JP4315257B2 - Novel chondroitin sulfate proteoglycan, its core protein, DNA encoding it and antibody to it - Google Patents
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Description
本発明は、新規なコンドロイチン硫酸プロテオグリカン、そのコア蛋白質、それをコードするDNAおよびそれに対する抗体に関する。 The present invention relates to a novel chondroitin sulfate proteoglycan, a core protein thereof, a DNA encoding the same, and an antibody thereto.
プロテオグリカンはグリコサミノグリカンが共有結合的に蛋白質(コア蛋白質)に結合した化合物の総称である。それらは細胞表面と細胞外空間に局在し、ケモトロフィック(chemotrophic)因子、細胞接着分子さらには細胞外マトリックス糖タンパク質(非特許文献1、2)等に結合することによって体細胞上でさまざまな調節効果をもつと推定されている。
Proteoglycan is a general term for compounds in which glycosaminoglycan is covalently bound to a protein (core protein). They are localized on the cell surface and in the extracellular space, and various on somatic cells by binding to chemotrophic factors, cell adhesion molecules, and extracellular matrix glycoproteins (Non-patent
また哺乳動物の脳のタンパク質についての最近の生化学的研究において、脳の発生過程で様々なプロテオグリカンが正確に調節されて発現することが明らかにされた(非特許文献3、4)。このようなプロテオグリカンの分子発生学的に調節された発現は神経膠繊維(非特許文献5)、視覚システム(非特許文献6)、そして大脳皮質のバレル(barrel)システム(非特許文献7−9)のような脳中のいくつかの複雑な構造形成に関与している。インビトロでの研究で、同様に神経系プロテオグリカンがたとえば軸索発生におけるニューロンの形態形成に関与することが示された。このプロテオグリカンはインビトロでの軸索の成長におけるポジテイブ(非特許文献10、11)とネガテイブ(非特許文献12−15)の両方の効果に関与する。
In addition, recent biochemical studies on mammalian brain proteins revealed that various proteoglycans are accurately regulated and expressed during brain development (Non-Patent
神経系プロテオグリカンの機能については、他の体細胞におけるコア蛋白質の一次構造が明らかにされてきているのでそれに伴って様々なことが明らかになってきている。そのような研究の進展の成果として、多くのプロテオグリカンのコア蛋白質が似たような配列モチーフを有しており、いくつかのファミリーにグループ化できることを明らかにされた。ニューロカン(Neurocan)(非特許文献16)、ブレビカン(brevican)(非特許文献17)、バーシカン(versican)(非特許文献18)そしてBEHAB(非特許文献19)は可溶性コンドロイチン硫酸プロテオグリカンファミリーのメンバーである。これらの配列はヒアルロン酸結合ドメインのタンデム繰り返し構造を含んでいる。N−シンデカン(N-syndecan)(非特許文献20)は多くの似たような膜貫通ドメインと細胞質ドメインを含むヘパラン硫酸プロテオグリカンであるシンデカンファミリーのメンバーである。さらに最近、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンであるフォスファカン(phosphacan)/6B4プロテオグリカンが受容体様タンパク質であるチロシンフォスファターゼ、RPTPβ/ζ(非特許文献21、22)の細胞質外性変異体であることが明らかにされた。 Regarding the function of nervous system proteoglycans, the primary structure of the core protein in other somatic cells has been elucidated, and various things have been elucidated accordingly. As a result of such research progress, it has been clarified that many proteoglycan core proteins have similar sequence motifs and can be grouped into several families. Neurocan (Non-patent document 16), brevican (Non-patent document 17), versican (Non-patent document 18) and BEHAB (Non-patent document 19) are members of the soluble chondroitin sulfate proteoglycan family. is there. These sequences contain a tandem repeat structure of the hyaluronic acid binding domain. N-syndecan (Non-Patent Document 20) is a member of the syndecan family, a heparan sulfate proteoglycan that contains many similar transmembrane and cytoplasmic domains. More recently, it has been clarified that phosphacan / 6B4 proteoglycan, a chondroitin sulfate proteoglycan, is an extracytoplasmic variant of the receptor-like protein tyrosine phosphatase, RPTPβ / ζ (Non-patent Documents 21 and 22). .
前記したように最近多数のコア蛋白質の一次構造が報告されてきた。しかしながら、脳においては多くのプロテオグリカンがまだ未同定のままである。ラット脳の膜結合分画において少なくとも16種類のコア蛋白質があるが(非特許文献4)、わずかに3種類の膜結合型プロテオグリカンの完全な一次構造が報告されているのみである。つまりNG2(非特許文献23)、グリピカン(glypican)(非特許文献24)そしてセレブログリカン(cerebroglycan)(非特許文献25)である。
新規のプロテオグリカンを発見し精製、同定することは、脳研究の進展をもたらし、脳疾患の新規の診断方法の確立、脳疾患の新規の治療方法および予防方法の開発につながる。とくに本発明の膜結合型新規プロテオグリカンは神経の軸索発生に関与しこれらを通じて神経系形態形成に関与していると推定される。本発明者らは、このような脳の新規なプロテオグリカンの探索を行ない、新規なプロテオグリカンを見出した。従って、本発明の課題は、脳における新規なプロテオグリカンを発見し、精製そして同定し、これを提供することである。さらに、本発明の課題は、このような新規プロテオグリカンの発見のためには、ツールとしての脳に特異的な膜結合型プロテオグリカンに対する抗体の作成が必要とされており、このような抗体を提供することにある。またさらに本発明のプロテオグリカン又は蛋白質をコードするDNAを提供することにある。 The discovery, purification, and identification of new proteoglycans will lead to progress in brain research, leading to the establishment of new diagnostic methods for brain diseases, and the development of new methods for treating and preventing brain diseases. In particular, the novel membrane-bound proteoglycan of the present invention is presumed to be involved in neuronal axon development and through these, to be involved in nervous system morphogenesis. The present inventors searched for a novel proteoglycan in the brain and found a novel proteoglycan. The object of the present invention is therefore to discover, purify and identify and provide new proteoglycans in the brain. Furthermore, the object of the present invention is to create an antibody against a membrane-bound proteoglycan specific to the brain as a tool for the discovery of such a novel proteoglycan, and provides such an antibody. There is. Furthermore, it is providing the DNA which codes the proteoglycan or protein of this invention.
本発明者らは前記課題を解決するために、最初に新規のプロテオグリカンの分離同定を試みた。次いで分離した新規プロテオグリカンに対する抗体作成を試み、得られた抗体を利用して前記新規プロテオグリカンに対するcDNAを得、全遺伝子構造を解析した後このコンドロイチン硫酸プロテオグリカンが脳に特異的なものであることを確認し、本発明を完成させるに至った。 In order to solve the above problems, the present inventors first tried to isolate and identify a new proteoglycan. Next, an attempt was made to create an antibody against the isolated new proteoglycan. Using the obtained antibody, cDNA for the new proteoglycan was obtained, and after analyzing the entire gene structure, it was confirmed that the chondroitin sulfate proteoglycan was specific to the brain. As a result, the present invention has been completed.
本発明の新規コンドロイチン硫酸プロテオグリカンは神経回路網の正常な形成に寄与すると考えられるので神経疾患等の新規診断法の開発、神経疾患等の予防や治療に用いることができる。 Since the novel chondroitin sulfate proteoglycan of the present invention is thought to contribute to the normal formation of neural networks, it can be used for the development of new diagnostic methods for neurological diseases and the prevention and treatment of neurological diseases.
次に、本発明を詳細に説明する。
<1>本発明のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの抽出と部分精製以下の方法で新規コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの抽出を行うことができる。哺乳動物(例えばラット等)の脳をタンパク質分解酵素阻害剤(例えば2mMフェニルメチルスルフォニルフルオライド等)、金属キレート剤(例えば20mM エチレンジアミン四酢酸(EDTA)等)及び還元剤(例えば10mM N−エチルマレイミド等)を含む緩衝液(例えばリン酸緩衝食塩水(PBS)等)でホモジナイザー等を用いてホモジナイズし、ホモジネートは高速遠心等を行い、不溶性物質を得る(再度ホモジネーションと高速遠心等を繰り返してもよい)。この不溶性物質をタンパク質分解酵素阻害剤と界面活性剤(例えばトリトン系界面活性剤(ノニデットP−40(商品名)等)等)を含む緩衝液中でホモジナイズした後、遠心等を行なって上清としてコンドロイチン硫酸プロテオグリカン粗画分が得られる。
Next, the present invention will be described in detail.
<1> Extraction and partial purification of chondroitin sulfate proteoglycan of the present invention A novel chondroitin sulfate proteoglycan can be extracted by the following method. A mammalian (eg, rat) brain is transformed into a proteolytic enzyme inhibitor (eg, 2 mM phenylmethylsulfonyl fluoride), a metal chelator (eg, 20 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)) and a reducing agent (eg, 10 mM N-ethylmaleimide). Etc.) with a buffer solution (for example, phosphate buffered saline (PBS), etc.) using a homogenizer, etc., and the homogenate is subjected to high-speed centrifugation, etc. to obtain insoluble substances (repeat homogenization and high-speed centrifugation, etc. again). Also good). This insoluble substance is homogenized in a buffer solution containing a protease inhibitor and a surfactant (for example, Triton-based surfactant (Nonidet P-40 (trade name), etc.)), and then centrifuged to obtain a supernatant. As a result, a crude chondroitin sulfate proteoglycan fraction is obtained.
このようにして得られたコンドロイチン硫酸プロテオグリカン粗画分よりコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの部分精製を行うことができる。すなわち該粗画分をそのまま又は凍結乾燥等の後、界面活性剤(例えばトリトン系界面活性剤(ノニデットP−40(商品名)等)等)、金属キレート剤(例えばEDTA等)、還元剤(例えばN−エチルマレイミド等)及び蛋白質分解酵素阻害剤(例えばフェニルメチルスルフォニルフルオライド等)を含む高濃度尿素液(例えば4M尿素)を含む緩衝液(尿素緩衝液)の適量に分散する。その後同尿素緩衝液で透析する。高速遠心(例えば27,000g,30分間)後、上清を尿素緩衝液で平衡化した陰イオン交換樹脂(例えばDEAEセファセル等)と混合する。該陰イオン交換樹脂を常法に従って回収し、カラムに詰め、尿素緩衝液中で食塩の濃度勾配(例えば 0.1Mから 0.7Mへの直線濃度勾配)によってコンドロイチン硫酸プロテオグリカンを溶出する。プロテオグリカン画分(0.45から0.68M NaClの濃度で溶出される画分)を集め、常法に従って(例えば限外濾過等)、濃縮する。濃縮試料について次にセファロースCL−4B(ファルマシア製)等のゲル濾過剤を用いてゲル濾過クロマトグラフを行う。 From the obtained chondroitin sulfate proteoglycan crude fraction, partial purification of chondroitin sulfate proteoglycan can be performed. That is, the crude fraction is used as it is or after freeze-drying, and then a surfactant (for example, Triton surfactant (Nonidet P-40 (trade name) etc.) etc.), metal chelating agent (eg EDTA etc.), reducing agent ( For example, N-ethylmaleimide etc.) and a buffer solution (urea buffer solution) containing a high concentration urea solution (eg 4M urea) containing a protease inhibitor (eg phenylmethylsulfonyl fluoride etc.) are dispersed. Then dialyze against the same urea buffer. After high-speed centrifugation (for example, 27,000 g, 30 minutes), the supernatant is mixed with an anion exchange resin (for example, DEAE Sephacel) equilibrated with urea buffer. The anion exchange resin is collected according to a conventional method, packed in a column, and chondroitin sulfate proteoglycan is eluted in a urea buffer solution by a salt concentration gradient (for example, a linear concentration gradient from 0.1 M to 0.7 M). The proteoglycan fraction (the fraction eluted at a concentration of 0.45 to 0.68 M NaCl) is collected and concentrated according to a conventional method (for example, ultrafiltration). Next, the gel sample is subjected to gel filtration chromatography using a gel filter agent such as Sepharose CL-4B (Pharmacia).
コンドロイチン硫酸プロテオグリカン画分(Kavは0.11から0.65)を集め、常法で濃縮(例えば限外濾過等)する。プロテオグリカンを酢酸カリウム(例えば約 1.3%(w/v)を含むエタノール水溶液(例えば約95%濃度のエタノール)の添加によって溶液から沈澱させる。沈澱物は氷冷下、酢酸カリウム(例えば1%(W/V))を含むエタノール水溶液(例えば約75%エタノール)で洗浄し、減圧乾燥する。乾燥物を適量のグアニジン塩酸(好ましくは4M)を含む緩衝液(グアニジン緩衝液)等に溶解し、オクチルセファロース等を用いて疎水クロマトグラフィーを行い、界面活性剤(例えばトリトン系界面活性剤(ノニデットP−40(商品名)等)等)の濃度勾配によって溶出する。コンドロイチン硫酸プロテオグリカン画分(例えばノニデットP−40の場合 0.3%から 0.6%のノニデットP−40濃度の画分)を集め、上述したようにエタノール等で沈澱し、乾燥する。こうして得たコンドロイチン硫酸プロテオグリカンは、グアニジン緩衝液中で塩化セシウム(CsCl)密度勾配遠心法(例えば初期密度1.38g/ml)によって常法に従い遠心(例えば150,000Xg で30時間)してさらに精製してもよい。こうして精製されたコンドロイチン硫酸プロテオグリカンを得ることができる。こうして得られるコンドロイチン硫酸プロテオグリカンはドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)で還元条件下において約150キロダルトン(kDa)のバンドを形成する。 The chondroitin sulfate proteoglycan fraction (Kav is 0.11 to 0.65) is collected and concentrated by a conventional method (for example, ultrafiltration or the like). Proteoglycans are precipitated from solution by the addition of aqueous potassium acetate (eg, about 1.3% (w / v) ethanol aqueous solution (eg, about 95% strength ethanol)) under ice cooling with potassium acetate (eg, 1% (W / V)), and then dried under reduced pressure.The dried product is dissolved in a buffer solution (guanidine buffer solution) containing an appropriate amount of guanidine hydrochloride (preferably 4M) and octyl. Hydrophobic chromatography is performed using sepharose, etc., and elution is performed with a concentration gradient of a surfactant (for example, Triton surfactant (Nonidet P-40 (trade name), etc.) etc.) Chondroitin sulfate proteoglycan fraction (for example, Nonidet P) In the case of -40, fractions of 0.3% to 0.6% nonidet P-40 concentration) were collected and The chondroitin sulfate proteoglycan thus obtained is centrifuged (for example, 150,000 × g) in a guanidine buffer by a cesium chloride (CsCl) density gradient centrifugation (for example, an initial density of 1.38 g / ml) according to a conventional method. The purified chondroitin sulfate proteoglycan can be obtained in this manner by using sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) under reducing conditions. A band of about 150 kilodaltons (kDa) is formed below.
また本発明により、本発明のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコア蛋白質のアミノ酸配列が明らかにされたので、アミノ酸からコア蛋白質を合成し、当該コア蛋白質に糖鎖を共有結合させることによっても本発明のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンを得ることができる。また本発明により、本発明のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコア蛋白質をコードするDNAの塩基配列が明らかにされたので、このDNAから当該コア蛋白質を発現させ、発現させて得られるコア蛋白質に糖鎖を共有結合させることによっても本発明のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンを得ることができる。 Further, since the amino acid sequence of the core protein of the chondroitin sulfate proteoglycan of the present invention has been clarified by the present invention, the chondroitin sulfate of the present invention can also be synthesized by synthesizing the core protein from the amino acid and covalently binding the sugar chain to the core protein. Proteoglycans can be obtained. In addition, since the base sequence of the DNA encoding the core protein of the chondroitin sulfate proteoglycan of the present invention has been clarified by the present invention, the core protein is expressed from this DNA, and the sugar chain is shared with the core protein obtained by the expression. The chondroitin sulfate proteoglycan of the present invention can also be obtained by binding.
<2>コア蛋白質の精製
次にコア蛋白質は、部分的に前田ら(非特許文献22)によって記述されたプロテオグリカン型蛋白質であるチロシンホスファターゼの部分精製のために使われた方法に従って精製することができる。すなわち、哺乳動物全脳から調製した核除去分画を1%CHAPS等で可溶化する。可溶化したものはDEAE−樹脂(例えばDEAEトヨパール)等の陰イオン交換樹脂のカラムに負荷し常法によって、高濃度食塩(例えば約 0.6M)溶液等で溶出する。続いてCsCl密度勾配遠心にて分画する。得られた分画をコンドロイチナーゼABCで消化し、SDS−PAGE(例えば6%ポリアクリルアミド等)等によって分離しコア蛋白質を得ることができる。こうして得られたコア蛋白質は還元条件下のSDS−PAGE法で120kDaのバンドを形成する。またこのコア蛋白質はウエスタンブロットを用いて、後述の新規のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンを認識するモノクローナル抗体によって認識される。また本発明により、本発明のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコア蛋白質のアミノ酸配列が明らかにされたので、アミノ酸からコア蛋白質を合成することもできる。また本発明により、本発明のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコア蛋白質をコードするDNAの塩基配列が明らかにされたので、このDNAから当該コア蛋白質を発現させ、コア蛋白質を得ることもできる。
<2> Purification of core protein Next, the core protein can be partially purified according to the method used for partial purification of tyrosine phosphatase, a proteoglycan type protein described by Maeda et al. (Non-patent Document 22). it can. That is, the nuclear removal fraction prepared from the whole mammalian brain is solubilized with 1% CHAPS or the like. The solubilized product is loaded onto a column of an anion exchange resin such as DEAE-resin (for example, DEAE Toyopearl) and eluted with a high-concentration sodium chloride (for example, about 0.6 M) solution by a conventional method. Subsequently, fractionation is performed by CsCl density gradient centrifugation. The obtained fraction can be digested with chondroitinase ABC and separated by SDS-PAGE (for example, 6% polyacrylamide etc.) to obtain the core protein. The core protein thus obtained forms a 120 kDa band by SDS-PAGE under reducing conditions. This core protein is recognized by a monoclonal antibody that recognizes a novel chondroitin sulfate proteoglycan described later using Western blot. Moreover, since the amino acid sequence of the core protein of the chondroitin sulfate proteoglycan of the present invention has been clarified by the present invention, the core protein can also be synthesized from the amino acid. Moreover, since the base sequence of DNA encoding the core protein of the chondroitin sulfate proteoglycan of the present invention has been clarified by the present invention, the core protein can be expressed from this DNA to obtain the core protein.
<3>本発明の抗体の製造
本発明の抗体は、本発明のプロテオグリカンおよび本発明の蛋白質の両者あるいはどちらか一方と結合する抗体であり、ポリクローナル、モノクローナルのいずれでもよい。本発明の抗体は、上記のようにして製造された本発明のプロテオグリカンもしくはそのコア蛋白質またはこれらと他の蛋白質との融合蛋白質を抗原として、常法に従って例えば以下のように作製することが可能である。ポリクローナルな本発明の抗体は、例えばマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ等の被免疫動物を上記抗原で免疫し、これらの動物から血清を採取することによって得ることができる。被免疫動物を免疫する際に、補助剤(アジュバント)を併用することは、抗体産生細胞を賦活するので望ましい。得られた抗血清から、常法によってイムノグロブリン分画を精製してもよい。
<3> Production of Antibody of the Present Invention The antibody of the present invention is an antibody that binds to either or both of the proteoglycan of the present invention and the protein of the present invention, and may be either polyclonal or monoclonal. The antibody of the present invention can be prepared according to a conventional method, for example, as described below, using the proteoglycan of the present invention produced as described above or a core protein thereof or a fusion protein of these and other proteins as an antigen. is there. The polyclonal antibody of the present invention can be obtained, for example, by immunizing an immunized animal such as mouse, rat, guinea pig, rabbit, goat or sheep with the above antigen, and collecting serum from these animals. When immunizing an animal to be immunized, it is desirable to use an adjuvant (adjuvant) in combination because it activates antibody-producing cells. The immunoglobulin fraction may be purified from the obtained antiserum by a conventional method.
モノクローナルな本発明の抗体は、例えば次のようにして得られる。すなわち、上記抗原をマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ等の被免疫動物の腹腔内、皮下、足蹠(footpad)に投与した後に脾臓又は膝窩リンパ節を摘出し、これらから採取した細胞と腫瘍細胞株であるミエローマ細胞とを細胞融合させてハイブリドーマを樹立し、得られたハイブリドーマを連続増殖させ、さらに得られたハイブリドーマからの本発明のプロテオグリカンまたは本発明の蛋白質に対する特異抗体を継続的に産生する細胞株を選別する。こうして選別された株を好適な培地で培養することによって、培地中にモノクローナルな本発明の抗体が得られる。あるいは、マウスの腹腔などの生体内にて前記ハイブリドーマを培養することによって、モノクローナルな本発明の抗体を大量に製造することができる。細胞融合に用いる細胞としては、脾細胞以外にリンパ節細胞および末梢血中のリンパ細胞等を用いることができる。また、ミエローマ細胞株は、異種細胞種由来のものに比べ同種細胞種由来のものが望ましく、安定な抗体産生ハイブリドーマを得ることができる。 The monoclonal antibody of the present invention can be obtained, for example, as follows. That is, after the above antigen was administered intraperitoneally, subcutaneously, or footpad of an immunized animal such as mouse, rat, guinea pig, rabbit, goat, sheep, etc., the spleen or popliteal lymph node was removed and collected from these Cells and tumor cell lines, myeloma cells, are fused to establish hybridomas, the resulting hybridomas are continuously grown, and the resulting hybridomas continue to have specific antibodies to the proteoglycans of the present invention or the proteins of the present invention. Selective cell lines. By culturing the strain thus selected in a suitable medium, the antibody of the present invention which is monoclonal in the medium can be obtained. Alternatively, a large amount of the monoclonal antibody of the present invention can be produced by culturing the hybridoma in a living body such as the abdominal cavity of a mouse. As cells used for cell fusion, lymph node cells and lymphocytes in peripheral blood can be used in addition to spleen cells. The myeloma cell line is preferably derived from the same cell type as compared to that derived from a heterogeneous cell type, and a stable antibody-producing hybridoma can be obtained.
得られたポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の精製法としては、硫酸ナトリウム、硫酸アンモニウム等による塩析、低温アルコール沈殿およびポリエチレングリコールまたは等電点による選択的沈殿分別法、電気泳動法、DEAE(ジエチルアミノエチル)−誘導体、CM(カルボキシメチル)−誘導体等のイオン交換体を用いたイオン交換クロマトグラフィー、プロテインAまたはプロテインGを用いたアフィニティークロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、抗原を固定化した免疫吸着クロマトグラフィー、ゲル濾過法および超遠心法等を挙げることができる。なお本発明の抗体を、抗原結合部位(Fab)を分解しないプロテアーゼ(例えばプラスミン、ペプシン、パパイン等)で処理して得られるFabを含むフラグメントとしても良い。また本発明の抗体をコードする遺伝子の塩基配列もしくは抗体のアミノ酸配列が決定されれば、遺伝子工学的に本発明の抗体のFabを含むフラグメントやキメラ抗体(例えば本発明の抗体のFab部分を含むキメラ抗体等)を作製することができ、このようなフラグメントやキメラ抗体も、本発明の抗体に包含される。 Purification methods of the obtained polyclonal and monoclonal antibodies include salting out with sodium sulfate, ammonium sulfate, etc., low temperature alcohol precipitation, selective precipitation fractionation with polyethylene glycol or isoelectric point, electrophoresis, DEAE (diethylaminoethyl)- Derivatives, ion exchange chromatography using ion exchangers such as CM (carboxymethyl) -derivatives, affinity chromatography using protein A or protein G, hydroxyapatite chromatography, immunoadsorption chromatography with immobilized antigen, gel Examples thereof include a filtration method and an ultracentrifugation method. The antibody of the present invention may be a fragment containing Fab obtained by treatment with a protease that does not degrade the antigen binding site (Fab) (for example, plasmin, pepsin, papain, etc.). If the nucleotide sequence of the gene encoding the antibody of the present invention or the amino acid sequence of the antibody is determined, a fragment containing the Fab of the antibody of the present invention or a chimeric antibody (for example, including the Fab portion of the antibody of the present invention) is genetically engineered. Chimera antibodies, etc.) can be prepared, and such fragments and chimeric antibodies are also encompassed by the antibodies of the present invention.
本発明の抗体の製造方法の一例を以下に述べるが、これに限定されるものではない。本発明のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンを、例えば2週間間隔で完全および不完全フロイントアジュバントとともマウスの腹腔に投与する。4回目にブースターとして投与した後、マウスを屠殺し脾臓細胞はポリエチレングリコールを用いてミエローマ細胞と融合する。培地中で選択したハイブリドーマを培養後、該ハイブリドーマを培養上清を用いて本発明のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンと反応する抗体の有無でウエスタンブロッテイングによってスクリーニングする。陽性ハイブリドーマは限界希釈法によってクローン化する。確立したハイブリドーマ細胞株はウエスタンブロットでコンドロイチン硫酸プロテオグリカン(分子量約150kDa)又はコア蛋白質(約120kDa)と反応する抗体を製造した。 Although an example of the manufacturing method of the antibody of this invention is described below, it is not limited to this. The chondroitin sulfate proteoglycan of the present invention is administered to the peritoneal cavity of mice together with complete and incomplete Freund's adjuvant, for example, at 2-week intervals. After the fourth dose as a booster, the mice are sacrificed and the spleen cells are fused with myeloma cells using polyethylene glycol. After culturing the selected hybridoma in the medium, the hybridoma is screened by Western blotting using the culture supernatant in the presence or absence of an antibody that reacts with the chondroitin sulfate proteoglycan of the present invention. Positive hybridomas are cloned by limiting dilution. The established hybridoma cell line produced an antibody that reacts with chondroitin sulfate proteoglycan (molecular weight about 150 kDa) or core protein (about 120 kDa) by Western blot.
抗体生産はしかしながら他の方法によっても製造することができる。つまり抗体はコア蛋白質が配列表配列番号2に示す1番目のバリン(Val)から514番目のトレオニン(Thr)までのアミノ酸と相同性を有するアミノ酸配列で示されるプロテオグリカン、配列表配列番号2に示される252番目のリジン(Lys)から398番目のシステイン(Cys)までのアミノ酸配列もしくはそれと相同性を有するアミノ酸配列を含み、糖鎖を有していても良い蛋白質またはそれらのペプチドフラグメントをヒト以外の哺乳動物に免疫し、該動物の体液から採取することができ、または該動物の抗体産生細胞によって産生され、該プロテオグリカンおよび該蛋白質の両者あるいはどちらか一方と反応する抗体であって、そのような抗体の製造方法であれば抗体生産の方法として用いることができる。なお、得られた抗体によって認識される蛋白質もしくはそのフラグメントは脳に局在している。上記の方法で得られた抗体は、さらに公知の方法で精製してもよい。 Antibody production can, however, also be produced by other methods. That is, the antibody is a proteoglycan whose core protein is represented by an amino acid sequence having homology with the amino acid from the first valine (Val) to the 514th threonine (Thr) shown in SEQ ID NO: 2 in SEQ ID NO: 2; A non-human protein or peptide fragment thereof, which contains an amino acid sequence from the 252nd lysine (Lys) to the 398th cysteine (Cys) or an amino acid sequence having homology thereto, and may have a sugar chain An antibody that is immunized to a mammal and can be collected from a body fluid of the animal or produced by antibody-producing cells of the animal and reacts with the proteoglycan and / or the protein, such as Any antibody production method can be used as an antibody production method. The protein or fragment thereof recognized by the obtained antibody is localized in the brain. The antibody obtained by the above method may be further purified by a known method.
<4>cDNAライブラリーとコンドロイチン硫酸プロテオグリカンに対するcDNAクローンの分離
哺乳動物の全脳から得られるポリ(A)+ を用いて鋳型およびランダムプライマーとして使用するcDNAライブラリー(非特許文献22)を調製する。また哺乳動物の全脳から得られるポリ(A)+ を用いて鋳型およびオリゴd(T)プライマーとして使用するcDNAライブラリーを構築する。これらのcDNAライブラリーは、先に得られたコンドロイチン硫酸プロテオグリカンを認識するモノクローナル抗体等を用いて免疫学的にスクリーニングすることができる。免疫学的スクリーニングはサムブロックら(Sambrook et al)の文献(非特許文献29)に記述されたようにして行なうことができる。陽性クローンを免疫学的スクリーニングによって分離し常法に従ってDNAの配列決定等を行うことで、配列表配列番号1に示されるDNAを得ることができる。こうして30残基のシグナルペプチドと新規コンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコア蛋白質をすべてコードする514残基のアミノ酸をコードするcDNAを得ることができた。
<4> Isolation of cDNA library and cDNA clone for chondroitin sulfate proteoglycan Prepare a cDNA library (Non-patent Document 22) to be used as a template and random primer using poly (A) + obtained from whole mammalian brain . Also, a poly (A) + obtained from the whole brain of a mammal is used to construct a cDNA library to be used as a template and oligo d (T) primer. These cDNA libraries can be screened immunologically using a monoclonal antibody that recognizes chondroitin sulfate proteoglycan obtained previously. Immunological screening can be performed as described in Sambrook et al. (Non-patent Document 29). By isolating positive clones by immunological screening and performing DNA sequencing or the like according to conventional methods, the DNA shown in SEQ ID NO: 1 can be obtained. Thus, a cDNA encoding a 514-residue amino acid encoding all of the 30-residue signal peptide and the core protein of the novel chondroitin sulfate proteoglycan could be obtained.
こうして見い出され同定された新規コンドロイチン硫酸プロテオグリカンは脳に局在し、他の知られているいずれのプロテオグリカンとも相同性を示さない故、本発明のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンは新規なコンドロイチン硫酸プロテオグリカンであって(図1)、これらはニューロンの形態形成に関与すると考えられるので、神経系疾患等に対する診断方法、治療薬や予防薬としての使用が期待さる。また、治療あるいは予防における投与経路としては静脈注射、動脈注射、脳室内投与、ウイルス遺伝子を利用した遺伝子工学的投与手段等を用いることができる。 The novel chondroitin sulfate proteoglycan found and identified in this way is localized in the brain and does not show homology with any other known proteoglycan, so the chondroitin sulfate proteoglycan of the present invention is a novel chondroitin sulfate proteoglycan ( Since these are considered to be involved in neuronal morphogenesis, they are expected to be used as diagnostic methods, therapeutic agents and preventive agents for nervous system diseases and the like. In addition, as an administration route in treatment or prevention, intravenous injection, arterial injection, intraventricular administration, genetic engineering administration means using a viral gene, or the like can be used.
<5>本発明のプロテオグリカン
本発明のプロテオグリカンは次の性質を有するコア蛋白質と糖鎖とからなるコンドロイチン硫酸プロテオグリカンである。
(A)コア蛋白質の一次構造:配列表配列番号2の1番目のバリン(Val)から514番目のトレオニン(Thr)までのアミノ酸配列もしくはそれと相同性を有するアミノ酸配列を有する。
(B)糖鎖:分子量約30キロダルトンのコンドロイチン硫酸を含有する。
(C)本プロテオグリカンにノイラミニダーゼ、O−グリコシダーゼまたはN−グリコシダーゼを作用させると糖鎖が遊離する。
<5> Proteoglycan of the Present Invention The proteoglycan of the present invention is a chondroitin sulfate proteoglycan comprising a core protein and a sugar chain having the following properties.
(A) Primary structure of the core protein: the amino acid sequence from the first valine (Val) to the 514th threonine (Thr) in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing, or an amino acid sequence having homology thereto.
(B) Sugar chain: Contains chondroitin sulfate having a molecular weight of about 30 kilodaltons.
(C) When neuraminidase, O-glycosidase or N-glycosidase is allowed to act on the proteoglycan, sugar chains are released.
さらに分子量が、還元条件下におけるドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動において約150キロダルトンであることを特徴とする該コンドロイチン硫酸プロテオグリカンも本発明に含まれる。 Further, the chondroitin sulfate proteoglycan having a molecular weight of about 150 kilodaltons in sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis under reducing conditions is also included in the present invention.
<6>本発明の糖蛋白質
次の性質を有する糖蛋白質も本発明に含まれる。
(A)分子量:(a)ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で還元条件下において約120キロダルトンのバンドを形成する、(b)ノイラミニダーゼ、O−グリコシダーゼおよびN−グリコシダーゼの酵素反応後、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で還元条件下において約100キロダルトンのバンドを形成する、(B)蛋白質の一次構造:配列表配列番号2に示す1番目のバリン(Val)から514番目のトレオニン(Thr)までのアミノ酸配列あるいはそれと相同性を有するアミノ酸配列を有する。
<6> Glycoprotein of the present invention Glycoprotein having the following properties is also included in the present invention.
(A) Molecular weight: (a) Forms a band of about 120 kilodaltons under reducing conditions by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, (b) After enzymatic reaction of neuraminidase, O-glycosidase and N-glycosidase, dodecyl (B) Primary structure of protein that forms a band of about 100 kilodaltons under reducing conditions by sodium sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis: first valine (Val) to 514 threonine shown in SEQ ID NO: 2 It has an amino acid sequence up to (Thr) or an amino acid sequence having homology thereto.
<7>本発明の蛋白質
配列表配列番号2に示す1番目のバリン(Val)から514番目のトレオニン(Thr)までのアミノ酸配列あるいはそれと相同性を有するアミノ酸配列を含み、糖鎖を有していてもよい蛋白質も本発明に含まれる。さらには、配列表配列番号2の252番目のリジン(Lys)から398番目のシステイン(Cys)までのアミノ酸配列は本発明のプロテオグリカンや蛋白質の特徴であるので、配列表配列番号2の252番目のリジン(Lys)から398番目のシステイン(Cys)までのアミノ酸配列あるいはそれと相同性を有するアミノ酸配列を含み、糖鎖を有していてもよい蛋白質も本発明に含まれ、上記それぞれのプロテオグリカンや蛋白質をコードするDNAも本発明に含まれる。
<7> Protein of the present invention The amino acid sequence from the first valine (Val) to the 514th threonine (Thr) shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing, or an amino acid sequence having homology thereto, and having a sugar chain Proteins that may be included are also included in the present invention. Furthermore, since the amino acid sequence from the 252nd lysine (Lys) to the 398th cysteine (Cys) of SEQ ID NO: 2 is a characteristic of the proteoglycan and protein of the present invention, the 252nd of SEQ ID NO: 2 A protein that includes an amino acid sequence from lysine (Lys) to 398th cysteine (Cys) or an amino acid sequence having homology therewith and may have a sugar chain is also included in the present invention, and each of the above proteoglycans and proteins The DNA encoding is also included in the present invention.
このような蛋白質には、例えば配列表配列番号2に示す−30番目のメチオニン(Met)から514番目のトレオニン(Thr)までのアミノ酸配列あるいはそれと相同性を有するアミノ酸配列を含み、糖鎖を有していてもよい蛋白質が包含される。本発明においてアミノ酸配列において相同性を有するとは、本発明のプロテオグリカン及び蛋白質が由来する生物種が相違しても同一機能を有するプロテオグリカン及び蛋白質においては一定の割合のアミノ酸配列が維持され、共通性を有していることを意味する。例えば既知のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンであるバーシカンでは、ニワトリ由来の該プロテオグリカンとヒト由来の該プロテオグリカンのコア蛋白質のうち、活性ドメインのアミノ酸配列は、96%の相同性を有している。また既知の膜結合型プロテオグリカンであるシンデカンのコア蛋白質ではマウスとヒトとの間でアミノ酸配列に高い相同性部分を有することが知られている。したがって本発明のプロテオグリカン及び蛋白質も、種間におけるアミノ酸配列の相同性は約60〜90%以上と想定される。 Such a protein includes, for example, an amino acid sequence from the -30th methionine (Met) to the 514th threonine (Thr) shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing, or an amino acid sequence having homology thereto, and has a sugar chain. Proteins that may be included are included. In the present invention, homology in amino acid sequences means that a certain proportion of amino acid sequences are maintained in proteoglycans and proteins having the same function even if the biological species from which the proteoglycans and proteins of the present invention are derived are different. It means that it has. For example, in versican, which is a known chondroitin sulfate proteoglycan, the amino acid sequence of the active domain has 96% homology among the core protein of the proteoglycan derived from chicken and the proteoglycan derived from human. Moreover, it is known that the core protein of syndecan, which is a known membrane-bound proteoglycan, has a highly homologous portion in the amino acid sequence between mouse and human. Accordingly, the proteoglycans and proteins of the present invention are also expected to have about 60 to 90% or more amino acid sequence homology between species.
本発明の一例のcDNAの遺伝子配列から推定される蛋白質はシグナルペプチドドメイン、コンドロイチン硫酸結合ドメイン(CSアタッチメント)、塩基性アミノ酸のクラスター、システイン含有ドメイン、膜貫通ドメイン(transmembrane domain)そして細胞質ドメイン(cytoplasmic domain)の各部分からなると推定される(図1)。本発明の脳に局在する新規コンドロイチン硫酸プロテオグリカンをニューログリカンCと命名した(以下、NGCという)。NGCのmRNAはノーザンブロットによる分析において、新生児および成熟哺乳動物の脳中に 3.1kbの単一mRNAとして検出されるが、しかし腎臓、肝臓、肺臓、筋肉のいずれからも検出されない。コア蛋白質の配列はいかなる他の既知のタンパク質とも有意のホモロジーを示さなかった。このことはニューログリカンC(NGC)が新規のプロテオグリカンであることを示している。 Proteins deduced from the gene sequence of an example cDNA of the present invention include a signal peptide domain, a chondroitin sulfate binding domain (CS attachment), a cluster of basic amino acids, a cysteine-containing domain, a transmembrane domain, and a cytoplasmic domain. domain)) (FIG. 1). A novel chondroitin sulfate proteoglycan localized in the brain of the present invention was named neuroglycan C (hereinafter referred to as NGC). NGC mRNA is detected in Northern blot analysis as a single 3.1 kb mRNA in the brains of newborns and adult mammals, but not in any of kidney, liver, lung, or muscle. The core protein sequence did not show significant homology with any other known protein. This indicates that neuroglycan C (NGC) is a novel proteoglycan.
また、本発明には配列表配列番号4の31番目のバリン(Val)から545番目のトレオニン(Thr)までのアミノ酸配列あるいはそれと相同性を有するアミノ酸配列を含み、糖鎖を有していてもよい蛋白質、配列表配列番号4の283番目のリジン(Lys)から429番目のシステイン(Cys)までのアミノ酸配列あるいはそれと相同性を有するアミノ酸配列を含み、糖鎖を有していてもよい蛋白質も包含される。これらはヒト由来の蛋白質であることから、ヒトに対して用いる医薬品として特に好ましい。このような蛋白質には、例えば配列表配列番号4に示す1番目のメチオニン(Met)から545番目のトレオニン(Thr)までのアミノ酸配列あるいはそれと相同性を有するアミノ酸配列を含み、糖鎖を有していてもよい蛋白質が包含される。 Further, the present invention includes an amino acid sequence from the 31st valine (Val) to the 545th threonine (Thr) of SEQ ID NO: 4 in the sequence listing, or an amino acid sequence having homology thereto, and having a sugar chain. A good protein, an amino acid sequence from the 283rd lysine (Lys) to the 429th cysteine (Cys) in SEQ ID NO: 4 or an amino acid sequence having homology therewith, and a protein that may have a sugar chain Is included. Since these are human-derived proteins, they are particularly preferred as pharmaceuticals used for humans. Such a protein includes, for example, the amino acid sequence from the first methionine (Met) to the 545th threonine (Thr) shown in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing, or an amino acid sequence having homology thereto, and has a sugar chain. Proteins that may be included are included.
なお本発明蛋白質は、必ずしも単独の蛋白質でなくてもよく、必要により融合蛋白質の一部となっていてもよい。融合蛋白質は、公知の遺伝子工学的手法により製造することができ、通常、本発明の蛋白質をコードするDNAを任意の蛋白質をコードするDNAと連結させることによって得た組換えDNAから発現させることによって得ることができる。 The protein of the present invention is not necessarily a single protein, and may be part of a fusion protein if necessary. A fusion protein can be produced by a known genetic engineering technique, and is usually expressed by expressing a DNA encoding the protein of the present invention from a recombinant DNA obtained by ligating the DNA encoding an arbitrary protein. Obtainable.
また本発明の蛋白質には、配列表配列番号2に示されるアミノ酸配列と配列番号4に示されるアミノ酸配列との間で共通するアミノ酸をその順序で含むアミノ酸配列を有し、糖鎖を有していてもよい蛋白質も包含される。配列表配列番号2に示されるアミノ酸配列と配列番号4に示されるアミノ酸配列との間で共通しないアミノ酸は任意のアミノ酸でよい。ただし、配列表配列番号4の282番目のメチオニン(Met)に対応する配列表配列番号2のアミノ酸はないものとする。 In addition, the protein of the present invention has an amino acid sequence that includes amino acids that are common between the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 4 in that order, and has a sugar chain. Also included are proteins that may be present. The amino acid that is not common between the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 4 may be any amino acid. However, it is assumed that there is no amino acid in SEQ ID NO: 2 corresponding to the 282nd methionine (Met) of SEQ ID NO: 4.
<8>本発明のDNA
本発明には、上記のプロテオグリカン、糖蛋白質及び蛋白質をコードするDNAが包含される。例えば配列表配列番号2に示す1番目のバリン(Val)から514番目のトレオニン(Thr)までのアミノ酸配列あるいはそれと相同性を有するアミノ酸配列を含み、糖鎖を有していてもよい蛋白質をコードする塩基配列を有するDNAとして具体的には、配列表配列番号1の103番目のグアニン(G)から1644番目のシトシン(C)までの塩基配列を含むDNAが例示される。また、配列表配列番号2の252番目のリジン(Lys)から398番目のシステイン(Cys)までのアミノ酸配列あるいはそれと相同性を有するアミノ酸配列を含み、糖鎖を有していてもよい蛋白質をコードするDNAとして具体的には、配列表配列番号1の856番目のアデニン(A)から1296番目のシトシン(C)までの塩基配列を含むDNAが例示される。このようなDNAには、配列表配列番号1に示す13番目のアデニン(A)から1644番目のシトシン(C)までの塩基配列を含むDNAも含まれる。
<8> DNA of the present invention
The present invention includes the above proteoglycans, glycoproteins and DNAs encoding the proteins. For example, it encodes a protein that contains an amino acid sequence from the first valine (Val) to the 514th threonine (Thr) shown in SEQ ID NO: 2 or an amino acid sequence having homology thereto, and may have a sugar chain Specifically, the DNA having the nucleotide sequence to be exemplified is DNA containing the nucleotide sequence from the 103rd guanine (G) to the 1644th cytosine (C) in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. In addition, it encodes a protein that includes an amino acid sequence from the 252nd lysine (Lys) to the 398th cysteine (Cys) of Sequence Listing SEQ ID NO: 2 or an amino acid sequence having homology thereto, and may have a sugar chain Specific examples of the DNA to be performed include DNA containing the base sequence from the 856th adenine (A) to the 1296th cytosine (C) in SEQ ID NO: 1 in Sequence Listing. Such DNA includes DNA containing the base sequence from the 13th adenine (A) to the 1644th cytosine (C) shown in SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing.
配列表配列番号4の31番目のバリン(Val)から545番目のトレオニン(Thr)までのアミノ酸配列あるいはそれと相同性を有するアミノ酸配列を含み、糖鎖を有していてもよい蛋白質をコードする塩基配列を有するDNAとして具体的には、配列表配列番号3の91番目のグアニン(G)から1635番目のシトシン(C)までの塩基配列を含むDNAが例示される。配列表配列番号4の283番目のリジン(Lys)から429番目のシステイン(Cys)までのアミノ酸配列あるいはそれと相同性を有するアミノ酸配列を含み、糖鎖を有していてもよい蛋白質をコードする塩基配列を有するDNAとして具体的には、配列表配列番号3の847番目のアデニン(A)から1287番目のシトシン(C)までの塩基配列を含むDNAが例示される。このようなDNAには、配列表配列番号3に示す1番目のアデニン(A)から1635番目のシトシン(C)までの塩基配列を含むDNAも含まれる。 A base that encodes a protein that includes an amino acid sequence from the 31st valine (Val) to the 545th threonine (Thr) of the sequence listing SEQ ID NO: 4 or an amino acid sequence having homology thereto, and may have a sugar chain Specific examples of the DNA having a sequence include DNA containing the nucleotide sequence from 91st guanine (G) to 1635th cytosine (C) in SEQ ID NO: 3 in the Sequence Listing. A base that encodes a protein that includes an amino acid sequence from 283rd lysine (Lys) to 429th cysteine (Cys) in Sequence Listing SEQ ID NO: 4 or an amino acid sequence having homology thereto, and may have a sugar chain Specific examples of the DNA having a sequence include DNA containing a base sequence from the 847th adenine (A) to the 1287th cytosine (C) of SEQ ID NO: 3 in the sequence listing. Such DNA includes DNA containing the base sequence from the first adenine (A) to the 1635th cytosine (C) shown in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing.
なお、遺伝暗号の縮重による異なった塩基配列のDNAも本発明のDNAに包含されることは、当業者であれば容易に理解されるところである。これらのDNAのいずれもが本発明DNAに包含される。また本発明には、本発明のDNAに相補的なDNAまたはRNAが包含される。さらに本発明DNAは、上記蛋白質をコードするコード鎖のみの一本鎖であってもよいし、この一本鎖及びこれと相補的な配列を有するDNA鎖またはRNA鎖とからなる二本鎖であってもよい。また本発明DNAには、公知の遺伝子工学的手法によって本発明DNAに任意の蛋白質をコードするDNAや、機能を有するDNAを連結させることによって得た組換えDNAも包含される。なお、染色体由来の本発明蛋白質の遺伝子は、コード領域にイントロンを含むことが予想されるが、そのようなイントロンで分断されているDNA断片であっても、本発明蛋白質をコードする限り、本発明DNAに含まれる。すなわち、本明細書において「コードする」とは、転写時にプロセッシング等を受けて最終的に目的の蛋白質を生じ得る塩基配列を有することも包含する。 It should be readily understood by those skilled in the art that DNAs of different base sequences due to the degeneracy of the genetic code are also included in the DNA of the present invention. Any of these DNAs are included in the DNA of the present invention. The present invention also includes DNA or RNA complementary to the DNA of the present invention. Further, the DNA of the present invention may be a single strand consisting only of the coding strand encoding the protein, or a double strand comprising this single strand and a DNA strand or RNA strand having a complementary sequence thereto. There may be. The DNA of the present invention also includes a DNA encoding an arbitrary protein and a recombinant DNA obtained by linking a functional DNA to the DNA of the present invention by a known genetic engineering technique. Note that the gene of the protein of the present invention derived from a chromosome is expected to contain an intron in the coding region, but even a DNA fragment fragmented by such an intron is not limited as long as it encodes the protein of the present invention. Included in the invention DNA. That is, the term “encode” in the present specification includes having a base sequence that can be processed at the time of transcription to finally produce a target protein.
以下に本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明は下記実施例によって何等制限されるものではない。 EXAMPLES The present invention will be specifically described below with reference to examples, but the present invention is not limited to the following examples.
膜結合型コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの抽出
10日齢スプラグ−ドウリー(Sprague−Dawley)ラットの脳(通常実験当たり100匹のラット;Slc:SD系統;SLC(株)製)をプロテアーゼ阻害剤として2mMのフェニルメチルスルフォニルフルオライド、20mMのEDTA及び10mMのN−エチルマレイミドを含む氷冷リン酸塩緩衝食塩水(phosphate-buffered saline) (PBS)(2ml/脳)中でテフロングラスホモジナイザーを用いてホモジナイズした。ホモジナイゼーションおよびそれに続く工程は特に示していない限り、全て4℃で行なった。ホモジネートは27,000Xgで40分間遠心した。沈澱物を同じ溶液で再度ホモジネーションした。遠心後、PBS−不溶性物質を前記プロテアーゼ阻害剤と1%ノニデット(Nonidet)P−40を含むPBS(2ml/脳)中で0℃においてホモジナイズした。ホモジネートをマグネチックスターラーで60分間撹拌し、次に27,000Xgで40分間遠心した。上清はとっておき、沈澱物を再度界面活性剤含有緩衝液で処理し遠心した。遠心後、これらの界面活性剤含有上清を合わせ、凍結乾燥した。
Extraction of membrane-bound chondroitin sulfate proteoglycan 10 day-old Sprague-Dawley rat brain (usually 100 rats per experiment; Slc: SD strain; manufactured by SLC Co.) as a protease inhibitor with 2 mM phenyl Homogenization was performed using a Teflon glass homogenizer in ice-cold phosphate-buffered saline (PBS) (2 ml / brain) containing methylsulfonyl fluoride, 20 mM EDTA and 10 mM N-ethylmaleimide. All homogenization and subsequent steps were performed at 4 ° C. unless otherwise indicated. The homogenate was centrifuged at 27,000 Xg for 40 minutes. The precipitate was rehomogenized with the same solution. After centrifugation, PBS-insoluble material was homogenized at 0 ° C. in PBS (2 ml / brain) containing the protease inhibitor and 1% Nonidet P-40. The homogenate was stirred with a magnetic stirrer for 60 minutes and then centrifuged at 27,000 Xg for 40 minutes. The supernatant was saved, and the precipitate was again treated with a surfactant-containing buffer and centrifuged. After centrifugation, these surfactant-containing supernatants were combined and lyophilized.
膜結合型コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの部分精製
実施例1で得られた凍結乾燥残渣を、0.2 %ノニデットP−40、0.1 M NaCl、2mM EDTA、1mM N−エチルマレイミド及び0.2 mMフェニルメチルスルフォニルフルオライドを含む4M尿素、50mMトリス塩酸緩衝液、pH7.5 (尿素緩衝液)中に脳1個当り1mlの割合で分散した、そしてこの分散液は同緩衝液を用いて透析した。27,000Xgで30分間遠心後、上清を尿素緩衝液で平衡化したDEAEセファセル樹脂(ファルマシア社製)と脳1個当り1mlの割合で混合し、混合物をマグネチックスターラーで2時間撹拌した。このDEAEセファセル樹脂を6,500Xg 、10分間の遠心によって回収し、そして尿素緩衝液で2回洗浄した。この樹脂をガラスカラムに詰め、この樹脂からプロテオグリカンを0.1 Mから0.7 MのNa Clを含む尿素緩衝液での直線濃度勾配によって溶出した。
Partial purification of membrane-bound chondroitin sulfate proteoglycan The lyophilized residue obtained in Example 1 contains 0.2% nonidet P-40, 0.1 M NaCl, 2 mM EDTA, 1 mM N-ethylmaleimide and 0.2 mM phenylmethylsulfonyl fluoride. Dispersed in 4M urea, 50 mM Tris-HCl buffer, pH 7.5 (urea buffer) at a rate of 1 ml per brain, and this dispersion was dialyzed using the same buffer. After centrifugation at 27,000 Xg for 30 minutes, the supernatant was mixed with DEAE Sephacel resin (Pharmacia) equilibrated with urea buffer at a rate of 1 ml per brain, and the mixture was stirred with a magnetic stirrer for 2 hours. The DEAE Sephacel resin was recovered by centrifugation at 6,500 × g for 10 minutes and washed twice with urea buffer. The resin was packed in a glass column and the proteoglycan was eluted from the resin by a linear concentration gradient in urea buffer containing 0.1 M to 0.7 M NaCl.
プロテオグリカン画分(0.45から0.68MのNaCl濃度で溶出)を集め、そしてダイアフロー YM−10メンブラン(アミコン(株)製)を使って5mlに濃縮した。濃縮した溶液を、0.2 %ノニデットP−40と前記プロテアーゼインヒビターとを含む4Mグアニジン塩酸、50mM トリス塩酸 pH7.5 を用いてセファロースCL−4B(ファルマシア社製)のカラム(直径1.6 cm×100cm)上でクロマトグラフを行った。プロテオグリカン画分(Kav0.11から0.65)を集め、ダイアフローYM−10メンブランを用いて3mlに濃縮した。プロテオグリカンを1.3 %(W/V)酢酸カリウムを含む3倍容の95%エタノールを添加して溶液から沈澱した。沈澱物を0℃で1%(W/V)酢酸カリウムを含む75%エタノールで2回洗浄し、減圧下P2O5で乾燥した。得られた乾燥物を室温で4Mグアニジン塩酸、50mMトリス塩酸、pH7.5(グアニジン塩酸緩衝液)10ml中に溶解した。この溶液をオクチルセファロース(ファルマシア社製)のカラム(直径1.6 cm径×5.0 cm)に負荷した。ノニデットP−40を0%から0.8 %(V/V)含むグアニジン塩酸緩衝液で直線濃度勾配によって溶出を行った。0.3 %から0.6 %のノニデットP−40濃度で溶出した画分を集め、そして集めた画分中のプロテオグリカンをエタノールで沈澱し上述したようにして乾燥した。 The proteoglycan fraction (eluted at a concentration of 0.45 to 0.68 M NaCl) was collected and concentrated to 5 ml using Diaflow YM-10 membrane (Amicon). The concentrated solution was applied to a Sepharose CL-4B (Pharmacia) column (diameter 1.6 cm × 100 cm) using 4M guanidine hydrochloride containing 0.2% nonidet P-40 and the protease inhibitor, and 50 mM Tris-HCl pH 7.5. And chromatographed. Proteoglycan fractions (Kav 0.11 to 0.65) were collected and concentrated to 3 ml using Diaflow YM-10 membrane. Proteoglycan was precipitated from the solution by adding 3 volumes of 95% ethanol containing 1.3% (W / V) potassium acetate. The precipitate was washed twice with 75% ethanol containing 1% (W / V) potassium acetate at 0 ° C. and dried over P 2 O 5 under reduced pressure. The obtained dried product was dissolved in 10 ml of 4M guanidine hydrochloride, 50 mM Tris hydrochloride, pH 7.5 (guanidine hydrochloride buffer) at room temperature. This solution was loaded onto a column (diameter 1.6 cm diameter × 5.0 cm) of octyl sepharose (Pharmacia). Elution was performed with a guanidine hydrochloride buffer containing nonidet P-40 from 0% to 0.8% (V / V) by a linear concentration gradient. Fractions eluted at 0.3% to 0.6% nonidet P-40 concentrations were collected, and the proteoglycans in the collected fractions were precipitated with ethanol and dried as described above.
さらに、得られたプロテオグリカンを、初期密度1.38g/ml(4Mグアニジン塩酸、50mMトリス塩酸、pH7.5)のCsCl密度勾配によってRPS−65Tローター(日立社製)を用いて10℃で150,000Xg で30時間超遠心することによって精製した。遠心後、試料を7分画して集めた。分画番号2から6の試料を集め、4℃でPBSに対して透析を行った。プロテオグリカン溶液中のヘキスロン酸(hexuronate)とタンパク質の含量を Bitter and Muir法(非特許文献26)及びタンパク質分析キット(Bio-Rad社製)によってそれぞれ測定した。この精製方法によって、100個の脳からヘキスロン酸含量約3マイクロモル(蛋白質含量2.2mg)のプロテオグリカンを得た。
Further, the obtained proteoglycan was obtained at 150,000 Xg at 10 ° C using an RPS-65T rotor (manufactured by Hitachi) with a CsCl density gradient with an initial density of 1.38 g / ml (4M guanidine hydrochloride, 50 mM Tris hydrochloride, pH 7.5). Purified by ultracentrifugation for 30 hours. After centrifugation, the sample was collected in 7 fractions. Samples with
また、可溶性プロテオグリカンをプロテアーゼインヒビターを含むPBSで10日齢のラットの脳から公知の方法(非特許文献3)で抽出し精製した。すなわち、プロテオグリカンを、DEAEセファロースを用いたカラムクロマトグラフィーとセファロースCL−4Bを用いたゲル濾過によって分画し、精製した。0.45から0.60の範囲のKavを有する画分をウエスタンブロット分析のために用いた。 Soluble proteoglycans were extracted from the brains of 10-day-old rats with PBS containing protease inhibitors by a known method (Non-patent Document 3) and purified. That is, proteoglycan was fractionated and purified by column chromatography using DEAE Sepharose and gel filtration using Sepharose CL-4B. Fractions with a Kav ranging from 0.45 to 0.60 were used for Western blot analysis.
グリコシダーゼを用いる膜結合型コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの処理
プロテオグリカンのコア蛋白質からコンドロイチン硫酸側鎖とヘパラン硫酸側鎖を除去するため、膜結合型コンドロイチン硫酸プロテオグリカン(ウロン酸含量50nmol)をプロテアーゼの含まれていないコンドロイチナーゼABC(EC4.2.2.4;生化学工業(株)製)で消化し、次にヘパリチーゼI(heparitinase I)(EC4.2.2.8;生化学工業(株)製)で消化した(非特許文献8参照)。得られた蛋白(コアグリコプロテイン)を、続いて2mM EDTA、1mM N−エチルマレイミド、0.2 mMフェニルメチルスルフォニルフルオライド及び0.07mMペプスタチンを含む50mM酢酸ナトリウム緩衝液、pH5.0100μl中でノイラミニダーゼ2mIU(EC 3.2.1.18;ナカライテスク社製)で37℃、1時間処理した。酵素反応を0℃で 1.3%酢酸カリウムを含む95%エタノール300μlの添加によって停止させた。1時間後コア糖蛋白質(以下、コアグリコプロティン)を遠心によって沈澱させた。コアグリコプロテインを説明書の指示に従ってコアプロテインの変性後さらに1 IU Nーグリコシダーゼ F(EC 3.2.2.18;ベーリンガーマンハイム社製)を用いるかあるいは1mIUのO−グリコシダーゼ(EC3.2.1.97;ベーリンガーマンハイム社製)を用いて37℃で24時間消化することによって脱グリコシレーションした。
Treatment of membrane-bound chondroitin sulfate proteoglycan with glycosidase To remove chondroitin sulfate side chain and heparan sulfate side chain from the core protein of proteoglycan, membrane-bound chondroitin sulfate proteoglycan (
ゲル電気泳動とウエスタンブロット分析
膜結合型コンドロイチン硫酸プロテオグリカンを6%分離ゲルと3%スタッキングゲルを用いてジチオスライトールでの還元条件下でドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)によって分離した。それらを4℃で20%(V/V)メタノールを含む25mMトリス、192mMグリシン(pH8.3 )中で一昼夜60Vでポリビニリデンジフルオライド(PVDF)膜(イモビロン−P(商品名);ミリポアー社製)に電気泳動的に移動(転写)させた。抗体の非特異的結合を阻止するため、該膜を1%スキムミルク(DIFCO ラボラトリース社製)を含むPBS中でインキュベートした。次にこの膜を後記実施例5のハイブリドーマの培養上清(マウスモノクローナル抗体を含む)で4℃、一昼夜処理し、そしてベクタステイン(Vectastain)ABCキット(ベクター研究所製)を用いてPBS中で染色した。いくつかの実験においては、免疫染色の強度はイメージスキャナー(GT−6500;エプソン社)を経てコンピューター(LC520;アップル社)とアプリケーションソフト、NIHイメージプログラム(パブリックドメイン)を用いて定量した。
Gel Electrophoresis and Western Blot Analysis Membrane-bound chondroitin sulfate proteoglycan was analyzed by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) using 6% separation gel and 3% stacking gel under reducing conditions with dithiothrite. separated. Polyvinylidene difluoride (PVDF) membranes (Immobilon-P (trade name); Millipore) at 60 V overnight in 25 mM Tris, 192 mM glycine (pH 8.3) containing 20% (V / V) methanol at 4 ° C. Made by electrophoresis (transfer). In order to block non-specific binding of antibodies, the membrane was incubated in PBS containing 1% skim milk (DIFCO Laboratories). Next, this membrane was treated with the hybridoma culture supernatant (including mouse monoclonal antibody) of Example 5 described later at 4 ° C. overnight, and in PBS using a Vectastain ABC kit (manufactured by Vector Laboratory). Stained. In some experiments, the intensity of immunostaining was quantified using an image scanner (GT-6500; Epson) and a computer (LC520; Apple), application software, and NIH image program (public domain).
モノクローナル抗体の製造
各種モノクローナル抗体は公知の方法(非特許文献27参照)によって製造した。すなわち、膜結合型コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの調製物(50μgタンパク質/投与)を2週間間隔で完全および不完全フロイントアジュバントとともBALB/cマウスの腹腔に注射した。4回目にブースターとして投与後、マウスを屠殺し、得られた脾臓細胞をポリエチレングリコールを用いてPAIミエローマ細胞と融合した。HAT培地中で選択したハイブリドーマを10%ウシ胎児血清を含むRPMI1640培地(シグマ社製)で培養した。培養されたハイブリドーマを培養上清を用いてプロテオグリカンと反応する抗体の有無でウエスタンブロッテイングによってスクリーニングした。陽性ハイブリドーマは限界希釈法によってクローン化した。選択されたハイブリドーマより得られたモノクローナル抗体C1,C3,C5及びC15が実施例2の膜結合型コンドロイチン硫酸プロテオグリカンと反応した。これらの4つの抗体のすべてがマウスモノクローナル抗体イソタイピングキット(イムノタイプ(商品名);シグマ社製)を用いてIgG1 であると決定された。
Production of monoclonal antibodies Various monoclonal antibodies were produced by known methods (see Non-Patent Document 27). That is, a preparation of membrane-bound chondroitin sulfate proteoglycan (50 μg protein / dose) was injected into the peritoneal cavity of BALB / c mice with complete and incomplete Freund's adjuvant at 2-week intervals. After administration as a booster for the fourth time, the mice were sacrificed, and the obtained spleen cells were fused with PAI myeloma cells using polyethylene glycol. Hybridomas selected in HAT medium were cultured in RPMI 1640 medium (Sigma) containing 10% fetal bovine serum. Cultured hybridomas were screened by Western blotting using the culture supernatant for the presence or absence of antibodies that react with proteoglycans. Positive hybridomas were cloned by limiting dilution. Monoclonal antibodies C1, C3, C5 and C15 obtained from the selected hybridomas reacted with the membrane-bound chondroitin sulfate proteoglycan of Example 2. All of these four antibodies were determined to be IgG1 using a mouse monoclonal antibody isotyping kit (Immunotype (trade name); manufactured by Sigma).
コアグリコプロテインの精製
コアグリコプロティンは、前田ら(非特許文献22)によって述べられたプロテオグリカン型タンパク質であるチロシンホスファターゼの部分精製のために使われた方法(非特許文献22)に従って精製した。すなわち、8日齢ラットの全脳から調製した核除去画分を1%CHAPS(3−〔(3−コールアミドプロピル)ジメチルアンモニオ〕−1−プロパンスルホン酸)で可溶化した。可溶化したものをDEAEトーヨーパール(トーソー(株)製)のカラムに負荷し、0.25M NaClで洗浄し、つづいて0.6 M NaClで溶出した。溶出物(カラムから得られた負に荷電した部分精製物)からプロテオグリカンを分離するためCsCl密度勾配超遠心にて分画した。遠心後、勾配を10分画にして集めた。これらの画分をコンドロイチナーゼABCで消化後分析したところ、3つの最も低い密度の画分中に140kDaと120kDaのタンパク質が主要な成分として検出された(非特許文献22中の (図2を参照)。従って、これらの画分中のプロテオグリカンをコンドロイチナーゼABCで消化し、得られたコアグリコプロテインをSDS−PAGE(6%ポリアクリルアミド)によって分離した。このコアグリコプロテインはPVDF膜に移され、そして120kDaのコアグリコプロテインのバンドを手術用メスで切りだした。120kDaのコアグリコプロテインはウエスタンブロットにおいて4つのモノクローナル抗体C1,C3,C5及びC15によって認識された。
Purification of Core Glycoprotein Core glycoprotein was purified according to the method used for partial purification of tyrosine phosphatase, a proteoglycan type protein described by Maeda et al. (Non-patent Document 22). That is, the nucleus-removed fraction prepared from the whole brain of 8-day-old rats was solubilized with 1% CHAPS (3-[(3-cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propanesulfonic acid). The solubilized product was loaded onto a column of DEAE Toyopearl (manufactured by Tosoh Corporation), washed with 0.25 M NaCl, and then eluted with 0.6 M NaCl. In order to separate the proteoglycan from the eluate (negatively charged partially purified product obtained from the column), it was fractionated by CsCl density gradient ultracentrifugation. After centrifugation, the gradient was collected in 10 fractions. When these fractions were analyzed after digestion with chondroitinase ABC, proteins of 140 kDa and 120 kDa were detected as major components in the three lowest density fractions (see FIG. 2 in Non-Patent Document 22). Therefore, proteoglycans in these fractions were digested with chondroitinase ABC and the resulting core glycoprotein was separated by SDS-PAGE (6% polyacrylamide), which was transferred to a PVDF membrane. A 120 kDa core glycoprotein band was cut out with a scalpel, which was recognized by four monoclonal antibodies C1, C3, C5 and C15 in a Western blot.
この精製された120kDaコアグリコプロテインのアミノ酸配列分析を行った。120kDaのコアグリコプロテインの断片をスコットら(Scott et al)の文献(非特許文献28)に記述されたように臭化シアン(CNBr)処理によって得た。完全なコアグリコプロテインとその断片とを上述したようにSDS−PAGEによって分離した。そして該タンパク質とその断片とを10%メタノールを含む10mMCAPS(3−(シクロヘキシルアミノ)プロパンスルホン酸)緩衝液(pH11)中で0.3 A(アンペア)で4℃、3時間でPVDF膜に移した。0.5 %ポンシュー レッド(Ponceau Red)含有1%酢酸で染色後、タンパク質のバンドを膜から切り出し、そしてタンパク質のアミノ酸配列を自動タンパク質シークエンサー(PPSQ−10;島津)で決定した。 Amino acid sequence analysis of this purified 120 kDa core glycoprotein was performed. A 120 kDa core glycoprotein fragment was obtained by treatment with cyanogen bromide (CNBr) as described by Scott et al (28). The complete core glycoprotein and its fragments were separated by SDS-PAGE as described above. The protein and fragments thereof were transferred to a PVDF membrane at 10 ° C. for 3 hours at 4 ° C. at 0.3 A (ampere) in 10 mM CAPS (3- (cyclohexylamino) propanesulfonic acid) buffer (pH 11) containing 10% methanol. After staining with 0.5% Ponceau Red containing 1% acetic acid, protein bands were excised from the membrane and the amino acid sequence of the protein was determined with an automated protein sequencer (PPSQ-10; Shimadzu).
cDNAライブラリーとcDNAクローンの分離
18日齢(P18)スプラグ−ドウリー(Sprague-Dawley)ラットの全脳から得られるポリ(A) +RNAを鋳型として使い、ランダムプライマーを用いて構築したλgt11cDNAライブラリーを利用した。他のλgt11cDNAライブラリーは、8日齢(P8)スプラグ−ドウリーラットの全脳から得られるポリ(A) +RNAを鋳型として使い、オリゴ(dT)プライマーを用いて構築した。これらのcDNAライブラリーはモノクローナル抗体C1,C3,C5及びC15の培養上清の混合液を用いて1×106 プラークを免疫学的にスクリーニングした。免疫学的スクリーニングはサムブロックら(Sambrook et al)の文献(非特許文献29)に記述されたようにして免疫的検出のためのベクタステイン(Vectastain)ABCキットを用いて行なった。
Isolation of cDNA library and cDNA clone λgt11 cDNA library constructed using poly (A) + RNA obtained from whole brain of 18-day-old (P18) Sprague-Dawley rats as a template and using random primers Was used. Another λgt11 cDNA library was constructed using oligo (dT) primers using poly (A) + RNA as a template from whole brains of 8-day-old (P8) sprag-Dawley rats. These cDNA libraries were immunologically screened for 1 × 10 6 plaques using a mixture of monoclonal antibody C1, C3, C5 and C15 culture supernatants. Immunological screening was performed using the Vectastain ABC kit for immunodetection as described in Sambrook et al. (Non-Patent Document 29).
最初の2つのクローン、(ランダムプライマーcDNAライブラリーからの)(NGC1と(オリゴ−d(T)プライマーcDNAライブラリーからの)(NGC3が免疫学的スクリーニングによって単離され、続いてクローンを32P標識cDNAプローブを用いてプラークハイブリダイゼーションによって得た。プラークハイブリダイゼーションとノーサンブロッテイングのためのcDNAプローブはメガプライム(Megaprime)DNAラベリングシステム(アマーシャム インターナショナル社製)を用いて標識した。(gt11クローンからのcDNA挿入物を精製し、そして pBluescript II プラスミドベクター(ストラトジーンクローニングシステム社製)中にサブクローンした。 The first two clones (from random primer cDNA library) (from NGC1 and (from oligo-d (T) primer cDNA library) (from NGC3 were isolated by immunological screening) and subsequently cloned into 32 P Obtained by plaque hybridization using a labeled cDNA probe The cDNA probe for plaque hybridization and north blotting was labeled using the Megaprime DNA labeling system (Amersham International) (from gt11 clone). The cDNA insert was purified and subcloned into the pBluescript II plasmid vector (Stratogene Cloning System).
DNAの配列決定
配列決定のために制限酵素を用いたデレーションによるサブクローニングを行なった。DNA配列決定は自動DNAシークエンサー(AlfII/Alfredコンバインドシステム;ファーマシア社)を用いてTaq ポリメラーゼと色素標識プライマーを使用し、行なった。配列の編集(Editing) と分析はGENETYX ソフトウエアー(ソフトウエアー開発(株))を用いて行われた。リーデングフレームは120kDaのコアグリコプロテインのN末端アミノ酸配列とCNBr処理によって得られたその断片についての本発明者らのデーターから裏付けられた。ジーンバンク(GenBank)(Release87)とスイス−プロット(Swiss−Prot)(Release31)中の配列との比較は部分配列探索ツールを用いて行った(非特許文献30)。
Sequencing of DNA Subcloning by restriction using restriction enzymes was performed for sequencing. DNA sequencing was performed using an automated DNA sequencer (AlfII / Alfred combined system; Pharmacia) using Taq polymerase and dye-labeled primers. Sequence editing and analysis was performed using GENETYX software (Software Development Corp.). The reading frame was supported by our data on the N-terminal amino acid sequence of the 120 kDa core glycoprotein and its fragments obtained by CNBr treatment. A comparison between the sequences in GeneBank (Release 87) and Swiss-Prot (Release 31) was performed using a partial sequence search tool (Non-patent Document 30).
ノーサンブロット分析
全RNAはチョムジンスキーおよびサッキー(Chomczynsky and Sacchi)らの文献(非特許文献31)に記述されたようにして生後7日および成熟ラットの脳から抽出し、同様に腎臓、肝臓、肺臓そして筋肉からも抽出した。ポリ(A)+ RNAはその方法手順にしたがってオリゴテックス−dT30(タカラバイオケミカル社製)を用いて精製した。ポリ(A)+ RNA(5μg)を 2.2M ホルムアルデヒドを含む1%アガロースゲル上で電気泳動し、PVDF膜(イモビロン−N、ミリポア社製)に移した(転写した)。(NGC1からの682塩基対挿入物を32P−dCTPで標識しそして3×106 cpm/mlの濃度でプローブとして用いた。このフィルターを最後に0.2 ×SSC(SSC:0.15 NaClと0.015 M 酢酸ナトリウム)中で68℃で洗浄しオートラジオグラフィーのためX−線フィルム(富士フィルム社)に露光した。
Northern blot analysis Total RNA was extracted from the brains of 7-day-old and adult rats as described in Chomczynsky and Sacchi et al. Extracted from lung and muscle. Poly (A) + RNA was purified using Oligotex-dT30 (Takara Biochemical Co., Ltd.) according to the method procedure. Poly (A) + RNA (5 μg) was electrophoresed on a 1% agarose gel containing 2.2 M formaldehyde and transferred (transferred) to a PVDF membrane (Immobilon-N, manufactured by Millipore). (The 682 base pair insert from NGC1 was labeled with 32 P-dCTP and used as a probe at a concentration of 3 × 10 6 cpm / ml. This filter was finally washed with 0.2 × SSC (SSC: 0.15 NaCl and 0.015 M acetic acid. (Sodium) at 68 ° C. and exposed to X-ray film (Fuji Film) for autoradiography.
モノクローナル抗体の特徴
本発明者らは、4種類のハイブリドーマ細胞株(C1,C3,C5そしてC15)を確立した。それぞれがウエスタンブロットにおいて膜結合型コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの調製品と反応する抗体(モノクローナル抗体C1,C3,C5およびC15)を生産した。この4種類のモノクローナル抗体(MAb)全ては抗原として用いた膜結合型コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの調製品が試験されたとき平均分子量150kDaに相当する非常に広いバンドを認識した(図3Aレーン1、MAb C5を用いたイムノブロット)。膜結合型コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの調製品をコンドロイチナーゼABCで消化した時、120kDaのタンパク質のバンドがMAb C5を用いたイムノブロットで検出された(図3Aレーン2および図3Bレーン1)。ヘパリチナーゼで処理してもこのバンドは移動しなかった(図3Aレーン3)。10日齢ラットの脳から得られたPBS可溶性プロテオグリカンの調製品を多量に用いてウエスタンブロットで分析したとき、75kDaのコアグリコプロテインがMAb C5で弱く検出された。MAb C5は肝臓、肺臓、腎臓、筋肉そして軟骨のような神経系以外から調製したいかなるプロテオグリカンのコアグリコプロテインとも反応しなかった。
Characteristics of the monoclonal antibody The present inventors established four types of hybridoma cell lines (C1, C3, C5 and C15). Antibodies (monoclonal antibodies C1, C3, C5 and C15) were produced that each reacted with a membrane-bound chondroitin sulfate proteoglycan preparation in a Western blot. All four monoclonal antibodies (MAbs) recognized a very broad band corresponding to an average molecular weight of 150 kDa when the membrane-bound chondroitin sulfate proteoglycan preparation used as the antigen was tested (FIG.
プロテオグリカンがコンドロイチン硫酸鎖に加えてオリゴ糖側鎖を有する可能性を試験するため、コアグリコプロテインを図3Bに示したように3つのグリコシダーゼ(ノイラミダーゼ、O−グリコシダーゼ、N−グリコシダーゼ)で順に消化しそして脱グリコシレーションされたコア蛋白質の分子量をSDS−PAGEで測定した(図3Bレーン2、3、4)。グリコシダーゼとのそれぞれの処理はSDS−PAGE上でのコア蛋白質のバンドの移動度の増加をひきおこした。コア蛋白質を認識するMAb C5の能力はいずれのグリコシダーゼとの消化によっても影響されなかった。それ故、MAb C5によって認識されるエピトープはポリペプチド部分に存在していると思われる。
To test the possibility that proteoglycans have oligosaccharide side chains in addition to chondroitin sulfate chains, the core glycoprotein was digested in turn with three glycosidases (neuramidase, O-glycosidase, N-glycosidase) as shown in FIG. 3B. The molecular weight of the deglycosylated core protein was measured by SDS-PAGE (FIG.
ラット大脳皮質におけるプロテオグリカンの発現をMAb C5を用いた免疫組織化学的染色によって試験した。すなわち、生後0日で、MAb C5で免疫染色した結果から該プロテオグリカンは発生中の神経細胞と関連していた(図4A)。同様の染色パターンは生後7日の大脳皮質にも見られた(図4B)。成熟脳においては、大脳皮質の免疫染色の強度は減少した。大脳皮質におけるプロテオグリカンの一時的発現を定量するため、種々の発生段階(12日胚(E12)から成熟まで)での大脳皮質のPBS−不溶性抽出物をコンドロイチナーゼABCで消化し、イムノブロッテイングを行い免疫標識されたバンドの強度を定量した。少量のプロテオグリカンが16日胚(E16)から18日胚(E18)において検出された。プロテオグリカンの量は生後20日(P20)付近で最大レベルに達するほどに増加した(図4C)。P20の後、プロテオグリカンの量は減少した。そして成熟大脳皮質においては、このプロテオグリカンは発現の最大レベルの約半分となった。 Proteoglycan expression in rat cerebral cortex was examined by immunohistochemical staining with MAb C5. That is, the proteoglycan was associated with the developing neuron from the result of immunostaining with MAb C5 at 0 days after birth (FIG. 4A). A similar staining pattern was also seen in the cerebral cortex at 7 days of age (FIG. 4B). In the mature brain, the intensity of immunostaining in the cerebral cortex decreased. To quantify transient expression of proteoglycans in the cerebral cortex, PBS-insoluble extracts of cerebral cortex at various developmental stages (from 12 day embryo (E12) to maturation) were digested with chondroitinase ABC and immunoblotted And the intensity of the immunolabeled band was quantified. A small amount of proteoglycan was detected in 16-day embryos (E16) to 18-day embryos (E18). The amount of proteoglycan increased to reach the maximum level around 20 days after birth (P20) (FIG. 4C). After P20, the amount of proteoglycan decreased. And in the mature cerebral cortex, this proteoglycan was about half the maximum level of expression.
cDNAクローンの分離
120kDaのコアグリコプロテインを精製し、それをCNBrで処理することによって数種のペプチドに分解し、完全なコアグリコプロテインと2つのペプチドの部分N末端アミノ酸配列を決定した。完全なコアグリコプロテインのN末端配列はアミノ酸の一文字表記でVPAREAGSAIEAEELであった。完全に異なったN末端配列がCNBrによって消化された2つの生産物(15kDaと24kDa)中で見いだされた。15kDaと24kDaのペプチドについてそれぞれ(M)VPGGSISLRPRPGDPGKDLA及び(M)GRFPGSPであった。
Isolation of cDNA clones The 120 kDa core glycoprotein was purified and digested into several peptides by treatment with CNBr, and the complete core glycoprotein and the partial N-terminal amino acid sequences of the two peptides were determined. The N-terminal sequence of the complete core glycoprotein was VPAREAGSAIEAEEL in single letter amino acid. Completely different N-terminal sequences were found in two products (15 kDa and 24 kDa) digested by CNBr. The 15 kDa and 24 kDa peptides were (M) VPGGSISLRRPPGDPGKDLA and (M) GRFPPGSP, respectively.
4種のMAb C1,C3,C5及びC15の混合液を用いて免疫学的にスクリーニングすることによって、P18のラット脳から誘導された(gt11 cDNAライブラリー(ランダムプライマー)から一個の陽性クローン(λNGC1)を単離し、P8のラット脳から誘導された(gt11cDNAライブラリー(オリゴ−d(T)プライマー)から他の陽性クローン(λNGC3)を最初に単離した。λNGC1とλNGC3はそれぞれ682塩基対と1398塩基対のインサートcDNAをそれぞれ含む(図5)。λNGC1に由来するβ−ガラクトシダーゼとの融合タンパク質はMAb C1とのみ反応し、MAb C3、C5及びC15とは反応しなかった。対照的にλNGC3に由来する融合タンパク質はMAb C3、C5及びC15と反応したが、MAb C1とは反応しなかった。さらに分析を行なうためにλNGC1とλNGC3をpBluescriptIIプラスミドベクター中にサブクローンした(以下それぞれをpNGC1とpNGC3という)。これらのクローンの信頼性は120kDaのコアグリコプロテインと24kDaのCNBr処理で得られた断片のアミノ酸配列がpNGC1中のインサートcDNA(第6図アンダーライン部分参照)から推定したアミノ酸配列の範囲内で一致し、そして15kDaのCNBr処理で得られた断片のアミノ酸配列がpNGC3中のインサートcDNAから推定したアミノ酸配列の範囲内で一致することから明白に立証された(図6参照、下線部分)。 One positive clone (λNGC1 from a gt11 cDNA library (random primer) derived from a rat brain of P18 by immunological screening with a mixture of four MAbs C1, C3, C5 and C15. ) Was isolated, and another positive clone (λNGC3) was first isolated from a rat brain of P8 (gt11 cDNA library (oligo-d (T) primer), λNGC1 and λNGC3 were 682 base pairs each. Each contains an insert cDNA of 1398 base pairs (FIG. 5) The fusion protein with β-galactosidase derived from λNGC1 reacted only with MAb C1, but not with MAbs C3, C5 and C15, in contrast to λNGC3. Fusion proteins derived from MAb C3, C5 and C15 ΛNGC1 and λNGC3 were subcloned into the pBluescript II plasmid vector (hereinafter referred to as pNGC1 and pNGC3, respectively) for further analysis, and the reliability of these clones was 120 kDa. The amino acid sequences of the core glycoprotein and the fragment obtained by CNBr treatment of 24 kDa match within the amino acid sequence deduced from the insert cDNA in pNGC1 (see the underlined part in FIG. 6), and obtained by CNBr treatment of 15 kDa. This was clearly demonstrated by the fact that the amino acid sequence of the obtained fragment matched within the amino acid sequence deduced from the insert cDNA in pNGC3 (see FIG. 6, underlined portion).
pNGC1中のインサートcDNAを〔32P〕−dCTPで標識しそしてこれに重なっているcDNAクローンを同定するためのプローブとして用い、P18のラット脳から誘導された(gt11 cDNA ライブラリー(ランダムプライマー)から4種類のcDNAクローン(λNGC7、λNGC13、λNGC15及びλNGC19)が、重なっているcDNA部分を含み、プロテオグリカンのコア蛋白質を全てコードするcDNAを得た。 図5はプロテオグリカン、すなわちニューログリカンC(NGC)の完全な配列の決定のために用いた異なったcDNAクローンの位置を示す。 The insert cDNA in pNGC1 was labeled with [ 32 P] -dCTP and used as a probe to identify overlapping cDNA clones, derived from a rat brain of P18 (from a gt11 cDNA library (random primer)). Four types of cDNA clones (λNGC7, λNGC13, λNGC15, and λNGC19) obtained cDNA that contained the overlapping cDNA portion and encoded all of the core protein of proteoglycan, that is, proteoglycan, that is, neuroglycan C (NGC). The location of the different cDNA clones used for complete sequencing is indicated.
NGCのコア蛋白質の予想構造
NGCのコア蛋白質を全てコードするcDNA配列と推定アミノ酸配列を図6に示した。これらのクローンは544アミノ酸をコードする読み取り枠(オープンリーデングフレーム)を含む2,107塩基対以上をカバーしている。算出された分子量(molecular mass)は58,612Daであった。3'未翻訳領域は463ヌクレオチドからなり、ポリアデニル化シグナル(AATAAA)を含む。このコーデイング領域において、CNBr切断による2種類の生産物の配列(下線部分)が同定された。120kDaのコアグリコプロテインのN末端アミノ酸配列(図6のアミノ酸残基31番ではじまる配列(下線部分))を決定した。13番目のヌクレオチドから始まるATGトリプレット付近のヌクレオチド配列は翻訳の開始部位に対応する配列に相当する(非特許文献32)。cDNAの5'領域の12塩基対は5'未翻訳領域である。最初のメチオニンから成熟コア蛋白質の最初のアミノ酸残基(バリン)までに疎水性アミノ酸配列があるがこれは恐らくシグナルペプチド配列である。カイテとドウーリトル(Kyte and Doolittle)ら(非特許文献33)の方法による予想タンパク質アミノ酸配列の疎水性か親水性かの分析(図2)から2個の塩基性残基に続く24アミノ酸からなる(図6のアミノ酸残基番号426−450)カルボキシル末端付近に第2の疎水性配列が明らかになった(図6、破線)。この配列はサバチニら(Sabatini et al)(非特許文献34)によって提案された膜貫通ドメインについての性質に一致する。
Predicted structure of NGC core protein FIG. 6 shows a cDNA sequence and a deduced amino acid sequence encoding all NGC core proteins. These clones cover more than 2,107 base pairs, including an open reading frame encoding 544 amino acids. The calculated molecular mass was 58,612 Da. The 3 ′ untranslated region consists of 463 nucleotides and contains a polyadenylation signal (AATAAA). In this coding region, two types of product sequences (underlined) by CNBr cleavage were identified. The N-terminal amino acid sequence of the 120 kDa core glycoprotein (sequence starting from amino acid residue 31 in FIG. 6 (underlined portion)) was determined. The nucleotide sequence near the ATG triplet starting from the 13th nucleotide corresponds to the sequence corresponding to the translation start site (Non-patent Document 32). The 12 base pairs of the 5 ′ region of the cDNA is a 5 ′ untranslated region. There is a hydrophobic amino acid sequence from the first methionine to the first amino acid residue (valine) of the mature core protein, which is probably the signal peptide sequence. From the analysis of whether the predicted protein amino acid sequence is hydrophobic or hydrophilic (Fig. 2) by the method of Kyte and Doolittle et al. (Non-patent Document 33), it consists of 24 amino acids following two basic residues ( A second hydrophobic sequence was revealed near the carboxyl terminus (amino acid residue numbers 426-450 in FIG. 6) (FIG. 6, dashed line). This sequence is consistent with the properties for the transmembrane domain proposed by Sabatini et al.
NGCのコアグリコプロテインはグリシン(10.5%)、ロイシン(9.9 %)、プロリン(9.0 %)、グルタミン酸(8.1 %)、セリン(7.9 %)そしてスレオニン(7.7 %)残基に富んでいる。計算より求められたNGCのpIは4.9 である。コアグリコプロテイン中に全部で10のシステイン残基が見いだされた。これら全てはNGCの中央に位置し、膜貫通ドメインより細胞の外側に位置している。NGCのコアグリコプロテインの推定される細胞外ドメインは3つのN−グリコシレーション可能な部位(非特許文献35)をふくみそしてO−結合糖鎖が結合可能な3つのセリンースレオニンクラスター(図6のアミノ酸残基番号143−144、188−189及び271−272)を含む(非特許文献36)。 NGC's core glycoprotein is rich in glycine (10.5%), leucine (9.9%), proline (9.0%), glutamic acid (8.1%), serine (7.9%) and threonine (7.7%) residues. The NGC pI obtained from the calculation is 4.9. A total of 10 cysteine residues were found in the core glycoprotein. All of these are located in the center of NGC and outside the cell from the transmembrane domain. The putative extracellular domain of NGC's core glycoprotein contains three N-glycosylation sites (Non-patent Document 35) and three serine-threonine clusters to which O-linked sugar chains can bind (FIG. 6). Amino acid residue numbers 143-144, 188-189, and 271-272) (Non-patent Document 36).
図6のアミノ酸番号残基31から281のN−末端領域は8個のセリン−グリシン(SG)あるいはグリシン−セリン(GS)のジペプチド配列を含んでいる。これらのジペプチドは、コンドロイチン硫酸の結合部位に合致するコア−部位の配列であると考えられる(非特許文献18、37)。この8個のセリン残基のまわりのアミノ酸配列はSGXG(非特許文献37)と(E/D)GSG(E/D)(非特許文献18)で示されるグリコサミノグリカンの結合部位に対応する配列とは異なっている。しかしながら、これらの対応する配列はコア蛋白質へグリコサミノグリカンが結合し得る唯一の配列ではない。例えば、ニューロカンにおいて、コンドロイチン硫酸鎖が結合しているセリン残基付近の配列はEEVASGQED(非特許文献16)である。アグリカン、バーシカン、シンデカン、デコリン及びIX型コラーゲンのようなプロテオグリカンにおけるコンドロイチン硫酸の結合部位に特徴的なアミノ酸の配列は前にSG/GSがそして酸性アミノ酸残基が続くことが報告されている(図7)。コンドロイチン硫酸の結合において酸性アミノ酸残基の重要性は同様に別の文献に記述されている(非特許文献18、37、38)。NGCコア蛋白質の8個のSG/GS−ジペプチドの付近にこれらに対応する配列が並んでいる。NGCは予想される細胞外ドメイン中に2個の付加的ジペプチド配列((図2の341番と374番のセリン残基)を含む。しかしながら、これらのジペプチドはコンドロイチン硫酸の結合部位に対応する配列と関連していなかった。従って、N−末端ドメインを推定コンドロイチン硫酸結合ドメインとした。塩基性アミノ酸の短い配列KRRKRRRRIR(図6のアミノ酸残基番号282−291)が仮のコンドロイチン硫酸結合ドメインに近接して見いだされた(2本下線で示す)。さらに塩基性アミノ酸の短い配列の後に、10個のシステイン残基を含む133個のアミノ酸(図6のアミノ酸残基番号292−425)からなる領域が見だされた。 The N-terminal region of amino acid number residues 31 to 281 in FIG. 6 contains eight serine-glycine (SG) or glycine-serine (GS) dipeptide sequences. These dipeptides are considered to be core-site sequences that match the binding site of chondroitin sulfate (Non-patent Documents 18 and 37). The amino acid sequences around these eight serine residues correspond to the glycosaminoglycan binding sites represented by SGXG (Non-patent Document 37) and (E / D) GSG (E / D) (Non-patent Document 18). It is different from the arrangement. However, these corresponding sequences are not the only sequences to which glycosaminoglycans can bind to the core protein. For example, in the neurocan, the sequence near the serine residue to which the chondroitin sulfate chain is bound is EEVASGQED (Non-patent Document 16). The amino acid sequence characteristic of the chondroitin sulfate binding site in proteoglycans such as aggrecan, versican, syndecan, decorin and type IX collagen has been reported to be preceded by SG / GS and acidic amino acid residues (FIG. 7). The importance of acidic amino acid residues in the binding of chondroitin sulfate is similarly described in other documents (Non-patent Documents 18, 37, 38). Sequences corresponding to these are arranged in the vicinity of the eight SG / GS-dipeptides of the NGC core protein. NGC contains two additional dipeptide sequences ((Serine residues 341 and 374 in FIG. 2) in the predicted extracellular domain, however, these dipeptides are sequences corresponding to the chondroitin sulfate binding site. Therefore, the N-terminal domain was the putative chondroitin sulfate binding domain, and the short sequence of basic amino acids KRRKRRRRRIR (amino acid residues 282 to 291 in FIG. 6) is in proximity to the temporary chondroitin sulfate binding domain. (A region consisting of 133 amino acids (amino acid residues 292 to 425 in FIG. 6) including 10 cysteine residues after a short basic amino acid sequence) Was found.
またNGCの細胞質ドメインはプロテインキナーゼによってリン酸化可能な部位となるセリンおよびスレオニン残基を含む。図6のアミノ酸残基番号465番のスレオニン残基付近のアミノ酸配列(KLRRTNK)と521番のセリン残基付近のアミノ酸配列(SPK)はグラフら(Graff et al)(非特許文献42)によって提案されたプロテインキナーゼCによるリン酸化部位に対応する配列(X(R/K)XX(T/S)X(R/K))に類似している。NGCがリン酸化されるかどうかは決定されていないけれども、NGCがシグナル伝導に関与している可能性はある。仮の細胞質ドメインは2つのチロシン残基を含む。しかしこれらのチロシン残基に接続する配列はチロシンのリン酸化に対して報告された対応する配列とは異なっている(非特許文献43)。図8はNGCコア蛋白質の提案されるドメイン構造の図示的表現である。 The cytoplasmic domain of NGC contains serine and threonine residues that serve as sites that can be phosphorylated by protein kinases. The amino acid sequence near the threonine residue of amino acid residue number 465 in FIG. 6 (KLRRTNK) and the amino acid sequence near the serine residue of number 521 (SPK) are proposed by Graff et al (Non-patent Document 42). Is similar to the sequence corresponding to the phosphorylated site by protein kinase C (X (R / K) XX (T / S) X (R / K)). Although it has not been determined whether NGC is phosphorylated, NGC may be involved in signal conduction. The hypothetical cytoplasmic domain contains two tyrosine residues. However, the sequences connected to these tyrosine residues are different from the corresponding sequences reported for tyrosine phosphorylation (Non-patent Document 43). FIG. 8 is a diagrammatic representation of the proposed domain structure of the NGC core protein.
アミノ酸レベルでのデータベース検索によりNGCの小さな部位がアグリカン、および軟骨のコンドロイチン硫酸プロテオグリカン(非特許文献44)のコアプロテインと似ている。この類似する領域は全てNGCの推定の細胞外ドメイン中に分布している。推定のコンドロイチン硫酸結合ドメインにおいて、11のホモロジーのあるクラスターを同定した:NGCの (図2のアミノ酸残基番号45−94とアグリカンの残基番号907−956(32%同一性/48%化学的相似性);以下同様に残基番号とその同一性、相似性を示すと26−70と967−1011(29%/56%);53−103と955−1005(22%/47%);88−113そして1585−1610(42%/54%);117−151と1649−1683(31%/40%);43−92と1130−1179(28%/38%);50−94と892−936(27%/47%);59−108と1233−1282(22%/44%);122−163と1296−1337(29%/36%);109−153と1705−1749(31%/40%);及び90−114と1108−1132(32%/56%)である。アグリカンにおいてホモロジーのあるクラスターの全ては推定されるコンドロイチン硫酸結合部位ドメインに局在している。NGCのシステイン含有ドメイン中に本発明者らは3つのホモロジーのあるクラスターを見いだした: (図2のアミノ酸残基番号287−322と1827と1862(31%同一性/42%化学的相似性);以下同様に348−386と1898−1936(23%/38%);及び401−411と1998−2008(55%/55%)である。アグリカン中の対応するホモロジーのあるクラスターの全ては同様にアグリカンのシステイン含有ドメインのひとつに局在している。ラットアグリカンとNGCのホモロジーのある配列の図示的配列が図9に示されている。アグリカンはいくつかの構造的に異なったドメインからなる、つまり、免疫グロブリン様ドメインとN末端部位中でのヒアルロン酸結合領域の2回の繰り返し、中央部のコンドロイチン硫酸結合部位ドメインとEGF様ドメイン、レクチン様ドメイン及びカルボキシ末端部位での補体調節タンパク質様ドメインからなる(非特許文献44)(図9参照)。いくつかの他のコンドロイチン硫酸プロテオグリカン、例えばバーシカン(非特許文献18)、ニューロカン(非特許文献16)、ブレビカン(非特許文献17)そしてBEHAB(非特許文献19)は同様にこれらのドメインを含む。従って、これらは全てアグリカンファミリーのメンバーであるとされる。NGCはこのファミリーのメンバーではない、なぜならNGCコア蛋白質はコンドロイチン硫酸結合ドメインを除いてこれらのいかなるドメインももたないからである(図9)。 By searching the database at the amino acid level, a small portion of NGC is similar to the core protein of aggrecan and chondroitin sulfate proteoglycan (Non-patent Document 44) of cartilage. All of these similar regions are distributed in the putative extracellular domain of NGC. In the putative chondroitin sulfate binding domain, 11 homologous clusters were identified: NGC (amino acid residues 45-94 in FIG. 2 and aggrecan residues 907-956 (32% identity / 48% chemical (Similarity); hereinafter, the residue numbers and their identities and similarities are shown as 26-70 and 967-1011 (29% / 56%); 53-103 and 955-1005 (22% / 47%); 88-113 and 1585-1610 (42% / 54%); 117-151 and 1649-1683 (31% / 40%); 43-92 and 1130-1179 (28% / 38%); 50-94 and 892 -936 (27% / 47%); 59-108 and 1233-1282 (22% / 44%); 122-163 and 1296-1337 (29% / 36%); 10 9-153 and 1705-1749 (31% / 40%); and 90-114 and 1108-1132 (32% / 56%) All of the homologous clusters in aggrecan are putative chondroitin sulfate binding site domains In the cysteine-containing domain of NGC, we found three homologous clusters: (amino acid residues 287-322, 1827 and 1862 in FIG. 2 (31% identity / 42% chemical similarity); 348-386 and 1898-1936 (23% / 38%); and 401-411 and 1998-2008 (55% / 55%), as well as the corresponding homology in aggrecan. All of the clusters in are also located in one of the cysteine-containing domains of aggrecan. An illustrative sequence of homologous sequences of aggrecan and NGC is shown in Figure 9. Aggrecan consists of several structurally distinct domains: an immunoglobulin-like domain and hyaluronic acid in the N-terminal site. It consists of two repeats of the binding region, a central chondroitin sulfate binding site domain, an EGF-like domain, a lectin-like domain, and a complement regulatory protein-like domain at the carboxy terminal site (Non-patent Document 44) (see FIG. 9). Some other chondroitin sulfate proteoglycans, such as versican (Non-patent document 18), neurocan (Non-patent document 16), brevican (Non-patent document 17) and BEHAB (Non-patent document 19) contain these domains as well. Therefore, they are all considered to be members of the aggrecan family. . NGC is not a member of this family because the NGC core protein does not have any of these domains except the chondroitin sulfate binding domain (FIG. 9).
ノーサンブロット分析
NGCのmRNAの組織分布をノーザンブロット分析によって検討し(図10)、3.1 kbの単一転写産物が7日齢と成熟ラットの脳の分析で検出された。ここでNGCのコーデイング領域とNGCのmRNAの間の長さの違いはmRNAにおける5'未翻訳領域と3'非コーデイング領域(図5、矢印)の存在に帰する。この転写産物は腎臓、肝臓、肺臓そして筋肉の分析では検出されなかった。
Northern blot analysis The tissue distribution of NGC mRNA was examined by Northern blot analysis (Figure 10), and a single 3.1 kb transcript was detected by analysis of 7 day old and adult rat brains. Here, the difference in length between the NGC coding region and the NGC mRNA is attributed to the presence of a 5 ′ untranslated region and a 3 ′ uncoded region (FIG. 5, arrow) in the mRNA. This transcript was not detected by analysis of kidney, liver, lung and muscle.
ヒト由来のNGCのクローニング
32P標識したcDNAプローブをラットのNGCのDNA断片(制限酵素XbaI-Hind III 消化DNA断片:配列表1の塩基番号624〜1735)をもとにして作製した。これをプローブとし2歳の健常な女性の側頭皮質より作製した市販のcDNAライブラリー(Stratagene Cloning System社) からプラークハイブリダイゼーションによって相同性の高い塩基配列を有するクローンを単離した。プラークハイブリダイゼーションの宿主には大腸菌(Escherichia coli) XL-1 blue MRF'(Stratagene Cloning System社) を用いた。ハイブリダイゼーションの条件は、60℃、3xSSC(SSC:0.15M NaCl、0.015M酢酸ナトリウム) 中で行い、洗浄は60℃、0.1 xSSCで行った。単離したDNAクローンは、pBluescriptII(Stratagene Cloning System社) にサブクローンした。
Cloning of human-derived NGC
A 32 P-labeled cDNA probe was prepared based on a rat NGC DNA fragment (restriction enzyme XbaI-Hind III digested DNA fragment: base numbers 624 to 1735 in Sequence Listing 1). Using this as a probe, a clone having a highly homologous base sequence was isolated by plaque hybridization from a commercially available cDNA library (Stratagene Cloning System) produced from the temporal cortex of a 2-year-old healthy woman. Escherichia coli XL-1 blue MRF '(Stratagene Cloning System) was used as a plaque hybridization host. Hybridization was performed at 60 ° C. in 3 × SSC (SSC: 0.15 M NaCl, 0.015 M sodium acetate), and washing was performed at 60 ° C. and 0.1 × SSC. The isolated DNA clone was subcloned into pBluescriptII (Stratagene Cloning System).
DNAの塩基配列決定は、実施例8と同様に行った。NGCのコア蛋白質を全てコードするcDNA配列と推定アミノ酸配列を配列番号2に示した。これらのクローンは545アミノ酸をコードする読み取り枠(オープンリーディングフレーム)を含む1740塩基対以上をカバーしている。算出された蛋白質の分子量は58538.89(未確定の3アミノ酸残基を除く)であった。またラットのNGC遺伝子との相同性は83.6%であった。また、ヒト由来のNGCをコードするDNA の塩基配列から推定されるアミノ酸配列を、配列番号2に併記した。ラットのNGCとの相同性は83.9%であった。 The DNA base sequence was determined in the same manner as in Example 8. The cDNA sequence encoding the entire NGC core protein and the deduced amino acid sequence are shown in SEQ ID NO: 2. These clones cover 1740 base pairs or more, including an open reading frame encoding 545 amino acids. The calculated molecular weight of the protein was 58538.89 (excluding three undefined amino acid residues). The homology with the rat NGC gene was 83.6%. In addition, the amino acid sequence deduced from the base sequence of DNA encoding human-derived NGC is also shown in SEQ ID NO: 2. The homology with rat NGC was 83.9%.
Claims (4)
(コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの製造方法)
工程1:ラットの脳を2mM フェニルメチルスルフォニルフルオライド、20mM EDTA及び10mM N−エチルマレイミドを含むリン酸塩緩衝食塩水中でホモジナイズし、そのホモジネートを27,000xgで40分間遠心して沈澱物を回収する。(本工程および以下の工程は特に示していない限り全て4℃で行う。)
工程2:工程1で回収した沈殿物について、再度、工程1と同様にホモジネーションし、遠心して、不溶性物質を回収する。
工程3:工程2で回収した不溶性物質を、2mM フェニルメチルスルフォニルフルオライドと1%ノニデット P−40を含むリン酸塩緩衝食塩水中で0℃においてホモジナイズし、ホモジネートを回収する。
工程4:工程3で回収したホモジネートを60分間撹拌し、次いでこれを27,000xgで40分間遠心して上清を回収し、これを凍結乾燥する。
工程5:工程4で得られた凍結乾燥物を、0.2 %ノニデットP−40、0.1 M NaCl、2mM EDTA、1mM N−エチルマレイミド及び0.2 mMフェニルメチルスルフォニルフルオライドを含む4M尿素、50mMトリス塩酸緩衝液(pH7.5)中に分散し、次いで同緩衝液に対して透析する。
工程6:工程5における透析後の溶液を27,000xgで30分間遠心し、上清を回収する。
工程7:工程6で回収した上清を、尿素緩衝液で平衡化したDEAE−樹脂と混合し、この混合物を2時間撹拌する。
工程8:工程7における撹拌後のDEAE−樹脂を回収し、これを尿素緩衝液で洗浄する。
工程9:工程8における洗浄後のDEAE−樹脂をカラムにつめ、次いで尿素緩衝液中でNaClの直線濃度勾配(0.1 Mから0.7 M)をかけ、0.45から0.68MのNaCl濃度で溶出される画分を回収する。
工程10:工程9で回収された画分を濃縮し、この濃縮液を、0.2 %ノニデットP−40と2mM フェニルメチルスルフォニルフルオライドとを含む4Mグアニジン塩酸、50mM トリス塩酸緩衝液(pH7.5)を用いたセファロースCL−4Bのカラム(直径1.6 cm×100cm)のクロマトグラフィーに付し、Kavが0.11から0.65の範囲にある画分を回収する。
工程11:工程10で回収された画分を濃縮する。
工程12:工程11で得られた濃縮液に、1.3 %(W/V)酢酸カリウムを含む3倍容の95%エタノールを添加して、沈殿物を形成させる。
工程13:工程12で形成された沈澱物を、0℃で、1%(W/V)酢酸カリウムを含む75%エタノールで洗浄し、減圧乾燥する。
工程14:工程13で得られた乾燥物を、室温で、グアニジン塩酸緩衝液(4Mグアニジン塩酸、50mMトリス塩酸、pH7.5)に溶解する。
工程15:工程14で得られた溶液をオクチルセファロースのカラム(直径1.6 cm×5.0 cm)に負荷し、グアニジン塩酸緩衝液中でノニデットP−40の直線濃度勾配(0%から0.8 %(V/V))をかけ、0.3 %から0.6 %(v/v)のノニデットP−40濃度で溶出される画分を回収する。
工程16:工程15で回収した画分にエタノールを添加して沈殿物を形成させ、この沈殿物を減圧乾燥する。
工程17:工程16で得られた乾燥物を、グアニジン塩酸緩衝液(4Mグアニジン塩酸、50mMトリス塩酸、pH7.5)中で塩化セシウム密度勾配遠心法(初期密度1.38g/ml;10℃;150,000xg で30時間)に付する。
工程18:工程17の処理が終了した試料を7つに分画し、その第2番目から第6番目の画分を回収する。
工程19:工程18で回収した画分をリン酸塩緩衝食塩水に対して透析して、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン画分を取得する。
(コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの性質)
(A)糖鎖:分子量30キロダルトンのコンドロイチン硫酸を含有する。
(B)本プロテオグリカンにノイラミニダーゼ、O−グリコシダーゼまたはN−グリコシダーゼを作用させると糖鎖が遊離する。
(C)分子量が、還元条件下におけるドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動において150キロダルトンである。
(コンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコア蛋白質の性質)
(a)配列表配列番号2に示す1番目のバリン(Val)から514番目のトレオニン(Thr)までのアミノ酸配列を有する。
(b)分子量が、還元条件下におけるドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動において120キロダルトンである。
(抗体の性質)
(1) 上記のコンドロイチン硫酸プロテオグリカン及び上記のコア蛋白質の両者あるいはいずれか一方に結合する。
(2) 上記のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンをコンドロイチナーゼABCで消化して得られる産物に結合する。
(3) 上記(2)により得られる産物をさらにヘパリチナーゼIで消化して得られる産物に結合する。
(4) 上記(3)により得られる産物をさらにノイラミニダーゼで消化して得られる産物に結合する。
(5) 上記(4)により得られる産物を、さらにN−グリコシダーゼ及びO−グリコシダーゼのいずれかの酵素で消化して得られる100キロダルトン(還元条件下におけるドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動)の産物にも結合する。
(6) エピトープが、上記のプロテオグリカンのポリペプチド部分に存在する。 A chondroitin sulfate proteoglycan produced by the following method and having the following properties can be immunized to a mammal other than a human and collected from the body fluid of the animal, or produced by antibody-producing cells of the animal. An antibody having the following properties:
(Method for producing chondroitin sulfate proteoglycan)
Step 1: Rat brain is homogenized in phosphate buffered saline containing 2 mM phenylmethylsulfonyl fluoride, 20 mM EDTA and 10 mM N-ethylmaleimide, and the homogenate is centrifuged at 27,000 × g for 40 minutes to collect the precipitate. (This step and the following steps are all performed at 4 ° C. unless otherwise specified.)
Step 2: The precipitate collected in Step 1 is homogenized again in the same manner as in Step 1 and centrifuged to collect insoluble substances.
Step 3: The insoluble material recovered in Step 2 is homogenized at 0 ° C. in phosphate buffered saline containing 2 mM phenylmethylsulfonyl fluoride and 1% nonidet P-40 to recover the homogenate.
Step 4: Stir the homogenate recovered in Step 3 for 60 minutes, then centrifuge it at 27,000 xg for 40 minutes to recover the supernatant and freeze-dry it.
Step 5: The lyophilized product obtained in Step 4 was mixed with 4M urea, 50 mM Tris-HCl buffer containing 0.2% nonidet P-40, 0.1 M NaCl, 2 mM EDTA, 1 mM N-ethylmaleimide and 0.2 mM phenylmethylsulfonyl fluoride. Disperse in solution (pH 7.5) and then dialyze against the same buffer.
Step 6: The solution after dialysis in Step 5 is centrifuged at 27,000 × g for 30 minutes, and the supernatant is collected.
Step 7: The supernatant collected in Step 6 is mixed with DEAE-resin equilibrated with urea buffer and the mixture is stirred for 2 hours.
Step 8: The DEAE-resin after stirring in Step 7 is recovered and washed with urea buffer.
Step 9: The washed DEAE-resin in Step 8 is packed into a column and then subjected to a linear NaCl gradient (0.1 M to 0.7 M) in urea buffer and eluted at a NaCl concentration of 0.45 to 0.68 M. Collect the minutes.
Step 10: The fraction collected in Step 9 is concentrated, and this concentrate is added to 4M guanidine hydrochloride, 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5) containing 0.2% nonidet P-40 and 2 mM phenylmethylsulfonyl fluoride. Chromatography is performed on a Sepharose CL-4B column (diameter 1.6 cm × 100 cm) using the above, and a fraction having a Kav in the range of 0.11 to 0.65 is collected.
Step 11: Concentrate the fraction collected in Step 10.
Step 12: To the concentrate obtained in Step 11, 3 volumes of 95% ethanol containing 1.3% (W / V) potassium acetate is added to form a precipitate.
Step 13: The precipitate formed in Step 12 is washed with 75% ethanol containing 1% (W / V) potassium acetate at 0 ° C. and dried under reduced pressure.
Step 14: The dried product obtained in Step 13 is dissolved in guanidine hydrochloride buffer (4M guanidine hydrochloride, 50 mM Tris hydrochloride, pH 7.5) at room temperature.
Step 15: The solution obtained in Step 14 was loaded onto an octyl sepharose column (diameter 1.6 cm × 5.0 cm), and a linear concentration gradient (0% to 0.8% (V / V) of nonidet P-40 in guanidine hydrochloride buffer solution. V)) and collect the fraction eluted at a nonidet P-40 concentration of 0.3% to 0.6% (v / v).
Step 16: Ethanol is added to the fraction collected in Step 15 to form a precipitate, and this precipitate is dried under reduced pressure.
Step 17: The dried product obtained in Step 16 was subjected to cesium chloride density gradient centrifugation (initial density 1.38 g / ml; 10 ° C .; 150,000) in guanidine hydrochloride buffer (4 M guanidine hydrochloride, 50 mM Tris hydrochloride, pH 7.5). xg for 30 hours).
Step 18: The sample that has undergone the processing in Step 17 is fractionated into seven, and the second to sixth fractions are collected.
Step 19: The fraction collected in Step 18 is dialyzed against phosphate buffered saline to obtain a chondroitin sulfate proteoglycan fraction.
(Characteristics of chondroitin sulfate proteoglycan)
(A) Sugar chain: Contains chondroitin sulfate having a molecular weight of 30 kilodaltons.
(B) When the neuraminidase, O-glycosidase or N-glycosidase is allowed to act on the proteoglycan, the sugar chain is released.
(C) The molecular weight is 150 kilodaltons in sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis under reducing conditions.
(Characteristics of chondroitin sulfate proteoglycan core protein)
(A) It has an amino acid sequence from the first valine (Val) to the 514th threonine (Thr) shown in SEQ ID NO: 2 in Sequence Listing.
(B) The molecular weight is 120 kilodaltons in sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis under reducing conditions.
(The nature of the antibody)
(1) It binds to the chondroitin sulfate proteoglycan and / or the core protein.
(2) The above chondroitin sulfate proteoglycan is bound to a product obtained by digestion with chondroitinase ABC.
(3) The product obtained by (2) above is further bound to the product obtained by digesting with heparitinase I.
(4) The product obtained by (3) above is further bound to the product obtained by digesting with neuraminidase.
(5) 100 kilodaltons obtained by further digesting the product obtained in (4) above with either N-glycosidase or O-glycosidase (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis under reducing conditions) It also binds to the product.
(6) An epitope is present in the polypeptide portion of the above proteoglycan.
A sample obtained by digesting a phosphate buffered saline-insoluble extract of cerebral cortex with chondroitinase ABC is subjected to immunoblotting using the antibody according to any one of claims 1 to 3. A method for measuring chondroitin sulfate proteoglycan or a core protein thereof in the cerebral cortex.
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