、好ましくはｐＨ4〜7、更に好ましくはｐＨ5〜6、最も好ましくはｐＨ5.5である。
【００２４】
また、加熱処理する際のヒト血清アルブミン濃度は、該ヒト血清アルブミンが溶解する濃度であれば特に制限はないが、好ましくは、10〜250mg/ml、更に好ましくは、80〜120mg/mlである。
【００２５】
加熱処理工程後のヒト血清アルブミンの純度は、ゲル濾過ＨＰＬＣ分析により測定することができる。カラムには、例えば、ＴＳＫgel Ｇ３００ＳＷ（東ソー社製）を用い、0.1ＭＫＨ2ＰＯ4／0.3ＭＮａＣｌ緩衝液で展開し、２８０ｎｍの吸光度を測定する。コントロールとして、同様の方法により得た非加熱処理のヒト血清アルブミン溶液を用いる。
また、ヒト血清アルブミン非産生酵母の培養液を本法と同様の方法で粗精製したものをウサギに免疫し、得られた抗血清を用いて精製ｒＨＳＡ中に存在する酵母由来成分を、酵素免疫測定法（ＥＩＡ法）により測定することもできる。
【００２６】
【発明の効果】
本発明によれば、宿主由来の夾雑蛋白質が混在するヒト血清アルブミン含有溶液を、該夾雑物の等電点近傍のｐＨで加熱処理をすることによって、該夾雑蛋白質を簡単に、且つ効果的に除去することができる。
また、本発明によれば、ヒトに投与された場合アレルギーなどの副作用の原因となる宿主由来物質の含有量が低減された高純度のヒト血清アルブミンが提供される。本発明を他の精製方法と組み合わせて利用することによって、更に高純度のヒト血清アルブミンを製造することが可能となる。
【００２７】
【実施例】
調製例１：多量体を含有するヒト血清アルブミン溶液の調製
特表平１１−５０９５２５に述べられている方法に従って、酵母（Saccharomyces cerevisiae）によりｒＨＳＡを生産させた。このｒＨＳＡを含む培養液を精製水で約２倍容量になるように希釈後、酢酸水溶液を用いてｐＨ4.5に調整した。50 mM塩化ナトリウムを含む50 mM酢酸ナトリウム緩衝液(ｐＨ4.5)で平衡化したストリームラインＳＰカラム（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）(径60cm×16cm)に適用した。次に、カラムの平衡化に用いた緩衝液と同じ緩衝液で洗浄し、次に、300 mM塩化ナトリウムを含む50 mMリン酸緩衝液(ｐＨ9.0)を送液してｒＨＳＡ含有画分を得た。
【００２８】
調製例２：システイン含有ヒト血清アルブミン溶液のアルカリ処理
得られたｒＨＳＡ含有画分（10ml）に１ mMシステインを添加し、５％（W/V）四ホウ酸二カリウム液（15ml）を終濃度３％（ｐＨ約9.0）となるように添加し、室温で５時間放置した。次いで、該溶液に酢酸水溶液を加え、ｐＨ7.0に調整しアルカリ処理を終了した。
【００２９】
実施例１：加熱処理
続いて、該ｒＨＳＡ水溶液を、分画分子量１万の限外濾過膜（ザルトリウス社製）を用いてｒＨＳＡ濃度約１００mg／mlまで濃縮すると共に、５ｍＭカプリル酸ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ5.5）に交換した。該ｒＨＳＡ溶液を、60℃、１時間加熱処理した。続いて、室温まで冷却し、生じた沈殿を遠心除去し、上清を回収した。
【００３０】
実験例１：ゲル濾過ＨＰＬＣ分析
前記上清0.2mlを、0.1ＭＫＨ2ＰＯ4／0.3ＭＮａＣｌ緩衝液で平衡化したＴＳＫgel Ｇ３００ＳＷ（東ソー社製）カラム（径0.75ｃｍｘ30ｃｍ）にかけ、同緩衝液で溶出し、溶出液を、波長２８０ｎｍで測定した。コントロールとして、同様の方法により得た非加熱処理のヒト血清アルブミン溶液を用いた。その分析結果を図１に示す。
【００３１】
実験例２：酵母由来成分の分析
ヒト血清アルブミン非産生酵母培養液を本発明と同様の方法で粗精製したものを、ウサギに免疫し、得られた抗血清を用いてELISA測定系を定法に従って構築し、本発明で得たＨＳＡ含有溶液中に存在する酵母由来成分を測定した。その結果を表１に示す。
【００３２】
【表１】
【図面の簡単な説明】
【図１】ゲル濾過ＨＰＬＣの分析結果を示す図面である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヒト血清アルブミンの製造方法に関する。より詳細には、遺伝子組換え技術により得られる組換え型ヒト血清アルブミン（以下、ｒＨＳＡと称することもある）の製造工程において、宿主由来の夾雑物（主として蛋白質）の等電点近傍で加熱処理する工程を含むｒＨＳＡの製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヒト血清アルブミン（以下、ＨＳＡと称することもある）は、血漿中の主要な蛋白質成分で、585個のアミノ酸の単鎖ポリペプチドからなり、約66,000ダルトンの分子量を有する(Minghetti, P. P. et al.(1986) Molecular structure of the human albumin gene is revealed by nucleotide sequence within 11-22 of chromosome 4. J.Biol.Chem. 261, 6747-6757)。ＨＳＡは、主に血液の正常な浸透圧の維持や血中に現れるカルシウムイオン、脂肪酸、ビリルビン、トリプトファン、薬物など様々なものと結合し、これらを運搬するキャリアーとしての役割を果たすことが知られている。純化したＨＳＡは、例えば、外科手術、出血性ショックあるいは熱傷やネフローゼ症候群などアルブミンの喪失による低アルブミン血症の治療に使用される。
【０００３】
従来、ＨＳＡは、ヒト血漿からコーンの低温エタノール分画法あるいは該方法に準じて、ＨＳＡ画分（ＨＳＡは画分Vに分画される）を得た後、更に、種々の精製方法を駆使して製造されている。また近年、原料をヒト血漿に依存しない方法として、遺伝子組換え技術を応用して酵母や大腸菌、枯草菌にヒト血清アルブミンを生産させる技術が開発されている。酵母については、(1) Production of Recombinant Human Serum Albumin from Saccharomyces cerevisiae; Quirk, R. et. al, Biotechnology and Applied Biochemistry 11, 273-287(1989)、(2) Secretory Expression of the Human Serum Albumin Gene in the Yeast, Saccharomyces cerevisiae; Ken. Okabayashi et.al, J. Biochemistry, 110, 103-110 (1991)、(3)Yeast Systems for the Commercial Production of Heterologous Proteins; Richard G. Buckholz and Martin A. G. Gleeson, Bio/Technology 9, 1067-1072(1991)、大腸菌については(4) Construction of DNA sequences and their use for microbial production of proteins, in particular human serum albumin; Lawn, R. M., European Patent Appl. 73,646 (1983)、(5) Synthesis and Purification of mature human serum albumin from E. coli; Latta, L. et. al. Biotechnique 5, 1309-1314 (1987)、枯草菌については(6) Secretion of human serum albumin from Bacillus subtilis; Saunders, C. W. et. al, J. Bacteriol. 169, 2917-2925 (1987)参照。
【０００４】
ヒト血清アルブミンの精製方法としては、一般に、蛋白質化学において通常使用される精製方法、例えば、塩析法、限外濾過法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換クロマトグラフィー法、ゲル濾過クロマトグラフィー法、アフィニティークロマトグラフィー法等を用いることができる。実際には、生体組織、細胞、血液などに由来する多種類の夾雑物が混在するため、ヒト血清アルブミンの精製は、上記方法の複雑な組み合わせにより行われている。例えば、特開平５−３１７０７９には、ヒト血清アルブミンを産生する組換え酵母の培養上清を、限外濾過し、加熱処理、酸処理し、再び限外濾過した後、陽イオン交換体、疎水性クロマト、陰イオン交換体、塩析の各処理に供することからなる、該ヒト血清アルブミンの製造方法が記載されている。
【０００５】
この製造方法は、還元剤の存在下で加熱処理することにより、着色を抑制しようとするものである。他にも加熱処理工程を含むヒト血清アルブミンの製造方法が幾つか報告されており、加熱処理に基づく種々の効果が認められている。
【０００６】
例えば、特公平６−７１４３４及び特開平８−１１６９８５には、遺伝子操作により調製されたヒト血清アルブミンの培養上清を、アセチルトリプトファン又は有機カルボン酸の存在下で、50℃〜70℃、１〜5時間加熱することにより、プロテアーゼが不活化されることが記載されている。
【０００７】
また、特開平７−１２６１８２には、組換えヒトアルブミン製剤を、５０〜70℃、30分間以上加熱することによって夾雑微生物が不活化されることが記載されている。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上記の組換えアルブミンの製造工程に組み入れられた加熱処理は、いずれも夾雑蛋白質の除去方法を開示するものではない。したがって、本発明の目的は、ヒト血清アルブミン中に存在する夾雑物を効果的に除去する方法を提供することにある。
【０００９】
また、本発明の他の目的は、医薬品として安全性の高いヒト血清アルブミンを提供することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記事情に鑑みて鋭意研究を進めた結果、ヒト血清アルブミン産生組換え酵母の培養物を希釈、陽イオン交換、アルカリ処理によるアルブミン多量体の単量体化、及び限外濾過処理を行った後、得られたｒＨＳＡ含有溶液を宿主由来蛋白質の等電点近傍のｐＨで加熱処理することによって、該宿主由来の夾雑蛋白質が効果的に除去されることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
本発明は、夾雑物を含有するヒト血清アルブミン溶液を、該夾雑物の等電点近傍のｐＨで加熱処理する工程を含むことを特徴とするヒト血清アルブミンの製造方法を提供するものである。本発明はまた、該方法により得られた夾雑蛋白質を含有しない高純度ｒＨＳＡを包含する。以下、本発明について詳述する。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明の方法は、ヒト血清アルブミンの製造工程において、宿主由来の夾雑蛋白質が混在するヒト血清アルブミン溶液を宿主由来夾雑蛋白質の等電点近傍のｐＨで加熱処理することを特徴とするものである。この方法を実施することにより、例えば、酵母由来の夾雑物を容易に除去することができ、高純度のヒト血清アルブミンの製造が可能となる。
【００１３】
本発明の加熱処理に供される対象として、遺伝子組換え技術によって得られたｒＨＳＡ産生宿主由来の夾雑蛋白質が混在するｒＨＳＡ含有溶液が挙げられる。斯かる宿主には特に制限はなく、酵母、大腸菌、枯草菌及び動物細胞などが挙げられる。好ましくは、酵母、例えば、サッカロミセス属、ピキア属が使用されるが、更に好ましくは、サッカロミセスセレビシエＡＨ22株又はその変異株が用いられる。本発明の方法は、ｒＨＳＡ産生性の組換え体宿主に限らず、血漿由来の蛋白成分が夾雑物として含まれている場合にも適用することが出来る。
【００１４】
本発明の加熱処理は、ｒＨＳＡ（又は血漿由来のヒト血清アルブミン）製造工程の任意の段階で使用することが出来る。例えば、本発明の方法は、ヒト血清アルブミンを生産する組換え酵母の培養上清若しくは酵母の破砕液、これらを適当に前処理したｒＨＳＡ含有溶液、又はイオン交換体、吸着クロマト、ゲル濾過、塩析などの処理を経て精製が進んだ段階で使用することが望ましい。好ましくは、本発明の方法は、ｒＨＳＡ産生酵母の培養上清を精製水で２〜３倍に希釈した後、陽イオン交換体、アルカリ処理及び限外濾過後に適用される。
【００１５】
該陽イオン交換体処理は、通常の方法に準じて行われる。陽イオン交換体としては、スルホ−アガロース、スルホ−セルロース、スルホプロピル−アガロース、スルホプロピル−デキストラン、スルホプロピル−ポリビニル、カルボキシメチル−アガロース、カルボキシメチル−デキストラン、カルボキシメチル−セルロースなどが挙げられるが、いずれの担体を使用しても良い。例えば、50 ｍＭ塩化ナトリウムを含む50ｍＭ酢酸緩衝液(ｐＨ4.5)で平衡化した陽イオン交換カラムに、同ｐＨに調整したヒト血清アルブミン溶液を添加し、洗浄後、300ｍＭ塩化ナトリウムを含む50ｍＭリン酸緩衝液(ｐＨ9.0)で溶出しＨＳＡ画分を得る方法が取られる。
【００１６】
次いで、培養又は製造工程で生じたヒト血清アルブミンの多量体を単量体化するためにアルカリ処理が行われる。多量体の単量体化には、ｐＨ８〜１１、好ましくは、ｐＨ8.5〜9.5の範囲のアルカリ水溶液が使用される。
【００１７】
アルカリ処理を行う際の温度は、必ずしも室温である必要はなく、ＨＳＡ及びｒＨＳＡを変性しない温度、例えば、0〜65℃の範囲で処理することができる。好ましくは、室温（約２５℃）で放置する方法が取られる。
【００１８】
ヒト血清アルブミンの多量体の単量体化は、多量体を含有する水溶液とアルカリ性溶液を混合した後、15分以上放置することにより行われる。好ましくは、３時間以上であり、上限は特に限定されない。
【００１９】
アルカリ処理液のｐＨをアルカリ性にするのに使用される化学物質は、特に限定されない。例えば、アルカリ性有機化合物、アルカリ性無機化合物、具体的には、アンモニア、アンモニウム塩、塩基性金属水酸化物（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム）、ホウ酸塩、リン酸塩、酢酸塩、蓚酸塩、クエン酸塩、トリスヒドロキシアミノメタン及びこれらの2種以上の混合物からなる群より選ばれる物質が挙げられる。
かかる化学物質は、ヒト血清アルブミンを変性させない濃度で使用される。
【００２０】
アルカリ処理において、そのアルカリ処理液中にＳＨ基を有する化合物を添加すると、ＨＳＡ分子内及び/又はＨＳＡ分子間、さらにはＨＳＡと夾雑物（主として、蛋白質と考えられる）とのミスホールディングが抑制され、より効果的に単量体化が達成される。
当該処理に用いるＳＨ基含有化合物としては、官能基ＳＨ基を含む化合物であるならば特に限定されないが、ＳＨ基を有する低分子化合物が好ましい。具体的には、システイン、システアミン、シスタミン、メチオニンなどが挙げられるが、好ましくは、システインが用いられる。
ＳＨ基含有化合物の添加量は、1〜100 mg/mlのｒＨＳＡ濃度に対し、0.1〜50 mM、好ましくは0.2〜15mM、更に好ましくは0.5〜5 mMである。
【００２１】
次いで、限外濾過膜（分画分子量１万）を用いてＨＳＡ含有溶液を濃縮した後、ｐＨを夾雑物の等電点近傍に調整し、加熱処理が行われる。
【００２２】
加熱処理は、好ましくは50℃〜70℃、更に好ましくは55℃〜60℃、最も好ましくは60℃で行われる。加熱時間は、好ましくは30分間〜5時間、更に好ましくは１時間である。
【００２３】
加熱処理する際のｐＨは、夾雑物の等電点付近が好ましく、例えば、酵母サッカロミセスセレビジエAH22株又はその変異株をヒト血清アルブミン産生宿主とした場合、好ましくはｐＨ4〜7、更に好ましくはｐＨ5〜6、最も好ましくはｐＨ5.5である。
【００２４】
また、加熱処理する際のヒト血清アルブミン濃度は、該ヒト血清アルブミンが溶解する濃度であれば特に制限はないが、好ましくは、10〜250mg/ml、更に好ましくは、80〜120mg/mlである。
【００２５】
加熱処理工程後のヒト血清アルブミンの純度は、ゲル濾過ＨＰＬＣ分析により測定することができる。カラムには、例えば、ＴＳＫgel Ｇ３００ＳＷ（東ソー社製）を用い、0.1ＭＫＨ2ＰＯ4／0.3ＭＮａＣｌ緩衝液で展開し、２８０ｎｍの吸光度を測定する。コントロールとして、同様の方法により得た非加熱処理のヒト血清アルブミン溶液を用いる。
また、ヒト血清アルブミン非産生酵母の培養液を本法と同様の方法で粗精製したものをウサギに免疫し、得られた抗血清を用いて精製ｒＨＳＡ中に存在する酵母由来成分を、酵素免疫測定法（ＥＩＡ法）により測定することもできる。
【００２６】
【発明の効果】
本発明によれば、宿主由来の夾雑蛋白質が混在するヒト血清アルブミン含有溶液を、該夾雑物の等電点近傍のｐＨで加熱処理をすることによって、該夾雑蛋白質を簡単に、且つ効果的に除去することができる。
また、本発明によれば、ヒトに投与された場合アレルギーなどの副作用の原因となる宿主由来物質の含有量が低減された高純度のヒト血清アルブミンが提供される。本発明を他の精製方法と組み合わせて利用することによって、更に高純度のヒト血清アルブミンを製造することが可能となる。
【００２７】
【実施例】
調製例１：多量体を含有するヒト血清アルブミン溶液の調製
特表平１１−５０９５２５に述べられている方法に従って、酵母（Saccharomyces cerevisiae）によりｒＨＳＡを生産させた。このｒＨＳＡを含む培養液を精製水で約２倍容量になるように希釈後、酢酸水溶液を用いてｐＨ4.5に調整した。50 mM塩化ナトリウムを含む50 mM酢酸ナトリウム緩衝液(ｐＨ4.5)で平衡化したストリームラインＳＰカラム（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）(径60cm×16cm)に適用した。次に、カラムの平衡化に用いた緩衝液と同じ緩衝液で洗浄し、次に、300 mM塩化ナトリウムを含む50 mMリン酸緩衝液(ｐＨ9.0)を送液してｒＨＳＡ含有画分を得た。
【００２８】
調製例２：システイン含有ヒト血清アルブミン溶液のアルカリ処理
得られたｒＨＳＡ含有画分（10ml）に１ mMシステインを添加し、５％（W/V）四ホウ酸二カリウム液（15ml）を終濃度３％（ｐＨ約9.0）となるように添加し、室温で５時間放置した。次いで、該溶液に酢酸水溶液を加え、ｐＨ7.0に調整しアルカリ処理を終了した。
【００２９】
実施例１：加熱処理
続いて、該ｒＨＳＡ水溶液を、分画分子量１万の限外濾過膜（ザルトリウス社製）を用いてｒＨＳＡ濃度約１００mg／mlまで濃縮すると共に、５ｍＭカプリル酸ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ5.5）に交換した。該ｒＨＳＡ溶液を、60℃、１時間加熱処理した。続いて、室温まで冷却し、生じた沈殿を遠心除去し、上清を回収した。
【００３０】
実験例１：ゲル濾過ＨＰＬＣ分析
前記上清0.2mlを、0.1ＭＫＨ2ＰＯ4／0.3ＭＮａＣｌ緩衝液で平衡化したＴＳＫgel Ｇ３００ＳＷ（東ソー社製）カラム（径0.75ｃｍｘ30ｃｍ）にかけ、同緩衝液で溶出し、溶出液を、波長２８０ｎｍで測定した。コントロールとして、同様の方法により得た非加熱処理のヒト血清アルブミン溶液を用いた。その分析結果を図１に示す。
【００３１】
実験例２：酵母由来成分の分析
ヒト血清アルブミン非産生酵母培養液を本発明と同様の方法で粗精製したものを、ウサギに免疫し、得られた抗血清を用いてELISA測定系を定法に従って構築し、本発明で得たＨＳＡ含有溶液中に存在する酵母由来成分を測定した。その結果を表１に示す。
【００３２】
【表１】
【図面の簡単な説明】
【図１】ゲル濾過ＨＰＬＣの分析結果を示す図面である。
Claims (4)
- 酵母由来の蛋白質である夾雑物を含有するヒト血清アルブミン溶液を、ｐＨ８．５〜９．５の範囲でかつ０〜６５℃の温度で少なくとも１５分間処理して、ヒト血清アルブミンの多量体を単量体に変換する工程、及び前記工程に続いて該夾雑物の等電点近傍のｐＨで、５０〜７０℃の範囲で０．５〜５時間加熱処理することにより夾雑物を除去する工程を含み、前記ｐＨが５．０〜６．０であることを特徴とするヒト血清アルブミンの製造方法。
- 加熱処理が、５５〜６０℃で行われる請求項１に記載の方法。
- 加熱処理が、１時間行われる請求項１または２記載の方法。
- 加熱処理が、ｐＨ５．５〜６．０で行われる請求項１ないし３のいずれか１項記載の方法。
Priority Applications (12)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000324030A JP4798833B2 (ja) | 2000-10-24 | 2000-10-24 | 加熱処理工程を含むヒト血清アルブミンの製造方法 |
| CA2395590A CA2395590C (en) | 2000-10-24 | 2001-10-24 | Method of producing human serum albumin involving heating step |
| AU10936/02A AU783638B2 (en) | 2000-10-24 | 2001-10-24 | Method of producing human serum albumin involving heating step |
| PCT/JP2001/009336 WO2002034787A1 (fr) | 2000-10-24 | 2001-10-24 | Procede d"elaboration d"albumine de serum d"origine humaine comportant une etape de chauffage |
| EP01978883A EP1329462B1 (en) | 2000-10-24 | 2001-10-24 | Method of producing human serum albumin involving heating step |
| AT01978883T ATE348111T1 (de) | 2000-10-24 | 2001-10-24 | Verfahren zur herstellung von humanem serumalbumin unter verwendung eines aufwarmschrittes |
| KR1020027008242A KR100839937B1 (ko) | 2000-10-24 | 2001-10-24 | 가열처리 공정을 포함하는 인체 혈청알부민의 제조방법 |
| DE60125218T DE60125218T2 (de) | 2000-10-24 | 2001-10-24 | Verfahren zur herstellung von humanen serumalbumin unter einbeziehen eines erwärmungsschrittes |
| ES01978883T ES2272548T3 (es) | 2000-10-24 | 2001-10-24 | Metodo para producir albumina de suero humano que implica un etapa de tratamiento con calor. |
| DK01978883T DK1329462T3 (da) | 2000-10-24 | 2001-10-24 | Fremgangsmåde til fremstilling af human serumalbumin, som inddrager opvarmningstrin |
| CNB018056466A CN1313493C (zh) | 2000-10-24 | 2001-10-24 | 包括加热处理步骤的人血清白蛋白的制造方法 |
| US10/175,103 US6908749B2 (en) | 2000-10-24 | 2002-06-20 | Method for preparing human serum albumin containing heat-treatment |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000324030A JP4798833B2 (ja) | 2000-10-24 | 2000-10-24 | 加熱処理工程を含むヒト血清アルブミンの製造方法 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002128796A JP2002128796A (ja) | 2002-05-09 |
| JP2002128796A5 JP2002128796A5 (ja) | 2007-12-06 |
| JP4798833B2 true JP4798833B2 (ja) | 2011-10-19 |
Family
ID=18801621
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000324030A Expired - Fee Related JP4798833B2 (ja) | 2000-10-24 | 2000-10-24 | 加熱処理工程を含むヒト血清アルブミンの製造方法 |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6908749B2 (ja) |
| EP (1) | EP1329462B1 (ja) |
| JP (1) | JP4798833B2 (ja) |
| KR (1) | KR100839937B1 (ja) |
| CN (1) | CN1313493C (ja) |
| AT (1) | ATE348111T1 (ja) |
| AU (1) | AU783638B2 (ja) |
| CA (1) | CA2395590C (ja) |
| DE (1) | DE60125218T2 (ja) |
| DK (1) | DK1329462T3 (ja) |
| ES (1) | ES2272548T3 (ja) |
| WO (1) | WO2002034787A1 (ja) |
Families Citing this family (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU783571B2 (en) * | 2000-10-24 | 2005-11-10 | Km Biologics Co., Ltd. | Method of monomerizing human serum albumin polymers |
| US20030119734A1 (en) | 2001-06-28 | 2003-06-26 | Flink James M. | Stable formulation of modified GLP-1 |
| WO2004048588A1 (en) * | 2002-11-26 | 2004-06-10 | Novo Nordisk A/S | Process for purifying a fermentation-derived product |
| GB0305989D0 (en) * | 2003-03-15 | 2003-04-23 | Delta Biotechnology Ltd | Agent |
| CN102940879B (zh) | 2003-06-03 | 2017-06-06 | 诺沃挪第克公司 | 稳定化的药物肽组合物 |
| WO2004105790A1 (en) | 2003-06-03 | 2004-12-09 | Novo Nordisk A/S | Stabilized pharmaceutical peptide compositions |
| DK1687019T3 (en) | 2003-11-20 | 2018-02-12 | Novo Nordisk As | Propylene glycol peptide formulations that are optimal for production and use in injection devices |
| EP1710250B1 (en) * | 2004-01-20 | 2009-04-15 | Juridical Foundation, The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute | Method for preparing human serum albumin through heat-treatment in presence of divalent cation |
| ES2442223T3 (es) | 2004-08-31 | 2014-02-10 | Novo Nordisk A/S | Uso de tris(hidroximetil) aminometano para la estabilización de péptidos, polipéptidos y proteínas |
| EP2494983B1 (en) | 2004-11-12 | 2019-04-24 | Novo Nordisk A/S | Stable formulations of glp-1 |
| JP2009520714A (ja) | 2005-12-22 | 2009-05-28 | ツェー・エス・エル・ベーリング・ゲー・エム・ベー・ハー | 低オクタノエート型ヒトアルブミン |
| JP4936272B2 (ja) * | 2006-02-13 | 2012-05-23 | 独立行政法人科学技術振興機構 | バイオナノカプセルの効率的な精製法 |
| US20080318864A1 (en) * | 2007-06-25 | 2008-12-25 | Fred Hutchinson Cancer Research Center | Methods and compositions regarding polychalcogenide compositions |
| ES2761854T3 (es) | 2016-10-04 | 2020-05-21 | Albumedix Ltd | Usos de albúmina de suero recombinante obtenida a partir de levadura |
| CN106749623B (zh) * | 2016-12-09 | 2020-04-10 | 浙江大学 | 一种基于混合模式的扩张床吸附分离人血白蛋白方法 |
| WO2019038412A1 (en) | 2017-08-24 | 2019-02-28 | Novo Nordisk A/S | GLP-1 COMPOSITIONS AND USES THEREOF |
| US20230000774A1 (en) | 2019-12-04 | 2023-01-05 | Albumedix Limited | Methods and compositions produced thereby |
| AU2021208601A1 (en) | 2020-02-18 | 2022-07-28 | Novo Nordisk A/S | Glp-1 compositions and uses thereof |
| US11739166B2 (en) | 2020-07-02 | 2023-08-29 | Davol Inc. | Reactive polysaccharide-based hemostatic agent |
Family Cites Families (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5071897A (ja) * | 1973-11-07 | 1975-06-14 | ||
| US4025500A (en) * | 1974-06-06 | 1977-05-24 | Baxter Laboratories, Inc. | Preparation of albumin by fractionation of blood plasma or serum |
| IL66614A (en) | 1981-08-28 | 1985-09-29 | Genentech Inc | Method of constructing a dna sequence encoding a polypeptide,microbial production of human serum albumin,and pharmaceutical compositions comprising it |
| US5004688A (en) * | 1988-04-15 | 1991-04-02 | Phillips Petroleum Company | Purification of hepatitis proteins |
| JP2926722B2 (ja) | 1988-10-20 | 1999-07-28 | 吉富製薬株式会社 | アルブミン製剤及びその製造方法 |
| JPH0768137B2 (ja) * | 1989-06-15 | 1995-07-26 | 株式会社ミドリ十字 | アルブミン製剤及びその製法 |
| JPH0671434B2 (ja) * | 1989-09-18 | 1994-09-14 | 株式会社ミドリ十字 | ヒト血清アルブミンの製造方法 |
| JPH04234326A (ja) * | 1990-12-27 | 1992-08-24 | Green Cross Corp:The | アルブミン製剤及びその製法 |
| JPH0671434A (ja) | 1991-05-30 | 1994-03-15 | Tadahiro Omi | クリーンチャンバーの溶接方法 |
| US5521287A (en) * | 1992-05-20 | 1996-05-28 | The Green Cross Corporation | Recombinant human serum albumin, process for producing the same and pharmaceutical preparation containing the same |
| US5440018A (en) * | 1992-05-20 | 1995-08-08 | The Green Cross Corporation | Recombinant human serum albumin, process for producing the same and pharmaceutical preparation containing the same |
| JP3269504B2 (ja) * | 1992-07-08 | 2002-03-25 | 三菱ウェルファーマ株式会社 | ヒト血清アルブミンの製造方法 |
| US5728553A (en) | 1992-09-23 | 1998-03-17 | Delta Biotechnology Limited | High purity albumin and method of producing |
| JPH07126182A (ja) * | 1993-10-27 | 1995-05-16 | Green Cross Corp:The | 組換えヒト血清アルブミン製剤の滅菌方法 |
| JP3840674B2 (ja) * | 1994-08-31 | 2006-11-01 | 三菱ウェルファーマ株式会社 | 遺伝子操作に由来するヒト血清アルブミンの精製方法 |
| WO1998007873A1 (fr) * | 1996-08-23 | 1998-02-26 | Kirin Beer Kabushiki Kaisha | Vecteurs de levure et procede de production de proteines les utilisant |
| JP2885212B2 (ja) * | 1997-01-06 | 1999-04-19 | 吉富製薬株式会社 | 遺伝子操作由来のヒト血清アルブミンより得られる高純度ヒト血清アルブミン含有組成物 |
-
2000
- 2000-10-24 JP JP2000324030A patent/JP4798833B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2001
- 2001-10-24 AU AU10936/02A patent/AU783638B2/en not_active Ceased
- 2001-10-24 ES ES01978883T patent/ES2272548T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2001-10-24 DE DE60125218T patent/DE60125218T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2001-10-24 EP EP01978883A patent/EP1329462B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-10-24 AT AT01978883T patent/ATE348111T1/de not_active IP Right Cessation
- 2001-10-24 KR KR1020027008242A patent/KR100839937B1/ko active IP Right Grant
- 2001-10-24 WO PCT/JP2001/009336 patent/WO2002034787A1/ja active IP Right Grant
- 2001-10-24 DK DK01978883T patent/DK1329462T3/da active
- 2001-10-24 CN CNB018056466A patent/CN1313493C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2001-10-24 CA CA2395590A patent/CA2395590C/en not_active Expired - Fee Related
-
2002
- 2002-06-20 US US10/175,103 patent/US6908749B2/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU1093602A (en) | 2002-05-06 |
| ATE348111T1 (de) | 2007-01-15 |
| CN1313493C (zh) | 2007-05-02 |
| EP1329462B1 (en) | 2006-12-13 |
| CN1406246A (zh) | 2003-03-26 |
| KR100839937B1 (ko) | 2008-06-20 |
| WO2002034787A1 (fr) | 2002-05-02 |
| US6908749B2 (en) | 2005-06-21 |
| AU783638B2 (en) | 2005-11-17 |
| DE60125218D1 (de) | 2007-01-25 |
| CA2395590A1 (en) | 2002-05-02 |
| US20020182680A1 (en) | 2002-12-05 |
| KR20020065609A (ko) | 2002-08-13 |
| EP1329462A1 (en) | 2003-07-23 |
| ES2272548T3 (es) | 2007-05-01 |
| JP2002128796A (ja) | 2002-05-09 |
| DK1329462T3 (da) | 2007-01-22 |
| CA2395590C (en) | 2012-12-11 |
| DE60125218T2 (de) | 2007-09-20 |
| EP1329462A4 (en) | 2004-09-08 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP4798833B2 (ja) | 加熱処理工程を含むヒト血清アルブミンの製造方法 | |
| JP4798832B2 (ja) | ヒト血清アルブミン多量体の除去方法 | |
| US20060258850A1 (en) | Method for preparing human serum albumin through heat-treatment in the presence of divalent cation | |
| CA2395587C (en) | Method of monomerizing human serum albumin polymers | |
| JP4798830B2 (ja) | ヒト血清アルブミン多量体の単量体化方法 | |
| JP4798831B2 (ja) | ヒト血清アルブミンのミスホールディングを抑制する方法 | |
| JP2885212B2 (ja) | 遺伝子操作由来のヒト血清アルブミンより得られる高純度ヒト血清アルブミン含有組成物 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20071024 |
|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20071024 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20100729 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20100924 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20110120 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20110322 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20110721 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20110802 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140812 Year of fee payment: 3 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 4798833 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| S531 | Written request for registration of change of domicile |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313532 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| S531 | Written request for registration of change of domicile |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313531 |
|
| S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313113 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |