JP4763459B2 - Stabilized polymer micelle - Google Patents
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Description
本発明は、安定化高分子ミセルに関する。詳しくは、本発明は、薬物運搬システム（ＤＤＳ）等の分野において有用なタンパク質又はＤＮＡ等の荷電性薬物を安定に保持する静電結合型高分子ミセルに関する。 The present invention relates to stabilized polymeric micelles. Specifically, the present invention relates to an electrostatically coupled polymer micelle that stably holds a charged drug such as protein or DNA that is useful in fields such as a drug delivery system (DDS).
最近、医薬品医療の分野において、薬物や遺伝子の体内分布を時間的又は空間的に正確に制御することによって、「必要なとき（ｔｉｍｉｎｇ）に、必要な部位（ｌｏｃａｔｉｏｎ）で、必要な薬物治療（ａｃｔｉｏｎ）」を最小限の副作用で達成する高精度ターゲティング治療に対する関心が高まっている。この治療法を首尾よく達成するためには、ナノスケールで精密設計された高機能化薬物運搬体（ドラッグキャリア）の開発が最も重要な課題となっている。
これまでに、共有結合又は非共有結合（疎水性相互作用、静電相互作用など）を介して、薬物をさまざまなキャリヤーに担持させる試みが活発に行われており、リポソーム、微粒子、各種水溶性高分子がキャリヤーとして用いられてきた（橋田 充：新バイオサイエンスシリーズ「ドラッグデリバリーシステム、−創薬と治療への新たなる挑戦−」、化学同人、１９９５年）。
そして、ポリイオンコンプレックス（ＰＩＣ）ミセルと呼ばれるポリエチレングリコール−ポリ（α，β−アスパラギン酸）ブロック共重合体を用いて荷電性薬物を担持させた、静電結合性型高分子ミセル担持剤も知られている（特許第２６９０２７６号）。この静電結合性型高分子ミセル担持剤は、薬物の疎水性、親水性の区別にかかわりなく、薬物を担持させることができるものであった。
しかしながら、静電結合性型高分子ミセル担持剤において、荷電性薬物は高分子ミセル内に静電結合によって担持されているため、同じ系に塩を添加することにより、ミセルが不安定化する場合がある。従って、塩の添加に際してはミセルの安定性を考慮しなければならない。Recently, in the field of pharmaceutical medicine, by controlling the biodistribution of drugs and genes accurately in time or space, “the necessary drug treatment (in the required location) at the required location (time)” There is growing interest in high-precision targeting therapies that achieve “action” with minimal side effects. In order to successfully achieve this therapy, the development of highly functional drug carriers (drug carriers) precisely designed at the nanoscale has become the most important issue.
So far, active attempts have been made to support drugs on various carriers through covalent bonds or non-covalent bonds (hydrophobic interaction, electrostatic interaction, etc.). Polymers have been used as carriers (Mitsubashi Hashida: New Bioscience Series “Drug Delivery System, New Challenges in Drug Discovery and Treatment”, Kagaku Dojin, 1995).
Also known is an electrostatic binding type polymeric micelle carrier that carries a charged drug using a polyethylene glycol-poly (α, β-aspartic acid) block copolymer called a polyion complex (PIC) micelle. (Japanese Patent No. 2690276). This electrostatic binding type polymer micelle carrier can carry a drug regardless of whether the drug is hydrophobic or hydrophilic.
However, in the electrostatic binding type polymer micelle support agent, the charged drug is supported by electrostatic coupling in the polymer micelle, so when adding the salt to the same system, the micelle becomes unstable There is. Therefore, the stability of micelles must be taken into account when adding salt.
そこで、安定して存在できる高分子ミセルを提供することが望まれていた。
本発明は、上記の課題を解決するものとして完成されたものである。
すなわち、本発明は、非荷電性セグメントと荷電性セグメントとを有するブロック共重合体からなる静電結合型高分子ミセルであって該ミセルの内核に前記荷電性セグメントと反対の荷電を有する薬物を担持させたものを、架橋剤と反応させることを特徴とする薬物担持高分子ミセルの製造方法である。
また、本発明は、非荷電性セグメントと荷電性セグメントとを有するブロック共重合体からなる静電結合型高分子ミセルに、前記荷電性セグメントと反対の荷電を有する薬物と架橋剤とを添加することを特徴とする薬物担持高分子ミセルの製造方法である。
さらに、本発明は、非荷電性セグメントと荷電性セグメントとを有するブロック共重合体からなる静電結合型高分子ミセルであって該ミセルの内核に前記荷電性セグメントと反対の荷電を有する薬物を担持させたものを、架橋剤と反応させることを特徴とする薬物担持高分子ミセルの安定化方法である。
さらに、本発明は、非荷電性セグメントと荷電性セグメントとを有するブロック共重合体からなる静電結合型高分子ミセルに、前記荷電性セグメントと反対の荷電を有する薬物と架橋剤とを添加することを特徴とする薬物担持高分子ミセルの安定化方法である。
ここで、架橋剤としては例えばグルタルアルデヒドが挙げられる。また、架橋剤と薬物分子中の反応性官能基とのモル比は、例えば２：１〜１０００：１である。さらに、非荷電性セグメントはポリエチレングリコール由来のもの、荷電性セグメントはポリアミノ酸由来のものである。そして、荷電性セグメントの末端がアミノ基であることが好ましい。さらに、薬物としては、タンパク質、酵素、核酸及び荷電性官能基を有する水溶性化合物からなる群から選択される。酵素としては、例えばトリプシン又はリゾチームが挙げられる。Therefore, it has been desired to provide a polymer micelle that can exist stably.
The present invention has been completed as a solution to the above problems.
That is, the present invention provides a capacitively coupled polymer micelle comprising a block copolymer having an uncharged segment and a charged segment, and a drug having a charge opposite to that of the charged segment is placed in the inner core of the micelle. A method for producing a drug-carrying polymer micelle characterized by reacting a supported product with a crosslinking agent.
In the present invention, a drug having a charge opposite to that of the charged segment and a cross-linking agent are added to the electrostatically coupled polymer micelle composed of a block copolymer having an uncharged segment and a charged segment. This is a method for producing a drug-carrying polymer micelle.
Furthermore, the present invention provides a capacitively coupled polymer micelle comprising a block copolymer having an uncharged segment and a charged segment, and a drug having a charge opposite to that of the charged segment is placed in the inner core of the micelle. A method for stabilizing a drug-carrying polymer micelle characterized by reacting a supported product with a crosslinking agent.
Furthermore, in the present invention, a drug having a charge opposite to that of the charged segment and a cross-linking agent are added to a capacitively coupled polymer micelle comprising a block copolymer having an uncharged segment and a charged segment. This is a method for stabilizing drug-supported polymer micelles.
Here, examples of the crosslinking agent include glutaraldehyde. The molar ratio of the crosslinking agent to the reactive functional group in the drug molecule is, for example, 2: 1 to 1000: 1. Further, the uncharged segment is derived from polyethylene glycol, and the charged segment is derived from polyamino acid. And it is preferable that the terminal of a chargeable segment is an amino group. Furthermore, the drug is selected from the group consisting of proteins, enzymes, nucleic acids, and water-soluble compounds having a chargeable functional group. Examples of the enzyme include trypsin or lysozyme.
図１は、グルタルアルデヒドを添加したときの添加比とミセルの時間経過に対する安定性を示す図である。
図２は、ミセルの粒径の分布を示す図である。
図３は、グルタルアルデヒドを添加したときのミセルの塩（ＮａＣｌ）濃度に対する安定性を示す図である。
図４は、グルタルアルデヒドを添加したときのミセルの塩（ＮａＣｌ）濃度に対する安定性を示す図である。
図５は、グルタルアルデヒドを添加したときのミセルの時間経過に対する安定性を示す図である。
図６は、ブロック共重合体中のアミノ基をアセチル化させたときのミセルの安定性を示す図である。
図７は、ミセルの粒径の分布を示す図である。
図８は、ミセルに内包させたビリルビンオキシダーゼの活性の安定化を示す図である。FIG. 1 is a diagram showing the addition ratio when glutaraldehyde is added and the stability of micelles over time.
FIG. 2 is a diagram showing the distribution of micelle particle size.
FIG. 3 is a diagram showing the stability of micelles against salt (NaCl) concentration when glutaraldehyde is added.
FIG. 4 is a graph showing the stability of micelles with respect to salt (NaCl) concentration when glutaraldehyde is added.
FIG. 5 is a diagram showing the stability of micelles over time when glutaraldehyde is added.
FIG. 6 is a view showing the stability of micelles when an amino group in a block copolymer is acetylated.
FIG. 7 is a diagram showing the distribution of micelle particle size.
FIG. 8 is a diagram showing stabilization of the activity of bilirubin oxidase encapsulated in micelles.
以下、本発明を詳細に説明する。
上記の通り、本発明は、従来の静電結合型高分子ミセル型薬剤を改良するために本発明の発明者による検討の結果なされたものである。そして、静電結合型高分子ミセル型薬剤と架橋剤とを反応させることによって、ミセル内の凝集力を増強させ、極めて安定したミセル型薬剤を提供するものである。
本発明におけるミセルは、非荷電性セグメントと荷電性セグメントとからなる静電結合型高分子ミセル担体を使用し、両セグメントともに各種のものが本発明に包含される。
非荷電性セグメントとしては、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール等のポリアルキレングリコール、ポリアルキレンオキシド、ポリサッカライド、ポリアクリルアミド、ポリ置換アクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリ置換メタクリルアミド、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリアクルル酸エステル、ポリメタクリル酸エステル、非荷電性ポリアミノ酸、又はそれらの誘導体由来の各種のセグメント等が例示される。
荷電性セグメントとしては、例えば荷電性側鎖を有するポリアミノ酸、より具体的には、ポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸、ポリリシン、ポリアルギニン、ポリヒスチジン等が、あるいはポリリンゴ酸、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリエチレンイミン、ポリビニルアミン、ポリアリルアミン、ポリビニルイミダゾール等が挙げられる。さらに、これらのポリアミノ酸の誘導体由来のセグメント等が例示されている。
ミセル内の凝集力をより増強させる観点から、荷電性セグメントの側鎖が架橋剤と反応性を有さない場合には、荷電性セグメントの末端は、架橋剤に対して反応性の高い官能基が用いられる。このような官能基としては、例えば、１級アミノ基（−ＮＨ２）であることが好ましい。
これらのセグメントから構成される本発明のブロック共重合体については、例えば次のものが例として挙げられる。
すなわち、ポリエチレングリコール−ポリアスパラギン酸ブロック共重合体、ポリエチレンオキシド−ポリグルタミン酸ブロック共重合体、ポリエチレングリコール−ポリアルギニンブロック共重合体、ポリエチレングリコール−ポリヒスチジンブロック共重合体、ポリエチレングリコール−ポリメタクリル酸ブロック共重合体、ポリエチレングリコール−ポリエチレンイミンブロック共重合体、ポリエチレングリコール−ポリビニルアミンブロック共重合体、ポリエチレングリコール−ポリアリルアミンブロック共重合体、ポリエチレンオキシド−ポリアスパラギン酸ブロック共重合体、ポリエチレンオキシド−ポリグルタミン酸ブロック共重合体、ポリエチレンオキシド−ポリリジンブロック共重合体、ポリエチレンオキシド−ポリアクリル酸ブロック共重合体、ポリエチレンオキシド−ポリビニルイミダゾールブロック共重合体、ポリアクリルアミド−ポリアスパラギン酸ブロック共重合体、ポリアクリルアミド−ポリヒスチジンブロック共重合体、ポリメタクリルアミド−ポリアクリル酸、ポリメタクリルアミド−ポリビニルアミンブロック共重合体、ポリビニルピロリドン−ポリメタクリル酸ブロック共重合体、ポリビニルアルコール−ポリアスパラギン酸ブロック共重合体、ポリビニルアルコール−ポリアルギニンブロック共重合体、ポリアクリル酸エステル−ポリグルタミン酸ブロック共重合体、ポリアクリル酸エステル−ポリヒスチジンブロック共重合体、ポリメタクリル酸エステル−ポリビニルアミンブロック共重合体、ポリメタクリル酸−ポリビニルイミダゾールブロック共重合体等である。
これらのブロック共重合体としては、例えば、次式（Ｉ）又は（ＩＩ）：
上記式中、Ｒ１は、水素原子、炭化水素基若しくは官能基、又は官能基置換炭化水素基を表し、Ｒ２は、ＮＨ、ＣＯ、又はＲ６（ＣＨ２）ｑＲ７（Ｒ６は、ＯＣＯ、ＯＣＯＮＨ、ＮＨＣＯ、ＮＨＣＯＯ、ＮＨＣＯＮＨ、ＣＯＮＨ又はＣＯＯを表し、Ｒ７は、ＮＨ又はＣＯを表し、ｑは１以上の整数を表す。）を表す。
また、Ｒ３は、カルボキシル基、カルボキシル基置換炭化水素基、アミノ基置換炭化水素基、ヒドラジノ基置換炭化水素基又は（ＣＨ２）ｐ−ＮＨＣＮＨＮＨ２基（ｐは１以上の整数を表す。）を表す。あるいは、Ｒ３は含窒素複素環基又は含窒素複素環基置換炭化水素基を表す。
Ｒ４は、水素原子、ヒドロキシル基又はその結合末端にＣＯ、ＮＨ若しくはＯのいずれかを有する炭化水素基を表す。
ｍは、４〜２５００、ｎは１〜３００、ｘは０〜３００であり、ｘ＜ｎである。
本発明においては、上記式中、Ｒ３が、−ＣＯＯＨ、−ＣＨ２ＣＯＯＨ、−（ＣＨ２）３−ＮＨ２、−（ＣＨ２）２ＮＨＣＮＨＮＨ２、又は次式（ＩＩＩ）：
これらのブロック共重合体としては、例えば、その代表的構造としていわゆるＡＢ型ブロック共重合体がある。より具体的には、次式（ＩＶ）：
上記共重合体は、例えばポリエチレングリコールとポリ（α，β−アスパラギン酸）から得られるポリエチレングリコール−ポリ（α，β−アスパラギン酸）ブロック共重合体であることが好ましい。この共重合体は、まず、β−ベンジル−Ｌ−アスパルテート−Ｎ−カルボン酸無水物を、片末端一級アミノ基のポリエチレングリコール（分子量約２００〜２５００００）を開始剤として重合することにより合成される。このポリエチレングリコール−ポリ（β−ベンジル−Ｌ−アスパルテート）ブロック共重合体における（β−ベンジル、Ｌ−アスパルテート）部分の分子量は約２０５〜６２０００まで可変である。この共重合体をアルカリ処理して脱ベンジル化を行うことにより、ポリエチレングリコール−ポリ（α，β−アスパラギン酸）ブロック共重合体を得ることができる。
また、ブロック共重合体としてカチオン性セグメントを有する次式（Ｖ）：
本発明において、上記ブロック共重合体からなる高分子ミセル中に静電的に担持させることのできる薬物としては、特にその種類に限定されるものではない。ここで、「薬物」とは、前記荷電性セグメントとは反対の荷電性を有する低分子又は高分子物質を意味し、例えばペプチドホルモン、タンパク質、酵素、核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）等の高分子性薬物、アドリアマイシン、ダラノマイシン等の分子内に荷電性官能基を有する低分子性薬物（水溶性化合物）等が例示される。反対荷電とは、分子の一方が正に、他方が負に帯電していることを意味し、複数の異なる帯電状態の官能基を有する分子の場合は、ｐＨを変化させることによって分子全体としての帯電状態の正、負を変化させる場合も含む。同じ荷電を有する場合は、反対荷電を有する官能基を有する化合物を反応させ、分子の帯電状態を変化させる処理をすることにより、一方の分子を他方の分子に対して反対荷電にすることができる。
これらの薬物を、高分子ミセルに担持させる際には、ブロック共重合体と薬物又はその溶液とを混合することを基本としているが、さらには、透析、攪拌、希釈、濃縮、超音波処理、温度制御、ｐＨ制御、有機溶媒の添加等の操作を適宜付加することができる。
例えば、上記式（ＩＶ）により示されるポリエチレングリコール−ポリ（α，β−アスパラギン酸）ブロック共重合体にトリプシンやリゾチーム等の酵素を封入させる場合には、共重合体の水溶液を適切な混合比、イオン強度及びｐＨ等の条件に設定し、共重合体の水溶液に上記酵素水溶液を混合すればよい。
また、上記式（Ｖ）により示されるポリエチレングリコール−ポリリシンブロック共重合体にＤＮＡを担持させる場合には、適切な混合比、イオン強度及びｐＨ等の条件を設定し、共重合体の水溶液にＤＮＡ溶液を混合し、ＤＮＡを担持することができる。
以上の通り、本発明の静電結合型高分子ミセルは、安定な高分子ミセル構造となり、その内核に効率よくタンパク質やＤＮＡ等の荷電物質を取り込むことができる。このため、生体内で分解されやすい荷電性薬物を安定化して体内投与することができる。
本発明において、架橋の対象となる薬物（酵素）としては以下のものが挙げられる。
（１）血液中生物の定量に使用可能な酵素（表１）
本発明において、ミセルに内包させることができるタンパク質分解酵素としては、塩基性アミノ酸（Ｌｙｓ、Ａｒｇ）のＣ末側を切断するエンドペプチダーゼを例示することができる。そのようなタンパク質分解酵素としては以下のものが挙げられる。
（ｉ）トリプシン、プラスミン、カリクレイン、トロンビン、第Ｘａ因子、アクロシン、エンテロペプチダーゼ、ウロキナーゼ、コクナーゼ、プレモフェノールモノオキシゲナーゼ活性化酵素、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）プロテアーゼ、マウス顎下腺プロテアーゼ、ヘビ毒トロンビン様酵素、カテプシンＢ１、フィシン、クロストリジウム・ヒストリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｉｃｕｍ）プロテアーゼ、ミクソバクター（Ｍｙｘｏｂａｃｔｅｒ）ＡＬ−１プロテアーゼＩＩ、アーミリアリア・メレア（Ａｒｍｉｌｌｉａｒｉａ ｍｅｌｌｅａ）プロテアーゼ
（ｉｉ）また、エキソペプチダーゼには、Ｃ末端から分解するカルボキシペプチダーゼとＮ末端から分解するアミノペプチダーゼがあるが、グルタルアルデヒドは１級アミノ基と高い反応性を有していることから、以下のアミノペプチダーゼに関しても有効である。
ロイシンアミノペプチダーゼ
ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅアミノペプチダーゼ
アミノペプチダーゼＢ
小腸表面アミノペプチダーゼ
酵母アミノペプチダーゼＩ
アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）アミノペプチダーゼ
アミノアシルプロリンアミノペプチダーゼ
バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）アミノペプチダーゼ
クロストリジウム・ヒストリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）アミノペプチダーゼ
アエロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）アミノペプチダーゼ
ストレプトミセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ）アミノペプチダーゼ
トリチラキウム・アルバム・リンバー（Ｔｒｉｔｉｒａｃｈｉｕｍ ａｌｂｕｍ Ｌｉｍｂｅｒ）アミノペプチダーゼ
アシルアミノ酸遊離酵素
ピロリドニルペプチダーゼ
（ｉｉｉ）さらに、グルタルアルデヒド以外の架橋剤を使用する場合は、その反応性基が反応する部位が活性部位であるエンドペプチダーゼにも有効である。そのようなエンドペプチダーゼとして、以下に示すセリンプロテアーゼ、チオールプロテアーゼ、カルボキシルプロテアーゼなどを使用することができる。
（ａ）上記以外のセリンプロテアーゼ
キモトリプシン
メトリジウム（Ｍｅｔｒｉｄｉｕｍ）プロテイナーゼＡ
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）プロテアーゼＩ
カテプシンＧ
エラスターゼ
α−リティクプロテアーゼ
サーモマイコリン
プロテイナーゼＫ
ストレプトミセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ）プロテアーゼ３
スタフィロコッカル（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃａｌ）プロテイナーゼ
テネブリオ（Ｔｅｎｅｂｒｉｏ）α−プロテイナーゼ
アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）セリンプロテイナーゼ
好熱性ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）アルカリプロテイナーゼ
アルターナリア（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ）エンドペプチダーゼ
カンジダ・リポリティカ（Ｃａｎｄｉｄａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）アルカリプロテイナーゼ
スブチリシン
その他微生物セリンプロテイナーゼ
（ｂ）チオールプロテアーゼ
パパイン
ブロメライン
キモパパイン
ストレプトコッカル（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ）プロテイナーゼ
カテプシンＬ
酵母プロテイナーゼＢ
カテプシンＳ
ＰＺ−ペプチダーゼ
（ｃ）カルボキシルプロテアーゼ
ペプシン
カテプシンＢ
レニン
キモシン
酵母プロテイナーゼＡ
カテプシンＥ
ペニシロペプシン
その他微生物カルボキシルプロテアーゼ
本発明においては、薬物を担持させた静電結合型高分子ミセルに架橋剤を添加して反応させる。
このような架橋剤として分子内に複数個のアルデヒド基を有するグルタルアルデヒド、スクシンアルデヒド、パラホルムアルデヒド、フタリックジカルボキシアルデヒド（フタルアルデヒド）など、分子内にマレイミド基と活性エステル基を有するＮ−［α−メレイミドアセトキシ］スクシンイミドエステル、Ｎ−［β−マレイミドプロピルオキシ］スクシンイミドエステル、Ｎ−［ε−マレイミドカプロイルオキシ］スクシンイミドエステル、Ｎ−［γ−マレイミドブチリルオキシ］スクシンイミドエステル、スクシニミジル−４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシ−［６−アミドカプロエート］、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、スクシニミジル−４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレート、スクシニミジル−４−［ｐ−メレイミドフェニル］ブチレート、スクシニミジル−６−［（β−マレイミドプロピオンアミド）ヘキサノエート］など、分子内に活性エステルとニトロフェニルアジド基を有するＮ−５−アジド−２−ニトロベンゾイルオキシスクシンイミド、Ｎ−スクシニミジル−６−［４’−アジド−２’−ニトロフェニルアミノ］ヘキサノエートなど、分子内にフェニルアジド基とフェニルグリオキサル基を有するｐ−アジドフェニルグリオキサルなど、分子内に複数個のマレイミド基を有する１，４−ビス−マレイミドブタン、ビス−マレイミドエタン、ビス−マレイミドヘキサン、１，４−ビス−マレイミジル−２，３−ジハイドロブタン、１，８−ビス−マレイミドトリエチレングリコール、１，１１−ビス−マレイミドテトラエチレングリコール、ビス［２−（スクシンイミジルオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン、トリス−［２−マレイミドエチル］アミンなど、分子内に複数個のスルホ活性エステル基を有するビス［スルホスクシンイミジル］スベレート、ビス［２−（スルフォスクシニミドキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン、ジスルホスクシニミジルタートレート、エチレングリコールビス［スルホスクシニミジルスクシネート］、トリス−スルホスクシニジルアミノトリアセテートなど、分子内に複数個のアリルハライド基を有する１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンなど、分子内に複数個のイミドエステル基を有するジメチルアジピミデート、ジメチルピメリミデート、ジメチルスベリミデートなど、分子内に複数個のピリジルジチオ基を有する１，４−ジ−［３’−（２’−ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ブタンなど、分子内に複数個の活性エステル基を有するジスクシニミジルグルタレート、ジスクシニミジルスベレート、ジスクシニミジルタートレート、エチレングリコールビス［スクシミジルスクシネート］など、分子内に複数個のビニルスルホン基を有する１，６−ヘキサン−ビス−ビニルスルホンなど、分子内にピリジルジチオ基と活性エステル基を有するスクシニミジル−６−［３−（２−ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ヘキサノエート、４−スクシニミジルオキシカルボニル−メチル−α−［２−ピリジルジチオ］トルエン、Ｎ−スクシニミジル−３−［２−ピリジルジチオ］プロピオネートなど、分子内にヒドロキシフェニルアジド基と活性エステル基を有するＮ−ヒドロキシスクシニミジル−４−アジドサリサイリック酸など、分子内にマレイミド基とイソシアネート基を有するＮ−［ｐ−マレイミドフェニル］イソシアネートなど、分子内にマレイミド基とスルホ活性エステル基を有するＮ−［ε−マレイミドカプロイルオキシ］スルホスクシンイミドエステル、Ｎ−［γ−マレイミドブチリルオキシ］スルホスクシンイミドエステル、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシニミジル−４−アジドベンゾエート、Ｎ−［κ−マレイミドウンデカノイルオキシ］スルホスクシンイミドエステル、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル、スルホスクシニミジル−４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレート、スルホスクシニミジル−４−［ｐ−マレイミドフェニル］ブチレートなど、分子内にピリジルジチオ基とスルホ活性エステル基を有するスルホスクシニミジル−６−［３’−（２−ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ヘキサノエート、スルホスクシニミジル−６−［α−メチル−α−（２−ピリジルジチオ）トルアミド］ヘキサノエートなど、分子内にヒドロキシフェニルアジド基とスルホ活性エステル基を有するスルホスクシニミジル［４−アジドサリサイルアミド］ヘキサノエートなど、分子内にニトロフェニルアジド基とスルホ活性エステル基を有するスルホスクニミジル−６−［４’−アジド−２’−ニトロフェニルアミノ］ヘキサノエートなど、分子内にビニルスルホン基と活性エステル基を有するＮ−スクシニミジル−［４−ビニルスルホニル］ベンゾエートなどを用いることができ、グルタルアルデヒドを用いることが特に好ましい。また、架橋剤をグルタルアルデヒド以外のものとした場合は、その反応性官能基が反応する部位が活性部位であるエンドペプチダーゼの場合にも安定化が可能である。
架橋剤の添加比、すなわち、架橋剤と薬物の反応性官能基のモル比は、２：１〜１０００：１であり、５：１〜５００：１であることが好ましく、５０：１〜５００：１であることがさらに好ましい。
架橋剤と高分子ミセルを反応させる際には、薬物を内包した高分子ミセルと架橋剤とを混合することを基本としている。但し、薬物を内包していない高分子ミセルと、架橋剤及び薬物の混合物とを混合して反応させることもできる。なお、透析、攪拌、希釈、濃縮、超音波処理、温度制御、ｐＨ制御、有機溶媒の添加等の操作を適宜に付加することができる。
本発明において作成されたミセルは、温度、ｐＨ等に安定である。安定温度範囲は、例えば１５℃〜４５℃であり、安定ｐＨ範囲は、例えばｐＨ６〜ｐＨ１０である。
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明は実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕 グルタルアルデヒドで架橋されたタンパク質を内包するミセルの作製（１）
ポリエチレングリコール−ポリ（α，β−アスパラギン酸）ブロック共重合体（ポリエチレングリコール分子量１２０００、ブロック共重合体１本鎖当たり重合度６３のポリアスパラギン酸、５．４ｍｇ）をリン酸緩衝液（塩濃度 １０ｍＭ、ｐＨ７．４、３．０ｍＬ）に、牛膵臓由来トリプシン（３０．０ｍｇ）をリン酸緩衝液（１２．０ｍＬ）に溶解した後、この各々の溶液を混合した。混合溶液を２．５ｍＬずつ６つに分取した。それぞれに７０％グルタルアルデヒド水溶液（０、２．６、１２．９、２６、１２９、２６０μＬ）を添加した。その際、トリプシン中のリシン残基の総数に対するグルタルアルデヒド溶液中のアルデヒド基の総数として定義されるグルタルアルデヒド架橋度（ＧＲ）を、０．００、１０．００、５０．００、１００．００、５００．００、１０００．００とした。架橋したミセル溶液を４℃で２４時間置き、グルタルアルデヒド中のアルデヒド基とトリプシン中のリシン残基との間の架橋を完全なものにした。
得られた水溶液について、動的光散乱測定により平均粒径を測定し、静的光散乱測定により混合直後の散乱強度に対する所定時間後の相対散乱強度を測定した（波長４８８ｎｍ、検出角９０度、温度２５℃、動的レーザー散乱スペクトロメーターＤＬＳ−７０００（大塚エレクトロニクス社））。
結果を図１に示す。図１において、（ａ）は相対散乱強度の変化を、（ｂ）は平均粒径の変化を示す。図１において、ＧＲはそれぞれ以下の通りである。
ＧＲ＝０（△）、１０（◆）、５０（□）、１００（▲）、５００（●）、１０００（◇）
グルタルアルデヒド水溶液を添加したものについては、混合３０分後において平均粒径１００ｎｍ以下のトリプシン内包高分子ミセルが観測された（図１ｂ）。混合６時間後においては、グルタルアルデヒドを添加しなかった水溶液については、動的光散乱測定で検出可能な高分子ミセルは存在せず、相対散乱強度が１％以下まで減少し、高分子ミセルが存在しないことが確認された。
これに対し、グルタルアルデヒド水溶液を添加したものについては、混合４８時間後においても平均粒径に変化は認められず、相対散乱強度も７０％以上を維持しており（図１ａ）、トリプシン内包高分子ミセルがグルタルアルデヒド水溶液の添加により安定化されていることが確認された。
なお、トリプシンを内包させたときのミセル、グルタルアルデヒドの架橋度をＧＲ＝１００としたときのミセル、及び塩化ナトリウムを添加したときのミセルについて、それぞれ粒径の分布を測定した。
その結果、図２に示すように、ミセルのサイズ分布は一定であった（多分散度１以下）。図２において、（ａ）はトリプシンを内包させたときのミセルでグルタルアルデヒドを添加する前のミセル、（ｂ）はグルタルアルデヒドの架橋度をＧＲ＝１００としたときのミセル（ＮａＣｌ添加前）、（ｃ）はＮａＣｌ（０．１５Ｍ）を添加した後のミセルの粒径分布図である。架橋反応によってミセルの構造に変化や凝集はなく、ミセルの安定性が示された。
〔実施例２〕 塩存在下におけるミセルの安定性試験
実施例１で調製したポリエチレングリコール−ポリ（α，β−アスパラギン酸）ブロック共重合体に、牛膵臓由来トリプシン及びグルタルアルデヒドを混合して混合溶液（１０．０ｍＬ）を調製し、得られた溶液を２．５ｍＬずつ４つに分取した。そのうち３つに塩化ナトリウム水溶液を添加し、混合後の塩化ナトリウムの濃度が０、０．１５、０．３、０．６Ｍとなるように４つの溶液を調製した。これらの溶液について、動的光散乱測定により平均粒径を測定し、静的光散乱測定により塩化ナトリウム濃度が０の水溶液の散乱強度に対する各溶液の相対散乱強度を測定した（検出角９０度、温度２５℃）。
結果を図３に示す。図３において、各ＧＲはそれぞれ以下の通りである。
ＧＲ＝０（△）、１０（◆）、５０（□）、１００（▲）、５００（●）、１０００（◇）
グルタルアルデヒド水溶液を添加しなかったもの以外は、いずれの塩化ナトリウム濃度の水溶液においてもミセルの平均粒径に変化は認められず（図３ｂ）、１００％以上の相対散乱強度を維持しており（図３ａ）、グルタルアルデヒド水溶液添加によいトリプシン内包高分子ミセルが安定化されていることが確認された。
塩濃度に対する安定性をさらに調べるため、グルタルアルデヒドの添加量がＧＲ＝２、４、１０、２０、３０となるようにし、混合後の塩化ナトリウムの濃度が０、０．０５、０．１、０．１５、０．２Ｍとなるように溶液を調製した。これらの溶液について、動的光散乱測定により平均粒径を測定し、静的光散乱測定により塩化ナトリウム濃度が０の水溶液の散乱強度に対する各溶液の相対散乱強度を測定した。
その結果、グルタルアルデヒドの添加量が２倍以上では、散乱光強度と粒径がほぼ変化せず、グルタルアルデヒド無添加と比較して極めて安定であることがわかった（図４）。
図４において、各ＧＲはそれぞれ以下の通りである。
ＧＲ＝０（○）、２（▲）、４（□）、１０（◇）、２０（●）、３０（△）Hereinafter, the present invention will be described in detail.
As described above, the present invention has been made as a result of studies by the inventors of the present invention in order to improve conventional electrostatically coupled polymer micelle type drugs. Then, the cohesive force in the micelle is enhanced by reacting the electrostatic binding type polymer micelle type drug and the crosslinking agent, thereby providing a very stable micelle type drug.
The micelle in the present invention uses an electrostatically coupled polymer micelle carrier composed of an uncharged segment and a charged segment, and various types of both segments are included in the present invention.
Examples of the non-chargeable segment include polyalkylene glycols such as polyethylene glycol and polypropylene glycol, polyalkylene oxides, polysaccharides, polyacrylamides, polysubstituted acrylamides, polymethacrylamides, polysubstituted methacrylamides, polyvinylpyrrolidone, polyvinyl alcohol, and polyacrylic acid. Examples include various segments derived from esters, polymethacrylic acid esters, uncharged polyamino acids, or derivatives thereof.
Examples of the charged segment include polyamino acids having charged side chains, more specifically, polyaspartic acid, polyglutamic acid, polylysine, polyarginine, polyhistidine, and the like, or polymalic acid, polyacrylic acid, polymethacrylic acid, and the like. , Polyethyleneimine, polyvinylamine, polyallylamine, polyvinylimidazole and the like. Furthermore, segments derived from derivatives of these polyamino acids are exemplified.
From the viewpoint of further enhancing the cohesive force in the micelle, when the side chain of the charged segment is not reactive with the crosslinking agent, the end of the charged segment is a functional group highly reactive with the crosslinking agent. Is used. As such a functional group, for example, a primary amino group (—NH 2 ) is preferable.
Examples of the block copolymer of the present invention composed of these segments include the following.
That is, polyethylene glycol-polyaspartic acid block copolymer, polyethylene oxide-polyglutamic acid block copolymer, polyethylene glycol-polyarginine block copolymer, polyethylene glycol-polyhistidine block copolymer, polyethylene glycol-polymethacrylic acid block Copolymer, polyethylene glycol-polyethyleneimine block copolymer, polyethylene glycol-polyvinylamine block copolymer, polyethylene glycol-polyallylamine block copolymer, polyethylene oxide-polyaspartic acid block copolymer, polyethylene oxide-polyglutamic acid Block copolymer, polyethylene oxide-polylysine block copolymer, polyethylene oxide-polyacrylate Luric acid block copolymer, polyethylene oxide-polyvinylimidazole block copolymer, polyacrylamide-polyaspartic acid block copolymer, polyacrylamide-polyhistidine block copolymer, polymethacrylamide-polyacrylic acid, polymethacrylamide- Polyvinylamine block copolymer, polyvinylpyrrolidone-polymethacrylic acid block copolymer, polyvinyl alcohol-polyaspartic acid block copolymer, polyvinyl alcohol-polyarginine block copolymer, polyacrylic acid ester-polyglutamic acid block copolymer , Polyacrylic acid ester-polyhistidine block copolymer, polymethacrylic acid ester-polyvinylamine block copolymer, polymethacrylic acid-polyvinylimidazo A Le block copolymer.
Examples of these block copolymers include the following formula (I) or (II):
In the above formula, R 1 represents a hydrogen atom, a hydrocarbon group or a functional group, or a functional group-substituted hydrocarbon group, R 2 represents NH, CO, or R 6 (CH 2 ) q R 7 (R 6 represents , OCO, OCONH, NHCO, NHCOO, NHCONH, CONH or COO, R 7 represents NH or CO, and q represents an integer of 1 or more.
R 3 represents a carboxyl group, a carboxyl group-substituted hydrocarbon group, an amino group-substituted hydrocarbon group, a hydrazino group-substituted hydrocarbon group, or a (CH 2 ) p —NHCNHNH 2 group (p represents an integer of 1 or more). Represents. Alternatively, R 3 represents a nitrogen-containing heterocyclic group or a nitrogen-containing heterocyclic group-substituted hydrocarbon group.
R 4 represents a hydrogen atom, a hydroxyl group, or a hydrocarbon group having any of CO, NH, or O at the bond end thereof.
m is 4 to 2500, n is 1 to 300, x is 0 to 300, and x <n.
In the present invention, in the above formula, R 3 is —COOH, —CH 2 COOH, — (CH 2 ) 3 —NH 2 , — (CH 2 ) 2 NHCNHNH 2 , or the following formula (III):
As these block copolymers, for example, there is a so-called AB type block copolymer as a typical structure. More specifically, the following formula (IV):
The copolymer is preferably a polyethylene glycol-poly (α, β-aspartic acid) block copolymer obtained from, for example, polyethylene glycol and poly (α, β-aspartic acid). This copolymer is first synthesized by polymerizing β-benzyl-L-aspartate-N-carboxylic acid anhydride using polyethylene glycol having a primary amino group at one end (molecular weight of about 200 to 250,000) as an initiator. The The molecular weight of the (β-benzyl, L-aspartate) moiety in the polyethylene glycol-poly (β-benzyl-L-aspartate) block copolymer is variable from about 205 to 62000. A polyethylene glycol-poly (α, β-aspartic acid) block copolymer can be obtained by subjecting this copolymer to alkali treatment and debenzylation.
Moreover, following formula (V) which has a cationic segment as a block copolymer:
In the present invention, the drug that can be electrostatically supported in the polymer micelle made of the block copolymer is not particularly limited to the kind. Here, “drug” means a low-molecular or high-molecular substance having a chargeability opposite to that of the charged segment, for example, a high-molecularity such as peptide hormone, protein, enzyme, nucleic acid (DNA or RNA). Examples thereof include low molecular weight drugs (water-soluble compounds) having a charged functional group in the molecule such as drugs, adriamycin, and daranomycin. Opposite charge means that one of the molecules is positively charged and the other is negatively charged. In the case of a molecule having a plurality of functional groups of different charged states, by changing the pH, This includes the case where the positive and negative charge states are changed. When they have the same charge, one molecule can be made oppositely charged with respect to the other molecule by reacting a compound having a functional group with opposite charge and changing the charged state of the molecule. .
When these drugs are loaded on polymer micelles, the block copolymer and the drug or a solution thereof are basically mixed. In addition, dialysis, stirring, dilution, concentration, sonication, Operations such as temperature control, pH control, and addition of an organic solvent can be added as appropriate.
For example, when an enzyme such as trypsin or lysozyme is encapsulated in the polyethylene glycol-poly (α, β-aspartic acid) block copolymer represented by the above formula (IV), an aqueous solution of the copolymer is mixed at an appropriate mixing ratio. The enzyme aqueous solution may be mixed with the aqueous copolymer solution under conditions such as ionic strength and pH.
In addition, when DNA is carried on the polyethylene glycol-polylysine block copolymer represented by the above formula (V), conditions such as an appropriate mixing ratio, ionic strength, and pH are set, and the DNA is added to the aqueous solution of the copolymer. The solution can be mixed to carry the DNA.
As described above, the electrostatically coupled polymer micelle of the present invention has a stable polymer micelle structure and can efficiently incorporate charged substances such as proteins and DNA into the inner core. For this reason, the chargeable drug which is easily degraded in the living body can be stabilized and administered in the body.
In the present invention, examples of drugs (enzymes) to be crosslinked include the following.
(1) Enzymes that can be used to quantify living organisms in the blood (Table 1)
(I) trypsin, plasmin, kallikrein, thrombin, factor Xa, acrosin, enteropeptidase, urokinase, cochnase, premophenol monooxygenase activating enzyme, E. coli protease, mouse submandibular gland protease, snake venom thrombin-like Enzymes, cathepsin B 1 , ficin, Clostridium histolyticum protease, Myxobacter AL-1 protease II, Armillaria melea protease (ii), and exopeptidase also has a C-terminus There are carboxypeptidase that degrades from amino acids and aminopeptidase that degrades from the N-terminus, but glutaraldehyde is 1 Since having an amino group and a high reactivity, it is also effective for the following aminopeptidase.
Leucine aminopeptidase particulate aminopeptidase aminopeptidase B
Intestinal surface aminopeptidase Yeast aminopeptidase I
Aspergillus aminopeptidase aminoacyl proline aminopeptidase Bacillus stearothermophilus aminopeptidase Clostridium histolyticum aminopeptidase Album Limber (Tritriachium Limber) Aminopeptidase Acylamino acid-releasing enzyme Pyrrolidonylpeptidase (iii) In addition, if a cross-linking agent other than glutaraldehyde is used, Reactive group is also effective endopeptidase site reactions are active site. As such endopeptidases, serine proteases, thiol proteases, carboxyl proteases and the like shown below can be used.
(A) Serine proteases other than those described above Chymotrypsin Metridium proteinase A
E. coli protease I
Cathepsin G
Elastase α-lytic protease Thermomycholine proteinase K
Staphylococcal Proteinase Tenebrio α-Proteinase Arthrobacterine Serine Proteinase Thermophilic Streptomyces Alkaline Protein Alternary C Microbial serine proteinase (b) thiol protease papain bromelain chymopapain streptococcal proteinase cathepsin L
Yeast proteinase B
Cathepsin S
PZ-peptidase (c) carboxyl protease pepsin cathepsin B
Renin chymosin yeast proteinase A
Cathepsin E
Penicillopepsin and other microorganism carboxyl protease In the present invention, a cross-linking agent is added to and reacted with the electrostatically coupled polymer micelle carrying the drug.
N- having a maleimide group and an active ester group in the molecule such as glutaraldehyde, succinaldehyde, paraformaldehyde, phthalic dicarboxaldehyde (phthalaldehyde) having a plurality of aldehyde groups in the molecule as such a crosslinking agent [Α-Meleimidoacetoxy] succinimide ester, N- [β-maleimidopropyloxy] succinimide ester, N- [ε-maleimidocaproyloxy] succinimide ester, N- [γ-maleimidobutyryloxy] succinimide ester, succinimidyl- 4- [N-maleimidomethyl] cyclohexane-1-carboxy- [6-amidocaproate], m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester, succinimidyl-4- [N-maleimidomethy] ] Cyclohexane-1-carboxylate, succinimidyl-4- [p-maleimidophenyl] butyrate, succinimidyl-6-[(β-maleimidopropionamido) hexanoate], etc., N having an active ester and a nitrophenyl azide group in the molecule P- having a phenylazide group and a phenylglyoxal group in the molecule such as -5-azido-2-nitrobenzoyloxysuccinimide and N-succinimidyl-6- [4'-azido-2'-nitrophenylamino] hexanoate. 1,4-bis-maleimidobutane, bis-maleimidoethane, bis-maleimidohexane, 1,4-bis-maleimidyl-2,3-dihydro having a plurality of maleimide groups in the molecule, such as azidophenylglyoxal Butane, 1,8-bis-maleimidotrie Len glycol, 1,11-bis-maleimidotetraethylene glycol, bis [2- (succinimidyloxycarbonyloxy) ethyl] sulfone, tris- [2-maleimidoethyl] amine, etc. Bis [sulfosuccinimidyl] suberate having an ester group, bis [2- (sulfosuccinimidoxycarbonyloxy) ethyl] sulfone, disulfosuccinimidyl tartrate, ethylene glycol bis [sulfosuccinimidyls] Succinate], tris-sulfosuccinidylaminotriacetate, etc., having a plurality of imide ester groups in the molecule, such as 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzene having a plurality of allyl halide groups in the molecule Dimethyl adipimidate, dimethyl pimelimidate, Multiple active ester groups in the molecule such as 1,4-di- [3 ′-(2′-pyridyldithio) propionamido] butane having multiple pyridyldithio groups in the molecule, such as dimethylsuberimidate 1,6-hexane having a plurality of vinyl sulfone groups in the molecule such as disuccinimidyl glutarate, disuccinimidyl suberate, disuccinimidyl tartrate, ethylene glycol bis [succimidyl succinate] -Succinimidyl-6- [3- (2-pyridyldithio) propionamido] hexanoate having a pyridyldithio group and an active ester group in the molecule, such as bis-vinylsulfone, 4-succinimidyloxycarbonyl-methyl-α- [2-Pyridyldithio] toluene, N-succinimidyl-3- [2-pyridyldithio] propi N- [p-maleimidophenyl having a maleimide group and an isocyanate group in the molecule, such as N-hydroxysuccinimidyl-4-azidosalicylic acid having a hydroxyphenyl azide group and an active ester group in the molecule ] N-[[epsilon] -maleimidocaproyloxy] sulfosuccinimide ester, N-[[gamma] -maleimidobutyryloxy] sulfosuccinimide ester, N-hydroxysulfosuccinimide having a maleimide group and a sulfo-active ester group in the molecule such as isocyanate Midyl-4-azidobenzoate, N- [κ-maleimidoundecanoyloxy] sulfosuccinimide ester, m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysulfosuccinimide ester, sulfosuccinimidyl-4- [N-maleimidomethyl] si Sulfosuccinimidyl-6- [3 ′-() having a pyridyldithio group and a sulfoactive ester group in the molecule, such as rhohexane-1-carboxylate, sulfosuccinimidyl-4- [p-maleimidophenyl] butyrate 2-pyridyldithio) propionamide] hexanoate, sulfosuccinimidyl-6- [α-methyl-α- (2-pyridyldithio) toluamide] hexanoate, etc., which have a hydroxyphenylazide group and a sulfo-active ester group in the molecule Sulfosuccinimidyl-6- [4′-azido-2′-nitrophenylamino] having a nitrophenylazide group and a sulfoactive ester group in the molecule, such as sulfosuccinimidyl [4-azidosalicylamido] hexanoate Hexanoate etc. have vinyl sulfone group and active ester group in the molecule That N- succinimidyl - such as [4-vinylsulfonyl] benzoate can be used, it is particularly preferable to use glutaraldehyde. In addition, when the cross-linking agent is other than glutaraldehyde, stabilization is possible even in the case of an endopeptidase in which the reactive functional group reacts with the active site.
The addition ratio of the crosslinking agent, that is, the molar ratio of the reactive functional group of the crosslinking agent to the drug is 2: 1 to 1000: 1, preferably 5: 1 to 500: 1, and preferably 50: 1 to 500. More preferably, the ratio is 1.
When the crosslinking agent and the polymer micelle are reacted, the polymer micelle encapsulating the drug and the crosslinking agent are basically mixed. However, polymer micelles not containing a drug and a mixture of a crosslinking agent and a drug can be mixed and reacted. In addition, operations such as dialysis, stirring, dilution, concentration, sonication, temperature control, pH control, and addition of an organic solvent can be added as appropriate.
The micelle prepared in the present invention is stable at temperature, pH and the like. The stable temperature range is, for example, 15 ° C. to 45 ° C., and the stable pH range is, for example,
Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the present invention is not limited to the examples.
[Example 1] Preparation of micelle encapsulating protein cross-linked with glutaraldehyde (1)
A polyethylene glycol-poly (α, β-aspartic acid) block copolymer (polyethylene glycol molecular weight 12000, polyaspartic acid with a degree of polymerization 63 per chain of 5.4 mg, 5.4 mg) was added to a phosphate buffer (salt concentration). In 10 mM, pH 7.4, 3.0 mL), bovine pancreas-derived trypsin (30.0 mg) was dissolved in phosphate buffer (12.0 mL), and each of these solutions was mixed. The mixed solution was separated into six 2.5 mL portions. A 70% glutaraldehyde aqueous solution (0, 2.6, 12.9, 26, 129, 260 μL) was added to each. The degree of glutaraldehyde crosslinking (GR), defined as the total number of aldehyde groups in the glutaraldehyde solution relative to the total number of lysine residues in trypsin, is defined as 0.00, 10.00, 50.00, 100.00, 500.00 and 1000.00. The cross-linked micelle solution was placed at 4 ° C. for 24 hours to complete the cross-linking between the aldehyde group in glutaraldehyde and the lysine residue in trypsin.
About the obtained aqueous solution, the average particle diameter was measured by dynamic light scattering measurement, and the relative scattering intensity after a predetermined time with respect to the scattering intensity immediately after mixing was measured by static light scattering measurement (wavelength 488 nm, detection angle 90 degrees, Temperature 25 ° C., dynamic laser scattering spectrometer DLS-7000 (Otsuka Electronics Co., Ltd.)).
The results are shown in FIG. In FIG. 1, (a) shows a change in relative scattering intensity, and (b) shows a change in average particle size. In FIG. 1, GR is as follows.
GR = 0 (△), 10 (◆), 50 (□), 100 (▲), 500 (●), 1000 (◇)
In the case of adding the glutaraldehyde aqueous solution, trypsin-encapsulating polymer micelles having an average particle size of 100 nm or less were observed after 30 minutes of mixing (FIG. 1b). After 6 hours of mixing, for the aqueous solution to which glutaraldehyde was not added, there was no polymer micelle detectable by dynamic light scattering measurement, the relative scattering intensity decreased to 1% or less, and the polymer micelle was It was confirmed that it does not exist.
On the other hand, in the case of adding a glutaraldehyde aqueous solution, no change was observed in the average particle size even after 48 hours of mixing, and the relative scattering intensity was maintained at 70% or more (FIG. 1a). It was confirmed that the molecular micelle was stabilized by the addition of an aqueous glutaraldehyde solution.
The particle size distribution was measured for micelles when trypsin was included, micelles when the degree of cross-linking of glutaraldehyde was GR = 100, and micelles when sodium chloride was added.
As a result, as shown in FIG. 2, the micelle size distribution was constant (polydispersity of 1 or less). In FIG. 2, (a) is a micelle when trypsin is encapsulated before adding glutaraldehyde, (b) is a micelle when glutaraldehyde has a cross-linking degree of GR = 100 (before NaCl addition), (C) is a particle size distribution diagram of micelles after adding NaCl (0.15M). There was no change or aggregation in the structure of the micelle due to the crosslinking reaction, indicating the stability of the micelle.
[Example 2] Micelle stability test in the presence of salt The polyethylene glycol-poly (α, β-aspartic acid) block copolymer prepared in Example 1 was mixed with bovine pancreatic trypsin and glutaraldehyde. A solution (10.0 mL) was prepared, and the obtained solution was divided into four 2.5 mL portions. A sodium chloride aqueous solution was added to three of them, and four solutions were prepared so that the concentration of sodium chloride after mixing was 0, 0.15, 0.3, and 0.6M. For these solutions, the average particle diameter was measured by dynamic light scattering measurement, and the relative scattering intensity of each solution with respect to the scattering intensity of an aqueous solution having a sodium chloride concentration of 0 was measured by static light scattering measurement (detection angle 90 °, Temperature 25 ° C.).
The results are shown in FIG. In FIG. 3, each GR is as follows.
GR = 0 (△), 10 (◆), 50 (□), 100 (▲), 500 (●), 1000 (◇)
Except for the case where no aqueous glutaraldehyde solution was added, no change was observed in the average micelle particle size in any aqueous solution of sodium chloride concentration (Fig. 3b), and the relative scattering intensity of 100% or more was maintained ( FIG. 3 a) confirms that the trypsin-encapsulating polymer micelle that is good for adding glutaraldehyde aqueous solution is stabilized.
In order to further investigate the stability against salt concentration, the addition amount of glutaraldehyde was set to GR = 2, 4, 10, 20, 30 and the concentration of sodium chloride after mixing was 0, 0.05, 0.1, Solutions were prepared to 0.15 and 0.2M. About these solutions, the average particle diameter was measured by dynamic light scattering measurement, and the relative scattering intensity of each solution with respect to the scattering intensity of an aqueous solution having a sodium chloride concentration of 0 was measured by static light scattering measurement.
As a result, it was found that when the addition amount of glutaraldehyde was 2 times or more, the scattered light intensity and particle size were not substantially changed, and it was extremely stable as compared with the case where glutaraldehyde was not added (FIG. 4).
In FIG. 4, each GR is as follows.
GR = 0 (◯), 2 (▲), 4 (□), 10 (◇), 20 (●), 30 (△)
ポリエチレングリコール−ポリ（α，β−アスパラギン酸）ブロック共重合体（１．８ｍｇ）をリン酸緩衝液（１．０ｍＬ）に溶解した溶液と、牛膵臓由来トリプシン（１０．０ｍｇ）をリン酸緩衝液（４．０ｍＬ）に溶解した溶液とを混合し、混合液を２．５ｍＬずつ２つに分取した。この一方にグルタルアルデヒド水溶液（２６μＬ）を添加することにより、グルタルアルデヒド水溶液添加高分子ミセル溶液、及びグルタルアルデヒド水溶液未添加高分子ミセル溶液を調製した。また、牛膵臓由来トリプシン（５．０ｍｇ）をリン酸緩衝液（２．５ｍＬ）に溶解した溶液（非ミセル化酵素溶液）も調製した。グルタルアルデヒド水溶液を添加したものについては、リン酸緩衝液に対して透析することによって、余剰のグルタルアルデヒドを除去した。なお、余剰グルタルアルデヒドの除去の確認は、３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾンを用いて行った。これら３つの溶液について、４１０ｎｍの吸光度の時間変化から単位時間当たりの基質の分解速度を測定することによって、トリプシンの酵素活性を測定した。基質は、Ｌ−リシンｐ−ニトロアニリンを用い、調製直後、１週間後、２週間後、３週間後に酵素活性を測定した。
その結果、トリプシンのみの溶液とグルタルアルデヒド未添加高分子ミセル溶液については、１週間後には、リン酸緩衝液に溶解直後のトリプシンの活性の１／３まで低下していた。これに対し、グルタルアルデヒド添加高分子ミセル溶液は、３週間後においても溶解直後のトリプシンと同程度の活性を維持していた（図５）。
〔比較例〕
ポリエチレングリコール−ポリ（α，β−アスパラギン酸）ブロック共重合体において、ポリ（α，β−アスパラギン酸）の末端の１級アミノ基にアセチル基を導入したものを作製し、グルタルアルデヒドとブロック共重合体とを反応させないようにした。ミセルに内包させるトリプシン濃度は２ｍｇ／ｍＬ、温度２５℃とし、塩化ナトリウムの濃度が０、０．０５、０．１、０．１５、０．２Ｍとなるように溶液を調製した。これらの溶液について、静的光散乱測定により塩化ナトリウム濃度が０の水溶液の散乱強度に対する各溶液の相対散乱強度を測定した。
その結果、アセチル基を導入したミセルは、塩濃度０．０５Ｍにおいて沈殿した（図６）。
実施例２で確認された塩化ナトリウム濃度増加に対する安定性は認められず、安定化のためにはブロック共重合体にもグルタルアルデヒド等の架橋剤と反応する官能基を有している必要があることが確認された。
〔実施例４〕 グルタルアルデヒドで架橋されたタンパク質を内包するミセルの作製（２）
本実施例は、実施例１で使用した牛膵臓由来トリプシンの代わりにビリルビンオキシダーゼ（ＢＯ）、ポリエチレングリコール−ポリ（α，β−アスパラギン酸）ブロック共重合体の代わりにポリエチレングリコール−ポリリシンブロック共重合体（ポリエチレングリコール分子量１２０００、ブロック共重合体１本鎖当たり重合度４８のリシン）を使用し実施例１と同様にしてミセル粒径を測定した。
また、ＢＯの酵素活性は、基質としてビリルビンを用いて実施例２に準じて測定した。
結果を図７及び図８に示す。
図７の結果より、グルタルアルデヒドの添加後においても単峰性のピークは維持されており、複合体構造を維持したまま架橋構造が導入されていることが示された。
また、図８より、グルタルアルデヒドを添加し構造の安定化を図ることによって、内包ＢＯの活性の保存安定性が著しく向上することが確認された。A solution obtained by dissolving a polyethylene glycol-poly (α, β-aspartic acid) block copolymer (1.8 mg) in a phosphate buffer (1.0 mL) and bovine pancreas-derived trypsin (10.0 mg) in a phosphate buffer The solution dissolved in the liquid (4.0 mL) was mixed, and the mixture was separated into two 2.5 mL portions. A glutaraldehyde aqueous solution-added polymer micelle solution and a glutaraldehyde aqueous solution-free polymer micelle solution were prepared by adding a glutaraldehyde aqueous solution (26 μL) to this one. In addition, a solution (non-micellar enzyme solution) in which bovine pancreas-derived trypsin (5.0 mg) was dissolved in a phosphate buffer (2.5 mL) was also prepared. About what added the glutaraldehyde aqueous solution, excess glutaraldehyde was removed by dialyzing with respect to a phosphate buffer solution. The removal of excess glutaraldehyde was confirmed using 3-methyl-2-benzothiazolinone hydrazone. For these three solutions, the enzyme activity of trypsin was measured by measuring the degradation rate of the substrate per unit time from the change with time in absorbance at 410 nm. As the substrate, L-lysine p-nitroaniline was used, and enzyme activity was measured immediately after preparation, 1 week, 2 weeks, and 3 weeks.
As a result, the trypsin-only solution and the glutaraldehyde-free polymer micelle solution were reduced to 1/3 of the trypsin activity immediately after dissolution in the phosphate buffer after one week. In contrast, the glutaraldehyde-added polymer micelle solution maintained the same activity as that of trypsin immediately after dissolution even after 3 weeks (FIG. 5).
[Comparative example]
A polyethylene glycol-poly (α, β-aspartic acid) block copolymer is prepared by introducing an acetyl group into the terminal primary amino group of poly (α, β-aspartic acid). The polymer was not allowed to react. The concentration of trypsin contained in the micelle was 2 mg / mL, the temperature was 25 ° C., and the solution was prepared so that the sodium chloride concentrations were 0, 0.05, 0.1, 0.15, and 0.2M. About these solutions, the relative scattering intensity | strength of each solution with respect to the scattering intensity | strength of the aqueous solution whose sodium chloride concentration is 0 was measured by static light scattering measurement.
As a result, micelles introduced with acetyl groups were precipitated at a salt concentration of 0.05 M (FIG. 6).
The stability against the increase in sodium chloride concentration confirmed in Example 2 was not recognized, and the block copolymer must have a functional group that reacts with a crosslinking agent such as glutaraldehyde for stabilization. It was confirmed.
[Example 4] Preparation of micelle encapsulating protein cross-linked with glutaraldehyde (2)
In this example, bilirubin oxidase (BO) instead of bovine pancreas-derived trypsin used in Example 1 and polyethylene glycol-polylysine block copolymer instead of polyethylene glycol-poly (α, β-aspartic acid) block copolymer were used. The micelle particle size was measured in the same manner as in Example 1 using a polymer (polyethylene glycol molecular weight 12000, block copolymer lysine having a polymerization degree of 48 per chain).
The enzyme activity of BO was measured according to Example 2 using bilirubin as a substrate.
The results are shown in FIGS.
From the results of FIG. 7, it was shown that a unimodal peak was maintained even after addition of glutaraldehyde, and a crosslinked structure was introduced while maintaining the complex structure.
Further, from FIG. 8, it was confirmed that the storage stability of the activity of the encapsulated BO was remarkably improved by adding glutaraldehyde to stabilize the structure.
本発明により、安定化したタンパク質内包高分子ミセルが提供される。本発明の方法により安定化されたミセルは、温度やｐＨに不安定な薬物を内包させることができるため、バイオナノリアクターやバイオナノリザーバーとして有用である。 According to the present invention, a stabilized protein-encapsulating polymer micelle is provided. The micelle stabilized by the method of the present invention can encapsulate a drug unstable in temperature and pH, and thus is useful as a bionanoreactor or bionano reservoir.
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