JP4153607B2

JP4153607B2 - Novel recombinant adenovirus

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Publication number: JP4153607B2
Application number: JP32856698A
Authority: JP
Inventors: 泉斎藤; 裕美鐘ケ江
Original assignee: Sumitomo Dainippon Pharma Co Ltd
Current assignee: Sumitomo Pharma Co Ltd
Priority date: 1998-11-18
Filing date: 1998-11-18
Publication date: 2008-09-24
Anticipated expiration: 2018-11-18
Also published as: JP2000152781A; CA2351314A1; US6740515B1; WO2000029598A1

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、組換えアデノウイルスに関する。
【０００２】
【従来の技術】
アデノウイルスベクターは、遺伝子導入効率の高さ、高力価ウイルス液の調製の容易さ、非増殖細胞にも遺伝子導入可能などの利点から、遺伝子治療用のベクターとして有望視されている。現在汎用されているアデノウイルスベクターは、アデノウイルスの増殖に必須なE1遺伝子を欠失させた非増殖型アデノウイルスベクターであるが、ヒトや動物個体に投与した場合、アデノウイルス蛋白質が発現することが知られており、安全性の観点から、ウイルスにコードされる蛋白質がなるべく発現しない構造のベクターが望まれている。
【０００３】
そのベクターの構造とは、治療用遺伝子など目的の外来遺伝子を挿入し、かつアデノウイルス由来の蛋白質をコードする遺伝子の一部もしくは全てを除いたものである。しかし、かかる性質を保持するウイルス（目的ベクターウイルス）は単独では増殖できないため、もう一つのアデノウイルス（ヘルパーウイルス）とともに宿主細胞に感染させ、ヘルパーウイルスから供給されたアデノウイルスの増殖に必須の蛋白質により、ヘルパーウイルスとともに目的ベクターウイルスも増殖させるという方法が取られている（Mitani, K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. Vol.92, 3854-3858 (1995)）。このヘルパーウイルスを用いた組換えアデノウイルス作製法においては、目的ベクターウイルスに対しヘルパーウイルスの量が少ない、すなわちヘルパーウイルスの増殖が抑制されているほど望ましい。
【０００４】
そのための方策の一つとして、ヘルパーウイルスゲノムのパッケージング配列の両側にリコンビナーゼCre の認識配列であるloxP配列を挿入したヘルパーウイルスを目的ベクターウイルスとともにリコンビナーゼCre を発現する宿主細胞に感染させて、パッケージング配列を除き、ヘルパーウイルスのゲノムDNA がウイルス粒子にパッケージングされなくなることにより、ヘルパーウイルスの増殖を抑制する工夫（Parks, RJ. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. Vol.93, 13565-13570 (1996)）がなされている。
【０００５】
パッケージング配列の両側にloxP配列を挿入したヘルパーウイルスは、それ単独で増殖させる場合は、増殖が抑制されないことおよび挿入したloxP配列が欠落しないことが重要であり、特にパッケージング配列の左側、すなわちアデノウイルス左端逆方向反復配列（inverted terminal repeat: ITR)とパッケージング配列との間のloxP配列の挿入部位は重要である。なぜならば、左端ITR とパッケージング配列との間に外来遺伝子を挿入可能な領域は、わずか100 塩基足らずの範囲しかないからである。前述したヘルパーウイルスのloxP配列挿入部位は、アデノウイルス５型の塩基配列188 位である（Parks, R. J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. Vol.93, 13565-13570 (1996)）。また、他のloxP配列の挿入例として、アデノウイルス５型の塩基配列193 位と194 位との間が報告されている（Hardy, S. et al., J. Virol. Vol.71, 1842-1849 (1997)）が、これらの挿入部位はいずれもパッケージング配列の直前であり、これらの部位がリコンビナーゼ認識配列の挿入部位として最善がどうかは明らかでない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、遺伝子治療の分野において一層安全性の高い遺伝子治療用ベクターの作製のための材料として、アデノウイルス左端ITR とパッケージング配列との間の新たな位置にリコンビナーゼ認識配列を挿入した組換えアデノウイルスを提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ヒトアデノウイルス５型を用いて、左端ITR とパッケージング配列との間で、リコンビナーゼ認識配列の挿入可能な部位を検索し、新たなリコンビナーゼ認識配列の挿入部位を発見した。かかる知見に基づき、当該部位にリコンビナーゼ認識配列の一つであるloxP配列を挿入した新たな組換えアデノウイルスを作製し、かつ当該アデノウイルスを、当該部位にloxP配列が挿入されていない他の組換えアデノウイルスと同等のウイルス力価を保持させることに成功した。
【０００８】
すなわち、本発明の要旨は、
下記配列：
（１）左端逆方向反復配列、
（２）パッケージング配列、
（３）前記左端逆方向反復配列と前記パッケージング配列の中間領域であって、ヒトアデノウイルス５型の 143 〜 148 位のいずれかに位置するリコンビナーゼ認識配列、および
（４）前記パッケージング配列の下流領域に位置する、前記リコンビナーゼ認識配列を認識するリコンビナーゼにより認識される少なくとももう１つのリコンビナーゼ認識配列、
をゲノム中に含有してなる、ヒトアデノウイルス５型の組換えアデノウイルス、
に関する。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明において、「組換えアデノウイルス」とは、アデノウイルス固有の塩基配列以外の塩基配列をそのゲノム中に含有するアデノウイルスのことをいう。アデノウイルス固有の塩基配列以外の塩基配列には特に制限はなく、蛋白質をコードする遺伝子やプロモーターやポリＡ配列などの調節遺伝子であってもよいし、また何ら機能を有さない塩基配列であってもよい。
【００１０】
本発明において、「左端逆方向反復配列」（以下、左端ITR と略す）とは、アデノウイルスゲノムの複製開始に必須なゲノム両端の塩基配列のうち、左端（即ち、E1遺伝子の上流側) に存在する塩基配列のことをいう。その具体例として、ヒトアデノウイルス５型においては、塩基配列1 位〜103 位が挙げられる。
【００１１】
本発明において、「パッケージング配列」とは、アデノウイルスゲノムDNA がアデノウイルス粒子に挿入されるために必須の塩基配列をいう。その具体例として、ヒトアデノウイルス５型においては、塩基配列195 位〜358 位が挙げられる。
【００１２】
本発明において、「リコンビナーゼ認識配列」とは、特異的DNA 組換え酵素である「リコンビナーゼ」により認識される塩基配列であって、「リコンビナーゼ」存在下に二つの「リコンビナーゼ認識配列」間で、DNA 鎖の切断、DNA 鎖の交換と結合の全行程の反応が可能となる塩基配列のことをいう。
【００１３】
「リコンビナーゼ」の例としては、バクテリオファージＰ１由来のリコンビナーゼ Cre（Sternberg et al., J. Mol. Biol. Vol.150, 467-486 (1981) ）、酵母(Saccharomyces cerevisiae)の２ミクロンＤＮＡによりコードされるＦＬＰ（Babineau et al., J. Biol. Chem. Vol.260, 12313-12319 (1985))、チゴサッカロマイセス・ルーイのpSR1プラスミド由来のＲ（Matsuzaki et al., Mol. Cell. Biol. Vol.8, 955-962 (1988)）などが挙げられる。
【００１４】
本発明において、「パッケージング配列の下流領域」とは、パッケージング配列から右端（即ち、E1遺伝子の下流側) ITR の間の領域をいう。その具体例として、ヒトアデノウイルス５型においては、塩基配列359 位以降が挙げられる。
【００１５】
本発明において、「リコンビナーゼ認識配列がバクテリオファージＰ１由来のリコンビナーゼCre の基質となる」とは、リコンビナーゼCre により、二つの「リコンビナーゼ認識配列」間で、DNA 鎖の切断、DNA 鎖の交換と結合の全行程の反応が起きることをいう。「リコンビナーゼ認識配列」の典型的な例としては、バクテリオファージＰ１内の34塩基からなるloxP配列（Abremski et al., J. Biol. Chem., 1509 −1514 (1984) および Hoess et al., Proc. Natl. Acad. Sci. Vol.81, 1026−1029 (1984))が挙げられる。loxP配列は下記の塩基配列からなるDNA 配列であり、以後この配列のことを野生型loxP配列という。
【００１６】
5'-ATAACTTCGTATA ATGTATGC TATACGAAGTTAT-3' （配列番号：１）
3'-TATTGAAGCATAT TACATACG ATATGCTTCAATA-5' （配列番号：２）
（前記配列中、下線部はスペーサー領域を示す）
【００１７】
本発明において、「リコンビナーゼCre の基質となる『リコンビナーゼ認識配列』」とは前記野生型loxP配列に限定される必要はなく、二つの「リコンビナーゼ認識配列」がリコンビナーゼCre 基質となる限りは、野生型loxP配列の一部が他の塩基に置換されていてもよい。さらに、野生型loxP配列の塩基の置換により、野生型loxP配列との組合せではリコンビナーゼCre の基質とならないloxP配列（変異型loxP配列）であっても、二つの同じ配列の変異型loxP配列どおしではリコンビナーゼCre の基質となる、すなわちDNA 鎖の切断、DNA 鎖の交換と結合の全行程の反応が起きる配列は、リコンビナーゼCre の認識配列に含まれる。そのような変異型loxP配列の例として、野生型loxP配列のスペーサー領域の一つの塩基を置換したloxP配列（Hoess et al., Nucleic Acids Res. Vol.14, 2287-2300 (1986) ）やスペーサー領域の二つの塩基を置換したloxP配列（Lee, G. et al., Gene Vol.14, 55-65 (1998) ）が挙げられる。
【００１８】
本発明において、「リコンビナーゼ認識配列がリコンビナーゼFLP の基質となる」とは、リコンビナーゼFLP により、二つの「リコンビナーゼ認識配列」間で、DNA 鎖の切断、DNA 鎖の交換と結合の全行程の反応が起きることをいう。「リコンビナーゼ認識配列」の典型的な例としては、酵母由来のFRT 配列（Babineau et al., J. Biol. Chem. Vol.260, 12313-12319 (1985))が挙げられる。FRT 配列は34塩基からなるDNA 配列で、本来の配列（野生型FRT 配列）は野生型loxP配列と同様に一義的に規定されているが、本発明において、「リコンビナーゼFLP の基質となる『リコンビナーゼ認識配列』」とは前記野生型FRT 配列に限定される必要はなく、二つの「リコンビナーゼ認識配列」がリコンビナーゼFLP 基質となる限りは、野生型FRT 配列の一部が他の塩基に置換されていてもよい。さらに、野生型FRT 配列の塩基の置換により、野生型FRT 配列との組合せではリコンビナーゼFLP の基質とならないFRT 配列（変異型FRT 配列）であっても、二つの同じ配列の変異型FRT 配列どおしではリコンビナーゼFLP の基質となる、すなわちDNA 鎖の切断、DNA 鎖の交換と結合の全行程の反応が起きる配列は、リコンビナーゼFLP の認識配列に含まれる。
【００１９】
本発明の組換えアデノウイルスは、さらに外来遺伝子を含有していてもよく、外来遺伝子としてはヒトの治療用遺伝子や、LacZ遺伝子等のいわゆるレポーター遺伝子、リコンビナーゼ等が挙げられる。外来遺伝子の挿入位置としては、E1遺伝子欠失部位、E3遺伝子欠失部位等が挙げられる。
【００２０】
本発明に用いる組換えアデノウイルスの由来は特に限定されないが、ヒト由来のアデノウイルスであることが好ましい。ヒト由来のアデノウイルスにおいては、Ｃ型に分類される２型または５型がより好ましい。以下、ヒトアデノウイルス５型を例として、また「リコンビナーゼ認識配列」の例としてloxP配列（野生型）を用いて、本発明をさらに詳細に説明する。
【００２１】
組換えアデノウイルスの作製法としては、アデノウイルスゲノムDNA に目的DNA を直接連結する方法や、アデノウイルスゲノムを分割して二つのプラスミドに挿入したプラスミドの一方に、目的DNA を挿入後相同組換えにより組換えアデノウイルスを作製する方法などが知られている。しかし、本発明では、アデノウイルスゲノムの大部分を含むコスミドベクターに目的遺伝子を挿入後、このコスミドベクターと制限酵素消化したアデノウイルスDNA −末端蛋白質複合体との相同組換えによる方法（COS-TPC 法：Miyake et al., Proc. Natl. Acad. Sci. Vol.93, 1320-1324 (1996)、および特開平7-298877号公報）により組換えアデノウイルスを作製することが好ましい。その理由は、かかる方法では非常に効率よく目的の組換えアデノウイルスが得られるからである。
【００２２】
まず、アデノウイルスE1及びE3遺伝子以外のアデノウイルス５型ゲノムの大部分を含むコスミドベクターpAxcw （図１、特開平8-308585号公報、15頁のpAdex1cwはpAxcw と同一である）の左端ITR とパッケージング配列との間に位置する、塩基配列147 位と148 位との間にloxP配列を挿入したコスミドベクターpAxcw15Lを作製する。その際、塩基配列143 位〜148 位に認識配列が存在する制限酵素AflIIIでアデノウイルスゲノムを含むDNA を切断し、さらにKlenow酵素による平滑化処理後loxP配列を含む65塩基の合成DNA を連結する。この操作によりAflIII消化により突出した４塩基が重複してloxP挿入部位に存在することになる。従って、塩基配列147 位と148 位との間への挿入とは、実際には143 位〜148 位のいずれかの位置にloxP配列を挿入したことになる。
【００２３】
また、従来知られている挿入部位（塩基配列188 位または193 位）と比較するため、これらの挿入部位の間に位置する塩基配列191 位と192 位との間にloxP配列を挿入したコスミドベクターpAxcw19Lも作製する。この場合も、塩基配列186 位〜193 位に認識配列が存在する制限酵素SgrAI でアデノウイルスゲノムを含むDNA を切断し、さらにKlenow酵素による平滑化処理後loxP配列を含む65塩基の合成DNA を連結するため、SgrAI 消化により突出した４塩基が重複してloxP挿入部位に存在することになる。従って、塩基配列191 位と192 位との間への挿入とは、実際には187 位〜192 位のいずれかの位置にloxP配列を挿入したことになる。
【００２４】
次いで、コスミドベクターpAxcw15LのE1遺伝子欠失部位に、loxP配列／EF1 αプロモーター／LacZ／ポリＡ配列を挿入したコスミドベクターpAxLEFLacZ15L を作製する。同様に、コスミドベクターpAxcw19 にloxP配列／EF1 αプロモーター／LacZ／ポリＡ配列を挿入したコスミドベクターpAxLEFLacZ19L も作製する。これらのコスミドベクターを用い、前述したCOS-TPC 法により目的の組換えアデノウイルスAxLEFLacZ15LおよびAxLEFLacZ19L（図４）を作製する。本発明者らが開発したCOS-TPC 法は非常に効率よく目的の組換えアデノウイルスが得られる方法であり、制限酵素消化したアデノウイルスDNA −末端蛋白質複合体と目的ウイルスの構造を有するコスミドベクターとで形質転換した細胞をクローン化後、任意のクローンを選ぶとその半数以上が目的組換えウイルスである（Miyake et al., Proc. Natl. Acad. Sci. Vol.93, 1320-1324 (1996)）。
【００２５】
組換えアデノウイルスAxLEFLacZ15L作製時の目的クローンの出現頻度は、例えば、６クローン中４クローンであり、本発明者らによる組換えアデノウイルス作製時に通常得られる目的クローンの出現頻度とほぼ同じである。一方、AxLEFLacZ19L作製時の目的クローンの出現頻度は、例えば、12クローン中３クローンと明らかに低い。さらに、AxLEFLacZ15Lは通常の組換えアデノウイルスとほぼ同程度の力価を保持している。この目的組換えウイルスの出現頻度の差は、ITR とパッケージング配列との間に挿入したloxP配列が、アデノウイルスの増殖に及ぼす影響を反映するものである。すなわち、塩基配列143 位〜148 位への挿入（AxLEFLacZ15L）は、アデノウイルスの増殖にほとんど影響しないが、塩基配列187 位〜192 位への挿入は、アデノウイルスDNA のウイルス粒子へのパッケージング過程を含めたウイルスの増殖サイクルに負の影響を及ぼすことが明らかとなった。従って、本発明者らが新たに発見した塩基配列143 位〜148 位への挿入部位は、従来知られていた挿入部位（塩基配列188 位または193 位）よりも、アデノウイルスの増殖に好適な挿入部位であることが判明した。
【００２６】
このようにして得られた塩基配列143 位〜148 位へloxP配列を挿入した組換えアデノウイルスは、パッケージング配列より右側の任意に位置にもう一つのloxPを挿入することにより、ヘルパーウイルスとして作用させることができる。その方法は、前記したように、ヘルパーウイルスゲノムのパッケージング配列の両側にリコンビナーゼCre の認識配列であるloxP配列を挿入したヘルパーウイルスを目的ベクターウイルスとともにリコンビナーゼCre を発現する宿主細胞に感染させて、パッケージング配列を除き、ヘルパーウイルスのゲノムDNA がウイルス粒子にパッケージングされなくなることにより、ヘルパーウイルスの増殖を抑制する方法である（Parks, RJ. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. Vol.93, 13565-13570 (1996)）。その際、パッケージング配列右側のもう一つのloxP配列の挿入位置に制限はなく、その例の一つとしてアデノウイルスE1A 遺伝子の欠失部位が挙げられる。本発明の組換えアデノウイルスAxLEFLacZ15Lは、その一例である。
【００２７】
さらに、本発明の組換えアデノウイルスは前述した変異型loxP配列と組み合わせることにより、遺伝子置換型組換えアデノウイルスの作製にも応用できる。ここにいう「遺伝子置換型組換えアデノウイルスの作製」とは、例えば外来遺伝子Ａを有する組換えアデノウイルスの遺伝子Ａを、リコンビナーゼCre の存在下にプラスミドなど他のDNA 分子に存在する遺伝子Ｂに置換する方法のことである。その方法の一例を以下に説明する。
【００２８】
遺伝子Ａを有する遺伝子置換用組換えアデノウイルスとして、左端ITR ／野生型loxP配列（塩基配列143 位〜148 位に挿入）／パッケージング配列／野生型loxP配列／遺伝子Ａ／変異型loxP配列、の順に野生型loxP配列および変異型loxP配列を挿入した組換えアデノウイルスを作製する。ここに野生型loxP配列／遺伝子Ａの断片はE1欠失部位に挿入される。遺伝子Ｂを有するプラスミドとしては、野生型loxP配列（塩基配列143 位〜148 位に挿入）／パッケージング配列／遺伝子Ｂ／変異型loxP配列の構造を有するプラスミドが挙げられる。遺伝子Ａを有する組換えアデノウイルスと遺伝子Ｂを有するプラスミとを同時にまたは順次、Cre 蛋白質を発現する293 細胞などの細胞に導入すると、遺伝子導入用組換えアデノウイルスでは２つの野生型loxP配列に挟まれたパッケージング配列が除かれるとともに、野生型loxP配列／遺伝子Ａ／変異型loxP配列の部分がプラスミド由来の野生型loxP配列／パッケージング配列／遺伝子Ｂ／変異型loxP配列に置換された組換えアデノウイルスが生成する。遺伝子置換されなかった遺伝子導入用組換えアデノウイルスは、二つの野生型loxP配列に挟まれたパッケージング配列が除去されるため、ウイルスDNA は複製するものの感染粒子にパッケージングされずウイルスとしては増殖しない。一方、遺伝子置換されたアデノウイルスはプラスミドから導入されたパッケージング配列を有するため、感染粒子にパッケージングされて増殖し、「遺伝子Ａ」が「遺伝子Ｂ」に置換された組換えアデノウイルスが高頻度に得られる。
【００２９】
さらに、遺伝子導入用組換えアデノウイルスの変異型loxP配列の挿入位置を変えることにより、アデノウイルス由来の蛋白質をコードする遺伝子の一部または全てを除いた組換えアデノウイルスを作製することもできる。この場合の変異型loxP配列の挿入位置の例として、アデノウイルスL3遺伝子とE2A 遺伝子との間の非翻訳領域、E3遺伝子の欠失部位、E4遺伝子の上流域と右端ITR との間などが挙げられる。これらの位置に変異型loxP配列を挿入して遺伝子置換を行う場合、生成するアデノウイルスDNA が感染粒子に効率よくパッケージングされるように、遺伝子Ｂを有するプラスミドの野生型loxP配列−変異型loxP配列間のDNA のサイズを調節する必要があるが、生成した組換えアデノウイルスは遺伝子置換「遺伝子Ａ」が「遺伝子Ｂ」に置換されるだけでなく、野生型loxP配列／遺伝子Ａ／変異型loxP配列間のDNA がプラスミドの野生型loxP配列−（遺伝子Ｂ）−変異型loxP配列間のDNA に置換されるため、遺伝子Ａ／変異型loxP配列間に存在するアデノウイルス遺伝子を欠失した組換えアデノウイルスを作製することができる。
【００３０】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定されるものではなく、本発明の技術分野における通常の変更ができることは言うまでもない。なお、実施例中のファージ、プラスミド、ＤＮＡ、各種酵素、大腸菌、培養細胞等を取り扱う諸操作は、特に断らない限り、「Molecular Cloning, A Laboratory Manual, T. Maniatis ら編、第２版 (1989), Cold Spring Harbor Laboratory」に記載の方法に準じて行なった。
【００３１】
実施例１
アデノウイルス５型ゲノムの塩基配列 147 位と 148 位との間に loxP 配列を挿入した組換えアデノウイルス作製用のコスミドベクターの作製
▲１▼ アデノウイルスE1及びE3遺伝子以外のアデノウイルス５型ゲノムの大部分を含み、かつE1遺伝子欠失部位にポリリンカーのみが挿入されたコスミドベクターpAxcw （図１、特開平8-308585号公報、15頁のpAdex1cwはpAxcw と同一である）をSalIで消化後自己ライゲーションさせ、アデノウイルゲノム左端約0.4kb を含むプラスミドpxcw（3.1kb ）を得た。
【００３２】
次にプラスミドpxcwをAflIIIで消化し、さらにKlenow酵素により両端を平滑化した後、loxP配列を含む66塩基の合成DNA （塩基配列：5'-GCTCGAGATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATACGCGTTCGCTCGGTACCCGCCATG-3'（配列番号：３）およびその相補鎖、図２参照）を連結し、アデノウイルスゲノムの147 位と148 位との間にloxP配列が挿入されたプラスミドpycw15L （3.2kb ）を得た。プラスミドpycw15L 中のアデノウイルス５型ゲノムの左端から521 bpまでの塩基配列を図２と配列番号：４に示す。
【００３３】
▲２▼ コスミドベクターpAxcw をSwaIおよびCsp45Iで同時に消化し、アデノウイルスゲノムの大部分を含む約28kbの断片(a) を得た。また、コスミドベクターpAxcw をCsp45IおよびPstIで同時に消化し、アデノウイルスゲノムを含まない約13kbの断片(b) を得た。さらに、プラスミドpycw15L をSwaIおよびPstIで同時に消化し、アデノウイルスゲノム左端を含む約1.2kb の断片(c) を得た。次いで、(a)(b)(c) の３断片をライゲーションし、アデノウイルスゲノムの大部分を含み、かつ147 位と148 位の間にloxP配列が挿入されたコスミドベクターpAxcw15Lを得た。
【００３４】
▲３▼ プラスミドpUC119の制限酵素Ecl136II部位に、野生型loxP配列／制限酵素SwaI部位／野生型loxP配列が挿入されたプラスミドpuLwL( Lee G. et. al. Gene Vol.14, 55-65 (1998)) を制限酵素XhoIで消化後、変異型loxP配列および制限酵素NheI部位を含む60塩基の合成DNA （配列番号：５および配列番号：６）を連結し、SwaI部位とアンピシリン耐性遺伝子との間に位置する野生型loxP配列を変異型loxP配列に置換したプラスミドpuLwM を得た。
5'-TCGAGTCCGGAATAACTTCGTATAACGTATACTATACGAAGTTATGCTAGCATTTAAATG-3'( 配列番号：５）
3'-CAGGCCTTATTGAAGCATATTGCATATGATATGCTTCAATACGATCGTAAATTTACAGCT-5'（配列番号：６）
【００３５】
▲４▼ EF1 αプロモーターからLacZ遺伝子を発現するプラスミドpEFLacZ （特開平7-298877号公報、11頁）をHindIII で消化後末端を平滑化し、プロモーター／LacZ／ポリＡ配列を含む断片を得た。この断片を、プラスミドpUC119のEcl136II部位にloxP配列／SwaI部位／変異型loxP配列が挿入された前記▲３▼で得られたプラスミドpULwM のSwaI部位に挿入し、プラスミドpULEFLacZM（9.1kb 、図３）を得た。次いで、プラスミドpULEFLacZMをNheIおよびAsp718で同時に消化後末端を平滑化し、loxP配列／プロモーター／LacZ／ポリＡ配列を含む断片を得た。さらに、この断片をコスミドpAxcw15LのSwaI部位に挿入したコスミドpAxLEFLacZ15L を得た。
【００３６】
実施例２
アデノウイルス５型ゲノムの塩基配列 191 位と 192 位との間に loxP 配列を挿入した組換えアデノウイルス作製用のコスミドベクターの作製
▲１▼ 実施例１の▲１▼で作製したプラスミドpxcwをSgrAI で消化し、さらにKlenow酵素により両端を平滑化した後、loxP配列を含む68塩基の合成DNA （塩基配列：5'-GTACTCGAGATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATACGCGTTCGCTCGGTACCCGGCCGG-3'、（配列番号：７）およびその相補鎖、図２参照）を挿入し、アデノウイルスゲノムの191 位と192 位との間にloxP配列が挿入されたプラスミドpycw19L （3.2kb ）を得た。プラスミドpycw19L 中のアデノウイルス５型ゲノムの左端から523 bpまでの塩基配列を図２と配列番号：８に示す。
【００３７】
▲２▼ プラスミドpycw19L をSwaIおよびPstIで同時に消化して得たアデノウイルスゲノム左端を含む約1.2kb の断片と、実施例１▲２▼で調製したpAxcw をSwaIおよびCsp45Iで同時に消化した断片(a) 、ならびにpAxcw をCsp45IおよびPstIで同時に消化した断片（b)の３断片をライゲーションし、アデノウイルスゲノムの大部分を含み、かつ191 位と192 位との間にloxP配列が挿入されたコスミドベクターpAxcw19Lを得た。
【００３８】
▲３▼ 実施例１▲４▼で調製したプラスミドpULEFLacZMより得たloxP配列／プロモーター／LacZ／ポリＡ配列を含む断片を、コスミドpAxcw19LのSwaI部位に挿入し、コスミドpAxLEFLacZ19L を得た。
【００３９】
実施例３
アデノウイルス５型ゲノムの塩基配列 147 位と 148 位との間、または 191 位と 192 位との間に loxP 配列を挿入し、かつ LacZ 遺伝子の発現単位を有する組換えアデノウイルスの作製
▲１▼ 組換えアデノウイルスの作製
実施例１、２で作製したコスミドベクター（pAxLEFLacZ15L 、pAxLEFLacZ19L ）を用い、アデノウイルス５型由来の非増殖型アデノウイルスベクター（E1及びE3遺伝子を欠失）のITR とパッケージング配列との間にloxP配列を挿入し、かつE1遺伝子欠失部位にloxP配列／EF1 αプロモーター／LacZ／ポリＡ配列を挿入した組換えアデノウイルスを作製した。組換えアデノウイルスの作製法、ならびにウイルスDNA の制限酵素消化による目的組換えアデノウイルスの同定法は既存の方法（Miyake et al., Proc. Natl. Acad. Sci. Vol.93, 1320-1324 (1996)、及び特開平7-298877号公報）に従った。
【００４０】
E3遺伝子を欠失したヒトアデノウイルス５型由来株であるAd5-dlX （Saito, I. et al., J. Virol. Vol.54, 711-719 (1985)）のウイルスDNA −末端蛋白質複合体を制限酵素EcoT22I で消化した。このウイルスDNA −末端蛋白質複合体と、コスミドベクターpAxLEFLacZ15L （実施例１で作製）もしくはコスミドベクターpAxLEFLacZ19L （実施例２で作製）とで、リン酸カルシウム共沈法により6cm シャーレで培養した293 細胞を形質転換した。翌日、形質転換した細胞を希釈後、96穴マイクロプレートにまき直し、２〜３週間培養した。ウイルスの増殖により細胞変成が起こった任意のウェルを選びウイルス液（一次ウイルス液）を調製し、24穴マイクロプレートで培養した293 細胞に２ウェルずつ感染させ、細胞変成が生じた後に片方のウェルから既存の方法によりウイルスDNA を調製した。ウイルスDNA をXhoI消化後、電気泳動によりウイルスのゲノム構造を解析し、目的組換えアデノウイルス（AxLEFLacZ15LまたはAxLEFLacZ19L、図４）クローンを同定した。
【００４１】
通常、この方法で作製した組換えアデノウイルスは、任意に選んだウイルスクローンの半数以上が目的ウイルスクローンである。AxLEFLacZ15Lの場合は６クローン中４クローンが目的クローンであり、その出現頻度は、本発明者らによる組換えアデノウイルス作製時に通常得られる目的クローンの出現頻度とほぼ同じであった。一方、AxLEFLacZ19Lの場合は12クローン中３クローンが目的クローンであり、その出現頻度はAxLEFLacZ15Lの場合よりも低かった。
【００４２】
ウイルスDNA の解析に用いなかったウェルより、AxLEFLacZ15Lは＃３クローンの、AxLEFLacZ19Lは＃３クローンのウイルス液（二次ウイルス液）を調製し、さらに順次スケールアップしてウイルスを継代し、最終的に四次ウイルス液を得た。
【００４３】
▲２▼ AxLEFLacZ15LならびにAxLEFLacZ19Lの力価測定
AxLEFLacZ15LならびにAxLEFLacZ19Lの四次ウイルス液の力価を293 細胞を用いて測定した。力価測定は、既存の方法（特開平7-298877号公報）に従い、96穴マイクロプレートを用いた限界希釈法にて行った。
【００４４】
その結果、AxLEFLacZ15Lの力価は3.4 x 10⁸PFU/ml、AxLEFLacZ19Lの力価は3.4 x 10⁸PFU/mlであり、両ウイルスとも通常の非増殖型組換えアデノウイルスとほぼ同等の力価を有していた。すなわち、ITR とパッケージング配列との間へのloxP配列を含む外来遺伝子の挿入は、アデノウイルスの増殖に致命的な欠陥を与えるものではないことが判明した。
【００４５】
【発明の効果】
本発明により、遺伝子治療の分野において一層安全性の高い遺伝子治療用ベクターを作製するための材料となる、組換えアデノウイルスが提供される。本発明により、アデノウイルスの増殖に必須の遺伝子を欠失した組換えアデノウイルスベクターの製造、および遺伝子置換型組換えアデノウイルスベクターの製造が効率的に行なわれ、遺伝子治療の分野で利用可能な組換えアデノウイルスベクターの供給が容易になる。
【００４６】
【配列表】

【００４７】

【００４８】

【００４９】

【００５０】

【００５１】

【００５２】

【００５３】

【００５４】

【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、コスミドベクターpAxcw の構造を示す模式図である。図中、斜線部分はアデノウイルスゲノムを、C 、Sw、S 、N はそれぞれ、制限酵素ClaI、SwaI、SalI、NruI部位を示す。また、Ａｐ^Rはアンピシリン耐性遺伝子、丸印はプラスミドの複製起点を示す。
【図２】図２は、ヒトアデノウイルス５型の１番目から455 番目までの塩基配列、ならびにITR とパッケージング配列との間に挿入したloxP配列を含む合成DNA （66bpおよび68bp）の塩基配列を示す。図中、上向きおよび下向きの三角はloxP配列を含むDNA の挿入位置を示し、下線を引いた塩基は制限酵素の認識配列を示す。また、挿入DNA 中の太字の塩基配列は34塩基のloxP配列を、小文字の塩基配列は制限酵素の認識配列を示す。
【図３】図３は、プラスミドpULEFLacZMの構造を示す模式図である。図中、EFはEF1 αプロモーター、LacZは大腸菌LacZ遺伝子、pAはポリＡ配列、斜線を引いた部分はloxP配列、黒塗り部分は変異型loxP配列を示す。Ａｐ^Rはアンピシリン耐性遺伝子、ｏｒｉはプラスミドの複製起点を示す。
【図４】図４は、組換えアデノウイルス（AxLEFLacZ15LならびにAxLEFLacZ19L）の構造を示す模式図である。図中、太線部分はアデノウイルスゲノム、黒塗り三角は、欠失したアデノウイルス遺伝子、白抜き三角はloxP配列、EFはEF1 αプロモーター、LacZは大腸菌LacZ遺伝子、pAはポリＡ配列、Ψはアデノウイルスのパッケージング配列を示す。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a recombinant adenovirus.
[0002]
[Prior art]
Adenovirus vectors are promising as vectors for gene therapy because of their high gene transfer efficiency, ease of preparation of high-titer virus solutions, and the advantages of gene transfer into non-proliferating cells. The currently widely used adenovirus vector is a non-propagating adenovirus vector in which the E1 gene essential for adenovirus growth is deleted. However, when administered to humans and animals, adenovirus proteins must be expressed. From the viewpoint of safety, a vector having a structure in which a virus-encoded protein is expressed as little as possible is desired.
[0003]
The structure of the vector is obtained by inserting a target foreign gene such as a therapeutic gene and excluding a part or all of a gene encoding an adenovirus-derived protein. However, since a virus that retains this property (target vector virus) cannot be propagated alone, it is necessary to infect a host cell with another adenovirus (helper virus) and to be an essential protein for the growth of adenovirus supplied from the helper virus. Thus, the method of propagating the target vector virus together with the helper virus is taken (Mitani, K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. Vol. 92, 3854-3858 (1995)). In this method for producing a recombinant adenovirus using a helper virus, it is desirable that the amount of the helper virus is smaller than the target vector virus, that is, the helper virus growth is suppressed.
[0004]
One way to achieve this is to infect a host cell that expresses recombinase Cre together with the target vector virus with a helper virus in which the loxP sequence, which is a recognition sequence for recombinase Cre, is inserted on both sides of the packaging sequence of the helper virus genome. Except that the helper virus genomic DNA is not packaged into the virus particle, thereby preventing the helper virus from growing (Parks, RJ. Et al., Proc. Natl. Acad. Sci. Vol.93, 13565-13570 (1996)).
[0005]
When a helper virus having a loxP sequence inserted on both sides of the packaging sequence is propagated alone, it is important that the growth is not suppressed and that the inserted loxP sequence is not lost, particularly the left side of the packaging sequence, The insertion site of the loxP sequence between the adenovirus left terminal inverted repeat (ITR) and the packaging sequence is important. This is because the region into which a foreign gene can be inserted between the leftmost ITR and the packaging sequence is only 100 bases. The loxP sequence insertion site of the above-mentioned helper virus is adenovirus type 5 base sequence position 188 (Parks, R. J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. Vol. 93, 13565-13570 (1996)). Another example of insertion of loxP sequences has been reported between adenovirus type 5 nucleotide sequence 193 and 194 (Hardy, S. et al., J. Virol. Vol. 71, 1842-). 1849 (1997)), however, these insertion sites are all immediately before the packaging sequence, and it is not clear whether these sites are the best insertion sites for recombinase recognition sequences.
[0006]
[Problems to be solved by the invention]
The object of the present invention is to insert a recombinase recognition sequence at a new position between the adenovirus left end ITR and the packaging sequence as a material for producing a safer gene therapy vector in the field of gene therapy. It is to provide a recombinant adenovirus.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors searched for a recombinase recognition sequence insertion site between the left end ITR and the packaging sequence using human adenovirus type 5, and found a new recombinase recognition sequence insertion site. Based on this finding, a new recombinant adenovirus in which the loxP sequence, which is one of the recombinase recognition sequences, is inserted into the site is prepared, and the adenovirus is transferred to another group in which the loxP sequence is not inserted into the site. We succeeded in maintaining the same virus titer as the modified adenovirus.
[0008]
That is, the gist of the present invention is as follows.
underSequence:
(1) Left end inverted repeat sequence,
(2) packaging arrangement,
(3) An intermediate region between the left end inverted repeat sequence and the packaging sequenceOf human adenovirus type 5 143 ~ 148 One of the ranksA recombinase recognition sequence located in
(4) at least another recombinase recognition sequence recognized by a recombinase that recognizes the recombinase recognition sequence located in a downstream region of the packaging sequence;
In the genomeOf human adenovirus type 5Recombinant adenovirus,
About.
[0009]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
In the present invention, “recombinant adenovirus” refers to an adenovirus containing a nucleotide sequence other than the nucleotide sequence unique to adenovirus in its genome. There are no particular limitations on the base sequence other than the adenovirus-specific base sequence, and it may be a gene encoding a protein, a regulatory gene such as a promoter or poly A sequence, or a base sequence having no function. May be.
[0010]
In the present invention, the “left-end inverted repeat sequence” (hereinafter abbreviated as the left-end ITR) is the left end (ie, upstream of the E1 gene) of the nucleotide sequences at both ends of the genome essential for the initiation of adenovirus genome replication. An existing base sequence. Specific examples thereof include base sequences 1 to 103 in human adenovirus type 5.
[0011]
In the present invention, the “packaging sequence” refers to a nucleotide sequence essential for adenovirus genomic DNA to be inserted into adenovirus particles. Specific examples thereof include base sequences 195 to 358 in human adenovirus type 5.
[0012]
In the present invention, the “recombinase recognition sequence” is a base sequence recognized by “recombinase” which is a specific DNA recombination enzyme, and in the presence of “recombinase”, between two “recombinase recognition sequences”, This is a base sequence that enables the reaction of the whole process of strand breakage, DNA strand exchange and binding.
[0013]
Examples of “recombinase” include bacteriophage P1-derived recombinase Cre (Sternberg et al., J. Mol. Biol. Vol. 150, 467-486 (1981)), encoded by 2 micron DNA of yeast (Saccharomyces cerevisiae) FLP (Babineau et al., J. Biol. Chem. Vol. 260, 12313-12319 (1985)), R derived from the pSR1 plasmid of Tigosaccharomyces loei (Matsuzaki et al., Mol. Cell. Biol. Vol. .8, 955-962 (1988)).
[0014]
In the present invention, the “downstream region of the packaging sequence” refers to a region between the packaging sequence and the right end (ie, downstream of the E1 gene) ITR. As a specific example, in human adenovirus type 5, the nucleotide sequence after position 359 is mentioned.
[0015]
In the present invention, “the recombinase recognition sequence serves as a substrate for the recombinase Cre derived from bacteriophage P1” means that the recombinase Cre causes DNA strand breaks, DNA strand exchanges and bindings between two “recombinase recognition sequences”. The reaction of the whole process occurs. Typical examples of “recombinase recognition sequences” include loxP sequences consisting of 34 bases in bacteriophage P1 (Abremski et al., J. Biol. Chem., 1509-1514 (1984) and Hoess et al., Proc Natl. Acad. Sci. Vol. 81, 1026-1029 (1984)). The loxP sequence is a DNA sequence comprising the following base sequence, and this sequence is hereinafter referred to as a wild type loxP sequence.
[0016]
5'-ATAACTTCGTATAATGTATGC TATACGAAGTTAT-3 '(SEQ ID NO: 1)
3'-TATTGAAGCATATTACATACG ATATGCTTCAATA-5 '(SEQ ID NO: 2)
(In the sequence, the underlined portion indicates a spacer region)
[0017]
In the present invention, the “recombinase recognition sequence” serving as a substrate for recombinase Cre is not necessarily limited to the wild-type loxP sequence, and as long as the two “recombinase recognition sequences” serve as recombinase Cre substrates, A part of the loxP sequence may be substituted with another base. Furthermore, even if the loxP sequence (mutant loxP sequence) does not become a substrate for recombinase Cre when combined with the wild type loxP sequence due to the substitution of the base of the wild type loxP sequence, In this case, the recombinase Cre recognition sequence includes a substrate that is a substrate for recombinase Cre, that is, a reaction that occurs during the entire process of DNA strand breakage, DNA strand exchange and binding. Examples of such mutant loxP sequences include loxP sequences (Hoess et al., Nucleic Acids Res. Vol.14, 2287-2300 (1986)) and spacers in which one base of the spacer region of the wild type loxP sequence is substituted. A loxP sequence (Lee, G. et al., Gene Vol. 14, 55-65 (1998)) in which two bases in the region are substituted can be mentioned.
[0018]
In the present invention, the phrase “recombinase recognition sequence serves as a substrate for recombinase FLP” means that the recombinase FLP causes a reaction between the two “recombinase recognition sequences” in the entire process of DNA strand breakage, DNA strand exchange and binding. It means getting up. A typical example of the “recombinase recognition sequence” is a yeast-derived FRT sequence (Babineau et al., J. Biol. Chem. Vol. 260, 12313-12319 (1985)). The FRT sequence is a DNA sequence consisting of 34 bases, and the original sequence (wild type FRT sequence) is uniquely defined in the same manner as the wild type loxP sequence. In the present invention, the “recombinase FLP substrate” The `` recognition sequence '' is not necessarily limited to the wild-type FRT sequence, and as long as the two `` recombinase recognition sequences '' serve as recombinase FLP substrates, a part of the wild-type FRT sequence is substituted with another base. May be. Furthermore, even if the FRT sequence (mutant FRT sequence) does not become a substrate for recombinase FLP when combined with the wild type FRT sequence due to the base substitution of the wild type FRT sequence, In this case, the recombinase FLP recognition sequence includes a substrate that is a substrate for recombinase FLP, that is, a reaction that occurs during the entire process of DNA strand breakage, DNA strand exchange and binding.
[0019]
The recombinant adenovirus of the present invention may further contain a foreign gene. Examples of the foreign gene include a human therapeutic gene, a so-called reporter gene such as a LacZ gene, and a recombinase. Examples of the insertion position of the foreign gene include an E1 gene deletion site and an E3 gene deletion site.
[0020]
The origin of the recombinant adenovirus used in the present invention is not particularly limited, but is preferably a human-derived adenovirus. In human-derived adenovirus, type 2 or type 5 classified into type C is more preferred. Hereinafter, the present invention will be described in more detail using human adenovirus type 5 as an example and using a loxP sequence (wild type) as an example of a “recombinase recognition sequence”.
[0021]
Recombinant adenovirus can be prepared by ligating the target DNA directly to the adenovirus genomic DNA, or by homologous recombination after inserting the target DNA into one of the two plasmids inserted into two plasmids. A method for producing a recombinant adenovirus is known. However, in the present invention, a method by homologous recombination (COS-TPC) between the cosmid vector and a restriction enzyme-digested adenovirus DNA-terminal protein complex after inserting the target gene into a cosmid vector containing most of the adenovirus genome. Method: It is preferable to produce a recombinant adenovirus according to Miyake et al., Proc. Natl. Acad. Sci. Vol. 93, 1320-1324 (1996), and JP-A-7-298877. The reason is that the target recombinant adenovirus can be obtained very efficiently by such a method.
[0022]
First, the left end ITR of the cosmid vector pAxcw containing most of the adenovirus type 5 genome other than the adenovirus E1 and E3 genes (FIG. 1, JP-A-8-308585, pAdex1cw on page 15 is the same as pAxcw) A cosmid vector pAxcw15L having a loxP sequence inserted between positions 147 and 148 between the packaging sequences is prepared. At that time, the DNA containing the adenovirus genome is cleaved with the restriction enzyme AflIII, which has a recognition sequence at positions 143 to 148, and then the 65-base synthetic DNA containing the loxP sequence is ligated after smoothing with Klenow enzyme. . By this operation, the 4 bases protruding by AflIII digestion are duplicated and present at the loxP insertion site. Therefore, the insertion between the base sequence 147 and 148 actually means that the loxP sequence has been inserted at any of the positions 143 to 148.
[0023]
In addition, a cosmid vector in which a loxP sequence is inserted between base positions 191 and 192 located between these insertion sites for comparison with conventionally known insertion sites (base sequence 188 or 193). pAxcw19L is also produced. In this case as well, the DNA containing the adenovirus genome is cleaved with the restriction enzyme SgrAI, which has a recognition sequence at positions 186 to 193, and 65-base synthetic DNA containing the loxP sequence is ligated after smoothing with the Klenow enzyme. Therefore, the 4 bases protruding by SgrAI digestion overlap and exist in the loxP insertion site. Therefore, the insertion between the base sequence 191st and 192nd actually means that the loxP sequence is inserted at any position from the 187th to 192nd positions.
[0024]
Next, a cosmid vector pAxLEFLacZ15L in which a loxP sequence / EF1α promoter / LacZ / polyA sequence is inserted into the E1 gene deletion site of the cosmid vector pAxcw15L is prepared. Similarly, a cosmid vector pAxLEFLacZ19L in which loxP sequence / EF1α promoter / LacZ / polyA sequence is inserted into cosmid vector pAxcw19 is also prepared. Using these cosmid vectors, the desired recombinant adenovirus AxLEFLacZ15L and AxLEFLacZ19L (FIG. 4) are prepared by the COS-TPC method described above. The COS-TPC method developed by the present inventors is a method for obtaining a target recombinant adenovirus very efficiently. A cosmid vector having a restriction enzyme digested adenovirus DNA-terminal protein complex and the structure of the target virus. After cloning the transformed cells, more than half of the selected clones are the target recombinant virus (Miyake et al., Proc. Natl. Acad. Sci. Vol. 93, 1320-1324 (1996). )).
[0025]
The frequency of appearance of the target clone when producing the recombinant adenovirus AxLEFLacZ15L is, for example, 4 out of 6 clones, which is almost the same as the frequency of appearance of the target clone usually obtained when the recombinant adenovirus is produced by the present inventors. On the other hand, the appearance frequency of the target clone at the time of AxLEFLacZ19L preparation is clearly low, for example, 3 clones out of 12 clones. In addition, AxLEFLacZ15L has almost the same titer as ordinary recombinant adenovirus. This difference in the frequency of appearance of the recombinant virus reflects the effect of the loxP sequence inserted between the ITR and the packaging sequence on the growth of adenovirus. In other words, the insertion from 143 to 148 of the nucleotide sequence (AxLEFLacZ15L) has little effect on the growth of adenovirus, but the insertion from 187 to 192 of the nucleotide sequence is the process of packaging adenoviral DNA into virions. It became clear that it had a negative effect on the growth cycle of viruses including. Therefore, the insertion site at positions 143 to 148 newly discovered by the present inventors is more suitable for the propagation of adenovirus than the conventionally known insertion site (base sequence 188 or 193). It was found to be an insertion site.
[0026]
The recombinant adenovirus inserted with the loxP sequence at positions 143 to 148 thus obtained acts as a helper virus by inserting another loxP at any position to the right of the packaging sequence. Can be made. As described above, the method comprises infecting a host cell expressing recombinase Cre together with the target vector virus with a helper virus in which a loxP sequence, which is a recognition sequence for recombinase Cre, is inserted on both sides of the packaging sequence of the helper virus genome. This is a method to suppress the growth of helper virus by removing the packaging sequence and preventing the genomic DNA of helper virus from being packaged into virus particles (Parks, RJ. Et al., Proc. Natl. Acad. Sci. Vol. .93, 13565-13570 (1996)). In that case, there is no restriction | limiting in the insertion position of another loxP arrangement | sequence on the right side of a packaging arrangement | sequence, The deletion site | part of an adenovirus E1A gene is mentioned as one of the examples. The recombinant adenovirus AxLEFLacZ15L of the present invention is an example.
[0027]
Furthermore, the recombinant adenovirus of the present invention can be applied to the production of a gene-replacement recombinant adenovirus by combining with the mutant loxP sequence described above. As used herein, “production of a gene-replacement recombinant adenovirus” means, for example, that a gene A of a recombinant adenovirus having a foreign gene A is converted to a gene B present in another DNA molecule such as a plasmid in the presence of recombinase Cre. It is a method of replacement. An example of the method will be described below.
[0028]
As a recombinant adenovirus for gene replacement having gene A, leftmost ITR / wild type loxP sequence (inserted at nucleotide positions 143 to 148) / packaging sequence / wild type loxP sequence / gene A / mutant loxP sequence A recombinant adenovirus in which a wild type loxP sequence and a mutant loxP sequence are sequentially inserted is prepared. Here, the wild type loxP sequence / gene A fragment is inserted into the E1 deletion site. Examples of the plasmid having gene B include a plasmid having a structure of wild type loxP sequence (inserted at nucleotide positions 143 to 148) / packaging sequence / gene B / mutant loxP sequence. When a recombinant adenovirus having gene A and a plasmid having gene B are introduced simultaneously or sequentially into cells such as 293 cells that express Cre protein, the recombinant adenovirus for gene transfer is sandwiched between two wild-type loxP sequences. Recombination in which a part of the wild type loxP sequence / gene A / mutant loxP sequence is replaced with a plasmid-derived wild type loxP sequence / packaging sequence / gene B / mutant loxP sequence. Adenovirus is generated. Recombinant adenovirus for gene transfer that has not undergone gene replacement removes the packaging sequence sandwiched between the two wild-type loxP sequences, so that the virus DNA replicates but is not packaged in the infectious particle but grows as a virus. do not do. On the other hand, since a gene-replaced adenovirus has a packaging sequence introduced from a plasmid, the recombinant adenovirus in which “gene A” is replaced by “gene B” is proliferated by packaging in an infectious particle. Obtained in frequency.
[0029]
Furthermore, by changing the insertion position of the mutant loxP sequence of the recombinant adenovirus for gene introduction, a recombinant adenovirus excluding a part or all of the gene encoding the protein derived from adenovirus can be prepared. Examples of insertion positions of mutant loxP sequences in this case include the untranslated region between the adenovirus L3 gene and the E2A gene, the deletion site of the E3 gene, and the region between the upstream region of the E4 gene and the rightmost ITR. It is done. When a gene is replaced by inserting a mutant loxP sequence at these positions, the wild-type loxP sequence of the plasmid having the gene B-mutated loxP so that the generated adenoviral DNA is efficiently packaged in the infectious particle. Although it is necessary to control the size of the DNA between the sequences, the generated recombinant adenovirus not only replaces the gene replacement “gene A” with “gene B” but also the wild type loxP sequence / gene A / mutant. Since the DNA between the loxP sequences is replaced with the DNA between the wild type loxP sequence of the plasmid- (gene B) -mutant loxP sequence, the adenovirus gene present between the gene A / mutant loxP sequences is deleted. Recombinant adenovirus can be generated.
[0030]
【Example】
EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention in more detail, it cannot be overemphasized that this invention is not limited at all by these Examples, and can perform the normal change in the technical field of this invention. Unless otherwise specified, various procedures for handling phages, plasmids, DNA, various enzymes, E. coli, cultured cells, etc. in the Examples are described in “Molecular Cloning, A Laboratory Manual, edited by T. Maniatis et al., 2nd edition (1989)”. ), Cold Spring Harbor Laboratory ".
[0031]
Example 1
Nucleotide sequence of adenovirus type 5 genome 147 And 148 Between loxP Production of cosmid vector for production of recombinant adenovirus with inserted sequence
(1) Cosmid vector pAxcw containing most of the adenovirus type 5 genome other than adenovirus E1 and E3 genes and having only a polylinker inserted at the E1 gene deletion site (FIG. 1, JP-A-8-308585) PAdex1cw on page 15 is identical to pAxcw) and digested with SalI and self-ligated to obtain plasmid pxcw (3.1 kb) containing about 0.4 kb of the left end of the adenovirus genome.
[0032]
Next, the plasmid pxcw was digested with AflIII, both ends were smoothed with Klenow enzyme, and then 66-base synthetic DNA containing the loxP sequence (base sequence: 5'-GCTCGAGATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATACGCGTTCGCTCGGTACCCGCCATG-3 '(SEQ ID NO: 3) and its complement The plasmid pycw15L (3.2 kb) in which the loxP sequence was inserted between positions 147 and 148 of the adenovirus genome was obtained. The nucleotide sequence from the left end of the adenovirus type 5 genome in the plasmid pycw15L to 521 bp is shown in FIG. 2 and SEQ ID NO: 4.
[0033]
(2) The cosmid vector pAxcw was simultaneously digested with SwaI and Csp45I to obtain an approximately 28 kb fragment (a) containing most of the adenovirus genome. The cosmid vector pAxcw was digested simultaneously with Csp45I and PstI to obtain an approximately 13 kb fragment (b) that does not contain the adenovirus genome. Furthermore, plasmid pycw15L was digested simultaneously with SwaI and PstI to obtain an approximately 1.2 kb fragment (c) containing the left end of the adenovirus genome. Subsequently, the three fragments (a), (b) and (c) were ligated to obtain a cosmid vector pAxcw15L containing the majority of the adenovirus genome and having the loxP sequence inserted between positions 147 and 148.
[0034]
(3) Plasmid puLwL in which wild type loxP sequence / restriction enzyme SwaI site / wild type loxP sequence is inserted into restriction enzyme Ecl136II site of plasmid pUC119 (Lee G. et. Al. Gene Vol. 14, 55-65 (1998 )) Was digested with restriction enzyme XhoI, and then a 60-base synthetic DNA (SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6) containing a mutant loxP sequence and a restriction enzyme NheI site was ligated between SwaI site and ampicillin resistance gene. Plasmid puLwM was obtained in which the wild-type loxP sequence located in was replaced with a mutant loxP sequence.
5'-TCGAGTCCGGAATAACTTCGTATAACGTATACTATACGAAGTTATGCTAGCATTTAAATG-3 '(SEQ ID NO: 5)
3'-CAGGCCTTATTGAAGCATATTGCATATGATATGCTTCAATACGATCGTAAATTTACAGCT-5 '(SEQ ID NO: 6)
[0035]
{Circle around (4)} The plasmid pEFLacZ expressing the LacZ gene from the EF1α promoter (JP-A-7-298877, page 11) was digested with HindIII and the ends were blunted to obtain a fragment containing the promoter / LacZ / polyA sequence. This fragment was inserted into the SwaI site of the plasmid pULwM obtained in the above (3) in which the loxP sequence / SwaI site / mutated loxP sequence was inserted into the Ecl136II site of the plasmid pUC119, and the plasmid pULEFLacZM (9.1 kb, FIG. 3) Got. Next, the plasmid pULEFLacZM was digested with NheI and Asp718 at the same time and the ends were blunted to obtain a fragment containing the loxP sequence / promoter / LacZ / polyA sequence. Furthermore, cosmid pAxLEFLacZ15L was obtained by inserting this fragment into the SwaI site of cosmid pAxcw15L.
[0036]
Example 2
Nucleotide sequence of adenovirus type 5 genome 191 And 192 Between loxP Production of cosmid vector for production of recombinant adenovirus with inserted sequence
(1) The plasmid pxcw prepared in (1) of Example 1 was digested with SgrAI, and both ends were smoothed with Klenow enzyme. Then, a 68-base synthetic DNA containing the loxP sequence (base sequence: 5'-GTACTCGAGATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATACGCGTTCGCTCGGTACCCGGCCGG- 3 ′ (SEQ ID NO: 7) and its complementary strand (see FIG. 2) were inserted to obtain plasmid pycw19L (3.2 kb) in which the loxP sequence was inserted between positions 191 and 192 of the adenovirus genome. . The nucleotide sequence from the left end of the adenovirus type 5 genome in the plasmid pycw19L to 523 bp is shown in FIG. 2 and SEQ ID NO: 8.
[0037]
(2) A fragment of about 1.2 kb including the left end of the adenovirus genome obtained by simultaneously digesting plasmid pycw19L with SwaI and PstI, and a fragment (a) of pAxcw prepared in Example 1 (2) with SwaI and Csp45I. ), And a cosmid vector comprising 3 fragments of the fragment (b) obtained by simultaneously digesting pAxcw with Csp45I and PstI, including the majority of the adenovirus genome and having a loxP sequence inserted between positions 191 and 192 pAxcw19L was obtained.
[0038]
(3) A fragment containing the loxP sequence / promoter / LacZ / polyA sequence obtained from the plasmid pULEFLacZM prepared in Example 1 (4) was inserted into the SwaI site of cosmid pAxcw19L to obtain cosmid pAxLEFLacZ19L.
[0039]
Example 3
Nucleotide sequence of adenovirus type 5 genome 147 And 148 Or between 191 And 192 Between loxP Insert an array, and LacZ Production of recombinant adenovirus with gene expression unit
(1) Production of recombinant adenovirus
Using the cosmid vectors (pAxLEFLacZ15L and pAxLEFLacZ19L) prepared in Examples 1 and 2, between the ITR of the non-propagating adenovirus vector derived from adenovirus type 5 (deletion of E1 and E3 genes) and the packaging sequence loxP A recombinant adenovirus was prepared by inserting the sequence and inserting the loxP sequence / EF1α promoter / LacZ / polyA sequence at the E1 gene deletion site. Recombinant adenovirus production and identification of target recombinant adenovirus by restriction enzyme digestion of viral DNA are the existing methods (Miyake et al., Proc. Natl. Acad. Sci. Vol.93, 1320-1324 ( 1996), and JP-A-7-298877).
[0040]
Viral DNA-terminal protein complex of Ad5-dlX (Saito, I. et al., J. Virol. Vol. 54, 711-719 (1985)), a strain derived from human adenovirus type 5 lacking the E3 gene Was digested with the restriction enzyme EcoT22I. With this viral DNA-terminal protein complex and cosmid vector pAxLEFLacZ15L (prepared in Example 1) or cosmid vector pAxLEFLacZ19L (prepared in Example 2), 293 cells cultured in a 6 cm petri dish were transformed by the calcium phosphate coprecipitation method. . On the next day, the transformed cells were diluted, re-plated in a 96-well microplate, and cultured for 2-3 weeks. Select any well in which cell degeneration has occurred due to virus growth, prepare a virus solution (primary virus solution), infect 293 cells cultured in a 24-well microplate, 2 wells at a time, and after cell degeneration occurs, one well From the above, viral DNA was prepared by an existing method. After digesting the viral DNA with XhoI, the genome structure of the virus was analyzed by electrophoresis, and the target recombinant adenovirus (AxLEFLacZ15L or AxLEFLacZ19L, FIG. 4) clone was identified.
[0041]
Usually, in the recombinant adenovirus produced by this method, more than half of the arbitrarily selected virus clones are target virus clones. In the case of AxLEFLacZ15L, 4 out of 6 clones were the target clones, and the appearance frequency was almost the same as the appearance frequency of the target clones usually obtained when the recombinant adenovirus was produced by the present inventors. On the other hand, in the case of AxLEFLacZ19L, 3 out of 12 clones were target clones, and the frequency of appearance was lower than that of AxLEFLacZ15L.
[0042]
Prepare virus solution (secondary virus solution) of # 3 clone for AxLEFLacZ15L and # 3 clone for AxLEFLacZ19L from wells that were not used for analysis of viral DNA. A quaternary virus solution was obtained.
[0043]
▲ 2 ▼ AxLEFLacZ15L and AxLEFLacZ19L titer measurement
The titers of AxLEFLacZ15L and AxLEFLacZ19L quaternary virus solutions were measured using 293 cells. The titer was measured by a limiting dilution method using a 96-well microplate according to an existing method (Japanese Patent Laid-Open No. 7-298877).
[0044]
As a result, AxLEFLacZ15L has a titer of 3.4 x 10⁸PFU / ml, AxLEFLacZ19L has a titer of 3.4 x 10⁸It was PFU / ml, and both viruses had almost the same titer as the normal non-proliferating recombinant adenovirus. That is, it was found that insertion of a foreign gene containing a loxP sequence between the ITR and the packaging sequence does not cause a fatal defect in adenovirus growth.
[0045]
【The invention's effect】
According to the present invention, there is provided a recombinant adenovirus that is a material for producing a safer gene therapy vector in the field of gene therapy. INDUSTRIAL APPLICABILITY According to the present invention, a recombinant adenovirus vector lacking a gene essential for adenovirus growth and a gene-replacement type recombinant adenovirus vector can be efficiently produced and used in the field of gene therapy. Supply of recombinant adenovirus vector is facilitated.
[0046]
[Sequence Listing]

[0047]

[0048]

[0049]

[0050]

[0051]

[0052]

[0053]

[0054]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a schematic diagram showing the structure of a cosmid vector pAxcw. In the figure, the hatched portion indicates the adenovirus genome, and C 1, Sw, S 1 and N indicate the restriction enzyme ClaI, SwaI, SalI and NruI sites, respectively. Ap^RIndicates an ampicillin resistance gene, and a circle indicates the origin of plasmid replication.
[Fig. 2] Fig. 2 shows the nucleotide sequence of synthetic DNA (66bp and 68bp) containing the nucleotide sequence from the 1st to 455th positions of human adenovirus type 5 and the loxP sequence inserted between ITR and packaging sequence. Indicates. In the figure, upward and downward triangles indicate the insertion positions of DNA containing the loxP sequence, and the underlined bases indicate restriction enzyme recognition sequences. The bold base sequence in the inserted DNA indicates a 34 base loxP sequence, and the lower case base sequence indicates a restriction enzyme recognition sequence.
FIG. 3 is a schematic diagram showing the structure of plasmid pULEFLacZM. In the figure, EF represents the EF1α promoter, LacZ represents the E. coli LacZ gene, pA represents the poly A sequence, the hatched portion represents the loxP sequence, and the black portion represents the mutant loxP sequence. Ap^RIndicates an ampicillin resistance gene, and ori indicates the origin of replication of the plasmid.
FIG. 4 is a schematic diagram showing the structures of recombinant adenoviruses (AxLEFLacZ15L and AxLEFLacZ19L). In the figure, the bold line portion is the adenovirus genome, the black triangle is the deleted adenovirus gene, the open triangle is the loxP sequence, EF is the EF1α promoter, LacZ is the E. coli LacZ gene, pA is the polyA sequence, and Ψ is the adenovirus The viral packaging sequence is indicated.

Claims

The following sequence:
(1) Left end inverted repeat sequence,
(2) packaging arrangement,
(3) a recombinase recognition sequence located between positions 143 to 148 of human adenovirus type 5, which is an intermediate region between the left end inverted repeat sequence and the packaging sequence, and (4) of the packaging sequence At least one recombinase recognition sequence recognized by a recombinase that recognizes the recombinase recognition sequence located in the downstream region;
A human adenovirus type 5 recombinant adenovirus comprising

Recombinase recognition sequence is a substrate for recombinase Cre derived from bacteriophage P1, claim 1 Symbol placement of recombinant adenovirus.

The recombinant adenovirus according to claim 2 , wherein the recombinase recognition sequence is a loxP sequence.

Recombinase recognition sequence is a substrate for recombinase FLP from yeast, claim 1 Symbol placement of recombinant adenovirus.

The recombinant adenovirus according to claim 4 , wherein the recombinase recognition sequence is an FRT sequence.