JP4490197B2

JP4490197B2 - ジアセチルスペルミンの測定方法および測定試薬キット

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Publication number: JP4490197B2
Application number: JP2004217804A
Authority: JP
Inventors: 正夫川喜田; 恭子平松; 昌泰榎本; 美恵子小坂
Original assignee: Alfresa Pharma Corp
Current assignee: Alfresa Pharma Corp
Priority date: 2004-07-26
Filing date: 2004-07-26
Publication date: 2010-06-23
Anticipated expiration: 2024-07-26
Also published as: JP2006038594A

Description

本発明は、金コロイド凝集反応を利用するジアセチルスペルミンの測定方法に関する。より詳細には、検体中のジアセチルスペルミンをｎｇ／ｍＬ単位で高感度にかつ短時間に測定することを可能にする技術に関する。

ジアセチルスペルミンは、尿中ポリアミン成分の１種であり、健常者尿中では尿中総ポリアミンの０．６％を占めるにすぎない微量成分である。しかし、癌患者の尿中においては、他の成分と比較して高い頻度で排泄量が増加し、しかも増加の割合も際立って高い。そのため、ジアセチルスペルミンは腫瘍マーカーとして注目されている（非特許文献１および２参照）。さらに、悪性腫瘍の治療効果の判定や予後予測の指標としても期待されている（非特許文献２）。

近年、臨床検査などの各種検査では自動化および測定時間の短縮が図られている。例えば、臨床検査においては、生体試料中の微量物質を測定するために免疫反応を利用する免疫測定方法が広く用いられている。免疫測定法としては、ＲＩＡ法、ＥＩＡ法、免疫比濁法、ラテックス凝集法、金属コロイド凝集法などの多くの方法がある。この中でもラテックス凝集法および金属コロイド凝集法は、反応液の分離や洗浄を行う必要がないため、自動化に適している。しかし、ジアセチルスペルミンなどの低分子物質（以下、ハプテンという）の測定においては、通常の免疫測定とは異なり競合法による免疫反応を利用するため、その測定を高感度かつ短時間に行うには困難が伴い、自動化の妨げとなっている。そのため、従来、生体試料中のｎｇ／ｍＬ濃度のハプテンを測定する場合、ＲＩＡ法やＥＩＡ法で測定されることが多く、自動化に適さず、簡便に測定できなかった。このように、ハプテン測定においても、高感度かつ短時間で測定が可能な、自動化に適した技術が望まれている。

金属コロイド凝集法によるハプテンの測定用試薬として、血中ハロペリドール測定用試薬「マーキット（登録商標）Ｇハロペリドール」および血中ブロムペリドール測定用試薬「マーキット（登録商標）Ｇブロムペリドール」が、大日本製薬株式会社（製造、株式会社アズウェル）より販売されている。これらによれば、血液中のハロペリドールおよびブロムペリドールを自動分析機により、高感度かつ短時間に測定することができる（非特許文献３および４）。しかしながら、腫瘍マーカーとして注目されているジアセチルスペルミンを金属コロイド凝集法により測定する方法については未だ知られていない。

尿中のジアセチルスペルミンの測定については、ＥＬＩＳＡに用いるためのジアセチルスペルミン特異抗体の製法が報告されている（非特許文献５）。また、ジアセチルスペルミンの測定用試薬の一つとして、「尿中ジアセチルスペルミン測定試薬用ＥＬＩＳＡキット」が、株式会社トランスジェニック（販売、フナコシ株式会社）より市販されている。このキットは、ＥＬＩＳＡ法を行うための試薬であり、構成品も１０種と多く、測定操作方法は煩雑であり、自動化および短時間での測定は困難である。

以上のとおり公知の測定法では、ジアセチルスペルミンを高感度かつ短時間で測定を行うことができず、自動化も困難であった。
スギモト（Sugimoto, M.）ら，ジャーナル・オブ・キャンサー・リサーチ・クリニカル・オンコロジー（J. Cancer Res. Clin. Oncol.），１９９５年，第１２１巻，ｐ．３１７−３１９ヒラマツ（Hiramatsu, K.）ら，ジャーナル・オブ・キャンサー・リサーチ・クリニカル・オンコロジー（J. Cancer Res. Clin. Oncol. ），１９９７年，第１２３巻，ｐ．５３９−５４５血中ハロペリドール測定用試薬「マーキット（登録商標）Ｇハロペリドール」添付文書血中ブロムペリドール測定用試薬「マーキット（登録商標）Ｇブロムペリドール」添付文書ヒラマツ（Hiramatsu, K. ）ら，ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（J. Biochem.），１９９８年，第１２４巻，ｐ．２３１−２３６

本発明は、測定感度が良好で、測定時間が短縮された、Ｂ／Ｆ分離を必要としない自動化に適したジアセチルスペルミンの測定法およびそのための測定キットを提供することを目的とする。

上記の目的を達成するために鋭意検討した結果、まず、ジアセチルスペルミンを含有する検体と、塩とジアセチルスペルミン類似化合物結合蛋白質を含有する第１試薬とを混合した後、抗ジアセチルスペルミン抗体結合金コロイドを含有する第２試薬を添加して混合し、金コロイドの免疫反応凝集による吸光度変化を測定することによって、ｎｇ／ｍＬ濃度のジアセチルスペルミン測定を、高感度かつ短時間に行うことが可能であることを見出し、本発明を完成した。

詳細には、本発明においては、予め検体とジアセチルスペルミン類似化合物結合蛋白質とを混合し、次いで抗ジアセチルスペルミン抗体結合金コロイドを添加することによって抗原抗体反応を開始し、検体中の被測定物質であるジアセチルスペルミンとジアセチルスペルミン類似化合物結合蛋白質との間で抗ジアセチルスペルミン抗体結合金コロイドが競合反応する、一段階のみの免疫競合反応とした。

本発明は、検体中のジアセチルスペルミンの量を測定する方法を提供し、この方法は、（ａ）該検体と、塩およびジアセチルスペルミン類似化合物結合蛋白質を含有する第１試薬とを混合する工程、（ｂ）該混合液に、抗ジアセチルスペルミン抗体結合金コロイドを含有する第２試薬を添加して混合する工程、および（ｃ）該ジアセチルスペルミン類似化合物結合蛋白質と抗ジアセチルスペルミン抗体結合金コロイドの免疫反応凝集による吸光度変化を、４５０〜５８０ｎｍで２回以上測定した吸光度、または、４５０ｎｍ〜５８０ｎｍを主波長および６２０ｎｍ〜８００ｎｍを副波長とする二波長で２回以上測定した吸光度より求める工程を含む。

好適な実施態様では、上記工程（ａ）から（ｃ）が１５分以内で行われる。さらに好適な実施態様では、１０分以内で行われる。

他の好適な実施態様では、上記混合液中に終濃度として、０．３〜１０％の塩、１０〜１０００ｍＭの緩衝剤、および５〜３０００ｎｇ／ｍＬのジアセチルスペルミン類似化合物結合蛋白質を含有するように、これら物質が第１試薬に含有される。

好適な実施態様では、ジアセチルスペルミン類似化合物結合蛋白質は、アセチルスペルミン結合ウシ血清アルブミンである。

好適な実施態様では、上記第１試薬は、平均分子量５，０００から５００，０００の水溶性高分子物質を０．０１％〜１０％（Ｗ／Ｖ）含有する。

他の好適な実施態様では、抗ジアセチルスペルミン抗体結合金コロイドの抗ジアセチルスペルミン抗体は、アセチルスペルミン結合ウシ血清アルブミンを動物に投与することによって生成されたポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり、そして上記ジアセチルスペルミン類似化合物結合蛋白質の蛋白質部分と反応しない。

好適な実施態様では、上記検体は、尿である。

本発明はまた、上記の方法を実施するために使用される、塩およびジアセチルスペルミン類似化合物結合蛋白質を含有する第１試薬、および抗ジアセチルスペルミン抗体結合金コロイドを含有する第２試薬を含むジアセチルスペルミン測定用試薬キットを提供する。

本発明の検体中のジアセチルスペルミンの量を測定する方法は、（ａ）該検体と、塩およびジアセチルスペルミン類似化合物結合蛋白質を含有する第１試薬とを混合する工程、（ｂ）該混合液に抗ジアセチルスペルミン類似化合物抗体結合金コロイドを含有する第２試薬を添加して混合する工程、および（ｃ）該ジアセチルスペルミン類似化合物結合蛋白質と抗ジアセチルスペルミン抗体結合金コロイドの免疫凝集による吸光度変化を、４５０ｎｍ〜５８０ｎｍおよび６２０ｎｍ〜８００ｎｍの二波長で２回以上測定した吸光度変化量より求める工程を含み、この方法によれば、ｎｇ／ｍＬのジアセチルスペルミンが短時間に精度良く測定できる。また、洗浄などの工程が不要であるため、自動化に適している。したがって、本発明の方法は、ジアセチルスペルミン測定の臨床検査分野などでの迅速化および省力化に寄与することができる。

本発明の検体中のジアセチルスペルミンの量を測定する方法は、（ａ）該検体と、塩およびジアセチルスペルミン類似化合物結合蛋白質を含有する第１試薬とを混合する工程、（ｂ）該混合液に、抗ジアセチルスペルミン抗体結合金コロイドを含有する第２試薬を添加して混合する工程、および（ｃ）該ジアセチルスペルミン類似化合物結合蛋白質と抗ジアセチルスペルミン抗体結合金コロイドの免疫反応凝集による吸光度変化を、４５０ｎｍ〜５８０で２回以上測定した吸光度、または、４５０ｎｍ〜５８０ｎｍを主波長および６２０ｎｍ〜８００ｎｍを副波長とする二波長で２回以上測定した吸光度より求める工程を含む。

（検体）
本発明において、測定に供する検体としては、血清、血漿、尿、または髄液などの生体試料、あるいは環境中より得られたサンプルまたはその抽出物などが挙げられる。本発明においては、尿が特に好適である。

（第１試薬）
本発明の方法で使用される第１試薬は、塩およびジアセチルスペルミン類似化合物結合蛋白質を含有する。

本発明において、ジアセチルスペルミン類似化合物結合蛋白質とは、ジアセチルスペルミン類似化合物と免疫原性蛋白質との結合物をいう。ジアセチルスペルミン類似化合物結合蛋白質（結合蛋白質）は、測定対象のジアセチルスペルミンと抗ジアセチルスペルミン抗体に対して競合反応し得るものであれば、ジアセチルスペルミン類似化合物として、どのような物質が蛋白質に結合したものであってもよい。蛋白質と結合させるジアセチルスペルミン類似化合物としては、結合蛋白質中のジアセチルスペルミン相当部分の化学構造が可能な限り本来のジアセチルスペルミンの構造に類似しているものを選択することが望ましい。また、ジアセチルスペルミン類似化合物としては、ジアセチルスペルミンと担体タンパク質との結合に伴って、ジアセチルスペルミン分子の一部が担体分子上の官能基と化学結合を生じることにより、必然的に遊離のジアセチルスペルミンとは一部異なる構造を有するようになった化合物も含む。本発明においては、ジアセチルスペルミン類似化合物として、Ｎ−アセチルスペルミンを用いることが好ましい。また、ジアセチルスペルミン類似化合物結合蛋白質には、蛋白質１分子当たり、４〜４０程度のジアセチルスペルミン類似化合物が結合していることが好ましい。

ジアセチルスペルミン類似化合物結合蛋白質の蛋白質は、ハプテンを結合させるために当該技術分野で通常用いられる免疫原性蛋白質であり、各種動物由来のアルブミン、ヘモシアニン、サイログロブリン、フィブリノーゲン、酵素などから適宜選択される。これらの蛋白質は、天然に存在する形態でジアセチルスペルミン類似化合物を結合させることもできるが、該蛋白質のアミノ酸側鎖の一部を化学修飾して改変蛋白質とした後に、ジアセチルスペルミン類似化合物との結合に供してもよい。本発明においては、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）のリシン残基の側鎖にメルカプトサクシニル基が付加されているメルカプトサクシニルＢＳＡが好ましい。

上記ジアセチルスペルミン類似化合物結合蛋白質は、当業者が通常用いる方法により製造することができる。このような製造方法は、ジアセチルスペルミン類に存在するアミノ基、カルボキシル基またはチオール基などの官能基を利用して、ジアセチルスペルミン類似化合物と蛋白質とを直接または結合剤を介して化学結合させるものであり、ジアセチルスペルミン類似化合物類の構造に応じて種々のものが知られている（生化学実験法１１エンザイムイムノアッセイ、Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｎ著、石川栄治編、２５２頁、１９８９年、東京化学同人）。化学結合を形成させるための試薬としては、アシル化剤、アルキル化剤などが挙げられる。好ましくは、カルボキシル基を活性化することにより得られるＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、弱アルカリ条件下で用いられるマレイミド類などである。本発明においては、Ｎ−アセチルスペルミンの１級アミノ基の部分と二価性架橋剤ＧＭＢＳ（Ｎ−(４−マレイミドブチリルオキシ)スクシンイミド）のエステル部分とをアミド結合させ、生成した付加物のマレイミド部分を利用して、メルカプトサクシニルＢＳＡに結合させることが好ましい。

第１試薬に含有されるジアセチルスペルミン類似化合物結合蛋白質は、反応最終液中に、蛋白質濃度として、５〜３０００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは２０〜５００ｎｇ／ｍＬ、さらに好ましくは３０〜２００ｎｇ／ｍＬ含有される。ジアセチルスペルミン類似化合物結合蛋白質の量が少なすぎると、抗ジアセチルスペルミン抗体結合金コロイドとの凝集反応が生じ難い。一方、ジアセチルスペルミン類似化合物結合蛋白質の量が多すぎると、被測定物質のジアセチルスペルミンとジアセチルスペルミン類似化合物結合蛋白質との競合反応が生じ難い。

第１試薬は、塩も含む。塩としては、塩化ナトリウムや塩化カリウムなどの無機塩類が挙げられる。これらは、単独で用いても、組み合わせて用いてもよい。これらの無機塩類の濃度は、終濃度として、通常０．３〜１０％、好ましくは１〜７％、より好ましくは２〜５％である。塩濃度が０．３％よりも少ないとハプテンとの競合反応が進行し難い。一方、１０％より多すぎると反応抑制が強くなり好ましくない。

また、十分な測定感度が得られるという点において、第１試薬は、凝集促進剤として、平均分子量５，０００から５００，０００の水溶性高分子を含有することが好ましい。含有量は、通常０．０１％〜１０％（Ｗ／Ｖ）、好ましくは０．０１〜５．０％（Ｗ／Ｖ）より好ましくは０．１〜３．０％（Ｗ／Ｖ）、さらに好ましくは１．０〜２．０％（Ｗ／Ｖ）である。水溶性高分子物質としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、デキストラン硫酸、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、ポリアクリル酸、プルランなどが挙げられる。

第１試薬には、ｐＨの維持のために適切な緩衝剤が含有され得る。緩衝剤としては、例えば、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、コハク酸緩衝液、あるいはグリシルグリシン、ＭＥＳ（２−(Ｎ−モノホリノ)エタンスルホン酸）、ＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−ヒドロキシエチル−ピペラジン−Ｎ’−エタンスルホン酸）、ＴＥＳ（Ｎ−トリス(ヒドロキシメチル)メチル−２−アミノエタンスルホン酸）、ＭＯＰＳ（３−(Ｎ−モノホリノ)プロパンスルホン酸）、ＰＩＰＥＳ（ピペラジン−１，４−ビス(２−エタンスルホン酸)）などのグッド緩衝液が好適に用いられる。ｐＨは、好ましくは５．０〜９．０、より好ましくは５．５〜８．０、さらに好ましくは６．０〜７．０である。緩衝剤の使用濃度は、終濃度として、好ましくは１０〜１０００ｍＭ、より好ましくは５０〜４００ｍＭである。

さらに、第１試薬は、アジ化ナトリウム、有機酸類、糖類、アミノ酸類、ＥＤＴＡなどのキレート剤、ＤＴＴなどのＳＨ試薬、各種動物由来のアルブミン、動物血清、γ−グロブリン、ヒトＩｇＧやＩｇＭに対する抗体、非イオンおよびイオン性の界面活性剤などを含有してもよい。これらの添加濃度は適宜選択できる。

（第２試薬）
本発明の方法で使用される第２試薬は、抗ジアセチルスペルミン抗体結合金コロイドを含有する。

上記抗ジアセチルスペルミン抗体結合金コロイドは、金コロイドに抗ジアセチルスペルミン抗体を結合または吸着させたものであり、当業者が通常用いる方法により製造され得る。抗体はそのまま結合させても、化学処理や酵素処理後に結合させてもよい。また、金コロイドと抗ジアセチルスペルミン抗体とは、ビオチン・アビジンのような親和性のある物質や修飾ＰＥＧのような化合物を介して結合してもよい。通常、抗ジアセチルスペルミン抗体を金コロイドに結合させた後、アルブミンなどの蛋白質でブロッキング処理を行う。そのブロッキング剤としては、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）が好ましい。

抗ジアセチルスペルミン抗体は、測定対象のジアセチルスペルミンに対して特異的な免疫反応性を有するものであれば、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれでもよい。通常は、測定対象のジアセチルスペルミン類似化合物と担体との結合物を動物に投与することにより産生させたポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり、ジアセチルスペルミン類似化合物結合蛋白質の蛋白質部分と反応しない抗体である。ジアセチルスペルミン類似化合物結合蛋白質の蛋白質部分と反応する抗体が含まれている場合は、吸着処理などによって除くことができる。また、抗ジアセチルスペルミン抗体が、測定対象のジアセチルスペルミンに類似の化合物と反応し、測定値に影響を及ぼす場合には、その類似化合物と反応する抗体を除くことができる。このような類似化合物としては、例えば、Ｎ^１−アセチルスペルミジン、Ｎ^８−アセチルスペルミジン、Ｎ−アセチルスペルミン、Ｎ^１，Ｎ^８−ジアセチルスペルミジンなどが挙げられる。これらの類似化合物と反応する抗体を除くためには、例えば、各種のポリアミン誘導体を結合させた樹脂を用いた親和性クロマトグラフィーを利用することができる。特に好適な実施態様においては、非特許文献５に記載の方法に準じて、目的の抗体の親和性精製を行うことができる。

抗ジアセチルスペルミン抗体を製造するための上記化合物における担体としては、該化合物が免疫原となり得るものであればいずれでもよく、例えば、蛋白質やポリペプチドなどが挙げられる。具体的には、アルブミン、グロブリン、ヘモシアニン、サイログロブリン、エデスチンなどが挙げられる。その中でも、好ましいのはアルブミンであり、特に好ましいのはＢＳＡである。また、抗ジアセチルスペルミン抗体を製造するためのハプテンと担体との結合物として、上記第１試薬に含有されるジアセチルスペルミン類似化合物結合蛋白質、具体的には、Ｎ−アセチルスペルミンを１級アミノ基の部分で二価性架橋剤の一端にアミド結合させたのち、架橋剤の他端で担体蛋白質と結合させたものも使用され得る。本発明においては、二価性架橋剤としてＧＭＢＳを利用し、そして担体タンパク質として、ＢＳＡのリシン残基をメルカプトサクシニル化したＢＳＡ誘導体を利用することが特に好ましい。

ポリクローナル抗体は、上記のジアセチルスペルミン類似化合物と担体との結合物を抗原として使用し、この結合物を適切なアジュバントと混合して、ウサギ、モルモット、羊、山羊などのヒト以外の動物に非経口的に投与（免疫）し、血清を採取して当業者が通常用いる方法で処理することによって製造し得る。

モノクローナル抗体は、上記のように免疫された動物の脾臓細胞を採取し、当業者が通常用いるミルシュタインらの方法によって、ミエローマ細胞との細胞融合、抗体産生細胞スクリーニング、およびクローニングを行い、抗ジアセチルスペルミン抗体を産生する細胞株を樹立し、これを培養することにより製造することができる。

このようにして得られた抗ジアセチルスペルミン抗体を、上述のように金コロイドに結合または吸着させることにより、抗ジアセチルスペルミン抗体結合金コロイドが得られる。こうして得られた抗ジアセチルスペルミン抗体結合金コロイドは、特定のジアセチルスペルミンおよびジアセチルスペルミン類似化合物結合蛋白質と特異的に結合する。

上記抗ジアセチルスペルミン抗体結合金コロイドは、反応液中での終濃度として、５４０ｎｍ（光路長１ｃｍ）での吸光度が１．５〜３．０となる金コロイド量であることが好ましい。金コロイドはその粒子径によって極大吸収が多少変化するが、５４０ｎｍ付近で極大吸収を示すため、この５４０ｎｍでの吸光度に基づいて金コロイド濃度を規定することができる。より好ましい金コロイド量は、５４０ｎｍでの吸光度で、１．９〜２．８であり、さらに好ましい金コロイド量は２．１〜２．６である。反応液中の抗ジアセチルスペルミン結合金コロイド量が、５４０ｎｍでの吸光度で１．５より少ないと反応が進行し難く、一方、３．０より多いと試薬コストや測定精度面で好ましくない。

第２試薬には、必要に応じて、アジ化ナトリウム、糖類、有機酸類、アミノ酸類、緩衝剤、ＥＤＴＡなどのキレート剤、各種動物由来のアルブミンや界面活性剤などをさらに含有させてもよい。これらの添加濃度は適宜選択できる。

（ジアセチルスペルミン量の測定方法）
本発明の方法による検体中のジアセチルスペルミン量の測定は、検体と上記第１試薬とを混合し、一定の時間後、上記第２試薬を添加して混合し、金コロイドの凝集による吸光度を、４５０ｎｍ〜５８０ｎｍおよび６２０ｎｍ〜８００ｎｍの二波長で２回以上測定し、吸光度変化量を求めることによって行われる。

吸光度の測定は、好ましくは、第２試薬の添加後２分以内に一回目の吸光度測定を行い、一回目の測定より８分以内に二回目の吸光度測定を行って、一回目と二回目との吸光度差を求める。あるいは、第２試薬添加後、２分以内より吸光度測定を開始し、測定開始後８分より短い時間内での吸光度変化（時間当たり）を求めてもよい。検体と第１試薬とを混合してから全ての測定が終了するまでに要する時間は、好ましくは１５分以内であり、より好ましくは１０分以内である。測定温度は、好ましくは２０〜４５℃であり、より好ましくは３０〜４０℃、さらに好ましくは３７℃である。

通常、ジアセチルスペルミン標準品（２濃度以上）を試料と同様の測定操作で測定して検量線を作成し、試料中のジアセチルスペルミン濃度を求める。

（ジアセチルスペルミン測定用試薬キット）
本発明のジアセチルスペルミン測定用試薬キットは、塩およびジアセチルスペルミン類似化合物結合蛋白質を含有する第１試薬、および抗ジアセチルスペルミン抗体結合金コロイドを含有する第２試薬を含む。第２試薬中の抗ジアセチルスペルミン抗体結合金コロイドは、好ましくは、終濃度として５４０ｎｍでの吸光度が１．５〜３．０となるように含まれる。また、本発明のジアセチルスペルミン測定用試薬キットは、検量線作成用のジアセチルスペルミンの標準品を含んでいてもよい。本発明のジアセチルスペルミン測定用測定キットは、上記測定方法において使用することが好ましく、特に好ましくは、尿中ジアセチルスペルミンの測定に使用される。

以下、実施例に基づいて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。なお、以下の実施例において、％は、特に記載がない限り、Ｗ／Ｖ％を表す。

実施例１：アセチルスペルミン結合ＢＳＡの調製
アセチルスペルミン結合ＢＳＡは、非特許文献５に記載の方法に準じて作製した。まず、担体蛋白質であるＢＳＡ２００ｍｇとＳ−アセチルメルカプト無水コハク酸１５ｍｇとを０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中で混合し、室温で３０分間攪拌して、Ｓ−アセチルメルカプトコハク酸(ＡＭＳ)−ＢＳＡ複合体を作製した。これとは別に、二価性架橋試薬であるＧＭＢＳ４５ｍｇとＮ−アセチルスペルミン・３塩酸塩１４７ｍｇとをテトラヒドロフラン／５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）（１：１（ｖ／ｖ））中で室温にて３０分間混合して、アセチルスペルミン−ＧＭＳ結合物を作製した。次いで、ＡＭＳ−ＢＳＡ２００ｍｇにヒドロキシルアミン塩酸塩４．２ｍｇを加え、メルカプトスクシニル−ＢＳＡ（ＭＳ−ＢＳＡ）とした。次いで、アセチルスペルミン−ＧＭＢ結合物とＭＳ−ＢＳＡとを混合して、Ｎ−アセチルスペルミンがアシルアミド結合した免疫抗原アセチルスペルミン−ＧＭＢ−ＢＳＡを作製した。このようにしてアセチルスペルミンを担体にアシルアミド結合させることにより、ジアセチルスペルミン類似化合物を側鎖として多数持つ免疫抗原を作製した。

アセチルスペルミン結合ＢＳＡの濃度は、１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ溶液の２８０ｎｍにおける吸光度（光路長１ｃｍ）、Ａ_２８０を０．６６として、Ａ_２８０値に基づいて算出した。

実施例２：抗ジアセチルスペルミン抗体の調製
（抗体作成）
上記実施例１で得たアセチルスペルミン結合ＢＳＡとアジュバント（初回免疫：コンプリートアジュバント、追加免疫：インコンプリートアジュバント）とを等量混和したエマルジョンを、ウサギ（New Zealand White種）背部皮下に注射することにより免疫を行った。初回免疫は１ｍｇ／羽で、そして追加免疫は１ｍｇ／羽の投与量で２週間おきに５〜６回行った。

（抗体精製）
上記の方法で免疫したウサギから採血し、得られた抗血清から、段階的な親和性精製によって高度にジアセチルスペルミン特異的な抗体を分画精製した。親和性精製については、非特許文献５に記載の方法に準じた。すなわち、抗血清をＮ^１−アセチルスペルミン結合カルボキシトヨパールに吸着させ、樹脂に吸着する成分を溶出・回収し、この成分をさらにＮ^８−アセチルスペルミジン結合カルボキシトヨパールに吸着させ、この樹脂に吸着しない成分を溶出し、部分精製抗体を得た。次いで、得られた部分精製抗体を、再度アセチルスペルミン結合カルボキシトヨパールに吸着させ、２ｍＭのＮ^１−アセチルスペルミジンを添加してもなお溶出されず、アセチルスペルミン結合カルボキシトヨパールに吸着したまま残留する成分を回収して精製抗体とした。この抗体は、ジアセチルスペルミンの類似物質として尿中に約３０倍も多く存在して尿中ジアセチルスペルミンの定量を妨害する可能性があるＮ^１−アセチルスペルミジンとの交差反応性が０．１％以下であった。

実施例３：金コロイド液の調製
９５℃の蒸留水１Ｌに１０％塩化金酸溶液２ｍＬを攪拌しながら加え、１分後に２％クエン酸ナトリウム溶液１０ｍＬを加え、さらに２０分間攪拌した後３０℃に冷却した。冷却後、０．１Ｍ炭酸カリウム溶液でｐＨ７．１に調節した。

実施例４：第１試薬の調製
上記実施例１で調製したジアセチルスペルミン結合ＢＳＡ、塩化ナトリウム、およびポリエチレングリコール２００００（ＰＥＧ）をそれぞれ種々の濃度で含む、０．２％ＥＤＴＡ、０．３％トリトンＸ−１００、０．１％ＢＳＡ、０．５％ウサギ血清、および０．１％アジ化ナトリウムを含む２００ｍＭＭＥＳ（ｐＨ６．２）を調製し、アセチルスペルミン結合ＢＳＡの濃度、塩化ナトリウム濃度、およびＰＥＧ濃度がそれぞれ異なる種々の第１試薬を調製した。

実施例５：抗ジアセチルスペルミン抗体結合金コロイド試薬（第２試薬）の調製
上記実施例２で調製した抗ジアセチルスペルミン抗体を、０．０５％アジ化ナトリウムを含む１０ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．１）で希釈し、４０μｇ／ｍＬの濃度にした。この液１００ｍＬを上記実施例３で調製した金コロイド液１Ｌに加え、冷蔵下で２時間攪拌した。この混合物に、５．４６％マンニトール、０．５％ＢＳＡ、および０．０５％アジ化ナトリウムを含む１０ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．１）を１１０ｍＬ添加し、３７℃で９０分間攪拌し、８，０００回転で４０分間遠心分離し、上清を除去した。得られた残渣に、３％マンニトール、０．１％ＢＳＡ、および０．０５％アジ化ナトリウムを含む５ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）（Ａ溶液）を約１Ｌ加え、抗体結合金コロイドを分散させた後、８，０００回転で４０分間遠心分離し、上清を除去した。残渣をＡ溶液に分散させ、この抗ジアセチルスペルミン抗体結合金コロイドの分散液を精製水で３０倍希釈したときに５４０ｎｍでの吸光度が１．０となるようにＡ溶液を添加し、抗体結合金コロイド原液とした。

さらに、抗体結合金コロイド原液をＡ溶液で希釈して、種々の抗体結合金コロイド濃度を有する抗ジアセチルスペルミン抗体結合金コロイド試薬を調製した。

実施例６：ジアセチルスペルミン添加尿の調製
ジアセチルスペルミン１ｍｇ／ｍＬを健常人ヒト尿で希釈し、種々の濃度のジアセチルスペルミンを含有する尿を調製した。

実施例７：第１試薬および第２試薬における各成分の濃度の検討
本実施例においては、第１試薬および第２試薬における各成分の濃度の検討を以下のように行った。まず、上記実施例６で調製したジアセチルスペルミン添加尿検体２０μＬおよび上記実施例４の第１試薬２００μＬを混合・攪拌し、３７℃で約５分加温した。次いで、上記実施例５で調製した第２試薬５０μＬを添加・攪拌した後、日立７０７０形自動分析装置により主波長５４６ｎｍおよび副波長６６０ｎｍで測光ポイント１８から３１の二ポイント測定を行って、二ポイント間の吸光度差を求めた。測定時間は約１０分間であった。

（塩濃度およびＰＥＧ濃度についての検討）
５０ｎｇ／ｍＬのアセチルスペルミン結合ＢＳＡを含む第１試薬中の塩として、塩化ナトリウムを０％〜７％の間で変化させ、尿中ジアセチルスペルミンを測定したときの吸光度変化を検討した。結果を表１に示す。なお、このとき、第１試薬中のＰＥＧ濃度は１．６％または１．８％であり、アセチルスペルミン結合ＢＳＡ量は５０ｎｇ／ｍＬであり、そして第２試薬中の抗ジアセチルスペルミン抗体結合金コロイドの測定液中での吸光度は（５４０ｎｍ（光路長１ｃｍ））は２．２２であった。

塩化ナトリウム濃度が０％の場合は、ジアセチルスペルミン濃度に依存した吸光度変化が認められず、測定できなかった。塩化ナトリウム濃度が１％〜５％と増加するに従って、ジアセチルスペルミンが０Ｍのときの吸光度差が小さくなった。塩化ナトリウム濃度が６％および７％の場合は、ＰＥＧ濃度を１．８％にすることにより、ジアセチルスペルミンが０Ｍのときの吸光度差が大きくなった。このように、塩濃度が高すぎると、抗原抗体反応が抑制されるため、凝集促進のためにＰＥＧなどの水溶性高分子物質を多く使用する必要が生じ、さらに好ましい塩濃度および好ましいＰＥＧ（水溶性高分子物質）濃度の厳密な設定が必要であった。これらのことから、塩化ナトリウム濃度が約２％の場合、ジアセチルスペルミン濃度に依存して明瞭に吸光度差が変化することがわかった。

（抗ハプテン抗体結合金コロイド量についての検討）
２％の塩化ナトリウム、１．６％のＰＥＧ、および１００ｎｇ／ｍＬのアセチルスペルミン結合ＢＳＡを含む第１試薬を用い、そして測定液における５４０ｎｍ（光路長１ｃｍ）の吸光度が１．５〜３．０となるような量で抗ハプテン抗体結合金コロイド（抗ジアセチルスペルミン抗体結合金コロイド）を含む第２試薬を用いて、尿中ジアセチルスペルミンを測定した。結果を表２に示す。

ジアセチルスペルミンが０Ｍのときの吸光度差が、抗ジアセチルスペルミン抗体結合金コロイド量の増加に従って大きくなった。金コロイド量が少ない場合は、ジアセチルスペルミン濃度に依存的な吸光度差の変化（競合反応の進行）が小さいため好ましくない。金コロイド量が多い場合は使用可能であるが、試薬のコストや測定精度の面で好ましくない。これらの結果から、第２試薬中の金コロイド量は、測定液における５４０ｎｍ（光路長１ｃｍ）の吸光度が約２．５となる場合が好適であることがわかった。

（ジアセチルスペルミン類似化合物結合蛋白質の量についての検討）
第１試薬中の競合物質であるハプテン結合蛋白質（アセチルスペルミン結合ＢＳＡ）量を５０ｎｇ／ｍＬ〜２００ｎｇ／ｍＬまで変化させて、尿中ジアセチルスペルミンを測定した。結果を表３に示す。このときの抗ジアセチルスペルミン抗体結合金コロイド量は、測定反応液中で５４０ｎｍ（光路長１ｃｍ）の吸光度が２．５となる濃度であった。

アセチルスペルミン結合ＢＳＡ量に依存して、ジアセチルスペルミンが０Ｍのときの吸光度差が大きくなったが、いずれの濃度においても尿中ジアセチルスペルミン濃度に応じた吸光度差の低下が認められ、測定可能であることがわかった。

実施例８：尿中ジアセチルスペルミンの測定
１００ｎｇ／ｍＬのアセチルスペルミン結合ＢＳＡ、２％の塩化ナトリウム、および１．８％のＰＥＧを含む第１試薬と、測定反応液中で５４０ｎｍ（１ｃｍ）の吸光度が２．５となる濃度の抗ジアセチルスペルミン抗体結合金コロイドを含む第２試薬とを用いて、尿中ジアセチルスペルミンを測定した。結果を図１に示す。図１から明らかなように、尿中ジアセチルスペルミン濃度に応じた吸光度差の低下が認められた。このように、ジアセチルスペルミンをｎｇ／ｍＬからμｇ／ｍＬまでの範囲で測定できることがわかった。

本発明の方法によれば、ｎｇ／ｍＬからμｇ／ｍＬまでの範囲のジアセチルスペルミンが短時間に精度良く測定できる。また、洗浄などの工程が不要であるため、自動化に適している。したがって、本発明の方法は、ジアセチルスペルミン測定の臨床検査分野などでの迅速化および省力化に寄与することができる。さらに、ジアセチルスペルミンは、腫瘍マーカーとしてだけではなく、悪性腫瘍の治療効果の判定や予後予測の指標としても期待されているため、本発明の方法は、臨床検査分野において非常に有用であり得る。

尿中ジアセチルスペルミンの濃度と本発明の方法によって測定した吸光度差との関係を示すグラフである。

Claims

検体中のジアセチルスペルミンの量を測定する方法であって、（ａ）該検体と、第１試薬とを混合する工程であって、該第１試薬が、終濃度として、１〜５Ｗ／Ｖ％の塩および２０〜５００ｎｇ／ｍＬのジアセチルスペルミン類似化合物結合蛋白質を含有し、そして、該塩が、塩化ナトリウムおよび塩化カリウムから選択される少なくとも１種である工程、（ｂ）該混合液に抗ジアセチルスペルミン抗体結合金コロイドを含有する第２試薬を添加して混合する工程、および（ｃ）該ジアセチルスペルミン類似化合物結合蛋白質と該抗ジアセチルスペルミン抗体結合金コロイドの免疫反応凝集による吸光度変化を、４５０〜５８０ｎｍで２回以上測定した吸光度、または、４５０ｎｍ〜５８０ｎｍを主波長および６２０ｎｍ〜８００ｎｍを副波長とする二波長で２回以上測定した吸光度より求める工程を含む、方法。
前記工程（ａ）から（ｃ）が１５分以内で行われる、請求項１に記載の方法。
前記第１試薬が、終濃度として、１０〜１０００ｍＭの緩衝剤を含有する、請求項１または２に記載の方法。
前記ジアセチルスペルミン類似化合物結合蛋白質がアセチルスペルミン結合ウシ血清アルブミンである、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
前記第１試薬が、平均分子量５，０００から５００，０００の水溶性高分子物質を０．０１Ｗ／Ｖ％〜１０Ｗ／Ｖ％含有する、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
前記抗ジアセチルスペルミン抗体結合金コロイドの抗ジアセチルスペルミン抗体が、アセチルスペルミン結合ウシ血清アルブミンを動物に投与することによって生成されたポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり、そして前記ジアセチルスペルミン類似化合物結合蛋白質の蛋白質部分と反応しない、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
前記検体が、尿である、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
請求項１から７のいずれか１項に記載の方法を実施するために使用される、ジアセチルスペルミン類似化合物結合蛋白質を含有する第１試薬、および抗ジアセチルスペルミン抗体結合金コロイドを含有する第２試薬を含む、ジアセチルスペルミン測定用試薬キットであって、該第１試薬が、終濃度として、１〜５Ｗ／Ｖ％の塩および２０〜５００ｎｇ／ｍＬのジアセチルスペルミン類似化合物結合蛋白質を含有し、そして、該塩が、塩化ナトリウムおよび塩化カリウムから選択される少なくとも１種である、キット。